PL103082B1 - Sposob wytwarzania nowego preparatu antygenowego - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowego preparatu antygenowego.

Wiadomo, ze aczkolwiek rózne zinaktywowane wirusy, np. wirus grypy, sa dobrymi czynnikami uodporniajacymi, to jednak wywoluja one goraczke i wprawdzie oczyszczajac czastke wirusa o wlasci¬ wosciach uodporniajacych mozna uniknac wywoly¬ wania przez nia goraczki, ale wówczas pozostale sub- jednostki wirusa nie dzialaja juz dostatecznie uod- porniajaco. Z tego tez wzgledu, do takich sub- jednostek trzeba stosowac odpowiedni srodek po¬ mocniczy i inne proteiny antygenowe, zwiekszajace dzialanie uodporniajace organizmu, który poddaje sie szczepieniu.

Ostatnio wzrasta zainteresowanie lipozomami jako nosnikami leków i enzymów, i mozliwoscia ich sto¬ sowania jako dodatków imunologicznych. Lipozomy stanowia wodna dyspersje wspólsrodkowych kul, skladajacych sie z podwójnych warstw fosfolipido- wych, oddzielonych wodnymi przedzialami. Maja one budowe w zasadzie podobna do budowy cebuli, opisana w literaturze. Wytwarza sie je, wytrzasajac w obecnosci substancji buforowej wysuszona blone fosfolipidu, np. lecytyny.

Wedlug znanych publikacji, dotyczacych lipozo- mów leki, preparaty enzymowe lub antygenowe znaj¬ duja sie w wewnetrznych wodnych przedzialach wielowarstwowych cial lipidowych.

Obecnie stwierdzono, ze antygenowe proteiny mo¬ ga byc wiazane z zewnetrzna powierzchnia pojedyn- czej zdwojonej warstwy lipidowej w podobnych do lipozomów jednowarstwowych cialach o zdwojonej warstwie lipidowej i ze takie preparaty maja w po¬ równaniu z niezwiazana proteina bardzo dobre wlasciwosci antygenowe. Jezeli antygenowa proteina stanowi subjednostke wirusowa, wówczas orientacja tych subjednostek obserwowana za pomoca elektro¬ nowego mikroskopu sugeruje, ze subjednostki te sa rozmieszczone w taki sam sposób, jak w czasteczce wirusa.

Wynalazek umozliwia wytwarzanie nowego prepa¬ ratu antygenowego, zawierajacego znaczna liczbe mikropecherzyków, z których kazdy zawiera jedna zdwojona warstwe lipidów, z której zewnetrzna po¬ wierzchnia jest zwiazana antygenowa proteina, po¬ chodzaca od organizmu chorobotwórczego.

Zgodnie z wynalazkiem lipid miesza sie w srodo¬ wisku wodnym w ciagu okresu czasu wystarczaja¬ co dlugiego na wytworzenie jednowarstwowych mi¬ kropecherzyków o zdwojonej warstwie lipidowej, po czym wytworzone mikropecherzyki miesza sie z an¬ tygenowa proteina, powodujac wiazanie sie antyge¬ nowej proteiny z zewnetrzna powierzchnia zdwojo¬ nej warstwy lipidowej jednowarstwowych mikrope¬ cherzyków, albo tez mieszanine lipidu, wodnego srodowiska i antygenowej proteiny miesza sie w ciagu okresu czasu wystarczajaco dlugiego na wy¬ tworzenie jednowarstwowych mikropecherzyków, o zdwojonej warstwie lipidowej, z której zewnetrzna powierzchnia zwiazana jest antygenowa proteina. 103 082103 082 3 - .

Dzieki zastosowaniu jednowarstwowych mikrope- cherzyków jako nosników protein uzyskuje sie zwia¬ zanie protein prawie wylacznie z zewnetrzna po¬ wierzchnia zdwojonej warstwy lipidowej, poniewaz wewnatrz mikropecherzyka znajduje sie tylko cen¬ tralny obszar wodny (jesli jest on wogóle obecny), a zatem proteiny, majace w wiekszosci charakter hydrofilowy, gromadza sie na zewnatrz mikropeche¬ rzyka. W lipozomach natomiast, dla protein jedna¬ kowo dostepne sa liczne przedzialy wodne wewnatrz stanowiacych lipozomy wielowarstwowych peche¬ rzyków, a zatem wiazanie sie protein z zewnetrzna powierzchnia zewnetrznej warstwy lipozomu zacho¬ dzi w odpowiednio mniejszym stopniu.

Gdy do wytworzonych juz jednowarstwowych mi- kropecherzyków dodaje sie proteine, proteinie tej udostepnione zostaje duze pole powierzchni ze¬ wnetrznych mikropecherzyków i bardzo niewielka objetosc wewnetrznych obszarów wodnych (jesli wogóle sa one obecne). W ukladzie takim nie istnieja praktycznie warunki termodynamiczne, sprzyjajace przedostawaniu sie proteiny do wewnetrznych ob¬ szarów wodnych.

