KR20000036088A - 리포좀 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 소포내 공간에 인트랩된 폴리뉴클레오티드를 갖는 양이온계 리포좀에 관한 것이다. 리포좀은 DOTAP와 같은 양이온계 리피드 등의 양이온계 성분들을 포함한다. 바람직하게, 리포좀을 형성하는 방법은 폴리뉴클레오티드 존재하에 탈수-재수화 방법을 사용한다. 바람직하게, 폴리뉴클레오티드는 목적하는 면역반응을 유발시킬 수 있는 항원, 즉 유전자 왁진을 유효하게 암호화한다.

Description

리포좀{LIPOSOMES}
폴리펩티드는 예를 들면 전염성 미생물에 대한 예방 면역법을 위해서 또는 면역요법 치료를 위해서 피실험체에 있어서 목적한 면역 반응을 유도하는데 유용한 면역성 폴리펩티드를 바람직하게 암호화한다. 리포좀은 적어도 하나의 양이온으로 하전된 리피드를 포함하는 것이 바람직하고, 탈수-재수화 기술에 의해 제조되는 것이 바람직하다.
여러가지 목적으로 동물이나 인간 피실험체의 몸에 유전 물질을 삽입하는 것이 알려져 있다. 1960년대 중반에, 정상적인 유전자 시퀀스를 그의 결손된 한쪽 부분을 갖고 있는 사람의 세포에 삽입해서 유전성 질병 치료를 하는데 사용될 수 있는 기술이 제안되었다. 유전자 치료에 의한 다양한 유전적 장애를 치료하는 시도들이 현재 진행중이다. 예를 들면, CF 트랜스멤브래인 콘덕탄스 조정제를 암호화하는 DNA를 삽입하여 낭포성 섬유증을 치료하기 위해 상당량의 연구가 행해져 왔다. 유전자 생성물이 허파에서 요구되기 때문에, 유전자를 허파에 직접 또는 코속으로 전달시키려는 시도를 해왔다.
더욱 최근에는 유전자 치료가 암 치료를 위해 제안되었다. 예를 들면, 종양 괴사 인자(TNF) 또는 인터루킨-2를 임파구 또는 종양 세포로 암호화하는 유전자를 삽입함으로써, 면역 반응을 자극해서 종양을 파괴하는 것이 기대된다. 그 외에, 인간 클래스 1 주요 조직적합성 항원(HLA-B7)을 암호화하는 유전자를 이러한 항원을 발현하지 않는 환자의 종양 세포에 삽입함으로써 면역 반응을 자극해서 항원이 종양 세포를 파괴하는 것이 기대된다.
여러 가지 벡터가 유전자 치료에서 핵산의 전달 및 발현을 위해 제안되어 왔다(Mulligan, 1993). 이들은 비비루스성 벡터(예, 양이온성 중합체 및 소포) 뿐만 아니라 비루스들(예, 레트로비루스 및 아데노비루스)을 포함한다. 그러나, 이들 벡터의 각각에, 예를 들면 레트로비루스의 세포 게놈으로의 동화(integration), 비루스 단백질에 대한 면역 반응의 촉진과 그에 따른 장기간 치료의 방지(Kay et al, 1994), 비비루스성 벡터에 의한 일시적인 또는 저효율의 트랜스펙션(Legendre and Szoke, 1995)에 있어서 가능한 부작용과 같은 결점이 있다. 종종 DNA 크기 및 구조에도 불구하고, 비비루스성 벡터로의 DNA 결합의 상대적인 단순함과 이들의 비병원체적 특성은 이들 벡터를 매력적인 대안으로 만들어 준다. 정말로, 구조물(미리 형성된 양이온성 소포 및 플라스미드 DNA의 복합체)은 이제 발전하여 시험관 내에서 트랜스펙션의 높은 지수를 나타내며(Felgner, 1991), 실험 동물에서 낮은 적당한 트랜스펙션을 나타낸다(Alton et al, 1993;Zhu st al, 1993). 이와 반대로, 이와 같은 복합체의 전위 독성(Raz et al, 1994) 및 DNA 이동 효율을 촉진시킬 수 있는 기타 제재와 비결합할 가능성 때문에, 생체 내에서 이들의 유용성은 핵산이 종래의 리포좀 내에서 결합하는 경우 만큼 유망하지는 않다. 이들은 적당하게 고안된(소포 크기, 표면 전하 및 리피드 조성의 항목에서) 경우에, 혈액 순환 중에 안정하게 유지되고(Scherphof et al., 1983; Gregoriadis., 1995) 그에 따라서 혈액 플라스마 중의 누클레아제로부터 그들의 핵산 함량을 보호하거나, 또는 최적의 사용에 도움이 되는 정화율을 얻게 한다(Gregoriadis., 1995). 또한, 길게 순환하는 리포좀의 표면에 세포-특정 리간드를 이식하는 것은 핵산을 우선적으로 목적 세포로 향하게 할 것이다(Gregoriadis., 1995). 기타 제재의 핵산-함유 리포좀으로의 결합은 또한 그들을 방추 유전자성이 되게 하고, 그들의 내용물이 엔도좀으로부터 시토플라즘으로 나오는 것을 용이하게 하거나, 또는 DNA의 핵산으로의 수송을 촉진시킬 수도 있다(Legendre 및 Szoka, 1995). 그러나, DNA의 리포좀으로의 인트랩먼트를 위한 대부분의 기술(Gregoriadis., 1993)은 효과가 없고, 그 크기와 양립하지 않거나, 또는 DNA 통합에 해로울 수 있는 조건(예, 초음파처리, 유기성 계면 활성제 및 용매)을 사용한다.
WO-A-9117424(Victal, Inc)에는 양 및 음으로 하전된 리피드 종류의 여러 가지 복합체 및 세포내의 전달이 향상된 활성 화합물이 기재되어 있다. 폴리누클레오티드의 양이온성 리포좀으로 낮은 인트랩먼트율은 미리 형성된 양으로 하전된 리포좀 및 폴리누클레오티드(음으로 하전된 것)의 양으로 하전된 순수한 복합체가 양으로 하전된 복합체를 도포한다고 말해지는 미리 형성된 음으로 하전된 과량의 리포좀과 후속적으로 결합시키는 방법에 의해 극복될 수 있다. 그러나, 폴리누클레오티드가 어떠한 소포 내부로도 인트랩되지 않기 때문에, 플라즈마 중의 누클레아제에 접근하게 될 것으로 믿어진다.
엡스타인(Eppstein)등의 명의로 출원되어 신텍스(Syntex)회사로 양도된 미국 특허출원 제 4,897,355호(US-A-4,897,355)에 활성 화합물의 세포내 전달에 사용되는 양이온성 리피드로 형성된 리포좀이 기재되어 있다. 활성 화합물로는, 예를 들면 효소 결핍 조건에서 사용되는 효소, 호르몬 치환 요법에 사용되는 호르몬, 혈액 응고 인자, 신경 송신체(transmitter), 항-비루스 화합물 및 항-종양 화합물, 또는 특정 단백질의 발현을 선택적으로 차단하기 위한 안티-센스 RNA의 전달을 위해 사용되는 호르몬을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 예로 들 수 있다. 활성 화합물은 미리 형성된, 비어 있는 리포좀과 혼합되고, 선택적으로 상기 배합체(conjugate)는 미리 형성된 리포좀과 잇따라 추가로 혼합된다.
Journal of Drug Targeting(1996, 인쇄 중)에서, Gregoriadis 등은 탈수-재수화 기술을 사용하여 만들어진 유전자 치료에 사용되는 인트랩된(entrapped) DNA와 리포좀의 형성을 기재하고 있다.
1995년에, "Targeting of Drugs: Strategies for Oligonucleotide and Gene Delivery in Theraphy" 회의에서 및 상기 회의에 뒤이어 만들어진 회의록(편집자 G. Gregoriadis 및 B. McCormack, 뉴욕 Plenum Press 출판)에서 데이비스(Davis)는 유전자 치료 방법에서 세포에 삽입된 유전자의 생성물에 대항하는 바람직하지 않은 면역 반응에 대해 논의했다. 데이비스는 유전자의 세포내 삽입 후 유도되는 면역 반응의 연구가 유전자 전이의 DNA-왁진주사(DNA-기초 면역법) 적용 뿐만 아니라 유전자 치료 처리를 최적화하기 위해 얼마나 중요한지를 제안하였다. 데이비스는 항원에 기초한 왁진에 비해 유전자 왁진의 많은 이로운 점을 기재하고 있고, 간염 B 표면 항원(HBsAg)에 대한 면역에 기초한 DNA를 위해 네이키드(naked) DNA를 사용한 몇 가지 결과를 기재하고 있다.
상기 회의에서 베르(Behr)는 응축하는 동안 DNA 주위에 스스로 모인다고 간주된 리포폴리아민으로 이루어진 유전자 치료용 폴리뉴클레오티드 시퀀스를 위한 합성 운반체를 기재하였다. 폴리뉴클레오티드는 세포 핵에 도달하게 된다. 본 발명자는 스스로 모인 입자들이 이층으로 구성되지 않고, 따라서 리포좀으로서 정의되지는 않을 것이라고 여긴다.
1996년 10월 23일과 24일에 미국 워싱턴 DC에서 열린 IPC의 2차 년례 회의 "Genetic Vaccines and Immunotherapeutic Strategies"에 관한 예비 회의 정보는 Felgner가 양이온성 리피드를 사용하여 항원을 코드화하는 유전자의 전달을 향상시킨 최근 연구를 기재하였다. 유전자는 코속으로 또는 허파 조직으로 전달되어 점막 면역성을 자극한다. 동회의에서, 래들리(Ladley)는 DNA의 생체내 이용율과 점막 세포내로 진입을 조절하기 위해 양이온성 리피드로 되는 유전자 전달 시스템을 기술하는 것을 주장했다. 그 의도는 효과적인 면역반응을 꾀하기 위한 것이다. 예비 회의 발표문은 유전자 전달이 어떻게 행해졌는지에 대해서 그 이상의 정보를 주지 않았다.
리포조말 전달 시스템에서 폴리뉴클레오티드의 캡슐화율을 증가시키는 것이 바람직하다. 또한, 유전자를 투여한 동물의 혈행(血行) 중에 유전자 생성물, 특히 치료 생성물의 농도를 증가시키는 것이 바람직하다. 또한, 유전자의 목표 세포 전달율을 증가시키는 것이 바람직하며, 여기서 유전자 생성물은 항원이다. 또한, 바람직한 유전자 반응을 유발시키는데 유용한 면역성 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 향상된 전달을 제공하는 것이 바람직하다.
