JP2020500552A - 新生抗原のウイルスによる送達方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、それぞれの全容を参照によって本明細書に援用するところの2016年11月23日出願の米国特許仮出願第62/425,996号、2016年12月16日出願の同第62/435,266号、2017年5月8日出願の同第62/503,196号、及び2017年6月21日出願の同第62/523,212号の利益を主張するものである。
本出願は、EFS−Web経由で提出され、その全容を参照によって本明細書に援用する配列表を含む。20XX年XX月に作成された前記ASCIIコピーは、XXXXXUS_sequencelisting.txtと名前が付けられており、そのサイズはX,XXX,XXXバイトである。
腫瘍特異的な新生抗原に基づいた治療用ワクチンは、次世代の個別化がん免疫療法として極めて有望である。1〜3非小細胞肺癌(NSCLC)及びメラノーマなどの高い遺伝子変異量を有するがんは、新生抗原を生じる可能性が比較的高いことから、かかる治療法の特に有望な標的である。4,5初期の証拠により、新生抗原に基づいたワクチン接種がT細胞応答を誘発し6、新生抗原を標的とした細胞療法が、選択された患者において腫瘍退縮を引き起こしうる7ことが示されている。
本明細書では、新生抗原カセットを含むチンパンジーアデノウイルスベクターを開示し、前記新生抗原カセットは、以下を含む:
(1)対象内に存在する腫瘍に由来する、複数の新生抗原コード核酸配列であって、
a.コードされたペプチド配列を、野生型核酸配列によってコードされる対応する核酸配列とは異なるものにする少なくとも1つの変化を有するMHCクラスIエピトープコード核酸配列と、
b.任意で5’リンカー配列と、
c.任意で3’リンカー配列と
をそれぞれが含む、少なくとも2個の腫瘍特異的及び対象特異的MHCクラスI新生抗原コード核酸配列
を含む、複数の新生抗原コード核酸配列と、
(2)前記複数の新生抗原コード核酸のうちの少なくとも1つの配列に機能的に連結された少なくとも1つのプロモーター配列と、
(3)任意で、少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列と、
(4)任意で、少なくとも1つのGPGPGリンカー配列(SEQ ID NO:56)と、
(5)任意で、少なくとも1つのポリアデニル化配列。
a.E1(nt577〜3403)欠失及びE3(nt27,125〜31,825)欠失を有するSEQ ID NO:1の配列を含む改変ChAdV68配列と、
b.CMVプロモーター配列と、
c.SV40ポリアデニル化シグナルヌクレオチド配列と、
d.新生抗原カセットであって、
(1)対象内に存在する腫瘍に由来する、複数の新生抗原コード核酸配列であって、複数の新生抗原コード核酸配列が、互いに直鎖状に連結された少なくとも20個の腫瘍特異的及び対象特異的なMHCクラスI新生抗原コード核酸配列を含み、各腫瘍特異的及び対象特異的なMHCクラスI新生抗原コード核酸配列が、
(A)コードされたペプチド配列を、野生型核酸配列によってコードされる対応するペプチド配列とは異なるものにする少なくとも1つの変化を有し、アミノ酸7〜15個の長さのMHCクラスIエピトープをコードする、MHCクラスIエピトープコード核酸配列と、
(B)前記MHC Iエピトープの天然の5’核酸配列であり、少なくともアミノ酸5個の長さであるペプチドをコードする、5’リンカー配列と、
(C)前記MHC Iエピトープの天然の3’核酸配列であり、少なくともアミノ酸5個の長さであるペプチドをコードする、3’リンカー配列と
を含み、
ここで、前記MHCクラスI新生抗原コード核酸配列のそれぞれが、アミノ酸25個の長さのポリペプチドをコードし、前記各MHCクラスI新生抗原コード核酸配列のそれぞれの3’末端が、前記複数の新生抗原コード核酸内の最後のMHCクラスI新生抗原コード核酸配列を除いて次のMHCクラスI新生抗原コード核酸配列の5’末端に連結されている、
複数の新生抗原コード核酸と、
(2)少なくとも2個のMHCクラスII抗原コード核酸配列であって、
(A)PADRE MHCクラスII配列(SEQ ID NO:48)と、
(B)破傷風トキソイドMHCクラスII配列(SEQ ID NO:46)と、
(C)前記PADRE MHCクラスII配列と前記破傷風トキソイドMHCクラスII配列とを連結する第1のGPGPGリンカー配列と、
(D)前記少なくとも2個のMHCクラスII抗原コード核酸配列の5’末端を、前記複数の新生抗原コード核酸配列に連結する第2のGPGPGリンカー配列と、
(E)少なくとも2個の前記MHCクラスII抗原コード核酸配列の3’末端をSV40ポリアデニル化シグナルヌクレオチド配列に連結する第3のGPGPGリンカー配列と
を含む、少なくとも2個のMHCクラスII抗原コード核酸配列と
を含む、新生抗原カセット;
ここで、前記新生抗原カセットが前記E1欠失内に挿入され、前記CMVプロモーター配列が前記新生抗原カセットに機能的に連結されている。
Pa−(L5b−Nc−L3d)X−(G5e−Uf)Y−G3g−Ah
を含む式に示される、ベクターの各要素の順序付けられた配列を、前記ベクターは有し、
式中、Pは、前記複数の配列のうちの少なくとも1つの配列に機能的に連結された少なくとも1つのプロモーター配列を含み、ここで、チンパンジーアデノウイルスベクターは任意で=1であり、Nは、コードされたペプチド配列を、野生型ヌクレオチド配列によってコードされる対応するペプチド配列とは異なるものにする少なくとも1つの変化を有するMHCクラスIエピトープコード核酸配列のうちの少なくとも1つを含み、ここで、c=1であり、L5は、5’リンカー配列を含み、ここで、b=0または1であり、L3は、3’リンカー配列を含み、ここで、d=0または1であり、G5は、少なくとも1つのGPGPGリンカー配列のうちの1つを含み、ここで、e=0または1であり、G3は、少なくとも1つのGPGPGリンカー配列のうちの1つを含み、ここで、g=0または1であり、Uは、MHCクラスII抗原をコードする少なくとも1つの核酸配列のうちの1つを含み、ここで、f=1であり、Aは、少なくとも1つのポリアデニル化配列を含み、ここで、h=0または1であり、X=2〜400であり、ここで、各Xについて、対応するNcは、C68の異なるMHCクラスIエピトープをコードする核酸配列であり、Y=0〜2であり、ここで、各Yについて、対応するUfは、MHCクラスII抗原をコードする核酸配列である。特定の態様において、b=1、d=1、e=1、g=1、h=1、X=20、Y=2であり、Pは、CMVプロモーター配列であり、各Nは、アミノ酸7〜15個の長さのMHCクラスIエピトープをコードし、L5は、前記MHC Iエピトープの天然の5’核酸配列であり、前記5’リンカー配列が、少なくともアミノ酸5個の長さであるペプチドをコードし、L3は、前記MHC Iエピトープの天然の3’核酸配列であり、前記3’リンカー配列が、少なくともアミノ酸5個の長さであるペプチドをコードし、Uは、PADREクラスII配列及び破傷風トキソイドMHCクラスII配列のそれぞれであり、前記チンパンジーアデノウイルスベクターは、E1(nt577〜3403)欠失及びE3(nt27,125〜31,825)欠失を有するSEQ ID NO:1の配列を含む改変ChAdV68配列を含み、前記新生抗原カセットが前記E1欠失内に挿入されており、前記MHCクラスI新生抗原コード核酸配列のそれぞれが、アミノ酸25個の長さのポリペプチドをコードしている。
I.定義
一般に、特許請求の範囲及び明細書において使用される用語は、当業者により理解される通常の意味を有するものとして解釈されるものとする。特定の用語を、さらなる明確性を与えるために下記に定義する。通常の意味と与えられる定義との間に矛盾が存在する場合、与えられる定義が用いられるものとする。
本明細書では、細胞表面上に提示される可能性が高い、及び/または免疫原性を有する可能性が高い、対象の腫瘍由来の新生抗原を特定するための方法を開示する。例として、かかる1つの方法は、対象の腫瘍細胞から、エクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも1つを得る工程であって、前記腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータを用いて新生抗原のセットの各々のペプチド配列を表すデータが取得され、各新生抗原のペプチド配列が、ペプチド配列を対応する野生型の親ペプチド配列とは異なるものにする少なくとも1つの変化を含む、工程と、各新生抗原のペプチド配列を、1つ以上の提示モデルに入力して、対象の腫瘍細胞の腫瘍細胞表面上の1つ以上のMHCアレルによって、または腫瘍内に存在する細胞によって新生抗原の各々が提示される数値的可能性のセットを生成する工程であって、前記数値的可能性のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて特定されている、工程と、前記数値的可能性のセットに基づいて前記新生抗原のセットのサブセットを選択して、選択された新生抗原のセットを生成する工程と、を含む方法を開示する。
また、ある特定の変異(例えば、がん細胞中に存在するバリアントまたはアレル)の特定のための方法も、本明細書に開示する。特に、これらの変異は、がんを有する対象のがん細胞のゲノム、トランスクリプトーム、プロテオーム、またはエクソーム中に存在し得るが、対象由来の正常組織には存在し得ない。
新生抗原は、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含むことができる。例えば、新生抗原は、ポリペプチド配列をコードするRNA配列であることができる。ワクチンにおいて有用な新生抗原は、したがって、ヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を含むことができる。
また、特異的な免疫応答、例えば、腫瘍特異的な免疫応答を生じることができる免疫原性組成物、例えば、ワクチン組成物も、本明細書に開示する。ワクチン組成物は、典型的に、例えば、本明細書に記載した方法を用いて選択された多数の新生抗原を含む。ワクチン組成物はまた、ワクチンと呼ぶこともできる。
1つ以上の新生抗原の選択に用いられる方法、「カセット」のクローニング及び構築、ならびにウイルスベクターへのその挿入は本明細書に与えられる教示を考慮すれば当該技術分野の範囲内である。「新生抗原カセット」とは、選択された新生抗原または複数の新生抗原と、ネオアンチゲン(複数可)を転写し、転写産物を発現するために必要とされる他の調節エレメントとの組み合わせを意味する。新生抗原または複数の新生抗原は、転写を可能とするような形で調節要素と機能的に連結することができる。かかる要素としては、ウイルスベクターをトランスフェクトした細胞内で新生抗原(複数可)の発現を推進することができる従来の調節エレメントが挙げられる。したがって、新生抗原カセットは、新生抗原(複数可)に連結され、組換えベクターの選択されたウイルス配列内に他の任意選択的な調節エレメントとともに配置された選択されたプロモーターも含むことができる。
本明細書に記載されるベクター、例えば本明細書に記載されるC68ベクター、または本明細書に記載されるアルファウイルスベクターは少なくとも1つの新生抗原をコードする核酸を含むことができ、また、同じまたは別のベクターが、免疫チェックポイント分子に結合してその活性を遮断する少なくとも1つの免疫調節因子(例えばscFvなどの抗体)をコードする核酸を含むことができる。ベクターは、新生抗原と、チェックポイント阻害剤をコードする1つ以上の核酸分子とを含むことができる。
V.C.1.すべての腫瘍サブクローンをカバーするペプチドのセットの決定
すべてのまたは大部分の腫瘍サブクローンによって提示されるものを意味するトランカルペプチド(truncal peptide)が、ワクチン中への包含について優先される53。任意で、高い確率で提示されかつ免疫原性であることが予測されるトランカルペプチドがない場合、または、高い確率で提示されかつ免疫原性であることが予測されるトランカルペプチドの数が、追加的な非トランカルペプチドをワクチンに含めることができるほど少ない場合には、腫瘍サブクローンの数及び同一性を推定すること、及びワクチンによってカバーされる腫瘍サブクローンの数を最大化するようにペプチドを選ぶことによって、さらなるペプチドを優先順位付けすることができる54。
上記の新生抗原フィルターのすべてを適用した後、ワクチン技術が対応できるよりも多くの候補新生抗原が、依然としてワクチン包含に利用可能である可能性がある。追加的に、新生抗原解析の種々の態様についての不確定度が残っている可能性があり、候補ワクチン新生抗原の様々な性状の間にトレードオフが存在する可能性がある。したがって、選択プロセスの各段階でのあらかじめ決定されたフィルターの代わりに、少なくとも以下の軸を有する空間に候補新生抗原を置き、積分アプローチを用いて選択を最適化する、積分多次元モデルを考えることができる。
1. 自己免疫または寛容のリスク(生殖細胞系列のリスク)(より低い自己免疫のリスクが、典型的に好ましい)
2. シークエンシングアーチファクトの確率(より低いアーチファクトの確率が、典型的に好ましい)
3. 免疫原性の確率(より高い免疫原性の確率が、典型的に好ましい)
4. 提示の確率(より高い提示の確率が、典型的に好ましい)
5. 遺伝子発現(より高い発現が、典型的に好ましい)
6. HLA遺伝子のカバレッジ(新生抗原のセットの提示に関与する、より多い数のHLA分子は、腫瘍が、HLA分子の下方制御または変異を介して免疫攻撃を回避するであろう確率を低くする可能性がある)
V.D.1.アルファウイルスの生物学
アルファウイルスは、トガウイルス科のメンバーであり、一本鎖プラス鎖RNAウイルスである。アルファウイルスは、自己複製型RNAまたはsrRNAと呼ぶこともできる。メンバーは、一般的に、シンドビス、ロスリバー、マヤロ、チクングニア、及びセムリキ森林ウイルスなどの旧世界型、または、東部ウマ脳炎ウイルス、アウラ、フォートモルガン、もしくはベネズエラウマ脳炎ウイルス及びその誘導株TC−83などの新世界型に分類される(Strauss Microbrial Review 1994)。天然のアルファウイルスゲノムは、通常、長さ約12kbであり、その最初の2/3は、ウイルスゲノムを自己複製するためのRNA複製複合体を形成する非構造タンパク質(nsP)をコードする遺伝子を含んでおり、最後の1/3は、ビリオンを産生するための構造タンパク質をコードするサブゲノム発現カセットを含んでいる(Frolov RNA 2001)。
アルファウイルスは、発現ベクター系として使用するために従来、遺伝子操作がなされている(Pushko 1997,Rheme 2004)。アルファウイルスは、異種抗原の発現が望ましい場合があるワクチン設定においていくつかの長所を有する。アルファウイルスは、宿主のサイトゾル中で自己複製するその能力のため、細胞内の発現カセットの高いコピー数を一般的に得ることができることから、高いレベルの異種抗原の産生を実現することができる。さらに、ベクターは一般的に一過性であるため、バイオセーフティーが高く、ベクターに対する免疫寛容の誘導は低い。また、一般公衆は、一般的にヒトアデノウイルスのような他の標準的ウイルスベクターと比較してアルファウイルスに対する既存の免疫を有していない。アルファウイルスに基づくベクターはまた、感染細胞に対する細胞毒性反応を一般的に生じる。細胞毒性は、発現された異種抗原に対して免疫応答を適性に誘発するためにワクチン設定においてある程度の重要性を有しうる。しかしながら、所望の細胞毒性の程度はバランスの問題であり、そのため、VEEのTC−83株をはじめとするいくつかの弱毒化されたアルファウイルスが開発されている。したがって、本明細書に記載される新生抗原発現ベクターの一例では、高いレベルの新生抗原発現を可能とし、新生抗原に対する強い免疫応答を誘発し、ベクター自体に対する免疫応答は誘発せず、安全に使用することができるアルファウイルス骨格を用いることができる。さらに、新生抗原発現カセットは、ベクターが、VEEまたはその弱毒化誘導株TC−83に由来する配列を含む(ただしこれらに限定されない)どのアルファウイルス配列を用いるかを最適化することを通じて異なるレベルの免疫応答を誘発するように設計することができる。
アルファウイルス送達ベクターは、一般的に、プラス鎖のRNAポリヌクレオチドである。RNA生成のための当該技術分野では周知の従来の方法として、インビトロ翻訳IVTがある。この方法では、所望のベクターのDNA鋳型が、クローニング、制限消化、ライゲーション、遺伝子合成、及びポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などの標準的な分子生物学的方法を含む当該技術分野では周知の方法によって最初に生成される。このDNA鋳型は、RNAに転写されることが望ましい配列の5’末端にRNAポリメラーゼのプロモーターを有している。プロモーターとしては、これらに限定されるものではないが、T3、T7、またはSP6などのバクテリオファージポリメラーゼのプロモーターが挙げられる。次に、DNA鋳型は、適当なRNAポリメラーゼ酵素、バッファー剤、及びヌクレオチド(NTP)とインキュベートされる。得られたRNAポリヌクレオチドは、7−メチルグアノシンまたは関連する構造などの5’キャップ構造の付加、及び任意で、ポリアデニル化(ポリA)テールを有するように3’末端を改変することを含む(ただしこれらに限定されない)方法によって、任意でさらに改変することができる。次に、RNAをフェノールクロロホルム抽出などの当該技術分野では周知の方法を用いて精製することができる。
ワクチンベクターの設計において考慮すべき重要な側面の1つとして、ベクター自体に対する免疫がある(Riley 2017)。これは、例えば特定のヒトアデノウイルス系などのベクター自体に対する既存の免疫の形である場合もあり、またはワクチンの投与後に生じるベクターに対する免疫の形である場合もある。後者は、例えば別々のプライミング及びブースター投与のように同じワクチンの複数回の投与が行われる場合、または異なる新生抗原カセットを送達するために同じワクチンベクターシステムが用いられるような場合に重要な考慮事項となる。
V.E.1.チンパンジーアデノウイルスによるウイルス送達
チンパンジー由来のアデノウイルスヌクレオチド配列、各種の新規ベクター、及びチンパンジーアデノウイルス遺伝子を発現する細胞株を与えることによって1種類以上の新生抗原を送達する(例えば新生抗原カセットにより)ためのワクチン組成物を調製することができる。チンパンジーC68アデノウイルス(本明細書ではChAdV68とも呼ぶ)のヌクレオチド配列を、新生抗原を送達するためのワクチン組成物中に使用することができる(SEQ ID NO:1を参照)。C68アデノウイルス由来ベクターの使用については米国特許第6,083,716号にさらに詳細に記載されており、当該特許の全容をあらゆる目的で参照によって本明細書に援用する。
本明細書に記載される遺伝子のいずれかにおいて欠失を有する組換えチンパンジーアデノウイルス(Ad)を作製するため、欠失させた遺伝子領域の機能(ウイルスの複製及び感染性に不可欠である場合)をヘルパーウイルスまたは細胞株(すなわち、相補性またはパッケージング細胞株)によって組換えウイルスに供給することができる。例えば、複製欠損チンパンジーアデノウイルスベクターを作製するには、ヒトまたはチンパンジーアデノウイルスのE1遺伝子産物を発現する細胞株を使用することができ、そのような細胞株にはHEK293またはそのバリアントが含まれうる。チンパンジーE1遺伝子を発現する細胞株の作製のプロトコール(米国特許第6,083,716号の実施例3及び4)にしたがって任意の選択されたチンパンジーアデノウイルス遺伝子を発現する細胞株を作製することができる。
本明細書に開示される組成物は、少なくとも1種類の新生抗原を細胞に送達するウイルスベクターを含むことができる。かかるベクターは、C68のようなチンパンジーアデノウイルスDNA配列と、カセットを直接発現するための調節配列に機能的に連結された新生抗原カセットとを含む。C68ベクターは、感染した哺乳動物細胞内でカセットを発現することが可能である。C68ベクターは1つ以上のウイルス遺伝子に機能的欠失を有することができる。新生抗原カセットは、プロモーターなどの1つ以上の調節配列の制御下にある少なくとも1つの新生抗原を含む。任意選択的なヘルパーウイルス及び/またはパッケージング細胞株によって、チンパンジーウイルスベクターに、欠失させたアデノウイルス遺伝子の任意の必要な産物を供給することができる。
本発明において有用なチンパンジーアデノウイルスC68ベクターには、組換え欠損アデノウイルス、すなわち、E1aまたはE1b遺伝子に機能的欠失を有し、任意で、例えば温度感受性変異または他の遺伝子における欠失などの他の変異を有するチンパンジーアデノウイルス配列が含まれる。これらのチンパンジー配列は、他のアデノウイルス及び/またはアデノ随伴ウイルス配列からハイブリッドベクターを形成するうえでも有用であると予想される。ヒトアデノウイルスから調製された同種アデノウイルスベクターについては、刊行文献に記載されている[例えば、上記に引用のKozarsky I及びII、ならびに同文献に引用された参照文献、米国特許第5,240,846号を参照]。
最小チンパンジーAd C68ウイルスとしては、複製及びビリオンのカプシド形成に必要なアデノウイルスのシスエレメントのみを含むウイルス粒子がある。すなわち、このベクターは、アデノウイルスのシス作用性の5’及び3’の末端逆位繰り返し配列(ITR)(複製起点として機能する)と、天然の5’パッケージング/エンハンサードメイン(直鎖状のAdのゲノム及びE1プロモーターのエンハンサーエレメントをパッケージングするために必要な配列を含む)とを含む。例えば、国際出願第WO96/13597号において「最小」ヒトAdベクターの調製について述べられ、本明細書に参照によって援用する方法を参照されたい。
組換え複製不全アデノウイルスは、最小チンパンジーアデノウイルス配列以上のものを含んでもよい。これらの他のAdベクターは、ウイルスの遺伝子領域の異なる部分の欠失、ならびに、必要に応じたヘルパーウイルス及び/またはパッケージング細胞株の使用によって形成される感染性ウイルス粒子によって特徴づけることができる。
新生抗原カセットを送達するために用いられるウイルスベクターのチンパンジーアデノウイルス遺伝子の含量に応じて、ヘルパーアデノウイルスまたは非複製ウイルスフラグメントを用いて、カセットを含む感染性の組換えウイルス粒子を生成するのに充分なチンパンジーアデノウイルス遺伝子配列を与えることができる。
アデノウイルス、新生抗原カセット、及び他のベクター因子の選択されたDNA配列の様々な中間プラスミド及びシャトルベクターへのアセンブリ、ならびに組換えウイルス粒子を作製するためのプラスミド及びシャトルベクターの使用は、従来の手法を用いてすべて実現することができる。かかる手法としては、従来のcDNAのクローニング法、インビトロ組換え法(例えば、ギブソンアセンブリ)、アデノウイルスゲノムの重複するオリゴヌクレオチド配列の使用、ポリメラーゼ連鎖反応、及び所望のヌクレオチド配列を与える任意の適当な方法が挙げられる。標準的なトランスフェクション及び同時トランスフェクションの手法、例えば、CaPO4沈殿法またはリポフェクタミンなどのリポソーム媒介トランスフェクション法が用いられる。用いられる他の従来の方法としては、ウイルスゲノムの相同組み換え、アガーオーバーレイ中でのウイルスのプラーク形成、シグナル発生測定の方法などが挙げられる。
したがって、新生抗原カセットを含む得られた組換えチンパンジーC68アデノウイルス(上記に述べたように、アデノウイルスベクターとヘルパーウイルスとの協同、またはアデノウイルスベクターとパッケージング細胞株との協同により作製される)は、新生抗原(複数可)をインビボまたはエクスビボで対象に送達することができる効率的な遺伝子導入担体を与えるものである。
本明細書に開示する方法を用いて特定された複数の新生抗原などの1つ以上の新生抗原を対象に投与することにより、対象に腫瘍特異的な免疫応答を誘導し、腫瘍に対するワクチン接種を行い、対象のがんの症状を治療及び/または緩和する方法も提供される。
ワクチン接種プロトコールを用いて対象に1つ以上の新生抗原を投与することができる。プライミングワクチン及びブースターワクチンを用いて対象への投与を行うことができる。プライミングワクチンは、C68(例えば、SEQ ID NO:1または2に示される配列)またはsrRNA(例えば、SEQ ID NO:3または4に示される配列)に基づいたものとすることができ、ブースターワクチンは、C68(例えば、SEQ ID NO:1または2に示される配列)またはsrRNA(例えば、SEQ ID NO:3または4に示される配列)に基づいたものとすることができる。各ベクターは、通常、新生抗原を含むカセットを含んでいる。カセットは、各抗原を通常取り囲む天然の配列、またはAAYなどの他の非天然のスペーサー配列などのスペーサーによって分離された約20個の新生抗原を含むことができる。カセットは、破傷風トキソイド抗原などのMHCII抗原、及びユニバーサルクラスII抗原とみなされるPADRE抗原を含んでもよい。カセットは、ユビキチンターゲティング配列などのターゲティング配列を含んでもよい。さらに、各ワクチン用量は、チェックポイント阻害剤(CPI)と組み合わせて(例えば、同時、その前、またはその後で)対象に投与することができる。CPIは、抗体またはその抗原結合部分など、CTLA4、PD1、及び/またはPDL1を阻害するものを含むことができる。かかる抗体としては、トレメリムマブまたはデュルバルマブを挙げることができる。
VIII.A.新生抗原候補の特定
腫瘍及び正常のエクソーム及びトランスクリプトームのNGS解析のための研究法を、新生抗原の特定のスペースに記載し、適用している6,14,15。下記の例は、臨床設定における新生抗原の特定について、より大きな感度及び特異性のためのある特定の最適化を考慮している。これらの最適化は、実験室プロセスに関連するもの及びNGSデータ解析に関連するものの、2つの区域にグループ化することができる。
本明細書に提示したプロセスの改善は、標的とされるがんパネルにおける信頼できるがんドライバー遺伝子の評価について開発された概念16を、新生抗原の特定のために必要な全エクソーム設定及び全トランスクリプトーム設定に拡大することによって、低い腫瘍含量及び少ない体積の臨床標本からの高精度の新生抗原の発見における難題に対処する。具体的には、これらの改善は、以下を含む:
1.低い腫瘍含量またはサブクローン状態のいずれかにより、低い変異体アレル頻度で存在する変異を検出するための、腫瘍エクソームにわたる深い(500xよりも大きい)固有の平均カバレッジのターゲティング。
2.可能性のある新生抗原の見逃しが最も少ないように、100x未満でカバーされる塩基が5%未満である、例として、
a. 個々のプローブQCを有するDNAベースの捕捉プローブの使用17
b.十分にカバーされていない領域についての追加的なベイトの包含
3.可能性のある新生抗原が体細胞性/生殖細胞系列ステータスについて分類されていないままである(したがってTSNAとして使用可能ではない)ことが最も少ないように、20x未満でカバーされる塩基が5%未満である、正常エクソームにわたる均一カバレッジのターゲティング。
4.必要とされるシークエンシングの総量を最小化するために、配列捕捉プローブは、非コードRNAは新生抗原を生じることができないことから、遺伝子のコード領域のみについて設計される。追加的な最適化は、以下を含む:
a.GCリッチであり、標準的なエクソームシークエンシングでは十分に捕捉されないHLA遺伝子についての補充的プローブ18。
b.不十分な発現、プロテアソームによる最適に満たない消化、または異例の配列特性などの要因により、候補新生抗原を少ししかまたは全く生成しないと予測される遺伝子の排除。
5.バリアント検出、遺伝子及びスプライスバリアント(「アイソフォーム」)発現の定量、ならびに融合物検出を可能にするために、腫瘍RNAが同様に、高深度(100Mリードよりも大きい)でシークエンシングされる。FFPE試料由来のRNAは、DNAにおいてエクソームを捕捉するために使用されるのと同じまたは類似したプローブで、プローブベース濃縮19を用いて抽出される。
解析法の改善は、一般的な研究変異コーリングアプローチの最適に満たない感度及び特異性に対処し、具体的には、臨床設定における新生抗原の特定のために関連するカスタマイズ化を考慮する。これらは、以下を含む:
1.アラインメントのための、HG38参照ヒトゲノムまたはより後のバージョンの使用(それが、以前のゲノムリリースとは対照的に、集団多型をより良好に反映する複数のMHC領域アセンブリーを含有するため)。
2.様々なプログラム5からの結果をマージすることによる、単一バリアントコーラー20の限界の克服。
a.単一ヌクレオチドバリアント及び挿入欠失は、以下を含む一連のツールで、腫瘍DNA、腫瘍RNA、及び正常DNAから検出される:Strelka21及びMutect22などの、腫瘍及び正常DNAの比較に基づくプログラム;ならびに、低純度の試料において特に有利である23、UNCeqRなどの、腫瘍DNA、腫瘍RNA、及び正常DNAを組み入れるプログラム。
b.挿入欠失は、Strelka及びABRA24などの、局所リアセンブリーを行うプログラムで決定される。
c.構造的再編成は、Pindel25またはBreakseq26などの専用のツールを用いて決定される。
3.試料スワップを検出して阻止するために、同じ患者についての試料由来のバリアントコールが、選ばれた数の多型部位で比較される。
4.例として、以下による、人工的コールの広範囲のフィルタリングが行われる:
a.潜在的に、低いカバレッジの例においては緩やかな検出パラメータで、及び挿入欠失の例においては許容的な近接基準での、正常DNAにおいて見出されるバリアントの除去。
b.低いマッピング品質または低い塩基品質によるバリアントの除去27。
c.たとえ対応する正常において観察されないとしても、再出現するシークエンシングアーチファクトから生じるバリアントの除去27。例は、主として1本の鎖上に検出されるバリアントを含む。
d.無関連の対照のセットにおいて検出されるバリアントの除去27。
5.seq2HLA28、ATHLATES29、またはOptitypeのうちの1つを使用する、かつまた、エクソーム及びRNAシークエンシングデータを組み合わせる28、正常エクソームからの正確なHLAコーリング。追加的な潜在的最適化は、ロングリードDNAシークエンシングなどの、HLAタイピングのための専用アッセイの採用30、または、RNA断片を連結して連続性を保持するための方法の適応31を含む。
6.腫瘍特異的スプライスバリアントから生じた新生ORFの堅牢な検出は、CLASS32、Bayesembler33、StringTie34、またはそのリファレンスガイドモードにおける類似したプログラム(すなわち、各実験からそれらの全体の転写産物を再作製するように試みるよりもむしろ、公知の転写産物構造を用いる)を用いて、RNA−seqデータから転写産物をアセンブルすることによって、行われる。Cufflinks35が、この目的で一般的に使用されるが、それは頻繁に、信じ難いほど多数のスプライスバリアントを産生し、それらの多くは、完全長遺伝子よりもはるかに短く、単純な陽性対照をリカバーすることができない場合がある。コード配列及び潜在的なナンセンス変異依存分解機構は、変異体配列を再導入した、SpliceR36及びMAMBA37などのツールで決定される。遺伝子発現は、Cufflinks35またはExpress(Roberts and Pachter,2013)などのツールで決定される。野生型及び変異体特異的な発現カウント及び/または相対レベルは、ASE38またはHTSeq39などの、これらの目的で開発されたツールで決定される。潜在的なフィルタリング段階は、以下を含む:
a.不十分に発現されていると考えられる候補新生ORFの除去。
b.ナンセンス変異依存分解機構(NMD)を引き起こすと予測される候補新生ORFの除去。
7.腫瘍特異的と直接検証することができない、RNAにおいてのみ観察される候補新生抗原(例えば、新生ORF)は、例として以下を考慮することにより、追加的なパラメータにしたがって、腫瘍特異的である可能性が高いとして分類される:
a.腫瘍DNAのみのシス作用性フレームシフトまたはスプライス部位変異の支持の存在。
b.スプライシング因子における腫瘍DNAのみのトランス作用性変異の確証の存在。例として、R625変異体SF3B1での3つの独立して公開された実験において、最も差次的にスプライシングを呈する遺伝子は、1つの実験がブドウ膜黒色腫患者を検討し40、第2の実験がブドウ膜黒色腫細胞株を検討し41、及び第3の実験が乳がん患者を検討した42にもかかわらず、一致していた。
c.新規のスプライシングアイソフォームについては、RNASeqデータにおける「新規の」スプライス−ジャンクションリードの確証の存在。
d.新規の再編成については、正常DNAには存在しない腫瘍DNAにおけるエクソン近傍リードの確証の存在。
e.GTEx43などの遺伝子発現大要からの欠如(すなわち、生殖細胞系列起源の可能性をより低くする)。
8.アラインメント及びアノテーションベースのエラー及びアーチファクトを直接避けるために、アセンブルされたDNAの腫瘍及び正常リード(またはそのようなリード由来のkマー)を比較することによる、参照ゲノムアラインメントベースの解析の補完(例えば、生殖細胞系列バリアントまたはリピートコンテクスト挿入欠失の近くに生じる体細胞性バリアントについて)。
HLAペプチド分子の単離は、組織試料の溶解及び可溶化後に、古典的な免疫沈降(IP)法を用いて行った(55〜58)。清澄化した溶解物を、HLA特異的IPに使用した。
ペプチドYVYVADVAAKを用いて、何が検出の限界かを、LCカラム上にロードした様々な量のペプチドを用いて決定した。試験したペプチドの量は、1pmol、100fmol、10fmol、1fmol、及び100amolであった。(表1)結果を図1Fに示す。これらの結果は、検出の最低限界(LoD)がアトモルの範囲(10−18)にあること、ダイナミックレンジが5桁に及ぶこと、及び、シグナル対ノイズが、低いフェムトモル範囲(10−15)でシークエンシングに十分であるように見えることを示す。
IX.A.システムの概要
図2Aは、1つの実施形態にしたがう、患者におけるペプチド提示の可能性を特定するための環境100の概要である。環境100は、それ自体が提示情報記憶装置165を含む提示特定システム160を導入するコンテクストを提供する。
図2は、1つの実施形態にしたがう、提示情報を取得する方法を説明する。提示情報165は、2つの一般的部類の情報:アレル相互作用情報及びアレル非相互作用情報を含む。アレル相互作用情報は、MHCアレルのタイプに依存する、ペプチド配列の提示に影響を及ぼす情報を含む。アレル非相互作用情報は、MHCアレルのタイプに非依存的な、ペプチド配列の提示に影響を及ぼす情報を含む。
アレル相互作用情報は、主として、ヒト、マウスなど由来の1つ以上の特定されたMHC分子によって提示されていることが公知である、特定されたペプチド配列を含む。注目すべきことに、これは、腫瘍試料から取得されたデータを含んでもよく、または含まなくてもよい。提示されたペプチド配列は、単一のMHCアレルを発現する細胞から特定されてもよい。この例において、提示されたペプチド配列は、概して、あらかじめ決定されたMHCアレルを発現するように操作されてその後合成タンパク質に曝露された単一アレル細胞株から収集される。MHCアレル上に提示されたペプチドは、酸溶出などの技法によって単離され、質量分析により特定される。図2Bは、あらかじめ決定されたMHCアレルHLA−A*01:01上に提示された例示的なペプチドYEMFNDKSが単離され、質量分析により特定される、この例を示す。この状況においては、ペプチドが、単一のあらかじめ決定されたMHCタンパク質を発現するように操作された細胞を通して特定されるため、提示されたペプチドとそれが結合したMHCタンパク質との間の直接の関連が、決定的に既知である。
が、特定されたMHCアレルHLA−A*01:01、HLA−A*02:01、HLA−B*07:02、HLA−B*08:01、HLA−C*01:03、及びHLA−C*01:04上に提示されており、単離され、質量分析により特定される、この例を示す。単一アレル細胞株とは対照的に、結合したペプチドが、特定される前のMHC分子から単離されるため、提示されたペプチドとそれが結合したMHCタンパク質との間の直接の関連は、未知である可能性がある。
アレル非相互作用情報は、その由来源タンパク質配列内の、新生抗原コード化ペプチドに隣接するC末端配列を含むことができる。C末端フランキング配列は、ペプチドのプロテアソームプロセシングに影響を及ぼし得る。しかし、C末端フランキング配列は、ペプチドが小胞体に輸送され、細胞の表面上のMHCアレルと遭遇する前に、プロテアソームによってペプチドから切断される。その結果、MHC分子は、C末端フランキング配列についてのいかなる情報も受け取らず、したがって、C末端フランキング配列の効果は、MHCアレルタイプに応じて変動することができない。例えば、図2Cに示した例に戻ると、提示情報165は、ペプチドの由来源タンパク質から特定された、提示されたペプチドFJIEJFOESSのC末端フランキング配列FOEIFNDKSLDKFJIを含み得る。
i.EGFR、KRAS、ALK、RET、ROS1、TP53、CDKN2A、CDKN2B、NTRK1、NTRK2、NTRK3などの公知のがんドライバー遺伝子におけるドライバー変異。
ii.抗原提示マシナリーに関与するタンパク質をコードする遺伝子(例えば、B2M、HLA−A、HLA−B、HLA−C、TAP−1、TAP−2、TAPBP、CALR、CNX、ERP57、HLA−DM、HLA−DMA、HLA−DMB、HLA−DO、HLA−DOA、HLA−DOBHLA−DP、HLA−DPA1、HLA−DPB1、HLA−DQ、HLA−DQA1、HLA−DQA2、HLA−DQB1、HLA−DQB2、HLA−DR、HLA−DRA、HLA−DRB1、HLA−DRB3、HLA−DRB4、HLA−DRB5、または、プロテアソームもしくはイムノプロテアソームの構成要素をコードする遺伝子のいずれか)におけるもの。その提示が、腫瘍において機能喪失変異の影響下にある抗原提示マシナリーの構成要素に依拠するペプチドは、提示の確率が低減している。
i.抗原提示マシナリーに関与するタンパク質をコードする遺伝子(例えば、B2M、HLA−A、HLA−B、HLA−C、TAP−1、TAP−2、TAPBP、CALR、CNX、ERP57、HLA−DM、HLA−DMA、HLA−DMB、HLA−DO、HLA−DOA、HLA−DOBHLA−DP、HLA−DPA1、HLA−DPB1、HLA−DQ、HLA−DQA1、HLA−DQA2、HLA−DQB1、HLA−DQB2、HLA−DR、HLA−DRA、HLA−DRB1、HLA−DRB3、HLA−DRB4、HLA−DRB5、または、プロテアソームもしくはイムノプロテアソームの構成要素をコードする遺伝子のいずれか)におけるもの。
図3は、1つの実施形態による、提示特定システム160のコンピュータ論理構成要素を説明する、ハイレベルブロック図である。この例示的実施形態において、提示特定システム160は、データ管理モジュール312、コード化モジュール314、訓練モジュール316、及び予測モジュール320を含む。提示特定システム160はまた、訓練データ記憶装置170及び提示モデル記憶装置175から構成される。モデル管理システム160のいくつかの実施形態は、本明細書に記載したものとは異なるモジュールを有する。同様に、機能は、本明細書に記載したものは異なる様式で、モジュールの間に分配され得る。
データ管理モジュール312は、提示情報165から訓練データ170のセットを生成する。各々の訓練データのセットは、多数のデータ例を含有し、各データ例iは、少なくとも、提示されるかまたは提示されないペプチド配列piと、ペプチド配列piと結合した1つ以上の関連するMHCアレルaiと、提示特定システム160が、独立変数の新たな値を予測することに関心があるという情報を表す従属変数yiとを含む、独立変数ziのセットを含有する。
コード化モジュール314は、訓練データ170に含有される情報を、1つ以上の提示モデルを生成するために使用することができる数値的表示へとコード化する。一実現形態では、コード化モジュール314は、配列(例えば、ペプチド配列またはC末端フランキング配列)を、あらかじめ決定された20文字のアミノ酸アルファベットについて、ワン・ホットでコード化する。具体的には、ki個のアミノ酸を有するペプチド配列piは、20・ki要素の行ベクトルとして表され、ペプチド配列のj番目の位置のアミノ酸のアルファベットに対応するpi 20・(j−1)+1,pi 20・(j−1)+2,...,pi 20・jの中の単一要素は、1の値を有する。その以外の、残りの要素は、0の値を有する。例として、所定のアルファベット{A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y}について、データ例iの3個のアミノ酸のペプチド配列EAFは、60個の要素の行ベクトル
によって表され得る。C末端フランキング配列ci、ならびに、MHCアレルについてのタンパク質配列dh、及び提示情報における他の配列データは、同様に、上記のようにコード化することができる。
によって表され得る。C末端フランキング配列ciまたは他の配列データは、同様に、上記のようにコード化することができる。したがって、ペプチド配列piまたはciにおける各々の独立変数または列は、配列の特定の位置の特定のアミノ酸の存在を表す。
(ただし、
は指標関数であり、Lkはペプチドpkの長さを意味する)として表す。ベクトルTkを、アレル相互作用変数xh iに含めることができる。
