RU2589503C2 - Липосомы с липидами, имеющими преимущественное значение рка, для доставки рнк - Google Patents

Липосомы с липидами, имеющими преимущественное значение рка, для доставки рнк Download PDF

Info

Publication number
RU2589503C2
RU2589503C2 RU2013104878/15A RU2013104878A RU2589503C2 RU 2589503 C2 RU2589503 C2 RU 2589503C2 RU 2013104878/15 A RU2013104878/15 A RU 2013104878/15A RU 2013104878 A RU2013104878 A RU 2013104878A RU 2589503 C2 RU2589503 C2 RU 2589503C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
rna
liposome
liposomes
lipid
pka
Prior art date
Application number
RU2013104878/15A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2013104878A (ru
Inventor
Эндрю ДЖИЛЛ
Original Assignee
Новартис Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=44534956&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RU2589503(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Новартис Аг filed Critical Новартис Аг
Publication of RU2013104878A publication Critical patent/RU2013104878A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2589503C2 publication Critical patent/RU2589503C2/ru

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers comprising non-phosphatidyl surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids or non-phosphatidyl liposomes coated or grafted with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
    • C12N2710/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
    • C12N2770/36134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Manufacturing Of Micro-Capsules (AREA)

Abstract

Предложенная группа изобретений относится к области невирусной доставки РНК для иммунизации. Предложена липосома для доставки in vivo РНК в клетку позвоночного животного, имеющая липидный бислой, содержащий липид, имеющий третичный амин и значение рКа от 5,0 до 6,8, который инкапсулирует водное ядро, включающее РНК, кодирующую иммуноген. Предложены также фармацевтическая композиция, содержащая указанную липосому, способ получения липосомы, способ индукции защитного иммунного ответа у позвоночного животного и применение липосомы или фармацевтической композиции для индукции защитного иммунного ответа у позвоночного животного. Предложенная группа изобретений обеспечивает эффективную доставку in vivo РНК для индукции защитного иммунного ответа у позвоночного животного. 5 н. и 10 з.п. ф-лы, 21 ил., 18 табл., 1 пр.