본 발명은 목적 폴리펩티드를 암호화하는 인트랩된 폴리뉴클레오티드를 갖는 리포좀 조성물에 관한 것이다.
도면은 다음과 같이 몇 가지 실시예의 결과를 나타낸다.
도 1은 실시예 2, 표 4에 언급된 결과를 나타내는 일련의 막대 차트이다
도 2는 실시예 3의 결과를 나타내는 일련의 막대 차트이다.
도 3은 실시예 4의 결과를 나타내는 일련의 막대 차트이다.
도 4 내지 8은 실시예 5의 결과를 나타내는 일련의 막대 차트이다.
본 발명의 첫 번째 면은 리포좀 및, 리포좀 내에 인트랩된, 인간 또는 동물 피실험체에서 목적한 면역 반응을 유발하는 면역성 폴리펩티드를 유효하게 코드화하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 신규한 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 인트랩된이란 용어는 폴리뉴클레오티드가 소포내 공간에 있다는 것을 의미한다. 따라서, 리포좀은 폴리뉴클레오티드의 존재 하에서 형성되어 왔다. 이것은 미리 형성된 리포좀과 폴리뉴클레오티드의 종래 기술의 복합체와 대조될 수 있다.
본 발명의 이러한 면에서, 유전자의 생성물은 면역 반응이 요구되는 항원이어야 한다. 따라서 펩티드는 비루스, 박테리아 또는 진균류와 같은 전염성 미생물에 대한 하나 이상의 항원성 결정인자를 포함한다. 상기 방법은 박테리아, 진균류 및 비루스, 특히 인플루엔자, HIV, 간염 B 및 간염 C에 대한 면역법에 특히 유용하다. 따라서, 유전자 생성물은 HBsAg 또는 간염 C 코어 단백질 또는 인플루엔자 항원 또는 항원성 HIV 펩티드 또는 소편일 수 있다. 본 발명은 유전자 생성물이 하나 이상의 단순 포진 비루스 단백질, SV40과 같은 종양 비루스 생성물, 또는 종양 항원, 결핵 항원 및 심지어 말라리아 등의 기생충과 같은 더욱 복잡한 미생물의 항원이라는 점에서 또한 가치가 있다.
본 발명에서, 리포좀 흡수를 위한 목표 조직은 근육, 피부, 간, 파괴될 비장 종양 세포, 코 또는 허파 또는 장 속에 있는 것과 같은 점막 세포, 및 특히 임파절의 세포이다. 유전자 왁진을 위한 목표 세포는 일반적으로 항원이 존재하는 세포이다. 상기 조성물은, 예를 들면 IV 주사에 의해 전신으로 투여될 수 있고, 예를 들면 코 속으로, 근육 내로 또는 피부 내로 직접, 또는 심지어 경피로 또는 경구로 투여될 수 있다. 본 발명은 처음으로 리포좀이 피하로 투여된 면역 반응의 성공적인 발생을 허용해주었다. 이것은 본 발명의 바람직한 면이므로, 상기 조설물을 피하로 투여한다.
본 명세서에서 "리포좀"이란 용어는 임의로 비리피드성 성분과 결합하고 있는 리피드를 일반적으로 포함하는 성분으로 형성된 이층으로 둘러싸인 소포를 언급한다.
리포좀의 외부 표면에 목표 조직을 인식하는데 적합한, 예를 들면 항체와 같은 목표 성분을 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 상기 조성물이 혈행 속으로 투여되는 경우, 리포좀의 외부 표면에 부착된 세포 특정 리간드는 핵산을 목표 세포로 향하게 할 것이다(Gregoriadis, 1995).
유전자는 목적 생성물이 목표 세포 중에 생성될 수 있는 형태로 존재해야만 하고, 따라서 목표 세포 중의 발현을 촉진하는 조정 요소를 포함하는 것이 바람직하다. 그러므로, 폴리뉴클레오티드는 촉진제를 포함하고, 리보좀 결합을 중개하는 영역 뿐만 아니라, 임의로 유전자 발현을 증강시킬 수 있는 기타 영역도 포함한다.
폴리뉴클레오티드는 RNA일 수 있지만, DNA인 것이 바람직하다. 이것은 일반적으로 플라스미드의 형태, 실질적으로 비복제 플라스미드인 것이 바람직한데, 그 이유는 본 발명의 이러한 면에 대해서, 일정 주간 또는 몇 개월 이상의 일시적인 활성이 일반적으로 적합하다.
본 발명의 이러한 면에서, 리포좀을 형성하는데 사용되는 성분을 형성하는 리포좀은 천연적, 양쪽성 이온계, 음이온계 및/또는 양이온계 리피드 부분을 포함할 수 있다. 이들은 리포좀에 전체적인 전하를 줄 만한 상대적인 양으로 사용될 수 있거나, 덜 바람직하게 리포좀이 어떠한 전체적인 전하도 갖지 않을 수 있다. 리포좀이 전체적인 양전하를 갖도록 리피드 성분을 사용하는 것은, 항원을 암호화하는 유전자를 전달하는데 사용되는 경우 면역 반응을 증가시킨다는 본 발명의 관점에서 향상된 결과를 제공할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 리피드로 칭하는 것이 적합한 성분들(글리세라이드 및 콜레스테롤을 포함) 외에, 리포좀 형성 성분들은 비이온계 또는 양이온계 계면 활성제와 같은 비리피드성 성분(예, 자연적으로 생기는 리피드가 아님)을 포함할 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 구현예에 따라서, 신규한 조성물은 리포좀이 전체 양하전을 갖는 양으로 적어도 하나 이상의 양으로 하전된 성분을 포함하는 리포좀 형성 성분으로부터 형성한 리포좀으로 이루어진다.
폴리뉴클레오티드가 양이온성 리포좀으로 인트랩된 것이 처음인 것으로 믿어진다. 그리하여, 본 발명의 두 번째 면에서, 적어도 하나 이상의 양으로 하전된 성분과 목적하는 폴리펩티드 생성물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형성 성분들로부터 형성된 리포좀이 제공되며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 리포좀 내에 인트랩되는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명자는, 시험관 내 시스템에서, 루시페라제 마커(marker) 단백질을 암호화하는 DNA의 인트랩먼트가 비하전 리포좀 또는 음이온으로 하전된 리포좀을 사용하는 다른 방법과 비교했을 때, 루시페라제 발현의 증가된 레벨을 주는 것을 확립했다. 발현의 레벨이 미리 형성한 양으로 하전된 리포좀(시판용 Lipofect AMINE(상표))의 복합체를 사용하는 것보다 낮은 반면에, 복합체와 비교했을 때에 인트랩먼트에 의한 뉴클레아제 공격에 대한 내성에 있어서 향상이 생체내에서 나타났다. 그 외에, 리포좀은 신속하게 집합하지 않는 반면에 이와 같은 집합은 특히 혈청 단백질 존재하에 미리 형성한 리포좀-폴리뉴클레오티드 시스템 혼합체에 대해서 일어날 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 인트랩먼트는 리포좀 표면상에 목적하는 리간드를 제공하거나 또는 인트랩된 활성을 갖는 리포좀상에 다른 표면 처리를 행하기 위한 보다 큰 자유를 제공한다. 고도의 모델 단백질 루시페라제의 발현은 유전자 생성물이 목적하는 면역 반응을 유발시키는 항원이었을 경우에 나타날 것으로 기대되다.
이것은 다음과 같은 실험에 의하여 확인되었는데, 즉 이 실험은 여러 가지의 루트에 의해서 리포좀-인트랩먼트PRc/CMV HBS(간염 B 표면 항원의 S 영역을 암호화함; 서브 타입 ayw)로 마우스를 왁진주사하면 마우스가 동종(Balb/c) 또는 이종(T/O)인지 여부와 주사의 경로(근육내, 피하, 정맥내, 복강내)에 무과한 체액 및 세포-중개 면역 반응을 가져온다. 이와 같은 반응은 대개의 경우에 있어서 동일한 조건하에서 네이키드 DNA로 알 수 있었던 것들 보다 상당히 크다(이하, 실시예 5 참조).
본 발명의 이러한 구현예에서, 리포좀에 혼입된 양이온성 성분은 폴리뉴클레오티드와 복합시킴으로써 트랜스펙션율을 향상시키는 리포좀 제제에 사용되어 왔었던 것들일 수 있다. 이 성분은 리피드성 또는 비리피드성 화합물일 수 있고, 이것은 합성 또는 천연 물질일 수 있다. 바람직한 양이온계 리피드는 1,2-비스(올레오일옥시)-3-(트리메틸암모니오)프로판(DOTAP), 1,2-비스(헥사데실옥시)-3-(트리메틸암모니오)프로판(BisHOP), N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,Nn-트리에틸암모늄클로라이드(DOTMA) 및 본 명세서에서 참고로 기재한 미국 특허 출원 제 4,897,355호에 정의된 식 I의 다른 리피드 또는 에스테르 유사체이다.
그 구조는 다음과 같거나 또는 그의 광학 이성질체이다.
식 중, Y1및 Y2는 서로 동일하거나 다른 것으로, 각각 -O- 또는 O-C(O)-(여기서, 카르보닐 탄소는 경우에 따라서 R1또는 R2에 결합됨)이고, R1및 R2는 독립적으로 6 내지 24개의 탄소원자를 갖는 알킬, 알케닐, 또는 알키닐이고, R3, R4및 R5는 독립적으로 수소, 1 내지 8개의 탄소원자를 갖는 알킬, 6 내지 11개의 탄소원자 를 갖는 아릴 또는 아랄킬이고; 양자 택일로 R3, R4및 R5중 둘 또는 셋은 양으로 하전된 질소 원자에 결합되어 5 내지 8개의 원자를 갖는 사이클릭 구조를 형성하고, 여기서 양으로 하전된 질소 원자 이외에, 상기 사이클릭 구조 중의 원자는 탄소 원자이고, 산소 원자, 질소 원자 또는 황 원자를 포함할 수 있으며, n은 1 내지 8이고, X는 음이온이다.
바람직한 구현예는 R1및 R2가 개별적으로 0 내지 6 개의 불포화 부위를 갖고, 다음과 같은 식을 갖는 조성물이다.
CH3-(CH2)a-(CH=CH-CH2)b-(CH2)c-
윗 식에서, a 및 c의 합은 1 내지 23이고, b는 0 내지 6이다. R1및 R2의 각각은 올레일인 것이 가장 바람직하다. 가장 바람직한 구현예는 긴 사슬 알킬기가 지방산, 즉, 여기서 Y1및 Y2가 서로 같은 것으로 -O-C(O)-인 조성물이다.
양자 택일로, 본 명세서에서 참고로 기재한 미국 특허 출원 제 5,459,127호에 정의된 일반식 I 또는 일반식 II의 양이온계 리피드가 사용될 수 있다.