訓練モジュール316は、ペプチド配列に関連するMHCアレルによってペプチド配列が提示されるかどうかの尤度を生成する、1つ以上の提示モデルを構築する。具体的には、ペプチド配列pk及びペプチド配列pkに関連するMHCアレルakのセットを与えられ、各提示モデルは、ペプチド配列pkが、関連するMHCアレルakのうちの1つ以上によって提示されるであろう尤度を示す、推定値ukを生成する。
訓練モジュール316は、165に保存された提示情報から生成された、記憶装置170に保存された訓練データセットに基づいて、1つ以上の提示モデルを構築する。概して、提示モデルの具体的なタイプに関わらず、提示モデルのすべては、損失関数が最小化されるように、訓練データ170における独立変数と従属変数との間の依存性を捕捉する。具体的には、損失関数
は、訓練データ170における1つ以上のデータ例Sについての従属変数yi∈Sの値と、提示モデルによって生成されたデータ例Sについての推定された尤度ui∈Sとの間の矛盾を表す。本明細書の残りの部分を通じて言及される1つの特定の実現形態において、損失関数(yi∈S,ui∈S;θ)は、以下のような等式(1a)によって与えられる負のlog尤度関数である。
しかし、実際には、別の損失関数が使用されてもよい。例えば、質量分析イオン電流について予測がなされる場合、損失関数は、以下のような等式1bによって与えられる平均二乗損失である。
訓練モジュール316は、アレルごとベースでペプチドの提示尤度を予測するための提示モデルを構築し得る。この例において、訓練モジュール316は、単一のMHCアレルを発現する細胞から生成された訓練データ170におけるデータ例Sに基づいて、提示モデルを訓練し得る。
によって、特定のアレルhについてのペプチドpkの推定提示尤度ukをモデル化し、ただし、ペプチド配列xh kは、ペプチドpk及び対応するMHCアレルhについてのコード化されたアレル相互作用変数を意味し、f(・)は、任意の関数であり、記載の便宜上、本明細書中を通して変換関数と呼ばれる。さらに、gh(・)は、任意の関数であり、記載の便宜上、本明細書中を通して依存性関数と呼ばれ、MHCアレルhについて決定されたパラメータθhのセットに基づいて、アレル相互作用変数xh kについての依存性スコアを生成する。各MHCアレルhについてのパラメータθhのセットの値は、θhに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、ここでiは、単一のMHCアレルhを発現する細胞から生成された訓練データ170のサブセットSにおける各例である。
によって与えられるexpit関数である。
別の例として、f(・)はまた、ドメインzの値が0以上である場合、
によって与えられる双曲線正接関数であることもできる。あるいは、予測が、範囲[0,1]の外側の値を有する質量分析イオン電流についてなされる場合、f(・)は、例えば、恒等関数、指数関数、log関数などの任意の関数であることができる。
本明細書を通して言及される1つの特定の実現形態において、依存性関数gh(・)は、xh kにおける各アレル相互作用変数を、関連するMHCアレルhについて決定されたパラメータθhのセットにおける対応するパラメータと線形結合する、
によって与えられるアフィン関数である。
によって与えられるネットワーク関数である。ノードは、パラメータθhのセットにおける関連するパラメータを各々有する接続を通して、他のノードに接続され得る。1つの特定のノードでの値は、特定のノードに関連する活性化関数によってマッピングされた関連するパラメータによって重み付けられた、特定のノードに接続されたノードの値の和として表され得る。アフィン関数と対照的に、ネットワークモデルは、提示モデルが非線形性、及び異なる長さのアミノ酸配列を有するプロセスデータを組み入れることができるため、有利である。具体的には、非線形モデリングを通して、ネットワークモデルは、ペプチド配列中の異なる位置のアミノ酸間の相互作用、及びこの相互作用がペプチド提示にいかに影響を及ぼすかを捕捉することができる。
として表すことができ、式中、g’h(xh k;θ’h)は、パラメータθ’hのセットを伴うアフィン関数、ネットワーク関数などであり、MHCアレルhについての提示のベースライン確率を表す、MHCアレルのアレル相互作用変数についてのパラメータのセットにおけるバイアスパラメータθh 0を伴う。
によって生成することができ、式中、x3 kは、MHCアレルh=3について特定されたアレル相互作用変数であり、θ3は、損失関数最小化を通してMHCアレルh=3について決定されたパラメータのセットである。
によって生成することができ、式中、x3 kは、MHCアレルh=3について特定されたアレル相互作用変数であり、θ3は、MHCアレルh=3に関連するネットワークモデルNN3(・)について決定されたパラメータのセットである。
一実現形態では、訓練モジュール316は、アレル非相互作用変数を組み入れて、
によって、ペプチドpkの推定提示尤度ukをモデル化し、式中、wkは、ペプチドpkについてのコード化されたアレル非相互作用変数を意味し、gw(・)は、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータθwのセットに基づく、アレル非相互作用変数wkについての関数である。具体的には、各MHCアレルhについてのパラメータθhのセット及びアレル非相互作用変数についてのパラメータθwのセットの値を、θh及びθwに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、iは、単一のMHCアレルを発現する細胞から生成された訓練データ170のサブセットSにおける各例である。
によって与えられ得る。
アレル相互作用変数についての依存性関数gh(・)と同様に、アレル非相互作用変数についての依存性関数gw(・)は、アフィン関数、または別々のネットワークモデルがアレル非相互作用変数wkに関連しているネットワーク関数であり得る。
によって与えられ得、式中、g’w(wk;θ’w)は、アレル非相互作用パラメータθ’wのセットを伴うアフィン関数、ネットワーク関数などであり、mkは、ペプチドpkについてのmRNA定量測定値であり、h(・)は、定量測定値を変換する関数であり、かつθw mは、mRNA定量測定値についての依存性スコアを生成するようにmRNA定量測定値と組み合わされる、アレル非相互作用変数についてのパラメータのセットにおけるパラメータである。本明細書の残りの部分を通じて言及される1つの特定の実施形態において、h(・)はlog関数であるが、実際には、h(・)は、様々な異なる関数のうちのいずれか1つであり得る。
によって与えられ、式中、g’w(wk;θ’w)は、アレル非相互作用パラメータθ’wのセットを伴うアフィン関数、ネットワーク関数などであり、okは、ペプチドpkについてヒトプロテオームにおけるタンパク質及びアイソフォームを表す上記の指標ベクトルであり、かつθw oは、指標ベクトルと組み合わされるアレル非相互作用変数についてのパラメータのセットにおける、パラメータのセットである。1つのバリエーションにおいて、ok及びパラメータθw oのセットの次元が有意に高い場合、
(
は、L1ノルム、L2ノルム、組み合わせなどを表す)などのパラメータ正則化項を、パラメータの値を決定する時に損失関数に加えることができる。ハイパーパラメータλの最適値を、適切な方法を通して決定することができる。
によって生成することができ、式中、wkは、ペプチドpkについて特定されたアレル非相互作用変数であり、θwは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
によって生成することができ、式中、wkは、ペプチドpkについて特定されたアレル相互作用変数であり、θwは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
訓練モジュール316はまた、2つ以上のMHCアレルが存在する複数アレル設定においてペプチドの提示尤度を予測するための提示モデルを構築し得る。この例において、訓練モジュール316は、単一のMHCアレルを発現する細胞、複数のMHCアレルを発現する細胞、またはそれらの組み合わせから生成された訓練データ170におけるデータ例Sに基づいて、提示モデルを訓練し得る。
一実現形態では、訓練モジュール316は、複数のMHCアレルHのセットに関連したペプチドpkの推定提示尤度ukを、等式(2)〜(11)と共に上記で説明したような、単一アレルを発現する細胞に基づいて決定されたセットHにおけるMHCアレルhの各々について決定された提示尤度uk h∈Hの関数としてモデル化する。具体的には、提示尤度ukは、uk h∈Hの任意の関数であることができる。一実現形態では、等式(12)に示すように、関数は最大値関数であり、提示尤度ukは、セットHにおける各MHCアレルhについての提示尤度の最大値として決定することができる。
一実現形態では、訓練モジュール316は、ペプチドpkの推定提示尤度ukを、
によってモデル化し、式中、要素ah kは、ペプチド配列pkに関連する複数のMHCアレルHについて1であり、xh kは、ペプチドpk及び対応するMHCアレルについてのコード化されたアレル相互作用変数を意味する。各MHCアレルhについてのパラメータθhのセットの値は、θhに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、iは、単一のMHCアレルを発現する細胞及び/または複数のMHCアレルを発現する細胞から生成された訓練データ170のサブセットSにおける各例である。依存性関数ghは、セクションX.B.1.において上記で導入された依存性関数ghのいずれかの形態であり得る。
によって生成することができ、式中、x2 k、x3 kは、MHCアレルh=2、h=3について特定されたアレル相互作用変数であり、θ2、θ3は、MHCアレルh=2、h=3について決定されたパラメータのセットである。
によって生成することができ、式中、NN2(・)、NN3(・)は、MHCアレルh=2、h=3について特定されたネットワークモデルであり、θ2、θ3は、MHCアレルh=2、h=3について決定されたパラメータのセットである。
一実現形態では、訓練モジュール316は、アレル非相互作用変数を組み入れて、
によって、ペプチドpkの推定提示尤度ukをモデル化し、式中、wkは、ペプチドpkについてのコード化されたアレル非相互作用変数を意味する。具体的には、各MHCアレルhについてのパラメータθhのセット及びアレル非相互作用変数についてのパラメータθwのセットの値を、θh及びθwに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、iは、単一のMHCアレルを発現する細胞及び/または複数のMHCアレルを発現する細胞から生成された訓練データ170のサブセットSにおける各例である。依存性関数gwは、セクションX.B.3.において上記で導入された依存性関数gwのいずれかの形態であり得る。
によって生成することができ、式中、wkは、ペプチドpkについて特定されたアレル非相互作用変数であり、θwは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
によって生成することができ、式中、wkは、ペプチドpkについて特定されたアレル相互作用変数であり、θwは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
によって与えられ得る。
別の実現形態において、訓練モジュール316は、ペプチドpkの推定提示尤度ukを、
によってモデル化し、式中、要素ah kは、ペプチド配列pkに関連する複数のMHCアレルh∈Hについて1であり、u’k hは、MHCアレルhについての暗黙のアレル当たりの提示尤度であり、ベクトルvは、要素vhが、ah k・u’k hに対応するベクトルであり、s(・)は、vの要素をマッピングする関数であり、かつr(・)は、入力の値を所定の範囲中にクリップするクリッピング関数である。より詳細に下記に記載するように、s(・)は、総和関数または二次関数であってもよいが、他の実施形態において、s(・)は、最大値関数などの任意の関数であり得ることが認識される。暗黙のアレル当たりの尤度についてのパラメータθのセットの値は、θに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、iは、単一のMHCアレルを発現する細胞及び/または複数のMHCアレルを発現する細胞から生成された訓練データ170のサブセットSにおける各例である。
r(z)=min(max(z,0),1)
であってもよく、zと1の間の最小値が、提示尤度ukとして選ばれる。別の実現形態において、r(・)は、
r(z)=tanh(z)
として与えられる双曲線正接関数であり、ドメインzの値は、0以上である。
によって生成することができ、式中、x2 k、x3 kは、MHCアレルh=2、h=3について特定されたアレル相互作用変数であり、θ2、θ3は、MHCアレルh=2、h=3について決定されたパラメータのセットである。
によって生成することができ、式中、NN2(・)、NN3(・)は、MHCアレルh=2、h=3について特定されたネットワークモデルであり、θ2、θ3は、MHCアレルh=2、h=3について決定されたパラメータのセットである。
1つの実現形態では、MHCアレルhについての暗黙のアレル当たりの提示尤度を、
によって生成して、提示尤度が、
によって生成されるようにして、ペプチド提示に、アレル非相互作用変数の影響を組み入れる。
によって生成することができ、式中、wkは、ペプチドpkについて特定されたアレル非相互作用変数であり、θwは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
によって生成することができ、式中、wkは、ペプチドpkについて特定されたアレル相互作用変数であり、θwは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
一実現形態では、s(・)は、二次関数であり、ペプチドpkの推定提示尤度ukは、
によって与えられ、式中、要素u’k hは、MHCアレルhについての暗黙のアレル当たりの提示尤度である。暗黙のアレル当たりの尤度についてのパラメータθのセットの値は、θに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、iは、単一のMHCアレルを発現する細胞及び/または複数のMHCアレルを発現する細胞から生成された訓練データ170のサブセットSにおける各例である。暗黙のアレル当たりの提示尤度は、上記の等式(18)、(20)、及び(22)において示すいずれかの形態であり得る。
によって生成することができ、式中、x2 k、x3 kは、HLAアレルh=2、h=3について特定されたアレル相互作用変数であり、θ2、θ3は、HLAアレルh=2、h=3について決定されたパラメータのセットである。
によって生成することができ、式中、NN2(・)、NN3(・)は、HLAアレルh=2、h=3について特定されたネットワークモデルであり、θ2、θ3は、HLAアレルh=2、h=3について決定されたパラメータのセットである。
予測モジュール320は、配列データを受け取って、提示モデルを用いて配列データ中の候補新生抗原を選択する。具体的には、配列データは、患者の腫瘍組織細胞から抽出されたDNA配列、RNA配列、及び/またはタンパク質配列であってよい。予測モジュール320は、配列データを、8〜15個のアミノ酸を有する複数のペプチド配列pkに処理する。例えば、予測モジュール320は、所定の配列「IEFROEIFJEF」を、9個のアミノ酸を有する3種類のペプチド配列「IEFROEIFJ」、「EFROEIFJE」、及び「FROEIFJEF」に処理することができる。一実施形態では、予測モジュール320は、患者の正常組織細胞から抽出された配列データをその患者の腫瘍組織細胞から抽出された配列データと比較して1つ以上の変異を有する部分を特定することによって、変異したペプチド配列である候補新生抗原を特定することができる。
XI.B.1 概要
カセット設計モジュール324は、患者に注射するためのv種類の選択された候補ペプチドに基づいてワクチンカセット配列を生成する。具体的には、容量vのワクチンに含まれる選択されたペプチドのセットpk,k=1,2,…,vについて、カセット配列は、それぞれが対応するペプチドpkの配列を含む一連の治療エピトープ配列p’k,k=1,2,…,vの連結鎖によって与えられる。一実施形態では、カセット設計モジュール324は、各エピトープを互いに対して直接隣接するように連結することができる。例えば、あるワクチンカセットCは、
で表すことができる(式中、p’tiは、カセットのi番目のエピトープを示す)。したがって、tiは、カセットのi番目の位置の選択されたペプチドの添え字k=1,2,…,vに対応する。別の実施形態では、カセット設計モジュール324は、隣接するエピトープ間に1つ以上の任意選択的なリンカー配列を有するように各エピトープを連結することができる。例えば、あるワクチンカセットCは、
で表すことができる(式中、l(ti,tj)は、カセットのi番目のエピトープp’tiとj=i+1番目のエピトープp’j=i+1との間に配置されたリンカー配列を示す)。カセット設計モジュール324は、選択されたエピトープp’k,k=1,2,…,vのどれがカセットの異なる位置に配置されるか、及び、各エピトープ間に配置されるすべてのリンカー配列を決定する。カセット配列Cは、本明細書に記載される方法のいずれかに基づいたワクチンとしてロードすることができる。
により与えられる(ただし、h(・)は、各ジャンクションの距離関数をあるスコアにマッピングする特定の関数である)。本明細書の残りの部分を通じて言及される1つの特定の例では、関数h(・)は、カセットの距離関数にわたった総和である。
v×vの行列Dは、非対称距離行列であり、各要素D(k,m),k=1,2,…,v;m=1,2,…,vは、エピトープp’kからエピトープp’mまでのジャンクションの距離関数に対応している。Pの列k=2,…,vは元のエピトープの各ノードに対応し、列1及び行1は、他のすべてのノードからの距離が0である「ゴーストノード」に対応する。行列への「ゴーストノード」の追加は、ワクチンカセットが環状ではなく直鎖状であり、したがって最初のエピトープと最後のエピトープとの間にジャンクションがないという概念を記号化するものである。換言すれば、配列は環状ではなく、最初のエピトープは配列内の最後のエピトープの後に連結されると仮定されない。エピトープp’kがエピトープp’mのN末端に連結され、そうでない場合には0である、方向付けられた経路(すなわち、カセット内のエピトープ−エピトープジャンクション)が存在する場合にxkmが、値1のバイナリー変数を示すものとする。さらに、Eが、すべてvの治療ワクチンエピトープのセットを示し、S⊂Eがエピトープのサブセットを示すものとする。任意のかかるサブセットSにおいて、out(S)が、エピトープ−エピトープジャンクションx_km=1の数を示すものとする(ただし、kはS内のエピトープであり、mはE\S内のエピトープである)。既知の経路行列Pが与えられたものとして、カセット設計モジュール324は、以下の整数線形計画問題を解く経路行列Xを見つける。
ただし、Pkmは、以下の制約条件の下で、経路行列Pの要素P(k,m)を示す。
最初の2つの制約条件は、各エピトープがカセット内にちょうど1回現れることを保証するものである。最後の制約条件は、カセットが連結されていることを保証するものである。換言すれば、xで記号化されたカセットは連結された直鎖状タンパク質配列である。
v=20個の治療エピトープを含む2個のカセット配列を、1,000,000通りの順列のランダムサンプリングにより(カセット配列C1)、また、等式(27)において整数線形計画問題を解くことにより(カセット配列C2)生成した。距離関数、したがって提示スコアを、等式(14)で記述される提示モデルに基づいて求めた(式中、fは、シグモイド関数であり、xh iは、ペプチドpiの配列であり、gh(・)は、ニューラルネットワーク関数であり、wは、フランキング配列、ペプチドpiのlogTPM(transcripts per kilobase million)、ペプチドpiのタンパク質の抗原性、及びペプチドpiの由来源の試料IDを含み、フランキング配列のgw(・)及びlogTPMは、それぞれニューラルネットワーク関数である)。gh(・)のニューラルネットワーク関数のそれぞれは、単一隠れ層の多層パーセプトロン(MLP)の1つの出力ノードを含み、入力次元231(11残基×残基ごとに21文字(pad文字を含む))の幅256、隠れ層での正規化線形ユニット(ReLU)活性化、出力層での線形活性化、及び、訓練データセット内のHLAアレルごとに1個の出力ノードのものであった。フランキング配列のニューラルネットワーク関数は、単一隠れ層MLPで、入力次元210(N末端フランキング配列の5残基+C末端フランキング配列の5残基×残基ごとに21文字(pad文字を含む))、幅32、隠れ層でのReLU活性化、及び出力層での線形活性化のものであった。RNA logTPMのニューラルネットワーク関数は、単一隠れ層MLPで、入力次元1、幅16、隠れ層でのReLU活性化、及び出力層での線形活性化のものであった。HLA−A*02:04、HLA−A*02:07、HLA−B*40:01、HLA−B*40:02、HLA−C*16:02、及びHLA−C*16:04のHLAアレルについて提示モデルを構築した。2個のカセット配列の提示されるジャンクションエピトープの期待数を示す提示スコアを比較した。結果は、等式(27)を解くことによって生成されたカセット配列の提示スコアが、ランダムサンプリングによって生成されたカセット配列の提示スコアよりも約4倍の改善をともなったことを示した。
であり、提示されるジャンクションエピトープの期待数の提示スコアは6.1であった。1,000,000通りのランダム配列の提示スコアの中央値は、18.3であった。実験は、提示されるジャンクションエピトープの期待数が、ランダムにサンプリングされたカセット間でカセット配列を特定することによって大幅に低減されたことを示している。
であり、提示スコア1.7であった。カセット配列C2の提示スコアは、カセット配列C1の提示スコアと比較して約4倍の改善を示し、ランダムに生成された1,000,000通りの候補カセットの提示スコアの中央値と比較して約11倍の改善を示した。カセットC1を生成するためのランタイムは、2.30GHzのIntel Xeon E5−2650 CPUのシングルスレッド上で20秒であった。カセットC2を生成するためのランタイムは、同じCPUのシングルスレッド上で1秒であった。したがって、この例では、等式(27)の整数線形計画問題を解くことによって特定されたカセット配列は、20倍低減された計算コストで約4倍良好な解を生成している。
この例では、腫瘍/正常エクソームのシークエンシング、腫瘍トランスクリプトームのシークエンシング、及び肺癌試料のHLAタイピングに基づいて選択されたv=20個の治療エピトープを含むカセット配列を、1,000,000通りの順列のランダムサンプリングにより、さらに等式(27)で整数線形計画問題を解くことによって生成した。距離関数、したがって提示スコアを、HLAペプチドの結合親和性の予測プログラムであるMHCflurryによって予測された、様々な閾値(例えば、50〜1000nM、またはこれよりも高いかもしくは低い値)を下回る親和性で患者のHLAに結合するジャンクションエピトープの数に基づいて求めた。この例では、治療エピトープとして選択される20個の非同義体細胞変異を、上記のセクションXI.Bの提示モデルにしたがって変異をランク付けすることによって腫瘍試料で特定された98個の体細胞変異間から選択した。しかしながら、他の実施形態では、治療エピトープは、安定性に基づくものなど、または提示スコア、親和性といった基準の組み合わせなどの他の基準に基づいて選択することもできる点は理解されよう。さらに、ワクチンに含めるための治療エピトープを優先順位付けするために用いられる基準は、カセット設計モジュール324で使用される距離関数D(k,m)を決定するために用いられる基準と同じである必要はない点は理解されよう。
上記の種々の提示モデルの妥当性を、提示モデルを訓練するために使用されなかった訓練データ170のサブセット、または、訓練データ170と類似した変数及びデータ構造を有する訓練データ170とは別々のデータセットであった、試験データTに対して試験した。
であり、これは、HLAアレル上に提示されると予測されたペプチド例の数に対する、関連するHLAアレル上に提示されると正確に予測されたペプチド例の数の比率を示す。一実現形態では、試験データTにおけるペプチドpiは、対応する尤度推定値uiが、所定の閾値t以上である場合に、1つ以上の関連するHLAアレル上に提示されると予測された。提示モデルの性能を示す別の関連性のある測定基準は、
であり、これは、HLAアレル上に提示されることが公知であったペプチド例の数に対する、関連するHLAアレル上に提示されると正確に予測されたペプチド例の数の比率を示す。提示モデルの性能を示す別の関連性のある測定基準は、受信者動作特性(ROC)の曲線下面積(AUC)である。ROCは、
によって与えられる、偽陽性率(FPR)に対するリコールをプロットする。
図13Aは、複数アレル質量分析データに基づいて、ペプチド提示予測について、本明細書において提示するような例示的な提示モデル、及び従来の技術水準モデルの性能結果を比較する。結果は、例示的な提示モデルが、親和性及び安定性の予測に基づく従来の技術水準モデルよりも有意に良好に、ペプチド提示の予測において機能したことを示した。
図13Bは、T細胞エピトープデータに基づいて、ペプチド提示予測について、本明細書において提示するような別の例示的な提示モデル、及び従来の技術水準モデルの性能結果を比較する。T細胞エピトープデータは、細胞表面上のMHCアレルによって提示されT細胞によって認識されたペプチド配列を含有する。結果は、例示的な提示モデルが、たとえ質量分析データに基づいて訓練されているとしても、親和性及び安定性の予測に基づく従来の技術水準モデルよりも有意に良好に、T細胞エピトープの予測において機能したことを示した。換言すると、図13Bの結果は、例示的な提示モデルが、質量分析試験データに基づくペプチド提示の予測において従来の技術水準モデルよりも良好に機能しただけではなく、T細胞によって実際に認識されたエピトープの予測においても、従来の技術水準モデルよりも有意に良好に機能したことを示した。これは、本明細書において提示するような様々な提示モデルが、免疫系において免疫原性応答を誘導する可能性が高い抗原の、改善された特定を提供できることのしるしである。
図13Cは、複数アレル質量分析データに基づいて、ペプチド提示予測について、例示的な和の関数モデル(等式(13))、例示的な関数の和モデル(等式(19))、及び例示的な二次モデル(等式(23))の性能結果を比較する。結果は、関数の和モデル及び二次モデルが、和の関数モデルよりも良好に機能したことを示した。これは、和の関数モデルが、実際にはペプチドの提示が有効に独立している場合、複数アレル設定におけるアレルが、ペプチド提示について互いに干渉し得ることを含意するためである。
図13Dは、複数アレル質量分析データについて、ペプチド提示予測に関して、単一アレル質量分析データを伴って及び伴わずに訓練される2つの例示的な提示モデルの性能結果を比較する。結果は、単一アレルデータを伴わずに訓練される例示的な提示モデルが、単一アレルデータを伴って訓練される例示的な提示モデルのものに匹敵する性能を達成することを示した。
図13Eは、図13Dに示す解析において提供されたアレルHLA−A*02:01及びHLA−B*07:02についての単一アレル質量分析データに基づく、図13Dに示す「A2/B7単一アレルデータを伴わない」及び「A2/B7単一アレルデータを伴う」例示的なモデルの性能を示す。結果は、たとえ例示的な提示モデルがこれらの2つのアレルについての単一アレル質量分析データを伴わずに訓練されるとしても、モデルが各MHCアレルについての結合モチーフを学習できることを示す。
図13Fは、図13Dに示す「A2/B7単一アレルデータを伴わない」例示的なモデルによって予測される、九量体の中で一般的な2位及び9位のアンカー残基を示す。ペプチドは、推定尤度が5%よりも上であった場合に、提示されることが予測された。結果は、MHCアレルHLA−A*02:01及びHLA−B*07:02上での提示について特定されたペプチドにおける最も一般的なアンカー残基が、これらのMHCアレルについて既知のアンカーモチーフと一致したことを示す。これは、例示的な提示モデルが、期待されたように、ペプチド配列のアミノ酸の特定の位置に基づいて、ペプチド結合を正確に学習したことを示す。
図13Gは、C末端フランキング配列及びN末端フランキング配列をアレル相互作用変数として組み入れた例示的な提示モデルと、C末端フランキング配列及びN末端フランキング配列をアレル非相互作用変数として組み入れた例示的な提示モデルとの間の性能結果を比較する。結果は、C末端フランキング配列及びN末端フランキング配列のアレル非相互作用変数としての組み入れが、モデル性能を有意に改善したことを示した。より具体的には、様々なMHCアレルにわたって共通である、ペプチド提示に適切な特性を特定し、これらのアレル非相互作用変数についての統計学的強度が、提示モデルの性能を改善するためにMHCアレルにわたって共有されるように、それらをモデル化することが、価値を有する。
図13Hは、腫瘍細胞に対する質量分析データについて、mRNA定量に基づく遺伝子と提示されるペプチドの画分との間の依存性を説明する。結果は、mRNA発現とペプチド提示との間に強い依存性があることを示す。
図13Iは、2つの例示的な提示モデルの性能を示し、そのうち1つは、質量分析腫瘍細胞データに基づいて訓練されており、もう1つは、mRNA定量データ及び質量分析腫瘍細胞データを組み入れている。図13Hから期待されるように、mRNA発現はペプチド提示の強い指標であるため、結果は、mRNA定量測定値を例示的な提示モデルに組み入れることによって、性能の有意な改善があることを示した。
図13Jは、図13Iに関して説明した「例示的なモデル、RNAあり」提示モデルによって生成された結果と、ペプチド提示を予測する時にペプチド長を計上しない従来の技術水準モデルによって予測された結果との間で、様々なペプチド長についてのペプチド提示の確率を比較する。結果は、図13Iからの「例示的なモデル、RNAあり」の例示的な提示モデルが、異なる長さのペプチドにわたって尤度の変動を捕捉したことを示した。
以下は、hによって意味されるMHCアレルHLA−C*16:04について、アレルごと提示モデル(等式(2))のバリエーションについて決定されたパラメータのセットを示し:
式中、relu(・)は、正規化線形ユニット(RELU:rectified linear unit)関数であり、Wh 1、bh 1、Wh 2、及びbh 2は、モデルについて決定されたパラメータθのセットである。アレル相互作用変数xh kは、ペプチド配列からなる。Wh 1の次元は(231x256)であり、bh 1の次元は(1x256)であり、Wh 2の次元は(256x1)であり、かつbh 2はスカラーである。証明の目的で、bh 1、bh 2、Wh 1、及びWh 2の値は、その教示するところのすべてについて本明細書に援用する国際公開第WO2017106638号に詳細に記載されている。
図14は、図1及び図3に示した実体を実施するための例示的なコンピュータ1400を説明する。コンピュータ1400は、チップセット1404に連結された少なくとも1つのプロセッサ1402を含む。チップセット1404は、メモリコントローラハブ1420及び入力/出力(I/O)コントローラハブ1422を含む。メモリ1406及びグラフィックスアダプタ1412は、メモリコントローラハブ1420に連結されており、ディスプレイ1418は、グラフィックスアダプタ1412に連結されている。記憶デバイス1408、入力装置1414、及びネットワークアダプタ1416は、I/Oコントローラハブ1422に連結されている。コンピュータ1400の他の実施形態は、異なるアーキテクチャを有する。
以下は、本明細書を実施するための具体的な実施形態の例である。これらの例はあくまで例示の目的で示されるものにすぎず、本発明の範囲をいかなる意味においても限定しようとするものではない。用いられる数値(例えば、量、温度など)に関して精度を確実とするべく努力に努めてはいるが、ある程度の実験的誤差及び偏差は無論のこと許容されなければならない。
ワクチン接種によって、対応する細胞免疫応答(複数可)を刺激するクラスI MHCに制限された複数の腫瘍特異的新生抗原(TSNA)を送達することができる。1つの例では、複数のエピトープを単一の遺伝子産物をしてコードするようにワクチンカセットを操作しているが、ここで各エピトープはそれらの天然の包囲ペプチド配列内に埋め込まれるか、または非天然リンカー配列によって分離されている。抗原のプロセシング及び提示、ひいてはTSNA特異的CD8 T細胞応答の程度及び幅に潜在的に影響を及ぼしうるいくつかの設計パラメータが特定されている。本例では、いくつかのモデルカセットを設計及び構築して以下を評価した。すなわち、(1)1個の発現カセットに組み込まれた複数のエピトープに対する強いT細胞応答を生じることができるかどうか、(2)どのような条件が、すべてのエピトープの最適なプロセシング及び提示につながる、発現カセット内のTSNA間に配置される最適リンカーを作るか、(3)カセット内の各エピトープの相対位置がT細胞応答に影響するか、(4)カセット内のエピトープの数が個々のエピトープに対するT細胞応答の程度または質に影響するかどうか、(5)細胞ターゲティング配列の付加がT細胞応答を向上させるか。
XIV.B.1.方法及び材料
TCR及びカセット設計及びクローニング
選択されたTCRは、A*0201により提示される場合にペプチドNLVPMVATV(PDB番号5D2N)、CLGGLLTMV(PDB番号3REV)、GILGFVFTL(PDB番号1OGA)LLFGYPVYV(PDB番号1AO7)を認識する。2Aペプチド連結TCRサブユニット(βに続きα)、EMCV IRES、及び2A連結CD8サブユニット(βに続きα及びプロマイシン耐性遺伝子)を含むトランスファーベクターを構築した。オープンリーディングフレーム配列は、コドン最適化され、GeneArt社により合成されたものである。
ペプチドは、ProImmune社またはGenscript社より購入し、水/DMSO(2:8,v/v)に加えた10mM tris(2−カルボキシルエチル)ホスフィン(TCEP)で10mg/mLに希釈した。細胞培地及び補助添加物質は特に断らない限りはGibco社より入手した。熱不活化ウシ胎児血清(FBShi)はSeradigm社より入手した。QUANTI−Luc基質、ゼオシン、及びプロマイシンはInvivoGen社より入手した。Jurkat−Lucia NFAT細胞(InvivoGen社)を10% FBShi、ピルビン酸ナトリウム、及び100μg/mLのゼオシンを添加したRPMI1640中で維持した。形質導入した後、これらの細胞にさらに0.3μg/mLのプロマイシンを加えた。T2細胞(ATCC CRL−1992)をIscove培地(IMDM)+20%FBShi中で培養した。U−87 MG(ATCC HTB−14)細胞を、10%FBShiを添加したMEM Eagles培地中で維持した。
T2細胞はTCRによる抗原認識を調べる目的で日常的に使用されている。T2細胞は、抗原プロセシング用のペプチドトランスポーターを欠失しており(TAP欠損)、内因性のペプチドをMHC上に提示するために小胞体に取り込むことができない。しかしながら、T2細胞には外因性のペプチドを容易に取り込ませることができる。5種類のマーカーペプチド(NLVPMVATV、CLGGLLTMV、GLCTLVAML、LLFGYPVYV、GILGFVFTL)及び2種類の無関係のペプチド(WLSLLVPFV、FLLTRICT)をT2細胞に取り込ませた。簡単に述べると、T2細胞をカウントし、IMDM +1%FBShiで1×106細胞/mLに希釈した。各ペプチドは10μgペプチド/1×106細胞となるように加えた。次いで細胞を37℃で90分間インキュベートした。細胞をIMDM+20%FBShiで2回洗浄し、5×10E5細胞/mLに希釈し、100μLを96ウェルCostar組織培養プレートにプレーティングした。Jurkat−Lucia TCRクローンをカウントし、RPMI1640+10%FBShi中で5×10E5細胞/mLに希釈し、100μLをT2細胞に加えた。プレートを37℃、5%CO2で一晩インキュベートした。次いでプレートを400gで3分間遠心し、20μLの上清を白色平底Greinerプレートに取った。指示にしたがってQUANTI−Luc基質を調製し、50μL/ウェルで加えた。ルシフェラーゼ発現をMolecular Devices SpectraMax iE3xで読み取った。
トランスジェニックHLA−A2.1(HLA−A2 Tg)マウスをTaconic Labs,Inc社より入手した。これらのマウスは、ヒトHLA−A2.1リーダードメイン、α1ドメイン、及びα2ドメインと、マウスH2−Kb α3ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインから構成されるキメラクラスI分子からなる導入遺伝子を有するものである(Vitiello et al.,1991)。これらの実験で使用したマウスは、C57Bl/6バックグラウンドの野生型BALB/cAnNTacの雌及びホモ接合型HLA−A2.1Tgの雌の第1世代子孫(F1)である。
HLA−A2 Tgマウスを、前脛骨筋の両側性の筋肉内注射により1×1010〜1×106 個のアデノウイルスベクターのウイルス粒子で免疫化した。免疫応答を免疫化の12日後に測定した。
免疫化したマウスの新しく収穫した脾臓及びリンパ節からリンパ球を単離した。GentleMACS組織解離装置を製造者の指示にしたがって使用して、10%ウシ胎児血清をペニシリン及びストレプトマイシンとともに含むRPMI(完全RPMI)中で組織を解離させた。
マウスIFNg ELISpotPLUSキット(MABTECH社)を使用し、ELISPOTハーモナイゼーションガイドライン(Janetzki et al.,2015)にしたがってELISPOT分析を行った。1×105個の脾細胞を、96ウェルIFNg抗体コーティングプレート中で、10uMの示したペプチドと16時間インキュベートした。スポットをアルカリホスファターゼを用いて現像した。反応時間を10分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させた。スポットをAID vSpot Reader Spectrumを用いてカウントした。ELISPOT分析を行うため、飽和度が50%よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が10%よりも大きい試料は分析から除外した。次いでスポットのカウントを、式:スポットカウント+2×(スポットカウント×コンフルエンス(%)/[100%−コンフルエンス(%)])を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。ネガティブペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによってネガティブバックグラウンドを補正した。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、100の位までの概数に端数を切り上げた。
新しく単離したリンパ球を2〜5×106細胞/mLの密度で10uMの示したペプチドと2時間インキュベートした。2時間後、ブレフェルジンAを5ug/mlの濃度にまで加え、細胞を刺激物質とさらに4時間インキュベートした。刺激後、生細胞を製造者のプロトコールにしたがって固定可能な生存率解析用色素eFluor780で標識し、抗CD8 APC(クローン53−6.7,BioLegend社)により1:400の希釈率で染色した。細胞内染色には抗IFNg PE(クローンXMG1.2,BioLegend社)を1:100で使用した。試料をAttune NxT Flow Cytometer(Thermo Scientific社)で収集した。FlowJoを使用してフローサイトメトリーデータをプロットし、分析を行った。抗原特異的応答の程度を評価するため、CD8+細胞のIFNg+の割合(%)及び全IFNg+細胞数/1×106個の生細胞の両方を、各ペプチド刺激物質に対して計算した。
新生抗原カセットの設計の評価の一例として、インビトロの細胞ベースのアッセイを開発し、モデルワクチンカセット内の選択されたヒトエピトープが抗原提示細胞によって発現、プロセシング、及び提示されるかどうかを評価した(図15)。認識後、特性がよく知られているペプチド−HLAの組み合わせに特異的な5種類のTCRのうちの1つを発現するように操作されたJurkat−LuciaレポーターT細胞が活性化され、活性化T細胞の核因子(NFAT)を核内に移行させると、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の転写が活性化される。個々のレポーターCD8 T細胞株の抗原刺激をバイオルミネッセンスによって定量した。
*エピトープ3のレポーターT細胞はまだ生成されていない。
インビトロT細胞活性化アッセイにおけるルシフェラーゼ誘導は、DPPベースのカセットと異なり、すべてのリンカーがカセット抗原の効率的な放出を促進したことを示した。T細胞エピトープのみ(リンカー無し)=9AA、片側に天然リンカー=17AA、両側に天然リンカー=25AA、非天然リンカー=AAY,RR,DPP
*エピトープ3のレポーターT細胞はまだ生成されていない。
インビトロT細胞活性化アッセイを用いることにより、4つのHLA−A*0201制限マーカーエピトープがモデルカセットから効率的に放出され、ターゲティング配列がT細胞の認識及び活性化を大幅に向上させないことが示された。
