TW201831691A - 新抗原之病毒遞送 - Google Patents

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TW201831691A
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布萊登 布理克－蘇利文
珍妮佛 巴斯比
亞得南 德提
里奥尼德 吉特林
海斯貝特 古藤伯格
卡琳 約斯
夏蘭 丹尼爾 斯卡倫
羅門 葉嫩史基
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美商葛利史東腫瘤科技公司
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Abstract

本文揭示包括源於個體腫瘤之新抗原編碼核酸序列的黑猩猩腺病毒載體。亦揭示與該等載體相關之核苷酸、細胞及方法，包括該等載體作為疫苗之用途。

Description

新抗原之病毒遞送
基於腫瘤特異性新抗原之治療性疫苗作為下一代個人化癌症免疫療法具有極大的前景。1-3 考慮到新抗原產生之可能性相對更大，具有高突變負荷之癌症，諸如非小細胞肺癌(NSCLC)及黑素瘤，為此類療法之特別有吸引力的靶標。4,5 早期證據表明，基於新抗原之疫苗接種可引發T細胞反應6 ，且靶向新抗原之細胞療法可在選定患者之某些情形下引起腫瘤消退。7 新抗原疫苗設計之一個問題為個體腫瘤中存在之許多編碼突變中的哪一個可生成「最佳」治療性新抗原，例如可引發抗腫瘤免疫性且引起腫瘤消退之抗原。 已提出初步方法，其併入使用下一代定序的基於突變之分析、RNA基因表現及預測候選新抗原肽之MHC結合親和力8 。然而，此等提出之方法可能無法模擬整個抗原決定基產生過程，除基因表現及MHC結合之外，其含有許多步驟(例如TAP轉運、蛋白酶體裂解及/或TCR識別)9 。因此，現有方法可能會降低低陽性預測值(PPV)。(圖1A) 事實上，由多個組進行的由腫瘤細胞呈現之肽的分析已顯示，使用基因表現及MHC結合親和力預測將呈現之肽的＜5%可在腫瘤表面MHC上發現10,11 (圖1B)。結合受限之新抗原對檢查點抑制劑反應之預測準確性相對於單獨突變數目沒有提高的最新觀察結果進一步加強結合預測與MHC呈現之間的此種低相關性。12 預測呈現之現有方法的此低陽性預測值(PPV)提出有關基於新抗原之疫苗設計的問題。若使用PPV低的預測來設計疫苗，則大多數患者不太可能接受治療性新抗原，更少的患者可能接受多於一種(即使假設所有呈現肽均為免疫原性的)。因此，用當前方法接種新抗原不可能在大量具有腫瘤之個體中成功。(圖1C) 此外，先前方法僅使用順式作用突變產生候選新抗原，且很大程度上忽視考慮neo-ORF之其他來源，包括在多種腫瘤類型中發生且導致許多基因異常剪接的剪接因子之突變13 ，及形成或移除蛋白酶裂解位點之突變。 最後，由於文庫構建、外顯子組及轉錄組捕捉、定序或資料分析中之次最佳條件，腫瘤基因組及轉錄組分析之標準方法可能會遺漏產生候選新抗原之體細胞突變。同樣，標準腫瘤分析方法可能無意中促進序列偽影或生殖系多形現象作為新抗原，分別導致低效使用疫苗能力或自身免疫性風險。 除當前新抗原預測方法之挑戰外，對於可用於人類之新抗原遞送的可用載體系統亦存在某些挑戰，其中許多源於人類。舉例而言，由於先前的自然暴露，許多人類對人類病毒具有預先存在的免疫性，且此種免疫性可為使用重組人類病毒用於癌症治療之新抗原遞送的主要障礙。
本文揭示包含新抗原卡匣之黑猩猩腺病毒載體，該新抗原卡匣包含：(1)源於個體內存在之腫瘤的複數個新抗原編碼核酸序列，該複數個新抗原編碼核酸序列包含：至少兩個腫瘤特異性及個體特異性MHC I類新抗原編碼核酸序列，其各自包含：a.具有至少一個改變之MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，該改變使所編碼之肽序列不同於野生型核酸序列編碼之相應肽序列，b.視情況5'連接子序列，及c.視情況3'連接子序列；(2)可操作地連接於該複數個序列中之至少一者的至少一個啟動子序列，(3)視情況至少一個MHC II類抗原編碼核酸序列；(4)視情況至少一個GPGPG連接子序列(SEQ ID NO:56)；及(5)視情況至少一個聚腺苷酸化序列。 本文亦揭示一種黑猩猩腺病毒載體，其包含：a.包含具有E1 (nt 577至3403)缺失及E3 (nt 27,125-31,825)缺失之SEQ ID NO:1序列的經修飾之ChAdV68序列；b. CMV啟動子序列；c. SV40聚腺苷酸化信號核苷酸序列；及d.新抗原卡匣，該新抗原卡匣包含：(1)源於個體中存在之腫瘤的複數個新抗原編碼核酸序列，該複數個新抗原編碼核酸序列包含：至少20個彼此線性連接之腫瘤特異性及個體特異性MHC I類新抗原編碼核酸序列，且各自包含：(A)具有至少一個改變之MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，該改變使所編碼之肽序列不同於野生型核酸序列編碼之相應肽序列，其中該MHC I抗原決定基編碼核酸序列編碼7-15個胺基酸長之MHC I類抗原決定基，(B) 5'連接子序列，其中該5'連接子序列為MHC I抗原決定基之天然5'核酸序列，且其中該5'連接子序列編碼至少5個胺基酸長之肽，(C) 3'連接子序列，其中該3'連接子序列為MHC I抗原決定基之天然3'核酸序列，且其中該3'連接子序列編碼至少5個胺基酸長之肽，且其中該等MHC I類新抗原編碼核酸序列中之每一者編碼25個胺基酸長之多肽，且其中各MHC I類新抗原編碼核酸序列之各3'端連接於後續MHC I類新抗原編碼核酸序列之5'端，該複數個新抗原編碼核酸序列中最後的MHC I類新抗原編碼核酸序列除外；及(2)至少兩個MHC II類抗原編碼核酸序列，其包含：(A) PADRE MHC II類序列(SEQ ID NO:48)，(B)破傷風類毒素MHC II類序列(SEQ ID NO:46)，(C)連接該PADRE MHC II類序列及該破傷風類毒素MHC II類序列之第一GPGPG連接子序列，(D)使至少兩個MHC II類抗原編碼核酸序列之5'端連接於該複數個新抗原編碼核酸序列之第二GPGPG連接子序列，(E)使至少兩個MHC II類抗原編碼核酸序列之3'端連接於該SV40聚腺苷酸化信號核苷酸序列之第三GPGPG連接子序列；且其中該新抗原卡匣插入該E1缺失內且該CMV啟動子序列可操作地連接於該新抗原卡匣。 在一些態樣中，載體之各元件的有序序列描述於下式中，自5'至3'包含： Pa -(L5b -Nc -L3d )X -(G5e -Uf )Y -G3g -Ah 其中P包含可操作地連接於複數個序列中之至少一者的至少一個啟動子序列，在黑猩猩腺病毒載體之情況下，視情況= 1，N包含具有至少一個改變之MHC I類抗原決定基編碼核酸序列中之一者，該改變使所編碼之肽序列不同於野生型核酸序列編碼之相應肽序列，其中c = 1，L5包含5'連接子序列，其中b = 0或1，L3包含3'連接子序列，其中d = 0或1，G5包含至少一個GPGPG連接子序列中之一者，其中e = 0或1，G3包含至少一個GPGPG連接子序列中之一者，其中g = 0或1，U包含至少一個MHC II類抗原編碼核酸序列中之一者，其中f = 1，A包含至少一個聚腺苷酸化序列，其中h = 0或1，X = 2至400，其中對於各X，相應Nc為C68特有MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，且Y = 0-2，其中對於各Y，相應Uf為MHC II類抗原編碼核酸序列。在一特定態樣中，b = 1，d = 1，e = 1，g = 1，h = 1，X = 20，Y = 2，P為CMV啟動子序列，各N編碼7-15個胺基酸長之MHC I類抗原決定基，L5為MHC I抗原決定基之天然5'核酸序列，且其中該5'連接子序列編碼至少5個胺基酸長之肽，L3為MHC I抗原決定基之天然3'核酸序列，且其中該3'連接子序列編碼至少5個胺基酸長之肽，U為PADRE MHC II類序列及破傷風類毒素MHC II類序列中之一者，黑猩猩腺病毒載體包含經修飾之ChAdV68序列，其包含具有E1 (nt 577至3403)缺失及E3 (nt 27,125-31,825)缺失之SEQ ID NO:1序列，且新抗原卡匣插入E1缺失內，且MHC I類新抗原編碼核酸序列中之每一者編碼25個胺基酸長之多肽。 在一些態樣中，複數個新抗原編碼核酸序列中之至少1、2或視情況3個編碼在腫瘤細胞表面上由MHC I類呈現之多肽序列或其部分。 在一些態樣中，複數個抗原編碼核酸序列中之每一者彼此直接連接。在一些態樣中，複數個抗原編碼核酸序列中之至少一者用連接子連接於複數個中之不同抗原編碼核酸序列。在一些態樣中，連接子連接兩個MHC I類序列或將MHC I類序列連接於MHC II類序列。在一些態樣中，連接子係選自由以下組成之群：(1)連續甘胺酸殘基，至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個殘基長；(2)連續丙胺酸殘基，至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個殘基長；(3)兩個精胺酸殘基(RR)；(4)丙胺酸、丙胺酸、酪胺酸(AAY)；(5)由哺乳動物蛋白酶體有效加工之至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基長之共同序列；及(6)側接源於同源蛋白的抗原且至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或2-20個胺基酸殘基長之一或多個天然序列。在一些態樣中，連接子連接兩個MHC II類序列或將MHC II類序列連接於MHC I類序列。在一些態樣中，連接子包含序列GPGPG。 在一些態樣中，複數個序列中之至少一者可操作地或直接連接於增強該複數個序列之表現、穩定性、細胞運輸、加工及呈現及/或免疫原性的分離或連續序列。在一些態樣中，分離或連續序列包含以下中之至少一者：泛素序列、經修飾以增加蛋白酶體靶向之泛素序列(例如泛素序列在位置76含有Gly至Ala取代)、免疫球蛋白信號序列(例如IgK)、主要組織相容性I類序列、溶酶體相關膜蛋白(LAMP)-1、人類樹突狀細胞溶酶體相關膜蛋白及主要組織相容性II類序列；視情況其中經修飾以增加蛋白酶體靶向之泛素序列為A76。 在一些態樣中，複數個新抗原編碼核酸序列中之至少一者編碼相對於經轉譯之相應野生型核酸序列對其相應MHC等位基因之結合親和力增加的多肽序列或其部分。在一些態樣中，複數個新抗原編碼核酸序列中之至少一者編碼相對於經轉譯之相應野生型親本核酸序列對其相應MHC等位基因之結合穩定性增加的多肽序列或其部分。在一些態樣中，複數個新抗原編碼核酸序列中之至少一者編碼相對於經轉譯之相應野生型親本核酸序列在其相應MHC等位基因上呈現之可能性增加的多肽序列或其部分。 在一些態樣中，至少一個改變包含點突變、讀框轉移突變、非讀框轉移突變、缺失突變、插入突變、剪接變體、基因組重排或蛋白酶體產生之剪接抗原。 在一些態樣中，腫瘤係選自由以下組成之群：肺癌、黑素瘤、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、胃癌、結腸癌、睪丸癌、頭頸癌、胰臟癌、腦癌、B細胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴球性白血病、T細胞淋巴球性白血病、非小細胞肺癌及小細胞肺癌。 在一些態樣中，複數個序列中之每一者的表現係由至少一個啟動子驅動。 在一些態樣中，複數個序列包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個核酸序列。在一些態樣中，複數個序列包含至少11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或多至400個核酸序列。在一些態樣中，複數個序列包含至少2-400個核酸序列，且其中複數個新抗原編碼核酸序列中之至少兩者編碼腫瘤細胞表面上由MHC I呈現之多肽序列或其部分。在一些態樣中，複數個序列包含至少2-400個核酸序列，且其中當投與個體且轉譯時，新抗原中之至少一者呈現在抗原呈現細胞上，引起靶向腫瘤細胞表面上之至少一個新抗原的免疫反應。在一些態樣中，複數個序列包含至少2-400個MHC I類及/或II類新抗原編碼核酸序列，其中當投與個體且轉譯時，MHC I類或II類新抗原中之至少一者呈現在抗原呈現細胞上，引起靶向腫瘤細胞表面上之至少一個新抗原的免疫反應，且視情況其中至少2-400個MHC I類或II類新抗原編碼核酸序列中之每一者的表現係由至少一個啟動子驅動。 在一些態樣中，各MHC I類新抗原編碼核酸序列編碼8至35個間胺基酸長、視情況9-17、9-25、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35個胺基酸長之多肽序列。 在一些態樣中，存在至少一個MHC II類抗原編碼核酸序列。在一些態樣中，存在至少一個MHC II類抗原編碼核酸序列且其包含至少一個具有至少一個改變之MHC II類新抗原編碼核酸序列，該改變使所編碼之肽序列不同於由野生型核酸序列編碼之相應肽序列。在一些態樣中，至少一個MHC II類抗原編碼核酸序列為12-20、12、13、14、15、16、17、18、19、20或20-40個胺基酸長。在一些態樣中，存在至少一個MHC II類抗原編碼核酸序列且其包含至少一個通用MHC II類抗原編碼核酸序列，視情況其中該至少一個通用序列包含破傷風類毒素及PADRE中之至少一者。 在一些態樣中，至少一個啟動子序列為誘導型。在一些態樣中，至少一個啟動子序列為非誘導型。在一些態樣中，至少一個啟動子序列為CMV、SV40、EF-1、RSV、PGK或EBV啟動子序列。 在一些態樣中，新抗原卡匣另外包含可操作地連接於複數個序列中之至少一者的至少一個聚腺苷酸化(polyA)序列，視情況其中該polyA序列位於複數個序列中之至少一個序列的3'。在一些態樣中，polyA序列包含SV40 polyA序列。在一些態樣中，新抗原卡匣另外包含以下中之至少一者：內含子序列、土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE)序列、內部核糖體入口序列(IRES)序列，或已知增強可操作地連接於複數個序列中之至少一者的mRNA的核輸出、穩定性或轉譯效率的5'或3'非編碼區中之序列。在一些態樣中，新抗原卡匣另外包含報導基因，其包括(但不限於)綠色螢光蛋白(GFP)、GFP變體、分泌型鹼性磷酸酶、螢光素酶或螢光素酶變體。 在一些態樣中，載體另外包含編碼至少一種免疫調節物之一或多個核酸序列。 在一些態樣中，免疫調節物為抗CTLA4抗體或其抗原結合片段、抗PD-1抗體或其抗原結合片段、抗PD-L1抗體或其抗原結合片段、抗4-1BB抗體或其抗原結合片段、或抗OX-40抗體或其抗原結合片段。在一些態樣中，抗體或其抗原結合片段為Fab片段、Fab'片段、單鏈Fv (scFv)、單域抗體(sdAb)呈單特異性或多特異性連接在一起 (例如駱駝科抗體域)、或全長單鏈抗體(例如具有藉由可撓性連接子連接之重鏈及輕鏈的全長IgG)。在一些態樣中，抗體之重鏈及輕鏈序列為由自裂解序列(諸如2A)或IRES分開的連續序列；或抗體之重鏈及輕鏈序列係由可撓性連接子(諸如連續甘胺酸殘基)連接。 在一些態樣中，免疫調節物為細胞介素。在一些態樣中，細胞介素為IL-2、IL-7、IL-12、IL-15或IL-21或其各自變體中之至少一者。 在一些態樣中，載體為黑猩猩腺病毒C68載體。在一些態樣中，載體包含SEQ ID NO:1中所列之序列。在一些態樣中，載體包含SEQ ID NO:1中所列之序列，但完全缺失或功能缺失選自由以下組成之群的至少一個基因中的序列：SEQ ID NO:1中所列之序列的黑猩猩腺病毒E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4及L5基因，視情況其中完全缺失或功能缺失以下的序列：SEQ ID NO:1中所列序列的(1) E1A及E1B；(2) E1A、E1B及E3；或(3) E1A、E1B、E3及E4。在一些態樣中，載體包含獲自SEQ ID NO:1序列之基因或調節序列，視情況其中該基因係選自由以下組成之群：SEQ ID NO:1中所列序列的黑猩猩腺病毒反向末端重複序列(ITR)、E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4及L5基因。 在一些態樣中，新抗原卡匣插入載體中之E1區、E3區及/或允許併入新抗原卡匣之任何缺失的AdV區。 在一些態樣中，載體係由第一代、第二代或輔助病毒依賴性腺病毒載體中之一者產生。 在一些態樣中，腺病毒載體包含SEQ ID NO:1中所列之序列的鹼基對編號577與3403之間或鹼基對456與3014之間的一或多個缺失，且視情況其中該載體另外包含鹼基對27,125與31,825之間或鹼基對27,816與31,333之間的一或多個缺失。在一些態樣中，腺病毒載體另外包含SEQ ID NO:1中所列之序列的鹼基對編號3957與10346、鹼基對編號21787與23370及鹼基對編號33486與36193之間的一或多個缺失。 在一些態樣中，至少兩個MHC I類新抗原編碼核酸序列係藉由執行以下步驟來選擇：自腫瘤獲得外顯子組、轉錄組或全基因組腫瘤核苷酸定序資料中之至少一者，其中該腫瘤核苷酸定序資料用於獲得代表新抗原集合中之每一者之肽序列的資料；將各新抗原之肽序列輸入呈現模型中，以產生新抗原中之每一者在腫瘤之腫瘤細胞表面上由MHC等位基因中之一或多者呈現的數值可能性集合，該數值可能性集合已至少基於所接收之質譜資料鑑別；及基於該數值可能性集合選擇該新抗原集合之子集，以產生經選擇之新抗原集合，其用於產生至少兩個MHC I類新抗原編碼核酸序列。 在一些態樣中，MHC I類抗原決定基編碼核酸序列中之每一者係藉由執行以下步驟來選擇：自腫瘤獲得外顯子組、轉錄組或全基因組腫瘤核苷酸定序資料中之至少一者，其中該腫瘤核苷酸定序資料用於獲得代表新抗原集合中之每一者之肽序列的資料；將各新抗原之肽序列輸入呈現模型中，以產生新抗原中之每一者在腫瘤之腫瘤細胞表面上由MHC等位基因中之一或多者呈現的數值可能性集合，該數值可能性集合已至少基於所接收之質譜資料進行鑑別；及基於該數值可能性集合選擇該新抗原集合之子集，以產生經選擇之新抗原集合，其用於產生至少兩個MHC I類新抗原編碼核酸序列。 在一些態樣中，該經選擇之新抗原集合的數目為2-20個。 在一些態樣中，呈現模型表示以下兩者之間的依賴性：MHC等位基因中之一對特定等位基因及在肽序列之特定位置處之特定胺基酸的存在；與在腫瘤細胞表面上由該對MHC等位基因中之一特定者呈現包含特定胺基酸在該特定位置之此類肽序列的可能性。 在一些態樣中，選擇該經選擇之新抗原集合包含基於呈現模型選擇相對於未經選擇之新抗原在腫瘤細胞表面上呈現之可能性增加的新抗原。在一些態樣中，選擇該經選擇之新抗原集合包含基於呈現模型選擇相對於未經選擇之新抗原能夠在個體中誘導腫瘤特異性免疫反應之可能性增加的新抗原。在一些態樣中，選擇該經選擇之新抗原集合包含基於呈現模型選擇相對於未經選擇之新抗原能夠由專職抗原呈現細胞(APC)呈現於初始T細胞之可能性增加的新抗原，視情況其中該APC為樹突狀細胞(DC)。在一些態樣中，選擇該經選擇之新抗原集合包含基於呈現模型選擇相對於未經選擇之新抗原經由中心或外周耐受性受抑制之可能性降低的新抗原。在一些態樣中，選擇該經選擇之新抗原集合包含基於呈現模型選擇相對於未經選擇之新抗原能夠在個體中誘導針對正常組織之自體免疫反應之可能性降低的新抗原。在一些態樣中，外顯子組或轉錄組核苷酸定序資料係藉由對腫瘤組織進行定序而獲得。在一些態樣中，定序為下一代定序(NGS)或任何大規模平行定序方法。 在一些態樣中，新抗原卡匣包含由新抗原卡匣中之相鄰序列形成的連接抗原決定基序列。在一些態樣中，至少一個或每個連接抗原決定基序列對MHC之親和力大於500 nM。在一些態樣中，每個連接抗原決定基序列為非自身的。在一些態樣中，新抗原卡匣不編碼包含轉譯之野生型核酸序列之非治療性MHC I類或II類抗原決定基核酸序列，其中該非治療性抗原決定基經預測顯示於個體之MHC等位基因上。在一些態樣中，經預測之非治療性MHC I類或II類抗原決定基序列為由新抗原卡匣中之相鄰序列形成的連接抗原決定基序列。在一些態樣中，預測係基於藉由將非治療性抗原決定基之序列輸入呈現模型中而產生之呈現可能性。在一些態樣中，新抗原卡匣中之複數個抗原編碼核酸序列的順序係藉由一系列步驟來確定，包含：1.產生對應於該複數個抗原編碼核酸序列之不同順序的候選新抗原卡匣序列集合；2.對於每個候選新抗原卡匣序列，基於候選新抗原卡匣序列中非治療性抗原決定基之呈現來確定呈現分數；及3.選擇與低於預定閾值之呈現分數相關的候選卡匣序列作為新抗原疫苗之新抗原卡匣序列。 本文亦揭示一種醫藥組合物，其包含本文所揭示之載體(諸如本文所揭示之基於ChAd之載體)及醫藥學上可接受之載劑。在一些態樣中，該組合物另外包含佐劑。在一些態樣中，該組合物另外包含免疫調節物。在一些態樣中，免疫調節物為抗CTLA4抗體或其抗原結合片段、抗PD-1抗體或其抗原結合片段、抗PD-L1抗體或其抗原結合片段、抗4-1BB抗體或其抗原結合片段、或抗OX-40抗體或其抗原結合片段。 本文亦揭示一種經分離之核苷酸序列，其包含本文所揭示之新抗原卡匣及本文所揭示之至少一種啟動子。在一些態樣中，經分離之核苷酸序列另外包含基於ChAd之基因。在一些態樣中，基於ChAd之基因獲自SEQ ID NO:1序列，視情況其中該基因係選自由以下組成之群：SEQ ID NO:1中所列之序列的黑猩猩腺病毒ITR、E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4及L5基因，且視情況其中該核苷酸序列為cDNA。 本文亦揭示一種經分離之細胞，其包含本文所揭示之經分離之核苷酸序列，視情況其中該細胞為CHO、HEK293或其變體、911、HeLa、A549、LP-293、PER.C6或AE1-2a細胞。 本文亦揭示一種載體，其包含本文所揭示之經分離之核苷酸序列。 本文亦揭示一種套組，其包含本文所揭示之載體及使用說明書。 本文亦揭示一種用於治療患有癌症之個體的方法，該方法包含向該個體投與本文所揭示之載體或本文所揭示之醫藥組合物。在一些態樣中，該載體或組合物係肌內(IM)、皮內(ID)或皮下(SC)投與。在一些態樣中，該方法另外包含向該個體投與免疫調節物，視情況其中該免疫調節物在該載體或醫藥組合物投與之前、同時或之後投與。在一些態樣中，免疫調節物為抗CTLA4抗體或其抗原結合片段、抗PD-1抗體或其抗原結合片段、抗PD-L1抗體或其抗原結合片段、抗4-1BB抗體或其抗原結合片段、或抗OX-40抗體或其抗原結合片段。在一些態樣中，免疫調節物係靜脈內(IV)、肌內(IM)、皮內(ID)或皮下(SC)投與。在一些態樣中，其中皮下投與靠近載體或組合物投與部位或非常接近於一或多個載體或組合物引流淋巴結。 在一些態樣中，該方法另外包含向該個體投與第二疫苗組合物。在一些態樣中，第二疫苗組合物在投與上述載體或組合物中之任一者的載體或醫藥組合物之前投與。在一些態樣中，第二疫苗組合物在投與上述載體或組合物中之任一者的載體或醫藥組合物之後投與。在一些態樣中，第二疫苗組合物與上述載體或組合物中之任一者的載體或醫藥組合物相同。在一些態樣中，第二疫苗組合物不同於上述載體或組合物中之任一者的載體或醫藥組合物。在一些態樣中，第二疫苗組合物包含編碼複數個新抗原編碼核酸序列之自我複製RNA (srRNA)載體。在一些態樣中，由srRNA載體編碼之複數個新抗原編碼核酸序列與上述載體技術方案中之任一者的複數個新抗原編碼核酸序列相同。 本文亦揭示一種製造本文所揭示之載體的方法，該方法包含：獲得包含至少一個啟動子序列及新抗原卡匣之質體序列；將該質體序列轉染至一或多個宿主細胞中；及自該一或多個宿主細胞分離該載體。 在一些態樣中，分離包含：溶解宿主細胞以獲得包含載體之細胞溶解物；及自該細胞溶解物且視情況亦自用於培養該宿主細胞之培養基純化該載體。 在一些態樣中，使用以下中之一者產生質體序列；在細菌細胞中DNA重組，或細菌重組，或全基因組DNA合成，或全基因組DNA合成與擴增合成之DNA。在一些態樣中，一或多個宿主細胞為CHO、HEK293或其變體、911、HeLa、A549、LP-293、PER.C6及AE1-2a細胞中之至少一者。在一些態樣中，自細胞溶解物純化載體涉及層析分離、離心、病毒沈澱及過濾中之一或多者。
相關申請案之交叉引用 本申請案主張2016年11月23日申請之美國臨時申請案第62/425,996號；2016年12月16日申請之美國臨時申請案第62/435,266號；2017年5月8日申請之美國臨時申請案第62/503,196號；及2017年6月21日申請之美國臨時申請案第62/523,212號之權益，其中之每一者以全文引用的方式併入於本文中。序列表 本申請案含有序列表，其已經由EFS-Web提交且以全文引用的方式併入本文中。在20XX年XX月創建之該ASCII複本命名為XXXXXUS_sequencelisting.txt，且大小為X,XXX,XXX位元組。I. 定義 一般而言，申請專利範圍及本說明書中所用之術語意欲解釋為具有一般熟習此項技術者所理解之普通含義。為了更清楚，某些術語定義如下。在普通含義與所提供之定義之間存在矛盾之情況下，將使用所提供之定義。 如本文所用，術語「抗原」為誘導免疫反應之物質。 如本文所用，術語「新抗原」為具有至少一個使其不同於相應野生型抗原之改變的抗原，例如經由腫瘤細胞中之突變或特異性針對腫瘤細胞之轉譯後修飾。新抗原可包括多肽序列或核苷酸序列。突變可包括讀框轉移或非讀框轉移插入缺失、誤義或無義取代、剪接位點改變、基因組重排或基因融合、或產生neoORF之任何基因組或表現改變。突變亦可包括剪接變體。特異性針對腫瘤細胞之轉譯後修飾可包括異常磷酸化。特異性針對腫瘤細胞之轉譯後修飾亦可包括蛋白酶體產生之剪接抗原。參見Liepe等人, A large fraction of HLA class I ligands are proteasome-generated spliced peptides; Science. 2016年10月21日;354(6310):354-358. 如本文所用，術語「腫瘤新抗原」為存在於個體之腫瘤細胞或組織中但不存在於個體之相應正常細胞或組織中的新抗原。 如本文所用，術語「基於新抗原之疫苗」為基於一或多個新抗原(例如複數個新抗原)之疫苗構築體。 如本文所用，術語「候選新抗原」為產生可代表新抗原之新序列的突變或其他畸變。 如本文所用，術語「編碼區」為編碼蛋白質之基因的部分。 如本文所用，術語「編碼突變」為在編碼區中出現之突變。 如本文所用，術語「ORF」意指開放閱讀框架。 如本文所用，術語「NEO-ORF」為由突變或其他畸變(諸如剪接)產生之腫瘤特異性ORF。 如本文所用，術語「誤義突變」為引起一個胺基酸至另一個胺基酸之取代的突變。 如本文所用，術語「無義突變」為引起胺基酸至終止密碼子之取代的突變。 如本文所用，術語「讀框轉移突變」為引起蛋白質框架改變之突變。 如本文所用，術語「插入缺失」為一或多個核酸之插入或缺失。 如本文所用，在兩個或更多個核酸或多肽序列之上下文中，術語「一致性」百分比係指當出於最大對應性比較及比對時，兩個或更多個序列或子序列具有指定百分比之核苷酸或胺基酸殘基為相同的，如使用下文所述之序列比較算法(例如BLASTP及BLASTN或技術人員可用之其他算法)中之一者或藉由目視檢查所量測。視應用而定，「一致性」百分比可存在於所比較之序列區域上，例如在功能域上，或者，存在於有待比較之兩個序列的全長上。 關於序列比較，通常一個序列充當與測試序列進行比較之參考序列。當使用序列比較算法時，將測試序列及參考序列輸入至電腦中，必要時指定子序列座標，且指定序列算法程式參數。隨後，序列比較算法基於指定程式參數計算測試序列相對於參考序列之序列一致性百分比。或者，序列相似性或不相似性可藉由組合存在或不存在特定核苷酸，或對於轉譯序列，在所選擇之序列位置(例如序列基元)處之胺基酸來建立。 用於比較之序列的最佳比對可例如藉由Smith及Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)之局部同源性算法、藉由Needleman及Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)之同源性比對算法、藉由Pearson及Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)之相似性搜尋方法、藉由此等算法之電腦化實施(Wisconsin Genetics套裝軟體中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.)或藉由目視檢查(一般參見Ausubel等人, 見下文)來進行。 適於確定序列一致性百分比及序列相似性之算法的一個實例為BLAST算法，其描述於Altschul等人, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)中。執行BLAST分析之軟體可經由國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)公開獲得。 如本文所用，術語「無終止或通讀」為引起天然終止密碼子移除之突變。 如本文所用，術語「抗原決定基」為通常由抗體或T細胞受體結合之抗原的特異性部分。 如本文所用，術語「免疫原性」為例如經由T細胞、B細胞或兩者引發免疫反應之能力。 如本文所用，術語「HLA結合親和力」、「MHC結合親和力」意指特異性抗原與特異性MHC等位基因之間結合的親和力。 如本文所用，術語「誘鉺」為用於自樣品富集DNA或RNA之特定序列的核酸探針。 如本文所用，術語「變體」為個體之核酸與用作對照之參考人類基因組之間的差異。 如本文所用，術語「變體識別」為通常根據定序之變體存在的算法確定。 如本文所用，術語「多形現象」為生殖系變體，亦即在個體之所有攜帶DNA的細胞中發現的變體。 如本文所用，術語「體細胞變體」為在個體之非生殖系細胞中產生之變體。 如本文所用，術語「等位基因」為基因之形式或基因序列之形式或蛋白質之形式。 如本文所用，術語「HLA型」為HLA基因等位基因之補體。 如本文所用，術語「無義介導之衰變」或「NMD」為因過早終止密碼子所致的細胞對mRNA之降解。 如本文所用，術語「軀幹突變」為起源於腫瘤發展早期且存在於大部分腫瘤細胞中之突變。 如本文所用，術語「亞純系突變」為起源於腫瘤發展後期且僅存在於腫瘤細胞子集中之突變。 如本文所用，術語「外顯子組」為編碼蛋白質之基因組的子集。外顯子組可為基因組之集合外顯子。 如本文所用，術語「邏輯回歸」為來自統計之二進制資料的回歸模型，其中因變數等於1之機率的邏輯經模型化為因變數之線性函數。 如本文所用，術語「神經網路」為用於分類或回歸之機器學習模型，其由多層線性變換組成，接著為通常經由隨機梯度下降及反向傳播進行訓練之元素級非線性。 如本文所用，術語「蛋白質組」為由細胞、細胞群或個體表現及/或轉譯之全部蛋白質的集合。 如本文所用，術語「肽組」為由MHC-I或MHC-II在細胞表面上呈現之所有肽的集合。肽組可指細胞或細胞集合(例如腫瘤肽組，意味著構成腫瘤之所有細胞的肽組的聯合)之特性。 如本文所用，術語「ELISPOT」意指酶聯免疫吸附斑點分析，其為用於監測人類及動物中之免疫反應的常用方法。 如本文所用，術語「葡聚糖肽多聚體」為在流式細胞測量術中用於抗原特異性T細胞染色之基於葡聚糖的肽-MHC多聚體。 如本文所用，術語「耐受性或免疫耐受性」為對一或多種抗原(例如自身抗原)免疫無反應性的狀態。 如本文所用，術語「中心耐受性」為藉由缺失自身反應性T細胞純系或藉由促進自身反應性T細胞純系分化成免疫抑制性調節性T細胞(Treg)而在胸腺中遭受的耐受性。 如本文所用，術語「外周耐受性」為藉由下調或不激活經受中心耐受性之自身反應性T細胞或促進此等T細胞分化成Treg而在外周遭受的耐受性。 術語「樣品」可包括藉由包括靜脈穿刺、排泄、射精、按摩、活組織檢查、針抽吸、灌洗樣品、刮取、手術切口或干預之手段或此項技術中已知的其他手段自個體獲取之單細胞或多細胞或細胞碎片或體液等分試樣。 術語「個體」涵蓋人類或非人類、無論活體內、離體或活體外、雄性或雌性的細胞、組織或生物體。術語個體包括涵蓋人類之哺乳動物。 術語「哺乳動物」涵蓋人類及非人類，且包括(但不限於)人類、非人類靈長類動物、犬科動物、貓科動物、鼠科動物、牛科動物、馬科動物及豬科動物。 術語「臨床因素」係指個體狀況之量度，例如疾病活動或嚴重程度。「臨床因素」涵蓋個體健康狀況之所有標記，包括非樣品標記，及/或個體之其他特徵，諸如但不限於年齡及性別。臨床因素可為可在確定條件下評估來自個體之樣品(或樣品群體)或個體而獲得的評分、值或值集合。臨床因素亦可藉由標記及/或其他參數(諸如基因表現代替物)來預測。臨床因素可包括腫瘤類型、腫瘤亞型及吸菸史。 術語「源於腫瘤之抗原編碼核酸序列」係指例如經由RT-PCR直接自腫瘤提取之核酸序列；或藉由腫瘤定序獲得之序列資料，且隨後使用定序資料例如經由此項技術中已知的各種合成或基於PCR之方法合成核酸序列。 術語「α病毒」係指披膜病毒科(Togaviridae )之成員，且為正義單股RNA病毒。α病毒通常分類為舊世界，諸如辛德畢斯(Sindbis)、羅斯河(Ross River)、馬雅羅(Mayaro)、基孔肯雅(Chikungunya)及塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)，或新世界，諸如東部馬腦炎(eastern equine encephalitis)、奧拉(Aura)、摩根堡(Fort Morgan)、或委內瑞拉馬腦炎(Venezuelan equine encephalitis)及其衍生病毒株TC-83。α病毒通常為自我複製RNA病毒。 術語「α病毒主鏈」係指允許病毒基因組自我複製之α病毒的最小序列。最小序列可包括用於非結構蛋白質介導之擴增的保守序列、非結構蛋白質1 (nsP1)基因、nsP2基因、nsP3基因、nsP4基因及polyA序列，以及用於亞基因組病毒RNA表現之序列，包括26S啟動子元件。 術語「用於非結構蛋白質介導之擴增的序列」包括熟習此項技術者熟知的α病毒保守序列元件(CSE)。CSE包括(但不限於) α病毒5' UTR、51-nt CSE、24-nt CSE或其他26S亞基因組啟動子序列、19-nt CSE及α病毒3' UTR。 術語「RNA聚合酶」包括催化由DNA模板產生RNA聚核苷酸之聚合酶。RNA聚合酶包括(但不限於)源於噬菌體之聚合酶，包括T3、T7及SP6。 術語「脂質」包括疏水性及/或兩親媒性分子。脂質可為陽離子、陰離子或中性的。脂質可為合成或天然來源的，且在一些情況下為可生物降解的。脂質可包括膽固醇、磷脂、脂質結合物，包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)結合物(聚乙二醇化脂質)、蠟、油、甘油酯、脂肪及脂溶性維生素。脂質亦可包括二亞油基甲基-4-二甲基胺基丁酸酯(MC3)及MC3樣分子。 術語「脂質奈米粒子」或「LNP」包括使用含脂質膜圍繞水性內部形成之小泡樣結構，亦稱為脂質體。脂質奈米粒子包括具有藉由界面活性劑穩定之固體脂質核心的基於脂質之組合物。核心脂質可為脂肪酸、醯基甘油、蠟及此等界面活性劑之混合物。生物膜脂質，諸如磷脂、鞘磷脂、膽汁鹽(牛磺膽酸鈉)及固醇(膽固醇)，可用作穩定劑。