기타 적합한 양이온계 화합물은 비리피드 성분 스테아릴아민 및 3β[N-(N´N´-디메틸아미노에탄)-카바밀]콜레스테롤(DC-Chol)(리피드성 성분)이다.
리포좀은, 양이온계 성분으로 이루어지는 것에 추가로, 일반적으로 리피드를 포함하는 비이온계 및/또는 양쪽성 이온계 성분으로 이루어지고, 이것은 인지질 또는 포스포릴기를 포함하지 않는 기타 리피드일 수 있다. 리피드는 천연 또는 합성 포스파티딜콜린스, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린과 같은 인지질을 포함하는 것이 바람직하며, 이들 중 어느 하나에서 긴 사슬 알킬기(에스테르 또는 에테르 결합을 통해 결합할 수 있음)는 포화된 것이거나 또는 불포화된 것일 수 있다. 글리세라이드 리피드의 아실기는 불포화된 것이 바람직하다. 상기 성분은 비리피드성 성분, 예를 들면 지방산의 소르비탄 모노 에스테르와 같은 비이온성 계면활성제, 및/또는 에톡실화 지방산 또는 에톡실화 라놀린과 같은 기타 유사물을 포함할 수 있다.
리포좀이 방추 유전자 리피드를 포함하는 경우에 최상의 결과가 얻어지고, 상기 유전자 리피드는 일반적으로 아실기가 불포화된 포스파티딜 에탄올아민이다. 콜레스테롤은 비록 리포좀을 폴리뉴클레오티드의 목표 세포로의 적합한 전달을 위해 지나치게 안정하게 만드는 것처럼 보이더라도 포함될 수 있다.
양이온 성분의 양은 리포좀 형성 성분의 전체 몰의 5 내지 50% 범위이고, 10 내지 25% 몰인 것이 바람직하다.
리포좀 조성물은 일반적으로 생리적 완충액과 같은 수성 현탁액 형태이다. 양자 택일로, 리포좀 조성물은 재수화를 위한 건조 조성물일 수 있다.
리포좀은 일반적으로 사용되는 리포좀 형성 기술 중 어느 것에 의해서도 만들어질 수 있다. 생성물 리포좀은 다층 또는 단층 소포일 수 있고, 이것은 상대적으로 크거나(소포 직경 300nm 내지 2000nm의 범위, 바람직하기로는 평균 직경 500-1000nm) 작을(소포 직경 100nm 내지 400nm의 범위, 바람직하기로는 평균 직경 200 내지 300nm) 수 있다. 리포좀은 평균 직경이 500nm를 초과하지 않는 것이 바람직하고, 실질적으로 모든 직경이 2000nm 미만인 것이 바람직하다.
리포좀은, 소포를 형성하고, 뉴클레오티드와 혼합하여 인트랩되도록 하고, 이어서 탈수시키고, 동결 건조시키고, 후속적으로 수성 조성물에서 재수화하여 탈수-재수화 소포를 만들고, 이어서 바람직하게 미세 유동화시켜 평균 크기를 감소시키는 방법으로 형성한다. 인트랩되지 않은 물질은 재수화 및/또는 미세 유동화 단계 후에, 원심분리 또는 분자체 크로마토그래피에 의해 리포좀으로부터 분리되는 것이 바람직하다.
본 발명자는 DRV´s의 사용이 폴리뉴클레오티드에 대해서 증가된 인트랩먼트 레벨을 제공할 수 있다는 것을 확립했다. 본 발명의 첫 번째 방법에 따라서, 다음의 단계들을 수반해서 폴리뉴클레오티드를 리포좀으로 인트랩핑시키는 방법이 제공된다.
1) 인간 또는 동물에 있어서 목적하는 면역 반응을 유발시키기에 유용한 면역성 폴리펩티드를 유효하게 암호화하는 네이키드 폴리뉴클레오티드 및 미리 형성된 리포좀으로 이루어지는 수용성 현탁액을 형성하고,
2) 상기 현탁액을 동결 건조시키고,
3) 상기 단계 2)의 생성물을 탈수시키고,
4) 상기 단계 3)의 탈수 재수화 소포의 수용성 현탁액을 미소 유동화시키고,
5) 인트랩되지 않은 폴리뉴클레오티드를 리포좀으로부터 분리시키는 단계.
본 발명의 두번째 방법 면을 따라서 다음과 같은 단계들을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 리포좀으로 인트랩핑시키는 방법이 제공된다.
1) 네이키드 폴리뉴클레오티드 및 미리 형성한 양이온계 리포좀으로 이루어지는 수용성 현탁액을 형성하고,
2) 상기 현탁액을 동결 건조시키고,
3) 상기 단계 2)의 생성물을 탈수시키고,
4) 상기 단계 3)의 탈수 재수화 소포의 수용성 현탁액을 미소 유동시키고,
5) 인트랩되지 않은 폴리뉴클레오티드로 리포좀으로부터 분리시키는 단계.
본 발명의 두 방법 중 탈수-재수화는 Kirby 및 Gregoriadis, 1984에 기재된 것과 실질적으로 같다. 따라서, 단계 1)에서 리포좀은 작은 단층 리포좀(SUV´s)이고, 상대적으로 단계 3)에서 만들어진 리포좀은 다층 리포좀(MLV´s)인 것이 바람직하다. 단계 3)의 생성물 리포좀은 일반적으로 탈수-재수화 소포(DRV´s)라고 칭한다. DRV´s의 미소 유동화는 실질적으로 국제 특허출원 제 92-4009호에 기재된 것과 같이 행하였다.
DRV 기술을 사용하여, 본 발명자는 10% 이상의 전체 용질 인트랩먼트 수율이 얻어질 수 있다는 것을 확립했다. 본 발명자는 동결 건조 단계를 거친 수성 현탁액에 존재하는 폴리뉴클레오티드의 90% 또는 심지어 그 이상이 리포좀으로 인트랩될 수 있다는 것을 확립했다. 더구나 미소 유동화로 폴리뉴클레오티드의 결합 백분율의 감소를 초래하지만, 그럼에도 불구하고, 10% 이상, 예를 들면 50% 이상까지 폴리뉴클레오티드의 인트랩먼트율이 얻어지도록 한다. 리포조말 조성물 중 폴리뉴클레오티드 인트랩먼트 레벨은 범위가 0.05 내지 5㎍/μ mole 리피드인 것이 바람직하고, 0.1 내지 1.0㎍/μ mole 리피드인 것이 더욱 바람직하며, 0.2 내지 0.5㎍/μ (또는 리피드 ㎎ 당 DNA 0.1 내지 10㎍ 범위)인 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 이러한 면은 처음 두 가지 면의 리포조말 제제를 만드는데 사용되는 것이 바람직하다.
본 발명의 두 번째 생성물 및 두 번째 방법에 있어서, 비록 폴리뉴클레오티드가 피실험체에서 목적한 면역 반응을 유발하는데 유용한 면역성 폴리펩티드를 유효하게 암호화하는 것이 바람직하지만, 상기 폴리뉴클레오티드는 유전자 치환 요법, 유전자 증강 요법, 유전자 면역요법(예, 종양 치료), 치료학적으로 활성인 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 삽입, 및 세포 독소(예, 종양 세포를 죽이는 것과 같은 세포에 유독한 화합물)를 암호화하는 유전자의 삽입과 같은 다른 응용에 대해서 유전자의 전달에 유용할 수도 있다.
본 발명은 또한 신규한 리포좀의 용도, 또는 본 발명의 신규한 공정에 의해 만들어진 치료 또는 예방 방법에 사용하기 위한 리포좀의 조성물도 포함한다. 예를 들면, 상기 방법은 전염성 미생물에 의한 전염에 대항하여 피실험체를 보호하기 위한 인간 또는 동물의 면역법(왁진주사)일 수 있다. 양자 택일로, 면역 반응은, 예를 들면 종양을 치료하기 위한 면역 치료에 유용한 유전자 생성물에 의해 발생될 수 있다. 이와 달리, 폴리뉴클레오티드는 유전자 증강 또는 치환 요법에 유용할 수 있다.
본 발명은 또한 인간 또는 동물 세포를 트랜스펙팅함에 있어서, 시함관 내에서 본 발명의 첫 번째 또는 두 번째 면에 따른 신규한 조성물의 용도 또는 본 발명의 방법들에서 얻어진 생성물의 용도를 제공한다. 세포들은 후속적으로 시험관 내에서 배양될 수 있고, 또는 후속적으로 세포가 제거된 환자에게 이식될 수 있다. 따라서, 본 발명은, 예를 들면 WO-A-93/14778에 기재된 유형과 같은 생체내 이식 방법을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 첫번째 면에 따른 리포조말 조성물 또는 본 발명의 두번째 면의 생성물과 제약적으로 허용되는 담체를 포함하는 신규한 제약 조성물을 포함한다. 조성물은 주사, 예를 들면, 정맥내(i.v.), 근육내(i.m.), 복강내 (i.p.), 경구 또는 피하(s.c.) 주사에 의해 투여하는 것이 적합할 수 있다. 양자 택일로, 상기 조성물은 비내 투여 또는 흡입법에 의해 허파로 직접 전달 또는 격피성 전달이 적합하다. 리포조말 투여에 사용되는 통상적인 제약 담체가 사용될 수 있다. 본 발명자는 본 발명이 임(im) 기술을 사용한 cDNA의 주입을 허용하는 것에 반하여, 과거에 네이키드 DNA가 왁진으로서 사용되었던 경우, 근육에 어떠한 손상도 피하고, 신뢰할 만한 비교 결과를 제공할 수 있도록 정확히 동일한 위치에 주입하기 위해 특별히 고도로 조절된 주입 프로토콜이 뒤따라야만 한다는 것을 발견했다. 예를 들면, 근육 재생제가 반응을 향상시키기 위해 미리 투여되어야만 하는 것을 발견했다.
본 발명은 또한 신규한 제약 조성물을 인간 또는 동물에 투여하는 치료 방법을 제공한다. 따라서 이 방법은 폴리뉴클레오티드에 의해 암호와된 항원, 예를 들면 전염성 미생물 제제의 항원에 면역 반응을 유발하는 방법일 수 있다. 양자 택일로, 상기 방법은 유전자 치환이나 증강 요법, 면역 요법, 예를 들면 종양 치료 또는 약학적으로 유용한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 투여일 수 있다.
본 발명을 하기 실시예에서 상세히 설명한다. 몇가지 실시예에서 인터페라제를 암호화하는 DNA가 모델 폴리뉴클레오티드로 사용되고, 루시페라제는 모델 유전자 생성물이 된다.