*エピトープ3のレポーターT細胞はまだ生成されていない。
新生抗原カセット設計の評価の別の例として、HLA−A*02:01に制限された形でCD8 T細胞を刺激することが知られている、特性がよく知られた5つのヒトクラスI MHCエピトープを含むようにワクチンカセットを設計した(図16A、17、19A)。それらのインビボ免疫原性の評価を行うため、これらのマーカーエピトープを含むワクチンカセットをアデノウイルスベクターに組み込み、HLA−A2トランスジェニックマウスに感染させるのに使用した(図18)。このマウスモデルは、ヒトHLA−A*0201及びマウスH2−Kbから一部が構成された導入遺伝子を保有しており、したがって、ヒトHLA−A2.1のリーダー、マウスα3に連結されたα1及びα2ドメイン、膜貫通及び細胞質H2−Kbドメインで構成されたキメラクラスI MHC分子をコードしている(Vitiello et al.,1991)。このキメラ分子は、HLA−A*02:01に制限された抗原提示を可能とする一方で、CD8共受容体とMHC上のα3ドメインとの種の一致した相互作用を維持する。
ELISPOTデータは、HLA−A2トランスジェニックマウスが1e11個のアデノウイルス粒子による感染17日後にカセット内のすべてのクラスI MHC制限エピトープに対してT細胞応答を生じたことを示した。
ELISPOTデータは、HLA−A2トランスジェニックマウスが5e10アデノウイルス粒子による感染17日後に長いワクチンカセット及び短いワクチンカセットの両方で同等の大きさのT細胞応答を生じたことを示した。
* 技術的なエラーによりT細胞応答が見られなかったと疑われる。
要約すると、モデルカセット評価による知見(図16〜19、表2〜6)によって、モデルワクチンカセットでは、アデノウイルスベースのベクターとの関連で約20個のエピトープをコードする「数珠つなぎ」アプローチを用いた場合に最適の免疫原性が得られることが実証された。エピトープは、両側にその天然の周辺ペプチド配列(例えば、両側に8個のアミノ酸残基)が隣接した最小のCD8 T細胞エピトープ(例えば、9個のアミノ酸残基)をそれぞれが埋め込んだ25マー配列を連結することによって最も効果的にアセンブルされる。本明細書において使用される場合、「天然」または「自然」のフランキング配列とは、その由来源タンパク質内のそのエピトープの天然に存在するという文脈で特定のエピトープのN末端及び/またはC末端側のフランキング配列のことを指す。例えば、HCMV pp65 MHC IエピトープNLVPMVATVは、その5’末端側に天然の5’配列WQAGILARが、その3’末端側に天然の3’配列QGQNLKYQが隣接し、それによりHCMV pp65由来源タンパク質内にみられるWQAGILARNLVPMVATVQGQNLKYQという25マーペプチドを生成する。天然または自然の配列は、天然のフランキング配列(複数可)が隣接したエピトープをコードするヌクレオチド配列のことを指す場合もある。各25マー配列は、それに続く25マー配列に直接連結される。最小のCD8 T細胞エピトープがアミノ酸9個よりも大きいかまたは小さい場合、フランキングペプチドの長さは、全体の長さが依然25マーのペプチド配列となるように調節することができる。例えば、アミノ酸10個のCD8 T細胞エピトープには、アミノ酸8個とアミノ酸7個の配列を隣接させることができる。このコンカテマーの後には、CD4 Tヘルパー細胞を刺激し、ワクチンカセット抗原の全体のインビボ免疫原性を改善するため(Alexander et al.,1994;Panina−Bordignon et al.,1989)に含ませた2個のユニバーサルクラスII MHCエピトープを繋げた。これらのクラスIIエピトープは、GPGPGアミノ酸リンカー(SEQ ID NO:56)によって最後のクラスIエピトープに連結した。2個のクラスIIエピトープは、GPGPGアミノ酸リンカーによって互いに対しても連結し、さらにC末端側にGPGPGアミノ酸リンカーを連結させた。エピトープの位置もその数もT細胞の認識または応答に大きく影響しないことが示された。ターゲティング配列も、カセットに由来する抗原の免疫原性に大きく影響しないようであった。
XV.A.ChAd新生抗原カセット送達ベクターの構築
1つの例では、チンパンジーアデノウイルス(ChAd)を操作して新生抗原カセットの送達ベクターとした。さらなる例では、完全長ChAdV68ベクターを、AC_000011.1(米国特許第6083716号に記載のSEQ ID NO:2)に基づいて合成し、E1(nt457〜3014)及びE3(nt27,816〜31,332)配列を欠失させた。CMVプロモーター/エンハンサーの制御下にあるレポーター遺伝子を欠失させたE1配列の代わりに挿入した。このクローンをHEK293細胞にトランスフェクトしたところ、感染性のウイルスは生成されなかった。野生型C68ウイルスの配列を確認するため、単離VR−594をATCCより入手して継代した後、個々に配列決定した(SEQ ID NO:10)。AC_000011.1配列を野生型ChAdV68ウイルスのATCC VR−594配列(SEQ ID NO:10)と比較したところ、6個のヌクレオチドの相違が特定された。1つの例では、改変ChAdV68ベクターを、AC_000011.1に基づいて作製し、対応するATCC VR−594ヌクレオチドを5つの位置で置換した(ChAdV68.5WTnt SEQ ID NO:1)。
XV.B.1.ChAdベクターの評価方法及び材料
リポフェクタミンを用いたHEK293A細胞のトランスフェクション
ChAdV68コンストラクト(ChAdV68.4WTnt.GFP、ChAdV68.5WTnt.GFP、ChAdV68.4WTnt.MAG25マー、及びChAdV68.5WTnt.MAG25マー)のDNAを調製し、以下のプロトコールを用いてHEK293A細胞にトランスフェクトした。
ChAdV68コンストラクト(ChAdV68.4WTnt.GFP、ChAdV68.5WTnt.GFP、ChAdV68.4WTnt.MAG25マー、ChAdV68.5WTnt.MAG25マー)のDNAを調製し、以下のプロトコールを用いてHEK293A細胞にトランスフェクトした。
8%CO2のインキュベーター内の293FreeStyle(商標)(ThermoFisher社)培地中で増殖させた293F細胞内でChAdV68ウイルス生成を行った。感染の当日、細胞を生存率98%で1mL当たり106細胞に希釈し、1LのShakeフラスコ(Corning社)中、1回の生成操作当たり400mLを使用した。1回の感染当たり目標MOIが3.3よりも高い4mLの三次ウイルスストックを使用した。トリパンブルーによって測定される生存率が70%を下回るまで48〜72時間にわたって細胞をインキュベートした。次いで感染細胞をベンチトップ遠心分離器で最大速度で遠心して収穫し、1×PBS中で洗浄し、再び遠心してから20mLの10mM Tris pH7.4に再懸濁した。細胞ペレットを、凍結解凍を3回行って溶解し、4,300×gで5分間遠心して清澄化した。
ウイルスDNAをCsCl遠心分離により精製した。2つの不連続な勾配の操作を行った。第1の遠心は、細胞成分からウイルスを精製するためのもので、第2の遠心は、細胞成分からの分離物をさらに精製し、感染性粒子から機能不全粒子を分離するためのものである。
1.1×1012個のウイルス粒子(VP)の消光係数はOD260nmの吸光度の値=1に相当することに基づき、OD260アッセイを用いてVP濃縮を行った。アデノウイルスの2つの希釈度(1:5と1:10)をウイルス溶解バッファー(0.1%SDS,10mM Tris pH7.4,1mM EDTA)中で作った。両方の希釈度でODを2重に測定し、OD260値×希釈係数×1.1×1012VPを掛けることによりVP濃度/mLを測定した。
C57BL/6J系の雌性マウス及びBalb/c系の雌性マウスに、1×108個のChAdV68.5WTnt.MAG25マーのウイルス粒子(VP)を、100uL体積中で両側性の筋肉内注射(各脚50uL)により注射した。
各マウスの脾臓及びリンパ節を、3mLの完全RPMI(RPMI、10%FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン)中にプールした。gentleMACS組織解離装置(Miltenyi Biotec社)を製造者の指示にしたがって使用して、機械的解離を行った。解離した細胞を40ミクロンのフィルターに通して濾過し、赤血球をACK溶解バッファー(150mM NH4Cl,10mM KHCO3,0.1mM Na2EDTA)で溶解した。細胞を30ミクロンのフィルターに通して再び濾過した後、完全RPMI中に再懸濁した。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を使用してAttune NxTフローサイトメーター(Thermo Fisher社)でカウントした。次に、その後の分析用に細胞を適当な生細胞の濃度に調整した。
マウスIFNg ELISpotPLUSキット(MABTECH社)を使用し、ELISPOTハーモナイゼーションガイドライン{DOI: 10.1038/nprot.2015.068}にしたがってELISPOT分析を行った。5×104個の脾細胞を、96ウェルIFNg抗体コーティングプレート中で、10uMの示したペプチドと16時間インキュベートした。スポットをアルカリホスファターゼを用いて現像した。反応時間を10分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させた。スポットをAID vSpot Reader Spectrumを用いてカウントした。ELISPOT分析を行うため、飽和度が50%よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が10%よりも大きい試料は分析から除外した。次いでスポットのカウントを、式:スポットカウント+2×(スポットカウント×コンフルエンス(%)/[100%−コンフルエンス(%)])を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。ネガティブペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによってネガティブバックグラウンドを補正した。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、100の位までの概数に端数を切り上げた。
1つの例において、ChAdV68.4WTnt.GFP(図21)及びChAdV68.5WTnt.GFP(図22)のDNAを、HEK293A細胞にトランスフェクトし、ウイルス複製(ウイルスプラーク)をトランスフェクションの7〜10日後に観察した。ChAdV68ウイルスプラークを光学(図21A及び22A)及び蛍光顕微鏡法(図21B〜C、及び図22B〜C)を使用して可視化した。GFPは、増殖性ChAdV68ウイルス送達粒子の生成を示す。
1つの例において、ChAdV68.4WTnt.GFP、ChAdV68.5WTnt.GFP、及びChAdV68.5WTnt.MAG25マーウイルスをHEK293F細胞内で増殖させ、精製ウイルスストックをトランスフェクションの18日後に生成した(図23)。精製ChAdV68ウイルスストック中のウイルス粒子を定量し、同じプロトコールを使用して生成されたアデノウイルス5型(Ad5)及びChAdVY25(近縁のChAdV;Dicks,2012,PloS ONE7,e40385)ウイルスストックと比較した。ChAdV68ウイルス力価は、Ad5及びChAdVY25と同等であった(表7)。
マウス腫瘍抗原を発現するC68ベクターを、マウス免疫原性実験で評価して、C68ベクターがT細胞応答を誘発することを実証する。MHCクラスIエピトープSIINFEKLに対するT細胞応答C57BL/6J系雌性マウスで測定し、MHCクラスIエピトープAH1−A5(Slansky et al.,2000,Immunity13:529−538)に対するT細胞応答をBalb/c系マウスで測定した。図29に示されるように、ChAdV68.5WTnt.MAG25マーによるマウスの免疫後に強いT細胞応答が測定された。脾細胞106個当たり、8957個及び4019個のスポット形成細胞(SFC)の平均の細胞性免疫応答が、ELISpotアッセイにおいて、C57BL/6J系またはBalb/c系マウスをそれぞれChAdV68.5WTnt.MAG25マーで免疫した場合に免疫の10日後に観察された。
XVI.A.アルファウイルス送達ベクター評価の材料及び方法
RNAを生成するためのインビトロ転写
インビトロ試験を行うため、プラスミドDNAをPmeIによる制限消化によって直鎖状とし、カラムを製造者の指示にしたがって洗浄し(GeneJet DNA cleanup kit,Thermo社)、テンプレートとして使用した。RiboMAX Large Scale RNA production System(Promega社)をm7Gキャップアナログ(Promega)とともに製造者の指示にしがって使用してインビトロ転写を行った。RNeasy kit(Qiagen社)を製造者の指示にしがって使用してmRNAを精製した。
HEK293A細胞を、96ウェルのウェル当たり6e4細胞で、24ウェルのウェル当たり2e5細胞で、トランスフェクションの約16時間前に播種した。細胞にMessengerMAXリポフェクタミン(Invitrogen社)を製造者のプロトコールにしたがって使用してmRNAをトランスフェクションした。96ウェルでは、ウェル当たり0.15uLのリポフェクタミン及び10 ng のmRNAを使用し、24ウェルでは、ウェル当たり0.75uLのリポフェクタミン及び150ngのmRNAを使用した。GFPを発現するmRNA(TriLink Biotechnologies社)をトランスフェクションの対照として使用した。
ルシフェラーゼレポーターアッセイを、白い壁の96ウェルプレートで、ONE−Gloルシフェラーゼアッセイ(Promega社)を製造者のプロトコールにしたがって使用して各条件を三重にして行った。発光度をSpectraMaxを使用して測定した。
トランスフェクトした細胞をトランスフェクションの2時間後に新鮮な培地で洗い、新鮮な培地に交換してトランスフェクトしなかったmRNAをすべて除去した。次いで細胞を異なる時点でRLT plus lysis buffer(Qiagen社)中に収穫し、いずれも製造者のプロトコールにしたがってQiaShredder(Qiagen社)及びRNAを使用してホモジナイズし、RNeasy kit(Qiagen社)を使用して抽出した。Nanodrop(Thermo Scientific社)を使用して全RNAを定量した。製造者のプロトコールにしたがってqTower3 (Analytik Jena)でQuantitect Probe One−Step RT−PCR kit(Qiagen社)を使用し、反応当たり20ngの全RNAを使用してqRT−PCRを行った。各試料を各プローブについて三重に試験した。ActinまたはGusBを参照遺伝子として用いた。カスタムプライマー/プローブはIDT社により生成されたものである(表8)。
C57BL/6J系マウスの左下脇腹に105個のB16−OVA細胞/動物を注射した。腫瘍を免疫化の前、3日間にわたって増殖させた。
Balb/c系マウスの左下脇腹に106個/動物のCT26細胞を注射した。腫瘍を免疫化の前、7日間にわたって増殖させた。
srRNAワクチンについては、マウスに100uL体積中、10ugのRNAを、両側性に筋肉内注射(各脚50uL)により注射した。Ad5ワクチンについては、マウスに5×1010個のウイルス粒子(VP)を、100uL体積中で両側性に筋肉内注射(各脚50uL)により注射した。各動物に、抗CTLA−4(クローン9D9,BioXcell社)、抗PD−1(クローンRMP1−14,BioXcell社)、または抗IgG(クローンMPC−11,BioXcell社)を、用量250ugで、週2回、腹腔内注射により注射した。
各時点においてマウスに腹腔内注射により150mg/kgのルシフェリン基質を注射し、注射の10〜15分後にIVISインビボイメージングシステム(PerkinElmer社)を使用して生物発光を測定した。
各マウスの脾臓及びリンパ節を、3mLの完全RPMI(RPMI、10%FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン)中にプールした。gentleMACS組織解離装置(Miltenyi Biotec社)を製造者の指示にしたがって使用して、機械的解離を行った。解離した細胞を40ミクロンのフィルターに通して濾過し、赤血球をACK溶解バッファー(150mM NH4Cl,10mM KHCO3,0.1mM Na2EDTA)で溶解した。細胞を30ミクロンのフィルターに通して再び濾過した後、完全RPMI中に再懸濁した。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を使用してAttune NxTフローサイトメーター(Thermo Fisher社)でカウントした。次に、その後の分析用に細胞を適当な生細胞の濃度に調整した。
マウスIFNg ELISpotPLUSキット(MABTECH社)を使用し、ELISPOTハーモナイゼーションガイドライン{DOI: 10.1038/nprot.2015.068}にしたがってELISPOT分析を行った。5×104個の脾細胞を、96ウェルIFNg抗体コーティングプレート中で、10uMの示したペプチドと16時間インキュベートした。スポットをアルカリホスファターゼを用いて現像した。反応時間を10分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させた。スポットをAID vSpot Reader Spectrumを用いてカウントした。ELISPOT分析を行うため、飽和度が50%よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が10%よりも大きい試料は分析から除外した。次いでスポットのカウントを、式:スポットカウント+2×(スポットカウント×コンフルエンス(%)/[100%−コンフルエンス(%)])を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。ネガティブペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによってネガティブバックグラウンドを補正した。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、100の位までの概数に端数を切り上げた。
XVI.B.1.アルファウイルスベクターのインビトロ評価
本明細書の一実現形態では、新生抗原発現システム用のRNAアルファウイルス骨格を、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEE)(Venezuelan Equine Encephalitis(VEE)(Kinney,1986,Virology 152:400−413)ベースの自己複製RNA(srRNA)ベクターから生成した。1つの例では、26Sサブゲノムプロモーターの3’側に位置するVEEの構造タンパク質をコードする配列を欠失させ(VEE配列の7544〜11,175を欠失させた。番号付けはKinney et al 1986に基づく。SEQ ID NO:6)、抗原配列(SEQ ID NO:14及びSEQ ID NO:4)またはルシフェラーゼレポーター(例えばVEE−ルシフェラーゼ、SEQ ID NO:15)に置き換えた(図24)。RNAをインビトロでsrRNA DNAベクターから転写させ、HEK293A細胞にトランスフェクトしてルシフェラーゼレポーターの発現を測定した。さらに、ルシフェラーゼをコードする(非複製)mRNAを比較のためにトランスフェクトした。VEE−ルシフェラーゼのsrRNAでは、2時間の測定値を23時間の測定値と比較した場合にsrRNAレポーターシグナルの約30,000倍の増大が観察された(表9)。これに対して、同じ時間でのmRNAレポーターのシグナルの増大は10倍未満であった(表9)。
96ウェル中、ウェル当たり10ngのVEE−ルシフェラーゼsrRNAまたは10ngの非複製ルシフェラーゼmRNA(TriLink L−6307)をHEK293A細胞にトランスフェクトした。トランスフェクト後の異なる時点で発光を測定した。ルシフェラーゼ発現を相対発光単位(RLU)として報告する。各データポイントは、3つのトランスフェクトしたウェルの平均±SDである。
HEK293A細胞にVEE−ルシフェラーゼsrRNAをトランスフェクトし(24ウェルのウェル当たり150ng)、トランスフェクション後の異なる時間にqRT−PCRによりRNAレベルを定量した。各測定値はアクチン参照遺伝子に対して正規化し、2時間の時点に対する変化倍率を示す。
HEK293細胞にVEE−MAG25マーsrRNAをトランスフェクトし(24ウェルのウェル当たり150ng)、トランスフェクション後の異なる時間にqRT−PCRによりRNAレベルを定量した。各測定値はGusB参照遺伝子に対して正規化し、2時間の時点に対する変化倍率を示す。グラフ上の異なる線は、いずれもsrRNAのエピトープカセット領域を検出する2つの異なるqPCRプライマー/プローブのセットを表す。
別の例において、VEE−ルシフェラーゼレポーターの発現をインビボで評価した。マウスに、脂質ナノ粒子(MC3)に封入された10ugのVEE−ルシフェラーゼsrRNAを注射し、注射の24及び48時間後、ならびに7及び14日後に撮影して生物発光シグナルを測定した。ルシフェラーゼシグナルが注射の24時間後に検出され、時間とともに増大し、srRNA注射の7日後にピークとなった(図25)。
1つの実現形態において、VEE srRNAベクターがインビボで抗原特異的免疫応答を誘導するかを調べるため、2つの異なるMHCクラスIマウス腫瘍エピトープであるSIINFEKL及びAH1−A5(Slansky et al.,2000,Immunity 13:529−538)を発現するVEE srRNAベクターを作製した(VEE−UbAAY,SEQ ID NO:14)。SFL(SIINFEKL)エピトープは、B16−OVAメラノーマ細胞株によって発現され、AH1−A5(SPSYAYHQF;Slansky et al.,2000,Immunity)エピトープは、CT26結腸癌細胞株によって発現される関連エピトープを標的とするT細胞を誘導する(AH1/SPSYVYHQF;Huang et al.,1996,Proc Natl Acad Sci USA 93:9730−9735)。1つの例では、インビボ実験において、VEE−UbAAY srRNA が、T7ポリメラーゼ(TriLink Biotechnologies)を使用したインビトロ転写によって生成され、脂質ナノ粒子(MC3)に封入された。
*Vaxグループのマウス#6からの結果は、三重のウェル間のばらつきが大きいことから分析から除外した。
ChAdV68及び自己複製RNA(srRNA)を用いた異なる投与プロトコールを、マウスCT26腫瘍モデルで評価した。
腫瘍の注入
Balb/c系マウスにCT26細胞株を注射した。腫瘍細胞注射の7日後にマウスを異なる実験アーム(各グループ当たりマウス28〜40匹)をランダムカセット配列し、処置を開始した。Balb/c系マウスの左下脇腹に106個/動物のCT26細胞を注射した。腫瘍を免疫化の前、7日間にわたって増殖させた。各実験アームは表15に詳細に記載したとおりである。
srRNAワクチンについては、マウスに100uL体積中、10ugのVEE−MAG25マーsrRNAを、両側性に筋肉内注射(各脚50uL)により注射した。C68ワクチンについては、マウスに1×1011個のChAdV68.5WTnt.MAG25マーのウイルス粒子(VP)を、100uL体積中で両側性に筋肉内注射(各脚50uL)により注射した。各動物に、抗PD−1(クローンRMP1−14,BioXcell社)、または抗IgG(クローンMPC−11,BioXcell社)を、用量250ugで、週2回、腹腔内注射により注射した。
各マウスの脾臓及びリンパ節を、3mLの完全RPMI(RPMI、10%FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン)中にプールした。gentleMACS組織解離装置(Miltenyi Biotec社)を製造者の指示にしたがって使用して、機械的解離を行った。解離した細胞を40ミクロンのフィルターに通して濾過し、赤血球をACK溶解バッファー(150mM NH4Cl,10mM KHCO3,0.1mM Na2EDTA)で溶解した。細胞を30ミクロンのフィルターに通して再び濾過した後、完全RPMI中に再懸濁した。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を使用してAttune NxTフローサイトメーター(Thermo Fisher社)でカウントした。次に、その後の分析用に細胞を適当な生細胞の濃度に調整した。
マウスIFNg ELISpotPLUSキット(MABTECH社)を使用し、ELISPOTハーモナイゼーションガイドライン{DOI: 10.1038/nprot.2015.068}にしたがってELISPOT分析を行った。5×104個の脾細胞を、96ウェルIFNg抗体コーティングプレート中で、10uMの示したペプチドと16時間インキュベートした。スポットをアルカリホスファターゼを用いて現像した。反応時間を10分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させた。スポットをAID vSpot Reader Spectrumを用いてカウントした。ELISPOT分析を行うため、飽和度が50%よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が10%よりも大きい試料は分析から除外した。次いでスポットのカウントを、式:スポットカウント+2×(スポットカウント×コンフルエンス(%)/[100%−コンフルエンス(%)])を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。ネガティブペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによってネガティブバックグラウンドを補正した。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、100の位までの概数に端数を切り上げた。
ChAdV68.5WTnt.MAG25マー/VEE−MAG25マーsrRNAの異種プライム/ブースト、またはVEE−MAG25マーsrRNAの同種プライム/ブーストワクチンの免疫原性及び有効性をCT26マウス腫瘍モデルで評価した。Balb/c系マウスにCT26細胞株を注射した。腫瘍細胞注射の7日後にマウスを異なる実験アームをランダムカセット配列し、処置を開始した。各実験アームは表15に詳細に、また表16により一般的に記載したとおりである。
ChAdV68及び自己複製RNA(srRNA)を用いた異なる投与プロトコールを、非ヒト霊長類(NHP)で評価した。
免疫化
プライミングワクチンを各NHPで筋肉内に注射して実験を開始した(ワクチンプライム)。Mamu A01インドアカゲザルを、LNP−1またはLNP−2中で配合した1×1012個のウイルス粒子(注射1回当たり5×1011個のウイルス粒子)のChAdV68.5WTnt.MAG25マー、30ugのVEE−MAG25マーsrRNA、100ugのVEE−MAG25マーsrRNA、または300ugのVEE−MAG25マーsrRNAで両側性に免疫した。30ug、100ugまたは300ugのVEE−MAG25マー srRNAワクチンブーストをプライムワクチン接種の4週間後に筋肉内投与した。更なる実験アームにおいて、30ug、100ugまたは300ugのVEE−MAG25マーsrRNAワクチンを第2のブーストとして最初のプライムワクチン接種の8週間後に筋肉内投与する。抗CTLA−4を、ワクチン免疫部位の近くに皮下投与するか、または特定のグループに静脈内投与した。用量当たり両側注射を、表21及び23に示したグループにしたがって投与した。
PBMCを、プライムワクチン接種の7、14、28、または35日後にLymphocyte Separation Medium(LSM,MP Biomedicals社)及びLeucoSep分離チューブ(Greiner Bio−One社)を使用して単離し、10%FBS及びペニシリン/ストレプトマイシンを含んだRPMIに再懸濁した。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を使用してAttune NxTフローサイトメーター(Thermo Fisher社)でカウントした。次に、その後の分析用に細胞を適当な生細胞の濃度に調整した。実験に用いたそれぞれのサルについて、ELISpotまたはフローサイトメトリー法を用いてT細胞応答を測定した。ワクチンにコードされた6種類の異なるアカゲザルMamu−A*01クラスIエピトープに対するT細胞応答を、ELISpot(ex vivo enzyme−linked immunospot)(エクスビボ酵素結合免疫スポット)分析を用いてIFN−γなどのサイトカインの誘導を測定することにより、PBMCから観測した。サルIFNg ELISpotPLUSキット(MABTECH社)を使用し、ELISPOTハーモナイゼーションガイドライン{DOI: 10.1038/nprot.2015.068}にしたがってELISpot分析を行った。200,000個のPBMCを、96ウェルIFNg抗体コーティングプレート中で、10uMの示したペプチドと16時間インキュベートした。スポットをアルカリホスファターゼを用いて現像した。反応時間を10分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させた。スポットをAID vSpot Reader Spectrumを用いてカウントした。ELISPOT分析を行うため、飽和度が50%よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が10%よりも大きい試料は分析から除外した。次に、スポットのカウントを、式:スポットカウント+2×(スポットカウント×コンフルエンス(%)/[100%−コンフルエンス(%)])を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。ネガティブペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによってネガティブバックグラウンドを補正した。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、100の位までの概数に端数を切り上げた。
この実験は、(a)ChAdV68.5WTnt.MAG25マープライミング免疫化に続いて、VEE−MAG25マーsrRNAの用量100μgによる異種プライム/ブーストの組み合わせの免疫原性及び予備的安全性を評価し、(b)ChAdV68.5WTnt.MAG25マー/VEE−MAG25マーsrRNAのプライム/ブーストの組み合わせに対するT細胞応答の速度論を評価するように設計した。この実験アームは、免疫原性を実証するためにmamu A01インドアカゲザルで行った。この実験で使用される選択抗原は、アカゲザル、具体的にはmamu A*01 MHCクラスIハプロタイプを有するものにおいてのみ認識される。mamu A01インドアカゲザルを異なる実験アーム(各グループ6匹のアカゲザル)にランダム化し、複数のmamu A01制限エピトープを含むモデル抗原をコードしたChAdV68.5WTnt.MAG25マーまたはVEE−MAG25マーsrRNAベクターのいずれかを筋肉内注射により投与した。各実験アームは表21に記載したとおりである。
この実験は、ワクチン誘導免疫応答に対する抗CTLA4の投与経路の影響を評価する(例えば、全身(IV)投与に対してワクチン流入領域リンパ節に近接した位置における抗CTLA4の局所(SC)投与を比較する)ように設計されたものである。この実験アームを、免疫原性を実証するためにmamu A01インドアカゲザルで行った。アカゲザルなどの非ヒト霊長類におけるワクチン免疫原性は、ヒトにおけるワクチン効力の最良の予測因子である。さらに、この実験で使用される選択抗原は、アカゲザル、具体的にはmamu A*01 MHCクラスIハプロタイプを有するものにおいてのみ認識される。mamu A01インドアカゲザルを異なる実験アーム(各グループ6匹のアカゲザル)にランダム化し、複数のmamu A01制限抗原を含むモデル抗原をコードしたChAdV68.5WTnt.MAG25マーを筋肉内注射により投与した。抗CTLA−4を、ワクチン免疫部位の近くに皮下投与するか、または特定のグループに静脈内投与した。各実験アームは表23に記載したとおりである。
前記対象の前記腫瘍細胞からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも1つを取得する工程であって、前記腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータが、新生抗原のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられ、各新生抗原のペプチド配列が、前記ペプチド配列を対応する野生型の親ペプチド配列とは異なるものにする少なくとも1つの変化を含む、工程と、
各新生抗原のペプチド配列を1つ以上の提示モデルに入力して、前記新生抗原のそれぞれが前記対象の前記腫瘍細胞の前記腫瘍細胞表面上の1つ以上のMHCアレルによって提示される数値的可能性のセットを生成する工程であって、前記数値的可能性のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて特定されたものである、工程と、
前記新生抗原のセットのサブセットを、前記数値的可能性のセットに基づいて選択することで、選択された新生抗原のセットを生成する工程と
を含む方法を開示する。
MHCアレルのうちの特定の1つとペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸とのペアの存在と、
前記ペアの前記MHCアレルのうちの特定の1つによる、前記特定の位置に前記特定のアミノ酸を含むそのようなペプチド配列の腫瘍細胞表面上での提示の可能性と
の間の依存性を表す。
前記1つ以上の提示モデルを、対応する新生抗原のペプチド配列に適用することによって、前記1つ以上のMHCアレルのそれぞれについて、前記対応する新生抗原のペプチド配列のアミノ酸の少なくとも位置に基づいて、前記MHCアレルが前記対応する新生抗原を提示するかどうかを示す依存性スコアを生成すること
を含む。
前記依存性スコアを変換することによって、各MHCアレルについて、前記対応するMHCアレルが前記対応する新生抗原を提示する可能性を示す対応するアレル当たりの可能性を生成することと、
前記アレル当たりの可能性を組み合わせて前記数値的可能性を生成することと
をさらに含む。
前記依存性スコアの組み合わせを変換して前記数値的可能性を生成すること
を含む。
前記アレル非相互作用特性に基づいて、対応する新生抗原のペプチド配列が提示されるかどうかを示す、前記アレル非相互作用特性についての依存性スコアを生成するために、1つ以上の提示モデルのうちのアレル非相互作用モデルを前記アレル非相互作用特性に適用することを含む。
1つ以上のMHCアレルの各MHCアレルについての前記依存性スコアを、前記アレル非相互作用特性についての依存性スコアと組み合わせることと、
前記対応するMHCアレルが前記対応する新生抗原を提示する可能性を示す、前記MHCアレルについての対応するアレル当たりの可能性を生成するために、各MHCアレルについての前記組み合わされた依存性スコアを変換することと、
前記アレル当たりの可能性を組み合わせて前記数値的可能性を生成することと
をさらに含む。
前記MHCアレルの各々についての依存性スコアと、前記アレル非相互作用特性についての依存性スコアとの組み合わせを変換することにより、前記数値的可能性を生成すること
を含む。
前記試料中に存在する前記訓練ペプチドのセットのペプチド存在量;
前記試料中の前記訓練ペプチドのセットのペプチド長
に関連するデータをさらに含む。
a.MHCアレルと新生抗原コード化ペプチドとが結合する予測親和性;
b.新生抗原コード化ペプチド−MHC複合体の予測安定性;
c.新生抗原コード化ペプチドの配列及び長さ;
d.質量分析プロテオミクスまたは他の手段によって評価される、特定のMHCアレルを発現する他の個体由来の細胞の類似した配列を有する新生抗原コード化ペプチドの提示の確率;
e.対象とされる対象の特定のMHCアレルの発現レベル(例えば、RNA−seqまたは質量分析によって測定される);
f.特定のMHCアレルを発現する他の別個の個体における、特定のMHCアレルによる提示の、全体的な新生抗原コード化ペプチド配列とは独立した確率;
g.他の別個の対象における、同じ分子のファミリー(例えば、HLA−A、HLA−B、HLA−C、HLA−DQ、HLA−DR、HLA−DP)のMHCアレルによる提示の、全体的な新生抗原コード化ペプチド配列とは独立した確率。
a.その由来源タンパク質配列内の、新生抗原コード化ペプチドに隣接するC末端及びN末端配列;
b.任意で、腫瘍細胞内の対応するプロテアーゼの発現(RNA−seqまたは質量分析によって測定される)にしたがって重み付けされる、新生抗原コード化ペプチド内のプロテアーゼ切断モチーフの存在;
c.適切な細胞タイプにおいて測定される由来源タンパク質の代謝回転速度;
d.RNA−seqもしくはプロテオーム質量分析によって測定される、または、DNAもしくはRNA配列データにおいて検出される生殖細胞系列もしくは体細胞系列スプライシング変異のアノテーションから予測される、腫瘍細胞に最も高発現している特定のスプライスバリアント(「アイソフォーム」)を任意で考慮した、由来源タンパク質の長さ;
e.腫瘍細胞におけるプロテアソーム、イムノプロテアソーム、胸腺プロテアソーム、または他のプロテアーゼの発現のレベル(RNA−seq、プロテオーム質量分析、または免疫組織化学によって測定することができる);
f.新生抗原コード化ペプチドの由来源遺伝子の発現(例えば、RNA−seqまたは質量分析によって測定される);
g.細胞周期の異なる段階における新生抗原コード化ペプチドの由来源遺伝子の典型的な組織特異的発現;
h.例えば、uniProtまたはPDB http://www.rcsb.org/pdb/home/home.doにみることができるような、由来源タンパク質及び/またはそのドメインの特性の包括的なカタログ;
i.ペプチドを含む由来源タンパク質のドメインの性質を説明する特性、例えば、二次構造または三次構造(例えば、βシートに対するαヘリックス);選択的スプライシング;
j.他の別個の対象における、対象とされる新生抗原コード化ペプチドの由来源タンパク質に由来するペプチドの提示の確率;
k.ペプチドが、技術的バイアスのために質量分析によって検出されないか、または過剰に表現される確率;
l.腫瘍細胞、間質、または腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の状態について情報を与える、RNASeqによって測定される、種々の遺伝子モジュール/経路の発現(ペプチドの由来源タンパク質を含む必要はない);
m.腫瘍細胞内の新生抗原コード化ペプチドの由来源遺伝子のコピー数;
n.ペプチドがTAPに結合する確率、またはTAPに対するペプチドの測定または予測される結合親和性;
o.腫瘍細胞におけるTAPの発現レベル(RNA−seq、プロテオーム質量分析、免疫組織化学によって測定することができる);
p.以下を含むがただしこれらに限定されない、腫瘍変異の有無:
i.EGFR、KRAS、ALK、RET、ROS1、TP53、CDKN2A、CDKN2B、NTRK1、NTRK2、NTRK3などの公知のがんドライバー遺伝子におけるドライバー変異、
ii.抗原提示マシナリーに関与するタンパク質をコードする遺伝子(例えば、B2M、HLA−A、HLA−B、HLA−C、TAP−1、TAP−2、TAPBP、CALR、CNX、ERP57、HLA−DM、HLA−DMA、HLA−DMB、HLA−DO、HLA−DOA、HLA−DOBHLA−DP、HLA−DPA1、HLA−DPB1、HLA−DQ、HLA−DQA1、HLA−DQA2、HLA−DQB1、HLA−DQB2、HLA−DR、HLA−DRA、HLA−DRB1、HLA−DRB3、HLA−DRB4、HLA−DRB5、または、プロテアソームもしくはイムノプロテアソームの構成要素をコードする遺伝子のいずれか)における変異;その提示が、腫瘍において機能喪失変異を生ずる抗原提示マシナリーの構成要素に依存するペプチドは、提示の確率が低い;
q.以下を含むがただしこれらに限定されない、機能的生殖細胞系列多型の有無:
i.抗原提示マシナリーに関与するタンパク質をコードする遺伝子(例えば、B2M、HLA−A、HLA−B、HLA−C、TAP−1、TAP−2、TAPBP、CALR、CNX、ERP57、HLA−DM、HLA−DMA、HLA−DMB、HLA−DO、HLA−DOA、HLA−DOBHLA−DP、HLA−DPA1、HLA−DPB1、HLA−DQ、HLA−DQA1、HLA−DQA2、HLA−DQB1、HLA−DQB2、HLA−DR、HLA−DRA、HLA−DRB1、HLA−DRB3、HLA−DRB4、HLA−DRB5、または、プロテアソームもしくはイムノプロテアソームの構成要素をコードする遺伝子のいずれか)における多型;
r.腫瘍タイプ(例えば、NSCLC、メラノーマ);
s.臨床的腫瘍サブタイプ(例えば、扁平上皮肺癌対非扁平上皮);
t.喫煙歴;
