TW202200605A - 冠狀病毒疫苗組成物和方法 - Google Patents

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西恩 蘇利凡
松田大輝
立川清
帕德瑪納 奇福庫拉
普莉亞 卡瑪利
傑瑞德 戴維斯
包艷潔
阿密特 薩吉
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Abstract

本發明提供編碼病毒複製蛋白和抗原性冠狀病毒蛋白或彼等之片段的核酸分子。本發明亦提供包括編碼病毒複製蛋白和抗原蛋白之核酸分子和脂質的組成物。本發明提供之核酸分子可用於誘導免疫反應。

Description

冠狀病毒疫苗組成物和方法
本發明揭示內容大抵關於誘導針對傳染原和腫瘤抗原之免疫反應，且更具體地關於用於抗原表現之自我轉錄和自我複製RNA。相關申請案之 交叉引用
本申請案主張2020年3月9日提交申請之美國臨時申請案62/987,191號和2020年9月2日提交申請之美國臨時申請案63/073,900號之權益。關於序列表
本申請案含有序列表，該序列表已經以ASCII格式經由電子方式提交，且其全部內容以引用方式併入本文。該在2021年3月8日創建之ASCII副本名稱為049386-538001WO_SequenceListing_ST25.txt且大小為481,150字節。
傳染病和癌症代表對全球健康的沉重負擔。根據世界衛生組織(WHO)，下呼吸道感染為2016年全球最致命的傳染病，造成約3百萬人死亡。由嚴重急性呼吸道症候群-冠狀病毒-2(SARS-CoV-2)引起之冠狀病毒病2019(COVID-19)大流行正說明傳染病的影響。SARS-CoV-2為2019年12月在中國武漢首次發現的新型冠狀病毒，截至2020年8月，已導致全球超過2000萬例確診感染，超過70萬人死亡。目前用來遏制SARS-CoV-2在全球快速傳播的控制措施(諸如國家封鎖、工作場所和學校關閉，以及減少國際旅行)將威脅導致全球經濟衰退到大蕭條後未曾見到的程度。
癌症為全球第二大死亡原因，造成2018年全球約960萬人死亡。癌症為一大群可以影響體內幾乎任何器官或組織的疾病。癌症負擔持續在全球增長，對患者和健康保健提供者的身體、情緒和財務造成壓力。
自我複製之核糖核酸(RNA)(例如源自病毒複製子)可用於表現用於各種不同目的之蛋白質，諸如異源蛋白質，諸如表現治療性蛋白質和表現用於疫苗之抗原。該等複製子之理想特性為持續表現該蛋白質之能力。
可用之用於由病毒和真核生物引起之感染的治療很少，而對用於治療細菌感染之抗生素的抗藥性正在增加。另外，需要快速反應，包括快速研發疫苗以有效地控制新出現的傳染病和大流行病。此外，許多癌症治療，包括昂貴且痛苦之外科手術和化學療法，儘管有嚴重的副作用，但通常不成功或僅適度地延長壽命。因此，對傳染病和癌症之預防和/或治療是有需要的。
於一態樣中，本發明提供核酸分子，其包含(i)編碼一或多種病毒複製蛋白之第一多核苷酸，其中該第一多核苷酸與編碼該一或多種病毒複製蛋白之野生型多核苷酸相比較呈密碼子優化；和(ii)包含第一轉基因之第二多核苷酸，該第一轉基因編碼第一抗原蛋白或其片段，其中該第一抗原蛋白為冠狀病毒蛋白。
於一些實施態樣中，該一或多種病毒複製蛋白為α病毒蛋白或風疹病毒(rubivirus)蛋白。
於一些實施態樣中，該α病毒蛋白係來自委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)、東方馬腦炎病毒(EEEV)、大沼澤地病毒(EVEV)、穆坎布(Mucambo)病毒(MUCV)、塞姆利基森林(Semliki forest)病毒(SFV)、皮克孫納(Pixuna)病毒(PIXV)、米德堡(Middelburg)病毒(MIDV)、屈公(Chikungunya)病毒(CHIKV)、歐尼恩(O'Nyong-Nyong)病毒(ONNV)、羅斯河(Ross River)病毒(RRV)、巴馬森林(Barmah Forest)病毒(BFV)、蓋他(Getah)病毒(GETV)、鷺山(Sagiyama)病毒(SAGV)、貝巴魯(Bebaru)病毒(BEBV)、馬雅羅(Mayaro)病毒(MAYV)、烏納(Una)病毒(UNAV)、辛德畢斯(Sindbis)病毒(SINV)、奧拉(Aura)病毒(AURAV)、沃達羅(Whataroa)病毒(WHAV)、巴班奇(Babanki)病毒(BABV)、庫孜拉加奇(Kyzylagach)病毒(KYZV)、西方馬腦炎病毒(WEEV)、高地(Highlands)J病毒(HJV)、摩根堡(Fort Morgan)病毒(FMV)、恩杜姆(Ndumu)病毒(NDUV)、鮭魚α病毒(Salmonid Alphavirus)(SAV)、博吉溪(Buggy Creek)病毒(BCRV)或彼等之任何組合。
於一些實施態樣中，該第一多核苷酸編碼包含α病毒nsP1蛋白、α病毒nsP2蛋白、α病毒nsP3蛋白、α病毒nsP4蛋白或彼等之任何組合的多蛋白。
於一些實施態樣中，該第一多核苷酸編碼包含α病毒nsP1蛋白、α病毒nsP2蛋白、α病毒nsP3蛋白或彼等之任何組合及α病毒nsP4蛋白之多蛋白。
於一些實施態樣中，該核酸分子進一步包含第一基因間區，該第一基因間區係介於編碼包含α病毒nsP1蛋白、α病毒nsP2蛋白、α病毒nsP3蛋白或彼等之任何組合之多蛋白的序列與編碼α病毒nsP4的序列之間。
於一些實施態樣中，該第一基因間區包含α病毒序列。
於一些實施態樣中，該第一多核苷酸包含與SEQ ID NO：72之序列具有至少80%同一性的序列。
於一些實施態樣中，該核酸分子進一步包含5'非轉譯區(UTR)。
於一些實施態樣中，該5'UTR包含病毒5'UTR、非病毒5'UTR或病毒和非病毒5'UTR序列之組合。
於一些實施態樣中，該5'UTR包含α病毒5'UTR。
於一些實施態樣中，該α病毒5'UTR包含委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)、東方馬腦炎病毒(EEEV)、大沼澤地病毒(EVEV)、穆坎布病毒(MUCV)、塞姆利基森林病毒(SFV)、皮克孫納病毒(PIXV)、米德堡病毒(MIDV)、屈公病毒(CHIKV)、歐尼恩病毒(ONNV)、羅斯河病毒(RRV)、巴馬森林病毒(BFV)、蓋他病毒(GETV)、鷺山病毒(SAGV)、貝巴魯病毒(BEBV)、馬雅羅病毒(MAYV)、烏納病毒(UNAV)、辛德畢斯病毒(SINV)、奧拉病毒(AURAV)、沃達羅病毒(WHAV)、巴班奇病毒(BABV)、庫孜拉加奇病毒(KYZV)、西方馬腦炎病毒(WEEV)、高地J病毒(HJV)、摩根堡病毒(FMV)、恩杜姆病毒(NDUV)、鮭魚α病毒(SAV)或博吉溪病毒(BCRV)5'UTR序列。
於一些實施態樣中，該5'UTR包含SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74或SEQ ID NO：75之序列。
於一些實施態樣中，該核酸分子進一步包含3'非轉譯區(UTR)。
於一些實施態樣中，該3'UTR包含病毒3'UTR、非病毒3'UTR或病毒和非病毒3'UTR序列之組合。於一些實施態樣中，該3'UTR包含α病毒3'UTR。
於一些實施態樣中，該α病毒3'UTR包含委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)、東方馬腦炎病毒(EEEV)、大沼澤地病毒(EVEV)、穆坎布病毒(MUCV)、塞姆利基森林病毒(SFV)、皮克孫納病毒(PIXV)、米德堡病毒(MIDV)、屈公病毒(CHIKV)、歐尼恩病毒(ONNV)、羅斯河病毒(RRV)、巴馬森林病毒(BFV)、蓋他病毒(GETV)、鷺山病毒(SAGV)、貝巴魯病毒(BEBV)、馬雅羅病毒(MAYV)、烏納病毒(UNAV)、辛德畢斯病毒(SINV)、奧拉病毒(AURAV)、沃達羅病毒(WHAV)、巴班奇病毒(BABV)、庫孜拉加奇病毒(KYZV)、西方馬腦炎病毒(WEEV)、高地J病毒(HJV)、摩根堡病毒(FMV)、恩杜姆病毒(NDUV)、鮭魚α病毒(SAV)或博吉溪病毒(BCRV)3'UTR序列。
於一些實施態樣中，該3'UTR包含聚A序列。
於一些實施態樣中，該3'UTR包含SEQ ID NO：76之序列。
於一些實施態樣中，該抗原蛋白為SARS-CoV-2蛋白。
於一些實施態樣中，該抗原蛋白為SARS-CoV-2刺突糖蛋白。
於一些實施態樣中，該SARS-CoV-2刺突糖蛋白為具有SEQ ID NO：123之胺基酸序列的野生型SARS-CoV-2刺突糖蛋白。
於一些實施態樣中，該第二多核苷酸包含與SEQ ID NO：121或SEQ ID NO：122之序列具有至少85%同一性的序列。
於一些實施態樣中，該第二多核苷酸包含至少二個轉基因。
於一些實施態樣中，該第二轉基因編碼第二抗原蛋白或其片段或免疫調節蛋白。
於一些實施態樣中，該第二多核苷酸進一步包含位於轉基因之間的編碼2A肽之序列、內部核醣體進入位點(IRES)或彼等之組合。
於一些實施態樣中，該免疫調節蛋白為細胞因子、趨化素或介白素。
於一些實施態樣中，該第二轉基因編碼第二冠狀病毒蛋白。
於一些實施態樣中，該第一多核苷酸位於該第二多核苷酸之5'。
於一些實施態樣中，該核酸分子進一步包含位於該第一多核苷酸與該第二多核苷酸之間的第二基因間區。
於一些實施態樣中，該第二基因間區包含與SEQ ID NO：77之序列具有至少85%同一性的序列。
於一些實施態樣中，該核酸分子為 (a)DNA分子；或者 (b)RNA分子，其中T被U取代。
於一些實施態樣中，該DNA分子進一步包含啟動子。
於一些實施態樣中，該啟動子位於該5'UTR之5'。
於一些實施態樣中，該啟動子為T7啟動子、T3啟動子或SP6啟動子。
於一些實施態樣中，該RNA分子為自我複製RNA分子。
於一些實施態樣中，該RNA分子進一步包含5'帽。
在一些實施例中，該5'帽具有Cap 1結構、Cap 1(m6 A)結構、Cap 2結構、Cap 0結構或彼等之任何組合。
於另一態樣中，本發明提供核酸分子，其包含 (a)SEQ ID NO：124之序列； (b)SEQ ID NO：124之序列，其中T被U取代； (c)SEQ ID NO：125之序列；或者 (d)SEQ ID NO：125之序列，其中T被U取代。
於一些實施態樣中，該核酸分子為RNA分子。
於一些實施態樣中，該核酸分子進一步包含具有Cap 1結構之5'帽。
再於另一態樣中，本發明提供核酸分子，其包含 (i) 第一多核苷酸，其包含與SEQ ID NO：72之序列具有至少80%同一性之序列；和 (ii) 第二多核苷酸，其包含編碼第一抗原蛋白或其片段之第一轉基因，其中該第一抗原蛋白為冠狀病毒蛋白。
於一些實施態樣中，該核酸分子進一步包含5'非轉譯區(UTR)。
於一些實施態樣中，該5'UTR包含病毒5'UTR、非病毒5'UTR或病毒和非病毒5'UTR序列之組合。
於一些實施態樣中，該5'UTR包含α病毒5'UTR。
於一些實施態樣中，該α病毒5'UTR包含委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)、東方馬腦炎病毒(EEEV)、大沼澤地病毒(EVEV)、穆坎布病毒(MUCV)、塞姆利基森林病毒(SFV)、皮克孫納病毒(PIXV)、米德堡病毒(MIDV)、屈公病毒(CHIKV)、歐尼恩病毒(ONNV)、羅斯河病毒(RRV)、巴馬森林病毒(BFV)、蓋他病毒(GETV)、鷺山病毒(SAGV)、貝巴魯病毒(BEBV)、馬雅羅病毒(MAYV)、烏納病毒(UNAV)、辛德畢斯病毒(SINV)、奧拉病毒(AURAV)、沃達羅病毒(WHAV)、巴班奇病毒(BABV)、庫孜拉加奇病毒(KYZV)、西方馬腦炎病毒(WEEV)、高地J病毒(HJV)、摩根堡病毒(FMV)、恩杜姆病毒(NDUV)、鮭魚α病毒(SAV)或博吉溪病毒(BCRV)5'UTR序列。
於一些實施態樣中，該5'UTR包含SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74或SEQ ID NO：75之序列。
於一些實施態樣中，該核酸分子進一步包含3'非轉譯區(UTR)。
於一些實施態樣中，該3'UTR包含病毒3'UTR、非病毒3'UTR或病毒和非病毒3'UTR序列之組合。
於一些實施態樣中，該3'UTR包含α病毒3'UTR。
於一些實施態樣中，該α病毒3'UTR包含委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)、東方馬腦炎病毒(EEEV)、大沼澤地病毒(EVEV)、穆坎布病毒(MUCV)、塞姆利基森林病毒(SFV)、皮克孫納病毒(PIXV)、米德堡病毒(MIDV)、屈公病毒(CHIKV)、歐尼恩病毒(ONNV)、羅斯河病毒(RRV)、巴馬森林病毒(BFV)、蓋他病毒(GETV)、鷺山病毒(SAGV)、貝巴魯病毒(BEBV)、馬雅羅病毒(MAYV)、烏納病毒(UNAV)、辛德畢斯病毒(SINV)、奧拉病毒(AURAV)、沃達羅病毒(WHAV)、巴班奇病毒(BABV)、庫孜拉加奇病毒(KYZV)、西方馬腦炎病毒(WEEV)、高地J病毒(HJV)、摩根堡病毒(FMV)、恩杜姆病毒(NDUV)、鮭魚α病毒(SAV)或博吉溪病毒(BCRV)3'UTR序列。
於一些實施態樣中，該3'UTR包含聚A序列。
於一些實施態樣中，該3'UTR包含SEQ ID NO：76之序列。
於一些實施態樣中，該抗原蛋白為SARS-CoV-2蛋白。
於一些實施態樣中，該抗原蛋白為SARS-CoV-2刺突糖蛋白。
於一些實施態樣中，該SARS-CoV-2刺突糖蛋白為具有SEQ ID NO：123之胺基酸序列的野生型SARS-CoV-2刺突糖蛋白。
於一些實施態樣中，該第二多核苷酸包含與SEQ ID NO：121或SEQ ID NO：122之序列具有至少85%同一性的序列。
於一些實施態樣中，該第二多核苷酸包含至少二個轉基因。
於一些實施態樣中，該第二轉基因編碼第二抗原蛋白或其片段或免疫調節蛋白。
於一些實施態樣中，該第二多核苷酸進一步包含位於轉基因之間的編碼2A肽之序列、內部核醣體進入位點(IRES)或彼等之組合。
於一些實施態樣中，該免疫調節蛋白為細胞因子、趨化素或介白素。
於一些實施態樣中，該第二轉基因編碼第二冠狀病毒蛋白。
於一些實施態樣中，該第一多核苷酸係位於該第二多核苷酸之5'。
於一些實施態樣中，該核酸分子進一步包含位在介於該第一多核苷酸與該第二多核苷酸之間的第二基因間區。
於一些實施態樣中，該第二基因間區包含與SEQ ID NO：77之序列具有至少85%同一性的序列。
於一些實施態樣中，該核酸分子為 (a)DNA分子；或者 (b)RNA分子，其中T被U取代。
於一些實施態樣中，該DNA分子進一步包含啟動子。
於一些實施態樣中，該啟動子位於該5'UTR之5'。
於一些實施態樣中，該啟動子為T7啟動子、T3啟動子或SP6啟動子。
於一些實施態樣中，該RNA分子為自我複製RNA分子。
於一些實施態樣中，該RNA分子進一步包含5'帽。
在一些實施例中，該5'帽具有Cap 1結構、Cap 1(m6 A)結構、Cap 2結構、Cap 0結構或彼等之任何組合。
再於另一態樣中，本發明提供包含本發明提供之任何核酸分子的組成物。於一些實施態樣中，該組成物進一步包含脂質。
於一些實施態樣中，該脂質包含可離子化之陽離子性脂質。
於一些實施態樣中，該可離子化之陽離子性脂質具有下式結構：
Figure 02_image001
Figure 02_image003
或彼等之醫藥上可接受之鹽。
再於另一態樣中，本發明提供包含如本文所描述之任何核酸分子和脂質配製劑的組成物。
於一些實施態樣中，該脂質配製劑包含可離子化之陽離子性脂質。
於一些實施態樣中，該可離子化之陽離子性脂質具有下式結構：
Figure 02_image005
Figure 02_image007
，或彼等之醫藥上可接受之鹽。
於一些實施態樣中，該脂質配製劑係選自脂質複合物(lipoplex)、脂質體、脂質奈米顆粒、聚合物為底質之載體、胞外體(exosome)、板層體(lamellar body)、膠束和乳劑。
於一些實施態樣中，該脂質配製劑為選自陽離子性脂質體、奈米脂質體、蛋白脂質體、單層脂質體、多層脂質體、含神經醯胺之奈米脂質體和多囊脂質體的脂質體。
於一些實施態樣中，該脂質配製劑為脂質奈米顆粒。
於一些實施態樣中，該脂質奈米顆粒具有小於約200 nm之尺寸。於一些實施態樣中，該脂質奈米顆粒具有小於約150 nm之尺寸。於一些實施態樣中，該脂質奈米顆粒具有小於約100 nm之尺寸。於一些實施態樣中，該脂質奈米顆粒具有約55 nm至約90 nm之尺寸。
於一些實施態樣中，該脂質配製劑包含一或多種陽離子性脂質。
於一些實施態樣中，該一或多種陽離子性脂質係選自5-羧基精基甘胺酸二十八烷基醯胺(DOGS)、2,3-二油基氧基-N-[2(精胺-羧醯胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙銨(DOSPA)、1,2-二油醯-3-二甲基銨-丙烷(DODAP)、1,2-二油醯-3-三甲基銨-丙烷(DOTAP)、1,2-二硬脂基氧基-N,N-二甲基-3-胺基丙烷(DSDMA)、1,2-二油基氧基-N,N-二甲基-3-胺基丙烷(DODMA)、1,2-二亞油基氧基-N,N-二甲基-3-胺基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亞麻基氧基-N,N-二甲基-3-胺基丙烷(DLenDMA)、N-二油基-N,N-二甲基氯化銨(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化銨(DDAB)、N-(1,2-二肉荳蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羥乙基溴化銨(DMRIE)、3-二甲胺基-2-(膽固醇-5-烯-3-β-氧基丁-4-氧基)-1-(順,順-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(CLinDMA)、2-[5'-((膽固醇-5-烯-3-β-氧基)-3'-氧雜戊氧基)-3-二甲基1-1-(順,順-9',1-2'-十八碳二烯氧基)丙烷(CpLinDMA)、N,N-二甲基-3,4-二油基氧基苄胺(DMOBA)、1,2-N,N'-二油基胺甲醯-3-二甲胺基丙烷(DOcarbDAP)、2,3-二亞油醯氧基-N,N-二甲基丙胺(DLinDAP)、1,2-N,N'-二亞油基胺甲醯-3-二甲胺基丙烷(DLincarbDAP)、1,2-二亞油醯胺甲醯-3-二甲胺基丙烷(DLinCDAP)、2,2-二亞油基-4-二甲胺基甲基-[1,3]-二氧戊環(DLin-K-DMA)和2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環或(DLin-K-XTC2-DMA)。
於一些實施態樣中，該脂質配製劑包含可離子化之陽離子性脂質。
於一些實施態樣中，該可離子化之陽離子性脂質具有式I之結構：
Figure 02_image009
或其醫藥上可接受之鹽或溶劑化物，其中R5 和R6 各自獨立地選自由下列所組成之群組：直鏈型或支鏈型C1 -C31 烷基、C2 -C31 烯基或C2 -C31 炔基和膽固醇基；L5 和L6 各自獨立地選自由下列所組成之群組：直鏈型C1 -C20 烷基和C2 -C20 烯基；X5 為-C(O)O-，由此形成-C(O)O-R6 或X5 為     -OC(O)-，由此形成-OC(O)-R6 ；X6 為-C(O)O-，由此形成 -C(O)O-R5 或X6 為-OC(O)-，由此形成-OC(O)-R5 ；X7 為S或O；L7 不存在或為低級烷基；R4 為直鏈型或支鏈型C1 -C6 烷基；且R7 和R8 各自獨立地選自由下列所組成之群組：氫和直鏈型或支鏈型C1 -C6 烷基。
於一些實施態樣中，該可離子化之陽離子性脂質係選自下列群組
Figure 02_image011
Figure 02_image013
Figure 02_image015
Figure 02_image017
Figure 02_image019
Figure 02_image021
Figure 02_image023
Figure 02_image025
Figure 02_image027
於一些實施態樣中，該可離子化之陽離子性脂質為ATX-126：
Figure 02_image029
於一些實施態樣中，該脂質配製劑包封該核酸分子。
於一些實施態樣中，該脂質配製劑與該核酸分子複合。
於一些實施態樣中，該脂質配製劑進一步包含輔助脂質。於一些實施態樣中，該輔助脂質為磷脂。於一些實施態樣中，該輔助脂質係選自二油醯磷脂醯乙醇胺(DOPE)、二肉荳蔻醯磷脂醯膽鹼(DMPC)、二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC)、二肉荳蔻醯磷脂醯甘油(DMPG)、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼(DPPC)和磷脂醯膽鹼(PC)。於具體之實施態樣中，該輔助脂質為二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC)。
於一些實施態樣中，該脂質配製劑進一步包含膽固醇。
於一些實施態樣中，該脂質配製劑進一步包含聚乙二醇(PEG)-脂質軛合物。於一些實施態樣中，該PEG-脂質軛合物為PEG-DMG。於一些實施態樣中，該PEG-DMG為PEG2000-DMG。
於一些實施態樣中，該脂質配製劑之脂質部分包含約40莫耳%至約60莫耳%之可離子化的陽離子性脂質、約4莫耳%至約16莫耳%之DSPC、約30莫耳%至約47莫耳%之膽固醇和約0.5莫耳%至約3莫耳%之PEG2000-DMG。
於一些實施態樣中，該脂質配製劑之脂質部分包含約42莫耳%至約58莫耳%之可離子化的陽離子性脂質、約6莫耳%至約14莫耳%之DSPC、約32莫耳%至約44莫耳%之膽固醇和約1莫耳%至約2莫耳%之PEG2000-DMG。
於一些實施態樣中，該脂質配製劑之脂質部分包含約45莫耳%至約55莫耳%之可離子化的陽離子性脂質、約8莫耳%至約12莫耳%之DSPC、約35莫耳%至約42莫耳%之膽固醇和約1.25莫耳%至約1.75莫耳%之PEG2000-DMG。
於一些實施態樣中，該組成物具有約50：1至約10：1之總脂質：核酸分子量比。於一些實施態樣中，該組成物具有約44：1至約24：1之總脂質：核酸分子量比。於一些實施態樣中，該組成物具有約40：1至約28：1之總脂質：核酸分子重量比。於一些實施態樣中，該組成物具有約38：1至約30：1之總脂質：核酸分子重量比。於一些實施態樣中，該組成物具有約37：1至約33：1之總脂質：核酸分子重量比。於一些實施態樣中，該組成物包含pH為約7.0至約8.5之HEPES或TRIS緩衝劑。
於一些實施態樣中，該HEPES或TRIS緩衝液之濃度為約7 mg/mL至約15 mg/mL。
於一些實施態樣中，該組成物進一步包含約2.0 mg/mL至約4.0 mg/mL之NaCl。
於一些實施態樣中，該組成物進一步包含一或多種冷凍保護劑。
於一些實施態樣中，該一或多種冷凍保護劑係選自蔗糖、甘油或蔗糖和甘油之組合。
於一些實施態樣中，該組成物包含濃度為約70 mg/mL至約110 mg/mL之蔗糖和濃度為約50 mg/mL至約70 mg/mL之甘油的組合。
於一些實施態樣中，該組成物為凍乾之組成物。
於一些實施態樣中，該凍乾之組成物包含一或多種凍乾保護劑。
於一些實施態樣中，該凍乾之組成物包含泊洛沙姆(poloxamer)、山梨酸鉀、蔗糖或彼等之任何組合。
於一些實施態樣中，該泊洛沙姆為泊洛沙姆188。
於一些實施態樣中，該凍乾之組成物包含約0.01至約1.0 % w/w之該核酸分子。
於一些實施態樣中，該凍乾之組成物包含約1.0至約5.0 % w/w之脂質。
於一些實施態樣中，該凍乾之組成物包含約0.5至約2.5 % w/w之TRIS緩衝劑。
於一些實施態樣中，該凍乾之組成物包含約0.75至約2.75 %w/w之NaCl。
於一些實施態樣中，該凍乾之組成物包含約85至約95 % w/w之糖。於一些實施態樣中，該糖為蔗糖。
於一些實施態樣中，該凍乾之組成物包含約0.01至約1.0 % w/w之泊洛沙姆。於一些實施態樣中，該泊洛沙姆為泊洛沙姆188。
於一些實施態樣中，該凍乾之組成物包含約1.0至約5.0 % w/w之山梨酸鉀。
於一些實施態樣中，該核酸分子包含 (a)SEQ ID NO：124之序列； (b)SEQ ID NO：124之序列，其中T被U取代； (c)SEQ ID NO：125之序列；或者 (d)SEQ ID NO：125之序列，其中T被U取代。
再於另一態樣中，本發明提供脂質奈米顆粒組成物，其包含 a. 脂質配製劑，其包含 i.約45莫耳%至約55莫耳%之具有ATX-126結構的可離子化之陽離子性脂質：
Figure 02_image031
ii.約8莫耳%至約12莫耳%之DSPC； iii.約35莫耳%至約42莫耳%之膽固醇；和 iv.約1.25莫耳%至約1.75莫耳%之PEG2000-DMG；和 b. 與SEQ ID NO：125具有至少85%序列同一性之核酸分子； 其中該脂質配製劑包封該核酸分子且該脂質奈米顆粒具有約60至約90 nm之尺寸。
再於另一態樣中，本發明提供對有需要之個體投予本文所描述之任何組成物的方法，其中該組成物係經由肌肉內、皮下、皮內、透皮、鼻內、口服、舌下、靜脈內、腹膜內、局部、藉由氣霧劑或經由肺部途徑投予。於具體之實施態樣中，該組成物係經由肌肉內投予。
於另一態樣中，本發明提供對有需要之個體投予本文所描述之任何組成物的方法，其中該組成物係經凍乾並在投予前經重構。
再於另一態樣中，本發明提供改善COVID-19之方法，其包含對有需要之個體投予本文所描述之任何組成物。
於一些實施態樣中係投予該組成物一次。於一些實施態樣中係投予該組成物二次。
再於另一態樣中，本發明提供對經接種疫苗之個體投予加強劑量之方法，其包含對先前已接種針對冠狀病毒之疫苗的個體投予本文所描述之任何組成物。
於一些實施態樣中，該組成物之投予劑量為約0.01 μg至約1,000 μg之核酸。
於一些實施態樣中，該組成物之投予劑量為約1、2、5、7.5或10 μg之核酸。
再於另一態樣中，本發明提供誘導個體的免疫反應之方法，該方法包含對該個體投予有效量之本文所描述的任何組成物。
於一些實施態樣中，該核酸分子可經由肌肉內、皮下、皮內、透皮、鼻內、口服、舌下、靜脈內、腹膜內、局部、藉由氣霧劑或經由肺部途徑投予。
再於另一態樣中，本發明提供誘導個體的免疫反應之方法，該方法包含對該個體投予有效量之本文所描述之任何組成物。
於一些實施態樣中，該組成物可經由肌肉內、皮下、皮內、透皮、鼻內、口服、舌下、靜脈內、腹膜內、局部、藉由氣霧劑或經由肺部途徑投予。
於一些實施態樣中，本文所描述之核酸分子可用於誘導針對該第一抗原蛋白或其片段之免疫反應。
於一些實施態樣中，本文所描述之核酸分子可用於製造用於誘導針對該第一抗原蛋白或其片段之免疫反應的藥物。
詳細說明
本發明關於自我複製RNA和編碼彼等之核酸，以用於表現轉基因，諸如，例如抗原蛋白和腫瘤抗原。本發明亦提供自我複製RNA之投予方法(例如，對宿主，諸如哺乳動物個體投予)，藉此該自我複製RNA在體內被轉譯並表現該異源蛋白質編碼序列，且，例如可在該接受者中引起對該異源蛋白質編碼序列之免疫反應或提供治療效果，其中該異源蛋白質編碼序列為治療性蛋白。本發明提供之自我複製RNA可用來作為疫苗，其可被快速產製且在低劑量和/或單一劑量下有效。本發明進一步關於使用本發明提供之自我複製RNA誘導免疫反應之方法。
於一些實施態樣中，可引起針對冠狀病毒，包括，但不限於：源自SARS冠狀病毒、禽傳染性支氣管炎病毒(IBV)、小鼠肝炎病毒(MHV)和豬傳染性腸胃炎病毒(TGEV)之免疫原的免疫反應。該冠狀病毒免疫原可為刺突多肽。
自我複製RNA描述於，例如US 2018/ 0036398(其全文以引用方式併入本文)中。 定義
如本文所使用之術語“片段”當指，例如蛋白質或核酸時，係指較全長蛋白質或核酸短之任何序列。因此，除了全長核酸或蛋白質序列之外的任何核酸或蛋白質序列均可為片段。於一些態樣中，蛋白質片段包括表位。於其他態樣中，蛋白質片段為表位。
如本文所使用之術語“核酸”係指任何去氧核糖核酸(DNA)分子、核糖核酸(RNA)分子或核酸類似物。DNA或RNA分子可為雙股或單股且可為任何尺寸。示例性核酸包括，但不限於染色體DNA、質粒DNA、cDNA、無細胞DNA(cfDNA)、粒線體DNA、葉綠體DNA、病毒DNA、mRNA、tRNA、rRNA、長非編碼RNA、siRNA、微RNA(miRNA或miR)、hnRNA和病毒RNA。示例性核酸類似物包括肽核酸、嗎啉代核酸和鎖核酸、二醇核酸和蘇糖核酸。如本文所使用之術語“核酸分子”意圖包括，例如核酸分子之片段以及任何全長或非片段化之核酸分子。除非上下文另外明確指出，如本文所使用之術語“核酸”和“核酸分子”可互換使用。
如本文所使用之術語“蛋白質”係指胺基酸之任何聚合鏈。除非上下文另外明確指出，術語“肽”和“多肽”可與術語蛋白質互換使用，且亦可指胺基酸之聚合鏈。術語“蛋白質”涵蓋天然或人工蛋白質、蛋白質片段和蛋白質序列之多肽類似物。蛋白質可為單體或聚合體的。除非與上下文矛盾，術語“蛋白質”涵蓋其片段和變體(包括變體之片段)。
通常，可互換使用之“序列同一性”或“序列同源性”分別指二個多核苷酸或多肽序列之精確核苷酸對核苷酸或胺基酸對胺基酸對應性。通常，用於測定序列同一性之技術包括測定多核苷酸之核苷酸序列和/或測定由其編碼之胺基酸序列或多肽之胺基酸序列，並將這些序列與第二核苷酸或胺基酸序列相比較。如本文所使用之術語“序列同一性百分比(%)”或“同一性百分比(%)”亦包括“同源性”，其係指在比對序列並引入間隙(若需要時)以取得最大序列同一性百分比，且不考慮將任何保守性取代視為序列同一性之一部分後，序列中與參考序列中之胺基酸殘基或核苷酸完全相同的胺基酸殘基或核苷酸之百分比。因此，二或多個序列(多核苷酸或胺基酸)可藉由測定其“同一性百分比”(亦稱為“同源性百分比”)來進行比較。與參考序列(例如核酸或胺基酸序列)之同一性百分比的計算可將二個最佳比對序列之間的精確匹配數目除以該參考序列之長度並乘以100來進行，該參考序列可為較長分子(例如多核苷酸或多肽)內之序列。同一性百分比亦可，例如使用進階BLAST電腦程式(包括可從美國國立衛生研究院獲得之版本2.2.9)比較序列信息來測定。該BLAST程式係基於Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87：2264-2268(1990)之比對方法及如Altschul et al., J. Mol. Biol. 215：403-410(1990)；Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. sci. USA 90：5873-5877(1993)；和Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25：3389-3402(1997)中之討論。簡單地說，該BLAST程式將同一性定義為比對完全相同之符號(即核苷酸或胺基酸)的數目除以該二條序列之較短者中的符號總數。該程式可用於測定相比較之序列的整個長度之同一性百分比。提供之默認參數係用於優化使用短查詢序列(例如使用blastp程式)進行搜索。該程式亦允許使用SEG過濾器來掩蔽藉由Wootton and Federhen, Computers and Chemistry 17：149-163(1993)之SEG程式測定之查詢序列的片段。理想之序列同一性程度的範圍為約80%至100%及介於其間之整數值。參考序列和主張專利之序列之間的同一性百分比可為至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、至少99.5%或至少99.9%。通常，精確匹配表明參考序列之整個長度的同一性為100%。用於比較序列和/或評估序列同一性的其他程式和方法包括Needleman-Wunsch算法(參見，例如可在ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss needle/取得之EMBOSS Needle比對儀，其可選擇地具有默認設置)、Smith-Waterman算法(參見，例如可在ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss water/取得之EMBOSS Water比對儀，其可選擇地具有默認設置、Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444之相似性搜索法或使用這些算法之電腦程式(威斯康辛州遺傳學軟體包(遺傳學電腦集團，威斯康辛州麥迪遜市科學路575號)中之GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA)。於一些態樣中，提及序列同一性百分比係指使用BLAST(基本局部比對搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool))測量之序列同一性。於其他態樣中，使用ClustalW來進行多序列比對。最佳比對可使用所選擇之算法的任何合適參數(包括默認參數)來評估。
如本文所使用之術語“藥物(drug)”或“藥品(medicament)”意指如本文所描述之醫藥配製劑或組成物。