Gdy mieszaniu poddaje sie mieszanine lipidu, sro¬ dowiska wodnego i proteiny, poczatkowo uzyskuje sie wielowarstwowe lipozomy z proteina, obecna w ich wewnetrznych przedzialach, lecz znacznie przedluzony okres mieszania powoduje rozbicie li- pozomów na jednowarstwowe mikropecherzyki, z których zewnetrzna powierzchnia zwjazana jest proteina. Tak wiec zwiazanie proteiny z zewnetrzna powierzchnia uzyskuje sie niezaleznie od tego, czy jednowarstwowe mikropecherzyki wytwarzane sa bezposrednio, czy tez posrednio z zawierajacych pro¬ teine lipózomów.

W sposobie wedlug wynalazku mieszanie prowadzi sie. znacznie dluzej niz w metodach znanych, przy czym konieczne jest stosowanie takiego mieszania az do przeprowadzenia wiekszosci zdyspergowanych w srodowisku czastek w jednowarstwowe mikrope¬ cherzyki o zdwojonej warstwie lipidowej. Do tego samego jednowarstwowego pecherzyka mozna przy¬ laczac antygenowe proteiny, pochodzcce od jednego tylko gatunku, od róznych gatunków tego samego rodzaju lub róznych rodzajów, jak równiez preparat moze zawierac ich mieszaniny. Poszczególne mikro¬ pecherzyki maja korzystnie wielkosc 40—100 nm, ale zgodnie z wynalazkiem mozna tez stosowac mi¬ kropecherzyki mniejsze lub wieksze, np. o srednicy —200 nm.

Antygenowe proteiny moga pochodzic od róznych organizmów chorobotwórczych, takich jak pierwo¬ tniaki, wielokomórkowce i bakterie, a zwlaszcza wi¬ rusy. Szczególnie korzystnie jest stosowac ochronna powierzchnie antygenów, pochodzaca od wirusów sluzowych, takich jak wirus A, B i C grypy, wirus choroba Newcastle i wirusy parainfluency typu 1, 2, 3 i 4, a takze innych wirusów, takich jak wirus odry, wirus swinki, cytomegalowirus i inne wirusy opryszczki, wirusy wiencowe i kapsomery, pochodza¬ ce od wirusów pikorna, takie jak wirusy pryszczycy, wirusy choroby Heinego-Medina, wirusy schorzen nosa, wirusy powodujace powstawanie brodawek i wirusy wywolujace schorzenia jelit. '¦'••*¦ 4 Przypuszcza sie, ze antygeny proteinowe wiaza sie z mikropecherzykami za pomoca wiazania hydrofo¬ bowego i jezeli antygenowa proteina sama nie ma hydrofobowego obszaru wolnego lub dajacego sie udostepnic, wówczas mozna wprowadzic grupe hy¬ drofobowa, np. do kapsomerów wirusów pikorna, na drodze reakcji z substancja, która moze byc zródlem takiej grupy, np. grupy palmitylowej, stea- rylowej, laurylowej lub polialanylowej albo innej grupy alifatycznej o dlugim lancuchu.

Mikropecherzyki mozna wytwarzac z dowolnych substancji lipidowych, korzystnie z takich, które ulegaja rozkladowi biologicznemu i nie sa przeciw- antygenowe. Szczególnie korzystnie stosuje sie do tego celu naturalne lub syntetyczne lecytyny i inne fosfolipidy. Mozna tez dodawac jako substancje wzmacniajace inne lipidy, np. cholesterol, w ilosci mniejszej niz 30% molowych w stosunku do cal¬ kowitej ilosci lipidu. W celu zapewnienia dodatniego lub ujemnego ladunku mozna tez ewentualnie sto¬ sowac trzeci skladnik. Jako zródlo ujemnego ladun¬ ku stosuje sie kwas fosfolipidowy, gangliczyd z mózgu wolowego, fosforan dwucetylowy, fosfaty- dyloseryne i fosfatydyloinozytol, a jako zródlo la- dunku dodatniego stosuje sie stearyloamine lub inne aminy pierwszorzedowe.

Mikropecherzyki moga ewentualnie zawierac we¬ wnatrz drugi znany dodatek pomocniczy.