Description

Данная заявка заявляет приоритет предварительных заявок на патент США 61/361830 (поданной 6 июля 2010) и 61/378837 (поданной 31 августа 2010), полное содержание обеих заявок включено в данный документ для сведения для всех целей.
Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится к области невирусной доставки РНК для иммунизации.
Уровень техники
В течение нескольких лет доставка нуклеиновых кислот для иммунизации животных является целью научных исследований. Тестировались различные подходы, при применении ДНК или РНК, такие как доставка с использованием вирусных и невирусных носителей (даже доставка без носителя в «голой» вакцине) реплицирующихся или нереплицирующихся векторов или вирусных, или невирусных векторов.
Остается потребность в дополнительных и улучшенных нуклеиновокислотных вакцинах.
Раскрытие изобретения
Согласно изобретению РНК, кодирующую иммуноген, доставляют в липосоме в целях иммунизации. Липосома включает липиды, которые имеют значение pKa в пределах от 5,0 до 7,6. В идеальном варианте липид со значением pKa в данных пределах содержит третичный амин; такие липиды ведут себя иначе по сравнению с липидами, такими как DOTAP или DC-Chol, которые содержат группу четвертичного амина. При физиологических значениях рН амины с pKa в пределах от 5,0 до 7,6 имеют нейтральный или пониженный поверхностный заряд, в то время как липид, такой как DOTAP, является сильно катионным. Заявители настоящего изобретения установили, что липосомы, образованные липидами с четвертичным амином (например, DOTAP), являются менее подходящими для доставки иммуноген-кодирующей РНК, чем липосомы, образованные липидами с третичным амином (например, DLinDMA).
Таким образом, изобретение относится к липосоме, имеющей липидный бислой, инкапсулирующий водное ядро, где (i) липидный бислой содержит липид, имеющий значение pKa от 5,0 до 7,6, и предпочтительно содержащий третичный амин, и (ii) водное ядро включает РНК, которая кодирует иммуноген. Такие липосомы подходят для доставки в условиях in vivo РНК в клетку позвоночных животных и, таким образом, они пригодны в качестве компонентов в фармацевтических композициях для иммунизации субъектов против вирусных заболеваний.
Изобретение также относится к способу получения РНК-содержащей липосомы, включающему стадии: (а) смешивание РНК с липидом при рН, который ниже pKa липида, но который выше 4,5, с образованием липосомы, в которой инкапсулирована РНК; и (b) повышение рН полученной липосома-содержащей смеси до значения, которое выше pKa липида.
Липосома
В изобретении используются липосомы, в которых инкапсулирована РНК, кодирующая иммуноген. Таким образом, РНК отделена (как и в природном вирусе) от внешней среды липидным бислоем липосомы, и было установлено, что такое инкапсулирование защищает РНК от расщепления РНКазой. Липосомы могут включать некоторое количество внешней РНК (например, на их поверхности), но, по меньшей мере, половина РНК (и в идеальном варианте вся РНК) инкапсулирована в ядре липосомы. Инкапсулирование в липосомах отличается, например, от комплексов липид/РНК, раскрытых в источнике 1.
Различные амфифильные липиды могут образовать бислои в водной среде с инкапсулированием РНК-содержащего водного ядра в виде липосомы. Такие липиды содержат анионную, катионную или цвитерионную гидрофильную «головку». Липосомы по изобретению содержат липид, имеющий значение pKa в пределах от 5,0 до 7,6, и предпочтительные липиды с pKa в этих пределах содержат третичный амин. Например, они могут содержать 1,2-дилинолеилокси-N,N-диметил-3-аминопропан (DLinDMA; pKa 5,8) и/или 1,2-дилиноленилокси-N,N-диметил-3-аминопропан (DLenDMA). Другим подходящим липидом, содержащим третичный амин, является 1,2-диолеилокси-N,N-диметил-3-аминопропан (DODMA). Смотри фиг.3 и источник 2. Также можно использовать некоторые аминолипиды из источника 3, а также некоторые аминолипиды из источника 4. Дополнительные подходящие липиды с третичными аминами в их «головках» раскрыты в источнике 5, полное содержание которого включено в данный документ для сведения.
Липосомы по изобретению также можно получить из одного липида или из смеси липидов, при условии, что, по меньшей мере, один из липидов имеет значение pKa в пределах от 5,0 до 7,6 (и предпочтительно содержит третичный амин). В данных пределах значений pKa предпочтительные липиды имеют pKa от 5,5 до 6,7, например, в пределах от 5,6 до 6,8, от 5,6 до 6,3, от 5,6 до 6,0, от 5,5 до 6,2 или от 5,7 до 5,9. pKa представляет рН, при котором 50% липидов заряжено, находясь в середине между точкой, при которой липиды полностью заряжены, и точкой, при которой липиды полностью не заряжены. Этот показатель можно определить различными путями, но предпочтительно с использованием способа, раскрытого ниже в разделе под заголовком «Определение pKa». Как правило, pKa следует определять для одного липида в большей степени, чем для липида в контексте смеси, которая также включает другие липиды (например, отлично от того, как описано в источнике 6, который в большей степени относится к pKa SNALP, чем для отдельных липидов).
Когда липосому по изобретению получают из смеси липидов, то предпочтительно, чтобы относительное количество липидов, которые имеют pKa в требуемых пределах, составляло 20-80% от общего содержания липидов в смеси, например, находилось в пределах 30-70% или 40-60%. Например, ниже показаны подходящие липосомы, в которых 40% или 60% от общего содержания липидов представлял липид с pKa в требуемых пределах. Остальная часть может представлять, например, холестерин (например, в смеси может находиться 35-50% холестерина) и/или DMG (необязательно ПЭГилированного), и/или DSPC. Такие смеси используются ниже. Такие % значения являются моль процентами.
Липосома может содержать амфифильный липид, в котором гидрофильный фрагмент ПЭГилирован (т.е. модифицирован ковалентным присоединением полиэтиленгликоля). Такая модификация может повысить стабильность и предупредить неспецифическую адсорбцию липосом. Например, липиды можно конъюгировать с ПЭГом с использованием методов, которые раскрыты в источниках 6 и 7. ПЭГ обеспечивает липосомы с оболочкой, которая придает ей благоприятные фармакокинетические свойства. Сочетание эффективного инкапсулирования РНК (в частности, самореплицирующейся РНК), катионного липида, имеющего значение pKa в пределах 5,0-7,6 и ПЭГилированной поверхности обеспечивают эффективную доставку к многочисленным типам клеток (включая иммунные и неиммунные клетки), тем самым вызывая более сильный и лучший иммунный ответ по сравнению с тем, когда используются четвертичные амины без ПЭГилирования. Можно использовать ПЭГ молекулярной массы, например, 0,5-8 kDa.
Липиды, используемые по изобретению, могут быть насыщенными или ненасыщенными. Применение, по меньшей мере, одного ненасыщенного липида для получения липосом является предпочтительным. На фиг.3 показано три подходящих ненасыщенных липида. Если ненасыщенный липид имеет два «хвоста», то оба «хвоста» могут быть ненасыщенными, или он может иметь один насыщенный «хвост» или ненасыщенный «хвост».
В примерах используется смесь DSPC, DLinDMA, PEG-DMG и холестерина. Независимым аспектом изобретения является липосома, содержащая DSPC, DLinDMA, ПЭГ-DMG и холестерин. Такая липосома предпочтительно инкапсулирует РНК, такую как самореплицирующаяся РНК, например, кодирующая иммуноген.
Липосомальные частицы обычно разделяют на три группы: мультиламеллярные везикулы (MLV); небольшие униламеллярные везикулы (SUV) и крупные униламеллярные везикулы (LUV). MLV имеют многочисленные бислои в каждой везикуле, образуя несколько отдельных водных компартментов. SUV и LUV имеют один бислой, инкапсулирующий водное ядро; как правило, SUV имеют диаметр ≤50 нм, и LUV имеют диаметр >50 нм. В идеальном варианте липосомальные частицы по изобретению являются LUV с диаметром в пределах 50-220 нм. Для композиции, содержащей популяцию LUV с различными диаметрами, имеются следующие условия: (i) по меньшей мере, 80% по количеству должно иметь диаметры в пределах 20-220 нм, (ii) в идеальном варианте средний диаметр (Zav по интенсивности) в популяции находится в пределах 40-200 нм и/или (iii) диаметры должны иметь показатель полидисперсности <2. Полагают, что комплексы липосома/РНК из источника 1 имеют диаметр в пределах 600-800 нм, и для них характерна высокая полидисперсность. Липосома должна быть по существу сферической.
Способы приготовления подходящих липосом являются хорошо известными в данной области, например, смотри источники 8-10. Один подходящий способ описан в источнике 11, и он включает смешивание (i) этанольного раствора липидов, (ii) водного раствора нуклеиновой кислоты и (iii) буфера с последующим перемешиванием, уравновешиванием, разведением и выделением. Предпочтительные липосомы по изобретению получают данным способом смешивания.
Способ смешивания
Как уже указывалось выше, изобретение относится к способу получения РНК-содержащей липосомы, включающему стадии: (а) смешивания РНК с липидом при рН, который ниже значения pKa липида, но выше 4,5; затем (b) повышение рН до значения, которое выше pKa липида.
Таким образом, катионный липид положительно заряжен во время образования липосомы на стадии (а), но затем изменение рН означает, что большинство (или все) положительно заряженные группы становятся нейтральными. Такой способ является преимущественным для приготовления липосом по изобретению, и избегая достичь рН ниже 4,5 на стадии (а), повышается стабильность инкапсулированной РНК.
Значения рН на стадии (а) находятся выше 4,5, и в идеальном варианте выше 4,8. Используя рН в пределах от 5,0 до 6,0 или в пределах 5,0 до 5,5, можно получить подходящие липосомы.
Повышенное значение рН на стадии (b) выше значения pKa липида. В идеальном варианте рН повышают до рН ниже 9 и предпочтительно ниже 8. В зависимости от pKa липида рН на стадии (b) можно, таким образом, повысить до пределов 6-8, например, до рН, равного 6,5±0,3. Повышения рН на стадии (b) можно достичь переносом липосом в подходящий буфер, например, забуференный фосфатом физиологический раствор. В идеальном варианте повышение рН на стадии (b) моно провести после образования липосом.
РНК, используемая на стадии (а), может находиться в водном растворе, который смешивают с органическим раствором липида (например, этанольным раствором, как описано в источнике (11)). Затем смесь разводят с получением липосом, после чего рН можно повысить на стадии (b).
РНК
Изобретение является подходящим для доставки в условиях in vivo РНК, которая кодирует иммуноген. РНК транслируется неиммунными клетками в месте доставки, приводя к экспрессии иммуногена, и она также стимулирует иммунные клетки к секреции интерферонов I и/или провоспалительных цитокинов, которые обеспечивают местный адъювантный эффект. Неиммунные клетки также могут секретировать интерфероны типа I и/или провоспалительные цитокины в ответ на РНК.
РНК является плюс-цепочечной и, таким образом, может транслироваться неиммунными клетками без необходимости в каких-либо промежуточных стадиях репликации, таких как обратная транскрипция. Она также может связываться с рецепторами TLR7, которые экспрессируются иммунными клетками, тем самым инициируя адъювантный эффект.
Предпочтительные плюс-цепочечные РНК являются самореплицирующимися молекулами. Молекула самореплицирующейся РНК (репликон), когда доставляется в клетки позвоночных животных даже без каких-либо белков, приводит к продукции многочисленных дочерних РНК транскрипцией из нее самой (посредством антисмысловой копии, которую она генерирует из себя самой). Таким образом, молекула самореплицирующейся РНК обычно представляет плюс-цепочечную молекулу, которая может непосредственно транслироваться после доставки в клетку, и такая трансляция обеспечивает РНК-зависимую РНК-полимеразу, которая затем продуцирует антисмысловые и смысловые транскрипты из доставленной РНК. Таким образом, доставленная РНК приводит к продукции многочисленных дочерних копий РНК. Такие дочерние РНК, а также коллинеарные субгеномные транскрипты, могут транслировать самих себя с обеспечением экспрессии in situ кодированного иммуногена, или могут транскрибироваться с обеспечением дополнительных транскриптов с тем же смыслом, что и доставленная РНК, которые транслируются с обеспечением экспрессии in situ иммуногена. В целом результаты данной последовательности транскрипций представляют высокую амплификацию копий введенных РНК-репликонов и, таким образом, кодированный иммуноген становится основным полипептидным продуктом клеток.
Как показано ниже, для РНК не требуется самореплицирующейся активности для обеспечения адъювантного эффекта, хотя, она может повысить секрецию цитокинов после трансфекции. Самореплицирующаяся активность является особенно пригодной для достижения высокого уровня экспрессии иммуногена неиммунными клетками. Она также может повысить апоптоз неиммунных клеток.
Одной подходящей системой для достижения саморепликации является применение РНК-репликона на основе альфа-вируса. Такие плюс-цепочечные репликоны транслируются после доставки в клетку с получением репликазы (или репликазы-транскриптазы). Репликаза транслируется в виде полипротеина, который саморасщепляется с обеспечением комплекса репликации, который продуцирует геномные минус-цепочечные копии плюс-цепочечной доставленной РНК. Такие минус-цепочечные транскрипты могут транскрибировать их самих с образованием дополнительных копий плюс-цепочечной исходной РНК и также могут генерировать субгеномный транскрипт, который кодирует иммуноген. Трансляция субгеномного транскрипта, таким образом, приводит к экспрессии in situ иммуногена инфицированной клеткой. В подходящих репликонах на основе альфа-вирусов можно использовать репликазу из вируса Синдбис, вируса леса Семлики, вируса восточного энцефалита лошадей, вируса венесуэльского энцефалита лошадей и т.д. В репликонах могут использоваться последовательности мутантных вирусов или вирусов дикого типа, например, аттенуированный мутант TC83 VEEV [12].
Таким образом, предпочтительная молекула самореплицирующейся РНК кодирует (i) РНК-зависимую РНК-полимеразу, которая может транскрибировать РНК из молекулы самореплицирующейся РНК, и (ii) иммуноген. Полимераза может представлять репликазу альфа-вируса, например, включающую один или более альфа-вирусных белков nsP1, nsP2, nsP3 и nsP4.
Несмотря на то, что геномы природных альфа-вирусов кодируют структурные белки вирионов в дополнении к неструктурному полибелку репликазы, предпочтительно, чтобы молекула самореплицирующейся РНК по изобретению не кодировала структурные белки альфавирусов. Таким образом, предпочтительная самореплицирующаяся РНК может приводить к продукции копий геномной РНК ее самой в клетке, но не продуцировать РНК-содержащие вирионы. Отсутствие способности продуцировать такие вирионы означает, что в отличие от альфа-вируса дикого типа, молекула самореплицирующейся РНК не может сохранять себя в инфекционной форме. Структурные белки альфа-вируса, которые необходимы для сохранения в вирусах дикого типа, отсутствуют из самореплицирующихся РНК по изобретению и их место занято геном(и), кодирующими интересующих иммуноген, так, что субгеномный транскрипт кодирует иммуноген в большей степени, чем структурные белки альфа-вирусного вириона.
Таким образом, молекула самореплицирующейся РНК, подходящая для изобретения, может иметь две открытых рамки считывания. Первая (5') открытая рамка считывания кодирует репликазу; вторая (3') открытая рамка считывания кодирует иммуноген. В некоторых вариантах осуществления РНК может иметь дополнительные (например, даунстрим) открытые рамки считывания, например, для кодирования дополнительных иммуногенов (смотри ниже) или для кодирования вспомогательных полипептидов.
Молекула самореплицирующейся РНК может содержать 5'-последовательность, которая совместима с кодированной репликазой.
Молекулы самореплицирующейся РНК могут иметь различную длину, но, как правило, их длина составляет 5000-25000 нуклеотидов, например, 8000-15000 нуклеотидов или 9000-12000 нуклеотидов. Таким образом, РНК длиннее, чем длина, наблюдаемая в системе siPHK доставки.
Молекула РНК, подходящая для изобретения, может содержать 5'-кэп (например, 7-метилгуанозин). Такая кэп-структура может повышать трансляцию РНК in vitro.
5'-нуклеотид молекулы РНК, подходящей для изобретения, содержит 5'-трифосфатную группу. В кэпированной РНК она может быть связана с 7-метилгуанозином посредством 5'-5' мостика. 5'-трифосфат может повышать связывание с RIG-I и, таким образом, стимулировать адъювантные эффекты.
Молекула РНК может содержать 3'-поли-А-хвост. Она также может содержать последовательность распознавания поли-А-полимеразы (например, AAUAAA) около 3'-конца.
Молекула РНК, подходящая для изобретения, как правило, является одноцепочечной. Одноцепочечные РНК обычно инициируют адъювантный эффект посредством связывания с TLR7, TLR8, РНК-геликазами и/или PKR. Доставленная в двухцепочечной форме РНК (dsPHK) может связываться c TLR3, и этот рецептор также может запускаться dsPHK, которая образуется во время репликации одноцепочечной РНК или находится во вторичной структуре одноцепочечной РНК.
Молекулу РНК, подходящую для изобретения, можно соответственно получить транскрипцией в условиях in vitro (IVT). При IVT можно использовать матрицу (кДНК), полученную и размноженную в плазмидной форме в бактериях, или получить синтетически (например, методами генной инженерии, синтезом гена и/или полимеразной цепной реакцией (ПЦР)). Например, ДНК-зависимую РНК-полимеразу (такую как РНК-полимеразы бактериофага Т7, Т3 или SP6) можно использовать для транскрибирования РНК с ДНК-матрицы. Можно использовать соответствующие реакции кэпирования и поли-А-добавления, в зависимости от того, что требуется (хотя, поли-А-хвост репликона обычно кодирован в ДНК-матрице). Такие РНК-полимеразы могут иметь строгие требования для транскрибированного 5'-нуклеотида(в), и в некоторых вариантах осуществления такие требования должны соответствовать требованиям кодированной репликазы для гарантии того, что транскрибированная IVT РНК может эффективно функционировать в качестве субстрата для ее самокодированной репликазы.
Как обсуждается в источнике 13, самореплицирующаяся РНК может содержать (в дополнении к 5'-кэпированной структуре) один или более модифицированных азотистых оснований. Таким образом, РНК может включать m5C (5-метилцитидин), m5U (метилуридин), m6A (N6-метиладенозин), s2U (2-тиоуридин), Um (2'-О-метилуридин), m1A (1-метиладенозин); m2A (2-метиладенозин); Am (2'-О-метиладенозин); ms2m6A (2-метилтио-N6-метиладенозин); i6A (N6-изопентениладенозин); ms2i6A (2-метилтио-N6-изопентениладенозин); io6A (N6-(цис-гидроксиизопентенил)аденозин); ms2io6A (2-метилтио-N6-(цис-гидроксиизопентенил)аденозин); g6A (N6-глицинилкарбамоиладенозин); t6A (N6-треонилкарбамоиладенозин); ms2t6A (2-метилтио-N6-треонилкарбамоиладенозин); m6t6A (N6-метил-N6-треонилкарбамоиладенозин); hn6A (N6-гидроксинорвалилкарбамоиладенозин); ms2hn6A (2-метилтио-N6-гидроксинорвалилкарбамоиладенозин); Ar(p) (2'-О-рибозиладенозин (фосфат)); I (инозин); m11 (1-метилинозин); m'Im (1,2'-О-диметилинозин); m3C (3-метилцитидин); Cm (2Т-О-метилцитидин); s2C (2-тиоцитидин); ас4С (N4-ацетилцитидин); f5C (5-фоннилцитидин); m5Cm (5,2-О-диметилцитидин); ac4Cm (N4-ацетил-2ТО-метилцитидин); k2C (лизидин); m1G (1-метилгуанозин); m2G (N2-метилгуанозин); m7G (7-метилгуанозин); Gm (2'-О-метилгуанозин); m22G (N2,N2-диметилгуанозин); m2Gm (N2,2'-O-диметилгуанозин); m22Gm (N2,N2,2'-O-триметилгуанозин); Gr(p)(2'-O-рибозилгуанозин (фосфат)); yW (вибутозин); o2yW (пероксивибутозин); OHyW (гидроксивибутозин); OHyW* (немодифицированный гидроксивибутозин); imG (виозин); mimG (метилгуанозин); Q (квеозин); oQ (эпоксиквеозин); galQ (галтактозилквеозин); manQ (маннозилквеозин); preQ (7-циано-7-деазагуанозин); preQi (7-аминометил-7-деазагуанозин); G (археозин); D (дигидроуридин); m5Um (5,2'-О-диметилуридин); s4U (4-тиоуридин); m5s2U (5-метил-2-тиоуридин); s2Um (2-тио-2'-О-метилуридин); acp3U (3-(3-амино-3-карбоксипропил)уридин); ho5U (5-гидроксиуридин); mo5U (5-метоксиуридин); cmo5U (уридин-5-оксиуксусную кислоту); mcmo5U (метиловый эфир уридин-5-оксиуксусной кислоты); chm5U (5-(карбоксигидроксиметил)уридин)); mchm5U (метиловый эфир 5-(карбоксигидроксиметил)уридина)); mcm5U (5-метоксикарбонилметилуридин); mcm5Um (S-метоксикарбонилметил-2-О-метилуридин); mcm5s2U (5-метоксикарбонилметил-2-тиоуридин); nm5s2U (5-аминометил-2-тиоуридин); mnm5U (5-метиламинометилуридин); mnm5s2U (5-метиламинометил-2-тиоуридин); mnm5se2U (5-метиламинометил-2-селеноуридин); ncm5U (5-карбамоилметилуридин); ncn5Um (5-карбамоилметилуридин); ncm5Um (5-карбамоилметил-2'-О-метилуридин); cmnm5U (5-карбоксиметиламинометилуридин); cnmm5Um (5-карбоксиметиламинометил-2-L-О-метилуридин); cmnm5s2U (5-карбоксиметиламинометил-2-тиоуридин); m62A (N6,N6-диметиладенозин); Tm (2'-О-метилинозин); m4C (N4-метилцитидин); m4Cm (N4,2-O-диметилцитидин); hm5C (5-гидроксиметилцитидин); m3U (3-метилуридин); cm5U (5-карбоксиметилуридин); m6Am (N6,T-O-диметиладенозин); rn62Am (N6,N6,О-2-триметиладенозин); m2'7G (N2,7-диметилгуанозин); m2'2'7G (N2,N2,7-триметилгуанозин); m3Um (3,2Т-О-диметилуридин); m5D (5-метилдигидроуридин); f5Cm (5-формил-2'-О-метилцитидин); m1Gm (1,2'-О-диметилгуанозин); m'Am (1,2-О-диметиладенозин)иринометилуридин); tm5s2U (S-тауринометил-2-тиоуридин); imG-14 (4-деметилгуанозин); imG2 (изогуанозин) или ас6А (N6-ацетиладенозин), гипоксантин, инозин, 8-оксоаденин, его 7-замещенные производные, дигидроурацил, псевдоурацил, 2-тиоурацил, 4-тиоурацил, 5-аминоурацил, 5-(С1-С6)алкилурацил, 5-метилурацил, 5-(С2-С6)алкенилурацил, 5-(С2-С6)алкинилурацил, 5-(гидроксиметил)урацил, 5-хлорурацил, 5-фторурацил, 5-бромурацил, 5-гидроксицитозин, 5-(С1-С6)алкилцитозин, 5-метилцитозин, 5-(С2-С6)алкенилцитозин, 5-(С2-С6)алкинилцитозин, 5-хлорцитозин, 5-фторцитозин, 5-бромцитозин, N2-диметилгуанин, 7-деазагуанин, 8-азагуанин, 7-деаза-7-замещенный гуанин, 7-деаза-7-(С2-С6)алкинилгуанин, 7-деаза-8-замещенный гуанин, 8-гидроксигуанин, 6-тиогуанин, 8-оксогуанин, 2-аминопурин, 2-амино-6-хлорпурин, 2,4-диаминопурин, 2,6-диаминопурин, 8-азапурин, замещенный 7-деазапурин, 7-деаза-7-замещенный пурин, 7-деаза-8-замещенный пурин или абазический нуклеотид. Например, самореплицирующаяся РНК может содержать одно или более модифицированных пиримидиновых азотистых оснований, таких как остатки псевдоуридина и/или 5-метилцитозина. Однако в некоторых вариантах осуществления РНК включает немодифицированные азотистые основания, и может включать немодифицированные нуклеотиды, т.е. все нуклеотиды в РНК являются обычными А, С, G и U рибонуклеотидами (за исключением 5'-кэпированной структуры, которая может содержать 7'-метилгуанозин). В других вариантах осуществления РНК может включать 5'-кэп, содержащий 7'-метилгуанозин, и первые 1, 2 или 3 5'-рибонуклеотида могут быть метилированными в 2'-положении рибозы.
В идеальном варианте РНК, используемая в изобретении, включает только фосфодиэфирные связи между нуклеотидами, но в некоторых вариантах осуществления она может содержать фосфорамидатные, фосфоротиоатные и/или метилфосфонатные связи.
В идеальном варианте липосома включает менее 10 различных видов РНК, например, 5, 4, 3 или 2 различных вида; наиболее предпочтительно липосома включает один вид РНК, т.е. молекулы РНК в липосоме имеют одинаковую последовательность и длину.
Количество РНК на липосому может варьировать. Как правило, число отдельных молекул самореплицирующихся РНК на липосому составляет ≤50, например, <20, <10, <5 или 1-4 на липосому.
Иммуноген
Молекулы РНК, используемые в изобретении, кодируют полипептидный иммуноген. После введения в липосомах РНК транслируется в условиях in vivo, и иммуноген может вызывать иммунный ответ у реципиента. Иммуноген может вызывать иммунный ответ против бактерии, вируса, гриба или паразита (или в некоторых вариантах осуществления против аллергена, и в других вариантах осуществления против опухолевого антигена). Иммунный ответ может включать ответную продукцию антител (обычно представляющих собой IgG) и/или опосредованный клетками иммунный ответ. Полипептидный иммуноген, как правило, будет вызывать иммунный ответ, в результате которого распознается соответствующий бактериальный, вирусный, грибковый или паразитарный (или аллерген или опухолевый) полипептид, но в некоторых вариантах осуществления полипептид может функционировать в качестве мимотопа для индукции иммунного ответа, который распознает бактериальный, вирусный, грибковый или паразитарный сахарид. Как правило, иммуноген является поверхностным полипептидом, например, адгезином, гемагглютинином, гликопротеином оболочки, гликопротеином шипов и т.д.
Молекулы самореплицирующейся РНК могут кодировать единичный полипептидный иммуноген или многочисленные полипептиды. Многочисленные иммуногены могут находиться в виде одного полипептидного иммуногена (слитого полипептида) или в виде отдельных полипептидов. Если иммуногены экспрессируются в виде отдельных полипептидов, то тогда один или более из них может обеспечиваться с апстрим IRE или дополнительным вирусным промоторным элементом. Альтернативно многочисленные иммуногены могут экспрессироваться из полипротеина, который кодирует отдельные иммуногены, слитые с короткой аутокаталитический протеазой (например, белок 2А вируса ящура), или в виде интеинов.
В отличие от источников 1 и 14, РНК кодирует иммуноген. Во избежание разночтений изобретение не включает РНК, которая кодирует люциферазу светляков или которая кодирует слитый белок β-галактозидазу E. coli, или которая кодирует зеленый флуоресцентный белок (GFP). Также РНК не является общей мышиной РНК тимуса.
В некоторых вариантах осуществления иммуноген вызывает иммунный ответ против одной из следующих бактерий:
Nesseria meningitides: подходящие иммуногены включают, не ограничиваясь этим, мембранные белки, такие как адгезины, аутотранспортеры, токсины, белки захвата железа и белок, связывающийся с фактором Н.
Streptococcus pneumoniae: подходящие полипептидные иммуногены описаны в источнике 16. Они включают, не ограничиваясь этим, субъединицу фимбрии RrgB, предшественник бета-N-ацетилгексозаминидазы (spr0057), spr0096, общий стресс-белок GSP-781 (spr2021, SP2216), серин-треониновую протеинкиназу StkP (SP1732) и поверхностный адгезин PsaA пневмококков.
Streptococcus pyogenes: подходящие иммуногены включают, не ограничиваясь этим, полипептиды раскрытые в источниках 17 и 18.
Moraxella catarrhalis.