脂質奈米粒子可使用限定比率之不同脂質分子形成，包括(但不限於)限定比率之一或多種陽離子脂質、陰離子脂質或中性脂質。脂質奈米粒子可將分子囊封在外膜殼內，且隨後可與靶細胞接觸以將囊封之分子遞送至宿主細胞胞溶質。脂質奈米粒子可用非脂質分子修飾或官能化，包括在其表面上。脂質奈米粒子可為單層或多層。脂質奈米粒子可與核酸複合。單層脂質奈米粒子可與核酸複合，其中核酸在水性內部。多層脂質奈米粒子可與核酸複合，其中核酸在水性內部，或形成或包夾在之間。 縮寫：MHC：主要組織相容複合體；HLA：人類白細胞抗原或人類MHC基因座；NGS：下一代定序；PPV：陽性預測值；TSNA：腫瘤特異性新抗原；FFPE：福馬林固定、石蠟包埋；NMD：無義介導之衰變；NSCLC：非小細胞肺癌；DC：樹突狀細胞。 應注意，除非上下文另外明確規定，否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所用，單數形式「一(a/an)」及「該」包括複數個指示物。 本文中未直接定義之任何術語應理解為具有與本發明之技術領域中所理解通常相關的含義。本文論述某些術語，以向從業者描述本發明之態樣的組合物、裝置、方法及其類似物以及如何製造或使用其提供額外的指導。應瞭解，相同事物可以多於一種方式來表達。因此，替代性措辭及同義詞可用於本文所論述之術語中之任何一或多者。重要性將不在於術語是否在本文中詳述或論述。提供一些同義詞或可取代方法、材料及其類似物。除非明確陳述，否則對一個或數個同義詞或等效物的敍述不排除使用其他同義詞或等效物。包括術語實例在內之實例的使用僅用於說明性目的，且不在本文中限制本發明之態樣的範疇及含義。 出於所有目的，在本說明書正文內引用之所有參考文獻、頒佈專利及專利申請案均以全文引用之方式併入本文中。II. 鑑別新抗原之方法 本文揭示用於鑑別來自個體腫瘤之新抗原的方法，該等新抗原可能呈現在腫瘤之細胞表面上及/或可能為免疫原性的。舉例而言，一種此類方法可包含以下步驟：自個體之腫瘤細胞獲得外顯子組、轉錄組或全基因組腫瘤核苷酸定序資料中之至少一者，其中該腫瘤核苷酸定序資料用於獲得代表新抗原集合中之每一者之肽序列的資料，且其中各新抗原之肽序列包含至少一個使其不同於相應野生型肽序列之改變；將各新抗原之肽序列輸入至一或多個呈現模型中，以產生新抗原中之每一者在個體腫瘤細胞之腫瘤細胞表面或腫瘤中存在之細胞上由一或多個MHC等位基因呈現的數值可能性集合，該數值可能性集合已至少基於所接收之質譜資料進行鑑別；及基於該數值可能性集合選擇該新抗原集合之子集，以產生經選擇之新抗原集合。 呈現模型可包含在參考資料集合(亦稱為訓練資料集)上訓練的統計回歸或機器學習(例如深度學習)模型，該參考資料集合包含相應標記集合，其中該參考資料集合獲自複數個不同個體中之每一者，其中視情況一些個體可具有腫瘤，且其中該參考資料集合包含以下中之至少一者：代表來自腫瘤組織之外顯子組核苷酸序列的資料、代表來自正常組織之外顯子組核苷酸序列的資料、代表來自腫瘤組織之轉錄組核苷酸序列的資料、代表來自腫瘤組織之蛋白質組序列的資料、代表來自腫瘤組織之MHC肽組序列的資料以及代表來自正常組織之MHC肽組序列的資料。參考資料可另外包含經工程改造以表現隨後暴露於合成蛋白質之預定MHC等位基因的單等位基因細胞株、正常及腫瘤人類細胞株、以及新鮮及冷凍原始樣品的質譜資料、定序資料、RNA定序資料及蛋白質組學資料，及T細胞分析(例如ELISPOT)。在某些態樣中，該參考資料集合包括每種形式之參考資料。 呈現模型可包含至少部分自該參考資料集合導出的特徵集合，且其中該特徵集合包含等位基因依賴性特徵及等位基因非依賴性特徵中之至少一者。在某些態樣中，包括每一特徵。 樹突狀細胞呈現於初始T細胞之特徵可包含以下中之至少一者：上述特徵。疫苗中抗原之劑量及類型(例如肽、mRNA、病毒等)：(1)樹突狀細胞(DC)攝取抗原類型之途徑(例如內飲作用、微胞飲作用)；及/或(2) DC攝取抗原之功效。疫苗中佐劑之劑量及類型。疫苗抗原序列之長度。疫苗投與之次數及部位。基線患者免疫功能(例如，如藉由最近感染史、血液計數等所量測)。對於RNA疫苗：(1)樹突狀細胞中mRNA蛋白質產物之周轉率；(2)如活體外或活體內實驗中所量測，在樹突狀細胞攝取後mRNA之轉譯速率；及/或(3)如藉由活體內或活體外實驗所量測，在樹突狀細胞攝取後mRNA之轉譯的數目或輪數。肽中蛋白酶裂解基元之存在，視情況給予通常在樹突狀細胞中表現之蛋白酶的額外重量(如藉由RNA-seq或質譜法所量測)。典型的活化樹突狀細胞中蛋白酶體及免疫蛋白酶體的表現量(其可藉由RNA-seq、質譜法、免疫組織化學或其他標準技術量測)。所討論之個體中特定MHC等位基因之表現量(例如，如藉由RNA-seq或質譜法所量測)，視情況在活化的樹突狀細胞或其他免疫細胞中特異性量測。在表現特定MHC等位基因之其他個體中由特定MHC等位基因呈現肽之機率，視情況在活化的樹突狀細胞或其他免疫細胞中特異性量測。在其他個體中由同一家族分子(例如HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-DP)中之MHC等位基因呈現肽之機率，視情況在活化的樹突狀細胞或其他免疫細胞中特異性量測。 免疫耐受逃避特徵可包含以下中之至少一者：經由對一個或數個細胞類型進行之蛋白質質譜法直接量測自身肽組。藉由採用自身蛋白質之所有k聚體(例如5-25)子串的聯合來估計自身肽組。使用與上述應用於所有非突變自身蛋白質之呈現模型類似的呈現模型估計自身肽組，視情況考慮生殖系變體。 可使用由至少一個模型提供的複數個新抗原至少部分地基於數值可能性來執行排序。在排序後，可執行選擇以根據選擇標準來選擇經排序之新抗原的子集。在選擇後，可提供經排序之肽的子集作為輸出。 該經選擇之新抗原集合的數目可為20個。 呈現模型可表示以下兩者之間的依賴性：MHC等位基因中之一對特定等位基因及在肽序列之特定位置處之特定胺基酸的存在；與在腫瘤細胞表面上由該對MHC等位基因中之一特定者呈現在特定位置處包含特定胺基酸之此類肽序列的可能性。 本文所揭示之方法亦可包括將一或多種呈現模型應用於相應新抗原之肽序列，以產生一或多個MHC等位基因中之每一者的依賴性評分，指示MHC等位基因是否將至少基於相應新抗原之肽序列的胺基酸位置呈現相應新抗原。 本文所揭示之方法亦可包括變換依賴性評分以產生各MHC等位基因之相應的獨立等位基因的可能性，指示相應的MHC等位基因將呈現相應的新抗原的可能性；及組合獨立等位基因的可能性以產生數值可能性。 變換依賴性評分之步驟可使相應新抗原之肽序列的呈現模型化為相互排斥的。 本文所揭示之方法亦可包括變換依賴性評分組合以產生數值可能性。 變換依賴性評分組合之步驟可使相應新抗原之肽序列的呈現作為MHC等位基因之間的干擾而模型化。 該數值可能性集合可藉由至少一個等位基因非相互作用特徵進一步鑑別，且本文所揭示之方法亦可包括將不與一或多個呈現模型中之一者相互作用的等位基因應用於等位基因非相互作用特徵，以產生等位基因非相互作用特徵之依賴性評分，指示相應新抗原之肽序列是否將基於等位基因非相互作用特徵呈現。 本文所揭示之方法亦可包括將一或多個MHC等位基因中之每個MHC等位基因的依賴性評分與等位基因非相互作用特徵的依賴性評分組合；變換每個MHC等位基因之組合依賴性評分以產生MHC等位基因中相應的獨立等位基因的可能性，指示相應的MHC等位基因將呈現相應的新抗原的可能性；及組合獨立等位基因的可能性以產生數值可能性。 本文所揭示之方法亦可包括變換每個MHC等位基因之依賴性評分與等位基因非相互作用特徵之依賴性評分的組合以產生數值可能性。 用於呈現模型之數值參數集合可基於訓練資料集來訓練，該訓練資料集包括鑑別為存在於複數個樣品中之至少一個訓練肽序列集合及與每個訓練肽序列相關之一或多個MHC等位基因，其中訓練肽序列係經由對自源於複數個樣品之MHC等位基因溶離的經分離之肽進行質譜法來鑑別。 樣品亦可包括經工程改造以表現單個MHC I類或II類等位基因之細胞株。 樣品亦可包括經工程改造以表現複數個MHC I類或II類等位基因之細胞株。 樣品亦可包括獲自或源於複數個患者之人類細胞株。 樣品亦可包括獲自複數個患者之新鮮或冷凍的腫瘤樣品。 樣品亦可包括獲自複數個患者之新鮮或冷凍的組織樣品。 樣品亦可包括使用T細胞分析鑑別之肽。 訓練資料集可另外包括與以下相關之資料：樣品中存在之訓練肽集合的肽豐度；樣品中之訓練肽集合的肽長度。 訓練資料集可藉由將訓練肽序列集合與包含已知蛋白質序列集合之資料庫經由比對進行比較來產生，其中訓練蛋白質序列集合比訓練肽序列更長且包括訓練肽序列。 訓練資料集可基於對細胞株執行或已執行核苷酸定序以獲得該細胞株之外顯子組、轉錄組或全基因組定序資料中之至少一者來產生，該定序資料包括至少一個包括改變之核苷酸序列。 訓練資料集可基於自正常組織樣品獲得外顯子組、轉錄組及全基因組正常核苷酸定序資料中之至少一者來產生。 訓練資料集可另外包括與樣品相關之蛋白質組序列相關的資料。 訓練資料集可另外包括與樣品相關之MHC肽組序列相關的資料。 訓練資料集可另外包括與至少一種經分離之肽的肽-MHC結合親和力量測相關的資料。 訓練資料集可另外包括與至少一種經分離之肽的肽-MHC結合穩定性量測相關的資料。 訓練資料集可另外包括與樣品相關之轉錄組相關的資料。 訓練資料集可另外包括與樣品相關之基因組相關的資料。 訓練肽序列之長度可在k聚體之範圍內，其中k對於MHC I類而言在8-15之間(包括端點)或對於MHC II類而言在9-30之間(包括端點)。 本文所揭示之方法亦可包括使用獨熱編碼方案編碼肽序列。 本文所揭示之方法亦可包括使用左填充獨熱編碼方案編碼訓練肽序列。 治療具有腫瘤之個體的方法包含執行技術方案1之步驟，且另外包含獲得包含經選擇之新抗原集合的腫瘤疫苗，且向該個體投與該腫瘤疫苗。 本文亦揭示一種用於製造腫瘤疫苗之方法，其包含以下步驟：自個體之腫瘤細胞獲得外顯子組、轉錄組或全基因組腫瘤核苷酸定序資料中之至少一者，其中該腫瘤核苷酸定序資料用於獲得代表新抗原集合中之每一者之肽序列的資料，且其中各新抗原之肽序列包含至少一個使其不同於相應野生型肽序列之改變；將各新抗原之肽序列輸入至一或多個呈現模型中，以產生新抗原中之每一者在個體腫瘤細胞之腫瘤細胞表面上由一或多個MHC等位基因呈現的數值可能性集合，該數值可能性集合已至少基於所接收之質譜資料進行鑑別；及基於該數值可能性集合選擇該新抗原集合之子集，以產生經選擇之新抗原集合；及產生或已產生包含該經選擇之新抗原集合的腫瘤疫苗。 本文亦揭示一種包括經選擇之新抗原集合的腫瘤疫苗，該經選擇之新抗原集合藉由執行包含以下步驟之方法來選擇：自個體之腫瘤細胞獲得外顯子組、轉錄組或全基因組腫瘤核苷酸定序資料中之至少一者，其中該腫瘤核苷酸定序資料用於獲得代表新抗原集合中之每一者之肽序列的資料，且其中各新抗原之肽序列包含至少一個使其不同於相應野生型肽序列之改變；將各新抗原之肽序列輸入至一或多個呈現模型中，以產生新抗原中之每一者在個體腫瘤細胞之腫瘤細胞表面上由一或多個MHC等位基因呈現的數值可能性集合，該數值可能性集合已至少基於所接收之質譜資料進行鑑別；及基於該數值可能性集合選擇該新抗原集合之子集，以產生經選擇之新抗原集合；及產生或已產生包含該經選擇之新抗原集合的腫瘤疫苗。 腫瘤疫苗可包括核苷酸序列、多肽序列、RNA、DNA、細胞、質體或載體中之一或多者。 腫瘤疫苗可包括在腫瘤細胞表面上呈現之一或多個新抗原。 腫瘤疫苗可包括在個體中具有免疫原性之一或多個新抗原。 腫瘤疫苗可不包含在個體中誘導針對正常組織之自體免疫反應的一或多個新抗原。 腫瘤疫苗可包括佐劑。 腫瘤疫苗可包括賦形劑。 本文所揭示之方法亦可包括基於呈現模型選擇相對於未經選擇之新抗原在腫瘤細胞表面上呈現之可能性增加的新抗原。 本文所揭示之方法亦可包括基於呈現模型選擇相對於未經選擇之新抗原能夠在個體中誘導腫瘤特異性免疫反應之可能性增加的新抗原。 本文所揭示之方法亦可包括基於呈現模型選擇相對於未經選擇之新抗原能夠由專職抗原呈現細胞(APC)呈現於初始T細胞之可能性增加的新抗原，視情況其中該APC為樹突狀細胞(DC)。 本文所揭示之方法亦可包括基於呈現模型選擇相對於未經選擇之新抗原經由中心或外周耐受性受抑制之可能性降低的新抗原。 本文所揭示之方法亦可包括基於呈現模型選擇相對於未經選擇之新抗原能夠在個體中誘導針對正常組織之自體免疫反應之可能性降低的新抗原。 外顯子組或轉錄組核苷酸定序資料可藉由對腫瘤組織進行定序而獲得。 定序可為下一代定序(NGS)或任何大規模平行定序方法。 數值可能性集合可藉由至少MHC-等位基因相互作用特徵來進一步鑑別，該等特徵包含以下中之至少一者：經預測之MHC等位基因與新抗原編碼肽結合之親和力；經預測之新抗原編碼肽-MHC複合物之穩定性；新抗原編碼肽之序列及長度；如藉由質譜蛋白質組學或其他手段所評定，在來自表現特定MHC等位基因之其他個體的細胞中呈現具有類似序列之新抗原編碼肽的機率；所討論之個體中特定MHC等位基因之表現量(例如，如藉由RNA-seq或質譜法所量測)；在表現特定MHC等位基因之其他不同個體中由特定MHC等位基因呈現之總體新抗原編碼肽序列獨立性機率；在其他不同個體中由同一家族分子(例如HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-DP)中之MHC等位基因呈現之總體新抗原編碼肽序列獨立性機率。 數值可能性集合藉由至少MHC-等位基因非相互作用特徵來進一步鑑別，該等特徵包含以下中之至少一者：在其源蛋白序列內側接新抗原編碼肽之C端及N端序列；新抗原編碼肽中蛋白酶裂解基元之存在，視情況根據相應蛋白酶在腫瘤細胞中之表現加權(如藉由RNA-seq或質譜法所量測)；如在適當細胞類型中所量測，源蛋白之周轉率；源蛋白之長度，視情況考慮在腫瘤細胞中最高度表現之特異性剪接變體(「同功異型物」)，如藉由RNA-seq或蛋白質組質譜法所量測，或如DNA或RNA序列資料中所偵測之生殖系或體細胞剪接突變的註解所預測；蛋白酶體、免疫蛋白酶體、胸腺蛋白酶體或其他蛋白酶在腫瘤細胞中之表現量(其可藉由RNA-seq、蛋白質組質譜法或免疫組織化學量測)；新抗原編碼肽之源基因的表現(例如，如藉由RNA-seq或質譜法所量測)；新抗原編碼肽之源基因在細胞週期之各種階段期間的典型組織特異性表現；源蛋白及/或其域之綜合特徵目錄，如例如uniProt或PDB http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do中可見；描述含有該肽之源蛋白之域特性的特徵，例如：二級或三級結構(例如α螺旋對β摺疊)；替代性剪接；在其他不同個體中由所討論之新抗原編碼肽之源蛋白呈現肽的機率；由於技術偏差，肽將不會由質譜法偵測到或過量表示之機率；藉由RNASeq (其無需含有肽之源蛋白)所量測之提供關於腫瘤細胞、基質或腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)狀態之資訊的各種基因模組/通路之表現；新抗原編碼肽之源基因在腫瘤細胞中之複本數；肽結合於TAP之機率或經量測或經預測之肽對TAP之結合親和力；TAP在腫瘤細胞中之表現量(其可藉由RNA-seq、蛋白質組質譜法、免疫組織化學量測)；存在或不存在腫瘤突變，包括(但不限於)：已知癌症驅動基因(諸如EGFR、KRAS、ALK、RET、ROS1、TP53、CDKN2A、CDKN2B、NTRK1、NTRK2、NTRK3)及編碼抗原呈現機制中所涉及之蛋白質的基因(例如B2M、HLA-A、HLA-B、HLA-C、TAP-1、TAP-2、TAPBP、CALR、CNX、ERP57、HLA-DM、HLA-DMA、HLA-DMB、HLA-DO、HLA-DOA、HLA-DOBHLA-DP、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQ、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DR、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5或編碼蛋白酶體或免疫蛋白酶體組分之基因中之任一者)中的驅動突變。呈現依賴於腫瘤中經受功能喪失性突變之抗原呈現機制之組分的肽具有降低的呈現機率；存在或不存在功能性生殖系多形現象，包括(但不限於)：在編碼抗原呈現機制中所涉及之蛋白質的基因(例如B2M、HLA-A、HLA-B、HLA-C、TAP-1、TAP-2、TAPBP、CALR、CNX、ERP57、HLA-DM、HLA-DMA、HLA-DMB、HLA-DO、HLA-DOA、HLA-DOBHLA-DP、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQ、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DR、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5或編碼蛋白酶體或免疫蛋白酶體組分之基因中之任一者)中；腫瘤類型(例如NSCLC、黑素瘤)；臨床腫瘤亞型(例如鱗狀肺癌對非鱗狀)；吸菸史；該肽之源基因在相關腫瘤類型或臨床亞型中之典型表現，視情況藉由驅動突變分層。 至少一個改變可為讀框轉移或非讀框轉移插入缺失、誤義或無義取代、剪接位點改變、基因組重排或基因融合、或產生neoORF之任何基因組或表現改變。 腫瘤細胞可選自由以下組成之群：肺癌、黑素瘤、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、胃癌、結腸癌、睪丸癌、頭頸癌、胰臟癌、腦癌、B細胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴球性白血病、T細胞淋巴球性白血病、非小細胞肺癌及小細胞肺癌。 本文所揭示之方法亦可包括獲得包含經選擇之新抗原集合或其子集的腫瘤疫苗，視情況另外包含向個體投與該腫瘤疫苗。 當呈多肽形式時，經選擇之新抗原集合中之至少一種新抗原可包括以下中之至少一者：在小於1000 nM之IC50值下與MHC之結合親和力，對於長度為8-15、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸之MHC 1類多肽，在親本蛋白質序列中在該多肽內部或附近存在促進蛋白酶體裂解之序列基元，及存在促進TAP轉運之序列基元。 本文亦揭示一種產生用於鑑別可能在腫瘤細胞之腫瘤細胞表面上呈現之一或多個新抗原之模型的方法，其包含以下步驟：接收包含與自源於複數個樣品之主要組織相容複合體(MHC)溶離的複數個經分離之肽相關之資料的質譜資料；藉由至少鑑別樣品中存在之訓練肽序列集合及與各訓練肽序列相關之一或多個MHC獲得訓練資料集；使用包含訓練肽序列之訓練資料集來訓練呈現模型之數值參數集合，呈現模型提供來自腫瘤細胞之肽序列在腫瘤細胞表面上由一或多個MHC等位基因呈現之複數個數值可能性。 呈現模型可表示以下兩者之間的依賴性：在肽序列之特定位置處存在特定胺基酸；與由腫瘤細胞上之MHC等位基因中之一者呈現在該特定位置處含有該特定胺基酸之肽序列的可能性。 樣品亦可包括經工程改造以表現單個MHC I類或II類等位基因之細胞株。 樣品亦可包括經工程改造以表現複數個MHC I類或II類等位基因之細胞株。 樣品亦可包括獲自或源於複數個患者之人類細胞株。 樣品亦可包括獲自複數個患者之新鮮或冷凍的腫瘤樣品。 樣品亦可包括使用T細胞分析鑑別之肽。 訓練資料集可另外包括與以下相關之資料：樣品中存在之訓練肽集合的肽豐度；樣品中之訓練肽集合的肽長度。 本文所揭示之方法亦可包括藉由將訓練肽序列集合與包含已知蛋白質序列集合之資料庫經由比對進行比較來獲得基於訓練肽序列之訓練蛋白質序列集合，其中訓練蛋白質序列集合比訓練肽序列更長且包括訓練肽序列。 本文所揭示之方法亦可包括對細胞株執行或已執行質譜法以獲得該細胞株之外顯子組、轉錄組或全基因組核苷酸定序資料中之至少一者，該核苷酸定序資料包括至少一個包括突變之蛋白質序列。 本文所揭示之方法亦可包括：使用獨熱編碼方案編碼訓練肽序列。 本文所揭示之方法亦可包括自正常組織樣品獲得外顯子組、轉錄組及全基因組正常核苷酸定序資料中之至少一者；及使用正常核苷酸定序資料訓練呈現模型之參數集合。 訓練資料集可另外包括與樣品相關之蛋白質組序列相關的資料。 訓練資料集可另外包括與樣品相關之MHC肽組序列相關的資料。 訓練資料集可另外包括與至少一種經分離之肽的肽-MHC結合親和力量測相關的資料。 訓練資料集可另外包括與至少一種經分離之肽的肽-MHC結合穩定性量測相關的資料。 訓練資料集可另外包括與樣品相關之轉錄組相關的資料。 訓練資料集可另外包括與樣品相關之基因組相關的資料。 本文所揭示之方法亦可包括使參數集合邏輯回歸。 訓練肽序列之長度可在k聚體之範圍內，其中k對於MHC I類而言在8-15之間(包括端點)或對於MHC II類而言在9-30之間(包括端點)。 本文所揭示之方法亦可包括使用左填充獨熱編碼方案編碼訓練肽序列。 本文所揭示之方法亦可包括使用深度學習算法確定參數集合之值。 本文揭示用於鑑別可能在腫瘤細胞之腫瘤細胞表面上呈現之一或多個新抗原的方法，其包含執行以下步驟：接收包含與自源於複數個新鮮或冷凍腫瘤樣品之主要組織相容複合體(MHC)溶離的複數個經分離之肽相關之資料的質譜資料；藉由至少鑑別腫瘤樣品中存在且呈現在與各訓練肽序列相關之一或多個MHC等位基因上的訓練肽序列集合來獲得訓練資料集；基於訓練肽序列獲得訓練蛋白質序列集合；及使用訓練蛋白質序列及訓練肽序列訓練呈現模型之數值參數集合，呈現模型提供來自腫瘤細胞之肽序列在腫瘤細胞表面上由一或多個MHC等位基因呈現之複數個數值可能性。 呈現模型可表示以下兩者之間的依賴性：MHC等位基因中之一對特定等位基因及在肽序列之特定位置處之特定胺基酸的存在；與在腫瘤細胞表面上由該對MHC等位基因中之一特定者呈現在特定位置處包含特定胺基酸之此類肽序列的可能性。 本文所揭示之方法亦可包括選擇新抗原之子集，其中新抗原之子集係因為相對於一或多個不同腫瘤新抗原各自在腫瘤細胞表面上呈現之可能性增加而被選擇。 本文所揭示之方法亦可包括選擇新抗原之子集，其中新抗原之子集係因為相對於一或多個不同腫瘤新抗原各自能夠在個體中誘導腫瘤特異性免疫反應之可能性增加而被選擇。 本文所揭示之方法亦可包括選擇新抗原之子集，其中新抗原之子集係因為相對於一或多個不同腫瘤新抗原各自能夠由專職抗原呈現細胞(APC)呈現於初始T細胞之可能性增加而被選擇，視情況其中該APC為樹突狀細胞(DC)。 本文所揭示之方法亦可包括選擇新抗原之子集，其中新抗原之子集係因為相對於一或多個不同腫瘤新抗原各自經由中心或外周耐受性受抑制之可能性降低而被選擇。 本文所揭示之方法亦可包括選擇新抗原之子集，其中新抗原之子集係因為相對於一或多個不同腫瘤新抗原各自能夠在個體中誘導針對正常組織之自體免疫反應之可能性降低而被選擇。 本文所揭示之方法亦可包括選擇新抗原之子集，其中新抗原之子集係因為相對於APC各自將在腫瘤細胞中經差異性轉譯後修飾之可能性降低而被選擇，視情況其中該APC為樹突狀細胞(DC)。 除非另外指明，否則本文方法之實踐將採用此項技術之技能範圍內的蛋白質化學、生物化學、重組DNA技術及藥理學之習知方法。此類技術在文獻中充分解釋。參見例如T.E. Creighton,Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993)；A.L. Lehninger,Biochemistry (Worth Publishers, Inc., 現行版)；Sambrook等人,Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版, 1989)；Methods In Enzymology (S. Colowick及N. Kaplan編, Academic Press, Inc.);Remington's Pharmaceutical Sciences , 第18版 (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990)；Carey及SundbergAdvanced Organic Chemistry 第 3 版 . (Plenum Press) A卷及B卷(1992)。III. 鑑別新抗原中之腫瘤特異性突變 本文亦揭示用於鑑別某些突變(例如癌細胞中存在之變體或等位基因)之方法。具體而言，此等突變可存在於患有癌症之個體之癌細胞的基因組、轉錄組、蛋白質組或外顯子組中，而非個體之正常組織中。 若腫瘤中之基因突變引起腫瘤中特有之蛋白質的胺基酸序列變化，則認為其可用於免疫靶向腫瘤。有用的突變包括：(1)非同義突變，導致蛋白質中之胺基酸不同；(2)通讀突變，其中終止密碼子經修飾或缺失，導致轉譯在C端具有新穎腫瘤特異性序列之較長蛋白質；(3)剪接位點突變，導致在成熟mRNA中包含內含子且因此導致特有的腫瘤特異性蛋白質序列；(4)染色體重排，在2種蛋白質之接合處產生具有腫瘤特異性序列之嵌合蛋白質(亦即基因融合)；(5)框移突變或缺失，導致具有新穎腫瘤特異性蛋白質序列之新的開放閱讀框架。突變亦可包括非讀框轉移插入缺失、誤義或無義取代、剪接位點改變、基因組重排或基因融合、或產生neoORF之任何基因組或表現改變中之一或多者。 由例如腫瘤細胞中之剪接位點、讀框轉移、通讀或基因融合突變產生之具有突變之肽或突變多肽可藉由對腫瘤與正常細胞中之DNA、RNA或蛋白質進行定序來鑑別。 突變亦可包括先前鑑別之腫瘤特異性突變。已知腫瘤突變可見於癌症體細胞突變目錄(COSMIC)資料庫。 多種方法可用於偵測個體之DNA或RNA中特定突變或等位基因的存在。本領域中之進步已提供精確、容易且便宜的大規模SNP基因分型。舉例而言，已描述數種技術，包括動態等位基因特異性雜交(DASH)、微量盤陣列對角線凝膠電泳(MADGE)、焦磷酸定序、寡核苷酸特異性連接、TaqMan系統以及各種DNA「晶片」技術，諸如Affymetrix SNP晶片。此等方法利用通常藉由PCR擴增靶基因區。仍有其他方法，基於藉由侵入性裂解產生小信號分子，隨後進行質譜法或固定化掛鎖探針及滾環擴增。下文彙總此項技術中已知用於偵測特異性突變之數種方法。 基於PCR之偵測手段可包括同時多重擴增複數個標記。舉例而言，選擇PCR引子以產生大小不重疊且可同時分析之PCR產物為此項技術中所熟知的。或者，可用經差異性標記且因此可各自經差異性偵測之引子擴增不同的標記。當然，基於雜交之偵測手段允許樣品中多個PCR產物之差異偵測。此項技術中已知其他技術以允許複數個標記之多重分析。 已開發數種方法以便於基因組DNA或細胞RNA中單核苷酸多形現象之分析。舉例而言，單鹼基多形現象可藉由使用特殊化核酸外切酶抗性核苷酸來偵測，如例如Mundy, C. R. (美國專利第4,656,127號)中所揭示。根據該方法，允許與緊靠著多形位點3'之等位基因序列互補的引子與獲自特定動物或人類之靶分子雜交。若靶分子上之多形位點含有與所存在之特定核酸外切酶抗性核苷酸衍生物互補的核苷酸，則該衍生物將併入於雜交引子之末端上。此類併入使得引子對核酸外切酶具有抗性，從而允許其偵測。由於樣品之核酸外切酶抗性衍生物的身分為已知的，故引子已對核酸外切酶具有抗性之發現揭露靶分子之多形位點中存在之核苷酸與反應中所用之核苷酸衍生物互補。此方法之優勢在於其不需要確定大量無關序列資料。 可使用基於溶液之方法確定多形位點之核苷酸的身分。Cohen, D.等人 (法國專利2,650,840；PCT申請案第WO91/02087號)。如在美國專利第4,656,127號之芒迪方法(Mundy method)中，採用與緊靠著多形位點3'之等位基因序列互補的引子。該方法使用經標記之雙去氧核苷酸衍生物確定該位點之核苷酸的身分，若該核苷酸與多形位點之核苷酸互補，則將併入於引子之末端上。 稱為遺傳位元分析或GBA之替代方法由Goelet, P.等人(PCT申請案第92/15712號)描述。Goelet, P.等人之方法使用經標記之終止子及與多形位點3'序列互補之引子的混合物。所併入的經標記之終止子因此藉由所評估之靶分子之多形位點中存在的核苷酸確定且與其互補。與Cohen等人(法國專利2,650,840；PCT申請案第WO91/02087號)之方法相比，Goelet, P.等人之方法可為非均相分析，其中引子或靶分子固定於固相。 已描述數種用於分析DNA中多形位點之引子引導的核苷酸併入程序(Komher, J. S.等人, Nucl. Acids. Res. 17:7779-7784 (1989)；Sokolov, B. P., Nucl. Acids Res. 18:3671 (1990)；Syvanen, A.-C.等人, Genomics 8:684-692 (1990)；Kuppuswamy, M. N.等人, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:1143-1147 (1991)；Prezant, T. R.等人, Hum. Mutat. 1:159-164 (1992)；Ugozzoli, L.等人, GATA 9:107-112 (1992)；Nyren, P.等人, Anal. Biochem. 208:171-175 (1993))。此等方法與GBA的不同之處在於其利用併入經標記之去氧核苷酸來區分多形位點處的鹼基。在此類格式中，由於信號與併入之去氧核苷酸之數目成比例，故在同一核苷酸之操作中發生的多形現象可產生與操作之長度成比例的信號(Syvanen, A.-C.等人, Amer. J. Hum. Genet. 52:46-59 (1993))。 許多方案直接自數百萬個單獨的DNA或RNA分子中並行獲取序列資訊。即時單分子合成定序技術依賴於螢光核苷酸之偵測，因為其併入至與正定序之模板互補的DNA的新生股中。在一種方法中，將長度為30-50個鹼基之寡核苷酸在5'端共價錨定於玻璃蓋玻片上。此等錨定股執行兩種功能。首先，若模板經結構設計成具有與表面結合之寡核苷酸互補的捕捉尾部，則其充當靶模板股之捕捉位點。其亦充當模板引導之引子延伸的引子，形成序列閱讀的基礎。捕捉引子充當固定位點以便使用多個合成、偵測及化學裂解染料連接子來移除染料之循環進行序列測定。各循環由添加聚合酶/經標記之核苷酸混合物、沖洗、成像及染料之裂解組成。在一替代方法中，聚合酶經螢光供體分子修飾且固定在載玻片上，而各核苷酸用連接至γ-磷酸之受體螢光部分進行顏色編碼。系統偵測經螢光標記之聚合酶與經螢光修飾之核苷酸之間的相互作用，因為核苷酸併入至從頭鏈中。亦存在其他合成定序技術。 可使用任何適合之合成定序平台鑑別突變。如上所述，目前可用四種主要合成定序平台：來自Roche/454 Life Sciences之基因組定序儀、來自Illumina/Solexa之1G分析儀、來自Applied BioSystems之SOLiD系統及來自Helicos Biosciences之Heliscope系統。合成定序平台亦已由Pacific BioSciences及VisiGen Biotechnologies描述。在一些實施例中，將要定序之複數個核酸分子結合於支撐物(例如固體支撐物)。為將核酸固定於支撐物上，可在模板之3'及/或5'端添加捕捉序列/通用引發位點。核酸可藉由將捕捉序列與共價連接於支撐物之互補序列雜交而結合於支撐物。捕捉序列(亦稱為通用捕捉序列)為與連接至支撐物之序列互補的核酸序列，其可雙重充當通用引子。 作為捕捉序列之替代方案，偶合對(諸如抗體/抗原、受體/配體或如例如美國專利申請案第2006/0252077號中所述之抗生物素蛋白-生物素對)之一成員可連接於各片段，而被捕捉在用該偶合對之相應第二成員塗佈的表面上。 在捕捉後，可例如藉由單分子偵測/定序來分析序列，例如，如實例及美國專利第7,283,337號中所述，包括模板依賴性合成定序。在合成定序中，表面結合之分子在聚合酶存在下暴露於複數個經標記之核苷酸三磷酸。模板之序列藉由併入至生長鏈之3'端的經標記之核苷酸的順序來確定。此可即時進行或可以分步重複模式進行。對於即時分析，可將不同的光學標記併入各核苷酸且可利用多個雷射刺激併入的核苷酸。 定序亦可包括其他大規模平行定序或下一代定序(NGS)技術及平台。大規模平行定序技術及平台之額外實例為the Illumina HiSeq或MiSeq、Thermo PGM或Proton、the Pac Bio RS II或Sequel、Qiagen之Gene Reader及the Oxford Nanopore MinION。可使用其他類似的當前大規模平行定序，以及此等技術之後代。 可利用任何細胞類型或組織來獲得用於本文所述之方法的核酸樣品。舉例而言，DNA或RNA樣品可獲自腫瘤或體液，例如藉由已知技術(例如靜脈穿刺)獲得之血液或唾液。或者，可對乾燥樣品(例如頭髮或皮膚)執行核酸測試。另外，可自腫瘤獲得樣品用於定序且可自正常組織獲得另一樣品用於定序，其中正常組織具有與腫瘤相同的組織類型。可自腫瘤獲得樣品用於定序且可自正常組織獲得另一樣品用於定序，其中正常組織相對於腫瘤具有不同的組織類型。 腫瘤可包括肺癌、黑素瘤、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、胃癌、結腸癌、睪丸癌、頭頸癌、胰臟癌、腦癌、B細胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴球性白血病、T細胞淋巴球性白血病、非小細胞肺癌及小細胞肺癌中之一或多者。 或者，可使用蛋白質質譜法鑑別或驗證與腫瘤細胞上之MHC蛋白質結合之突變肽的存在。肽可自腫瘤細胞或自腫瘤免疫沈澱之HLA分子酸溶離，且隨後使用質譜法鑑別。IV. 新抗原 新抗原可包括核苷酸或多肽。舉例而言，新抗原可為編碼多肽序列之RNA序列。可用於疫苗中之新抗原可因此包括核苷酸序列或多肽序列。 本文揭示包含藉由本文所揭示之方法鑑別的腫瘤特異性突變的經分離之肽、包含已知腫瘤特異性突變之肽及藉由本文所揭示之方法鑑別的突變多肽或其片段。新抗原肽可描述於其編碼序列之上下文中，其中新抗原包括編碼相關多肽序列之核苷酸序列(例如DNA或RNA)。 由新抗原核苷酸序列編碼之一或多個多肽可包含以下中之至少一者：在小於1000 nM之IC50值下與MHC之結合親和力，對於長度為8-15、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸之MHC 1類多肽，在肽內部或附近存在促進蛋白酶體裂解之序列基元，及存在促進TAP轉運之序列基元。 一或多個新抗原可呈現在腫瘤之表面上。 一或多個新抗原在具有腫瘤之個體中可為免疫原性的，例如能夠在個體中引發T細胞反應或B細胞反應。 在疫苗生產背景下，對於具有腫瘤之個體，可不考慮在個體中誘導自體免疫反應之一或多個新抗原。 至少一個新抗原肽分子之大小可包含(但不限於)約5個、約6個、約7個、約8個、約9個、約10個、約11個、約12個、約13個、約14個、約15個、約16個、約17個、約18個、約19個、約20個、約21個、約22個、約23個、約24個、約25個、約26個、約27個、約28個、約29個、約30個、約31個、約32個、約33個、約34個、約35個、約36個、約37個、約38個、約39個、約40個、約41個、約42個、約43個、約44個、約45個、約46個、約47個、約48個、約49個、約50個、約60個、約70個、約80個、約90個、約100個、約110個、約120個或更多個胺基分子殘基，及其中可導出之任何範圍。在具體實施例中，新抗原肽分子等於或小於50個胺基酸。 新抗原肽及多肽可為：對於MHC I類，15個殘基或更小的長度且通常由約8至約11個殘基、尤其9或10個殘基組成；對於MHC II類，15-24個殘基。 若需要，可以數種方式設計較長的肽。