실시예 1. DNA를 암호화는 루시페라제의 인트랩먼트 및 복합체형성 시험관내 세포의 트랜스펙션
물질
계란 포스파티딜콜린(PC), 스테아릴아민(SA) 및 1,2-비스(헥사데실옥시)-3-트리메틸아미노프로판(BisHOP)의 소스 및 등급이 다른 곳(Tan 및 Gregoriadis, 1989)에 기재되어 있다. N[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 (DOTMA)은 Genemedicine(Houston, Texas, U.S.A)에서 얻은 것이다. 포스파티딜세린 (PS) 및 디올레일 포스파티딜에탄올아민(DOPE)은 시그마 케미칼 코(Sigma Chemical Co.) (Poole, Dorset, UK)에서 입수했다. SV40 프로모터로부터 루시페라제 리포터 진을 발현하는 성숙핵 발현 벡터 pGL2-콘트롤(3.99×106달톤)을 프로메가(Promega) (Southampton, UK)에서 구입했다. Gibco BRL(Paisly, UK)에서 입수한 양이온성 LipofectAMINE을 사용하기 전에 15:1(wt:st) 비율로 GLUTAMAX 1(Gibco BRL)을 함유하는 OptiMEM 1 환원 혈청 배지 중에서 pGL2로 복합체를 형성했다. 데옥시리보뉴클리아제(소의 취장, 유형Ⅱ; 비활성:2500 Kunitz units mg-1프로테인)는 시그마 케미칼 코에서 입수했다. RQ1 데옥시리보뉴클리아제(1 유니트 ㎕-1) 및 루시페라제 평가 시스템 키트는 프로메가에서 구입했다. pGL2 플라스미드 DNA는 휠러 (Wheeler) 및 쿠텔(Coutelle)의 방법(1995)에 의하여35S-dATP(37 kBq; ICN Flow, Thame, U.K)로 방사능 표지했다. 기타 모든 시약은 분석등급이였다.
방법
플라스미드 DNA 의 리포좀으로의 혼입
pGL2 플라스미드 DNA를 리포좀으로 혼입시키기 위해 탈수-재수화 처리(Kirby 및 Gregoriadis, 1984)를 사용했다. 요약해서, PC(16μmoles) 및 DOPE(몰비=1:1)로 구성되는 작은 단층 소포(SUV) 2㎖; PC(16μmoles), DOPE 및 PS(몰비=1:1:0.5; 음하전); PC(16μmoles), DOPE 및 SA, 또는 BisHOP(몰비=1:1:0.5; 양하전). PC(16μmoles), DOPE 및 DOTMA(몰비=1:1:0.25;양하전); 및 DOPE(16μmoles) 및 DOTMA(몰비=1:0.25; 양하전)를 상기 (Kirby 및 Gregoriadis, 1984) 처리로 제조하고, pGL-2 10-100㎍(10-100㎕)와 혼합하고, 여기에 트레이서35S-표지 플라스미드 DNA pGL2(6×104-7×104dpm)를 첨가하고, 철야 동결 건조시켰다. 조절(Kirby 및 Gregoriadis, 1984) 재수화 및 다층(Gregoriadis et al. 1993) 탈수-재수화 소포 (DRV)의 발생 다음에, 이들을 40,000×g에서 25분 동안 원심분리해서 비결합 DNA를 제거했다. 리포좀 펠릿을 0.9% Nacl로 보충하여 pH7.2로 유지시킨 0.1M 인산나트륨완충액(PBS) 중에 현탁시킨 후, 다시 원심분리 시켰다. 세척한 펠릿을 PBS 중에 다시 현탁시킨 후, 추가 사용할 때까지 4℃에서 보관했다. 별개의 실험에서, 상기 유리, 비결합 DNA(즉, 원심분리하기 전)와 혼합한 DNA-결합 DRV를 미소 유동화기 M110S(Microfluidics, Newton, MA, USA) 중에서 3 사이클 동안, 또는 1,2,3,5 및 10 사이클(PC:DOPE-:DOTMA 리포좀 유일) 동안 미소 유동화했다(Gregoriadis et al, 1990). 미소 유동화 리포좀 중에서 유리 DNA로부터 결합 DNA의 분리는 세파로스 4B CL 컬럼(Pharmacia)을 사용하는 상기(1,2,3 및 5 사이클) 또는 분자체 크로마토그래피(10 사이클)(Gregoriadis et al, 1990)와 같이 원심분리로 행했다. 몇 개의 실험에서, 미리형성한(DNA-유리) DRV를 DNA 10 또는 50㎍과 혼합하고, 20℃에서 20시간 동안 배양하거나 또는 3 사이클 동안 미소 유동화 시켰다. 양자의 경우에서, 리포좀을 상기와 같이 원심분리해서 비흡착 DNA로 부터 흡착 DNA를 분리했다. DNA의 리포좀으로의 혼입 또는 리포좀 표면상에 DNA 흡착은 현탁시킨 펠릿(비 미소유동 DRV 및 1,2,3 또는 5 사이클 동안 미소유동시킨 DRV) 중에서 회수한35S 방사능에 기초하거나 또는 크로마토그래피(10 사이클) 다음에 용출된 분류물에 기초해서 평가했다.
광자 상호관계 분광학
비 미소유동 DRV 및 미소유동 DRV의 Z-평균 민 사이즈를 Malvern Autosizer IIc(Gerogriadis et al, 1993; Gregoriadis et al, 1990) 중에서 측정했다.
데옥시리보뉴클리아제로 리포좀의 배양
비 미소유동 DRV 또는 PBS 1㎖ 중에서 pGL2 플라스미드 DNA(0.75-22.5㎍) 및 트레이서35S-표지 pGL2 플라스미드 DNA를 결합한 미소유동(3 사이클) DRV를 100 유니트 데옥시리보뉴클리아제 I과 혼합하고, 37℃에서 10분 동안 배양했다. 0.5M EDTA(pH8) 1㎕를 첨가해서 반응을 정지시키고, 혼합물을 원심분리해서 침지하지 않은 리포조말(non-digested liposomal) DNA에서 침지한 DNA를 분리했다. 침지한 DNA를 상징액 중에서 방출된 방사능에 기초하여 평가했다. 예비 작업으로 동일한 조건하에서 네이키드 pGL2 100㎍의 완전한 분해를 확실히 했다. 다른 실험에서, DNA 2㎍을 함유하는 유사한 리포좀의 샘플을 디티오트레이톨 50mM과 소혈청 알부민 50㎍/㎖ (분류물 V; Sigma Chemical Co.)를 함유하는 완충제로 100㎕ 희석시키고, RQ1 데옥시리보뉴클리아제(Promega) 1 유니트와 혼합시킨 후, 37℃에서 30분 동안 배양했다. 0.5M EDTA (pH8.0) 1㎕를 첨가해서 침지를 중단했다.
아가로스-겔 전기영동
비 미소유동 DNA- 또는 미소유동 DNA-결합 DRV의 샘플을 RQ1 데옥시리보뉴클리아제를 첨가하거나 또는 첨가하지 않고 상기와 같이 배양시키고, 이어서 페놀-클로로포름 혼합물로 2회 추출해서 리피드 물질을 제거했다. 수용성 층 중의 DNA를 에탄올을 첨가해서 석출시키고, TE 완충제(Tris-Cl 10mM, pH8.0 및 EDTA 1mM, pH8.0) 20㎕ 중에 현탁시킨 후, 아가로스 겔 전기영동시켜서 DNA 통합성 (integrity)을 결정했다.
트랜스펙션(transfection) 실험
10% 송아지 태아 혈청을 함유하는 FLUTAMAX I(Gibco BRL) 200mM을 첨가한 Dulbecco's 변형 이글 배지(DMEM) 중에 유리시킨 원숭이 신장 COS-7 상피 세포를 트립신화(trypsinization)에 의해서 거두어들이고, 24-웰 플레이트(Falcon)에 파종 (seeding)하고(웰당 5×104), 18 내지 24시간 동안 배양했다. 70-80% 합류점 (confluency)에서 웰 함유 착생 세포를 Dulbecco 인삼염 완충 염수(칼슘 또는 마그네슘 없음, pH7.2(Gibco BRL))로 세척하고, 이어서, GLUTAMAX I을 함유하는 OptiMEM 1 환원 혈청 배지 0.5㎖ 용적 중에서 리포좀 결합체 1㎍(6-18㎕) 또는 pGL2 DNA 1㎍으로 복합체를 형성한 LipofectAMINE(리피드 약 24㎍)으로 트랜스펙트 (transfect) 했다. 이것을 37℃에서 4-6시간 동안 배양시킨 다음에, 트랜스펙션 배지를 제거하고, DMEM 완전배지 1㎖로 대체했다. 세포들을 총 48시간 동안 배양시키고, 리포터 용해 완충액(Promega) 200㎖로 스크래핑(scrapping)하여 용해시키고 (세포 용해는 드라이 아이스상에 1 사이클 동결용해로 증대되었다), 이어서 12,000×g에서 5분 동안 원심분리해서 맑은 상징액을 얻었다. 이들을 60초 동안 기록한 총발광을 갖는 LKB 1251 루미노미터(luminometer)를 사용하여 루시페라제 분석 시스템 키트로 루시페라제 활성을 3배로 평가했다. 각 용해질 중의 단백질 농도를 Bio-Rad 단백질 분석 용액을 사용하는 브래드포드(Bradford)방법(1976)에 의해 측정했다. 루시페라제 활성을 단백질 ㎎당 상대 광 유니트(RLU/㎎)로 나타냈다.
결과
플라스미드 DNA의 리포좀으로의 혼입
플라스미드 DNA를 중성 DRV [직경 710-843㎚; PC 및 DOPE로 구성된 실시예 1.1.(1-6), 인지질(phospholipid)로 일컬음(Legendre 및 Szoka, 1995)]에 혼입시켜서 트랜스펙션을 촉진하고, 음으로(590-871㎚; 실시예 1.2.(1-5) 또는 양으로 (647-899㎚; 실시예 1.3.(1-6), 1.4.(1-4) 및 1.5.(1-2) 하전된 암피필 (amphiphiles)로 보충한 유사한 리포좀에 혼입했다. 하전된 소포 이층(bilayer)을 이층 사이에서 수용성 스페이스를 넓게 하고, 용질 인트랩먼트를 크게 하는데 기여하는 것으로 알려졌다. 음하전 DNA의 경우에, 양하전 리포좀(양이온성 DRV)의 결합의 추가 향상은 정전기적 상호 작용의 결과로서 기대된다. 표 1은 중성 DRV 중에서 DNA의 결합이 상당하고(44-55%), 음하전 DRV에 있어서, 실시예 1.1.(1-6) 및 1.2.(1-5)의 사용량(10-100㎍) 각각에 대해서 더욱 큰 것임(45-63%)을 나타낸 것이다. 또한, 대부분의 DNA가 소포내에 혼입되는 것 보다는 오히려 리포좀 표면에 흡착되는 가능성은 없는 것으로 사료되며, 미리 형성한 DRV를 네이키드 DNA로 배양시키면, 이것이 알맞는 비율(12∼13%)에서만 원심분리 후 DRV와 함께 회수된다(실시예 1.1.7 및 1.2.(6-7)). 비결합(유리) DNA 존재하에 유사한 DNA-결합 DRV의 미소유동화(3 사이클)는 중성 DRV의 경우에 상당히 감소된(10-20%) 그리고 음하전 리포좀(실시예 1.1.(1-6) 및 1.2.(1-5)에 대해서는 보다 적은 정도(37-51%)로 감소된 DNA 함량을 갖는 보다 작은(직경 209-329㎚)소포를 생성한다. 다시, 매우 적은, (6 및 10%) DNA를, 미리 형성한 DRV를 유리 DNA(실시예 1.1.7 및 1.2.(6-7)) 존재하에 미소 유동화시켰을 경우에 리포좀과 함께 회수했다.
