JP2001502299A

JP2001502299A - リポソーム

Info

Publication number: JP2001502299A
Application number: JP10513398A
Authority: JP
Inventors: グレゴリーグレゴリアディス
Original assignee: リポゼンリミテッド
Priority date: 1996-09-13
Filing date: 1997-09-15
Publication date: 2001-02-20
Also published as: CN1237102A; ATE395904T1; CA2271388A1; US7790696B2; ES2305157T3; EP1254657A3; AU4215497A; ATE228824T1; DE69738719D1; KR100507660B1; DE69717661T2; AU728581B2; EP1254657A2; EP0938298A1; CA2271388C; EP1254657B1; EP0938298B1; WO1998010748A1; KR20000036088A; CN1138533C

Abstract

(57)【要約】小胞内スペースにポリヌクレオチドを取り込んだカチオン性リポソームが記載されている。該リポソームはDOTAPといったカチオン性脂質等のカチオン性成分を含有する。リポソーム形成方法は、好ましくはポリヌクレオチド存在下で脱水-再水和方法を使用するものである。ポリヌクレオチドは、好ましくは所望の免疫応答を誘導し得る抗原をコードするものであり、すなわち遺伝子ワクチンである。

Description

【発明の詳細な説明】リポソーム本発明は所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するリポソーム組成物に関する。当該ポリヌクレオドは、好ましくは、例えば感染性微生物に対する予防免疫化又は免疫療法処置を目的として、対象物に所望の免疫応答を誘導するのに有用な免疫原性ポリペプチドをコードするものである。当該リポソームは、好ましくは少なくとも一種のカチオン性に荷電した脂質を含み、また好ましくは脱水−再水和技術によって作成されたものである。種々の目的で、遺伝的材料をヒト若しくは動物の体内に導入することは知られている。１９６０年中頃、該技術は、正常な遺伝子配列をその欠陥対応物を保有するヒトの細胞中に導入することによって、遺伝的疾患の治療に使用できることが示唆された。現今、遺伝子療法によって遺伝性の種々の遺伝子疾患を治療する方法が試みとして進行中である。例えば、ＣＦ膜貫通性コンダクタンス調整因子をコードするＤＮＡを導入することによる嚢胞性線維症の治療に関して、かなりの量の研究が行なわれている。遺伝子産物が肺において要求されてから、遺伝子を肺に直接、または経鼻的に届ける試みがなされている。より最近、遺伝子治療が癌治療のために提案されている。例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）又はインターロイキン−２をコードする遺伝子を、リンパ球又は腫瘍細胞に導入することによって、免疫応答を刺激し、結果として腫瘍を破壊することが期待される。加えて、ヒトクラス１主要組織適合性抗原（ＨＬＡ−Ｂ７）をコードする遺伝子を、該抗原を発現し得ない患者の腫瘍細胞に導入することによって、該抗原に対する免疫応答を刺激し、その結果腫瘍細胞を破壊することが期待される。遺伝子治療において、多種のベクターが核酸のデリバリー及び発現のために提案されている（Mulligan，1993）。これらはウイルス類（例えばレトロウイルス及びアデノウイルス）及び非ウイルス性ベクター（例えばカチオン性ポリマー及びベジクル）を包含する。しかしながら、これらのベクターにはそれぞれ欠点がある。例えば細胞染色体へのレトロウイルスの組み込みにおける副作用の可能性、ウイルス性蛋白に対する免疫応答を促進して長期の治療を妨げる（Kay et al ，1994）、並びに非ウイルス性ベクターによる一過性若しくは効率の低いトランスフェクション（Legendre及びSzoka，1995）等である。それにもかかわらず、非ウイルス性ベクターへのＤＮＡの組み込みが比較的簡単であり、しばしばＤＮＡサイズ及び構造に関係せず、またそれらの非病原性ゆえに、これらのベクターが魅力的な選択肢となっている。実際に、in vitroにおいて高いトランスフェクション指数（Felgner，1991）を示し、また実験動物において低いか若しくは適度なトランスフェクション（Altonら，1993;Zhuら，1993）を示す構築物（予め形成されたカチオン性小胞(vesicle)とブラスミドＤＮＡとの複合体）が現在開発されている。一方、そのような複合体の強い毒性（Razら，1994）及びＤＮＡ転移効率を促進し得る他の剤との組合せができないことから、それらのin viv oにおける有用性は、核酸を通常のリポソーム内に組み込む場合のようには、有望でないかもしれない。これらは、適切にデザインされると（小胞サイズ、表面電荷及び脂質組成の点で）、血液循環系に安定に保持され（Scherphofら，1983; Gregoriadis，1995）、かくして血漿中のヌクレアーゼからその核酸内容物が保護されるか又は最適使用に導くクリアランス割合を達成する（Gregoriadis，199 5）。更に、長期に循環するリポソーム(long circulating liposome)表面への細胞特異的リガンドの接合は、核酸を優先的に標的細胞に導く（Gregoriadis，1995）。他の剤の核酸含有リポソームへの組み込みは、また、それらを融合誘導性とし、それらの内容物のエンドソームから細胞質への逸脱を促進し、またＤＮＡの核への輸送を促進させる（Legendre 及びSzoka，1995）。しかしながら、ＤＮＡをリポソームに取り込むための多くの技術（Gregoriadis，1993）は役に立たず、そのサイズ又は使用条件（例えば超音波処理、有機洗浄剤及び溶媒）が適合せず、ＤＮＡの完全性に有害であるかもしれない。国際公開第９１１７４２４号（WO-A-9117424）(Vical,Inc)には、正及び負に荷電した脂質種と、改善された細胞間デリバリーを有する活性化合物との種々の複合体が記載されている。カチオン性リポソームへのポリヌクレオチドの組み込み率の低さは、予め形成された正に荷電したリポソームとポリヌクレオチド（負に荷電したもの）とからなる全体として正に荷電した複合体を、引き続いて、予め形成された負に荷電した過剰量のリポソームと会合させて、正に荷電した上記複合体を被覆する方法によって解消できることが示唆されている。しかしながら、ポリヌクレオチドは小胞内部に組み込まれないので、血漿中のヌクレアーゼの影響を受けやすいと考えられる。米国特許公報第4,897,355号（US-A-4,897,355）において、エプスタインら（E ppstein et al(Syntex)）は、活性化合物の細胞間デリバリーに用いるための、カチオン性脂質から形成されるリポソームを記載している。活性化合物の一つの例は、ポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドとしては、例えば酵素欠損状態において使用される酵素、ホルモン交換療法に用いられたり、血液凝固因子、神経伝達物質、抗ウイルス性化合物及び抗癌化合物、若しくは特定蛋白の発現を選択的に停止するためのアンチセンスＲＮＡのデリバリーのために使用されるホルモン類をコードするものがあげられる。これらの活性化合物は、予め形成された空のリポソームと混合され、必要に応じて、該抱合体は引き続いて更に予め形成されたリポソームと混合される。ジャーナルオブドラッグターゲティング、1996年（Journal of Drug Ta rgeting，1996）（印刷中）において、グレゴリアディス（Gregoriadis）らは、脱水−再水和技術を利用して作られた、遺伝子治療に用いられる、ＤＮＡを組み込んだリポソームの形成について記載している。１９９５年の会議「医薬のターゲティング：治療におけるオリゴヌクレオチド及び遺伝子デリバリーのための戦略（Targeting of Drugs:Strategies for Oligonucleotide and Gene Deliver y in Therapy）」及びその後の該会議の報告書（G.Gregoriadis及びB McCormack 編、1996年、Plenum Press，New York発行）にて、ディビス（Davis）は、遺伝子療法のために細胞内に導入された遺伝子産物に対する好ましくない免疫応答について議論している。彼女は、遺伝子の細胞内導入において誘発される免疫応答に関する研究が、遺伝子療法処置の最適化並びに遺伝子転移のＤＮＡ−ワクチン化（ＤＮＡを基礎とする免疫化）への適用に、どれほど重要であるかを示唆する。彼女は遺伝子ワクチンが抗原を基礎とするワクチンよりも多くの利点を有することを述べ、また裸のＤＮＡ(naked DNA)を、Ｂ型肝炎表面抗原（HBsAg）に対するＤＮＡを基礎とする免疫化のために使用した、いくつかの結果を述べている。