在一種情況下，當HLA等位基因上肽之呈現可能性經預測或已知時，較長的肽可由以下任一者組成：(1)個別呈現之具有朝向各相應基因產物之N端及C端延伸2-5個胺基酸的肽；(2)所呈現之肽中之一些或全部與各自之延伸序列的串接。在另一種情況下，當定序揭露腫瘤中所存在之長(＞10個殘基)新抗原決定基序列(例如歸因於產生新穎肽序列之讀框轉移、通讀或內含子包含)時，較長的肽將由以下組成：(3)新穎腫瘤特異性胺基酸之整個延伸段，因此繞過對基於計算或活體外測試選擇最強HLA呈現之較短肽的需要。在兩種情況下，使用較長的肽允許患者細胞進行內源性加工，且可引起更有效的抗原呈現及誘導T細胞反應。 新抗原肽及多肽可呈現於HLA蛋白質上。在一些態樣中，新抗原肽及多肽以比野生型肽更大的親和力呈現於HLA蛋白質上。在一些態樣中，新抗原肽或多肽之IC50可至少小於5000 nM、至少小於1000 nM、至少小於500 nM、至少小於250 nM、至少小於200 nM、至少小於150 nM、至少小於100 nM、至少小於50 nM或更小。 在一些態樣中，新抗原肽及多肽在投與個體時不誘導自體免疫反應及/或引起免疫耐受性。 亦提供包含至少兩個或大於兩個新抗原肽之組合物。在一些實施例中，組合物含有至少兩個不同的肽。至少兩個不同的肽可源於相同的多肽。不同的多肽意指肽根據長度、胺基酸序列或兩者而變化。該等肽源於已知或已發現含有腫瘤特異性突變之任何多肽。可例如在COSMIC資料庫中發現可獲得新抗原肽之適合之多肽。COSMIC策劃關於人類癌症體細胞突變之綜合資訊。該肽含有腫瘤特異性突變。在一些態樣中，腫瘤特異性突變為特定癌症類型之驅動突變。 具有所需活性或特性之新抗原性肽及多肽可經修飾以提供某些所需屬性，例如改良之藥理學特徵，同時增加或至少保留未修飾之肽的實質上所有生物活性以結合所需MHC分子且活化適當T細胞。舉例而言，新抗原肽及多肽可進行各種變化，諸如保守或非保守取代，其中此類變化可在其使用中提供某些優勢，諸如改良之MHC結合、穩定性或呈現。保守取代意指胺基酸殘基用生物學及/或化學上類似的另一個胺基酸殘基置換，例如一個疏水性殘基置換另一個，或一個極性殘基置換另一個。取代包括以下組合，諸如Gly、Ala；Val、Ile、Leu、Met；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；及Phe、Tyr。單胺基酸取代之效應亦可使用D-胺基酸探測。此類修飾可使用熟知的肽合成程序進行，如Merrifield, Science 232:341-347 (1986), Barany及Merrifield, The Peptides, Gross及Meienhofer, 編 (N.Y., Academic Press), 第1-284頁 (1979)；及Stewart及Young, Solid Phase Peptide Synthesis, (Rockford, Ill., Pierce), 第2版 (1984)中所述。 肽及多肽用各種胺基酸模擬物或非天然胺基酸修飾可在提高肽及多肽之活體內穩定性方面特別有用。穩定性可以多種方式加以分析。舉例而言，肽酶及各種生物介質(諸如人類血漿及血清)已用於測試穩定性。參見例如Verhoef等人, Eur. J. Drug Metab Pharmacokin. 11:291-302 (1986)。肽之半衰期可使用25%人類血清(v/v)分析方便地確定。方案一般如下。彙集之人類血清(AB型，非加熱不活化)在使用之前藉由離心去脂。血清隨後用RPMI組織培養基稀釋至25%且用於測試肽穩定性。在預定時間間隔下，移出少量反應溶液且添加至6%三氯乙酸或乙醇水溶液中。將混濁的反應樣品冷卻(4℃) 15分鐘，且隨後旋轉集結沈澱的血清蛋白質。隨後使用穩定性特異性層析條件藉由逆相HPLC確定肽之存在。 肽及多肽可經修飾以提供除改良之血清半衰期以外的所需屬性。舉例而言，肽誘導CTL活性之能力可藉由與含有至少一個能夠誘導T輔助細胞反應之抗原決定基的序列連接來增強。免疫原性肽/T輔助細胞結合物可藉由間隔分子連接。間隔子通常由相對較小的中性分子(諸如胺基酸或胺基酸模擬物)構成，其在生理條件下實質上不帶電。間隔子通常選自例如Ala、Gly或非極性胺基酸或中性極性胺基酸之其他中性間隔子。應理解，視情況存在之間隔子無需由相同殘基組成，且因此可為雜寡聚物或均寡聚物。當存在時，間隔子將通常為至少一個或兩個殘基，更通常三至六個殘基。或者，肽可在無間隔子之情況下連接於T輔助肽。 新抗原肽可直接或經由在肽之胺基或羧基端處的間隔子連接於T輔助肽。新抗原肽或T輔助肽之胺基端可經醯化。例示性T輔助肽包括破傷風類毒素830-843、流感307-319、瘧疾環子孢子382-398及378-389。 蛋白質或肽可藉由熟習此項技術者已知的任何技術製造，包括經由標準分子生物學技術表現蛋白質、多肽或肽；自天然來源分離蛋白質或肽；或化學合成蛋白質或肽。先前已揭示對應於各種基因之核苷酸及蛋白質、多肽及肽序列，且可見於一般熟習此項技術者已知的電腦化資料庫中。一個此類資料庫為位於美國國家衛生研究院(National Institutes of Health)網站之國家生物技術資訊中心的Genbank及GenPept資料庫。已知基因之編碼區可使用本文所揭示或一般熟習此項技術者應知曉之技術擴增及/或表現。或者，蛋白質、多肽及肽之各種市售製劑已為熟習此項技術者所知。 在另一態樣中，新抗原包括編碼新抗原肽或其部分之核酸(例如聚核苷酸)。聚核苷酸可為例如DNA、cDNA、PNA、CNA、RNA (例如mRNA)、單股及/或雙股、或天然或穩定形式之聚核苷酸，諸如具有硫代磷酸主鏈之聚核苷酸，或其組合，且其可含有或可不含內含子。另一態樣提供一種能夠表現多肽或其部分之表現載體。不同細胞類型的表現載體在此項技術中已熟知且無需過度實驗便可選擇。一般而言，DNA以適當定向插入至表現載體(諸如質體)中且以正確閱讀框架進行表現。若需要，DNA可連接於由所需宿主識別之適當轉錄及轉譯調節控制核苷酸序列，而此類控制件一般可用於表現載體中。載體隨後經由標準技術引入至宿主中。指導可見於例如Sambrook等人 (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.中。V. 疫苗組合物 本文亦揭示一種能夠引起特異性免疫反應(例如腫瘤特異性免疫反應)之免疫原性組合物，例如疫苗組合物。疫苗組合物通常包含例如使用本文所述之方法選擇的複數個新抗原。疫苗組合物亦可稱為疫苗。 疫苗可含有1至30個肽；2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個不同的肽；6、7、8、9、10、11、12、13或14個不同的肽；或12、13或14個不同的肽。肽可包括轉譯後修飾。疫苗可含有1至100或更多個核苷酸序列；2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多個不同的核苷酸序列；6、7、8、9、10、11、12、13或14個不同的核苷酸序列；或12、13或14個不同的核苷酸序列。疫苗可含有1至30個新抗原序列；2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多個不同的新抗原序列；6、7、8、9、10、11、12、13或14個不同的新抗原序列；或12、13或14個不同的新抗原序列。 在一個實施例中，選擇不同的肽及/或多肽或其編碼核苷酸序列，以使得肽及/或多肽能夠與不同的MHC分子(諸如不同的MHC I類分子)締合。在一些態樣中，一種疫苗組合物包含能夠與最常出現之MHC I類分子締合之肽及/或多肽的編碼序列。因此，疫苗組合物可包含能夠與至少2個較佳的、至少3個較佳的、或至少4個較佳的MHC I類分子締合的不同片段。 疫苗組合物能夠引起特異性細胞毒性T細胞反應及/或特異性輔助T細胞反應。 疫苗組合物可另外包含佐劑及/或載劑。有用的佐劑及載劑之實例在下文中給出。組合物可與載劑締合，諸如蛋白質或抗原呈現細胞，諸如能夠將肽呈現於T細胞之樹突狀細胞(DC)。 佐劑為混合至疫苗組合物中增加或以其他方式修飾對新抗原之免疫反應的任何物質。載劑可為骨架結構，例如能夠與新抗原締合之多肽或多糖。視情況，佐劑為共價或非共價結合的。 佐劑提高對抗原之免疫反應的能力通常顯現為免疫介導性反應之顯著或實質性增加或疾病症狀之減少。舉例而言，體液免疫之提高通常顯現為針對抗原所產生之抗體的效價顯著增加，且T細胞活性之增加通常顯現為細胞增殖、或細胞毒性、或細胞介素分泌增加。佐劑亦可改變免疫反應，例如藉由將主要體液或Th反應變為主要細胞或Th反應。 適合之佐劑包括(但不限於) 1018 ISS、礬、鋁鹽、Amplivax、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特(Imiquimod)、ImuFact IMP321、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、JuvImmune、LipoVac、MF59、單磷醯基脂質A、Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、PepTel載體系統、PLG微粒、雷西莫特(resiquimod)、SRL172、病毒顆粒及其他病毒樣顆粒、YF-17D、VEGF捕獲劑、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、Aquila之源於皂素之QS21刺激子(Aquila Biotech, Worcester, Mass., USA)、分支桿菌提取物及合成細菌細胞壁模擬物，及其他專用佐劑，諸如Ribi之Detox. Quil或Superfos。諸如弗氏不完全或GM-CSF之佐劑為有用的。先前已描述特異性針對樹突狀細胞之數種免疫佐劑(例如MF59)及其製備(Dupuis M,等人, Cell Immunol. 1998; 186(1):18-27; Allison A C; Dev Biol Stand. 1998; 92:3-11)。亦可使用細胞介素。數種細胞介素已直接關聯於：影響樹突狀細胞遷移至淋巴組織(例如TNF-α)、加速樹突狀細胞成熟變為T-淋巴球之有效抗原呈現細胞(例如GM-CSF、IL-1及IL-4) (美國專利第5,849,589號，其以全文引用的方式特別併入本文中)及充當免疫佐劑(例如IL-12) (Gabrilovich D I,等人, J Immunother Emphasis Tumor Immunol. 1996 (6):414-418)。 亦已報導CpG免疫刺激性寡核苷酸增強佐劑在疫苗環境中之效應。亦可使用其他TLR結合分子，諸如結合RNA之TLR 7、TLR 8及/或TLR 9。 有用佐劑之其他實例包括(但不限於)經化學修飾之CpG (例如CpR、Idera)、聚(I:C) (例如聚i:CI2U)、非CpG細菌DNA或RNA以及免疫活性小分子及抗體，諸如環磷醯胺、舒尼替尼(sunitinib)、貝伐單抗(bevacizumab)、西樂葆(celebrex)、NCX-4016、西地那非(sildenafil)、他達拉非(tadalafil)、伐地那非(vardenafil)、索拉菲尼(sorafinib)、XL-999、CP-547632、帕佐泮尼(pazopanib)、ZD2171、AZD2171、伊匹單抗(ipilimumab)、曲美單抗(tremelimumab)及SC58175，其可起治療作用及/或充當佐劑。佐劑及添加劑之量及濃度可容易由熟習此項技術者確定而無需過度實驗。額外佐劑包括群落刺激因子，諸如顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF，沙格司亭(sargramostim))。 疫苗組合物可包含多於一種不同的佐劑。此外，治療性組合物可包含任何佐劑物質，包括以上各者中之任一者或其組合。亦預期，疫苗及佐劑可一起或以任何適當的順序分開投與。 載劑(或賦形劑)可獨立於佐劑存在。載劑之功能可例如為增加特定突變體之分子量以提高活性或免疫原性、賦予穩定性、增加生物活性或增加血清半衰期。此外，載劑可輔助呈現肽至T細胞。載劑可為熟習此項技術者已知的任何適合之載劑，例如蛋白質或抗原呈現細胞。載劑蛋白質可為(但不限於)匙孔螺血氰蛋白、血清蛋白質(諸如轉鐵蛋白)、牛血清白蛋白、人類血清白蛋白、甲狀腺球蛋白或卵白蛋白、免疫球蛋白或激素，諸如胰島素或棕櫚酸。為用於人類免疫接種，載劑一般為生理學上可接受之載劑，其為人類可接受的且為安全的。然而，破傷風類毒素及/或白喉類毒素為適合之載劑。或者，載劑可為葡聚糖，例如瓊脂糖。 細胞毒性T細胞(CTL)識別與MHC分子結合之肽形式的抗原，而非完整外來抗原本身。MHC分子本身位於抗原呈現細胞之細胞表面上。因此，若存在肽抗原、MHC分子及APC之三聚體複合物，則可能活化CTL。相應地，若不僅肽用於活化CTL，而且若另外添加具有相應MHC分子之APC，則可增強免疫反應。因此，在一些實施例中，疫苗組合物另外含有至少一種抗原呈現細胞。 新抗原亦可包括於基於病毒載體之疫苗平台中，諸如牛痘、禽痘、自我複製α病毒、馬拉巴病毒(marabavirus)、腺病毒(參見例如Tatsis等人, Adenoviruses,Molecular Therapy (2004) 10, 616-629)或慢病毒，包括(但不限於)第二、第三或雜交第二/第三代慢病毒及任一代之重組慢病毒，其經設計以靶向特定細胞類型或受體(參見例如Hu等人, Immunization Delivered by Lentiviral Vectors for Cancer and Infectious Diseases,Immunol Rev. (2011) 239(1): 45-61, Sakuma等人, Lentiviral vectors: basic to translational,Biochem J. (2012) 443(3):603-18, Cooper等人, Rescue of splicing-mediated intron loss maximizes expression in lentiviral vectors containing the human ubiquitin C promoter,Nucl. Acids Res. (2015) 43 (1): 682-690, Zufferey等人, Self-Inactivating Lentivirus Vector for Safe and Efficient In Vivo Gene Delivery,J. Virol. (1998) 72 (12): 9873-9880)。視上述基於病毒載體之疫苗平台的包裝能力而定，此方法可遞送編碼一或多個新抗原肽之一或多個核苷酸序列。序列可側接非突變序列，可由連接子分開或可在前面有一或多個靶向亞細胞區室之序列(參見例如Gros等人, Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients,Nat Med. (2016) 22 (4):433-8, Stronen等人, Targeting of cancer neoantigens with donor-derived T cell receptor repertoires,Science. (2016) 352 (6291):1337-41, Lu等人, Efficient identification of mutated cancer antigens recognized by T cells associated with durable tumor regressions,Clin Cancer Res. (2014) 20( 13):3401-10)。在引入宿主後，經感染細胞表現新抗原，從而引發針對肽之宿主免疫(例如CTL)反應。用於免疫方案中之牛痘載體及方法描述於例如美國專利第4,722,848號中。另一種載體為卡介苗(Bacille Calmette Guerin，BCG)。BCG載體描述於Stover等人 (Nature 351:456-460 (1991))中。根據本文描述，用於新抗原之治療性投與或免疫接種的各種其他疫苗載體，例如傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)載體及其類似物對於熟習此項技術者將為顯而易見的。V.A. 新抗原卡匣 鑒於本文所提供之教示內容，用於選擇一或多個新抗原、選殖及構築「卡匣」及其插入至病毒載體中之方法在此項技術之技能內。「新抗原卡匣」意指經選擇之新抗原或複數個新抗原與轉錄新抗原且表現轉錄產物所必需之其他調控元件之組合。新抗原或複數個新抗原可以允許轉錄之方式可操作地連接於調控組件。此類組件包括可驅動經病毒載體轉染之細胞中表現新抗原的習知調控元件。因此，新抗原卡匣亦可含有經選擇之啟動子，其連接於新抗原且與其他視情況之調控元件一起位於重組載體之經選擇之病毒序列內。 有用的啟動子可為組成型啟動子或經調控(誘導型)啟動子，其將能夠控制有待表現之新抗原的量。舉例而言，合乎需要的啟動子為細胞巨大病毒即刻早期啟動子/強化子之啟動子[參見例如Boshart等人, Cell, 41:521-530 (1985)]。另一種合乎需要的啟動子包括勞斯肉瘤(Rous sarcoma)病毒LTR啟動子/強化子。另一種啟動子/強化子序列為雞細胞質β-肌動蛋白啟動子[T. A. Kost等人, Nucl. Acids Res., 11(23):8287 (1983)]。其他適合或合乎需要的啟動子可由熟習此項技術者選擇。 新抗原卡匣亦可包括與病毒載體序列異源的核酸序列，包括提供轉錄物之有效聚腺苷酸化信號(poly-A或pA)之序列及具有功能性剪接供體及受體位點之內含子。本發明之例示性載體之採用之普通poly-A序列源於乳多泡病毒SV-40。poly-A序列一般可在基於新抗原之序列之後及在病毒載體序列之前插入於卡匣中。普通內含子序列亦可源於SV-40，且稱為SV-40 T內含子序列。新抗原卡匣亦可含有位於啟動子/強化子序列與新抗原之間的此類內含子。此等及其他普通載體元件之選擇為習知的[參見例如Sambrook等人, 「Molecular Cloning. A Laboratory Manual.」, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989)及其中列舉之參考文獻]且許多此類序列可自商業及工業來源以及Genbank獲得。 新抗原卡匣可具有一或多個新抗原。舉例而言，給定卡匣可包括1-10、1-20、1-30、10-20、15-25、15-20、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個新抗原。新抗原可彼此直接連接。新抗原亦可用連接子彼此連接。新抗原可相對於彼此呈任一定向，包括N至C或C至N。 如上所述，新抗原卡匣可位於病毒載體中任何經選擇之缺失位點，諸如E1基因區缺失或E3基因區缺失之位點等可經選擇之位點。V.B. 免疫檢查點 本文所述之載體，諸如本文所述之C68載體或本文所述之α病毒載體，可包含編碼至少一種新抗原之核酸，且同一或另一載體可包含編碼至少一種免疫調節物(例如抗體，諸如scFv)之核酸，其結合於免疫檢查點分子且阻斷免疫檢查點分子之活性。載體可包含新抗原卡匣及一或多個編碼檢查點抑制劑之核酸分子。 可靶向用於阻斷或抑制之說明性免疫檢查點分子包括(但不限於) CTLA-4、4-1BB (CD137)、4-1BBL (CD137L)、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、2B4 (屬於CD2家族之分子且在所有NK、γδ及記憶CD8+ (αβ) T細胞上表現)、CD160 (亦稱為BY55)及CGEN-15049。免疫檢查點抑制劑包括抗體或其抗原結合片段、或其他結合蛋白，其結合且阻斷或抑制以下中之一或多者之活性：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、VISTA、KIR、2B4、CD160及CGEN-15049。說明性免疫檢查點抑制劑包括曲美單抗(CTLA-4阻斷抗體)、抗OX40、PD-L1單株抗體(抗B7-H1；MEDI4736)、伊匹單抗、MK-3475 (PD-1阻斷劑)、納武單抗(Nivolumamb) (抗PD1抗體)、CT-011 (抗PD1抗體)、BY55單株抗體、AMP224 (抗PDL1抗體)、BMS-936559 (抗PDL1抗體)、MPLDL3280A (抗PDL1抗體)、MSB0010718C (抗PDL1抗體)及Yervoy/伊匹單抗(抗CTLA-4檢查點抑制劑)。抗體編碼序列可使用此項技術中之普通技能經工程改造至諸如C68之載體中。例示性方法描述於Fang等人, Stable antibody expression at therapeutic levels using the 2A peptide.Nat Biotechnol. 2005年5月;23(5):584-90. 電子版2005年4月17日中；其以引用的方式併入本文中用於所有目的。V.C. 疫苗設計 及製造的額外考慮 V.C.1. 確定覆蓋所有腫瘤 次純系之肽集合 軀幹肽，意指由所有或大部分腫瘤次純系呈現之彼等肽，可優先包括於疫苗中。53 視情況，若不存在經預測以高機率呈現且具有免疫原性之軀幹肽，或若經預測以高機率呈現且具有免疫原性之軀幹肽的數目足夠小以致額外非軀幹肽可包括於疫苗中，則其他肽可藉由估計腫瘤次純系之數目及身分且選擇肽以使疫苗所覆蓋之腫瘤次純系之數目達到最大而進行優先排序。54 V.C.2. 新抗原優先排序 在應用所有上述新抗原過濾器後，與疫苗技術可支持的相比，更多候選新抗原仍可包含於疫苗中。另外，可保留關於新抗原分析之各個態樣的不確定性，且候選疫苗新抗原之不同特性之間可存在折衷。因此，可考慮整合式多維模型代替選擇過程之各步驟中的預定過濾器，將候選新抗原置於具有至少以下軸之空間中且使用整合方法優化選擇。 1. 自體免疫或耐受性之風險(生殖系之風險) (自體免疫之風險較低通常為較佳的) 2. 定序偽影之機率(偽影之機率較低通常為較佳的) 3. 免疫原性之機率(免疫原性之機率較高通常為較佳的) 4. 呈現之機率(呈現之機率較高通常為較佳的) 5. 基因表現(較高表現通常為較佳的) 6. HLA基因之覆蓋率(參與新抗原集合呈現之HLA分子數目愈大可降低腫瘤經由HLA分子之下調或突變逃避免疫攻擊的機率)V.D. α 病毒 V.D.1. α 病毒生物學 α病毒為披膜病毒科之成員，且為正義單股RNA病毒。α病毒亦可稱為自我複製RNA或srRNA。成員通常分類為舊世界，諸如辛德畢斯、羅斯河、馬雅羅、基孔肯雅及塞姆利基森林病毒，或新世界，諸如東部馬腦炎、奧拉、摩根堡、或委內瑞拉馬腦炎及其衍生病毒株TC-83 (Strauss Microbrial Review 1994)。天然α病毒基因組通常約12kb長，其中前三分之二含有編碼非結構蛋白(nsP)之基因，該等非結構蛋白形成用於病毒基因組自我複製之RNA複製複合物，且最後三分之一含有編碼用於病毒粒子產生之結構蛋白的亞基因組表現卡匣(Frolov RNA 2001)。 α病毒之模型生命週期涉及數個不同步驟(Strauss Microbrial Review 1994, Jose Future Microbiol 2009)。在病毒附著於宿主細胞後，病毒粒子與內飲區室內之膜融合，導致基因組RNA最終釋放至胞溶質中。以正股定向且包含5'甲基鳥苷酸帽及3' polyA尾部之基因組RNA經轉譯以產生形成複製複合物之非結構蛋白nsP1-4。在感染早期，正股隨後由複合物複製成負股模板。在當前模型中，複製複合物隨著感染進展被進一步加工，使得所得經加工之複合物轉換成將負股轉錄成全長正股基因組RNA以及含有結構基因之26S亞基因組正股RNA。α病毒之數個保守序列元件(CSE)已鑑別為可能在各種RNA複製步驟中起作用，包括：負股模板之正股RNA複製中的5' UTR的互補序列、基因組模板之負股合成複製中的51-nt CSE、負股之亞基因組RNA轉錄中的在nsP與26S RNA之間的接合區中的24-nt CSE、及正股模板之負股合成中的3' 19-nt CSE。 在各種RNA物種複製後，病毒粒子隨後通常在病毒之天然生命週期中組裝。26S RNA經轉譯且所得蛋白質經進一步加工以產生結構蛋白，其包括衣殼蛋白、醣蛋白E1及E2以及兩個小多肽E3及6K (Strauss 1994)。發生病毒RNA之衣殼化，衣殼蛋白通常僅特異性針對所包裝之基因組RNA，隨後病毒粒子組裝且在膜表面出芽。V.D.2. α 病毒作為遞送載體 α病毒先前已經工程改造以用作表現載體系統(Pushko 1997, Rheme 2004)。α病毒提供數種優勢，特別是在可能需要異源抗原表現之疫苗環境中。由於在宿主胞溶質中自我複製的能力，故α病毒載體一般能夠在細胞內產生高複本數之表現卡匣，從而導致高水準異源抗原產生。另外，載體一般為瞬時的，從而使得生物安全性得以改良以及減少對載體之免疫耐受性的誘導。與其他標準病毒載體(諸如人類腺病毒)相比，公眾一般亦缺乏對α病毒載體預先存在的免疫性。基於α病毒之載體亦一般導致對經感染細胞的細胞毒性反應。在一定程度上，細胞毒性在疫苗環境中對於適當違禁引發對所表現之異源抗原的免疫反應可為重要的。然而，所需細胞毒性之程度可為平衡作用，且因此已開發數種減毒α病毒，包括VEE之TC-83病毒株。因此，本文所述之新抗原表現載體之實例可利用α病毒主鏈，其允許高水準之新抗原表現、引發對新抗原之穩固免疫反應、不引發對載體本身之免疫反應，且可以安全方式使用。此外，新抗原表現卡匣可經設計以經由優化載體使用之α病毒序列(包括但不限於源於VEE或其減毒衍生物TC-83之序列)而引發不同水準之免疫反應。 已使用α病毒序列工程改造數種表現載體設計策略(Pushko 1997)。在一個策略中，α病毒載體設計包括在結構蛋白基因下游插入26S啟動子序列元件之第二複本，隨後為異源基因(Frolov 1993)。因此，除天然非結構蛋白及結構蛋白之外，亦產生表現異源蛋白之額外亞基因組RNA。在此系統中，存在用於產生感染性病毒粒子之所有元件，且因此可能發生在未感染細胞中反覆輪表現載體之感染。 另一種表現載體設計利用輔助病毒系統(Pushko 1997)。在此策略中，結構蛋白由異源基因替代。因此，在由仍完整之非結構基因介導病毒RNA之自我複製之後，26S亞基因組RNA提供異源蛋白之表現。傳統上，表現結構蛋白之額外載體隨後諸如藉由細胞株之共轉染以反式供應，以產生感染性病毒。系統詳細描述於USPN 8,093,021中，其出於所有目的以全文引用的方式併入本文中。輔助載體系統提供限制形成感染性顆粒之可能性的益處，因此提高生物安全性。另外，輔助載體系統減小總載體長度，潛在提高複製及表現效率。因此，本文所述之新抗原表現載體之實例可利用結構蛋白由新抗原卡匣替代之α病毒主鏈，所得載體降低生物安全問題，同時由於整體表現載體尺寸減小而促進有效表現。V.D.3. 活體外 α 病毒產生 α病毒遞送載體一般為正義RNA聚核苷酸。此項技術中熟知的用於產生RNA之便利技術為活體外轉錄IVT。在此技術中，首先藉由熟習此項技術者熟知的技術產生所需載體之DNA模板，包括標準分子生物學技術，諸如選殖、限制性消化、連接、基因合成及聚合酶鏈式反應(PCR)。DNA模板在期望轉錄成RNA之序列的5'端處含有RNA聚合酶啟動子。啟動子包括(但不限於)噬菌體聚合酶啟動子，諸如T3、T7或SP6。DNA模板隨後與適當RNA聚合酶、緩衝劑及核苷酸(NTP)一起培育。所得RNA聚核苷酸可視情況經進一步修飾，包括(但不限於)添加5'帽結構，諸如7-甲基鳥苷或相關結構，且視情況修飾3'端以包括聚腺苷酸(polyA)尾部。RNA可隨後使用本領域中熟知的技術純化，諸如苯酚-氯仿提取。V.D.4. 經由脂質奈米粒子遞送 在疫苗載體設計中考慮之一重要態樣為針對載體本身之免疫性(Riley 2017)。此可呈對載體本身(諸如某些人類腺病毒系統)預先存在的免疫性形式，或呈在疫苗投與後對載體產生免疫性之形式。若進行相同疫苗之多次投與(諸如分開的初始及增強劑量)，或若使用相同疫苗載體系統遞送不同新抗原卡匣，則後者為重要的考慮因素。 在α病毒載體之情況下，標準遞送方法為先前論述之輔助病毒系統，其以反式提供衣殼、E1及E2蛋白質以產生感染性病毒粒子。然而，重要的是注意E1及E2蛋白質通常為中和抗體之主要靶標(Strauss 1994)。因此，若中和抗體靶向感染性粒子，則使用α病毒載體遞送所關注之新抗原至靶細胞的功效可能會降低。 病毒粒子介導之基因遞送的替代方案為使用奈米材料遞送表現載體(Riley 2017)。重要的是，奈米材料載具可由非免疫原性材料製成且一般避免引發對遞送載體本身之免疫性。此等材料可包括(但不限於)脂質、無機奈米材料及其他聚合材料。脂質可為陽離子、陰離子或中性的。材料可為合成或天然來源的，且在一些情況下為可生物降解的。脂質可包括脂肪、膽固醇、磷脂、脂質結合物，包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)結合物(聚乙二醇化脂質)、蠟、油、甘油酯及脂溶性維生素。 脂質奈米粒子(LNP)為有吸引力的遞送系統，因為脂質之兩親媒性使得能夠形成膜及囊泡狀結構(Riley 2017)。一般而言，此等囊泡藉由吸收至靶細胞之膜中且將核酸釋放至胞溶質中來遞送表現載體。另外，LNP可經進一步修飾或官能化以有助於靶向特定細胞類型。LNP設計中之另一考慮因素為靶向效率與細胞毒性之間的平衡。脂質組合物一般包括陽離子、中性、陰離子及兩性脂質之確定的混合物。在一些情況下，包括特定脂質以防止LNP聚集、防止脂質氧化、或提供有助於額外部分附著之功能性化學基團。脂質組合物可影響整體LNP大小及穩定性。在一實例中，脂質組合物包含二亞油基甲基-4-二甲基胺基丁酸酯(MC3)及MC3樣分子。MC3及MC3樣脂質組合物可經調配以包括一或多種其他脂質，諸如PEG或PEG結合之脂質、固醇或中性脂質。 直接暴露於血清之核酸載體(諸如表現載體)可具有數種不期望之結果，包括核酸由血清核酸酶降解或游離核酸對免疫系統之脫靶刺激。因此，囊封α病毒載體可用於避免降解，同時亦避免潛在的脫靶影響。在某些實例中，α病毒載體完全囊封在遞送載具內，諸如在LNP之含水內部。α病毒載體囊封在LNP內可藉由熟習此項技術者熟知的技術來進行，諸如在微流體液滴生成裝置上進行的微流體混合及液滴生成。此類裝置包括(但不限於)標準T形接頭裝置或流動聚焦裝置。在一實例中，所需脂質調配物(諸如含有MC3或MC3樣之組合物)與α病毒遞送載體及其他所需藥劑並行提供至液滴生成裝置，使得遞送載體及所需藥劑完全囊封在基於MC3或MC3樣之LNP內部。在一實例中，液滴生成裝置可控制所產生之LNP的尺寸範圍及尺寸分佈。舉例而言，LNP之尺寸可在1至1000奈米直徑範圍內，例如1、10、50、100、500或1000奈米。在液滴生成後，囊封表現載體之遞送載具可經進一步處理或修飾以使其準備用於投與。V.E. 黑猩猩腺病毒 (ChAd) V.E.1. 用黑猩猩腺病毒遞送病毒 用於遞送一或多個新抗原(例如經由新抗原卡匣)之疫苗組合物可藉由提供黑猩猩來源之腺病毒核苷酸序列、多種新穎載體及表現黑猩猩腺病毒基因之細胞株來產生。黑猩猩C68腺病毒(在本文中亦稱為ChAdV68)之核苷酸序列可用於新抗原遞送之疫苗組合物中(參見SEQ ID NO:1)。源於C68腺病毒之載體的使用進一步詳細描述於USPN 6,083,716中，其出於所有目的以全文引用的方式併入本文中。 在另一態樣中，本文提供一種重組腺病毒，其包含黑猩猩腺病毒(諸如C68)之DNA序列及可操作地連接於引導其表現之調控序列的新抗原卡匣。重組病毒能夠感染哺乳動物細胞、較佳人類細胞，且能夠在細胞中表現新抗原卡匣產物。在此載體中，天然黑猩猩E1基因及/或E3基因及/或E4基因可缺失。新抗原卡匣可插入至此等基因缺失位點中之任一者中。新抗原卡匣可包括新抗原，針對其激活之免疫反應為所需的。 在另一態樣中，本文提供一種經黑猩猩腺病毒(諸如C68)感染之哺乳動物細胞。 在另一態樣中，提供一種新穎的哺乳動物細胞株，其表現黑猩猩腺病毒基因(例如來自C68)或其功能片段。 在另一態樣中，本文提供一種用於將新抗原卡匣遞送至哺乳動物細胞中之方法，其包含以下步驟：向細胞中引入有效量之已經工程改造以表現新抗原卡匣之黑猩猩腺病毒，諸如C68。 另一態樣提供一種用於在哺乳動物宿主中引發免疫反應以治療癌症之方法。該方法可包含以下步驟：向宿主投與有效量之重組黑猩猩腺病毒(諸如C68)，其包含編碼免疫反應所靶向之來自腫瘤之一或多個新抗原的新抗原卡匣。 亦揭示一種非猿猴哺乳動物細胞，其表現獲自SEQ ID NO:1序列之黑猩猩腺病毒基因。該基因可選自由以下組成之群：SEQ ID NO:1之腺病毒E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4及L5。 亦揭示一種包含黑猩猩腺病毒DNA序列之核酸分子，該黑猩猩腺病毒DNA序列包含獲自SEQ ID NO:1序列之基因。該基因可選自由以下組成之群：SEQ ID NO:1之該等黑猩猩腺病毒E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4及L5基因。在一些態樣中，核酸分子包含SEQ ID NO:1。在一些態樣中，核酸分子包含SEQ ID NO:1序列，缺少選自由以下組成之群的至少一個基因：SEQ ID NO:1之E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4及L5基因。 亦揭示一種載體，其包含獲自SEQ ID NO:1之黑猩猩腺病毒DNA序列及可操作地連接於一或多個調控序列之新抗原卡匣，該一或多個調控序列引導卡匣在異源宿主細胞中之表現，視情況其中該黑猩猩腺病毒DNA序列包含至少用於複製及病毒粒子衣殼化所必需之順式元件，該等順式元件側接新抗原卡匣及調控序列。在一些態樣中，黑猩猩腺病毒DNA序列包含選自由以下組成之群的基因：SEQ ID NO:1之E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4及L5基因序列。在一些態樣中，載體可缺乏E1A及/或E1B基因。 本文亦揭示經本文所揭示之載體轉染之宿主細胞，該載體諸如經工程改造以表現新抗原卡匣之C68載體。本文亦揭示經由將本文所揭示之載體引入細胞中而表現其中引入之經選擇之基因的人類細胞。 本文亦揭示一種用於將新抗原卡匣遞送至哺乳動物細胞之方法，其包含向該細胞中引入有效量之本文所揭示之載體，諸如經工程改造以表現新抗原卡匣之C68載體。 本文亦揭示一種用於產生新抗原之方法，其包含將本文所揭示之載體引入哺乳動物細胞中，在適合之條件下培養細胞且產生新抗原。V.E.2. 表現 E1 之互補細胞株 為產生缺失本文所述之基因中之任一者的重組黑猩猩腺病毒(Ad)，缺失基因區之功能若對於病毒之複製及感染性必不可少，則可藉由輔助病毒或細胞株(亦即互補或包裝細胞株)供應至重組病毒。舉例而言，為產生複製缺陷型黑猩猩腺病毒載體，可使用表現人類或黑猩猩腺病毒之E1基因產物的細胞株；此類細胞株可包括HEK293或其變體。可遵循產生表現黑猩猩E1基因產物之細胞株的方案(USPN 6,083,716之實例3及4)，以產生表現任何經選擇之黑猩猩腺病毒基因的細胞株。 AAV增強分析可用於鑑別表現黑猩猩腺病毒E1之細胞株。此分析用於鑑別藉由使用例如來自其他物種之其他未表徵之腺病毒的E1基因製備的細胞株中的E1功能。該分析描述於USPN 6,083,716之實例4B中。 經選擇之黑猩猩腺病毒基因(例如E1)可在啟動子之轉錄控制下用於在經選擇之親本細胞株中表現。誘導型或組成型啟動子可用於此目的。