Bordetella pertussis: подходящие столбнячные иммуногены включают, не ограничиваясь этим, столбнячный токсин или токсоид (РТ), нитчатый гемагглютинин (FHA), пертактин и агглютиногены 2 и 3.
Staphylococcus aureus: подходящие иммуногены включают, не ограничиваясь этим, полипептиды, раскрытые в источнике 19, такие как гемолизин, esxA, esxB, феррихром-связывающий белок (sta006) и/или липопротеин sta011.
Clostridium tetani: типичным иммуногеном является столбнячный токсоид.
Cornynebacterium diphtheriae: типичным иммуногеном является дифтерийный токсоид.
Haemophilus influenzae: подходящие иммуногены включают, не ограничиваясь этим, полипептиды, раскрытые в источниках 20 и 21.
Pseudomonas aeruginosa.
Streptococcus agalactiae: подходящие иммуногены включают, не ограничиваясь этим, полипептиды раскрытые в источнике 17.
Chlamydia trachomatis: подходящие иммуногены включают, не ограничиваясь этим, PepA, LcrE, ArtJ, DnaK, CT398, OmpH-подобный, AtoS, CT547, Eno, HtrA и MurG (например, смотри раскрытые в источнике 22. LcrE [23] и HtrA [24] являются двумя предпочтительными иммуногенами.
Chlamydia pneumoniae: подходящие иммуногены включают, не ограничиваясь этим, полипептиды раскрытые в источнике 25.
Helicobacter pylori: подходящие иммуногены включают, не ограничиваясь этим, CagA, VacA, NAP и/или уреазу [26].
Escherichia coli: подходящие иммуногены включают, не ограничиваясь этим, иммуногены, полученные из энтеротоксигенных E. coli (ETEC), энтероаггрегативных E. coli (EAggEC), диффузноадгезирующих E. coli (DAEC), энтеропатогенных E. coli (EPEC), внекишечных патогенных E. coli (ExPEC) и/или энтерогеморрагических E. coli (EHEC). Штаммы ExPEC включают уропатогенные E. coli (UPEC) и менингит/сепсис-ассоциированные E. coli (MNEC). Подходящие полипептидные иммуногены раскрыты в источниках 27 и 28. Подходящие иммуногены MNEC раскрыты в источнике 29. Подходящим иммуногеном для некоторых типов E. coli является AcfD [30].
Bacillus anthracis
Yersinia pestis: подходящие иммуногены включают, не ограничиваясь этим, полипептиды раскрытые в источниках 31 и 32.
Staphylococccus epidermis
Clostridium perfringens или Clostridium botulinums
Leggionella pneumophila
Coxiella burnetii
Brucella, такие как B. abortis, B. canis, B. melitensis, B. neotomae, B. ovis, B. suis, B. Pinnipediae.
Francisella, такие как F. novicida, F. philomiragia, F. tularensis
Neisseria gonorrhoeae
Treponema pallidum
Haemophilus ducreyi
Enterococcus faecalis или Enterococcus faecium
Staphylococcus saprophyticus
Yersinia enterocolitica
Mycobacterium tuberculosis
Rickettsia
Listeria monocytogenes
Vibrio cholerae
Salmonella typhi
Borrelia burgdorferi
Porphyrominas gingivalis
Klebsiella
В некоторых вариантах осуществления иммуноген вызывает иммунный ответ против одного из следующих вирусов:
Ортомиксовирус: подходящие иммуногены могут происходить из вируса гриппа А, В и С, такие как гемагглютинин, нейраминидаза или матричные белки М2. В том случае, когда иммуноген представляет собой гемагглютинин вируса гриппа А, то он может происходить из любого субтипа, например, Н1, Н2, Н3, Н4, Н5, Н6, Н7, Н8, Н9, Н10, Н11, Н12, Н13, Н14, Н15 или Н16.
Парамиксовирусы: вирусные иммуногены включают, не ограничиваясь этим, полученные из пневмовирусов (например, респираторный синцитиальный вирус, RSV), рубулавирусов (например, вирус свинки), парамиксовирусов (например, вирус парагриппа), метапневмовирусов и морбилливирусов (например, кори).
Поксвирус: вирусные иммуногены включают, не ограничиваясь этим, полученные из ортопоксвируса, такого как Variola vera, включая, не ограничиваясь этим, Variola major и Variola minor.
Пикорнавирус: вирусные иммуногены включают, не ограничиваясь этим, полученные из пикорнавирусов, таких как энтеровирусы, риновирусы, гепарнавирусы, кардиовирусы и афтоловирусы. В одном варианте осуществления энтеровирус является полиовирусом, например, полиовирусом типа 1, типа 2 и/или типа 3. В еще одном варианте осуществления энтеровирус представляет энтеровирус EV71. В еще одном варианте осуществления энтеровирус представляет вирус Коксаки А или В.
Буньявирус: вирусные иммуногены включают, не ограничиваясь этим, полученные из ортобуньявируса, такого как вирус калифорнийского энцефалита, флебовируса, такого как вирус лихорадки долины Рифт, или наировируса, такого как вирус геморрагической лихорадки Крым-Конго.
Гепарнавирус: вирусные иммуногены включают, не ограничиваясь этим, полученные из гепарнавируса, такого как вирус гепатита А (HAV).
Филовирус: вирусные иммуногены включают, не ограничиваясь этим, полученные из филовируса, такого как вирус Эбола (включая подтипы вируса Эбола заирский, побережья Ивори, рестонский или суданский) или вирус Марбурга.
Тогавирус: вирусные иммуногены включают, не ограничиваясь этим, полученные из тогавируса, такого как рубивирус, альфа-вирус или артеривирус. Они включают вирус краснухи. rubella
Флавивирус: вирусные иммуногены включают, не ограничиваясь этим, полученные из флавивируса, такого как вирус клещевого энцефалита (TBE), вирус Денге (тип 1, 2, 3 или 4), вирус желтой лихорадки, вирус японского энцефалита, вирус болезни кьясанурского леса, вирус энцефалита Западного Нила, вирус энцефалита Сент-Луис, вирус русского весеннего-летнего энцефалита, вирус энцефалита Повассан.
Пестивирус: вирусные иммуногены включают, не ограничиваясь этим, полученные из пестивирусов, вызывающих вирусную диарею крупного рогатого скота (BVDV), классическую лихорадку свиней (CSFV) или пограничную болезнь (BDV).
Гепаднавирус: вирусные иммуногены включают, не ограничиваясь этим, полученные из гепаднавируса, такого как вирус гепатита В. Композиция может включать поверхностный антиген вирус гепатита В (HBsAg).
Другие вирусы гепатита: композиция может включать иммуноген из вируса гепатита С, вируса гепатита-дельта, вируса гепатита Е или вируса гепатита G.
Рабдовирус: вирусные иммуногены включают, не ограничиваясь этим, полученные из рабдовирусов, таких как лиссавирус (например, вирус бешенства) и везикуловирус (VSV).
Калицивирус: вирусные иммуногены включают, не ограничиваясь этим, полученные из калицивируса, такого как вирус Норуолк (Norovirus) и Норуолк-подобные вирусы, такие как вирус Гавайи и вирус Снежных Гор.
Коронавирус: вирусные иммуногены включают, не ограничиваясь этим, полученные из коронавируса SARS, вируса инфекционного бронхита птиц (IBV), вируса гепатита мышей (MHV) и вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней (TGEV). Иммуноген коронавируса может быть полипептидом шипов.
Ретровирус: вирусные иммуногены включают, не ограничиваясь этим, полученные из онковируса, лентивируса (например, HIV-1 или HIV-2) или спумавируса.
Реовирус: вирусные иммуногены включают, не ограничиваясь этим, полученные из ортореовируса, ротавируса, орбивируса или колтивируса.
Парвовирус: вирусные иммуногены включают, не ограничиваясь этим, полученные из парвовируса B19.
Герпесвирус: вирусные иммуногены включают, не ограничиваясь этим, полученные из герпесвирусов человека, таких как, например, приводимые только в качестве примера, вирус герпеса простого (HSV) (например, HSV типов 1 и 2), вирус опоясывающего лишая (VZV), вирус Эпштейна-Барра (EBV), цитомегаловирус (CMV), герпесвирус человека типа 6 (HHV6), герпесвирус человека типа 7 (HHV7) и герпесвирус человека типа 8 (HHV8).
Паповавирусы: вирусные иммуногены включают, не ограничиваясь этим, полученные из папилломавирусов и полиомавирусов. Папилломавирус (человека) может представлять серотип 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 11, 13, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 41, 42, 47, 51, 57, 58, 63 или 65, например, одного или более серотипов 6, 11, 16 и/или 18.
Аденовирус: вирусные иммуногены включают, не ограничиваясь этим, полученные из аденовируса серотипа 36 (Ad-36).
В некоторых вариантах осуществления иммуноген вызывает иммунный ответ против вируса, который заражает рыб, такого как вирус инфекционной анемии лососевых (ISAV), вирус болезни поджелудочной железы лососевых (SPDV), вирус инфекционного некроза поджелудочной железы (IPNV), возбудитель вирусной болезни канального сома (CCV), вирус лимфоцистиса рыб (FLDV), вирус инфекционного гематопоэтического некроза (IHNV), кои-герпесвирус, вирус, подобный пикорнавирусам у лососевых (также известный, как вирус, подобный пикорнавирусам у атлантического лосося), вирус пресноводного лосося (LSV), ротавирус атлантического лосося (ASR), вирус земляничной форели (TSD), вирус папилломатоза лосося кижуча (CSTV) или вирус геморрагической септицемии (VHSV).
Грибковые иммуногены могут быть получены из Dermatophytres, включая: Epidermophyton floccusum, Microsporum audouini, Microsporum canis, Microsporum distorum, Microsporum equinum, Microsporum gypsum, Microsporum nanum, Trichophyton concetricum, Trichophyton equinum, Trichophyton gallinae, Trichophyton gypseum, Trichophyton megnini, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton quinckeanum, Trichophyton rubrum, Trichophyton schoeleini, Trichophyton tonsurans, Trichophyton verrucosum, Trichophyton verrucosum var. album, var. discoides, var. ochraceum, Trichophyton violaceum и/или Trichophyton faviforme; или из Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Aspergillus sydowi, Aspergillus flavatus, Aspergillus glaucus, Blastoschizomyces capitatus, Candida albicans, Candida enolase, Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida stellatoidea, Candida kusei, Candida parakwsei, Candida lusitaniae, Candida pseudotropicalis, Candida guilliermondi, Cladosporium carrionii, Coccidiodes immitis, Blastomyces dermatidis, Cryptococcus neoformans, Geotrichum clavatum, Histoplasma capsulatum, Klebsiella pneumoniae, Microsporidia, Encephalitozoon spp., Septata interstinalis и Enterocytozoon bieneusi; реже Brachiola sp., Microsporidium sp., Nosema sp., Pleistophora sp., Trachipleistophora sp., Vittaforma sp., Paracoccidioides brasiliensis, Pneumocystis carinii, Pythiumn insidiosum, Pityrosporum ovale, Sacharomyces cerevisae, Sacharomyces boulardii, Sacharomyces pombe, Scedosporium apiosperum, Sporothrix schenckii, Trichosporon beigelii, Toxoplasma gondii, Penicillium marneffei, Malassezia spp., Fonsecaea spp., Wangiella spp., Sporothrix spp., Basidiobolus spp., Conidiobolus spp., Rhizopus spp., Mucor spp., Absidia spp., Mortierella spp., Cunninghamella spp., Saksenaea spp., Alternaria spp., Curvularia spp., Helminthosporium spp., Fusarium spp., Aspergillus spp., Penicillium spp., Monolinia spp., Rhizoctonia spp., Paecilomyces spp., Pithomyces spp. и Cladosporium spp.
В некоторых вариантах осуществления иммуноген вызывает иммунный ответ против паразита из рода Plasmodium, такого как P. falciparum, P. vivax, P. malariae или P. ovale. Таким образом, изобретение можно использовать для иммунизации против малярии. В некоторых вариантах осуществления иммуноген вызывает иммунный ответ против паразита семейства Caligidae, в частности, родов Lepeophtheirus и Caligus, например, это морская вошь, такая как Lepeophtheirus salmonis и Caligus rogercresseyi.
В некоторых вариантах осуществления иммуноген вызывает иммунный ответ против: аллергенов пыльцы (аллергенов пыльцы деревьев, травянистых растений, сорных растений и злаковых трав); аллергенов насекомых или клещей (воздушных аллергенов, аллергенов слюны и яда, например, аллергенов клещей, аллергенов тараканов и мошек, аллергенов яда отряда перепончатокрылых); аллергенов волос и перхоти животных (например, собак, кошек, лошади, крысы мыши и т.д.) и пищевых аллергенов (например, глиадин). Важными аллергенами пыльцы деревьев, злаковых трав и травянистых растений являются аллергены, которые происходят от растений таксономических отрядов Fagales, Oleales, Pinales и Platanaceae, включая, не ограничиваясь этим, березу (Betula), ольху (Alnus), лещина (Corylus), граб (Carpinus) и оливковое дерево (Olea), кедр (Cryptomeria и Juniperus), плоское дерево (Platanus), отряд Poales, включая злаковые травы родов Lolium, Phleum, Poa, Cynodon, Dactylis, Holcus, Phalaris, Secale и Sorghum, отрядов Asteralis и Urticales, включая травянистые растения родов Ambrosia, Artemisia и Parietaria. Другими важными воздушными аллергенами являются аллергены клещей домашней пыли рода Dermatophagoides и Euroglyphus, амбарных клещей, например, Lepidoglyphys, Glycyphagus и Tyrophagus, аллергены тараканов, мошек и блох, например, Blatella, Periplaneta, Chironomus и Ctenocepphalides, и аллергены млекопитающих, таких как кошка, собака и лошадь, аллергены ядов, включая аллергены жалящих или кусающих насекомых, такие как аллергены таксономического отряда перепончатокрылых, включая пчел (Apidae), ос (Vespidea) и муравьев (Formicoidae).
В некоторых вариантах осуществления иммуноген является опухолевым антигеном, выбранным из: (а) антигенов злокачественной опухоли семенников, таких как полипептиды семейства NY-ESO-1, SSX2, SCP1, а также полипептиды семейства RAGE, BAGE, GAGE и MAGE, например, GAGE-1, GAGE-2, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6 и MAGE-12 (которые можно использовать, например, при вакцинации против меланомы, опухолей легких, головы и шеи, NSCLC, молочной железы, органов желудочно-кишечного тракта и мочевого пузыря); (b) мутированных антигенов, например, р53 (ассоциированного с различными солидными опухолями, например, злокачественными опухолями ободочной и прямой кишки, легких, головы и шеи), p21/Ras (ассоциированного, например, с меланомой, раком поджелудочной железы и колоректальным раком), CDK4 (ассоциированного с меланомой), MUM1 (ассоциированного, например, с меланомой), каспазы-8 (ассоциированной, например, со злокачественными опухолями головы и шеи), CIA 0205 (ассоциированного, например, с раком мочевого пузыря), HLA-A2-R1701, бета-катенина (ассоциированного, например, с меланомой), TCR (ассоциированного, например, с Т-клеточной неходжкинской лимфомой), BCR-abl (ассоциированного, например, с хроническим миелогенным лейкозом), триосефосфатизомеразы, KIA 0205, CDC-27 и LDLR-FUT; (c) сверхэкспрессированных антигенов, например, галектина 4 (ассоциированного, например, с колоректальным раком), галектина 9 (ассоциированного, например, с болезнью Ходжкина), протеиназы 3 (ассоциированной, например, с хроническим миелоидным лейкозом), WT 1 (ассоциированного, например, с различными лейкозами), карбоангидразы (ассоциированной, например, с раком почек), альдолазы А (ассоциированной, например, с раком легких), PRAME (ассоциированного, например, с меланомой), HER-2/neu (ассоциированного, например, с раком молочной железы, ободочной кишки, легких и яичников), маммоглобина, альфа-фетопротеина (ассоциированного, например, с гепатомой), KSA (ассоциированного, например, с колоректальным раком), гастрина (ассоциированного, например, с раком поджелудочной железы и желудка), каталитического компонента теломеразы MUC-1 (ассоциированного, например, с раком молочной железы и яичников), G-250 (ассоциированного, например, с почечно-клеточной карциномой), р53 (ассоциированного, например, с раком молочной железы, ободочной кишки) и карциноэмбрионального антигена (ассоциированного, например, с раком молочной железы, раком легких и раком органов желудочно-кишечного тракта, таким как колоректальный рак); (d) общих антигенов, например, антигенов меланомы-дифференцировки меланоцитов, таких как MART-1/Melan A, gp100, MC1R, рецептор меланоцит-стимулирующего гормона, тирозиназы, связанного с тирозиназой белка-1/TRP1 и связанного с тирозиназой белка-2/TRP2 (ассоциированных, например, с меланомой); (е) ассоциированных с предстательной железой антигенов, таких как PAP, PSA, PSMA, PSH-1, PSM-P1, PSM-P2, ассоциированных, например, с раком предстательной железы; (f) иммуноглобулиновых идиотипов (ассоциированных, например, с миеломой и В-клеточными лимфомами). В некоторых вариантах осуществления опухолевые иммуногены включают, не ограничиваясь этим, p15, Hom/Mel-40, H-Ras, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, антигены вируса Эпштейна-Барра, EBNA, антигены папилломавируса (HPV), включая Е6 иЕ7, антигены вируса гепатита В и С, антигены Т-лимфотропного вируса, TSP-180, p185erbB2, p180erb-3, c-met, mn-23H1, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, p16, TAGE, PSCA, CT7, 43-9F, 5T4, 791 Tgp72, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3 (CA 27.29\BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\KP1, CO-029, FGF-5, Ga733 (EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90 (Mac-2-связывающий белок/циклофилин С-ассоциированный белок), TAAL6, TAG72, TLP, TPS и тому подобное.
Фармацевтические композиции
Липосомы по изобретению являются подходящими в качестве компонентов в фармацевтических композициях для иммунизации субъектов против различных заболеваний. Как правило, такие композиции включают фармацевтически приемлемый носитель в дополнении к липосомам. Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых носителей приводится в источнике 33.
Фармацевтическая композиция по изобретению может включать один или более небольших молекул иммунопотенциаторов. Например, композиция может содержать агонист TLR2 (например, Pam3CSK4), агонист TLR4 (например, аминоалкилглюкозаминид фосфат, такой как Е6020), агонист TLR4 (например, имиквимод), агонист TLR8 (например, резиквимод) и/или агонист TLR9 (например, IC31). В идеальном варианте любой такой агонист имеет молекулярную массу <2000 Da. В том случае, если РНК инкапсулирована, то в некоторых вариантах осуществления агонист(ы) также инкапсулируют с РНК, но в других вариантах осуществления они остаются неинкапсулированными. В тех случаях, когда РНК адсорбирована на частице, то в некоторых вариантах осуществления такой агонист(ы) также адсорбируется с РНК, но в других вариантах осуществления он не адсорбирован.
Фармацевтические композиции по изобретению могут содержать липосомы в обыкновенной воде (например, в вожже для инъекций) или в буфере, например, фосфатном буфере, Трис-буфере, боратном буфере, сукцинатном буфере, гистидиновом буфере или цитратном буфере. Как правило, соли буфера будут находиться в количестве в пределах 5-20 мМ.
Фармацевтические композиции по изобретению могут иметь рН в пределах от 5,0 до 9,5, например, от 6,0 до 8,0.
Композиции по изобретению могут содержать соли натрия (например, хлорида натрия) для обеспечения эффективного осмотического давления раствора. Концентрация NaCl 10±2 мг/мл является типичной, например, примерно 9 мг/мл.
Композиции по изобретению могут содержать вещества, образующие хелатные комплексы с ионами металлов. Они могут пролонгировать стабильность РНК посредством удаления ионов, ускоряющих гидролиз фосфодиэфирных связей. Таким образом, композиция может содержать одно или более из ЭДТА, ЭГТА, BAPTA, пентетовой кислоты и т.д. Такие хелатообразующие вещества, как правило, находятся в количестве 10-500 мкМ, например, 0,1 мМ. Цитрат, такой как цитрат натрия, также может функционировать в качестве хелатообразующего агента, одновременно преимущественно обеспечивая также буферную активность.
Фармацевтические композиции по изобретению могут иметь осмолярность в пределах от 200 мОсм/кг до 400 мОсм/кг, в пределах 240-360 мОсм/кг или в пределах 290-310 мОсм/кг.
Фармацевтические композиции по изобретению могут содержать один или более консервантов, таких как тиомерсал или 2-феноксиэтанол. Предпочтительными являются не содержащие ртути композиции, и можно приготовить не содержащие консервантов вакцины.
Фармацевтические композиции по изобретению предпочтительно являются стерильными.
Фармацевтические композиции по изобретению предпочтительно являются непирогенными, например, содержащими <1 ЕЭ (единиц эндотоксина, стандартный показатель) на дозу, и предпочтительно <0,1 ЕЭ.
Фармацевтические композиции по изобретению предпочтительно не содержат глютен.
Фармацевтические композиции по изобретению можно приготовить в форме разовой дозы. В некоторых вариантах осуществления разовая доза может иметь объем в пределах 0,1-1,0 мл, например, примерно 0,5 мл.
Композиции можно приготовить в виде инъекционных препаратов, или в виде растворов или суспензий. Композицию можно приготовить для пульмонарного введения, например, с помощью ингалятора, с использованием мелкодисперсного спрея. Можно приготовить композиции для интраназального, внутриушного или внутриглазного введения, например, в виде спрея или капель. Типичными являются инъекционные препараты для внутримышечного введения.
Композиции могут включать иммунологически эффективное количество липосом, а также любые другие компоненты, которые требуются. Выражение «иммунологически эффективное количество» означает, что введение такого количества индивидууму, в одной дозе или в виде части серий доз, эффективно для лечения или профилактики. Такое количество варьирует в зависимости от состояния здоровья и физического состояния индивидуума, который подвергается лечению, возраста, таксономической группы индивидуума, который подвергается лечению (например, примат, отличный от человека, примат и т.д.), способности иммунной системы индивидуума продуцировать антитела, степени требуемой защиты, формуляции вакцины, оценки медицинской ситуации лечащим врачом и других имеющих отношении факторов. Полагается, что количество будет находиться в относительно широких пределах, которые можно определить обычными исследованиями. Содержание липосомы и РНК в композициях по изобретению, как правило, будет выражаться в единицах количества РНК на дозу. Предпочтительная доза составляет ≤100 мкг РНК (например, в пределах 10-100 мкг, например, примерно 10 мкг, 25 мкг, 50 мкг, 75 мкг или 100 мкг), но экспрессия может наблюдаться при значительно более низких количествах, ≤1 мкг/дозу, ≤100 нг/дозу, ≤10 нг/дозу, ≤1 нг/дозу и т.д.
Изобретение также относится к устройству для доставки (например, шприцу, распылителю, пульверизатору, дермальному пластырю и т.д.), содержащему фармацевтическую композицию по изобретению. Такое устройство можно использовать для введения композиции субъекту позвоночному животному.
Липосомы по изобретению не содержат рибосом.
Способы лечения и медицинские применения
В противоположность частицам, раскрытым в источнике 14, липосомы и фармацевтические композиции по изобретению являются пригодными в условиях in vivo для индукции иммунного ответа против интересующего иммуногена.
Изобретение относится к способу индукции иммунного ответа у позвоночного животного, включающему стадию введения эффективного количества липосомы и фармацевтической композиции по изобретению. Иммунный ответ предпочтительно является протективным и предпочтительно включает антитела и/или опосредованный клетками иммунитет. Способ может индуцировать бустер-эффект.
Также изобретение относится к липосоме и фармацевтической композиции по изобретению для применения в способе индукции иммунного ответа у позвоночного животного.
Также изобретение относится к применению липосомы по изобретению в производстве лекарственного препарата для индукции иммунного ответа у позвоночного животного.
Посредством индукции иммунного ответа у позвоночного животного с данными применениями и способами позвоночное животное может быть защищено против различных заболеваний и/или инфекций, например, против бактериальных и/или вирусных заболеваний, которые обсуждались выше. Липосомы и композиции являются иммуногенными, и более предпочтительно представляют вакцинные композиции. Вакцины по изобретению могут быть профилактическими (т.е. профилактировать инфекцию) или терапевтическими (т.е. лечить инфекцию), но обычно они являются профилактическими.
Позвоночное животное предпочтительно является млекопитающим, таким как человек или крупное сельскохозяйственное животное (например, лошади, крупный рогатый скот, олень, козы, свиньи). В том случае, когда вакцина предназначена для профилактического применения, то человек предпочтительно является ребенком (например, ребенком ясельного возраста или младенцем), или подростком; когда вакцина рассчитана для терапевтического применения, то человек предпочтительно представляет подростка или взрослого человека. Вакцину, предназначенную для детей, также можно вводить взрослым, например, для оценки безопасности, установления дозировки, иммуногенности и т.д.
Вакцины, приготовленные по изобретению, можно использовать для лечения детей и взрослых. Таким образом, человек-пациент может находиться в возрасте моложе 1 года, моложе 5 лет, в возрасте 1-5 лет, 5-15 лет, 15-55 лет или, по меньшей мере, 55 лет. Предпочтительными пациентами для введения вакцин являются пожилые люди (например, в возрасте ≥50 лет, ≥60 лет и предпочтительно ≥65 лет), молодые люди (например, в возрасте ≤5 лет), пациенты больниц, работники учреждений здравоохранения, военные и полицейские, беременные женщины, пациенты с хроническими болезнями или люди с иммунодефицитными состояниями. Однако вакцины подходят не только для этих групп, их можно использовать более широко для других групп населения.
Композиции по изобретению, как правило, вводят непосредственно пациенту. Прямую доставку можно осуществить парентеральной инъекцией (например, подкожно, внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно, внутрикожно или в интерстициальное пространство ткани; в отличие от источника 1, внутриязычная инъекция не используется широко в настоящем изобретении). Альтернативные пути введения включают ректальный, пероральный (например, таблетки, спрей), буккальный, сублингвальный, интравагинальный, местный, трансдермальный или чрезкожный, интраназальный, внутриглазной, внутриушной, пульмонарный или другие мукозальные пути введения. Внутрикожное и внутримышечное введение является двумя предпочтительными путями. Инъекцию можно проводить с использованием иглы (например, гиподермической иглы), но альтернативно можно проводить безыгольную инъекцию. Типичная доза при внутримышечном введении составляет 0,5 мл.
Изобретение можно использовать для индукции системного и/или мукозального иммунитета, предпочтительно для индукции повышенного системного и/или мукозального иммунитета.