同じ会議にて、ベール（Behr）は、ＤＮＡを凝縮しながらＤＮＡ周辺に自己集合するとされるリポポリアミン類からなる、遺伝子治療のためのポリヌクレオチド配列用の合成担体について述べた。該ポリヌクレオチドは細胞核に到達することを意図している。本発明者は、上記自己集合した粒子は２重層によって構成されていないので、リポソームと定義されないと信じる。１９９６年１０月２３及び２４日にワシントン（Washington DC，USA）において開催された、ＩＰＣの第２回アニュアル会議「遺伝的ワクチン及び免疫療法戦略（Genetic Vaccines and Immunotherapeutic Strategies）」に関連する予備会議の報告は、フェルグナー（Felgner）がカチオン性脂質を用いて抗原をコードする遺伝子のデリバリーを改善した最近の研究について述べたことを示している。当該遺伝子は経鼻的に肺組織に運ばれて粘膜の免疫を刺激する。また同じ会議にて、レッドリー（Ledley）は、バイオアベイラビリティー及びＤＮＡの粘膜細胞への導入を制御するカチオン性脂質からなる遺伝子デリバリーシステムについて述べたことが明確に示されている。その意図は効果的な免疫応答を設計することにある。予備会議での発表は、遺伝子デリバリーがどのようにして行なわれるかについての更なる情報は何ら与えるものではない。リポソームデリバリーシステムにおいては、ポリヌクレオチドの被包割合を増加させることが望ましい。更に、遺伝子が投与された動物の循環系における遺伝子産物、特に治療的産物のレベルを増加させるのが望ましい。更に、遺伝子産物が抗原である場合には、標的細胞に対する遺伝子のデリバリー率を増加させるのが望ましい。更に、所望の免疫応答を誘導するのに有用な免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの、改善されたデリバリーを提供するのが望ましい。本発明の第１の側面は、リポソーム及び該リポソーム内に組み込まれた、ヒト又は動物に所望の免疫応答を誘導する免疫原性ポリペプチドを機能的にコードするポリヌクレオチドを含有する新規な組成物を提供することにある。本明細書において、「取り込まれた（entrapped）」という用語は、ポリヌクレオチドが小胞内スペース中にあることを意味する。従って、リポソームは、ポリヌクレオチドの存在のもとで形成される。ここが予め形成されたリポソームとポリヌクレオチドからなる従来技術の複合体と相違するところである。本発明のこの側面において、遺伝子産物は、所望の免疫応答に対する抗原である。従って、上記ペプチドは、ウイルス類、細菌類又はカビ類等の感染性微生物の１もしくはそれ以上の抗原決定基を有する。上記方法は細菌類、カビ類及びウイルス類、特にインフルエンザ、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎に対する免疫化に特に有用である。それ故、遺伝子産物は、HBsAg又はＣ型肝炎核蛋白又はインフルエンザ抗原又は抗原性ＨＩＶペプチド若しくはその断片であることができる。本発明はまた、遺伝子産物が１以上の単純ヘルペスウイルス蛋白類、ＳＶ４０のような癌ウイルス産物又は癌抗原、結核抗原類及び例えばマラリアのような寄生虫のような、より複雑な微生物の抗原類である場合に、価値あるものである。本発明では、リポソームを取り込むための標的細胞は、筋肉，皮膚，肝臓，脾臓の破壊すべき癌細胞、鼻又は肺又は腸等の粘膜細胞、及び特にリンパ腺細胞であることができる。遺伝子ワクチンの標的細胞は、一般に、抗原提示細胞である。この組成物は、例えば静脈注射などにより全身的に投与するか、或いは例えば鼻腔内、筋肉内若しくは皮内に注射することにより、標的組織に直接投与するか、又は経皮的若しくは経口的にも投与できる。本発明によれば、初めて、リポソームを皮下投与して免疫応答をうまく生じさせることができた。従って、該組成物を皮下投与することは、本発明の好ましい一面である。本明細書では、用語「リポソーム」は、場合によっては非脂質成分と組み合わせて、通常、脂質を含む成分から形成される二重層で囲まれた小胞を意味する。標的組織の認識に適した、例えば抗体等のターゲッティング成分をリポソームの外表面に付けることは望ましいことであろう。例えば、該組成物を循環系に投与すると、リポソームの外表面に付着した細胞特異的リガンドは、核酸を標的細胞に導くであろう(グレゴリアディス（Gregoriadis），1995)。遺伝子は、所望の生成物を標的細胞中で産生できる様な形態で存在すべきであり、このため標的細胞での発現を容易にする調節成分を含むことが好ましい。従って、ポリヌクレオチドは、リボソーム結合を仲介する領域と共にプロモーターを含み、必要に応じて遺伝子発現を増強するであろう他の領域も含む。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡでも良いが、ＤＮＡが好ましい。本発明のこの側面では数週間又は２、３ヶ月以上の過渡活性が通常適当なので、一般にプラスミド、好ましくは、実質的に非複製性プラスミドの形態である。本発明のこの側面では、リポソームを形成するために用いられるリポソーム形成成分は、中性、両性、アニオン性、及び／又はカチオン性の脂質部分を含むことができる。これらは、リポソームに全体として電荷を与える様な相対量で使用できる。また、あまり好ましくないが、リポソームは、全体として電荷を有していなくても良い。リポソームが全体として正電荷を有する様に脂質成分を用いることは、抗原コード遺伝子のデリバリーに用いると免疫応答を増加させるという点で、本発明のこの側面に改善結果を与えることが判っている。リポソーム形成成分は、適切に名付けられた脂質（グリセリド及びコレステロールを含む）である成分に加えて、非イオン性又はカチオン性界面活性剤等の非脂質成分（即ち、天然に生じる脂質ではない）を含むことができる。本発明の特に好ましい態様では、この新規な組成物は、少なくとも一種のカチオン性荷電成分を、リポソームが全体として正電荷を有する量で含むリポソーム形成成分から形成されたリポソームを含有する。これが、ポリヌクレオチドがカチオン性リポソームに取り込まれた最初のものであると思われる。従って、本発明の第二の側面では、少なくとも一種のカチオン性荷電成分と、所望のポリペプチド生成物をコードするポリヌクレオチドとを含むリポソーム形成成分から形成され、かつ該ポリヌクレオチドがリポソームに取り込まれていることを特徴とするリポソームが提供される。こうして、本発明者は、In vitro系において、ルシフェラーゼ標識蛋白をコードするＤＮＡを取り込むことにより、非荷電のリポソーム又はアニオン性に荷電されたリポソームを用いた他の方法と比べて、ルシフェラーゼの発現レベルが増加することを証明した。発現レベルは、予め形成されたカチオン性荷電リポソームの複合体（商業的に入手可能なLipofe ctAMINE（商標名））を用いる場合より低かったが、取り込みにより、この複合体と比べてヌクレアーゼの攻撃に対する抵抗性の改善がin vivoで示されると予測される。加えて、このリポソームは急激に凝集することはないが、このような凝集は、予め形成されたリポソーム−ポリヌクレオチドの混合系については、特に、血清蛋白の存在下で生じることがあることが認められている。ポリヌクレオチドの取り込みは、リポソーム表面に標的リガンドを与えるか、又は取り込まれた有効成分を有するリポソームに他の表面処理を施すことについて、より大きな自由度を与える。遺伝子産物が所望の免疫応答を誘導する抗原であれば、モデル蛋白ルシフェラーゼの高レベルの発現が示されると予測される。種々の経路による、リポソーム−取り込みｐＲｃ／ＣＭＶＨＢＳ（Ｂ型肝炎表面抗原；サブタイプａｙｗのＳ領域をコード）を用いたマウスのワクチン接種の結果、マウスが同系繁殖体（Ｂａｌｂ／ｃ）又は異系繁殖体（Ｔ／ｏ）であるか否か、また注射の経路（筋内,ｉｍ；皮下,ｓｃ；静脈,ｉｖ；腹腔内,ｉｐ）とは無関係に、体液性及び細胞性の免疫応答を示すことが実験により確認された。この様な応答は、多くの場合、同じ条件下で裸のＤＮＡを用いて得られた応答よりも有意に大きい（下記実施例５参照）。本発明のこの態様において、リポソームに組み入れられるカチオン成分は、ポリヌクレオチドとの複合化によってトランスフェクション率を向上するためにリポソーム調製物で使用されている如何なるものでもよい。この成分は、脂質又は非脂質化合物のどちらでもよく、合成品又は天然品のどちらでもよい。好ましいカチオン性脂質は、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）ブロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ビス（ヘキサデシルオキシ）−３− トリメチルアミノプロパン（ＢｉｓＢＯＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）及び引用によりここに援用されたＵＳ−Ａ−４，８９７，３５５で定義された構造Ｉを有する他の脂質又はエステル類似体である。