除非上下文另外明確指出，如本文所使用之單數型“一(a、an)”和“該(the)”包括複數引用項目。因此，例如提及之“方法”包括本文所描述之一或多種方法和/或步驟類型，本技藝之技術熟習人士在閱讀本揭示內容，等之後將能清楚明白這些。
如本文所使用之“約”當指可測量之數值(諸如量、持續時間，等)時意圖涵蓋與該具體指定之數值相差+20%、或±10%、或±5%或甚至是±1%之變化，因為該等變化對所揭示之方法或執行所揭示之方法而言是適宜的。
術語“表現”係指從DNA模板轉錄核酸序列或多核苷酸所憑藉之過程(諸如轉錄成mRNA或其他RNA轉錄子)和/或轉錄之mRNA或其他RNA隨後轉譯成肽、多肽或蛋白所憑藉之過程。轉錄子和經編碼之多肽可統稱為“基因產物”。
除非上下文另外明確指明，如本文所使用之術語“自我複製RNA”、“自我轉錄和自我複製RNA”、“自我擴增RNA(saRNA)”和“複製子”可互換使用。通常，術語“複製子”或“病毒複製子”係指源自病毒基因組之的自我複製亞基因組RNA，其包括編碼對病毒複製而言重要之非結構蛋白的病毒基因，且缺少編碼結構蛋白之病毒基因。自我複製RNA可編碼無法自我複製之其他亞基因組RNA。
如本文所使用之“可操作地(operably)連接”、“可操作之連接”、“操作性地(operatively)連接”或其語法同等物係指遺傳元件(例如啟動子、增強子、聚腺苷酸化序列，等)之並置，其中該元素之間的關係允許它們以期望之方式運行。例如，若調節元件協助啟動該編碼序列之轉錄，則該調節元件(其可包含啟動子和/或增強子序列)係操作性地連接至編碼區。只要維持該功能性關係，該調控元件和編碼區之間可有中間殘基。 核酸分子
於一些實施態樣中，本發明提供包含下列者之核酸分子：(i)編碼一或多種病毒複製蛋白之第一多核苷酸，其中與編碼該一或多種病毒複製蛋白之野生型多核苷酸相比較，該第一多核苷酸為密碼子優化的；和(ii)包含編碼第一抗原蛋白或其片段之第一轉基因的第二多核苷酸，其中該第一抗原蛋白為冠狀病毒蛋白。
RNA分子可編碼單一多肽免疫原或多個多肽。多個免疫原可以單一多肽免疫原(融合多肽)或單獨多肽之形式存在。若免疫原係以單獨多肽之形式從複製子表現，則這些免疫原中之一或多者可與上游IRES或其他病毒啟動子元件一起提供。或者，多個免疫原可從編碼個別免疫原之多蛋白表現出，該個別免疫原係與短的自催化蛋白酶(例如口蹄疫病毒2A蛋白)融合或為內含蛋白(intein)形式。
於一些實施態樣中，本發明亦提供包含下列者之核酸分子：(i)包含與SEQ ID NO：72之序列具有至少80%同一性之序列的第一多核苷酸；和(ii)包含編碼第一抗原蛋白或其片段之第一轉基因的第二多核苷酸。 密碼子優化
於一些實施態樣中，本發明提供之編碼一或多種病毒複製蛋白之核酸分子的第一多核苷酸包括經密碼子優化之序列。如本文所使用之術語“密碼子優化的”意指與野生型或參考多核苷酸、核酸序列或編碼序列相比較，已藉由選擇不同的密碼子，但不改變該經編碼之蛋白質的胺基酸序列而被重新設計的多核苷酸、核酸序列或編碼序列。因此，密碼子優化通常係指以同義密碼子替代密碼子來優化蛋白質之表現，同時將該經轉譯之蛋白質的胺基酸序列保持相同。序列之密碼子優化可，例如增加該經編碼之蛋白質的蛋白質表現水準(Gustafsson et al., Codon bias and heterologous protein expression. 2004, Trends Biotechnol 22：346-53)並提供其他優點。變量，諸如藉由密碼子適應指數(codon adaptation index)(CAI)測量之密碼子使用偏好，例如U和其他核苷酸之存在或頻率、mRNA二級結構、順式調控序列、GC含量和其他變量可能與蛋白質表現水準相關(Villalobos et al., Gene Designer：a synthetic biology tool for constructing artificial DNA segments. 2006, BMC Bioinformatics 7：285)。
密碼子優化之任何方法均可用於密碼子優化本發明提供之多核苷酸和核酸分子，且可藉由密碼子優化來改變任何變量。因此，可使用密碼子優化方法的任何組合。示例性方法包括高密碼子適應指數(CAI)法、低U法，等。CAI法選擇最常用之同義密碼子來用於整個蛋白質編碼序列。例如，各胺基酸最常用之密碼子可從人基因組之74,218蛋白質編碼基因推導出。低U法靶向可被具有較少U部分之同義密碼子替代的含U密碼子，通常不會改變其他密碼子。若替代之選項不止一種，則可選擇較常使用之密碼子。本發明提供之任何多核苷酸、核酸序列或密碼子序列皆可經密碼子優化。
於一些實施態樣中，可對本文所描述之RNA或DNA模板之任何區域的核苷酸序列進行密碼子優化。較佳地，該初級cDNA模板可包括減少該模板股中某些核苷酸之出現或出現頻率。例如，模板中之核苷酸的發生率可降至低於該模板中該核苷酸之25%的水準。於進一步之實例中，模板中之核苷酸的發生率可降至低於該模板中之該核苷酸之20%的水準。於一些實例中，模板中之核苷酸的發生率可降至低於該模板中之該核苷酸之16%的水準。較佳地，模板中之核苷酸的發生率可降至低於該模板中之該核苷酸之15%的水準，且較佳地，可降至低於該模板中之該核苷酸之12%的水準。
於一些實施態樣中，該減少之核苷酸為尿苷。例如，本發明提供具有改變之尿嘧啶含量的核酸，其中該野生型序列中至少一個密碼子已被替代密碼子取代以產生尿嘧啶改變之序列。經改變之尿嘧啶序列可具有至少一種下列性質： (i)總體尿嘧啶含量增加或減少(即，該核酸之一部分，例如開放閱讀框的核酸中之總核苷酸含量的尿嘧啶百分比)； (ii)局部尿嘧啶含量增加或減少(即，尿嘧啶含量中之變化僅限於特定的子序列)； (iii)尿嘧啶分佈改變，而總尿嘧啶含量沒有改變； (iv)尿嘧啶簇改變(例如簇數、簇之位置或簇之間的距離)；或者 (v)彼等之組合。
於一些實施態樣中，該核酸序列中之尿嘧啶核鹼基的百分比相對於該野生型核酸序列中之尿嘧啶核鹼基的百分比而言降低。例如，該野生型序列中之30%核鹼基可為尿嘧啶，但本發明之核酸序列中為尿嘧啶之核鹼基較佳為少於本發明之核酸序列中之核鹼基的15%，較佳為少於12%，且較佳為少於10%。該尿嘧啶含量百分比可藉由將序列中之尿嘧啶數除以核苷酸之總數再乘以100來測定。
於一些實施態樣中，該核酸序列中之子序列中的尿嘧啶核鹼基的百分比相對於該野生型序列之對應子序列中的尿嘧啶核鹼基的百分比而言為降低。例如，該野生型序列可具有5'端區(例如30個密碼子)，該5'端區之局部尿嘧啶含量為30%，而較佳地，本發明之核酸序列中該相同區域中之尿嘧啶含量可降低至15%或更低，較佳為12%或更低且較佳為10%或更低。這些子序列亦可為本揭示內容之異源5'和3'UTR序列的野生型序列之一部分。
於一些實施態樣中，本揭示內容之核酸序列中的密碼子減少或修飾可能對蛋白質轉譯具有有害作用之尿嘧啶簇的數量、大小、位置或分佈。雖然於某些態樣中，較低之尿嘧啶含量是理想的，該野生型序列之一些子序列的尿嘧啶含量，特別是局部尿嘧啶含量可高於該野生型序列且仍然保持有利之特性(例如增加之表現)。
於一些實施態樣中，與野生型序列相比較，尿嘧啶修飾之序列誘導較低之Toll樣受體(TLR)反應。數種TLR可識別並對核酸反應。雙股(ds)RNA(常見之病毒組成分)已證明可活化TLR3。單股(ss)RNA可活化TLR7。RNA寡核苷酸(例如具有硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯之RNA)為人TLR8之配體。含有未經甲基化之CpG基序的DNA(細菌和病毒DNA之特徵)可活化TLR9。
如本文所使用之術語“TLR反應”之定義為TLR7受體識別單股RNA，且較佳為包含由該受體識別單股RNA所引起之RNA降解和/或生理反應。用於測定和定量RNA與TLR7之結合的方法為本技藝已知。類似地，用於測定RNA是否已觸發由TLR7介導之生理反應(例如細胞因子分泌)的方法為本技藝眾所周知。於一些實施態樣中，TLR反應可由TLR3、TLR8或TLR9介導，而非TLR7。抑制由TLR7介導之反應可經由核苷修飾來實現。自然界中，RNA經歷超過一百種不同的核苷修飾。例如，人rRNA具有較細菌rRNA多十倍以上之假尿嘧啶('P)和多25倍以上之2'-O-甲基化之核苷。細菌RNA不包含核苷修飾，而哺乳動物RNA除了N7-甲基鳥苷(m7G)外，還具有經修飾之核苷，諸如5-甲基胞苷(m5C)、N6-甲基腺苷(m6A)、肌苷和許多2'-O-甲基化核苷。
於一些實施態樣中，本文揭示之多核苷酸的尿嘧啶含量低於該參考序列中之序列中的總核鹼基之約50%、49%、48%、47%、46%、45%、44%、43%、42%、41%、40%、39%、38%、37%、36%、35%、34%、33%、32%、31%、30%、29%、28%、27%、26%、25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%。於一些實施態樣中，本文揭示之多核苷酸的尿嘧啶含量係介於約5%至約25%之間。於一些實施態樣中，本文揭示之多核苷酸的尿嘧啶含量係介於約15%至約25%之間。
於一些實施態樣中，本發明提供之核酸分子的第一多核苷酸包含與SEQ ID NO：72之序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少97.5%、至少98%、至少98.5%、至少99%、至少99.5%、至少99.6%、與99.7%、至少99.8%、至少99.9%，以及其間之任何數目或範圍的同一性。於一些實施態樣中，本發明提供之核酸分子的第一多核苷酸包含SEQ ID NO：72之序列。
於一些態樣中，本發明提供之核酸分子的第一多核苷酸和第二多核苷酸係包含在同一(即，單一)或分開之核酸分子中。通常，本發明提供之核酸分子的第一多核苷酸和第二多核苷酸係包含在單一核酸分子中。於一態樣中，該第一多核苷酸係位於第二多核苷酸之5'。於一態樣中，本發明提供之核酸分子的第一多核苷酸和第二多核苷酸係包含在分開之核酸分子中。再於另一態樣中，該第一多核苷酸和第二多核苷酸係包含在二個分開之核酸分子中。
於一些態樣中，第一多核苷酸和第二多核苷酸係包含在同一(即，單一)核酸分子中。本發明提供之核酸分子的第一多核苷酸和第二多核苷酸可為連續的，即，彼此相鄰，其間沒有核苷酸。於一態樣中，基因間區係位於第一多核苷酸和第二多核苷酸之間。再於另一態樣中，該位於第一多核苷酸和第二多核苷酸之間的基因間區為第二基因間區，且第一基因間區係包含在如下述之第一多核苷酸中。除非上下文另外明確指出，如本文所使用之術語“基因間區”和基因間序列”可互換使用。
位於第一多核苷酸和第二多核苷酸之間的基因間區可具有任何長度且可具有任何核苷酸序列。例如，該第一多核苷酸和第二多核苷酸之間的基因間區可包括約一個核苷酸、約二個核苷酸、約三個核苷酸、約四個核苷酸、約五個核苷酸、約六個核苷酸、約七個核苷酸、約八個核苷酸、約九個核苷酸、約10個核苷酸、約11個核苷酸、約12個核苷酸、約13個核苷酸、約14個核苷酸、約15個核苷酸、約16個核苷酸、約17個核苷酸、約18個核苷酸、約19個核苷酸、約20個核苷酸、約21個核苷酸、約22個核苷酸、約23個核苷酸、約24個核苷酸、約25個核苷酸、約26個核苷酸、約27個核苷酸、約28個核苷酸、約29個核苷酸、約30個核苷酸、約31個核苷酸、約32個核苷酸、約33個核苷酸、約34個核苷酸、約35個核苷酸、約36個核苷酸、約37個核苷酸、約38個核苷酸、約39個核苷酸、約40個核苷酸、約41個核苷酸、約42個核苷酸、約43個核苷酸、約44個核苷酸、約45個核苷酸、約46個核苷酸、約47個核苷酸、約48個核苷酸、約49個核苷酸、約50個核苷酸、約60個核苷酸、約70個核苷酸、約80個核苷酸、約90個核苷酸、約100個核苷酸、約125個核苷酸、約150個核苷酸、約175個核苷酸、約200個核苷酸、約250個核苷酸、約300個核苷酸、約350個核苷酸、約400個核苷酸、約450個核苷酸、約500個核苷酸、約600個核苷酸、約700個核苷酸、約800個核苷酸、約1,000個核苷酸、約1,500個核苷酸、約2,000個核苷酸、約2,500個核苷酸、約3,000個核苷酸、約3500個核苷酸、約4,000個核苷酸、約4,500個核苷酸、約5,000個核苷酸、約6,000個核苷酸、約7,000個核苷酸、約8,000個核苷酸、約9,000個核苷酸、約10,000個核苷酸，及介於其間之任何數量或範圍。於一態樣中，介於第一和第二多核苷酸之間的基因間區包括約10至100個核苷酸、約10至200個核苷酸、約10至300個核苷酸、約10至400個核苷酸或約10至500個核苷酸。再於另一態樣中，介於第一和第二多核苷酸之間的基因間區包括約1至10個核苷酸、約1至20個核苷酸、約1至30個核苷酸、約1至40個核苷酸或約1至50個核苷酸。再於另一態樣中，該區域包括約44個核苷酸。於一態樣中，本發明提供之核酸分子的第一和第二多核苷酸之間的基因間區為第二基因間區域。
於一態樣中，介於第一和第二多核苷酸之間的基因間區包括病毒序列。介於第一和第二多核苷酸之間的基因間區可包括來自任何病毒(例如，諸如α病毒和風疹病毒)之序列。於一態樣中，介於第一多核苷酸和第二多核苷酸之間的基因間區包含α病毒序列，諸如來自下列病毒之序列：委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)、東方馬腦炎病毒(EEEV)、大沼澤地病毒(EVEV)、穆坎布病毒(MUCV)、塞姆利基森林病毒(SFV)、皮克孫納病毒(PIXV)、米德堡病毒(MIDV)、屈公病毒(CHIKV)、歐尼恩病毒(ONNV)、羅斯河病毒(RRV)、巴馬森林病毒(BFV)、蓋他病毒(GETV)、鷺山病毒(SAGV)、貝巴魯病毒(BEBV)、馬雅羅病毒(MAYV)、烏納病毒(UNAV)、辛德畢斯病毒(SINV)、奧拉病毒(AURAV)、沃達羅病毒(WHAV)、巴班奇病毒(BABV)、庫孜拉加奇病毒(KYZV)、西方馬腦炎病毒(WEEV)、高地J病毒(HJV)、摩根堡病毒(FMV)、恩杜姆病毒(NDUV)、鮭魚α病毒(SAV)或博吉溪病毒(BCRV)或彼等之任何組合。於另一態樣中，該介於第一和第二多核苷酸之間的基因間區包含來自委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之序列。再於另一態樣中，該介於第一和第二多核苷酸之間的基因間區包含與SEQ ID NO：77具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少97.5%、至少98%、至少98.5%、至少99%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%、至少99.9%，及其間之任何數目或範圍的同一性之序列。於進一步之態樣中，該介於第一和第二多核苷酸之間的基因間區包含SEQ ID NO：77之序列。於另一進一步之態樣中，該介於第一和第二多核苷酸之間的基因間區為第二基因間區，該第二基因間區包含與SEQ ID NO：77具有至少85%同一性之序列。 天然和經修飾之核苷酸
本發明之自我複製RNA可包含一或多個經化學修飾之核苷酸。核酸單體之實例包括非天然、經修飾和經化學修飾之核苷酸，包括本技藝已知之任何該等核苷酸。核苷酸可在鹼基部分或糖部分經人工修飾。在自然界中，大多數多核苷酸包含為“未經修飾”或“天然”之核苷酸，該“未經修飾”或“天然”之核苷酸包含嘌呤鹼基腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)，及嘧啶鹼基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。這些鹼基通常在固定在核糖或去氧核糖之1'位置上。使用包含經化學修飾之核苷酸的RNA多核苷酸已被證明可改善RNA表現、表現速率、半衰期和/或表現之蛋白質濃度。包含經化學修飾之核苷酸的RNA多核苷酸亦對優化蛋白質定位，從而避免有害之生物反應(諸如免疫反應和/或降解途徑)有用。
經修飾或經化學修飾之核苷酸的實例包括5-羥基胞嘧啶核苷、5-烷基胞嘧啶核苷、5-羥烷基胞嘧啶核苷、5-羧基胞嘧啶核苷、5-甲醯基胞嘧啶核苷、5-烷氧基胞嘧啶核苷、5-炔基胞嘧啶核苷、5-鹵代胞嘧啶核苷、2-硫代胞嘧啶核苷、N4-烷基胞嘧啶核苷、N4-胺基胞嘧啶核苷、N4-乙醯基胞嘧啶核苷和N4,N4-二烷基胞嘧啶核苷。
經修飾或經化學修飾之核苷酸的實例包括5-羥基胞嘧啶核苷、5-甲基胞嘧啶核苷、5-羥甲基胞嘧啶核苷、5-羧基胞嘧啶核苷、5-甲醯基胞嘧啶核苷、5-甲氧基胞嘧啶核苷、5-丙炔基胞嘧啶核苷、5-溴胞嘧啶核苷、5-碘胞嘧啶核苷、2-硫代胞嘧啶核苷、N4-甲基胞嘧啶核苷、N4-胺基胞嘧啶核苷、N4-乙醯基胞嘧啶核苷和N4,N4-二甲基胞嘧啶核苷。
經修飾或經化學修飾之核苷酸的實例包括5-羥基尿苷、5-烷基尿苷、5-羥烷基尿苷、5-羧基尿苷、5-羧烷基酯尿苷、5-甲醯基尿苷、5-烷氧基尿苷、5-炔基尿苷、5-鹵代尿苷、2-硫代尿苷和6-烷基尿苷。
經修飾或經化學修飾之核苷酸的實例包括5-羥基尿苷、5-甲基尿苷、5-羥甲基尿苷、5-羧基尿苷、5-羧甲基酯尿苷、5-甲醯基尿苷、5-甲氧基尿苷(本文中亦稱為“5MeOU”)、5-丙炔基尿苷、5-溴尿苷、5-氟尿苷、5-碘尿苷、2-硫代尿苷和6-甲基尿苷。
經修飾或經化學修飾之核苷酸的實例包括5-甲氧羰基甲基-2-硫代尿苷、5-甲胺基甲基-2-硫代尿苷、5-胺甲醯基甲基尿苷、5-胺甲醯基甲基-2'-O-甲基尿苷、1-甲基-3-(3-胺基-3-羧丙基)假尿苷、5-甲胺基甲基-2-硒代尿苷、5-羧甲基尿苷、5-甲基二氫尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代尿苷、5-(異戊烯基胺甲基)尿苷、2'-O-甲基假尿苷、2-硫代-2'O-甲基尿苷和3,2'-O-二甲基尿苷。
經修飾或經化學修飾之核苷酸的實例包括N6-甲基腺苷、2-胺基腺苷、3-甲基腺苷、8-氮雜腺苷、7-脫氮雜腺苷、8-合氧基腺苷、8-溴腺苷、2-甲硫基-N6-甲基腺苷、N6-異戊烯基腺苷、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺苷、N6-(順式-羥基異戊烯基)腺苷、2-甲硫基-N6-(順式-羥基異戊烯基)腺苷、N6-甘胺醯胺甲醯基腺苷、N6-蘇胺醯基胺甲醯基-腺苷、N6-甲基-N6-蘇胺醯基胺甲醯基-腺苷、2-甲硫基-N6-蘇胺醯基胺甲醯基-腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、N6-羥基正戊基胺甲醯基腺苷、2-甲硫基-N6-羥基正纈胺醯基胺甲醯基-腺苷、N6-乙醯基-腺苷、7-甲基-腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、α-硫代腺苷、2'-O-甲基-腺苷、N6,2'-O-二甲基-腺苷、N6,N6,2'-O-三甲基-腺苷、1,2'-O-二甲基-腺苷、2'-O-核糖基腺苷、2-胺基-N6-甲基-嘌呤、1-硫代腺苷、2'-F-阿糖腺苷、2'-F-腺苷、2'-OH-阿糖腺苷和N6-(19-胺基-五氧雜十九烷基)-腺苷。
經修飾或經化學修飾之核苷酸的實例包括N1-烷基鳥苷、N2-烷基鳥苷、噻吩並鳥苷、7-去氮雜鳥苷、8-合氧基鳥苷、8-溴鳥苷、O6-烷基鳥苷、黃嘌呤核苷、肌苷和N1-烷基肌苷。
經修飾或經化學修飾之核苷酸的實例包括N1-甲基鳥苷、N2-甲基鳥苷、噻吩並鳥苷、7-去氮雜鳥苷、8-合氧基鳥苷、8-溴鳥苷、O6-甲基鳥苷、黃嘌呤核苷、肌苷和N1-甲基肌苷。
經修飾或經化學修飾之核苷酸的實例包括假尿苷。假尿苷之實例包括N1-烷基假尿苷、N1-環烷基假尿苷、N1-羥基假尿苷、N1-羥烷基假尿苷、N1-苯基假尿苷、N1-苯烷基假尿苷、N1-胺烷基假尿苷、N3-烷基假尿苷、N6-烷基假尿苷、N6-烷氧基假尿苷、N6-羥基假尿苷、N6-羥烷基假尿苷、N6-嗎啉代假尿苷、N6-苯基假尿苷和N6-鹵代假尿苷。假尿苷之實例包括：N1-烷基-N6-烷基假尿苷、N1-烷基-N6-烷氧基假尿苷、N1-烷基-N6-羥基假尿苷、N1-烷基-N6-羥烷基假尿苷、N1-烷基-N6-嗎啉代假尿苷、N1-烷基-N6-苯基假尿苷和N1-烷基-N6-鹵代假尿苷。在這些實例中，該烷基、環烷基和苯基取代基可為未經取代的，或進一步被烷基、鹵素、鹵代烷基、胺基或硝基取代基取代。
假尿苷之實例包括N1-甲基假尿苷(本文中亦稱為“N1MPU”)、N1-乙基假尿苷、N1-丙基假尿苷、N1-環丙基假尿苷、N1-苯基假尿苷、N1-胺甲基假尿苷、N3-甲基假尿苷、N1-羥基假尿苷和N1-羥甲基假尿苷。
核酸單體之實例包括經修飾和經化學修飾之核苷酸，包括本技藝已知之任何該等核苷酸。
經修飾和經化學修飾之核苷酸單體的實例包括本技藝已知之任何該等核苷酸，例如2'-O-甲基核糖核苷酸、2'-O-甲基嘌呤核苷酸、2'-去氧-2'-氟核糖核苷酸、2'-去氧-2'-氟嘧啶核苷酸、2'-去氧核糖核苷酸、2'-去氧嘌呤核苷酸、通用之鹼基核苷酸、5-C-甲基核苷酸和反向去氧鹼基殘基。
經修飾和經化學修飾之核苷酸單體的實例包括3'-端穩定化之核苷酸、3'-甘油核苷酸、3'-反向無鹼基核苷酸和3'-反向胸苷。
經修飾和經化學修飾之核苷酸單體的實例包括鎖核酸核苷酸(LNA)、2'-O,4'-C-伸甲基-(D-核糖呋喃糖基)核苷酸、2'-甲氧基乙氧基(MOE)核苷酸、2'-甲基-硫乙基、2'-去氧-2'-氟核苷酸和2'-O-甲基核苷酸。於示例性之實施態樣中，該經修飾之單體為鎖核酸核苷酸(LNA)。
經修飾和經化學修飾之核苷酸單體的實例包括2',4'-約束之2'-O-甲氧基乙基(cMOE)和2'-O-乙基(cEt)修飾之DNA。
經修飾和經化學修飾之核苷酸單體的實例包括2'-胺基核苷酸、2'-O-胺基核苷酸、2'-C-烯丙基核苷酸和2'-O-烯丙基核苷酸。
經修飾和經化學修飾之核苷酸單體的實例包括N6-甲基腺苷核苷酸。
經修飾和經化學修飾之核苷酸單體的實例包括具有經修飾之鹼基的核苷酸單體5-(3-胺基)丙基尿苷、5-(2-巰基)乙基尿苷、5-溴尿苷；8-溴鳥苷或7-脫氮雜腺苷。
經修飾和經化學修飾之核苷酸單體的實例包括2'-O-胺丙基取代之核苷酸。
經修飾和經化學修飾之核苷酸單體的實例包括以2'-R、2'-OR、2'-鹵素、2'-SR或2'-胺基取代核苷酸之2'-OH基團，其中R可為H、烷基、烯基或炔基。
上述鹼基修飾之實例可與核苷或核苷酸結構之其他修飾，包括糖修飾和鍵聯修飾組合。某些經修飾或經化學修飾之核苷酸單體可在自然界中找到。
較佳之核苷酸修飾包括N1-甲基假尿苷和5-甲氧基尿苷。 病毒複製蛋白和編碼彼之多核苷酸
於一些實施態樣中，本發明提供包含編碼一或多種病毒複製蛋白之第一多核苷酸的核酸分子。如本文所使用之術語“複製蛋白”或“病毒複製蛋白”係指在病毒基因組之複製中起作用之蛋白複合物的任何蛋白或任何蛋白亞單位。通常，病毒複製蛋白為非結構蛋白。由本發明提供之核酸分子編碼的病毒複製蛋白可在任何病毒基因組的複製中起作用。病毒基因組可為單股正義RNA基因組、單股反義RNA基因組、雙股RNA基因組、單股正義DNA基因組、單股反義DNA基因組或雙股DNA基因組。病毒基因組可包括單一核酸分子或一個以上之核酸分子。本發明提供之核酸分子可編碼來自任何病毒或病毒科，例如，包括動物病毒和植物病毒之一或多種病毒複製蛋白。由包含在本發明提供之核酸分子中的第一多核苷酸編碼的病毒複製蛋白可從自我複製RNA表現出。
本發明提供之核酸分子的第一多核苷酸序列可編碼一或多種披衣病毒(togavirus)複製蛋白。於一些態樣中，由本發明提供之核酸分子的第一多核苷酸編碼的一或多種病毒複製蛋白為α病毒蛋白。於一些實施態樣中，由本發明提供之核酸分子的第一多核苷酸編碼的一或多種病毒複製蛋白為風疹病毒蛋白。本發明提供之核酸分子的第一多核苷酸序列可編碼任何α病毒複製蛋白和風疹病毒複製蛋白。來自α病毒之示例性複製蛋白包括來自下列病毒之蛋白質：委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)、東方馬腦炎病毒(EEEV)、大沼澤地病毒(EVEV)、穆坎布病毒(MUCV)、塞姆利基森林病毒(SFV)、皮克孫納病毒(PIXV)、米德堡病毒(MIDV)、屈公病毒(CHIKV)、歐尼恩病毒(ONNV)、羅斯河病毒(RRV)、巴馬森林病毒(BFV)、蓋他病毒(GETV)、鷺山病毒(SAGV)、貝巴魯病毒(BEBV)、馬雅羅病毒(MAYV)、烏納病毒(UNAV)、辛德畢斯病毒(SINV)、奧拉病毒(AURAV)、沃達羅病毒(WHAV)、巴班奇病毒(BABV)、庫孜拉加奇病毒(KYZV)、西方馬腦炎病毒(WEEV)、高地J病毒(HJV)、摩根堡病毒(FMV)、恩杜姆病毒(NDUV)、鮭魚α病毒(SAV)或博吉溪病毒(BCRV)及彼等之任何組合。示例性風疹病毒複製蛋白包括來自風疹病毒之蛋白質。
由本發明提供之核酸分子的第一多核苷酸編碼之病毒複製蛋白可以一或多個多蛋白或以分開或單一蛋白質形式表現。通常，多蛋白為裂解後產生個別或分開之蛋白質的先驅蛋白。因此，源自先驅多蛋白之蛋白質可從單一開放閱讀框(ORF)表現。如本文所使用之術語“ORF”係指從起始密碼子(通常為ATG)開始且結束於終止密碼子(例如，諸如TAA、TAG或TGA)的核苷酸序列。將可理解的是，T存在於DNA中，而U存在於RNA中。因此，DNA中之ATG起始密碼子對應於RNA中之AUG，而DNA中之終止密碼子TAA、TAG和TGA對應於RNA中之UAA、UAG和UGA。將可進一步理解的是，在本揭示內容中提供之任何序列中，T存在於DNA中，而U存在於RNA中。因此，在本發明提供之任何序列方面，存在於DNA中之T被用於RNA分子之U取代，而存在於RNA中之U被用於DNA分子之T取代。
裂解多蛋白之蛋白酶可為病毒蛋白酶或細胞蛋白酶。於一些態樣中，本發明提供之核酸分子的第一多核苷酸編碼包含α病毒nsP1蛋白、α病毒nsP2蛋白、α病毒nsP3蛋白、α病毒nsP4蛋白或彼等之任何組合的多蛋白。於其他態樣中，本發明提供之核酸分子的第一多核苷酸編碼包含α病毒nsP1蛋白、α病毒nsP2蛋白、α病毒nsP3蛋白或彼等之任何組合，以及α病毒nsP4蛋白之多蛋白。於一些態樣中，該多蛋白為VEEV多蛋白。於其他態樣中，該α病毒nsP1、nsP2、nsP3和nsP4蛋白為VEEV蛋白。
於一態樣中，本發明提供之核酸分子的第一多核苷酸缺乏介於編碼nsP3蛋白的序列與nsP4蛋白的序列之間的終止密碼子。因此，於一些態樣中，本發明提供之核酸分子的第一多核苷酸編碼包含nsP1、nsP2、nsP3和nsP4之P1234多蛋白。本發明提供之核酸分子的第一多核苷酸亦可包含介於編碼nsP3蛋白的序列與nsP4蛋白的序列之間的終止密碼子。因此，於一些態樣中，本發明提供之核酸分子的第一多核苷酸編碼，例如包含nsP1、nsP2和nsP3之P123多蛋白和包含nsP1、nsP2、nsP3和nsP4之P1234多蛋白(為終止密碼子通讀之結果)。於其他態樣中，本發明提供之核酸分子的第一多核苷酸編碼與SEQ ID NO：79之序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少97.5%、至少98%、至少98.5%、至少99%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%、至少99.9%，以及彼等之間的任何數目或範圍的同一性之多蛋白。於一些實施態樣中，本發明提供之核酸分子的第一多核苷酸編碼具有SEQ ID NO：79之序列的多蛋白。其他示例性多蛋白包含SEQ ID NO：80或SEQ ID NO：81之序列。於一態樣中，nsP2和nsP3蛋白包括突變。示例性突變包括VEEV蛋白之G1309R和S1583G突變。於另一態樣中，該nsP1、nsP2、和nsP4蛋白為VEEV蛋白，且該nsP3蛋白為屈公病毒(CHIKV)nsP3蛋白。
於一些態樣中，本發明提供之核酸分子的第一多核苷酸可包括第一基因間區。於一些態樣中，該第一基因間區係位於編碼包含α病毒nsP1蛋白、α病毒nsP2蛋白、α病毒nsP3蛋白或彼等之任何組合之多蛋白的序列與編碼α病毒nsP4的序列之間。第一基因間區可包含任何序列，諸如任何病毒或非病毒序列。於一態樣中，該第一基因間區包含病毒序列。於另一態樣中，該第一基因間區包含α病毒序列。再於另一態樣中，該α病毒為VEEV。於一態樣中，nsP2和nsP3蛋白包括突變。示例性突變包括VEEV蛋白之G1309R和S1583G突變。於另一態樣中，該nsP1、nsP2和nsP4蛋白為VEEV蛋白，且該nsP3蛋白為屈公病毒(CHIKV)nsP3蛋白。
於一些實施態樣中，該第一多核苷酸可包含與SEQ ID NO：72之序列具有至少80%同一性的序列。
於一些實施態樣中，本文所描述之核酸分子可進一步包含第二多核苷酸，該第二多核苷酸包含編碼第一抗原蛋白或其片段之第一轉基因，其中該第一抗原蛋白為冠狀病毒蛋白。於特定之實施態樣中，該抗原蛋白可為SARS-CoV-2蛋白。於特定之實施態樣中，該抗原蛋白為SARS-CoV-2刺突糖蛋白。於特定之實施態樣中，該SARS-CoV-2刺突糖蛋白為具有SEQ ID NO：123之胺基酸序列的野生型SARS-CoV-2刺突糖蛋白。
於一些實施態樣中，該第二多核苷酸包含與SEQ ID NO：121或SEQ ID NO：122之序列具有至少85%同一性的序列。 5' 非轉譯區 (5'UTR)
本發明提供之核酸分子可進一步包含非轉譯區(UTR)。非轉譯區，包括，例如5' UTR和3' UTR，可影響RNA穩定性和/或RNA轉譯之效率，例如，諸如細胞和病毒mRNA之轉譯。5'UTR和3'UTR亦可影響病毒基因組RNA和自我複製RNA(包括源自病毒之自我複製RNA或複製子)之穩定性和轉譯。其穩定性和/或轉譯效率可能被5'UTR和3'UTR影響之示例性病毒基因組RNA包括正義RNA病毒之基因組核酸。正義RNA病毒的基因組核酸和自我複製RNA(包括源自病毒之自我複製RNA或複製子)二者可在感染或引入細胞中時被轉譯。
於一些態樣中，本發明提供之核酸分子進一步包括5'非轉譯區(5'UTR)。本發明提供之核酸分子中可包括任何5'UTR序列。於一些實施態樣中，本發明提供之核酸分子包括病毒5'UTR。於一態樣中，本發明提供之核酸分子包括非病毒5'UTR。本發明提供之核酸分子中可包括任何非病毒性5'UTR，諸如表現在任何細胞或器官(包括肌肉、皮膚、皮下組織、肝、脾、淋巴結、抗原呈遞細胞，等)中之轉錄子的5'UTR。於另一態樣中，本發明提供之核酸分子包括包含病毒和非病毒序列之5 'UTR。因此，包括在本發明提供之核酸分子中的5'UTR可包括病毒和非病毒5'UTR序列之組合。於一些態樣中，包括在本發明提供之核酸分子中的5'UTR係位於編碼一或多種病毒複製蛋白之第一多核苷酸的上游或5'。於其他態樣中，該5'UTR係位於本發明提供之編碼一或多種病毒複製蛋白的核酸分子之第一多核苷酸的5'或上游，且該第一多核苷酸係位於本發明提供之核酸分子的第二多核苷酸之5'或上游。
於一態樣中，本發明提供之核酸分子的5'UTR包含α病毒5'UTR。本發明提供之核酸分子可包括來自任何α病毒之5'UTR，包括來自下列病毒之5'UTR序列：委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)、東方馬腦炎病毒(EEEV)、大沼澤地病毒(EVEV)、穆坎布病毒(MUCV)、塞姆利基森林病毒(SFV)、皮克孫納病毒(PIXV)、米德堡病毒(MIDV)、屈公病毒(CHIKV)、歐尼恩病毒(ONNV)、羅斯河病毒(RRV)、巴馬森林病毒(BFV)、蓋他病毒(GETV)、鷺山病毒(SAGV)、貝巴魯病毒(BEBV)、馬雅羅病毒(MAYV)、烏納病毒(UNAV)、辛德畢斯病毒(SINV)、奧拉病毒(AURAV)、沃達羅病毒(WHAV)、巴班奇病毒(BABV)、庫孜拉加奇病毒(KYZV)、西方馬腦炎病毒(WEEV)、高地J病毒(HJV)、摩根堡病毒(FMV)、恩杜姆病毒(NDUV)、鮭魚α病毒(SAV)或博吉溪病毒(BCRV)。再於另一態樣中，該5'UTR包含與SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74或SEQ ID NO：75之序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少97.5%、至少98%、至少98.5%、至少99%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%、至少99.9%，以及其間之任何數目或範圍的同一性之序列。再於另一態樣中，該5'UTR包含SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74或SEQ ID NO：75之序列。
於一些實施態樣中，該5'UTR包含選自下列群組之5'UTR的序列：人IL-6、丙胺酸胺基轉移酶1、人載脂蛋白E、人纖維蛋白原α鏈、人轉甲狀腺素蛋白(transthyretin)、人結合球蛋白(haptoglobin)、人α-1-抗胰凝乳蛋白酶、人抗凝血酶、人α-1-抗胰蛋白酶、人白蛋白、人β球蛋白、人補體C3、人補體C5、SynK(源自藍細菌、集胞藻屬之類囊體(thylakoid)鉀道蛋白)、小鼠β球蛋白、小鼠白蛋白和煙草蝕刻病毒，或前述任一者之片段。較佳地，該5'UTR係源自煙草蝕刻病毒(TEV)。較佳地，本文所描述之mRNA包含源自由擬南芥(arabidopsis thaliana)表現之基因的5'UTR序列。較佳地，該由擬南芥表現之基因的5'UTR序列為AT1G58420。5'UTR和3'UTR之實例描述於PCT/US2018/035419中，其內容以引用方式併入本文。較佳地，5'UTR序列包含如表1中所示之SEQ ID NO：5至10和SEQ ID NO：25至45。