예상한 바와 같이, 양이온성 SA, BisHOP 및 DOTMA DRV 중에서 DNA의 결합은 미소유동화 DRV(269-383㎚; 실시예 1.3.(1-6), 1.4.(1-4) 및 1.5.(1-2))에 대해서 높게 남아 있는 값(50-83%)보다 더 크다(62-92%). 그러나 여기서, 미리 형성한 양이온성 DRV(SA)를 네이키드 DNA로 배양 또는 미소유동화시킨 후에, 사용한 물질의 40-60% 정도가 리포좀과 함께, 아마도 소포 표면 결합체(실시예 1.3.(7-9))로서 회수되었다.
데옥시리보뉴클리아제로 리포좀 DNA의 배양
표 1은 중성(45-72%), 음하전(58-69%) 또는 양하전(68-86%) 리포좀 중에 결합된 DNA의 대부분이 DNase에 의해 분해되지 아니했음을 나타낸 것이다. 이와 대조적으로, 효소에 노출된 후 중성 리포좀 또는 음하전 리포좀의 표면에 흡착된 DNA의 회수는 낮았다(18%)(실시예 1.1.7 및 1.2.6). 그러나, 양이온성(SA) 리포좀의 표면에 흡착된 DNA의 상당한 부분(41-58%)이 DNase에 의한 분해에 유용하지 못했다(실시예 1.3.(7-8)). 이것은 양이온성 소포에 일어날 수 있고, DNase에 내성인 것으로 알려진 농축 DNA 상태에 기인될 수 있다(Legendre 및 Szoka, 1995). 이러한 발견에 비추어서, 결합 과정의 종기에서 양이온성 리포좀 내에서 DNA 결합의 정도(이들의 표면에 결합되는 것과 반대임)는 정확하게 평가하는 것이 어렵다.
DNase에 대한 리포좀 DNA 취약성의 결과는 네이키드 DNA 또는 리포좀 DNA의 샘플을 RQ1 데옥시리보뉴클리아제에 노출시키고, 이어서 아가로스 겔 전기영동시키는 실험에서 주로 확인했다. 얼룩의 강도와 얼룩의 출현에 기초하여, 네이키드 플라스미드 DNA는 완전히 침지되는데 반하여, 양이온성 리포좀으로 인트랩된 DNA는 완전히 보호된 것을 알 수 있다. 한편, 중성 DRV 및 음하전 DRV 중에서 DNA는 침지하지 않는 것과 비교한 DNase 침지 샘플에서 보다 약한 밴드에 의해서 평가된 바와 같이 잘 보호되지 않았다.
리포좀 pGL2 플라스미드 DNA로 트랜스펙션
COS-7 세포를 비 미소유동 DRV 리포좀에 혼입시킨 pGL2 플라스미드 DNA로 트랜스펙트 하거나 또는 LipofectAMINE으로 복합체를 형성한 실험에서, 대조로서 후자를 제공한 경우에, 이면에서 상당한 수준의 루시페라제 활성이 DRV 제제 각각에 대해서 관찰되었다. 그러나, 양이온성 DRV(DOPE:DOTMA, PC:DOPE:DOTMA 및 PC:DOPE:SA)를 갖는 활성의 수준은 중성(PC:DOPE) 및 음하전(PC:DOPE:PS) 및 양이온성 PC:DOPE:BisHOP 리포좀 (표 2)으로 달성한 것보다 10배 높았다. 리포좀의 크기는 트랜스펙션의 효율에 관계될 수 있으므로, 관련 실험을 점진적으로 작아지는 크기(386,319,262,235 및 123㎚ Z-평균직경; 도시하지 않음)의 소포를 생산하기 위하여 1,2,3,5 또는 10 사이클 동안 미소유동화시킨 DRV 중에 혼입시킨 DNA로 행했다. 표 2는 PC: DOPE: DOTMA DRV의 미소유동(3 사이클)이 이들의 트랜스펙션 효율을 10배 향상시켰음을 나타낸 것이다. 그러나, 5 또는 10 사이클로 미소유동화시킨 PC:DOPE:DOTMA, DOPE:DOTMA, PC:DOPE 및 PE:DOPE:PS 리포좀으로 행한 트랜스펙션 실험을 DNA의 미소유동화-유도 점진적 얼룩에 의해 설명될 수 있는 중요한 루시페라제 활성(결과를 나타내지 않음)을 나타내는데 실패했다.
실험한 DRV 제제, 양하전 SA 및 DOTMA DRV 모두가 트랜스펙션의 가장 높은 값을 나타내는 미소유동제제(DOTMA)로 나머지 보다도 더욱 효과적인 것 같다. 그러나, 이 제제는 대조 LipofectAMINE 보다 10-15배 덜 효과적이였다.
트랜스펙트 세포 중에서 루시페라제 활성
실시예 리포좀 루시페라제 활성
1.6.1 DOPE:DOTMA 1.5 × 104
1.6.2 PC:DOPE:DOTMA 1.3 × 104
1.6.3 PC:DOPE:DOTMA MFx3 7 × 104
1.6.4 PC:DOPE:BisHOP 2 × 103
1.6.5 PC:DOPE:SA 9 × 103
1.6.6 PC:DOPE 2 × 103
1.6.7 PC:DOPE:PS 3 × 103
1.6.8 LIPOFECTAMINE 3 × 106
Mf x 3 - 미소유동화, 3 사이클.
실시예 2. 생체내 트랜스펙션 후 면역반응
실시예 1에 기재되어 있고 실시예 1의 소스에서 얻은 물질과 그 외에 Dr C Kirby가 입수한 3β[N-(N´N´-디메틸아미노에탄)-카르바밀]콜레스테롤, DC-CHOL 및 DOTAP-1,2-디올레오일옥시-3-트리메틸암모늄 프로판을 사용하여, 실험을 해서 생체내 트랜스펙션 후 면역반응을 측정했다. 폴리뉴클레오티드는 간염B 표면항원(S 영역, ayw 유형의 플라스미드 pRc/CMV-HBS(Davis HL et al))을 발현하는 플라스미드 DNA 이다. 리포좀은 PC 16 미크로몰(12㎎)을 사용하는 각각의 경우에 있어서 표들에서 사용한 비율로 표들에 열거한 양이온성 리피드로 형성했다. 플라스미드 DNA는 실시예 1의 방법을 사용하여 리포좀(표에 기재한 양으로)으로 인트랩하거나, 또는 미리 형성한 양이온성 리포좀과 DNA의 복합체는 이들 성분을 수용성 현탁액 중에서 함께 혼합해서(상기 Eppstein의 선행기술과 비교할 만한 기술을 사용) 제조한다.
이어서, 인트랩된 DNA, 복합체 및 네이키드 DNA를 갖는 리포좀을 생체내 트랜스펙션 실험을 위해서 마우스에 투여했다. 3 또는 4 마리 군의 Balb/c 마우스에 표들에 기재된 DNA ㎍을 투여할 정도의 양으로 제제를 근육내(뒷다리)로 주사했다. 플라스미드 DNA를 실시예 1의 방법을 사용하여 리포좀으로(표에 기재된 양으로) 인트랩하거나, 또는 미리 형성한 양이온성 리포좀과 DNA의 복합체는 이들 성분을 수용성 현탁액 중에서 함께 혼합해서(상기 Eppstein의 선행기술과 비교할만한 기술을 사용) 제조한다.
이어서, 인트랩된 DNA, 복합체 및 네이키드 DNA를 갖는 리포좀을 생체내 트랜스펙션 실험을 위해서 마우스에 투여했다. 3 또는 4 마리 군의 Balb/c 마우스에 표 4에 기재된 DNA 수준을 투여할 정도의 양으로 제제를 근육내(뒷다리)로 주사했다. 각 시험에 대해서, 마우스에 투여한 리포좀 제제 중의 리피드의 양은 대략적으로 일정하여, 전체 PC 리피드 1-2㎎ 범위의 값이다.
이어서, 마우스를 출혈시키고, 혈청을 면역반응을 결정하기 위하여 ELISA 기술로 시험했다. 이들 생체 내 실험에서, ELISA 시험을 awy형 간염 B의 S영역 항원을 사용하는 데이비스 등에 의해 공지된 기술(1987)과 같이 행했다. 항 HBS Ag(S영역 awy형)-IgG1, IgG2a및 IgG2b를 결정하기 위해 시험을 행했다. 얻어진 면역 반응을 흡수 판독치(양고추냉이 퍼옥시다제 ELISA 시험에서) 약 0.200을 얻기 위해 요구되는 혈청 희석액의 log10(평균치 + 또는 표준편차)로서 나타냈다.
실험에서, 실험의 결과를 표 4에 기재했으며, 마우스에 0일, 제 10일, 제 20일, 제 27일 및 제 37일에 주사했고, 제 26일, 제 34일 및 제 44일에 출혈했다. 표 5에 나타낸 결과에서, 마우스에 0일, 제 7일, 제 14일, 제 21일 및 제 28일에 주사했고, 제 21일 및 제 28일에 출혈했다.