この構造は、下記式、又はその光学異性体である：（式中、Ｙ¹及びＹ²は、同一又は異なって、−Ｏ−又はＯ−Ｃ（Ｏ）−であり、この場合カルボニル炭素は、場合により、Ｒ²又はＲ¹に結合する；Ｒ¹及びＲ²はそれぞれ独立して炭素数６〜２４のアルキル基、アルケニル基、又はアルキニル基であり、Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵は、それぞれ独立して、水素、炭素数１〜８のアルキル、炭素数６〜１１のアリール又はアラルキルであり；或いは、Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵の二個又は三個は正電荷を有する窒素原子と結合して原子数５〜８の環状構造を形成し、この場合、正電荷を有する窒素原子に加えて、この構造中の原子は炭素原子であり、一個の酸素、窒素又は硫黄原子を含むことができる；ｎは１〜８であり；Ｘはアニオンである。）。好ましい具体例は、Ｒ¹とＲ²がそれぞれ０〜６個の不飽和部分を有し、下記の構造を有する組成物である。ＣＨ₃−(ＣＨ₂)a−(ＣＨ=ＣＨ-ＣＨ₂)b−(ＣＨ₂)c−（式中、ａとｃの合計は１〜２３であり、ｂは０〜６である。）最も好ましくは、Ｒ¹及びＲ²のそれぞれがオレイルである。特に好ましい具体例は、長鎖アルキル基が脂肪酸、即ち、Ｙ¹とＹ²が等しく、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−である組成物である。或いは、引用によりここに援用されたＵＳ−Ａ−５，４５９，１２７で定義された一般式Ｉ又は一般式IIのカチオン性脂質が使用できる。他の適当なカチオン性化合物は、非脂質成分ステアリルアミン及び３β［Ｎ− （Ｎ’Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバミル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）（脂質成分）である。リポソームは、カチオン性成分を含有することに加えて、一般に、脂質を含む非イオン性及び／又は両性成分も含有し、これはリン脂質又はホスホリル基を含まない他の脂質であっても良い。該脂質には、好ましくは天然又は合成のホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン等のリン脂質が含まれ、これらのいずれにおいても、長鎖アルキル基（エステル又はエーテル結合を介して結合しても良い）は、飽和又は不飽和のいずれであっても良い。好ましくは、グリセリド脂質のアシル基は不飽和である。この成分は、非脂質成分、例えば、脂肪酸のソルビタンモノエステル等の非イオン性界面活性剤、及び／又はエトキシ化ラノリン等のエトキシ化脂肪酸又は他の類似物を含んでもよい。最良の結果は、リポソームが融合誘導性の脂質、すなわち通常はアシル基が不飽和化されたホスファチジルエタノールアミンを含む場合に達成される。コレステロールは、標的細胞へのポリヌクレオチドの適当なデリバリーに対してリポソームを安定化し過ぎると思われるが、含まれていても良い。カチオン成分の量は、好ましくは、リポソーム形成成分の全モル数の５〜５０％の範囲、好ましくは１０〜２５モル％の範囲である。リポソーム組成物は、一般に、例えば生理緩衝液等の水性懸濁液の形態である。或いは、再水和用の乾燥組成物とすることもできる。このリポソームは、一般に用いられている如何なるリポソーム形成技術でも調製できる。生成物であるリポソームは、多重膜又は単層膜の小胞とすることができ、比較的大型（小胞直径が３００ｎｍ〜２０００ｎｍの範囲であり、好ましくは平均直径が５００〜１０００ｎｍの範囲である）、又は小型（小胞直径が１００ｎｍ〜４００ｎｍの範囲であり、好ましくは平均直径が２００〜３００ｎｍの範囲である）とすることができる。好ましくはリポソームの平均直径は５００ｎｍ以下であり、好ましくは実質的に全てリポソームの直径が２０００ｎｍ未満である。リポソームは、好ましくは小胞を形成し、取り込むヌクレオチドと混合し、次いで脱水、好ましくは凍結乾燥を行い、続いて水性組成物中で再水和させて、脱水−再水和小胞(dehydration-rehydration vesicles，DRV)とし、好ましくは、引き続いて微小流動化(micro fluidizaton)を行って平均サイズを減少させる方法により形成される。好ましくは、取り込まれなかった非捕捉物質は、再水和及び／又は微小流動化工程の後に、遠心分離又は分子篩クロマトグラフィーにより、リポソームから分離される。本発明者は、ＤＲＶを使用することによりポリヌクレオチドの取り込みレベルを増加できることを立証した。本発明の第一の方法の態様によれば、下記の工程を含む、ポリヌクレオチドをリポソームに取り込む方法が提供される：１．ヒト又は動物において所望の免疫応答を引き起こすために有用な免疫原性ポリペプチドを機能的にコードする裸のポリヌクレオチド、及び予め形成されたリポソームを含む水性懸濁液を形成する、２．該水性懸濁液を凍結乾燥する、３．工程２の生成物を再水和する、４．工程３で得られた脱水、再水和された小胞の水性懸濁液を微小流動化（microfluidization）させる、５．必要に応じて、取り込まれなかったポリヌクレオチドをリポソームから分離する。本発明の第二の方法の態様によれば、下記の工程を含む、ポリヌクレオチドをリポソームに取り込む方法が提供される：１．裸のヌクレオチド及び予め形成されたカチオン性リポソームを含む水性懸濁液を形成する、２．該水性懸濁液を凍結乾燥する、３．工程２の生成物を再水和する、４．必要に応じて、工程３からのＤＲＶ’ｓの水性懸濁液を微小流動化させる、５．取り込まれなかったポリヌクレオチドをリポソームから分離する。本発明の両方法の態様における脱水−再水和は、実質的にキルビー及びグレゴリアディス，1984（Kirby and Gregoriadis，1984）に記載され、その内容は引用によりここに援用される。従って、工程１のリポソームは小さな単重層の小胞（SUV's）であり、工程３で作成されたものは好ましくは多重層のリポソーム（M LV's）である。工程３で生成されたリポソームは、一般に脱水−再水和小胞（DR V's）と称される。このＤＲＶの微小流動化は、実質的にWO-A-92/04009に記載のように実施される。その開示は引用及びにグレゴリアディスら，1990（Gregoriadis et al，1990）によってここに援用される。本発明者は、ＤＲＶ技術を使用することにより、全体として約10％もの溶質取り込み率を達成し得ることを立証した。本発明者は、凍結乾燥工程に供される水性懸濁液中のポリヌクレオチドの90％或いはそれ以上がリポソーム内に取り込まれることを立証した。さらに、微小流動化によれば、その間に、取り込まれたポリヌクレオチドの割合が減少するにもかかわらず、10％を超える、例えば50％までのポリヌクレオチドの取り込み率が達成できる。リポソーム組成物中のポリヌクレオチドの取り込みレベルは、好ましくは0.05〜5、好ましくは0.1〜1.0、さらに好ましくは0.2〜0.5μｇ/μｍｏｌｅ脂質の範囲（又は脂質ｍｇ当たり0.1〜 10μｇDNAの範囲）である。本発明のこの態様は、第一の二つの態様のリポソーム調製物を作成するために好適に使用される。本発明の第二の生成物及び第二の方法の側面において、ポリヌクレオチドは、好ましくは対象物に所望の免疫応答を誘導する有用な免疫原性ポリペプチドを機能的にコードするものであるが、また、例えば遺伝子置換療法、遺伝子増強療法、遺伝子免疫療法（例えば、ガン治療における）、治療的に活性なポリペプチドをコードする遺伝子の導入及び細胞毒素（すなわち、例えばガン細胞を殺傷するといった細胞に有毒な化合物）をコードする遺伝子の導入といった、他の応用における遺伝子のデリバリーにも有用かもしれない。本発明はまた、治療若しくは予防方法に用いられる組成物の製造における、本発明の新規リポソーム又は本発明の新規方法により製造されるリポソームの使用を包含する。例えば、上記治療又は予防方法は、感染性微生物による感染に対する防御を目的とするヒト又は動物の免疫化（ワクチン接種）であり得る。また、免疫応答は、例えばガン治療のための免疫療法に有用な遺伝子産物によって生じ得る。さらにまた、ポリヌクレオチドが遺伝子増強又は遺伝子置換療法に有用であるかもしれない。本発明は、また、ヒト若しくは動物細胞のトランスフェクションにおける、第一若しくは第二の態様の新規組成物又は本発明方法の生成物の新規なin vitro用法を提供する。上記細胞は、引き続いてin vitroで培養されてもよく、及び／又は、引き続いて該細胞が除去された患者に移植されてもよい。このように本発明は、例えば、その内容が引用によりここに援用されているWO-A-93/14778に記載されるタイブの、ex vivo移植法を包含するものである。また本発明は、本発明の第一の態様のリポソーム組成物若しくは第二の態様の生成物、並びに薬学的に許容される担体を含む、新しい薬学的組成物を供給する。該組成物は、例えば静脈（i.v.）、筋内（i.m.）、腹腔内（i.p.）、経口又は皮下（s.c.）といった注射による投与に適しているかもしれない。また、当該組成物は、鼻腔内投与、又は吸入による肺への直接的なデリバリー（輸送）又はトランスサーマル（transthermal）デリバリーに適している。