u.任意で、ドライバー変異によって層別化される、関連する腫瘍タイプまたは臨床的サブタイプにおけるペプチドの由来源遺伝子の典型的な発現。
複数の試料に由来する主要組織適合性複合体(MHC)から溶出された複数の単離ペプチドに関連するデータを含む質量分析データを受け取る工程と、
前記試料中に存在する訓練ペプチド配列のセット及び各訓練ペプチド配列に関連する1つ以上のMHCを少なくとも特定することにより、訓練データセットを取得する工程と、
前記訓練ペプチド配列を含む訓練データセットを用いて、提示モデルの数値的パラメータのセットを訓練する工程であって、前記提示モデルが、前記腫瘍細胞表面上の1つ以上のMHCアレルによって前記腫瘍細胞由来のペプチド配列が提示される複数の数値的可能性を与える、工程と
を実行することを含む方法も開示される。
ペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸の存在と、
前記特定の位置に前記特定のアミノ酸を有する前記ペプチド配列の、前記腫瘍細胞上のMHCアレルのうちの1つによる提示の可能性と
の間の依存性を表す。
前記試料中に存在する前記訓練ペプチドのセットのペプチド存在量;
前記試料中の前記訓練ペプチドのセットのペプチド長
に関連するデータをさらに含む。
既知のタンパク質配列のセットを含むデータベースとのアラインメントにより訓練ペプチド配列のセットを比較することによって、前記訓練ペプチド配列に基づいて、前記訓練ペプチド配列よりも長くかつ前記訓練ペプチド配列を含む前記訓練タンパク質配列のセットを取得することを含む。
細胞株からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムのヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも1つを取得するために、細胞株に対して質量分析を行うかまたは質量分析がこれまでに行われていることを含んでもよく、前記ヌクレオチドシークエンシングデータは、変異を含む少なくとも1つのタンパク質配列を含む。
ワン・ホット(one−hot)エンコーディングスキームを用いて前記訓練ペプチド配列をコードすることを含む。
正常組織試料からエクソーム、トランスクリプトーム、及び全ゲノムの正常ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも1つを取得することと、
前記正常ヌクレオチドシークエンシングデータを用いて、前記提示モデルの前記パラメータのセットを訓練することと
を含む。
前記パラメータのセットのロジスティック回帰を行うことを含む。
レフトパディング(left−padded)ワン・ホットエンコーディングスキームを用いて前記訓練ペプチド配列をコードすることを含む。
ディープラーニングアルゴリズムを用いて前記パラメータのセットについて値を決定することを含む。
複数の新鮮なまたは凍結腫瘍試料に由来する主要組織適合性複合体(MHC)から溶出された複数の単離ペプチドに関連するデータを含む質量分析データを受け取る工程と、
前記腫瘍試料中に存在し、各訓練ペプチド配列に関連する1つ以上のMHCアレル上に提示される訓練ペプチド配列のセットを少なくとも特定することにより、訓練データセットを取得する工程と、
前記訓練ペプチド配列に基づいて、訓練タンパク質配列のセットを取得する工程と、
前記訓練タンパク質配列及び前記訓練ペプチド配列を用いて、提示モデルの数値的パラメータのセットを訓練する工程であって、前記提示モデルが、前記腫瘍細胞表面上の1つ以上のMHCアレルによって前記腫瘍細胞由来のペプチド配列が提示される複数の数値的可能性を与える、工程と
を含む方法が開示される。
MHCアレルのうちの特定の1つとペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸とのペアの存在と、
前記ペアの前記MHCアレルのうちの特定の1つによる、前記特定の位置に前記特定のアミノ酸を含むそのようなペプチド配列の腫瘍細胞表面上での提示の可能性と
の間の依存性を表す。
本願は、それぞれの全容を参照によって本明細書に援用するところの2016年11月23日出願の米国特許仮出願第62/425,996号、2016年12月16日出願の同第62/435,266号、2017年5月8日出願の同第62/503,196号、及び2017年6月21日出願の同第62/523,212号の利益を主張するものである。
本出願は、EFS−Web経由で提出され、その全容を参照によって本明細書に援用する配列表を含む。20XX年XX月に作成された前記ASCIIコピーは、XXXXXUS_sequencelisting.txtと名前が付けられており、そのサイズはX,XXX,XXXバイトである。
腫瘍特異的な新生抗原に基づいた治療用ワクチンは、次世代の個別化がん免疫療法として極めて有望である。1〜3非小細胞肺癌(NSCLC)及びメラノーマなどの高い遺伝子変異量を有するがんは、新生抗原を生じる可能性が比較的高いことから、かかる治療法の特に有望な標的である。4,5初期の証拠により、新生抗原に基づいたワクチン接種がT細胞応答を誘発し6、新生抗原を標的とした細胞療法が、選択された患者において腫瘍退縮を引き起こしうる7ことが示されている。
本明細書では、新生抗原カセットを含むチンパンジーアデノウイルスベクターを開示し、前記新生抗原カセットは、以下を含む:
(1)対象内に存在する腫瘍に由来する、複数の新生抗原コード核酸配列であって、
a.コードされたペプチド配列を、野生型核酸配列によってコードされる対応する核酸配列とは異なるものにする少なくとも1つの変化を有するMHCクラスIエピトープコード核酸配列と、
b.任意で5’リンカー配列と、
c.任意で3’リンカー配列と
をそれぞれが含む、少なくとも2個の腫瘍特異的及び対象特異的MHCクラスI新生抗原コード核酸配列
を含む、複数の新生抗原コード核酸配列と、
(2)前記複数の新生抗原コード核酸のうちの少なくとも1つの配列に機能的に連結された少なくとも1つのプロモーター配列と、
(3)任意で、少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列と、
(4)任意で、少なくとも1つのGPGPGリンカー配列(SEQ ID NO:56)と、
(5)任意で、少なくとも1つのポリアデニル化配列。
a.E1(nt577〜3403)欠失及びE3(nt27,125〜31,825)欠失を有するSEQ ID NO:1の配列を含む改変ChAdV68配列と、
b.CMVプロモーター配列と、
c.SV40ポリアデニル化シグナルヌクレオチド配列と、
d.新生抗原カセットであって、
(1)対象内に存在する腫瘍に由来する、複数の新生抗原コード核酸配列であって、複数の新生抗原コード核酸配列が、互いに直鎖状に連結された少なくとも20個の腫瘍特異的及び対象特異的なMHCクラスI新生抗原コード核酸配列を含み、各腫瘍特異的及び対象特異的なMHCクラスI新生抗原コード核酸配列が、
(A)コードされたペプチド配列を、野生型核酸配列によってコードされる対応するペプチド配列とは異なるものにする少なくとも1つの変化を有し、アミノ酸7〜15個の長さのMHCクラスIエピトープをコードする、MHCクラスIエピトープコード核酸配列と、
(B)前記MHC Iエピトープの天然の5’核酸配列であり、少なくともアミノ酸5個の長さであるペプチドをコードする、5’リンカー配列と、
(C)前記MHC Iエピトープの天然の3’核酸配列であり、少なくともアミノ酸5個の長さであるペプチドをコードする、3’リンカー配列と
を含み、
ここで、前記MHCクラスI新生抗原コード核酸配列のそれぞれが、アミノ酸25個の長さのポリペプチドをコードし、前記各MHCクラスI新生抗原コード核酸配列のそれぞれの3’末端が、前記複数の新生抗原コード核酸内の最後のMHCクラスI新生抗原コード核酸配列を除いて次のMHCクラスI新生抗原コード核酸配列の5’末端に連結されている、
複数の新生抗原コード核酸と、
(2)少なくとも2個のMHCクラスII抗原コード核酸配列であって、
(A)PADRE MHCクラスII配列(SEQ ID NO:48)と、
(B)破傷風トキソイドMHCクラスII配列(SEQ ID NO:46)と、
(C)前記PADRE MHCクラスII配列と前記破傷風トキソイドMHCクラスII配列とを連結する第1のGPGPGリンカー配列(SEQ ID NO:56)と、
(D)前記少なくとも2個のMHCクラスII抗原コード核酸配列の5’末端を、前記複数の新生抗原コード核酸配列に連結する第2のGPGPGリンカー配列(SEQ ID NO:56)と、
(E)少なくとも2個の前記MHCクラスII抗原コード核酸配列の3’末端をSV40ポリアデニル化シグナルヌクレオチド配列に連結する第3のGPGPGリンカー配列(SEQ ID NO:56)と
を含む、少なくとも2個のMHCクラスII抗原コード核酸配列と
を含む、新生抗原カセット;
ここで、前記新生抗原カセットが前記E1欠失内に挿入され、前記CMVプロモーター配列が前記新生抗原カセットに機能的に連結されている。
Pa−(L5b−Nc−L3d)X−(G5e−Uf)Y−G3g−Ah
を含む式に示される、ベクターの各要素の順序付けられた配列を、前記ベクターは有し、
式中、Pは、前記複数の配列のうちの少なくとも1つの配列に機能的に連結された少なくとも1つのプロモーター配列を含み、ここで、チンパンジーアデノウイルスベクターは任意で=1であり、Nは、コードされたペプチド配列を、野生型ヌクレオチド配列によってコードされる対応するペプチド配列とは異なるものにする少なくとも1つの変化を有するMHCクラスIエピトープコード核酸配列のうちの少なくとも1つを含み、ここで、c=1であり、L5は、5’リンカー配列を含み、ここで、b=0または1であり、L3は、3’リンカー配列を含み、ここで、d=0または1であり、G5は、少なくとも1つのGPGPGリンカー配列(SEQ ID NO:56)のうちの1つを含み、ここで、e=0または1であり、G3は、少なくとも1つのGPGPGリンカー配列(SEQ ID NO:56)のうちの1つを含み、ここで、g=0または1であり、Uは、MHCクラスII抗原をコードする少なくとも1つの核酸配列のうちの1つを含み、ここで、f=1であり、Aは、少なくとも1つのポリアデニル化配列を含み、ここで、h=0または1であり、X=2〜400であり、ここで、各Xについて、対応するNcは、C68の異なるMHCクラスIエピトープをコードする核酸配列であり、Y=0〜2であり、ここで、各Yについて、対応するUfは、MHCクラスII抗原をコードする核酸配列である。特定の態様において、b=1、d=1、e=1、g=1、h=1、X=20、Y=2であり、Pは、CMVプロモーター配列であり、各Nは、アミノ酸7〜15個の長さのMHCクラスIエピトープをコードし、L5は、前記MHC Iエピトープの天然の5’核酸配列であり、前記5’リンカー配列が、少なくともアミノ酸5個の長さであるペプチドをコードし、L3は、前記MHC Iエピトープの天然の3’核酸配列であり、前記3’リンカー配列が、少なくともアミノ酸5個の長さであるペプチドをコードし、Uは、PADREクラスII配列及び破傷風トキソイドMHCクラスII配列のそれぞれであり、前記チンパンジーアデノウイルスベクターは、E1(nt577〜3403)欠失及びE3(nt27,125〜31,825)欠失を有するSEQ ID NO:1の配列を含む改変ChAdV68配列を含み、前記新生抗原カセットが前記E1欠失内に挿入されており、前記MHCクラスI新生抗原コード核酸配列のそれぞれが、アミノ酸25個の長さのポリペプチドをコードしている。
[本発明1001]
新生抗原カセットを含むチンパンジーアデノウイルスベクターであって、前記新生抗原カセットが、
(1)対象内に存在する腫瘍に由来する、複数の新生抗原コード核酸配列であって、
a.コードされたペプチド配列を、野生型核酸配列によってコードされる対応するペプチド配列とは異なるものにする少なくとも1つの変化を有するMHCクラスIエピトープコード核酸配列と、
b.任意で5’リンカー配列と、
c.任意で3’リンカー配列と
をそれぞれが含む、少なくとも2個の腫瘍特異的及び対象特異的MHCクラスI新生抗原コード核酸配列
を含む、前記複数の新生抗原コード核酸配列と、
(2)前記複数の新生抗原コード核酸のうちの少なくとも1つの配列に機能的に連結された少なくとも1つのプロモーター配列と、
(3)任意で、少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列と、
(4)任意で、少なくとも1つのGPGPGリンカー配列(SEQ ID NO:56)と、
(5)任意で、少なくとも1つのポリアデニル化配列と
を含む、前記チンパンジーアデノウイルスベクター。
[本発明1002]
a.E1(nt577〜3403)欠失及びE3(nt27,125〜31,825)欠失を有するSEQ ID NO:1の配列を含む改変ChAdV68配列と、
b.CMVプロモーター配列と、
c.SV40ポリアデニル化シグナルヌクレオチド配列と、
d.新生抗原カセットであって、
(1)対象内に存在する腫瘍に由来する、複数の新生抗原コード核酸配列であって、前記複数の新生抗原コード核酸配列が、互いに直鎖状に連結された少なくとも20個の腫瘍特異的及び対象特異的MHCクラスI新生抗原コード核酸配列を含み、各腫瘍特異的及び対象特異的MHCクラスI新生抗原コード核酸配列が、
(A)コードされたペプチド配列を、野生型核酸配列によってコードされる対応するペプチド配列とは異なるものにする少なくとも1つの変化を有し、アミノ酸7〜15個の長さのMHCクラスIエピトープをコードする、MHCクラスIエピトープコード核酸配列と、
(B)前記MHC Iエピトープの天然の5’核酸配列であり、少なくともアミノ酸5個の長さであるペプチドをコードする、5’リンカー配列と、
(C)前記MHC Iエピトープの天然の3’核酸配列であり、少なくともアミノ酸5個の長さであるペプチドをコードする、3’リンカー配列と
を含み、
ここで、前記MHCクラスI新生抗原コード核酸配列のそれぞれが、アミノ酸25個の長さのポリペプチドをコードし、前記各MHCクラスI新生抗原コード核酸配列のそれぞれの3’末端が、前記複数の新生抗原コード核酸内の最後のMHCクラスI新生抗原コード核酸配列を除いて次のMHCクラスI新生抗原コード核酸配列の5’末端に連結されている、
前記複数の新生抗原コード核酸と、
(2)少なくとも2個のMHCクラスII抗原コード核酸配列であって、
(A)PADRE MHCクラスII配列(SEQ ID NO:48)と、
(B)破傷風トキソイドMHCクラスII配列(SEQ ID NO:46)と、
(C)前記PADRE MHCクラスII配列と前記破傷風トキソイドMHCクラスII配列とを連結する第1のGPGPGリンカー配列と、
(D)前記少なくとも2個のMHCクラスII抗原コード核酸配列の5’末端を、前記複数の新生抗原コード核酸配列に連結する第2のGPGPGリンカー配列と、
(E)前記少なくとも2個のMHCクラスII抗原コード核酸配列の3’末端をSV40ポリアデニル化シグナルヌクレオチド配列に連結する第3のGPGPGリンカー配列と
を含む、前記少なくとも2個のMHCクラスII抗原コード核酸配列と
を含む、前記新生抗原カセットと
を含むチンパンジーアデノウイルスベクターであって、
前記新生抗原カセットが前記E1欠失内に挿入され、前記CMVプロモーター配列が前記新生抗原カセットに機能的に連結されている、
前記チンパンジーアデノウイルスベクター。
[本発明1003]
前記ベクターの各要素の順序付けられた配列が、5’から3’に向かって、
P a −(L5 b −N c −L3 d ) X −(G5 e −U f ) Y −G3 g −A h
を含む式で示され、
式中、Pは、前記複数の新生抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つの配列に機能的に連結された少なくとも1つのプロモーター配列を含み、ここでa=1であり、
Nは、コードされたペプチド配列を、野生型核酸配列によってコードされる対応するペプチド配列とは異なるものにする少なくとも1つの変化を有するMHCクラスIエピトープコード核酸配列のうちの1つを含み、ここでc=1であり、
L5は、前記5’リンカー配列を含み、ここでb=0または1であり、
L3は、前記3’リンカー配列を含み、ここでd=0または1であり、
G5は、前記少なくとも1つのGPGPGリンカー配列のうちの1つを含み、ここでe=0または1であり、
G3は、前記少なくとも1つのGPGPGリンカー配列のうちの1つを含み、ここでg=0または1であり、
Uは、前記少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列のうちの1つを含み、ここでf=1であり、
Aは、前記少なくとも1つのポリアデニル化配列を含み、ここでh=0または1であり、
X=2〜400であり、ただし各Xについて、対応するN c は、異なるMHCクラスIエピトープコード核酸配列であり、
Y=0〜2であり、ここで各Yについて、対応するU f は、MHCクラスII抗原コード核酸配列である、
本発明1001のベクター。
[本発明1004]
b=1、d=1、e=1、g=1、h=1、X=20、Y=2であり、
Pは、CMVプロモーター配列であり、
各Nは、アミノ酸7〜15個の長さのMHCクラスIエピトープをコードし、
L5は、前記MHC Iエピトープの天然の5’核酸配列であり、前記5’リンカー配列が、少なくともアミノ酸5個の長さであるペプチドをコードし、
L3は、前記MHC Iエピトープの天然の3’核酸配列であり、前記3’リンカー配列が、少なくともアミノ酸5個の長さであるペプチドをコードし、
Uは、PADREクラスII配列及び破傷風トキソイドMHCクラスII配列のそれぞれであり、
前記チンパンジーアデノウイルスベクターは、E1(nt577〜3403)欠失及びE3(nt27,125〜31,825)欠失を有するSEQ ID NO:1の配列を含む改変ChAdV68配列を含み、前記新生抗原カセットが前記E1欠失内に挿入されており、
前記MHCクラスI新生抗原コード核酸配列のそれぞれが、アミノ酸25個の長さのポリペプチドをコードしている、
本発明1003のベクター。
[本発明1005]
前記複数の新生抗原コード核酸配列における新生抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つが、前記腫瘍細胞表面上のMHCクラスIによって提示されるポリペプチド配列またはその一部をコードしている、本発明1001のベクター。
[本発明1006]
前記複数の新生抗原コード核酸配列内の各抗原コード核酸配列が互いに直接連結されている、本発明1002または1004を除く先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1007]
前記複数の新生抗原コード核酸配列内の少なくとも1つの抗原コード核酸配列が、リンカーによって前記複数の新生抗原コード核酸配列内の異なる抗原コード核酸配列に連結されている、本発明1002または1004を除く先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1008]
前記リンカーが、2個のMHCクラスI配列または1個のMHCクラスI配列を1個のに連結する、本発明1007のベクター。
[本発明1009]
前記リンカーが、
(1)少なくとも残基2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の長さの連続したグリシン残基、
(2)少なくとも残基2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の長さの連続したアラニン残基、
(3)2個のアルギニン残基(RR)、
(4)アラニン、アラニン、チロシン(AAY)、
(5)哺乳動物プロテアソームによって効率的にプロセシングされる、少なくともアミノ酸残基2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の長さのコンセンサス配列、及び
(6)元のタンパク質と同種のタンパク質に由来する抗原に隣接し、少なくともアミノ酸残基2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、または2〜20個の長さの1つ以上の天然配列
からなる群から選択される、本発明1008のベクター。
[本発明1010]
前記リンカーが、2個のMHCクラスII配列または1個のMHCクラスII配列をMHCクラスI配列に連結する、本発明1007のベクター。
[本発明1011]
前記リンカーが、配列GPGPGを含む、本発明1010のベクター。
[本発明1012]
前記複数の新生抗原コード核酸配列の発現、安定性、細胞トラフィッキング、プロセッシング及び提示、ならびに/または免疫原性を高める、分離したまたは連続した配列に、前記複数の新生抗原コード核酸配列内の少なくとも1つの配列が機能的または直接的に連結されている、本発明1002または1004を除く先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1013]
前記分離したまたは連続した配列が、ユビキチン配列、プロテアソームターゲティング性を高めるように改変されたユビキチン配列(例えば、76位にGlyからAlaへの置換を含むユビキチン配列)、免疫グロブリンシグナル配列(例えばIgK)、主要組織適合性クラスI配列、リソソーム膜タンパク質(LAMP)−1、ヒト樹状細胞リソソーム膜タンパク質、及び主要組織適合性クラスII配列のうちの少なくとも1つを含み、任意で、プロテアソームターゲティング性を高めるように改変された前記ユビキチン配列がA76である、本発明1012のベクター。
[本発明1014]
前記複数の新生抗原コード核酸配列内の前記新生抗原コード核酸配列の少なくとも1つが、翻訳後の対応する野生型核酸配列と比べて、その対応するMHCアレルに対する増大した結合親和性を有するポリペプチド配列またはその一部をコードする、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1015]
前記複数の新生抗原コード核酸配列内の前記新生抗原コード核酸配列の少なくとも1つが、翻訳後の対応する野生型核酸配列と比べて、その対応するMHCアレルに対する増大した結合安定性を有するポリペプチド配列またはその一部をコードする、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1016]
前記複数の新生抗原コード核酸配列内の前記新生抗原コード核酸配列の少なくとも1つが、翻訳後の対応する野生型核酸配列と比べて、その対応するMHCアレル上への増大した提示の可能性を有するポリペプチド配列またはその一部をコードする、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1017]
前記少なくとも1つの変化が、点変異、フレームシフト変異、非フレームシフト変異、欠失変異、挿入変異、スプライスバリアント、ゲノム再編成、またはプロテアソームにより生成されたスプライシングされた抗原を含む、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1018]
前記腫瘍が、肺癌、メラノーマ、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、胃癌、結腸癌、精巣癌、頭頸部癌、膵臓癌、脳癌、B細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、T細胞リンパ球性白血病、非小細胞肺癌、及び小細胞肺癌からなる群から選択される、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1019]
前記複数の新生抗原コード核酸配列内の各配列の発現が、前記少なくとも1つのプロモーターによって誘導される、本発明1002または1004を除く先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1020]
前記複数の新生抗原コード核酸配列が、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の核酸配列を含む、本発明1002または1004を除く先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1021]
前記複数の新生抗原コード核酸配列が、少なくとも11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、または最大400個の核酸配列を含む、本発明1002または1004を除く先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1022]
前記複数の新生抗原コード核酸配列が少なくとも2〜400個の核酸配列を含み、前記複数の新生抗原コード核酸配列内の前記新生抗原コード核酸配列のうちの少なくとも2個が、前記腫瘍細胞表面上のMHCクラスIによって提示されるポリペプチド配列またはその一部をコードする、本発明1002または1004を除く先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1023]
前記複数の新生抗原コード核酸配列が少なくとも2〜400個の核酸配列を含み、前記対象に投与されて翻訳された場合、前記新生抗原のうちの少なくとも1つが抗原提示細胞上に提示されて、前記腫瘍細胞表面上の前記新生抗原のうちの少なくとも1つを標的とする免疫応答をもたらす、本発明1002または1004を除く先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1024]
前記複数の新生抗原コード核酸配列が少なくとも2〜400個のMHCクラスI及び/またはMHCクラスII新生抗原コード核酸配列を含み、前記対象に投与されて翻訳された場合、前記MHCクラスIまたはMHCクラスII新生抗原のうちの少なくとも1つが、抗原提示細胞上に提示されて、前記腫瘍細胞表面上の前記新生抗原のうちの少なくとも1つを標的とする免疫応答をもたらし、任意で、前記少なくとも2〜400個のMHCクラスIまたはMHCクラスII新生抗原コード核酸配列のそれぞれの発現が、前記少なくとも1つのプロモーターによって誘導される、本発明1002または1004を除く先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1025]
各MHCクラスI新生抗原コード核酸配列が、アミノ酸8〜35個の長さ、任意で、アミノ酸9〜17個、9〜25個、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34または35個の長さのポリペプチド配列をコードする、本発明1002または1004を除く先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1026]
前記少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列が存在している、本発明1002または1004を除く先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1027]
前記少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列が存在し、かつ、前記コードされたペプチド配列を野生型核酸配列によってコードされる対応するペプチド配列とは異なるものにする少なくとも1つの変化を含む少なくとも1つのMHCクラスII新生抗原コード核酸配列を含む、本発明1002または1004を除く先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1028]
前記少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列が、アミノ酸12〜20個、12、13、14、15、16、17、18、19、20,または20〜40個の長さである、本発明1002または1004を除く先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1029]
前記少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列が存在し、かつ、少なくとも1つのユニバーサルMHCクラスII抗原コード核酸配列を含み、任意で、前記少なくとも1つのユニバーサル配列が、破傷風トキソイド及びPADREのうちの少なくとも一方を含む、本発明1002または1004を除く先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1030]
前記少なくとも1つのプロモーター配列が、誘導性である、本発明1002または1004を除く先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1031]
前記少なくとも1つのプロモーター配列が、非誘導性である、本発明1002または1004を除く先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1032]
前記少なくとも1つのプロモーター配列が、CMV、SV40、EF−1、RSV、PGK、またはEBVプロモーター配列である、本発明1002または1004を除く先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1033]
前記新生抗原カセットが、前記複数の新生抗原コード核酸配列内の配列のうちの少なくとも1つに機能的に連結された少なくとも1つのポリアデニル化(ポリA)配列をさらに含み、任意で、前記ポリA配列が、前記複数の新生抗原コード核酸配列内の前記少なくとも1つの配列の3’側に位置する、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1034]
前記ポリA配列が、SV40のポリA配列を含む、本発明1033のベクター。
[本発明1035]
前記新生抗原カセットが、イントロン配列、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子(WPRE)配列、内部リボソーム進入配列(IRES)配列、または、前記複数の新生抗原コード核酸配列内の配列のうちの少なくとも1つに機能的に連結されたmRNAの核外輸送、安定性、または翻訳効率を向上させることが知られている5’または3’末端の非コード領域内の配列のうちの少なくとも1つをさらに含む、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1036]
前記新生抗原カセットが、緑色蛍光タンパク質(GFP)、GFPバリアント、分泌型アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、またはルシフェラーゼバリアントを含むがこれらに限定されないレポーター遺伝子をさらに含む、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1037]
少なくとも1つの免疫調節物質をコードする1つ以上の核酸配列をさらに含む、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1038]
前記免疫調節物質が、抗CTLA4抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗PD−1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗PD−L1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗4−1BB抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗OX−40抗体もしくはその抗原結合フラグメントである、本発明1037のベクター。
[本発明1039]
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、一本鎖Fv(scFv)、単一特異性抗体もしくは互いに連結された多重特異性抗体としての単一ドメイン抗体(sdAb)(例えば、ラクダ科動物の抗体ドメイン)、または完全長の一本鎖抗体(例えば、フレキシブルリンカーによって連結された重鎖と軽鎖を有する完全長IgG)である、本発明1038のベクター。
[本発明1040]
前記抗体の重鎖配列と軽鎖配列とが、2AまたはIRESのような自己切断配列によって分離された連続的配列であるか、または前記抗体の重鎖配列と軽鎖配列とが連続したグリシン残基のようなフレキシブルリンカーによって連結されている、本発明1038のベクター。
[本発明1041]
前記免疫調節物質がサイトカインである、本発明1037のベクター。
[本発明1042]
前記サイトカインが、IL−2、IL−7、IL−12、IL−15、もしくはIL−21、またはそれぞれのそのバリアントのうちの少なくとも1つである、本発明1041のベクター。
[本発明1043]
チンパンジーアデノウイルスChAdV68ベクターである、本発明1002または1004を除く先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1044]
SEQ ID NO:1に記載の配列を含む、本発明1002または1004を除く先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1045]
SEQ ID NO:1に記載の配列のチンパンジーアデノウイルスE1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4、及びL5遺伝子からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子において配列が完全に欠失されているかまたは機能的に欠失されている点を除いて、前記ベクターがSEQ ID NO:1に記載の配列を含み、任意で、SEQ ID NO:1に記載の配列の(1)E1A及びE1B、(2)E1A、E1B、及びE3、または(3)E1A、E1B、E3、及びE4において配列が完全に欠失されているかまたは機能的に欠失されている、本発明1002または1004を除く先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1046]
前記ベクターが、SEQ ID NO:1の配列から得られる遺伝子または調節配列を含み、任意で、前記遺伝子が、SEQ ID NO:1に記載の配列のチンパンジーアデノウイルスの末端逆位繰り返し配列(ITR)、E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4、及びL5遺伝子からなる群から選択される、本発明1002または1004を除く先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1047]
前記新生抗原カセットが、E1領域、E3領域、及び/または、前記新生抗原カセットの組み込みが可能な任意の欠失されたAdV領域においてベクターに挿入されている、本発明1002または1004を除く先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1048]
第1世代、第2世代、またはヘルパー依存型のアデノウイルスベクターのうちの1つから作製される、本発明1002または1004を除く先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1049]
SEQ ID NO:1に記載の配列の塩基対番号577と3403との間、または塩基対456と3014との間に1つ以上の欠失を含み、任意で、塩基対27,125と31,825との間、または塩基対27,816と31,333との間に1つ以上の欠失をさらに含む、本発明1002または1004を除く先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1050]
SEQ ID NO:1に記載の配列の塩基対番号3957と10346との間、塩基対番号21787と23370との間、及び塩基対番号33486と36193との間に1つ以上の欠失をさらに含む、本発明1002または1004を除く先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1051]
前記少なくとも2個のMHCクラスI新生抗原コード核酸配列が、
前記腫瘍からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも1つを取得する工程であって、前記腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータが、新生抗原のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられる、前記工程と、
各新生抗原の前記ペプチド配列を提示モデルに入力して、前記新生抗原のそれぞれが前記腫瘍の腫瘍細胞表面上のMHCアレルのうちの1つ以上によって提示される数値的可能性のセットを生成する工程であって、前記数値的可能性のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて特定されたものである、前記工程と、
前記数値的可能性のセットに基づいて前記新生抗原のセットのサブセットを選択して、前記少なくとも2個のMHCクラスI新生抗原コード核酸配列を生成するために用いられる選択された新生抗原のセットを生成する工程と
を行うことによって選択される、本発明1002または1004を除く先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1052]
前記MHCクラスIエピトープコード核酸配列のそれぞれが、
前記腫瘍からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも1つを取得する工程であって、前記腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータが、新生抗原のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられる、前記工程と、
各新生抗原の前記ペプチド配列を提示モデルに入力して、前記新生抗原のそれぞれが前記腫瘍の腫瘍細胞表面上のMHCアレルのうちの1つ以上によって提示される数値的可能性のセットを生成する工程であって、前記数値的可能性のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて特定されたものである、前記工程と、
前記数値的可能性のセットに基づいて前記新生抗原のセットのサブセットを選択して、前記少なくとも2個のMHCクラスI新生抗原コード核酸配列を生成するために用いられる選択された新生抗原のセットを生成する工程と
を行うことによって選択される、本発明1002のベクター。
[本発明1053]
前記選択された新生抗原のセットの数が、2〜20である、本発明1051のベクター。
[本発明1054]
前記提示モデルが、
前記MHCアレルのうちの特定の1つとペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸とのペアの存在と、
前記ペアの前記MHCアレルのうちの前記特定の1つによる、前記特定の位置に前記特定のアミノ酸を含むそのようなペプチド配列の前記腫瘍細胞表面上での提示の可能性と
の間の依存性を表す、本発明1051または1052のベクター。
[本発明1055]
前記選択された新生抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されていない新生抗原と比べて前記腫瘍細胞表面上に提示される可能性が増大している新生抗原を選択することを含む、本発明1051または1052のベクター。
[本発明1056]
前記選択された新生抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されていない新生抗原と比べて前記対象において腫瘍特異的な免疫応答を誘導し得る可能性が増大している新生抗原を選択することを含む、本発明1051または1052のベクター。
[本発明1057]
前記選択された新生抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されていない新生抗原と比べて、プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)によってナイーブT細胞に対して提示され得る可能性が増大している新生抗原を選択することを含み、任意で、前記APCが樹状細胞(DC)である、本発明1051または1052のベクター。
[本発明1058]
前記選択された新生抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されていない新生抗原と比べて中枢性寛容または末梢性寛容によって阻害される可能性が減少している新生抗原を選択することを含む、本発明1051または1052のベクター。
[本発明1059]
前記選択された新生抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されていない新生抗原と比べて前記対象において正常組織に対する自己免疫応答を誘導し得る可能性が減少している新生抗原を選択することを含む、本発明1051または1052のベクター。
[本発明1060]
エクソームまたはトランスクリプトームのヌクレオチドシークエンシングデータが、腫瘍組織に対してシークエンシングを行うことによって取得される、本発明1051または1052のベクター。
[本発明1061]
前記シークエンシングが、次世代シークエンシング(NGS)または任意の大規模並列処理シークエンシング手法である、本発明1051または1052のベクター。
[本発明1062]