Wielowarstwowe mikropecherzyki (lipozomy), z których otrzymuje sie nastepnie mikropecherzyki jednowarstwowe, mozna wytwarzac znanymi spo¬ sobami, korzystnie rozpuszczajac jeden lub wieksza liczbe wyjsciowych lipidów w rozpuszczalniku i na¬ stepnie odparowujac rozpuszczalnik. Otrzymana blo- ne lipidu dysperguje sie w wodnej solance lub w roztworze buforowym, jezeli proteina ma byc wprowadzana po utworzeniu mikropecherzyków, al¬ bo w wodnej zawiesinie proteiny, jezeli proteina ma byc wprowadzana przed ctworzeniem mikrope- 40 cherzyków, po czym mieszanine miesza sie. Gdy proteine wprowadza sie po utworzeniu lipózomów, powstale lipozomy miesza sie przed dodaniem pro¬ teiny w ciagu okresu czasu wystarczajaco dlugiego na wytworzenie jednowarstwowych mikropecherzy- 45 ków o zdwojonej warstwie lipidowej, natomiast w przypadku dodawania proteiny przed powstaniem lipózomów przedluzone mieszanie prowadzi sie po ich powstaniu. Mozna tez zgodnie z wynalazkiem dodawac wyjsciowe lipidy do fazy wodnej i powoli 50 ogrzewac mieszanine, a nastepnie mieszac w celu wytworzenia lipózomów. Faza wodna moze zawierac antygenowa proteine lub tez mozna dodawac pro¬ teine pózniej, przy czym przedluzone mieszanie prowadzi sie po powstaniu lipózomów przed doda- 55 niem proteiny lub po powstaniu lipózomów, zwiaza¬ nych juz z proteina.

Inny sposób wytwarzania mikropecherzyków (li¬ pózomów) polega na szybkim wtryskiwaniu etano- lowego roztworu fosfolipidu do wodnej solanki lub eo do roztworu buforowego, przeplukanego uprzednio azotem. Otrzymany preparat lipozomowy steza sie nastepnie na drodze ultrasaczenia, z równoczesnym mieszaniem w atmosferze azotu pod zmniejszonym cisnieniem, w celu unikniecia wytwarzania wiek- 65 szych, niejednolitych lipózomów. Etanol mozna od-103 082 dzielac z frakcji lipozomowej na drodze dializy lub przez wymywanie na ultrafiltrze. Antygenowa-jmo- teina, która ma byc zwiazana ze zdwojona warstwa lipidowa jednowarstwowego mikropecherzyka mo¬ ze znajdowac sie w wodnym roztworze, albo tez frakcje lipozomowa otrzymana po ultrasaczeniu mozna mieszac za pomoca ultradzwieków z antyge¬ nowa proteina.

Antygenowe preparaty, otrzymane sposobem we¬ dlug wynalazku, zawieraja wodna dyspersje mikro- pecherzyków i mozna nadawac im postac szczepio¬ nek, które umieszcza sie w naczyniach jako dawki jednostkowe lub wielokrotne i wyjalawia. Szcze¬ pionki takie moga tez zawierac znane dodatki kon¬ serwujace, stabilizujace i inne. Otrzymane szcze¬ pionki stosuje sie znanymi sposobami, zwykle po¬ przez nos albo przez wstrzykiwanie domiesniowe albo podskórne. Szczepionki te mozna stosowac dla zwierzat i ludzi, przy czym wielkosc dawki zalezy oczywiscie od rodzaju antygenu, rodzaju zwierzecia, sposobu stosowania preparatu oraz zawartosci do¬ datków pomocniczych. Mozna stosowac szczepionki jednorazowo albo wielokrotnie, w mniejszych daw¬ kach w ciagu pewnego okresu czasu.

Wynalazek ilustruja nizej podane przyklady, nie ograniczajac jego zakresu, przy czym w przykla¬ dzie V podano przykladowa recepture roztworu do podawania pozajelitowego.

Przyklad I. A. Wytwarzanie subjednostek wi¬ rusa grypy Dokladnie oczyszczony metoda J.J. Skehcle i G.C.

Schield, Virology, 1971, 44, 396—408 wirus grypy PR8, zawierajacy 12 mg proteiny wirusowej w 1 ml miesza sie z niejonowym detergentem (Nonidet NP40) tak, aby otrzymac stezenie 5% objetosciowych i wlewa warstwami na 11 ml gradientów chlorku cezu, otrzymanych z roztworu chlorku cezu o ste¬ zeniu 24—45% wagowo-objetosciowych w 0,05 m roz¬ tworze fosforanu buforowego o wartosci pH 7,0, stosujac jako warstwy pokrywajace 0,3 ml sacha¬ rozy.

Gradienty odwirowuje sie przy 100 000 G w ciagu 3 godzin lub dluzej, po czym frakcjonuje i oznacza zdolnosc aglutynacji krwi przez poszczególne frakcje.