リポソーム投与に用いられる通常の薬学的担体が使用できる。従来裸のDNAがワクチンとして使用される場合、筋肉に対する損傷を回避し、また信頼できる同等な結果を得るべく同じ位置に正確に注射するために、特別に高度にコントロールされた注射プロトコルに従わなくてはならないが、本発明者は、本発明によれば、筋肉内投与技術（ im technique）を用いたcDNAの注射も可能であることを見出した。例えば、筋肉再生剤を予め投与しておくと応答が向上することを見いだした。本発明は、新規な薬学的組成物をヒト又は動物に投与する処置方法をも提供する。従って、当該方法はポリヌクレオチドによりコードされた抗原、例えば感染性微生物因子の抗原に対して免疫応答を引き起こす方法でもよい。また、該方法は、遺伝子置換若しくは遺伝子増強治療のため、例えばガン治療用の免疫治療のため、又は薬理学的に有用なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与するための方法でもあってもよい。本発明を下記の実施例で例証する。いくつかの実施例では、ルシフェラーゼをコードするDNAがモデルポリヌクレオチドとして使用されている。ルシフェラーゼはモデル遺伝子産物である。図面は、以下に示すように、実施例のいくつかの結果を示す。図１は、実施例２，表４に記載の結果を示す一連の棒グラフである。図２は、実施例３の結果を示す一連の棒グラフである。図３は、実施例４の結果を示す一連の棒グラフである。図４〜８は、実施例５の結果を示す一連の棒グラフである。実施例１ −ルシフェラーゼをコードするDNAの取り込み及び複合化、並びに細胞のin vitroトランスフェクション材料卵のホスファチジルコリン（PC）、ステアリルアミン（SA）及び1,2-ビス（ヘキサデシルオキシ）-3-トリメチルアミノプロパン（BisHOP）の入手先及びグレードは、他文献に記載されている（タン及びグレゴリアディス（Tan and Gregoriadis）、1989）。N[1-（2,3-ジオレイルオキシ）プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウム（DOTMA）は、ジーンメディシン（GeneMedicine）（ヒューストン、テキサス、USA（Houston，Texa s，USA））から贈られた。ホスファチジルセリン（PS）及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）は、シグマケミカル社（Sigma Chemical Co. ）（プール、ドーセット、UK（Poole，Dorset，UK））から入手した。SV40プロモーター由来のルシフェラーゼリポーター遺伝子を発現させる真核生物の発現ベクターpGL2-コントロール（p （Promega）（サウザンプトン、UK（Southampton，UK））から購入した。ギブコ BRL（Gibco BRL）（ペイスリー、UK（Paisly，UK））から入手したカチオン性の LipofectAMINEを、使用前に、15：1（wt：st）の割合でGLUTAMAX 1（ギブコBRL ）を含有する0ptiMEM 1還元血清培地(OptiMEM 1 reduced serum medium)中でpGL 2と複合した。デオキシリボヌクレアーゼＩ（牛の膵臓、タイプII；比活性：250 0 Kunitz units mg^-1プロテイン）をシグマケミカル社から入手した。RQ1デオキシリボヌクレアーゼ（1 unit μｌ^-1）及びルシフェラーゼアッセイシステムキットをプロメガ社から購入した。該pGL2プラスミドDNAを、ウイーラー及びコーテル（Wheeler and Coute lle）（1995）の方法により³⁵S-dATP（37kBq；ICNフロー（ICN Flow）、テム（T hame）、UK）で放射線標識を行った。他のすべての試薬は分析用グレードである。方法リポソームへのプラスミドDNAの取り込み脱水−再水和方法（Kirby and Gregoriadis，1984）を、pGL2プラスミドDNAをリポソームへ組み込むために使用した。すなわち、PC(16μｍｏｌｅ)及びDOPE（モル比1：1）；PC（16μｍｏｌｅ）、DOPE及びPS（モル比1：1：0.5；負電荷）；PC（16μｍｏｌｅ）、DOPE及びSA、又はBisHOP（モル比1：1：0.5；正電荷）；PC（16μｍｏｌｅ）、DOPE及びDOTMA（モル比1：1：0.25；正電荷）；並びにD OPE（16μｍｏｌｅ）及びDOTMA（モル比1：0.25；正電荷）、からなる2mlの小さい一重層小胞（SUV）を、記載されているようにして調製し（Kirby and Gregori adis，1984）、トレーサー³⁵S-標識プラスミドDNA pGL2（6×10⁴-7×10⁴dpm）を添加したpGL-2 10-100μｇ（10-100μｌ）と混合し、次いで凍結乾燥を一晩行った。コントロールされた脱水（Kirb y and Gregoriadis，1984）、並びに多重層の脱水−再水和小胞（DRV）の生成（ Gregoriadis et al，1993）に次いで、40,000xgで25分間遠心分離を行って、取り込まれなかったDNAを除去した。該リポソームのペレットを、0.9％のNaClを補足した0.1Mのリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.2、PBS）に懸濁し、再び遠心分離した。洗浄したペレットをPBS中で再び懸濁し、次の使用まで4℃で保管した。分離実験において、混合物中に遊離した上記のDNA−組み込みDRV、非組み込みDNA（即ち、遠心分離前）を、マイクロフルイダイザーM110S（Microfluidizer M110S ）（Microfluidics，Newton，MA，USA）中で、3回又は1、2、3、5及び10回かけて、微小流動化（Gregoriadis et al，1990）した（PC:DOPE-:DOTMA リポソームのみ）。微小流動化されたリポソーム中の遊離DNAから、組み込みDNAを、上記の遠心分離（1、2、3及び5回）又はセファロース4B CLカラム（Pharmacia）を用いた分子篩クロマトグラフィー（10回）（Gregoriadis et al，1990）によって分離した。いくつかの実験において、予め形成された（DNA-フリー）DRVを10又は5 0μｇのDNAと混合し、20℃で20時間インキュベートするか、又は3回微小流動化するかのいずれかを行った。いずれの場合も前述するようにリポソームを遠心分離して、吸着されたDNAと吸着されなかったDNAとを分離した。DNAのリポソーム内への組み込み又はリポソーム表面への吸着を、懸濁ペレット（微小流動化しなかったDRV並びに1、2、3又は5回微小流動化されたDRV）又はその後のクロマトグラフィー（10回）での溶出確画分中に回収される³⁵Ｓ放射能に基づいて評価した。光子相関分光非微小流動化及び微小流動化DRVのz-平均の平均サイズを、他文献（Gregoriad is et al，1993；Gregoriadis et al，1990）に記載のマルバーンオートサイザーIIc（Malvern Autosizer IIc）で測定した。デオキシリボヌクレアーゼとリポソームとのインキュベーション pGL2プラスミドDNA（0.75-22.5μｇ）及びトレーサー³⁵S-標識pGL2プラスミド DNAを組み込んだ、1mlのPBS中の非微小流動化DRV又は微小流動化（3回）DRVを、 100 unitsのデオキシリボヌクレアーゼＩと混合し、37℃で10分間インキュベートした。該反応を１μｌの0.5MのEDTA（pH8）で停止し、該混合物を遠心分離して、非消化のリポソームDNAから消化されたリポソームDNAを分離した。消化されたDNAを上清中の放射能に基づき評価した。予備的な実験によって、同一条件下で裸のpGL2 100μｇが完全に分解することが証明された。他の実験において、２μｇのDNAを含有する同様なリポソーム試料を、50mMのジチオスレイトール及び50μｇ/mlの牛血清アルブミン（フラクションＶ；シグマケミカル社）を含有する緩衝液で100μｌに希釈し、１ユニットのRQ1デオキシリボヌクレアーゼ（プロメガ社）と混合し37℃で30分インキュベートした。0.5M EDTA（pH8.0）1μｌを添加して、消化を停止した。アガロース−ゲル電気泳動非微小流動化又は微小流動化DNA組み込みDRVの試料を、上記のようにしてRQ1 デオキシリボヌクレアーゼの存在下若しくは非存在下でインキュベートし、次いでフェノール-クロロホルム混合液で２回抽出して脂質物質を除去した。水相中のDNAをエタノールで沈殿させ、20μｌのTE緩衝液（10mM Tris-C1，pH8.0及び1m M EDTA，pH8.0）中で再懸濁し、アガロースゲル電気泳動に供して、DNAの完全性を測定した。トランスフェクション実験 10％牛胎児血清を含有する200mMのFLUTAMAX I（Gibco BRL）を有するダルベッコ改良イーグル培地（DMEM）中で保存された猿の腎臓のCOS-7上皮細胞を、トリプシン処理により収集し、24穴プレート（Falcon）に播種し（5×10⁴cell/well）、18〜24時間インキュベートした。