결과 및 결론
플라스미드 DNA의 인트랩먼트(리포좀으로)
실시예 리포좀(몰비) 인트랩 또는복합체 형성 DNA 사용량(㎍) 인트랩먼트/복합화율(DNA의 사용%)
2.1 PC, DOPE(1:0.5) E 100 57.3
E 150 53.6
2.2 PC, DOPE,DC-CHOL(1:0.5:0.25) E 100 95.4
E 150 78.9
2.3 PC, DOPE,DOTAP(1:0.5:0;25) E 100 82.9
E 100 78.4
E 150 77.1
E 150 82.1
2.4 PC, DOPE,DOTAP(1:0.5:0.25) C 100 93.9
C 150 83.3
유리 또는 리포좀으로 인트랩된 DNA로 면역시킨 마우스의 면역반응 *(ELISA 결과±SD)
리피드, 제조비율(실시예) DNA 주사량(㎍) 26일 34일
IgG1 IgG2a IgG2b IgG1 IgG2a IgG2b
PC, DOPE,DOTAP (2.3)(1.0:0.5:0.25) 5 3.1±0.2 2.2 ND 4.2±0.4 3.2±0.0 3.1±0.2
10 3.2±0.0 ND ND 4.2±0.0 3.2±0.0 3.2±0.0
PC:DOPEDC-CHOL (2.2)(1.0:0.5:0.25) 5 3.2±0.3 2.2 ND 4.0±0.2 3.0±0.3 2.7±0.0
10 3.0±0.3 ND ND 4.0±0.2 3.6±0.2 3.1±0.2
네이키드 DNA 5 3.2±0.0 ND ND 2.2±0.0 2.2±0.0 1.8±0.0
10 2.4±0.2 ND ND 2.2±0.0 2.2±0.0 1.8±0.0
표 4 계속
리피드, 제제비율(실시예) DNA 주사량(㎍) 44일
IgG1 IgG2a IgG2b
PC, DOPE,DOTAP (2.3)(1.0:0.5:0.25) 5 5.5±0.2 3.1±0.3 2.7±0.0
10 4.8±0.5 3.4±0.3 3.0±0.3
PC:DOPEDC-CHOL (2.2)(1.0:0.5:0.25) 5 5.2±0.2 3.0±0.3 2.9±0.3
10 5.0±0.2 3.4±0.3 3.2±0.0
네이키드 DNA 5 3.2±0.0 2.2±0.0 2.2±0.0
10 2.9±0.3 2.2±0.0 2.2±0.0
ND는 "측정 않음"을 의미한다.
※ 희석의 log10은 ELISA 시험에서 약 0.200의 판독치를 얻기 위해 요구되었다.
도 1참조, 여기서 A는 DOTAP를 포함하는 리포좀의 결과를 나타내고, B는 DC-Chol을 포함하는 리포좀의 결과를 나타내고, C는 동일한 양으로(표에 나타내지 않음) 스테아릴아민을 포함하는 리포좀의 결과를 나타내고, D는 네이키드 DNA를 나타내며, 각각의 경우에 있어서, DNA 5㎍을 투여했다. 백색 막대는 IgG1치이고, 흑색 막대는 IgG2a이고, 점선 막대는 IgG2b이다.
네이키드 DNA, 복합화 DNA 및 인트랩된 DNA로 면역시킨 마우스의 면역반응 (ELISA 결과±SD)
DNA 제제(실시예) 시험 보고 DNA 주사량(㎍) 21일 28일
IgG1 P IgG1 P
PC, DOPE,DOTAP1.0:0.5:0.25(인트랩됨)(2.3) a 1 2.2±0.0 2.5±0.3 a vs g〈0.05
b 10 3.2±0.0 b vsa,c,d,e,f,g,h〈0.0001 4.0±0.2 b vs h〈0.0007
PC, DOPEDOTAP1.0:0.5:0.25(복합됨)(2.4) c 1 2.2±0.0 2.4±0.2
d 10 2.2±0.0 2.8±0.2 d vs b〈0.0032
PC, DOPE(2.1)1.0:0.5 e 1 2.2±0.0 2.2±0.0
f 10 2.2±0.0 2.7±0.0 f vs b〈0.001f vs h〈0.003
네이키드 DNA g 1 2.2±0.0 2.2±0.0
h 10 2.2.±0.0 2.2±0.0 h vs d〈0.0001
상기 표에서, 칼럼 P는 열거한 결과들이 서로 다른 신뢰수준을 나타내는 한쌍 학생 t-시험의 결과를 나타낸 것이다.
표 3은 인트랩먼트 백분율이 양이온성 리피드를 함유하는 리피드 조성물에 대해서 지극히 높은 것을 나타내준다. 플라스피드 DNA를 미리 형성한 리피드로 복합화시키는 비율 또한 매우 높다. 각 경우에 있어서, 인트랩먼트 백분율/복합화 비율은 DNA 100㎍ 또는 150㎍의 사용에 의해 변화를 가져오지 않았다.
표 4 및 도 1은 간염 B 표면항원을 암호화하는 인트랩된 DNA로 마우스를 면역시킨 다음의 면역반응이 네이키드 DNA로 면역시킨 다음의 것보다 더 높은 것을 나타낸다. 한편, 이 효과는 실험 개시 26일 후에 이미 명백하며, 이 효과는 실험을 계속할 때에 더욱 현저해 진다. 이 효과는, IgG2a및 IgG2b의 레벨이, 모두 출혈한 후에, 네이키드 DNA 전달에 비교해서 증가된 양으로 존재할지라도 IgG1에 대해서 특히 현저하다.
표 5의 결과는 네이키드 DNA에 대해서, DNA 최초 투여 28일 후에도 반응이 없는 것을 나타낸다.
중성 리포좀(PC, DOPE)내에 인트랩된 DNA에 대해서, 보다 많은 양으로 DNA를 주사한지 28일 후에 면역 반응에 있어서 약간의 증가가 있을지라도, 그리고 이것이 네이키드 DNA를 투여한 후 반응보다 현저히 높다고 할지라도, 21일 후에 면역반응에 있어서 증가가 없다.
미리 형성된 양이온성 리포좀과 DNA의 복합체에 대해서, 면역반응은 실험초기로부터 28일후에, DNA 투여의 양 레벨에 대해서 발전하는 것으로 나타나며, 이것은 네이키드 DNA의 투여 후 반응보다도 현저하게 높다. 그러나, 면역반응은 양이온성 리포좀내에 인트랩된 DNA에 대해서 얻어진 것들 만큼 높지는 않다.
21일 후 인트랩된 DNA를 갖는 양이온성 리포좀에 대해서, 이미 면역반응은 다른 실시예의 모든 것 보다도 상당히 높으며, 여기서 DNA의 주사량은 10㎍이고, 양이온성 리포좀 내에 인트랩된 DNA 1㎍을 투여한 후의 반응과 DNA 1㎍을 투여한 다른 실시예의 반응 사이에 현저한 차이는 없다. 28일 후, DNA의 저수준(1㎍)을 투여했을 때에 네이키드 DNA를 다량으로 또는 소량으로 투여한 경우와 비교했을 경우 면역반응이 현저하게 증가했다. 그러나, 양이온성 리포좀으로 복합시키거나 또는 중성 리포좀 내에 인트랩된 저수준의 DNA를 투여한 다음에 반응에 현저한 차이가 없다. 양이온성 리포좀에 인트랩된 고수준의 DNA 투여(10㎍)에 대해서, 28일 후에 면역반응은 다른 시험의 모든 것 보다도 현저하게 높다.
실시예 3. 네이키드, 복합화 또는 리포좀 인트랩된 플라스미드 DNA로 면역시킨 마우스의 비장에서 사이토킨 농도
4마리 군의 Balb/c 마우스(실시예 2와 동일한 프로토콜 및 실험)에 PC, DOPE 및 DOTAP(A)로 구성되는 양으로 하전된 리포좀, PC 및 DOPE(B)로 구성되는 비하전 리포좀 중에 인트랩시키고, 미리 형성한 비슷한 양이온성 DOTAP 리포좀(C)으로 복합화시키거나 또는 네이키드형(D)의 pRc/CMV HBS 1㎍(백색 막대) 또는 10㎍(흑색 막대)을 0일, 제 7일, 제 14일, 제 21일 및 제 28일에 근육내로 주사했다. "대조"는 보통의 면역시키지 않은 마우스의 사이토킨 농도를 나타낸다. 최종 주사 3주 후에, 마우스를 죽여서 마우스의 비장을 사이토킨 분석으로 처리했다. 비장 중의 IFN-γ 및 IL-4의 내생농도를 de Souza 등에 의해서 미리 변형시킨 것과 같은 Nakane 등의 방법으로 측정했다. 개개의 비장을 무게를 달고, 다운스 조직 균등기(Dounce tissue homogenizer) 중에서 1% 3-[(콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트(CHAPS; Sigma)를 함유하는 빙냉 RPM1 중에서 균질화시켜서 10%(wt/vol) 균등질을 제조했다. 균등질을 얼음 위에서 1시간 동안 방치하고, 이어서 불용성 부스러기를 2000 xg에서 20분 동안 원심분리시켜 제조했다. 맑은 상징액을 -70℃에서 보관했다.
사이토킨 평가분석
표준 포착 ELISAs를 모노클로날 항체쌍 및 Maxisorp(NUNC, UK) 플레이트와 함께 사용했다. IFN-γ(R46A2) 및 IL-4(11B11)에 대한 주 모노클로날 항체 및 이차 바이오티닐화 안티-마우스 IL-4(BVD6-24G2) 및 안티-마우스 IFN-γ(XMG1.2)모노클로날 항체(Pharmingen, USA)를 기질로서 스트렙타비딘 퍼옥시다제(Dako, Denmark) 및 O-페닐렌디아민(Sigma)와 함께 사용했다. 재조합 IFN-γ 및 IL-4 스탠다드를 Pharmingen으로부터 입수했다. 결과(평균±SE)를 적어도 4 마리의 마우스에서 ng/비장으로 나타냈다. 결과를 도 2에 나타냈으며, 여기서 각각의 막대는 4마리 마우스 군의 평균±SE를 나타낸다(a-d는 상기한 리포좀을 나타냄).
데이터(도 2)는 Th1및 Th2서브세트(subset) 모두에 대한 활성화가 네이키드 DNA와 비교했을 때에 리포좀-인트랩 DNA으로 보다 커졌음을 나타낸다. 이 발견은 또한 시험관내 HBsAg 항원에 대한 예비 T 세포 증식 평가 분석에서 확인되었다. 그러므로, 리포좀-인트랩 플라스미드 DNA가 체액 및 세포-중개 면역을 일으키는 것으로 생각되어진다.
실시예 4. 플라스미드 DNA 단일 주사 후 마우스의 면역반응
네이키드 DNA 왁진주사에 관한 대부분의 보고는 다중 주사의 프로토콜을 이용했으나, 단일 투여는 암호화한 항원에 대해서 체액 반응을 일으킨다(Davis et al Human Gene Therapy 1993 및 Raz et al PNAS 1994). 예를 들면, 네이키드 pRc/CMV HBS(본 발명에서 사용한 플라스미드와 동일함)에 대한 전체 IgG 반응은 주사 후 1-2주에 검출할 수 있고, 4-8주에 피크치에 도달한다(Davis et al 1996).