在誘導型啟動子中包括可由鋅誘導之綿羊金屬硫蛋白啟動子，或可由糖皮質激素、特別是地塞米松(dexamethasone)誘導之小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動子。其他誘導型啟動子，諸如以引用的方式併入本文中之國際專利申請案WO95/13392中所鑑別之彼等誘導型啟動子，亦可用於產生包裝細胞株。亦可採用控制黑猩猩腺病毒基因表現之組成型啟動子。 親本細胞可經選擇以產生表現任何所需C68基因之新穎細胞株。此類親本細胞株可為(但不限於) HeLa [ATCC寄存編號CCL 2]、A549 [ATCC寄存編號CCL 185]、KB [CCL 17]、Detroit [例如Detroit 510、CCL 72]及WI-38 [CCL 75]細胞。其他適合之親本細胞株可獲自其他來源。親本細胞株可包括CHO、HEK293或其變體、911、HeLa、A549、LP-293、PER.C6或AE1-2a。 表現E1之細胞株可用於產生重組黑猩猩腺病毒E1缺失之載體。使用基本上相同的程序構築之表現一或多種其他黑猩猩腺病毒基因產物的細胞株用於產生缺失編碼彼等產物之基因的重組黑猩猩腺病毒載體。另外，表現其他人類Ad E1基因產物之細胞株亦用於產生黑猩猩重組Ad。V.E.3. 作為載體之重組病毒粒子 本文所揭示之組合物可包含病毒載體，其將至少一個新抗原遞送至細胞。此類載體包含黑猩猩腺病毒DNA序列(諸如C68)及可操作地連接於引導卡匣表現之調控序列的新抗原卡匣。C68載體能夠在經感染之哺乳動物細胞中表現卡匣。C68載體可功能性缺失一或多個病毒基因。新抗原卡匣包含至少一個在一或多個調控序列(諸如啟動子)控制下的新抗原。視情況輔助病毒及/或包裝細胞株可向黑猩猩病毒載體供應缺失之腺病毒基因的任何必需產物。 術語「功能性缺失」意指移除或以其他方式改變(例如藉由突變或修飾)足夠量的基因區，使得基因區不再能夠產生一或多種基因表現之功能性產物。若需要，可移除整個基因區。 形成本文所揭示之載體的核酸序列之修飾，包括序列缺失、插入及其他突變，可使用標準分子生物學技術產生且在本發明之範疇內。V.E.4. 病毒質體載體之構築 用於本發明之黑猩猩腺病毒C68載體包括重組缺陷型腺病毒，亦即在E1a或E1b基因中功能性缺失且視情況攜帶其他突變(例如其他基因中之溫度敏感性突變或缺失)的黑猩猩腺病毒序列。預期此等黑猩猩序列亦用於形成來自其他腺病毒及/或腺相關病毒序列之雜交載體。由人類腺病毒製備之同源腺病毒載體描述於公開的文獻中[參見例如上文所引用之Kozarsky I及II，及其中列舉之參考文獻，美國專利第5,240,846號]。 在構築用於將新抗原卡匣遞送至人類(或其他哺乳動物)細胞之有用的黑猩猩腺病毒C68載體時，可在載體中採用一系列腺病毒核酸序列。包含最小黑猩猩C68腺病毒序列之載體可與輔助病毒結合使用以產生感染性重組病毒粒子。輔助病毒提供最小黑猩猩腺病毒載體之病毒感染性及繁殖所需的基本基因產物。當在另外的功能性病毒載體中僅產生黑猩猩腺病毒基因之一或多個經選擇之缺失時，可藉由在經選擇之包裝細胞株中繁殖病毒而在病毒載體生產過程中供應缺失的基因產物，該包裝細胞株提供反式缺失之基因功能。V.E.5. 重組最小腺病毒 最小的黑猩猩Ad C68病毒為僅含有複製及病毒粒子衣殼化所必需之腺病毒順式元件的病毒粒子。亦即，載體含有腺病毒之順式作用5'及3'反向末端重複(ITR)序列(其充當複製起點)及天然5'包裝/強化子域(其含有用於包裝線性Ad基因組所必需的序列及E1啟動子之強化子元件)。參見例如在國際專利申請案WO96/13597中所描述且以引用的方式併入本文中的用於製備「最小」人類Ad載體之技術。V.E.6. 其他缺陷型腺病毒 重組複製缺乏型腺病毒亦可比最小黑猩猩腺病毒序列含有更多。此等其他Ad載體可藉由病毒基因區之各個部分的缺失及藉由視情況使用輔助病毒及/或包裝細胞株形成的感染性病毒粒子來表徵。 作為一個實例，適合之載體可藉由使C68腺病毒立即早期基因E1a及延遲早期基因E1b之全部或足夠部分缺失來形成，從而消除其正常的生物功能。當在含有提供相應反式基因產物之功能性腺病毒E1a及E1b基因的黑猩猩腺病毒轉化的互補細胞株上生長時，複製缺陷型E1缺失病毒能夠複製且產生感染性病毒。基於與已知腺病毒序列之同源性，預期與此項技術之人類重組E1缺失腺病毒一樣，所得重組黑猩猩腺病毒能夠感染許多細胞類型且可表現新抗原，但無法在大部分不攜帶黑猩猩E1區DNA之細胞中複製，除非細胞以極高感染倍率感染。 作為另一個實例，C68腺病毒延遲早期基因E3之全部或一部分可自形成重組病毒之一部分的黑猩猩腺病毒序列消除。 亦可構築具有E4基因缺失之黑猩猩腺病毒C68載體。另一個載體可在延遲早期基因E2a中含有缺失。 亦可在黑猩猩C68腺病毒基因組之晚期基因L1至L5中之任一者中獲得缺失。類似地，中間基因IX及IVa2中之缺失可用於一些目的。可在其他結構性或非結構性腺病毒基因中獲得其他缺失。 上述缺失可單獨使用，亦即腺病毒序列可僅含有E1缺失。或者，可以任何組合使用有效破壞或降低其生物活性之完整基因或其部分的缺失。舉例而言，在一個例示性載體中，腺病毒C68序列可缺失E1基因及E4基因，或缺失E1、E2a及E3基因，或缺失E1及E3基因，或在缺失或不缺失E3之情況下缺失E1、E2a及E4基因等等。如上文所論述，此類缺失可與其他突變(諸如溫度敏感性突變)組合使用，以達成所需結果。 將包含新抗原之卡匣視情況插入至黑猩猩C68 Ad病毒之任一缺失區中。或者，若需要，可將卡匣插入至現有基因區中以破壞該區之功能。V.E.7. 輔助病毒 視用於攜帶新抗原卡匣之病毒載體的黑猩猩腺病毒基因含量而定，可使用輔助腺病毒或非複製性病毒片段來提供足夠的黑猩猩腺病毒基因序列以產生含有該卡匣之感染性重組病毒粒子。 有用的輔助病毒含有經選擇之腺病毒基因序列，其不存在於腺病毒載體構築體中及/或不由載體轉染之包裝細胞株表現。輔助病毒可為複製缺陷型且除上述序列之外，亦含有多種腺病毒基因。輔助病毒可與本文所述之表現E1之細胞株組合使用。 對於C68，「輔助」病毒可為藉由用SspI剪切C68基因組之C末端形成的片段，其自病毒之左端移除約1300 bp。此經剪切之病毒隨後與質體DNA共轉染至表現E1之細胞株中，由此藉由與質體中之C68序列同源重組形成重組病毒。 輔助病毒亦可形成聚陽離子結合物，如Wu等人, J. Biol. Chem., 264:16985-16987 (1989)；K. J. Fisher及J. M. Wilson, Biochem. J., 299:49 (1994年4月1日)中所述。輔助病毒可視情況含有報導基因。許多此類報導基因為此項技術已知的。與腺病毒載體上之新抗原卡匣不同，輔助病毒上報導基因之存在允許獨立地監測Ad載體及輔助病毒。此第二報導體用於純化後能夠將所得重組病毒與輔助病毒分離。V.E.8. 病毒粒子之組裝及細胞株之感染 將經選擇之腺病毒DNA序列、新抗原卡匣及其他載體元件組裝至各種中間質體及穿梭載體中，以及使用該等質體及載體產生重組病毒粒子均可使用習知技術實現。此類技術包括cDNA之習知選殖技術、活體外重組技術(例如吉布森組裝(Gibson assembly))、腺病毒基因組之重疊寡核苷酸序列的使用、聚合酶鏈式反應及提供所需核苷酸序列之任何適合之方法。採用標準轉染及共轉染技術，例如CaPO4沈澱技術或脂質體介導之轉染方法，諸如脂染胺。所採用之其他習知方法包括病毒基因組之同源重組、瓊脂覆層中病毒之蝕斑、量測信號產生之方法及其類似方法。 舉例而言，在構築及組裝所需含有新抗原卡匣之病毒載體後，可在輔助病毒存在下將載體活體外轉染至包裝細胞株中。同源重組發生在輔助序列與載體序列之間，其允許載體中之腺病毒新抗原序列複製且包裝至病毒粒子衣殼中，從而產生重組病毒載體粒子。 所得重組黑猩猩C68腺病毒用於將新抗原卡匣轉移至經選擇之細胞中。在使用包裝細胞株中生長之重組病毒的活體內實驗中，E1缺失之重組黑猩猩腺病毒在將卡匣轉移至非黑猩猩(較佳人類)細胞中展現效用。V.E.9. 重組病毒載體之用途 所得含有新抗原卡匣之重組黑猩猩C68腺病毒(如上所述，藉由腺病毒載體及輔助病毒或腺病毒載體及包裝細胞株之合作產生)因此提供一種有效的基因轉移載具。其可將新抗原活體內或離體遞送至個體。 上述重組載體根據公開的基因療法投與人類。攜帶新抗原卡匣之黑猩猩病毒載體可投與患者，較佳懸浮於生物相容性溶液或醫藥學上可接受之遞送媒劑中。適合之媒劑包括無菌鹽水。已知為醫藥學上可接受之載劑且為熟習此項技術者所熟知的其他水性及非水性等張無菌注射溶液以及水性及非水性無菌懸浮液可用於此目的。 黑猩猩腺病毒載體係以足以轉導人類細胞且提供足夠水準之新抗原轉移及表現的量投與，從而提供治療益處而無過度不良效應或具有醫學上可接受之生理效應，其可由熟習醫藥技術之人員來確定。習知及醫藥學上可接受之投藥途徑包括(但不限於)直接遞送至肝臟、鼻內、靜脈內、肌內、皮下、皮內、經口及其他非經腸投藥途徑。若需要，可組合投藥途徑。 病毒載體之劑量主要將取決於以下因素：諸如所治療之病況、患者之年齡、體重及健康狀況，且因此可在患者當中變化。劑量將經調節以平衡治療益處與任何副作用，且此類劑量可視採用重組載體之治療應用而變化。可監測新抗原表現量以確定劑量投與頻率。 重組複製缺陷型腺病毒可以「醫藥學有效量」投與，亦即在投藥途徑中有效轉染所需細胞且提供經選擇之基因的足夠表現量以提供疫苗益處(亦即一些可量測之保護性免疫水準)的重組腺病毒之量。包含新抗原卡匣之C68載體可與佐劑一起共投與。佐劑可與載體分開(例如礬)或在載體內編碼，尤其若佐劑為蛋白質。佐劑為此項技術中所熟知。 習知且醫藥學上可接受之投藥途徑包括(但不限於)鼻內、肌內、氣管內、皮下、皮內、經直腸、經口及其他非經腸投藥途徑。若需要，可組合或調整投藥途徑，視免疫原或疾病而定。舉例而言，在狂犬病預防中，皮下、氣管內及鼻內途徑為較佳的。投藥途徑主要將取決於所治療之疾病的性質。 可監測對新抗原之免疫水準以確定是否需要增強劑。舉例而言，在評定血清中之抗體效價後，可能需要視情況追加免疫。VI. 治療及製造方法 亦提供一種藉由向個體投與一或多個新抗原(諸如使用本文所揭示之方法鑑別的複數個新抗原)在個體中誘導腫瘤特異性免疫反應、針對腫瘤接種疫苗、治療及或緩解個體之癌症症狀的方法。 在一些態樣中，個體已診斷患有癌症或處於罹患癌症之風險下。個體可為人類、犬、貓、馬或需要腫瘤特異性免疫反應之任何動物。腫瘤可為任何實體腫瘤，諸如乳房腫瘤、卵巢腫瘤、前列腺腫瘤、肺腫瘤、腎臟腫瘤、胃腫瘤、結腸腫瘤、睪丸腫瘤、頭頸部腫瘤、胰臟腫瘤、腦腫瘤、黑素瘤及其他組織器官腫瘤，以及血液腫瘤，諸如淋巴瘤及白血病，包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴球性白血病、T細胞淋巴球性白血病及B細胞淋巴瘤。 新抗原可以足以誘導CTL反應之量投與。 新抗原可單獨或與其他治療劑組合投與。治療劑為例如化學治療劑、輻射或免疫療法。可針對特定癌症投與任何適合之治療性治療。 另外，可向個體進一步投與抗免疫抑制劑/免疫刺激劑，諸如檢查點抑制劑。舉例而言，可向個體進一步投與抗CTLA抗體或抗PD-1或抗PD-L1。藉由抗體阻斷CTLA-4或PD-L1可增強患者對癌細胞之免疫反應。具體而言，已顯示在按照疫苗接種方案時CTLA-4阻斷為有效的。 可確定包括於疫苗組合物中之各新抗原的最佳量及最佳給藥方案。舉例而言，可製備用於靜脈內(i.v.)注射、皮下(s.c.)注射、皮內(i.d.)注射、腹膜內(i.p.)注射、肌內(i.m.)注射之新抗原或其變體。注射方法包括s.c.、i.d.、i.p.、i.m.及i.v.。DNA或RNA注射方法包括i.d.、i.m.、s.c.、i.p.及i.v.。疫苗組合物之其他投與方法為熟習此項技術者已知的。 疫苗可經編譯以使得組合物中存在之新抗原的選擇、數目及/或量為組織、癌症及/或患者特異性的。舉例而言，肽之精確選擇可藉由親本蛋白質在給定組織中之表現模式來指導。選擇可取決於癌症之具體類型、疾病狀態、較早的治療方案、患者免疫狀態及當然患者之HLA單倍型。此外，疫苗可根據特定患者之個人需要而含有個別化組分。實例包括根據新抗原在特定患者中之表現改變新抗原之選擇或在第一輪或治療方案之後調整二次治療。 對於待用作癌症疫苗之組合物，在正常組織中大量表現之具有類似正常自身肽的新抗原可避免或以低量存在於本文所述之組合物中。另一方面，若已知患者之腫瘤表現大量特定新抗原，則用於治療此癌症之相應醫藥組合物可大量存在及/或可包括多於一種特異性針對此特定新抗原或此新抗原之途徑的新抗原。 可向已罹患癌症之個體投與包含新抗原之組合物。在治療應用中，組合物以足以引發對腫瘤抗原之有效CTL反應且治癒或至少部分遏制症狀及/或併發症之量投與患者。足以實現此目標之量定義為「治療有效劑量」。對此用途有效之量將取決於例如組合物、投藥方式、所治療疾病之階段及嚴重程度、患者之體重及一般健康狀況、以及處方醫師之判斷。應記住，組合物一般可用於嚴重的疾病病況，亦即危及生命或可能危及生命之情形，尤其當癌症已轉移時。在此類情況下，鑒於外來物質之最小化及新抗原之相對無毒性，治療醫師可能且可能感覺需要投與實質性過量之此等組合物。 對於治療用途，可在偵測或手術移除腫瘤時開始投藥。此後為增強劑量，直至症狀至少實質上減弱且此後持續一段時間。 用於治療性治療之醫藥組合物(例如疫苗組合物)意欲非經腸、局部、經鼻、經口或局部投與。醫藥組合物可非經腸投與，例如靜脈內、皮下、皮內或肌內投與。組合物可在手術切除部位投與以誘導針對腫瘤之局部免疫反應。本文揭示用於非經腸投與之組合物，其包含新抗原及疫苗組合物溶解或懸浮於可接受之載劑(例如水性載劑)中之溶液。可使用多種水性載劑，例如水、緩衝水、0.9%生理食鹽水、0.3%甘胺酸、玻尿酸及其類似物。此等組合物可藉由習知的熟知滅菌技術滅菌或可經無菌過濾。所得水溶液可封裝以按原樣使用或凍乾，凍乾製劑在投與之前與無菌溶液組合。組合物可含有接近生理條件所需要之醫藥學上可接受之輔助物質，諸如pH調節劑及緩衝劑、張力調節劑、濕潤劑及其類似物，例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。 新抗原亦可經由脂質體投與，脂質體使其靶向特定的細胞組織，諸如淋巴組織。脂質體亦用於增加半衰期。脂質體包括乳液、泡沫、膠束、不可溶單層、液晶、磷脂分散體、層狀層及其類似物。在此等製劑中，有待遞送之新抗原作為脂質體之一部分單獨或與結合於例如淋巴細胞中普遍存在之受體的分子(諸如結合於CD45抗原之單株抗體)或與其他治療性或免疫原性組合物一起併入。因此，用所需新抗原填充之脂質體可引導至淋巴細胞之位點，在此脂質體隨後遞送經選擇之治療性/免疫原性組合物。脂質體可由標準的形成囊泡之脂質形成，其一般包括中性及帶負電荷之磷脂及固醇(諸如膽固醇)。脂質之選擇一般藉由考慮例如脂質體大小、脂質體在血流中之酸不穩定性及穩定性來指導。多種方法可用於製備脂質體，如例如Szoka等人, Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9; 467 (1980)；美國專利第4,235,871號、第4,501,728號、第4,501,728號、第4,837,028號及第5,019,369號中所述。 為靶向免疫細胞，有待併入至脂質體中之配體可包括例如特異性針對所需免疫系統細胞之細胞表面決定子的抗體或其片段。脂質體懸浮液可以一定劑量靜脈內、局部、表面等投與，該劑量尤其根據投藥方式、所遞送之肽及所治療疾病之階段而變化。 出於治療或免疫目的，編碼肽及視情況一或多種本文所述之肽的核酸亦可投與患者。多種方法方便地用於將核酸遞送至患者。舉例而言，核酸可以「裸DNA」形式直接遞送。此方法描述於例如Wolff等人, Science 247: 1465-1468 (1990)以及美國專利第5,580,859號及第5,589,466號中。核酸亦可使用彈道式遞送投與，如例如美國專利第5,204,253號中所述。可投與僅包含DNA之粒子。或者，DNA可黏附於粒子，諸如金粒子。在存在或不存在電穿孔之情況下，用於遞送核酸序列之方法可包括病毒載體、mRNA載體及DNA載體。 核酸亦可與陽離子化合物(諸如陽離子脂質)複合遞送。脂質介導之基因遞送方法描述於例如9618372WOAWO 96/18372；9324640WOAWO 93/24640；Mannino及Gould-Fogerite, BioTechniques 6(7): 682-691 (1988)；美國專利第5,279,833號；Rose美國專利第5,279,833號；9106309WOAWO 91/06309；及Felgner等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7414 (1987)中。 新抗原亦可包括於基於病毒載體之疫苗平台中，諸如牛痘、禽痘、自我複製α病毒、馬拉巴病毒、腺病毒(參見例如Tatsis等人, Adenoviruses,Molecular Therapy (2004) 10, 616-629)或慢病毒，包括(但不限於)第二、第三或雜交第二/第三代慢病毒及任一代之重組慢病毒，其經設計以靶向特定細胞類型或受體(參見例如Hu等人, Immunization Delivered by Lentiviral Vectors for Cancer and Infectious Diseases,Immunol Rev. (2011) 239(1): 45-61, Sakuma等人, Lentiviral vectors: basic to translational,Biochem J. (2012) 443(3):603-18, Cooper等人, Rescue of splicing-mediated intron loss maximizes expression in lentiviral vectors containing the human ubiquitin C promoter,Nucl. Acids Res. (2015) 43 (1): 682-690, Zufferey等人, Self-Inactivating Lentivirus Vector for Safe and Efficient In Vivo Gene Delivery,J. Virol. (1998) 72 (12): 9873-9880)。視上述基於病毒載體之疫苗平台的包裝能力而定，此方法可遞送編碼一或多個新抗原肽之一或多個核苷酸序列。序列可側接非突變序列，可由連接子分開或可在前面有一或多個靶向亞細胞區室之序列(參見例如Gros等人, Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients,Nat Med. (2016) 22 (4):433-8, Stronen等人, Targeting of cancer neoantigens with donor-derived T cell receptor repertoires,Science. (2016) 352 (6291):1337-41, Lu等人, Efficient identification of mutated cancer antigens recognized by T cells associated with durable tumor regressions,Clin Cancer Res. (2014) 20( 13):3401-10)。在引入宿主後，經感染細胞表現新抗原，從而引發針對肽之宿主免疫(例如CTL)反應。用於免疫方案中之牛痘載體及方法描述於例如美國專利第4,722,848號中。另一種載體為BCG (卡介苗)。BCG載體描述於Stover等人 (Nature 351:456-460 (1991))中。根據本文描述，用於新抗原之治療性投與或免疫接種的各種其他疫苗載體，例如傷寒沙門氏菌載體及其類似物對於熟習此項技術者將為顯而易見的。 投與核酸之手段使用編碼一或多個抗原決定基之袖珍基因構築體。為產生編碼經選擇在人類細胞中表現之CTL抗原決定基(袖珍基因)之DNA序列，逆轉譯抗原決定基之胺基酸序列。使用人類密碼子使用表來指導各胺基酸之密碼子選擇。此等編碼抗原決定基之DNA序列直接鄰接，產生連續多肽序列。為使表現及/或免疫原性最佳化，可將額外元件併入至袖珍基因設計中。可經逆轉譯且包括於袖珍基因序列中之胺基酸序列的實例包括：輔助T淋巴細胞、抗原決定基、前導(信號)序列及內質網滯留信號。另外，可藉由包括相鄰於CTL抗原決定基之合成(例如聚丙胺酸)或天然存在的側接序列來改良CTL抗原決定基之MHC呈現。藉由組裝編碼袖珍基因之正股及負股的寡核苷酸而將袖珍基因序列轉化成DNA。重疊寡核苷酸(30-100個鹼基長)係在適當條件下使用熟知技術合成、磷酸化、純化及黏接。寡核苷酸之末端係使用T4 DNA連接酶連接。編碼CTL抗原決定基多肽之此合成袖珍基因可隨後選殖至所期望之表現載體中。 可製備經純化之質體DNA以便使用多種調配物注射。其中最簡單的為凍乾DNA在無菌磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)中復原。已描述多種方法，且可使用新技術。如上文所指出，核酸宜用陽離子脂質調配。另外，統稱為保護性、相互作用性、非縮合性(PINC)之糖脂、促融脂質體、肽及化合物亦可與經純化之質體DNA複合以影響以下變數：諸如穩定性、肌內分散或運輸至特定器官或細胞類型。 亦揭示一種製造腫瘤疫苗之方法，其包含執行本文所揭示之方法的步驟；及產生包含複數個新抗原或複數個新抗原之子集的腫瘤疫苗。 本文所揭示之新抗原可使用此項技術中已知之方法製造。舉例而言，產生本文所揭示之新抗原或載體(例如包括編碼一或多個新抗原之至少一個序列的載體)的方法可包括在適於表現新抗原或載體之條件下培養宿主細胞，其中該宿主細胞包含至少一個編碼新抗原或載體之聚核苷酸；及純化新抗原或載體。標準純化方法包括層析技術、電泳、免疫、沈澱、透析、過濾、濃縮及層析聚焦技術。 宿主細胞可包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NS0細胞、酵母或HEK293細胞。宿主細胞可用一或多個包含至少一個編碼本文所揭示之新抗原或載體之核酸序列的聚核苷酸轉化，視情況其中該經分離之聚核苷酸另外包含可操作地連接於編碼新抗原或載體之至少一個核酸序列的啟動子序列。在某些實施例中，經分離之聚核苷酸可為cDNA。VII. 新抗原使用及投藥 可使用疫苗接種方案給予個體一或多種新抗原。初始疫苗及增強疫苗可用於向個體給藥。初始疫苗可基於C68 (例如SEQ ID NO:1或2中所示之序列)或srRNA (例如SEQ ID NO:3或4中所示之序列)，且增強疫苗可基於C68 (例如SEQ ID NO:1或2中所示之序列)或srRNA (例如SEQ ID NO:3或4中所示之序列)。各載體通常包括具有新抗原之卡匣。卡匣可包括約20種新抗原，其由間隔子(諸如通常包圍各抗原之天然序列)或其他非天然間隔序列(諸如AAY)分開。卡匣亦可包括MHCII抗原，諸如破傷風類毒素抗原及PADRE抗原，其可視為通用II類抗原。卡匣亦可包括靶向序列，諸如泛素靶向序列。另外，各疫苗劑量可與檢查點抑制劑(CPI)結合(例如同時、之前或之後)投與個體。CPI可包括抑制CTLA4、PD1及/或PDL1之彼等，諸如抗體或其抗原結合部分。此類抗體可包括曲美單抗或德瓦魯單抗(durvalumab)。 初始疫苗可注射(例如肌內)於個體。可使用每一劑量雙側注射。舉例而言，可使用一或多次ChAdV68 (C68)注射(例如總劑量1×1012 個病毒粒子)；可使用選自0.001至1 μg RNA、尤其0.1或1 μg範圍之低疫苗劑量的一或多次自我複製RNA (srRNA)注射；或可使用選自1至100 μg RNA、尤其10或100 μg範圍之高疫苗劑量的一或多次srRNA注射。 可在初始疫苗接種之後注射(例如肌內)疫苗增強劑(增強疫苗)。增強疫苗可在初打後約每1、2、3、4、5、6、7、8、9或10週，例如每4週及/或8週投與。可使用每一劑量雙側注射。舉例而言，可使用一或多次ChAdV68 (C68)注射(例如總劑量1×1012 個病毒粒子)；可使用選自0.001至1 μg RNA、尤其0.1或1 μg範圍之低疫苗劑量的一或多次自我複製RNA (srRNA)注射；或可使用選自1至100 μg RNA、尤其10或100 μg範圍之高疫苗劑量的一或多次srRNA注射。 亦可向個體投與抗CTLA-4 (例如曲美單抗)。舉例而言，抗CTLA4可在肌內疫苗注射(ChAdV68初打或srRNA低劑量)部位附近皮下投與，以確保引流至同一淋巴結。曲美單抗為CTLA-4之選擇性人類IgG2 mAb抑制劑。目標抗CTLA-4 (曲美單抗)皮下劑量通常為70-75 mg (尤其75 mg)，其劑量範圍為例如1-100 mg或5-420 mg。 在某些情況下，可使用抗PD-L1抗體，諸如德瓦魯單抗(MEDI 4736)。德瓦魯單抗為一種選擇性、高親和力人類IgG1 mAb，其阻斷PD-L1結合於PD-1及CD80。德瓦魯單抗一般每4週以20 mg/kg i.v.投與。 可在疫苗投與之前、期間及/或之後進行免疫監測。除其他參數外，此類監測可告知安全性及功效。 為進行免疫監測，通常使用PBMC。PBMC可在初始疫苗接種之前及在初始疫苗接種之後(例如4週及8週)分離。PBMC可僅在增強疫苗接種之前及在每次增強疫苗接種之後(例如4週及8週)收集。 可評定T細胞反應作為免疫監測方案之一部分。可使用此項技術中已知的一或多種方法量測T細胞反應，諸如ELISpot、細胞內細胞介素染色、細胞介素分泌及細胞表面捕捉、T細胞增殖、MHC多聚體染色或藉由細胞毒性分析。針對疫苗中編碼之抗原決定基的T細胞反應可藉由使用ELISpot分析量測細胞介素(諸如IFN-γ)之誘導而自PBMC監測。針對疫苗中編碼之抗原決定基的特異性CD4或CD8 T細胞反應可藉由使用流式細胞測量術量測胞內或胞外捕捉之細胞介素(諸如IFN-γ)之誘導而自PBMC監測。針對疫苗中編碼之抗原決定基的特異性CD4或CD8 T細胞反應可藉由使用MHC多聚體染色量測表現特異性針對抗原決定基/MHC I類複合物之T細胞受體的T細胞群體而自PBMC監測。針對疫苗中編碼之抗原決定基的特異性CD4或CD8 T細胞反應可藉由在3H-胸苷、溴去氧尿苷及羧基螢光素-二乙酸酯-琥珀醯亞胺酯(CFSE)併入後量測T細胞群之離體擴增而自PBMC監測。特異性針對疫苗中編碼之抗原決定基之源於PBMC之T細胞的抗原識別能力及溶解活性可藉由鉻釋放分析或替代性比色細胞毒性分析來功能性評定。VIII. 新抗原鑑別 VIII.A. 新抗原候選物鑑別 已描述關於腫瘤及正常外顯子組及轉錄組之NGS分析的研究方法且將其應用於新抗原鑑別空間。6,14,15 以下實例考慮在臨床環境中對新抗原鑑別之靈敏度及特異性更大的某些優化。此等優化可分為兩個領域，亦即與實驗室方法相關之彼等優化及與NGS資料分析相關之彼等優化。VIII.A.1. 實驗室方法優化 此處提出之方法改良藉由將對靶向癌症小組16 中可靠的癌症驅動基因評定開發之概念擴展至新抗原鑑別所必需之全外顯子組及轉錄組環境來解決來自腫瘤含量低及體積小之臨床樣本之高精確性新抗原發現的挑戰。具體而言，此等改良包括： 1. 靶向整個腫瘤外顯子組之深度(＞500×)獨特的平均覆蓋率，以偵測由於低腫瘤含量或亞純系狀態而以低突變等位基因頻率出現的突變。 2. 靶向整個腫瘤外顯子組之均勻覆蓋率，在＜100×覆蓋＜5%之鹼基，以使得錯過新抗原之可能最低，例如藉由： a. 採用基於DNA之捕捉探針及單個探針QC17 b. 包括不良覆蓋區之額外誘餌 3. 靶向整個正常外顯子組之均勻覆蓋率，其中在＜20×下覆蓋＜5%之鹼基，以便最少的新抗原對於體細胞/生殖系狀態可能保持未分類(且因此不能用作TSNA) 4. 為使所需定序總量減到最少，序列捕捉探針將經設計以僅用於基因之編碼區，因為非編碼RNA無法產生新抗原。額外優化包括： a. 用於HLA基因之補充探針，其富含GC且藉由標準外顯子組定序很難捕捉18 b. 排除由於以下因素而經預測產生極少或不產生候選新抗原之基因：諸如表現不足、蛋白酶體消化次優或異常序列特徵。 5. 腫瘤RNA將同樣在高深度(＞100M讀段)下定序，以便能夠進行變體偵測、基因及剪接變體(「同功異型物」)表現定量及融合偵測。來自FFPE樣品之RNA將使用基於探針之富集19 來提取，其中相同或類似探針用於捕捉DNA中之外顯子組。VIII.A.2. NGS 資料分析優化 分析方法之改良解決常見研究突變調用方法之次優靈敏度和特異性，且具體考慮臨床環境中與新抗原鑑別相關的定製。其包括： 1. 使用HG38參考人類基因組或後續版本進行比對，因為其含有較佳反映群體多形現象之多個MHC區組裝，與先前的基因組版本相反。 2. 藉由合併來自不同程式5 之結果來克服單個變體調用者20 之侷限性 a. 用一套工具自腫瘤DNA、腫瘤RNA及正常DNA中偵測單核苷酸變體及插入缺失，該等工具包括：基於腫瘤及正常DNA比較之程式，諸如Strelka21 及Mutect22 ；及併入腫瘤DNA、腫瘤RNA及正常DNA之程式，諸如UNCeqR，其在低純度樣品中特別有利23 。 b. 插入缺失將用進行局部再組裝之程式來確定，諸如Strelka及ABRA24 。 c. 結構重排將使用專用工具來確定，諸如Pindel25 或Breakseq26 。 3. 為偵測及防止樣品調換，將在選定數量之多形位點比較來自同一患者之樣本的變體調用。 4. 假性調用之廣泛過濾將例如藉由以下來執行： a. 移除在正常DNA中發現的變體，在低覆蓋率情況下可能使用放鬆的偵測參數，且在插入缺失情況下使用容許的接近準則 b. 移除歸因於低映射品質或低鹼基品質之變體27 。 c. 即使在相應的正常情況下沒有觀察到，亦移除源自復發序列偽影之變體27 。實例包括主要在一股上偵測之變體。 d. 移除不相關之對照集合中所偵測之變體27 5. 使用seq2HLA28 、ATHLATES29 或Optitype中之一者自正常外顯子組精確調用HLA且亦將外顯子組與RNA定序資料組合28 。其他潛在優化包括採用專門的HLA分型分析，諸如長讀段DNA定序30 ，或調適連接RNA片段以保持連續性的方法31 。 6. 由腫瘤特異性剪接變體產生之neo-ORF的穩固偵測將藉由使用CLASS32 、Bayesembler33 、StringTie34 或其參考引導模式中的類似程式自RNA-seq資料組裝轉錄物來進行(亦即，使用已知的轉錄物結構而非試圖自每個實驗中全部重新創建轉錄物)。雖然Cufflinks35 通常用於此目的，但其經常產生難以置信的大量剪接變體，其中許多比全長基因短得多，且可能無法恢復簡單的陽性對照。編碼序列及無義介導之衰變可能性將藉由諸如SpliceR36 及MAMBA37 之工具來確定，其中重新引入突變序列。基因表現將藉由諸如Cufflinks35 或Express (Roberts及Pachter, 2013)之工具來確定。野生型及突變體特異性表現計數及/或相對水準將藉由開發用於此等目的之工具(諸如ASE38 或HTSeq39 )來確定。可能的過濾步驟包括： a. 移除視為不充分表現之候選neo-ORF。 b. 移除經預測會觸發無義介導之衰變(NMD)的候選neo-ORF。 7. 僅在RNA中觀察到的不能直接驗證為腫瘤特異性之候選新抗原(例如neoORF)將根據額外參數歸類為可能的腫瘤特異性，例如藉由考慮： a. 僅存在支持腫瘤DNA之順式作用讀框轉移或剪接位點突變 b. 在剪接因子中存在確證的腫瘤DNA-僅反式作用的突變。舉例而言，在用R625突變型SF3B1進行的三個獨立發表的實驗中，儘管一個實驗檢查葡萄膜黑素瘤患者40 ，第二個檢查葡萄膜葡萄膜黑素瘤細胞株41 且第三個檢查乳癌患者42 ，但表現出最大差異剪接之基因為一致的。 c. 對於新穎的剪接同功異型物，在RNASeq資料中存在確證的「新穎」剪接連接讀段。 d. 對於新穎的重新排列，腫瘤DNA中存在確證的近似外顯子讀段，而正常DNA中不存在 e. 不存在基因表現綱要，諸如GTEx43 (亦即使生殖系起源不太可能) 8. 藉由直接比較組裝的DNA腫瘤與正常讀段(或來自此類讀數之k聚體)來補充基於參考基因組比對之分析，以避免基於比對及註解的錯誤及偽影。(例如對於在生殖系變體或重複內容缺失附近出現的體細胞變體) 在具有聚腺苷酸化RNA之樣品中，RNA-seq資料中之病毒及微生物RNA的存在將使用RNA CoMPASS44 或類似方法評定，以鑑別可預測患者反應的其他因素。VIII.B. HLA 肽之分離及偵測 在裂解及溶解組織樣品後，使用經典免疫沈澱(IP)方法進行HLA-肽分子之分離(55-58)。澄清的溶解物用於HLA特異性IP。 免疫沈澱係使用與珠粒偶合之抗體來進行，其中抗體特異性針對HLA分子。對於泛I類HLA免疫沈澱，使用泛I類CR抗體，對於II類HLA-DR，使用HLA-DR抗體。在隔夜培育期間，抗體共價連接於NHS-瓊脂糖珠粒。在共價連接後，將珠粒洗滌且等分用於IP。(59, 60) 將澄清的組織溶解物添加至抗體珠粒中進行免疫沈澱。在免疫沈澱後，自溶解物移除珠粒且將溶解物儲存用於額外實驗，包括額外IP。洗滌IP珠粒以移除非特異性結合且使用標準技術自珠粒溶離HLA/肽複合物。使用分子量旋轉管柱或C18分級分離自肽移除蛋白質組分。所得肽藉由SpeedVac蒸發變乾且在一些情況下，在MS分析之前儲存在-20℃下。 乾燥的肽在適於逆相層析之HPLC緩衝液中復原且裝載於C-18微毛細管HPLC管柱上，以便在Fusion Lumos質譜儀(Thermo)中梯度溶離。在Orbitrap偵測器中以高解析度收集肽質量/電荷(m/z)之MS1譜，隨後在經選擇之離子的HCD片段化後，在離子阱偵測器中收集MS2低解析度掃描。另外，可使用CID或ETD片段化方法或三種技術之任何組合來獲得MS2譜，以達到肽之更大的胺基酸覆蓋率。MS2譜亦可在Orbitrap偵測器中以高解析度質量精度量測。 使用Comet (61, 62)對來自各分析之MS2譜進行蛋白質資料庫搜尋，且使用Percolator (63-65)對肽鑑別進行評分。VIII.B.1. 支持綜合 HLA 肽 定序之 MS 偵測極限研究 . 使用肽YVYVADVAAK，使用裝載於LC管柱上之不同量的肽確定偵測極限。所測試之肽的量為1 pmol、100 fmol、10 fmol、1 fmol及100 amol。(表1) 結果展示於圖1F中。此等結果表明，最低偵測極限(LoD)在埃莫耳範圍(10-18 )中，動態範圍跨越五個數量級，且信號雜訊比足以在低飛莫耳範圍(10-15 )定序。表 1 IX. 呈現模型 IX.A. 系統綜述 圖2A係根據一個實施例，用於鑑別患者中肽呈現之可能性之環境100的概述。環境100提供背景以引入呈現鑑別系統160，其本身包括呈現資訊存儲器165。 呈現鑑別系統160為一個或多個如以下關於圖14所論述體現在計算系統中之電腦模型，其接收與MHC等位基因集合相關之肽序列且確定肽序列將由相關MHC等位基因集合中之一或多者呈現的可能性。此在各種情形下均有用。呈現鑑別系統160之一個具體使用情況為其能夠接收與來自患者110之腫瘤細胞之MHC等位基因集合相關之候選新抗原的核苷酸序列且確定候選新抗原將由腫瘤之相關MHC等位基因中之一或多者呈現的可能性及/或在患者110之免疫系統中誘導免疫原性反應。可選擇由系統160確定的具有高可能性之彼等候選新抗原以包括於疫苗118中，此類抗腫瘤免疫反應可由提供腫瘤細胞之患者110的免疫系統引發。 呈現鑑別系統160經由一或多個呈現模型來確定呈現可能性。具體而言，呈現模型產生給定肽序列是否將由相關MHC等位基因集合呈現之可能性，且係基於存儲在存儲器165中之呈現資訊產生的。