粘着細胞を70-80％の密集度で含有するウェルを、pH7.2のダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（Dulbecco's phosphatebuffered saline）（カルシウム及びマグネシウムを含まない）（Gibco BRL）で洗浄し、次いでGLUTAMAX Iを含有する0ptiMEM 1還元血清培地0.5ml中で、pGL2のDNA(1μｇ)を組み込んだリポソーム１μｇ（6-18μｌ）またはpGL2のDNA（1μｇ）と複合されたLipofectAMINE（およそ24μｇの脂質）でトランスフェクトした。37℃で4〜6時間インキュベートした後、トランスフェクション培地を除去し、1mlのDMEM完全培地に置換した。細胞を合計48時間インキュベートし、200μｌのリポーター溶解バッファー（rep orter lysis buffer）（プロメガ社）中にこすり落とすことによって溶菌し（ドライアイス上で凍結−溶解を１サイクル行って細胞溶解を高めた）、次いで12,0 00xgで５分間遠心分離を行って、清澄な上清を得た。ルシフェラーゼ活性を、総放出光が６０秒以上で記録されるLKB 1251照度計を使用してルシフェラーゼアッセイシステムキットで、3回ずつ測定した。各々の溶解中のタンパク濃度を、Bio -Radプロテインアッセイ溶液を用いるブラッドフォード（Bradford）（1976）の方法により測定した。ルシフェラーゼ活性は、タンパクmg当たりの相対的な光のユニットとして表した（RLU/mg）。結果プラスミドＤＮＡのリポソームへの組み込みプラスミドＤＮＡは、ＰＣ及びＤＯＰＥ、トランスフェクションを容易にすると考えられるリン脂質（レジェンドレ(Legendere)及びスゾカ（Szoka）、１９９５）を含有する中性ＤＲＶ（７１０−８４３ｎｍ直径；実施例１．１．（１−６））、並びに陰性（５９０−８７１ｎｍ、実施例１．２．（１−５））又は陽性（６４７−８９９ｎｍ；実施例１．３．（１−６）、１．４．（１−４）及び１．５（１−２））に荷電した両親媒性物質で補足された同様のリポソームに組み込まれた。荷電を有する小胞の二重層表面は、二重層間により大きな水性スペースをもたらすことが知られており（バングハム(Bangham)ら、１９７４）、このため、より大きい溶質の取り込みに寄与する。陰性に荷電したＤＮＡの場合、陽性に荷電したリポソーム（カチオン性ＤＲＶ）への組み込みのさらなる改善が、静電的な相互作用の結果として、期待される。表１は、使用された量（１０−１００μ ｇ）のそれぞれについて、中性ＤＲＶ中へのＤＮＡの組み込みがかなり（４４〜５５％）であり、陰性に荷電したＤＲＶにおいては更に一層良好である（４５〜６３％）ことを示す（実施例１．１．（１−６）及び１．２．（１−５））。しかも、ＤＮＡのほとんどは、小胞内に組み込まれたのではなくリポソームの表面に吸着されているという可能性は、ありそうもないと考えられた：予め形成されたＤＲＶを裸のＤＮＡと共にインキュベートすると、遠心分離によりＤＲＶと共に回収されたのは低い割合（１２〜１３％）だったからである（実施例１．１．７及び１．２（６−７））。組み込まれなかった（遊離）ＤＮＡの存在下で、同様のＤＮＡ組み込みＤＲＶの微小流動化を行うことにより（３回）、より小さい（２０９〜３２９ｎｍ直径）の小胞が生じ、そのＤＮＡ含量は、中性ＤＲＶの場合はかなり減少し（１０〜２０％にまで）、陰性に荷電したリポソームについてはその減少の程度は低かった（３７〜５１％にまで）（実施例１．１（１−６）及び１．２．（１−５）。また、予め形成されたＤＲＶを遊離ＤＮＡの存在下で微小流動化すると、非常に少量（６及び１０％）のＤＮＡがリポソームと共に回収された（実施例１．１．７及び１．２．（６−７））。予想されたように、カチオン性ＳＡ、ＢｉｓＨＯＰ及びＤＯＴＭＡＤＲＶへのＤＮＡの組み込みは、更に大きく（６２〜９２％）、微小流動化されたＤＲＶについてもその値は高く維持されていた（５０〜８３％）（２６９〜３８３ｎｍ；実施例１．３．（１−６）、１．４．（１−４）及び１．５．（１−２））。しかしながら、ここで、予め形成されたカチオン性ＤＲＶ（ＳＡ）を裸のＤＮＡと共にインキュベートするか又は微小流動化すると、その後には、４０〜６０％もの多くの使用物質が、おそらくは小胞表面に結合された状態で、リポソームと共に回収された（実施例１．３（７−９））。リポソームＤＮＡのデオキシリボヌクレアーゼとのインキュベーション表１は、中性リポソーム（４５〜７２％）、陰性に荷電したリポソーム（５８〜６９％）又はカチオン性リポソーム（６８〜８６％）中に組み込まれたＤＮＡのほとんどが、ＤＮａｓｅにより分解されなかったことを示す。これとは対照的に、該酵素に曝された後の、中性又は陰性に荷電した表面に吸着されたＤＮＡの回収率は低かった（１８％）（実施例１．１．７及び１．２．６）。しかし、カチオン性（ＳＡ）リポソームの表面に吸着したＤＮＡについては、そのかなりの割合（４１〜５８％）がDNaseによる分解に利用できなかった（実施例１．３．（７−８））。これは、カチオン性小胞において生じ、DNaseに対して耐性を示すことが知られている凝縮ＤＮＡ状態に起因するのかもしれない（レジェンドレ(Legendere)及びスゾカ（Szoka）、１９９５）。これら知見に鑑みると、組み込み操作終了時において、（リポソーム表面に結合されるのではなく）カチオン性リポソーム内へＤＮＡが組み込まれる程度を、正確に見積もることは困難である。 DNaseに対するリポソームＤＮＡの脆弱性の結果は、裸若しくはリポソームのＤＮＡ試料をＲＱ１デオキシリボヌクレアーゼに曝し、次いでアガロースゲル電気泳動に供する実験において十分確認された。染色度の強さ及びスミアリング（ smearing）の出現に基づくと、裸のプラスミドＤＮＡは完全に消化されたが、カチオン性リポソーム内に取り込まれたＤＮＡは十分に保護されていることが判る。一方、中性及び陰性に荷電したＤＲＶ中のＤＮＡは、DNase非消化試料と比べて、消化試料はより薄いバンドであったことからわかるように、充分に保護されている程度は低かった。リポソーム性ｐＧＬ２プラスミドＤＮＡでのトランスフェクションＣＯＳ−７細胞を、非微小流動化ＤＲＶリポソームに組み込まれたｐＧＬ２プラスミドＤＮＡ又はLipofectAMINEと複合化されたｐＧＬ２プラスミドＤＮＡ（コントロールとして）でトランスフェクトした実験において、バックグラウンドに対して有意なレベルのルシフェラーゼ活性が、各ＤＲＶ処方について観察された。しかしながら、カチオン性ＤＲＶ（ＤＯＰＥ：ＤＯＴＭＡ、ＰＣ：ＤＯＰＥ：ＤＯＴＭＡ及びＰＣ：ＤＯＰＥ：ＳＡ）についての活性のレベルは、中性（ＰＣ：ＤＯＰＥ）及び陰性に荷電した（ＰＣ：ＤＯＰＥ：ＰＳ）、並びにカチオン性ＰＣ：ＤＯＰＥ：ＢｉｓＨＯＰリポソームを用いて達成されたレベルに比して、約１０倍高かった（表２）。リポソームのサイズがトランスフェクションの効率に関係するかもしれないので、また１、２、３、５又は１０回の微小流動化を行なって調製した、漸進的に小さくなるサイズ（それぞれ、３８６、３１９，２６２，２３５及び１２３ｎｍのｚ−平均直径；示さず）の小胞ＤＲＶ中に組み込まれたＤＮＡを用いて、関連実験を行なった。表２は、ＰＣ：ＤＯＰＥ：ＤＯＴＭＡＤＲＶを微小流動化（３回）すると、それらのトランスフェクション効率が１０倍向上したことを示す。しかしながら、５又は１０回の微小流動化に供したＰＣ：ＤＯＰＥ：ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ：ＤＯＴＭＡ、ＰＣ：ＤＯＰＥ及びＰＥ：ＤＯＰＥ：ＰＳリポソームでのトランスフェクション実験によっては、有意なルシフェラーゼ活性を示すことができなかった（結果は示していない）。これは微小流動化により誘発されたＤＮＡの漸進的スミアリングにより説明できる。試験したすべてのＤＲＶ処方のうち、陽性に荷電したＳＡ及びＤＯＴＭＡＤＲＶが他のものよりも、より効率的であったように思われ、その微小流動化した調製物（ＤＯＴＭＡ）がトランスフェクションの最高値を示した。しかしながら、この調製物でさえも、コントロールのLipofectAMINEよりも１０〜１５倍効率の低いものであった。実施例２−in vivo トランスフェクション後の免疫応答記載された材料及び実施例１から供給された材料（及び更に３β［Ｎ−（Ｎ’ ，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）-カルバミル］コレステロール、ＤＣ−ＣＨＯＬ（シーキルビー博士(Dr C Kirby)から入手）、及びＤＯＴＡＰ−１，２−ジオレオイルオキシ−３−トリメチルアンモニウムプロパン）を使用し、in vivo でのトランスフェクション後に免疫応答を測定する実験を行なった。ポリヌクレオチドは、Ｂ型肝炎表面抗原を発現するプラスミドＤＮＡ（Ｓ領域、ａｙｗタイプのプラスミドｐＲｃ／ＣＭＶ−ＨＢＳ（デービスエイチエル(Davis HL)ら））である。リポソームは、各場合において通して１６マイクロモルのＰＣ（１２ｍｇ）、並びに表で特定されたカチオン性脂質を表記載の割合で用いて、形成された。