Figure 02_image033
Figure 02_image035
3' 非轉譯區 (3'UTR)
於一些態樣中，本發明提供之核酸分子進一步包括3'非轉譯區(3'UTR)。本發明提供之核酸分子中可包括任何3'UTR序列。於一態樣中，本發明提供之核酸分子包括病毒3'UTR。於另一態樣中，本發明提供之核酸分子包括非病毒3'UTR。本發明提供之核酸分子中可包含任何非病毒3'UTR，諸如表現在任何細胞或器官(包括肌肉、皮膚、皮下組織、肝、脾、淋巴結、抗原呈遞細胞，等)中之轉錄子的3'UTR。於一些態樣中，本發明提供之核酸分子包括包含病毒和非病毒序列之3'UTR。因此，包含在本發明提供之核酸分子中的3'UTR可包含病毒和非病毒3'UTR序列之組合。於一態樣中，該3'UTR係位於本發明提供之核酸分子的第二多核苷酸之3'或下游，該第二多核苷酸包含編碼第一抗原蛋白或其片段之第一轉基因。於另一態樣中，該3'UTR係位於本發明提供之核酸分子的第二多核苷酸之3'或下游，該第二多核苷酸包含編碼第一抗原蛋白或其片段之第一轉基因，且該第二多核苷酸係位於本發明提供之核酸分子的第一多核苷酸之3'或下游。
於一態樣中，本發明提供之核酸分子的3'UTR包含α病毒3'UTR。本發明提供之核酸分子可包括來自任何α病毒之3'UTR，包括來自委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)、東方馬腦炎病毒(EEEV)、大沼澤地病毒(EVEV)、穆坎布病毒(MUCV)、塞姆利基森林病毒(SFV)、皮克孫納病毒(PIXV)、米德堡病毒(MIDV)、屈公病毒(CHIKV)、歐尼恩病毒(ONNV)、羅斯河病毒(RRV)、巴馬森林病毒(BFV)、蓋他病毒(GETV)、鷺山病毒(SAGV)、貝巴魯病毒(BEBV)、馬雅羅病毒(MAYV)、烏納病毒(UNAV)、辛德畢斯病毒(SINV)、奧拉病毒(AURAV)、沃達羅病毒(WHAV)、巴班奇病毒(BABV)、庫孜拉加奇病毒(KYZV)、西方馬腦炎病毒(WEEV)、高地J病毒(HJV)、摩根堡病毒(FMV)、恩杜姆病毒(NDUV)、鮭魚α病毒(SAV)或博吉溪病毒(BCRV)之3'UTR序列。於另一態樣中，該3'UTR包含與SEQ ID NO：76之序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少97.5%、至少98%、至少98.5%、至少99%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8、至少99.9%以及其間之任何數目或範圍的同一性之序列。於另一態樣中，該3'UTR包含聚A序列。於進一步之態樣中，該3'UTR包含SEQ ID NO：76之序列。
於一些實施態樣中，該3'UTR包含選自下列群組之3'UTR：丙胺酸胺基轉移酶1、人載脂蛋白E、人纖維蛋白原α鏈、人結合球蛋白、人抗凝血酶、人α球蛋白、人β球蛋白、人補體C3、人生長因子、人鐵調素(hepcidin)、MALAT-1、小鼠β球蛋白、小鼠白蛋白和非洲爪蟾(Xenopus)β球蛋白，或前述任一者之片段。於一些實施態樣中，該3'UTR係源自非洲爪蟾β球蛋白。示例性3'UTR序列包括如表2中所示之SEQ ID NO：16至22。
Figure 02_image037
三個一組之終止密碼子
於一些實施態樣中，該自我複製RNA可包含緊接在產生三個一組之終止密碼子之編碼區(即，ORF)的下游之序列。該三個一組之終止密碼子為具有三個連續終止密碼子之序列。該三個一組之終止密碼子可確保表現匣之完全絕緣且可併入以增強轉譯之效率。於一些實施態樣中，本發明之自我複製RNA可包含緊接在本文所描述之ORF的下游之序列UAG、UGA或UAA中任一者之三個一組的組合。該三個一組之組合可為三個相同的密碼子、三個不同的密碼子或該三個終止密碼子之任何其他排列。 轉譯增強子和Kozak序列
在轉譯起始方面，核醣體和mRNA之間必須建立適當之交互作用以決定該轉譯起始區之確切位置。然而，核醣體亦必須從該轉譯起始區解離，以在mRNA轉譯過程中滑向下游序列。mRNA起始序列上游之轉譯增強子可增進蛋白質生物合成之產量。幾項研究已調查轉譯增強子之效果。於一些實施態樣中，本文所描述之mRNA包含轉譯增強子序列。這些轉譯增強子序列增強本發明之自我複製RNA的轉譯效率，從而增加由該mRNA編碼之蛋白質的產量。該轉譯增強子區可位於mRNA序列之5'或3'UTR中。轉譯增強子區之實例包括來自TEV 5'UTR和非洲爪蟾β-球蛋白3'UTR之天然增強子區。示例性5'UTR增強子序列包括，但不限於源自編碼人熱休克蛋白(HSP)之mRNA者，該人熱休克蛋白(HSP)包括HSP70-P2、HSP70-M1、HSP72-M2、HSP17.9和HSP70-P1。如表3所示，根據本發明之實施態樣所使用的較佳轉譯增強子序列係由表3中所示之SEQ ID No：11至15代表。
Figure 02_image039
於一些實施態樣中，本發明之自我複製RNA包含Kozak序列。如本技藝中所理解者，Kozak序列為圍繞真核mRNA之轉譯起始位點的短共有序列，其允許mRNA轉譯之有效起始。參見，例如Kozak, Marilyn(1988)Mol. and Cell Biol, 8：2737-2744；Kozak, Marilyn(1991)J. Biol. Chem, 266：19867-19870；Kozak, Marilyn(1990)Proc Natl. Acad. Sci. USA, 87：8301-8305；和Kozak, Marilyn(1989)J. Cell Biol, 108：229-241。其確保從介導核醣體組裝和轉譯起始之遺傳信息正確轉譯蛋白質。該核醣體轉譯機制可在Kozak序列之背景下識別AUG起始密碼子。Kozak序列可插入用於所欲蛋白質之編碼序列的上游、5'UTR之下游，或插入用於所欲蛋白質之編碼序列的上游和5'UTR之下游。於一些實施態樣中，本文所描述之自我複製RNA包含具有胺基酸序列GCCACC(SEQ ID NO：23)之Kozak序列。較佳地，本文所描述之自我複製RNA包含具有胺基酸序列GCCA(SEQ ID NO：24)之部分Kozak序列“p”。 轉基因
包括在本發明提供之核酸分子中的轉基因可編碼抗原蛋白或其片段。於一些實施態樣中，本發明提供之核酸分子的第二多核苷酸包含第一轉基因。包括在本發明提供之核酸分子的第二多核苷酸中之第一轉基因可編碼第一抗原蛋白或其片段。包括在本發明提供之核酸分子的第二多核苷酸中之轉基因可包含編碼抗原蛋白之的完整胺基酸序列的序列或編碼抗原蛋白之完整胺基酸序列的任何合適部分或片段之序列。於一些實施態樣中，該抗原蛋白為冠狀病毒蛋白。
於另一實施態樣中，當對哺乳動物個體投予該抗原蛋白時，該抗原蛋白可引起針對病原體，例如冠狀病毒之免疫反應。於一些更特定之實施態樣中，該抗原蛋白係表現在冠狀病毒之外表面；而於其他更特定之實施態樣中，該抗原可為非表面抗原，例如可作為T細胞表位。該免疫原可引起針對冠狀病毒之免疫反應。該免疫反應可包含抗體反應(通常包括IgG)和/或由細胞介導之免疫反應。該多肽免疫原通常將會引起識別該對應之冠狀病毒的免疫反應。該免疫原通常將為表面多肽，例如外套糖蛋白、刺突糖蛋白，等。
於一些態樣中，該由包括在本發明提供之核酸分子中的轉基因編碼之病毒蛋白為冠狀病毒蛋白。於一些實施態樣中，該抗原蛋白為SARS-CoV-2蛋白。
於一態樣中，該抗原蛋白為SARS-CoV-2刺突糖蛋白或其片段。於另一態樣中，該SARS-CoV-2刺突糖蛋白為野生型SARS-CoV-2刺突糖蛋白。於一些態樣中，該野生型SARS-CoV-2刺突糖蛋白具有SEQ ID NO：123之胺基酸序列。再於另一態樣中，本發明提供之核酸分子的第二多核苷酸包含與SEQ ID NO：121或SEQ ID NO：122之序列具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少97.5%、至少98%、至少98.5%、至少99%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%、至少99.9%以及其間之任何數目或範圍之同一性的序列。於另一態樣中，本發明提供之核酸分子的第二多核苷酸包含SEQ ID NO：121或SEQ ID NO：122之序列。因此，於一些態樣中，包括在本發明提供之核酸分子的第二多核苷酸中之第一轉基因包含與SEQ ID NO：121或SEQ ID NO：122之序列具有至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少97.5%，至少98%，至少98.5%，至少99%，至少99.5%，至少99.6%，至少99.7、至少99.8%，至少99.9%、以及其間之任何數目或範圍、或100%之同一性的序列。
於一態樣中，本發明提供之核酸分子的第二多核苷酸編碼野生型SARS-CoV-2刺突糖蛋白或其片段。於一些態樣中，野生型SARS-CoV-2刺突糖蛋白包含SEQ ID NO：123之序列。於另一態樣中，本發明提供之核酸分子的第二多核苷酸編碼SARS-CoV-2刺突糖蛋白，該SARS-CoV-2刺突糖蛋白與野生型SARS-CoV-2刺突糖蛋白序列相比較下包含一或多個突變。突變可包括替代、缺失、插入，等。突變可存在於SARS-CoV-2刺突糖蛋白之任意位置或位置之任意組合。SARS-CoV-2刺突糖蛋白之任何一或多個位置處可存在任何數目之取代、插入、缺失或彼等之組合。例如，取代可包括在任何位置或任何位置組合處之野生型胺基酸改變成任何其他胺基酸或任何其他胺基酸之組合。示例性突變包括在位置614、936、320、477、986、987、或彼等之任意組合之位置處的突變。於一態樣中，由包括在本發明提供之核酸分子中的第二多核苷酸之轉基因編碼的SARS-CoV-2刺突糖蛋白或其片段包括D614G突變、D936Y突變、D936H突變、V320G突變、S477N突變、S477I突變、S477T突變、K986P突變、V987P突變或彼等之任何組合。其他突變和變體可在中國科學院中國國家生物信息中心/北京基因組研究所國家基因組學數據中心，國家生物信息中心2019年新型冠狀病毒信息數據庫(2019nCoVR)中找到，網址為bigd.big.ac.cn/ncov/ variation/annotation。於另一態樣中，該第二多核苷酸包含編碼SARS-CoV-2糖蛋白之轉基因，該SARS-CoV-2糖蛋白與SEQ ID NO：123之序列具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少97.5%、至少98%、至少98.5%、至少99%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%、至少99.9%，以及其間之任何數目或範圍、或100%之同一性。
於一些態樣中，本發明提供之核酸分子的第二多核苷酸包含至少二個轉基因，諸如第二冠狀病毒蛋白。本發明提供之核酸分子的第二多核苷酸中可包含任何數目之轉基因，諸如一、二、三、四、五、六、七、八、九、十或更多個轉基因。於一態樣中，本發明提供之核酸分子的第二多核苷酸包括編碼第二抗原蛋白或其片段或免疫調節蛋白之第二轉基因。於一態樣中，該第二多核苷酸進一步包含位於轉基因之間的內部核醣體進入位點(IRES)、編碼2A肽之序列或彼等之組合。如本文所使用之術語“2A肽”係指小(通常為18至22個胺基酸)序列，其允許透過2A肽序列內之核醣體跳躍事件在單一閱讀框中有效、化學計量地產製離散蛋白質產物。如本文所使用之術語“內部核醣體進入位點”或“IRES”係指核苷酸序列，其允許在無AUG起始密碼子存在或不使用AUG起始密碼子之情況下啟動信使RNA(mRNA)序列之蛋白質轉譯。IRES可在mRNA序列中之任何地方找到，諸如在，例如在mRNA序列之開始處或其附近、中間處或其附近，或終端處或其附近。
包含在本發明提供之核酸分子的第二多核苷酸中的任何數目之轉基因可經由2A肽和IRES序列之任何組合表現。例如，位於第一轉基因之3'的第二轉基因可經由2A肽序列或經由IRES序列表現。另一實例為位於第一轉基因之3'的第二轉基因和位於第二轉基因之3'的第三轉基因可經由位於第一和第二轉基因之間，及第二和第三轉基因之間的2A肽序列表現、經由位於第一和第二轉基因之間，以及第二和第三轉基因之間的IRES序列表現、經由位於第一和第二轉基因之間的2A肽序列及位於第二和第三轉基因之間的IRES序列表現、或經由位於第一和第二轉基因之間的IRES序列及位於第二和第三轉基因之間的2A肽序列表現。位於轉基因之間的類似結構和2A肽和IRES序列之組合預期用於包含在本發明提供之核酸分子的第二多核苷酸中之任何數目的轉基因。除了經由2A肽和IRES序列表現之外，包括在本發明提供之核酸分子中之二或更多個轉基因亦可從單獨之亞基因組RNA表現。
包括在本發明提供之核酸分子之第二多核苷酸中的第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十，等轉基因可編碼免疫調節蛋白或其功能性片段或功能性變體。包括在第二多核苷酸中之轉基因可編碼任何免疫調節蛋白或其功能性片段或功能性變體。
如本文所使用之術語“功能性變體”或“功能性片段”係指包括，例如核酸或蛋白質之分子，該分子包含與親本或參考分子之核苷酸和/或胺基酸序列相比較，被一或多個核苷酸和/或胺基酸改變之核苷酸和/或胺基酸序列。在蛋白質方面，功能性變體仍然能夠以類似於親本分子之方式運作。換言之，該親本分子之胺基酸和/或核苷酸序列中之修飾不會顯著影響或改變由該核苷酸序列編碼之分子或由或含有該胺基酸序列之分子的功能特性。該功能性變體可具有保守性序列修飾，包括核苷酸和胺基酸取代、添加和缺失。這些修飾可藉由本技藝已知之標準技術引入，諸如定點誘變和隨機性由PCR介導之誘變。功能性變體亦可包括，但不限於在初級結構序列上基本相似，但含有，例如在親本分子中未發現之體外或體內，化學和/或生化修飾之衍生物。該等修飾包括，尤其是乙醯化、醯化、ADP-核糖基化、醯胺化、黃素之共價連接、血紅素部分之共價連接、核苷酸或核苷酸衍生物之共價連接、脂質或脂質衍生物之共價連接、磷脂醯肌醇之共價連接、交聯、環化、二硫鍵形成、去甲基化、共價交聯之形成、半胱胺酸之形成、焦麩胺酸之形成、甲醯化、γ-羧基化、糖基化、GPI錨形成、羥基化、碘化、甲基化、肉荳蔻醯基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、異戊烯基化、外消旋化、硒醯基化、硫酸化、由連轉RNA介導之在蛋白質添加胺基酸，諸如精胺醯化、泛素化，等。
於一態樣中，包含在本發明提供之核酸分子的第二多核苷酸中之第二轉基因編碼細胞因子、趨化素或介白素。示例性細胞因子包括干擾素、TNF-α、TGF-β、G-CSF和GM-CSF。示例性趨化素包括CCL3、CCL26和CXCL7。示例性介白素包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和IL-23。編碼任何細胞因子、趨化素、介白素或彼等之組合的任何轉基因或轉基因之組合均可包括在本發明提供之核酸分子的第二多核苷酸中。
於一些實施態樣中，該第二轉基因編碼第二冠狀病毒蛋白。 DNA 和 RNA 分子
本發明提供之核酸分子可為DNA分子或RNA分子。可理解的是，存在於DNA中之T被RNA中之U取代，反之亦然。於一態樣中，本發明提供之核酸分子為DNA分子。於另一態樣中，本發明提供之DNA分子進一步包含啟動子。如本文所使用之術語“啟動子”係指啟動轉錄之調控序列。啟動子可為可操作地連接本發明提供之核酸分子的第一和第二多核苷酸。通常，包含在本發明提供之DNA分子中的啟動子包括用於體外轉錄(IVT)之啟動子。用於體外轉錄之任何合適的啟動子均可包含在本發明提供之DNA分子中，諸如T7啟動子、T3啟動子、SP6啟動子，等。於一態樣中，本發明提供之DNA分子包含T7啟動子。於另一態樣中，該啟動子位於包括在本發明提供之DNA分子中之5'UTR的5'。再於另一態樣中，該啟動子為位於包括在本發明提供之DNA分子中之5'UTR的5'之T7啟動子。再於另一態樣中，該啟動子與5'UTR重疊。啟動子和5'UTR可重疊約一個核苷酸、約2個核苷酸、約3個核苷酸、約4個核苷酸、約5個核苷酸、約6個核苷酸、約7個核苷酸、約8個核苷酸、約9個核苷酸、約10個核苷酸、約11個核苷酸、約12個核苷酸、約13個核苷酸、約14個核苷酸、約15個核苷酸、約16個核苷酸、約17個核苷酸、約18個核苷酸、約19個核苷酸、約20個核苷酸、約21個核苷酸、約22個核苷酸、約23個核苷酸、約24個核苷酸、約25個核苷酸、約26個核苷酸、約27個核苷酸、約28個核苷酸、約29個核苷酸、約30個核苷酸、約31個核苷酸、約32個核苷酸、約33個核苷酸、約34個核苷酸、約35個核苷酸、約36個核苷酸、約37個核苷酸、約38個核苷酸、約39個核苷酸、約40個核苷酸、約41個核苷酸、約42個核苷酸、約43個核苷酸、約44個核苷酸、約45個核苷酸、約46個核苷酸、約47個核苷酸、約48個核苷酸、約49個核苷酸、約50個核苷酸或更多個核苷酸。
於一些態樣中，本發明提供之DNA分子包括用於體內轉錄之啟動子。通常，用於體內轉錄之啟動子為RNA聚合酶II(RNA pol II)啟動子。任何RNA pol II啟動子均可包括在本發明提供之DNA分子中，包括組成型啟動子、誘導型啟動子和組織特異性啟動子。示例性組成型啟動子包括巨細胞病毒(CMV)啟動子、EF1 α啟動子、SV40啟動子、PGK1啟動子、Ubc啟動子、人β肌動蛋白啟動子、CAG啟動子，等。任何組織特異性啟動子均可包含在本發明提供之DNA分子中。於一態樣中，該RNA pol II啟動子為肌肉特異性啟動子、皮膚特異性啟動子、皮下組織特異性啟動子、肝特異性啟動子、脾臟特異性啟動子、淋巴結特異性啟動子或具有任何其他組織特異性之啟動子。本發明提供之DNA分子亦可包括增強子。本發明提供之DNA分子可包括任何增加轉錄之增強子。
於一些態樣中，本發明提供之核酸分子為RNA分子。本發明提供之RNA分子可藉由本發明提供之DNA分子的體外轉錄(IVT)產生。於一態樣中，本發明提供之RNA分子為自我複製RNA分子。於另一態樣中，本發明提供之RNA分子進一步包含5'帽。任何5'帽均可包括在本發明提供之RNA分子中，包括具有Cap 1結構、Cap 1(m6A)結構、Cap 2結構、Cap 0結構或彼等之任何組合的5'帽。於一態樣中，本發明提供之RNA分子包括具有Cap 1結構之5'帽。再於另一態樣中，本發明提供之RNA分子為包含具有Cap 1結構之5'帽的自我複製RNA分子。於進一步之態樣中，本發明提供之RNA分子包含具有Cap 1結構之帽，其中m7G係經由5'-5'三磷酸化物與5'UTR之5'端連接。於另一進一步之態樣中，本發明提供之RNA分子包含具有Cap 1結構之帽，其中m7G係經由5'-5'三磷酸化物與包含SEQ ID NO：73之序列的5'UTR之5'端連接。可使用任何加帽方法，包括，但不限於使用牛痘加帽酶(New England Biolabs, Ipswich, Mass.)，在體外轉錄(IVT)開始時或開始後不久藉由，例如包括加帽劑作為體外轉錄(IVT)反應之一部分進行共轉錄加帽或加帽。(Nuc. Acids Symp. (2009)53：129)。
於一些實施態樣中，本發明提供核酸分子，其包含(a)SEQ ID NO：10之序列；(b)SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：76和SEQ ID NO：77之序列，其中T被U取代；(c)SEQ ID NO：124之序列；(d)SEQ ID NO：124之序列，其中T被U取代；(e)SEQ ID NO：125之序列；(f)SEQ ID NO：125之序列，其中T被U取代。於一態樣中，本發明提供之核酸分子為RNA分子。於另一態樣中，本發明提供之RNA分子進一步包含具有Cap 1結構之5'帽。本發明提供之任何RNA分子均可為自我複製RNA分子。
只有那些帶有Cap結構之mRNA在Cap依賴性轉譯中才有活性。mRNA之“脫帽”導致其在合成蛋白質方面之模板活性幾乎完全喪失(Nature, 255：33-37,(1975)； J. Biol. Chem., vol. 253：5228-5231,(1978)；and Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72：1189-1193,(1975))。
真核mRNA之另一要素為在轉錄子位置1(Cap 1)，且在某些情況下，在轉錄子位置1和2(Cap 2)存在2'-O-甲基核苷殘基。mRNA之2'-O-甲基化提供較高之體內mRNA轉譯效力(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：3952-3956 (1980))，且進一步改善5'-加帽之mRNA的核酸酶穩定性。該帶有Cap 1(和Cap 2)之mRNA為令細胞識別出真正之mRNA 5'端的獨特標記，且在某些情況下，用於區分源自傳染性遺傳元件之轉錄子(Nucleic Acid Research 43：482-492(2015))。
WO2015/051169A2、WO/2015/061491、US 2018/0273576和美國專利案8,093,367、8,304,529號和US 10,487,105中提出具有5'帽結構的一些實例和用於製備包含彼之mRNA的方法。於一些實施態樣中，該5'帽為本技藝已知之m7GpppAmpG。於一些實施態樣中，該5'帽為本技藝已知之m7GpppG或m7GpppGm。下文中提供具有5'帽結構之實施態樣的結構式。
於一些實施態樣中，本發明之自我複製RNA包含具有式(Cap I)之結構的5'帽。
Figure 02_image041
其中B1 為天然或經修飾之核鹼基；R1 和R2 各自獨立地選自鹵素、OH和OCH3 ；各L係獨立選自由磷酸酯、硫代磷酸酯和硼烷磷酸酯組成之群組，其中各L係藉由二酯鍵連接；n為0或1，且mRNA代表連接其5'端之本發明的mRNA。於一些實施態樣中，B1 為G、m7 G或A。於一些實施態樣中，n為0。於一些實施態樣中，n為1。於一些實施態樣中，B1 為A或m6 A且R1 為OCH3 ；其中G為鳥嘌呤，m7 G為7-甲基鳥嘌呤，A為腺嘌呤，且m6 A為N6 -甲基腺嘌呤。
於一些實施態樣中，本發明之自我複製RNA包含具有式(Cap II)之結構的5'帽。
Figure 02_image043
其中B1 和B2 各自獨立為天然或經修飾之核鹼基；R1 、R2 和R3 各自獨立地選自鹵素、OH和OCH3 ；各L係獨立選自由磷酸酯、硫代磷酸酯和硼烷磷酸酯組成之群組，其中各L係藉由二酯鍵連接；mRNA代表連接其5'端之本發明的mRNA，且n為0或1。於一些實施態樣中，B1 為G、m7 G或A。於一些實施態樣中，n為0。於一些實施態樣中，n為1。於一些實施態樣中，B1 為A或m6 A且R1 為OCH3 ；其中G為鳥嘌呤，m7 G為7-甲基鳥嘌呤，A為腺嘌呤，且m6 A為N6 -甲基腺嘌呤。
於一些實施態樣中，本發明之自我複製RNA包含具有式(Cap III)之結構的5'帽。
Figure 02_image045
其中B1、B2和B3各自獨立為天然或經修飾之核鹼基；R1、R2、R3和R4各自獨立地選自鹵素、OH和OCH3 ；各L係獨立選自由磷酸酯、硫代磷酸酯和硼烷磷酸酯組成之群組，其中各L係藉由二酯鍵連接；mRNA代表連接其5'端之本發明之mRNA；且n為0或1。於一些實施態樣中，R1、R2、R3和R4中至少一者為OH。於一些實施態樣中，B1為G、m7 G或A。於一些實施態樣中，B1 為A或m6 A且R1為OCH3 ；其中G為鳥嘌呤，m7 G為7-甲基鳥嘌呤，A為腺嘌呤，且m6 A為N6-甲基腺嘌呤。於一些實施態樣中，n為1。
於一些實施態樣中，本揭示內容之自複製的RNA包含具有式(Cap IV)之結構的m7GpppG 5'帽類似物。
Figure 02_image047
其中，R1 、R2 和R3 各自獨立地選自鹵素、OH和OCH3 ；各L係獨立選自由磷酸酯、硫代磷酸酯和硼烷磷酸酯所組成之群組，其中各L係藉由二酯鍵連接；mRNA代表連接其5'端之本發明的mRNA；n為0或1。於一些實施態樣中，R1 、R2 和R3 中至少一者為OH。於一些實施態樣中，該5'帽為m7 GpppG，其中R1 、R2 和R3 各為OH，n為1，且各L為磷酸化物。於一些實施態樣中，n為1。於一些實施態樣中，該5'帽為m7GpppGm，其中R1 和R2 各為OH，R3 為OCH3 ，各L為磷酸化物，mRNA為連接其5'端之編碼具有OTC活性之酶的mRNA，且n為1。
於一些實施態樣中，本發明之自我複製RNA包含具有式(Cap V)之結構的m7Gpppm7G 5'帽類似物。
Figure 02_image049
其中，R1 、R2 和R3 各自獨立地選自鹵素、OH和OCH3 ；各L係獨立選自由磷酸酯、硫代磷酸酯和硼烷磷酸酯所組成之群組，其中各L係藉由二酯鍵連接；mRNA代表連接其5'端之本發明之mRNA；且n為0或1。於一些實施態樣中，R1 、R2 和R3 中至少一者為OH。於一些實施態樣中，n為1。
於一些實施態樣中，本發明之自我複製RNA包含m7Gpppm7GpN，5'帽類似物，其中N為天然或經修飾之核苷酸，該5'帽類似物具有式(Cap VI)之結構。
Figure 02_image051
其中B3 為天然或經修飾之核鹼基；R1 、R2 、R3 和R4 各自獨立地選自鹵素、OH和OCH3 ；各L係獨立選自由磷酸酯、硫代磷酸酯和硼烷磷酸酯所組成之群組，其中各L係藉由二酯鍵連接；mRNA代表連接其5'端之本發明之mRNA；且n為0或3。於一些實施態樣中，R1 、R2 、R3 和R4 中至少一者為OH。於一些實施態樣中，B1 為G、m7 G或A。於一些實施態樣中，B1 為A或m6 A且R1 為OCH3 ；其中G為鳥嘌呤，m7 G為7-甲基鳥嘌呤，A為腺嘌呤，且m6 A為N6 -甲基腺嘌呤。於一些實施態樣中，n為1。
於一些實施態樣中，本發明之自我複製RNA包含具有式(Cap VII)之結構的m7Gpppm7GpG 5'帽類似物。
Figure 02_image053
其中，R1 ，R2 ，R3 和R4 各自獨立地選自鹵素，OH和OCH3 ；各L係獨立選自由磷酸酯、硫代磷酸酯和硼烷磷酸酯所組成之群組，其中各L係藉由二酯鍵連接；mRNA代表連接其5'端之本發明之mRNA；且n為0或1。於一些實施態樣中，R1 、R2 、R3 和R4 中至少一者為OH。於一些實施態樣中，n為1。
於一些實施態樣中，本發明之自我複製RNA包含具有式(Cap VIII)之結構的m7Gpppm7Gpm7G 5'帽類似物。
Figure 02_image055
其中，R1 、R2 、R3 和R4 各自獨立地選自鹵素、OH和OCH3 ；各L係獨立選自由磷酸酯、硫代磷酸酯和硼烷磷酸酯所組成之群組，其中各L係藉由二酯鍵連接；mRNA代表連接其5'端之本發明之mRNA；且n為0或1。於一些實施態樣中，R1 、R2 、R3 和R4 中至少一者為OH。於一些實施態樣中，n為1。
於一些實施態樣中，本發明之自我複製RNA包含具有式(Cap IX)之結構的m7GpppA 5'帽類似物。
Figure 02_image057
其中，R1 、R2 和R3 各自獨立地選自鹵素、OH和OCH3 ；各L係獨立選自由磷酸酯、硫代磷酸酯和硼烷磷酸酯所組成之群組，其中各L係藉由二酯鍵連接；mRNA代表連接其5'端之本發明之mRNA；且n為0或1。於一些實施態樣中，R1 、R2 和R3 中至少一者為OH。於一些實施態樣中，n為1。
於一些實施態樣中，本發明之自我複製RNA包含m7GpppApN 5'帽類似物，其中N為天然或經修飾之核苷酸，且該5'帽具有式(Cap X)之結構。
Figure 02_image059
其中B3 為天然或經修飾之核鹼基；R1 、R2 、R3 和R4 各自獨立地選自鹵素、OH和OCH3 ；各L係獨立選自由磷酸酯、硫代磷酸酯和硼烷磷酸酯所組成之群組，其中各L係藉由二酯鍵連接；mRNA代表連接其5'端之本發明之mRNA；且n為0或1。於一些實施態樣中，R1 、R2 、R3 和R4 中至少一者為OH。於一些實施態樣中，B3 為G、m7 G、A或m6 A；其中G為鳥嘌呤，m7 G為7-甲基鳥嘌呤，A為腺嘌呤，且m6 A為N6 -甲基腺嘌呤。於一些實施態樣中，n為1。
於一些實施態樣中，本發明之自我複製RNA包含具有式(Cap XI)之結構的m7GpppAmpG 5'帽類似物。
Figure 02_image061
其中，R1 、R2 和R4 各自獨立地選自鹵素、OH和OCH3 ；各L係獨立選自由磷酸酯、硫代磷酸酯和硼烷磷酸酯所組成之群組，其中各L係藉由二酯鍵連接；mRNA代表連接其5'端之本發明之mRNA；且n為0或1。於一些實施態樣中，R1 、R2 和R4 中至少一者為OH。於一些實施態樣中，式Cap XI之化合物為m7 GpppAmpG，其中R1 、R2 和R4 各為OH，n為1，且各L為磷酸化物鍵聯。於一些實施態樣中，n為1。
於一些實施態樣中，本發明之自我複製RNA包含具有式(Cap XII)之結構的m7GpppApm7G 5'帽類似物。
Figure 02_image063
其中，R1 、R2 、R3 和R4 各自獨立地選自鹵素、OH和OCH3 ；各L係獨立選自由磷酸酯、硫代磷酸酯和硼烷磷酸酯所組成之群組，其中各L係藉由二酯鍵連接；mRNA代表連接其5'端之本發明之mRNA；且n為0或1。於一些實施態樣中，R1 、R2 、R3 和R4 中至少一者為OH。於一些實施態樣中，n為1。
於一些實施態樣中，本發明之自我複製RNA包含具有式(Cap XIII)之結構的m7GpppApm7G 5'帽類似物。
Figure 02_image065
其中，R1 、R2 和R4 各自獨立地選自鹵素、OH和OCH3 ；各L係獨立選自由磷酸酯、硫代磷酸酯和硼烷磷酸酯所組成之群組，其中各L係藉由二酯鍵連接；mRNA代表連接其5'端之本發明之mRNA；且n為0或1。於一些實施態樣中，R1 、R2 和R4 中至少一者為OH。於一些實施態樣中，n為1。 聚腺嘌呤(聚A)尾
聚腺苷酸化係將聚(A)尾(長度通常約100至120個單體之腺嘌呤核苷酸鏈)添加在mRNA上。在真核生物中，聚腺苷酸化為產生用於轉譯之成熟mRNA的過程之一部分並在轉錄基因終止子時開始。首先藉由一組蛋白質將新製造之前-mRNA的最3'-節段裂解；然後這些蛋白質在3'端合成聚(A)尾。聚(A)尾對mRNA之核輸出、轉譯和穩定性很重要。該尾會隨著時間而縮短，且當其足夠短時，mRNA會經酶催化降解。然而，在一些細胞類型中，具有短聚(A)尾之mRNA被存儲起來，以供稍後在細胞溶質中藉由再聚腺苷酸化來活化。
較佳地，本發明之自我複製RNA包含3'尾區，其可用來保護RNA免於核酸外切酶降解作用。該尾區可為3'聚(A)和/或3'聚(C)區。較佳地，該尾區為3'聚(A)尾。如本文所使用者，“3'聚(A)尾”為連續腺嘌呤核苷酸之聚合物，其大小可在，例如10至250個連續腺嘌呤核苷酸；60至125個連續腺嘌呤核苷酸、90至125個連續腺嘌呤核苷酸、95至125個連續腺嘌呤核苷酸、95至121個連續腺嘌呤核苷酸、100至121個連續腺嘌呤核苷酸、110至121個連續腺嘌呤核苷酸；112至121個連續腺嘌呤核苷酸；114至121個連續腺嘌呤核苷酸；或115至121個連續腺嘌呤核苷酸之範圍內。較佳地，如本文所描述之3'聚(A)尾包含90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107，108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124或125個連續腺嘌呤核苷酸。3'聚(A)尾可使用本技藝已知之多種方法添加，例如使用聚(A)聚合酶將尾添加至合成的或體外轉錄之RNA。其他方法包括使用轉錄載體以編碼聚(A)尾或使用連接酶(例如，經由使用T4 RNA連接酶和/或T4 DNA連接酶之夾板連接)，其中聚(A)可連接至有義RNA之3'端。於一些實施態樣中，使用上述任何方法之組合。 自我複製RNA之設計及合成
本發明之示例性自我複製RNA序列的構建體提供於表4至5中。
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RNA序列可包括表4和5中列出之RNA序列的任何組合。於一些實施態樣中，本發明之RNA序列包括表4和5中列出之RNA序列的任何組合，其中該mRNA序列之0%至100%、1%至100%、25%至100%、50%至100%和75%至100%的尿嘧啶核苷酸經修飾。於一些實施態樣中，1%至100%之該尿嘧啶核苷酸為N1-甲基假尿苷或5-甲氧基尿苷。於一些實施態樣中，100%之該尿嘧啶核苷酸為N1-甲基假杜鵑鹼。於一些實施態樣中，100%之該尿嘧啶核苷酸為5-甲氧基尿苷。
本發明之自我複製RNA可藉由任何合適之方式獲得。用於製造自我複製RNA之方法為本技藝已知，且對一般技術人士而言為顯而易見的。本發明之自我複製RNA可根據任何可用之技術製備，該技術包括，但不限於化學合成、體外轉錄(IVT)或酶催化性或化學裂解較長之前體，等。