4 마리 군의 Balb/c 마우스에, PC, DOPE 및 DOTAP(A)로 구성되는 양으로 하전된 리포좀, PC 및 DOPE(B)로 구성되는 비하전 리포좀 중에 인트랩시키고, 미리 형성한 비슷한 DOTAP 리포좀(C)으로 복합화시키거나 또는 네이키드형(D)의 pRc/CMV HBS 2㎍(백색 막대, 도 3참조) 또는 10㎍(흑색 막대)으로 1회 근육주사했다. 안티-HBsAg IgG1반응을 주사 후, 시간 간격을 두고 얻은 혈청 중에서 분석했다(ELISA). 면역 반응은 리포조말 DNA로 주사한 모든 마우스에서 올라갔지만, 20-27일 후에만 측정할 수 있게 되었다. 나머지 상세한 것은 실시예 2에 기재한 바와 같았다. 양이온성 리포조말 DNA로 면역시킨 마우스와 네이키드 DNA로 면역시킨 마우스 사이에서 Log10값(양자 투여: 모두 시간 간격을 가짐)의 차이는 통계적으로 중요하다( P〈 0.001-0.002). PC, DOPE 및 PS로 구성되는 음이온성 리포좀(실시예 1에 기재한 바와 같은 방법으로 제조했음) 중에 인트랩시킨 pRc/CMV HBS로 위와 같이 한번 면역시킨 네 마리 마우스의 제 5군에서, IgG1반응(log10)은 각각 21일 및 29일에 2.25 ±0.0 및 2.73±0.0 이었다. 더욱 낮은 투여량(2 및 10㎍)의 pRc/CMV HBS로 단일 면역(도 3)시키는 현재의 조건하에서, 네이키드 DNA 및 복합 DNA에 대한 안티-HBsAg IgG1반응은 7주 후에라도 거의 검출할 수 없었다. 이와 대조적으로, 양이온성 리포좀 중에 인트랩시킨 DNA에 대하여 조기에 현저한 IgG1반응이 있었지만, 중성 또는 음으로 하전된 리포좀 중에 인트랩시킨 DNA에 대해서는 지연되었으나 중요한 반응이 있었다(도 3).
실시예 5. 양이온성 리포좀 중의 Hep B 항원으로 주사한 동종 및 이종 마우스의 체액 및 세포-중개 반응
마우스의 군(군당 4-5마리)에 계란 포스파티딜콜린(PC), 디올레오일 포스파티딜콜린(DOPE) 및 1,2-디올레오일-3-(트리메틸암모늄)프로판(DOTAP)(몰비 1:5.5: 0.25)으로 구성되는 양이온성 DRV 리포좀(상기 실시예 1에 기재한 일반적인 기술과 물질을 사용하여 제조함) 중에 인트랩시킨 pRc/CMV HBS(간염 B 표면 항원의 S영역을 암호화함;서브타입 ayw) 10㎍ 또는 네이키드 pRc/CMV HBS(모두 PBS 중) 10㎍으로 0일 및 제 7일에 2회 주사했다(근육내, 복강내, 정맥내 또는 피하주사). 마우스를 시간 간격을 두고 출혈시키고, IgG1, IgG2a및 IgG2b를 플라스마 중에서 ELISA에 의해 측정했다. 실험 종기에(첫 번째 주사 후 38일째), 마우스를 죽이고, 사이토킨 IFNγ 및 IL-4를 상기한 바와 같이 비장에서 측정했다(추가적인 실험 상세는 Gregoriadis et al, 1997 참조). 사이토킨은 또한 대조(손상하지 않음) 마우의 비장에서 측정했다.
결과
결과는 마우스 양 종족에 대한 면역 반응(평균±SD)이 첫 번째 주사 후 21일 후(IgG1;도 4) 또는 28일 후(IgG2a및 IgG2b: 각각 도 5 및 도 6)에만 측정할 수 있게 되었다. 리포조말 DNA에 대한 반응(흑색 막대)은 일반적으로 네이키드 DNA에 대한 반응(점선 막대)보다 현저하게 컸다(양종족 및 모든 투여경로, 특히 근육내, 피하 및 정맥내 주사). 중요한 레벨(P〈 0.05)는 - *,**,*** 순서로 증가한다.
사이토킨 IFNγ(Th1 반응)(도 7) 및 인터루킨 4(IL-4)(Th2 반응)(도 8)를 분석한 결과 (T/O 마우스에서 정맥내 경로)에 대한 양종족에서 근육내 및 피하 경로에 의한 리포조말 DNA에 대해서 레벨이 현저하게 큰 것으로 나타났다. 복강내 경로(양종족)에 대한 리포조말 DNA와 네이키드 DNA 사이에 값의 차이가 없었다.
실시예 6. 6개의 다른 플라스미드 DNA에 대한 인트랩치
35S-표지 플라스미드 DNA(10-500㎍)를 실시예 1에 기재된 기술을 사용하여 중성, 음이온성 또는 양이온성 탈수 재수화 소포(DRV)에 혼입 또는 혼합시켰다. 사용한 플라스미드 DNA는 다음과 같았다.
pGL2 - 실시예 1에서와 같이, 루시페라제 암호화
pRc/CMV HBS - 실시예 2에서와 같이, 간염B 표면 항원(S)영역
pRSVGH - 인간 성장 호르몬 암호화, 치료 단백질
pCMV4.65 - 미크로박테륨속 나병 단백질, 항원체
pCMV4.EGFP - "형광녹색 단백질"
VR1020 - 주혈흡충 단백질, 항원체
사용한 리피드는 상기 실시예 1에 기재된 중성 리피드 PC 및 DOPE, 음이온성 리피드, PS, 실시예 1에 기재된 포스파티딜 혈청 또는 포스파티딜 글리세롤(PG) 및 양이온성 화합물 스테아릴아민(SA), BisHOP 및 DOTMA(모두 실시예 1에 기재됨), 실시예 2에서 사용한 DC-Chol 및 DOTAP, 그 외에 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄 프로판 DODAP를 포함했다.
아래 표는 플라스미드 DNA가 결합 ((a)DRV로 캡슐화 또는 단지 (b)DRV와 혼합)된지 여부를 나타낸다. 이 표는 또한 리피드 성분과 DNA에 대한 결합치를 나타내고 있다. 이전 시험들은 각각의 DRV 제제에 대해서 상이한 양의 DRV를 사용하는 결합치가 현저하게 다르지 않았다는 것을 나타냈다. 그러므로, 결과를 모으고, 표 중에 기재한 값은 3 내지 5개의 실험에서 얻은 값의 평균치이다.
플라스미드 DNA의 리포좀으로의 혼입
리포좀 혼입 플라스미드 DNA(사용율 %)
pGL2 pRc/CMV HBS pRSVGH pCMV4.65 pCMV4.EGFP VR1020
PC, DOPEa 44.2 55.4 45.6 28.6
PC, DOPEb 12.1 11.3
PC, DOPE, PSa 57.3
PC, DOPE, PSb 12.6
PC, DOPE, PGa 53.5
PC, DOPE, PGb 10.2
PC, DOPE, SAa 74.8
PC, DOPE, SAb 48.3
PC, DOPE, BisHOPa 69.3
PC, DOPE, DOTMAa 86.8
PC, DOPE, DC-Chola 87.1 76.9
PC, DOPE, DC-Cholb 77.2
PC, DOPE, DOTAPa 80.1 79.8 52.7 71.9 89.6
PC, DOPE, DOTAPb 88.6 80.6 67.7 81.6
PC, DOPE, DODAPa 57.4
PC, DOPE, DODAPb 64.8
상기 결과는 DNA를 캡슐화함으로써, 훨씬 높은 값의 결합 수준이 리피드가 음으로 하전되었을 경우에 얻어질 수 있음을 나타낸다. 양이온성 리피드가 사용될 경우에, 캡슐화가 양이온성 성분이 비리피드성 화합물(스테아릴아민)일 경우에 더 높은 값을 줄지라도, 결합치는 캡슐화와 물리적 혼합 사이에 현저히 다르게 나타나지 않는다.
실시예 7. 인트랩된 pRc/CMV HBS에 의해 암호화한 HBsAg 항원에 대한 면역반응에 대한 양이온성 리포좀의 유효한 리피드 조성
상기 일반적인 기술을 사용하여, 플라스미드 DNA를 여러가지 양이온성 리포좀에 인트랩시켰다. 사용한 리피드와 몰비율을 하기 표 7에 나타냈다. 리피드는 앞의 실시예들에서 사용한 것들이고, 추가 PE는 계란 리피드를 갖는 포스파티딜 에탄올아민, DSPC, 디스테아로일포스파티딜콜린, 포화 리피드 이다. 다섯 마리로 되는 군의 Balb/c 마우스에 유리 플라스미드 또는 리포좀 인트래핑시킨 플라스미드 10㎍을 0일, 2주 후 및 5주 후에 근육내로 주사했다. 마우스를 8주, 10주 및 13주 후에 출혈시키고, 혈청을 안티-HBsAg(S영역), IgG1항체에 대해서 ELISA에 의해서 평가분석했다. 사용한 기술은 실시예 5에 일반적으로 기술한 것과 같다. 결과를 하기 표 7에 나타냈다.
리피드의 리포좀 몰비 IgG1(log10역수 종말점 희석도±SD)
8주 10주 13주
A. PC:DOPE:DOTAP (1:0.5:0.25) 2.99±0.24 2.87±0.29 2.63±0.15
B. PC:PE:DOTAP (1:0.5:0.25) 2.99±0.56 3.17±0.64 2.75±0.35
C. PC:DOTAP (1:0.25) 2.05±0.66 1.98±0.58 1.83±0.33
D. DSPC:DOPE:DOTAP (1:0.50:0.25) 2.51±0.19 2.48±0.19 1.90±0.00
E. PC:Chol:DOTAP (1:0.50:0.25) 2.57±0.35 2.51±0.27 2.14±0.23
F. Free pRC/CMV HBS 1.30±0.00 1.30±0.00 1.23±0.13
결과치(쌍을 이루지 않은 T시험)의 통계학적 분석은 (a) 모든 리포조말 DNA 제제와 유리 DNA (P〈 0.0001-0.0441;모두 시간 간격), PC:DOPE:DOTAP 및 PC:DOTAP (P〈 0.0036-0.0357;모두 시간 간격), PC:PE:DOTAP 및 PC:DOTAP (P〈 0.0095-0.0385; 10주 및 13주), PC:DOPE:DOTAP 및 DSPC:DOPE:DOTAP (P〈 0.0001-0.0138, 8주 및 13주) 및 PC:DOPE:DOTAP 및 PC:CHOL:DOTAP (P〈 0.0158;13주) 사이에 현저한 차이를 나타냈다.