前記新生抗原カセットが、前記新生抗原カセット内の隣接配列によって形成されたジャンクショナルエピトープ配列を含む、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1063]
少なくとも1つの、または各ジャンクショナルエピトープ配列が、MHCに対して500nMよりも高い親和性を有する、本発明のベクター。
[本発明1064]
各ジャンクショナルエピトープ配列が、非自己である、本発明のベクター。
[本発明1065]
前記新生抗原カセットが、翻訳後の野生型核酸配列を含む非治療的MHCクラスIまたはクラスIIエピトープ核酸配列をコードしておらず、前記非治療的エピトープが前記対象のMHCアレル上に提示されると予測される、先行本発明のいずれかのベクター。
[本発明1066]
前記非治療的な予測されたMHCクラスIまたはクラスIIエピトープ配列が、前記新生抗原カセット内の隣接配列によって形成されたジャンクショナルエピトープ配列である、本発明1065のベクター。
[本発明1067]
前記予測が、前記非治療的エピトープの配列を提示モデルに入力することによって生成される提示可能性に基づいたものである、本発明1062または1066のベクター。
[本発明1068]
前記新生抗原カセット内の前記複数の抗原コード核酸配列の順序が、
1.前記複数の抗原コード核酸配列の異なる順序に対応した候補新生抗原カセット配列のセットを生成する工程と、
2.各候補新生抗原カセット配列について、前記候補新生抗原カセット配列内の非治療的エピトープの提示に基づいた提示スコアを決定する工程と、
3.所定の閾値を下回る提示スコアに関連する候補カセット配列を、新生抗原ワクチン用の新生抗原カセット配列として選択する工程と
を含む一連の工程によって決定される、本発明1062〜1067のいずれかのベクター。
[本発明1069]
先行本発明のいずれかのベクターと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
[本発明1070]
アジュバントをさらに含む、本発明1069の医薬組成物。
[本発明1071]
免疫調節物質をさらに含む、本発明1069または1070の医薬組成物。
[本発明1072]
前記免疫調節物質が、抗CTLA4抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗PD−1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗PD−L1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗4−1BB抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗OX−40抗体もしくはその抗原結合フラグメントである、本発明1071の医薬組成物。
[本発明1073]
先行するベクターの本発明のいずれかの新生抗原カセットと、
SEQ ID NO:1の配列から得られる遺伝子と
を含む、単離ヌクレオチド配列であって、
任意で、前記遺伝子が、SEQ ID NO:1に記載の配列のチンパンジーアデノウイルスのITR、E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4、及びL5遺伝子からなる群から選択され、
任意で、前記ヌクレオチド配列がcDNAである、
前記単離ヌクレオチド配列。
[本発明1074]
本発明1073のヌクレオチド配列を含む単離細胞であって、任意で、前記細胞が、CHO、HEK293もしくはそのバリアント、911、HeLa、A549、LP−293、PER.C6、またはAE1−2a細胞である、前記単離細胞。
[本発明1075]
本発明1073のヌクレオチド配列を含むベクター。
[本発明1076]
先行するベクターの本発明のいずれかのベクターと、
使用説明書と
を含むキット。
[本発明1077]
がんを有する対象を治療するための方法であって、前記対象に、先行するベクターの本発明のいずれかのベクター、または本発明1069〜1070のいずれかの医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
[本発明1078]
前記ベクターまたは組成物が、筋肉内(IM)、皮内(ID)、または皮下(SC)に投与される、本発明1077の方法。
[本発明1079]
前記対象に免疫調節物質を投与することをさらに含み、任意で、前記免疫調節物質が前記ベクターまたは医薬組成物の投与前、投与と同時、または投与後に投与される、本発明1077または1078の方法。
[本発明1080]
前記免疫調節物質が、抗CTLA4抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗PD−1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗PD−L1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗4−1BB抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗OX−40抗体もしくはその抗原結合フラグメントである、本発明1079の方法。
[本発明1081]
前記免疫調節物質が、静脈内(IV)、筋肉内(IM)、皮内(ID)、または皮下(SC)に投与される、本発明1079の方法。
[本発明1082]
前記皮下投与が、前記ベクターもしくは組成物の投与部位の近くに、または1つ以上のベクターもしくは組成物の流入領域リンパ節に近接して行われる、本発明1081の方法。
[本発明1083]
前記対象に第2のワクチン組成物を投与することをさらに含む、本発明1077〜1082のいずれかの方法。
[本発明1084]
前記第2のワクチン組成物が、本発明1077〜1082のいずれかのベクターまたは医薬組成物の投与の前に投与される、本発明1083の方法。
[本発明1085]
前記第2のワクチン組成物が、本発明1077〜1082のいずれかのベクターまたは医薬組成物の投与の後に投与される、本発明1083の方法。
[本発明1086]
前記第2のワクチン組成物が、本発明1077〜1082のいずれかのベクターまたは医薬組成物と同じである、本発明1084または1085の方法。
[本発明1087]
前記第2のワクチン組成物が、本発明1077〜1082のいずれかのベクターまたは医薬組成物と異なる、本発明1084または1085の方法。
[本発明1088]
前記第2のワクチン組成物が、複数の新生抗原コード核酸配列をコードする自己複製RNA(srRNA)ベクターを含む、本発明1087の方法。
[本発明1089]
前記srRNAベクターによってコードされる前記複数の新生抗原コード核酸配列が、先行するベクターの本発明のいずれかの複数の新生抗原コード核酸配列と同じである、本発明1088の方法。
[本発明1090]
先行するベクターの本発明のいずれかのベクターの製造方法であって、
前記少なくとも1つのプロモーター配列と前記新生抗原カセットとを含むプラスミド配列を得ることと、
前記プラスミド配列を1つ以上の宿主細胞にトランスフェクトすることと、
前記1つ以上の宿主細胞から前記ベクターを単離することと
を含む、前記方法。
[本発明1091]
前記単離することが、
前記宿主細胞を溶解して前記ベクターを含む細胞ライセートを得ることと、
前記細胞ライセートから、及び任意で、前記宿主細胞を培養するために用いた培地からも、前記ベクターを精製することと
を含む、本発明1090の製造方法。
[本発明1092]
前記プラスミド配列が、
DNA組換えまたは細菌組換えまたは全ゲノムDNA合成または細菌細胞内での合成されたDNAの増幅を用いた全ゲノムDNA合成
のうちの1つを用いて生成される、本発明1090の製造方法。
[本発明1093]
前記1つ以上の宿主細胞が、CHO、HEK293もしくはそのバリアント、911、HeLa、A549、LP−293、PER.C6、及びAE1−2a細胞のうちの少なくとも1つである、本発明1066の製造方法。
[本発明1094]
前記細胞ライセートから前記ベクターを精製することが、クロマトグラフィー分離、遠心分離、ウイルス沈殿、及び濾過のうちの1つ以上を含む、本発明1091の製造方法。
I.定義
一般に、特許請求の範囲及び明細書において使用される用語は、当業者により理解される通常の意味を有するものとして解釈されるものとする。特定の用語を、さらなる明確性を与えるために下記に定義する。通常の意味と与えられる定義との間に矛盾が存在する場合、与えられる定義が用いられるものとする。
本明細書では、細胞表面上に提示される可能性が高い、及び/または免疫原性を有する可能性が高い、対象の腫瘍由来の新生抗原を特定するための方法を開示する。例として、かかる1つの方法は、対象の腫瘍細胞から、エクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも1つを得る工程であって、前記腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータを用いて新生抗原のセットの各々のペプチド配列を表すデータが取得され、各新生抗原のペプチド配列が、ペプチド配列を対応する野生型の親ペプチド配列とは異なるものにする少なくとも1つの変化を含む、工程と、各新生抗原のペプチド配列を、1つ以上の提示モデルに入力して、対象の腫瘍細胞の腫瘍細胞表面上の1つ以上のMHCアレルによって、または腫瘍内に存在する細胞によって新生抗原の各々が提示される数値的可能性のセットを生成する工程であって、前記数値的可能性のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて特定されている、工程と、前記数値的可能性のセットに基づいて前記新生抗原のセットのサブセットを選択して、選択された新生抗原のセットを生成する工程と、を含む方法を開示する。
また、ある特定の変異(例えば、がん細胞中に存在するバリアントまたはアレル)の特定のための方法も、本明細書に開示する。特に、これらの変異は、がんを有する対象のがん細胞のゲノム、トランスクリプトーム、プロテオーム、またはエクソーム中に存在し得るが、対象由来の正常組織には存在し得ない。
新生抗原は、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含むことができる。例えば、新生抗原は、ポリペプチド配列をコードするRNA配列であることができる。ワクチンにおいて有用な新生抗原は、したがって、ヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を含むことができる。
また、特異的な免疫応答、例えば、腫瘍特異的な免疫応答を生じることができる免疫原性組成物、例えば、ワクチン組成物も、本明細書に開示する。ワクチン組成物は、典型的に、例えば、本明細書に記載した方法を用いて選択された多数の新生抗原を含む。ワクチン組成物はまた、ワクチンと呼ぶこともできる。
1つ以上の新生抗原の選択に用いられる方法、「カセット」のクローニング及び構築、ならびにウイルスベクターへのその挿入は本明細書に与えられる教示を考慮すれば当該技術分野の範囲内である。「新生抗原カセット」とは、選択された新生抗原または複数の新生抗原と、ネオアンチゲン(複数可)を転写し、転写産物を発現するために必要とされる他の調節エレメントとの組み合わせを意味する。新生抗原または複数の新生抗原は、転写を可能とするような形で調節要素と機能的に連結することができる。かかる要素としては、ウイルスベクターをトランスフェクトした細胞内で新生抗原(複数可)の発現を推進することができる従来の調節エレメントが挙げられる。したがって、新生抗原カセットは、新生抗原(複数可)に連結され、組換えベクターの選択されたウイルス配列内に他の任意選択的な調節エレメントとともに配置された選択されたプロモーターも含むことができる。
本明細書に記載されるベクター、例えば本明細書に記載されるC68ベクター、または本明細書に記載されるアルファウイルスベクターは少なくとも1つの新生抗原をコードする核酸を含むことができ、また、同じまたは別のベクターが、免疫チェックポイント分子に結合してその活性を遮断する少なくとも1つの免疫調節因子(例えばscFvなどの抗体)をコードする核酸を含むことができる。ベクターは、新生抗原と、チェックポイント阻害剤をコードする1つ以上の核酸分子とを含むことができる。
V.C.1.すべての腫瘍サブクローンをカバーするペプチドのセットの決定
すべてのまたは大部分の腫瘍サブクローンによって提示されるものを意味するトランカルペプチド(truncal peptide)が、ワクチン中への包含について優先される53。任意で、高い確率で提示されかつ免疫原性であることが予測されるトランカルペプチドがない場合、または、高い確率で提示されかつ免疫原性であることが予測されるトランカルペプチドの数が、追加的な非トランカルペプチドをワクチンに含めることができるほど少ない場合には、腫瘍サブクローンの数及び同一性を推定すること、及びワクチンによってカバーされる腫瘍サブクローンの数を最大化するようにペプチドを選ぶことによって、さらなるペプチドを優先順位付けすることができる54。
上記の新生抗原フィルターのすべてを適用した後、ワクチン技術が対応できるよりも多くの候補新生抗原が、依然としてワクチン包含に利用可能である可能性がある。追加的に、新生抗原解析の種々の態様についての不確定度が残っている可能性があり、候補ワクチン新生抗原の様々な性状の間にトレードオフが存在する可能性がある。したがって、選択プロセスの各段階でのあらかじめ決定されたフィルターの代わりに、少なくとも以下の軸を有する空間に候補新生抗原を置き、積分アプローチを用いて選択を最適化する、積分多次元モデルを考えることができる。
1. 自己免疫または寛容のリスク(生殖細胞系列のリスク)(より低い自己免疫のリスクが、典型的に好ましい)
2. シークエンシングアーチファクトの確率(より低いアーチファクトの確率が、典型的に好ましい)
3. 免疫原性の確率(より高い免疫原性の確率が、典型的に好ましい)
4. 提示の確率(より高い提示の確率が、典型的に好ましい)
5. 遺伝子発現(より高い発現が、典型的に好ましい)
6. HLA遺伝子のカバレッジ(新生抗原のセットの提示に関与する、より多い数のHLA分子は、腫瘍が、HLA分子の下方制御または変異を介して免疫攻撃を回避するであろう確率を低くする可能性がある)
V.D.1.アルファウイルスの生物学
アルファウイルスは、トガウイルス科のメンバーであり、一本鎖プラス鎖RNAウイルスである。アルファウイルスは、自己複製型RNAまたはsrRNAと呼ぶこともできる。メンバーは、一般的に、シンドビス、ロスリバー、マヤロ、チクングニア、及びセムリキ森林ウイルスなどの旧世界型、または、東部ウマ脳炎ウイルス、アウラ、フォートモルガン、もしくはベネズエラウマ脳炎ウイルス及びその誘導株TC−83などの新世界型に分類される(Strauss Microbrial Review 1994)。天然のアルファウイルスゲノムは、通常、長さ約12kbであり、その最初の2/3は、ウイルスゲノムを自己複製するためのRNA複製複合体を形成する非構造タンパク質(nsP)をコードする遺伝子を含んでおり、最後の1/3は、ビリオンを産生するための構造タンパク質をコードするサブゲノム発現カセットを含んでいる(Frolov RNA 2001)。
アルファウイルスは、発現ベクター系として使用するために従来、遺伝子操作がなされている(Pushko 1997,Rheme 2004)。アルファウイルスは、異種抗原の発現が望ましい場合があるワクチン設定においていくつかの長所を有する。アルファウイルスは、宿主のサイトゾル中で自己複製するその能力のため、細胞内の発現カセットの高いコピー数を一般的に得ることができることから、高いレベルの異種抗原の産生を実現することができる。さらに、ベクターは一般的に一過性であるため、バイオセーフティーが高く、ベクターに対する免疫寛容の誘導は低い。また、一般公衆は、一般的にヒトアデノウイルスのような他の標準的ウイルスベクターと比較してアルファウイルスに対する既存の免疫を有していない。アルファウイルスに基づくベクターはまた、感染細胞に対する細胞毒性反応を一般的に生じる。細胞毒性は、発現された異種抗原に対して免疫応答を適性に誘発するためにワクチン設定においてある程度の重要性を有しうる。しかしながら、所望の細胞毒性の程度はバランスの問題であり、そのため、VEEのTC−83株をはじめとするいくつかの弱毒化されたアルファウイルスが開発されている。したがって、本明細書に記載される新生抗原発現ベクターの一例では、高いレベルの新生抗原発現を可能とし、新生抗原に対する強い免疫応答を誘発し、ベクター自体に対する免疫応答は誘発せず、安全に使用することができるアルファウイルス骨格を用いることができる。さらに、新生抗原発現カセットは、ベクターが、VEEまたはその弱毒化誘導株TC−83に由来する配列を含む(ただしこれらに限定されない)どのアルファウイルス配列を用いるかを最適化することを通じて異なるレベルの免疫応答を誘発するように設計することができる。
アルファウイルス送達ベクターは、一般的に、プラス鎖のRNAポリヌクレオチドである。RNA生成のための当該技術分野では周知の従来の方法として、インビトロ翻訳IVTがある。この方法では、所望のベクターのDNA鋳型が、クローニング、制限消化、ライゲーション、遺伝子合成、及びポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などの標準的な分子生物学的方法を含む当該技術分野では周知の方法によって最初に生成される。このDNA鋳型は、RNAに転写されることが望ましい配列の5’末端にRNAポリメラーゼのプロモーターを有している。プロモーターとしては、これらに限定されるものではないが、T3、T7、またはSP6などのバクテリオファージポリメラーゼのプロモーターが挙げられる。次に、DNA鋳型は、適当なRNAポリメラーゼ酵素、バッファー剤、及びヌクレオチド(NTP)とインキュベートされる。得られたRNAポリヌクレオチドは、7−メチルグアノシンまたは関連する構造などの5’キャップ構造の付加、及び任意で、ポリアデニル化(ポリA)テールを有するように3’末端を改変することを含む(ただしこれらに限定されない)方法によって、任意でさらに改変することができる。次に、RNAをフェノールクロロホルム抽出などの当該技術分野では周知の方法を用いて精製することができる。
ワクチンベクターの設計において考慮すべき重要な側面の1つとして、ベクター自体に対する免疫がある(Riley 2017)。これは、例えば特定のヒトアデノウイルス系などのベクター自体に対する既存の免疫の形である場合もあり、またはワクチンの投与後に生じるベクターに対する免疫の形である場合もある。後者は、例えば別々のプライミング及びブースター投与のように同じワクチンの複数回の投与が行われる場合、または異なる新生抗原カセットを送達するために同じワクチンベクターシステムが用いられるような場合に重要な考慮事項となる。
V.E.1.チンパンジーアデノウイルスによるウイルス送達
チンパンジー由来のアデノウイルスヌクレオチド配列、各種の新規ベクター、及びチンパンジーアデノウイルス遺伝子を発現する細胞株を与えることによって1種類以上の新生抗原を送達する(例えば新生抗原カセットにより)ためのワクチン組成物を調製することができる。チンパンジーC68アデノウイルス(本明細書ではChAdV68とも呼ぶ)のヌクレオチド配列を、新生抗原を送達するためのワクチン組成物中に使用することができる(SEQ ID NO:1を参照)。C68アデノウイルス由来ベクターの使用については米国特許第6,083,716号にさらに詳細に記載されており、当該特許の全容をあらゆる目的で参照によって本明細書に援用する。
本明細書に記載される遺伝子のいずれかにおいて欠失を有する組換えチンパンジーアデノウイルス(Ad)を作製するため、欠失させた遺伝子領域の機能(ウイルスの複製及び感染性に不可欠である場合)をヘルパーウイルスまたは細胞株(すなわち、相補性またはパッケージング細胞株)によって組換えウイルスに供給することができる。例えば、複製欠損チンパンジーアデノウイルスベクターを作製するには、ヒトまたはチンパンジーアデノウイルスのE1遺伝子産物を発現する細胞株を使用することができ、そのような細胞株にはHEK293またはそのバリアントが含まれうる。チンパンジーE1遺伝子を発現する細胞株の作製のプロトコール(米国特許第6,083,716号の実施例3及び4)にしたがって任意の選択されたチンパンジーアデノウイルス遺伝子を発現する細胞株を作製することができる。
本明細書に開示される組成物は、少なくとも1種類の新生抗原を細胞に送達するウイルスベクターを含むことができる。かかるベクターは、C68のようなチンパンジーアデノウイルスDNA配列と、カセットを直接発現するための調節配列に機能的に連結された新生抗原カセットとを含む。C68ベクターは、感染した哺乳動物細胞内でカセットを発現することが可能である。C68ベクターは1つ以上のウイルス遺伝子に機能的欠失を有することができる。新生抗原カセットは、プロモーターなどの1つ以上の調節配列の制御下にある少なくとも1つの新生抗原を含む。任意選択的なヘルパーウイルス及び/またはパッケージング細胞株によって、チンパンジーウイルスベクターに、欠失させたアデノウイルス遺伝子の任意の必要な産物を供給することができる。
本発明において有用なチンパンジーアデノウイルスC68ベクターには、組換え欠損アデノウイルス、すなわち、E1aまたはE1b遺伝子に機能的欠失を有し、任意で、例えば温度感受性変異または他の遺伝子における欠失などの他の変異を有するチンパンジーアデノウイルス配列が含まれる。これらのチンパンジー配列は、他のアデノウイルス及び/またはアデノ随伴ウイルス配列からハイブリッドベクターを形成するうえでも有用であると予想される。ヒトアデノウイルスから調製された同種アデノウイルスベクターについては、刊行文献に記載されている[例えば、上記に引用のKozarsky I及びII、ならびに同文献に引用された参照文献、米国特許第5,240,846号を参照]。
最小チンパンジーAd C68ウイルスとしては、複製及びビリオンのカプシド形成に必要なアデノウイルスのシスエレメントのみを含むウイルス粒子がある。すなわち、このベクターは、アデノウイルスのシス作用性の5’及び3’の末端逆位繰り返し配列(ITR)(複製起点として機能する)と、天然の5’パッケージング/エンハンサードメイン(直鎖状のAdのゲノム及びE1プロモーターのエンハンサーエレメントをパッケージングするために必要な配列を含む)とを含む。例えば、国際出願第WO96/13597号において「最小」ヒトAdベクターの調製について述べられ、本明細書に参照によって援用する方法を参照されたい。
組換え複製不全アデノウイルスは、最小チンパンジーアデノウイルス配列以上のものを含んでもよい。これらの他のAdベクターは、ウイルスの遺伝子領域の異なる部分の欠失、ならびに、必要に応じたヘルパーウイルス及び/またはパッケージング細胞株の使用によって形成される感染性ウイルス粒子によって特徴づけることができる。
新生抗原カセットを送達するために用いられるウイルスベクターのチンパンジーアデノウイルス遺伝子の含量に応じて、ヘルパーアデノウイルスまたは非複製ウイルスフラグメントを用いて、カセットを含む感染性の組換えウイルス粒子を生成するのに充分なチンパンジーアデノウイルス遺伝子配列を与えることができる。
アデノウイルス、新生抗原カセット、及び他のベクター因子の選択されたDNA配列の様々な中間プラスミド及びシャトルベクターへのアセンブリ、ならびに組換えウイルス粒子を作製するためのプラスミド及びシャトルベクターの使用は、従来の手法を用いてすべて実現することができる。かかる手法としては、従来のcDNAのクローニング法、インビトロ組換え法(例えば、ギブソンアセンブリ)、アデノウイルスゲノムの重複するオリゴヌクレオチド配列の使用、ポリメラーゼ連鎖反応、及び所望のヌクレオチド配列を与える任意の適当な方法が挙げられる。標準的なトランスフェクション及び同時トランスフェクションの手法、例えば、CaPO4沈殿法またはリポフェクタミンなどのリポソーム媒介トランスフェクション法が用いられる。用いられる他の従来の方法としては、ウイルスゲノムの相同組み換え、アガーオーバーレイ中でのウイルスのプラーク形成、シグナル発生測定の方法などが挙げられる。
したがって、新生抗原カセットを含む得られた組換えチンパンジーC68アデノウイルス(上記に述べたように、アデノウイルスベクターとヘルパーウイルスとの協同、またはアデノウイルスベクターとパッケージング細胞株との協同により作製される)は、新生抗原(複数可)をインビボまたはエクスビボで対象に送達することができる効率的な遺伝子導入担体を与えるものである。
本明細書に開示する方法を用いて特定された複数の新生抗原などの1つ以上の新生抗原を対象に投与することにより、対象に腫瘍特異的な免疫応答を誘導し、腫瘍に対するワクチン接種を行い、対象のがんの症状を治療及び/または緩和する方法も提供される。
ワクチン接種プロトコールを用いて対象に1つ以上の新生抗原を投与することができる。プライミングワクチン及びブースターワクチンを用いて対象への投与を行うことができる。プライミングワクチンは、C68(例えば、SEQ ID NO:1または2に示される配列)またはsrRNA(例えば、SEQ ID NO:3または4に示される配列)に基づいたものとすることができ、ブースターワクチンは、C68(例えば、SEQ ID NO:1または2に示される配列)またはsrRNA(例えば、SEQ ID NO:3または4に示される配列)に基づいたものとすることができる。各ベクターは、通常、新生抗原を含むカセットを含んでいる。カセットは、各抗原を通常取り囲む天然の配列、またはAAYなどの他の非天然のスペーサー配列などのスペーサーによって分離された約20個の新生抗原を含むことができる。カセットは、破傷風トキソイド抗原などのMHCII抗原、及びユニバーサルクラスII抗原とみなされるPADRE抗原を含んでもよい。カセットは、ユビキチンターゲティング配列などのターゲティング配列を含んでもよい。さらに、各ワクチン用量は、チェックポイント阻害剤(CPI)と組み合わせて(例えば、同時、その前、またはその後で)対象に投与することができる。CPIは、抗体またはその抗原結合部分など、CTLA4、PD1、及び/またはPDL1を阻害するものを含むことができる。かかる抗体としては、トレメリムマブまたはデュルバルマブを挙げることができる。
VIII.A.新生抗原候補の特定
腫瘍及び正常のエクソーム及びトランスクリプトームのNGS解析のための研究法を、新生抗原の特定のスペースに記載し、適用している6,14,15。下記の例は、臨床設定における新生抗原の特定について、より大きな感度及び特異性のためのある特定の最適化を考慮している。これらの最適化は、実験室プロセスに関連するもの及びNGSデータ解析に関連するものの、2つの区域にグループ化することができる。
本明細書に提示したプロセスの改善は、標的とされるがんパネルにおける信頼できるがんドライバー遺伝子の評価について開発された概念16を、新生抗原の特定のために必要な全エクソーム設定及び全トランスクリプトーム設定に拡大することによって、低い腫瘍含量及び少ない体積の臨床標本からの高精度の新生抗原の発見における難題に対処する。具体的には、これらの改善は、以下を含む:
1.低い腫瘍含量またはサブクローン状態のいずれかにより、低い変異体アレル頻度で存在する変異を検出するための、腫瘍エクソームにわたる深い(500xよりも大きい)固有の平均カバレッジのターゲティング。
2.可能性のある新生抗原の見逃しが最も少ないように、100x未満でカバーされる塩基が5%未満である、例として、
a. 個々のプローブQCを有するDNAベースの捕捉プローブの使用17
b.十分にカバーされていない領域についての追加的なベイトの包含
3.可能性のある新生抗原が体細胞性/生殖細胞系列ステータスについて分類されていないままである(したがってTSNAとして使用可能ではない)ことが最も少ないように、20x未満でカバーされる塩基が5%未満である、正常エクソームにわたる均一カバレッジのターゲティング。
4.必要とされるシークエンシングの総量を最小化するために、配列捕捉プローブは、非コードRNAは新生抗原を生じることができないことから、遺伝子のコード領域のみについて設計される。追加的な最適化は、以下を含む:
a.GCリッチであり、標準的なエクソームシークエンシングでは十分に捕捉されないHLA遺伝子についての補充的プローブ18。
b.不十分な発現、プロテアソームによる最適に満たない消化、または異例の配列特性などの要因により、候補新生抗原を少ししかまたは全く生成しないと予測される遺伝子の排除。
5.バリアント検出、遺伝子及びスプライスバリアント(「アイソフォーム」)発現の定量、ならびに融合物検出を可能にするために、腫瘍RNAが同様に、高深度(100Mリードよりも大きい)でシークエンシングされる。FFPE試料由来のRNAは、DNAにおいてエクソームを捕捉するために使用されるのと同じまたは類似したプローブで、プローブベース濃縮19を用いて抽出される。
解析法の改善は、一般的な研究変異コーリングアプローチの最適に満たない感度及び特異性に対処し、具体的には、臨床設定における新生抗原の特定のために関連するカスタマイズ化を考慮する。これらは、以下を含む:
1.アラインメントのための、HG38参照ヒトゲノムまたはより後のバージョンの使用(それが、以前のゲノムリリースとは対照的に、集団多型をより良好に反映する複数のMHC領域アセンブリーを含有するため)。
2.様々なプログラム5からの結果をマージすることによる、単一バリアントコーラー20の限界の克服。
a.単一ヌクレオチドバリアント及び挿入欠失は、以下を含む一連のツールで、腫瘍DNA、腫瘍RNA、及び正常DNAから検出される:Strelka21及びMutect22などの、腫瘍及び正常DNAの比較に基づくプログラム;ならびに、低純度の試料において特に有利である23、UNCeqRなどの、腫瘍DNA、腫瘍RNA、及び正常DNAを組み入れるプログラム。
b.挿入欠失は、Strelka及びABRA24などの、局所リアセンブリーを行うプログラムで決定される。
c.構造的再編成は、Pindel25またはBreakseq26などの専用のツールを用いて決定される。
3.試料スワップを検出して阻止するために、同じ患者についての試料由来のバリアントコールが、選ばれた数の多型部位で比較される。
4.例として、以下による、人工的コールの広範囲のフィルタリングが行われる:
a.潜在的に、低いカバレッジの例においては緩やかな検出パラメータで、及び挿入欠失の例においては許容的な近接基準での、正常DNAにおいて見出されるバリアントの除去。
b.低いマッピング品質または低い塩基品質によるバリアントの除去27。
c.たとえ対応する正常において観察されないとしても、再出現するシークエンシングアーチファクトから生じるバリアントの除去27。例は、主として1本の鎖上に検出されるバリアントを含む。
d.無関連の対照のセットにおいて検出されるバリアントの除去27。
5.seq2HLA28、ATHLATES29、またはOptitypeのうちの1つを使用する、かつまた、エクソーム及びRNAシークエンシングデータを組み合わせる28、正常エクソームからの正確なHLAコーリング。追加的な潜在的最適化は、ロングリードDNAシークエンシングなどの、HLAタイピングのための専用アッセイの採用30、または、RNA断片を連結して連続性を保持するための方法の適応31を含む。
6.腫瘍特異的スプライスバリアントから生じた新生ORFの堅牢な検出は、CLASS32、Bayesembler33、StringTie34、またはそのリファレンスガイドモードにおける類似したプログラム(すなわち、各実験からそれらの全体の転写産物を再作製するように試みるよりもむしろ、公知の転写産物構造を用いる)を用いて、RNA−seqデータから転写産物をアセンブルすることによって、行われる。Cufflinks35が、この目的で一般的に使用されるが、それは頻繁に、信じ難いほど多数のスプライスバリアントを産生し、それらの多くは、完全長遺伝子よりもはるかに短く、単純な陽性対照をリカバーすることができない場合がある。コード配列及び潜在的なナンセンス変異依存分解機構は、変異体配列を再導入した、SpliceR36及びMAMBA37などのツールで決定される。遺伝子発現は、Cufflinks35またはExpress(Roberts and Pachter,2013)などのツールで決定される。野生型及び変異体特異的な発現カウント及び/または相対レベルは、ASE38またはHTSeq39などの、これらの目的で開発されたツールで決定される。潜在的なフィルタリング段階は、以下を含む:
a.不十分に発現されていると考えられる候補新生ORFの除去。
b.ナンセンス変異依存分解機構(NMD)を引き起こすと予測される候補新生ORFの除去。
7.腫瘍特異的と直接検証することができない、RNAにおいてのみ観察される候補新生抗原(例えば、新生ORF)は、例として以下を考慮することにより、追加的なパラメータにしたがって、腫瘍特異的である可能性が高いとして分類される:
a.腫瘍DNAのみのシス作用性フレームシフトまたはスプライス部位変異の支持の存在。
b.スプライシング因子における腫瘍DNAのみのトランス作用性変異の確証の存在。例として、R625変異体SF3B1での3つの独立して公開された実験において、最も差次的にスプライシングを呈する遺伝子は、1つの実験がブドウ膜黒色腫患者を検討し40、第2の実験がブドウ膜黒色腫細胞株を検討し41、及び第3の実験が乳がん患者を検討した42にもかかわらず、一致していた。
c.新規のスプライシングアイソフォームについては、RNASeqデータにおける「新規の」スプライス−ジャンクションリードの確証の存在。
d.新規の再編成については、正常DNAには存在しない腫瘍DNAにおけるエクソン近傍リードの確証の存在。
e.GTEx43などの遺伝子発現大要からの欠如(すなわち、生殖細胞系列起源の可能性をより低くする)。
8.アラインメント及びアノテーションベースのエラー及びアーチファクトを直接避けるために、アセンブルされたDNAの腫瘍及び正常リード(またはそのようなリード由来のkマー)を比較することによる、参照ゲノムアラインメントベースの解析の補完(例えば、生殖細胞系列バリアントまたはリピートコンテクスト挿入欠失の近くに生じる体細胞性バリアントについて)。
HLAペプチド分子の単離は、組織試料の溶解及び可溶化後に、古典的な免疫沈降(IP)法を用いて行った(55〜58)。清澄化した溶解物を、HLA特異的IPに使用した。
ペプチドYVYVADVAAK(SEQ ID NO:59)を用いて、何が検出の限界かを、LCカラム上にロードした様々な量のペプチドを用いて決定した。試験したペプチドの量は、1pmol、100fmol、10fmol、1fmol、及び100amolであった。(表1)結果を図1Fに示す。これらの結果は、検出の最低限界(LoD)がアトモルの範囲(10−18)にあること、ダイナミックレンジが5桁に及ぶこと、及び、シグナル対ノイズが、低いフェムトモル範囲(10−15)でシークエンシングに十分であるように見えることを示す。
IX.A.システムの概要
図2Aは、1つの実施形態にしたがう、患者におけるペプチド提示の可能性を特定するための環境100の概要である。環境100は、それ自体が提示情報記憶装置165を含む提示特定システム160を導入するコンテクストを提供する。
図2は、1つの実施形態にしたがう、提示情報を取得する方法を説明する。提示情報165は、2つの一般的部類の情報:アレル相互作用情報及びアレル非相互作用情報を含む。アレル相互作用情報は、MHCアレルのタイプに依存する、ペプチド配列の提示に影響を及ぼす情報を含む。アレル非相互作用情報は、MHCアレルのタイプに非依存的な、ペプチド配列の提示に影響を及ぼす情報を含む。
アレル相互作用情報は、主として、ヒト、マウスなど由来の1つ以上の特定されたMHC分子によって提示されていることが公知である、特定されたペプチド配列を含む。注目すべきことに、これは、腫瘍試料から取得されたデータを含んでもよく、または含まなくてもよい。提示されたペプチド配列は、単一のMHCアレルを発現する細胞から特定されてもよい。この例において、提示されたペプチド配列は、概して、あらかじめ決定されたMHCアレルを発現するように操作されてその後合成タンパク質に曝露された単一アレル細胞株から収集される。MHCアレル上に提示されたペプチドは、酸溶出などの技法によって単離され、質量分析により特定される。図2Bは、あらかじめ決定されたMHCアレルHLA−A*01:01上に提示された例示的なペプチドYEMFNDKS(SEQ ID NO:60)が単離され、質量分析により特定される、この例を示す。この状況においては、ペプチドが、単一のあらかじめ決定されたMHCタンパク質を発現するように操作された細胞を通して特定されるため、提示されたペプチドとそれが結合したMHCタンパク質との間の直接の関連が、決定的に既知である。
が、特定されたMHCアレルHLA−A*01:01、HLA−A*02:01、HLA−B*07:02、HLA−B*08:01、HLA−C*01:03、及びHLA−C*01:04上に提示されており、単離され、質量分析により特定される、この例を示す。単一アレル細胞株とは対照的に、結合したペプチドが、特定される前のMHC分子から単離されるため、提示されたペプチドとそれが結合したMHCタンパク質との間の直接の関連は、未知である可能性がある。
アレル非相互作用情報は、その由来源タンパク質配列内の、新生抗原コード化ペプチドに隣接するC末端配列を含むことができる。C末端フランキング配列は、ペプチドのプロテアソームプロセシングに影響を及ぼし得る。しかし、C末端フランキング配列は、ペプチドが小胞体に輸送され、細胞の表面上のMHCアレルと遭遇する前に、プロテアソームによってペプチドから切断される。その結果、MHC分子は、C末端フランキング配列についてのいかなる情報も受け取らず、したがって、C末端フランキング配列の効果は、MHCアレルタイプに応じて変動することができない。例えば、図2Cに示した例に戻ると、提示情報165は、ペプチドの由来源タンパク質から特定された、提示されたペプチドFJIEJFOESS(SEQ ID NO:63)のC末端フランキング配列FOEIFNDKSLDKFJI(SEQ ID NO:67)を含み得る。
i.EGFR、KRAS、ALK、RET、ROS1、TP53、CDKN2A、CDKN2B、NTRK1、NTRK2、NTRK3などの公知のがんドライバー遺伝子におけるドライバー変異。
ii.抗原提示マシナリーに関与するタンパク質をコードする遺伝子(例えば、B2M、HLA−A、HLA−B、HLA−C、TAP−1、TAP−2、TAPBP、CALR、CNX、ERP57、HLA−DM、HLA−DMA、HLA−DMB、HLA−DO、HLA−DOA、HLA−DOBHLA−DP、HLA−DPA1、HLA−DPB1、HLA−DQ、HLA−DQA1、HLA−DQA2、HLA−DQB1、HLA−DQB2、HLA−DR、HLA−DRA、HLA−DRB1、HLA−DRB3、HLA−DRB4、HLA−DRB5、または、プロテアソームもしくはイムノプロテアソームの構成要素をコードする遺伝子のいずれか)におけるもの。その提示が、腫瘍において機能喪失変異の影響下にある抗原提示マシナリーの構成要素に依拠するペプチドは、提示の確率が低減している。
i.抗原提示マシナリーに関与するタンパク質をコードする遺伝子(例えば、B2M、HLA−A、HLA−B、HLA−C、TAP−1、TAP−2、TAPBP、CALR、CNX、ERP57、HLA−DM、HLA−DMA、HLA−DMB、HLA−DO、HLA−DOA、HLA−DOBHLA−DP、HLA−DPA1、HLA−DPB1、HLA−DQ、HLA−DQA1、HLA−DQA2、HLA−DQB1、HLA−DQB2、HLA−DR、HLA−DRA、HLA−DRB1、HLA−DRB3、HLA−DRB4、HLA−DRB5、または、プロテアソームもしくはイムノプロテアソームの構成要素をコードする遺伝子のいずれか)におけるもの。
図3は、1つの実施形態による、提示特定システム160のコンピュータ論理構成要素を説明する、ハイレベルブロック図である。この例示的実施形態において、提示特定システム160は、データ管理モジュール312、コード化モジュール314、訓練モジュール316、及び予測モジュール320を含む。提示特定システム160はまた、訓練データ記憶装置170及び提示モデル記憶装置175から構成される。モデル管理システム160のいくつかの実施形態は、本明細書に記載したものとは異なるモジュールを有する。同様に、機能は、本明細書に記載したものは異なる様式で、モジュールの間に分配され得る。
データ管理モジュール312は、提示情報165から訓練データ170のセットを生成する。各々の訓練データのセットは、多数のデータ例を含有し、各データ例iは、少なくとも、提示されるかまたは提示されないペプチド配列piと、ペプチド配列piと結合した1つ以上の関連するMHCアレルaiと、提示特定システム160が、独立変数の新たな値を予測することに関心があるという情報を表す従属変数yiとを含む、独立変数ziのセットを含有する。
コード化モジュール314は、訓練データ170に含有される情報を、1つ以上の提示モデルを生成するために使用することができる数値的表示へとコード化する。一実現形態では、コード化モジュール314は、配列(例えば、ペプチド配列またはC末端フランキング配列)を、あらかじめ決定された20文字のアミノ酸アルファベットについて、ワン・ホットでコード化する。具体的には、ki個のアミノ酸を有するペプチド配列piは、20・ki要素の行ベクトルとして表され、ペプチド配列のj番目の位置のアミノ酸のアルファベットに対応するpi 20・(j−1)+1,pi 20・(j−1)+2,...,pi 20・jの中の単一要素は、1の値を有する。その以外の、残りの要素は、0の値を有する。例として、所定のアルファベット{A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y}について、データ例iの3個のアミノ酸のペプチド配列EAFは、60個の要素の行ベクトル