於一些實施態樣中，本發明之自我複製RNA係從初級互補DNA(cDNA)構建體產生。該cDNA構建體可藉由逆轉錄酶(例如RNA依賴性DNA聚合酶)之作用在RNA模板上產生。本文描述之初級cDNA構建體的設計和合成過程通常包括基因構建、RNA產生(具有或不具有修飾)和純化之步驟。在IVT方法中，首先選擇編碼本發明之自我複製RNA的標靶多核苷酸序列以併入載體中，該載體將經擴增以產生cDNA模板。可選擇地，該標靶多核苷酸序列和/或任一側翼序列可為密碼子優化的。然後，使用該cDNA模板透過體外轉錄(IVT)來產生本發明之自我複製RNA。產生後，本發明之自我複製RNA可經歷純化和淨化過程。其步驟將更詳細地提供於下文中。
基因構建之步驟可包括，但不限於基因合成、載體擴增、質粒純化、質粒線性化和淨化，以及cDNA模板合成和淨化。一旦選定用於生產之所欲蛋白質，即設計初級構建體。在該初級構建體中，可使用選定之核酸(DNA或RNA)轉錄子的開放閱讀框(ORF)來構建編碼該所欲多肽之經連接的核苷之第一區。該ORF可包含野生型ORF、其同種型、變體或片段。如本文所使用之“開放閱讀框”或“ORF”係指能夠編碼所欲多肽之核酸序列(DNA或RNA)。ORF通常從起始密碼子ATG開始，並結束於無義或終止密碼子或信號。
該cDNA模板可使用體外轉錄(IVT)系統轉錄以產生本發明之自我複製RNA。該系統通常包含轉錄緩衝液、三磷酸核苷酸(NTP)、RNase抑制劑和聚合酶。該NTP可選自，但不限於本文所描述者，包括天然和非天然(經修飾之)NTP。該聚合酶可選自，但不限於T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶和突變體聚合酶，諸如，但不限於能夠併入經修飾之核酸的聚合酶。
初級cDNA模板或經轉錄之RNA序列亦可經歷加帽和/或拖尾反應。加帽反應可藉由本技藝已知之方法進行，以在該初級構建體之5'端添加5'帽。用於加帽之方法包括，但不限於使用牛痘病毒加帽酶(New England Biolabs，麻薩諸塞州Ipswich)或在體外轉錄開始時藉由，例如在IVT反應中包含加帽劑作為反應之一部分來進行加帽(Nuc.Acids Symp.(2009)53：129)。聚(A)拖尾反應可藉由本技藝已知之方法，諸如，但不限於2'O-甲基轉移酶進行，及藉由如本文所描述之方法進行。若該從cDNA產生之初級構建體不包含聚-T，則在初級構建體淨化之前進行聚(A)拖尾反應可能是有利的。
編碼非結構型蛋白質之經密碼子優化的cDNA構建體和用於自我複製RNA蛋白質之轉基因特別適合用於產生本文所描述之自我複製RNA序列。例如，諸如可使用cDNA構建體作為基礎以在體外轉錄編碼所欲蛋白之多核糖核苷酸，作為自我複製RNA的一部分。
本揭示內容亦提供包含編碼自我複製RNA之核苷酸序列的表現載體，該編碼自我複製RNA之核苷酸序列較佳為可操作地連接至少一個調控序列。調控序列為本技藝已識別的且被選擇用來指導該經編碼之多肽的表現。
因此，術語調控序列包括啟動子、增強子和其他表現控制元件。表現載體之設計可取決於諸如下列因素：所選擇之欲轉形之宿主細胞和/或期望表現之蛋白質類型。
本發明亦提供針對本發明之自我複製RNA的多核苷酸(例如DNA、RNA、cDNA、mRNA，等)，其可能可操作地連接表現構建體(諸如載體或質粒)中之一個或多個調節性核苷酸序列。於某些實施態樣中，該等構建體為DNA構建體。調節性核苷酸序列對用於表現之宿主細胞通常將是適當的。本技藝中已知多種類型之用於各種不同宿主細胞的合適表現載體及合適之調控序列。
通常，該一或多個調節性核苷酸序列可包括，但不限於啟動子序列、前導序列或信號序列、核醣體結合位點、轉錄起始和終止序列、轉譯起始和終止序列以及增強子或活化子序列。本發明之實施態樣考慮本技藝已知之組成型或誘導型啟動子。該啟動子可為天然存在之啟動子或雜種啟動子，該雜種啟動子係組合一個以上之啟動子元件。
表現構建體可存在於細胞中游離基因上，諸如質粒，或者該表現構建體可插入染色體中。於一些實施態樣中，該表現載體含有可選擇之標記基因以允許選擇經轉形之宿主細胞。可選擇之標記基因為本技藝中所熟知的，且將隨所使用之宿主細胞而變化。
本揭示內容亦提供使用本文所描述之自我複製RNA或DNA轉染的宿主細胞。該自我複製RNA或DNA可編碼任何所欲之冠狀病毒蛋白，例如抗原，包括COVID-19病毒之S抗原。該宿主細胞可為任何原核或真核細胞。例如，由自我複製RNA編碼之多肽可在細菌細胞(諸如大腸桿菌)、昆蟲細胞(例如使用桿狀病毒表現系統)、酵母或哺乳動物細胞中表現。其他合適之宿主細胞為本技藝中之技術熟習人士已知。
使用包含本發明之自我複製RNA的表現載體轉染之宿主細胞可在適當條件下培養，以允許表現該擴增之自我複製RNA及多肽轉譯發生。該多肽可分泌出並從細胞之混合物和含有該多肽之培養基中分離出。或者，該多肽可保留在細胞質或膜分液中，並收穫、裂解該細胞及分離出該蛋白質。細胞培養物包括宿主細胞、培養基和其他副產物。用於細胞培養之合適培養基為本技藝所熟知。
本文所描述之表現出的蛋白質可使用本技藝已知之用於純化蛋白質的技術從細胞培養基、宿主細胞或此二者中分離出，該用於純化之技術包括離子交換層析法、凝膠過濾層析法、超濾、電泳和使用特異於該多肽之特定表位的抗體之免疫親和純化法。 組成物和醫藥組成物
於一些實施態樣中，本發明提供包含本發明提供之任何核酸分子的組成物。本發明提供之組成物可包含脂質。任何脂質均可包含在本發明提供之組成物中。於一態樣中，該脂質為可離子化之陽離子性脂質。任何可離子化之陽離子性脂質均可包括在包含本發明提供之核酸分子的組成物中。
本發明之組成物和多核苷酸可用於將個體免疫化或進行疫苗接種以對抗病毒感染。於一些實施態樣中，本揭示內容之組成物和多核苷酸可用於為個體接種疫苗或免疫化以對抗COVID-19病毒。
於一些實施態樣中，本發明亦提供包含本發明提供之任何核酸分子和脂質配製劑的醫藥組成物。任何脂質均可包括在本發明提供之醫藥組成物的脂質配製劑中。於一態樣中，本發明提供之醫藥組成物的脂質配製劑包括可離子化之陽離子性脂質。本發明提供之組成物和醫藥組成物的示例性可離子化之陽離子性脂質包括下列者：
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於一態樣中，本發明提供之可離子化之陽離子性脂質具有下式結構：
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，或彼等之醫藥上可接受之鹽。
於另一態樣中，本發明提供之組成物的可離子化之陽離子性脂質具有下式結構：
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，或其醫藥上可接受之鹽。
於一態樣中，該包括在本發明提供之醫藥組成物的脂質配製劑中之可離子化的陽離子性脂質具有下式結構：
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，或彼等之醫藥上可接受之鹽。
於另一態樣中，該包括在本發明提供之醫藥組成物的脂質配製劑中之可離子化的陽離子性脂質具有下式結構：
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，或其醫藥上可接受之鹽。 脂質配製劑 /LNP
基於細胞內遞送核酸至靶細胞的療法面臨細胞外和細胞內屏障。實際上，裸出之核酸物質由於其毒性、在血清中之穩定性低、快速之腎臟清除率、靶細胞攝取減少、吞噬細胞攝取及其活化免疫反應之能力、所有阻止其臨床發展之特性，因而無法輕易地全身性投予。當外源性核酸物質(例如mRNA)進入人類生物系統時，其被網狀內皮系統(RES)識別為外來病原體，並在有機會遇到血管系統內或外之靶細胞之前被從血液循環中清除。據報導，血流中之裸出之核酸的半衰期約為數分鐘(Kawabata K, Takakura Y, Hashida MPharm Res.1995 Jun；12(6)：825-30)。化學修飾和適當之遞送方法可減少被RES攝取，並保護核酸免於被普遍存在之核酸酶降解，此可增加基於核酸之療法的穩定性和功效。此外，RNA或DNA為不利於被細胞攝取之陰離子性親水性聚合物，其表面上亦為陰離子性的。因此，基於核酸之療法的成功很大程度係取決於研發出能夠有效率且有效地將遺傳物質遞送至靶細胞並在體內以最小的毒性獲得足夠之表現水準的載劑或載體。
再者，當內化進入靶細胞時，核酸遞送載體受到細胞內屏障之挑戰，包括內體捕集、溶酶體降解、核酸從載體揭開、跨核膜轉位(在DNA方面)、在細胞質釋放(在RNA方面)，等。因此，成功之基於核酸的療法取決於該載體將核酸遞送至細胞內靶位點，以獲得足夠水準之期望活性(諸如基因表現)的能力。
雖然數種基因療法已能夠成功利用病毒遞送載體(例如AAV)，但基於脂質之配製劑由於其生物相容性及其易於大規模生產已日益被視為用於RNA和其他核酸化合物之最有希望的遞送系統之一。基於脂質之核酸療法中最重要的進展之一係發生在2018年8月，當時Patisiran (ALN-TTR02)為美國食品藥物管理局(FDA)和歐盟委員會(EC)所批准之首個siRNA治療劑。ALN-TTR02為基於所謂的穩定核酸脂質顆粒(SNALP)轉染技術之siRNA配製劑。不管Patisiran的成功，經由脂質配製劑遞送核酸治療劑(包括mRNA)仍在持續開發中。
根據各種實施態樣，一些本技藝公認之用於核酸治療劑的脂質配製之遞送載劑包括聚合物為底質之載體，諸如聚乙烯亞胺(PEI)、脂質奈米顆粒和脂質體、奈米脂質體、含有神經醯胺之奈米脂質體、多囊脂質體、蛋白脂質體、天然及合成來源二者之胞外體、天然、合成及半合成之板狀體、奈米微粒、膠束和乳劑。這些脂質配製劑在其結構和組成方面可有不同變化，且如同可在快速發展之領域中預期者，該技藝中已使用數種不同之術語來描述單一類型的遞送載劑。同時，用於脂質配製劑之術語由於其在該科學文獻全文中之預期含義而有所不同，而此種不一致的用法已引起關於脂質配製劑之多個術語之確切含義的混淆。為了本發明之目的，在幾種可能之脂質配製劑中，本文中具體詳細地描述並定義脂質體、陽離子性脂質體和脂質奈米顆粒。 脂質體
常規脂質體為由至少一個雙層和內部水性隔室所組成的囊泡。脂質體之雙層膜通常由兩親性分子形成，諸如包含空間上分隔之親水和疏水結構域的合成或天然來源之脂質(Lasic, Trends Biotechnol., 16：307-321, 1998)。該脂質體之雙層膜亦可藉由兩親性聚合物和表面活性劑形成(例如聚合物囊泡(polymersome)、非離子性脂質體(niosome)，等)。其通常以球形囊泡形式存在且大小可在20 nm至幾微米之範圍內。脂質體配製劑可製備成膠體分散劑，或者其可經凍乾以降低穩定性風險，並改善以脂質體為底質之藥物的保存期限。製備脂質體組成物之方法為本技藝已知且係在一般技術人士之技術範圍內。
僅具有一個雙層之脂質體被稱為單層的，而具有一個以上之雙層的脂質體被稱為多層的。脂質體最常見之類型為小單層囊泡(SUV)、大單層囊泡(LUV)和多層囊泡(MLV)。與脂質體相反，溶酶體、膠束和反向膠束係由脂質之單層組成。一般而言，脂質體被認為具有單一內部隔室，然而某些配製劑可為多囊脂質體(MVL)，該多囊脂質體係由眾多不連續之內部水性隔室組成，該眾多不連續內部水性隔室係藉由數個非同心之脂質雙層隔開。
鑑於脂質體基本上為生物膜之類似物且可從天然及合成之磷脂製備(Int J Nanomedicine. 2014；9：1833-1843)，由於脂質體具有優異之生物相容性，其長久以來被視為藥物遞送載劑。在其作為藥物遞送載劑時，由於脂質體具有被疏水膜包圍之水溶液核心，因此溶解在該核心中之親水性溶質無法輕易通過該雙層，且疏水化合物將與該雙層結合。因此，脂質體可裝填疏水性和/或親水性分子。當使用脂質體來攜帶核酸(諸如RNA)時，該核酸將被包含在水相中之脂質體隔室。 陽離子性脂質體
脂質體可由陽離子性、陰離子性和/或中性脂質組成。作為脂質體之重要子類別，陽離子性脂質體為全部或部分從帶正電荷之脂質體(或更具體地，同時包含陽離子基團和親脂性部分之脂質)製造。除了上文中概述之脂質體的一般特性外，用於陽離子性脂質體之陽離子性脂質的帶正電荷部分提供數種優點和一些獨特之結構特性。例如，該陽離子性脂質之親脂性部分為疏水性，因此將指引其自身離開該脂質體之水性內部並與其他非極性和疏水性物種結合。相反地，該陽離子性部分將與水性介質結合，且更重要的是，與極性分子和物種結合，該陽離子性部分可與極性分子和物種在該陽離子性脂質體之水性內部複合。由於這些原因，越來越多研究將陽離子性脂質體用於基因治療，因為陽離子性脂質體經由靜電交互作用而偏向帶負電荷之核酸，而導致可提供生物相容性、低毒性之複合物以及體內臨床施用所需之大規模生產的可行性。適合用於陽離子性脂質體之陽離子性脂質列於下文中。 脂質奈米顆粒
與脂質體和陽離子性脂質體相反，脂質奈米顆粒(LNP)具有包括單一脂質單層或雙層的結構，該脂質單層或雙層將化合物包封在固相中。因此，與脂質體不同，脂質奈米顆粒在其內部不具有水相或其他液相，而是該來自該雙層或單層殼之脂質直接與內部化合物複合，從而將其包封在固體核心中。脂質奈米顆粒通常為球形囊泡，該球形囊泡之形狀和尺寸的分佈相當均勻。雖然來源將根據何種尺寸之脂質顆粒符合作為奈米顆粒之規格而有所不同，但對於脂質奈米顆粒可具有範圍在10 nm至1000 nm之直徑是有一些共識。然而，更常見地，其被認為小於120 nm或甚至是100 nm。
在脂質奈米顆粒核酸遞送系統方面，該脂質殼係配製成包括可離子化之陽離子性脂質，該可離子化之陽離子性脂質可與該核酸核心之帶負電荷的主鏈複合並結合。表觀pKa值低於約7之可離子化的陽離子性脂質之益處為提供可與該核酸之帶負電荷的骨架結合的陽離子性脂質，並在低於該可離子化脂質帶正電荷時之pKa的pH值下裝載入該脂質奈米顆粒中。然後，在生理pH值下，該脂質奈米顆粒可採用相對中性之外部，以允許在靜脈內投予後該顆粒之循環半衰期顯著增加。在核酸遞送之背景下，脂質奈米顆粒提供優於其他基於脂質之核酸遞送系統的利益，包括高核酸封裝效率、有效轉染、改善之組織滲透性以遞送治療劑以及低水準之細胞毒性和免疫原性。
在研發用於核酸之脂質奈米顆粒遞送系統之前，對陽離子性脂質作為用於遞送核酸藥物之合成材料進行廣泛的研究。在這些早期的努力中，在生理pH下混合在一起後，核酸被陽離子性脂質濃縮以形成稱為脂質複合物(lipoplex)的脂質-核酸複合物。然而，脂質複合物被證明是不穩定的，且特徵為從亞微米規格至數微米的廣泛尺寸分佈。脂質複合物，諸如Lipofectamine®試劑，已被發現對體外轉染而言非常有用。然而，這些第一代脂質複合物尚未被證明在體內是有用的。大粒徑和正電荷(由陽離子性脂質賦予)可導致快速血漿清除、溶血和其他毒性，以及免疫系統活化。於一些態樣中，本發明提供之核酸分子和本發明提供之脂質或脂質配製劑形成脂質奈米顆粒(LNP)。
於其他態樣中，本發明提供之核酸分子係併入脂質配製劑(即，基於脂質之遞送載體)中。
於本發明之背景下，基於脂質之遞送載劑通常用於將所需之RNA運送至靶細胞或組織。該基於脂質之遞送載劑可為本技藝已知之任何合適的基於脂質之遞送載劑。於一些態樣中，該基於脂質之遞送載劑為含有本發明之自我複製RNA的脂質體、陽離子性脂質體或脂質奈米顆粒。於一些態樣中，該基於脂質之遞送載劑包含脂質分子之奈米顆粒或雙層以及本發明之自我複製RNA。於一些態樣中，該脂質雙層進一步包含中性脂質或聚合物。於一些態樣中，該脂質配製劑包含液體介質。於一些態樣中，該配製劑進一步包封核酸。於一些態樣中，該脂質配製劑進一步包含核酸和中性脂質或聚合物。於一些態樣中，該脂質配製劑包封核酸。
該描述提供脂質配製劑，該脂質配製劑包含封裝在該脂質配製劑中之一或多個自我複製RNA分子。於一些態樣中，該脂質配製劑包含脂質體。於一些態樣中，該脂質配製劑包含陽離子性脂質體。於一些態樣中，該脂質配製劑包含脂質奈米顆粒。
於一些態樣中，該自我複製RNA完全包封在該脂質配製劑之脂質部分內，從而使該脂質配製劑中之RNA可在水溶液中抵抗核酸酶降解。於其他態樣中，本文描述之脂質配製劑對動物，諸如人和其他哺乳動物基本上沒有毒性。
本揭示內容之脂質配製劑亦通常具有約1：1至約100：1、約1：1至約50：1、約2：1至約45：1、約3：1至約40：1、約5：1至約45：1、或約10：1至約40：1、或約15：1至約40：1、或約20：1至約40：1；或約25：1至約45：1；或約30：1至約45：1；或約32：1至約42：1；或約34：1至約42：1之總脂質：RNA比(質量/質量比)。於一些態樣中，該總脂質：RNA比(質量/質量比)為約30：1至約45：1。該比率可為在所列舉之範圍內的任何值或子值，包括端點。
本揭示內容之脂質配製劑通常具有約30 nm至約150 nm、約40 nm至約150 nm、約50 nm至約150 nm、約60 nm至約130 nm、約70 nm至約110 nm、約70 nm至約100 nm、約80 nm至約100 nm、約90 nm至約100 nm、約70 nm至約90 nm、約80 nm至約90 nm、約70 nm至約80 nm、或約30 nm、約35 nm、約40 nm、約45 nm、約50 nm、約55 nm、約60 nm、約65 nm、約70 nm約75 nm、約80 nm、約85 nm、約90 nm、約95 nm、約100 nm、約105 nm、約110 nm、約115 nm、約120 nm、約125 nm、約130 nm、約135 nm、約140 nm、約145 nm或約150 nm之平均直徑，且基本上無毒。該直徑可為所列舉之範圍內的任何值或子值，包括端點。此外，當存在於本發明之脂質奈米顆粒中時，核酸在水溶液中通常可抵抗核酸酶降解。
於一些實施態樣中，該脂質奈米顆粒之尺寸小於約500 nm、小於約400 nm、小於約300 nm、小於約200 nm、小於約100 nm或小於約50 nm。於具體之實施態樣中，該脂質奈米顆粒之尺寸為約55 nm至約90 nm。
於一些態樣中，該脂質配製劑包含自我複製RNA、陽離子性脂質(例如本文所描述之一或多種陽離子性脂質或其鹽類)、磷脂和抑制該顆粒聚集之軛合脂質(例如一或多種PEG-脂質軛合物)。該脂質配製劑亦可包含膽固醇。於一態樣中，該陽離子性脂質為可離子化之陽離子性脂質。
於核酸-脂質配製劑中，該RNA可被完全包封在該配製劑之脂質部分內，從而保護該核酸免於被核酸酶降解。於一些態樣中，包含RNA之脂質配製劑被完全包封在該脂質配製劑之脂質部分內，從而保護核酸免於被核酸酶降解。於某些態樣中，使顆粒在37℃下暴露於核酸酶至少20、30、45或60分鐘後，該脂質配製劑中之RNA基本上未被降解。於某些其他態樣中，該配製劑在37℃之血清中培育至少30、45或60分鐘或至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36小時後，該脂質配製劑中之RNA基本上未被降解。於一些態樣中，該RNA與該配製劑之脂質部分複合。本發明之配製劑的益處之一為該核酸-脂質組成物對動物，諸如人和其他哺乳動物基本上無毒性。
在核酸之背景下，完全包封可藉由進行膜不可滲透性螢光染料排阻分析來測定，該分析使用與核酸結合時具有增強之螢光的染料。藉由將染料添加到脂質配製劑中，測量所產生之螢光並將其與添加少量非離子性清潔劑時所觀察到之螢光相比較來測定包封。由清潔劑介導之脂質層破壞可釋放該經包封之核酸，允許其與該膜不可滲透性染料交互作用。核酸包封之計算法可為E=(I0-I)/I0，其中/和I0係指添加清潔劑之前和之後的螢光強度。
於一些態樣中，本發明提供包含多個核酸脂質體、核酸陽離子性脂質體或核酸脂質奈米顆粒之核酸脂質組成物。於一些態樣中，該核酸-脂質組成物包含多個RNA-脂質體。於一些態樣中，該核酸-脂質組成物包含多個RNA陽離子性脂質體。於一些態樣中，該核酸-脂質組成物包含多個RNA-脂質奈米顆粒。
於一些態樣中，該脂質配製劑包含被完全包封在該配製劑之脂質部分內的RNA，從而使約30%至約100%、約40%至約100%、約50%至約100%、約60%至約100%、約70%至約100%、約80%至約100%、約90%至約100%、約30%至約95%、約40%至約95%、約50%至約95%、約60%至約95%、約70%至約95%、約80%至約95%、約85%至約95%、約90%至約95%、約30%至約90%、約40%至約90%、約50%至約90%、約60%至約90%、約70%至約90%、約80%至約90%、或至少約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%(或其任何部分或其中之範圍)之顆粒具有包封在其中之RNA。該量可為所列舉之範圍內的任何值或子值，包括端點。包括在本發明提供之任何RNA-脂質組成物或RNA-脂質配製劑中的RNA可為自我複製RNA。
根據該脂質配製劑之預期用途，該組分之比例可有變化，且可使用本技藝已知之分析來測量特定配製劑之遞送效率。
於一些態樣中，本發明提供之核酸分子為經脂質配製的。該脂質配製劑較佳為選自，但不限於脂質體、陽離子性脂質體和脂質奈米顆粒。於一態樣中，該脂質配製劑為陽離子性脂質體或脂質奈米顆粒(LNP)，其包含：
( a)本發明之RNA，
( b)陽離子性脂質，
( c)聚集減少劑(諸如聚乙二醇(PEG)脂質或經PEG修飾之脂質)，
( d)可選擇地，非陽離子性脂質(諸如中性脂質)，和
( e)可選擇地，固醇。
於另一態樣中，該陽離子性脂質為可離子化之陽離子性脂質。任何可離子化之陽離子性脂質，包括本發明提供之示例性陽離子性脂質均可包括在脂質配製劑中。 陽離子性脂質
於一態樣中，該脂質奈米顆粒配製劑包含(i)至少一種陽離子性脂質；和(ii)輔助脂質；(iii)固醇(例如膽固醇)；(iv)PEG-脂質。於另一態樣中，該陽離子性脂質為可離子化之陽離子性脂質。再於另一態樣中，該脂質奈米顆粒配製劑包含(i)至少一種陽離子性脂質；(ii)輔助脂質；(iii)固醇(例如膽固醇)；(iv)PEG-脂質，其莫耳比為約40至70%之可離子化陽離子性脂質：約2至15%之輔助脂質：約20至45%之固醇：約0.5至5%之PEG-脂質。於進一步之態樣中，該陽離子性脂質為可離子化之陽離子性脂質。
於一態樣中，該脂質奈米顆粒配製劑係由下列者組成：(i)至少一種陽離子性脂質；(ii)輔助脂質；(iii)固醇(例如膽固醇)；和(iv)PEG-脂質。於另一態樣中，該陽離子性脂質為可離子化之陽離子性脂質。再於另一態樣中，該脂質奈米顆粒配製劑係由下列者組成：(i)至少一種陽離子性脂質；(ii)輔助脂質；(iii)固醇(例如膽固醇)；和(iv)PEG-脂質，其莫耳比為約40至70%之可離子化的陽離子性脂質：約2至15%之輔助脂質：約20至45%之固醇：約0.5至5%之PEG-脂質。於進一步之態樣中，該陽離子性脂質為可離子化之陽離子性脂質。
於目前揭示之脂質配製劑中，該陽離子性脂質可為，例如N,N-二油基-N,N-二甲基氯化銨(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化銨(DDAB)、1,2-二油醯三甲基銨丙烷氯化物(DOTAP)(亦稱為N-(2,3-二油醯氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化銨和1,2-二油基氧基-3-三甲基胺基丙烷氯酸鹽)、N-(1-(2,3-二油基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTMA)、N,N-二甲基-2,3-二油氧基)丙胺(DODMA)、1,2-二亞油基氧基-N,N-二甲胺基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亞麻基氧基-N,N-二甲胺基丙烷(DLenDMA)、1,2-二-y-亞麻基氧基-N,N-二甲胺基丙烷(γ-DLenDMA)、1,2-二亞麻基胺基甲醯氧基-3-二甲胺基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二亞麻基氧基-3-(二甲胺基)乙醯氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亞油基氧基-3-嗎啉丙烷(DLin-MA)、1,2-二亞油醯-3-二甲胺基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亞油基硫代-3-二甲胺基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亞油醯-2-亞油基氧基-3-二甲胺基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亞油基氧基-3-三甲胺基丙烷鹽酸鹽(DLin-TMA.Cl)、1,2-二亞油醯-3-三甲胺基丙烷鹽酸鹽(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亞油基氧基-3-(N-甲基六氫吡井基)丙烷(DLin-MPZ)或3-(N,N-二亞油基胺基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油基胺基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二亞油基合氧基-3-(2-N,N-二甲胺基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、2,2-二亞油基-4-二甲胺基甲基-[1,3]-二氧戊環(DLin-K-DMA)或其類似物、(3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)四氫-3aH-環戊[d][l,3]二噁唑-5-胺、(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲胺基)丁酸酯(MC3)、l,l'-(2-(4-(2-((2-(雙(2-羥基十二烷基)胺基)乙基)(2-羥基十二烷基)胺基)乙基)六氫吡井-1-基)乙基氮烷二基)雙十二碳-2-醇(C12-200)、2,2-二亞油基-4-(2-二甲胺基乙基)-[1,3]-二氧戊環(DLin-K-C2-DMA)、2,2-二亞油基-4-二甲胺基甲基-[1,3]-二氧戊環(DLin-K-DMA)、(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲胺基)丁酸酯(DLin-M-C3-DMA)、3-((6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基氧基)-N,N-二甲基丙-1-胺(MC3醚)、4-((6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基氧基)-N,N-二甲基丁-1-胺(MC4醚)或彼等之任何組合。其他陽離子性脂質包括，但不限於N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化銨(DDAB)、3P-(N-(N',N'-二甲胺基乙烷)-胺甲醯)膽固醇(DC-Choi)、N-(1-(2,3-二油基氧基)丙基)-N-2-(精胺羧醯胺基)乙基)-N,N-二甲基三氟醋酸銨(DOSPA)、雙十八烷基醯胺基糖基羧精胺(DOGS)、1,2-二油醯-sn-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二油醯-3-二甲基銨丙烷(DODAP)、N-(1,2-二肉荳蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羥乙基溴化銨(DMRIE)和2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(XTC)。此外，可使用陽離子性脂質之商業製劑，諸如，例如LIPOFECTIN(包括可從GIBCO/BRL獲得之DOTMA和DOPE)和Lipofectamine(包含可從GIBCO/BRL獲得之DOSPA和DOPE)。
其他合適之陽離子性脂質揭示於國際刊物編號WO 09/086558、WO 09/127060、WO 10/048536、WO 10/054406、WO 10/088537、WO 10/129709和WO 2011/ 153493；美國專利刊物編號2011/0256175、2012/0128760和2012/0027803；美國專利案8,158,601號和Love et al., PNAS, 107(5), 1864-69, 2010，其內容以引用方式併入本文。
本發明之RNA-脂質配製劑可包含輔助脂質，其可稱為中性輔助脂質、非陽離子性脂質、非陽離子性輔助脂質、陰離子性脂質、陰離子性輔助脂質或中性脂質。現已發現，若脂質配製劑中存在輔助脂質，則該脂質配製劑，特別是陽離子性脂質體和脂質奈米顆粒具有增加之細胞攝取。(Curr. Drug Metab. 2014；15(9)：882-92)。例如，一些研究指明中性和兩性離子性脂質(諸如1,2-二油醯sn-甘油-3-磷脂醯膽鹼(DOPC)、二-油醯-磷脂醯-乙醇胺(DOPE)和1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC))較陽離子性脂質更具致融性(即，促進融合)、可影響脂質-核酸複合物之多態特性、促進從層狀相轉變成六方相，從而誘導融合並破壞該細胞膜(Nanomedicine(Lond). 2014 Jan；9(1)：105-20)。此外，使用輔助脂質可協助減少由使用許多普遍之陽離子性脂質而引起的任何潛在之有害影響(諸如毒性和免疫原性)。
適合用於本發明之脂質配製劑的非陽離子性脂質的非限制性實例包括磷脂，諸如卵磷脂、磷脂醯乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲胺酸、磷脂醯肌醇、鞘磷脂、蛋鞘磷脂(ESM)、腦磷脂(cephalin)、心磷脂(cardiolipin)、磷脂酸、腦苷脂(cerebroside)、二鯨蠟基磷酸酯、二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC)、二油醯磷脂醯膽鹼(DOPC)、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼(DPPC)、二油醯磷脂醯甘油(DOPG)、二棕櫚醯磷脂醯甘油(DPPG)、二油醯磷脂醯乙醇胺(DOPE)、棕櫚醯油醯-磷脂醯膽鹼(POPC)、棕櫚醯油醯-磷脂醯乙醇胺(POPE)、棕櫚醯油醯-磷脂醯甘油(POPG)、二油醯磷脂醯乙醇胺4-(N-馬來醯亞胺基甲基)-環己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕櫚醯-磷脂醯乙醇胺(DPPE)、二肉荳蔻醯-磷脂醯乙醇胺(DMPE)、二硬脂醯基-磷脂醯乙醇胺(DSPE)、單甲基-磷脂醯乙醇胺、二甲基-磷脂醯乙醇胺、二戊醯基-磷脂醯乙醇胺(DEPE)、硬脂醯油醯基-磷脂醯乙醇胺(SOPE)、溶血磷脂醯膽鹼、二亞油醯磷脂醯膽鹼及其混合物。亦可使用其他二醯基磷脂醯膽鹼和二醯基磷脂醯乙醇胺磷脂。這些脂質中之醯基較佳為衍生自具有C10-C24碳鏈之脂肪酸的醯基，例如月桂醯、肉荳蔻醯、棕櫚醯、硬脂醯或油醯。
非陽離子性脂質之其他實例包括固醇，諸如膽固醇及其衍生物。作為輔助脂質，膽固醇可增加與核酸交界之脂質層的電荷間距，使電荷分佈與核酸所具者更緊密地配合。(J. R. Soc. Interface. 2012 Mar 7；9(68)：548-561)。膽固醇衍生物之非限制性實例包括極性類似物，諸如5α-二氫膽固醇(cholestanol)、5α-糞固醇(coprostanol)、膽固醇基-(2'-羥基)-乙醚、膽固醇基-(4'-羥基)-丁醚和6-酮二氫膽固醇；非極性類似物，諸如5α-膽固烷、膽固烯酮(cholestenone)、5α-膽固酮、5α-膽固酮和癸酸膽固醇酯；及彼等之混合物。於一些態樣中，該膽固醇衍生物為極性類似物，諸如膽固醇基-(4'-羥基)-丁醚。
於一些態樣中，存在於該脂質配製劑中之輔助脂質包含一或多種磷脂和膽固醇或其衍生物之混合物或由其組成。於其他態樣中，存在於該脂質配製劑中之中性脂質包含一或多種磷脂或由其組成，例如不含膽固醇之脂質配製劑。再於其他態樣中，存在於該脂質配製劑中之中性脂質包含膽固醇或其衍生物，或由其組成，例如不含磷脂之脂質配製劑。
輔助脂質之其他實例包括含有無磷之脂質，諸如，例如硬脂胺、十二烷胺、十六烷胺、棕櫚酸乙醯酯、蓖麻油酸甘油酯、十六烷基硬脂酸酯、肉荳蔻酸異丙酯、兩性丙烯酸聚合物、三乙醇胺-月桂基硫酸酯、烷基芳基硫酸酯聚乙氧基化之脂肪酸醯胺、雙十八烷基二甲基溴化銨、神經醯胺和鞘磷脂。
其他合適之陽離子性脂質包括那些具有替代之脂肪酸基團和其他二烷胺基者，包括其中該烷基取代基不同者(例如N-乙基-N-甲胺基-和N-丙基-N-乙胺基-)。這些脂質為被稱為胺基脂質之陽離子性脂質的子類別之一部分。於本文所描述之脂質配製劑的一些實施態樣中，該陽離子性脂質為胺基脂質。一般而言，具有較少之飽和醯基鏈的胺基脂質較容易按尺寸排列，特別是當該複合物之尺寸必須小於約0.3微米以用於過濾器滅菌之目的時。可使用含有其碳鏈長度在C14至C22之範圍內的不飽和脂肪酸之胺基脂質。亦可使用其他支架來將該胺基脂質之胺基和脂肪酸或脂肪烷基部分分開。
於一些實施態樣中，該脂質配製劑包含根據專利申請案PCT/EP2017/064066之具有式I的陽離子性脂質。在此背景下，PCT/EP2017/064066之揭示內容亦以引用方式併入本文。