舉例而言，呈現模型可產生肽序列「YVYVADVAAK」是否將由等位基因集合HLA-A*02:01、HLA-B*07:02、HLA-B*08:03、HLA-C*01:04、HLA-A*06:03、HLA-B*01:04在樣品之細胞表面上呈現的可能性。呈現資訊165含有關於肽是否結合於不同類型的MHC等位基因以使得彼等肽由MHC等位基因呈現之資訊，其在模型中視肽序列中胺基酸之位置而確定。呈現模型可基於呈現資訊165預測未識別之肽序列是否將與相關MHC等位基因集合相關聯地呈現。IX.B. 呈現資訊 圖2展示根據一實施例獲得呈現資訊之方法。呈現資訊165包括兩個一般類別之資訊：等位基因相互作用資訊及等位基因非相互作用資訊。等位基因相互作用資訊包括影響視MHC等位基因類型而定之肽序列之呈現的資訊。等位基因非相互作用資訊包括影響與MHC等位基因類型無關之肽序列之呈現的資訊。IX.B.1. 等位基因相互作用資訊 等位基因相互作用資訊主要包括經鑑別之肽序列，已知該等肽序列已由來自人類、小鼠等之一或多種經鑑別之MHC分子呈現。值得注意的是，此可包括或可不包括獲自腫瘤樣品之資料。所呈現之肽序列可自表現單個MHC等位基因之細胞鑑別。在此情況下，所呈現之肽序列一般自經工程改造以表現預定MHC等位基因且隨後暴露於合成蛋白質之單等位基因細胞株收集。在MHC等位基因上呈現之肽係藉由諸如酸溶離之技術分離且經由質譜法鑑別。圖2B展示此種情況之實例，其中在預定MHC等位基因HLA-A*01:01上呈現之實例肽YEMFNDKS經分離且經由質譜法鑑別。因為在此情況下，肽係經由經工程改造以表現單個預定MHC蛋白質之細胞來鑑別，所以所呈現之肽及與其結合之MHC蛋白質之間的直接關聯為確定已知的。 所呈現之肽序列亦可自表現多個MHC等位基因之細胞收集。通常在人體中，細胞表現6種不同類型的MHC分子。如此呈現之肽序列可自經工程改造以表現多個預定MHC等位基因之多等位基因細胞株鑑別。如此呈現之肽序列亦可自組織樣品(正常組織樣品或腫瘤組織樣本)鑑別。尤其在此情況下，MHC分子可自正常或腫瘤組織免疫沈澱。呈現於多個MHC等位基因上之肽可類似地藉由諸如酸溶離之技術分離且經由質譜法鑑別。圖2C展示此種情況之實例，其中六種實例肽YEMFNDKSF、HROEIFSHDFJ、FJIEJFOESS、NEIOREIREI、JFKSIFEMMSJDSSU及KNFLENFIESOFI呈現於經鑑別之MHC等位基因HLA-A*01:01、HLA-A*02:01、HLA-B*07:02、HLA-B*08:01、HLA-C*01:03及HLA-C*01:04，經分離且經由質譜法鑑別。與單等位基因細胞株相反，所呈現之肽及與其結合之MHC蛋白質之間的直接關聯可為未知的，因為所結合之肽在鑑別之前與MHC分子分離。 等位基因相互作用資訊亦可包括質譜離子流，其視肽-MHC分子複合物之濃度及肽之離子化效率而定。離子化效率在肽與肽之間以序列依賴性方式變化。一般而言，離子化效率在肽與肽之間在約兩個數量級內變化，而肽-MHC複合物之濃度在與之相比較大的範圍內變化。 等位基因相互作用資訊亦可包括給定MHC等位基因與給定肽之間的結合親和力的量測或預測。一或多個親和力模型可產生此類預測。舉例而言，回至圖1D中所示之實例，呈現資訊165可包括肽YEMFNDKSF與等位基因HLA-A*01:01之間的1000 nM的結合親和力預測。IC50 ＞ 1000 nm之肽極少由MHC呈現，且較低IC50值增加呈現機率。 等位基因相互作用資訊亦可包括對MHC複合物穩定性之量測或預測。一或多個穩定性模型可產生此類預測。更穩定的肽-MHC複合物(亦即具有較長半衰期之複合物)更可能以高複本數呈現在腫瘤細胞及遭遇疫苗抗原之抗原呈現細胞上。舉例而言，回至圖2C中所示之實例，呈現資訊165可包括分子HLA-A*01:01之半衰期為1小時的穩定性預測。 等位基因相互作用資訊亦可包括經量測或經預測之肽-MHC複合物形成反應速率。以較高速率形成之複合物更可能以高濃度呈現在細胞表面上。 等位基因相互作用資訊亦可包括肽之序列及長度。MHC I類分子通常偏好呈現長度在8與15個肽之間的肽。60-80%之呈現肽的長度為9。來自數個細胞株之呈現肽長度的直方圖展示於圖5中。 等位基因相互作用資訊亦可包括新抗原編碼肽上激酶序列基元之存在，及新抗原編碼肽上特異性轉譯後修飾之不存在或存在。激酶基元之存在影響轉譯後修飾之機率，轉譯後修飾可增強或干擾MHC結合。 等位基因相互作用資訊亦可包括轉譯後修飾過程中所涉及之蛋白質(例如激酶)的表現或活性水平(如由RNA seq、質譜法或其他方法量測或預測)。 等位基因相互作用資訊亦可包括來自表現特定MHC等位基因之其他個體的細胞中具有類似序列之肽的呈現機率，如藉由質譜蛋白質組學或其他手段評定。 等位基因相互作用資訊亦可包括所討論之個體中特定MHC等位基因之表現量(例如藉由RNA-seq或質譜所量測)。與高水準表現之MHC等位基因結合最強的肽比與低水準表現之MHC等位基因結合最強的肽更可能被呈現。 等位基因相互作用資訊亦可包括表現特定MHC等位基因之其他個體中由特定MHC等位基因呈現之總體新抗原編碼肽序列獨立性機率。 等位基因相互作用資訊亦可包括在其他個體中由同一家族分子(例如HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-DP)中之MHC等位基因呈現之總體肽序列獨立性機率。舉例而言，HLA-C分子通常以低於HLA-A或HLA-B分子之水準表現，且因此，由HLA-C呈現肽憑經驗比由HLA-A或HLA-B 11呈現之可能性低。 等位基因相互作用資訊亦可包括特定MHC等位基因之蛋白質序列。 以下部分列出之任何MHC等位基因非相互作用資訊亦可經模型化為MHC等位基因相互作用資訊。IX.B.2. 等位基因非相互作用資訊 等位基因非相互作用資訊可包括在其源蛋白序列內側接新抗原編碼肽之C端序列。C端側接序列可影響肽之蛋白酶體加工。然而，在將肽轉運至內質網且遇到細胞表面上之MHC等位基因之前，C端側接序列由蛋白酶體自肽裂解。因此，MHC分子不接收關於C端側接序列之資訊，且因此，C端側接序列之效應無法視MHC等位基因類型而變化。舉例而言，回至圖2C中所示之實例，呈現資訊165可包括自肽之源蛋白鑑別之呈現肽FJIEJFOESS的C端側接序列FOEIFNDKSLDKFJI。 等位基因非相互作用資訊亦可包括mRNA定量量測。舉例而言，可獲得提供質譜訓練資料之相同樣品的mRNA定量資料。如稍後參照圖13H所述，RNA表現經鑑別為肽呈現之強預測因子。在一個實施例中，mRNA定量量測係自軟體工具RSEM鑑別。RSEM軟體工具之具體實施可見於Bo Li及Colin N. Dewey.RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome .BMC Bioinformatics , 12:323, 2011年8月。在一個實施例中，mRNA定量係以片段/千鹼基轉錄物/百萬定位讀段(FPKM)為單位量測。 等位基因非相互作用資訊亦可包括在其源蛋白序列內側接肽之N端序列。 等位基因非相互作用資訊亦可包括肽中蛋白酶裂解基元之存在，視情況根據腫瘤細胞中相應蛋白酶之表現加權(如藉由RNA-seq或質譜法所量測)。含有蛋白酶裂解基元之肽不大可能呈現，因為其將更容易由蛋白酶降解，且因此在細胞內會更不穩定。 等位基因非相互作用資訊亦可包括在適當細胞類型中所量測之源蛋白的周轉率。較快周轉率(亦即較低半衰期)增加呈現機率；然而，若在不同細胞類型中量測，則此特徵之預測能力較低。 等位基因非相互作用資訊亦可包括源蛋白之長度，視情況考慮在腫瘤細胞中最高度表現之特異性剪接變體(「同功異型物」)，如藉由RNA-seq或蛋白質組質譜法所量測，或如由DNA或RNA序列資料中所偵測之生殖系或體細胞剪接突變的註解所預測。 等位基因非相互作用資訊亦可包括蛋白酶體、免疫蛋白酶體、胸腺蛋白酶體或其他蛋白酶在腫瘤細胞中之表現量(其可藉由RNA-seq、蛋白質組質譜法或免疫組織化學量測)。不同的蛋白酶體具有不同的裂解位點偏好。將賦予與其表現量成比例之各類型蛋白酶體之裂解偏好較大的權重。 等位基因非相互作用資訊亦可包括肽之源基因的表現(例如，如藉由RNA-seq或質譜法所量測)。可能的優化包括調節所量測之表現以考慮腫瘤樣品內基質細胞及腫瘤浸潤性淋巴球的存在。來自較高度表現之基因的肽更可能被呈現。來自表現量不可偵測之基因的肽可排除考慮。 等位基因非相互作用資訊亦可包括新抗原編碼肽之源mRNA將經受無義介導之衰變的機率，如由無義介導之衰變的模型(例如來自Rivas等人, Science 2015之模型)所預測。 等位基因非相互作用資訊亦可包括肽之源基因在細胞週期之各種階段期間的典型組織特異性表現。以總體低水準表現(如藉由RNA-seq或質譜蛋白質組學所量測)但已知在細胞週期之特定階段期間以高水準表現之基因相比以極低水準穩定表現之基因可能產生更多呈現肽。 等位基因非相互作用資訊亦可包括源蛋白之綜合特徵目錄，如例如uniProt或PDB http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do中可所給出。此等特徵可尤其包括：蛋白質之二級及三級結構、亞細胞定位11、基因本體(GO)項。具體而言，此資訊可含有在蛋白質水準起作用之註解(例如5' UTR長度)，及在特定殘基水準起作用之註解(例如殘基300與310之間的螺旋基元)。此等特徵亦可包括轉角基元、摺疊基元及無序殘基。 等位基因非相互作用資訊亦可包括描述含有肽之源蛋白之域特性，例如：二級或三級結構(例如α螺旋對β摺疊)；替代性剪接。 等位基因非相互作用資訊亦可包括描述在肽之源蛋白中在肽之位置處存在或不存在呈現熱點的特徵。 等位基因非相互作用資訊亦可包括在其他個體中由所討論之肽的源蛋白呈現肽的機率(在調節彼等個體中源蛋白之表現量及彼等個體之不同HLA類型的影響之後)。 等位基因非相互作用資訊亦可包括由於技術偏差，肽將不會由質譜法偵測到或過量表示之機率。 如藉由基因表現分析(諸如RNASeq)、微陣列、靶向組(諸如Nanostring)所量測之各種基因模組/途徑之表現，或藉由諸如RT-PCR之分析(其無需含有肽之源蛋白)量測之基因模組的單/多基因代表，提供關於腫瘤細胞、基質或腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)狀態之資訊。 等位基因非相互作用資訊亦可包括肽之源基因在腫瘤細胞中之複本數。舉例而言，來自腫瘤細胞中經受純合缺失之基因的肽可經指定呈現機率為零。 等位基因非相互作用資訊亦可包括肽與TAP結合之機率或肽與TAP之經量測或經預測之結合親和力。更可能與TAP結合之肽或以較高親和力結合TAP之肽更可能被呈現。 等位基因非相互作用資訊亦可包括TAP在腫瘤細胞中之表現量(其可藉由RNA-seq、蛋白質組質譜法、免疫組織化學量測)。較高TAP表現量增加所有肽呈現之機率。 等位基因非相互作用資訊亦可包括存在或不存在腫瘤突變，其包括(但不限於)： i. 已知癌症驅動基因(諸如EGFR、KRAS、ALK、RET、ROS1、TP53、CDKN2A、CDKN2B、NTRK1、NTRK2、NTRK3)中之驅動突變 ii. 在編碼抗原呈現機制中所涉及之蛋白質的基因(例如B2M、HLA-A、HLA-B、HLA-C、TAP-1、TAP-2、TAPBP、CALR、CNX、ERP57、HLA-DM、HLA-DMA、HLA-DMB、HLA-DO、HLA-DOA、HLA-DOBHLA-DP、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQ、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DR、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5或編碼蛋白酶體或免疫蛋白酶體組分之基因中之任一者)中。呈現依賴於腫瘤中經受功能喪失性突變之抗原呈現機制之組分的肽具有降低的呈現機率。 存在或不存在功能性生殖系多形現象，其包括(但不限於)：i. 在編碼抗原呈現機制中所涉及之蛋白質的基因(例如B2M、HLA-A、HLA-B、HLA-C、TAP-1、TAP-2、TAPBP、CALR、CNX、ERP57、HLA-DM、HLA-DMA、HLA-DMB、HLA-DO、HLA-DOA、HLA-DOBHLA-DP、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQ、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DR、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5或編碼蛋白酶體或免疫蛋白酶體組分之基因中之任一者)中 等位基因非相互作用資訊亦可包括腫瘤類型(例如NSCLC、黑素瘤)。 等位基因非相互作用資訊亦可包括HLA等位基因之已知功能，如由例如HLA等位基因後綴所反映。舉例而言，等位基因名稱HLA-A*24:09N中之N後綴指示未表現且因此不可能呈現抗原決定基之剔除式等位基因；完整HLA等位基因後綴命名法描述於https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/nomenclature/suffixes.html。 等位基因非相互作用資訊亦可包括臨床腫瘤亞型(例如鱗狀肺癌對非鱗狀)。 等位基因非相互作用資訊亦可包括吸菸史。 等位基因非相互作用資訊亦可包括曬傷史、太陽曝曬史或暴露於其他誘變劑之歷史。 等位基因非相互作用資訊亦可包括肽之源基因在相關腫瘤類型或臨床亞型中之典型表現，視情況藉由驅動突變分層。通常在相關腫瘤類型中以高水準表現之基因更可能被呈現。 等位基因非相互作用資訊亦可包括所有腫瘤中、或相同類型之腫瘤中、或具有至少一個共享MHC等位基因之個體的腫瘤中、或具有至少一個共享MHC等位基因之個體之相同類型的腫瘤中的突變頻率。 在突變的腫瘤特異性肽之情況下，用於預測呈現機率之特徵清單亦可包括突變之註解(例如誤義、通讀、讀框轉移、融合等)或預測突變是否導致無義介導之衰變(NMD)。舉例而言，由於純合早期終止突變而在腫瘤細胞中不轉譯之蛋白質區段的肽可經指定呈現機率為零。NMD使得mRNA轉譯降低，其降低呈現機率。IX.C. 呈現鑑別系統 圖3係說明根據一個實施例的呈現鑑別系統160之電腦邏輯組件的高級框圖。在此示例實施例中，呈現鑑別系統160包括資料管理模組312、編碼模組314、訓練模組316及預測模組320。呈現鑑別系統160亦由訓練資料存儲器170及呈現模型存儲器175構成。模型管理系統160之一些實施例具有與此處所述不同的模組。類似地，功能可以不同於此處描述之方式分佈於模組當中。IX.C.1. 資料管理模組 資料管理模組312自呈現資訊165產生數組訓練資料170。每組訓練資料含有複數個資料實例，其中每個資料實例i 含有一組自變數 zi ，其包括至少一個經呈現或未經呈現之肽序列 pi 、一或多個與該肽序列 pi 相關聯之相關MHC等位基因 ai ；及一個因變數yi ，其表示呈現鑑別系統160有意預測自變數之新值之資訊。 在本說明書其餘部分通篇提及的一個特定實施方案中，因變數yi 係一種二元標記，指示肽 pi 是否經一或多個相關MHC等位基因 ai 呈現。不過，應瞭解，在其他實施方案中，取決於自變數 zi ，因變數 yi 可以表示呈現鑑別系統160有意進行預測的任何其他種類之資訊。舉例而言，在另一實施方案中，因變數 yi 亦可為指示所鑑別的資料實例之質譜離子電流的數值。 資料實例 i 之肽序列 pi 係具有ki 個胺基酸之序列，其中ki 可以隨資料實例i 而在一定範圍內變化。舉例而言，該範圍對於I類MHC可以為8-15或對於II類MHC為9-30。在系統160之一個特定實施方案中，一個訓練資料集中的所有肽序列 pi 可以具有相同長度，例如9。肽序列中之胺基酸數量可以取決於MHC等位基因之類型(例如人體中之MHC等位基因等)而變化。資料實例i 之MHC等位基因 ai 指示存在的與相應肽序列 pi 相關聯之MHC等位基因。 資料管理模組312亦可包括另外的等位基因相互作用變數，諸如與訓練資料170中所包含的肽序列 pi 及相關MHC等位基因 ai 有關之結合親和力 bi 及穩定性 si 預測值。舉例而言，訓練資料170可以含有肽 pi 與 ai 中指示之相關MHC分子中之每一個之間的結合親和力預測值 bi 。作為另一實例，訓練資料170可以含有關於 ai 中指示之MHC等位基因中之每一個的穩定性預測值 si 。 資料管理模組312亦可包括等位基因非相互作用變數 wi ，諸如與肽序列 pi 有關的C末端側接序列及mRNA定量量測值。 資料管理模組312亦鑑別未經MHC等位基因呈現之肽序列以產生訓練資料170。一般而言，此涉及鑑別源蛋白質之「較長」序列，其包括呈現前之呈現肽序列。當呈現資訊含有經工程改造之細胞株時，資料管理模組312鑑別該等細胞所暴露之合成蛋白質中未呈現於該等細胞之MHC等位基因上的一系列肽序列。當呈現資訊含有組織樣品時，資料管理模組312鑑別呈現肽序列來源之源蛋白質，且鑑別源蛋白質中未呈現於組織樣品細胞之MHC等位基因上的一系列肽序列。 資料管理模組312亦可利用隨機胺基酸序列人工產生肽，且鑑別所產生之序列為不呈現於MHC等位基因上之肽。此可以藉由隨機地產生肽序列實現，允許資料管理模組312容易地產生大量不呈現於MHC等位基因上之肽的合成資料。由於實際上MHC等位基因呈現小百分率之肽序列，故合成產生之肽序列極可能不由MHC等位基因呈現，即使該等序列包括在經細胞加工之蛋白質中。 圖4說明根據一個實施例的一實例組之訓練資料170A。特定地，訓練資料170A中之前3個資料實例指示由包含等位基因HLA-C*01:03之單等位基因細胞株得到的肽呈現資訊以及3個肽序列QCEIOWARE、FIEUHFWI及FEWRHRJTRUJR。訓練資料170A中的第四個資料實例指示由包含等位基因HLA-B*07:02、HLA-C*01:03、HLA-A*01:01之多等位基因細胞株得到的肽資訊以及肽序列QIEJOEIJE。第一個資料實例指示肽序列QCEIOWARE未經等位基因HLA-C*01:03呈現。如前兩段中所論述，肽序列可以由資料管理模組312隨機產生或自呈現肽之源蛋白質鑑別。訓練資料170A亦包括肽序列-等位基因對的1000nM之結合親和力預測值及1小時半衰期之穩定性預測值。訓練資料170A亦包括等位基因非相互作用變數，諸如肽FJELFISBOSJFIE之C末端側接序列及102 FPKM之mRNA定量量測值。第四個資料實例指示，肽序列QIEJOEIJE經等位基因HLA-B*07:02、HLA-C*01:03或HLA-A*01:01之一呈現。訓練資料170A亦包括有關等位基因中之每一個的結合親和力預測值及穩定性預測值，以及該肽之C端側接序列及該肽之mRNA定量量測值。IX.C.2. 編碼模組 編碼模組314將訓練資料170中所包含之資訊編碼成可以用於產生一或多個呈現模型的數字表示。在一個實施方案中，編碼模組314經預定的20字母胺基酸字母表獨熱編碼序列(例如肽序列或C末端側接序列)。具體言之，具有ki 個胺基酸之肽序列 pi 表示為具有20 ∙ki 個元素之列向量，其中pi 20∙(j-1)+1 、 pi 20∙(j-1)+2 、… ,pi 20∙j 當中對應於字母表中在該肽序列第j 位之胺基酸的單一元素之值為1。另外，其餘元素的值為0。舉例而言，對於給定字母表{A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y}，資料實例i 的具有3個胺基酸之肽序列EAF可以由具有60個元素之列向量表示： pi =[0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0]。C末端側接序列 ci ，以及MHC等位基因之蛋白質序列 dh ，及呈現資訊中之其他序列資料可以與上文所描述類似之方式編碼。 當訓練資料170含有胺基酸長度不同之序列時，編碼模組314亦可藉由添加PAD字符以擴充預定字母表，將該等肽編碼成相等長度之向量。舉例而言，此可以藉由用PAD字符對該肽序列左側填充直至該肽序列之長度達到訓練資料170中具有最大長度之肽序列來進行。因此，當具有最大長度之肽序列具有kmax 個胺基酸時，編碼模組314將各序列以數字方式表示為具有(20+1 )∙kmax 個元素之列向量。舉例而言，對於擴充之字母表{PAD, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y}及kmax =5 之最大胺基酸長度，該具有3個胺基酸之示例肽序列EAF可以由具有105個元素之列向量表示： pi =[1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0]。C末端側接序列 ci 或其他序列資料可以與上文所描述類似之方式編碼。因此，肽序列 pi 或 ci 中的每個自變數或每一行表示在該序列特定位置處特定胺基酸之存在。 儘管以上編碼序列資料之方法係參照具有胺基酸序列之序列描述，但該方法亦可類似地擴展至其他類型之序列資料，諸如DNA或RNA序列資料，及類似序列資料。 編碼模組314亦將資料實例i 之一或多個MHC等位基因 ai 編碼為具有m 個元素之列向量，其中各元素h=1, 2, … , m 對應於唯一鑑別之MHC等位基因。對應於所鑑別的資料實例i 之MHC等位基因的元素之值為1。另外，其餘元素的值為0。舉例而言，m=4 種唯一鑑別之MHC等位基因類型{HLA-A*01:01, HLA-C*01:08, HLA-B*07:02, HLA-C*01:03}當中對應於多等位基因細胞株的資料實例i 之等位基因HLA-B*07:02及HLA-C*01:03可以由具有4個元素之列向量表示： ai =[0 0 1 1]，其中a3 i =1及a4 i =1。儘管本文中用4種經鑑別之MHC等位基因類型描述實例，但MHC等位基因類型之數量實際上可以為數百種或數千種。如先前所論述，每個資料實例i 通常含有至多6種不同的與肽序列 pi 相關聯之MHC等位基因類型。 編碼模組314亦將各資料實例i 之標記yi 編碼為具有來自集合{0, 1}之值的二元變數，其中值1指示肽 xi 經相關MHC等位基因 ai 之一呈現，且值0指示肽 xi 未經相關MHC等位基因 ai 中之任一個呈現。當因變數yi 表示質譜離子電流時，編碼模組314可以另外使用各種函數，諸如對於在[0, ∞]之間之離子電流值具有[-∞, ∞]之範圍的對數函數縮放該等值。 編碼模組314可以將有關肽pi 及相關MHC等位基因h 的一對等位基因相互作用變數 xh i 表示為列向量，其中等位基因相互作用變數之數字表示係相繼地串接。舉例而言，編碼模組314可以將 xh i 表示為等於[pi ] 、[pi bh i ] 、[pi sh i ] 或[pi bh i sh i ] 之列向量，其中bh i 係肽pi 及相關MHC等位基因h 之結合親和力預測值，且類似地適用於有關穩定性之sh i 。或者，等位基因相互作用變數之一或多個組合可以個別地存儲(例如以個別向量或矩陣形式)。 在一個實例中，編碼模組314藉由將結合親和力之量測值或預測值併入等位基因相互作用變數 xh i 中來表示結合親和力資訊。 在一個實例中，編碼模組314藉由將結合穩定性之量測值或預測值併入等位基因相互作用變數 xh i 中來表示結合穩定性資訊。 在一個實例中，編碼模組314藉由將結合締合速率之量測值或預測值併入等位基因相互作用變數 xh i 中來表示結合締合速率資訊。 在一個實例中，編碼模組314將肽長度表示為向量 Tk =[(Lk =8) (Lk =9) (Lk =10) (Lk =11) (Lk =12) (Lk =13) (Lk =14) (Lk =15)]，其中係指標函數，且Lk 表示肽 pk 之長度。向量 Tk 可以包括在等位基因相互作用變數 xh i 中。 在一個實例中，編碼模組314藉由將基於RNA-seq之MHC等位基因表現量併入等位基因相互作用變數 xh i 中來表示MHC等位基因之RNA表現資訊。 類似地，編碼模組314可以將等位基因非相互作用變數 wi 表示為列向量，其中等位基因非相互作用變數之數字表示係相繼地串接。舉例而言， wi 可以為等於[ci ] 或[ci mi wi ] 之列向量，其中 wi 係表示除肽 pi 之C末端側接序列及與該肽有關之mRNA定量量測值 mi 外的任何其他等位基因非相互作用變數之列向量。或者，等位基因非相互作用變數之一或多個組合可以個別地存儲(例如以個別向量或矩陣形式)。 在一個實例中，編碼模組314藉由將轉換率或半衰期併入等位基因非相互作用變數 wi 中來表示源蛋白質之轉換率。 在一個實例中，編碼模組314藉由將蛋白質長度併入等位基因非相互作用變數 wi 中來表示源蛋白質或同功異型物之長度。 在一個實例中，編碼模組314藉由將包括β 1 i 、β 2 i 、β 5 i 次單元在內之免疫蛋白酶體特異性蛋白酶體次單元之平均表現量併入等位基因非相互作用變數 wi 中來表示免疫蛋白酶體之活化。 在一個實例中，編碼模組314藉由將源蛋白質之豐度併入等位基因非相互作用變數 wi 中來表示肽之源蛋白質或肽之基因或轉錄物的RNA-Seq豐度(藉由諸如RSEM之技術，以FPKM、TPM為單位定量)。 在一個實例中，編碼模組314藉由將利用例如Rivas等人, Science, 2015中之模型估計的肽之源轉錄物經歷無義介導之衰變(NMD)的機率併入等位基因非相互作用變數 wi 中來表示該機率。 在一個實例中，編碼模組314例如藉由使用例如經RNA-Seq評估之路徑中每個基因之RSEM，接著計算該路徑中所有基因之概括統計量，例如平均值，以TPM為單位定量該路徑中基因之表現，以此表示基因模組或路徑之活化狀態。該平均值可以併入等位基因非相互作用變數 wi 中。 在一個實例中，編碼模組314藉由將複本數併入等位基因非相互作用變數 wi 中來表示源基因之複本數。 在一個實例中，編碼模組314藉由將量測或預測之TAP結合親和力(例如以奈莫耳濃度為單位)包括在等位基因非相互作用變數 wi 中來表示TAP結合親和力。 在一個實例中，編碼模組314藉由將利用RNA-seq量測(且藉由例如RSEM以TPM為單位定量)的TAP表現量包括在等位基因非相互作用變數 wi 中來表示TAP表現量。 在一個實例中，編碼模組314在等位基因非相互作用變數 wi 中將腫瘤突變表示為指標變數之向量(亦即，若肽 pk 來自具有KRAS G12D突變之樣品，則 dk =1，否則為0)。 在一個實例中，編碼模組314將抗原呈現基因中之生殖系多態性表示為指標變數之向量(亦即，若肽 pk 來自在TAP中具有物種生殖系多態性之樣品，則 dk =1)。該等指標變數可以包括在等位基因非相互作用變數 wi 中。 在一個實例中，編碼模組314經腫瘤類型(例如NSCLC、黑素瘤、結腸直腸癌等)之字母表將腫瘤類型表示為長度一獨熱編碼之向量。該等獨熱編碼之變數可以包括在等位基因非相互作用變數wi 中。 在一個實例中，編碼模組314藉由用不同後綴處理4數位之HLA等位基因來表示MHC等位基因後綴。舉例而言，出於該模型之目的，HLA-A*24:09N被視為與HLA-A*24:09不同之等位基因。或者，由於以N後綴結尾之HLA等位基因不表現，故可以將所有肽中經加N後綴之MHC等位基因呈現之機率設定成零。 在一個實例中，編碼模組314經腫瘤亞型(例如肺腺癌、肺鱗狀細胞癌等)之字母表將腫瘤亞型表示為長度一獨熱編碼之向量。該等獨熱編碼之變數可以包括在等位基因非相互作用變數 wi 中。 在一個實例中，編碼模組314將抽菸史表示為二元指標變數(若患者有抽菸史，則 dk =1，否則為0)，該變數可以包括在等位基因非相互作用變數 wi 中。或者，抽菸史可以經抽菸嚴重程度之字母表編碼為長度一獨熱編碼之變數。舉例而言，抽菸狀態可以在1-5級量表上評級，其中1級指示非抽菸者，且5級指示當前多量抽菸者。由於抽菸史主要與肺腫瘤相關，故當訓練有關多個腫瘤類型之模型時，此變數亦可定義為當患者有抽菸史時等於1且腫瘤類型係肺腫瘤，否則為0。 在一個實例中，編碼模組314將曬傷史表示為二元指標變數(若患者有重度曬傷史，則 dk =1，否則為0)，該變數可以包括在等位基因非相互作用變數 wi 中。由於重度曬傷主要與黑素瘤相關，故當訓練有關多個腫瘤類型之模型時，此變數亦可定義為當患者有重度曬傷史時等於1且腫瘤類型係黑素瘤，否則為0。 在一個實例中，編碼模組314藉由使用參考資料庫，諸如TCGA將有關人類基因組中各基因或轉錄物之特定基因或轉錄物表現量分佈表示為表現量分佈之概括統計量(例如平均值、中值)。具體言之，對於腫瘤類型為黑素瘤之樣品中的肽 pk ，不僅肽 pk 之源基因或轉錄物的經量測基因或轉錄物表現量包括在等位基因非相互作用變數 wi 中，而且如藉由TCGA所量測的黑素瘤中肽 pk 之源基因或轉錄物之平均及/或中值基因或轉錄物表現量亦包括在內。 在一個實例中，編碼模組314經突變類型(例如錯義、讀框轉移、NMD誘導等)之字母表將突變類型表示為長度一獨熱編碼之變數。該等獨熱編碼之變數可以包括在等位基因非相互作用變數 wi 中。 在一個實例中，編碼模組314在等位基因非相互作用變數 wi 中將蛋白質層面之蛋白質特徵表示為註釋值(例如5' UTR長度)。在另一實例中，編碼模組314藉由在等位基因非相互作用變數 wi 中包括指標變數來表示肽 pk 之源蛋白質的殘基層面之註釋，亦即，若肽 pk 與螺旋基序重疊則等於1，否則等於0，或亦即，若肽 pk 完全包含在螺旋基元內則等於1。在另一實例中，表示肽 pk 中包含在螺旋基元註釋內之殘基之比例的特徵可以包括在等位基因非相互作用變數 wi 中。 在一個實例中，編碼模組314將人類蛋白質組中蛋白質或同功異型物之類型表示為指標向量 ok ，該向量之長度等於人類蛋白質組中蛋白質或同功異型物之數量，且若肽 pk 來自蛋白質i ，則相應元素ok i 係1，否則為0。 編碼模組314亦可將有關肽 pi 及相關MHC等位基因h 之變數 zi 的總體集合表示為列向量，其中等位基因相互作用變數 xi 及等位基因非相互作用變數 wi 之數字表示係相繼地串接。舉例而言，編碼模組314可以將 zh i 表示為等於[xh i wi ] 或[ Wi xh i ] 之 列向量。X. 訓練模組 訓練模組316構築一或多個呈現模型，該等模型產生肽序列是否會由與該等肽序列相關聯之MHC等位基因呈現的可能性。具體言之，已知肽序列 pk 及與該肽序列 pk 相關聯之一組MHC等位基因 ak ，每個呈現模型產生估計值uk ，其指示該肽序列 pk 將由相關MHC等位基因 ak 中之一或多個呈現的可能性。X.A. 綜述 訓練模組316基於由存儲於165中之呈現資訊產生的存儲於存儲器170中之訓練資料集構築該一或多個呈現模型。一般而言，不管呈現模型之具體類型如何，所有該等呈現模型均捕捉訓練資料170中自變數與因變數之間的相關性以使損失函數減到最小。具體言之，損失函數(yi ∈ S ,ui ∈ S ； θ )表示訓練資料170中一或多個資料實例S 之因變數yi ∈ S 值與由呈現模型產生的資料實例S 之估計可能性ui ∈ S 之間的偏差。在本說明書其餘部分通篇所提及的一個特定實施方案中，損失函數(yi ∈ S , ui ∈ S ； θ )係由以下等式(1a)提供的負對數可能性函數：。 (1a) 不過，實際上可以使用另一損失函數。舉例而言，當對質譜離子電流進行預測時，損失函數係由以下等式1b提供的均方損失：。 (1b) 呈現模型可以為一種參數模型，其中一或多個參數 θ 在數學上指明自變數與因變數之間的相關性。通常，使損失函數(yi ∈ S , ui ∈ S ； θ )減到最小的參數型呈現模型之各種參數係經由基於梯度之數值優化算法，諸如批量梯度算法、隨機梯度算法及類似算法確定。或者，呈現模型可以為一種非參數模型，其中模型結構係由訓練資料170決定且並不嚴格基於固定參數集合。X.B. 獨立等位基因模型 訓練模組316可以在獨立等位基因(per-allele)基礎上構築呈現模型以預測肽之呈現可能性。在此情況下，訓練模組316可以基於由表現單一MHC等位基因之細胞產生的訓練資料170中之資料實例S 訓練呈現模型。 在一個實施方案中，訓練模組316藉由下式使特定等位基因h 對於肽 pk 之估計呈現可能性uk 模型化：， (2) 其中肽序列 xh k 表示編碼的有關肽 pk 及相應MHC等位基因h 之等位基因相互作用變數，f (∙)係任何函數且為便於說明，在本文通篇稱為變換函數。另外，gh (∙)係任何函數，為便於說明，在本文通篇稱為相關性函數(dependency function)，且基於所測定的MHC等位基因h 之一組參數 θ h 產生對於等位基因相互作用變數 xh k 的相關性評分。有關各MHC等位基因h 之參數集合 θh 的值可以藉由使有關 θh 之損失函數減到最小來測定，其中i 係由表現單一MHC等位基因h 之細胞產生的訓練資料170之子集S 中的每一實例。 相關性函數gh ( xh k ; θ h )之輸出值表示至少基於等位基因相互作用特徵 xh k ，且特定言之，基於肽 pk 之肽序列中之胺基酸位置的針對MHC等位基因h 之相關性評分，其指示MHC等位基因h 是否會存在於相應新抗原中。舉例而言，若MHC等位基因h 可能呈現肽 pk ，則有關MHC等位基因h 之相關性評分可以具有較高值，且若不可能呈現，則可能具有較低值。變換函數f (∙)將輸入變換成，且更確切地說，在此情況下將由gh ( xh k ; θh )產生之相關性評分變換成適當值以指示肽 pk 會經MHC等位基因呈現之可能性。 在本說明書其餘部分通篇提及的一個特定實施方案中，f (∙)係對於適當域範圍具有在[0, 1]內之範圍的函數。在一個實例中，f (∙)係由以下提供之expit函數：。 (4) 作為另一實例，當域z 之值等於或大於0時，f (∙)亦可為由以下提供之雙曲正切函數：(5) 或者，當質譜離子電流之預測值超出範圍[0, 1]時，f (∙)可以為任何函數，諸如恆等函數、指數函數、對數函數及類似函數。 因此，可以藉由將有關MHC等位基因h之相關性函數gh (∙)應用於肽序列 pk 之經編碼形式以產生相應相關性評分來產生肽序列 pk 會經MHC等位基因h 呈現之獨立等位基因可能性。相關性評分可以藉由變換函數f (∙)變換以產生肽序列 pk 會經MHC等位基因h 呈現之獨立等位基因可能性。X.B.1 有關等位基因相互作用變數之相關性函數 在本說明書通篇提及的一個特定實施方案中，相關性函數gh (∙)係由下式提供之仿射函數：， (6) 該函數將 xh k 中的每個等位基因相互作用變數與所測定的相關MHC等位基因h 之參數集合 θ h 中的相應參數線性地組合。 在本說明書通篇提及的另一特定實施方案中，相關性函數 gh (∙) 係由下式提供之網路函數：， (7) 以具有佈置在一或多個層中之一系列節點的網路模型NNh (∙)表示。一個節點可以經由連接來連接至其他節點，該等連接各自在參數集合 θ h 中具有相關參數。在一個特定節點處之值可以表示為藉由與該特定節點相關聯之激發函數所映射之相關參數加權的連接至該特定節點之節點之值的總和。與仿射函數相比，由於呈現模型可以併入具有不同胺基酸序列長度之非線性及製程資料，故網路模型係有利的。具體言之，經由非線性建模，網路模型可以捕捉在肽序列中不同位置處之胺基酸之間的相互作用及此相互作用如何影響肽呈現。 一般而言，網路模型NNh (∙)可以經結構化為前饋網路，諸如人工神經網路(ANN)、迴旋神經網路(CNN)、深度神經網路(DNN)，及/或循環網路，諸如長短期記憶網路(LSTM)、雙向循環網路、深度雙向循環網路及類似網路。 在本說明書其餘部分通篇所提及的一個實例中，h=1, 2, … , m 中之每個MHC等位基因與獨立網路模型相關，且NNh (∙)表示來自與MHC等位基因h 相關聯之網路模型的輸出。 