によって表され得る。C末端フランキング配列ci、ならびに、MHCアレルについてのタンパク質配列dh、及び提示情報における他の配列データは、同様に、上記のようにコード化することができる。
によって表され得る。C末端フランキング配列ciまたは他の配列データは、同様に、上記のようにコード化することができる。したがって、ペプチド配列piまたはciにおける各々の独立変数または列は、配列の特定の位置の特定のアミノ酸の存在を表す。
(ただし、
は指標関数であり、Lkはペプチドpkの長さを意味する)として表す。ベクトルTkを、アレル相互作用変数xh iに含めることができる。
訓練モジュール316は、ペプチド配列に関連するMHCアレルによってペプチド配列が提示されるかどうかの尤度を生成する、1つ以上の提示モデルを構築する。具体的には、ペプチド配列pk及びペプチド配列pkに関連するMHCアレルakのセットを与えられ、各提示モデルは、ペプチド配列pkが、関連するMHCアレルakのうちの1つ以上によって提示されるであろう尤度を示す、推定値ukを生成する。
訓練モジュール316は、165に保存された提示情報から生成された、記憶装置170に保存された訓練データセットに基づいて、1つ以上の提示モデルを構築する。概して、提示モデルの具体的なタイプに関わらず、提示モデルのすべては、損失関数が最小化されるように、訓練データ170における独立変数と従属変数との間の依存性を捕捉する。具体的には、損失関数
は、訓練データ170における1つ以上のデータ例Sについての従属変数yi∈Sの値と、提示モデルによって生成されたデータ例Sについての推定された尤度ui∈Sとの間の矛盾を表す。本明細書の残りの部分を通じて言及される1つの特定の実現形態において、損失関数(yi∈S,ui∈S;θ)は、以下のような等式(1a)によって与えられる負のlog尤度関数である。
しかし、実際には、別の損失関数が使用されてもよい。例えば、質量分析イオン電流について予測がなされる場合、損失関数は、以下のような等式1bによって与えられる平均二乗損失である。
訓練モジュール316は、アレルごとベースでペプチドの提示尤度を予測するための提示モデルを構築し得る。この例において、訓練モジュール316は、単一のMHCアレルを発現する細胞から生成された訓練データ170におけるデータ例Sに基づいて、提示モデルを訓練し得る。
によって、特定のアレルhについてのペプチドpkの推定提示尤度ukをモデル化し、ただし、ペプチド配列xh kは、ペプチドpk及び対応するMHCアレルhについてのコード化されたアレル相互作用変数を意味し、f(・)は、任意の関数であり、記載の便宜上、本明細書中を通して変換関数と呼ばれる。さらに、gh(・)は、任意の関数であり、記載の便宜上、本明細書中を通して依存性関数と呼ばれ、MHCアレルhについて決定されたパラメータθhのセットに基づいて、アレル相互作用変数xh kについての依存性スコアを生成する。各MHCアレルhについてのパラメータθhのセットの値は、θhに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、ここでiは、単一のMHCアレルhを発現する細胞から生成された訓練データ170のサブセットSにおける各例である。
によって与えられるexpit関数である。
別の例として、f(・)はまた、ドメインzの値が0以上である場合、
によって与えられる双曲線正接関数であることもできる。あるいは、予測が、範囲[0,1]の外側の値を有する質量分析イオン電流についてなされる場合、f(・)は、例えば、恒等関数、指数関数、log関数などの任意の関数であることができる。
本明細書を通して言及される1つの特定の実現形態において、依存性関数gh(・)は、xh kにおける各アレル相互作用変数を、関連するMHCアレルhについて決定されたパラメータθhのセットにおける対応するパラメータと線形結合する、
によって与えられるアフィン関数である。
によって与えられるネットワーク関数である。ノードは、パラメータθhのセットにおける関連するパラメータを各々有する接続を通して、他のノードに接続され得る。1つの特定のノードでの値は、特定のノードに関連する活性化関数によってマッピングされた関連するパラメータによって重み付けられた、特定のノードに接続されたノードの値の和として表され得る。アフィン関数と対照的に、ネットワークモデルは、提示モデルが非線形性、及び異なる長さのアミノ酸配列を有するプロセスデータを組み入れることができるため、有利である。具体的には、非線形モデリングを通して、ネットワークモデルは、ペプチド配列中の異なる位置のアミノ酸間の相互作用、及びこの相互作用がペプチド提示にいかに影響を及ぼすかを捕捉することができる。
として表すことができ、式中、g’h(xh k;θ’h)は、パラメータθ’hのセットを伴うアフィン関数、ネットワーク関数などであり、MHCアレルhについての提示のベースライン確率を表す、MHCアレルのアレル相互作用変数についてのパラメータのセットにおけるバイアスパラメータθh 0を伴う。
によって生成することができ、式中、x3 kは、MHCアレルh=3について特定されたアレル相互作用変数であり、θ3は、損失関数最小化を通してMHCアレルh=3について決定されたパラメータのセットである。
によって生成することができ、式中、x3 kは、MHCアレルh=3について特定されたアレル相互作用変数であり、θ3は、MHCアレルh=3に関連するネットワークモデルNN3(・)について決定されたパラメータのセットである。
一実現形態では、訓練モジュール316は、アレル非相互作用変数を組み入れて、
によって、ペプチドpkの推定提示尤度ukをモデル化し、式中、wkは、ペプチドpkについてのコード化されたアレル非相互作用変数を意味し、gw(・)は、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータθwのセットに基づく、アレル非相互作用変数wkについての関数である。具体的には、各MHCアレルhについてのパラメータθhのセット及びアレル非相互作用変数についてのパラメータθwのセットの値を、θh及びθwに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、iは、単一のMHCアレルを発現する細胞から生成された訓練データ170のサブセットSにおける各例である。
によって与えられ得る。
アレル相互作用変数についての依存性関数gh(・)と同様に、アレル非相互作用変数についての依存性関数gw(・)は、アフィン関数、または別々のネットワークモデルがアレル非相互作用変数wkに関連しているネットワーク関数であり得る。
によって与えられ得、式中、g’w(wk;θ’w)は、アレル非相互作用パラメータθ’wのセットを伴うアフィン関数、ネットワーク関数などであり、mkは、ペプチドpkについてのmRNA定量測定値であり、h(・)は、定量測定値を変換する関数であり、かつθw mは、mRNA定量測定値についての依存性スコアを生成するようにmRNA定量測定値と組み合わされる、アレル非相互作用変数についてのパラメータのセットにおけるパラメータである。本明細書の残りの部分を通じて言及される1つの特定の実施形態において、h(・)はlog関数であるが、実際には、h(・)は、様々な異なる関数のうちのいずれか1つであり得る。
によって与えられ、式中、g’w(wk;θ’w)は、アレル非相互作用パラメータθ’wのセットを伴うアフィン関数、ネットワーク関数などであり、okは、ペプチドpkについてヒトプロテオームにおけるタンパク質及びアイソフォームを表す上記の指標ベクトルであり、かつθw oは、指標ベクトルと組み合わされるアレル非相互作用変数についてのパラメータのセットにおける、パラメータのセットである。1つのバリエーションにおいて、ok及びパラメータθw oのセットの次元が有意に高い場合、
(
は、L1ノルム、L2ノルム、組み合わせなどを表す)などのパラメータ正則化項を、パラメータの値を決定する時に損失関数に加えることができる。ハイパーパラメータλの最適値を、適切な方法を通して決定することができる。
によって生成することができ、式中、wkは、ペプチドpkについて特定されたアレル非相互作用変数であり、θwは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
によって生成することができ、式中、wkは、ペプチドpkについて特定されたアレル相互作用変数であり、θwは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
訓練モジュール316はまた、2つ以上のMHCアレルが存在する複数アレル設定においてペプチドの提示尤度を予測するための提示モデルを構築し得る。この例において、訓練モジュール316は、単一のMHCアレルを発現する細胞、複数のMHCアレルを発現する細胞、またはそれらの組み合わせから生成された訓練データ170におけるデータ例Sに基づいて、提示モデルを訓練し得る。
一実現形態では、訓練モジュール316は、複数のMHCアレルHのセットに関連したペプチドpkの推定提示尤度ukを、等式(2)〜(11)と共に上記で説明したような、単一アレルを発現する細胞に基づいて決定されたセットHにおけるMHCアレルhの各々について決定された提示尤度uk h∈Hの関数としてモデル化する。具体的には、提示尤度ukは、uk h∈Hの任意の関数であることができる。一実現形態では、等式(12)に示すように、関数は最大値関数であり、提示尤度ukは、セットHにおける各MHCアレルhについての提示尤度の最大値として決定することができる。
一実現形態では、訓練モジュール316は、ペプチドpkの推定提示尤度ukを、
によってモデル化し、式中、要素ah kは、ペプチド配列pkに関連する複数のMHCアレルHについて1であり、xh kは、ペプチドpk及び対応するMHCアレルについてのコード化されたアレル相互作用変数を意味する。各MHCアレルhについてのパラメータθhのセットの値は、θhに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、iは、単一のMHCアレルを発現する細胞及び/または複数のMHCアレルを発現する細胞から生成された訓練データ170のサブセットSにおける各例である。依存性関数ghは、セクションX.B.1.において上記で導入された依存性関数ghのいずれかの形態であり得る。
によって生成することができ、式中、x2 k、x3 kは、MHCアレルh=2、h=3について特定されたアレル相互作用変数であり、θ2、θ3は、MHCアレルh=2、h=3について決定されたパラメータのセットである。
によって生成することができ、式中、NN2(・)、NN3(・)は、MHCアレルh=2、h=3について特定されたネットワークモデルであり、θ2、θ3は、MHCアレルh=2、h=3について決定されたパラメータのセットである。
一実現形態では、訓練モジュール316は、アレル非相互作用変数を組み入れて、
によって、ペプチドpkの推定提示尤度ukをモデル化し、式中、wkは、ペプチドpkについてのコード化されたアレル非相互作用変数を意味する。具体的には、各MHCアレルhについてのパラメータθhのセット及びアレル非相互作用変数についてのパラメータθwのセットの値を、θh及びθwに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、iは、単一のMHCアレルを発現する細胞及び/または複数のMHCアレルを発現する細胞から生成された訓練データ170のサブセットSにおける各例である。依存性関数gwは、セクションX.B.3.において上記で導入された依存性関数gwのいずれかの形態であり得る。
によって生成することができ、式中、wkは、ペプチドpkについて特定されたアレル非相互作用変数であり、θwは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
によって生成することができ、式中、wkは、ペプチドpkについて特定されたアレル相互作用変数であり、θwは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
によって与えられ得る。
別の実現形態において、訓練モジュール316は、ペプチドpkの推定提示尤度ukを、
によってモデル化し、式中、要素ah kは、ペプチド配列pkに関連する複数のMHCアレルh∈Hについて1であり、u’k hは、MHCアレルhについての暗黙のアレル当たりの提示尤度であり、ベクトルvは、要素vhが、ah k・u’k hに対応するベクトルであり、s(・)は、vの要素をマッピングする関数であり、かつr(・)は、入力の値を所定の範囲中にクリップするクリッピング関数である。より詳細に下記に記載するように、s(・)は、総和関数または二次関数であってもよいが、他の実施形態において、s(・)は、最大値関数などの任意の関数であり得ることが認識される。暗黙のアレル当たりの尤度についてのパラメータθのセットの値は、θに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、iは、単一のMHCアレルを発現する細胞及び/または複数のMHCアレルを発現する細胞から生成された訓練データ170のサブセットSにおける各例である。
r(z)=min(max(z,0),1)
であってもよく、zと1の間の最小値が、提示尤度ukとして選ばれる。別の実現形態において、r(・)は、
r(z)=tanh(z)
として与えられる双曲線正接関数であり、ドメインzの値は、0以上である。
によって生成することができ、式中、x2 k、x3 kは、MHCアレルh=2、h=3について特定されたアレル相互作用変数であり、θ2、θ3は、MHCアレルh=2、h=3について決定されたパラメータのセットである。
によって生成することができ、式中、NN2(・)、NN3(・)は、MHCアレルh=2、h=3について特定されたネットワークモデルであり、θ2、θ3は、MHCアレルh=2、h=3について決定されたパラメータのセットである。
1つの実現形態では、MHCアレルhについての暗黙のアレル当たりの提示尤度を、
によって生成して、提示尤度が、
によって生成されるようにして、ペプチド提示に、アレル非相互作用変数の影響を組み入れる。
によって生成することができ、式中、wkは、ペプチドpkについて特定されたアレル非相互作用変数であり、θwは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
によって生成することができ、式中、wkは、ペプチドpkについて特定されたアレル相互作用変数であり、θwは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
一実現形態では、s(・)は、二次関数であり、ペプチドpkの推定提示尤度ukは、
によって与えられ、式中、要素u’k hは、MHCアレルhについての暗黙のアレル当たりの提示尤度である。暗黙のアレル当たりの尤度についてのパラメータθのセットの値は、θに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、iは、単一のMHCアレルを発現する細胞及び/または複数のMHCアレルを発現する細胞から生成された訓練データ170のサブセットSにおける各例である。暗黙のアレル当たりの提示尤度は、上記の等式(18)、(20)、及び(22)において示すいずれかの形態であり得る。
によって生成することができ、式中、x2 k、x3 kは、HLAアレルh=2、h=3について特定されたアレル相互作用変数であり、θ2、θ3は、HLAアレルh=2、h=3について決定されたパラメータのセットである。
によって生成することができ、式中、NN2(・)、NN3(・)は、HLAアレルh=2、h=3について特定されたネットワークモデルであり、θ2、θ3は、HLAアレルh=2、h=3について決定されたパラメータのセットである。
予測モジュール320は、配列データを受け取って、提示モデルを用いて配列データ中の候補新生抗原を選択する。具体的には、配列データは、患者の腫瘍組織細胞から抽出されたDNA配列、RNA配列、及び/またはタンパク質配列であってよい。予測モジュール320は、配列データを、8〜15個のアミノ酸を有する複数のペプチド配列pkに処理する。例えば、予測モジュール320は、所定の配列「IEFROEIFJEF(SEQ ID NO:73)」を、9個のアミノ酸を有する3種類のペプチド配列「IEFROEIFJ(SEQ ID NO:74)」、「EFROEIFJE(SEQ ID NO:75)」、及び「FROEIFJEF(SEQ ID NO:76)」に処理することができる。一実施形態では、予測モジュール320は、患者の正常組織細胞から抽出された配列データをその患者の腫瘍組織細胞から抽出された配列データと比較して1つ以上の変異を有する部分を特定することによって、変異したペプチド配列である候補新生抗原を特定することができる。
XI.B.1 概要
カセット設計モジュール324は、患者に注射するためのv種類の選択された候補ペプチドに基づいてワクチンカセット配列を生成する。具体的には、容量vのワクチンに含まれる選択されたペプチドのセットpk,k=1,2,…,vについて、カセット配列は、それぞれが対応するペプチドpkの配列を含む一連の治療エピトープ配列p’k,k=1,2,…,vの連結鎖によって与えられる。一実施形態では、カセット設計モジュール324は、各エピトープを互いに対して直接隣接するように連結することができる。例えば、あるワクチンカセットCは、
で表すことができる(式中、p’tiは、カセットのi番目のエピトープを示す)。したがって、tiは、カセットのi番目の位置の選択されたペプチドの添え字k=1,2,…,vに対応する。別の実施形態では、カセット設計モジュール324は、隣接するエピトープ間に1つ以上の任意選択的なリンカー配列を有するように各エピトープを連結することができる。例えば、あるワクチンカセットCは、
で表すことができる(式中、l(ti,tj)は、カセットのi番目のエピトープp’tiとj=i+1番目のエピトープp’j=i+1との間に配置されたリンカー配列を示す)。カセット設計モジュール324は、選択されたエピトープp’k,k=1,2,…,vのどれがカセットの異なる位置に配置されるか、及び、各エピトープ間に配置されるすべてのリンカー配列を決定する。カセット配列Cは、本明細書に記載される方法のいずれかに基づいたワクチンとしてロードすることができる。
により与えられる(ただし、h(・)は、各ジャンクションの距離関数をあるスコアにマッピングする特定の関数である)。本明細書の残りの部分を通じて言及される1つの特定の例では、関数h(・)は、カセットの距離関数にわたった総和である。
v×vの行列Dは、非対称距離行列であり、各要素D(k,m),k=1,2,…,v;m=1,2,…,vは、エピトープp’kからエピトープp’mまでのジャンクションの距離関数に対応している。Pの列k=2,…,vは元のエピトープの各ノードに対応し、列1及び行1は、他のすべてのノードからの距離が0である「ゴーストノード」に対応する。行列への「ゴーストノード」の追加は、ワクチンカセットが環状ではなく直鎖状であり、したがって最初のエピトープと最後のエピトープとの間にジャンクションがないという概念を記号化するものである。換言すれば、配列は環状ではなく、最初のエピトープは配列内の最後のエピトープの後に連結されると仮定されない。エピトープp’kがエピトープp’mのN末端に連結され、そうでない場合には0である、方向付けられた経路(すなわち、カセット内のエピトープ−エピトープジャンクション)が存在する場合にxkmが、値1のバイナリー変数を示すものとする。さらに、Eが、すべてvの治療ワクチンエピトープのセットを示し、S⊂Eがエピトープのサブセットを示すものとする。任意のかかるサブセットSにおいて、out(S)が、エピトープ−エピトープジャンクションx_km=1の数を示すものとする(ただし、kはS内のエピトープであり、mはE\S内のエピトープである)。既知の経路行列Pが与えられたものとして、カセット設計モジュール324は、以下の整数線形計画問題を解く経路行列Xを見つける。
ただし、Pkmは、以下の制約条件の下で、経路行列Pの要素P(k,m)を示す。
最初の2つの制約条件は、各エピトープがカセット内にちょうど1回現れることを保証するものである。最後の制約条件は、カセットが連結されていることを保証するものである。換言すれば、xで記号化されたカセットは連結された直鎖状タンパク質配列である。
v=20個の治療エピトープを含む2個のカセット配列を、1,000,000通りの順列のランダムサンプリングにより(カセット配列C1)、また、等式(27)において整数線形計画問題を解くことにより(カセット配列C2)生成した。距離関数、したがって提示スコアを、等式(14)で記述される提示モデルに基づいて求めた(式中、fは、シグモイド関数であり、xh iは、ペプチドpiの配列であり、gh(・)は、ニューラルネットワーク関数であり、wは、フランキング配列、ペプチドpiのlogTPM(transcripts per kilobase million)、ペプチドpiのタンパク質の抗原性、及びペプチドpiの由来源の試料IDを含み、フランキング配列のgw(・)及びlogTPMは、それぞれニューラルネットワーク関数である)。gh(・)のニューラルネットワーク関数のそれぞれは、単一隠れ層の多層パーセプトロン(MLP)の1つの出力ノードを含み、入力次元231(11残基×残基ごとに21文字(pad文字を含む))の幅256、隠れ層での正規化線形ユニット(ReLU)活性化、出力層での線形活性化、及び、訓練データセット内のHLAアレルごとに1個の出力ノードのものであった。フランキング配列のニューラルネットワーク関数は、単一隠れ層MLPで、入力次元210(N末端フランキング配列の5残基+C末端フランキング配列の5残基×残基ごとに21文字(pad文字を含む))、幅32、隠れ層でのReLU活性化、及び出力層での線形活性化のものであった。RNA logTPMのニューラルネットワーク関数は、単一隠れ層MLPで、入力次元1、幅16、隠れ層でのReLU活性化、及び出力層での線形活性化のものであった。HLA−A*02:04、HLA−A*02:07、HLA−B*40:01、HLA−B*40:02、HLA−C*16:02、及びHLA−C*16:04のHLAアレルについて提示モデルを構築した。2個のカセット配列の提示されるジャンクションエピトープの期待数を示す提示スコアを比較した。結果は、等式(27)を解くことによって生成されたカセット配列の提示スコアが、ランダムサンプリングによって生成されたカセット配列の提示スコアよりも約4倍の改善をともなったことを示した。
であり、提示されるジャンクションエピトープの期待数の提示スコアは6.1であった。1,000,000通りのランダム配列の提示スコアの中央値は、18.3であった。実験は、提示されるジャンクションエピトープの期待数が、ランダムにサンプリングされたカセット間でカセット配列を特定することによって大幅に低減されたことを示している。
であり、提示スコア1.7であった。カセット配列C2の提示スコアは、カセット配列C1の提示スコアと比較して約4倍の改善を示し、ランダムに生成された1,000,000通りの候補カセットの提示スコアの中央値と比較して約11倍の改善を示した。カセットC1を生成するためのランタイムは、2.30GHzのIntel Xeon E5−2650 CPUのシングルスレッド上で20秒であった。カセットC2を生成するためのランタイムは、同じCPUのシングルスレッド上で1秒であった。したがって、この例では、等式(27)の整数線形計画問題を解くことによって特定されたカセット配列は、20倍低減された計算コストで約4倍良好な解を生成している。
この例では、腫瘍/正常エクソームのシークエンシング、腫瘍トランスクリプトームのシークエンシング、及び肺癌試料のHLAタイピングに基づいて選択されたv=20個の治療エピトープを含むカセット配列を、1,000,000通りの順列のランダムサンプリングにより、さらに等式(27)で整数線形計画問題を解くことによって生成した。距離関数、したがって提示スコアを、HLAペプチドの結合親和性の予測プログラムであるMHCflurryによって予測された、様々な閾値(例えば、50〜1000nM、またはこれよりも高いかもしくは低い値)を下回る親和性で患者のHLAに結合するジャンクションエピトープの数に基づいて求めた。この例では、治療エピトープとして選択される20個の非同義体細胞変異を、上記のセクションXI.Bの提示モデルにしたがって変異をランク付けすることによって腫瘍試料で特定された98個の体細胞変異間から選択した。しかしながら、他の実施形態では、治療エピトープは、安定性に基づくものなど、または提示スコア、親和性といった基準の組み合わせなどの他の基準に基づいて選択することもできる点は理解されよう。さらに、ワクチンに含めるための治療エピトープを優先順位付けするために用いられる基準は、カセット設計モジュール324で使用される距離関数D(k,m)を決定するために用いられる基準と同じである必要はない点は理解されよう。
上記の種々の提示モデルの妥当性を、提示モデルを訓練するために使用されなかった訓練データ170のサブセット、または、訓練データ170と類似した変数及びデータ構造を有する訓練データ170とは別々のデータセットであった、試験データTに対して試験した。
であり、これは、HLAアレル上に提示されると予測されたペプチド例の数に対する、関連するHLAアレル上に提示されると正確に予測されたペプチド例の数の比率を示す。一実現形態では、試験データTにおけるペプチドpiは、対応する尤度推定値uiが、所定の閾値t以上である場合に、1つ以上の関連するHLAアレル上に提示されると予測された。提示モデルの性能を示す別の関連性のある測定基準は、
であり、これは、HLAアレル上に提示されることが公知であったペプチド例の数に対する、関連するHLAアレル上に提示されると正確に予測されたペプチド例の数の比率を示す。提示モデルの性能を示す別の関連性のある測定基準は、受信者動作特性(ROC)の曲線下面積(AUC)である。ROCは、
によって与えられる、偽陽性率(FPR)に対するリコールをプロットする。
図13Aは、複数アレル質量分析データに基づいて、ペプチド提示予測について、本明細書において提示するような例示的な提示モデル、及び従来の技術水準モデルの性能結果を比較する。結果は、例示的な提示モデルが、親和性及び安定性の予測に基づく従来の技術水準モデルよりも有意に良好に、ペプチド提示の予測において機能したことを示した。
図13Bは、T細胞エピトープデータに基づいて、ペプチド提示予測について、本明細書において提示するような別の例示的な提示モデル、及び従来の技術水準モデルの性能結果を比較する。T細胞エピトープデータは、細胞表面上のMHCアレルによって提示されT細胞によって認識されたペプチド配列を含有する。結果は、例示的な提示モデルが、たとえ質量分析データに基づいて訓練されているとしても、親和性及び安定性の予測に基づく従来の技術水準モデルよりも有意に良好に、T細胞エピトープの予測において機能したことを示した。換言すると、図13Bの結果は、例示的な提示モデルが、質量分析試験データに基づくペプチド提示の予測において従来の技術水準モデルよりも良好に機能しただけではなく、T細胞によって実際に認識されたエピトープの予測においても、従来の技術水準モデルよりも有意に良好に機能したことを示した。これは、本明細書において提示するような様々な提示モデルが、免疫系において免疫原性応答を誘導する可能性が高い抗原の、改善された特定を提供できることのしるしである。
図13Cは、複数アレル質量分析データに基づいて、ペプチド提示予測について、例示的な和の関数モデル(等式(13))、例示的な関数の和モデル(等式(19))、及び例示的な二次モデル(等式(23))の性能結果を比較する。結果は、関数の和モデル及び二次モデルが、和の関数モデルよりも良好に機能したことを示した。これは、和の関数モデルが、実際にはペプチドの提示が有効に独立している場合、複数アレル設定におけるアレルが、ペプチド提示について互いに干渉し得ることを含意するためである。
図13Dは、複数アレル質量分析データについて、ペプチド提示予測に関して、単一アレル質量分析データを伴って及び伴わずに訓練される2つの例示的な提示モデルの性能結果を比較する。結果は、単一アレルデータを伴わずに訓練される例示的な提示モデルが、単一アレルデータを伴って訓練される例示的な提示モデルのものに匹敵する性能を達成することを示した。
図13Eは、図13Dに示す解析において提供されたアレルHLA−A*02:01及びHLA−B*07:02についての単一アレル質量分析データに基づく、図13Dに示す「A2/B7単一アレルデータを伴わない」及び「A2/B7単一アレルデータを伴う」例示的なモデルの性能を示す。結果は、たとえ例示的な提示モデルがこれらの2つのアレルについての単一アレル質量分析データを伴わずに訓練されるとしても、モデルが各MHCアレルについての結合モチーフを学習できることを示す。
図13Fは、図13Dに示す「A2/B7単一アレルデータを伴わない」例示的なモデルによって予測される、九量体の中で一般的な2位及び9位のアンカー残基を示す。ペプチドは、推定尤度が5%よりも上であった場合に、提示されることが予測された。結果は、MHCアレルHLA−A*02:01及びHLA−B*07:02上での提示について特定されたペプチドにおける最も一般的なアンカー残基が、これらのMHCアレルについて既知のアンカーモチーフと一致したことを示す。これは、例示的な提示モデルが、期待されたように、ペプチド配列のアミノ酸の特定の位置に基づいて、ペプチド結合を正確に学習したことを示す。
図13Gは、C末端フランキング配列及びN末端フランキング配列をアレル相互作用変数として組み入れた例示的な提示モデルと、C末端フランキング配列及びN末端フランキング配列をアレル非相互作用変数として組み入れた例示的な提示モデルとの間の性能結果を比較する。結果は、C末端フランキング配列及びN末端フランキング配列のアレル非相互作用変数としての組み入れが、モデル性能を有意に改善したことを示した。より具体的には、様々なMHCアレルにわたって共通である、ペプチド提示に適切な特性を特定し、これらのアレル非相互作用変数についての統計学的強度が、提示モデルの性能を改善するためにMHCアレルにわたって共有されるように、それらをモデル化することが、価値を有する。
図13Hは、腫瘍細胞に対する質量分析データについて、mRNA定量に基づく遺伝子と提示されるペプチドの画分との間の依存性を説明する。結果は、mRNA発現とペプチド提示との間に強い依存性があることを示す。
図13Iは、2つの例示的な提示モデルの性能を示し、そのうち1つは、質量分析腫瘍細胞データに基づいて訓練されており、もう1つは、mRNA定量データ及び質量分析腫瘍細胞データを組み入れている。図13Hから期待されるように、mRNA発現はペプチド提示の強い指標であるため、結果は、mRNA定量測定値を例示的な提示モデルに組み入れることによって、性能の有意な改善があることを示した。
図13Jは、図13Iに関して説明した「例示的なモデル、RNAあり」提示モデルによって生成された結果と、ペプチド提示を予測する時にペプチド長を計上しない従来の技術水準モデルによって予測された結果との間で、様々なペプチド長についてのペプチド提示の確率を比較する。結果は、図13Iからの「例示的なモデル、RNAあり」の例示的な提示モデルが、異なる長さのペプチドにわたって尤度の変動を捕捉したことを示した。
以下は、hによって意味されるMHCアレルHLA−C*16:04について、アレルごと提示モデル(等式(2))のバリエーションについて決定されたパラメータのセットを示し:
式中、relu(・)は、正規化線形ユニット(RELU:rectified linear unit)関数であり、Wh 1、bh 1、Wh 2、及びbh 2は、モデルについて決定されたパラメータθのセットである。アレル相互作用変数xh kは、ペプチド配列からなる。Wh 1の次元は(231x256)であり、bh 1の次元は(1x256)であり、Wh 2の次元は(256x1)であり、かつbh 2はスカラーである。証明の目的で、bh 1、bh 2、Wh 1、及びWh 2の値は、その教示するところのすべてについて本明細書に援用する国際公開第WO2017106638号に詳細に記載されている。
図14は、図1及び図3に示した実体を実施するための例示的なコンピュータ1400を説明する。コンピュータ1400は、チップセット1404に連結された少なくとも1つのプロセッサ1402を含む。チップセット1404は、メモリコントローラハブ1420及び入力/出力(I/O)コントローラハブ1422を含む。メモリ1406及びグラフィックスアダプタ1412は、メモリコントローラハブ1420に連結されており、ディスプレイ1418は、グラフィックスアダプタ1412に連結されている。記憶デバイス1408、入力装置1414、及びネットワークアダプタ1416は、I/Oコントローラハブ1422に連結されている。コンピュータ1400の他の実施形態は、異なるアーキテクチャを有する。
以下は、本明細書を実施するための具体的な実施形態の例である。これらの例はあくまで例示の目的で示されるものにすぎず、本発明の範囲をいかなる意味においても限定しようとするものではない。用いられる数値(例えば、量、温度など)に関して精度を確実とするべく努力に努めてはいるが、ある程度の実験的誤差及び偏差は無論のこと許容されなければならない。
ワクチン接種によって、対応する細胞免疫応答(複数可)を刺激するクラスI MHCに制限された複数の腫瘍特異的新生抗原(TSNA)を送達することができる。1つの例では、複数のエピトープを単一の遺伝子産物をしてコードするようにワクチンカセットを操作しているが、ここで各エピトープはそれらの天然の包囲ペプチド配列内に埋め込まれるか、または非天然リンカー配列によって分離されている。抗原のプロセシング及び提示、ひいてはTSNA特異的CD8 T細胞応答の程度及び幅に潜在的に影響を及ぼしうるいくつかの設計パラメータが特定されている。本例では、いくつかのモデルカセットを設計及び構築して以下を評価した。すなわち、(1)1個の発現カセットに組み込まれた複数のエピトープに対する強いT細胞応答を生じることができるかどうか、(2)どのような条件が、すべてのエピトープの最適なプロセシング及び提示につながる、発現カセット内のTSNA間に配置される最適リンカーを作るか、(3)カセット内の各エピトープの相対位置がT細胞応答に影響するか、(4)カセット内のエピトープの数が個々のエピトープに対するT細胞応答の程度または質に影響するかどうか、(5)細胞ターゲティング配列の付加がT細胞応答を向上させるか。
XIV.B.1.方法及び材料
TCR及びカセット設計及びクローニング
選択されたTCRは、A*0201により提示される場合にペプチドNLVPMVATV(SEQ ID NO:128)(PDB番号5D2N)、CLGGLLTMV(SEQ ID NO:129)(PDB番号3REV)、GILGFVFTL(SEQ ID NO:130)(PDB番号1OGA)LLFGYPVYV(SEQ ID NO:131)(PDB番号1AO7)を認識する。2Aペプチド連結TCRサブユニット(βに続きα)、EMCV IRES、及び2A連結CD8サブユニット(βに続きα及びプロマイシン耐性遺伝子)を含むトランスファーベクターを構築した。オープンリーディングフレーム配列は、コドン最適化され、GeneArt社により合成されたものである。
ペプチドは、ProImmune社またはGenscript社より購入し、水/DMSO(2:8,v/v)に加えた10mM tris(2−カルボキシルエチル)ホスフィン(TCEP)で10mg/mLに希釈した。細胞培地及び補助添加物質は特に断らない限りはGibco社より入手した。熱不活化ウシ胎児血清(FBShi)はSeradigm社より入手した。QUANTI−Luc基質、ゼオシン、及びプロマイシンはInvivoGen社より入手した。Jurkat−Lucia NFAT細胞(InvivoGen社)を10% FBShi、ピルビン酸ナトリウム、及び100μg/mLのゼオシンを添加したRPMI1640中で維持した。形質導入した後、これらの細胞にさらに0.3μg/mLのプロマイシンを加えた。T2細胞(ATCC CRL−1992)をIscove培地(IMDM)+20%FBShi中で培養した。U−87 MG(ATCC HTB−14)細胞を、10%FBShiを添加したMEM Eagles培地中で維持した。
T2細胞はTCRによる抗原認識を調べる目的で日常的に使用されている。T2細胞は、抗原プロセシング用のペプチドトランスポーターを欠失しており(TAP欠損)、内因性のペプチドをMHC上に提示するために小胞体に取り込むことができない。しかしながら、T2細胞には外因性のペプチドを容易に取り込ませることができる。5種類のマーカーペプチド(NLVPMVATV(SEQ ID NO:128)、CLGGLLTMV(SEQ ID NO:129)、GLCTLVAML(SEQ ID NO:132)、LLFGYPVYV(SEQ ID NO:131)、GILGFVFTL(SEQ ID NO:130))及び2種類の無関係のペプチド(WLSLLVPFV(SEQ ID NO:133)、FLLTRICT(SEQ ID NO:134))をT2細胞に取り込ませた。簡単に述べると、T2細胞をカウントし、IMDM +1%FBShiで1×106細胞/mLに希釈した。各ペプチドは10μgペプチド/1×106細胞となるように加えた。次いで細胞を37℃で90分間インキュベートした。細胞をIMDM+20%FBShiで2回洗浄し、5×10E5細胞/mLに希釈し、100μLを96ウェルCostar組織培養プレートにプレーティングした。Jurkat−Lucia TCRクローンをカウントし、RPMI1640+10%FBShi中で5×10E5細胞/mLに希釈し、100μLをT2細胞に加えた。プレートを37℃、5%CO2で一晩インキュベートした。次いでプレートを400gで3分間遠心し、20μLの上清を白色平底Greinerプレートに取った。指示にしたがってQUANTI−Luc基質を調製し、50μL/ウェルで加えた。ルシフェラーゼ発現をMolecular Devices SpectraMax iE3xで読み取った。
トランスジェニックHLA−A2.1(HLA−A2 Tg)マウスをTaconic Labs,Inc社より入手した。これらのマウスは、ヒトHLA−A2.1リーダードメイン、α1ドメイン、及びα2ドメインと、マウスH2−Kb α3ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインから構成されるキメラクラスI分子からなる導入遺伝子を有するものである(Vitiello et al.,1991)。これらの実験で使用したマウスは、C57Bl/6バックグラウンドの野生型BALB/cAnNTacの雌及びホモ接合型HLA−A2.1Tgの雌の第1世代子孫(F1)である。
HLA−A2 Tgマウスを、前脛骨筋の両側性の筋肉内注射により1×1010〜1×106 個のアデノウイルスベクターのウイルス粒子で免疫化した。免疫応答を免疫化の12日後に測定した。
免疫化したマウスの新しく収穫した脾臓及びリンパ節からリンパ球を単離した。GentleMACS組織解離装置を製造者の指示にしたがって使用して、10%ウシ胎児血清をペニシリン及びストレプトマイシンとともに含むRPMI(完全RPMI)中で組織を解離させた。
マウスIFNg ELISpotPLUSキット(MABTECH社)を使用し、ELISPOTハーモナイゼーションガイドライン(Janetzki et al.,2015)にしたがってELISPOT分析を行った。1×105個の脾細胞を、96ウェルIFNg抗体コーティングプレート中で、10uMの示したペプチドと16時間インキュベートした。スポットをアルカリホスファターゼを用いて現像した。反応時間を10分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させた。スポットをAID vSpot Reader Spectrumを用いてカウントした。ELISPOT分析を行うため、飽和度が50%よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が10%よりも大きい試料は分析から除外した。次いでスポットのカウントを、式:スポットカウント+2×(スポットカウント×コンフルエンス(%)/[100%−コンフルエンス(%)])を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。ネガティブペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによってネガティブバックグラウンドを補正した。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、100の位までの概数に端数を切り上げた。
新しく単離したリンパ球を2〜5×106細胞/mLの密度で10uMの示したペプチドと2時間インキュベートした。2時間後、ブレフェルジンAを5ug/mlの濃度にまで加え、細胞を刺激物質とさらに4時間インキュベートした。刺激後、生細胞を製造者のプロトコールにしたがって固定可能な生存率解析用色素eFluor780で標識し、抗CD8 APC(クローン53−6.7,BioLegend社)により1:400の希釈率で染色した。細胞内染色には抗IFNg PE(クローンXMG1.2,BioLegend社)を1:100で使用した。試料をAttune NxT Flow Cytometer(Thermo Scientific社)で収集した。FlowJoを使用してフローサイトメトリーデータをプロットし、分析を行った。抗原特異的応答の程度を評価するため、CD8+細胞のIFNg+の割合(%)及び全IFNg+細胞数/1×106個の生細胞の両方を、各ペプチド刺激物質に対して計算した。