Frakcje o wysokiej aktywnosci laczy sie, dializuje pod zmniejszonym cisnieniem za pomoca solanki buforowanej fosforanem (PBS) i nalewa na drugi gradient z 20—60% wagowo-objetosciowych sacha¬ rozy w PBS i odwirowuje przy 100 000 G w ciagu 16 godzin. Ponownie bada sie zdolnosc poszczegól¬ nych frakcji do aglutynacji krwi, laczy frakcje o duzej aktywnosci i dializuje je pod zmniejszonym cisnieniem za pomoca PBS.

Otrzymany ostatecznie roztwór ma stezenie pro¬ teiny 1,76 mg/ml i zdolnosc aglutynacji krwi, wyno¬ szaca okolo 106 HAU/ml. Do wytwarzania lipozo- mów roztwór ten doprowadza sie do stezenia prote¬ iny 200 mikrogramów/ml. Stosowana w tym przy¬ kladzie solanka buforowa fosforanem (PBS) zawiera w 1 litrze 10 g chlorku sodowego, 0,25 g chlorku po¬ tasowego, 0,25 g dwuwodorofosforanu potasowego i 1,4375 g wodorofosforanu dwusodowego. 40 45 50 55 60 65 B.; Wytwarzanie lipozomów 2,5 mg fosforanu dwucetylowego i 22,5 mg lecytyny rozpuszcza sie w okolo 50 ml chloroformu i roztwór odparowuje do sucha w wyparce typu Buchi pod nieco zmniejszonym cisnieniem. Do pozostalosci do¬ daje sie 5 ml preparatu wirusowego antygenu w PBS i wytrzasa recznie oraz mechanicznie az do otrzymania zawiesiny lipidu w cieczy. Nastepnie mieszanine przelewa sie do fiolki i w ciagu 1,5 mi¬ nuty poddaje dzialaniu ultradzwieków, stosujac sonde 1 cm i amplitude 8 mikronów.

C. Próba ochrony myszy myszy dzieli sie na 4 grupy po 5 i myszom z dwóch grup wstrzykuje sie dootrzewnowo siib- jednostki wirusowe, wytworzone w sposób opisany w przykladzie I A, przy czym dla jednej grupy sto¬ suje sie dawke 50 mikrogramów) 0,25 ml, a drugiej mikrogramów na 0,25 ml. Myszom z grupy drugiej i trzeciej podobnie wstrzykuje sie lipozomy, wytwo¬ rzone w sposób opisany w przykladzie I B, przy czym jednej grupie podaje sie 5 mikrogramów, a drugiej 50 mikrogramów w 0,25 ml. Po uplywie 10 dni myszy poddaje sie dzialaniu zywego wirusa te¬ go samego szczepu i w 2 dni pózniej bada pluca my¬ szy, homogenizujac je i poddajac dzialaniu ultra¬ dzwieków, w celu uwolnienia ewentualnie obecnego wirusa. Otrzymana zawiesine bada sie w hodowli omoczni, metoda opisana przez Fazekas de St.

Groth i White w Journal of Hygiene 56, 151 (1958).

Wyniki podane w tablicy 1, swiadcza o tym, ze dawka 50 mikrogramów subjednostek, zwiazanych z lipozomem dawala dobra ochrone przed dziala¬ niem homologicznego wirusa po uplywie 10 dni od zabiegu immunizacji i tylko slady rozwoju wirusa wykryto w plucach jednej z 5 myszy tej grupy.

Dawka 5 mikrogramów lipozomów dawala taka sa¬ ma ochrone jak dawka 50 mikrogramów, co dowo¬ dzi, ze substancja lipozomu przyczynila sie do dzie¬ sieciokrotnego wzmozenia ochrony.

Antygen 1 Subjednostki PR8 Subjednostki PB8 Tablica Dawka dootrze¬ wnowa (mikro- gramy) 2 50 1 Numer myszy 3 1 2 3 4 6 7 8 9 Wirus plucny miarecz¬ kowanie (log10) 4 — 4,21 — 3,39 %\7 ciag dalszy tablicy 1 1 1 Lipozymy — zawiesina sub¬ jednostek PR8 otrzymana przez 10-krot- ne rozciencze¬ nie preparatu podanego nizej Lipozomy (sub- jednostki PR8) 0,5% lipidu 1 2 | 3 [ 4 50 11 12 13 14 16 17 18 19 -3,4 —1,76 brak wzro¬ stu wirusa i tylko w cach jednej myszy stwierdzo¬ no 1/8 wzrostu Przyklad II A. 2,5 mg fosforanu dwucetylo- wego i 22,5 mg lecytyny rozpuszcza sie w okolo 50 ml chloroformu i jak opisano w przykladzie 1, odparowuje roztwór do sucha i do pozostalosci do¬ daje tyle solanki buforowanej fosforanem, aby otrzy¬ mac stezenie lipidu 16,6 mikromola/ml. Otrzymana mieszanine poddaje sie dzialaniu ultradzwieków w ciagu 1,5 godziny, stosujac kapiel ultradzwiekowa przy czystosci 50 KHz.