Дозировка может представлять однодозовую схему или мультидозовую схему. Мультидозы можно использовать в схеме первичной иммунизации и/или схеме повторной иммунизации. В мультидозовой схеме различные дозы можно вводить одним и тем же или различными путями, например, первую дозу - парентеральным путем и повторную дозу - через слизистую, первую дозу - через слизистую и повторную дозу - парентеральным путем и т.д. Как правило, мультидозы вводят, по меньшей мере, с интервалом 1 неделю (например, примерно 2 недели, примерно 3 недели, примерно 3 недели, примерно 4 недели, примерно 6 недель, примерно 8 недель, примерно 10 недель, примерно 12 недель, примерно 16 недель и т.д.). В одном варианте осуществления мультидозы можно вводить через примерно 6 недель, 10 недель и 14 недель после рождения, например, в возрасте 6 недель, 10 недель и 14 недель, как это часто применяют в расширенной программе иммунизации Всемирной Организации Здравоохранения («EPI»). В альтернативном варианте осуществления две основные дозы вводят с интервалом примерно два месяца, например, с интервалом примерно 7, 8 или 9 недель, с последующим введением одной или более повторных доз примерно через период времени от 6 месяцев до 1 года после второй основной дозы, например, примерно через 6, 8, 10 или 12 месяцев после второй основной дозы. В дополнительном варианте осуществления три основных дозы вводят с интервалом примерно два месяца, например, с интервалом примерно 7, 8 или 9 недель, с последующим введением одной или более повторных доз через период времени от 6 месяцев до 1 года после третьей основной дозы, например, примерно через 6, 8, 10 или 12 месяцев после третьей основной дозы.
Общая информация
В практике настоящего изобретения будут применяться, если не указано иначе, обычные методы химии, биохимии, молекулярной биологии, иммунологии и фармакологии, известные в данной области. Такие методы подробно описаны в литературе. Смотри, например, источники 34-40 и т.д.
Термин «содержащий» означает «включающий», а также «состоящий», например, композиция, «содержащая» Х, может исключительно состоять из Х, или может содержать некоторые дополнительные компоненты, например, Х+Y.
Термин «примерно» по отношению к цифровому значению x является необязательным и означает, например, х±10%.
Выражение «по существу» не исключает «полностью», например, композиция, которая «по существу не содержит» Y, может полностью не содержать Y. Когда это необходимо, то выражение «по существу» можно исключить из определения по изобретению.
Обращения к терминам заряд, катионы, анионы, цвитеррионы и т.д., используются при рН 7.
TLR3 представляет Toll-подобный рецептор 3. Это единичный мембранный рецептор, который играет ключевую роль в системе врожденного иммунитета. Известные агонисты TLR3 включают поли(I:C). «TLR3» является принятым по номенклатуре HGNC названием гена, кодирующего данный рецептор, и его уникальным номером HGNC ID является HGNC:11849. Последовательность RefSeq для гена TLR3 человека представляет GI:2459625.
TLR7 представляет Toll-подобный рецептор 7. Это единичный мембранный рецептор, который играет ключевую роль в системе врожденного иммунитета. Известные агонисты TLR7 включают, например, имиквимод. «TLR7» является принятым по номенклатуре HGNC названием гена, кодирующего данный рецептор, и его уникальным номером HGNC ID является HGNC:15631. Последовательность RefSeq гена TLR7 человека представляет GI:67944638.
TLR8 представляет Toll-подобный рецептор 8. Это единичный мембранный рецептор, который играет ключевую роль системе врожденного иммунитета. Известные агонисты TLR7 включают, например, резиквимод. «TLR8» является принятым по номенклатуре HGNC названием гена, кодирующего данный рецептор, и его уникальным номером HGNC ID является HGNC:15632. Последовательность RefSeq гена TLR8 человека представляет GI:20302165.
Семейство RIG-I-подобных рецепторов («RLR») включает различные РНК-геликазы, которые играют ключевую роль системе врожденного иммунитета [41]. RLR-1 (также известный, как RIG-I или ген I, индуцируемый ретиноевой кислотой) имеет два домена рекрутирования каспазы около его N-конца. Принятым по номенклатуре HGNC названием гена, кодирующего геликазу RLR-1, является «DDX58» (для DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box полипептида 58), и его уникальным номером HGNC ID является HGNC:19102. Последовательность RefSeq гена RLR-1 человека представляет GI:77732514. RLR-2 (также известный, как MDA5 или ассоциированный с дифференцировкой меланомы ген 5) также имеет два домена рекрутирования каспазы около его N-конца. Принятым по номенклатуре HGNC названием гена, кодирующего геликазу RLR-2, является «IFIH1» (для домена 1 индуцированной интерфероном геликазы С), и его уникальный номер HGNC ID представляет HGNC:18873. Последовательность RefSeq гена RLR-2 человека представляет GI:27886567. RLR-3 (также известный, как LGP2 или лаборатория генетики и физиологии 2) не имеет доменов рекрутирования каспазы. Принятым по номенклатуре HGNC названием гена, кодирующего геликазу RLR-3, является «DHX58» (для DHX (Asp-Glu-Х-His) box полипептида 58), и его уникальным номером HGNC ID является HGNC:29517. Последовательность RefSeq гена RLR-3 человека представляет GI:149408121.
PKR представляет зависимую от двухцепочечной РНК протеинкиназу. Она играет ключевую роль в системе врожденного иммунитета. «EIF2AK2» (для эукариотического фактора инициации трансляции 2-альфа киназы 2) является принятым по номенклатуре HGNC названием гена, кодирующего данный фермент, и его уникальный номер HGNC ID представляет HGNC:9437. Последовательность RefSeq гена PKR человека представляет GI:208431825.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
На фиг.1 показан гель с окрашенной РНК. Дорожки показывают (1) маркеры (2) «голый» репликон (3) репликон после обработки РНКазой (4) репликон, инкапсулированный в липосоме (5) липосома после обработки РНКазой (6) липосома, обработанная РНКазой, затем подвергнутая экстракции смесью фенол/хлороформ.
Фиг.2 представляет электронную микрофотографию липосом.
На фиг.3 приведены структуры DLinDMA, DLenDMA и DODMA.
На фиг.4 показан гель с окрашенной РНК. Дорожки показывают (1) маркеры (2) «голый» репликон (3) репликон, инкапсулированный в липосому (4) липосома, обработанная РНКазой, затем подвергнутая экстракции смесью фенол/хлороформ.
На фиг.5 показана экспрессия белка на сутки 1; 3 и 6 после доставки РНК в виде упакованного в вирион репликона (прямоугольники) в виде «голой» РНК (ромбы) или в липосомах (+=0,1 мкг, х=1 мкг).
На фиг.6 показана экспрессия белка на сутки 1; 3 и 6 после доставки инкапсулированной в липосому РНК в четырех различных дозах.
На фиг.7 показаны титры анти-F-IgG у животных, получивших упакованный в вирион репликон (VRP или VSRP), 1 мкг «голой» РНК и 1 мкг инкапсулированной в липосому РНК.
На фиг.8 показаны титры анти-F-IgG у животных, получивших VRP, 1 мкг «голой» РНК и 0,1 г или 1 мкг инкапсулированной в липосому РНК.
На фиг.9 показаны титры нейтрализующих антител у животных, получивших VRP или 0,1 г или 1 мкг инкапсулированной в липосому РНК.
На фиг.10 показаны уровни экспрессии после доставки репликона в виде «голой» РНК (кружки), инкапсулированной в липосому РНК (треугольники и прямоугольники) или в виде липоплекс (перевернутые треугольники).
На фиг.11 показаны титры F-специфического IgG (через 2 недели после второй дозы) после доставки репликона в виде «голой» РНК (0,01-1 мкг), инкапсулированной в липосому РНК (0,01-10 мкг) или упакованной в виде вириона (VRP, 106 инфекционных единиц или МЕ).
На фиг.12 показаны титры F-специфического IgG (кружки) и титры PRNT (прямоугольники) после доставки репликона в виде «голой» РНК (1 мкг), инкапсулированной в липосому РНК (0,1 или 1 мкг) или упакованной в виде вириона (VRP, 106 МЕ). Также представлены титры у интактных мышей. Сплошные линии являются геометрическими средними значениями.
На фиг.13 показана внутриклеточная продукция цитокинов после повторной стимуляции синтетическими пептидами, представляющими основные эпитопы в белке F, 4 недели после второй дозы. На оси Y приведен % цитокина+ CD8+CD4-.
На фиг.14 показаны титры F-специфического IgG (log10 средних значений титров) в течение 63 суток (фиг.14А) и 210 суток (фиг.14В) после иммунизации телят. Три линии легко распознаются на 63 сутки и снизу вверх означают: отрицательный контроль PBS, доставленная в липосомах РНК и продукт «Triangle 2».
На фиг.15 показана зависимость экспрессии SEAP (относительная интенсивность) на сутки 6 против pKa липидов, использованных в липосомах. Кружки показывают значения для липосом с DSPC и прямоугольники - для липосом без DSPC; в некоторых случаях прямоугольники и кружки перекрываются, оставляя видимыми только прямоугольники для данного значения pKa.
На фиг.16 показана экспрессия титров анти-F-IgG (относительно RV01, 100%) через две недели после первой дозы репликона, кодирующего F-белок. Строили график зависимости титров от pKa аналогично тому, как на фиг.15. Звездочки показывают RV02, в которых использовали катионный липид, имеющий pKa выше, чем другие липиды. Треугольники показывают данные для липосом с отсутствием DSPC; кружки - для липосом, которые содержали DSPC.
На фиг.17 показаны общие титры IgG после доставки репликона в липосомах с использованием, слева направо, RV01, RV16, RV17, RV18 или RV19. Линии показывают средние значения. Верхняя линия в каждом случае 2wp2 (т.е. через 2 недели после второй дозы), в то время как нижняя линия представляет 2wp1.
На фиг.18 показаны титры IgG в 13 группах мышей. Каждый кружок означает отдельную мышь, и сплошные линии показывают геометрические средние значения. Прерывистая горизонтальная линия представляет предел определения теста. 13 групп, слева направо, представляют от А до М, как показано ниже.
На фиг.19 показано (А) IL-6 и (В) IFNα (пкг/мл), продуцированные pDC. Имеются 4 пары столбцов, слева направо: контроль; иммунизированные РНК+DOTAP; иммунизированные РНК+липофектамин и иммунизированные РНК в липосомах. В каждой паре черный столбец представляет мышей дикого типа, серый - мутанта rsq1.
СПОСОБЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
РНК-репликоны
Ниже используются различные репликоны. В целом они основаны на рекомбинантном геноме альфа-вируса с неструктурными белками из вируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEEV), сигналом упаковки из вируса Синдбис и 3' UTR из вируса Синдбис или мутанта VEEV. Репликон имеет длину примерно 10 т.п.н. и содержит поли-А-хвост.
Плазмидная ДНК, кодирующая репликоны альфа-вируса (имеющая название: pT7-mVEEV-FL.RSVF или A317; pT7-mVEEV-SEAP или A306; pSP6-VCR-GFP или A50), служила в качестве матрицы для синтеза РНК в условиях in vitro. Репликоны содержат генетические элементы альфа-вируса, необходимые для репликации РНК, но в них отсутствуют элементы, кодирующие продукты гена, необходимые для сборки частиц; структурные белки замещены интересующим белком (репортером, таким как SEAP или GFP, или иммуногеном, таким как полноразмерный RSV F-белок) и, таким образом, репликоны не способны индуцировать генерацию инфекционных частиц. Промотор бактериофага (Т7 или SP6) апстрим кДНК альфа-вируса облегчает синтез РНК-репликона в условиях in vitro, и рибозим вируса гепатита дельта (HDV) сразу же даунстрим поли(А)-хвоста генерирует правильный 3'-конец посредством его саморасщепляющей активности.
После линеаризации плазмидной ДНК даунстрим от рибозима HDV с использованием подходящей рестриктазы, синтезировали «прерванные» транскрипты в условиях in vitro с использованием ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактерифага Т7 или SP6. Транскрипции проводили в течение 2 ч при 37°С в присутствии 7,5 мМ (РНК-полимеразы Т7) или 5 мМ (РНК-полимеразы SP6) каждого из нуклеозидтрифосфатов (ATP, CTP, GTP и UTP), следуя инструкциям, предоставленным изготовителем (Ambion). После транскрипции ДНК-матрицу расщепляли ДНКазой TURBO (Ambion). РНК-репликон преципитировали LiCl и восстанавливали в воде, не содержащей нуклеаз. После транскрипции некэпированную РНК кэпировали с использованием Vaccinia Capping Enzyme (VCE) с использованием системы ScriptCap m7G Capping System (Epicentre Biotechnologies), как описано в инструкции для пользователя; репликоны, кэпированные таким образом, представлены с приставкой «v», например, vA317 является репликоном A317, кэпированным VCE. После транскрипции кэпированную РНК преципитировали LiCl и восстанавливали в воде, не содержащей нуклеаз. Концентрацию образцов РНК анализировали по определению OD260nm. Целостность транскриптов in vitro подтверждали электрофорезом в агарозном геле в денатурирующих условиях.
Липосомальное инкапсулирование
РНК инкапсулировали в липосомах, приготовленных способом, описанным в источниках 11 и 42. Липосомы готовили из 10% DSPC (цвиттерионный), 40% DLinDMA (катионный), 48% холестерина и 2% конъюгированного с ПЭГом DMG (ПЭГ 2 kDa). Данные относительные количества относятся к моль % к всей липосоме.
DLinDMA (1,2-дилинолеилокси-N,N-диметил-3-аминопропан) синтезировали с использованием метода, описанного в источнике 6. DSPC (1,2-диастероил-sn-глицеро-3-фосфохолин) получали от Genzyme. Холестерин получали от Sigma-Aldrich. Конъюгированный с ПЭГом DMG (1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль] аммониевая соль), DOTAP (1,2-диолеоил-3-триметиламмоний пропан хлорид) и DC-chol (3β-[N-(N',N'-диметиламиноэтан)карбамоил]холестерин гидрохлорид) получали от Avanti Polar Lipids.
Вкратце, липиды растворяли в этаноле (2 мл), РНК-репликон растворяли в буфере (2 мл, 100 мМ цитрата натрия, рН 6) и растворы смешивали с 2 мл буфера с последующим уравновешиванием в течение 1 ч. Смесь разбавляли 6 мл буфера, затем фильтровали. Полученный продукт содержал липосомы, с эффективностью инкапсулирования примерно 95%.
Например, в одном конкретном способе готовили свежие маточные растворы в этаноле. Взвешивали 37 мг DLinDMA, 11,8 мг DSPC, 27,8 мг холестерина и 8,07 мг ПЭГ-DMG и растворяли в 7,55 мл этанола. Свежеприготовленный маточный раствор липидов осторожно качали при 37°С примерно в течение 15 мин с получением гомогенной смеси. Затем 755 мкл маточного раствора добавляли к 1,245 мл этанола с получением рабочего маточного раствора липидов объемом 2 мл. Это количество липидов использовали для получения липосом с 250 мкг РНК. Также готовили 2 мл рабочего раствора РНК из маточного раствора с концентрацией ≈1 мкг/мкл в 100 мМ цитратном буфере (рН 6). Три стеклянных сосуда емкостью 20 мл (с магнитной мешалкой) промывали раствором RNase Away (Molecular BioProducts) и промывали избытком воды MilliQ перед использованием для инактивации РНКаз в сосудах. Один из сосудов использовали для рабочего раствора РНК и другие для сбора смесей липида и РНК (как описано ниже). Рабочие растворы липидов и РНК нагревали при 37°С в течение 10 мин перед загрузкой в шприцы 3cc «Луер Лок». В другой шприц 3cc вносили 2 мл цитратного буфера (рН 6). Шприцы, содержащие РНК и липиды, подсоединяли к Т-смесителю (PEEKTM 500 мкм ID junction, Idex health Science), используя трубку из FEP (фторированный этилен-пропилен; все использованные FEP-трубки имели внутренний диаметр 2 мм и внешний диаметр 3 мм). Выходное отверстие Т-смесителя также представляло трубку из FEP. Третий шприц, содержащий цитратный буфер, соединяли с отдельным участком FEP-трубки. Затем содержимое всех шприцов приводилось в движение со скоростью 7 мл/мин с использованием шприцевого насоса. Выходные отверстия трубок располагались для сбора смесей в стеклянном сосуде емкостью 20 мл (с одновременным перемешиванием). Затем извлекали магнитные мешалки, и смеси этанол/водный раствор давали уравновеситься при комнатной температуре в течение 1 ч. 4 мл смеси загружали в шприц 5 сс, который был соединен с участком FEP-трубки, и в другой шприц 5 сс, соединенный с таким же по длине участком FEP-трубки, загружали равное количество 100 мМ цитратного буфера (рН 6). Содержимое двух шприцов приводили в движение со скоростью 7 мл/мин с использованием шприцевого насоса и конечную смесь собирали в стеклянном сосуде емкостью 20 мл (с одновременным перемешиванием). Затем смесь, собранную на второй стадии сбора (липосомы) пропускали через мембрану Mustang Q (анионообменная подложка, которая связывает и удаляет анионные молекулы, производства Pall Corporation). Перед использованием данной мембраны для липосом через нее последовательно пропускали 4 мл 1М NaOH, 4 мл 1М NaCl и 10 мл 100 мМ цитратного буфера (рН 6). Липосомы подогревали в течение 10 мин при 37°С до пропускания через мембрану. Затем липосомы концентрировали до 2 мл и диализовали против 10-15 объемов IX PBS с использованием тангенциального проточного фильтрования перед извлечением конечного продукта. Систему TFF и фильтрационные мембраны из полых волокон получали от Spectrum Labs (Rancho Dominguez) и использовали согласно указаниям изготовителя. Использовали полисульфоновые фильтрационные мембраны из полых волокон с отсечением по молекулярной массе 100 kD и площадью поверхности 8 см2. Для экспериментов in vitro и in vivo композиции разбавляли до требуемой концентрации РНК с использованием IX PBS.
На фиг.2 показан пример электронной микрофотографии липосом, приготовленных данными способами. Эти липосомы содержат инкапсулированную РНК, кодирующую полноразмерный антиген RSV F. Результаты динамического рассеяния света одной партии показывали, что средний диаметр равен 141 нм (по интенсивности) или 78 нм (по числу).
Определяли процент инкапсулированной РНК и концентрацию РНК с использованием набора Quant-iT RiboGreen RNA reagent (Invitrogen), следуя инструкциям изготовителя. Стандарт рибосомальной РНК, включенный в набор, использовали для построения калибровочной кривой. Липосомы разводили 10× или 100× буфером 1X TE (из набора) перед добавлением красителя. Отдельно липосомы разводили 10× или 100× буфером 1X TE, содержащим 0,5% Тритона Х до добавления красителя (для разрушения липосом и, таким образом, анализа общей фракции РНК). Затем добавляли равное количество красителя в каждый раствор и затем ≈180 мкл каждого раствора, после добавления красителя, вносили в двух параллелях в 96-луночный планшет для культивирования тканей. Определяли флуоресценцию (длина волны возбуждения 485 нм, длина волны эмиссии 528 нм) на ридере для планшетов. Все композиции липосом дозировали in vivo по инкапсулированному количеству РНК.
Было показано, что липосомы защищали РНК от расщепления РНКазой. В опытах использовали 3,8 mAU РНКазы А на мкг РНК, инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. РНКазу инактивировали протеиназой К при 55°С в течение 10 мин. Затем добавляли смесь образца добавляли 1:1 об/об к смеси фенол:хлороформ:изоамиловый спирт 25:24:1 об/об/об для экстракции РНК из липидов в водную фазу. Образцы смешивали на вортексе в течение нескольких секунд и затем помещали в центрифугу на 15 мин при 12k RPM. Водную фазу (содержащую РНК) удаляли и использовали для анализа РНК. Перед загрузкой (400 нг РНК на лунку) все образцы инкубировали с красителем, содержащим формальдегид, денатурировали в течение 10 мин при 65°С и охлаждали до комнатной температуры. Использовали маркеры Ambion Millennium для приближения к молекулярной массе РНК-конструкции. Электрофорез в геле проводили при 90 В. Гель окрашивали с использованием красителя 0,1% SYBR gold согласно инструкциям изготовителя в воде при качании при комнатной температуре в течение 1 ч. На фиг.1 показано, что РНКаза полностью расщепляет РНК в отсутствии инкапсулирования (дорожка 3). РНК не детектируется после инкапсулирования (дорожка 4), и отсутствовали изменения, если липосомы обрабатывали РНКазой (дорожка 4). После обработки РНКазой липосомы подвергали экстракции фенолом, видна нерасщепленная РНК (дорожка 6). Даже после 1 недели при 4°С РНК детектировали без какой-либо фрагментации (фиг.4, стрелка). Экспрессия белка in vivo не изменялась через 6 недель выдерживания при 4°С и одного цикла замораживания-оттаивания. Таким образом, инкапсулированная в липосоме РНК является стабильной.
Для оценки экспрессии РНК in vivo репортерный фермент (SEAP; секретированная щелочная фосфатаза) кодировали в репликон в большей степени, чем в иммуноген. Определяли уровни экспрессии в сыворотке крови, разведенной 1:4 в буфере для разведения 1X Phospa-Light, с использованием хемилюминесцентного субстрата щелочной фосфатазы. 8-10-недельным мышам BALB/c (5 животных/на группу) вводили внутримышечно на сутки 0 по 0,50 мкл на конечность в дозе 0,1 мкг или 1 мкг РНК. Этот же вектор также вводили без липосом (в 1X PBS, не содержащем РНКазу) в дозе 1 мкг. Также тестировали упакованные в вирион репликоны. Упакованные в вирион репликоны, использованные в данном случае (далее относится к «VRP»), получали с использованием способов, описанных в источнике 43, где альфа-вирусный репликон был получен из мутантного VEEV или химеры, полученной из генома VEEV, сконструированного с включением 3' UTR вируса Синдбис и сигнала упаковки вируса Синдбис (PS), упакованных совместной электропорацией в клетки BHK с дефектными хэлперными РНК, кодирующими гены капсида вируса Синдбис и гликопротеина.
Как показано на фиг.5, инкапсулирование повышало уровни SEAP примерно на ½ log при дозе 1 мкг, и на 6 сутки экспрессия после введения 0,1 мкг инкапсулированной дозы совпадала с уровнями, наблюдаемыми для 1 мкг неинкапсулированной дозы. На 3 сутки уровни экспрессии превышали таковые, достигаемые с VRP (прямоугольники). Таким образом, экспрессия возрастала, когда РНК формулировали в липосомы по сравнению с контрольной «голой» РНК, даже в 10 раз более низкой дозе. Экспрессия также была выше по сравнению с контролем VRP, но кинетика экспрессии была очень различной (смотри фиг.5). Доставка РНК электропорацией приводила к повышенной экспрессии по сравнению с «голой» РНК, но эти уровни были ниже по сравнению с липосомами.
Для оценки того, насколько эффект, наблюдаемый в группах с липосомами, имел место только за счет компонентов липосомы или был непосредственно связан с инкапсулированием, репликон вводили в инкапсулированной форме (с двумя различными протоколами выделения, 0,1 мкг РНК) или смешивали с липосомами после их приготовления (неинкапсулированный «липоплекс», 0,1 мкг РНК), или в виде «голой» РНК (1 мкг). На фиг.10 показано, что липоплекс давал наиболее низкие уровни экспрессии, свидетельствуя о том, что инкапсулирование является важным для обеспечения высокой экспрессии.
Опыты in vivo с использованием доставки в липосомах подтвердили эти установленные факты. Мышам вводили различные комбинации (i) самореплицирующийся РНК-репликон, кодирующий полноразмерный RSV F-белок, (ii) самореплицирующийся РНК-репликон, кодирующий GFP, (iii) РНК-репликон, кодирующий GFP, с нокаутом в nsP4, что элиминировало саморепликацию, (iv) полноразмерный RSV F-белок. 13 групп мышей в целом получали:
A - -
B 0,1 мкг (i), «голая» -
C 0,1 мкг (i), инкапсулированная в липосому -
D 0,1 мкг (i), с отдельными липосомами -
E 0,1 мкг (i), «голая» 10 мкг (ii), «голая»
F 0,1 мкг (i), «голая» 10 мкг (iii), «голая»
G 0,1 мкг (i), инкапсулированная в липосому 10 мкг (ii), «голая»
H 0,1 мкг (i), инкапсулированная в липосому 10 мкг (iii), «голая»
I 0,1 мкг (i), инкапсулированная в липосому 1 мкг (ii), инкапсулированная в липосому
J 0,1 мкг (i), инкапсулированная в липосому 1 мкг (iii), инкапсулированная в липосому
K 5 мкг F-белка -
L 5 мкг F-белка 1 мкг (ii), инкапсулированная в липосому
M 5 мкг F-белка 1 мкг (iii), инкапсулированная в липосому
Результаты, приведенные на фиг.18, показывают, что для ответной продукции F-специфического IgG требуется инкапсулирование в липосоме в большей степени, чем только совместная доставка с пустыми липосомами (сравните группы С&D). Сравнение данных по группам K, L и М показывает, что РНК обеспечивает адъювантный эффект против совместно доставленного белка, и данный эффект имел место как с реплицирующейся, так и нереплицирующейся РНК.
Дальнейшие опыты с SEAP показали наличие четкой зависимости доза-ответ в условиях in vivo для экспрессии, регистрируемой после доставки, по меньшей мере, 1 нг РНК (фиг.6). Результаты дальнейших экспериментов по сравнению экспрессии от инкапсулированного и «голого» репликонов указывали, что действие 0,01 мкг инкапсулированной РНК эквивалентно действию 1 мкг «голой» РНК. Инкапсулированное вещество в дозе 0,5 мкг РНК приводило к более высокой 12-кратной экспрессии на 6 сутки; в дозе 0,1 мкг - к 24-кратной экспрессии на 6 сутки.
Проводили анализ не только средних значений по группе, но также исследовали отдельных животных. В то время, как несколько животных не были респондерами на «голые» репликоны, инкапсулирование элиминировало наличие таких нон-респондеров.
В дальнейших опытах DLinDMA заменяли на DOTAP. Несмотря на то, что липосомы с DOTAP приводили к лучшей экспрессии по сравнению с «голым» репликоном, их эффект был ниже по сравнению с липосомами, содержащими DLinDMA (на 1 сутки различие составило 2-3 раза). В то время как DOTAP содержит четвертичный амин, и, таким образом, имеет положительный заряд в точке доставки, DLinDMA содержит третичный амин.
Для оценки иммуногенности in vivo конструировали репликон для экспрессии полноразмерного F-белка из респираторного синцитиального вируса (RSV). Его вводили «голым» (1 мкг), инкапсулированным в липосомы (0,1 или 1 мкг) или упакованным в вирионы (106 МЕ; «VRP») на сутки 0 и 21. На фиг.7 приведены титры анти-F-IgG через 2 недели после второй дозы, и липосомы четко повышали иммуногенность. На фиг.8 показаны титры еще через 2 недели, на этой временной точке отсутствовала статистически достоверная разница между группами с инкапсулированной РНК в дозе 0,1 мкг, инкапсулированной РНК в дозе 1 мкг или VRP. Титры нейтрализации (определено в виде 60% снижения бляшкообразования, «PRNT60») не различались статистически значимым образом в данных трех группах через 2 недели после второй дозы (фиг.9). На фиг.12 показаны титры IgG и PRNT через 4 недели после второй дозы.
Данные на фиг.13 подтверждают, что РНК индуцирует сильный ответ CD8 Т-клеток.
В дальнейших опытах сравнивали титры F-специфического IgG у мышей, получавших VRP, 0,1 мкг инкапсулированной в липосомы РНК или 1 мкг инкапсулированной в липосомы РНК. Соотношения титров (VRP:липосома) на различные периоды времени после второй дозы были следующими:
  2 недели 4 недели 8 недель
0,1 мкг 2,9 1,0 1,1
1 мкг 2,3 0,9 0,9
Таким образом, инкапсулированная в липосомы РНК индуцировала по существу такой же иммунный ответ, что и введение вирионов.
В дальнейших опытах была показана более высокая ответная продукция F-специфического IgG с дозой 10 мкг, эквивалентные ответы на дозы 1 мкг и 0,1 мкг, и более низкий ответ на дозировку 0,01 мкг. На фиг.11 показаны титры IgG у мышей, получавших репликон в «голой» форме при введении в трех различных дозах, в липосомах в 4 различных дозах или VRP (106 МЕ). Ответ, наблюдаемый с 1 мкг инкапсулированной в липосомы РНК не отличался статистически достоверно (ANOVA) по сравнению с VRP, но был установлен достоверно более высокий ответ на 10 мкг инкапсулированной в липосомы РНК (Р<0,05) по сравнению с обеими группами.