新生抗原カセットの設計の評価の一例として、インビトロの細胞ベースのアッセイを開発し、モデルワクチンカセット内の選択されたヒトエピトープが抗原提示細胞によって発現、プロセシング、及び提示されるかどうかを評価した(図15)。認識後、特性がよく知られているペプチド−HLAの組み合わせに特異的な5種類のTCRのうちの1つを発現するように操作されたJurkat−LuciaレポーターT細胞が活性化され、活性化T細胞の核因子(NFAT)を核内に移行させると、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の転写が活性化される。個々のレポーターCD8 T細胞株の抗原刺激をバイオルミネッセンスによって定量した。
*エピトープ3のレポーターT細胞はまだ生成されていない。
インビトロT細胞活性化アッセイにおけるルシフェラーゼ誘導は、DPPベースのカセットと異なり、すべてのリンカーがカセット抗原の効率的な放出を促進したことを示した。T細胞エピトープのみ(リンカー無し)=9AA、片側に天然リンカー=17AA、両側に天然リンカー=25AA、非天然リンカー=AAY,RR,DPP
*エピトープ3のレポーターT細胞はまだ生成されていない。
インビトロT細胞活性化アッセイを用いることにより、4つのHLA−A*0201制限マーカーエピトープがモデルカセットから効率的に放出され、ターゲティング配列がT細胞の認識及び活性化を大幅に向上させないことが示された。
*エピトープ3のレポーターT細胞はまだ生成されていない。
新生抗原カセット設計の評価の別の例として、HLA−A*02:01に制限された形でCD8 T細胞を刺激することが知られている、特性がよく知られた5つのヒトクラスI MHCエピトープを含むようにワクチンカセットを設計した(図16A、17、19A)。それらのインビボ免疫原性の評価を行うため、これらのマーカーエピトープを含むワクチンカセットをアデノウイルスベクターに組み込み、HLA−A2トランスジェニックマウスに感染させるのに使用した(図18)。このマウスモデルは、ヒトHLA−A*0201及びマウスH2−Kbから一部が構成された導入遺伝子を保有しており、したがって、ヒトHLA−A2.1のリーダー、マウスα3に連結されたα1及びα2ドメイン、膜貫通及び細胞質H2−Kbドメインで構成されたキメラクラスI MHC分子をコードしている(Vitiello et al.,1991)。このキメラ分子は、HLA−A*02:01に制限された抗原提示を可能とする一方で、CD8共受容体とMHC上のα3ドメインとの種の一致した相互作用を維持する。
ELISPOTデータは、HLA−A2トランスジェニックマウスが1e11個のアデノウイルス粒子による感染17日後にカセット内のすべてのクラスI MHC制限エピトープに対してT細胞応答を生じたことを示した。
ELISPOTデータは、HLA−A2トランスジェニックマウスが5e10アデノウイルス粒子による感染17日後に長いワクチンカセット及び短いワクチンカセットの両方で同等の大きさのT細胞応答を生じたことを示した。
* 技術的なエラーによりT細胞応答が見られなかったと疑われる。
要約すると、モデルカセット評価による知見(図16〜19、表2〜6)によって、モデルワクチンカセットでは、アデノウイルスベースのベクターとの関連で約20個のエピトープをコードする「数珠つなぎ」アプローチを用いた場合に最適の免疫原性が得られることが実証された。エピトープは、両側にその天然の周辺ペプチド配列(例えば、両側に8個のアミノ酸残基)が隣接した最小のCD8 T細胞エピトープ(例えば、9個のアミノ酸残基)をそれぞれが埋め込んだ25マー配列を連結することによって最も効果的にアセンブルされる。本明細書において使用される場合、「天然」または「自然」のフランキング配列とは、その由来源タンパク質内のそのエピトープの天然に存在するという文脈で特定のエピトープのN末端及び/またはC末端側のフランキング配列のことを指す。例えば、HCMV pp65 MHC IエピトープNLVPMVATV(SEQ ID NO:128)は、その5’末端側に天然の5’配列WQAGILAR(SEQ ID NO:135)が、その3’末端側に天然の3’配列QGQNLKYQ(SEQ ID NO:136)が隣接し、それによりHCMV pp65由来源タンパク質内にみられるWQAGILARNLVPMVATVQGQNLKYQ(SEQ ID NO:137)という25マーペプチドを生成する。天然または自然の配列は、天然のフランキング配列(複数可)が隣接したエピトープをコードするヌクレオチド配列のことを指す場合もある。各25マー配列は、それに続く25マー配列に直接連結される。最小のCD8 T細胞エピトープがアミノ酸9個よりも大きいかまたは小さい場合、フランキングペプチドの長さは、全体の長さが依然25マーのペプチド配列となるように調節することができる。例えば、アミノ酸10個のCD8 T細胞エピトープには、アミノ酸8個とアミノ酸7個の配列を隣接させることができる。このコンカテマーの後には、CD4 Tヘルパー細胞を刺激し、ワクチンカセット抗原の全体のインビボ免疫原性を改善するため(Alexander et al.,1994;Panina−Bordignon et al.,1989)に含ませた2個のユニバーサルクラスII MHCエピトープを繋げた。これらのクラスIIエピトープは、GPGPGアミノ酸リンカー(SEQ ID NO:56)によって最後のクラスIエピトープに連結した。2個のクラスIIエピトープは、GPGPGアミノ酸リンカー(SEQ ID NO:56)によって互いに対しても連結し、さらにC末端側にGPGPGアミノ酸リンカー(SEQ ID NO:56)を連結させた。エピトープの位置もその数もT細胞の認識または応答に大きく影響しないことが示された。ターゲティング配列も、カセットに由来する抗原の免疫原性に大きく影響しないようであった。
XV.A.ChAd新生抗原カセット送達ベクターの構築
1つの例では、チンパンジーアデノウイルス(ChAd)を操作して新生抗原カセットの送達ベクターとした。さらなる例では、完全長ChAdV68ベクターを、AC_000011.1(米国特許第6083716号に記載のSEQ ID NO:2)に基づいて合成し、E1(nt457〜3014)及びE3(nt27,816〜31,332)配列を欠失させた。CMVプロモーター/エンハンサーの制御下にあるレポーター遺伝子を欠失させたE1配列の代わりに挿入した。このクローンをHEK293細胞にトランスフェクトしたところ、感染性のウイルスは生成されなかった。野生型C68ウイルスの配列を確認するため、単離VR−594をATCCより入手して継代した後、個々に配列決定した(SEQ ID NO:10)。AC_000011.1配列を野生型ChAdV68ウイルスのATCC VR−594配列(SEQ ID NO:10)と比較したところ、6個のヌクレオチドの相違が特定された。1つの例では、改変ChAdV68ベクターを、AC_000011.1に基づいて作製し、対応するATCC VR−594ヌクレオチドを5つの位置で置換した(ChAdV68.5WTnt SEQ ID NO:1)。
XV.B.1.ChAdベクターの評価方法及び材料
リポフェクタミンを用いたHEK293A細胞のトランスフェクション
ChAdV68コンストラクト(ChAdV68.4WTnt.GFP、ChAdV68.5WTnt.GFP、ChAdV68.4WTnt.MAG25マー、及びChAdV68.5WTnt.MAG25マー)のDNAを調製し、以下のプロトコールを用いてHEK293A細胞にトランスフェクトした。
ChAdV68コンストラクト(ChAdV68.4WTnt.GFP、ChAdV68.5WTnt.GFP、ChAdV68.4WTnt.MAG25マー、ChAdV68.5WTnt.MAG25マー)のDNAを調製し、以下のプロトコールを用いてHEK293A細胞にトランスフェクトした。
8%CO2のインキュベーター内の293FreeStyle(商標)(ThermoFisher社)培地中で増殖させた293F細胞内でChAdV68ウイルス生成を行った。感染の当日、細胞を生存率98%で1mL当たり106細胞に希釈し、1LのShakeフラスコ(Corning社)中、1回の生成操作当たり400mLを使用した。1回の感染当たり目標MOIが3.3よりも高い4mLの三次ウイルスストックを使用した。トリパンブルーによって測定される生存率が70%を下回るまで48〜72時間にわたって細胞をインキュベートした。次いで感染細胞をベンチトップ遠心分離器で最大速度で遠心して収穫し、1×PBS中で洗浄し、再び遠心してから20mLの10mM Tris pH7.4に再懸濁した。細胞ペレットを、凍結解凍を3回行って溶解し、4,300×gで5分間遠心して清澄化した。
ウイルスDNAをCsCl遠心分離により精製した。2つの不連続な勾配の操作を行った。第1の遠心は、細胞成分からウイルスを精製するためのもので、第2の遠心は、細胞成分からの分離物をさらに精製し、感染性粒子から機能不全粒子を分離するためのものである。
1.1×1012個のウイルス粒子(VP)の消光係数はOD260nmの吸光度の値=1に相当することに基づき、OD260アッセイを用いてVP濃縮を行った。アデノウイルスの2つの希釈度(1:5と1:10)をウイルス溶解バッファー(0.1%SDS,10mM Tris pH7.4,1mM EDTA)中で作った。両方の希釈度でODを2重に測定し、OD260値×希釈係数×1.1×1012VPを掛けることによりVP濃度/mLを測定した。
C57BL/6J系の雌性マウス及びBalb/c系の雌性マウスに、1×108個のChAdV68.5WTnt.MAG25マーのウイルス粒子(VP)を、100uL体積中で両側性の筋肉内注射(各脚50uL)により注射した。
各マウスの脾臓及びリンパ節を、3mLの完全RPMI(RPMI、10%FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン)中にプールした。gentleMACS組織解離装置(Miltenyi Biotec社)を製造者の指示にしたがって使用して、機械的解離を行った。解離した細胞を40ミクロンのフィルターに通して濾過し、赤血球をACK溶解バッファー(150mM NH4Cl,10mM KHCO3,0.1mM Na2EDTA)で溶解した。細胞を30ミクロンのフィルターに通して再び濾過した後、完全RPMI中に再懸濁した。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を使用してAttune NxTフローサイトメーター(Thermo Fisher社)でカウントした。次に、その後の分析用に細胞を適当な生細胞の濃度に調整した。
マウスIFNg ELISpotPLUSキット(MABTECH社)を使用し、ELISPOTハーモナイゼーションガイドライン{DOI: 10.1038/nprot.2015.068}にしたがってELISPOT分析を行った。5×104個の脾細胞を、96ウェルIFNg抗体コーティングプレート中で、10uMの示したペプチドと16時間インキュベートした。スポットをアルカリホスファターゼを用いて現像した。反応時間を10分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させた。スポットをAID vSpot Reader Spectrumを用いてカウントした。ELISPOT分析を行うため、飽和度が50%よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が10%よりも大きい試料は分析から除外した。次いでスポットのカウントを、式:スポットカウント+2×(スポットカウント×コンフルエンス(%)/[100%−コンフルエンス(%)])を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。ネガティブペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによってネガティブバックグラウンドを補正した。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、100の位までの概数に端数を切り上げた。
1つの例において、ChAdV68.4WTnt.GFP(図21)及びChAdV68.5WTnt.GFP(図22)のDNAを、HEK293A細胞にトランスフェクトし、ウイルス複製(ウイルスプラーク)をトランスフェクションの7〜10日後に観察した。ChAdV68ウイルスプラークを光学(図21A及び22A)及び蛍光顕微鏡法(図21B〜C、及び図22B〜C)を使用して可視化した。GFPは、増殖性ChAdV68ウイルス送達粒子の生成を示す。
1つの例において、ChAdV68.4WTnt.GFP、ChAdV68.5WTnt.GFP、及びChAdV68.5WTnt.MAG25マーウイルスをHEK293F細胞内で増殖させ、精製ウイルスストックをトランスフェクションの18日後に生成した(図23)。精製ChAdV68ウイルスストック中のウイルス粒子を定量し、同じプロトコールを使用して生成されたアデノウイルス5型(Ad5)及びChAdVY25(近縁のChAdV;Dicks,2012,PloS ONE7,e40385)ウイルスストックと比較した。ChAdV68ウイルス力価は、Ad5及びChAdVY25と同等であった(表7)。
マウス腫瘍抗原を発現するC68ベクターを、マウス免疫原性実験で評価して、C68ベクターがT細胞応答を誘発することを実証する。MHCクラスIエピトープSIINFEKL(SEQ ID NO:57)に対するT細胞応答C57BL/6J系雌性マウスで測定し、MHCクラスIエピトープAH1−A5(Slansky et al.,2000,Immunity13:529−538)に対するT細胞応答をBalb/c系マウスで測定した。図29に示されるように、ChAdV68.5WTnt.MAG25マーによるマウスの免疫後に強いT細胞応答が測定された。脾細胞106個当たり、8957個及び4019個のスポット形成細胞(SFC)の平均の細胞性免疫応答が、ELISpotアッセイにおいて、C57BL/6J系またはBalb/c系マウスをそれぞれChAdV68.5WTnt.MAG25マーで免疫した場合に免疫の10日後に観察された。
XVI.A.アルファウイルス送達ベクター評価の材料及び方法
RNAを生成するためのインビトロ転写
インビトロ試験を行うため、プラスミドDNAをPmeIによる制限消化によって直鎖状とし、カラムを製造者の指示にしたがって洗浄し(GeneJet DNA cleanup kit,Thermo社)、テンプレートとして使用した。RiboMAX Large Scale RNA production System(Promega社)をm7Gキャップアナログ(Promega)とともに製造者の指示にしがって使用してインビトロ転写を行った。RNeasy kit(Qiagen社)を製造者の指示にしがって使用してmRNAを精製した。
HEK293A細胞を、96ウェルのウェル当たり6e4細胞で、24ウェルのウェル当たり2e5細胞で、トランスフェクションの約16時間前に播種した。細胞にMessengerMAXリポフェクタミン(Invitrogen社)を製造者のプロトコールにしたがって使用してmRNAをトランスフェクションした。96ウェルでは、ウェル当たり0.15uLのリポフェクタミン及び10 ng のmRNAを使用し、24ウェルでは、ウェル当たり0.75uLのリポフェクタミン及び150ngのmRNAを使用した。GFPを発現するmRNA(TriLink Biotechnologies社)をトランスフェクションの対照として使用した。
ルシフェラーゼレポーターアッセイを、白い壁の96ウェルプレートで、ONE−Gloルシフェラーゼアッセイ(Promega社)を製造者のプロトコールにしたがって使用して各条件を三重にして行った。発光度をSpectraMaxを使用して測定した。
トランスフェクトした細胞をトランスフェクションの2時間後に新鮮な培地で洗い、新鮮な培地に交換してトランスフェクトしなかったmRNAをすべて除去した。次いで細胞を異なる時点でRLT plus lysis buffer(Qiagen社)中に収穫し、いずれも製造者のプロトコールにしたがってQiaShredder(Qiagen社)及びRNAを使用してホモジナイズし、RNeasy kit(Qiagen社)を使用して抽出した。Nanodrop(Thermo Scientific社)を使用して全RNAを定量した。製造者のプロトコールにしたがってqTower3 (Analytik Jena)でQuantitect Probe One−Step RT−PCR kit(Qiagen社)を使用し、反応当たり20ngの全RNAを使用してqRT−PCRを行った。各試料を各プローブについて三重に試験した。ActinまたはGusBを参照遺伝子として用いた。カスタムプライマー/プローブはIDT社により生成されたものである(表8)。
C57BL/6J系マウスの左下脇腹に105個のB16−OVA細胞/動物を注射した。腫瘍を免疫化の前、3日間にわたって増殖させた。
Balb/c系マウスの左下脇腹に106個/動物のCT26細胞を注射した。腫瘍を免疫化の前、7日間にわたって増殖させた。
srRNAワクチンについては、マウスに100uL体積中、10ugのRNAを、両側性に筋肉内注射(各脚50uL)により注射した。Ad5ワクチンについては、マウスに5×1010個のウイルス粒子(VP)を、100uL体積中で両側性に筋肉内注射(各脚50uL)により注射した。各動物に、抗CTLA−4(クローン9D9,BioXcell社)、抗PD−1(クローンRMP1−14,BioXcell社)、または抗IgG(クローンMPC−11,BioXcell社)を、用量250ugで、週2回、腹腔内注射により注射した。
各時点においてマウスに腹腔内注射により150mg/kgのルシフェリン基質を注射し、注射の10〜15分後にIVISインビボイメージングシステム(PerkinElmer社)を使用して生物発光を測定した。
各マウスの脾臓及びリンパ節を、3mLの完全RPMI(RPMI、10%FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン)中にプールした。gentleMACS組織解離装置(Miltenyi Biotec社)を製造者の指示にしたがって使用して、機械的解離を行った。解離した細胞を40ミクロンのフィルターに通して濾過し、赤血球をACK溶解バッファー(150mM NH4Cl,10mM KHCO3,0.1mM Na2EDTA)で溶解した。細胞を30ミクロンのフィルターに通して再び濾過した後、完全RPMI中に再懸濁した。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を使用してAttune NxTフローサイトメーター(Thermo Fisher社)でカウントした。次に、その後の分析用に細胞を適当な生細胞の濃度に調整した。
マウスIFNg ELISpotPLUSキット(MABTECH社)を使用し、ELISPOTハーモナイゼーションガイドライン{DOI: 10.1038/nprot.2015.068}にしたがってELISPOT分析を行った。5×104個の脾細胞を、96ウェルIFNg抗体コーティングプレート中で、10uMの示したペプチドと16時間インキュベートした。スポットをアルカリホスファターゼを用いて現像した。反応時間を10分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させた。スポットをAID vSpot Reader Spectrumを用いてカウントした。ELISPOT分析を行うため、飽和度が50%よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が10%よりも大きい試料は分析から除外した。次いでスポットのカウントを、式:スポットカウント+2×(スポットカウント×コンフルエンス(%)/[100%−コンフルエンス(%)])を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。ネガティブペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによってネガティブバックグラウンドを補正した。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、100の位までの概数に端数を切り上げた。
XVI.B.1.アルファウイルスベクターのインビトロ評価
本明細書の一実現形態では、新生抗原発現システム用のRNAアルファウイルス骨格を、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEE)(Venezuelan Equine Encephalitis(VEE)(Kinney,1986,Virology 152:400−413)ベースの自己複製RNA(srRNA)ベクターから生成した。1つの例では、26Sサブゲノムプロモーターの3’側に位置するVEEの構造タンパク質をコードする配列を欠失させ(VEE配列の7544〜11,175を欠失させた。番号付けはKinney et al 1986に基づく。SEQ ID NO:6)、抗原配列(SEQ ID NO:14及びSEQ ID NO:4)またはルシフェラーゼレポーター(例えばVEE−ルシフェラーゼ、SEQ ID NO:15)に置き換えた(図24)。RNAをインビトロでsrRNA DNAベクターから転写させ、HEK293A細胞にトランスフェクトしてルシフェラーゼレポーターの発現を測定した。さらに、ルシフェラーゼをコードする(非複製)mRNAを比較のためにトランスフェクトした。VEE−ルシフェラーゼのsrRNAでは、2時間の測定値を23時間の測定値と比較した場合にsrRNAレポーターシグナルの約30,000倍の増大が観察された(表9)。これに対して、同じ時間でのmRNAレポーターのシグナルの増大は10倍未満であった(表9)。
96ウェル中、ウェル当たり10ngのVEE−ルシフェラーゼsrRNAまたは10ngの非複製ルシフェラーゼmRNA(TriLink L−6307)をHEK293A細胞にトランスフェクトした。トランスフェクト後の異なる時点で発光を測定した。ルシフェラーゼ発現を相対発光単位(RLU)として報告する。各データポイントは、3つのトランスフェクトしたウェルの平均±SDである。
HEK293A細胞にVEE−ルシフェラーゼsrRNAをトランスフェクトし(24ウェルのウェル当たり150ng)、トランスフェクション後の異なる時間にqRT−PCRによりRNAレベルを定量した。各測定値はアクチン参照遺伝子に対して正規化し、2時間の時点に対する変化倍率を示す。
HEK293細胞にVEE−MAG25マーsrRNAをトランスフェクトし(24ウェルのウェル当たり150ng)、トランスフェクション後の異なる時間にqRT−PCRによりRNAレベルを定量した。各測定値はGusB参照遺伝子に対して正規化し、2時間の時点に対する変化倍率を示す。グラフ上の異なる線は、いずれもsrRNAのエピトープカセット領域を検出する2つの異なるqPCRプライマー/プローブのセットを表す。
別の例において、VEE−ルシフェラーゼレポーターの発現をインビボで評価した。マウスに、脂質ナノ粒子(MC3)に封入された10ugのVEE−ルシフェラーゼsrRNAを注射し、注射の24及び48時間後、ならびに7及び14日後に撮影して生物発光シグナルを測定した。ルシフェラーゼシグナルが注射の24時間後に検出され、時間とともに増大し、srRNA注射の7日後にピークとなった(図25)。
1つの実現形態において、VEE srRNAベクターがインビボで抗原特異的免疫応答を誘導するかを調べるため、2つの異なるMHCクラスIマウス腫瘍エピトープであるSIINFEKL(SEQ ID NO:57)及びAH1−A5(Slansky et al.,2000,Immunity 13:529−538)を発現するVEE srRNAベクターを作製した(VEE−UbAAY,SEQ ID NO:14)。SFL(SIINFEKL(SEQ ID NO:57))エピトープは、B16−OVAメラノーマ細胞株によって発現され、AH1−A5(SPSYAYHQF(SEQ ID NO:58);Slansky et al.,2000,Immunity)エピトープは、CT26結腸癌細胞株によって発現される関連エピトープを標的とするT細胞を誘導する(AH1/SPSYVYHQF(SEQ ID NO:153);Huang et al.,1996,Proc Natl Acad Sci USA 93:9730−9735)。1つの例では、インビボ実験において、VEE−UbAAY srRNA が、T7ポリメラーゼ(TriLink Biotechnologies)を使用したインビトロ転写によって生成され、脂質ナノ粒子(MC3)に封入された。
*Vaxグループのマウス#6からの結果は、三重のウェル間のばらつきが大きいことから分析から除外した。
ChAdV68及び自己複製RNA(srRNA)を用いた異なる投与プロトコールを、マウスCT26腫瘍モデルで評価した。
腫瘍の注入
Balb/c系マウスにCT26細胞株を注射した。腫瘍細胞注射の7日後にマウスを異なる実験アーム(各グループ当たりマウス28〜40匹)をランダムカセット配列し、処置を開始した。Balb/c系マウスの左下脇腹に106個/動物のCT26細胞を注射した。腫瘍を免疫化の前、7日間にわたって増殖させた。各実験アームは表15に詳細に記載したとおりである。
srRNAワクチンについては、マウスに100uL体積中、10ugのVEE−MAG25マーsrRNAを、両側性に筋肉内注射(各脚50uL)により注射した。C68ワクチンについては、マウスに1×1011個のChAdV68.5WTnt.MAG25マーのウイルス粒子(VP)を、100uL体積中で両側性に筋肉内注射(各脚50uL)により注射した。各動物に、抗PD−1(クローンRMP1−14,BioXcell社)、または抗IgG(クローンMPC−11,BioXcell社)を、用量250ugで、週2回、腹腔内注射により注射した。
各マウスの脾臓及びリンパ節を、3mLの完全RPMI(RPMI、10%FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン)中にプールした。gentleMACS組織解離装置(Miltenyi Biotec社)を製造者の指示にしたがって使用して、機械的解離を行った。解離した細胞を40ミクロンのフィルターに通して濾過し、赤血球をACK溶解バッファー(150mM NH4Cl,10mM KHCO3,0.1mM Na2EDTA)で溶解した。細胞を30ミクロンのフィルターに通して再び濾過した後、完全RPMI中に再懸濁した。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を使用してAttune NxTフローサイトメーター(Thermo Fisher社)でカウントした。次に、その後の分析用に細胞を適当な生細胞の濃度に調整した。
マウスIFNg ELISpotPLUSキット(MABTECH社)を使用し、ELISPOTハーモナイゼーションガイドライン{DOI: 10.1038/nprot.2015.068}にしたがってELISPOT分析を行った。5×104個の脾細胞を、96ウェルIFNg抗体コーティングプレート中で、10uMの示したペプチドと16時間インキュベートした。スポットをアルカリホスファターゼを用いて現像した。反応時間を10分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させた。スポットをAID vSpot Reader Spectrumを用いてカウントした。ELISPOT分析を行うため、飽和度が50%よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が10%よりも大きい試料は分析から除外した。次いでスポットのカウントを、式:スポットカウント+2×(スポットカウント×コンフルエンス(%)/[100%−コンフルエンス(%)])を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。ネガティブペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによってネガティブバックグラウンドを補正した。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、100の位までの概数に端数を切り上げた。
ChAdV68.5WTnt.MAG25マー/VEE−MAG25マーsrRNAの異種プライム/ブースト、またはVEE−MAG25マーsrRNAの同種プライム/ブーストワクチンの免疫原性及び有効性をCT26マウス腫瘍モデルで評価した。Balb/c系マウスにCT26細胞株を注射した。腫瘍細胞注射の7日後にマウスを異なる実験アームをランダムカセット配列し、処置を開始した。各実験アームは表15に詳細に、また表16により一般的に記載したとおりである。
ChAdV68及び自己複製RNA(srRNA)を用いた異なる投与プロトコールを、非ヒト霊長類(NHP)で評価した。
免疫化
プライミングワクチンを各NHPで筋肉内に注射して実験を開始した(ワクチンプライム)。Mamu A01インドアカゲザルを、LNP−1またはLNP−2中で配合した1×1012個のウイルス粒子(注射1回当たり5×1011個のウイルス粒子)のChAdV68.5WTnt.MAG25マー、30ugのVEE−MAG25マーsrRNA、100ugのVEE−MAG25マーsrRNA、または300ugのVEE−MAG25マーsrRNAで両側性に免疫した。30ug、100ugまたは300ugのVEE−MAG25マー srRNAワクチンブーストをプライムワクチン接種の4週間後に筋肉内投与した。更なる実験アームにおいて、30ug、100ugまたは300ugのVEE−MAG25マーsrRNAワクチンを第2のブーストとして最初のプライムワクチン接種の8週間後に筋肉内投与する。抗CTLA−4を、ワクチン免疫部位の近くに皮下投与するか、または特定のグループに静脈内投与した。用量当たり両側注射を、表21及び23に示したグループにしたがって投与した。
PBMCを、プライムワクチン接種の7、14、28、または35日後にLymphocyte Separation Medium(LSM,MP Biomedicals社)及びLeucoSep分離チューブ(Greiner Bio−One社)を使用して単離し、10%FBS及びペニシリン/ストレプトマイシンを含んだRPMIに再懸濁した。細胞を、死細胞及びアポトーシス細胞を除外するためのヨウ化プロピジウム染色を使用してAttune NxTフローサイトメーター(Thermo Fisher社)でカウントした。次に、その後の分析用に細胞を適当な生細胞の濃度に調整した。実験に用いたそれぞれのサルについて、ELISpotまたはフローサイトメトリー法を用いてT細胞応答を測定した。ワクチンにコードされた6種類の異なるアカゲザルMamu−A*01クラスIエピトープに対するT細胞応答を、ELISpot(ex vivo enzyme−linked immunospot)(エクスビボ酵素結合免疫スポット)分析を用いてIFN−γなどのサイトカインの誘導を測定することにより、PBMCから観測した。サルIFNg ELISpotPLUSキット(MABTECH社)を使用し、ELISPOTハーモナイゼーションガイドライン{DOI: 10.1038/nprot.2015.068}にしたがってELISpot分析を行った。200,000個のPBMCを、96ウェルIFNg抗体コーティングプレート中で、10uMの示したペプチドと16時間インキュベートした。スポットをアルカリホスファターゼを用いて現像した。反応時間を10分間計り、プレートに水道水を流して反応を停止させた。スポットをAID vSpot Reader Spectrumを用いてカウントした。ELISPOT分析を行うため、飽和度が50%よりも高いウェルを「多すぎてカウント不能」として記録した。複製ウェルの偏差が10%よりも大きい試料は分析から除外した。次に、スポットのカウントを、式:スポットカウント+2×(スポットカウント×コンフルエンス(%)/[100%−コンフルエンス(%)])を用いてウェルのコンフルエンシーについて補正した。ネガティブペプチド刺激ウェル中のスポットカウントを抗原刺激したウェルから引くことによってネガティブバックグラウンドを補正した。最後に、多すぎてカウント不能として示したウェルを、最も高い観察された補正値に設定し、100の位までの概数に端数を切り上げた。
この実験は、(a)ChAdV68.5WTnt.MAG25マープライミング免疫化に続いて、VEE−MAG25マーsrRNAの用量100μgによる異種プライム/ブーストの組み合わせの免疫原性及び予備的安全性を評価し、(b)ChAdV68.5WTnt.MAG25マー/VEE−MAG25マーsrRNAのプライム/ブーストの組み合わせに対するT細胞応答の速度論を評価するように設計した。この実験アームは、免疫原性を実証するためにmamu A01インドアカゲザルで行った。この実験で使用される選択抗原は、アカゲザル、具体的にはmamu A*01 MHCクラスIハプロタイプを有するものにおいてのみ認識される。mamu A01インドアカゲザルを異なる実験アーム(各グループ6匹のアカゲザル)にランダム化し、複数のmamu A01制限エピトープを含むモデル抗原をコードしたChAdV68.5WTnt.MAG25マーまたはVEE−MAG25マーsrRNAベクターのいずれかを筋肉内注射により投与した。各実験アームは表21に記載したとおりである。
この実験は、ワクチン誘導免疫応答に対する抗CTLA4の投与経路の影響を評価する(例えば、全身(IV)投与に対してワクチン流入領域リンパ節に近接した位置における抗CTLA4の局所(SC)投与を比較する)ように設計されたものである。この実験アームを、免疫原性を実証するためにmamu A01インドアカゲザルで行った。アカゲザルなどの非ヒト霊長類におけるワクチン免疫原性は、ヒトにおけるワクチン効力の最良の予測因子である。さらに、この実験で使用される選択抗原は、アカゲザル、具体的にはmamu A*01 MHCクラスIハプロタイプを有するものにおいてのみ認識される。mamu A01インドアカゲザルを異なる実験アーム(各グループ6匹のアカゲザル)にランダム化し、複数のmamu A01制限抗原を含むモデル抗原をコードしたChAdV68.5WTnt.MAG25マーを筋肉内注射により投与した。抗CTLA−4を、ワクチン免疫部位の近くに皮下投与するか、または特定のグループに静脈内投与した。各実験アームは表23に記載したとおりである。
前記対象の前記腫瘍細胞からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも1つを取得する工程であって、前記腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータが、新生抗原のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられ、各新生抗原のペプチド配列が、前記ペプチド配列を対応する野生型の親ペプチド配列とは異なるものにする少なくとも1つの変化を含む、工程と、
各新生抗原のペプチド配列を1つ以上の提示モデルに入力して、前記新生抗原のそれぞれが前記対象の前記腫瘍細胞の前記腫瘍細胞表面上の1つ以上のMHCアレルによって提示される数値的可能性のセットを生成する工程であって、前記数値的可能性のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて特定されたものである、工程と、
前記新生抗原のセットのサブセットを、前記数値的可能性のセットに基づいて選択することで、選択された新生抗原のセットを生成する工程と
を含む方法を開示する。
MHCアレルのうちの特定の1つとペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸とのペアの存在と、
前記ペアの前記MHCアレルのうちの特定の1つによる、前記特定の位置に前記特定のアミノ酸を含むそのようなペプチド配列の腫瘍細胞表面上での提示の可能性と
の間の依存性を表す。
前記1つ以上の提示モデルを、対応する新生抗原のペプチド配列に適用することによって、前記1つ以上のMHCアレルのそれぞれについて、前記対応する新生抗原のペプチド配列のアミノ酸の少なくとも位置に基づいて、前記MHCアレルが前記対応する新生抗原を提示するかどうかを示す依存性スコアを生成すること
を含む。
前記依存性スコアを変換することによって、各MHCアレルについて、前記対応するMHCアレルが前記対応する新生抗原を提示する可能性を示す対応するアレル当たりの可能性を生成することと、
前記アレル当たりの可能性を組み合わせて前記数値的可能性を生成することと
をさらに含む。
前記依存性スコアの組み合わせを変換して前記数値的可能性を生成すること
を含む。
前記アレル非相互作用特性に基づいて、対応する新生抗原のペプチド配列が提示されるかどうかを示す、前記アレル非相互作用特性についての依存性スコアを生成するために、1つ以上の提示モデルのうちのアレル非相互作用モデルを前記アレル非相互作用特性に適用することを含む。
1つ以上のMHCアレルの各MHCアレルについての前記依存性スコアを、前記アレル非相互作用特性についての依存性スコアと組み合わせることと、
前記対応するMHCアレルが前記対応する新生抗原を提示する可能性を示す、前記MHCアレルについての対応するアレル当たりの可能性を生成するために、各MHCアレルについての前記組み合わされた依存性スコアを変換することと、
前記アレル当たりの可能性を組み合わせて前記数値的可能性を生成することと
をさらに含む。
前記MHCアレルの各々についての依存性スコアと、前記アレル非相互作用特性についての依存性スコアとの組み合わせを変換することにより、前記数値的可能性を生成すること
を含む。
前記試料中に存在する前記訓練ペプチドのセットのペプチド存在量;
前記試料中の前記訓練ペプチドのセットのペプチド長
に関連するデータをさらに含む。
a.MHCアレルと新生抗原コード化ペプチドとが結合する予測親和性;
b.新生抗原コード化ペプチド−MHC複合体の予測安定性;
c.新生抗原コード化ペプチドの配列及び長さ;
d.質量分析プロテオミクスまたは他の手段によって評価される、特定のMHCアレルを発現する他の個体由来の細胞の類似した配列を有する新生抗原コード化ペプチドの提示の確率;
e.対象とされる対象の特定のMHCアレルの発現レベル(例えば、RNA−seqまたは質量分析によって測定される);
f.特定のMHCアレルを発現する他の別個の個体における、特定のMHCアレルによる提示の、全体的な新生抗原コード化ペプチド配列とは独立した確率;
g.他の別個の対象における、同じ分子のファミリー(例えば、HLA−A、HLA−B、HLA−C、HLA−DQ、HLA−DR、HLA−DP)のMHCアレルによる提示の、全体的な新生抗原コード化ペプチド配列とは独立した確率。
a.その由来源タンパク質配列内の、新生抗原コード化ペプチドに隣接するC末端及びN末端配列;
b.任意で、腫瘍細胞内の対応するプロテアーゼの発現(RNA−seqまたは質量分析によって測定される)にしたがって重み付けされる、新生抗原コード化ペプチド内のプロテアーゼ切断モチーフの存在;
c.適切な細胞タイプにおいて測定される由来源タンパク質の代謝回転速度;
d.RNA−seqもしくはプロテオーム質量分析によって測定される、または、DNAもしくはRNA配列データにおいて検出される生殖細胞系列もしくは体細胞系列スプライシング変異のアノテーションから予測される、腫瘍細胞に最も高発現している特定のスプライスバリアント(「アイソフォーム」)を任意で考慮した、由来源タンパク質の長さ;
e.腫瘍細胞におけるプロテアソーム、イムノプロテアソーム、胸腺プロテアソーム、または他のプロテアーゼの発現のレベル(RNA−seq、プロテオーム質量分析、または免疫組織化学によって測定することができる);
f.新生抗原コード化ペプチドの由来源遺伝子の発現(例えば、RNA−seqまたは質量分析によって測定される);
g.細胞周期の異なる段階における新生抗原コード化ペプチドの由来源遺伝子の典型的な組織特異的発現;
h.例えば、uniProtまたはPDB http://www.rcsb.org/pdb/home/home.doにみることができるような、由来源タンパク質及び/またはそのドメインの特性の包括的なカタログ;
i.ペプチドを含む由来源タンパク質のドメインの性質を説明する特性、例えば、二次構造または三次構造(例えば、βシートに対するαヘリックス);選択的スプライシング;
j.他の別個の対象における、対象とされる新生抗原コード化ペプチドの由来源タンパク質に由来するペプチドの提示の確率;
k.ペプチドが、技術的バイアスのために質量分析によって検出されないか、または過剰に表現される確率;
l.腫瘍細胞、間質、または腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の状態について情報を与える、RNASeqによって測定される、種々の遺伝子モジュール/経路の発現(ペプチドの由来源タンパク質を含む必要はない);
m.腫瘍細胞内の新生抗原コード化ペプチドの由来源遺伝子のコピー数;
n.ペプチドがTAPに結合する確率、またはTAPに対するペプチドの測定または予測される結合親和性;
o.腫瘍細胞におけるTAPの発現レベル(RNA−seq、プロテオーム質量分析、免疫組織化学によって測定することができる);
p.以下を含むがただしこれらに限定されない、腫瘍変異の有無:
i.EGFR、KRAS、ALK、RET、ROS1、TP53、CDKN2A、CDKN2B、NTRK1、NTRK2、NTRK3などの公知のがんドライバー遺伝子におけるドライバー変異、