B. Do otrzymanego preparatu dodaje sie tyle sub- jednostek wirusa grypy, wytworzonych w sposób, opisany w przykladzie I A, aby otrzymac stezenie 200 mikrogramów/ml. Mieszanine poddaje sie na¬ stepnie dzialaniu ultradzwieków w ciagu 15 minut, jak w ustepie A.

C. Badanie za pomoca elektronowego mikroskopu metoda ujemnego znakowania mikroskopowych cial, wytworzonych w sposób opisany w ustepie A, wy¬ kazuje, ze znaczna wiekszosc tych cial stanowi male struktury jednowarstwowe, nieco zanieczyszczone wiekszymi strukturami wielowarstwowymi, to jest lipozomami. Wiekszosc tarcz lipidów ma srednice 50—100 milimikronów.

D. Preparat subjednostek wirusa grypy, przygoto¬ wany w sposób opisany w ustepie B, badany w spo¬ sób podany w ustepie C, wykazuje tylko typowe po¬ stacie gwiazd lub kól wozu, które kojarzy sie z sub- jednostkami aglutyniny krwi i neuraminidazy.

E. Badanie metoda, opisana w ustepie C, wykazu¬ je, ze preparat, otrzymany w sposób, opisany w us¬ tepie B, zawiera glówna czesc subjednostek, umiesz¬ czonych na powierzchni jednowarstwowych cial, to jest bardzo podobnie do ulozenia wlasciwego dla wi¬ rusa grypy. W wiekszosci cial mikroskopowych przewazaja subjednostki aglutyniny krwi, ale na niektórych powierzchniach mozna zauwazyc sub- jednostki neuraminidazy. Dalsze badanie tych cial 3082 8 mikroskopowych metoda immuno-elektromikrosko- powa wykazuje, ze dodanie hiperodpornej przeciw- surowicy grupy A powoduje skupienie sie cial w du¬ ze kompleksy.

Przyklad 111. Wytwarzanie etanololipozomów mg lecytyny z jaj rozpuszcza sie w chloroformie i odparowuje do sucha w obrotowej wyparce w cia¬ gu 1,5 godziny, pod nieco zmniejszonym cisnieniem.

Pozostaly lipid rozpuszcza sie w 2 ml etanolu i roz- twór umieszcza w strzykawce o pojemnosci 2 ml, wyposazonej w igle nr 27 do wstrzykiwan podskór¬ nych. Oddzielnie przygotowuje sie 30 ml roztworu chlorku potasowego o stezeniu 0,16 m i przez roz¬ twór przeprowadza w ciagu 1 godziny gazowy azot, po czym do tego roztworu wtryskuje sie szybko przygotowany roztwór lecytyny.

Otrzymany preparat lipozomowy steza sie przez ultrasaczenie do objetosci okolo 3 ml, stosujac ultra- filtr Amicon model 52, wyposazony w przepone PM , opisany w B.B. Acta 298 (1973) str. 1015—1019.

Przyklad IV. Etanololipozomy, przygotowane w sposób^ opisany w przykladzie III, miesza sie z ta¬ ka sama objetoscia podjednostek wirusa grypy X 31 (250 mikrogramów na 1 ml) i poddaje slabemu dzia¬ laniu ultradzwieków. Otrzymany preparat antygeno¬ wy bada sie w sposób, opisany w przykladzie I C, w celu ustalenia jego zdolnosci do chronienia myszy.

Wyniki podano w tablicy 2.

Tablica 2 Antygen 42 mikrogra- my subjedno¬ stek X 31 na alkohololipo- zomach 42 mikrogra- my subjedno¬ stek X 31 w PBS Bez uodpor¬ niania Dawka w mi- krogra- mach na 0,25 ml. 42 42 — Numer myszy 1 2 3 4 16 17 18 19 21 22 23 24 Wirus plucny miareczko¬ wanie (log10) — 1,75 — 1,75 — 1,75 — 1,75 — 2,25 srednio —1,85 ± 0,22, — 3,31 — 2,63 — 3,88 — 3,13 — 1,81 srednio — 2,95 ± 0,78 — 4,06 — 4,50 — 4,50 — 4,56 — 4,50 srednio — 4,42 ± 0,21 |103 082 Przyklad V. Roztwór do podawania pozajeli¬ towego Roztwór ten ma nastepujacy sklad: lecytyna i fosforan dwucetylowy w sto¬ sunku wagowym9:1 — 1 mg subjednostki proteinowe wirusa grypy X31 — 50 ug mertiolan sodowy — 40 /ug solanka buforowana fosforanem (wartosc pH7,2) — 0,2 ml.