於一些實施態樣中，本揭示內容之胺基或陽離子性脂質為可離子化的且具有至少一個可質子化或可去質子化之基團，從而使該脂質在生理pH或低於生理pH(例如pH7.4)下帶正電，且在第二pH(較佳為生理pH或高於生理pH)下為中性。當然，將可理解的是，作為pH之函數的添加或移除質子為平衡過程，且對帶電荷或中性脂質之引用係指該主要物種之性質，並不需要所有脂質以帶電荷或中性形式存在。具有一個以上之可質子化或可去質子化基團，或為兩性離子性的脂質不排除用於本發明中。於某些實施態樣中，該可質子化之脂質的可質子化基團之pKa係在約4至約11之範圍內。於一些實施態樣中，該可離子化之陽離子性脂質具有約5至約7之pKa。於一些實施態樣中，該可離子化之陽離子性脂質的pKa為約6至約7。
於一些實施態樣中，該脂質配製劑包含式I之可離子化的陽離子性脂質：
Figure 02_image153
或其醫藥上可接受之鹽或溶劑化物，其中R5和R6各自獨立地選自由下列所組成之群組：直鏈或支鏈型C1-C31烷基、C2-C31烯基或C2-C31炔基和膽固醇基；L5和L6各自獨立地選自由下列所組成之群組：直鏈型C1-C20烷基和C2-C20烯基；X5為-C(O)O-，從而形成-C(O)O-R6或X5為-OC(O)-，從而形成-OC(O)-R6；X6為-C(O)O-，從而形成-C(O)O-R5或X6為-OC(O)-，從而形成-OC(O)-R5；X7為S或O；L7不存在或為較低烷基；R4為直鏈或支鏈型C1-C6烷基；且R7和R8各自獨立地選自由下列所組成之群組：氫和直鏈或支鏈型C1-C6烷基。
於一些實施態樣中，X7為S。
於一些實施態樣中，X5為-C(O)O-，從而形成-C(O)O-R6，且X6為-C(O)O-，從而形成-C(O)O-R5。
於一些實施態樣中，R7和R8各自獨立地選自由下列所組成之群組：甲基、乙基和異丙基。
於一些實施態樣中，L5和L6各自獨立為C1-C10烷基。於一些實施態樣中，L5為C1-C3烷基，且L6為C1-C5烷基。於一些實施態樣中，L6為C1-C2烷基。於一些實施態樣中，L5和L6各自為直鏈型C7烷基。於一些實施態樣中，L5和L6各自為直鏈型C9烷基。
於一些實施態樣中，R5和R6各自獨立為烯基。於一些實施態樣中，R6為烯基。於一些實施態樣中，R6為C2-C9烯基。於一些實施態樣中，該烯基包含單一雙鍵。於一些實施態樣中，R5和R6各自為烷基。於一些實施態樣中，R5為支鏈型烷基。於一些實施態樣中，R5和R6各自獨立地選自由下列所組成之群組：C9烷基、C9烯基和C9炔基。於一些實施態樣中，R5和R6各自獨立地選自由下列所組成之群組：C11烷基、C11烯基和C11炔基。於一些實施態樣中，R5和R6各自獨立地選自由下列所組成之群組：C7烷基、C7烯基和C7炔基。於一些實施態樣中，R5為-CH((CH2)pCH3)2或-CH((CH2)pCH3)((CH2)p-1CH3)，其中p為4至8。於一些實施態樣中，p為5且L5為C1-C3烷基。於一些實施態樣中，p為6且L5為C3烷基。於一些實施態樣中，p為7。於一些實施態樣中，p為8且L5為C1-C3烷基。於一些實施態樣中，R5係由-CH((CH2) pCH3)((CH2)p-1CH3)組成，其中p為7或8。
於一些實施態樣中，R4為伸乙基或伸丙基。於一些實施態樣中，R4為n-伸丙基或異伸丁基。
於一些實施態樣中，L7不存在，R4為伸乙基，X7為S，且R7和R8各為甲基。於一些實施態樣中，L7不存在，R4為n-伸丙基，X7為S，且R7和R8各為甲基。於一些實施態樣中，L7不存在，R4為伸乙基，X7為S，且R7和R8各為乙基。
於一些實施態樣中，X7為S，X5為       -C(O)O-，從而形成-C(O)O-R6，X6為-C(O)O-，從而形成 -C(O)O-R5，L5和L6各自獨立為線性C3-C7烷基，L7不存在，R5為-CH((CH2)pCH3)2，且R6為C7-C12烯基。於一些進一步之實施態樣中，p為6且R6為C9烯基。
於一些實施態樣中，該脂質配製劑可包含選自由LIPID＃1至LIPID＃8所組成之群組的可離子化之陽離子性脂質：
Figure 02_image155
Figure 02_image157
Figure 02_image159
於一些實施態樣中，該脂質配製劑包含具有選自下列式之結構的可離子化之陽離子性脂質：
Figure 02_image161
Figure 02_image163
或彼等之醫藥上可接受之鹽。 於一些較佳之實施態樣中，該脂質配製劑包含具有下式結構之可離子化之陽離子性脂質：
Figure 02_image165
或其醫藥上可接受之鹽。
於實施態樣中，本文所列舉之任何一或多種脂質可被明確排除。
於一些態樣中，該輔助脂質佔該存在於該脂質配製劑中之總脂質的約2莫耳%至約20莫耳%、約3莫耳%至約18莫耳%、約4莫耳%至約16莫耳%、約5莫耳%至約14莫耳%、約6莫耳%至約12莫耳%、約5莫耳%至約10莫耳%、約5莫耳%至約9莫耳%、或約2莫耳%、約3莫耳%、約4莫耳%、約5莫耳%、約6莫耳%、約7莫耳%、約8莫耳%、約9莫耳%、約10莫耳%、約11莫耳%或約12莫耳%(或彼等之任何分數或其中之範圍)。
該脂質配製劑中之脂質部分、或膽固醇、或膽固醇衍生物可至多佔該存在於該脂質配製劑中之總脂質的約40莫耳%、約45莫耳%、約50莫耳%、約55莫耳%或約60莫耳%。於一些態樣中，該膽固醇或膽固醇衍生物佔該存在於該脂質配製劑中之總脂質的約15莫耳%至約45莫耳%、約20莫耳%至約40莫耳%、約25莫耳%至約35莫耳%、或約28莫耳%至約35莫耳%、或約25莫耳%、約26莫耳%、約27莫耳%、約28莫耳%、約29莫耳%、約30莫耳%、約31莫耳%、約32莫耳%、約33莫耳%、約34莫耳%、約35莫耳%、約36莫耳%或約37莫耳%。
於具體之實施態樣中，該脂質配製劑之脂質部分為約35莫耳%至約42莫耳%之膽固醇。
於一些態樣中，該混合物中之磷脂組分可佔該存在於該脂質配製劑中之總脂質的約2莫耳%至約20莫耳%、約3莫耳%至約18莫耳%、約4莫耳%至約16莫耳%、約5莫耳%至約14莫耳%、約6莫耳%至約12莫耳%、約5莫耳%至約10莫耳%、約5莫耳%至約9莫耳%、或約2莫耳%、約3莫耳%、約4莫耳%、約5莫耳%、約6莫耳%、約7莫耳%、約8莫耳%、約9莫耳%、約10莫耳%、約11莫耳%或約12莫耳%(或彼等之任何分數或其中之範圍)。
於某些實施態樣中，該脂質配製劑之脂質部分包含，但不一定限於約40莫耳%至約60莫耳%之可離子化之陽離子性脂質、約4莫耳%至約16莫耳%之DSPC、約30莫耳%至約47莫耳%之膽固醇和約0.5莫耳%至約3莫耳%之PEG2000-DMG。
於某些實施態樣中，該脂質配製劑之脂質部分可包含，但不一定限於約42莫耳%至約58莫耳%之可離子化之陽離子性脂質、約6莫耳%至約14莫耳%之DSPC、約32莫耳%至約44莫耳%之膽固醇和約1莫耳%至約2莫耳%之PEG2000-DMG。
於某些實施態樣中，該脂質配製劑之脂質部分可包含，但不一定限於約45莫耳%至約55莫耳%之可離子化之陽離子性脂質、約8莫耳%至約12莫耳%之DSPC、約35莫耳%至約42莫耳%之膽固醇和約1.25莫耳%至約1.75莫耳%之PEG2000-DMG。
存在於該脂質配製劑中之輔助脂質的百分比為目標量，而存在於該配製劑中之輔助脂質的實際量可能有例如±5莫耳%之變化。
包括陽離子性脂質化合物或可離子化之陽離子性脂質化合物的脂質配製劑按莫耳計可為約30至70%之陽離子性脂質化合物、約25至40%之膽固醇、約2至15%之輔助脂質和約0.5至5%之聚乙二醇(PEG)脂質，其中該百分比為存在於該配製劑中之總脂質的百分比。於一些態樣中，該組成物為約40至65%之陽離子性脂質化合物、約25至35%之膽固醇、約3至9%之輔助脂質和約0.5至3%之PEG-脂質，其中該百分比為存在於該配製劑中之總脂質的百分比。
該配製劑可為脂質顆粒製劑，例如含有8至30%之核酸化合物、5至30%之輔助脂質和0至20%之膽固醇；4至25%之陽離子性脂質、4至25%之輔助脂質、2至25%之膽固醇、10至35%之膽固醇-PEG和5%之膽固醇-胺；或2至30%之陽離子性脂質、2至30%之輔助脂質、1至15%之膽固醇、2至35%之膽固醇-PEG和1至20%之膽固醇-胺；或高達90%之陽離子性脂質和2至10%之輔助脂質，或甚至100%之陽離子性脂質。 脂質軛合物
本文所描述之脂質配製劑可進一步包含脂質軛合物。該軛合之脂質的有用之處在於其可防止顆粒聚集。合適之軛合的脂質包括，但不限於PEG-脂質軛合物，陽離子性聚合物-脂質軛合物及彼等之混合物。此外，脂質遞送載劑可藉由將配體(例如抗體、肽和碳水化合物)連接其表面或連接至該連接之PEG鏈的末端來用於特異性靶向(Front Pharmacol. 2015 Dec 1；6：286)。
於一些態樣中，該脂質軛合物為PEG-脂質。該脂質配製劑中包含聚乙二醇(PEG)作為塗層或表面配體(稱為PEG化之技術)來協助保護奈米顆粒免於被免疫系統破壞並使其逃離免於被RES吸收(Nanomedicine(Lond). 2011 Jun；6(4)：715-28)。聚乙二醇化已透過物理、化學和生物學機制用於穩定脂質配製劑及其有效載荷。清潔劑樣PEG脂質(例如PEG-DSPE)可進入該脂質配製劑以在該表面上形成水合層和空間屏障。基於PEG化之程度，該表面層通常可分為二種類型，刷樣層和蘑菇樣層。在經PEG-DSPE穩定之配製劑方面，在PEG化程度較低(通常低於5莫耳%)時PEG呈現蘑菇狀構形，且將隨著PEG-DSPE含量增加超過一定水準時轉變為刷狀構形(Journal of Nanomaterials. 2011；2011：12)。聚乙二醇化導致脂質配製劑之循環半衰期顯著增加(Annu. Rev. Biomed. Eng. 2011 Aug 15；13()：507-30；J. Control Release. 2010 Aug 3；145(3)：178-81)。
PEG-脂質之實例包括，但不限於與二烷氧基丙基偶聯之PEG(PEG-DAA)、與二醯基甘油偶聯之PEG(PEG-DAG)、甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG或PEG2000-DMG)、與磷脂偶聯之PEG，諸如磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)、與神經醯胺軛合之PEG、與膽固醇或其衍生物軛合之PEG，及彼等之混合物。
PEG為具有二個末端羥基之乙烯PEG重複單元的線性水溶性聚合物。PEG按其分子量分類且包括下列群組：單甲氧基聚乙二醇(MePEG-OH)、單甲氧基聚乙二醇-琥珀酸酯(MePEG-S)、單甲氧基聚乙二醇-琥珀醯亞胺基琥珀酸酯(MePEG-S-NHS)、單甲氧基聚乙二醇-胺(MePEG-NH2)、單甲氧基聚乙二醇-三氟乙基磺酸酯(MePEG-TRES)、單甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基(MePEG-IM)以及含有末端羥基而非末端甲氧基之該等化合物(例如HO-PEG-S、HO-PEG-S-NHS、HO-PEG-NH2)。
本文所描述之PEG-脂質軛合物的PEG部分可包含在約550道耳吞至約10,000道耳吞之範圍內的平均分子量。於某些態樣中，該PEG部分之平均分子量為約750道耳吞至約5,000道耳吞(例如約1,000道耳吞至約5,000道耳吞、約1,500道耳吞至約3,000道耳吞、約750道耳吞至約3,000道耳吞、約750道耳吞至約2,000道耳吞)。於一些態樣中，該PEG部分之平均分子量為約2,000道耳吞或約750道耳吞。該平均分子量可為所列舉之範圍內的任何值或子值，包括端點。
於某些態樣中，該PEG可選擇地被烷基、烷氧基、醯基或芳基取代。PEG可直接與脂質軛合，或可經由連接子部分連接該脂質。適合用於將PEG與脂質偶聯之任何連接子部分均可使用，包括，例如非含酯之連接子部分和含酯之連接子部分。於一態樣中，該連接子部分為非含酯之連接子部分。示例性非含酯之連接子部分包括，但不限於醯胺基(-C(O)NH-)、胺基(-NR-)、羰基(-C(O)-)、胺基甲酸酯(-NHC(O)O-)、尿素(-NHC(O)NH-)、二硫化物  (-S-S-)、醚(-O-)、琥珀醯基(-(O)CCH2CH2C(O)-)、琥珀醯亞胺基(-NHC(O)CH2CH2C(O)NH-)、醚以及彼等之組合(諸如同時含有胺基甲酸酯連接子部分和醯胺基連接子部分的連接子)。於一態樣中，該胺基甲酸酯連接子係用於將該PEG與脂質偶聯。
於一些態樣中，使用含酯之連接子部分來將PEG與脂質偶聯。示例性之含酯的連接子部分包括，例如碳酸酯(-OC(O)O-)、琥珀醯基、磷酸酯(-O-(O)POH-O-)、磺酸酯及彼等之組合。
可將具有各種具不同鏈長和飽和度之醯基鏈的磷脂醯乙醇胺與PEG軛合以形成該脂質軛合物。該等磷脂醯乙醇胺可商購，或可使用本技藝之技術熟習人士已知的常規技術分離出或合成。含有飽和或不飽和脂肪酸且碳鏈長度在C10 至C20 之範圍內的磷脂醯乙醇胺為較佳者。亦可使用具有單或二不飽和脂肪酸及飽和與不飽和脂肪酸之混合物的磷脂醯乙醇胺。合適之磷脂醯乙醇胺包括，但不限於二肉荳蔻醯-磷脂醯乙醇胺(DMPE)、二棕櫚醯-磷脂醯乙醇胺(DPPE)、二油醯-磷脂醯乙醇胺(DOPE)和二硬脂醯-磷脂醯乙醇胺(DSPE)。
於一些態樣中，該PEG-DAA軛合物為PEG-二癸基氧基丙基(C10)軛合物，PEG-二月桂基氧基丙基(C12)軛合物，PEG-二肉荳蔻基氧基丙基(C14)軛合物，PEG-二棕櫚基氧基丙基(C16)軛合物或PEG-二硬脂基氧基丙基(C18)軛合物。於一些態樣中，該PEG具有約750或約2,000道耳吞之平均分子量。於一些態樣中，該PEG之末端羥基被甲基取代。
除了前述者之外，可使用其他親水性聚合物來代替PEG。可用來代替PEG之合適聚合物的實例包括，但不限於聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羥丙基、甲基丙烯醯胺、聚甲基丙烯醯胺和聚二甲基丙烯醯胺、聚乳酸、聚乙醇酸和衍生之纖維素，諸如羥甲基纖維素或羥乙基纖維素。
於一些態樣中，該脂質軛合物(例如PEG-脂質)佔存在於該脂質配製劑中之總脂質的約0.1莫耳%至約2莫耳%、約0.5莫耳%至約2莫耳%、約1莫耳%至約2莫耳%、約0.6莫耳%至約1.9莫耳%、約0.7莫耳%至約1.8莫耳%、約0.8莫耳%至約1.7莫耳%、約0.9莫耳%至約1.6莫耳%、約0.9莫耳%至約1.8莫耳%、約1莫耳%至約1.8莫耳%、約1莫耳%至約1.7莫耳%、約1.2莫耳%至約1.8莫耳%、約1.2莫耳%至約1.7莫耳%、約1.3莫耳%至約1.6莫耳%、或約1.4莫耳%至約1.6莫耳%(或彼等之任何分數或其中之範圍)。於其他實施態樣中，該脂質軛合物(例如PEG-脂質)佔存在於該脂質配製劑中之總脂質的約0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%、1.7、1.8%、1.9%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%或5%(或彼等之任何分數或其中之範圍)。該量可為所列舉之範圍內的任何值或子值，包括端點。
存在於本發明之脂質配製劑中的脂質軛合物(例如PEG-脂質)之百分比為目標量，而存在於該配製劑中之脂質軛合物的實際量可能有例如±0.5莫耳%之變化。本技藝之一般技術人士將理解該脂質軛合物之濃度可根據所使用之脂質軛合物和該脂質配製劑變成致融性的速率而變化。
於一些實施態樣中，用於本文所描述之任何組成物的脂質配製劑包含脂質複合物、脂質體、脂質奈米顆粒、基於聚合物之顆粒、外來體、層狀體、膠束或乳劑。 細胞攝取脂質配製劑之作用機制
於一些態樣中，用於細胞內遞送核酸之脂質配製劑，尤其是脂質體、陽離子性脂質體和脂質奈米顆粒係經過設計以藉由滲透靶細胞由細胞攝取，此係透過利用靶細胞之內吞機制進行，其中該脂質遞送載劑之內容物係被遞送至該靶細胞之胞質溶膠。(Nucleic Acid Therapeutics, 28(3)：146-157, 2018)。在內吞之前，在該脂質遞送載劑表面之官能化配體(諸如PEG-脂質)從表面脫落，此觸發內化進入該靶細胞。在內吞期間，該細胞之質膜的一些部分圍繞該載體並將其吞噬入囊泡中，然後從細胞膜縮進去，進入胞質溶膠且最終進入並通過內溶酶體途徑移動。在可離子化之含陽離子性脂質的遞送載劑方面，隨著胞內體老化而增加之酸度導致載劑表面帶有強正電荷。然後，該遞送載劑與胞內體膜之間的交互作用導致膜融合事件，此膜融合事件導致該有效負載之胞質溶膠遞送。在RNA有效負載方面，該細胞自身之內部轉譯過程會將RNA轉譯成該經編碼之蛋白質。所編碼之蛋白質可進一步經歷轉譯後處理，包括運輸至該細胞內之目標細胞器或位置，或從該細胞排泄。
藉由控制該脂質軛合物之組成和濃度，個人可控制該脂質軛合物從該脂質配製劑中交換出來之速率，反過來，可控制該脂質配製劑變成致融性之速率。另外，可使用其他變量(包括，例如pH、溫度或離子強度)來改變和/或控制該脂質配製劑變成致融性之速率。本技藝之技術熟習人士在閱讀本揭示內容之後可清楚明白可用來控制該脂質配製劑變成致融性之速率的其他方法。同樣地，藉由控制該脂質軛合物之組成和濃度，個人可控制該脂質體或脂質顆粒之大小。 脂質配製劑製造
有許多不同方法可用來製備包含核酸之脂質配製劑。(Curr. Drug Metabol. 2014, 15, 882-892；Chem. Phys. Lipids 2014, 177, 8-18；Int. J. Pharm. Stud. Res. 2012, 3, 14-20)。本文簡要地描述薄膜水化、雙乳劑、逆相蒸發、微流體製備、雙不對稱性離心、乙醇注射、清潔劑透析、藉由乙醇稀釋之自發性囊泡形成和封裝在預製之脂質體中的技術。 薄膜水化
在薄膜水化(TFH)或Bangham方法中，將脂質溶解在有機溶劑中，然後透過使用旋轉蒸發儀進行蒸發來導致形成薄的脂質層。藉由含有該欲裝載之化合物的水性緩衝溶液將層水化後，形成多層囊泡(MLV)，該多層囊泡可藉由通過膜擠出或將該起始MLV進行超音波處理來縮小其尺寸，從而產生小或大的單層囊泡(LUV和SUV)。 雙重乳劑
脂質配製劑亦可透過雙重乳劑技術製備，該雙重乳劑技術涉及將脂質溶解在水/有機溶劑混合物中。將該含有水滴之有機溶液與過量的水性介質混合以導致形成水包油包水(W/O/W)雙重乳劑。機械劇烈搖動後，部分水滴坍塌，產生大的單層囊泡(LUV)。 逆相蒸發
逆相蒸發(REV)法亦允許個人取得裝載核酸之LUV。在該技術中，藉由將磷脂溶解在有機溶劑和水性緩衝液中來形成雙相系統。然後將所產生之懸浮液短暫進行超音波處理，直至該混合物變成透明之單相分散體。將該有機溶劑在減壓下蒸發後取得該脂質配製劑。該技術已被用於包封包括核酸之不同的大和小的親水性分子。 微流體製備
與其他批量技術不同，該微流體方法提供控制脂質水合過程之可能性。根據操縱流之方式，該方法可分為連續流微流體和基於液滴之微流體。在以連續流動模式操作之微流體流體動力聚焦(MHF)方法中，脂質係溶解在異丙醇中，異丙醇係流體動力聚焦在介於二個水性緩衝液流之間的微通道交叉接合處。囊泡大小可藉由調節流速來控制，從而控制該脂質溶液/緩衝液稀釋過程。該方法可藉由使用由三個入口和一個出口組成之微流體裝置來生產寡核苷酸(ON)脂質配製劑。 雙不對稱離心
雙不對稱離心(DAC)與較常見之離心不同，因為其使用環繞其自身之垂直軸的附加旋轉。由於產生二個重疊運動，因此達到有效均質化：如同在常規之離心機中，該樣品被向外推，然後由於額外之旋轉，該樣品被推向小瓶的中心。藉由混合脂質和NaCl溶液可獲得黏性囊泡磷脂凝膠(VPC)，然後將其稀釋以獲得脂質配製劑分散體。該脂質配製劑尺寸可藉由優化DAC速度、脂質濃度和均質時間來調節。 乙醇注射
乙醇注射(EI)法可用於核酸封裝。該方法透過使用針頭來將其中已溶解脂質之乙醇溶液快速注射入含有欲包封之核酸的水性介質中。當該磷脂被分散在整個介質中時，囊泡可自發形成。 清潔劑透析
清潔劑透析方法可用於包封核酸。簡單地說，將脂質和質粒溶解在具有適當離子強度之清潔劑溶液中，藉由透析除去清潔劑後，形成穩定之脂質配製劑。然後藉由離子交換色層分析法除去未包封之核酸，並藉由蔗糖密度梯度離心法去除空囊泡。該技術對陽離子性脂質含量和透析緩衝液之鹽濃度高度敏感，且該方法亦難以規模化。 藉由乙醇稀釋自發形成囊泡
穩定之脂質配製劑亦可藉由乙醇稀釋法透過自發形成囊泡來產生，其中逐步或逐滴之乙醇稀釋可瞬時形成裝載核酸之囊泡，此可藉由以經控制之方式在含有該核酸之快速混合的水性緩衝液中添加溶解在乙醇中的脂質進行。 包封在預先形成之脂質體中
捕捉核酸亦可透過二種不同的方法從預先形成之脂質體開始來達成：(1)將陽離子性脂質體與核酸簡單混合，如此可產生稱為“脂質複合物(lipoplex)”之靜電複合物，核酸可在此複合物中成功地用來轉染細胞培養，但其特徵為低包封效率且在體內性能較差；(2)脂質體去穩定化，在陽離子囊泡之懸浮液中緩慢加入無水乙醇直至濃度為40%v/v，然後逐滴加入核酸以取得經裝載之囊泡；然而，該二個決定該包封過程之特徵的主要步驟過於敏感且顆粒之尺寸必須縮小。 賦形劑
本文揭示之醫藥組成物可使用一或多種賦形劑配製，以：(1)增加穩定性；(2)增加細胞轉染；(3)允許持續釋放或延遲釋放(例如從多核苷酸、初級構建體或RNA之儲庫型配製劑中釋放)；(4)改變生物分佈(例如將該多核苷酸、初級構建體或RNA靶向特定組織或細胞類型)；(5)增加在體內轉譯經編碼之蛋白質；和/或(6)改變經編碼之蛋白質在體內之釋放變化形廓。
本文所描述之醫藥組成物可藉由藥理學技藝中已知或之後研發的任何方法製備。通常，該等製備方法包括將該活性成分(即，核酸)與賦形劑和/或一或多種其他輔助成分結合之步驟。根據本發明之醫藥組成物可以單一單位劑量和/或以多個單一單位劑量大批製備、包裝和/或出售。
醫藥組成物可另外包含醫藥上可接受之賦形劑，如本文所使用者包括，但不限於適合所需之特定劑型的任何和所有溶劑、分散介質、稀釋劑或其他液體載劑、分散或懸浮助劑、表面活性劑、等張劑、增稠劑或乳化劑、防腐劑，等。
除了習知賦形劑(諸如任何和所有溶劑、分散介質、稀釋劑或其他液體載劑、分散或懸浮助劑、表面活性劑、等張劑、增稠劑或乳化劑、防腐劑)，本揭示內容之賦形劑可包括，但不限於脂質體、脂質奈米顆粒、聚合物、脂質複合物、核-殼奈米顆粒、肽、蛋白質、以初級DNA構建體或RNA轉染之細胞(例如用於移植入個體中)、透明質酸酶、奈米顆粒模擬物及彼等之組合。
因此，本文描述之醫藥組成物可包括一或多種賦形劑，各賦形劑之量為加在一起時可增加該脂質配製劑中之核酸的穩定性、增加該核酸之細胞轉染、增加經編碼之蛋白質的表現和/或改變經編碼之蛋白質的釋放曲線。再者，本發明之RNA可使用自組裝核酸奈米顆粒配製。
用於配製醫藥組成物之各種賦形劑和製備該組成物之技術為本技藝所已知(參見Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, Md., 2006；其全文以引用方式併入本文)。本發明之實施態樣的範圍可考慮使用常規賦形劑介質，但可能與物質或其衍生物不相容(諸如藉由產生任何不希望之生物學作用或以有害方式與該醫藥組成物之任何其他組分交互作用)之任何常規賦形劑介質除外。
本發明之醫藥組成物可進一步依近似生理條件之需要含有醫醫藥上可接受之載體物質，諸如pH調節劑和緩衝劑、張力調節劑和潤濕劑，例如醋酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、山梨糖醇酐單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯及彼等之混合物。在固體組成物方面，可使用常規無毒性醫藥上可接受之載體，其包括，例如製藥級之甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石粉、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂，等。
於本揭示內容之某些實施態樣中，該RNA-脂質配製劑可在緩釋配製劑中投予，例如在包括緩釋聚合物之組成物中投予。該活性劑可與防止快速釋放之載體一起製備，例如控釋載劑，諸如聚合物、微膠囊化之遞送系統或生物黏附凝膠。本發明之各種組成物中之RNA可藉由在組成物中包括延遲吸收之作用劑，例如單硬脂酸鋁水凝膠和明膠來實現延長遞送。 誘導免疫反應之方法
於一些實施態樣中，本發明提供誘導個體之免疫反應的方法。使用本發明提供之方法可誘導任何類型之免疫反應，包括適應性和先天性免疫反應。於一態樣中，使用本發明提供之方法誘導的免疫反應包括抗體反應、細胞免疫反應或抗體反應和細胞免疫反應二者。
本發明提供之誘導免疫反應的方法包括對個體投予有效量之本發明提供的任何核酸分子。於一態樣中，誘導免疫反應之方法包括對個體投予有效量之包含本發明提供之核酸分子和脂質的任何組成物。於另一態樣中，誘導免疫反應之方法包括對個體投予有效量之包含本發明提供之核酸分子和脂質配製劑的任何醫藥組成物。於一些態樣中，本發明提供之核酸分子、組成物和醫藥組成物為可以引發，例如保護性或治療性免疫反應之疫苗。
如本文所使用之術語“個體”係指對其執行本發明之方法的任何個體或患者。術語“個體(subject)”可與術語“個體(individual)”或“患者”互換使用。本技藝之人士將理解該個體可為人，儘管該個體可為動物。因此，其他動物，包括哺乳動物，諸如囓齒動物(包括小鼠、大鼠、倉鼠和豚鼠)、貓、狗、兔子、農場動物(包括牛、馬、山羊、綿羊、豬，等)，以及靈長類動物(包括猴子、黑猩猩、猩猩和大猩猩)係包括在個體之定義中。如本文所使用之術語“有效量”或“治療有效量”係指足以實現預期之應用效果(包括，但不限於誘導如本文所定義之免疫反應和/或疾病治療)的本文所描述之核酸分子、組成物或醫藥組成物的量。該治療有效量可能根據預期之應用(例如，誘導免疫反應、治療、在體內施用)或該個體或患者以及接受治療之疾病病況，例如個體之體重和年齡、物種、該疾病病況之嚴重程度、投予方式，等而有不同，此可由本技藝之一般技術人士輕易地決定。該術語亦適用於將在靶細胞中誘導特定反應之劑量。該特定劑量將根據所選擇之特定核酸分子、組成物或醫藥組成物、欲遵循之給藥方案、是否與其他化合物聯合投予、投予時點、欲對其投予之組織和承載該劑量之物理遞送系統而變化。
可投予之核酸分子的示例性劑量包括約0.01 μg、約0.02 μg、約0.03 μg、約0.04 μg、約0.05 μg、約0.06 μg、約0.07 μg、約0.08 μg、約0.09 μg、約0.1 μg、約0.2 μg、約0.3 μg、約0.4 μg、約0.5 μg、約0.6 μg、約0.7 μg、約0.8 μg、約0.9 μg、約1.0 μg、約1.5 μg、約2.0 μg、約2.5 μg、約3.0 μg、約3.5 μg、約4.0 μg、約4.5 μg、約5.0 μg、約5.5 μg、約6.0 μg、約6.5 μg、約7.0 μg、約7.5 μg、約8.0 μg、約8.5 μg、約9.0 μg、約9.5 μg、約10 μg、約11 μg、約12 μg、約13 μg、約14 μg、約15 μg、約16 μg、約17 μg、約18 μg、約19 μg、約20 μg、約21 μg、約22 μg、約23 μg、約24 μg、約25 μg、約26 μg、約27 μg、約28 μg、約29 μg、約30 μg、約35 μg、約40 μg、約45 μg、約50 μg、約55 μg、約60 μg、約65 μg、約70 μg、約75 μg、約80 μg、約85 μg、約90 μg、約95 μg、約100 μg、約125 μg、約150 μg、約175 μg、約200 μg、約250 μg、約300 μg、約350 μg、約400 μg、約450 μg、約500 μg、約600 μg、約700 μg、約800 μg、約900 μg、約1,000 μg或更多，以及其間之任何數目或範圍。於一態樣中，該核酸分子為RNA分子。於另一態樣中，該核酸分子為DNA分子。核酸分子可在單一劑量中具有包含約0.01 μg至約1,000 μg或更多核酸之單位劑量。
於一些態樣中，本發明提供之可投予的組成物包括約0.01 μg、約0.02 μg、約0.03 μg、約0.04 μg、約0.05 μg、約0.06 μg、約0.07 μg、約0.08 μg、約0.09 μg、約0.1 μg、約0.2 μg、約0.3 μg、約0.4 μg、約0.5 μg、約0.6 μg、約0.7 μg、約0.8 μg、約0.9 μg、約1.0 μg、約1.5 μg、約2.0 μg、約2.5 μg、約3.0 μg、約3.5 μg、約4.0 μg、約4.5 μg、約5.0 μg、約5.5 μg、約6.0 μg、約6.5 μg、約7.0 μg、約7.5 μg、約8.0 μg、約8.5 μg、約9.0 μg、約9.5 μg、約10 μg、約11 μg、約12 μg、約13 μg、約14 μg、約15 μg、約16 μg、約17 μg、約18 μg、約19 μg、約20 μg、約21 μg、約22 μg、約23 μg、約24 μg、約25 μg、約26 μg、約27 μg、約28 μg、約29 μg、約30 μg、約35 μg、約40 μg、約45 μg、約50 μg、約55 μg、約60 μg、約65 μg、約70 μg、約75 μg、約80 μg、約85 μg、約90 μg、約95 μg、約100 μg、約125 μg、約150 μg、約175 μg、約200 μg、約250 μg、約300 μg、約350 μg、約400 μg、約450 μg、約500 μg、約600 μg、約700 μg、約800 μg、約900 μg、約1,000 μg或更多，以及其間之任何數目或範圍的核酸和脂質。於其他態樣中，本發明提供之可投予的醫藥組成物包括約0.01 μg、約0.02 μg、約0.03 μg、約0.04 μg、約0.05 μg、約0.06 μg、約0.07 μg、約0.08 μg、約0.09 μg、約0.1 μg、約0.2 μg、約0.3μg、約0.4 μg、約0.5 μg、約0.6 μg、約0.7 μg、約0.8 μg、約0.9 μg、約1.0 μg、約1.5 μg、約2.0 μg、約2.5 μg、約3.0 μg、約3.5 μg、約4.0 μg、約4.5 μg、約5.0 μg、約5.5 μg、約6.0 μg、約6.5 μg、約7.0 μg、約7.5 μg、約8.0 μg、約8.5 μg、約9.0 μg、約9.5 μg、約10 μg、約11 μg、約12 μg、約13 μg、約14 μg、約15 μg、約16 μg、約17 μg、約18 μg、約19 μg、約20 μg、約21 μg、約22 μg、約23 μg、約24 μg、約25 μg、約26 μg、約27 μg、約28 μg、約29 μg、約30 μg、約 35 μg、約40 μg、約45 μg、約50 μg、約55 μg、約60 μg、約65 μg、約70 μg、約75 μg、約80 μg、約85 μg、約90 μg、約95 μg、約100 μg、約125 μg、約150 μg、約175 μg、約200 μg、約250 μg、約300 μg、約350 μg、約400 μg、約450 μg、約500 μg、約600 μg、約700 μg、約800 μg、約900 μg、約1,000 μg或更多，以及其間之任何數目或範圍的核酸和脂質配製劑。
於一態樣中，本發明提供之組成物可在單一劑量中具有包含約0.01 μg至約1,000 μg或更多核酸和脂質之單位劑量。於另一態樣中，本發明提供之組成物可具有在單一劑量中具有包含約0.01 μg至約1,000 μg或更多核酸和脂質配製劑之單位劑量。疫苗單位劑量可對應於本發明提供之核酸分子、組成物或醫藥組成物的單位劑量且可對個體投予。於一態樣中，本發明之疫苗組成物在單一劑量中具有包含約0.01 μg至約1,000 μg或更多核酸和脂質配製劑之單位劑量。於另一態樣中，本發明之疫苗組成物在單一劑量中具有包含約0.01 μg至約50 μg或更多核酸和脂質配製劑之單位劑量。再於另一態樣中，本發明之疫苗組成物在單一劑量中具有包含約0.2 μg至約20 μg或更多核酸和脂質配製劑之單位劑量。
本發明之組成物的劑型可為固體，其可在投予前在液體中重構。該固體可以粉末形式投予。該固體可為膠囊、片劑或凝膠之形式。於一些實施態樣中，該醫藥組成物包含已經凍乾之核酸脂質配製劑。於一些實施態樣中，該凍乾之組成物可包含一或多種凍乾保護劑，諸如，包括，但不一定侷限於葡萄糖、海藻糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇、肌醇、羥丙基-β-環糊精和/或聚乙二醇。於一些實施態樣中，該凍乾之組成物包含泊洛沙姆、山梨酸鉀、蔗糖或彼等之任何組合。於具體之實施態樣中，該泊洛沙姆為泊洛沙姆188。於一些實施態樣中，本文描述之凍乾組成物可包含約0.01至約1.0 % w/w之泊洛沙姆。於一些實施態樣中，本文描述之凍乾組成物可包含約1.0至約5.0 % w/w之山梨酸鉀。該百分比可為所列舉之範圍內的任何數值或子值，包括端點。
於一些實施態樣中，該凍乾之組成物可包含約0.01至約1.0 % w/w之核酸分子。於一些實施態樣中，該組成物可包含約1.0至約5.0 % w/w之脂質。於一些實施態樣中，該組成物可包含約0.5至約2.5 % w/w之TRIS緩衝液。於一些實施態樣中，該組成物可包含約0.75至約2.75 % w/w之NaCl。於一些實施態樣中，該組成物可包含約85至約95 % w/w之糖。該百分比可為所列舉之範圍內的任何數值或子值，包括端點。