プラスミドＤＮＡを実施例１の方法を用いてリポソーム中に（表中に特定した量で）取り込むか、又は、あらかじめ形成されたカチオン性リポソームとＤＮＡとを水性懸濁液中で混合しこれらの複合体を作成させた（前記エプスタイン(Epp stein)による先行技術と同等の技術を用いて）。次いで、ＤＮＡを取り込んだリポソーム、上記複合体及び裸のＤＮＡを、in vivoでのトランスフェクション実験のためにマウスに投与した。一群３ないし４匹のＢａｌｂ／ｃマウスに、該調製物を、表のμｇＤＮＡが投与されるような量で、筋肉内（後脚）注射した。プラスミドＤＮＡを実施例１の方法を用いてリポソーム中に（表中に特定した量で）取り込むか、又は、あらかじめ形成されたカチオン性リポソームとＤＮＡとを水性懸濁液中で混合しこれらの複合体を作成させた（前記エプスタイン(Epp stein)による先行技術と同等の技術を用いて）。次いで、ＤＮＡを取り込んだリポソーム、上記複合体及び裸のＤＮＡを、in v ivoでのトランスフェクション実験のためにマウスに投与した。一群３ないし４匹のＢａｌｂ／ｃマウスに、該調製物を、表４に記載のＤＮＡレベルが投与されるような量で、筋肉内（後脚）注射した。各試験について、マウスに投与されたリポソーム調製物中の脂質量はほぼ一定であり、１〜２ｍｇ総ＰＣ脂質の範囲である。次いで、マウスから採血し、血清をＥＬＩＺＡ法により試験して免疫応答を測定した。これらin vivo実験において、ＥＬＩＺＡ試験は、ａｙｗタイプのＢ型肝炎のＳ領域抗原を用いて、デービス(Davis)ら（１９８７）の記載のようにして行なわれる。試験は、抗−ＨＢＳＡｇ（Ｓ領域ａｙｗタイプ）−ＩｇＧ₁、ＩｇＧ_2a及びＩｇＧ_2bを測定するのに使用された。得られた免疫応答は、約０．２００の吸光度（ホースラディッシュペルオキシダーゼＥＬＩＺＡ試験において）となるのに必要な血清希釈率のｌｏｇ₁₀（平均＋又は−標準偏差）として表した。表４に結果を報告する上記実験において、マウスは、試験の０日、１０日、２０日、２７日及び３７日に注射され、２６日、３４日及び４４日に採血された。表５に記載の結果においては、マウスは、試験の０日、７日、１４日、２１日及び２８日に注射され、２１日及び２８日に採血された。結果及び結論これらの表において、Ｐ欄は、特定された結果が他のものとは異なっているという信頼レベルを示すスチューデント・ペアード・ｔ-テスト(students paired t-test)の結果を示している。表３は、取り込み率が、カチオン性脂質を含む脂質組成物について極めて高いことを示している。予め形成された脂質を有するプラスミドＤＮＡの複合化率もまた非常に高い。いずれのケースにおいても、取り込み／複合化率（百分率）は、１００μｇ又は１５０μｇのＤＮＡの使用によって殆ど効果はなかった。表４及び図１は、Ｂ型肝炎表面抗原をコードする、取り込まれたＤＮＡでマウスを免疫した後の免疫応答は、裸のＤＮＡで免疫した後のそれよりも非常に高かった。この効果は、実験開始から２６日後に既に明らかであるが、該効果は実験を続けているうちにより一層明白になる。この効果は、ＩｇＧ_2a及びＩｇＧ_2bについては、全採血後、裸ＤＮＡの投与と比べて増加した量で示されるが、ＩｇＧ₁ については特に明白である。表５における結果は、裸ＤＮＡについては、ＤＮＡを最初に投与してから２８日後でさえも応答が見られないことを示している。中性のリポソーム(PC,DOPE)の中に取り込まれたＤＮＡについては、２１日において免疫応答は全く増加しないが、より多量のＤＮＡを注射した場合に２８日後に応答が僅かに増加し、これは裸のＤＮＡを投与した後の応答よりも有意に高い。予め形成されたリポソームとＤＮＡとの複合体については、免疫応答は、ＤＮＡ投与のどちらのレベルについても、実験開始から２８日後に発現することが明らかである。そして、この免疫応答は裸のＤＮＡ投与後の応答よりも有意に大きい。しかし、その免疫応答は、カチオン性リポソーム内に取り込まれたＤＮＡについて得られるものほど高くない。カチオン性リポソームに取り込まれたＤＮＡ１μｇを投与した場合の応答と１ μｇのＤＮＡを投与する他の実施例との間に有意な違いはないが、注入されたＤＮＡ量が１０μｇであると、ＤＮＡを取り込んだカチオン性リポソームについては、２１日後にすでに、免疫応答が他の全実施例よりも有意に高くなる。投与されたＤＮＡがより低いレベル（１μｇ）の場合、２８日後に、多いか少ない量の裸のＤＮＡの場合と比べて、免疫応答が有意に増加する。しかしながら、カチオン性リポソームと複合化されたＤＮＡ又は中性リポソーム内に取り込まれたＤＮＡを低いレベルで投与した後の応答については有意な差異はない。カチオン性リポソーム内に取り込まれたＤＮＡをより多い量（１０μｇ）で投与すると、２８日後の免疫応答は、他の全ての試験のものよりも有意に大きい。実施例３ −裸−、複合化−又はリポソームに取り込まれた−プラスミドＤＮＡで免疫化されたマウスの脾臓におけるサイトカインレベル一群あたり４匹のBalb/cマウス（実施例２と同じプロトコル及び実験）に、PC ，DOPE及びDOTAPからなる陽性に荷電したリポソーム内に取り込まれたpRc/CMV H BS（Ａ）、PC及びDOPEからなる非荷電のリポソーム内に取り込まれたpRc/CMV HB S（Ｂ）、同様に予め形成されたカチオン性DOTAPリポソームと複合されたpRc/CM V HBS（Ｃ）又は裸のpRc/CMV HBS（Ｄ）を、１μｇ（白バー）又は１０μｇ（黒バー）の用量で、０．７、１４、２１及び２８日に、筋肉内投与した。「コントロール」は、正常な免疫していないマウスのサイトカインレベルを表す。最後の注射から３週間後にマウスを殺し、脾臓をサイトカイン分析に供した。脾臓におけるＩＦＮ−γ及びＩＬ−４の内性レベルは、ソーザら(de Souza et al)により修正されたナカネら(Nakane et al)の方法に従い、測定された。個々の脾臓の重さを量り、ドウンス(Dounce)組織ホモゲナイサー中で１％の３−［（コルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート(CHAPS；シグマ社 )を含む氷冷ＲＰＭＩ中でホモゲナイズし、１０％(wt/vol)ホモゲネートを調製した。ホモゲネートを氷上に１時間放置し、次いで不溶物を遠心分離（２０００×ｇ、２０分）により除去した。清澄な上清を−７０℃で保存した。サイトカイン分析標準のcapture ELISAを、一対のモノクローナル抗体及びマクシソープ(Maxiso rp)(ヌンク社，英国)板を用いて、使用した。ＩＦＮ−γ(R46A2)及びＩＬ−4(11 B11)に対する第一のモノクローナル抗体、並びに第二のビオチン化−抗マウスＩＬ−４(BVD6-24G2)及び抗マウスＩＦＮ−γ(XMG1.2)モノクローナル抗体（ファーミンゲン(Pharmingen)，米国）が、ストレプトアビジン・ペルオキシダーゼ(D ako,デンマーク)及び基質としてのｏ−フェニレンジアミン（シグマ）と共に用いられた。組換えＩＦＮ−γ及びＩＬ−４標品は、ファーミンゲンから入手した。結果(mean±SE)は、少なくとも４匹のマウスについてのｎｇ／脾臓として表した。結果を図２に示すが、図において各バーは４匹のマウスからなる１群のmean ±SEを表している（a-dは上記で特定したリポソームを表す）。データ（第２図）は、Ｔｈ１とＴｈ２のサブセット両方の活性が、裸の又は複合化されたＤＮＡよりもリポソームで取り込まれたＤＮＡがより大きいことを示している。この知見は、また、in vitroでの、予備的な、ＨＢｓＡｇ抗原に対するＴ細胞増殖アッセイにおいても確認された。それ故、リポソームに取り込まれたプラスミドＤＮＡでの免疫化は、体液性及び細胞性免疫の両方を誘導することが明らかである。実施例４ −プラスミドＤＮＡの一回注射後のマウスにおける免疫応答裸のＤＮＡのワクチン接種についての多くの報告によれば、一回投与によって、コードされた抗原に対して体液性応答を生じるものの(Davis et al Human Gen e Therapy 1993,及びRaz et al PNAS 1994)、複数回注射するというくプロトコルが採用されている。例えば、裸のpRc/CMV HBS（ここで用いられているプラスミドと同一）に対する全ＩｇＧ応答は、注射後１−２週間で検出できるようになり、４−８週間までにピーク値に到達する(Davis et al 1996)。一群あたり４匹のBalb/cマウスに、PC，DOPE及びDOTAPからなる陽性に荷電したリポソーム内に取り込まれたpRc/CMV HBS（Ａ）、PC及びDOPEからなる非荷電のリポソーム内に取り込まれたpRc/CMV HBS（Ｂ）、予め形成された同様のDOTAP リポソームと複合されたpRc/CMV HBS（Ｃ）又は裸のpRc/CMV HBS（Ｄ）を、２μ ｇ（図３の白バー）又は１０μｇ（黒バー）、１回筋肉注射した。注射後時間をおいて得られる血清について、抗−ＨＢｓＡｇＩｇＧ₁応答を分析(ELISA)した。免疫応答は、リポソームＤＮＡを注射した全てのマウスで上昇していたが、２０−２７日においてのみ測定できた。他の詳細については、実施例２の記載と同様である。