Sklad solanki buforowanej fosforanem jest naste¬ pujacy: chlorek sodowy — 10 g/litr chlorek potasowy — 0,25 g/litr dwuwodorofosforan potasowy — 0,25 g/litr wodorofosforan dwusodowy — 1,4375 g/litr Przyklad VI. Lipozomy z wprowadzonym tok¬ soidem blonicy A. Wytwarzanie lipozomów 3 mg fosforanu dwucetylu i 27 mg lecytyny rozpusz¬ cza sie w 4 ml chloroformu i miesza, po czym doda¬ je sie 3 ml solanki buforowanej fosforanem i laczy kolbe z obrotowa wyparka typu Buchi. Wodna i nie- wodna faze miesza sie za pomoca mieszadla magne¬ tycznego oraz obraca w ciagu 1 godziny pod cisnie¬ niem 100 mm Hg, w temperaturze 20°C, po czym zmniejszajac cisnienie odparowuje sie chloroform.

Otrzymany preparat lipozomowy pozostawia sie na okres 3 godzin, w celu osiagniecia stanu równo¬ wagi, po czym dodaje sie 0,3 ml toksoidu blonicy o stezeniu 9 mg/ml, produkcji firmy Wellcome La¬ boratories i miesza dalej w ciagu 1/2 godziny, w celu wprowadzenia toksoidu na powierzchnie lipozomów.

Nadmiar toksoidu usuwa sie przez odwirowanie przy 40000 G w ciagu 2 godzin w temperaturze 5°C i nastepnie dodaje 3 ml solanki buforowanej fosfora¬ nem (Biochim. Acta., 1972, 266, str. 320), otrzymujac zawiesine lipozomów w solance.

B. Imunologiczne dzialanie lipozomów, zawieraja¬ cych toksoid blonicy na myszy Grupom po 5 samców myszy CBA oraz po 12 sam¬ ców myszy Porton Albino wstrzykuje sie podskórnie na grzbiecie rózne dawki toksoidu blonicy albo po¬ dobne dawki lipozomów z wprowadzonym w nie toksoidem blonicy, przy stezeniu lipidu 1% wago- wo-objetosciowo. Dla kazdej próby pozostawia sie grupe myszy poddanych wstrzykiwaniu, stanowia¬ cych grupy kontrolne. Po uplywie 21 dni myszy wy¬ krwawia sie i surowice poddaje absorpcji, w celu usuniecia przeciwciala do czerwonych krwinek ow¬ cy i metoda aglutynacji krwi, stosujac czerwone krwinki owcze uczulone toksoidem blonicy (J. Immunol, 1968, 100, nr 2, str. 274). Za wskaznik aglutynacji uwaza sie te wartosc rozcienczenia surowicy, przy której wystepuje wyrazna aglutynacja. 50 65 60 Wszystkie próby prowadzi sie w odniesieniu do rozcienczen typowej surowicy konskiej przeciwko blonicy, stanowiacej dodatnia próbe kontrolna oraz w odniesieniu do uczulonych komórek bez surowicy, bedacej negatywna próba kontrolna. Myszy z grup, którym nie stosowano wstrzykiwan, dawaly w kaz¬ dym przypadku reakcje ujemna. Wyniki prób w po¬ staci przecietnych wartosci wskazników aglutynacji, obliczona jako odwrotnosci, podano w tablicy 3 dla myszy CBA i w tablicy 4 dla myszy Porton Albino.

Stezenie toksoidu blonicy w mikro- gramach 0 2,5 ,0 ,0 Tabli c a 3 Wskaznik aglutynacji krwi: próba negatywna <2 — — — odwrotnosc sam toksoid blonicy — <2 8,0 ,8 lipozomy z wprowa¬ dzonym toksoidem blonicy 12,8 32 64 Stezenie toksoidu blonicy w mikro- gramach 0 8 Tabll c a 4 Wskaznik aglutynacji krwi: odwrotnosc próba negatywna <2 sam toksoid blonicy <2 lipozomy z wprowa¬ dzonym toksoidem blonicy 11,3 C. Imunologiczne dzialanie lipozomów, zawieraja¬ cych toksoid blonicy na swinki morskie Grupom po 5 samców swinki morskiej Porcellus wstrzykuje sie w dniu 0 podskórnie 0,4 mikrograma toksoidu blonicy lub lipozomy z wprowadzonym w nie toksoidem blonicy, przy stezeniu lipidu 1% wagowo-objetosciowo. Po uplywie 21 dni zwierzeta wykrwawia sie. W dniu 28 obu grupom zwierzat wstrzykuje sie 0,4 mikrograma toksoidu blonicy i wykrwawia po uplywie 7 dni. Surowice bada sie, jak opisane w ustepie B i dla wszystkich zwierzat oznacza przecietne odwrotnosci wskazników agluty¬ nacji krwi. Surowice pobrane od swinek morskich przed pierwszym wstrzykiwaniem stosuje sie jako negatywne próby kontrolne. Nie wykazuja one re¬ akcji na toksoid blonicy. Wyniki podano w tablicy 5.103 082 11 Tablica 5 Prót>y aglutynacji krwi dla surowic z grup po 5 swinek morskich 12 i) reakcja pier¬ wotna ii) reakcja wtórna Stezenie toksoidu blonicy w mikrogra- mach 0,4 0,4 Wskaznik aglutynacji "krwi: odwrotnosc , tokspid blonicy <3 1^ lipozomy z wprowa¬ dzonym toksoidem blonicy <2 150 i) po uplywie 21 dni od pierwszego wstrzykniecia toksoidu blonicy albo lipozomów z wprowadzo¬ nym toksoidem blonicy ii) po uplywie 7 dni od dodatkowego wstrzykniecia samego toksoidu blonicy