於一較佳之實施態樣中，本文描述之醫藥組成物的劑型可為本文所描述之自我複製RNA脂質奈米顆粒的液體懸浮液。於一些實施態樣中，該液體懸浮液係在緩衝溶液中。於一些實施態樣中，該緩衝之溶液包含選自由下列所組成之群組的緩衝劑：HEPES、MOPS、TES和TRIS。於一些實施態樣中，該緩衝液之pH為約7.4。於一些較佳之實施態樣中，該緩衝液為HEPES。於一些進一步之實施態樣中，該緩衝之溶液進一步包含冷凍保護劑。於一些實施態樣中，該冷凍保護劑係選自糖和甘油或糖和甘油之組合。於一些實施態樣中，該糖為二聚醣。於一些實施態樣中，該糖為蔗糖。於一些較佳之實施態樣中，該緩衝液包含HEPES、蔗糖和甘油，pH為7.4。於某些實施態樣中，該組成物包含HEPES、MOPS、TES或TRIS緩衝液，pH為約7.0至約8.5。於一些實施態樣中，該HEPES、MOPS、TES或TRIS緩衝液之濃度可在7 mg/mL至約15 mg/mL之範圍內。該pH或濃度可為所列舉之範圍內的任何數值或子值，包括端點。
於一些實施態樣中，在儲存期間將懸浮液冷凍並在投予前解凍。於一些實施態樣中，將懸浮液冷凍在低於約70℃之溫度下。於一些實施態樣中，在靜脈內投予期間將懸浮液以無菌水稀釋。於一些實施態樣中，靜脈內投予包含使用約2體積至約6體積之無菌水稀釋該懸浮液。於一些實施態樣中，該懸浮液包含約0.1 mg至約3.0 mg之自我複製RNA/mL、約15 mg/mL至約25 mg/mL之可離子化之陽離子性脂質、約0.5 mg/mL至約2.5 mg/mL之PEG-脂質、約1.8 mg/mL至約3.5 mg/mL之輔助脂質、約4.5 mg/mL至約7.5 mg/mL之膽固醇、約7 mg/mL至約15 mg/mL之緩衝液、約2.0 mg/mL至約4.0 mg/mL之NaCl、約70 mg/mL至約110 mg/mL之蔗糖和約50 mg/mL至約70 mg/mL之甘油。於一些實施態樣中，凍乾之自我複製RNA-脂質奈米顆粒配製劑可重新懸浮於如本文所描述之緩衝液中。
於一些實施態樣中，對個體投予本發明之組成物，從而在單一劑量中或以單一治療週期之一部分的形式投予至少約0.05 mg/kg體重、至少約0.1 mg/kg體重、至少約0.5 mg/kg體重、至少約1.0 mg/kg體重、至少約2.0 mg/kg體重、至少約3.0 mg/kg體重、至少約4.0 mg/kg體重、至少約5.0 mg/kg體重之自我複製RNA濃度。於一些實施態樣中，對個體投予本發明之組成物，從而在一或多個劑量中投予總量為至少約0.1 mg、至少約0.5 mg、至少約1.0 mg、至少約2.0 mg、至少約3.0 mg、至少約4.0 mg、至少約5.0 mg、至少約6.0 mg、至少約7.0 mg、至少約8.0 mg、至少約9.0 mg、至少約10 mg、至少約15 mg、至少約20 mg、至少約25 mg、至少約30 mg、至少約35 mg、至少約40 mg、至少約45 mg、至少約50 mg、至少約55 mg、至少約60 mg、至少約65 mg、至少約70 mg、至少約75 mg、至少約80 mg、至少約85 mg、至少約90 mg、至少約95 mg、至少約100 mg、至少約105 mg、至少約110 mg、至少約115 mg、至少約120 mg或至少約125 mg之自我複製RNA，至多為最大劑量約300 mg、約350 mg、約400 mg、約450 mg或約500 mg之自我複製RNA。
本發明提供之方法中可包括任何投予途徑。於一些態樣中，本發明提供之核酸分子、組成物和醫藥組成物係經由肌肉內、皮下、皮內、透皮、鼻內、口服、舌下、靜脈內、腹膜內、局部、藉由氣霧劑或藉由過肺部途徑(諸如，例如藉由吸入或霧化)投予。於一些實施態樣中，所描述之醫藥組成物係經由全身性途徑投予。合適之投予途徑包括，例如口服、直腸、陰道、透黏膜、肺(包括氣管內或吸入)，或腸內投予；腸胃道外遞送，包括皮內、透皮(局部)、肌肉內、皮下、髓內注射，以及鞘內、直接心室內、靜脈內、腹膜內或鼻內注射。於特定之實施態樣中，肌肉內投予係投予至選自由下列所組成之群體的肌肉：骨骼肌、平滑肌和心肌。於一些實施態樣中，該醫藥組成物係經由靜脈內投予。
醫藥組成物可投予至任何期望之組織。於一些實施態樣中，該遞送之自我複製RNA係表現在與經投予該脂質配製劑或醫藥組成物之組織不同的組織中。於較佳之實施態樣中，自我複製RNA係遞送至肝臟，並在肝臟中表現。
於其他態樣中，本發明提供之核酸分子、組成物和醫藥組成物係經由肌肉內途徑投予。
於一些態樣中，其中誘導免疫反應之個體為健康個體。如本文所使用之術語“健康個體”係指不具有病況或疾病(包括，例如傳染病或癌症)，或不具有該經誘導之免疫反應所針對之病況或疾病的個體。因此，於一些態樣中，本發明提供之核酸分子、組成物或醫藥組成物係經預防性地投予以預防，例如傳染病或癌症。於其他態樣中，其中經誘導免疫反應之個體患有癌症。該個體可能患有任何癌症或具有任何腫瘤，包括實體瘤和液體瘤。於一態樣中，該癌症為腎臟癌(kidney cancer)、腎癌(renal cancer)、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、乳癌、子宮頸癌、卵巢癌、肺癌、肝癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、口腔癌、喉癌、胰腺癌、甲狀腺癌、黑色素瘤、皮膚癌、頭頸癌、腦癌、造血系統癌、白血病、淋巴瘤、骨癌或肉瘤。因此，本發明提供之核酸分子、組成物或醫藥組成物可在病況或疾病，諸如癌症發作後治療性投予，即，用於治療病況或疾病。
如本文所使用之術語“治療(treat)”、“治療(treatment)”、“療法(therapy)”、“治療的(therapeutic)”，等係指獲得期望之藥理和/或生理效果，包括，但不限於減輕、延遲或減緩疾病或病症之進展、減輕其影響或症狀、預防疾病或病症發作、抑制、改善疾病或病症發作、獲得與疾病、病症或醫學狀況相關之有益或期望的結果，諸如治療益處和/或預防益處。如本文所使用之“治療”包括對哺乳動物，特別是對人類之疾病的任何治療，且包括：(a)防止疾病在個體中發生，包括易罹患該疾病或處於得到該疾病之風險中，但尚未被診斷為患有該疾病之個體；(b)抑制該疾病，即，阻止其發展；(c)減輕該疾病，即，使疾病消退。治療益處包括清除或改善所治療之潛在疾病。再者，治療益處可藉由消除或改善與潛在疾病相關之一或多種生理症狀，從而在個體中觀察到改善來實現，雖然個體仍可能患有潛在疾病。於一些態樣中，為了預防益處，對處於發展出特定疾病之風險中的個體，或對報告一或多種疾病之生理症狀的個體投予治療或用於治療之組成物，包括醫藥組成物，即使可能尚未診斷出該疾病。本發明之方法可與任何哺乳動物或其他動物一起使用。於一些態樣中，治療導致症狀減輕或停止。預防作用包括延遲或消除疾病或病況出現、延遲或消除疾病或病況之症狀發作、減緩、停止或逆轉疾病或病況進展，或彼等之任何組合。
本發明提供之核酸分子、組成物和醫藥組成物可投予一次或多次。因此，本發明提供之核酸分子、組成物和醫藥組成物可投予一次、二次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或更多次。介於二或更多次投予之間的時間間隔可為一週、二週、三週、四週、五週、六週、七週、八週、九週、十週、11週、12週、13週、14週、15週、16週、17週、18週、19週、20週、21週、22週、23週、24週、25週、26週、27週、28週、29週、30週、31週、32週、33週、34週、35週、36週、37週、38週、39週、40週、41週、42週、43週、44週、45週、46週、47週、48週、49週、50週、51週、52週或更長之時間，以及介於其間之任何數目或範圍。於一些態樣中，介於二或更多次投予之間的時間間隔可為一個月、二個月、三個月、四個月、五個月、六個月、七個月、八個月、九個月、十個月、11個月、12個月、13個月、14個月、15個月、16個月、17個月、18個月、19個月、20個月、21個月、22個月、23個月、24個月或更多個月，以及介於其間之任何數目或範圍。於其他態樣中，介於二或更多次投予之間的時間間隔可為一年、二年、三年、四年、五年、六年、七年、八年、九年、十年或更多年，以及介於其間之任何數目或範圍。介於第一次和任何後續投予之間的時間間隔可為相同或不同。於一態樣中，本發明提供之核酸分子、組成物或醫藥組成物係投予一次。
本發明提供之方法中可投予一種以上之核酸分子、組成物或醫藥組成物。於一態樣中，本發明提供之二或更多種核酸分子、組成物或醫藥組成物係同時投予。於另一態樣中，本發明提供之二或更多種核酸分子、組成物或醫藥組成物係依序投予。同時和依序投予可包括本發明提供之核酸分子、組成物或醫藥組成物的任何數量和任何組合。同時或依序投予之多種核酸分子、組成物或醫藥組成物可包括編碼不同抗原蛋白或其片段的轉基因。以此方式可誘導針對不同抗原靶的之免疫反應。可同時或依次投予二、三、四、五、六、七、八、九、十或更多個包括編碼不同抗原蛋白或其片段之轉基因的核酸分子、組成物或醫藥組成物。可同時或依序投予包括轉基因之任何組合的核酸分子、組成物和醫藥組成物之任何組合。於一些態樣中，投予係同時進行。於其他態樣中，投予係依序進行。介於二或更多次投予之間的時間間隔可為一週、二週、三週、四週、五週、六週、七週、八週、九週、十週、11週、12週、13週、14週、15週、16週、17週、18週、19週、20週、21週、22週、23週、24週、25週、26週、27週、28週、29週、30週、31週、32週、33週、34週、35週、36週、37週、38週、39週、40週、41週、42週、43週、44週、45週、46週、47週、48週、49週、50週、51週、52週或更長之時間，以及介於其間之任何數目或範圍。於一些態樣中，介於二或更多次投予之間的時間間隔可為一個月、二個月、三個月、四個月、五個月、六個月、七個月、八個月、九個月、十個月、11個月、12個月、13個月、14個月、15個月、16個月、17個月、18個月、19個月、20個月、21個月、22個月、23個月、24個月或更長之時間，以及介於其間之任何數目或範圍。於其他態樣中，介於二或更多次投予之間的時間間隔可為一年、二年、三年、四年、五年、六年、七年、八年、九年、十年或更多年，以及介於其間之任何數目或範圍。介於第一次和任何後續投予之間的時間間隔可為相同或不同。本發明提供之核酸分子、組成物和醫藥組成物可與任何其他疫苗或治療一起投予。
將組成物投予個體後，可在靶的組織中檢測到由本發明之自我複製RNA所編碼之蛋白質產物(例如抗原)至少約1至7天或更久。實現治療效果所需之蛋白質產物的量將根據在患者中產生對COVID-19之免疫力所需的抗體效價而變化。例如，將組成物投予個體後，在靶的組織中可檢測到之蛋白質產物的濃度(例如治療濃度)為至少約0.025至1.5 μg/ml(例如，至少約0.050 μg/ml、至少約0.075 μg/ml、至少約0.1 μg/ml、至少約0.2 μg/ml、至少約0.3 μg/ml、至少約0.4 μg/ml、至少約0.5 μg/ml、至少約0.6 μg/ml、至少約0.7 μg/ml、至少約0.8 μg/ml、至少約0.9 μg/ml、至少約1.0 μg/ml、至少約1.1 μg/ml、至少約1.2 μg/ml、至少約1.3 μg/ml、至少約1.4 μg/ml或至少約1.5 μg/ml)，持續至少約1、2、3、4、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45天或更長之時間。
於一些實施態樣中，本文所描述之組成物可投予一次。於一些實施態樣中，本文所描述之組成物可投予二次。
於一些實施態樣中，可將該組成物以加強劑量之形式投予至先前已接種對抗冠狀病毒之疫苗的個體。
於一些實施態樣中，每個月對個體投予一次本發明之醫藥組成物。於一些實施態樣中，每個月對個體投予二次本發明之醫藥組成物。於一些實施態樣中，每個月對個體投予三次本發明之醫藥組成物。於一些實施態樣中，每個月對個體投予四次本發明之醫藥組成物。
或者，本發明之組成物可以局部而非全身性方式投予，例如，經由將醫藥組成物直接注射在靶的組織中，較佳為長效配製劑或緩釋配製劑。局部遞送根可據欲靶向之組織以各種不同方式起作用。例如，可吸入含有本發明之組成物的氣霧劑(用於鼻、氣管或支氣管遞送)；例如，可將本發明之組成物注射至損傷、疾病表現或疼痛之部位；組成物可以用於口服、氣管或食道施用之錠劑形式提供；可以用於投予至胃或腸道之液體、片劑或膠囊形式供應、可以用於直腸或陰道施用之栓劑形式供應；或甚至可藉由使用乳霜、滴劑或甚至注射劑遞送到眼睛。含有與治療性分子或配體複合之本發明的組成物之配製劑甚至可經手術投予(例如與可允許組成物從植入部位擴散至周圍細胞之聚合物或其他結構或物質結合)。或者，其可在不使用聚合物或輔助品之情況下藉由外科手術施用。 組合物
本文所描述之自我複製RNA、其配製劑或編碼之蛋白質可與一或多種其他治療劑、預防劑、診斷劑或成像劑組合使用。“與……組合”並不意味該作用劑必須同時投予和/或經配製以一起遞送，儘管這些遞送方法係在本發明之範圍內。組成物可與一或多種其他需要之治療或醫學程序同時、在醫學程序之前或之後投予。通常，各作用劑將以為該作用劑決定之劑量和/或時間表投予。較佳地，本發明之治療方法包含將藥學、預防性、診斷性或成像組成物與可改善彼等之生物可利用度、減少和/或修飾彼等之代謝、抑制彼等之排泄和/或修飾彼等在體內之分佈的作用劑組合遞送。作為非限制性實例，本發明之自我複製RNA可與用於將個體免疫化或免疫接種之藥劑組合使用。通常，期望與本發明之自我複製RNA及其配製劑組合使用之作用劑的用量不超過它們個別使用之量。於一些實施態樣中，該組合中所使用之量將低於個別使用之量。於一實施態樣中，該組合物可根據本技藝已知之分開給藥方案各自或一起投予。 範圍
本揭示內容之全文中，各種態樣可以範圍形式呈現。應理解的是，範圍格式之任何描述僅是為了方便和簡潔，並不意圖限制。因此，範圍之描述應被視為已具體揭示所有可能之子範圍以及該範圍內之個別數值。例如，對範圍之描述(諸如從1至6)應被視為已具體揭示諸如從1至3、從1至4、從1至5、從2至4、從2至6、從3至6，等之子範圍，以及該範圍內之個別數字，例如1、2、2.1、2.2、2.5、3、4、4.75、4.8、4.85、4.95、5、5.5、5.75、5.9、5.00和6。此適用於任何幅度之範圍。實施例 實施例 1
本實施例描述mRNA和自我複製RNA(STARRTM )平台之設計和表現的比較。
mRNA和STARRTM 疫苗構建體均經過設計以編碼全長SARS-CoV-2 S蛋白(1273aa)，而STARRTM 自我複製RNA另外編碼委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)複製酶基因(第1A圖；STARRTM 疫苗構建體，其對應於具有SEQ ID NO：125之序列的RNA，其中U代替T，本文中稱為“STARRTM SARS-CoV-2 RNA”；mRNA對應於SEQ ID NO：126之序列，其中U代替T且包括煙草蝕刻病毒(TEV)5'UTR、非洲爪蟾β-球蛋白(Xbg)3'UTR和編碼SARS-CoV-2糖蛋白之密碼子優化的開放閱讀框)。首先研究這些不同構建體之特性。將構建體包封在相同之LNP組成物中。簡言之，將RNA構建體包封在脂質奈米顆粒(LNP)中，該脂質奈米顆粒(LNP)包括分散在HEPES緩衝液(pH 8.0)中之4種脂質賦形劑(可離子化之陽離子性脂質、1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)、膽固醇和PEG2000-DMG)，該HEPES緩衝液(pH 8.0)含有氯化鈉及冷凍保護劑蔗糖和甘油。該可離子化陽離子性脂質具有以下結構：
Figure 02_image167
不管mRNA和STARRTM SARS-CoV-2 RNA構建體之RNA長度的差異，該LNP直徑、多分散性指數和RNA捕集效率相似(第1B圖)。轉染後24小時透過S蛋白之陽性西方點墨檢測來確認細胞溶胞產物中之mRNA疫苗和STARRTM SARS-CoV-2 RNA構建體的體外表現(第1C圖)。亦觀察到mRNA和STARRTM 疫苗均表現全長S蛋白和裂解之S蛋白(即，S被裂解為S1和S2跨膜和胞質膜結構域)之混合物(第1C圖)。藉由使用表現螢光素酶報告子之mRNA和STARRTM 構建體來比較BALB/c小鼠體內二種RNA平台之蛋白質表現(第1D圖)。雖然表現水準隨時間降低，注射mRNA疫苗構建體之動物在第1天顯示高體內螢光素酶表現。相反地，注射STARRTM 之小鼠中的螢光素酶表現直至接種後第7天仍顯示出持續甚至增加之信號，除了那些被給予0.2 μg劑量者外(第1D圖)。
這些數據表明劑量對劑量下，與mRNA疫苗相比較，STARRTM 之抗原表現更加延長。實施例 2
本實施例描述接種STARRTM 構建體和mRNA疫苗後之免疫基因表現。
為C57BL/6J小鼠接種劑量為0.2 μg、2 μg和10 μg之STARRTM SARS-CoV-2 RNA(編碼如上述之SARS-CoV-2糖蛋白(實施例1))和mRNA疫苗或PBS對照組。前4天動物體重無顯著之平均減輕發生，除了那些接受10 μg之STARRTM SARS-CoV-2 RNA者(第2A圖)。然而，除了體重減輕以外，臨床評分之最小差異表明其他臨床徵狀很少。接種疫苗後第3天體重和臨床評分均得到改善。
先天免疫反應(諸如第I型干擾素(IFN)反應)先前已被證明與，例如接種黃熱病疫苗後之疫苗免疫原性有關。此外，活性氧類驅動之促炎反應已證明會加強黃熱病疫苗接種中之全身性不良事件。因此，測量接種PBS、mRNA疫苗或STARRTM SARS-CoV-2 RNA構建體之C57BL/6小鼠之全血中的先天免疫和促炎性基因之表現。與mRNA疫苗或PBS相比較，接種STARRTM SARS-CoV-2 RNA之動物中第I型IFN途徑中之基因的表現最高(第2B圖和第8圖)。相反地，與mRNA疫苗或PBS相比較，接種STARRTM SARS-CoV-2 RNA後，與促炎反應相關之基因大多大量減少(第2B圖和第8圖)。
由於適應性免疫反應係在引流淋巴結之生發中心發展，因此在接種後第7天解剖該引流淋巴結(第2A圖中之研究示意圖)。與接種mRNA疫苗或PBS之小鼠不同，接種STARRTM SARS-CoV-2 RNA之小鼠的腹股溝淋巴結顯示出重量呈劑量依賴性增加；來自接受10 μg之STARRTM SARS-CoV-2 RNA的小鼠之淋巴結的平均重量顯著高於接受等效mRNA疫苗者(第2C圖)。免疫基因表現之主成分分析(PCA)顯示出與PBS對照組(STARRTM RNA)背離之對3種STARRTM SARS-CoV-2 RNA劑量中之各劑量的叢聚反應：其描繪成第2D圖中較下方之球體，第2E圖中之最小球體，和第2F圖中較下方之球體；PBS對照組：其描繪成第2D圖中較上方之球體，第2E圖中較下方之長而狹窄的球體和第2F圖中較上方之球體，其表明接種STARRTM SARS-CoV-2 RNA和安慰劑組之間的免疫基因表現有明顯差異。這些趨勢亦與接受mRNA疫苗之小鼠的趨勢不相似，接受mRNA疫苗之小鼠在所有測試劑量下，PCA均顯示出與安慰劑基本上重疊(mRNA：以第2D圖中之中心球體、第2E圖中之大直立球體和第2F圖中沿著中心正方形底部之具有四個數據點之平線表示；安慰劑(PBS對照組)：以第2D圖中較上方之球體、第2E圖中較下方之長而狹窄之球體和第2F圖中較上方之球體表示)。
接著評估與那些接種mRNA疫苗之小鼠相比較時接受STARRTM SARS-CoV-2 RNA之小鼠的淋巴結中之差別表現的基因。火山圖分析鑑定出經免疫接種STARRTM SARS-CoV-2 RNA之動物中數種先天、B細胞和T細胞基因顯著上調(第2G至2 I圖)。差別表現程度最高的一些基因包括，例如GZMB(對細胞毒性免疫細胞殺死靶細胞很重要)、S100A8和S100A9(經由TLR4調節免疫反應之因子)、TNFRSF17(亦稱為BCMA並調節體液免疫)、CXCR3(涉及T細胞運輸和功能之趨化素受體)和AICDA(介導B細胞中之抗體類別轉換和體細胞超突變)。
這些發現共同表明與接種非複製型mRNA疫苗之小鼠的免疫反應相比較，接種STARRTM SARS-CoV-2 RNA之小鼠的引流淋巴結中的適應性免疫反應似乎顯著不同。實施例 3
本實施例描述由STARRTM SARS-CoV-2 RNA誘導之T細胞反應。
接著調查為C57BL/6小鼠(每組n=5)接種如上述之編碼SARS-CoV-2糖蛋白的mRNA或STARRTM SARS-CoV-2 RNA構建體(實施例1)疫苗後之細胞免疫反應。接種疫苗後第7天，收穫脾臟並藉由流式細胞術評估CD8和CD4 T細胞。與接種PBS或mRNA疫苗之小鼠相比較，接種STARRTM SARS-CoV-2 RNA疫苗之小鼠中，CD8+T細胞CD44+CD62L-效應子/記憶細胞亞群顯著擴增(第3A至B圖)。這些動物之CD4+T效應細胞的比例並無統計學上顯著之差異(第3C圖)。使用細胞內染色(ICS)與流式細胞術時發現與接種mRNA疫苗之動物相比較，接種STARRTM SARS-CoV-2 RNA之動物中的IFN γ+CD8+T細胞(使用2 μg和10 μg劑量)和IFN γ+CD4+T細胞(使用0.2 μg和10 μg劑量)成比例地較高(第3D至3F圖)。
藉由ELISPOT評估接種疫苗之動物中的SARS-CoV-2特異性細胞反應。將一組涵蓋SARS-CoV-2 S蛋白之15-mer肽分成4個匯集庫，並測試經接種和未經接種疫苗之動物的脾細胞中的IFN γ+反應。藉由ELISPOT檢測與PBS對照組相比較時，經接種STARRTM SARS-CoV-2 RNA和mRNA疫苗來免疫化之動物中的SARS-CoV-2特異性細胞反應(以IFN γ+SFU/106細胞表示)(第3G至3 I圖)。與經接種mRNA疫苗之組別相比較，經接種STARRTM SARS-CoV-2 RNA疫苗之組別在各劑量下這些反應均較高(第3G至3 I圖)。即使是mRNA疫苗之最高測試劑量(10 μg)所產生的IFN γ+ELISPOT反應仍明顯低於由STARRTM SARS-CoV-2 RNA疫苗之最低劑量(0.2μg)所產生者。
這些結果表明STARRTM SARS-CoV-2 RNA構建體誘導強T細胞反應。實施例 4
本實施例說明使用STARRTM SARS-CoV-2 RNA進行疫苗接種後之體液反應。
在二種不同的小鼠模型BALB/c和C57BL/6中決定接種疫苗後之SARS-CoV-2特異性體液反應的特徵。在第0天為雌性小鼠(每組n=5)接種疫苗並每10天抽血，在BALB/c方面直至第60天，而在C57BL/6方面直至第30天(第4A圖)。使用內部Luminex免疫分析，以1：2000血清稀釋度測試SARS-CoV-2 S特異性IgM反應。所有測試之mRNA疫苗和STARRTM SARS-CoV-2 RNA(對應於SEQ ID NO：125，如上述實施例1中之描述)的劑量均在二種小鼠模型中產生可檢測之S特異性IgM反應(第4B-4C圖)。當將接種mRNA與接種STARRTM SARS-CoV-2 RNA之BALB/c小鼠相比較時，未觀察到IgM反應之差異；在接種疫苗後第10天，C57BL/6小鼠的IgM水準高於STARRTM SARS-CoV-2 RNA之C57BL/6小鼠的IgM水準。相反地，與mRNA疫苗相比較，接種STARRTM SARS-CoV-2 RNA之動物從20天起SARS-CoV-2 S特異性IgG(以1：2000血清稀釋)水準較高(第4D-4E圖)。明顯地，單次接種STARRTM SARS-CoV-2 RNA疫苗之BALB/c和C57BL/6小鼠在所有劑量下均顯示IgG水準持續增加之趨勢，直到接種第50天後。此趨勢與接受mRNA疫苗之小鼠相反，接種mRNA疫苗之BALB/c小鼠在接種後第10天抗體水準達到穩定水準；在已接種mRNA疫苗之C57BL/6小鼠中可觀察到S特異性IgG水準升高，但低於接受STARRTM SARS-CoV-2 RNA之小鼠。
在免疫化後第30天後，進一步表徵接種疫苗之動物的SARS-CoV-2特異性IgG反應以評估S蛋白被靶向之區域。估計對完整胞外結構域S蛋白、S1、S2和受體結合結構域(RBD)區域之IgG終點效價。在二種候選疫苗方面，大多數SARS-CoV-2特異性IgG均識別S1，儘管亦檢測到對S2蛋白具有較高之IgG終點效價(第4F至4G圖)。然而，與由接種mRNA疫苗產生之IgG終點效價相比較，由STARRTM SARS-CoV-2 RNA引發之IgG終點效價明顯較高(第4F至4G圖)。值得注意的是，與經接種mRNA疫苗之動物相比較，在接種STARRTM SARS-CoV-2 RNA疫苗之動物中，與S蛋白之受體結合結構域(RBD)(其為中和抗體之免疫優勢位點)結合的IgG亦較高。此外，在較低劑量下，mRNA疫苗在較具Th1優勢之C57BL/6小鼠品種中難以引起較高之SARS-CoV-2特異性IgG效價，但STARRTM SARS-CoV-2 RNA則否(第4G圖)。綜合起來，與mRNA疫苗相比較，單劑量之STARRTM SARS-CoV-2 RNA在引流淋巴結中引起免疫基因表現之顯著差異和優異之細胞免疫反應，因而引起體液免疫反應。
這些數據表明，與接種mRNA疫苗相比較，STARRTM SARS-CoV-2 RNA疫苗接種誘導提升之體液反應。實施例 5
本實施例說明接種STARRTM SARS-CoV-2 RNA疫苗時免疫增強風險降低。
冠狀病毒疫苗的安全性考慮為由疫苗介導之呼吸系統疾病的免疫增強風險。實際上，SARS-CoV和MERS-CoV疫苗研發突顯Th1偏斜反應的重要性以避免由疫苗誘導之免疫增強。因此，研究由接種mRNA和STARRTM SARS-CoV-2 RNA(如上述實施例1中描述之自我複製RNA構建體)二種疫苗引發之Th1/Th2平衡。漿細胞之IgG亞類命運受T輔助(Th)細胞影響。在接種疫苗後第30天，除C56BL/6J小鼠中之0.2 μg劑量外，mRNA和STARRTM SARS-CoV-2 RNA二者在小鼠中誘導相當量之SARS-CoV-2 S-特異性IgG1(Th2相關之IgG亞類(第5A至5B圖)。相反地，在接種STARRTM SARS-CoV-2 RNA疫苗之動物中，Th1相關之IgG亞類-在BALB/c中之IgG2a和在C56BL/ 6J中之IgG2c-明顯較高。在接種STARRTM SARS-CoV-2 RNA疫苗之動物中，S蛋白特異性IgG2a/IgG1(BALBc)和IgG2c/IgG1(C57BL/6)之比率大於1(第5A至5B圖)。除0.2μg劑量外，與接種mRNA疫苗之動物相比較，接種STARRTM SARS-CoV-2 RNA疫苗之動物中這些比率均明顯較高。
在接種第7天，使用ICS來研究經接種疫苗之C56BL/6J小鼠的脾臟中由CD4+T細胞產生之IFNγ(Th1細胞因子)和IL4(Th2細胞因子)。如上文中所示(實施例3)，與接種mRNA疫苗相比較，接種STARRTM SARS-CoV-2 RNA疫苗之動物中的IFNγ水準明顯較高(第3F圖)。在0.2 μg和2 μg劑量下，與STARRTM SARS-CoV-2 RNA相比較，接種mRNA者之CD4+T細胞中的IL-4表現略高(第5C圖)。比較個別小鼠中之IFNγ和IL4水準，接種STARRTM SARS-CoV-2 RNA和mRNA疫苗之小鼠的CD4+T細胞中之IFNγ/IL4的比率均大於1(第5D圖)。在0.2 μg和2 μg劑量下，接種STARRTM SARS-CoV-2 RNA之小鼠中之CD4+T細胞中的IFNγ/IL4的比率明顯大於接種mRNA疫苗的小鼠(第5F圖)。然而，不受理論的限制，在這些劑量中升高之比率似乎是由於IL4表現水準低於背景水準(即PBS對照小鼠)，而非由於降低IFNγ，而降低Th1活性。
綜合起來，這些數據表明STARRTM SARS-CoV-2 RNA產生Th1而非Th2偏斜之適應性免疫反應。實施例 6
本實施例說明由STARRTM SARS-CoV-2 RNA誘導之體液免疫反應的品質。
接著評估由自我複製之STARRTM SARS-CoV-2 RNA(如上述實施例1中之構建體)和mRNA疫苗構建體引起之抗體反應的結合強度(親和力)和中和能力。在接種後第30天，使用經修飾之Luminex免疫分析，以8M尿素清洗液測量血清IgG親和力。在所有測試之劑量下，在二種小鼠模型中，與mRNA相比較，STARRTM SARS-CoV-2 RNA均引起較高親和力之S蛋白特異性IgG(第6A圖)。在BALB/c中，除了0.2 μg外，所有劑量均觀察到這些差異(第6A圖)，此表明STARRTM SARS-CoV-2 RNA引發較常規mRNA更佳品質之抗體。
使用噬斑減少中和測試(PRNT)來評估以來自經接種疫苗之動物的血清中和活SARS-CoV-2。在第30天，接種STARRTM SARS-CoV-2 RNA疫苗之BALB/c顯示出PRNT50效價中有明顯的劑量依賴性提升；在10 μg STARRTM SARS-CoV-2 RNA組中之5隻小鼠中有4隻(80%)顯示出高於320上限的PRNT50效價(第6B圖)。C57BL/6小鼠中亦發現PRNT50效價有類似之劑量依賴趨勢，雖然在這些動物中，一些動物即使在低於0.2 μg之疫苗接種劑量下其PRNT50效價超過320上限(第6B圖)。相反地，除了接受10 μg劑量的一隻C57BL/6J小鼠外，接種mRNA疫苗構建體之動物中之PRNT50效價均＜20(第6B圖)。出乎意料且令人驚訝的是，接種單劑量之STARRTM SARS-CoV-2 RNA疫苗的BALBc小鼠在接種後第30天至60天之間，PRNT50和PRNT70效價持續升高(第6C至6D圖)。這些效價亦與來自恢復期COVID-19患者之血清中的PRNT70效價相當(第6D圖)。
在二種小鼠模型中，S蛋白IgG效價亦與PRNT50效價呈正相關(第6E圖)。在針對S1和RBD之IgG亦觀察到類似之正相關性(第9圖)。與此相反地，經接種mRNA疫苗之小鼠中IgG與PRNT50效價之間未發現相關性(第6E圖)。綜合起來，不受理論之限制，這些抗體反應分析表明接種STARRTM SARS-CoV-2 RNA疫苗後較高之PRNT50效價非僅歸因於產生之IgG的量，且亦由於抗SARS-CoV-2抗體之品質優越。
總言之，相較於常規mRNA，STARRTM SARS-CoV-2 RNA誘導品質上更優越之體液性免疫反應。實施例 7
本實施例說明第二STARRTM SARS-CoV-2 RNA劑量之效果。
接著探討第二STARRTM SARS-CoV-2 RNA(如上述實施例1中描述之自我複製RNA構建體)劑量對該針對SARS-CoV-2 S之S蛋白的細胞和體液免疫反應可能增加之益處。第二劑量後之臨床評分高於第一劑量後之臨床評分(第7A圖)。如同第一劑量，接受2 μg和10 μg之STARRTM SARS-CoV-2 RNA的小鼠經歷體重減損(第7B圖)。針對第二STARRTM SARS-CoV-2 RNA劑量之IgG反應產生明顯增加之S蛋白特異性IgG水準，但僅在使用0.2 μg和2 μg STARRTM SARS-CoV-2 RNA時(第7C圖)。不受理論限制，在10 μg劑量下抗S蛋白特異性IgG水準未增加可能的原因是該螢光量接近檢測器的飽和點且血清未被進一步稀釋以觀察且增加。然而，在隨後之Balb/c小鼠的研究中，當使用96孔微量中和分析格式來分析時，來自經接種5 μgRNA劑量之小鼠的血清產生顯著增加之中和抗體效價，該5 μgRNA劑量係在0.05 mL注射體積中經單側投予。每14天為小鼠抽血，並在第28天接種投予第二5 μg疫苗。為4隻小鼠注射表現螢光素酶之VEEV複製子RNA作為陰性對照組，以及為6隻小鼠接種STARRTM SARS-CoV-2 RNA疫苗。結果顯示於下列表8中。
Figure 02_image169
該中和效價在接種後第14天至第28天之間增加~10倍。在第28天之加強劑之後，該中和效價在加強劑之後14天額外增加20倍。
為了測定IFNγ+CD8+T細胞計數是否從第二劑量之疫苗接種獲得額外益處，將僅接受第一劑之小鼠中的CD8 T細胞IFNγ反應與接受第一劑和加強劑之小鼠的反應相比較。計算僅接受第一劑或接受第一劑和加強劑之小鼠中疫苗接種組相較於PBS組的IFNγ+CD8+T細胞之倍數變化。在2 μg和10 μg之STARRTM SARS-CoV-2 RNA劑量下，第一劑和第一劑+加強劑之後的IFNγ+CD8+T細胞倍數變化相似(第7D至7E圖)；該0.2 μg劑量顯示出IFNγ+CD8+T細胞在第一劑(第7天)和第一劑+加強劑(第50天)之間的倍數變化較大。相對於PBS對照組，使用0.2 μg之mRNA進行預防接種亦顯示出在接種二個疫苗劑量後IFNγ+CD8+T細胞增加。不受理論的限制，這些結果表明與單劑量疫苗接種相比較，第二10 μg STARRTM SARS-CoV-2 RNA劑量未產生優越之細胞免疫。因此，無明顯之來自第二10 μg STARRTM SARS-CoV-2 RNA劑量的益處。
綜合起來，這些數據表明10 μg STARRTM SARS-CoV-2 RNA提供接種單劑量疫苗來防止COVID-19之機會。實施例 8
本實施例說明使用STARRTM SARS-CoV-2自我複製RNA進行疫苗接種後保護小鼠免於SARS-CoV-2病毒挑戰。
使用人ACE2轉基因小鼠進行小鼠病毒挑戰研究。以STARRTM SARS-CoV-2 RNA(如上述實施例1中之RNA構建體)之2 μg和10 μg RNA劑量將小鼠免疫化或注射PBS。每個治療組有3個不同小組，每一小組有5隻小鼠。小組1和小組3接受5 X 105 TCID50之致命SARS-CoV-2病毒挑戰荷載量。監控小組1之存活，並在挑戰後5天對小組3實施安樂死。分析肺之病毒荷載量並進行組織病理學處理。小組2接受5 X 104 TCID50之亞致死病毒載量。在病毒挑戰後5天對小組2實施安樂死，並分析肺中之傳染性病毒且進行組織病理學處理。接種疫苗後30天經由氣管內途徑為所有小鼠接種單一STARRTM SARS-CoV-2 RNA劑量。