圖5說明與任意MHC等位基因h= 3相關之示例網路模型NN3 (∙)。如圖5中所示，關於MHC等位基因h=3 之網路模型NN3 (∙)包括在層l=1 處之三個輸入節點、在層l=2 處之四個節點、在層l=3 處之兩個節點及在層l=4 處之一個輸出節點。網路模型NN3 (∙)與一組十個參數θ 3 (1), θ 3 (2), … , θ 3 (10)相關。網路模型NN3 (∙)接受關於MHC等位基因h=3 之三個等位基因相互作用變數x3 k (1)、x3 k (2)及x3 k (3)之輸入值(包括經編碼之多肽序列資料及所用任何其他訓練資料之個別資料實例)且輸出值NN3 (x3 k )。 在另一實例中，經鑑別之MHC等位基因h=1,2, … , m 與單一網路模型NNH (∙)相關聯，且NNh (∙)表示與MHC等位基因h 相關聯之單一網路模型的一或多個輸出。在此類實例中，參數集合 θh 可以對應於該單一網路模型之一組參數，且因此，參數集合 θh 可以為所有MHC等位基因共有的。 圖6A說明MHC等位基因h=1,2, … ,m 共享的示例網路模型NNH (∙)。如圖6A中所示，該網路模型NNH (∙)包括m 個輸出節點，各自對應於MHC等位基因。網路模型NN3 (∙)接受有關MHC等位基因h=3 之等位基因相互作用變數 x3 k 並輸出m 個值，包括對應於MHC等位基因h=3 之值NN3 (x3 k )。 在又一實例中，單一網路模型NNH (∙)可以為在已知MHC等位基因h 之等位基因相互作用變數 xh k 及經編碼之蛋白質序列 dh 情況下，輸出相關性評分的網路模型。在此類實例中，參數集合 θh 可以再次對應於單一網路模型之一組參數，且因此，參數集合 θh 可以為所有MHC等位基因共享的。因此，在此類實例中，NNh (∙)可以表示在該單一網路模型之輸入[ xh k dh ] 已知情況下，該單一網路模型NNH (∙)之輸出。由於訓練資料中未知之MHC等位基因的肽呈現機率只能藉由鑑別其蛋白質序列進行預測，故此類網路模型係有利的。 圖6B說明MHC等位基因共享的示例網路模型NNH (∙)。如圖6B中所示，網路模型(∙)接受MHC等位基因h=3 之等位基因相互作用變數及蛋白質序列作為輸入，且輸出對應於MHC等位基因h=3 之相關性評分NN3 (x3 k )。 在又一實例中，相關性函數 gh (∙) 可以表示為：其中g ' h ( xh k ; θ ' h )係具有一組參數 θ ' h 的仿射函數、網路函數或類似函數，其中有關MHC等位基因之等位基因相互作用變數的參數集合中之偏差參數 θ h 0 表示MHC等位基因h 之基線呈現機率。 在另一實施方案中，偏差參數 θ h 0 可以為MHC等位基因h 之基因家族共享的。亦即，MHC等位基因h 之偏差參數 θh 0 可以等於 θ 基因 (h) 0 ，其中基因 (h )係MHC等位基因h 之基因家族。舉例而言，MHC等位基因HLA-A*02:01、HLA-A*02:02及HLA-A*02:03可以指定給「HLA-A」基因家族，且該等MHC等位基因中之每一個的偏差參數 θ h 0 可以為共享的。 再回到等式(2)，作為一個實例，在使用仿射相關性函數gh (∙)鑑別的m=4 種不同MHC等位基因中，肽 pk 會經MHC等位基因h=3 呈現之可能性可以由下式產生：， 其中 x3 k 係所鑑別的MHC等位基因h=3 之等位基因相互作用變數，且 θ 3 係經由損失函數最小化測定的MHC等位基因h=3 之參數集合。 作為另一實例，在使用獨立網路變換函數gh (∙)鑑別的m=4 種不同MHC等位基因當中，肽 pk 會經MHC等位基因h=3 呈現之可能性可以藉由下式產生： 其中 x3 k 係所鑑別的MHC等位基因h=3之等位基因相互作用變數，且 θ 3 係所測定的與MHC等位基因h=3 相關聯之網路模型NN3 (∙)的參數集合。 圖7說明使用示例網路模型NN3 (∙)產生與MHC等位基因h= 3相關聯之肽 pk 之呈現可能性。如圖7中所示，網路模型NN3 (∙)接受有關MHC等位基因h=3 之等位基因相互作用變數 x3 k 並產生輸出NN3 ( x3 k )。該輸出經函數 f (∙) 映射以產生估計的呈現可能性uk 。X.B.2. 具有等位基因非相互作用變數之獨立等位基因 在一個實施方案中，訓練模組316併入等位基因非相互作用變數且藉由下式使肽 pk 之估計呈現可能性uk 模型化：， (8) 其中 wk 表示關於肽 pk 之經編碼等位基因非相互作用變數，gw (∙)係基於所測定的等位基因非相互作用變數 wk 之一組參數 θ w 的有關等位基因非相互作用變數之函數。具體言之，有關各MHC等位基因h 之參數集合 θh 及有關等位基因非相互作用變數之參數集合 θw 的值可以藉由使關於 θh 及 θw 之損失函數減到最小來測定，其中i 係由表現單一MHC等位基因之細胞產生的訓練資料170之子集S 中的每一實例。 相關性函數gw ( wk ;θw )之輸出表示基於等位基因非相互作用變數之影響進行的等位基因非相互作用變數之相關性評分，其指示肽 pk 是否會經一或多個MHC等位基因呈現。舉例而言，若肽 pk 與已知會積極地影響肽 pk 之呈現的C末端側接序列相關，則等位基因非相互作用變數之相關性評分可能具有較高值，且若肽 pk 與已知會不利地影響肽 pk 之呈現的C末端側接序列相關，則可能具有較低值。 根據等式(8)，肽序列 pk 會經MHC等位基因h 呈現之獨立等位基因可能性可以藉由將有關MHC等位基因h 之函數gh (∙)應用於肽序列 pk 之經編碼形式以產生等位基因相互作用變數之相應相關性評分來產生。有關等位基因非相互作用變數之函數gw (∙)亦應用於等位基因非相互作用變數之經編碼形式以產生等位基因非相互作用變數之相關性評分。將兩個評分合併，且藉由變換函數f (∙)變換該合併之評分以產生肽序列 pk 會經MHC等位基因h 呈現之獨立等位基因可能性。 或者，訓練模組316可以藉由將等位基因非相互作用變數 wk 添加至等式(2)中之等位基因相互作用變數 xh k 中而在預測值中包括等位基因非相互作用變數 wk 。因此，呈現可能性可以藉由下式得到：。 (9)X.B.3 有關等位基因非相互作用變數之相關性函數 與有關等位基因相互作用變數之相關性函數gh (∙)類似，有關等位基因非相互作用變數之相關性函數gw (∙)可以為仿射函數或網路函數，其中獨立網路模型與等位基因非相互作用變數 wk 相關聯。 具體言之，相關性函數gw (∙)係由下式提供之仿射函數：， 該函數將等位基因非相互作用變數 wk 與參數集合 θ w 中之相應參數線性地組合。 相關性函數 gw (∙) 亦可為由下式提供之網路函數：， 其由具有參數集合 θ w 中之相關參數之網路模型NNw (∙)表示。 在另一實例中，有關等位基因非相互作用變數之相關性函數 gw (∙) 可以由下式提供：， (10) 其中g ' w ( wk ; θ ' w )係仿射函數、具有等位基因非相互作用參數集合 θ ' w 之網路函數或類似函數，mk 係肽 pk 之mRNA定量量測值，h (∙)係變換該定量量測值之函數，且θ w m 係有關等位基因非相互作用變數之參數集合中之參數，其與該mRNA定量量測值組合以產生mRNA定量量測值之相關性評分。在本說明書其餘部分通篇提及的一個特定實施例中，h (∙)係對數函數，不過實際上，h (∙)可以為多種不同函數中之任一種。 在又一實例中，有關等位基因非相互作用變數之相關性函數 gw (∙) 可以由下式提供：， (11) 其中g ' w ( wk ; θ ' w )係仿射函數、具有等位基因非相互作用參數集合 θ ' w 之網路函數或類似函數， ok 係以上描述的表示人類蛋白質組中有關肽 pk 之蛋白質及同功異型物的指標向量，且 θ w o 係與指標向量組合的有關等位基因非相互作用變數之參數集合中的一組參數。在一種變化形式中，當 ok 之維度及參數集合 θw o 明顯較高時，可以在測定參數值時將參數正則項，諸如，添加至損失函數中，其中||∙||表示L1範數、L2範數、組合或類似物。超參數λ之最佳值可以經由適當方法確定。 再回到等式(8)，作為一個實例，在使用仿射變換函數gh (∙)、gw (∙)鑑別的m=4種不同MHC等位基因中，肽 pk 會經MHC等位基因h=3 呈現之可能性可以由下式產生：， 其中 wk 係所鑑別的有關肽 pk 之等位基因非相互作用變數，且 θ w 係所測定的等位基因非相互作用變數之參數之集合。 作為另一實例，在使用網路變換函數gh (∙)、gw (∙)鑑別的m=4 種不同MHC等位基因當中，肽 pk 會經MHC等位基因h=3 呈現之可能性可以藉由下式產生：其中 wk 係所鑑別的有關肽 pk 之等位基因相互作用變數，且 θ w 係所測定的等位基因非相互作用變數之參數之集合。 圖8說明使用示例網路模型NN3 (∙)及NNw (∙)產生與MHC等位基因h= 3相關聯之肽 pk 之呈現可能性。如圖8中所示，網路模型NN3 (∙)接受有關MHC等位基因h=3 之等位基因相互作用變數 x3 k 並產生輸出NN3 ( x3 k )。網路模型NNw (∙)接受有關肽 pk 之等位基因非相互作用變數 wk 並產生輸出NNw ( wk )。將該等輸出合併並藉由函數f (∙)映射以產生估計呈現可能性uk 。X.C. 多等位基因模型 訓練模組316亦可在存在兩個或兩個以上MHC等位基因之多等位基因環境中構築呈現模型以預測肽之呈現可能性。在此情況下，訓練模組316可以基於由表現單一MHC等位基因之細胞、表現多個MHC等位基因之細胞或其組合產生的訓練資料170中之資料實例S 訓練呈現模型。X.C.1. 實例 1 ： 獨立等位基因模型之最大值 在一個實施方案中，訓練模組316使與一組多個等位基因H 相關聯之肽 pk 的估計呈現可能性uk 隨基於表現單等位基因之細胞所測定的集合H 中每一MHC等位基因h 之呈現可能性uk h ∈ H 的變化模型化，如上文結合等式(2)-(11)所描述。具體言之，呈現可能性uk 可以為uk h ∈ H 之任何函數。在一個實施方案中，如等式(12)中所示，該函數係最大函數，且呈現可能性uk 可以測定為集合H 中每一MHC等位基因h 之呈現可能性最大值。。 (12)X.C.2. 實例 2.1 ： 和之函數 (Function-of-Sums) 模型 在一個實施方案中，訓練模組316藉由下式使肽 pk 之估計呈現可能性uk 模型化：， (13) 其中元素ah k 對於與肽序列 pk 相關聯之多個MHC等位基因H 為1且 xh k 表示編碼的有關肽 pk 及相應MHC等位基因之等位基因相互作用變數。有關每一MHC等位基因h 之參數集合 θh 的值可以藉由使關於 θh 之損失函數減到最小來測定，其中i 係由表現單一MHC等位基因之細胞及/或表現多個MHC等位基因之細胞產生的訓練資料170之子集S 中的每個實例。相關性函數 gh 可以呈以上X.B.1部分中介紹的相關性函數 gh 中之任一種的形式。 根據等式(13)，肽序列 pk 會經一或多個MHC等位基因h 呈現的呈現可能性可以藉由將相關性函數gh (∙)應用於有關MHC等位基因H 中之每一個的肽序列 pk 之經編碼形式以產生等位基因相互作用變數之相應評分來產生。將每個MHC等位基因h 之評分合併，且藉由變換函數f (∙)變換以產生肽序列 pk 會經MHC等位基因集合H 呈現之呈現可能性。 等式(13)之呈現模型與等式(2)之獨立等位基因模型之不同之處在於，每個肽 pk 之相關等位基因的數量可以大於1。換言之，對於與肽序列 pk 相關聯之多個MHC等位基因H ，ah k 中多於一個元素的值可以為1。 舉例而言，在使用仿射變換函數gh (∙)鑑別的m=4 種不同MHC等位基因中，肽 pk 會經MHC等位基因h=2 、h=3 呈現之可能性可以藉由下式產生：， 其中 x2 k 、 x3 k 係鑑別的有關MHC等位基因h=2 、h=3 之等位基因相互作用變數，且 θ 2 、 θ 3 係測定的有關MHC等位基因h=2 、h=3 之參數集合。 作為另一實例，在使用網路變換函數gh (∙)、gw (∙)鑑別的m=4 種不同MHC等位基因當中，肽 pk 會經MHC等位基因h=2 、h=3 呈現之可能性可以藉由下式產生：， 其中NN2 (∙)、NN3 (∙)係鑑別的有關MHC等位基因h=2 、h=3 之網路模型，且 θ 2 、 θ 3 係所測定的有關MHC等位基因h=2 、h=3 之參數集合。 圖9說明使用示例網路模型NN2 (∙)及NN3 (∙)產生與MHC等位基因h= 2、h= 3相關聯之肽 pk 之呈現可能性。如圖9中所示，網路模型NN2 (∙)接受有關MHC等位基因h=2 之等位基因相互作用變數 x2 k 並產生輸出NN2 ( x2 k )且網路模型NN3 (∙)接受有關MHC等位基因h=3 之等位基因相互作用變數 x3 k 並產生輸出NN3 ( x3 k )。將該等輸出合併並藉由函數f (∙)映射以產生估計呈現可能性uk 。X.C.3. 實例 2.2 ：利用等位基因非相互作用變數的和之函數模型 在一個實施方案中，訓練模組316併入等位基因非相互作用變數且藉由下式使肽 pk 之估計呈現可能性uk 模型化：， (14) 其中 wk 表示編碼的有關肽 pk 之等位基因非相互作用變數。具體言之，有關每一MHC等位基因h 之參數集合 θh 及有關等位基因非相互作用變數之參數集合 θw 的值可以藉由使關於 θh 及 θw 之損失函數減到最小來測定，其中i 係由表現單一MHC等位基因之細胞及/或表現多個MHC等位基因之細胞產生的訓練資料170之子集S 中的每一實例。相關性函數 gw 可以呈以上X.B.3部分中介紹的相關性函數 gw 中之任一種的形式。 因此，根據等式(14)，肽序列 pk 會經一或多個MHC等位基因H 呈現之呈現可能性可以藉由將函數gh (∙)應用於有關MHC等位基因H 中之每一個的肽序列 pk 之經編碼形式以產生有關每個MHC等位基因h 之等位基因相互作用變數的相應相關性評分來產生。有關等位基因非相互作用變數之函數gw (∙)亦應用於等位基因非相互作用變數之經編碼形式以產生等位基因非相互作用變數之相關性評分。將該等評分合併，且藉由變換函數f (∙)變換該合併之評分以產生肽序列 pk 會經MHC等位基因H 呈現之呈現可能性。 在等式(14)之呈現模型中，每個肽 pk 之相關等位基因的數量可以大於1。換言之，對於與肽序列 pk 相關聯之多個MHC等位基因H ，ah k 中多於一個元素的值可以為1。 舉例而言，在使用仿射變換函數gh (∙)、gw (∙)鑑別的m=4 種不同MHC等位基因中，肽 pk 會經MHC等位基因h=2 、h=3 呈現之可能性可以藉由下式產生：， 其中 wk 係所鑑別的有關肽 pk 之等位基因非相互作用變數，且 θ w 係所測定的等位基因非相互作用變數之參數之集合。 作為另一實例，在使用網路變換函數gh (∙)、gw (∙)鑑別的m=4 種不同MHC等位基因當中，肽 pk 會經MHC等位基因h=2 、h=3 呈現之可能性可以藉由下式產生：其中 wk 係所鑑別的有關肽 pk 之等位基因相互作用變數，且 θ w 係所測定的等位基因非相互作用變數之參數之集合。 圖10說明使用示例網路模型NN2 (∙)、NN3 (∙)產生與MHC等位基因h=2 、h= 3相關聯之肽 pk 之呈現可能性。如圖10中所示，網路模型NN2 (∙)接受有關MHC等位基因h=2 之等位基因相互作用變數 x2 k 並產生輸出NN2 ( x2 k )。網路模型NN3 (∙)接受有關MHC等位基因h=3 之等位基因相互作用變數 x3 k 並產生輸出NN3 ( x3 k )。網路模型NNw (∙)接受有關肽 pk 之等位基因非相互作用變數 wk 並產生輸出NNw ( wk )。將該等輸出合併並藉由函數f (∙)映射以產生估計呈現可能性uk 。 或者，訓練模組316可以藉由在等式(15)中將等位基因非相互作用變數 wk 添加至等位基因相互作用變數 xh k 而在預測值中包括等位基因非相互作用變數 wk 。因此，呈現可能性可以藉由下式提供：。 (15)X.C.4. 實例 3.1 ： 使用隱式獨立等位基因可能性之模型 在另一實施方案中，訓練模組316藉由下式使肽 pk 之估計呈現可能性uk 模型化：， (15) 其中元素ah k 對於與肽序列 pk 相關聯之多個MHC等位基因h ∈ H 為1，u ' k h 係MHC等位基因h 之隱式獨立等位基因呈現可能性，向量 v 係元素vh 對應於ah k ∙u ' k h 之向量，s (∙)係映射元素 v 之函數，且r (∙)係限幅函數(clipping function)，其將輸入值削減至給定範圍中。如以下更詳細地描述，s (∙)可以為求和函數或二階函數，但應瞭解，在其他實施例中，s (∙)可以為任何函數，諸如最大函數。有關隱式獨立等位基因可能性之參數集合 θ 的值可以藉由使關於 θ 之損失函數減到最小來測定，其中i 係由表現單一MHC等位基因之細胞及/或表現多個MHC等位基因之細胞產生的訓練資料170之子集S 中的每個實例。 使等式(17)之呈遞模型中的呈遞可能性隨各自對應於肽 pk 會經個別MHC等位基因h 呈現之可能性的隱式獨立等位基因呈現可能性u ' k h 的變化模型化。隱式獨立等位基因可能性與X.B部分之獨立等位基因呈現可能性的不同之處在於，隱式獨立等位基因可能性參數可以自多等位基因環境習得，其中除單等位基因環境外，經呈現之肽與相應MHC等位基因之間的直接關聯亦係未知的。因此，在多等位基因環境中，呈現模型不僅可以估計肽 pk 是否會經作為整體之一組MHC等位基因H 呈現，而且亦可提供指示最可能呈現肽 pk 之MHC等位基因h 的個別可能性u ' k h ∈ H 。其優勢在於，呈現模型可以在不存在有關表現單一MHC等位基因之細胞的訓練資料情況下產生隱式可能性。 在本說明書其餘部分通篇提及的一個特定實施方案中，r (∙)係具有範圍[0, 1]之函數。舉例而言，r (∙)可以為限幅函數：， 其中選擇z 與1之間的最小值作為呈現可能性uk 。在另一實施方案中，當域z之值等於或大於0時，r (∙)係由下式提供之雙曲正切函數：。X.C.5. 實例 3.2 ： 函數之和模型 在一個特定實施方案中，s (∙)係求和函數，且呈現可能性係藉由對隱式獨立等位基因呈現可能性求和得到：。 (17) 在一個實施方案中，MHC等位基因h 之隱式獨立等位基因呈現可能性係藉由下式產生：， (18) 由此藉由下式估計出呈現可能性：。 (19) 根據等式(19)，肽序列 pk 會經一或多個MHC等位基因H 呈現的呈現可能性可以藉由將函數gh (∙)應用於有關MHC等位基因H 中之每一個的肽序列 pk 之經編碼形式以產生等位基因相互作用變數之相應相關性評分來產生。每個相關性評分先藉由函數f (∙)變換以產生隱式獨立等位基因呈現可能性u ' k h 。將獨立等位基因可能性u ' k h 合併，且可以將限幅函數應用於該合併之可能性以將值削減至範圍[0, 1]中以產生肽序列 pk 會經MHC等位基因集合H 呈現之呈現可能性。相關性函數 gh 可以呈以上X.B.1部分中介紹的相關性函數 gh 中之任一種的形式。 舉例而言，在使用仿射變換函數gh (∙)鑑別的m=4 種不同MHC等位基因中，肽 pk 會經MHC等位基因h=2 、h=3 呈現之可能性可以藉由下式產生：， 其中 x2 k 、 x3 k 係鑑別的有關MHC等位基因h=2 、h=3 之等位基因相互作用變數，且 θ 2 、 θ 3 係測定的有關MHC等位基因h=2 、h=3 之參數集合。 作為另一實例，在使用網路變換函數gh (∙)、gw (∙)鑑別的m=4 種不同MHC等位基因當中，肽 pk 會經MHC等位基因h=2 、h=3 呈現之可能性可以藉由下式產生：， 其中NN2 (∙)、NN3 (∙)係鑑別的有關MHC等位基因h=2 、h=3 之網路模型，且 θ 2 、 θ 3 係所測定的有關MHC等位基因h=2 、h=3 之參數集合。 圖11說明使用示例網路模型NN2 (∙)及NN3 (∙)產生與MHC等位基因h= 2、h= 3相關聯之肽 pk 之呈現可能性。如圖9中所示，網路模型NN2 (∙)接受有關MHC等位基因h=2 之等位基因相互作用變數 x2 k 並產生輸出NN2 ( x2 k )且網路模型NN3 (∙)接受有關MHC等位基因h=3 之等位基因相互作用變數 x3 k 並產生輸出NN3 ( x3 k )。每個輸出均藉由函數f (∙)映射且合併以產生估計呈現可能性uk 。 在另一實施方案中，當對質譜離子電流之對數進行預測時，r (∙)係對數函數且f (∙)係指數函數。X.C.6. 實例 3.3 ： 利用等位基因非相互作用變數的函數之和模型 在一個實施方案中，MHC等位基因h 之隱式獨立等位基因呈現可能性係藉由下式產生：， (20) 由此藉由下式產生呈現可能性：， (21) 以併入等位基因非相互作用變數對肽呈現之影響。 根據等式(21)，肽序列 pk 會經一或多個MHC等位基因H 呈現之呈現可能性可以藉由將函數gh (∙)應用於有關MHC等位基因H 中之每一個的肽序列 pk 之經編碼形式以產生有關每個MHC等位基因h 之等位基因相互作用變數的相應相關性評分來產生。有關等位基因非相互作用變數之函數gw (∙)亦應用於等位基因非相互作用變數之經編碼形式以產生等位基因非相互作用變數之相關性評分。將等位基因非相互作用變數之評分與等位基因相互作用變數之相關性評分中的每一個合併。藉由函數f (∙)變換每一合併之評分以產生隱式獨立等位基因呈現可能性。將隱式可能性合併，且可以將限幅函數應用於該合併之輸出以將值削減至範圍[0, 1]中以產生肽序列 pk 會經MHC等位基因H 呈現之呈現可能性。相關性函數 gw 可以呈以上X.B.3部分中介紹的相關性函數 gw 中之任一種的形式。 舉例而言，在使用仿射變換函數gh (∙)、gw (∙)鑑別的m=4 種不同MHC等位基因中，肽 pk 會經MHC等位基因h=2 、h=3 呈現之可能性可以藉由下式產生：， 其中 wk 係所鑑別的有關肽 pk 之等位基因非相互作用變數，且 θw 係所測定的等位基因非相互作用變數之參數之集合。 作為另一實例，在使用網路變換函數gh (∙)、gw (∙)鑑別的m=4 種不同MHC等位基因當中，肽 pk 會經MHC等位基因h=2 、h=3 呈現之可能性可以藉由下式產生：其中 wk 係所鑑別的有關肽 pk 之等位基因相互作用變數，且 θw 係所測定的等位基因非相互作用變數之參數之集合。 圖12說明使用示例網路模型NN2 (∙)、NN3 (∙)及NNw (∙)產生與MHC等位基因h=2 、h= 3相關聯之肽 pk 之呈現可能性。如圖12中所示，網路模型NN2 (∙)接受有關MHC等位基因h=2 之等位基因相互作用變數 x2 k 並產生輸出NN2 ( x2 k )。網路模型NNw (∙)接受有關肽 pk 之等位基因非相互作用變數 wk 並產生輸出NNw ( wk )。將輸出合併並藉由函數f (∙)映射。網路模型NN3 (∙)接受有關MHC等位基因h=3 之等位基因相互作用變數 x3 k 並產生輸出NN3 ( x3 k )，再次將該輸出與相同網路模型NNw (∙)之輸出NNw ( wk )合併且藉由函數f (∙)映射。將兩個輸出合併以產生估計呈現可能性uk 。 在另一實施方案中，MHC等位基因h 之隱式獨立等位基因呈現可能性係藉由下式產生：。 (22) 由此藉由下式產生呈現可能性：。X.C.7. 實例 4 ： 二階模型 在一個實施方案中，s (∙)係二階函數，且肽 pk 之估計呈現可能性uk 係藉由下式提供：(23) 其中元素u ' k h 係MHC等位基因h 之隱式獨立等位基因呈現可能性。有關隱式獨立等位基因可能性之參數集合 θ 的值可以藉由使關於 θ 之損失函數減到最小來測定，其中i 係由表現單一MHC等位基因之細胞及/或表現多個MHC等位基因之細胞產生的訓練資料170之子集S 中的每個實例。隱式獨立等位基因呈現可能性可以呈以上描述之等式(18)、(20)及(22)中所示之任何形式。 在一個態樣中，等式(23)之模型可以暗示存在肽 pk 會同時經兩個MHC等位基因呈現之可能，其中兩個HLA等位基因之呈現在統計學上係獨立的。 根據等式(23)，肽序列 pk 會經一或多個MHC等位基因H 呈現之呈現可能性可以藉由組合隱式獨立等位基因呈現可能性並自總和中減去每對MHC等位基因將同時呈現肽 pk 之可能性以產生肽序列 pk 會經MHC等位基因H 呈現之呈現可能性來產生。 舉例而言，在使用仿射變換函數gh (∙)鑑別的m=4 種不同HLA等位基因中，肽 pk 會經HLA等位基因h=2 、h=3 呈現之可能性可以藉由下式產生：， 其中 x2 k 、 x3 k 係鑑別的有關HLA等位基因h=2 、h=3 之等位基因相互作用變數，且 θ 2 、 θ 3 係測定的有關HLA等位基因h=2 、h=3 之參數集合。 作為另一實例，在使用網路變換函數gh (∙)、gw (∙)鑑別的m=4 種不同HLA等位基因中，肽 pk 會經HLA等位基因h=2 、h=3 呈現之可能性可以藉由下式產生：， 其中NN2 (∙)、NN3 (∙)係所鑑別的有關HLA等位基因h=2 、h=3 之網路模型，且 θ 2 、 θ 3 係測定的有關HLA等位基因h=2 、h=3 之參數集合。XI.A 實例 5 ： 預測模組 預測模組320接受序列資料且使用呈現模型選擇序列資料中之候選新抗原。具體言之，序列資料可以為自患者之腫瘤組織細胞提取的DNA序列、RNA序列及/或蛋白質序列。預測模組320將序列資料處理成複數個具有8-15個胺基酸之肽序列 pk 。舉例而言，預測模組320可以將給定序列「IEFROEIFJEF」處理成三個具有9個胺基酸之肽序列，即「IEFROEIFJ」、「EFROEIFJE」及「FROEIFJEF」。在一個實施例中，預測模組320可以藉由將自患者之正常組織細胞提取的序列資料與自患者之腫瘤組織細胞提取的序列資料相比較以鑑別含有一或多個突變之部分，由此鑑別出呈突變肽序列之新抗原。 呈現模組320將一或多個呈現模型應用於經處理之肽序列以估計該等肽序列之呈現可能性。具體言之，預測模組320可以藉由將呈現模型應用於候選新抗原來選擇一或多個可能在腫瘤HLA分子上呈現之候選新抗原肽序列。在一個實施方案中，呈現模組320選出估計呈現可能性超過預定臨限值之候選新抗原序列。在另一實施方案中，呈現模型選出N 個具有最高估計呈現可能性之候選新抗原序列(其中N 一般為可以在疫苗中遞送的最大抗原決定基數量)。包括選擇用於給定患者之候選新抗原的疫苗可以注射至患者體內以誘導免疫反應。XI.B. 實例 6 ：卡匣設計模組 XI.B.1 綜述 卡匣設計模組324基於v 個選擇用於注射至患者體內之候選肽產生疫苗卡匣序列。具體言之，對於納入容量v 之疫苗中的一組所選肽 pk (k=1, 2, … , v )，卡匣序列係藉由串接一系列治療性抗原決定基序列 p ' k (k=1, 2, … , v )來提供，該等抗原決定基序列各自包括相應肽 pk 之序列。在一個實施例中，卡匣設計模組324可以直接彼此相鄰地串接抗原決定基。舉例而言，疫苗卡匣C 可以表示為：(24) 其中 p ' ti 表示該卡匣之第i 個抗原決定基。因此，ti 對應於在該卡匣第i 位處所選肽之指數k=1, 2, … , v 。在另一個實施例中，卡匣設計模組324可以在相鄰抗原決定基之間用一或多個可選連接子序列串接抗原決定基。舉例而言，疫苗卡匣C 可以表示為：(25) 其中 l(ti,tj) 表示置放於該卡匣之第i 個抗原決定基 p ' ti 與第j=i+1 個抗原決定基 p ' j=i+1 之間的連接子序列。卡匣設計模組324確定在該卡匣不同位置處佈置之所選抗原決定基 p ' k (k=1, 2, … , v )，以及置放於該等抗原決定基之間的連接子序列。可以基於本說明書中所描述之方法中的任一種裝載卡匣序列C 作為疫苗。 在一個實施例中，可以基於由預測模組320確定的與超過預定臨限值之呈現可能性相關聯之所選肽產生治療性抗原決定基集合，其中該等呈現可能性係由呈現模型測定。然而，應瞭解，在其他實施例中，可以基於多種方法中之任一種或多種(單獨或組合形式)，例如基於針對患者之I類或II類HLA等位基因之結合親和力或預測之結合親和力、針對患者之I類或II類HLA等位基因之結合穩定性或預測之結合穩定性、隨機取樣及類似方法產生治療性抗原決定基之集合。 在一個實施例中，治療性抗原決定基 p ' k 可以對應於所選肽 pk 本身。在另一個實施例中，除所選肽外，治療性抗原決定基 p ' k 亦可包括C末端及/或N末端側接序列。舉例而言，卡匣中所包括的抗原決定基 p ' k 可以表示為序列[ nk pk ck ]，其中 ck 係連接所選肽 pk 之C末端的C末端側接序列，且 nk 係連接至所選肽 pk 之N末端的N末端側接序列。在本說明書其餘部分通篇提及的一個實例中，N末端及C末端側接序列係處於源蛋白質環境中之治療性疫苗抗原決定基的天然N末端及C末端側接序列。在本說明書其餘部分通篇提及的一個實例中，治療性抗原決定基 p ' k 表示固定長度之抗原決定基。在另一實例中，治療性抗原決定基 p ' k 可以表示可變長度之抗原決定基，其中抗原決定基之長度可以取決於例如C-或N-側接序列之長度而變化。舉例而言，C末端側接序列 ck 及N末端側接序列 nk 各自可以2-5個殘基的變化之長度，由此產生16種可能的抗原決定基 p ' k 選擇。 在一個實施例中，卡匣設計模組324藉由考慮橫跨該卡匣中一對治療性抗原決定基之間之接合點的接合點抗原決定基之呈現來產生卡匣序列。接合點抗原決定基係由於在該卡匣中串接治療性抗原決定基及連接子序列之過程而在該卡匣中產生的新穎非自身但不相關之抗原決定基序列。接合點抗原決定基之新穎序列不同於該卡匣之治療性抗原決定基本身。跨越抗原決定基 p ' ti 及 p ' tj 之接合點抗原決定基可以包括與 p ' ti 或 p ' tj 重疊且不同於治療性抗原決定基 p ' ti 及 p ' tj 本身之序列的任何抗原決定基序列。具體言之，在存在或不存在可選連接子序列 l(ti,tj) 情況下，該卡匣之抗原決定基 p ' ti 與相鄰抗原決定基 p ' tj 之間的接合點各自可以與n(ti,tj) 接合點抗原決定基 e n (ti,tj) (n=1, 2, … , n(ti,tj) )相關聯。接合點抗原決定基可以為與抗原決定基 p ' ti 及 p ' tj 兩者至少部分重疊之序列，或者可以為與置放於抗原決定基 p ' ti 與 p ' tj 之間之連接子序列至少部分重疊的序列。接合點抗原決定基可以藉由I類MHC、II類MHC或兩者呈現。 圖13顯示兩個示例卡匣序列：卡匣1(C1)及卡匣2(C2)。每個卡匣具有v=2 之疫苗容量，且包括治療性抗原決定基 p ' t1 =p1 = SINFEKL及 p ' t2 =p2 = LLLLLVVVV，以及在該兩個抗原決定基之間的連接子序列 l (t1,t2) =AAY。具體言之，卡匣C1 之序列係藉由[ p1 l (t1,t2) p2 ]提供，而卡匣C2 之序列係藉由[ p2 l (t1,t2) p1 ]提供。卡匣C1 之示例接合點抗原決定基 e n (1,2) 可以為橫跨該卡匣中之抗原決定基 p ' 1 及 p ' 2 兩者的序列，諸如EKLAAYLLL、KLAAYLLLLL及FEKLAAYL，且可以為橫跨該卡匣中之連接子序列及所選單一抗原決定基之序列，諸如AAYLLLLL及YLLLLLVVV。類似地，卡匣C2 之示例接合點抗原決定基 e m (2,1) 可以為諸如VVVVAAYSIN、VVVVAAY及AYSINFEK之序列。儘管兩個卡匣涉及相同序列 p1 ,l (c1,c2) 及 p2 集合，但所鑑別的接合點抗原決定基集合取決於該卡匣內治療性抗原決定基之有序序列而不同。 在一個實施例中，卡匣設計模組324產生降低在患者中呈現接合點抗原決定基之可能性的卡匣序列。具體言之，當將卡匣注射至患者體內時，接合點抗原決定基有可能經患者之I類HLA或II類HLA等位基因呈現，且分別刺激CD8或CD4 T細胞反應。由於T細胞與接合點抗原決定基之反應沒有治療益處，且可能因抗原競爭而減弱針對該卡匣中所選治療性抗原決定基之免疫反應，故此類反應常常係不合需要的。76 在一個實施例中，卡匣設計模組324迭代一或多個候選卡匣，且確定與卡匣序列相關聯之接合點抗原決定基之呈現分數低於數字臨限值的卡匣序列。接合點抗原決定基呈現分數係與該卡匣中接合點抗原決定基之呈現可能性相關聯的量，且較高的接合點抗原決定基呈現分數值指示該卡匣之接合點抗原決定基會由I類HLA或II類HLA或兩者呈現之可能性較高。 在一個實施例中，卡匣設計模組324可以確定候選卡匣序列中與最低接合點抗原決定基呈現分數相關聯之卡匣序列。在一個實例中，給定卡匣序列C 之 呈現分數係基於分別與該卡匣C 中之接合點相關聯的一組距離度量d ( e n (ti,tj) ，n=1, 2, … , n(ti,tj)) =d(ti,tj) 確定。具體言之，距離度量d(ti,tj) 指明跨越相鄰治療性抗原決定基 p ' ti 及 p ' tj 對之一或多個接合點抗原決定基會經呈現之可能性。接著，可以藉由將函數(例如求和、統計函數)應用於有關卡匣C之距離度量集合來確定卡匣C 之接合點抗原決定基呈現分數。在數學上，呈現分數係藉由以下提供：(26) 其中h (∙)係將每一接合點之距離度量映射至評分的某種函數。在本說明書其餘部分通篇提及的一個特定實例中，函數h (∙)係整個卡匣距離度量之求和。 卡匣設計模組324可以迭代一或多個候選卡匣序列，確定候選卡匣之接合點抗原決定基呈現分數，且鑑別與低於臨限值之接合點抗原決定基呈現分數相關聯之最佳卡匣序列。在本說明書其餘部分通篇提及的一個特定實施例中，關於給定接合點之距離度量d (∙)可以由利用本說明書VII及VIII部分中所描述之呈現模型測定的呈現可能性或經呈現接合點抗原決定基之預期數量的總和來提供。然而，應瞭解，在其他實施例中，距離度量可以由單獨或與如以上例示之模型之模型組合的其他因素得到，其中該等其他因素可以包括自以下任一種或多種(單獨或組合形式)得出距離度量：對於I類HLA或II類HLA之HLA結合親和力或穩定性量測值或預測值，及基於HLA質譜或T細胞抗原決定基資料訓練的有關I類HLA或II類HLA之呈現或免疫原性模型。在一個實施例中，距離度量可以組合關於I類HLA及II類HLA呈現之資訊。舉例而言，距離度量可以為預測以低於臨限值之結合親和力結合患者之I類HLA或II類HLA等位基因中之任一個的接合點抗原決定基之數量。在另一實施例中，距離度量可以為預測會經患者之I類HLA或II類HLA等位基因中之任一個呈現的抗原決定基之預期數量。 卡匣設計模組324可以進一步檢查該一或多個候選卡匣序列以鑑別候選卡匣序列中之接合點抗原決定基中之任一個是否為設計使用該疫苗之給定患者之自身抗原決定基。為實現此目的，卡匣設計模組324針對已知資料庫，諸如母細胞檢查接合點抗原決定基。在一個實施例中，卡匣設計模組可以配置成藉由將有關抗原決定基ti ,tj 對之距離度量d(ti,tj) 設定為極大值(例如100)來設計避免接合點自身抗原決定基之卡匣，其中將抗原決定基ti 串接至抗原決定基tj 之N末端使得形成接合點自身抗原決定基。 再回到圖13中之實例，卡匣設計模組324確定(例如)藉由長度對於I類MHC為8至15個胺基酸或對於II類MHC為9至30個胺基酸的所有可能接合點抗原決定基 e n (t1,t2) = e n (1,2) 之呈現可能性求和提供的卡匣C1 中單一接合點(t1 ,t2 )之距離度量d(t1,t2) =d(1,2) =0.39。由於卡匣C1 中不存在其他接合點，故接合點抗原決定基呈現分數亦藉由0.39提供，該評分係有關卡匣C1 之整個距離度量的求和。