Claims (29)

Zastrzezenia patentowe

1. Sposób wytwarzania nowego preparatu anty¬ genowego, zawierajacego znaczna ilosc mikrope- cherzyków, zwiazanych z antygenowa proteina, po¬ chodzaca od organizmu chorobotwórczego, znamien¬ ny tym, ze lipid miesza sie w srodowisku wodnym w ciagu okresu czasu wystarczajaco dlugiego do wy¬ tworzenia jednowarstwowych mikropecherzyków o zdwojonej warstwie lipidowej, po czym wytworzo¬ ne mikropecherzyki miesza sie z antygenowa prote¬ ina, powodujac wiazanie sie antygenowej proteiny z zewnetrzna powierzchnia zdwojonej warstwy lipi¬ dowej jednowarstwowych mikropecherzyków.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze li¬ pidowy produkt wyjsciowy rozpuszcza sie w roz¬ puszczalniku, który nastepnie odparowywuje sie i otrzymana warstwe lipidu dysperguje w wodnym roztworze i miesza w ciagu okresu czasu wystarcza¬ jaco dlugiego na wytworzenie jednowarstwowych mikropecherzyków o zdwojonej warstwie lipidowej, po czym do otrzymanego roztworu dodaje sie anty¬ genowa proteina i ponownie miesza.

3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze lipidowy produkt wyjsciowy dodaje sie do wodnego roztworu, powoli ogrzewa i nastepnie miesza w ciagu okresu czasu wystarczajaco dlugiego do wy¬ tworzenia jednowarstwowych mikropecherzyków o zdwojonej warstwie lipidowej, po czym dodaje sie antygenowa proteine i otrzymana mieszanine ponownie miesza.

4. Sposób wedlug zastrz. 1 albo 2 albo 3, zna¬ mienny tym, ze jako lipid stosuje sie lecytyne.

5. Sposób wedlug zastrz. 1 albo 2 albo 3, znamien¬ ny tym, ze jako wzmacniacz mikropecherzyków sto¬ suje sie cholesterol. 20 30 35 45 50 55 65

6. Sposób wedlug zastrz. 1 albo 2 albo 3, znamien¬ ny tym, ze stosuje sie antygenowa proteine pocho¬ dzaca od chorobotwórczego mikroorganizmu.

7. Sposób wedlug zastrz. 1 albo 2 albo 3, zna¬ mienny tym, ze stosuje sie antygenowa proteine pochodzaca od wirusa.

8. Sposób wedlug zastrz. 7, znamienny tym, ze sto¬ suje sie antygenowa proteine pochodzaca od wirusa grypy.

9. Sposób wedlug zastrz. 1 albo 2 albo 3, znamien¬ ny tym, ze stosuje sie antygenowa proteine pocho¬ dzaca od pierwotniaków.

10. Sposób wedlug zastrz. 1 albo 2 albo 3, zna¬ mienny tym, ze stosuje sie antygenowa proteine pochodzaca od bakterii.

11. Sposób wedlug zastrz. 1, albo 2 albo 3, zna¬ mienny tym, ze stosuje sie antygenowa proteine z wprowadzona hydrofobowa grupa zdolna do wia¬ zania sie z mikropecherzykami.

12. Sposób wedlug zastrz. 1 albo 2 albo 3, znamien¬ ny tym, ze mieszanie prowadzi sie az do wytworze¬ nia jednowarstwowych mikropecherzyków o wiel¬ kosci 20—200 nm.

13. Sposób wedlug zastrz. 1 albo 2 albo 3, zna¬ mienny tym, ze mieszanie prowadzi sie.za pomoca ultradzwieków, korzystnie stosujac jako roztwór wodny roztwór buforowany fosforanem.

14. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze jako rozpuszczalnik stosuje sie chloroform.