小組1中所有注射PBS之小鼠在第7天死亡，而所有接種疫苗之小鼠在病毒挑戰後15天均未顯示感染跡象(第10圖)。在接受亞致死病毒荷載量之小組2方面，藉由RT-PCR測得肺中具有10至3300個病毒RNA副本，平均為1,200個副本，而接種ARTC-021之2 μg和10 μg RNA劑量的小鼠中未測量到病毒RNA副本(LOD為0.1個副本；第11圖，左)。PBS治療組之大腦中亦觀察到20至80個病毒RNA副本，而接種2.0 μg或10.0 μg RNA劑量之小鼠的大腦中未測量到病毒RNA副本(第11圖，右)。最後，仔細處理肺部並分析肺部斑塊效價。注射PBS之組別的平均斑塊效價為8×103/mL肺勻漿，而接種2.0 μg或10.0 μg STARRTM SARS-CoV-2 RNA疫苗之小鼠中未檢測到斑塊(第12圖)。分析來自小組3之肺和腦組織之病毒副本數和感染性病毒。進行小組2和3之肺部組織病理學檢查。
這些結果表明使用STARRTM SARS-CoV-2自我複製RNA進行疫苗接種可保護小鼠免於致命之SARS-CoV-2感染，並在受到亞致死劑量之SARS-CoV-2挑戰時可保護肺和腦部免於感染。實施例 9
COVID-19大流行係由SARS-CoV-2病毒感染所引起。迄今為止，在SARS-CoV-2病毒外套刺突蛋白(其負責病毒連接至宿主，亦為宿主抗體的主要標靶)中檢測到之主要突變為位置614處之天冬胺酸(D)突變成甘胺酸(G)，此突變經常出現在中國菌株中。使用與實施例1至8中描述之研究完全相同的脂質配製劑來配製表現SARS-CoV-2刺突糖蛋白之D614和G614版的VEEV複製子轉錄子。為Balb/c小鼠接種0.2 μg、2.0 μg和10.0 μg RNA之單次投予RNA疫苗。每一劑量使用5隻小鼠。在接種疫苗後第14、28和42天為小鼠抽血。將血清稀釋2000倍，並與Luminex珠一起培育，該Luminex珠係以含有D614胺基酸序列之SARS-CoV-2刺突糖蛋白衍生得來。使用以螢光團衍生之第二小鼠抗體來分析與小珠結合之抗體，並按RNA劑量之函數計算經調整之平均螢光強度(MFI)，顯示於第13圖中。結果表明，按RNA劑量之函數計算的MFI增加，而來自使用G614刺突糖蛋白免疫化之小鼠的血清中所觀察到之MFI略高。此些微提升歸因於具有D614胺基酸序列之全長RNA的百分比較低。重要的結論為來自使用G614刺突糖蛋白RNA構建體免疫化之小鼠的血清能夠與具有D614胺基酸序列之刺突糖蛋白結合，表明具有交叉反應性。
這些結果表明使用從自我複製RNA表現之G614刺突糖蛋白進行免疫化可導致能夠與D614刺突糖蛋白結合之抗體產生。實例 1 至 9 之討論
COVID-19之大流行使疫苗必須快速研發，因為進行物理隔離以防止SARS-CoV-2傳播而並非可持續之長期解決方案。現在有數種候選COVID-19疫苗正在臨床試驗中並有更多候選藥物正進入首次人體試驗。然而，正在研發之大多數候選疫苗需要二個劑量才能獲得足夠的適應性免疫力。同時產生細胞和體液免疫，且不會升高由疫苗介導之免疫增強風險的單劑量疫苗仍然是未被滿足的需求。在不受理論限制的情況下，單劑量疫苗之部署將能夠有較高度之依從性且能夠將疫苗之有限生產分配給全球更多易感人群。
在獲得許可之疫苗中，減毒活疫苗可提供針對病毒性疾病的持久保護。活疫苗在接種部位，且有些甚至在引流淋巴結中感染並複製。複製使病毒抗原能夠內源表現，從而能夠呈遞抗原以刺激細胞毒性CD8+T細胞。表現出之抗原亦將被抗原呈遞細胞吸收以觸發CD4+T細胞協助驅動B細胞中親和力成熟。對減毒黃熱病活疫苗之研究已表明較長期刺激適應性免疫反應可、產生較優越之適應性免疫反應。不受理論的限制，模擬活疫苗接種之過程可提供針對COVID-19之持久免疫力的機會。
在諸如COVID-19之危機中，核酸疫苗平台提供用於加速研發之機會。在本文描述之研究中，進行由二種SARS-CoV-2候選疫苗，非複製性mRNA構建體和STARRTM SARS-CoV-2 RNA引起之免疫原性的並排比較。與mRNA疫苗相比較，STARRTM SARS-CoV-2 RNA在體內產生較高和較長之蛋白質表現並上調血液和引流淋巴結中數種先天、B細胞和T細胞反應基因之基因表現。這些性質轉譯成明顯較強之CD8+T細胞反應、IFNγ+ELISPOT反應和SARS-CoV-2特異性IgG及Th1偏斜反應。有趣的是，儘管mRNA之最高測試劑量引發與STARRTM SARS-CoV-2 RNA之最低測試劑量相當之S蛋白質特異性抗體，由mRNA引發之IgG未顯示出與來自STARRTM SARS-CoV-2 RNA疫苗接種者類似之親合力或中和活性。因此，這些發現強調自我複製RNA優於mRNA平台的免疫優點。此外，使用SARS-CoV-2病毒之小鼠挑戰研究表明以單一高劑量(10 μg)或單一低劑量(2 μg)之STARRTM SARS-CoV-2自我複製RNA進行疫苗接種可保護小鼠免於致死性SARS-CoV-2感染，並在使用亞致死性SARS-CoV-2劑量挑戰時免於肺和腦部感染。
STARRTM 疫苗複製活疫苗特性之程度仍有待實驗確定。不受理論的限制，由STARRTM SARS-CoV-2 RNA引起之免疫反應的品質優於mRNA疫苗構建體可歸因於多種因素，所有這些因素已發現均與活疫苗有關。例如，較高和較長之免疫原表現產生較佳之免疫力，此可能透過T濾泡輔助細胞之更佳接合，從而導致更多樣化之抗體靶的和更多中和抗體反應。STARRTM SARS-CoV-2 RNA之複製將導致形成負股模板，以用於產生更多正股mRNA和表現S轉基因之亞基因組mRNA。負股和正股之間的交互作用將形成雙股RNA(dsRNA)，該雙股RNA將與TLR3和RIG-I樣受體交互作用以刺激干擾素反應，此已被證明與優異之適應性免疫反應有關。然後，IFNγ之產生可刺激細胞毒性CD8+T細胞之發展。重要的是，S蛋白確實含有人CD8+T細胞表位。不受理論之束縛，如有關針對SARS-CoV-2和其他冠狀病毒感染之T細胞反應的最新發現所表明者，T細胞記憶之發展對長期免疫而言可能是重要的。
形成複製複合物之VEEV nsP1-4是否含有任何免疫原性質仍不清楚，儘管nsP蛋白中之突變已顯示會影響第I型IFN之誘導。VEEV複製子亦顯示出輔助黏膜部位之免疫反應，進一步說明使用STARRTM 平台研發COVID-19疫苗之優勢。不受理論的限制，如同對動物第二次投予複製子時抗原特異性IgG產製增加所表明者，未出現針對複製子非結構性蛋白之免疫反應。當出現針對非結構型蛋白之免疫反應時，第二次投予後可能導致抗原特異性IgG產製增加有限或未增加。該RNA係包封在脂質奈米顆粒(LNP)中，該脂質奈米顆粒可一起形成導致強烈之免疫反應的強效佐劑。此外，利用抗原之遺傳序列，包括病毒抗原(諸如來自SARS-CoV-2之刺突蛋白)，例如STARRTM 疫苗可利用無細胞和可快速擴展之技術快速產生和製造。
總結，由STARRTM SARS-CoV-2 RNA示例之STARRTM 疫苗提供模擬數種活疫苗接種特性之方法並提供針對COVID-19之單劑量疫苗的可能性。
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SEQ ID NO ： 127( 具有二個亞基因組啟動子Luc和E3L之構建體的RNA序列)
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SEQ ID NO ： 128( STARR Fluc IRES-E3L之RNA序列)
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SEQ ID NO ： 129( STARR Fluc IRES-E3L之RNA序列(短3'UTR))
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實施例 10
本實施例描述使用螢火蟲螢光素酶轉基因表現來表徵自我複製(STARRTM )技術。
使用濃度為0.1 mg/ml之脂質奈米顆粒(LNP)配製體外轉錄子，並經由肌肉內注射為雌性BALB/C小鼠(n=3)在二條腿各注射5 μg之劑量。經由腹膜內注射投予100μl在PBS中之1.5 mg Xenolight D-螢光素(PerkinElmer)，約10分鐘後藉由IVIS Lumina LT系列III(PerkinElmer)測量螢火蟲螢光素酶(FLuc)之表現。在每個時間點為每組小鼠取得六個數據點(第18A至18D圖)。
藉由體內成像系統(IVIS)監測來自STARRTM Fluc、SINV FLuc和mRNA FLuc之螢火蟲螢光素酶(FLuc)表現直至第28天。觀察來自STARRTM 之增加的轉基因表現水準和持續時間。來自STARRTM Fluc之表現在第3天至第7天達到峰值，直到第22天才下降。來自SINV FLuc之Fluc表現亦在第10天達到峰值，然而，該表現之降低速度明顯快於STARRTM FLuc。此外，第3天之表現明顯低於STARRTM FLuc。來自常規mRNA骨架之FLuc表現在第1天(本研究中最早的時間點)最高，其下降速度較STARRTM -Fluc稍快(第18A圖)。第18B圖顯示在給藥後第14天，來自STARRTM -Fluc之Fluc表現較其他組高約二個數量級。第18 D圖顯示出STARRTM 骨架之效果在整個實驗期間(直至第28天)保持最低，而先前投予之SINV複製子骨架導致Fluc轉基因表現降低〜2個數量級。
接著，以編碼來自gp70(內源性小鼠白血病病毒之外套糖蛋白)之AH1A5表位的STARRTM 骨架構建癌症疫苗基質TA STARRTM 。AH1(SPSYVYHQF)(SEQ ID NO：110)為gp70423-431之H-2Ld限制性抗原，其表現在諸如CT26結腸直腸癌細胞株之腫瘤細胞中，但不表現在大多數正常組織中。AH1-A5為具有
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(SEQ ID NO：111)(下方劃線之突變)之突變序列，其對T細胞受體之親和力增強(Slansky, et al., 2000, Immunity 13：529-538)。TA STARRTM 亞基因組RNA之開放閱讀框含有匣，該匣具有來自第I類HLA抗原之信號肽、含有AH1A5表位之gp70序列、卵白蛋白表位(OVA323-339)和第I類MHC運輸信號(Kreiter, et al. 2008, J Immunol 180：309-318)。在第0天和第7天，經由肌肉內為三隻雌性BALB/c小鼠注射10 μg之LNP配製的STARRTM 轉錄子、STARRTM FLuc或TA  STARRTM 。在第16天，收穫脾臟並分離出脾細胞。將脾細胞(2.5x105 細胞)與或不與AH1A5(SPSYAYHQF)(SEQ ID NO：111)、1 μg/ml之β-gal肽(TPHPARIGL)(SEQ ID NO：112)和1x伴刀豆球蛋白A(Life Technologies)一起培育。根據製造商之說明進行以ELISpot檢測小鼠IFN-γ(ImmunoSpot)。從第19圖中可以看出，TA STARRTM 誘導抗原特異性IFN-γ反應。
經由皮下在10週大之雌性BALB/c小鼠的右側腹植入5x105 個在PBS中之CT26細胞。一天後，經由肌肉內在左腿注射在100μl中之10 μg的LNP配製之STARRTM RNA劑量。第8天對小鼠投予另一為相同劑量之加強劑。在使用抗小鼠PD1(RMP1-14，BioXCell)和抗小鼠PDL1 (10F.9G2，BioXcell)之聯合治療的組別方面，從第3天開始，每週二次，經由腹膜內注射在右邊象限投予組合之檢查點抑制劑(各100 μg)，持續二週。在使用抗小鼠CTLA4(9H10，BioxCell)治療之組別方面，以相同方式投予200 μg之檢查點抑制劑，但從第7天開始。使用TA STARRTM 疫苗和檢查點抑制劑之組合治療的組別中有5隻在第25天仍然無腫瘤，因而進一步經由皮下在右側腹植入CT26(5×105 個細胞)進行挑戰，其中該植入部位略高於第一次植入部位。使用未經處理之小鼠作為對照組。在安樂死之前另外監測腫瘤生長17天(即，從第一次植入CT26開始直至第42天)。第20A至20F圖說明由於接種TA STARRTM 疫苗導致腫瘤生長減少，第21圖顯示使用TA STARRTM 疫苗與檢查點抑制劑之聯合治療導致延長之保護作用。 收穫來自使TA STARRTM 和抗PD1/PDL1之聯合治療組的脾細胞以用於使用AH1肽之四聚體染色。以來自使用LNP配製緩衝液和具有相同給藥方案之對照組的脾細胞作為陰性對照組。將脾細胞(2x106個細胞)與AH1(H-2Ld)-四聚體(MBL)一起培育，接著依循製造商的建議與適當之經螢光標記的抗體(Alexa Fluor 488抗CD8a(53-6.7)、Pacific Orange 抗CD4(RM4-5)和Pacific Blue抗小鼠CD3ε(145-2C11)，eBioscience)和DRAQ7(Invitrogen)一起培育，並藉由ZE5細胞分析儀(Bio-Rad)分析500K事件。結果顯示於第22A至22C圖中。
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實施例 11
本實施例描述從自我複製RNA或mRNA表現之流感血凝素(HA)的免疫原性之分析。
設計自我複製RNA和mRNA疫苗構建體以編碼來自流感病毒A/加利福尼亞/07/2009(H1N1)之全長血凝素(HA)蛋白(SEQ ID NO：113和114)。如上文關於實施例1之描述，編碼HA之mRNA疫苗構建體包括煙草蝕刻病毒(TEV)5'UTR和非洲爪蟾β-球蛋白(Xbg)3'UTR。將自我複製RNA(SEQ ID NO：56；完整RNA mARM3039)和mRNA疫苗構建體(SEQ ID NO：116；完整RNA序列mARM3038)包封在同一脂質奈米顆粒(LNP)組成物中，該脂質奈米顆粒(LNP)組成物包括四種分散在HEPES緩衝液(pH 8.0)中的脂質賦形劑(可離子化之陽離子性脂質、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)、膽固醇和PEG2000-DMG)，該HEPES緩衝液(pH 8.0)含有氯化鈉和冷凍保護劑蔗糖，及甘油。複合脂質和RNA之N：P比為約9：1。該可離子化之陽離子性脂質具有下列結構：
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經由肌肉內為5隻8至10週大之雌性Balb/c小鼠注射2mg之編碼HA的mRNA或自我複製RNA。在第14、28、42和56天為小鼠抽血，然後使用連續稀釋之血清進行血球凝集抑制(HAI)分析。導致血球凝集抑制之最高血清稀釋度的倒數被視為HAI效價，1/40之效價對流感病毒感染具有保護作用，較基線高四倍之效價表明血清轉換。
第23圖中之結果表明與編碼HA之mRNA相比較，使用編碼HA之自我複製RNA獲得較高之HAI效價。從第28天開始，編碼HA之自我複製RNA構建體在所有時間點的HAI效價均高於編碼HA之mRNA的HAI效價。此外，從第28天開始，編碼HA之自我複製RNA構建體可見到保護性HAI效價且維持至少56天。相反地，編碼HA之mRNA僅在第56天顯示低於自我複製RNA HA構建體之HAI效價的保護性HAI效價。在所有其他時間點，編碼HA之mRNA構建體的HAI效價均低於保護性效價閾值，其HAI效價在第28天時與使用PBS對照組注射相當。
這些結果表明，編碼HA之自我複製RNA構建體引發保護性HA抗體效價，與編碼HA之mRNA構建體相比較具有較高之HAI效價。實施例 12
本實施例描述用於自我複製RNA之dsRNA產生和螢光素酶表現。
使用綠色螢光蛋白(GFP)或螢火蟲螢光素酶(Luc)作為報告基因測試來自不同α病毒之數種自我複製RNA系統的體外表現。與mRNA相比較，使用增加量之自我複製RNA初次轉染細胞導致報告基因在較低之劑量表現。然而，隨著輸入之自我複製RNA數量增加，該報告基因之可檢測表現降低。
自我複製RNA在擴增過程中產生雙股RNA(dsRNA)作為中間體。過量產生dsRNA可抑制轉譯。為了評估dsRNA產生對轉基因表現之影響，同時測量dsRNA和報告基因螢光素酶之表現。使用商購之RNA轉染試劑，以2 μg之複製子A(SEQ ID NO：115；完整RNA序列mARM2826)或複製子B(SEQ ID NO：100，完整RNA序列mARM2809)自我複製RNA或表現Luc之mRNA(SEQ ID NO：102，完整mRNA序列mARM1782)轉染HEK293細胞。未經轉染之細胞(UTC)作為對照組。轉染後24小時，使用用於dsRNA之免疫組織化學染色定量dsRNA產製(第24A圖)，然後使用螢光掃描儀定量螢光。藉由並行測量生物發光來分析螢光素酶表現(第24B圖)。
轉染後24小時，複製子A產生之dsRNA水準較複製子B高3倍(第24A圖)。然而，複製子B產生之螢光素酶的表現水準較複製子A高2.4倍。再者，來自複製子A之螢光素酶表現水準與從mRNA觀察到之水準相同。因此，即使複製子A具有擴增複製子RNA和轉錄之編碼螢光素酶的mRNA之量的能力，擴增之mRNA的轉譯受抑制，此與過量產生dsRNA抑制轉譯相一致。此外，與mRNA相比較，在HEK293細胞轉染後24、48和72小時，複製子RNA之螢光素酶基因表現水準較高(第15A圖)。具有表現匣之自我複製RNA亦顯示強螢光素酶表現，該表現匣包括螢光素酶報告基因，其後為IRES和E3L(第15B、15C圖；SEQ ID NO：128和129)。表現來自第一亞基因組啟動子之E3L和來自位於該E3L開放閱讀框之3'的第二亞基因組啟動子之螢光素酶報告基因的自我複製RNA亦可觀察到螢光素酶表現(未顯示)。因此，與mRNA相比較，複製子RNA不僅產生較高水準之螢光素酶基因表現，且複製子RNA在72小時之期間內亦顯示出增加之表現持續時間。實施例 13
本實施例描述液體和凍乾之自我複製RNA配製劑的免疫原性。在二項獨立之臨床前研究中，在BALB/c小鼠中測試配製成凍乾之液體脂質奈米顆粒(LYO-LNP)的自我複製RNA(SEQ ID NO：125)之免疫原性，並與液體(冷凍的)LNP配製劑(液體-LNP)相比較。各研究包括使用PBS給藥組作為陰性對照組並使用液體給藥組(液體-LNP)作為陽性對照組。LYO-LNP和液體-LNP配製劑二者之給藥量均為0.2和2 μg。各研究中每個劑量組具有n=5隻動物。經由肌肉內(IM)投予測試配製劑並在免疫化後之各種不同時間點(第一個研究為第10、19、31天，而第二個研究為第10、20、30天)收集血清以利用Luminex珠螢光分析測量抗SARS-CoV-2刺突蛋白IgG之產生。
在二項研究中，以時間和劑量依賴性方式檢測液體-LNP和LYO-LNP配製劑二者之血清中的抗SARS-CoV-2刺突蛋白IgG，而PBS注射並未引發免疫原性反應(第16A至16D圖)。在第一項研究中，液體-LNP和LYO-LNP劑量組的免疫原性之間並無統計學上之差異，而在第二項研究中，LYO-LNP產生與液體-LNP為統計學上不同且較高之IgG。不受理論之限制，此二項單獨之研究的效力不足(n=5 /組)可能促成在二項研究中所觀察到之免疫原性結果的統計差異。綜合二項研究之結果，在0.2和2 μg劑量水準下，液體-LNP和LYO-LNP配製劑之間未觀察到統計學上之顯著差異(第17A、17B圖)。綜合上述，這些研究之結果表明該液體和凍乾配製劑之免疫原性彼此相當。
總之，自我複製RNA疫苗(SEQ ID NO：125)之液體和凍乾配製劑顯示出相當之免疫原性。該疫苗可誘導靶向SARS-CoV-2 S糖蛋白之有效、適應性體液(中和抗體)和細胞(CD8+)免疫反應。該疫苗亦引發誘導較常規mRNA疫苗更高之抗刺突糖蛋白抗體(IgG)水準，且亦誘導以較常規mRNA疫苗更快之速率產生IgG抗體。直到疫苗接種後第50天仍持續產生增加之IgG量，然而常規mRNA疫苗則在疫苗接種後第10天達到穩定水準。其引起CD8+T淋巴細胞呈RNA劑量依賴性增加，及平衡之Th1優勢CD4+T輔助細胞免疫反應，沒有偏向Th2反應。
本發明全文中對其他文件(諸如專利案、專利申請案、專利出版物、期刊、書籍、論文、網絡內容)之任何和所有參考及引用均出於所有目且其全文併入本文中。
儘管已參考上述實驗描述本發明，應理解的是，該修改和變化係包含在本發明之精神和範圍內。因此，本發明僅受限於所附之申請專利範圍。實施例 14 自我複製RNA脂質奈米顆粒配製劑材料的凍乾和一般方法
本實施例中進行之方法係使用脂質奈米顆粒組成物進行，該脂質奈米顆粒組成物係根據眾所周知之方法製造，例如美國申請案編號16/823,212，其內容以引用方式併入以用於教示脂質奈米顆粒製造方法的特定目的。決定該脂質奈米顆粒組成物和凍乾產物之幾種性質的特徵。本實施例中提供用於這些表徵過程之材料和方法，以及製造該用於凍乾實驗之脂質奈米顆粒組成物的一般方法。 脂質奈米顆粒製造
將在乙醇中之脂質(可離子化之陽離子性脂質(ATX-126)：輔助脂質：膽固醇：PEG-脂質)與溶解在檸檬酸鹽緩衝液中之RNA混合以製造用於本實施例中之脂質奈米顆粒配製劑。以磷酸鹽緩衝液將該混合之材料立即稀釋。藉由使用再生纖維素膜(100 kD MWCO)，對磷酸鹽緩衝液進行透析，或使用經改質之聚醚碸(mPES)中空纖維膜(100 kD MWCO)進行切向流過濾(TFF)來除去乙醇。一旦將乙醇完全去除，將緩衝液與含有10至300(例如40至60)mM NaCl和5至15%蔗糖，pH7.3的HEPES(4-(2-羥乙基)-1-六氫吡井乙磺酸)緩衝液交換。將配製劑濃縮，然後使用PES過濾器進行0.2μm過濾。然後，藉由RiboGreen螢光分析測量配製劑中之RNA濃度，並使用含有10至100(例如40至60)mM NaCl、0-15%蔗糖，pH值7.2至8.5，含有甘油之HEPES緩衝液稀釋以將濃度調節至最終所需濃度。若不立即用於進一步研究，則將該最終配製劑通過0.2μm過濾器過濾，然後裝填入玻璃小瓶中，塞好塞子、加蓋並置於-70±5°C下。決定該脂質奈米顆粒配製劑之pH和滲透壓之特徵。藉由高效液相色層分析法(HPLC)測量脂質含量和RNA含量，並藉由片段分析儀測量mRNA完整性。 動態光散射(DLS)
在Malvern Zetasizer Nano ZS(英國)上，藉由動態光散射來測量實施例中所使用之脂質奈米顆粒配製劑的平均粒徑(z)和多分散性指數(PDI)。 RiboGreen分析
使用RiboGreen螢光分析表徵該脂質奈米顆粒配製劑之包封效率。RiboGreen為用於檢測和定量核酸，包括RNA和DNA的專有螢光染料(Molecular Probes/ Invitrogen為Life Technologies的一個部門，現為美國俄勒岡州尤金市Thermo Fisher Scientific的一部分)。當為游離形式時RiboGreen幾乎不顯示螢光且擁有可忽略不計之吸光度特徵。當與核酸結合時，該染料螢光強度高於未結合形式數個數量級。然後，可藉由傳感器(螢光計)檢測螢光並可定量該核酸。 凍乾過程
自我複製RNA(又名複製子RNA)通常大於平均mRNA，並設計試驗以測定自我複製RNA脂質奈米顆粒配製劑是否可被成功凍乾。藉由分析凍乾後之配製劑及將其與凍乾之前，以及常規冷凍/解凍循環(即，在〜-70°C下冷凍然後令其在室溫解凍)後之脂質奈米顆粒配製劑相比較，以評估該凍乾之脂質奈米顆粒配製劑的品質。
該脂質奈米顆粒配製劑之分析包括對粒度和多分散性(PDI)，以及包封效率(%Encap)之分析。將凍乾後之粒度與凍乾前之粒度相比較且該差異可報告為delta(δ)。篩選所測試之各種不同組成物是否符合性能閾值，包括最小粒徑增加(δ＜10 nm)、維持PDI(＜0.2)和維持高包封效率(＞ 85%)。
依上述使用自我複製RNA(SEQ ID NO：125)製備脂質奈米顆粒配製劑。然後，將所得之脂質奈米顆粒配製劑以緩衝液交換處理，以形成具有濃度為0.05至2.0 mg/mL之自我複製RNA、0.01至0.05M山梨酸鉀、0.01至0.10%w/v泊洛沙姆188(Kolliphor®)、14至18%w/v蔗糖、25至75 mM NaCl和15至25 mM pH 8.0 Tris緩衝液的預凍乾懸浮液。然後，使用2.0mL懸浮液之等分試樣和下列表10中提供之凍乾循環將預凍乾配製劑在Millrock Revo冷凍乾燥器(型號RV85S4)中凍乾。然後，將本實施例之凍乾的配製劑以“LYO-LNP”應用於上述實施例13的研究中。
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將按照上述方法製備之凍乾顆粒在2mL水中重構，並使用DLS和RiboGreen進行表徵。下表11中提供之結果表明該凍乾之組成物證實在重構後產生具有適當尺寸、多分散性和δ值(〜5.3nm)之凍乾的脂質奈米顆粒配製劑。
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[第 1A 至 1D 圖 ]顯示mRNA和自我複製RNA(STARRTM )平台中SARS-CoV-2疫苗之設計和表現。(1A)SARS-CoV-2自我複製STARRTM RNA和mRNA疫苗構建體之示意圖。該STARRTM 構建體編碼四個來自委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之非結構型蛋白，ns1-ns4和SARS-CoV-2全長刺突(S)蛋白。該mRNA構建體編碼SARS-CoV-2全長刺突S蛋白。(1B)mRNA和STARRTM (對應於SEQ ID NO：125之自我複製RNA；本文中稱為“STARRTM SARS-CoV-2 RNA”)疫苗中之LNP的物理特性和RNA捕獲效率。(1C)以STARRTM RNA和mRNA構建體轉染HEK293細胞後，SARS-CoV-2 S蛋白之西方點墨檢測。(1D)肌肉內(IM)投予含有表現螢光素酶之STARRTM RNA或mRNA的LNP後，體內蛋白質表現的比較。經由IM為Balb/c小鼠(n=3/組)注射0.2 µg、2.0 µg和10.0 µg在脂質配製劑中之STARRTM RNA或mRNA。在IM投予後第1、3和7天藉由體內生物發光測量螢光素酶表現。S結構域1=S1，S結構域2=S2，跨膜結構域=TM，胞質結構域=CP。
[第 2A 至 2I 圖 ]顯示以STARRTM RNA或mRNA SARS-CoV-2候選疫苗進行疫苗接種後之臨床得分、小鼠體重和免疫基因之轉錄體分析。(2A)使用PBS、mRNA或STARRTM SARS-CoV-2 RNA(劑量0.2 μg、2 μg或10 μg)將C57BL/6小鼠免疫化，每天評估體重和臨床得分，在免疫化後第1天抽血，接種疫苗後第7天處死小鼠並收集淋巴結。分別測量全血(第1天)和淋巴結(第7天)中之炎症基因和免疫基因之基因表現。(2B)全血中之IFN和發炎反應基因之表現以z得分之熱圖(heatmap)表示。(2C)接種後7天之淋巴結重量。使用劑量(2D)0.2 μg、(2E)2 μg和(2F)10 μg之mRNA或STARRTM SARS-CoV-2 RNA進行疫苗接種後免疫基因表現之主成分分析(PCA)。劑量(2G)0.2 μg、(2H)2 μg和(2I)10 μg之STARRTM SARS-CoV-2 RNA對mRNA之倍數變化(x軸)和STARRTM SARS-CoV-2 RNA對mRNA之Log10 P-值(y軸)的火山圖(volcano plot)。
[第 3A 至 3J 圖 ]顯示以SARS-CoV-2 STARRTM RNA或mRNA進行疫苗接種後之細胞免疫反應。使用0.2 μg、2 μg或10 μg之STARRTM RNA或mRNA經由IM為C57BL/6小鼠(每組n=5)進行免疫接種，在接種疫苗後第7天處死小鼠並藉由流式細胞術和ELISPOT分析脾之細胞性T細胞反應。使用用於T細胞標記物之表面染色和流式細胞術評估經接種疫苗之動物中的(3A至3B)CD8+和C)CD4+T效應細胞。以PMA/離子黴素(IO)在體外刺激和細胞內染色後評估經免疫化之小鼠的脾臟中之(3D至3E)IFNγ+CD8+T細胞和(3F)IFNγ+/IL4+CD4+T細胞的比例。以mRNA(3H)或STARRTM RNA(3I)進行疫苗接種後，使用IFNγ ELISPOT分析來評估對匯集之S蛋白肽的(3G至3I)SARS-CoV-2S蛋白特異性反應。S蛋白結構域之示意圖顯示於(3J)中。
[第 4A 至 4G 圖 ]顯示以mRNA和STARRTM 候選疫苗進行免疫接種後在多個小鼠品系中之體液反應。(4A)經由IM為BALB/c和C57BL/6J小鼠免疫接種0.2 μg、2 μg或10 μg之STARRTM RNA或mRNA(n=5/組)。在基線和接種疫苗後第10、19、30、40、50和60天為BALB/c採血，並在接種疫苗後第10、20和30天為C57BL/6J採血。在Luminex免疫分析(MFI測量值)中使用源自昆蟲細胞之全S蛋白評估隨時間變化之針對SARS-CoV-2 S蛋白的(4B至4C)IgM和(4D至4E)IgG。在接種疫苗後第30天，評估(4F)BALB/c和(4G)C57BL/6J中針對源自哺乳動物之全S蛋白、S1、S2和受體結合結構域(RBD)蛋白之IgG終點效價。
[第 5B 至 5D 圖 ]顯示STARRTM SARS-CoV-2 RNA引起Th1偏斜免疫反應。以STARRTM RNA和mRNA進行疫苗接種後30天(5A)BAL B/c和(5B)C57BL/6J小鼠中之SARS-CoV-2刺突特異性IgG亞類和IgG2a/c/IgG1的比例。疫苗接種後第7天，藉由ICS測量C57BL/6J小鼠中CD4 T細胞中之Th2細胞因子和Th1/Th2偏斜作為(5C)IL4+CD4 T細胞之百分比和(5D)IFNγ+/IL4+CD4+T細胞之比率。
[第 6A 至 6E 圖 ]顯示與mRNA平台相比較，STARRTM SARS-CoV-2 RNA引起較高品質之體液反應。(6A)在免疫接種後第30天使用8M尿素洗滌液來測量SARS-CoV-2S蛋白特異性IgG之親和力。(6B)在接種疫苗後第30天在BAL B/c和C57BL/6J二者中測得之針對臨床分離出之活SARS-CoV-2病毒的中和抗體(PRNT50效價)。虛線描繪藉由PRNT測試之血清稀釋範圍(即，從1：20至1：320)。來自COVID-19患者之接種疫苗後第60天和恢復期血清中之SARS-CoV-2中和的(6C)PRNT50和(6D)PRNT70。(6E)針對SARS-CoV-2中和(PRNT50)之刺突特異性IgG終點效價的相關性分析。PRNT-菌斑減少中和試驗。
[第7A 至 7E 圖]顯示在初次免疫後第30天之加強劑之後C57BL/6J的臨床評分、體重和對STARRTM SARS-CoV-2 RNA和mRNA的免疫反應。疫苗接種加強劑後之(7A)臨床評分和(7B)初始體重百分比。(7C)藉由mRNA和STARRTM SARS-CoV-2 RNA加強後之抗-刺突IgG反應。灰色虛線標記實驗分析飽和點。使用(7D)mRNA或(7 E)STARRTM SARS-CoV-2 RNA候選疫苗初次接種或初次接種&加強後動物中之IFN γ+CD8+T效應細胞反應(對PBS之倍數變化)。
[第 8A 至 8B 圖 ]顯示在初次接種疫苗1天後之全血轉錄體數據，其顯示每50ng之選定的(8A)IFN和(8B)發炎基因的RNA之Nanostring計數。
[第 9A 至 9B 圖 ]顯示針對BALB/c和C57BL/6J小鼠品系中結合IgG和IgG亞類之活SARS-CoV-2中和的相關分析。(9A)針對特異於數種SARS-CoV-2抗原(包括S、S1和RBD重組蛋白)之總IgG的SARS-CoV-2中和(PRNT50)之Spearman相關分析。(9B)針對SARS-CoV-2S特異性-IgG亞類(IgG1和IgG2a或IgG2c)之SARS-CoV-2中和(PRNT50)的Spearman相關分析。
[第 10 圖 ]顯示以致死劑量之SARS-CoV-2病毒挑戰後，未接種疫苗(PBS)之小鼠和接種STARRTM SARS-CoV-2 RNA之小鼠的Kaplan-Meier存活曲線。上方線-STARRTM SARS-CoV-2 RNA(2 μg，10 μg)；下降線-PBS。
[第 11 圖 ]顯示STARRTM SARS-CoV-2 RNA疫苗接種可防止肺和腦部SARS-CoV-2感染。未接種疫苗之小鼠(PBS)和經接種指定劑量之STARRTM SARS-CoV-2 RNA之小鼠的肺(第11圖，左)和腦(第11圖，右)中的病毒RNA水準。
[第 12 圖 ]顯示以SARS-CoV-2挑戰後，未接種疫苗(PBS)之小鼠和經接種指定劑量之STARRTM SARS-CoV-2 RNA之小鼠的肺中之病毒效價。
[第 13 圖 ]顯示從自我複製RNA表現之G614和D614 SARS CoV-2糖蛋白之間的RNA劑量依賴性免疫原性比較。
[第 14 圖 ]顯示說明STARRTM 技術和由脂質介導之遞送的一種態樣之示意圖。
[第 15 圖 ]顯示與mRNA相比較，自我複製(複製子)RNA(STARRTM )，諸如(15A)STARRTM FLuc、(15B)STARRTM FLuc IRES-E3L和(15C)STARRTM FLuc IRES E3L(短3'UTR)之螢光素酶報告基因表現之持續時間。