ii.抗原提示マシナリーに関与するタンパク質をコードする遺伝子(例えば、B2M、HLA−A、HLA−B、HLA−C、TAP−1、TAP−2、TAPBP、CALR、CNX、ERP57、HLA−DM、HLA−DMA、HLA−DMB、HLA−DO、HLA−DOA、HLA−DOBHLA−DP、HLA−DPA1、HLA−DPB1、HLA−DQ、HLA−DQA1、HLA−DQA2、HLA−DQB1、HLA−DQB2、HLA−DR、HLA−DRA、HLA−DRB1、HLA−DRB3、HLA−DRB4、HLA−DRB5、または、プロテアソームもしくはイムノプロテアソームの構成要素をコードする遺伝子のいずれか)における変異;その提示が、腫瘍において機能喪失変異を生ずる抗原提示マシナリーの構成要素に依存するペプチドは、提示の確率が低い;
q.以下を含むがただしこれらに限定されない、機能的生殖細胞系列多型の有無:
i.抗原提示マシナリーに関与するタンパク質をコードする遺伝子(例えば、B2M、HLA−A、HLA−B、HLA−C、TAP−1、TAP−2、TAPBP、CALR、CNX、ERP57、HLA−DM、HLA−DMA、HLA−DMB、HLA−DO、HLA−DOA、HLA−DOBHLA−DP、HLA−DPA1、HLA−DPB1、HLA−DQ、HLA−DQA1、HLA−DQA2、HLA−DQB1、HLA−DQB2、HLA−DR、HLA−DRA、HLA−DRB1、HLA−DRB3、HLA−DRB4、HLA−DRB5、または、プロテアソームもしくはイムノプロテアソームの構成要素をコードする遺伝子のいずれか)における多型;
r.腫瘍タイプ(例えば、NSCLC、メラノーマ);
s.臨床的腫瘍サブタイプ(例えば、扁平上皮肺癌対非扁平上皮);
t.喫煙歴;
u.任意で、ドライバー変異によって層別化される、関連する腫瘍タイプまたは臨床的サブタイプにおけるペプチドの由来源遺伝子の典型的な発現。
複数の試料に由来する主要組織適合性複合体(MHC)から溶出された複数の単離ペプチドに関連するデータを含む質量分析データを受け取る工程と、
前記試料中に存在する訓練ペプチド配列のセット及び各訓練ペプチド配列に関連する1つ以上のMHCを少なくとも特定することにより、訓練データセットを取得する工程と、
前記訓練ペプチド配列を含む訓練データセットを用いて、提示モデルの数値的パラメータのセットを訓練する工程であって、前記提示モデルが、前記腫瘍細胞表面上の1つ以上のMHCアレルによって前記腫瘍細胞由来のペプチド配列が提示される複数の数値的可能性を与える、工程と
を実行することを含む方法も開示される。
ペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸の存在と、
前記特定の位置に前記特定のアミノ酸を有する前記ペプチド配列の、前記腫瘍細胞上のMHCアレルのうちの1つによる提示の可能性と
の間の依存性を表す。
前記試料中に存在する前記訓練ペプチドのセットのペプチド存在量;
前記試料中の前記訓練ペプチドのセットのペプチド長
に関連するデータをさらに含む。
既知のタンパク質配列のセットを含むデータベースとのアラインメントにより訓練ペプチド配列のセットを比較することによって、前記訓練ペプチド配列に基づいて、前記訓練ペプチド配列よりも長くかつ前記訓練ペプチド配列を含む前記訓練タンパク質配列のセットを取得することを含む。
細胞株からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムのヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも1つを取得するために、細胞株に対して質量分析を行うかまたは質量分析がこれまでに行われていることを含んでもよく、前記ヌクレオチドシークエンシングデータは、変異を含む少なくとも1つのタンパク質配列を含む。
ワン・ホット(one−hot)エンコーディングスキームを用いて前記訓練ペプチド配列をコードすることを含む。
正常組織試料からエクソーム、トランスクリプトーム、及び全ゲノムの正常ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも1つを取得することと、
前記正常ヌクレオチドシークエンシングデータを用いて、前記提示モデルの前記パラメータのセットを訓練することと
を含む。
前記パラメータのセットのロジスティック回帰を行うことを含む。
レフトパディング(left−padded)ワン・ホットエンコーディングスキームを用いて前記訓練ペプチド配列をコードすることを含む。
ディープラーニングアルゴリズムを用いて前記パラメータのセットについて値を決定することを含む。
複数の新鮮なまたは凍結腫瘍試料に由来する主要組織適合性複合体(MHC)から溶出された複数の単離ペプチドに関連するデータを含む質量分析データを受け取る工程と、
前記腫瘍試料中に存在し、各訓練ペプチド配列に関連する1つ以上のMHCアレル上に提示される訓練ペプチド配列のセットを少なくとも特定することにより、訓練データセットを取得する工程と、
前記訓練ペプチド配列に基づいて、訓練タンパク質配列のセットを取得する工程と、
前記訓練タンパク質配列及び前記訓練ペプチド配列を用いて、提示モデルの数値的パラメータのセットを訓練する工程であって、前記提示モデルが、前記腫瘍細胞表面上の1つ以上のMHCアレルによって前記腫瘍細胞由来のペプチド配列が提示される複数の数値的可能性を与える、工程と
を含む方法が開示される。
MHCアレルのうちの特定の1つとペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸とのペアの存在と、
前記ペアの前記MHCアレルのうちの特定の1つによる、前記特定の位置に前記特定のアミノ酸を含むそのようなペプチド配列の腫瘍細胞表面上での提示の可能性と
の間の依存性を表す。
Claims (94)
- 新生抗原カセットを含むチンパンジーアデノウイルスベクターであって、前記新生抗原カセットが、
(1)対象内に存在する腫瘍に由来する、複数の新生抗原コード核酸配列であって、
a.コードされたペプチド配列を、野生型核酸配列によってコードされる対応するペプチド配列とは異なるものにする少なくとも1つの変化を有するMHCクラスIエピトープコード核酸配列と、
b.任意で5’リンカー配列と、
c.任意で3’リンカー配列と
をそれぞれが含む、少なくとも2個の腫瘍特異的及び対象特異的MHCクラスI新生抗原コード核酸配列
を含む、前記複数の新生抗原コード核酸配列と、
(2)前記複数の新生抗原コード核酸のうちの少なくとも1つの配列に機能的に連結された少なくとも1つのプロモーター配列と、
(3)任意で、少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列と、
(4)任意で、少なくとも1つのGPGPGリンカー配列(SEQ ID NO:56)と、
(5)任意で、少なくとも1つのポリアデニル化配列と
を含む、前記チンパンジーアデノウイルスベクター。 - a.E1(nt577〜3403)欠失及びE3(nt27,125〜31,825)欠失を有するSEQ ID NO:1の配列を含む改変ChAdV68配列と、
b.CMVプロモーター配列と、
c.SV40ポリアデニル化シグナルヌクレオチド配列と、
d.新生抗原カセットであって、
(1)対象内に存在する腫瘍に由来する、複数の新生抗原コード核酸配列であって、前記複数の新生抗原コード核酸配列が、互いに直鎖状に連結された少なくとも20個の腫瘍特異的及び対象特異的MHCクラスI新生抗原コード核酸配列を含み、各腫瘍特異的及び対象特異的MHCクラスI新生抗原コード核酸配列が、
(A)コードされたペプチド配列を、野生型核酸配列によってコードされる対応するペプチド配列とは異なるものにする少なくとも1つの変化を有し、アミノ酸7〜15個の長さのMHCクラスIエピトープをコードする、MHCクラスIエピトープコード核酸配列と、
(B)前記MHC Iエピトープの天然の5’核酸配列であり、少なくともアミノ酸5個の長さであるペプチドをコードする、5’リンカー配列と、
(C)前記MHC Iエピトープの天然の3’核酸配列であり、少なくともアミノ酸5個の長さであるペプチドをコードする、3’リンカー配列と
を含み、
ここで、前記MHCクラスI新生抗原コード核酸配列のそれぞれが、アミノ酸25個の長さのポリペプチドをコードし、前記各MHCクラスI新生抗原コード核酸配列のそれぞれの3’末端が、前記複数の新生抗原コード核酸内の最後のMHCクラスI新生抗原コード核酸配列を除いて次のMHCクラスI新生抗原コード核酸配列の5’末端に連結されている、
前記複数の新生抗原コード核酸と、
(2)少なくとも2個のMHCクラスII抗原コード核酸配列であって、
(A)PADRE MHCクラスII配列(SEQ ID NO:48)と、
(B)破傷風トキソイドMHCクラスII配列(SEQ ID NO:46)と、
(C)前記PADRE MHCクラスII配列と前記破傷風トキソイドMHCクラスII配列とを連結する第1のGPGPGリンカー配列と、
(D)前記少なくとも2個のMHCクラスII抗原コード核酸配列の5’末端を、前記複数の新生抗原コード核酸配列に連結する第2のGPGPGリンカー配列と、
(E)前記少なくとも2個のMHCクラスII抗原コード核酸配列の3’末端をSV40ポリアデニル化シグナルヌクレオチド配列に連結する第3のGPGPGリンカー配列と
を含む、前記少なくとも2個のMHCクラスII抗原コード核酸配列と
を含む、前記新生抗原カセットと
を含むチンパンジーアデノウイルスベクターであって、
前記新生抗原カセットが前記E1欠失内に挿入され、前記CMVプロモーター配列が前記新生抗原カセットに機能的に連結されている、
前記チンパンジーアデノウイルスベクター。 - 前記ベクターの各要素の順序付けられた配列が、5’から3’に向かって、
Pa−(L5b−Nc−L3d)X−(G5e−Uf)Y−G3g−Ah
を含む式で示され、
式中、Pは、前記複数の新生抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つの配列に機能的に連結された少なくとも1つのプロモーター配列を含み、ここでa=1であり、
Nは、コードされたペプチド配列を、野生型核酸配列によってコードされる対応するペプチド配列とは異なるものにする少なくとも1つの変化を有するMHCクラスIエピトープコード核酸配列のうちの1つを含み、ここでc=1であり、
L5は、前記5’リンカー配列を含み、ここでb=0または1であり、
L3は、前記3’リンカー配列を含み、ここでd=0または1であり、
G5は、前記少なくとも1つのGPGPGリンカー配列のうちの1つを含み、ここでe=0または1であり、
G3は、前記少なくとも1つのGPGPGリンカー配列のうちの1つを含み、ここでg=0または1であり、
Uは、前記少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列のうちの1つを含み、ここでf=1であり、
Aは、前記少なくとも1つのポリアデニル化配列を含み、ここでh=0または1であり、
X=2〜400であり、ただし各Xについて、対応するNcは、異なるMHCクラスIエピトープコード核酸配列であり、
Y=0〜2であり、ここで各Yについて、対応するUfは、MHCクラスII抗原コード核酸配列である、
請求項1に記載のベクター。 - b=1、d=1、e=1、g=1、h=1、X=20、Y=2であり、
Pは、CMVプロモーター配列であり、
各Nは、アミノ酸7〜15個の長さのMHCクラスIエピトープをコードし、
L5は、前記MHC Iエピトープの天然の5’核酸配列であり、前記5’リンカー配列が、少なくともアミノ酸5個の長さであるペプチドをコードし、
L3は、前記MHC Iエピトープの天然の3’核酸配列であり、前記3’リンカー配列が、少なくともアミノ酸5個の長さであるペプチドをコードし、
Uは、PADREクラスII配列及び破傷風トキソイドMHCクラスII配列のそれぞれであり、
前記チンパンジーアデノウイルスベクターは、E1(nt577〜3403)欠失及びE3(nt27,125〜31,825)欠失を有するSEQ ID NO:1の配列を含む改変ChAdV68配列を含み、前記新生抗原カセットが前記E1欠失内に挿入されており、
前記MHCクラスI新生抗原コード核酸配列のそれぞれが、アミノ酸25個の長さのポリペプチドをコードしている、
請求項3に記載のベクター。 - 前記複数の新生抗原コード核酸配列における新生抗原コード核酸配列のうちの少なくとも1つが、前記腫瘍細胞表面上のMHCクラスIによって提示されるポリペプチド配列またはその一部をコードしている、請求項1に記載のベクター。
- 前記複数の新生抗原コード核酸配列内の各抗原コード核酸配列が互いに直接連結されている、請求項2または4を除く先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記複数の新生抗原コード核酸配列内の少なくとも1つの抗原コード核酸配列が、リンカーによって前記複数の新生抗原コード核酸配列内の異なる抗原コード核酸配列に連結されている、請求項2または4を除く先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記リンカーが、2個のMHCクラスI配列または1個のMHCクラスI配列を1個のに連結する、請求項7に記載のベクター。
- 前記リンカーが、
(1)少なくとも残基2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の長さの連続したグリシン残基、
(2)少なくとも残基2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の長さの連続したアラニン残基、
(3)2個のアルギニン残基(RR)、
(4)アラニン、アラニン、チロシン(AAY)、
(5)哺乳動物プロテアソームによって効率的にプロセシングされる、少なくともアミノ酸残基2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の長さのコンセンサス配列、及び
(6)元のタンパク質と同種のタンパク質に由来する抗原に隣接し、少なくともアミノ酸残基2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、または2〜20個の長さの1つ以上の天然配列
からなる群から選択される、請求項8に記載のベクター。 - 前記リンカーが、2個のMHCクラスII配列または1個のMHCクラスII配列をMHCクラスI配列に連結する、請求項7に記載のベクター。
- 前記リンカーが、配列GPGPGを含む、請求項10に記載のベクター。
- 前記複数の新生抗原コード核酸配列の発現、安定性、細胞トラフィッキング、プロセッシング及び提示、ならびに/または免疫原性を高める、分離したまたは連続した配列に、前記複数の新生抗原コード核酸配列内の少なくとも1つの配列が機能的または直接的に連結されている、請求項2または4を除く先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記分離したまたは連続した配列が、ユビキチン配列、プロテアソームターゲティング性を高めるように改変されたユビキチン配列(例えば、76位にGlyからAlaへの置換を含むユビキチン配列)、免疫グロブリンシグナル配列(例えばIgK)、主要組織適合性クラスI配列、リソソーム膜タンパク質(LAMP)−1、ヒト樹状細胞リソソーム膜タンパク質、及び主要組織適合性クラスII配列のうちの少なくとも1つを含み、任意で、プロテアソームターゲティング性を高めるように改変された前記ユビキチン配列がA76である、請求項12に記載のベクター。
- 前記複数の新生抗原コード核酸配列内の前記新生抗原コード核酸配列の少なくとも1つが、翻訳後の対応する野生型核酸配列と比べて、その対応するMHCアレルに対する増大した結合親和性を有するポリペプチド配列またはその一部をコードする、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記複数の新生抗原コード核酸配列内の前記新生抗原コード核酸配列の少なくとも1つが、翻訳後の対応する野生型核酸配列と比べて、その対応するMHCアレルに対する増大した結合安定性を有するポリペプチド配列またはその一部をコードする、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記複数の新生抗原コード核酸配列内の前記新生抗原コード核酸配列の少なくとも1つが、翻訳後の対応する野生型核酸配列と比べて、その対応するMHCアレル上への増大した提示の可能性を有するポリペプチド配列またはその一部をコードする、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記少なくとも1つの変化が、点変異、フレームシフト変異、非フレームシフト変異、欠失変異、挿入変異、スプライスバリアント、ゲノム再編成、またはプロテアソームにより生成されたスプライシングされた抗原を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記腫瘍が、肺癌、メラノーマ、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、胃癌、結腸癌、精巣癌、頭頸部癌、膵臓癌、脳癌、B細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、T細胞リンパ球性白血病、非小細胞肺癌、及び小細胞肺癌からなる群から選択される、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記複数の新生抗原コード核酸配列内の各配列の発現が、前記少なくとも1つのプロモーターによって誘導される、請求項2または4を除く先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記複数の新生抗原コード核酸配列が、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の核酸配列を含む、請求項2または4を除く先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記複数の新生抗原コード核酸配列が、少なくとも11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、または最大400個の核酸配列を含む、請求項2または4を除く先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記複数の新生抗原コード核酸配列が少なくとも2〜400個の核酸配列を含み、前記複数の新生抗原コード核酸配列内の前記新生抗原コード核酸配列のうちの少なくとも2個が、前記腫瘍細胞表面上のMHCクラスIによって提示されるポリペプチド配列またはその一部をコードする、請求項2または4を除く先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記複数の新生抗原コード核酸配列が少なくとも2〜400個の核酸配列を含み、前記対象に投与されて翻訳された場合、前記新生抗原のうちの少なくとも1つが抗原提示細胞上に提示されて、前記腫瘍細胞表面上の前記新生抗原のうちの少なくとも1つを標的とする免疫応答をもたらす、請求項2または4を除く先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記複数の新生抗原コード核酸配列が少なくとも2〜400個のMHCクラスI及び/またはMHCクラスII新生抗原コード核酸配列を含み、前記対象に投与されて翻訳された場合、前記MHCクラスIまたはMHCクラスII新生抗原のうちの少なくとも1つが、抗原提示細胞上に提示されて、前記腫瘍細胞表面上の前記新生抗原のうちの少なくとも1つを標的とする免疫応答をもたらし、任意で、前記少なくとも2〜400個のMHCクラスIまたはMHCクラスII新生抗原コード核酸配列のそれぞれの発現が、前記少なくとも1つのプロモーターによって誘導される、請求項2または4を除く先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 各MHCクラスI新生抗原コード核酸配列が、アミノ酸8〜35個の長さ、任意で、アミノ酸9〜17個、9〜25個、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34または35個の長さのポリペプチド配列をコードする、請求項2または4を除く先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列が存在している、請求項2または4を除く先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列が存在し、かつ、前記コードされたペプチド配列を野生型核酸配列によってコードされる対応するペプチド配列とは異なるものにする少なくとも1つの変化を含む少なくとも1つのMHCクラスII新生抗原コード核酸配列を含む、請求項2または4を除く先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列が、アミノ酸12〜20個、12、13、14、15、16、17、18、19、20,または20〜40個の長さである、請求項2または4を除く先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記少なくとも1つのMHCクラスII抗原コード核酸配列が存在し、かつ、少なくとも1つのユニバーサルMHCクラスII抗原コード核酸配列を含み、任意で、前記少なくとも1つのユニバーサル配列が、破傷風トキソイド及びPADREのうちの少なくとも一方を含む、請求項2または4を除く先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記少なくとも1つのプロモーター配列が、誘導性である、請求項2または4を除く先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記少なくとも1つのプロモーター配列が、非誘導性である、請求項2または4を除く先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記少なくとも1つのプロモーター配列が、CMV、SV40、EF−1、RSV、PGK、またはEBVプロモーター配列である、請求項2または4を除く先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記新生抗原カセットが、前記複数の新生抗原コード核酸配列内の配列のうちの少なくとも1つに機能的に連結された少なくとも1つのポリアデニル化(ポリA)配列をさらに含み、任意で、前記ポリA配列が、前記複数の新生抗原コード核酸配列内の前記少なくとも1つの配列の3’側に位置する、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記ポリA配列が、SV40のポリA配列を含む、請求項33に記載のベクター。
- 前記新生抗原カセットが、イントロン配列、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子(WPRE)配列、内部リボソーム進入配列(IRES)配列、または、前記複数の新生抗原コード核酸配列内の配列のうちの少なくとも1つに機能的に連結されたmRNAの核外輸送、安定性、または翻訳効率を向上させることが知られている5’または3’末端の非コード領域内の配列のうちの少なくとも1つをさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記新生抗原カセットが、緑色蛍光タンパク質(GFP)、GFPバリアント、分泌型アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、またはルシフェラーゼバリアントを含むがこれらに限定されないレポーター遺伝子をさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 少なくとも1つの免疫調節物質をコードする1つ以上の核酸配列をさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記免疫調節物質が、抗CTLA4抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗PD−1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗PD−L1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗4−1BB抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗OX−40抗体もしくはその抗原結合フラグメントである、請求項37に記載のベクター。
- 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、一本鎖Fv(scFv)、単一特異性抗体もしくは互いに連結された多重特異性抗体としての単一ドメイン抗体(sdAb)(例えば、ラクダ科動物の抗体ドメイン)、または完全長の一本鎖抗体(例えば、フレキシブルリンカーによって連結された重鎖と軽鎖を有する完全長IgG)である、請求項38に記載のベクター。
- 前記抗体の重鎖配列と軽鎖配列とが、2AまたはIRESのような自己切断配列によって分離された連続的配列であるか、または前記抗体の重鎖配列と軽鎖配列とが連続したグリシン残基のようなフレキシブルリンカーによって連結されている、請求項38に記載のベクター。
- 前記免疫調節物質がサイトカインである、請求項37に記載のベクター。
- 前記サイトカインが、IL−2、IL−7、IL−12、IL−15、もしくはIL−21、またはそれぞれのそのバリアントのうちの少なくとも1つである、請求項41に記載のベクター。
- チンパンジーアデノウイルスChAdV68ベクターである、請求項2または4を除く先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- SEQ ID NO:1に記載の配列を含む、請求項2または4を除く先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- SEQ ID NO:1に記載の配列のチンパンジーアデノウイルスE1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4、及びL5遺伝子からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子において配列が完全に欠失されているかまたは機能的に欠失されている点を除いて、前記ベクターがSEQ ID NO:1に記載の配列を含み、任意で、SEQ ID NO:1に記載の配列の(1)E1A及びE1B、(2)E1A、E1B、及びE3、または(3)E1A、E1B、E3、及びE4において配列が完全に欠失されているかまたは機能的に欠失されている、請求項2または4を除く先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記ベクターが、SEQ ID NO:1の配列から得られる遺伝子または調節配列を含み、任意で、前記遺伝子が、SEQ ID NO:1に記載の配列のチンパンジーアデノウイルスの末端逆位繰り返し配列(ITR)、E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4、及びL5遺伝子からなる群から選択される、請求項2または4を除く先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記新生抗原カセットが、E1領域、E3領域、及び/または、前記新生抗原カセットの組み込みが可能な任意の欠失されたAdV領域においてベクターに挿入されている、請求項2または4を除く先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 第1世代、第2世代、またはヘルパー依存型のアデノウイルスベクターのうちの1つから作製される、請求項2または4を除く先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- SEQ ID NO:1に記載の配列の塩基対番号577と3403との間、または塩基対456と3014との間に1つ以上の欠失を含み、任意で、塩基対27,125と31,825との間、または塩基対27,816と31,333との間に1つ以上の欠失をさらに含む、請求項2または4を除く先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- SEQ ID NO:1に記載の配列の塩基対番号3957と10346との間、塩基対番号21787と23370との間、及び塩基対番号33486と36193との間に1つ以上の欠失をさらに含む、請求項2または4を除く先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記少なくとも2個のMHCクラスI新生抗原コード核酸配列が、
前記腫瘍からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも1つを取得する工程であって、前記腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータが、新生抗原のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられる、前記工程と、
各新生抗原の前記ペプチド配列を提示モデルに入力して、前記新生抗原のそれぞれが前記腫瘍の腫瘍細胞表面上のMHCアレルのうちの1つ以上によって提示される数値的可能性のセットを生成する工程であって、前記数値的可能性のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて特定されたものである、前記工程と、
前記数値的可能性のセットに基づいて前記新生抗原のセットのサブセットを選択して、前記少なくとも2個のMHCクラスI新生抗原コード核酸配列を生成するために用いられる選択された新生抗原のセットを生成する工程と
を行うことによって選択される、請求項2または4を除く先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。 - 前記MHCクラスIエピトープコード核酸配列のそれぞれが、
前記腫瘍からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも1つを取得する工程であって、前記腫瘍ヌクレオチドシークエンシングデータが、新生抗原のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられる、前記工程と、
各新生抗原の前記ペプチド配列を提示モデルに入力して、前記新生抗原のそれぞれが前記腫瘍の腫瘍細胞表面上のMHCアレルのうちの1つ以上によって提示される数値的可能性のセットを生成する工程であって、前記数値的可能性のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて特定されたものである、前記工程と、
前記数値的可能性のセットに基づいて前記新生抗原のセットのサブセットを選択して、前記少なくとも2個のMHCクラスI新生抗原コード核酸配列を生成するために用いられる選択された新生抗原のセットを生成する工程と
を行うことによって選択される、請求項2に記載のベクター。 - 前記選択された新生抗原のセットの数が、2〜20である、請求項51に記載のベクター。
- 前記提示モデルが、
前記MHCアレルのうちの特定の1つとペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸とのペアの存在と、
前記ペアの前記MHCアレルのうちの前記特定の1つによる、前記特定の位置に前記特定のアミノ酸を含むそのようなペプチド配列の前記腫瘍細胞表面上での提示の可能性と
の間の依存性を表す、請求項51または52に記載のベクター。 - 前記選択された新生抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されていない新生抗原と比べて前記腫瘍細胞表面上に提示される可能性が増大している新生抗原を選択することを含む、請求項51または52に記載のベクター。
- 前記選択された新生抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されていない新生抗原と比べて前記対象において腫瘍特異的な免疫応答を誘導し得る可能性が増大している新生抗原を選択することを含む、請求項51または52に記載のベクター。
- 前記選択された新生抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されていない新生抗原と比べて、プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)によってナイーブT細胞に対して提示され得る可能性が増大している新生抗原を選択することを含み、任意で、前記APCが樹状細胞(DC)である、請求項51または52に記載のベクター。
- 前記選択された新生抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されていない新生抗原と比べて中枢性寛容または末梢性寛容によって阻害される可能性が減少している新生抗原を選択することを含む、請求項51または52に記載のベクター。
- 前記選択された新生抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて選択されていない新生抗原と比べて前記対象において正常組織に対する自己免疫応答を誘導し得る可能性が減少している新生抗原を選択することを含む、請求項51または52に記載のベクター。
- エクソームまたはトランスクリプトームのヌクレオチドシークエンシングデータが、腫瘍組織に対してシークエンシングを行うことによって取得される、請求項51または52に記載のベクター。
- 前記シークエンシングが、次世代シークエンシング(NGS)または任意の大規模並列処理シークエンシング手法である、請求項51または52に記載のベクター。
- 前記新生抗原カセットが、前記新生抗原カセット内の隣接配列によって形成されたジャンクショナルエピトープ配列を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 少なくとも1つの、または各ジャンクショナルエピトープ配列が、MHCに対して500nMよりも高い親和性を有する、請求項に記載のベクター。
- 各ジャンクショナルエピトープ配列が、非自己である、請求項に記載のベクター。
- 前記新生抗原カセットが、翻訳後の野生型核酸配列を含む非治療的MHCクラスIまたはクラスIIエピトープ核酸配列をコードしておらず、前記非治療的エピトープが前記対象のMHCアレル上に提示されると予測される、先行請求項のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記非治療的な予測されたMHCクラスIまたはクラスIIエピトープ配列が、前記新生抗原カセット内の隣接配列によって形成されたジャンクショナルエピトープ配列である、請求項65に記載のベクター。
- 前記予測が、前記非治療的エピトープの配列を提示モデルに入力することによって生成される提示可能性に基づいたものである、請求項62または66に記載のベクター。
- 前記新生抗原カセット内の前記複数の抗原コード核酸配列の順序が、
1.前記複数の抗原コード核酸配列の異なる順序に対応した候補新生抗原カセット配列のセットを生成する工程と、
2.各候補新生抗原カセット配列について、前記候補新生抗原カセット配列内の非治療的エピトープの提示に基づいた提示スコアを決定する工程と、
3.所定の閾値を下回る提示スコアに関連する候補カセット配列を、新生抗原ワクチン用の新生抗原カセット配列として選択する工程と
を含む一連の工程によって決定される、請求項62〜67のいずれか一項に記載のベクター。 - 先行請求項のいずれか一項に記載のベクターと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
- アジュバントをさらに含む、請求項69に記載の医薬組成物。
- 免疫調節物質をさらに含む、請求項69または70に記載の医薬組成物。
- 前記免疫調節物質が、抗CTLA4抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗PD−1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗PD−L1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗4−1BB抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗OX−40抗体もしくはその抗原結合フラグメントである、請求項71に記載の医薬組成物。
- 先行するベクターの請求項のいずれか一項に記載の新生抗原カセットと、
SEQ ID NO:1の配列から得られる遺伝子と
を含む、単離ヌクレオチド配列であって、
任意で、前記遺伝子が、SEQ ID NO:1に記載の配列のチンパンジーアデノウイルスのITR、E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4、及びL5遺伝子からなる群から選択され、
任意で、前記ヌクレオチド配列がcDNAである、
前記単離ヌクレオチド配列。 - 請求項73に記載のヌクレオチド配列を含む単離細胞であって、任意で、前記細胞が、CHO、HEK293もしくはそのバリアント、911、HeLa、A549、LP−293、PER.C6、またはAE1−2a細胞である、前記単離細胞。
- 請求項73に記載のヌクレオチド配列を含むベクター。
- 先行するベクターの請求項のいずれか一項に記載のベクターと、
使用説明書と
を含むキット。 - がんを有する対象を治療するための方法であって、前記対象に、先行するベクターの請求項のいずれか一項に記載のベクター、または請求項69〜70のいずれかに記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
- 前記ベクターまたは組成物が、筋肉内(IM)、皮内(ID)、または皮下(SC)に投与される、請求項77に記載の方法。
- 前記対象に免疫調節物質を投与することをさらに含み、任意で、前記免疫調節物質が前記ベクターまたは医薬組成物の投与前、投与と同時、または投与後に投与される、請求項77または78に記載の方法。
- 前記免疫調節物質が、抗CTLA4抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗PD−1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗PD−L1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗4−1BB抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗OX−40抗体もしくはその抗原結合フラグメントである、請求項79に記載の方法。
- 前記免疫調節物質が、静脈内(IV)、筋肉内(IM)、皮内(ID)、または皮下(SC)に投与される、請求項79に記載の方法。
- 前記皮下投与が、前記ベクターもしくは組成物の投与部位の近くに、または1つ以上のベクターもしくは組成物の流入領域リンパ節に近接して行われる、請求項81に記載の方法。
- 前記対象に第2のワクチン組成物を投与することをさらに含む、請求項77〜82のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2のワクチン組成物が、請求項77〜82のいずれか一項に記載のベクターまたは医薬組成物の投与の前に投与される、請求項83に記載の方法。
- 前記第2のワクチン組成物が、請求項77〜82のいずれか一項に記載のベクターまたは医薬組成物の投与の後に投与される、請求項83に記載の方法。
- 前記第2のワクチン組成物が、請求項77〜82のいずれか一項に記載のベクターまたは医薬組成物と同じである、請求項84または85に記載の方法。
- 前記第2のワクチン組成物が、請求項77〜82のいずれか一項に記載のベクターまたは医薬組成物と異なる、請求項84または85に記載の方法。
- 前記第2のワクチン組成物が、複数の新生抗原コード核酸配列をコードする自己複製RNA(srRNA)ベクターを含む、請求項87に記載の方法。
- 前記srRNAベクターによってコードされる前記複数の新生抗原コード核酸配列が、先行するベクターの請求項のいずれか一項に記載の複数の新生抗原コード核酸配列と同じである、請求項88に記載の方法。
- 先行するベクターの請求項のいずれか一項に記載のベクターの製造方法であって、
前記少なくとも1つのプロモーター配列と前記新生抗原カセットとを含むプラスミド配列を得ることと、
前記プラスミド配列を1つ以上の宿主細胞にトランスフェクトすることと、
前記1つ以上の宿主細胞から前記ベクターを単離することと
を含む、前記方法。 - 前記単離することが、
前記宿主細胞を溶解して前記ベクターを含む細胞ライセートを得ることと、
前記細胞ライセートから、及び任意で、前記宿主細胞を培養するために用いた培地からも、前記ベクターを精製することと
を含む、請求項90に記載の製造方法。 - 前記プラスミド配列が、
DNA組換えまたは細菌組換えまたは全ゲノムDNA合成または細菌細胞内での合成されたDNAの増幅を用いた全ゲノムDNA合成
のうちの1つを用いて生成される、請求項90に記載の製造方法。 - 前記1つ以上の宿主細胞が、CHO、HEK293もしくはそのバリアント、911、HeLa、A549、LP−293、PER.C6、及びAE1−2a細胞のうちの少なくとも1つである、請求項66に記載の製造方法。
- 前記細胞ライセートから前記ベクターを精製することが、クロマトグラフィー分離、遠心分離、ウイルス沈殿、及び濾過のうちの1つ以上を含む、請求項91に記載の製造方法。
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