カチオン性リポソームＤＮＡで免疫化されたマウスと裸のＤＮＡで免疫化されたマウスとの間のｌｏｇ₁₀値（両用量；全て時間をおいて）における差異は、統計学的に有意であった(P<0.0001-0.002)。PC，DOPE及びPSからなる陰性に荷電したリポソーム内に取り込まれたpRc/CMV HBS（実施例１で記載された方法により作製）１０μｇで上記のように１回免疫化した４匹のマウスからなる５群において、ＩｇＧ₁応答（ｌｏｇ₁₀）は、２１日及び２９日でそれぞれ２．２５±０．０及び２．７３±０．０であった。 pRc/CMV HBSのかなり少ない用量（２及び１０μｇ）で単回免疫化する本発明の条件（図３）では、裸のＤＮＡ及び複合化したＤＮＡに対する抗−ＨＢｓＡｇＩｇＧ₁応答は、７週間でさえも殆ど検出できなかった。一方、カチオン性リポソームに取り込まれたＤＮＡについては、早期に著しいＩｇＧ₁応答が、また中性又は陰性に荷電したリポソームに取り込まれたＤＮＡについては遅いが、有意なＩｇＧ₁応答が認められた（図３）。実施例５ −カチオン性リポソーム中のＢ型肝炎抗原が注射された同系又は異系マウスの体液性及び細胞性応答卵ホスファチジルコリン(PC)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPE)及び１，２−ジオレオイル−３−（トリメチルアンモニウム）プロパン(DOTAP)（モル比１：５．５：０．２５）からなるカチオン性ＤＲＶリポソーム内に取り込まれたpRc/CMV HBS（Ｂ型肝炎表面抗原のＳ領域をコード；サブタイプａｙｗ）（上記実施例１に記載する一般的な技術及び材料を用いて作成）１０μｇ、又は裸のpRc/CMV HBS１０μｇ（共にＰＢＳ中）を、マウスの各群（１群４−５匹）に２回（０及び７日）、注射（筋肉内、腹腔内、静脈内又は皮下内）した。時間をおいて、マウスから採血し、血漿中のＩｇＧ₁、ＩｇＧ_2a及びＩｇＧ_2bをＥＬＩＳＡにより測定した。実験の終わりに（最初の注射から３８日）に動物を殺し、前述するように脾臓中のサイトカインＩＦＮγ及びＩＬ−４を測定した（更なる実験の詳細はグレゴリアディスら，1997(Gregoriadis et al,1997)を参照）。コントロール（未処理）マウスの脾臓についても、サイトカインを測定した。結果結果は、両系統のマウスの免疫応答(mean±SD)は最初の注射から２１日（ＩｇＧ₁；図４）又は２８日（ＩｇＧ_2a及びＩｇＧ_2b；それぞれ図５及び図６）後にのみ測定できるようになったことを示している。リポソームＤＮＡに対する応答（黒バー）は、裸のＤＮＡに対する応答（網掛けバー）に比べて、一般的に有意に高かった（両系統及び全投与形態において；特に筋肉内、皮下内及び静脈内）。有意なレベル(P<0.05)は、+*，**，***の順に高い。サイトカインＩＦＮγ（Ｔｈｌ応答）（図７）及びインターロイキン４（ＩＬ −４）（Ｔｈ２応答）（図８）の分析により、リポソームＤＮＡを、T/oマウスに静脈内投与するよりも、両系統に筋肉内及び皮下内投与するほうが有意に大きことが明らかになった。腹腔内投与については、リポソームＤＮＡと裸のＤＮＡとの間の値に差異はなかった（両系統とも）。実施例６ −６種の異なるプラスミドＤＮＡの取り込み率実施例１に記載の方法により、³⁵Ｓ−標識プラスミドＤＮＡ（10-500μｇ）を、中性、アニオン性又はカチオン性の脱水再水和小胞（ＤＲＶ）に組み込むか、又はそれと混合した。使用したプラスミドＤＮＡは、次の通りである：ｐＧＬ２−実施例１のように、ルシフェラーゼをコードしているｐＲｃ／ＣＭＶＨＢＳ−実施例２におけるように、Ｂ型肝炎表面抗原（Ｓ）領域ｐＲＳＶＧＨ−治療用蛋白である、ヒト成長ホルモンをコードしているｐＣＭＶ４．６５−マイコバクテリウムのレプロシイ蛋白（micobacterium le prosy protein）、抗原ｐＣＭＶ４．ＥＧＦＰ−「蛍光グリーン蛋白」（”fluorescent green protei n”）ＶＲ１０２０−住血吸虫蛋白、抗原。使用した脂質は、実施例１に記載の中性脂質であるＰＣ及びＤＯＰＥ、実施例１に記載のアニオン性脂質であるＰＳ、ホスファチジルセリン、又はホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、及び実施例１に記載のカチオン性化合物であるステアリルアミン（ＳＡ）、ＢｉｓＨＯＰ及びＤＯＴＭＡ、実施例２で用いたＤＣ− Ｃｈｏｌ及びＤＯＴＡＰ、それに加えて１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパンＤＯＤＡＰを、包含している。下記表は、プラスミドＤＮＡが組み込まれたかどうか（即ち、ＤＲＶ中に取り込まれているか（ａ）又はＤＲＶと単に混合しただけであるか（ｂ））を示す。更に、表は、脂質成分及びＤＮＡの取り込み率を示す。先のテストは、各ＤＲＶ処方について異なる量のＤＮＡを用いでも、取り込み率に有意差が無いことを示した。結果を一緒にし、表に３〜５回の実験から得られた値を平均値として示す。結果は、ＤＮＡが取り込まれることにより、脂質が陰性に荷電している場合、組み込みレベルが遥かに高い値になり得ることを示す。カチオン化合物が非脂質化合物（ステアリルアミン）である場合は、組み込みはより高率になるようであるが、カチオン性脂質を用いた場合の組み込み率に関しては、取り込みと物理的混合との間に有意差は無いように思われる。実施例７ −取り込まれたｐＲｃ／ＣＭＶＨＢＳによりコードされたＨＢｓＡｇ抗原に対する免疫応答に対して、有効なカチオン性リポソームの脂質組成物前記の一般的方法を用いて、プラスミドＤＮＡを、種々のカチオン性リポソーム内に取り込んだ。用いた脂質及びそのモル比を、表７に示す。脂質は、前記各実施例で用いたものであり、そして追加のＰＥは卵の脂質であるホスファチジルエタノールアミンであり、及びＤＳＰＣは飽和脂質であるジステアロイルホスファチジルコリンである。一群５匹からなるＢａｌｂ／ｃ系マウスに、遊離の又はリポソーム内に取り込まれたプラスミド１０μｇを、０日、２週目、５週目に、筋肉注射により投与した。８、１０及び１３週目に動物から採血し、血漿中の抗ＨＢｓＡｇ（Ｓ領域）ＩｇＧ₁抗体をＥＬＩＳＡにより測定した。用いた方法は、実施例５に一般的に記載されている通りである。結果を、下記表７に示す。結果の統計的分析（アンペアードＴ−テスト）により、（ａ）全てのリポソームのＤＮＡ処方と遊離のＤＮＡとの間（P<0.0001-0.0441；すべて時間をおいて）、ＰＣ：ＤＯＰＥ：ＤＯＴＡＰとＰＣ：ＤＯＴＡＰとの間（P<0.0036-0.0357 ；すべて時間をおいて）、ＰＣ：ＰＥ：ＤＯＴＡＰとＰＣ：ＤＯＴＡＰとの間（ P<0.0095-0.0385；１０及び１３週目において）、ＰＣ：ＤＯＰＥ：ＤＯＴＡＰとＤＳＰＣ：ＤＯＰＥ：ＤＯＴＡＰとの間（P<0.0001-0.0138；８及び１３週目において）及びＰＣ：ＤＯＰＥ：ＤＯＴＡＰとＰＣ：ＣＨＯＬ：ＤＯＴＡＰとの間（P<0.0158；１３週目において）において、有意な差が判明した。結果は、免疫応答を促進するリポソームの効果に関して、（ａ）ＤＯＰＥは、リポソームの効果の損失無く、ＰＥに置換できる（ＤＯＰＥ及びＰＥは共に不飽和脂質）、ｂ）ホスファチジルトリエタノールアミン（ＰＥ又はＤＯＰＥ）は、このタイプの脂質を含まないリポソームに比して、リポソームをより効果的にする、ｃ）ＰＣを飽和のＤＳＰＣで置換するとリポソームの効果が減少する、ｄ）コレステロールを含むがホスファチジルエタノールアミンを含まないリポソームは、ホスファチジルエタノールアミンを含むリポソームと、８及び１０週目においてであるが、ほぼ近似した効果である。実施例８ −非リン脂質リポソームへのｐＲｃ／ＣＭＶＨＢＳの取り込み本実施例では、リン脂質以外のリポソームを形成する種々の成分が、前記各実施例で用いられた肝炎抗原を取り込むために使用された。リポソーム形成成分には、グリセライドのＭｏｎｏＰａｌ；１−モノパルミトイル−ｒａｃ−グリセロール、並びに非イオン性界面活性剤のＳｐａｎ６０（−ソルビタンモノステアレート）及びＳｏｌｕｌａｎ２４（ラノリンアルコール及び同族の脂肪族アルコールの２４モルエトキシ化混合物）が包含される。（Ｓｐａｎ６０及びＳｏｌｕｌａｎ２４は商標である。）リポソームを形成する成分のモル比は、表に示されている。他の成分は、前記実施例で使用したものである。結果は、十分な取り込み率が、リン脂質を含まないリポソーム形成成分を用いて、達成できることを示している。非イオン性界面活性剤は、必要に応じてコレステロールの様な他の非リン脂質の脂質成分と組み合わせて、十分な取り込み率を与えることができる。実施例８．４、８．５、８．６及び８．８で形成されたリポソームは、放置すると沈殿し、組成に関しては最適化されていない。取り込み率を、下記表８に示した。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年１０月２９日（１９９８．１０．２９）【補正内容】１．リポソーム形成成分、及びリポソーム内に取り込まれた、ヒト又は動物に所望の免疫応答を誘導するのに有用な免疫原性ポリペプチドを機能的にコードするポリヌクレオチドから形成されるリポソームを含有する組成物。２．ポリヌクレオチドが、二本鎖ＤＮＡである請求項１に記載の組成物。３．