15. Sposób wytwarzania nowego preparatu anty¬ genowego, zawierajacego znaczna ilosc mikropeche¬ rzyków, zwiazanych z antygenowa proteina, pocho¬ dzaca od organizmu chorobotwórczego, znamienny tym, ze mieszanine lipidu, wodnego srodowiska i an¬ tygenowej proteiny miesza sie w ciagu okresu czasu wystarczajaco dlugiego na wytworzenie jednowar¬ stwowych mikropecherzyków o zdwojonej warstwie lipidowej, z której zewnetrzna powierzchnia zwiaza¬ na jest antygenowa proteina.

16. Sposób wedlug zastrz. 15, znamienny tym, ze lipidowy produkt wyjsciowy rozpuszcza sie w roz¬ puszczalniku, który nastepnie odparowuje sie i otrzymana warstwe lipidu dysperguje w wodnym roztworze lipidu i miesza, a nastepnie do otrzyma¬ nego roztworu dodaje sie antygenowa proteine i po¬ nownie miesza w ciagu okresu czasu wystarczajaco dlugiego na wytworzenie jednowarstwowych mikro¬ pecherzyków o zdwojonej warstwie lipidowej z któ¬ rej zewnetrzna powierzchnia zwiazana jest antyge¬ nowa proteina.

17. Sposób wedlug zastrz. 15, znamienny tym, ze lipidowy produkt wyjsciowy dodaje sie do wodnego roztworu, powoli ogrzewa i nastepnie miesza, po czym dodaje sie antygenowa proteine i otrzymana mieszanine ponownie miesza w ciagu okresu czasu dostatecznie dlugiego na wytworzenie jednowar¬ stwowych mikropecherzyków o zdwojonej warstwie lipidowej, z której zewnetrzna powierzchnia zwia¬ zana jest antygenowa proteina.

18. Sposób wedlug zastrz. 15, znamienny tym, ze roztwór lipidowego produktu wyjsciowego w alka- nolu, korzystnie w etanolu wtryskuje sie szybko do wodnego roztworu i otrzymany preparat lipozomowy103 082 13 14 steza sie przez ultrasaczenie, korzystnie w atmosfe¬ rze azotu i pod cisnieniem nizszym od atmosferycz¬ nego, a nastepnie dodaje sie antygenowa proteine i miesza w ciagu okresu czasu dostatecznie dlugiego na wytworzenie jednowarstwowych mikropecherzy- ków o zdwojonej warstwie lipidowej, z której ze¬ wnetrzna powierzchnia zwiazana jest antygenowa proteina.

19. Sposób wedlug zastrz. 15 albo 16 albo 17 albo 18, znamienny tym, ze jako lipid stosuje sie lecy¬ tyne.

20. Sposób wedlug zastrz. 15 albo 16 albo 17 albo 18, znamienny tym, ze jako wzmacniacz mikropeche- cherzyków stosuje sie cholesterol.

21. Sposób wedlug zastrz. 15 albo 16 albo 17 albo 18, znamienny tym, ze stosuje sie antygenowa pro¬ teine pochodzaca od chorobotwórczego mikroorga¬ nizmu.

22. Sposób wedlug zastrz. 15 albo 16 albo 17 albo 18, znamienny tym, ze stosuje sie antygenowa pro¬ teine pochodzaca od wirusa. 10 15 20

23. Sposób wedlug zastrz. 15 albo 16 albo 17 albo 18, znamienny tym, ze stosuje sie antygenowa pro¬ teine pochodzaca od wirusa grypy.

24. Sposób wedlug zastrz. 15 albo 16 albo 17 albo 18, znamienny tym, ze stosuje sie antygenowa pro¬ teine pochodzaca od pierwotniaków.

25. Sposób wedlug zastrz. 15 albo 16 albo 17 albo 18, znamienny tym, ze stosuje sie antygenowa pro^ teine pochodzaca od bakterii.

26. Sposób wedlug zastrz. 15 albo 16 albo 17 albo 18, znamienny tym, ze stosuje sie antygenowa pro¬ teine z wprowadzona hydrofobowa grupa zdolna do wiazania sie z mikropecherzykami.

27. Sposób wedlug zastrz. 15 albo 16 albo 17 albo 18, znamienny tym, ze mieszanie prowadzi sie az do wytworzenia jednowarstwowych pecherzyków o wielkosci 20—200 nm.

28. Sposób wedlug zastrz. 15 albo 16 albo 17 albo 18, znamienny tym, ze mieszanie prowadzi sie za po¬ moca ultradzwieków, korzystnie stosujac jako roz¬ twór wodny roztwór buforowany fosforanem.

29. Sposób wedlug zastrz. 16, znamienny tym, ze jako rozpuszczalnik stosuje sie chloroform.