[第 16A 至 16D 圖 ]顯示抗SARS-Cov-2刺突糖蛋白IgG在二項臨床前研究中之Luminex分析的結果。為BALB/c小鼠接種遞增之自我複製RNA(SEQ ID NO：125)劑量，該RNA劑量係配製成凍乾脂質奈米顆粒(LYO-LNP)和液體(冷凍)脂質奈米顆粒(液體-LNP)。(16A)第一項研究0.2 μg，(16B)第一項研究2 μg，(16C)第二項研究0.2 μg，和(16D)第二項研究2 μg。在疫苗接種後的不同時間收集血液並將其處理成血清，且評估抗SARS-CoV-2刺突糖蛋白IgG。使用雙因子ANOVA、試驗後Tukey氏多重比較來將LYO-LNP與液體-LNP相比較，其中* p ＜0.0332，** p ＜0.0021，*** p ＜0.0002，**** p ＜0.0001。
[第 17A 至 17B 圖 ]顯示抗SARS-Cov-2刺突糖蛋白IgG之曲線下面積(AUC)分析(第一項研究和第二項研究組合數據)。將來自二項研究之IgG分析結果組合以評估配製為凍乾之脂質奈米顆粒(LYO-LNP)和液體(冷凍)脂質奈米顆粒(液體-LNP)之(17A)0.2 μg和(17B)2 μg的自我複製RNA(SEQ ID NO：125)。N=10/組。將第一項研究之第19和31天的結果分別與第二項研究之第20和30天的結果合併，並進行曲線下面積(AUC)分析。使用單因子ANOVA、試驗後Sidak氏多重比較來將LYO-LNP與液體-LNP相比較，結果不具有統計學差異。
[第 18A 至 18D 圖 ]顯示使用螢火蟲螢光素酶轉基因表現來表徵STARRTM 技術。(18A)藉由體內成像系統(IVIS)監控來自STARRTM Fluc、SINV FLuc和mRNA FLuc之螢火蟲螢光素酶(FLuc)表現直到第28天。將小鼠群組中來自6個注射部位的總通量(p/s)之平均值繪製在每個時間點並加上平均值之標準誤差，SEM。(18B)顯示經投予圖片下方標記之測試品的各組在第14天時每一組中之三隻小鼠(6個注射部位)的IVIS圖像。(18C)藉由IVIS監控經由肌肉內注射STARRTM FLuc之小鼠在投予後長達63天之螢光素酶表現。(18D)檢查先前投予之STARRTM (上圖)和SINV(下圖)的複製子骨架之效果。在第0天投予具有不相關基因/序列(標記為STARRTM irr或SINV irr)之同源骨架的複製子劑量後第7天，經由IM注射編碼FLuc之複製子。每一STARRTM 和SINV組中均包括在第0天投予PBS之小鼠組作為參考。
[第 19 圖 ]顯示STARRTM 引發抗原特異性IFN-γ反應。使用酶聯免疫吸附斑點ELISpot來計算被抗原肽特異刺激之脾細胞的數目，該抗原肽具有在TA STARRTM 中編碼之相同胺基酸序列。每一種肽(僅細胞)和相關肽(Bgal)均未引發大量來自經接種STARRTM FLuc或TA STARRTM 之小鼠的脾細胞之IFN-γ。使用AH1-A5肽刺激導致檢測到特異地來自經接種TA STARRTM 之小鼠的IFN-γ製造細胞。使用刀豆蛋白(concanavalin)A(ConA)作為IFN-γ產製之陽性對照組。
[第 20A 至 20F 圖 ]說明在CT26同系小鼠模型中藉由接種TA STARRTM 疫苗降低腫瘤生長速率。將CT26鼠結腸直腸癌細胞(5x105 )經由皮下植入10週齡雌性BALB/c小鼠中(每組n=8)。在第1和8天，為小鼠接種STARRTM FLuc(陰性對照組)或TA STARRTM (編碼AH1A5表位)。監控經接種下列疫苗之小鼠中的腫瘤生長(20A)STARRTM FLuc，無檢查點抑制劑治療；(20B)STARRTM FLuc，與抗PD1/PDL1聯合治療；(20C)STARRTM FLuc，與抗CTLA4聯合治療；(20D)STARRTM 疫苗，無檢查點抑制劑治療；(20E)STARRTM 疫苗，與抗PD1和抗PDL1聯合治療；及(20F)STARRTM 疫苗，與抗CTLA4聯合治療。來自經投予STARRTM FLuc和TA STARRTM 之小鼠組別的個別腫瘤生長曲線分別顯示於上圖和下圖中。
[第 21 圖 ]說明藉由TA STARRTM 疫苗與檢查點抑制劑之聯合治療進行之延長保護。接受聯合TA STARRTM 與抗PD1/PDL1或抗CTLA4之治療的小鼠被發現在第25至42天的CT26挑戰後對腫瘤生長具有抗性。使用未經治療之小鼠作為CT26腫瘤生長的對照組。
[第 22A 至 22C 圖 ]顯示為(22A)圖形及(22B和22C)圖區形式之CD8+T細胞的AH1-四聚體染色之結果。在第42天以AH1(H-2Ld)-四聚體將來自使用TA STARRTM 和抗-PD1/PDL1聯合治療之小鼠組別的脾細胞染色。該染色特異於來自以TA STARRTM 治療之小鼠組別的CD8+T細胞，且該群體佔來自該脾細胞之總CD8+T細胞的9至17%。
[第 23 圖 ]顯示從自我複製RNA(STARRTM )和編碼流感病毒A/California/07/2009(H1N1)之血凝素的mRNA構建體獲得之HAI效價。
[第 24A 至 24B 圖 ]顯示與mRNA相比較，指定之自我複製(複製子)RNA的RNA複製量(第24A圖)和螢光素酶報告基因表現水準(第24B圖)。
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Claims (145)

  1. 一種核酸分子，其包含： (i)編碼一或多種病毒複製蛋白之第一多核苷酸，其中該第一多核苷酸與編碼一或多種病毒複製蛋白之野生型多核苷酸相比較呈密碼子優化；和 (ii)包含第一轉基因之第二多核苷酸，該第一轉基因編碼第一抗原蛋白或其片段，其中該第一抗原蛋白為冠狀病毒蛋白。
  2. 如請求項1之核酸分子，其中該一或多種病毒複製蛋白為α病毒蛋白或風疹病毒(rubivirus)蛋白。
  3. 如請求項2之核酸分子，其中該α病毒蛋白係來自委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)、東方馬腦炎病毒(EEEV)、大沼澤地病毒(EVEV)、穆坎布(Mucambo)病毒(MUCV)、塞姆利基森林(Semliki Forest)病毒(SFV)、皮克孫納(Pixuna)病毒(PIXV)、米德堡(Middelburg)病毒(MIDV)、屈公(Chikungunya)病毒(CHIKV)、歐尼恩(O'Nyong-Nyong)病毒(ONNV)、羅斯河(Ross River)病毒(RRV)、巴馬森林(Barmah Forest)病毒(BFV)、蓋他(Getah)病毒(GETV)、鷺山(Sagiyama)病毒(SAGV)、貝巴魯(Bebaru)病毒(BEBV)、馬雅羅(Mayaro)病毒(MAYV)、烏納(Una)病毒(UNAV)、辛德畢斯(Sindbis)病毒(SINV)、奧拉(Aura)病毒(AURAV)、沃達羅(Whataroa)病毒(WHAV)、巴班奇(Babanki)病毒(BABV)、庫孜拉加奇(Kyzylagach)病毒(KYZV)、西方馬腦炎病毒(WEEV)、高地(Highland)J病毒(HJV)、摩根堡(Fort Morgan)病毒(FMV)、恩杜姆(Ndumu)病毒(NDUV)、鮭魚α病毒(Salmonid Alphavirus) (SAV)、博吉溪(Buggy Creek)病毒(BCRV)或彼等之任何組合。
  4. 如請求項1至3中任一項之核酸分子，其中該第一多核苷酸編碼包含α病毒nsP1蛋白、α病毒nsP2蛋白、α病毒nsP3蛋白、α病毒nsP4蛋白或彼等之任何組合的多蛋白。
  5. 如請求項1至3中任一項之核酸分子，其中該第一多核苷酸編碼包含α病毒nsP1蛋白、α病毒nsP2蛋白、α病毒nsP3蛋白或彼等之任何組合及α病毒nsP4蛋白之多蛋白。
  6. 如請求項5之核酸分子，其進一步包含第一基因間區，該第一基因間區係介於編碼包含α病毒nsP1蛋白、α病毒nsP2蛋白、α病毒nsP3蛋白或彼等之任何組合之多蛋白的序列與編碼α病毒nsP4的序列之間。
  7. 如請求項6之核酸分子，其中該第一基因間區包含α病毒序列。
  8. 如請求項1之核酸分子，其中該第一多核苷酸包含與SEQ ID NO：72之序列具有至少80%同一性的序列。
  9. 如請求項1至8中任一項之核酸分子，其進一步包含5'非轉譯區(UTR)。
  10. 如請求項9之核酸分子，其中該5'UTR包含病毒5'UTR、非病毒5'UTR或病毒和非病毒5'UTR序列之組合。
  11. 如請求項10之核酸分子，其中該5'UTR包含α病毒5'UTR。
  12. 如請求項11之核酸分子，其中該α病毒5'UTR包含委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)、東方馬腦炎病毒(EEEV)、大沼澤地病毒(EVEV)、穆坎布病毒(MUCV)、塞姆利基森林病毒(SFV)、皮克孫納病毒(PIXV)、米德堡病毒(MIDV)、屈公病毒(CHIKV)、歐尼恩病毒(ONNV)、羅斯河病毒(RRV)、巴馬森林病毒(BFV)、蓋他病毒(GETV)、鷺山病毒(SAGV)、貝巴魯病毒(BEBV)、馬雅羅病毒(MAYV)、烏納病毒(UNAV)、辛德畢斯病毒(SINV)、奧拉病毒(AURAV)、沃達羅病毒(WHAV)、巴班奇病毒(BABV)、庫孜拉加奇病毒(KYZV)、西方馬腦炎病毒(WEEV)、高地J病毒(HJV)、摩根堡病毒(FMV)、恩杜姆病毒(NDUV)、鮭魚α病毒(SAV)或博吉溪病毒(BCRV)5'UTR序列。
  13. 如請求項9之核酸分子，其中該5'UTR包含SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74或SEQ ID NO：75之序列。
  14. 如請求項1至13中任一項之核酸分子，其進一步包含3'非轉譯區(UTR)。
  15. 如請求項14之核酸分子，其中該3'UTR包含病毒3'UTR、非病毒3'UTR或病毒和非病毒3'UTR序列之組合。
  16. 如請求項15之核酸分子，其中該3'UTR包含α病毒3'UTR。
  17. 如請求項16之核酸分子，其中該α病毒3'UTR包含委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)、東方馬腦炎病毒(EEEV)、大沼澤地病毒(EVEV)、穆坎布病毒(MUCV)、塞姆利基森林病毒(SFV)、皮克孫納病毒(PIXV)、米德堡病毒(MIDV)、屈公病毒(CHIKV)、歐尼恩病毒(ONNV)、羅斯河病毒(RRV)、巴馬森林病毒(BFV)、蓋他病毒(GETV)、鷺山病毒(SAGV)、貝巴魯病毒(BEBV)、馬雅羅病毒(MAYV)、烏納病毒(UNAV)、辛德畢斯病毒(SINV)、奧拉病毒(AURAV)、沃達羅病毒(WHAV)、巴班奇病毒(BABV)、庫孜拉加奇病毒(KYZV)、西方馬腦炎病毒(WEEV)、高地J病毒(HJV)、摩根堡病毒(FMV)、恩杜姆病毒(NDUV)、鮭魚α病毒(SAV)或博吉溪病毒(BCRV)3'UTR序列。
  18. 如請求項17之核酸分子，其中該3'UTR包含聚A序列。
  19. 如請求項14之核酸分子，其中該3'UTR包含SEQ ID NO：76之序列。
  20. 如請求項1至19中任一項之核酸分子，其中該抗原蛋白為SARS-CoV-2蛋白。
  21. 如請求項20之核酸分子，其中該抗原蛋白為SARS-CoV-2刺突糖蛋白。
  22. 如請求項21之核酸分子，其中該SARS-CoV-2刺突糖蛋白為具有SEQ ID NO：123之胺基酸序列的野生型SARS-CoV-2刺突糖蛋白。
  23. 如請求項1至22中任一項之核酸分子，其中該第二多核苷酸包含與SEQ ID NO：121或SEQ ID NO：122之序列具有至少85%同一性的序列。
  24. 如請求項1至23中任一項之核酸分子，其中該第二多核苷酸包含至少二個轉基因。
  25. 如請求項24之核酸分子，其中該第二轉基因編碼第二抗原蛋白或其片段或免疫調節蛋白。
  26. 如請求項24或25之核酸分子，其中該第二多核苷酸進一步包含位於轉基因之間的編碼2A肽之序列、內部核醣體進入位點(IRES)或彼等之組合。
  27. 如請求項25或26之核酸分子，其中該免疫調節蛋白為細胞因子、趨化素或介白素。
  28. 如請求項25至27中任一項之核酸分子，其中該第二轉基因編碼第二冠狀病毒蛋白。
  29. 如請求項1至28中任一項之核酸分子，其中該第一多核苷酸位於該第二多核苷酸之5'。
  30. 如請求項29之核酸分子，其進一步包含位於該第一多核苷酸與該第二多核苷酸之間的第二基因間區。
  31. 如請求項30之核酸分子，其中該第二基因間區包含與SEQ ID NO：77之序列具有至少85%同一性的序列。
  32. 如請求項1至31中任一項之核酸分子，其中該核酸分子為 (c)DNA分子；或者 (d)RNA分子，其中T被U取代。
  33. 如請求項32之核酸分子，其中該DNA分子進一步包含啟動子。
  34. 如請求項33之核酸分子，其中該啟動子位於該5'UTR之5'。
  35. 如請求項34之核酸分子，其中該啟動子為T7啟動子、T3啟動子或SP6啟動子。
  36. 如請求項32之核酸分子，其中該RNA分子為自我複製RNA分子。
  37. 如請求項32或36之核酸分子，其中該RNA分子進一步包含5'帽。
  38. 如請求項37之核酸分子，其中該5'帽具有Cap 1結構、Cap 1(m6 A)結構、Cap 2結構、Cap 0結構或彼等之任何組合。
  39. 一種核酸分子，其包含 (a)SEQ ID NO：124之序列； (b)SEQ ID NO：124之序列，其中T被U取代； (c)SEQ ID NO：125之序列；或者 (d)SEQ ID NO：125之序列，其中T被U取代。
  40. 如請求項39之核酸分子，其中該核酸分子為RNA分子。
  41. 如請求項40之核酸分子，其進一步包含具有Cap 1結構之5'帽。
  42. 一種核酸分子，其包含： (i) 第一多核苷酸，其包含與SEQ ID NO：72之序列具有至少80%同一性之序列；和 (ii) 第二多核苷酸，其包含編碼第一抗原蛋白或其片段之第一轉基因，其中該第一抗原蛋白為冠狀病毒蛋白。
  43. 如請求項42之核酸分子，其進一步包含5'非轉譯區(UTR)。
  44. 如請求項43之核酸分子，其中該5'UTR包含病毒5'UTR、非病毒5'UTR或病毒和非病毒5'UTR序列之組合。
  45. 如請求項44之核酸分子，其中該5'UTR包含α病毒5'UTR。
  46. 如請求項45之核酸分子，其中該α病毒5'UTR包含委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)、東方馬腦炎病毒(EEEV)、大沼澤地病毒(EVEV)、穆坎布病毒(MUCV)、塞姆利基森林病毒(SFV)、皮克孫納病毒(PIXV)、米德堡病毒(MIDV)、屈公病毒(CHIKV)、歐尼恩病毒(ONNV)、羅斯河病毒(RRV)、巴馬森林病毒(BFV)、蓋他病毒(GETV)、鷺山病毒(SAGV)、貝巴魯病毒(BEBV)、馬雅羅病毒(MAYV)、烏納病毒(UNAV)、辛德畢斯病毒(SINV)、奧拉病毒(AURAV)、沃達羅病毒(WHAV)、巴班奇病毒(BABV)、庫孜拉加奇病毒(KYZV)、西方馬腦炎病毒(WEEV)、高地J病毒(HJV)、摩根堡病毒(FMV)、恩杜姆病毒(NDUV)、鮭魚α病毒(SAV)或博吉溪病毒(BCRV)5'UTR序列。
  47. 如請求項43之核酸分子，其中該5'UTR包含SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74或SEQ ID NO：75之序列。
  48. 如請求項42至47中任一項之核酸分子，其進一步包含3'非轉譯區(UTR)。
  49. 如請求項48之核酸分子，其中該3'UTR包含病毒3'UTR、非病毒3'UTR或病毒和非病毒3'UTR序列之組合。
  50. 如請求項49之核酸分子，其中該3'UTR包含α病毒3'UTR。
  51. 如請求項50之核酸分子，其中該α病毒3'UTR包含委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)、東方馬腦炎病毒(EEEV)、大沼澤地病毒(EVEV)、穆坎布病毒(MUCV)、塞姆利基森林病毒(SFV)、皮克孫納病毒(PIXV)、米德堡病毒(MIDV)、屈公病毒(CHIKV)、歐尼恩病毒(ONNV)、羅斯河病毒(RRV)、巴馬森林病毒(BFV)、蓋他病毒(GETV)、鷺山病毒(SAGV)、貝巴魯病毒(BEBV)、馬雅羅病毒(MAYV)、烏納病毒(UNAV)、辛德畢斯病毒(SINV)、奧拉病毒(AURAV)、沃達羅病毒(WHAV)、巴班奇病毒(BABV)、庫孜拉加奇病毒(KYZV)、西方馬腦炎病毒(WEEV)、高地J病毒(HJV)、摩根堡病毒(FMV)、恩杜姆病毒(NDUV)、鮭魚α病毒(SAV)或博吉溪病毒(BCRV)3'UTR序列。
  52. 如請求項48之核酸分子，其中該3'UTR包含聚A序列。
  53. 如請求項48之核酸分子，其中該3'UTR包含SEQ ID NO：76之序列。
  54. 如請求項42至53中任一項之核酸分子，其中該抗原蛋白為SARS-CoV-2蛋白。
  55. 如請求項54之核酸分子，其中該抗原蛋白為SARS-CoV-2刺突糖蛋白。
  56. 如請求項55之核酸分子，其中該SARS-CoV-2刺突糖蛋白為具有SEQ ID NO：123之胺基酸序列的野生型SARS-CoV-2刺突糖蛋白。
  57. 如請求項42至56中任一項之核酸分子，其中該第二多核苷酸包含與SEQ ID NO：121或SEQ ID NO：122之序列具有至少85%同一性的序列。
  58. 如請求項42至57中任一項之核酸分子，其中該第二多核苷酸包含至少二個轉基因。
  59. 如請求項58之核酸分子，其中該第二轉基因編碼第二抗原蛋白或其片段或免疫調節蛋白。
  60. 如請求項58或59之核酸分子，其中該第二多核苷酸進一步包含位於轉基因之間的編碼2A肽之序列、內部核醣體進入位點(IRES)或彼等之組合。
  61. 如請求項59或60之核酸分子，其中該免疫調節蛋白為細胞因子、趨化素或介白素。
  62. 如請求項59至61中任一項之核酸分子，其中該第二轉基因編碼第二冠狀病毒蛋白。
  63. 如請求項42至62中任一項之核酸分子，其中該第一多核苷酸係位於該第二多核苷酸之5'。
  64. 如請求項42至63中任一項之核酸分子，其進一步包含位在介於該第一多核苷酸與該第二多核苷酸之間的第二基因間區。
  65. 如請求項64之核酸分子，其中該第二基因間區包含與SEQ ID NO：77之序列具有至少85%同一性的序列。
  66. 如請求項42至65中任一項之核酸分子，其中該核酸分子為 (c)DNA分子；或者 (d)RNA分子，其中T被U取代。
  67. 如請求項66之核酸分子，其中該DNA分子進一步包含啟動子。
  68. 如請求項67之核酸分子，其中該啟動子位於該5'UTR之5'。
  69. 如請求項68之核酸分子，其中該啟動子為T7啟動子、T3啟動子或SP6啟動子。
  70. 如請求項66之核酸分子，其中該RNA分子為自我複製RNA分子。
  71. 如請求項66或70之核酸分子，其中該RNA分子進一步包含5'帽。
  72. 如請求項71之核酸分子，其中該5'帽具有Cap 1結構、Cap 1(m6 A)結構、Cap 2結構、Cap 0結構或彼等之任何組合。
  73. 一種組成物，其包含如請求項1至72中任一項之核酸分子和脂質。
  74. 如請求項73之組成物，其中該脂質包含可離子化之陽離子性脂質。
  75. 如請求項74之組成物，其中該可離子化之陽離子性脂質具有下式結構：
    Figure 03_image001
    Figure 03_image003
    ，或彼等之醫藥上可接受之鹽。
  76. 一種組成物，其包含如請求項1至72中任一項之核酸分子和脂質配製劑。
  77. 如請求項76之組成物，其中該脂質配製劑包含可離子化之陽離子性脂質。
  78. 如請求項77之組成物，其中該可離子化之陽離子性脂質具有下式結構：
    Figure 03_image005
    Figure 03_image007
    ，或彼等之醫藥上可接受之鹽。
  79. 如請求項76之組成物，其中該脂質配製劑係選自脂質複合物(lipoplex)、脂質體、脂質奈米顆粒、聚合物為底質之載體、胞外體(exosome)、板層體(lamellar body)、膠束和乳劑。
  80. 如請求項79之組成物，其中該脂質配製劑為選自陽離子性脂質體、奈米脂質體、蛋白脂質體、單層脂質體、多層脂質體、含神經醯胺之奈米脂質體和多囊脂質體的脂質體。
  81. 如請求項79之組成物，其中該脂質配製劑為脂質奈米顆粒。
  82. 如請求項81之組成物，其中該脂質奈米顆粒具有小於約200 nm之尺寸。
  83. 如請求項81之組成物，其中該脂質奈米顆粒具有小於約150 nm之尺寸。
  84. 如請求項81之組成物，其中該脂質奈米顆粒具有小於約100 nm之尺寸。
  85. 如請求項81之脂質組成物，其中該脂質奈米顆粒具有約55 nm至約90 nm之尺寸。
  86. 如請求項76至85中任一項之脂質組成物，其中該脂質配製劑包含一或多種陽離子性脂質。
  87. 如請求項86之脂質組成物，其中該一或多種陽離子性脂質係選自5-羧基精基甘胺酸二十八烷基醯胺(DOGS)、2,3-二油氧基-N-[2(精胺-羧醯胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙銨(DOSPA)、1,2-二油醯-3-二甲基銨-丙烷(DODAP)、1,2-二油醯-3-三甲基銨-丙烷(DOTAP)、1,2-二硬脂基氧基-N,N-二甲基-3-胺基丙烷(DSDMA)、1,2-二油氧基-N,N-二甲基-3-胺基丙烷(DODMA)、1,2-二亞油基氧基-N,N-二甲基-3-胺基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亞麻基氧基-N,N-二甲基-3-胺基丙烷(DLenDMA)、N-二油基-N,N-二甲基氯化銨(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化銨(DDAB)、N-(1,2-二肉荳蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羥乙基溴化銨(DMRIE)、3-二甲胺基-2-(膽固醇-5-烯-3-β-氧基丁-4-氧基)-1-(順,順-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(CLinDMA)、2-[5'-((膽固醇-5-烯-3-β-氧基)-3'-氧雜戊氧基)-3-二甲基1-1-(順,順-9',1-2'-十八碳二烯氧基)丙烷(CpLinDMA)、N,N-二甲基-3,4-二油氧基苄胺(DMOBA)、1,2-N,N'-二油基胺基甲醯-3-二甲胺基丙烷(DOcarbDAP)、2,3-二亞油醯氧基-N,N-二甲基丙胺(DLinDAP)、1,2-N,N'-二亞油醯胺甲醯基-3-二甲胺基丙烷(DLincarbDAP)、1,2-二亞油醯胺基甲醯-3-二甲胺基丙烷(DLinCDAP)、2,2-二亞油基-4-二甲胺基甲基-[1,3]-二氧戊環(DLin-K-DMA)和2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧戊環或(DLin-K-XTC2-DMA)。
  88. 如請求項76至85中任一項之組成物，其中該脂質配製劑包含可離子化之陽離子性脂質。
  89. 如請求項88之組成物，其中該可離子化之陽離子性脂質具有式I之結構：
    Figure 03_image009
    ， 或彼之醫藥上可接受之鹽或溶劑化物，其中R5 和R6 各自獨立地選自由下列所組成之群組：直鏈型或支鏈型C1 -C31 烷基、C2 -C31 烯基或C2 -C31 炔基和膽固醇基；L5 和L6 各自獨立地選自由下列所組成之群組：直鏈型C1 -C20 烷基和C2 -C20 烯基；X5 為-C(O)O-，由此形成-C(O)O-R6 或X5 為   -OC(O)-，由此形成-OC(O)-R6 ；X6 為-C(O)O-，由此形成 -C(O)O-R5 或X6 為-OC(O)-，由此形成-OC(O)-R5 ；X7 為S或O；L7 不存在或為低級烷基；R4 為直鏈型或支鏈型C1 -C6 烷基；且R7 和R8 各自獨立地選自由下列所組成之群組：氫和直鏈型或支鏈型C1 -C6 烷基。
  90. 如請求項88之組成物，其中該可離子化之陽離子性脂質係選自下列群組
    Figure 03_image011
    Figure 03_image013
    Figure 03_image015
    Figure 03_image017
    Figure 03_image019
    Figure 03_image021
    Figure 03_image023
    Figure 03_image025
    Figure 03_image027
  91. 如請求項88之組成物，其中該可離子化之陽離子性脂質為ATX-126：
    Figure 03_image029
  92. 如請求項76至91中任一項之組成物，其中該脂質配製劑包封該核酸分子。
  93. 如請求項76至92中任一項之組成物，其中該脂質配製劑與該核酸分子複合。
  94. 如請求項76至93中任一項之組成物，其中該脂質配製劑進一步包含輔助脂質。
  95. 如請求項94之組成物，其中該輔助脂質為磷脂。
  96. 如請求項94之組成物，其中該輔助脂質係選自二油醯磷脂醯乙醇胺(DOPE)、二肉荳蔻醯磷脂醯膽鹼(DMPC)、二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC)、二肉荳蔻醯磷脂醯甘油(DMPG)、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼(DPPC)和磷脂醯膽鹼(PC)。
  97. 如請求項96之組成物，其中該輔助脂質為二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC)。
  98. 如請求項76至97中任一項之組成物，其中該脂質配製劑進一步包含膽固醇。
  99. 如請求項76至98中任一項之組成物，其中該脂質配製劑進一步包含聚乙二醇(PEG)-脂質軛合物。
  100. 如請求項99之組成物，其中該PEG-脂質軛合物為PEG-DMG。
  101. 如請求項100之組成物，其中該PEG-DMG為PEG2000-DMG。
  102. 如請求項76至98中任一項之組成物，其中該脂質配製劑之脂質部分包含約40莫耳%至約60莫耳%之可離子化的陽離子性脂質、約4莫耳%至約16莫耳%之DSPC、約30莫耳%至約47莫耳%之膽固醇和約0.5莫耳%至約3莫耳%之PEG2000-DMG。
  103. 如請求項102之組成物，其中該脂質配製劑之脂質部分包含約42莫耳%至約58莫耳%之可離子化的陽離子性脂質、約6莫耳%至約14莫耳%之DSPC、約32莫耳%至約44莫耳%之膽固醇和約1莫耳%至約2莫耳%之PEG2000-DMG。
  104. 如請求項103之組成物，其中該脂質配製劑之脂質部分包含約45莫耳%至約55莫耳%之可離子化的陽離子性脂質、約8莫耳%至約12莫耳%之DSPC、約35莫耳%至約42莫耳%之膽固醇和約1.25莫耳%至約1.75莫耳%之PEG2000-DMG。
  105. 如請求項76至104中任一項之組成物，其中該組成物具有約50：1至約10：1之總脂質：核酸分子量比。
  106. 如請求項105之組成物，其中該組成物具有約44：1至約24：1之總脂質：核酸分子量比。
  107. 如請求項106之組成物，其中該組成物具有約40：1至約28：1之總脂質：核酸分子重量比。
  108. 如請求項76之組成物，其中該組成物具有約38：1至約30：1之總脂質：核酸分子重量比。
  109. 如請求項108之組成物，其中該組成物具有約37：1至約33：1之總脂質：核酸分子重量比。
  110. 如請求項76至109中任一項之組成物，其中該組成物包含pH為約7.0至約8.5之HEPES或TRIS緩衝劑。
  111. 如請求項110之組成物，其中該HEPES或TRIS緩衝液之濃度為約7 mg/mL至約15 mg/mL。
  112. 如請求項110或111之組成物，其中該組成物進一步包含約2.0 mg/mL至約4.0 mg/mL之NaCl。
  113. 如請求項76至112中任一項之組成物，其中該組成物進一步包含一或多種冷凍保護劑。
  114. 如請求項113之組成物，其中該一或多種冷凍保護劑係選自蔗糖、甘油或蔗糖和甘油之組合。
  115. 如請求項114之組成物，其中該組成物包含濃度為約70 mg/mL至約110 mg/mL之蔗糖和濃度為約50 mg/mL至約70 mg/mL之甘油的組合。
  116. 如請求項76至112中任一項之組成物，其中該組成物為凍乾之組成物。
  117. 如請求項116之組成物，其中該凍乾之組成物包含一或多種凍乾保護劑。
  118. 如請求項116之組成物，其中該凍乾之組成物包含泊洛沙姆(poloxamer)、山梨酸鉀、蔗糖或彼等之任何組合。
  119. 如請求項118之組成物，其中該泊洛沙姆為泊洛沙姆188。
  120. 如請求項116至119中任一項之組成物，其中該凍乾之組成物包含約0.01至約1.0 % w/w之該核酸分子。
  121. 如請求項116至119中任一項之組成物，其中該凍乾之組成物包含約1.0至約5.0 % w/w之脂質。
  122. 如請求項116至121中任一項之組成物，其中該凍乾之組成物包含約0.5至約2.5 % w/w之TRIS緩衝劑。
  123. 如請求項116至122中任一項之組成物，其中該凍乾之組成物包含約0.75至約2.75 % w/w之NaCl。
  124. 如請求項116至123中任一項之組成物，其中該凍乾之組成物包含約85至約95 % w/w之糖。
  125. 如請求項124之組成物，其中該糖為蔗糖。
  126. 如請求項116至125中任一項之組成物，其中該凍乾之組成物包含約0.01至約1.0 % w/w之泊洛沙姆。
  127. 如請求項126之組成物，其中該泊洛沙姆為泊洛沙姆188。
  128. 如請求項116至127中任一項之組成物，其中該凍乾之組成物包含約1.0至約5.0 % w/w之山梨酸鉀。
  129. 如前述請求項中任一項之組成物，其中該核酸分子包含 (a)SEQ ID NO：124之序列； (b)SEQ ID NO：124之序列，其中T被U取代； (c)SEQ ID NO：125之序列；或者 (d)SEQ ID NO：125之序列，其中T被U取代。
  130. 一種脂質奈米顆粒組成物，其包含 a.脂質配製劑，其包含 i.約45莫耳%至約55莫耳%之具有ATX-126結構的可離子化之陽離子性脂質：
    Figure 03_image031
    ii.約8莫耳%至約12莫耳%之DSPC； iii.約35莫耳%至約42莫耳%之膽固醇；和 iv.約1.25莫耳%至約1.75莫耳%之PEG2000-DMG；和 b.與SEQ ID NO：125具有至少85%序列同一性之核酸分子； 其中該脂質配製劑包封該核酸分子且該脂質奈米顆粒具有約60至約90 nm之尺寸。
  131. 一種對有需要之個體投予如請求項76至129中任一項之組成物之方法，其中該組成物係經由肌肉內、皮下、皮內、透皮、鼻內、口服、舌下、靜脈內、腹膜內、局部、藉由氣霧劑或經由肺部途徑投予。
  132. 如請求項131之方法，其中該組成物係經由肌肉內投予。
  133. 一種對有需要之個體投予如請求項76至129中任一項之組成物之方法，其中該組成物係經凍乾並在投予前經重構。
  134. 一種預防或改善COVID-19之方法，其包含對有需要之個體投予如請求項76至129中任一項之組成物。
  135. 如請求項134之方法，其中係投予該組成物一次。
  136. 如請求項134之方法，其中係投予該組成物二次。
  137. 一種對經接種疫苗之個體投予加強劑量之方法，其包含對先前已接種針對冠狀病毒之疫苗的個體投予如請求項76至129之組成物。
  138. 如請求項131至137 中任一項之方法，其中該組成物之投予劑量為約0.01 μg至約1,000 μg之核酸。
  139. 如請求項138之方法，其中該組成物之投予劑量為約1、2、5、7.5或10 μg之核酸。
  140. 一種誘導個體的免疫反應之方法，其包含： 對該個體投予有效量之如請求項1至75中任一項之核酸分子。
  141. 如請求項140之方法，其包含經由肌肉內、皮下、皮內、透皮、鼻內、口服、舌下、靜脈內、腹膜內、局部、藉由氣霧劑或經由肺部途徑投予該核酸分子。
  142. 一種誘導個體的免疫反應之方法，其包含： 對該個體投予有效量之如請求項76至129中任一項之組成物。
  143. 如請求項142之方法，其包含經由肌肉內、皮下、皮內、透皮、鼻內、口服、舌下、靜脈內、腹膜內、局部、藉由氣霧劑或經由肺部途徑投予該組成物。
  144. 如請求項1至75中任一項之核酸分子，其係用於誘導針對該第一抗原蛋白或其片段之免疫反應。
  145. 一種如請求項1至75中任一項之核酸分子於製造用於誘導針對該第一抗原蛋白或其片段之免疫反應的藥物之用途。
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