卡匣設計模組324亦確定藉由長度對於I類MHC為8至15個或對於II類MHC為9至30個胺基酸的所有可能接合點抗原決定基 e n ( t1,t2) = e n (2,1) 之呈現可能性求和提供的卡匣C2 中單一接合點之距離度量d(t1,t2) =d(2,1) =0.068。在此實例中，亦藉由單一接合點之距離度量0.068提供卡匣C2 之接合點抗原決定基呈現分數。卡匣設計模組324輸出C2 之卡匣序列作為最佳卡匣，因為接合點抗原決定基呈現分數低於C1 之卡匣序列。 在一些情況下，卡匣設計模組324可以執行蠻力方法且迭代全部或大部分可能的候選卡匣序列以選出具有最小接合點抗原決定基呈現分數之序列。然而，由於疫苗容量v 增加，此類候選卡匣之數量可能極大。舉例而言，對於v=20 個抗原決定基之疫苗容量，卡匣設計模組324必須迭代約1018 個可能的候選卡匣，才能確定具有最低接合點抗原決定基呈現分數之卡匣。對於卡匣設計模組324在合理的時間量內完成以產生用於患者之疫苗而言，此確定在計算上可能較為繁瑣(就所需之計算處理資源而言)且有時難以處理。另外，考慮到每一候選卡匣的可能接合點抗原決定基，甚至可能更為繁瑣。因此，卡匣設計模組324可以基於迭代明顯少於蠻力方法中之候選卡匣序列數量的候選卡匣數量來選擇卡匣序列。 在一個實施例中，卡匣設計模組324產生一小組隨機產生或至少偽隨機產生的候選卡匣，且選擇與低於預定臨限值之接合點抗原決定基呈現分數相關聯之候選卡匣作為卡匣序列。另外，卡匣設計模組324可以自該小組中選擇具有最低接合點抗原決定基呈現分數之候選卡匣作為卡匣序列。舉例而言，卡匣設計模組324可以針對一組v=20 個所選抗原決定基產生一小組約1百萬個候選卡匣，且選出具有最小接合點抗原決定基呈現分數之候選卡匣。儘管產生一小組隨機卡匣序列並自該小組中選出具有低接合點抗原決定基呈現分數之卡匣序列可能不如蠻力方法好，但其需要明顯較少的計算資源，由此使其實施在技術上為可實行的。另外，相對於此種更高效之技術，執行蠻力法可能僅引起接合點抗原決定基呈現分數之微小或甚至可忽略的改良，因此，由資源分配之觀點看，蠻力法係不值得實施的。 在另一個實施例中，卡匣設計模組324藉由將卡匣之抗原決定基序列用非對稱旅行商問題(TSP)公式表示來確定改良之卡匣結構。根據節點清單及每對節點之間之距離，TSP確定與最短總距離相關聯之節點之序列以訪問每個節點恰好一次且返回至原始節點。舉例而言，根據城市A、B及C且已知彼此之間的距離，TSP之解決方案產生一個閉合的城市序列，對於該序列，訪問每個城市恰好一次所行進之總距離係可能途徑當中最短的。TSP之非對稱形式確定當一對節點之間的距離不對稱時節點之最佳序列。舉例而言，自節點A行進至節點B之「距離」可以不同於自節點B行進至節點A之「距離」。 卡匣設計模組324藉由解決非對稱TSP來確定改良之卡匣序列，其中每一節點對應於一個治療性抗原決定基 p ' k 。自對應於抗原決定基 p ' k 之節點對應於抗原決定基 p ' m 之另一節點的距離係藉由接合點抗原決定基距離度量d(k,m) 提供，而自對應於抗原決定基 p ' m 之節點至對應於抗原決定基 p ' k 之節點的距離係由可能不同於距離度量d(k,m) 之距離度量d(m,k) 提供。藉由使用非對稱TSP解決改良之最佳卡匣，卡匣設計模組324可以尋找使所有在該卡匣之抗原決定基之間之接合點之呈現分數降低的卡匣序列。非對稱TSP解決方案指示對應於應當在卡匣中串接抗原決定基以使該卡匣之所有接合點的接合點抗原決定基呈現分數減到最小之次序的治療性抗原決定基序列。具體言之，已知治療性抗原決定基集合k=1, 2, … , v ，卡匣設計模組324確定該卡匣中每一對可能的有序治療性抗原決定基之距離度量d(k,m) ，k, m=1, 2, … , v 。換言之，對於給定的抗原決定基對k,m ，確定在抗原決定基 p ' k 之後串接治療性抗原決定基 p ' m 之距離度量d( k,m) 及在抗原決定基 p ' m 之後串接治療性抗原決定基 p ' k 之距離度量d(m,k) ，因為該等距離度量可能彼此不同。 在一個實施例中，卡匣設計模組324經由整數線性規劃問題來解決非對稱TSP。具體言之，卡匣設計模組324產生藉由以下提供之路徑矩陣P ：(26)。v ×v 矩陣D 係一種非對稱距離矩陣，其中每個元素D(k,m )(k=1, 2, … , v ；m=1, 2, … , v )對應於自抗原決定基 p ' k 至抗原決定基 p ' m 之接合點的距離度量。P 之列k=2, … , v 對應於原始抗原決定基之節點，而第1列及第1行對應於「重像節點(ghost node)」，該節點與所有其他節點之距離為零。將「重像節點」添加至矩陣中編碼疫苗卡匣係線性而非圓形的概念，因此在第一個與最後一個抗原決定基之間不存在接合點。換言之，該序列並非圓形，且假定在該序列中，第一個抗原決定基並未串接在最後一個抗原決定基之後。使表示二元變數，若存在有向路徑(亦即，該卡匣中之抗原決定基-抗原決定基接合點)，其中抗原決定基 p ' k 串接至抗原決定基 p ' m 之N末端，則其值為1，否則為0。此外，使E 表示所有v 個治療性疫苗抗原決定基之集合，且使表示抗原決定基之子集。對於任何此類子集S ，使out(S )表示抗原決定基-抗原決定基接合點之數量，其中k 係S 中之抗原決定基且m 係E\S 中之抗原決定基。根據已知路徑矩陣P ，卡匣設計模組324發現解決以下整數線性規劃問題之路徑矩陣X ：(27) 其中Pkm 表示路徑矩陣P 之元素P(k,m )，滿足以下限制條件：, , , ,。 前兩條限制條件保證每個抗原決定基在該卡匣中恰好呈現一次。最後一個限制條件確保該卡匣係連接的。換言之，由x 編碼之卡匣係連接之線性蛋白質序列。 等式(27)之整數線性規劃問題中有關xkm (k,m=1, 2, … , v+1 )之解答指示可以用於推斷低於接合點抗原決定基之呈現分數的該卡匣之一或多個治療性抗原決定基序列的節點及重像節點之閉合序列。具體言之，值xkm =1指示存在自節點k 至節點m 之「路徑」，或換言之，在改良之卡匣序列中，治療性抗原決定基 p ' m 應當串接在治療性抗原決定基 p ' k 之後。xkm =0之解答指示不存在此類路徑，或換言之，在改良之卡匣序列中，治療性抗原決定基 p ' m 不應串接在治療性抗原決定基 p ' k 之後。總起來說，等式(27)之整數規劃問題中的值xkm 表示節點及重像節點之序列，其中路徑輸入且存在每個節點恰好一次。舉例而言，值x 重像 ,1 =1 、x13 =1 、x32 =1 及x2, 重像 =1 (否則為0)可以指示節點及重像節點之序列重像 →1 →3 →2 →重像 。 一旦解決該序列，即自該序列刪除重像節點以產生僅具有對應於該卡匣中之治療性抗原決定基之原始節點的改進序列。該改進序列指示應當在該卡匣中串接所選抗原決定基以改善呈現分數的次序。舉例而言，由前一段中之實例繼續，可以刪除重像節點以產生改進序列1 →3 →2 。該改進序列指示在該卡匣中串接抗原決定基的一種可能方式，即 p1 → p3 → p2 。 在一個實施例中，當治療性抗原決定基 p ' k 係可變長度抗原決定基時，卡匣設計模組324確定對應於不同長度之治療性抗原決定基 p ' k 及 p ' m 的候選距離度量，並鑑別距離度量d(k,m) 作為最小候選距離度量。舉例而言，抗原決定基 p ' k =[ nk pk ck ]及 p ' m =[ nm pm cm ]可以各自包括可在(在一個實施例中)2-5個胺基酸間變化的相應N末端及C末端側接序列。因此，基於置放於接合點中之4個可能的 nk 長度值及4個可能的 cm 長度值，抗原決定基 p ' k 與 p ' m 之間的接合點與16組不同的接合點抗原決定基相關聯。卡匣設計模組324可以確定每組接合點抗原決定基之候選距離度量，並確定距離度量d(k,m) 作為最小值。卡匣設計模組324接著可以構築路徑矩陣P 並解決等式(27)中之整數線性規劃問題以確定卡匣序列。 相較於隨機取樣方法，使用整數規劃問題解決卡匣序列需要測定分別對應於疫苗中之一對治療性抗原決定基的v ×(v-1 )距離度量。相較於隨機取樣方法，經由此方法確定的卡匣序列可以產生具有明顯較少接合點抗原決定基呈現之序列，同時可能需要明顯較少的計算資源，尤其是在所產生的候選卡匣序列數量很大時。XI.B.2. 藉由隨機取樣與非對稱 TSP 產生的卡匣序列之接合點抗原決定基呈現之比較 藉由隨機取樣1,000,000個排列(卡匣序列C1 )及藉由解決等式(27)中之整數線性規劃問題(卡匣序列C2 )產生兩個包括v =20個治療性抗原決定基之卡匣序列。基於等式(14)中所描述之呈現模型確定距離度量，且因此確定呈現分數，其中f 係S型函數， xh i 係肽 pi 之序列，gh (∙)係神經網路函數，w 包括側接序列、肽 pi 之每百萬條讀段中每一千個鹼基之轉錄本數(transcripts per kilobase million，TPM)的對數、肽 pi 之蛋白質之抗原性及肽 pi 之起源的樣品ID，且側接序列及log TPM之gw (∙)分別為神經網路函數。神經網路函數gh (∙)各自包括含一個隱藏層之多層感知器(MLP)的一個輸出節點，其具有輸入維度231(11個殘基×21個字符/殘基，包括填充字符在內)、寬度256、隱藏層中之修正線性單元(ReLU)激活函數、輸出層中之線性激活函數，及訓練資料集中每個HLA等位基因一個輸出節點。側接序列之神經網路函數係含一個隱藏層之MLP，其具有輸入維度210(N末端側接序列之5個殘基+C末端側接序列之5個殘基×21個字符/殘基，包括填充字符在內)、寬度32、隱藏層中之ReLU激活函數及輸出層中之線性激活函數。RNA log TPM之神經網路函數係含一個隱藏層之MLP，其具有輸入維度1、寬度16、隱藏層中之ReLU激活函數及輸出層中之線性激活函數。構築HLA等位基因HLA-A*02:04、HLA-A*02:07、HLA-B*40:01、HLA-B*40:02、HLA-C*16:02及HLA-C*16:04之呈現模型。比較指示該兩個卡匣序列之預期經呈現接合點抗原決定基數量的呈現分數。結果顯示，藉由解決等式(27)產生的卡匣序列之呈現分數相對於藉由隨機取樣產生的卡匣序列之呈現分數有約4倍改良。 具體言之，v= 20個抗原決定基係藉由以下提供：。 在第一個實例中，用該20個治療性抗原決定基隨機產生1,000,000個不同的候選卡匣序列。產生該等候選卡匣序列各自之呈現分數。經鑑別具有最低呈現分數的候選卡匣序列為：且具有預期數量之經呈現接合點抗原決定基的呈現分數為6.1。該1,000,000個隨機序列之中值呈現分數係18.3。實驗顯示，可以藉由鑑別隨機取樣之卡匣當中的卡匣序列，明顯減少經呈現之接合點抗原決定基的預期數量。 在第二個實例中，藉由解決等式(27)中之整數線性規劃問題來鑑別卡匣序列C2 。具體言之，測定一對治療性抗原決定基之間每一可能接合點的距離度量。使用該等距離度量解答有關整數規劃問題之解決方案。藉由此方法鑑別之卡匣序列係：且呈現分數為1.7。卡匣序列C2 之呈現分數相對於卡匣序列C1 之呈現分數顯示約4倍改良，且相對於該1,000,000個隨機產生之候選卡匣之中值呈現分數顯示約11倍改良。在2.30 GHz Intel Xeon E5-2650 CPU之單一執行緒上，用於產生卡匣C1 之運行時間係20秒。在相同CPU之單一執行緒上，用於產生卡匣C2 之運行時間係1秒。因此，在此實例中，藉由解決等式(27)之整數規劃問題鑑別的卡匣序列以降低20倍之計算成本產生約4倍優化之解決方案。 結果顯示，相較於由隨機取樣鑑別之卡匣序列，整數規劃問題有可能以較少的計算資源可能地提供經呈現接合點抗原決定基數量較少之卡匣序列。XI.B.3. 藉由 MHCflurry 與呈現模型產生的用於卡匣序列選擇之接合點抗原決定基呈現的比較 在本實例中，包括v =20個治療性抗原決定基之卡匣序列係藉由隨機取樣1,000,000個排列，及藉由解決等式(27)中之整數線性規劃問題產生，其中該抗原決定基係基於腫瘤/正常外顯子組測序、腫瘤轉錄組測序及肺癌樣品之HLA分型來選擇。基於藉由MHCflurry預測的接合點抗原決定基數量確定距離度量且因此確定呈現分數，MHCflurry係以低於多種臨限值(例如50-1000 nM或更高，或更低)之親和力結合患者之HLA的HLA-肽結合親和力預測器。在本實例中，選作治療性抗原決定基的20個非同義體細胞突變係選自根據以上XI.B部分中之呈現模型，藉由對突變排序而在腫瘤樣品中鑑別的98個體細胞突變。然而，應瞭解，在其他實施例中，可以基於其他標準選擇治療性抗原決定基；諸如基於穩定性之標準，或諸如呈現分數、親和力諸如此類標準之組合。此外，還應瞭解，用於對疫苗中所包括之治療性抗原決定基區分優先級的標準不必與用於確定卡匣設計模組324中使用之距離度量D(k,m )之標準相同。 患者之I類HLA等位基因係HLA-A*01:01、HLA-A*03:01、HLA-B*07:02、HLA-B*35:03、HLA-C*07:02、HLA-C*14:02。 具體言之，在本實例中，v=20個治療性抗原決定基係下表中自本實例得到之結果比較了如經由三種示例方法所發現的藉由MHCflurry預測以低於臨限值欄中之值的親和力結合患者之HLA的接合點抗原決定基之數量(其中nM表示奈莫耳濃度)。對於第一種方法，經由以上描述之旅行商問題(ATSP)公式發現具有1秒運行時間之最佳卡匣。對於第二種方法，最佳化卡匣係藉由取得在1百萬個隨機樣品之後發現之最佳卡匣確定。對於第三種方法，在該1百萬個隨機樣品中發現接合點抗原決定基之中值數量。 本實例之結果說明，可以使用多種標準中之任一種鑑別給定卡匣設計是否滿足設計要求。具體言之，如藉由先前實例所展示，自許多候選物選出的卡匣序列可以藉由具有最低接合點抗原決定基呈現分數或至少低於所鑑別之臨限值之此類評分的卡匣序列指定。此實例表示，可以使用另一標準，諸如結合親和力，指明給定卡匣設計是否滿足設計要求。對於此標準，可以設定臨限結合親和力(例如50-1000，或更大或更小)，指明卡匣設計序列應具有少於某一臨限數目的超過臨限值(例如0)之接合點抗原決定基，且可以使用多種方法中之任一種(例如表中所示之方法一至三)鑑別給定候選卡匣序列是否滿足該等要求。該等示例方法進一步說明，取決於所用方法，可能需要設定不同的臨限值。可以設想其他標準，諸如基於穩定性之標準，或諸如呈現分數、親和力諸如此類之標準的組合。 在另一實施例中，使用相同HLA類型及來自此部分(XI.C)中先前內容之20個治療性抗原決定基，而非使用基於結合親和力預測之距離度量來產生相同卡匣，關於抗原決定基m,k之距離度量係經預測患者之I類HLA等位基因會以超過一系列臨限值之呈現機率(在0.005與0.5機率之間，或更高，或更低)呈現的跨越m至k接合點之肽之數量，其中呈現機率係由以上XI.B部分中之呈現模型確定。本實例進一步說明認為可以用於鑑別給定候選卡匣序列是否滿足用於疫苗之設計要求的標準之廣度。 以上實例已鑑別出用於確定候選卡匣序列是否滿足設計要求的標準可以隨實施方案變化。該等實例分別說明，高於或低於標準之接合點抗原決定基數量之計數可以為確定候選卡匣序列是否滿足該標準時使用的計數。舉例而言，若標準係滿足或超過對於HLA之臨限結合親和力的抗原決定基之數量，則候選卡匣序列具有大於還是少於該數量可以確定該候選卡匣序列是否滿足用作選擇用於疫苗之卡匣的標準。若該標準係超過臨限呈現可能性之接合點抗原決定基之數量，則情況類似。 然而，在其他實施例中，可執行除計數外之計算以確定候選卡匣序列是否滿足設計標準。舉例而言，實際上可以測定超過或低於臨限值之接合點抗原決定基之比例，例如是否頂部X%的接合點抗原決定基具有超過某一臨限值Y之呈現可能性，或是否X%之接合點抗原決定基具有小於或大於Z nM之HLA結合親和力，代替超出/低於某一臨限值之抗原決定基計數。此等僅為實例，一般而言，標準可以基於任一個別接合點抗原決定基之任何屬性，或由該等接合點抗原決定基中之一些或全部之聚合得到的統計資料。此處，X一般可以為在0與100%之間之任何數(例如75%或更小)且Y可以為在0與1之間之任何值，且Z可以為適合於相關標準之任何數。該等值可以取決於所用模型及標準，以及所用訓練資料之品質，憑經驗確定。 因此，在某些態樣中，具有高呈現機率之接合點抗原決定基可以經移除；具有低呈現機率之接合點抗原決定基可以得到保留；緊密結合之接合點抗原決定基，亦即結合親和力低於1000 nM或500 nM或某一其他臨限值之接合點抗原決定基可以經移除；及/或較弱結合之接合點抗原決定基，亦即結合親和力超過1000 nM或500 nM或某一其他臨限值之接合點抗原決定基可以得到保留。 儘管以上實例使用以上描述之呈現模型實施方案鑑別出候選序列，但該等原理同樣地適用於基於其他類型之模型，諸如基於親和力、穩定性，諸如此類之模型鑑別卡匣序列中佈置之抗原決定基的實施方案。XII. 實例 7 ： 顯示出示例呈現模型效能之實驗結果 基於測試資料T 測試以上描述之各種呈現模型之有效性，該等測試資料係未用於訓練呈現模型的訓練資料170之子集或來自訓練資料170的具有與訓練資料170類似之變數及資料結構之獨立資料集。 指示呈現模型之效能的相關度量係： 陽性預測值其指示正確預測的會在相關HLA等位基因上呈現之肽實例之數量與經預測會在HLA等位基因上呈現的肽實例之數量的比率。在一個實施方案中，若相應可能性估計值ui 大於或等於給定臨限值t ，則預測測試資料T 中之肽 pi 會在一或多個相關HLA等位基因上呈現。指示呈現模型之效能的另一相關度量係： 召回率其指示正確預測的會在相關HLA等位基因上呈現的肽實例之數量與已知會在HLA等位基因上呈現的肽實例之數量的比率。指示呈現模型之效能的另一相關度量係接收者操作特徵曲線(receiver operating characteristic，ROC)之曲線下面積(AUC)。ROC將召回率相對於假陽性率(FPR)作圖，FPR係由下式提供： 。 XII.A. 基於質譜資料之呈現模型效能與目前先進技術模型的比較 圖13A比較如本文中所述之示例呈現模型與目前先進技術模型基於多等位基因質譜資料預測肽呈現之效能結果。結果顯示，示例呈現模型在預測肽呈現方面的效能明顯優於基於親和力及穩定性預測之目前先進技術模型。 具體言之，使用仿射相關性函數gh (∙)及expit函數f (∙)，圖13A顯示為「MS」之示例呈現模型係等式(12)中顯示之獨立等位基因呈現模型之最大值。示例呈現模型係基於來自IEDB資料集之單等位基因HLA-A*02:01質譜資料之子集(資料集「D1」)(資料可以見於http://www.iedb.org/doc/mhc_ligand_full.zip)及來自IEDB資料集之單等位基因HLA-B*07:02質譜之子集(資料集「D2」)(資料可以見於http://www.iedb.org/doc/mhc_ligand_full.zip)。自訓練資料中去除測試集中來自源蛋白質的含有經呈現肽之所有肽，使得該示例呈現模型不是簡單地記錄經呈現抗原之序列。 圖13A中顯示為「親和力」之模型係與目前先進技術模型類似的模型，該模型基於親和力預測值NETMHCpan預測肽呈現。NETMHCpan之實施方案詳細提供於http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/。圖13A中顯示為「穩定性」之模型係與目前先進技術模型類似之模型，該模型基於穩定性預測值NETMHCstab預測肽呈現。NETMHCstab之實施方案詳細提供於http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCstab-1.0/。測試資料係來自Bassani-Sternberg資料集之多等位基因JY細胞株HLA-A*02:01及HLA-B*07:02質譜資料之子集(資料集「D3」)(資料可以見於www.ebi.ac.uk/pride/archive/projects/PXD000394)。誤差條(如實線所指示)顯示95%信賴區間。 如圖13A之結果中所示，相對於基於MHC結合親和力預測值或MHC結合穩定性預測值來預測肽呈現的目前先進技術模型，基於質譜資料訓練的示例呈現模型在10%召回率下具有明顯較高的PPV值。具體言之，示例呈現模型之PPV比基於親和力預測值之模型高約14%，且其PPV比基於穩定性預測值之模型高約12%。 該等結果展示，相較於基於MHC結合親和力或MHC結合穩定性預測值預測肽呈現的目前先進技術模型，示例呈現模型具有明顯較佳之效能，即使該示例呈現模型未基於含有經呈現肽之蛋白質序列進行訓練。XII.B. 基於 T 細胞抗原決定基資料之呈現模型效能與目前先進技術模型的比較 圖13B比較如本文中所述之另一示例呈現模型與目前先進技術模型基於T細胞抗原決定基資料預測肽呈現的效能結果。T細胞抗原決定基資料含有經細胞表面上之MHC等位基因呈現且由T細胞識別之肽序列。結果顯示，即使基於質譜資料訓練示例呈現模型，示例呈現模型在預測T細胞抗原決定基方面之效能仍明顯優於基於親和力及穩定性預測值之目前先進技術模型。換言之，圖13B之結果指示，示例呈現模型不僅在基於質譜測試資料預測肽呈現方面之效能優於目前先進技術模型，而且示例呈現模型在預測實際上由T細胞識別之抗原決定基方面的效能亦明顯優於目前先進技術模型。由此指示，本文中所提供之多種呈現模型可以更佳地鑑別可能在免疫系統中誘導免疫原性反應之抗原。 具體言之，使用仿射變換函數gh (∙)及expit函數f (∙)，圖13B中顯示為「MS」示例呈現模型係基於資料集D1之子集訓練的等式(2)中顯示之獨立等位基因呈現模型。自訓練資料中去除測試集中來自源蛋白質的含有經呈現肽之所有肽，使得該呈現模型不是簡單地記錄經呈現抗原之序列。 將該等模型分別應用於測試資料，該測試資料係基於HLA-A*02:01T細胞抗原決定基資料之質譜資料之子集(資料集「D4」)(資料可以見於www.iedb.org/doc/tcell full v3.zip)。圖13B中顯示為「親和力」之模型係與目前先進技術模型類似的模型，該模型基於親和力預測值NETMHCpan預測肽呈現，且圖13B中顯示為「穩定性」之模型係與目前先進技術模型類似之模型，該模型基於穩定性預測值NETMHCstab預測肽呈現。誤差條(如實線所指示)顯示95%信賴區間。 如圖13A之結果中所示，相較於基於MHC結合親和力或MHC結合穩定性預測值預測肽呈現的目前先進技術模型，基於質譜資料訓練之獨立等位基因呈現模型在10%召回率下具有明顯較高之PPV值，即使該呈現模型未基於含有經呈現肽之蛋白質序列進行訓練。具體言之，示例呈現模型之PPV比基於親和力預測值之模型高約9%，且其PPV比基於穩定性預測值之模型高約8%。 該等結果展示，基於質譜資料訓練之示例呈現模型在預測由T細胞識別之抗原決定基方面的效能明顯優於目前先進技術模型。XII.C. 基於質譜資料之不同呈現模型效能之比較 圖13C比較示例和之函數模型(等式(13))、示例函數之和模型(等式(19))及示例二階模型(等式(23))基於多等位基因質譜資料預測肽呈現之效能結果。結果顯示，函數之和模型及二階模型的效能優於和之函數模型。此係因為和之函數模型暗示，多等位基因環境中之等位基因會干擾彼此之肽呈現，而實際上，肽之呈現係有效地獨立的。 具體言之，圖13C中標記為「和之S型函數」之示例呈現模型係利用網路相關性函數gh (∙)、恆等函數f (∙)及expit函數r (∙)的和之函數模型。標記為「S型函數之和」的示例模型係利用網路相關性函數gh (∙)、expit函數f (∙)及恆等函數r (∙)之等式(19)中的函數之和模型。標記為「雙曲正切」之示例模型係利用網路相關性函數gh (∙)、expit函數f (∙)及雙曲正切函數r (∙)之等式(19)中的函數之和模型。標記為「二階」之示例模型係使用含網路相關性函數gh (∙)及expit函數f (∙)之等式(18)中顯示之隱式獨立等位基因呈現可能性形式的等式(23)中之二階模型。每個模型係基於資料集D1、D2及D3之子集訓練。將示例呈現模型應用於測試資料，該測試資料係不與訓練資料重疊之資料集D3之隨機子集。 如圖13C中所示，第一行係指當將各呈現模型應用於測試集時ROC之AUC，第二行係指可能性損失之負對數值，且第三行係指在10%召回率下之PPV。如圖13C中所示，呈現模型「S型函數之和」、「雙曲正切」及「二階」之效能在10%召回率下約15-16%之PPV下大致相當，而模型「和之S型函數」之效能在約11%下略微較低。 如先前在X.C.4部分中所論述，結果顯示，呈現模型「S型函數之和」、「雙曲正切」及「二階」相較於「和之S型函數」模型具有較高PPV值，因為該等模型正確地解釋多等位基因環境中的每個MHC等位基因如何獨立地呈現肽。XII.D. 在基於及不基於單等位基因質譜資料訓練情況下呈現模型效能之比較 圖13D比較利用與不利用單等位基因質譜資料訓練的兩個示例呈現模型針對多等位基因質譜資料預測肽呈現的效能結果。結果指示，在無單等位基因資料下訓練之示例呈現模型的效能與利用單等位基因資料訓練之示例呈現模型的效能相當。 示例模型「利用A2/B7單等位基因資料」係利用網路相關性函數gh (∙)、expit函數f (∙)及恆等函數r (∙)之等式(19)中的「S型函數之和」呈現模型。該模型係基於資料集D3之子集以及來自IEDB資料庫之多種MHC等位基因之單等位基因質譜資料訓練(資料可以見於：http://www.iedb.org/doc/mhc_ligand_full.zip)。示例模型「無A2/B7單等位基因資料」係相同模型，但基於多等位基因D3資料集之子集訓練，無等位基因HLA-A*02:01及HLA-B*07:02之單等位基因質譜資料，而是利用其他等位基因之單等位基因質譜資料。在多等位基因訓練資料內，細胞株HCC1937表現HLA-B*07:02，但不表現HLA-A*02:01，且細胞株HCT116表現HLA-A*02:01，但不表現HLA-B*07:02。將示例呈現模型應用於測試資料，該測試資料係不與訓練資料重疊之資料集D3之隨機子集。 「相關性」一行係指指示肽是否在測試資料中之相應等位基因上呈現的實際標記與用於預測之標記之間的相關性。如圖13D中所示，基於MHC等位基因HLA-A*02:01之隱式獨立等位基因呈現可能性進行預測之效能明顯優於基於MHC等位基因HLA-A*02:01而非MHC等位基因HLA-B*07:02之單等位基因測試資料進行預測的效能。關於MHC等位基因HLA-B*07:02顯示類似結果。 該等結果指示，呈現模型之隱式獨立等位基因呈現可能性可以正確地預測及區分結合基元與個別MHC等位基因，即使並不瞭解訓練資料中肽與每一個別MHC等位基因之間的直接關聯。XII.E. 在不基於單等位基因質譜資料訓練情況下獨立等位基因預測效能之比較 圖13E顯示基於圖13D中所示之分析中保持的等位基因HLA-A*02:01及HLA-B*07:02之單等位基因質譜資料，圖13D中顯示的「無A2/B7單等位基因資料」及「利用A2/B7單等位基因資料」示例模型之效能。結果指示，即使該示例呈現模型未利用該兩個等位基因之單等位基因質譜資料進行訓練，該模型仍能夠學習到各MHC等位基因之結合基元。 如圖13E中所示，「A2模型預測B7」指示當基於有關MHC等位基因HLA-A*02:01之隱式獨立等位基因呈現可能性估計值，針對單等位基因HLA-B*07:02資料預測肽呈現時該模型之效能。類似地，「A2模型預測A2」指示當基於有關MHC等位基因HLA-A*02:01之隱式獨立等位基因呈現可能性估計值，針對單等位基因HLA-A*02:01預測肽呈現時該模型之效能。「B7模型預測B7」指示當基於有關MHC等位基因HLA-B*07:02之隱式獨立等位基因呈現可能性估計值，針對單等位基因HLA-B*07:02資料預測肽呈現時該模型之效能。「B7模型預測A2」指示當基於有關MHC等位基因HLA-B*07:02之隱式獨立等位基因呈現可能性估計值，針對單等位基因HLA-A*02:01預測肽呈現時該模型之效能。 如圖13E中所示，有關HLA等位基因之隱式獨立等位基因可能性之預測能力明顯高於有關預定等位基因之預測能力，且明顯低於有關其他HLA等位基因之預測能力。與圖13D中顯示之結果類似，示例呈現模型正確地習得區分個別等位基因HLA-A*02:01與HLA-B*07:02之肽呈現，即使肽呈現與該等等位基因之間之直接關聯在多等位基因訓練資料中不存在。XII.F. 獨立等位基因預測中頻繁出現之錨定殘基匹配已知之典型錨定基元 圖13F顯示在圖13D中顯示之「無A2/B7單等位基因資料」示例模型所預測的九聚體當中在2位及9位處之共同錨定殘基。若估計可能性超過5%，則預測該等肽將會經呈現。結果顯示，所鑑別的在MHC等位基因HLA-A*02:01及HLA-B*07:02上呈現之肽中的最常見錨定殘基與先前已知的該等MHC等位基因之錨定基元相配。此指示，正如預期的，基於肽序列中胺基酸之特定位置，示例呈現模型正確地習得肽結合。 如圖13F中所示，已知在2位處之胺基酸L/M及在9位處之胺基酸V/L係HLA-A*02:01之典型錨定殘基基元(如https://link.springer.com/article/10.1186/1745-7580-4-2之表4中所示)，且已知在2位處之胺基酸P及在9位處之胺基酸L/V係HLA-B*07:02之典型錨定殘基基元。在該模型鑑別之肽的2位及9位處的最常見錨定殘基基元與已知的該兩個HLA等位基因之典型錨定殘基基元相配。XII.G. 利用及不利用等位基因非相互作用變數之呈現模型效能之比較 圖13G比較併入C末端及N末端側接序列作為等位基因相互作用變數之示例呈現模型與併入C末端及N末端側接序列作為等位基因非相互作用變數之示例呈現模型之間的效能結果。結果顯示，併入C末端及N末端側接序列作為等位基因非相互作用變數使模型效能明顯改善。更具體言之，鑑別所有不同MHC等位基因共有的適用於肽呈現之特徵並使其模型化，由此使所有MHC等位基因共享該等等位基因非相互作用變數之統計強度以改善呈現模型效能非常有意義。 示例「等位基因相互作用」模型係使用等式(22)中之隱式獨立等位基因呈現可能性形式的函數之和模型，其併入C末端及N末端側接序列作為等位基因相互作用變數，且利用網路相關性函數gh (∙)及expit函數f (∙)。示例「等位基因非相互作用」模型係等式(21)中顯示之函數之和模型，其併入C末端及N末端側接序列作為等位基因非相互作用變數，且利用網路相關性函數gh (∙)及expit函數f (∙)。等位基因非相互作用變數係經由獨立網路相關性函數gw (∙)模型化。兩個模型均基於資料集D3之子集以及來自IEDB資料庫之多種MHC等位基因之單等位基因質譜資料訓練(資料可以見於：http://www.iedb.org/doc/mhc_ligand_full.zip)。將該等呈現模型分別應用於測試資料集，該測試資料集係不與訓練資料重疊之資料集D3之隨機子集。 如圖13G中所示，在示例呈現模型中併入C末端及N末端側接序列作為等位基因非相互作用變數相對於使其模型化作為等位基因相互作用變數實現約3%之PPV值改良。一般而言，此係因為「等位基因非相互作用」示例呈現模型能夠藉由利用獨立網路相關性函數使影響模型化而在所有MHC等位基因中共享等位基因非相互作用變數之統計強度，同時極少增加計算能力。XII.H. 經呈現肽與 mRNA 定量之間的相關性 圖13H說明基於腫瘤細胞質譜資料進行mRNA定量得到基因呈現肽之百分率之間的相關性。結果顯示，mRNA表現量與肽呈現之間存在較強相關性。 具體言之，圖13G中之橫軸指示以每百萬條讀段數之轉錄本數(TPM)之四分位數表示的mRNA表現量。圖13G中之豎軸指示由相應mRNA表現量四分位數中之基因呈現之抗原決定基的百分率。每一實線係有關自腫瘤樣品得到的兩個量測值之曲線，其與相應質譜資料及mRNA表現量測值相關聯。如圖13G中所示，mRNA表現量與相應基因中之肽之百分率之間存在較強正相關性。具體言之，RNA表現量之頂四分位數中之基因呈現肽之可能性係底四分位數之超過20倍。另外，經由RNA未偵測到的基因基本上不呈現肽。 結果指示，藉由併入mRNA定量量測值可以大幅改良呈現模型之效能，因為該等量測值有利地預測肽呈現。XII.I. 在併入 RNA 定量資料下呈現模型效能之比較 圖13I顯示兩個示例呈現模型之效能，其中之一係基於質譜腫瘤細胞資料訓練，另一個併入mRNA定量資料及質譜腫瘤細胞資料。正如自圖13H所預期的，結果指示，由於mRNA表現量係肽呈現之有力指標，藉由在示例呈現模型中併入mRNA定量量測值使效能明顯改良。 「MHCflurry+RNA過濾器」係與基於親和力預測值預測肽呈現之目前先進技術模型類似的模型。其係使用MHCflurry以及標準基因表現過濾器實施，該過濾器利用mRNA定量量測值移除蛋白質中小於3.2 FPKM之所有肽。MHCflurry之實施方案詳細提供於https://github.com/hammerlab/ mhcflurry/及http://biorxiv.org/content/early/2016/05/22/054775。「示例模型，無RNA」模型係利用網路相關性函數gh (∙)、網路相關性函數gw (∙)及expit函數f (∙)之等式(21)中顯示的「S型函數之和」示例呈現模型。「示例模型，無RNA」模型經由網路相關性函數gw (∙)併入C末端側接序列作為等位基因非相互作用變數。 「示例模型，有RNA」模型係利用網路相關性函數gh (∙)、在等式(10)中經由對數函數併入mRNA定量資料之網路相關性函數gh (∙)及expit函數f (∙)的等式(19)中顯示之「S型函數之和」呈現模型。「示例模型，有RNA」模型經由網路相關性函數gw (∙)併入C末端側接序列作為等位基因非相互作用變數且經由對數函數併入mRNA定量量測值。 每個模型均基於來自IEDB資料集之單等位基因質譜資料、來自Bassani-Sternberg資料集之多等位基因質譜資料的7個細胞株及20個質譜腫瘤樣品的組合進行訓練。將每個模型應用於包括5,000個提供的來自7個腫瘤樣品之蛋白質的測試集，其構成來自總計52,156,840個肽之9,830個經呈現肽。 如圖13I之前兩個條形圖中所示，「示例模型，無RNA」模型在20%召回率下PPV值為21%，而目前先進技術模型之PPV值為約3%。由此指示PPV值之18%的初始效能改良，甚至在不併入mRNA定量量測值下亦如此。如圖13I之第三個條形圖中所示，將mRNA定量中併入呈現模型中之「示例模型，有RNA」顯示約30%的PPV值，相較於不利用mRNA定量量測值之示例呈現模型，效能增加近10%。 因此，結果指示，正如自圖13H中之發現所預期的，mRNA表現量實際上為肽預測之有力預測器，其能夠在極少增加計算複雜度情況下明顯改良呈現模型之效能。XII.J. 測定的有關 MHC 等位基因 HLA-C*16:04 之參數的實例 圖13J比較在不同肽長度下，由關於圖13I描述之「示例模型，有RNA」呈現模型產生的結果與當預測肽呈現時不考慮肽長度之目前先進技術模型預測的結果之間之肽呈現機率。結果指示，圖13I之「示例模型，有RNA」示例呈現模型捕捉不同長度肽間之可能性變化。 橫軸指示長度為8、9、10及11之肽樣品。豎軸指示視肽長度而定之肽呈現機率。曲線「實際測試資料機率」顯示在樣品測試資料集中視肽長度變化的經呈現肽之比例。呈現可能性隨肽長度而變化。舉例而言，如圖13J中所示，具有典型HLA-A2 L/V錨定基元之10mer肽的呈現可能性比具有相同錨定殘基之9mer低約3倍。曲線「忽略長度之模型」指示在將忽略肽長度之目前先進技術模型應用於相同測試資料集進行呈現預測時的預測量測值。該等模型可以為4.0版之前之NetMHC版本、3.0版之前之NetMHCpan版本，及MHCflurry，不考慮肽呈現隨肽長度之變化。如圖13J中所示，經呈現肽之比例在不同肽長度值間將為恆定的，指示該等模型將無法捕捉肽呈現隨長度之變化。曲線「Gritstone，有RNA」指示由「Gritstone，有RNA」呈現模型產生的量測值。