Результаты дополнительного опыта подтвердили, что 0,1 мкг инкапсулированной в липосомы РНК обеспечивало более высокую ответную продукцию анти-F-IgG (через 15 суток после второй дозы) по сравнению с 0,1 мкг доставленной ДНК, и первая была более иммуногенной по сравнению с 20 мкг плазмидной ДНК, кодирующей F-антиген, доставленной электропорацией (ElgenTM DNA Delivery System, Inovio).
Проводили дополнительное исследование на хлопковых крысах (Sigmodon hispidis) вместо мышей. Инкапсулирование в липосомы в дозе 1 мкг приводило к повышению титров F-специфического IgG в 8,3 раза по сравнению с «голой» РНК и к повышению титров PRNT в 9,5 раз. Уровень ответной продукции антител был эквивалентным ответу, индуцированному 5×106 МЕ VRP. «Голая» и инкапсулированная в липосомы РНК были способны защитить хлопковых крыс от заражения RSV (1×105 бляшкообразующих единиц), снижая вирусную нагрузку в легких, по меньшей мере, в 3,5 log. Инкапсулирование усиливало снижение примерно в 2 раза.
Опыт на крупных животных проводил на крупном рогатом скоте. Коров иммунизировали 66 мкг репликона, кодирующего полноразмерный RSV F-белок на сутки 0 и 21, формулированного в липосомах. Один PBS использовали а качестве отрицательного контроля, а официально разрешенную вакцину использовали в качестве положительного контроля («Triangle» 4 производства Fort Dodge, содержащую убитый вирус). На фиг.14 показаны титры F-специфического IgG в течение 63-суточного периода, начиная от первой иммунизации. РНК-репликон был иммуногенным у коров, хотя, он индуцировал более низкие титры по сравнению официально разрешенной вакциной. У всех вакцинированных коров детектировали наличие F-специфических антител после второй дозы, и титры были очень стабильными в период 2-6 недель после введения второй дозы (и были особенно стабильными для РНК-вакцины).
Механизм действия
Дендритные клетки, генерированные из костного мозга (pDC), получали от мышей дикого типа или мышей мутантного штамма «Resq» (rsq1). Мутантный штамм содержит точечную мутацию в аминоконце рецептора TLR7, что элиминирует сигнальный путь TLR7, не оказывая влияние на связывание лиганда [44]. Клетки стимулировали РНК-репликоном, формулированным с DOTAP, липофектамином 2000 и внутри липосомы. Как показано на фиг.16, IL-6 и INFα продуцировались клетками мышей дикого типа, но данный ответ почти полностью отсутствовал у мутантных мышей. Эти результаты свидетельствуют о том, что TLR7 необходим для распознавания РНК в иммунных клетках, и что инкапсулированные в липосомах репликоны могут стимулировать иммунные клетки к секреции высоких уровней интерферонов и провоспалительных цитокинов.
Определение pKa
pKa липида определяют в воде при обычной температуре и давлении с использованием следующего метода:
- Готовят 2 мМ раствор липида в этаноле взвешиванием липида и растворением в этаноле. Готовят 0,3 мМ раствор флуоресцентного зонда толуолнитросульфоновой кислоты (TNS) в смеси этанол:метанол 9:1 посредством приготовления вначале 3 мМ раствора TNS в метаноле и затем разведением до 0,3 мМ этанолом.
- Готовят водный буфер, содержащий фосфат натрия, цитрат натрия, ацетат натрия и хлорид натрия в концентрациях соответственно 20 мМ, 25 мМ, 20 мМ и 150 мМ. Буфер разделяют на восемь частей и рН доводят 12н HCl или 6н NaOH до 4,44-4,52, 5,27, 6,15-6,21, 6,57, 7,10-7,20, 7,72-7,80, 8,27-8,33 и 10,47-11,12. Смешивают 400 мкл 2 мМ раствора липида и 800 мкл 0,3 мМ раствора TNS.
- 7,5 мкл смеси зонд/липид добавляют к 242,5 мкл буфера в 1 мл в 96-луночном планшете. Так поступают со всеми восьмью буферами. После перемешивания 100 мкл каждой смеси зонд/липид/буфер переносят в 250 мкл в черный 96-луночный планшет с прозрачным дном (например, модель COSTAR 3904, Corning). Удобным способом осуществления такого перемешивания является применение высокопропускного манипулятора для жидкостей Tecan Genesis RSP150 и программного обеспечения Gemini Software.
- Анализируют флуоресценцию каждой смеси зонд/липид/буфер (например, на спектрофотометре SpectraMax M5 и программном обеспечении SoftMax pro 5,2) при длине волны возбуждения 322 нм и длине волны эмиссии 431 нм (аутопорог при 420 нм).
- После анализа вычитают фоновую флуоресценцию пустой лунки в 96-луночном планшете из флуоресценции смеси зонд/липид/буфер. Затем значения флуоресценции нормализуют к значению при наиболее низком рН. Затем строят график зависимости нормализованной флуоресценции против рН и получают линию наилучшей подгонки.
- Находят точку на линии наилучшей подгонки, при которой интенсивность нормализованной флуоресценции равна, 0,5. Находят рН, соответствующий нормализованной интенсивности флуоресценции, равной 0,5, и принимают это значение за pKa липида.
Данный метод дает значение pKa, равное 5,8, для DLinDMA. Значения pKa, анализированные данным методом, для катионных липидов из источника 5 приведены ниже.
Инкапсулирование в липосомах с использованием альтернативных катионных липидов
В качестве альтернативны для DLinDMA использовали катионные липиды из источника 5. Данные липиды можно синтезировать, как описано в источнике 5.
Липосомы, полученные выше, с использованием DLinDMA относятся ниже к серии «RV01». DLinDMA заменяли на различные катионные липиды в сериях «RV02»-«RV12», как описано ниже. Получали два различных типа каждой липосомы с использованием 2% ПЭГ2000-DMG с (01) 40% катионного липида, 10% DSPC и 48% холестерина или (02) 60% катионного липида и 38% холестерина. Таким образом, сравнение липосом (01) и (02) показывает эффект нейтрального цвиттерионного липида.
Липосомы RV02 готовили с использованием следующего катионного липида (pKa>9, без третичного амина):
Figure 00000001
Липосомы RV03 готовили с использованием следующего катионного липида (pKa 6,4):
Figure 00000002
Липосомы RV04 готовили с использованием следующего катионного липида (pKa 6,62):
Figure 00000003
Липосомы RV05 готовили с использованием следующего катионного липида (pKa 5,85):
Figure 00000004
Липосомы RV06 готовили с использованием следующего катионного липида (pKa 7,27):
Figure 00000005
Липосомы RV07 готовили с использованием следующего катионного липида (pKa 6,8):
Figure 00000006
Липосомы RV08 готовили с использованием следующего катионного липида (pKa 5,72):
Figure 00000007
Липосомы RV09 готовили с использованием следующего катионного липида (pKa 6,07):
Figure 00000008
Липосомы RV10 готовили с использованием следующего катионного липида (pKa 7,86):
Figure 00000009
Липосомы RV11 готовили с использованием следующего катионного липида (pKa 6,41):
Figure 00000010
Липосомы RV12 готовили с использованием следующего катионного липида (pKa 7):
Figure 00000011
Липосомы RV16 готовили с использованием следующего катионного липида (pKa 6,1) [45]:
Figure 00000012
Липосомы RV17 готовили с использованием следующего катионного липида (pKa 7,27):
Figure 00000013
Липосомы RV18 готовили с использованием DODMA. Липосомы RV19 получали с использованием DOTMA, и липосомы RV13 готовили с использованием DOTAP, оба липида содержали «головку» из четвертичного амина.
Липосомы характеризовали и тестировали с использованием репортера SEAP, описанного выше. В следующей таблице приведены размеры липосом (Z средний размер и индекс полидисперности), % инкапсулирования РНК в каждой липосоме, вместе с активностью SEAP, детектированной на 1 и 6 сутки после инъекции. Активность SEAP выражена относительно липосом «RV01(02)», приготовленных из DlinDMA, холестерина и ПЭГ-DMG:
RV pKa липида Zav (pdI) % инкапсулирования SEAP на сутки 1 SEAP на сутки 6
RV01 (01) 5,8 154,6 (0,131) 95,5 80,9 71,1
RV01 (02) 5,8 162,0 (0,134) 85,3 100 100
RV02 (01) >9 133,9 (0,185) 96,5 57 45,7
RV02 (02) >9 134,6 (0,082) 97,6 54,2 4,3
RV03 (01) 6,4 158,3 (0,212) 62,0 65,7 44,9
RV03 (02) 6,4 164,2 (0,145) 86 62,2 39,7
RV04 (01) 6,62 131,0 (0,145) 74,0 91 154,8
RV04 (02) 6,62 134,6 (0,117) 81,5 90,4 142,6
RV05 (01) 5,85 164,0 (0,162) 76,0 76,9 329,8
RV05 (02) 5,85 177,8 (0,117) 72,8 67,1 227,9
RV06 (01) 7,27 116,0 (0,180) 79,8 25,5 12,4
RV06 (02) 7,27 136,3 (0,164) 74,9 24,8 23,1
RV07 (01) 6,8 140,6 (0,184) 77 26,5 163,3
RV07 (02) 6,8 138,6 (0,122) 87 29,7 74,8
RV08(01) 5,72 176,7 (0,185) 50 76,5 187
RV08 (02) 5,72 199,5 (0,191) 46,3 82,4 329,8
RV09 (01) 6,07 165,3 (0,169) 72,2 65,1 453,9
RV09 (02) 6,07 179,5 (0,157) 65 68,5 658,2
RV10(01) 7,86 129,7 (0,184) 78,4 113,4 47,8
RV10 (02) 7,86 147,6 (0,131) 80,9 78,2 10,4
RV11 (01) 6,41 129,2 (0,186) 71 113,6 242,2
RV11 (02) 6,41 139 (0198) 75,2 71,8 187,2
RV12 (01) 7 135,7 (0,161) 78,8 65 10
RV12 (02) 7 158,3 (0,287) 69,4 78,8 8,2
На фиг.15 приведены графики зависимости уровней SEAP от pKa катионных липидов на 6 сутки. Наилучшие результаты были получены, когда липид имел значение pKa в пределах от 5,6 до 6,8, и в идеальном варианте от 5,6 до 6,3.
Данные липосомы также использовали для доставки репликона, кодирующего полноразмерный RSV F-белок. Строили график зависимости общих титров IgG к F-белку против pKa через две недели после введения первой дозы (2wp1), который приведен на фиг.16. Наилучшие результаты были получены при pKa, когда катионный липид имеет pKa в пределах 5,7-5,9, но только значение pKa не в достаточной мере гарантирует высокий титр IgG, например, липид должен поддерживать образование липосомы.
Иммуногенность RSV
Проводили дальнейшую работу с самореплицирующимся репликоном (vA317), кодирующим RSV F-белок. Мышей BALB/c, 4-8 животных на группу, вакцинировали билатерально внутримышечно (50 мкл на конечность) на сутки 0 и 21 одним репликоном (1 мкг) или репликоном, формулированным в липосомы с липидами RV01 или RV02 (смотри выше; pKa равен 5,8 или 5,85) или с RV013. Липосомы RV01 содержали 40% DLinDMA, 10% DSPC, 48% холестерина и 2% ПЭГ-DMG, но с различными количествами РНК. Липосомы RV05(01) содержали 40% катионного липида, 48% холестерина, 10% DSPC и 2% ПЭГ-DMG; липосомы RV05(02) содержали 60% катионного липида, 38% холестерина и 2% ПЭГ-DMG. Липосомы RV13 содержали 40% DOTAP, 10% DPE, 48% холестерина, 10% DSPC и 2% ПЭГ-DMG. В целях сравнения «голую» плазмидную ДНК (20 мкг), экспрессирующую тот же антиген RSV-F, доставляли либо с использованием электропорации, либо в липосомах RV01(10) (0,1 мкг ДНК). Четыре мыши использовали в качестве интактной контрольной группы.
Липосомы готовили способом (А) или (В). В способе (А) готовили свежие маточные растворы липидов в этаноле. Взвешивали 37 мг катионного липида, 11,8 мг DSPC, 27,8 мг холестерина и 8,07 мг ПЭГ-DMG, и растворяли в 7,55 мл этанола. Свежеприготовленный маточный раствор липидов осторожно качали при 37°С примерно в течение 15 мин с получением гомогенной смеси. Затем 226,7 мкл маточного раствора добавляли к 1,773 мл этанола с получением рабочего маточного раствора липидов объемом 2 мл. Это количество липидов использовали для приготовления липосом с 75 мкг РНК с получением соотношения азота к фосфору, равного 8:1 (за исключением липосом RV01(08) и RV01(09), для которых данное соотношение изменяли на 4:1 или 16:1). Также готовили 2 мл рабочего раствора РНК (или для RV01(10) ДНК) из маточного раствора с концентрацией ≈1 мкг/мкл в 100 мМ цитратном буфере (рН 6). Три стеклянных сосуда емкостью 20 мл (с магнитной мешалкой) промывали раствором RNase Away (Molecular BioProducts) и промывали избытком воды MilliQ перед использованием для инактивации РНКаз в сосудах. Один из сосудов использовали для рабочего раствора РНК и другие для сбора смесей липида и РНК (как описано ниже). Рабочие растворы липидов и РНК нагревали при 37°С в течение 10 мин перед загрузкой в шприцы 3cc «Луер Лок». В другой шприц 3cc вносили 2 мл цитратного буфера (рН 6). Шприцы, содержащие РНК и липиды, подсоединяли к Т-смесителю (PEEKTM 500 мкм ID junction, Idex health Science), используя трубку из FEP. Выходное отверстие Т-смесителя также представляло трубку из FEP. Третий шприц, содержащий цитратный буфер, соединяли с отдельным участком FEP-трубки. Затем содержимое всех шприцов приводилось в движение со скоростью 7 мл/мин с использованием шприцевого насоса. Выходные отверстия трубок располагались для сбора смесей в стеклянном сосуде емкостью 20 мл (с одновременным перемешиванием). Затем извлекали магнитные мешалки, и смеси этанол/водный раствор давали уравновеситься при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем смесь загружали в шприц 5 сс, который был соединен с участком FEP-трубки, и в другой шприц 5 сс, соединенный с таким же по длине участком FEP-трубки, загружали равное количество 100 мМ цитратного буфера (рН 6). Содержимое двух шприцов приводили в движение со скоростью 7 мл/мин с использованием шприцевого насоса и конечную смесь собирали в стеклянном сосуде емкостью 20 мл (с одновременным перемешиванием). Затем липосомы концентрировали до 2 мл и диализовали против 10-15 объемов IX PBS с использованием TFF перед извлечением конечного продукта. Систему для TFF и и фильтрационные мембраны из полых волокон получали от Spectrum Labs и использовали согласно указаниям изготовителя. Использовали полисульфоновые (PES) фильтрационные мембраны из полых волокон (код P-C1-100E-100-01N) с отсечением по молекулярной массе 100 kD и площадью поверхности 20 см2. Для экспериментов in vitro и in vivo композиции разбавляли до требуемой концентрации РНК с использованием IX PBS.
Способ приготовления (В) отличался двояким образом от способа (А). Вначале после сбора в стеклянном сосуде емкостью 20 мл, но до концентрирования TFF, смесь пропускали через мембрану Mustang Q (анионообменная подложка, которая связывает и удаляет анионные молекулы, производства Pall Corporation Ann Arbor, MI, США). Данную мембрану вначале промывали 4 мл 1 М NaOH, 4 мл 1 М NaCl и 10 мл 100 мМ цитратного буфера (рН 6), и липосомы подогревали в течение 10 мин при 37°С до фильтрования. Второе отличие: фильтрационная мембрана из полых волокон представляла собой полисульфон (код PN: Х1АВ-100-20Р).
Средний диаметр частиц Z, индекс полидисперности и эффективность инкапсулирования липосом были следующими:
RV Zav (нм) pdI % инкапсулирования Способ приготовления
RV01 (10) 158,6 0,088 90,7 (A)
RV01 (08) 156,8 0,144 88,6 (A)
RV01 (05) 136,5 0,136 99 (B)
RV01 (09) 153,2 0,067 76,7 (A)
RV05 (01) 148 0,127 80,6 (A)
RV05 (02) 177,2 0,136 72,4 (A)
RV01 (10) 134,7 0,147 87,8* (A)
RV13 (02) 128,3 0,179 97 (A)
* в композиции RV01(10) нуклеиновой кислотой была ДНК, а не РНК.
Сыворотки крови собирали для анализа антител на сутки 14; 36 и 49. Образцы селезенки отбирали у мышей на сутки 49 для анализа Т-клеток.
Сывороточные титры F-специфического IgG (GMT) были следующими:
RV Сутки 14 Сутки 36
«Голая» ДНК-плазмида 439 6712
«Голая» РНК А317 78 2291
RV01 (10) 3020 26170
RV01 (08) 2326 9720
RV01 (05) 5352 54907
RV01 (09) 4428 51316
RV05 (01) 1356 5346
RV05 (02) 961 6915
RV01 (10) ДНК 5 13
RV13 (02) 644 3616
Относительное количество Т-клеток, которые являются цитокин-позитивными и специфическими для пептида RSV F51-66, являются следующими, показаны только цифровые данные, которые статистически достоверно выше нуля:
RV CD4+CD8- CD4-CD8+
IFNγ IL2 IL5 TNFα IFNγ IL2 IL5 TNFα
«Голая» ДНК-плазмида 0,04 0,07   0,10 0,57 0,29   0,66
«Голая» РНК А317 0,04 0,05   0,08 0,57 0,23   0,67
RV01 (10) 0,07 0,10   0,13 1,30 0,59   1,32
RV01 (08) 0,02 0,04   0,06 0,46 0,30   0,51
RV01 (05) 0,08 0,12   0,15 1,90 0,68   1,94
RV01 (09) 0,06 0,08   0,09 1,62 0,67   1,71
RV05 (01)         0,06 0,04   0,19
RV05 (02) 0,05 0,07   0,11 0,64 0,35   0,69
RV01 (10) ДНК       0,03       0,08
RV13 (02) 0,03 0,04   0,06 1,15 0,41   1,18
Таким образом, липосомальные композиции достоверно повышали иммуногенность по сравнению с «голыми» контрольными РНК, судя по повышенным титрам F-специфического IgG и относительному количеству отдельных популяций Т-клеток. Плазмидная ДНК, формулированная в липосомах, или доставленная «голой» с использованием электропорации, была менее иммуногенной по сравнению с самореплицирующейся РНК, формулированной в липосомы.
РНК-вакцины RV01 и RV05 были более иммуногенными по сравнению с вакциной RV13 (DOTAP). Данные композиции имели сравнимые физические характеристики и были сформулированы с одной и той же самореплицирующейся РНК, но они содержали разные катионные липиды. Липиды в RV01 и RV05 содержат третичный амин в «головке» и имеют значение pKa примерно 5,8, и также включают ненасыщенные алкильные хвосты. Липид в RV13 содержит ненасыщенные алкильные «хвосты», но в его «головке» имеется четвертичный амин, и он является сильно катионным. На основании этих результатов можно предположить, что липиды с третичными аминами со значениями pKa в пределах от 5,0 до 7,6 превосходят по своим свойствам липиды, такие как DOTAP, которые являются высоко катионными, при использовании в липосомальной системе для доставки РНК.
Дополнительные альтернативы DLinDMA
Катионный липид в липосомах RV01 (DLinDMA) замещали RV16, RV17, RV18 или RV19. Общие титры IgG приведены на фиг.17. Наиболее низкие результаты были получены с RV19, т.е. с DOTMA, содержащим четвертичный амин.
Экспрессия в BHK
Липосомы с различными липидами инкубировали с клетками ВНК в течение ночи и оценивали на их способность экспрессировать белок. По сравнению с фоновым уровнем экспрессия белка с липидом RV05 повышалась в 18 раз при добавлении в липосому 10% 1,2-дифитаноил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина (DPyPE), в 10 раз при добавлении 10% 18:2 (цис) фосфатидилхолина, и в 900 раз при замене на RV01.
Иммуногенность RSV на различных штаммах мышей
Репликон «vA142» кодирует полноразмерный поверхностный слитый (F) гликопротеин дикого типа RSV, но с делецированным слитым белком, и 3'-конец сформирован рибозим-опосредованным отщеплением.
Мышей BALB/c вакцинировали билатерально внутримышечно (50 мкл на конечность) на сутки 0 и 22. Животных разделяли на 8 опытных групп (5 животных в группе) и интактную контрольную группу (2 животных):
мышам группы 1 вводили «голый» репликон (1 мкг);
мышам группы 2 вводили 1 мкг репликона при введении в липосомах «RV01(37)» с 40% DLinDMA, 10% DSPC, 48% Chol, 2% конъюгированного с ПЭГом DMG;
мышам группы 3 вводили то же самое, что и мышам группы 2, но вводили в дозе 0,1 мкг РНК;
мышам группы 4 вводили 1 мкг репликона в липосомах «RV17(10)» (40% RV17 (смотри выше), 10% DSPC, 49,5% холестерина, 0,5% ПЭГ-DMG);
мышам группы 5 вводили 1 мкг репликона в липосомах «RV05(11)» (40% липид RV17, 30% PE 18:2 (DLoPE, 28% холестерина, 2% ПЭГ-DMG);
мышам группы 6 вводили 0,1 мкг репликона в липосомах «RV17(10)»;
мышам группы 7 вводили 5 мкг субъединицы белка RSV-F с адъювантом гидроксидом алюминия;
мыши группы 8 были интактными контрольными (2 животных).
Собирали сыворотки крови для анализа антител на сутки 14; 35 и 49. GMT F-специфического IgG были следующими:
Сутки 1 2 3 4 5 6 7 8
14 82 2463 1789 2496 1171 1295 1293 5
35 1538 34181 25605 23579 13718 8887 73809 5
На сутки 35 титры (GMT) F-специфических IgG1 и IgG2 были следующими:
IgG 1 2 3 4 5 6 7
IgG1 94 6238 4836 7425 8288 1817 78604
IgG2a 5386 77064 59084 33749 14437 17624 24
Титры сывороточных нейтрализующих RSV антител на сутки 35 и 49 были следующими (данные представляют титры нейтрализации по 60% снижению бляшек для объединенных сывороток от 2-5 мышей, 1 пул на группу):
Сутки 1 2 3 4 5 6 7 8
35 <20 143 20 101 32 30 111 <20
49 <20 139 <20 83 41 32 1009 <20
Образцы селезенки отбирали на сутки 49 для анализа Т-клеток. Средние значения относительной доли чистых F-специфических цитокин-позитивных Т-клеток (CD4+ или CD8+) были следующими, показаны только цифровые данные, которые статистически достоверно выше нуля (специфические для пептидов RSV F51-66, F164-178, F309-323 для CD4+ или для пептидов F85-93 и F249-258 для CD8+):
Группа CD4+CD8- CD4-CD8+
IFNγ IL2 IL5 TNFα IFNγ IL2 IL5 TNFα
1 0,03 0,06   0,08 0,47 0,29   0,48
2 0,05 0,10   0,08 1,35 0,52   1,11
3 0,03 0,07   0,06 0,64 0,31   0,61
4 0,05 0,09   0,07 1,17 0,65   1,09
5 0,03 0,08   0,07 0,65 0,28   0,58
6 0,05 0,07   0,07 0,74 0,36   0,66
7   0,02     0,04 0,04    
8                
Мышей C57BL/6 иммунизировали аналогично, но мыши 9-й группы получали VRP (1×106 МЕ), экспрессирующие полноразмерный слитый поверхностный гликопротеин дикого типа RSV (слитый пептид делеции).
Собирали сыворотки крови для анализа антител на сутки 14; 35 и 49. Титры (GMT) F-специфического IgG были следующими:
Сутки 1 2 3 4 5 6 7 8 9
14 1140 2133 1026 2792 3045 1330 2975 5 1101
35 1721 5532 3184 3882 9525 2409 39251 5 12139
На сутки 35 титры (GMT) F-специфических IgG1 и IgG2 были следующими:
IgG 1 2 3 4 5 6 7 8
IgG1 66 247 14 328 468 92 56258 79
IgG2a 2170 7685 5055 6161 1573 2944 35 14229
Титры сывороточных нейтрализующих RSV антител на сутки 35 и 49 были следующими (данные представляют титры нейтрализации по 60% снижению бляшек для объединенных сывороток от 2-5 мышей, 1 пул на группу):
Сутки 1 2 3 4 5 6 7 8 9
35 <20 27 29 22 36 <20 28 <20 <20
49 <20 44 30 23 36 <20 33 <20 37
Образцы селезенки отбирали на сутки 49 для анализа Т-клеток. Средние значения относительной доли чистых F-специфических цитокин-позитивных Т-клеток (CD8+) были следующими, показаны только цифровые данные, которые статистически достоверно выше нуля (специфические для пептидов RSV F85-93 и F249-258):
Группа CD4-CD8+
IFNγ IL2 IL5 TNFα
1 0,42 0,13   0,37
2 1,21 0,37   1,02
3 1,01 0,26   0,77
4 1,26 0,23   0,93
5 2,13 0,70   1,77
6 0,59 0,19   0,49
7 0,10 0,05    
8        
9 2,83 0,72   2,26
Девять групп мышей C3H/HeN иммунизировали аналогично. Титры (GMT) F-специфического IgG были следующими:
Сутки 1 2 3 4 5 6 7 8 9
14 5 2049 1666 1102 298 984 3519 5 806
35 152 27754 19008 17693 3424 6100 62297 5 17249
На сутки 35 титры (GMT) F-специфических IgG1 и IgG2 были следующими:
IgG 1 2 3 4 5 6 7 8
IgG1 5 1323 170 211 136 34 83114 189
IgG2a 302 136941 78424 67385 15667 27085 3800 72727
Титры сывороточных нейтрализующих антител RSV на сутки 35 и 49 были следующими:
Сутки 1 2 3 4 5 6 7 8 9
35 <20 539 260 65 101 95 443 <20 595
49 <20 456 296 35 82 125 1148 <20 387
Таким образом, три разных липида (RV01, RV05, RV17; pKa 5,8, 5,85, 6,1) тестировали на трех различных штаммах инбредных мышей. На всех 3 штаммах RV01 был более эффективным по сравнению с RV17; для мышей штаммов BALB/c и С3Н RV05 был менее эффективным по сравнению с RV01 или RV17, но был более эффективным на штамме В6. Однако во всех случаях липосомы были более эффективными, чем две катионные наноэмульсии, которые тестировались параллельно.
Иммуногенность CMV
Липосомы RV01 с DLinDMA в качестве катионного липида использовали для доставки РНК-репликонов, кодирующих гликопротеины цитомегаловируса (CMV). Репликон «vA160» кодирует полноразмерные гликопротеины Н и L (gH/gL), в то время как «vA322» кодирует растворимую форму (gHsol/gL). Два белка находятся под контролем отдельных субгеномных промоторов в одном репликоне; совместное введение двух отдельных векторов, из которых один кодирует gH, и другой кодирует gL, не давало хороших результатов.
Мышей BALB/c, 10 животных на группу, вакцинировали билатерально внутримышечно (50 мкл на конечность) на сутки 0; 21 и 42 VRP, экспрессирующими gH/gL (1×106 МЕ), VRP, экспрессирующими gHsol/gL (1×106 МЕ), и PBS в качестве контроля. Две опытные группы получали 1 мкг репликона vA160 или vA322, формулированного в липосомах (40% DLinDMA, 10% DSPC, 48% Chol, 2% ПЭГ-DMG; липосомы были приготовлены способом (А), как обсуждалось выше, но партией размером 150 мкг РНК).
Липосомы vA160 имели диаметр Zav 168 нм, pdI 0,144, и эффективность инкапсулирования равнялась 87,4%. Липосомы vA322 имели диаметр Zav 162 нм, pdI 0,131 и с 90% инкапсулированием.
Репликоны были способны экспрессировать два белка из одного вектора.
Собирали сыворотки для иммунологического анализа на сутки 63 (3wp3). Титры нейтрализации CMV (обратная величина разбавлению сыворотки, которая дает 50% снижение числа позитивных на вирус очагов на лунку по сравнению с контролем) были следующими:
gH/gL VRP gHsol/gL VRP Липосома gH/gL Липосома gHsol/gL
4576 2393 4240 10062
Таким образом, РНК, экспрессирующая полноразмерную или растворимую форму комплекса CMV gH/gL, индуцировала высокие титры нейтрализующих антител при тестировании на эпителиальных клетках. Средние титры, индуцированные инкапсулированными в липосомы РНК, были, по меньшей мере, такими же высокими, как для соответствующих VRP.
Очевидно, понятно, что изобретение описано только с помощью примера, и могут быть сделаны модификации, не отступая от объема и сущности изобретения.
СПИСОК ИСТОЧНИКОВ ЛИТЕРАТУРЫ
[I] Johanning etal. (1995) Nucleic Acids Res 23:1495-1501. [2] WO2005/121348.
[3] WO2008/137758.
[4] WO2009/086558.
[5] WO2011/076807.
[6] Heyes etal. (2005) JControlled Release 107:276-87.
[7] WO2005/121348.
[8] Liposomes: Methods and Protocols, Volume 1: Pharmaceutical Nanocarriers: Methods an Protocols, (ed. Weissig). Humana Press, 2009. ISBN 160327359X.
[9] Liposome Technology, volumes I, II & III. (ed. Gregoriadis). Informa Healthcare, 2006.
[10] Functional Polymer Colloids and Microparticles volume 4 (Microspheres, microcapsules & liposomes). (eds. Arshady & Guyot). Citus Books, 2002.
[11] Jeffs et al. (2005) Pharmaceutical Research 22 (3):362-372.
[12] WO2005/113782.
[13] WO2011/005799.
[14] El Ouahabi et al. (1996)FEBSLetts 380:108-12.
[15] Giuliani et al. (2006)Proc Natl Acad Sci USA 103(29): 10834-9.
[16] WO2009/016515.
[17] WO02/34771.
[18] WO2005/032582.
[19] WO2010/119343.
[20] WO2006/110413.
[21] WO2005/111066.
[22] WO2005/002619.
[23] WO2006/138004.
[24] WO2009/109860.
[25] WO02/02606.
[26] WO03/018054.
[27] WO2006/091517.
[28] WO2008/020330.
[29] WO2006/089264.
[30] WO2009/104092.
[31] WO2009/031043.
[32] WO2007/049155.
[33] Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th edition, ISBN: 0683306472.
[34] Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.)
[35] Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds, 1986, Blackwell Scientific Publications)
[36] Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press).
[37] Handbook of Surface and Colloidal Chemistry (Birdi, K.S. ed., CRC Press, 1997)
[38] Ausubel et al. (eds) (2002) Short protocols in molecular biology, 5th edition (Current Protocols).
[39] Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, (Ream et al, eds., 1998, Academic Press)
[40] PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2nd ed. (Newton & Graham eds., 1997, Springer Verlag)
[41] Yoneyama & Fujita (2007) Cytokine & Growth Factor Reviews 18:545-51.
[42] Maurer et al. (2001) Biophysical Journal, 80: 2310-2326.
[43] Perri et al. (2003) J Virol 77:10394-10403.
[44] Iavarone et al. (2011) J Immunol 186;4213-22.
[45] WO2011/057020.