ポリヌクレオチドが、プロモーター及び必要に応じてリボソーム結合配列を含むプラスミドの形態である請求項２に記載の組成物。４．ポリヌクレオチドが、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡである請求項１に記載の組成物。５．免疫原性のポリペプチドが、感染性微生物の抗原若しくは抗原のフラグメントを含有する前記いずれかの請求項に記載の組成物。６．リポソーム形成成分が、リポソームが全体として電荷を有さないように選択された前記いずれかの請求項に記載の組成物。７．リポソーム形成成分が、少なくとも１種のカチオンに荷電したリポソーム形成成分を、リポソーム形成成分が全体としてカチオンに電荷を有する量で含有する請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。８．少なくとも１種のカチオン性荷電成分をリポソーム形成成分が全体として正の電荷を有する量で、並びに所望のポリペプチド生成物をコードするポリヌクレオチドを含有する成分から形成されるリポソームであって、リポソーム形成成分から空のリポソームを形成し、該空のリポソームをポリヌクレオチドと混合し、次いで脱水し、該脱水混合物を水性組成物中で再水和させて脱水−再水和小胞を形成させる工程により、上記ポリヌクレオチドがリポソーム内に取り込まれていることを特徴とする、リポソームを含有する組成物。９．カチオン性成分が、一般式［式中、Ｙ¹及びＹ²は、同一又は異なって、−Ｏ−又はＯ−Ｃ（Ｏ）−であり、この場合カルボニル炭素は、場合により、Ｒ²又はＲ¹に結合する；Ｒ¹及びＲ²はそれぞれ独立して炭素数６〜２４のアルキル基、アルケニル基、又はアルキニル基であり、Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵は、それぞれ独立して、水素、炭素数１〜８のアルキル、炭素数６〜１１のアリール又はアラルキルであり；或いは、Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵の２又は３個は正電荷を有する窒素原子と結合して原子数５〜８の環状構造を形成し、この場合、正電荷を有する窒素原子に加えて、この構造中の原子は炭素原子であり、一個の酸素、窒素又は硫黄原子を含むことができる；ｎは１〜８であり；Ｘはアニオンである。］を有するグリセリド又はその光学異性体である請求項７又は８に記載の組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号９７１３９９４．３ (32)優先日平成９年７月１日(1997．7．1) (33)優先権主張国イギリス（ＧＢ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．リポソーム形成成分、及びリポソーム内に取り込まれた、ヒト又は動物に所望の免疫応答を誘導するのに有用な免疫原性ポリペブチドを機能的にコードするポリヌクレオチドから形成されるリポソームを含有する組成物。２．ポリヌクレオチドが、二本鎖ＤＮＡである請求項１に記載の組成物。３．ポリヌクレオチドが、プロモーター及び必要に応じてリボソーム結合配列を含むプラスミドの形態である請求項２に記載の組成物。４．ポリヌクレオチドが、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡである請求項１に記載の組成物。５．免疫原性のポリペプチドが、感染性微生物の抗原若しくは抗原のフラグメントを含有する前記いずれかの請求項に記載の組成物。６．リポソーム形成成分が、リポソームが全体として電荷を有さないように選択された前記いずれかの請求項に記載の組成物。７．リポソーム形成成分が、少なくとも１種のカチオンに荷電したリポソーム形成成分を、リポソーム形成成分が全体としてカチオンに電荷を有する量で含有する請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。８．少なくとも１種のカチオン性荷電成分をリポソーム形成成分が全体として正の電荷を有する量で、並びに所望のポリペプチド生成物をコードするポリヌクレオチドを含有する成分から形成されるリポソームであって、該リポソーム内に上記ポリヌクレオチドが取り込まれていることを特徴とするリポソームを含有する組成物。９．カチオン性成分が、一般式［式中、Ｙ¹及びＹ²は、同一又は異なって、−Ｏ−又はＯ−Ｃ（Ｏ）−であり、この場合カルボニル炭素は、場合により、Ｒ²又はＲ¹に結合する；Ｒ¹及びＲ²はそれぞれ独立して炭素数６〜２４のアルキル基、アルケニル基、又はアルキニル基であり、Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵は、それぞれ独立して、水素、炭素数１〜８のアルキル、炭素数６〜１１のアリール又はアラルキルであり；或いは、Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵の２又は３個は正電荷を有する窒素原子と結合して原子数５〜８の環状構造を形成し、この場合、正電荷を有する窒素原子に加えて、この構造中の原子は炭素原子であり、一個の酸素、窒素又は硫黄原子を含むことができる；ｎは１〜８であり；Ｘはアニオンである。］を有するグリセリド又はその光学異性体である請求項７又は８に記載の組成物。１０．Ｒ¹及びＲ²が各々０〜６の不飽和部分を有し、構造 CH₃−(CH₂)_a−(CH＝CH−CH₂)_b−(CH₂)_c− ［式中、ａとｃの合計は１〜２３であり；ｂは０〜６である。］を有する請求項９に記載の組成物。１１．カチオン性成分が、DOTAP、BisHOP、DC−Chol及びステアリルアミンから選ばれるものである請求項７又は８に記載の組成物。１２．リポソーム形成成分が、融合誘導性成分、好ましくはホスファチジルエタノールアミンを含む前記いずれかの請求項に記載の組成物。１３．リポソームが、脱水−再水和工程、好ましくは次いで微小流動化工程又は押出を行うことにより形成されるものである前記いずれかの請求項に記載の組成物。１４．リポソームの平均直径が、１００〜１０００ｎｍ、好ましくは２００〜５００ｎｍである前記いずれかの請求項に記載の組成物。１５．リポソーム形成成分ｍｇ当たり０．１〜１０μｇのポリヌクレオチドを含有する前記いずれかの請求項に記載の組成物。１６．ヒト又は動物を治療又は予防処置する方法に用いる組成物の製造のための前記いずれかの請求項に規定されたリポソームの使用。１７．上記方法が、感染性微生物又はガン細胞に対する免疫化のためのワクチン接種である請求項１６に記載の使用。１８．組成物を筋肉内投与する請求項１６又は１７記載の使用。１９．請求項１〜１５のいずれかに記載のリポソーム調製物及び薬学的に許容される賦形剤を含有する薬学的組成物。２０．請求項１９に記載の薬学的組成物をヒト又は動物に投与し、それによって標的細胞においてポリヌクレオチドのポリペプチド生成物が発現される、かかる処置を必要とするヒト又は動物の処置方法。２１．薬学的組成物を筋肉内投与する請求項２０に記載の方法。２２．薬学的組成物を皮下投与する請求項２０に記載の方法。２３．薬学的組成物を静脈内投与する請求項２０に記載の方法。２４．薬学的組成物を腹腔内投与する請求項２０に記載の方法。２５．細胞を請求項１〜１５のいずれかに記載のリポソーム組成物と接触させ、該細胞を培養し、それにより細胞のトランスフェクション及びポリヌクレオチドの発現並びにポリヌクレオチドのポリペプチド生成物の合成が起こる、ヒト又は動物から単離した細胞のトランスフェクション方法。２６．次いで培養細胞を宿主動物又はヒトに移植し、ポリペブチドの発現がin v ivoで生じる請求項２５に記載の方法。２７．発現されたポリヌクレオチドが所望の免疫応答、好ましくは感染性微生物又はガン細胞の抗原に対する応答を誘導する請求項２０〜２４のいずれかに記載の方法。２８．1．ヒト又は動物において所望の免疫応答を誘導するのに有用な免疫原性ポリペプチドを機能的にコードする裸のポリヌクレオチド及び予め形成されたリポソームを含有する水性懸濁液を形成し、 2．該懸濁液を凍結乾燥し、 3．工程２の生成物を再水和し、 4．工程３の脱水、再水和された小胞の水性懸濁液を微小流動化に供し、 5．必要に応じて、取り込まれなかったポリヌクレオチドをリポソームから分離する工程を含むポリヌクレオチドをリポソーム内に取り込む方法。２９．リポソームがカチオン性リポソームである請求項２８に記載の方法。３０．1.裸のポリヌクレオチド及び予め形成されたカチオン性リポソームを含有する水性懸濁液を形成し、 2.該懸濁液を凍結乾燥し、 3.工程２の生成物を再水和し、 4.工程３の脱水、再水和された小胞の水性懸濁液を微小流動化に供し、 5.必要に応じて、取り込まれなかったポリヌクレオチドをリポソームから分離する工程を含むポリヌクレオチドをリポソーム内に取り込む方法。３１．工程１〜４におけるポリヌクレオチドの取り込み率が、工程１の懸濁液中のポリヌクレオチドの１０〜９０％、好ましくは２０〜８５％の範囲である請求項２８〜３０のいずれかに記載の方法。３２．最終生成物における、ポリヌクレオチドの濃度が、リポソーム形成成分ｍｇあたり０.１〜２０μｇである請求項２８〜３１のいずれかに記載の方法。