상기 결과는, 면역반응을 촉진하는 리포조말 효력면에서, a) DOPE가 리포조말 효력을 상실하지 않고 PE에 의해서 대체될 수 있고(DOPE 및 PE는 모두 불포화 리피드 이다), b) 포스파티딜에탄올아민(PE 또는 DOPE)이 이러한 유형의 리피드 없이 리포좀보다 리포좀을 더욱 유효하게 하고, c) PC를 포화 DSPC로 대체하면 리포조말 효력을 감소시키고, d) 콜레스테롤은 갖지만 포스파티딜에탄올아민은 갖지 않은 리포좀은 포스파티딜에탄올아민을 갖는 리포좀만큼 거의 효과적이지만 8주 및 10주 후에만 효과적인 것을 암시해 준다.
실시예 8. pRc/CMV HBS의 비인지질 리포좀으로의 인트랩먼트
이 실시예에서, 앞의 실시예에서 사용한 간염 항원을 인트래핑시키기 위하여 인지질 이외의 여러가지 리포좀 형성 성분들을 사용했다. 리포좀 형성 성분들은 글리세라이드, Monopal; 1-모노팔미토일-rac-글리세롤, 및 비이온계 계면 활성제, Span 60(-소르비탄 모노스테아레이트) 및 Solulan 24,(라놀린 알콜 및 관련 지방 알콜의 24몰 에톡실화 복합체)를 포함했다. 리포좀 형성성분들의 몰비를 표에 나타냈다. 기타 성분들은 상기 실시예에서 사용한 것이다.
결과는 적당한 인트랩먼트율은 인지질을 함유하지 않는 리포좀 형성 성분들을 사용하여 성취할 수 있다. 임의로 콜레스테롤 등의 기타 비인지질 리피드 성분들과 조합하는 비이온계 계면활성제는 적당한 인트랩먼트율을 줄 수 있다. 실시예 8.4, 8.5, 8.6 및 8.8에서 형성한 리포좀이 방치 후에 침전되었고, 그리하여 조성면에서 낙관적인 아니였음을 알았다.
인트랩먼트율을 하기 표 8에 나타냈다.
실시예 리포좀 몰비(또한 μ몰 면에서 절대치) 인트랩먼트(DNA 사용율%)
8.1 MonoPal:Chol:DOTAP 16:16:4 63.2
8.2 MonoPal:Chol:DOTAP 20:8:4 84.0
8.3 MonoPal:Chol:DOTAP 16:8:4 64.1
8.4 MonoPal:DOPE:DOTAP 16:8:4 28.1
8.5 MonoPal:ChollDOPE:DOTAP 16:16:8:4 46.4
8.6 SPAN60:ChollDOTAP 16:16:4 83.6
8.7 SPAN60:Solulan:Chol:DOTAP 16:0:72:16:4 66.0
8.8 SPAN60:Chol:DOTAP 20:8:4 55.8
참고문헌

Claims (32)

  1. 리포좀 형성 성분들로부터 형성되는 리포좀, 및 리포좀 내에 인트랩되며, 인간 또는 동물에서 목적하는 면역반응을 유발시키기에 유용한 면역성 폴리펩티드를 유효하게 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 조성물
  2. 제 1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 이중 가닥의 DNA인 조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 촉진제와 리보좀 결합 시퀀스를 포함하는 플라스미드 형태인 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 RNA, 바람직하기로는 mRNA인 조성물.
  5. 상기 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 면역성 폴리펩티드가 항원 또는 전염성 미생물의 항원의 소편으로 이루어지는 조성물.
  6. 상기 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 리포좀 형성 성분들을 리포좀이 전체 하전을 갖지 않도록 선택한 조성물.
  7. 제 1항 내지 5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 리포좀 형성 성분들이 전체 양이온성 하전을 갖는 양으로 상기 리포좀 형성 성분들이 적어도 하나 이상의 양이온으로 하전된 리포좀을 포함하는 조성물.
  8. 리포좀 형성 성분들이 전체 양하전을 갖는 양으로 적어도 하나 이상의 양으로 하전된 성분들을 포함하는 리포좀 형성 성분들로부터 형성된 리포좀과 목적 폴리펩티드 생성물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 이루어지고, 폴리뉴클레오티드가 리포좀내에서 인트랩되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 7항 또는 8항에 있어서, 양이온계 성분이 하기 식을 갖는 글리세라이드 또는 그의 광학 이성질체인 조성물.
    식 중, Y1및 Y2는 서로 동일하거나 다른 것으로서, 각각 -O- 또는 O-C(O)- (여기서, 카르보닐 탄소는 경우에 따라서 R1또는 R2에 결합됨)이고, R1또는 R2는 독립적으로 6 내지 24개의 탄소원자를 갖는 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고, R3, R4및 R5는 독립적으로 수소, 1 내지 8개의 탄소원자를 갖는 알킬, 6 내지 11개의 탄소원자를 갖는 아릴 또는 아랄킬이고; 양자택일로 R3, R4및 R5중 둘 또는 셋은 양으로 하전된 질소원자에 결합되어 5 내지 8개의 원자를 갖는 사이클릭 구조를 형성하고, 여기서 양으로 하전된 질소원자 이외에, 상기 사이클릭 구조 중의 원자는 탄소원자이고, 산소 원자, 질소 원자 또는 황 원자를 포함할 수 있으며, n은 1 내지 8이고, x는 음이온이다.
  10. 제 9항에 있어서, R1및 R2가 개별적으로 0 내지 6개의 불포화 부위를 갖고, 하기 식을 갖는 조성물.
    CH3-(CH2)a-(CH=CH-CH2)b-(CH2)c-
    식 중, a 및 c의 합은 1 내지 23이고, b는 0 내지 6이다.
  11. 제 7항 또는 8항에 있어서, 양이온계 성분이 DOTAP, BisHOP, DC-Chol 및 스테아릴 아민으로부터 선택되는 조성물.
  12. 상기 항중 어느 하나의 항에 있어서, 리포좀 형성 성분이 푸조제닉 성분 (fusogenic component), 바람직하기로는 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 조성물.
  13. 상기 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 리포좀이 탈수-재수화 공정, 바람직하기로는 이어서 미소 유동화 또는 압출에 의해 형성되는 조성물.
  14. 상기 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 리포좀의 평균 직경이 100 내지 1000㎚, 바람직하기로는 200-500㎚ 범위인 조성물.
  15. 상기 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 리포좀 형성성분 ㎎당 폴리뉴클레오티드 0.1 내지 10㎍으로 이루어지는 조성물.
  16. 치료 또는 예방에 의해 인간 또는 동물을 치료하는 방법에 사용하기 위한 조성물의 제조에 있어서 상기 항 중 어느 하나의 항에서 정의한 리포좀의 용도.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 방법이 전염성 미생물 또는 종양 세포에 대해서 면역을 주기 위한 왁진주사인 용도.
  18. 제 16항 또는 제 17항에 있어서, 조성물이 근육 내로 투여되는 용도.
  19. 제 1항 내지 15항 중 어느 하나에 따른 리포좀 제제 및 제약적으로 허용되는 부형제로 되는 제약 조성물.
  20. 제 19항에 따른 제약 조성물을 인간 또는 동물에 투여해서 폴리뉴클레오티드 중의 폴리펩티드 생성물을 목표 세포 중에서 발현시키는 처리를 필요로하는 인간 또는 동물을 치료하는 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 제약 조성물이 근육내로 투여되는 방법.
  22. 제 20항에 있어서, 제약 조성물이 피하로 투여되는 방법.
  23. 제 20항에 있어서, 제약 조성물이 정맥내로 투여되는 방법.
  24. 제 20항에 있어서, 제약 조성물이 복강내로 투여되는 방법.
  25. 세포를 제 1항 내지 15항 중 어느 하나의 항에 따른 리포조말 조성물과 접촉시키고, 세포를 배양해서 세포의 트랜스펙션, 폴리뉴클레오티드의 발현 및 폴리뉴클레오티드 중의 폴리펩티드 생성물의 합성을 행하여 만든 인간 또는 동물로부터 분리시킨 세포를 트랜스펙션시키는 방법.
  26. 제 25항에 있어서, 배양된 세포를 후속적으로 숙주 동물 또는 인간에 이식시켜서 폴리펩티드의 발현을 생체내에서 일으키는 방법.
  27. 제 20항 내지 24항 중 어느 하나의 항에 있어서, 발현시킨 폴리뉴클레오티드가 목적하는 면역반응, 바람직하기로는 전염성 미생물 또는 종양 세포의 항원에 대한 반응을 유발시키는 방법.
  28. 1) 인간 또는 동물에 있어서 목적하는 면역반응을 유발시키기에 유용한 면역성 폴리펩티드를 유효하게 암호화하는 네이키드 폴리뉴클레오티드 및 미리 형성된 리포좀으로 이루어지는 수용성 현탁액을 형성하고,
    2) 상기 현탁액을 동결 건조시키고,
    3) 상기 단계 2)의 생성물을 탈수시키고,
    4) 상기 단계 3)의 탈수 재수화 소포의 수용성 현탁액을 미소유동화시키고,
    5) 인트랩되지 않은 폴리뉴클레오티드를 리포좀으로붙 분리시키는 단계로 되는 폴리뉴클레오티드를 리포좀으로 인트래핑시키는 방법.
  29. 제 28항에 있어서, 리포좀이 양이온계 리포좀인 방법.
  30. 1) 네이키드 폴리뉴클레오티드 및 미리 형성한 양이온계 리포좀으로 이루어지는 수용성 현탁액을 형성하고,
    2) 상기 현탁액을 동결 건조시키고,
    3) 상기 단계 2)의 생성물을 탈수시키고,
    4) 상기 단계 3)의 탈수 재수화 소포의 수용성 현탁액을 미소 유동시키고,
    5) 인트랩되지 않은 폴리뉴클레오티드로 리포좀으로부터 분리시키는 단계로 되는 폴리뉴클레오티드를 리포좀으로 인트래핑시키는 방법.
  31. 제 28항 내지 30항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 1)-4)에서 폴리뉴클레오티드의 인트랩율이 단계 1)의 현탁액 중에서 폴리뉴클레오티드의 10 내지 90%, 바람직하기로는 20 내지 85%인 방법.
  32. 제 28항 내지 제 31항 중 어느 하나의 항에 있어서, 최종 생성물 중에 폴리뉴클레오티드의 농도가 리포좀 형성 성분 ㎎당 0.1 내지 20㎍ 범위인 방법.
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