Claims (15)

1. Липосома для доставки in vivo РНК в клетку позвоночного животного, имеющая липидный бислой, инкапсулирующий водное ядро, где (i) липидный бислой содержит липид, имеющий третичный амин и значение рКа от 5,0 до 6,8; и (ii) водное ядро включает РНК, которая кодирует иммуноген.
2. Липосома по п. 1, где липид имеет рКа в пределах от 5,6 до 6,8.
3. Липосома по п. 1, где рКа находится в пределах 5,7-5,9.
4. Липосома по п. 1, где липид, имеющий рКа в пределах от 5,0 до 6,8, представляет собой липид, выбранный из группы, состоящей из:
Figure 00000014

Figure 00000015

Figure 00000016

Figure 00000017

Figure 00000018

Figure 00000019

Figure 00000020

Figure 00000021

или
Figure 00000022

Figure 00000023
5. Липосома по п. 1, имеющая диаметр в пределах 20-220 нм.
6. Липосома по п. 1, где молекула РНК кодирует (i) РНК-зависимую РНК-полимеразу, которая может транскрибировать РНК из молекулы РНК, и (ii) иммуноген.
7. Липосома по п. 5, где молекула РНК имеет две открытые рамки считывания, где первая кодирует репликазу альфа-вируса и вторая кодирует иммуноген.
8. Липосома по п. 1, где молекула РНК имеет длину 9000-12000 нуклеотидов.
9. Липосома по п. 1, где иммуноген может вызывать иммунный ответ в условиях in vivo против бактерии, вируса, гриба или паразита.
10. Липосома по п. 1, где иммуноген может вызывать иммунный ответ в условиях in vivo против гликопротеина F респираторного синцитиального вируса.
11. Фармацевтическая композиция для доставки in vivo РНК в клетку позвоночного животного, содержащая липосому по одному из предшествующих пунктов.
12. Способ индукции защитного иммунного ответа у позвоночного животного, включающий стадию введения позвоночному животному эффективного количества липосомы по пп. 1-10 или фармацевтической композиции по п. 11.
13. Способ получения РНК-содержащей липосомы по п. 1, включающий стадии: (а) смешивание РНК с липидом при рН, который ниже значения рКа липида, но выше 4,5; затем (b) повышение рН до значения, которое выше рКа липида.
14. Способ по п. 13, где РНК, использованная на стадии (а), находится в водном растворе, предназначенном для смешивания с органическим раствором липида, с получением смеси, которую затем разводят с образованием липосом; и рН повышают на стадии (b) после образования липосом.
15. Применение липосомы по пп. 1-10 или фармацевтической композиции по п. 11 для индукции защитного иммунного ответа у позвоночного животного.
RU2013104878/15A 2010-07-06 2011-07-06 Липосомы с липидами, имеющими преимущественное значение рка, для доставки рнк RU2589503C2 (ru)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US36183010P 2010-07-06 2010-07-06
US61/361,830 2010-07-06
US37883710P 2010-08-31 2010-08-31
US61/378,837 2010-08-31
PCT/US2011/043105 WO2012006378A1 (en) 2010-07-06 2011-07-06 Liposomes with lipids having an advantageous pka- value for rna delivery

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2013104878A RU2013104878A (ru) 2014-08-20
RU2589503C2 true RU2589503C2 (ru) 2016-07-10

Family

ID=44534956

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2013104878/15A RU2589503C2 (ru) 2010-07-06 2011-07-06 Липосомы с липидами, имеющими преимущественное значение рка, для доставки рнк

Country Status (19)

Country Link
US (15) US20130171241A1 (ru)
EP (1) EP2590626B1 (ru)
JP (6) JP2013537518A (ru)
CN (1) CN103153284B (ru)
AU (1) AU2011276234B2 (ru)
BR (1) BR112013000244A2 (ru)
CA (1) CA2804396C (ru)
DK (1) DK2590626T3 (ru)
ES (1) ES2557382T3 (ru)
HR (1) HRP20151349T1 (ru)
HU (1) HUE026646T2 (ru)
MX (1) MX2013000164A (ru)
PL (1) PL2590626T3 (ru)
PT (1) PT2590626E (ru)
RS (1) RS54489B1 (ru)
RU (1) RU2589503C2 (ru)
SI (1) SI2590626T1 (ru)
SM (1) SMT201600007B (ru)
WO (1) WO2012006378A1 (ru)

Families Citing this family (247)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8530708B2 (en) 2003-07-25 2013-09-10 Honeywell International Inc. Processes for selective dehydrohalogenation of halogenated alkanes
US9770463B2 (en) 2010-07-06 2017-09-26 Glaxosmithkline Biologicals Sa Delivery of RNA to different cell types
PT2591114T (pt) 2010-07-06 2016-08-02 Glaxosmithkline Biologicals Sa Imunização de mamíferos de grande porte com doses baixas de arn
HRP20161352T1 (hr) 2010-07-06 2016-12-02 Glaxosmithkline Biologicals Sa Čestice nalik na virione za unos samoreplicirajućih molekula rna
EP3243526B1 (en) 2010-07-06 2019-11-27 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Delivery of rna to trigger multiple immune pathways
EP2590626B1 (en) 2010-07-06 2015-10-28 GlaxoSmithKline Biologicals SA Liposomes with lipids having an advantageous pka-value for rna delivery
CA2807552A1 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
PL4066857T3 (pl) 2010-08-31 2023-03-20 Glaxosmithkline Biologicals Sa Pegylowane liposomy do dostarczania rna kodującego immunogen
SMT202300096T1 (it) 2010-08-31 2023-05-12 Glaxosmithkline Biologicals Sa Liposomi piccoli per la somministrazione di rna codificante un immunogeno
SI3590949T1 (sl) 2010-10-01 2022-09-30 Modernatx, Inc. Ribonukleinske kisline, ki vsebujejo N1-metil-psevdouracil, in njihove uporabe
CA2814386C (en) * 2010-10-11 2019-08-20 Novartis Ag Antigen delivery platforms
JP2014511687A (ja) 2011-03-31 2014-05-19 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッド 工学操作された核酸の送達および製剤
WO2012170930A1 (en) 2011-06-08 2012-12-13 Shire Human Genetic Therapies, Inc Lipid nanoparticle compositions and methods for mrna delivery
CA2838063C (en) 2011-06-08 2023-07-11 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Cleavable lipids
CA2840989A1 (en) 2011-07-06 2013-01-10 Novartis Ag Immunogenic combination compositions and uses thereof
CN103764121A (zh) 2011-07-06 2014-04-30 诺华股份有限公司 用于递送rna分子的具有有用n:p比的脂质体
TR201900264T4 (tr) 2011-08-31 2019-02-21 Glaxosmithkline Biologicals Sa İmmünojen şifreleyici rna'nın verilmesi için pegile edilmiş lipozomlar.
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP2763701B1 (en) 2011-10-03 2018-12-19 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
RU2649364C2 (ru) 2011-12-16 2018-04-02 Модерна Терапьютикс, Инк. Составы на основе модифицированного нуклеозида, нуклеотида и нуклеиновой кислоты
RS58794B1 (sr) * 2012-03-26 2019-07-31 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Formulacija rnk za imunoterapiju
WO2013143555A1 (en) 2012-03-26 2013-10-03 Biontech Ag Rna formulation for immunotherapy
CN108949772A (zh) 2012-04-02 2018-12-07 现代泰克斯公司 用于产生与人类疾病相关的生物制剂和蛋白质的修饰多核苷酸
EP3520821A1 (en) 2012-04-02 2019-08-07 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of biologics and proteins associated with human disease
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US9878056B2 (en) 2012-04-02 2018-01-30 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cosmetic proteins and peptides
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
CA2870182A1 (en) * 2012-04-10 2013-10-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Human respiratory syncytial virus consensus antigens, nucleic acid constructs and vaccines made therefrom, and methods of using same
HK1208618A1 (en) 2012-06-08 2016-03-11 夏尔人类遗传性治疗公司 Pulmonary delivery of mrna to non-lung target cells
AU2013286093B2 (en) 2012-07-06 2018-01-04 Novartis Ag Complexes of cytomegalovirus proteins
US9512456B2 (en) 2012-08-14 2016-12-06 Modernatx, Inc. Enzymes and polymerases for the synthesis of RNA
SI2922554T1 (sl) 2012-11-26 2022-06-30 Modernatx, Inc. Terminalno modificirana RNA
EP2943221A1 (en) 2013-01-10 2015-11-18 Novartis AG Influenza virus immunogenic compositions and uses thereof
EP3434774A1 (en) 2013-01-17 2019-01-30 ModernaTX, Inc. Signal-sensor polynucleotides for the alteration of cellular phenotypes
AU2014224205C1 (en) 2013-03-08 2019-04-04 Novartis Ag Lipids and lipid compositions for the delivery of active agents
WO2014159813A1 (en) 2013-03-13 2014-10-02 Moderna Therapeutics, Inc. Long-lived polynucleotide molecules
PL2970456T3 (pl) 2013-03-14 2022-01-31 Translate Bio, Inc. Sposoby i kompozycje do dostarczania przeciwciał kodowanych mrna
US10258698B2 (en) 2013-03-14 2019-04-16 Modernatx, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
CA2923029A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
WO2015034925A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
US10023626B2 (en) 2013-09-30 2018-07-17 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
KR20160067219A (ko) 2013-10-03 2016-06-13 모더나 세라퓨틱스, 인코포레이티드 저밀도 지단백질 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드
MA58292B1 (fr) 2014-04-23 2025-01-31 Modernatx, Inc. Vaccins à base d'acide nucléique
EP2974739A1 (en) 2014-07-15 2016-01-20 Novartis AG RSVF trimerization domains
WO2015199952A1 (en) 2014-06-25 2015-12-30 Acuitas Therapeutics Inc. Novel lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
WO2016011226A1 (en) 2014-07-16 2016-01-21 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
JP2016023148A (ja) * 2014-07-17 2016-02-08 富士フイルム株式会社 脂質粒子の製造法および脂質粒子を有する核酸送達キャリア
JP6240570B2 (ja) 2014-07-17 2017-11-29 富士フイルム株式会社 脂質粒子および核酸送達キャリア
US20170210788A1 (en) 2014-07-23 2017-07-27 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of intrabodies
EP3061826A1 (en) 2015-02-27 2016-08-31 Novartis AG Flavivirus replicons
EP4353257A3 (en) 2015-04-13 2024-08-07 CureVac Manufacturing GmbH Method for producing rna compositions
JP2017000667A (ja) 2015-06-16 2017-01-05 国立大学法人三重大学 無針注射器及びそれを用いた注射対象領域へのｄｎａ導入方法
HUE067372T2 (hu) 2015-06-29 2024-10-28 Acuitas Therapeutics Inc Lipidek és nanoszemcsés lipid formulázások nukleinsavak beadására
US11364292B2 (en) 2015-07-21 2022-06-21 Modernatx, Inc. CHIKV RNA vaccines
US11007260B2 (en) 2015-07-21 2021-05-18 Modernatx, Inc. Infectious disease vaccines
WO2017031232A1 (en) 2015-08-17 2017-02-23 Modernatx, Inc. Methods for preparing particles and related compositions
JP6948313B6 (ja) 2015-09-17 2022-01-14 モデルナティエックス インコーポレイテッド 治療剤の細胞内送達のための化合物および組成物
CA3001003A1 (en) 2015-10-05 2017-04-13 Modernatx, Inc. Methods for therapeutic administration of messenger ribonucleic acid drugs
JP2018531290A (ja) 2015-10-22 2018-10-25 モデルナティーエックス， インコーポレイテッド 性感染症ワクチン
PL3718565T3 (pl) 2015-10-22 2022-09-19 Modernatx, Inc. Szczepionki przeciwko wirusom układu oddechowego
EA201891001A1 (ru) 2015-10-22 2018-11-30 МОДЕРНАТиЭкс, ИНК. Вакцины на основе нуклеиновых кислот против вируса ветряной оспы (vzv)
KR20180096592A (ko) * 2015-10-22 2018-08-29 모더나티엑스, 인크. 호흡기 세포융합 바이러스 백신
EP3364950A4 (en) 2015-10-22 2019-10-23 ModernaTX, Inc. VACCINES AGAINST TROPICAL DISEASES
IL286515B2 (en) 2015-10-28 2024-02-01 Acuitas Therapeutics Inc Novel lipids and nanoparticle formulations of lipids for delivery of nucleic acids
SMT202200358T1 (it) 2015-12-10 2022-11-18 Modernatx Inc Composizioni e metodi di rilascio degli agenti terapeutici
EP3394030B2 (en) 2015-12-22 2025-02-12 ModernaTX, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of agents
LT3394093T (lt) 2015-12-23 2022-04-25 Modernatx, Inc. Ox40 ligandus koduojančių polinukleotidų naudojimo būdai
KR102860636B1 (ko) 2015-12-28 2025-09-17 노파르티스 아게 혈색소병증의 치료를 위한 조성물 및 방법
MA43587A (fr) 2016-01-10 2018-11-14 Modernatx Inc Arnm thérapeutiques codant pour des anticorps anti-ctla-4
WO2017162265A1 (en) 2016-03-21 2017-09-28 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Trans-replicating rna
WO2017162266A1 (en) 2016-03-21 2017-09-28 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Rna replicon for versatile and efficient gene expression
KR102533456B1 (ko) 2016-05-18 2023-05-17 모더나티엑스, 인크. 릴랙신을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드
EP3463445A1 (en) 2016-06-02 2019-04-10 GlaxoSmithKline Biologicals SA Zika viral antigen constructs
CN106109424A (zh) * 2016-08-17 2016-11-16 浙江美保龙生物技术有限公司 一种猪圆环病毒2型脂质体稀释液冻干制品及其制备方法
CN106176633A (zh) * 2016-08-17 2016-12-07 浙江美保龙生物技术有限公司 一种猪传染性胃肠炎病毒脂质体稀释液冻干制品及其制备方法
CN106176634A (zh) * 2016-08-17 2016-12-07 浙江美保龙生物技术有限公司 一种猪传染性胃肠炎‑流行性腹泻二联弱毒疫苗脂质体稀释液冻干制品及其制备方法
CN109715205A (zh) 2016-08-19 2019-05-03 库瑞瓦格股份公司 用于癌症治疗的rna
EP3518966A1 (en) 2016-09-29 2019-08-07 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Compositions and methods of treatment of persistent hpv infection
GB201616904D0 (en) 2016-10-05 2016-11-16 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccine
EP3538067A1 (en) 2016-11-08 2019-09-18 Modernatx, Inc. Stabilized formulations of lipid nanoparticles
WO2018089851A2 (en) 2016-11-11 2018-05-17 Modernatx, Inc. Influenza vaccine
EP3541416A1 (en) 2016-11-17 2019-09-25 GlaxoSmithKline Biologicals SA Zika viral antigen constructs
EP3551193A4 (en) 2016-12-08 2020-08-19 Modernatx, Inc. NUCLEIC ACID VACCINES AGAINST RESPIRATORY VIRUSES
CN110582304A (zh) 2016-12-08 2019-12-17 库尔维科公司 用于治疗或预防肝脏疾病的rna
US11542490B2 (en) 2016-12-08 2023-01-03 CureVac SE RNAs for wound healing
WO2018115527A2 (en) 2016-12-23 2018-06-28 Curevac Ag Mers coronavirus vaccine
EP3558354A1 (en) 2016-12-23 2019-10-30 CureVac AG Lassa virus vaccine
TW201839136A (zh) 2017-02-06 2018-11-01 瑞士商諾華公司 治療血色素異常症之組合物及方法
MA47787A (fr) * 2017-03-15 2020-01-22 Modernatx Inc Vaccin contre le virus respiratoire syncytial
DK3596041T3 (da) 2017-03-15 2023-01-23 Modernatx Inc Forbindelse og sammensætninger til intracellulær afgivelse af terapeutiske midler
WO2018170336A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle formulation
WO2018170270A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Varicella zoster virus (vzv) vaccine
SI3596042T1 (sl) 2017-03-15 2022-04-29 Modernatx, Inc. Kristalne oblike amino lipidov
WO2018170256A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Herpes simplex virus vaccine
MA52262A (fr) 2017-03-15 2020-02-19 Modernatx Inc Vaccin à large spectre contre le virus de la grippe
JP2020514370A (ja) 2017-03-17 2020-05-21 キュアバック アーゲー 組合せ抗癌療法のためのｒｎａワクチン及び免疫チェックポイント阻害剤
EP3601576A1 (en) 2017-03-24 2020-02-05 CureVac AG Nucleic acids encoding crispr-associated proteins and uses thereof
WO2018187590A1 (en) 2017-04-05 2018-10-11 Modernatx, Inc. Reduction or elimination of immune responses to non-intravenous, e.g., subcutaneously administered therapeutic proteins
TW201907937A (zh) 2017-05-08 2019-03-01 美商葛利史東腫瘤科技公司 阿爾法病毒新抗原載體
EP3625345B1 (en) 2017-05-18 2023-05-24 ModernaTX, Inc. Modified messenger rna comprising functional rna elements
EP3625246A1 (en) 2017-05-18 2020-03-25 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding tethered interleukin-12 (il12) polypeptides and uses thereof
ES3039647T3 (en) 2017-05-31 2025-10-23 Arcturus Therapeutics Inc Synthesis and structure of high potency rna therapeutics
EP3638678B1 (en) 2017-06-14 2025-12-03 ModernaTX, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of agents
EP3638292A1 (en) * 2017-06-14 2020-04-22 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding coagulation factor viii
MA49421A (fr) 2017-06-15 2020-04-22 Modernatx Inc Formulations d'arn
BR112019028280A2 (pt) 2017-07-04 2020-07-14 Curevac Ag moléculas de ácido nucleico
CA3073211A1 (en) 2017-08-31 2019-03-07 Modernatx, Inc. Methods of making lipid nanoparticles
US20200283497A1 (en) 2017-09-13 2020-09-10 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Rna replicon for expressing at cell receptor or an artificial t cell receptor
US12291717B2 (en) 2017-09-13 2025-05-06 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh RNA replicon for reprogramming somatic cells
WO2019055807A1 (en) 2017-09-14 2019-03-21 Modernatx, Inc. RNA VACCINES AGAINST ZIKA VIRUS
EP3461497A1 (en) 2017-09-27 2019-04-03 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Viral antigens
US20220233568A1 (en) 2017-10-19 2022-07-28 Curevac Ag Novel artificial nucleic acid molecules
JP6388700B2 (ja) * 2017-10-20 2018-09-12 富士フイルム株式会社 脂質粒子の製造法および脂質粒子を有する核酸送達キャリア
JP6495995B2 (ja) * 2017-11-02 2019-04-03 富士フイルム株式会社 脂質粒子および核酸送達キャリア
US20220265856A1 (en) 2017-11-22 2022-08-25 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding propionyl-coa carboxylase alpha and beta subunits for the treatment of propionic acidemia
CA3079428A1 (en) 2017-11-22 2019-05-31 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding ornithine transcarbamylase for the treatment of urea cycle disorders
US11939601B2 (en) 2017-11-22 2024-03-26 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding phenylalanine hydroxylase for the treatment of phenylketonuria
MX2020007077A (es) 2018-01-04 2020-10-28 Iconic Therapeutics Inc Anticuerpos anti-factor tisular, conjugados anticuerpo-farmaco y metodos relacionados.
EP3735270A1 (en) 2018-01-05 2020-11-11 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding anti-chikungunya virus antibodies
MA54676A (fr) 2018-01-29 2021-11-17 Modernatx Inc Vaccins à base d'arn contre le vrs
EP3773745A1 (en) 2018-04-11 2021-02-17 ModernaTX, Inc. Messenger rna comprising functional rna elements
MA52709A (fr) 2018-05-23 2021-03-31 Modernatx Inc Administration d'adn
US12357580B2 (en) 2018-06-19 2025-07-15 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Lipid nanoparticle compositions for delivery of mRNA and long nucleic acids
WO2020023390A1 (en) 2018-07-25 2020-01-30 Modernatx, Inc. Mrna based enzyme replacement therapy combined with a pharmacological chaperone for the treatment of lysosomal storage disorders
AU2019321186B2 (en) 2018-08-17 2024-05-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic compositions and uses thereof
EP3846776A1 (en) 2018-09-02 2021-07-14 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding very long-chain acyl-coa dehydrogenase for the treatment of very long-chain acyl-coa dehydrogenase deficiency
GB2592505B (en) 2018-09-04 2023-05-03 Univ Texas Compositions and methods for organ specific delivery of nucleic acids
WO2020051220A1 (en) * 2018-09-04 2020-03-12 The Board of the Regents of the University of Texas System Compositions and methods for organ specific delivery of nucleic acids
WO2020056155A2 (en) 2018-09-13 2020-03-19 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding branched-chain alpha-ketoacid dehydrogenase complex e1-alpha, e1-beta, and e2 subunits for the treatment of maple syrup urine disease
MX2021003015A (es) 2018-09-13 2021-07-15 Modernatx Inc Polinucleotidos que codifican glucosa-6-fosfatasa para el tratamiento de la glucogenosis.
AU2019339430A1 (en) 2018-09-14 2021-04-29 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding uridine diphosphate glycosyltransferase 1 family, polypeptide A1 for the treatment of Crigler-Najjar Syndrome
US12263248B2 (en) 2018-09-19 2025-04-01 Modernatx, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
JP7640452B2 (ja) 2018-09-19 2025-03-05 モデルナティエックス インコーポレイテッド 高純度ｐｅｇ脂質及びそれらの使用
WO2020061284A1 (en) 2018-09-19 2020-03-26 Modernatx, Inc. Peg lipids and uses thereof
US12090235B2 (en) 2018-09-20 2024-09-17 Modernatx, Inc. Preparation of lipid nanoparticles and methods of administration thereof
US12329857B2 (en) 2018-09-21 2025-06-17 Acuitas Therapeutics, Inc. Systems and methods for manufacturing lipid nanoparticles and liposomes
MA53734A (fr) 2018-09-27 2021-08-04 Modernatx Inc Polynucléotides codant pour l'arginase 1 pour le traitement d'une déficience en arginase
US20220001026A1 (en) 2018-11-08 2022-01-06 Modernatx, Inc. Use of mrna encoding ox40l to treat cancer in human patients
MX2021005389A (es) 2018-11-09 2021-07-21 Arbutus Biopharma Corp Formulaciones de nanoparticulas lipidicas.
TWI852977B (zh) 2019-01-10 2024-08-21 美商健生生物科技公司 前列腺新抗原及其用途
EP3908328A1 (en) 2019-01-10 2021-11-17 BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH Localized administration of rna molecules for therapy
JP7523449B2 (ja) 2019-01-11 2024-07-26 アクイタス セラピューティクス インコーポレイテッド 活性剤の脂質ナノ粒子送達のための脂質
US11351242B1 (en) 2019-02-12 2022-06-07 Modernatx, Inc. HMPV/hPIV3 mRNA vaccine composition
MA55321A (fr) 2019-03-15 2022-01-19 Modernatx Inc Vaccins à base d'arn contre le vih
EP3965797A1 (en) 2019-05-08 2022-03-16 AstraZeneca AB Compositions for skin and wounds and methods of use thereof
MX2021014525A (es) 2019-05-30 2022-03-17 Gritstone Bio Inc Adenovirus modificados.
MA56517A (fr) 2019-06-24 2022-04-27 Modernatx Inc Arn messager comprenant des éléments d'arn fonctionnels et leurs utilisations
EP3987027A1 (en) 2019-06-24 2022-04-27 ModernaTX, Inc. Endonuclease-resistant messenger rna and uses thereof
CN112237628A (zh) * 2019-07-17 2021-01-19 四川大学华西医院 靶向EBV的LMP2-mRNA纳米疫苗
JP7662609B2 (ja) 2019-07-18 2025-04-15 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 造血の完全なアブレーションを誘導するための方法
JP2022542032A (ja) 2019-07-21 2022-09-29 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 治療用ウイルスワクチン
KR20220101077A (ko) 2019-09-19 2022-07-19 모더나티엑스, 인크. 치료제의 세포내 전달을 위한 분지형 꼬리 지질 화합물 및 조성물
AU2020352552A1 (en) 2019-09-23 2022-03-17 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating hepatocyte nuclear factor 4-alpha (HNF4α) gene expression
CN114391040A (zh) 2019-09-23 2022-04-22 欧米茄治疗公司 用于调节载脂蛋白b(apob)基因表达的组合物和方法
EP3819377A1 (en) 2019-11-08 2021-05-12 Justus-Liebig-Universität Gießen Circular rna and uses thereof for inhibiting rna-binding proteins
JP7630507B2 (ja) 2019-11-18 2025-02-17 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 変異型ｃａｌｒ及びｊａｋ２に基づくワクチン並びにこれらの使用
JP2023506842A (ja) 2019-12-18 2023-02-20 ノバルティス アーゲー 異常ヘモグロビン症の治療用組成物及び方法
US12194089B2 (en) 2020-02-04 2025-01-14 CureVac SE Coronavirus vaccine
TW202200605A (zh) 2020-03-09 2022-01-01 美商亞克圖羅斯醫療公司 冠狀病毒疫苗組成物和方法
WO2021183720A1 (en) 2020-03-11 2021-09-16 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating forkhead box p3 (foxp3) gene expression
US20230364219A1 (en) 2020-04-16 2023-11-16 Glaxosmithkline Biologicals Sa Sars cov-2 spike protein construct
EP4158005A1 (en) 2020-06-01 2023-04-05 ModernaTX, Inc. Phenylalanine hydroxylase variants and uses thereof
AU2021286169A1 (en) 2020-06-04 2023-01-19 BioNTech SE RNA replicon for versatile and efficient gene expression
US20230234992A1 (en) 2020-06-05 2023-07-27 Glaxosmithkline Biologicals Sa Modified betacoronavirus spike proteins
WO2022002783A1 (en) 2020-06-29 2022-01-06 Glaxosmithkline Biologicals Sa Adjuvants
WO2022009052A2 (en) 2020-07-06 2022-01-13 Janssen Biotech, Inc. Prostate neoantigens and their uses
CN116096702A (zh) 2020-07-16 2023-05-09 爱康泰生治疗公司 用于脂质纳米颗粒的阳离子脂质
JP2023541108A (ja) 2020-08-06 2023-09-28 グリットストーン バイオ インコーポレイテッド マルチエピトープワクチンカセット
JP2023537609A (ja) 2020-08-14 2023-09-04 アークトゥラス・セラピューティクス・インコーポレイテッド 脂質ナノ粒子を凍結乾燥する方法
CA3199784A1 (en) 2020-11-13 2022-05-19 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding cystic fibrosis transmembrane conductance regulator for the treatment of cystic fibrosis
EP4008785A1 (en) 2020-12-03 2022-06-08 Justus-Liebig-Universität Gießen Circular nucleic acids and uses thereof for interfering with genome expression and proliferation of coronaviruses
US20240156946A1 (en) 2020-12-22 2024-05-16 CureVac SE Rna vaccine against sars-cov-2 variants
WO2022137128A2 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Self-amplifying messenger rna
EP4277929A1 (en) * 2021-01-14 2023-11-22 Translate Bio, Inc. Methods and compositions for delivering mrna coded antibodies
EP4032546A1 (en) 2021-01-20 2022-07-27 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Therapeutic viral vaccine
US11524023B2 (en) 2021-02-19 2022-12-13 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle compositions and methods of formulating the same
US20240207444A1 (en) 2021-03-24 2024-06-27 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding phenylalanine hydroxylase and uses thereof
WO2022204380A1 (en) 2021-03-24 2022-09-29 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding propionyl-coa carboxylase alpha and beta subunits and uses thereof
WO2022204370A1 (en) 2021-03-24 2022-09-29 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles and polynucleotides encoding ornithine transcarbamylase for the treatment of ornithine transcarbamylase deficiency
US20240226025A1 (en) 2021-03-24 2024-07-11 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding methylmalonyl-coa mutase for the treatment of methylmalonic acidemia
US20240207374A1 (en) 2021-03-24 2024-06-27 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding glucose-6-phosphatase and uses thereof
US20240181038A1 (en) 2021-03-26 2024-06-06 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic compositions
US20240285755A1 (en) 2021-05-24 2024-08-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Adjuvants
US20240272143A1 (en) 2021-06-09 2024-08-15 Glaxosmithkline Biologicals Sa Release assay for determining potency of self-amplifying rna drug product and methods for using
US20240384277A1 (en) 2021-06-15 2024-11-21 Modernatx, Inc. Engineered polynucleotides for cell-type or microenvironment-specific expression
US20240376445A1 (en) 2021-06-22 2024-11-14 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding uridine diphosphate glycosyltransferase 1 family, polypeptide a1 for the treatment of crigler-najjar syndrome
EP4359527A2 (en) 2021-06-23 2024-05-01 Novartis AG Compositions and methods for the treatment of hemoglobinopathies
WO2023283359A2 (en) 2021-07-07 2023-01-12 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating secreted frizzled receptor protein 1 (sfrp1) gene expression
WO2023006999A2 (en) 2021-07-30 2023-02-02 CureVac SE Mrnas for treatment or prophylaxis of liver diseases
WO2023020992A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods
WO2023021421A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Low-dose lyophilized rna vaccines and methods for preparing and using the same
WO2023020994A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods
WO2023020993A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods
US20240350410A1 (en) 2021-08-16 2024-10-24 Glaxosmithkline Biologicals Sa Freeze-drying of lipid nanoparticles (lnps) encapsulating rna and formulations thereof
EP4396355A1 (en) 2021-09-03 2024-07-10 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Substitution of nucleotide bases in self-amplifying messenger ribonucleic acids
AU2022348995A1 (en) * 2021-09-22 2024-04-11 Hdt Bio Corp. Cancer therapy compositions and uses thereof
WO2023056044A1 (en) 2021-10-01 2023-04-06 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding relaxin for the treatment of fibrosis and/or cardiovascular disease
CA3234214A1 (en) 2021-10-18 2023-04-27 BioNTech SE Methods for determining mutations for increasing modified replicable rna function and related compositions and their use
JP2024539087A (ja) 2021-10-18 2024-10-28 バイオエヌテック エスエー 修飾複製可能ｒｎａおよび関連組成物ならびにそれらの使用
US12186387B2 (en) 2021-11-29 2025-01-07 BioNTech SE Coronavirus vaccine
EP4448485A2 (en) 2021-12-16 2024-10-23 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for use in lipid nanoparticle formulations
US20250084389A1 (en) 2022-01-17 2025-03-13 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods of inducing cell death of a population of solid tumor cells
WO2023144193A1 (en) 2022-01-25 2023-08-03 CureVac SE Mrnas for treatment of hereditary tyrosinemia type i
EP4479081A1 (en) 2022-02-14 2024-12-25 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Use of the 15-lipoxygenase for the treatment of lymphedema
WO2023161350A1 (en) 2022-02-24 2023-08-31 Io Biotech Aps Nucleotide delivery of cancer therapy
WO2023183909A2 (en) 2022-03-25 2023-09-28 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding fanconi anemia, complementation group proteins for the treatment of fanconi anemia
WO2023213378A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 BioNTech SE Replicon compositions and methods of using same for the treatment of diseases
EP4539876A2 (en) 2022-06-18 2025-04-23 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Recombinant rna molecules comprising untranslated regions or segments encoding spike protein from the omicron strain of severe acute respiratory coronavirus-2
US11878055B1 (en) 2022-06-26 2024-01-23 BioNTech SE Coronavirus vaccine
WO2024017479A1 (en) 2022-07-21 2024-01-25 BioNTech SE Multifunctional cells transiently expressing an immune receptor and one or more cytokines, their use and methods for their production
WO2024023034A1 (en) 2022-07-25 2024-02-01 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Use of apelin for the treatment of lymphedema
TW202412818A (zh) 2022-07-26 2024-04-01 美商現代公司 用於暫時控制表現之經工程化多核苷酸
EP4577519A1 (en) 2022-08-23 2025-07-02 ModernaTX, Inc. Methods for purification of ionizable lipids
WO2024047247A1 (en) 2022-09-02 2024-03-07 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Base editing approaches for the treatment of amyotrophic lateral sclerosis
CN120239748A (zh) 2022-09-15 2025-07-01 生物技术欧洲股份公司 包含具有miRNA的反式扩增RNA载体的体系和组合物
KR20250075664A (ko) 2022-09-26 2025-05-28 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 인플루엔자 바이러스 백신
US12186389B2 (en) 2022-10-28 2025-01-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Nucleic acid base vaccine against emerging SARS-CoV-2 variants
EP4630033A1 (en) 2022-12-09 2025-10-15 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Novel human antiviral genes related to the eleos and lamassu prokaryotic systems
WO2024133160A1 (en) 2022-12-19 2024-06-27 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis b compositions
WO2024149697A1 (en) 2023-01-09 2024-07-18 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Use of the recombinant fibrinogen-like domain of angiopoietin-like 4 for treating adverse post-ischemic cardiac remodeling in a patient who experienced a myocardial infarction
WO2024153636A1 (en) 2023-01-17 2024-07-25 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Vasorin as a biomarker and biotarget in nephrology
EP4654984A1 (en) 2023-01-27 2025-12-03 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Use of amphiregulin (areg) in methods of treating vascular hyperpermeability
WO2024160936A1 (en) 2023-02-03 2024-08-08 Glaxosmithkline Biologicals Sa Rna formulation
GB202302092D0 (en) 2023-02-14 2023-03-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Analytical method
WO2024197033A1 (en) 2023-03-21 2024-09-26 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding relaxin for the treatment of heart failure
WO2024194484A1 (en) 2023-03-23 2024-09-26 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Modulating the expression and/or activity of gas7 for modulating viral replication
WO2024223724A1 (en) 2023-04-27 2024-10-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Influenza virus vaccines
WO2024223728A1 (en) 2023-04-27 2024-10-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Influenza virus vaccines
WO2024229321A1 (en) 2023-05-03 2024-11-07 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding cystic fibrosis transmembrane conductance regulator for the treatment of cystic fibrosis
WO2024243438A2 (en) 2023-05-23 2024-11-28 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for reducing cxcl9, cxcl10, and cxcl11 gene expression
US12311033B2 (en) 2023-05-31 2025-05-27 Capstan Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations and compositions
WO2025011529A2 (en) 2023-07-07 2025-01-16 Shanghai Circode Biomed Co., Ltd. Circular rna vaccines for seasonal flu and methods of uses
WO2025040709A1 (en) 2023-08-24 2025-02-27 BioNTech SE Systems and compositions comprising highly active trans-amplifying replicases
WO2025045142A1 (en) 2023-08-29 2025-03-06 Shanghai Circode Biomed Co., Ltd. Circular rna encoding vegf polypeptides, formulations, and methods of uses
EP4520345A1 (en) 2023-09-06 2025-03-12 Myneo Nv Product
WO2025051381A1 (en) 2023-09-08 2025-03-13 BioNTech SE Methods and compositions for localized expression of administered rna
WO2025064850A1 (en) 2023-09-22 2025-03-27 BioNTech SE Rna constructs with n-terminal degrons to enhance an immune response
WO2025072482A1 (en) 2023-09-27 2025-04-03 Modernatx, Inc. Immunoglobulin a protease polypeptides, polynucleotides, and uses thereof
WO2025083211A1 (en) 2023-10-20 2025-04-24 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Use of factor h for the treatment of dementia
GB202416789D0 (en) 2023-11-15 2025-01-01 BioNTech SE SARS-COV-2 immunogenic compositions
WO2025106754A1 (en) 2023-11-15 2025-05-22 BioNTech SE Coronavirus vaccine
WO2025132839A1 (en) 2023-12-21 2025-06-26 Glaxosmithkline Biologicals Sa Influenza virus vaccines
GB202404607D0 (en) 2024-03-29 2024-05-15 Glaxosmithkline Biologicals Sa RNA formulation
WO2025215072A1 (en) 2024-04-10 2025-10-16 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Class i lanthipeptides with anti-viral function
WO2025229572A1 (en) 2024-05-01 2025-11-06 Glaxosmithkline Biologicals Sa Epstein-barr virus antigen-encoding messenger ribonucleic acid and antigen protein vaccines
CN119331936B (zh) * 2024-10-21 2025-08-19 兴湾智造(深圳)科技有限公司 Pdrn、含有该pdrn的超分子脂质体及其制备方法和用途

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2245149C2 (ru) * 1999-09-25 2005-01-27 Юниверсити Оф Айова Рисерч Фаундейшн Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты

Family Cites Families (242)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6090406A (en) 1984-04-12 2000-07-18 The Liposome Company, Inc. Potentiation of immune responses with liposomal adjuvants
US4853228A (en) 1987-07-28 1989-08-01 Micro-Pak, Inc. Method of manufacturing unilamellar lipid vesicles
JP3250802B2 (ja) 1989-03-21 2002-01-28 バイカル・インコーポレイテッド 脊椎動物における外因性ポリヌクレオチド配列の発現
US6867195B1 (en) 1989-03-21 2005-03-15 Vical Incorporated Lipid-mediated polynucleotide administration to reduce likelihood of subject's becoming infected
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5279833A (en) 1990-04-04 1994-01-18 Yale University Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells
US5264618A (en) * 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
FR2676072B1 (fr) 1991-05-03 1994-11-18 Transgene Sa Vecteur de delivrance d'arn.
US5693535A (en) 1992-05-14 1997-12-02 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. HIV targeted ribozymes
US5750390A (en) 1992-08-26 1998-05-12 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for treatment of diseases caused by expression of the bcl-2 gene
EP0646178A1 (en) 1992-06-04 1995-04-05 The Regents Of The University Of California expression cassette with regularoty regions functional in the mammmlian host
WO1994002595A1 (en) 1992-07-17 1994-02-03 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for treatment of animal diseases
US5474914A (en) 1992-07-29 1995-12-12 Chiron Corporation Method of producing secreted CMV glycoprotein H
US20020102273A1 (en) 1995-08-08 2002-08-01 Robert B. Grieve Use of alphavirus expression vectors to produce parasite anitgens
JPH09500013A (ja) 1993-06-01 1997-01-07 ライフ・テクノロジーズ・インコーポレイテッド カチオン性脂質による遺伝子免疫
US6015686A (en) 1993-09-15 2000-01-18 Chiron Viagene, Inc. Eukaryotic layered vector initiation systems
EP0702690A1 (en) 1994-04-07 1996-03-27 Akzo Nobel N.V. Freeze-dried compositions comprising rna
US5993850A (en) 1994-09-13 1999-11-30 Skyepharma Inc. Preparation of multivesicular liposomes for controlled release of encapsulated biologically active substances
US5885613A (en) * 1994-09-30 1999-03-23 The University Of British Columbia Bilayer stabilizing components and their use in forming programmable fusogenic liposomes
WO1996017072A2 (en) 1994-11-30 1996-06-06 Chiron Viagene, Inc. Recombinant alphavirus vectors
US5965434A (en) 1994-12-29 1999-10-12 Wolff; Jon A. Amphipathic PH sensitive compounds and delivery systems for delivering biologically active compounds
US5792462A (en) 1995-05-23 1998-08-11 University Of North Carolina At Chapel Hill Alphavirus RNA replicon systems
US7422902B1 (en) 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
JPH11512609A (ja) 1995-09-27 1999-11-02 アメリカ合衆国 クローン化されたヌクレオチド配列からの感染性ＲＳウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）の生産
CA2244110A1 (en) 1996-02-12 1997-08-14 Cobra Therapeutics Limited Novel methods of vaccination and vaccines thereof comprising a nucleic acid encoding a first epitope and a peptide containing a second epitope
DE19605548A1 (de) 1996-02-15 1997-09-04 Boehringer Ingelheim Int Zusammensetzung für die Transfektion höherer eukaryotischer Zellen
US6451592B1 (en) 1996-04-05 2002-09-17 Chiron Corporation Recombinant alphavirus-based vectors with reduced inhibition of cellular macromolecular synthesis
US6610321B2 (en) 1996-07-03 2003-08-26 University Of Pittsburgh Emulsion formulations for hydrophilic active agents
US7384923B2 (en) 1999-05-14 2008-06-10 Lipoxen Technologies Limited Liposomes
WO1998010748A1 (en) 1996-09-13 1998-03-19 The School Of Pharmacy Liposomes
US6395302B1 (en) 1996-11-19 2002-05-28 Octoplus B.V. Method for the preparation of microspheres which contain colloidal systems
DE69841002D1 (de) 1997-05-14 2009-09-03 Univ British Columbia Hochwirksame verkapselung von nukleinsäuren in lipidvesikeln
US6048546A (en) * 1997-07-31 2000-04-11 Sandia Corporation Immobilized lipid-bilayer materials
US6060308A (en) 1997-09-04 2000-05-09 Connaught Laboratories Limited RNA respiratory syncytial virus vaccines
CA2311395C (en) 1997-11-28 2006-11-28 The Crown In The Right Of The Queensland Department Of Health Flavivirus expression and delivery system
US6009406A (en) 1997-12-05 1999-12-28 Square D Company Methodology and computer-based tools for re-engineering a custom-engineered product line
GB9726555D0 (en) 1997-12-16 1998-02-11 Smithkline Beecham Plc Vaccine
US6432925B1 (en) 1998-04-16 2002-08-13 John Wayne Cancer Institute RNA cancer vaccine and methods for its use
EP2311436A1 (en) 1998-04-27 2011-04-20 Altus Pharmaceuticals Inc. Stabilized protein crystals, formulations containing them and methods of making them
AU767551B2 (en) 1998-06-29 2003-11-13 U.S. Medical Research Institute Of Infectious Diseases Marburg virus vaccines
DE69906977T2 (de) 1998-07-20 2004-05-19 Protiva Biotherapeutics Inc., Burnaby In liposomen verkapselte nukleinsäurekomplexe
US6602705B1 (en) 1998-12-31 2003-08-05 Chiron Corporation Expression of HIV polypeptides and production of virus-like particles
DE69923840T2 (de) 1999-09-09 2006-04-06 Curevac Gmbh Transfer von mRNAs unter Verwendung von polykationischen Verbindungen
WO2001029233A2 (en) 1999-10-20 2001-04-26 The Johns Hopkins University School Of Medicine Chimeric immunogenic compositions and nucleic acids encoding them
US8541008B2 (en) 1999-11-19 2013-09-24 Los Angeles Biomedical Research Institute At Harbor-Ucla Medical Center Pharmaceutical compositions and methods to vaccinate against candidiasis
US20030212022A1 (en) 2001-03-23 2003-11-13 Jean-Marie Vogel Compositions and methods for gene therapy
AU2001253323A1 (en) 2000-04-18 2001-10-30 Human Genome Sciences, Inc. Extracellular matrix polynucleotides, polypeptides, and antibodies
MXPA02012198A (es) 2000-06-09 2004-08-19 Teni Boulikas Encapsulacion de polinucleotidos y drogas en liposomas objetivos.
EP1297005B1 (en) 2000-07-03 2009-08-26 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Immunisation against chlamydia pneumoniae
AU2001290520A1 (en) 2000-08-01 2002-02-13 The Johns Hokpins University Intercellular transport protein linked to an antigen as a molecular vaccine
US20040142474A1 (en) 2000-09-14 2004-07-22 Expression Genetics, Inc. Novel cationic lipopolymer as a biocompatible gene delivery agent
JP2004518631A (ja) 2000-09-28 2004-06-24 カイロン コーポレイション 異種核酸の送達のための微粒子
ES2330083T3 (es) 2000-10-27 2009-12-04 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Acidos nucleicos y proteinas de estreptococos de los grupos a y b.
US7731975B2 (en) 2001-01-31 2010-06-08 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Chimeric filovirus glycoprotein
AU2002242016A1 (en) 2001-02-01 2002-08-12 The Johns Hopkins University Nucleic acid derived vaccine that encodes an antigen linked to a polypeptide that promotes antigen presentation
US20030040498A1 (en) 2001-03-14 2003-02-27 Ansardi David Calvert Oncolytic RNA replicons
WO2002074920A2 (en) 2001-03-16 2002-09-26 Johns Hopkins University A replication-defective alphavirus vaccine linking antigen with an immunogenicity-potentiating polypeptide and a method of delivery the same
WO2002088318A2 (en) * 2001-04-30 2002-11-07 Targeted Genetics Corporation Lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
US20030077251A1 (en) 2001-05-23 2003-04-24 Nicolas Escriou Replicons derived from positive strand RNA virus genomes useful for the production of heterologous proteins
ES2340532T3 (es) 2001-06-05 2010-06-04 Curevac Gmbh Arnm con un contenido g/c aumentado que codifica para un antigeno bacteriano y utilizacion del mismo.
EP1423142A1 (en) 2001-08-31 2004-06-02 Chiron SRL. Helicobacter pylori vaccination with a combination of caga, vaca and nap proteins
EP1432791B2 (en) 2001-09-06 2013-10-23 Alphavax, Inc. Alphavirus replicon vector systems
WO2003068190A1 (en) 2002-02-13 2003-08-21 Northeastern University Intracellular delivery of therapeutic agents
DE10207177A1 (de) 2002-02-19 2003-09-04 Novosom Ag Fakultativ kationische Lipide
EP2823809B1 (en) 2002-06-28 2016-11-02 Protiva Biotherapeutics Inc. Method and apparatus for producing liposomes
RU2311911C2 (ru) 2002-07-05 2007-12-10 Липоксен Текнолоджиз Лимитед Способ усиления иммунного ответа при вакцинации нуклеиновой кислотой
EP1530585A2 (en) 2002-08-22 2005-05-18 Cytos Biotechnology AG Inducible alphaviral/orip based gene expression system
CN1694959B (zh) 2002-09-13 2013-09-18 雷普利瑟公司 非序列互补的抗病毒寡核苷酸
CA2509973C (en) 2002-12-13 2013-02-26 Alphavax, Inc. Multi-antigenic alphavirus replicon particles and methods
EP2311848B1 (en) 2002-12-23 2013-07-03 Vical Incorporated Codon-optimized polynucleotide-based vaccines against human cytomegalovirus infection
US8338583B2 (en) 2003-02-04 2012-12-25 Bar-Ilan University Snornai-small nucleolar RNA degradation by RNA interference in trypanosomatids
US20040228842A1 (en) 2003-02-27 2004-11-18 Shan Lu Compositions and methods for cytomegalovirus treatment
EP1608762B1 (en) 2003-03-20 2014-01-08 Alphavax, Inc. Improved alphavirus replicons and helper constructs
US7731967B2 (en) 2003-04-30 2010-06-08 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Compositions for inducing immune responses
JP4623426B2 (ja) 2003-05-30 2011-02-02 日本新薬株式会社 オリゴ核酸担持複合体、当該複合体を含有する医薬組成物
JP4896715B2 (ja) 2003-06-26 2012-03-14 ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓに対する免疫原性組成物
ATE432285T1 (de) 2003-07-11 2009-06-15 Alphavax Inc Cytomegalovirusimpfstoffe, die auf dem alphavirus basieren
US7368537B2 (en) 2003-07-15 2008-05-06 Id Biomedical Corporation Of Quebec Subunit vaccine against respiratory syncytial virus infection
EP2567693B1 (en) 2003-07-16 2015-10-21 Protiva Biotherapeutics Inc. Lipid encapsulated interfering RNA
ES2505695T3 (es) 2003-07-31 2014-10-10 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Composiciones inmunógenas para Streptococcus pyogenes
EP1512393A1 (de) 2003-09-08 2005-03-09 BOEHRINGER INGELHEIM PHARMA GMBH &amp; CO. KG Verfahren zur Herstellung von homogenen Liposomen und Lipoplexen
WO2005046621A2 (en) 2003-11-12 2005-05-26 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Enhancement of vaccine-induced immune responses and protection by heterologous boosting with alphavirus replicon vaccines
US7303881B2 (en) 2004-04-30 2007-12-04 Pds Biotechnology Corporation Antigen delivery compositions and methods of use
GB0410866D0 (en) 2004-05-14 2004-06-16 Chiron Srl Haemophilius influenzae
CA2566355C (en) 2004-05-18 2014-04-15 Vical Incorporated Influenza virus vaccine composition and methods of use
AU2005245956B2 (en) 2004-05-18 2011-05-19 Alphavax, Inc. TC-83-derived alphavirus vectors, particles and methods
GB0411428D0 (en) 2004-05-21 2004-06-23 Got A Gene Ab Vectors
CA2567446C (en) 2004-05-21 2018-01-02 Chiron Corporation Alphavirus vectors for respiratory pathogen vaccines
CA2569664C (en) 2004-06-07 2013-07-16 Protiva Biotherapeutics, Inc. Lipid encapsulated interfering rna
JP4764426B2 (ja) * 2004-06-07 2011-09-07 プロチバ バイオセラピューティクス インコーポレイティッド カチオン性脂質および使用方法
WO2006085983A2 (en) 2004-07-09 2006-08-17 University Of North Carolina At Chapel Hill Viral adjuvants
WO2006007712A1 (en) 2004-07-19 2006-01-26 Protiva Biotherapeutics, Inc. Methods comprising polyethylene glycol-lipid conjugates for delivery of therapeutic agents
WO2006038129A2 (en) 2004-10-01 2006-04-13 Novartis Vaccines And Diagnostics Srl Hepatitis c virus replication system
US20060159737A1 (en) 2004-11-19 2006-07-20 Steffen Panzner Pharmaceutical compositions for local administration
GB2421025A (en) 2004-12-09 2006-06-14 Oxxon Therapeutics Ltd HSV vaccination vectors
US7404969B2 (en) 2005-02-14 2008-07-29 Sirna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle based compositions and methods for the delivery of biologically active molecules
AU2006336384B2 (en) 2005-02-14 2010-12-16 Sirna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle based compositions and methods for the delivery of biologically active molecules
JP2008530245A (ja) 2005-02-18 2008-08-07 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド 尿路病原性菌株由来の抗原
DK1858920T3 (en) 2005-02-18 2016-02-29 Glaxosmithkline Biolog Sa PROTEINS AND NUCLEIC ACIDS FROM MENINGITIS / SEPSIS-ASSOCIATED ESCHERICHIA COLI
DE602006008278D1 (de) 2005-03-02 2009-09-17 Pharmazeutische zusammensetzung
GB0504436D0 (en) 2005-03-03 2005-04-06 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
MX2007012057A (es) 2005-03-30 2007-11-23 Novartis Vaccines & Diagnostic Haemophilus influenzae tipo b.
US7618393B2 (en) 2005-05-03 2009-11-17 Pharmajet, Inc. Needle-less injector and method of fluid delivery
JP2008544745A (ja) 2005-05-12 2008-12-11 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのための免疫原性組成物
US8703095B2 (en) 2005-07-07 2014-04-22 Sanofi Pasteur S.A. Immuno-adjuvant emulsion
EP1909758A1 (en) 2005-08-02 2008-04-16 I.D.M. Immuno-Designed Molecules Process for the preparation of liposomal formulations
US7951384B2 (en) 2005-08-05 2011-05-31 University Of Massachusetts Virus-like particles as vaccines for paramyxovirus
PL2578685T3 (pl) 2005-08-23 2020-01-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Rna zawierający zmodyfikowane nukleozydy i sposoby jego zastosowania
EP1764089A1 (en) 2005-09-15 2007-03-21 Novosom AG Serum stable liposomes comprising amphoter II lipid mixtures
DE102005046490A1 (de) 2005-09-28 2007-03-29 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Modifikationen von RNA, die zu einer erhöhten Transkriptstabilität und Translationseffizienz führen
WO2007041270A1 (en) 2005-09-29 2007-04-12 Elan Pharmaceuticals, Inc. Pyrimidinyl amide compounds which inhibit leukocyte adhesion mediated by vla-4
WO2007047749A1 (en) 2005-10-18 2007-04-26 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. Mucosal and systemic immunizations with alphavirus replicon particles
JP2007112768A (ja) 2005-10-24 2007-05-10 Kyoto Univ 肝指向性リポソーム組成物
AU2006307602A1 (en) 2005-10-25 2007-05-03 Novartis Vaccines And Diagnostics Srl Compositions comprising Yersinia pestis antigens
EP2360175B1 (en) 2005-11-22 2014-07-16 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Norovirus and Sapovirus virus-like particles (VLPs)
CA2631714C (en) 2005-12-02 2014-09-16 Novartis Ag Nanoparticles for use in immunogenic compositions
EP2004141A2 (en) 2006-03-17 2008-12-24 Novosom AG An efficient method for loading amphoteric liposomes with nucleic acid active substances
EP3031469B1 (en) 2006-06-07 2023-08-23 The Trustees Of Princeton University Cytomegalovirus surface protein complex for use in vaccines and as a drug target
US7915399B2 (en) 2006-06-09 2011-03-29 Protiva Biotherapeutics, Inc. Modified siRNA molecules and uses thereof
JP2009541328A (ja) 2006-06-21 2009-11-26 ザ・スクリプス・リサーチ・インステイチユート 腫瘍間質抗原ｆａｐに対するｄｎａ組成物及びその使用方法
EP2586790A3 (en) 2006-08-16 2013-08-14 Novartis AG Immunogens from uropathogenic Escherichia coli
ES2517869T3 (es) 2006-09-12 2014-11-04 Alphavax, Inc. Partículas de replicones de alfavirus emparejadas con antígenos proteicos como adyuvantes inmunológicos
DE102007001370A1 (de) 2007-01-09 2008-07-10 Curevac Gmbh RNA-kodierte Antikörper
EP2131848A4 (en) 2007-02-16 2012-06-27 Merck Sharp & Dohme COMPOSITIONS AND METHODS FOR REINFORCED ACTIVITY OF BIOLOGICAL ACTIVE MOLECULES
WO2008109806A2 (en) 2007-03-08 2008-09-12 Massachusetts Institute Of Technology Electrostatic coating of particles for drug delivery
US8877206B2 (en) 2007-03-22 2014-11-04 Pds Biotechnology Corporation Stimulation of an immune response by cationic lipids
CA2682161A1 (en) 2007-03-29 2008-10-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a gene from ebola virus
US8748591B2 (en) 2007-04-17 2014-06-10 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Chimeric sindbis-western equine encephalitis virus and uses thereof
AU2008247488B2 (en) 2007-05-04 2014-02-27 Marina Biotech, Inc. Amino acid lipids and uses thereof
JP2010528591A (ja) 2007-05-23 2010-08-26 マンカインド コーポレイション マルチシストロン性ベクター及びそれらの設計方法
DE102007029471A1 (de) 2007-06-20 2008-12-24 Novosom Ag Neue fakultativ kationische Sterole
NZ582495A (en) 2007-06-21 2012-05-25 Alphavax Inc Promoterless cassettes for expression of alphavirus structural proteins
WO2009003975A1 (en) 2007-07-04 2009-01-08 Ribovax Biotechnologies Sa Antibodies against human cytomegalovirus (hcmv)
GB0714963D0 (en) 2007-08-01 2007-09-12 Novartis Ag Compositions comprising antigens
US20110177155A1 (en) 2007-08-21 2011-07-21 Immune Disease Institute, Inc. Methods of delivery of agents to leukocytes and endothelial cells
GB0717187D0 (en) 2007-09-04 2007-10-17 Novartis Ag Compositions comprising yersinia pestis antigens
EP2205751A2 (en) 2007-09-26 2010-07-14 Vanderbilt University Vaccine for rsv and mpv
EP2042193A1 (en) * 2007-09-28 2009-04-01 Biomay AG RNA Vaccines
JP5627464B2 (ja) 2007-11-26 2014-11-19 ノバルティス アーゲー アルファウイルス粒子を生成する方法
EP2067749A1 (en) 2007-11-29 2009-06-10 Total Petrochemicals France Process for purification of an aqueous phase containing polyaromatics
WO2009074861A2 (en) 2007-12-10 2009-06-18 Powderject Research Limited Improved vaccine
US20110165223A1 (en) 2008-01-02 2011-07-07 The Johns Hopkins University Antitumor Immunization by Liposomal Delivery of Vaccine to the Spleen
JP5749494B2 (ja) 2008-01-02 2015-07-15 テクミラ ファーマシューティカルズ コーポレイション 核酸の送達のための改善された組成物および方法
ITMI20081249A1 (it) 2008-07-09 2010-01-09 Novartis Vaccines & Diagnostic Immunogeni di escherichia coli con solubilità migliorata.
WO2009109860A2 (en) 2008-03-06 2009-09-11 Novartis Ag Mutant forms of chlamydia htra
WO2009127060A1 (en) 2008-04-15 2009-10-22 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel lipid formulations for nucleic acid delivery
WO2009127230A1 (en) 2008-04-16 2009-10-22 Curevac Gmbh MODIFIED (m)RNA FOR SUPPRESSING OR AVOIDING AN IMMUNOSTIMULATORY RESPONSE AND IMMUNOSUPPRESSIVE COMPOSITION
WO2009132131A1 (en) 2008-04-22 2009-10-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Amino lipid based improved lipid formulation
WO2009132206A1 (en) 2008-04-25 2009-10-29 Liquidia Technologies, Inc. Compositions and methods for intracellular delivery and release of cargo
US20100040650A1 (en) 2008-05-30 2010-02-18 Crowe Jr James E Virus-Like paramyxovirus particles and vaccines
EP2130912A1 (en) 2008-06-04 2009-12-09 Institut für Viruskrankeiten und Immunprophylaxe Pestivirus replicons providing an RNA-based viral vector system
EP2310494A1 (en) 2008-06-25 2011-04-20 ProBioGen AG Cell line for propagation of highly attenuated alphaviruses
EP2310045A1 (en) 2008-06-25 2011-04-20 Novartis AG Rapid responses to delayed booster immunisations
WO2010007463A1 (en) 2008-07-16 2010-01-21 Humabs Llc Human cytomegalovirus neutralising antibodies and use thereof
JP2010025644A (ja) * 2008-07-16 2010-02-04 Kochi Univ Of Technology 硝酸イオンの呈色試薬並びにこれを用いた硝酸イオンの検出及び定量方法
NZ591056A (en) 2008-07-16 2013-02-22 Inst Research In Biomedicine Human cytomegalovirus neutralizing antibodies and use thereof
US20110280949A1 (en) 2008-08-06 2011-11-17 Padma Malyala Microparticles for use in immunogenic compositions
CL2008002322A1 (es) * 2008-08-07 2009-06-05 Univ Concepcion Formulacion farmaceutica veterinaria que comprende un sistema vectorial viral constituido por una particula recombinante de arn que codifica una cu/zn superoxido dismutasa de la bacteria patogena de bovinos brucella abortus, y al menos un alfavirus arn perteneciente a la familia del virus semliki forest (sfv), util como vacuna.
EP2323628B1 (en) 2008-08-13 2022-04-13 California Institute of Technology Carrier nanoparticles and related compositions, methods and systems
WO2010036948A2 (en) 2008-09-26 2010-04-01 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Dna prime/inactivated vaccine boost immunization to influenza virus
ES2475065T3 (es) * 2008-10-09 2014-07-10 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Aminol�pidos mejorados y métodos para la administración de ácidos nucleicos
JP6087504B2 (ja) 2008-11-07 2017-03-01 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー アミノアルコールリピドイドおよびその使用
ES2993911T3 (en) 2008-11-10 2025-01-13 Arbutus Biopharma Corp Novel lipids and compositions for the delivery of therapeutics
EP2367844A4 (en) 2008-11-18 2012-08-01 Ligocyte Pharmaceuticals Inc RSV-F VLP AND MANUFACTURING METHOD AND METHOD OF USE THEREOF
AU2010208035B2 (en) 2009-01-29 2016-06-23 Arbutus Biopharma Corporation Improved lipid formulation for the delivery of nucleic acids
CA3154626A1 (en) 2009-04-14 2010-10-21 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Compositions for immunising against staphylococcus aureus
WO2010129687A1 (en) 2009-05-05 2010-11-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc Methods of delivering oligonucleotides to immune cells
DK3431076T3 (da) 2009-06-10 2021-12-20 Arbutus Biopharma Corp Forbedret lipidformulering
ES2613498T3 (es) 2009-07-01 2017-05-24 Protiva Biotherapeutics Inc. Nuevas formulaciones de lípidos para el suministro de agentes terapéuticos a tumores sólidos
EP2450031B1 (en) 2009-07-02 2018-08-29 Konica Minolta Holdings, Inc. Method for producing liposomes by two-stage emulsification method using outer aqueous phase containing specific dispersing agent, method for producing liposome dispersion or dry powder thereof using the method for producing liposomes, and liposome dispersion or dry powder thereof produced thereby
US20110300205A1 (en) 2009-07-06 2011-12-08 Novartis Ag Self replicating rna molecules and uses thereof
SG178026A1 (en) 2009-07-15 2012-03-29 Novartis Ag Rsv f protein compositions and methods for making same
US9642903B2 (en) 2009-07-16 2017-05-09 Lior Carmon Antigen specific multi epitope-based anti-infective vaccines
WO2011012316A2 (de) 2009-07-31 2011-02-03 Ludwig-Maximilians-Universität Rna mit einer kombination aus unmodifizierten und modifizierten nucleotiden zur proteinexpression
TWI445708B (zh) 2009-09-02 2014-07-21 Irm Llc 作為ｔｌｒ活性調節劑之化合物及組合物
MX2012002723A (es) 2009-09-02 2012-04-11 Novartis Ag Composiciones inmunogenicas que incluyen moduladores de la actividad de receptores tipo toll.
US20110070260A1 (en) 2009-09-09 2011-03-24 Baric Ralph S Multivalent Immunogenic Compositions Against Noroviruses and Methods of Use
WO2011057020A1 (en) 2009-11-04 2011-05-12 Marina Biotech, Inc. Activity generating delivery molecules
WO2011140627A1 (en) 2009-11-04 2011-11-17 The University Of British Columbia Nucleic acid-containing lipid particles and related methods
US20110112353A1 (en) 2009-11-09 2011-05-12 Circulite, Inc. Bifurcated outflow cannulae
SI3338765T1 (sl) 2009-12-01 2019-05-31 Translate Bio, Inc. Derivat steroida za dostavo MRNA pri humanih genetskih boleznih
PT3112467T (pt) 2009-12-07 2018-04-16 Univ Pennsylvania Preparações de arn compreendendo arn modificado purificado para a reprogramação de células
US9687550B2 (en) 2009-12-07 2017-06-27 Arbutus Biopharma Corporation Compositions for nucleic acid delivery
AU2010330814B2 (en) 2009-12-18 2017-01-12 Acuitas Therapeutics Inc. Methods and compositions for delivery of nucleic acids
AU2010334911A1 (en) 2009-12-23 2012-07-12 Novartis Ag Lipids, lipid compositions, and methods of using them
US20130101609A1 (en) 2010-01-24 2013-04-25 Novartis Ag Irradiated biodegradable polymer microparticles
ES2651005T3 (es) 2010-03-09 2018-01-23 Biomedical Research Models, Inc. Una nueva estrategia de vacunación mucosa para el virus del herpes simple tipo-2
BR112012025364A2 (pt) 2010-04-07 2015-09-22 Novartis Ag método para geração de partícula semelhante a vírus de parvovírus b19
WO2012006380A2 (en) 2010-07-06 2012-01-12 Novartis Ag Cationic oil-in-water emulsions
PT2591114T (pt) 2010-07-06 2016-08-02 Glaxosmithkline Biologicals Sa Imunização de mamíferos de grande porte com doses baixas de arn
EP3243526B1 (en) 2010-07-06 2019-11-27 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Delivery of rna to trigger multiple immune pathways
AU2011276328C1 (en) 2010-07-06 2016-01-21 Novartis Ag Norovirus derived immunogenic compositions and methods
HRP20161352T1 (hr) 2010-07-06 2016-12-02 Glaxosmithkline Biologicals Sa Čestice nalik na virione za unos samoreplicirajućih molekula rna
US9192661B2 (en) 2010-07-06 2015-11-24 Novartis Ag Delivery of self-replicating RNA using biodegradable polymer particles
EP2590626B1 (en) 2010-07-06 2015-10-28 GlaxoSmithKline Biologicals SA Liposomes with lipids having an advantageous pka-value for rna delivery
US9770463B2 (en) 2010-07-06 2017-09-26 Glaxosmithkline Biologicals Sa Delivery of RNA to different cell types
US8898852B2 (en) 2010-08-04 2014-12-02 Honeywell International Inc. Air burst to clear detection window
CA2807552A1 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
PL4066857T3 (pl) 2010-08-31 2023-03-20 Glaxosmithkline Biologicals Sa Pegylowane liposomy do dostarczania rna kodującego immunogen
SMT202300096T1 (it) 2010-08-31 2023-05-12 Glaxosmithkline Biologicals Sa Liposomi piccoli per la somministrazione di rna codificante un immunogeno
CA2809863A1 (en) 2010-08-31 2012-03-08 Novartis Ag Lipids suitable for liposomal delivery of protein-coding rna
US20130164289A1 (en) 2010-09-09 2013-06-27 Virginia Commonwealth University Human cytomegalovirus vaccine
SI3590949T1 (sl) 2010-10-01 2022-09-30 Modernatx, Inc. Ribonukleinske kisline, ki vsebujejo N1-metil-psevdouracil, in njihove uporabe
CA2814386C (en) 2010-10-11 2019-08-20 Novartis Ag Antigen delivery platforms
MX341185B (es) 2010-10-25 2016-08-09 Stepan Co Aminas grasas cuaternizadas, amidoaminas, y sus derivados de la metatesis de aceite natural.
HRP20190791T1 (hr) 2011-01-26 2019-06-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Režim imuniziranja protiv rsv
KR20140007404A (ko) 2011-01-31 2014-01-17 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 신규 허피스 항원을 암호화하는 핵산 분자, 이것을 포함하는 백신 및 이것의 사용 방법
WO2012116714A1 (en) 2011-03-02 2012-09-07 Curevac Gmbh Vaccination in elderly patients
JP2014511687A (ja) 2011-03-31 2014-05-19 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッド 工学操作された核酸の送達および製剤
PT3275892T (pt) 2011-05-13 2020-04-08 Glaxosmithkline Biologicals Sa Antigénios f de rsv de pré-fusão
BR112013029490A2 (pt) 2011-05-17 2019-09-24 Moderna Therapeutics Inc ácidos nucleicos projetados e métodos de uso dos mesmos para vertebrados não humanos
CA2838063C (en) 2011-06-08 2023-07-11 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Cleavable lipids
CN103796639B (zh) 2011-07-06 2017-05-31 诺华股份有限公司 阳离子水包油乳液
CA2840989A1 (en) 2011-07-06 2013-01-10 Novartis Ag Immunogenic combination compositions and uses thereof
RU2606846C2 (ru) 2011-07-06 2017-01-10 Новартис Аг Эмульсии типа "масло в воде", которые содержат нуклеиновые кислоты
US11058762B2 (en) 2011-07-06 2021-07-13 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic compositions and uses thereof
CN103764121A (zh) 2011-07-06 2014-04-30 诺华股份有限公司 用于递送rna分子的具有有用n:p比的脂质体
TR201900264T4 (tr) 2011-08-31 2019-02-21 Glaxosmithkline Biologicals Sa İmmünojen şifreleyici rna'nın verilmesi için pegile edilmiş lipozomlar.
EP3384938A1 (en) 2011-09-12 2018-10-10 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP2763701B1 (en) 2011-10-03 2018-12-19 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
CN104105504A (zh) 2011-10-11 2014-10-15 诺华股份有限公司 重组多顺反子核酸分子
EP2766385A2 (en) 2011-10-12 2014-08-20 Novartis AG Cmv antigens and uses thereof
EP2791364A4 (en) 2011-12-14 2015-11-11 Moderna Therapeutics Inc PROCESS FOR RESPONSE TO A BIOLOGICAL THREAT
RU2649364C2 (ru) 2011-12-16 2018-04-02 Модерна Терапьютикс, Инк. Составы на основе модифицированного нуклеозида, нуклеотида и нуклеиновой кислоты
RU2014129863A (ru) 2011-12-21 2016-02-10 Модерна Терапьютикс, Инк. Способы повышения жизнеспособности или увеличения продолжительности жизни органа или экспланта органа
EP3520821A1 (en) 2012-04-02 2019-08-07 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of biologics and proteins associated with human disease
CN108949772A (zh) 2012-04-02 2018-12-07 现代泰克斯公司 用于产生与人类疾病相关的生物制剂和蛋白质的修饰多核苷酸
SI2922554T1 (sl) 2012-11-26 2022-06-30 Modernatx, Inc. Terminalno modificirana RNA
EP2943221A1 (en) 2013-01-10 2015-11-18 Novartis AG Influenza virus immunogenic compositions and uses thereof
US9504747B2 (en) 2013-03-08 2016-11-29 Novartis Ag Lipids and lipid compositions for the delivery of active agents
US20160032316A1 (en) 2013-03-14 2016-02-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Purification and Purity Assessment of RNA Molecules Synthesized with Modified Nucleosides
US10258698B2 (en) 2013-03-14 2019-04-16 Modernatx, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
WO2015095340A1 (en) 2013-12-19 2015-06-25 Novartis Ag Lipids and lipid compositions for the delivery of active agents
JP6948313B6 (ja) 2015-09-17 2022-01-14 モデルナティエックス インコーポレイテッド 治療剤の細胞内送達のための化合物および組成物
IL286515B2 (en) 2015-10-28 2024-02-01 Acuitas Therapeutics Inc Novel lipids and nanoparticle formulations of lipids for delivery of nucleic acids
IL266501B2 (en) 2016-11-10 2024-06-01 Translate Bio Inc Improved ice-based lipid nanoparticle formulation for delivery of mrna
WO2018170270A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Varicella zoster virus (vzv) vaccine
WO2020106946A1 (en) 2018-11-21 2020-05-28 Translate Bio, Inc. TREATMENT OF CYSTIC FIBROSIS BY DELIVERY OF NEBULIZED mRNA ENCODING CFTR
US20230172858A1 (en) 2019-08-30 2023-06-08 Glaxosmithkline Biologicals Sa Jet mixing lipid nanoparticle manufacturing process
WO2022137133A1 (en) 2020-12-22 2022-06-30 Curevac Ag Rna vaccine against sars-cov-2 variants

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2245149C2 (ru) * 1999-09-25 2005-01-27 Юниверсити Оф Айова Рисерч Фаундейшн Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты

Also Published As

Publication number Publication date
US20220125723A1 (en) 2022-04-28
US20220323354A1 (en) 2022-10-13
US20220362152A1 (en) 2022-11-17
US20130171241A1 (en) 2013-07-04
CA2804396C (en) 2021-06-29
US11638694B2 (en) 2023-05-02
US11883534B2 (en) 2024-01-30
WO2012006378A1 (en) 2012-01-12
DK2590626T3 (en) 2016-01-25
RU2013104878A (ru) 2014-08-20
US20230381105A1 (en) 2023-11-30
JP2024153806A (ja) 2024-10-29
US11857681B2 (en) 2024-01-02
US20220125724A1 (en) 2022-04-28
MX2013000164A (es) 2013-03-05
US11839686B2 (en) 2023-12-12
JP7531561B2 (ja) 2024-08-09
HRP20151349T1 (hr) 2016-01-01
CN103153284B (zh) 2015-11-25
PL2590626T3 (pl) 2016-04-29
SMT201600007B (it) 2016-02-25
US20240115501A1 (en) 2024-04-11
US20220125726A1 (en) 2022-04-28
CN103153284A (zh) 2013-06-12
JP2023002709A (ja) 2023-01-10
US20220125722A1 (en) 2022-04-28
PT2590626E (pt) 2016-01-26
CA2804396A1 (en) 2012-01-12
AU2011276234A1 (en) 2013-02-21
US11766401B2 (en) 2023-09-26
JP2017043626A (ja) 2017-03-02
US11850305B2 (en) 2023-12-26
EP2590626A1 (en) 2013-05-15
US20230381106A1 (en) 2023-11-30
ES2557382T3 (es) 2016-01-25
RS54489B1 (sr) 2016-06-30
SI2590626T1 (sl) 2016-01-29
US11786467B2 (en) 2023-10-17
US11638693B2 (en) 2023-05-02
US11666534B2 (en) 2023-06-06
AU2011276234B2 (en) 2016-02-25
JP2020189881A (ja) 2020-11-26
US20220125727A1 (en) 2022-04-28
US20220331248A1 (en) 2022-10-20
US20220347097A1 (en) 2022-11-03
BR112013000244A2 (pt) 2016-05-17
US20220125725A1 (en) 2022-04-28
US20230381107A1 (en) 2023-11-30
JP2013537518A (ja) 2013-10-03
HUE026646T2 (en) 2016-07-28
EP2590626B1 (en) 2015-10-28
JP2019006777A (ja) 2019-01-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11766401B2 (en) Methods of administering lipid formulations with immunogens
US20220192997A1 (en) Virion-like delivery particles for self-replicating rna molecules
RU2671482C2 (ru) Маленькие липосомы для доставки кодирующей иммуноген рнк
HK40088259A (en) Virion-like delivery particles for self-replicating rna molecules
HK40071976A (en) Virion-like delivery particles for self-replicating rna molecules
HK40071976B (en) Virion-like delivery particles for self-replicating rna molecules

Legal Events

Date Code Title Description
PC41 Official registration of the transfer of exclusive right

Effective date: 20220127