如圖13J中所示，由「Gritstone，有RNA」模型產生之量測值近似地遵循「實際測試資料機率」中顯示之量測值且正確地考慮在長度8、9、10及11下的不同肽呈現程度。 因此，結果顯示，如本文中所示之示例呈現模型不僅產生有關9mer肽之改良之預測，而且亦改良對在8-15之間的其他長度之肽之預測，該等肽在I類HLA等位基因中之經呈現肽中佔高達40%。XII.K. 測定的有關 MHC 等位基因 HLA-C*16:04 之參數的實例 以下顯示所測定的有關以h 指示之MHC等位基因HLA-C*16:04之獨立等位基因呈現模型(等式(2))之變化形式的一組參數：， 其中relu(∙)係修正線性單元(RELU)函數，且 Wh 1 、 bh 1 、 Wh 2 及bh 2 係測定的該模型之參數集合 θ 。等位基因相互作用變數 xh k 由肽序列組成。 Wh 1 之維度係231×256)， bh 1 之維度係(1×256)， Wh 2 之維度係(256×1)且 bh 2 係標量。出於證實之目的， bh 1 、bh 2 、 Wh 1 及 Wh 2 之值詳細地描述於PCT公開案WO2017106638中，其全部教示以引用的方式併入本文中。XIII. 示例電腦 圖14說明用於實施圖1及3中所示之實體的示例電腦1400。電腦1400包括耦合至晶片組1404之至少一個處理器1402。晶片組1404包括記憶體控制器集線器1420及輸入/輸出(I/O)控制器集線器1422。記憶體1406及圖形配接器1412係耦合至記憶體控制器集線器1420，且顯示器1418係耦合至圖形配接器1412。存儲裝置1408、輸入裝置1414及網路配接器1416係耦合至I/O控制器集線器1422。電腦1400之其他實施例具有不同架構。 存儲裝置1408係非暫時性電腦可讀存儲媒體，諸如硬盤驅動器、緊密光碟唯讀記憶體(CD-ROM)、DVD或固態記憶體裝置。記憶體1406保存處理器1402所使用之指令及資料。輸入介面1414係觸控式螢幕界面，滑鼠、軌跡球或其他類型之指向裝置、鍵盤或其某一組合，且用於將資料輸入電腦1400中。在一些實施例中，電腦1400可以經配置以經由用戶之示意動作自輸入介面1414接收輸入(例如命令)。圖形配接器1412將圖像及其他資訊顯示於顯示器1418上。網路1416將電腦1400耦合至一或多個電腦網路。 電腦1400經調適以執行電腦程式模組以提供本文所描述之功能。如本文所使用，術語「模組」係指用於提供指定功能之電腦程式邏輯。因此，模組可以在硬體、韌體及/或軟體中實施。在一個實施例中，程式模組係存儲於存儲裝置1408上，裝載至記憶體1406中且由處理器1402執行。 圖1之實體所使用之電腦1400的類型可以取決於實施例及實體所需之處理功率而變化。舉例而言，呈現鑑別系統160可以在單一電腦1400中或在經由網路(諸如在伺服器群中)彼此連通之多台電腦1400中運行。電腦1400可以缺少以上描述之組件中之一部分，諸如圖形配接器1412及顯示器1418。XIV. 新抗原遞送載體實例 以下為執行本發明之特定實施例之實例。該等實例僅出於說明目的提供，且不意欲以任何方式限制本發明之範疇。已作出努力以確保所使用數字(例如量、溫度等)的精確性，但一些實驗性誤差及偏差當然應為允許的。 除非另外指明，否則本發明將採用在此項技術之技能範圍內的蛋白質化學、生物化學、DNA重組技術及藥理學習知方法實行。該等技術在文獻中有完整解釋。參見例如，T.E. Creighton,Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993)；A.L. Lehninger,Biochemistry (Worth Publishers, Inc., 當前版本)；Sambrook等人,Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版, 1989)；Methods In Enzymology (S. Colowick及N. Kaplan編, Academic Press, Inc.);Remington's Pharmaceutical Sciences , 第18版 (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990)；Carey and SundbergAdvanced Organic Chemistry 第 3 版 (Plenum Press) 第A及B卷(1992)。XIV.A. 新抗原卡匣設計 可以經由疫苗接種遞送刺激相應細胞免疫反應之多個I類MHC限制性腫瘤特異性新抗原(TSNA)。在一個實例中，疫苗卡匣經工程改造而以單一基因產物形式編碼多個抗原決定基，其中該等抗原決定基係嵌入其天然的周圍肽序列內或藉由非天然連接子序列隔開。鑑別出會潛在地影響抗原加工及呈現且因此影響TSNA特異性CD8 T細胞反應之量值及廣度的若干設計參數。在本實例中，設計及構築出若干模型卡匣以評價：(1)是否可以針對併入單一表現卡匣中之多個抗原決定基產生穩定T細胞反應；(2)什麼使得最佳連接子置放於表現卡匣內之TSNA之間，引起所有抗原決定基之最佳加工及呈現；(3)該等抗原決定基在卡匣內之相對位置是否影響T細胞反應；(4)卡匣內抗原決定基之數量是否影響針對個別抗原決定基之T細胞反應的量值或品質；(5)添加細胞靶向序列是否改善T細胞反應。 產生兩個讀取結果以評價抗原呈現及對模型卡匣內之標記物抗原決定基具有特異性之T細胞反應：(1)活體外基於細胞之篩選，其允許藉由專門工程改造之報導體T細胞之活化進行衡量，來評估抗原呈遞(Aarnoudse等人, 2002；Nagai等人, 2012)；及(2)使用HLA-A2轉殖基因小鼠(Vitiello等人, 1991)，藉由其相應抗原決定基特異性T細胞反應評估卡匣來源之人源抗原決定基之疫苗接種後免疫原性的活體內分析(Cornet等人, 2006；Depla等人, 2008；Ishioka等人, 1999)。XIV.B. 新抗原卡匣設計評價 XIV.B.1. 方法與材料 TCR 及卡匣設計及選殖 當藉由A*0201呈現時，所選TCR識別肽NLVPMVATV(PDB# 5D2N)、CLGGLLTMV(PDB#3REV)、GILGFVFTL(PDB#1OGA)、LLFGYPVYV(PDB#1AO7)。構築含有2A肽連接之TCR次單元(β隨後為α)、EMCV IRES及2A連接之CD8次單元(β隨後為α及嘌呤黴素抗性基因)的轉移載體。對開放閱讀框架序列進行密碼子優化且由GeneArt合成。產生用於活體外抗原決定基加工及呈現研究的細胞株 肽係購自ProImmune或Genscript，在含10 mM參(2-羧基乙基)膦(TCEP)之水/DMSO(2:8，v/v)中稀釋至10 mg/mL。除非另外指出，否則細胞培養基及補充劑係來自Gibco。熱滅活胎牛血清(FBShi)係來自Seradigm。QUANTI-Luc受質、吉歐黴素(Zeocin)及嘌呤黴素係來自InvivoGen。將Jurkat-Lucia NFAT細胞(InvivoGen)維持在補充有10% FBShi、丙酮酸鈉及100 µg/mL吉歐黴素之RPMI 1640中。轉導後，該等細胞立即另外接受0.3 µg/mL嘌呤黴素。在伊氏培養基(Iscove's Medium，IMDM)加20% FBShi中培養T2細胞(ATCC CRL-1992)。U-87 MG(ATCC HTB-14)細胞係維持在補充有10% FBShi之MEM伊格爾培養基(MEM Eagles Medium)中。 Jurkat-Lucia NFAT細胞含有NFAT誘導性Lucia報導體構築體。Lucia基因在藉由接合T細胞受體(TCR)活化時，將利用腔腸素之螢光素酶分泌至培養基中。此螢光素酶可使用QUANTI-Luc螢光素酶偵測試劑量測。用慢病毒轉導Jurkat-Lucia細胞以表現抗原特異性TCR。HIV源性慢病毒轉移載體係自GeneCopoeia獲得，且表現VSV-G之慢病毒輔助質體(support plasmid)(pCMV-VsvG)、Rev(pRSV-Rev)及Gag-pol(pCgpV)係自Cell Design Labs獲得。 藉由使用40 µl脂染胺及20 µg DNA混合物(以重量計4:2:1:1之轉移質體:pCgpV:pRSV-Rev:pCMV-VsvG)，用脂染胺2000(Thermo Fisher)轉染T75燒瓶中50-80%匯合之HEK293細胞，來製備慢病毒。使用Lenti-X系統(Clontech)濃縮8-10 mL含病毒之培養基，且使病毒再懸浮於100-200 µl新鮮培養基中。使用此體積覆蓋相等體積之Jurkat-Lucia細胞(在不同實驗中使用5×10E4-1×10E6細胞)。在含0.3 µg/ml嘌呤黴素之培養基中培養之後，分選細胞以獲得選殖性。使用裝載肽之T2細胞測試該等Jurkat-Lucia TCR純系之活性及選擇性。活體外抗原決定基加工及呈現分析 常規地使用T2細胞，藉由TCR檢查抗原識別。T2細胞缺乏用於抗原加工之肽轉運蛋白(TAP缺陷型)且不能在內質網中裝載內源性肽以在MHC上呈現。然而，T2細胞可以容易地裝載外源肽。將五個標記物肽(NLVPMVATV、CLGGLLTMV、GLCTLVAML、LLFGYPVYV、GILGFVFTL)及兩個不相關的肽(WLSLLVPFV、FLLTRICT)裝載至T2細胞上。簡言之，對T2細胞計數且用IMDM加1% FBShi稀釋至1×106 個細胞/毫升。添加肽以產生10 µg肽/1×106 個細胞。接著在37℃下培育細胞90分鐘。用IMDM加20% FBShi洗滌細胞兩次，稀釋至5×10E5個細胞/毫升並將100 µL塗鋪至96孔Costar組織培養盤中。對Jurkat-Lucia TCR純系計數並在RPMI 1640加10% FBShi中稀釋至5×10E5個細胞/毫升，且將100 µL添加至T2細胞中。培養盤在37℃及5% CO2 下培育隔夜。接著以400g離心培養盤3分鐘並將20 µL上清液移至白色平底Greiner盤中。QUANTI-Luc受質係根據說明書製備且以每孔50 µL添加。在Molecular Devices SpectraMax iE3x上讀取螢光素酶表現量。 為了測試腺病毒卡匣之標記物抗原決定基呈現，使用U-87 MG細胞作為替代抗原呈現細胞(APC)且用腺病毒載體轉導。收集U-87 MG細胞並以5×10E5個細胞/100 µl塗鋪於96孔Costar組織培養盤中之培養基中。在37℃培育培養盤約2小時。用MEM加10% FBShi將腺病毒卡匣稀釋至MOI 100、50、10、5、1及0並將其以每孔5µl添加至U-87 MG細胞中。再在37℃下培育培養盤約2小時。對Jurkat-Lucia TCR純系計數並在RPMI加10% FBShi中稀釋至5×10E5個細胞/毫升，且將其以每孔100 µL添加至U-87 MG細胞中。接著，在37℃及5% CO2下培育培養盤約24小時。以400g離心培養盤3分鐘並將20 µL上清液移至白色平底Greiner盤中。QUANTI-Luc受質係根據說明書製備且以每孔50 µL添加。在Molecular Devices SpectraMax iE3x上讀取螢光素酶表現量。用於免疫原性研究之小鼠品系 轉殖基因HLA-A2.1(HLA-A2 Tg)小鼠係自Taconic Labs, Inc獲得。該等小鼠攜帶由嵌合I類分子組成之轉殖基因，該嵌合I類分子包含人類HLA-A2.1前導序列、α1及α2域以及鼠類H2-Kb α3、跨膜及細胞質域(Vitiello等人, 1991)。用於該等研究之小鼠係基於C57Bl/6背景的野生型BALB/cAnNTac雌性及純合HLA-A2.1 Tg雄性的第一代後代(F1)。腺病毒載體 (Ad5v) 免疫接種 經由兩側肌肉內注射至脛前肌中對HLA-A2 Tg小鼠免疫接種1×1010 至1×106 個腺病毒載體病毒粒子。在免疫接種後12天量測免疫反應。淋巴細胞分離 自新鮮收集的經免疫接種小鼠之脾及淋巴結分離淋巴細胞。使用GentleMACS組織解離器，根據製造商的說明書，在含有10%胎牛血清以及青黴素及鏈黴素之RPMI(完全RPMI)中解離組織。離體酶聯免疫斑點 (enzyme-linked immunospot ， ELISPOT) 分析 ELISPOT分析係根據ELISPOT統一準則(Janetzki等人, 2015)，利用小鼠IFNg ELISpotPLUS套組(MABTECH)進行。將1×105 個脾細胞與10 μM指定肽一起在塗有IFNg抗體之96孔盤中培育16小時。使用鹼性磷酸酶使斑點顯色。對反應定時10分鐘並藉由用自來水流過盤來淬滅反應。使用AID vSpot讀取器譜圖對斑點計數。對於ELISPOT分析，將飽和度＞50%之孔記錄為「太多而無法計數」。將複製孔之偏差＞10%的樣品自分析中排除。接著，使用下式，針對孔匯合校正斑點計數：斑點計數+2 ×(斑點計數×%匯合/[100%-%匯合])。藉由用抗原刺激之孔減去陰性肽刺激孔中之斑點計數來校正陰性背景。最後，將標記為太多而無法計數之孔設定成最高觀察校正值，四捨五入至最接近之百分數。離體細胞內細胞因子染色 (ICS) 及流式細胞測量術分析 將2-5×106 個細胞/毫升密度的新鮮分離之淋巴細胞與10 μM指定肽一起培育2小時。兩小時之後，添加布雷菲爾德菌素A(brefeldin A)達到5 μg/ml濃度且將細胞與刺激劑一起再培育4小時。刺激之後，用可固定的死活細胞鑑定染料(fixable viability dye) eFluor780，根據製造商之方案標記活細胞，並用以1:400稀釋之抗CD8 APC(純系53-6.7, BioLegend)染色。對於細胞內染色，使用1:100稀釋之抗IFNg PE(純系XMG1.2, BioLegend)。將樣品收集於Attune NxT流式細胞儀(Thermo Scientific)上。使用FlowJo標繪對流式細胞測量術資料並分析。為了評估抗原特異性反應之程度，計算響應於各肽刺激劑的FNg+之CD8+細胞百分比及總IFNg+細胞數量/1×106 個活細胞。XIV.B.2. 新抗原卡匣設計之活體外評價 作為新抗原卡匣設計評價之實例，開發活體外基於細胞之分析以評估在模型疫苗卡匣內之所選人類抗原決定基是否經抗原呈現細胞表現、加工及呈現(圖15)。在識別後，經工程改造成表現五種對明確表徵之肽-HLA組合具有特異性之TCR之一的Jurkat-Lucia報告子T細胞變得活化且將活化T細胞核因子(NFAT)易位至核中，引起螢光素酶報導基因之轉錄活化。藉由生物發光定量個別報導體CD8 T細胞株之抗原刺激。 藉由用表現構築體轉導慢病毒來改良個別Jurkat-Lucia報導體株，該表現構築體包括藉由P2A核糖體跳躍序列(skip sequence)分離以確保等莫耳量轉譯產物之抗原特異性TCRβ及TCRα鏈(Banu等人, 2014)。將第二CD8β-P2A-CD8α元件添加至慢病毒構築體中提供親代報導體細胞株所缺乏之CD8 輔助受體之表現，因為細胞表面上之CD8對於與靶pMHC分子之結合親和力至關重要且經由接合其胞質尾區增強信號傳導(Lyons等人, 2006；Yachi等人, 2006)。 在慢病毒轉導之後，使Jurkat-Lucia報告子在嘌呤黴素選擇下擴增，經歷單細胞螢光輔助細胞分選(FACS)且測試單株群之螢光素酶表現。由此得到具有功能性細胞反應的針對特定肽抗原1、2、4及5之穩定轉導之報導體細胞株。(表2)。表 2 ： 活體外T細胞活化分析之研究。如藉由螢光素酶之誘導所量測的肽特異性T細胞識別指示疫苗卡匣抗原之有效加工及呈現。 *尚未產生的針對抗原決定基3之報導體T細胞 在另一實例中，對於一系列短卡匣，所有標記物抗原決定基均併入相同位置中(圖16A)且僅分隔HLA-A*0201限制性抗原決定基之連接子(圖16B)係變化的。將報導體T細胞個別地與經表現該等短卡匣之腺病毒構築體感染的U-87抗原呈現細胞(APC)混合，並相對於未感染對照組量測螢光素酶表現。藉由匹配報導體T細胞識別模型卡匣中之全部四個抗原，展示多個抗原之有效加工及呈現。T細胞反應之量值在很大程度上遵循天然及AAY-連接子之類似趨勢。自基於RR-連接子之卡匣釋放的抗原顯示較低螢光素酶誘導(表3)。經設計以破壞抗原加工之DPP-連接子製造的疫苗卡匣引起較差抗原決定基呈現(表3)。表 3 ： 短卡匣中連接子序列之評價。在活體外T細胞活化分析中之螢光素酶誘導指示，除基於DPP之卡匣外，所有連接子均有助於卡匣抗原之有效釋放。僅T細胞抗原決定基(無連接子)=9AA，天然連接子一側=17AA，天然連接子兩側=25AA，非天然連接子=AAY、RR、DPP * 尚未產生的針對抗原決定基3之報導體T細胞 在另一實例中，構築另外一系列之短卡匣，該等卡匣除人類及小鼠抗原決定基外，亦含有定位於該卡匣之N或C末端上的靶向序列諸如泛素(Ub)、MHC及Ig-κ信號肽(SP)及/或MHC跨膜(TM)基元。(圖17)。當藉由腺病毒載體遞送至U-87 APC時，報導體T細胞再次展示多個卡匣源性抗原之有效加工及呈現。不過，各種靶向特徵對於T細胞反應之量值無明顯影響(表4)。表 4 ： 添加至模型疫苗卡匣之細胞靶向序列的評價。採用活體外活化分析證實，四個HLA-A*0201限制性標記物抗原決定基自模型卡匣有效釋放且靶向序列沒有明顯改善T細胞識別及活化。 * 尚未產生的針對抗原決定基3之報導體T細胞XIV.B.3. 新抗原卡匣設計之活體內評價 作為新抗原卡匣設計評價之另一實例，疫苗卡匣經設計以含有5個已知以HLA-A*02:01限制性方式刺激CD8 T細胞的明確表徵之I類人類MHC抗原決定基(圖16A、17、19A)。為了評價活體內免疫原性，將含有該等標記物抗原決定基之疫苗卡匣併入腺病毒載體中並用於感染HLA-A2轉殖基因小鼠(圖18)。此小鼠模型攜帶的轉殖基因部分由人類HLA-A*0201及小鼠H2-Kb組成，且因此編碼由人類HLA-A2.1前導序列、連接至鼠類α3之α1及α2域、跨膜及細胞質H2-Kb域組成的嵌合I類MHC分子(Vitiello等人, 1991)。該嵌合分子允許HLA-A*02:01限制性抗原呈現，同時維持CD8輔助受體與MHC上之α3域的物種相配之相互作用。 對於短卡匣，如藉由IFN-γ ELISPOT所測定，所有標記物抗原決定基產生劇烈T細胞反應，其程度比通常所報導之程度強約10-50倍(Cornet等人, 2006；Depla等人, 2008；Ishioka等人, 1999)。在評價的所有連接子中，各自含有藉由天然胺基酸序列側接之極小抗原決定基的25聚體序列多聯體產生最大且最廣泛之T細胞反應(表5)。細胞內細胞因子染色(ICS)及流式細胞測量術分析揭示，抗原特異性T細胞反應係源自於CD8 T細胞。表 5 ： 短卡匣中連接子序列之活體內評價。ELISPOT資料指示，HLA-A2轉殖基因小鼠在用1e11腺病毒病毒粒子感染後17天，針對卡匣中之所有I類MHC限制性抗原決定基產生T細胞反應。 在另一實例中，構築一系列長疫苗卡匣並將其併入腺病毒載體中，其緊鄰著原始的5個標記物抗原決定基含有另外16個具有已知CD8 T細胞反應性之HLA-A*02:01、A*03:01及B*44:05抗原決定基(圖19A、B)。該等長卡匣之尺寸近似地模仿最終臨床卡匣設計，且僅抗原決定基相對於彼此之位置係不同的。對於長疫苗卡匣與短疫苗卡匣，CD8 T細胞反應在量值及廣度方面係相當的，證實(a)添加更多抗原決定基不會影響針對原始抗原決定基集合之免疫反應的量值，及(b)抗原決定基在卡匣中之位置不影響隨之而來的針對其之T細胞反應(表6)。表 6 ： 有關長卡匣中抗原決定基位置之影響的活體內評價。ELISPOT指示，對於長疫苗卡匣與短疫苗卡匣，HLA-A2轉殖基因小鼠在用5e10腺病毒病毒粒子感染後17天，產生之T細胞反應的量值相當。 * 疑似技術失誤引起T細胞反應之缺乏。XIV.B.4. 用於免疫原性及毒理學研究之新抗原卡匣設計 總體而言，有關模型卡匣評價之發現(圖16-19，表2-6)證實，對於模型疫苗卡匣，當採用「串珠(string of beads)」法在基於腺病毒之載體的背景下編碼約20個抗原決定基時，實現最佳免疫原性。抗原決定基最佳藉由串接25聚體序列組裝，該等序列各自嵌入在兩側上藉由其天然、周圍肽序列(例如在每一側上之8個胺基酸殘基)側接的極小CD8 T細胞抗原決定基(例如9個胺基酸殘基)。如本文所用，「天然」或「原生」側接序列係指給定抗原決定基在該抗原決定基處於其源蛋白質內之天然存在環境中的N及/或C末端側接序列。舉例而言，HCMV pp65 MHC I抗原決定基NLVPMVATV係藉由原生5'序列WQAGILAR側接於其5'端上且藉由原生3'序列QGQNLKYQ側接於其3'端上，由此產生在HCMV pp65源蛋白質內發現的25聚體肽WQAGILARNLVPMVATVQGQNLKYQ。天然或原生序列亦可指編碼藉由原生側接序列側接之抗原決定基的核苷酸序列。每個25聚體序列係直接連接至隨後之25聚體序列。在極小CD8 T細胞抗原決定基係大於或小於9個胺基酸之實例中，側接肽長度可以經調整以使得總長度仍為25聚體肽序列。舉例而言，10個胺基酸之CD8 T細胞抗原決定基可以藉由8個胺基酸之序列及7個胺基酸側接。多聯體之後為兩個通用的II類MHC抗原決定基，包括該等抗原決定基係為了刺激CD4 T輔助細胞及改善疫苗卡匣抗原之總體活體內免疫原性。(Alexander等人, 1994；Panina-Bordignon等人, 1989) II類抗原決定基係藉由GPGPG胺基酸連接子(SEQ ID NO:56)連接至最終I類抗原決定基。該兩個II類抗原決定基亦藉由GPGPG胺基酸連接子彼此連接且藉由GPGPG胺基酸連接子側接於C末端上。經證明，抗原決定基之位置及數量基本上不影響T細胞識別或反應。靶向序列看起來亦基本上不影響卡匣源性抗原之免疫原性。 作為另一實例，基於用模型卡匣獲得的活體外及活體內資料(圖16-19，表2-6)，產生交替已知在非人類靈長類動物(NHP)、小鼠及人類中具有免疫原性的明確表徵之T細胞抗原決定基的卡匣設計。該全部嵌入天然25聚體序列中的20個抗原決定基之後係存在於所評價的所有模型卡匣中之兩個通用II類MHC抗原決定基(圖20)。使用此卡匣設計在多個物種中研究免疫原性以及藥理學及毒理學研究。XV. ChAd 新抗原卡匣遞送載體 XV.A. ChAd 新抗原卡匣遞送載體之構築 在一個實例中，將黑猩猩腺病毒(ChAd)工程改造成用於新抗原卡匣之遞送載體。在另一實例中，基於缺失E1(nt 457至3014)及E3(nt 27,816-31,332)序列的AC_000011.1(來自專利US 6083716之序列2)合成全長ChAdV68載體。插入處於CMV啟動子/強化子控制下的報導基因代替缺失之E1序列。將此純系轉染至HEK293細胞中不會產生感染性病毒。為了確定野生型C68病毒之序列，自ATCC獲得分離株VR-594，傳代，且接著獨立地測序(SEQ ID NO: 10)。當將AC_000011.1序列與野生型ChAdV68病毒之ATCC VR-594序列(SEQ ID NO: 10)相比較時，鑑別出6個核苷酸差異。在一個實例中，基於相應ATCC VR-594核苷酸在五個位置處經取代之AC_000011.1產生經修飾之ChAdV68載體(ChAdV68.5WTnt SEQ ID NO: 1)。 在另一實例中，基於缺失E1(nt 577至3403)及E3(nt 27,816-31,332)序列且相應ATCC VR-594核苷酸在四個位置經取代之AC_000011.1產生經修飾之ChAdV68載體。插入處於CMV啟動子/強化子控制下之GFP報導體(ChAdV68.4WTnt.GFP；SEQ ID NO: 11)或模型新抗原卡匣(ChAdV68.4WTnt.MAG25mer；SEQ ID NO: 12)代替缺失之E1序列。 在另一實例中，基於缺失E1(nt 577至3403)及E3(nt 27,125-31,825)序列且相應ATCC VR-594核苷酸在五個位置經取代之AC_000011.1產生經修飾之ChAdV68載體。插入處於CMV啟動子/強化子控制下之GFP報導體(ChAdV68.5WTnt.GFP；SEQ ID NO: 13)或模型新抗原卡匣(ChAdV68.5WTnt.MAG25mer；SEQ ID NO: 2)代替缺失之E1序列。 XV.B. ChAd 新抗原卡匣遞送載體測試 XV.B.1. ChAd 載體評價之方法及材料 使用脂染胺轉染 HEK293A 細胞 使用以下方案，製備ChAdV68構築體(ChAdV68.4WTnt.GFP、ChAdV68.5WTnt.GFP、ChAdV68.4WTnt.MAG25mer及ChAdV68.5WTnt.MAG25mer)之DNA並將其轉染至HEK293A細胞中。 用PacI消化10 μg 質體DNA以釋放病毒基因組。接著，根據製造商的說明書，對於較長DNA片段，使用GeneJet DNA淨化微型管柱(DNA cleanup Micro columns；Thermo Fisher)純化DNA，且在20μl預熱之水中溶離；在溶離步驟之前，使管柱在37度下保持0.5-1小時。 在轉染之前，將HEK293A以106 個細胞/孔之細胞密度引入6孔培養盤中，保持14-18小時。用每孔1 ml新鮮培養基(含青黴素/鏈黴素及麩胺酸之DMEM-10% hiFBS)覆蓋細胞。在根據製造商的方案，用微升體積(2-4 μl)脂染胺2000兩次轉染中使用每孔1-2 μg之純化DNA。將0.5 ml含有轉染混合物之OPTI-MEM培養基添加至各孔中之1 ml標準生長培養基中並在細胞上保持隔夜。 在37℃下培育經轉染之細胞培養物至少5-7天。若在轉染後第7天未見到病毒蝕斑，則將細胞以1:4或1:6分離，並在37℃下培育以監測蝕斑之產生。或者，收集經轉染之細胞且進行3個循環的冷凍及解凍，並使用細胞溶解產物感染HEK293A細胞且培育細胞直至觀察到病毒蝕斑。使用磷酸鈣將 ChAdV68 轉染至 HEK293A 細胞中並產生第三代病毒原液 使用以下方案，製備ChAdV68構築體(ChAdV68.4WTnt.GFP、ChAdV 68.5WTnt.GFP、ChAdV68.4WTnt.MAG25mer、ChAdV68.5WTnt.MAG25 mer)之DNA並將其轉染至HEK293A細胞中。 在轉染前一天，將HEK293A細胞以106 個細胞/孔接種於6孔盤之5% BS/DMEM/1XP/S、1XGlutamax中。每次轉染需要兩個孔。在轉染前二至四小時，將培養基更換成新鮮培養基。用PacI使ChAdV68.4WTnt.GFP質體線性化。接著，用酚氯仿提取經線性化之DNA並使用十分之一體積之3M乙酸鈉pH 5.3及兩體積之100%乙醇使其沈澱。藉由以12,000xg離心5分鐘使沈澱之DNA集結，隨後用70%乙醇洗1次。空氣乾燥集結粒並使其再懸浮於50 µL無菌水中。使用NanoDropTM (ThermoFisher)測定DNA濃度並將體積調整至5 µg DNA/50 µL。 將169 µL無菌水添加至微量離心管中。接著將5 µL 2M CaCl2 添加至水中並藉由移液管移液徐緩地混合。將50 µL DNA逐滴添加至CaCl2 水溶液中。接著添加二十六微升2M CaCl2 並藉由微量移液管移液兩次徐緩地混合。此最終溶液應由5 µg DNA於250 µL之0.25M CaCl2 中組成。接著製備含有250 µL之2XHBS(Hepes緩衝溶液)之第二管。使用連接至Pipet-Aid空氣之2 mL無菌移液管緩慢鼓泡通過2XHBS溶液。同時，逐滴添加於0.25M CaCl2 溶液中之DNA溶液。在添加最終DNA液滴之後，繼續鼓泡約5秒。接著在室溫培育溶液達20分鐘，隨後添加至293A細胞中。將250 µL DNA/磷酸鈣溶液逐滴添加至前一天以106 個細胞/孔接種於6孔盤中的293A細胞單層中。將細胞放回恆溫箱中並培育隔夜。24小時後更換培養基。72小時後，將細胞以1:6分至6孔盤中。每天藉由光學顯微鏡檢查監測細胞單層之細胞病變效應(CPE)之跡象。轉染後7-10天，觀察到病毒蝕斑且藉由用移液管吸移孔中之培養基以使細胞升高來收集細胞單層。將收集之細胞及培養基轉移至50 mL離心管中，隨後進行三輪冷凍解凍(在-80℃及37℃)。隨後之溶解產物，稱為初代病毒原液，藉由在桌上型(bench top)離心機(4300Xg)上全速離心來澄清且使用一部分溶解產物(10-50%)感染T25燒瓶中之293A細胞。將感染之細胞培育48小時，隨後在完全CPE下收集細胞及培養基。再次收集細胞，冷凍解凍並澄清，隨後使用此第二代病毒原液感染每個燒瓶接種1.5×107 個細胞之T150燒瓶。在72小時實現完全CPE之時，以先前病毒原液相同之方式收集並處理培養基及細胞以產生第三代原液。在 293F 細胞中之製造 在8% CO2 之恆溫箱中，在293 FreeStyleTM (ThermoFisher)培養基中生長之293F細胞中進行ChAdV68病毒之製造。感染當天，將細胞稀釋至106 個細胞/毫升，且具有98%活力，並在每個製造操作於1L搖瓶(Corning)中使用400 mL。每次感染使用靶MOI ＞3.3之4 mL第三代病毒原液。將細胞培育48-72小時，直至藉由錐蟲藍量測到活力＜70%。接著，藉由全速桌上型離心機離心來收集及經感染細胞並在1×PBS中洗滌，再離心，且接著使其再懸浮於20 mL之10mM Tris pH7.4中。藉由冷凍解凍3次將細胞集結粒溶解並藉由以4,300Xg離心5分鐘使其澄清。藉由 CsCl 離心純化 藉由CsCl離心使病毒DNA純化。執行兩次不連續梯度操作。第一次係自細胞組分中純化出病毒且第二次係自細胞組分進一步優化分離並將缺陷性粒子與感染性粒子分離。 將10 mL之1.2(26.8g CsCl溶解於92 mL之10 mM Tris pH 8.0中)CsCl添加至異質同晶聚合物管中。接著，使用移液管遞送至管底部，小心地添加8 mL之1.4 CsCl(53g CsCl溶解於87 mL之10 mM Tris pH 8.0中)。將澄清之病毒小心地鋪在該1.2層之頂部上。必要時，再添加10 mM Tris以使各管平衡。接著將該等管置放於SW-32Ti旋轉器中並在10℃下離心2小時30分鐘。接著將該管移至層流櫃中並使用18號針及10 mL注射器抽吸病毒帶。應避免取出污染性宿主細胞DNA及蛋白質。接著用10 mM Tris pH 8.0將該病毒帶稀釋至少2倍並如前所述鋪在如上文所描述之不連續梯度上。如前所述進行操作，不過，此時進行該操作隔夜。次日，小心抽吸病毒帶以避免抽吸出任何缺陷性粒子帶。接著使用Slide -A-LyzerTM 盒(Pierce)針對ARM緩衝液(20 mM Tris pH 8.0、25 mM NaCl、2.5%丙三醇)透析病毒。進行此操作3次，每次更換緩衝液保持1小時。接著將病毒等分以在-80℃下儲存。病毒分析 基於1.1×1012 個病毒粒子(VP)之消光係數相當於在OD260 nm下之吸光度值1，藉由使用OD 260分析測定VP濃度。在病毒溶解緩衝液(0.1% SDS、10 mM Tris pH 7.4、1 mM EDTA)中製備腺病毒之兩種稀釋液(1:5及1:10)。一式兩份量測該兩種稀釋液之OD且藉由用OD260值乘以稀釋因子乘以1.1× 1012 VP來量測每毫升VP濃度。 利用病毒原液之限制性稀釋分析來計算感染單位(IU)力價。病毒起初在DMEM/5%NS/1× PS中100倍稀釋且接著，使用10倍稀釋法稀釋至1×10-7 。接著，將100 µL該等稀釋液添加至在之前至少一小時以3e5個細胞/孔接種於24孔盤中之293A細胞中。此操作係一式兩份進行。37℃下，在CO2(5%)恆溫箱中培育盤48小時。接著用1×PBS洗滌細胞，且接著用100%冷甲醇(-20℃)固定。接著在-20℃培育該等盤最少20分鐘。用1×PBS洗滌各孔，接著在室溫下，在1×PBS/0.1% BSA中阻斷1小時。添加兔抗Ad抗體(Abcam, Cambridge, MA)於阻斷緩衝液中之1:8,000稀釋液(每孔0.25 ml)並在室溫下培育1小時。用每孔0.5 mL PBS洗滌各孔4次。每孔添加1000倍稀釋的HRP偶聯之山羊抗兔抗體(Bethyl Labs, Montgomery Texas)並培育1小時，隨後進行最後一輪洗滌。進行5次PBS洗滌並使用於含0.01% H2 O2 之Tris緩衝生理食鹽水中的二胺基聯苯胺四鹽酸鹽(Diaminobenzidine tetrahydrochloride，DAB)受質(0.67 mg/mL DAB於50 mM Tris pH 7.5、150 mM NaCl)使該等盤顯色。使各孔顯色5分鐘，隨後計數。使用產生每個視野4-40個經染色細胞之稀釋液，在10×下對細胞計數。所用視野係0.32 mm2 柵格，相當於在24孔盤上每個視野有625個柵格。可以藉由每個柵格中經染色細胞之數量乘以每個視野之柵格數量乘以稀釋因子10測定每毫升中感染性病毒之數量。類似地，當用GFP表現性細胞操作時，可以使用螢光而非衣殼染色來測定每毫升中GFP表現性病毒粒子之數量。免疫接種 經兩側肌肉內注射向C57BL/6J雌性小鼠及Balb/c雌性小鼠注射1×108 個ChAdV68.5WTnt.MAG25mer病毒粒子(VP)，體積為100μL(每條腿50 μL)。脾細胞解離 將每隻小鼠之脾及淋巴結匯集於3 mL完全RPMI(RPMI、10% FBS、青黴素/鏈黴素)中。使用gentleMACS解離器(Miltenyi Biotec)，遵循製造商的方案進行機械解離。經由40微米過濾器過濾解離之細胞並用ACK溶解緩衝液(150mM NH4 Cl、10mM KHCO3 、0.1mM Na2 EDTA)溶解紅細胞。再次經由30微米過濾器過濾細胞且接著使其再懸浮於完全RPMI中。在Attune NxT流式細胞儀(Thermo Fisher)上使用碘化丙錠染色對細胞計數以排除死亡及凋亡之細胞。接著將細胞調整至適當活細胞濃度以供隨後分析。離體酶聯免疫斑點 (ELISPOT) 分析 ELISPOT分析係根據ELISPOT統一準則{DOI: 10.1038/nprot.2015.068}，利用小鼠IFNg ELISpotPLUS套組(MABTECH)進行。將5×104 個脾細胞與10 μM指定肽一起在塗有IFNg抗體之96孔盤中培育16小時。使用鹼性磷酸酶使斑點顯色。對反應定時10分鐘並藉由用自來水流過盤終止反應。使用AID vSpot讀取器譜圖對斑點計數。對於ELISPOT分析，將飽和度＞50%之孔記錄為「太多而無法計數」。將複製孔之偏差＞10%的樣品自分析中排除。接著，使用下式，針對孔匯合校正斑點計數：斑點計數+2 ×(斑點計數×%匯合/[100%-%匯合])。藉由用抗原刺激之孔減去陰性肽刺激孔中之斑點計數來校正陰性背景。最後，將標記為太多而無法計數之孔設定成最高觀察校正值，四捨五入至最接近之百分數。XV.B.2. 在 DNA 轉染之後 ChAdV68 病毒遞送粒子之製造 在一個實例中，將ChAdV68.4WTnt.GFP(圖21)及ChAdV68.5WTnt.GFP(圖22)DNA轉染至HEK293A細胞中並在轉染之後7-10天觀察病毒複製(病毒蝕斑)。使用光學顯微鏡檢查(圖21A及22A)及螢光顯微鏡檢查(圖21B-C及圖22B-C)觀測ChAdV68病毒蝕斑。GFP表示產毒ChAdV68病毒遞送粒子之產生。XV.B.3. ChAdV68 病毒遞送粒子擴增 在一個實例中，使ChAdV68.4WTnt.GFP、ChAdV68.5WTnt.GFP及ChAdV68.5WTnt.MAG25mer在HEK293F細胞中擴增並在轉染之後18天，製備純化之病毒原液(圖23)。定量經純化ChAdV68病毒原液中之病毒粒子數且與使用相同方案製造的5型腺病毒(Ad5)及ChAdVY25(密切相關之ChAdV；Dicks, 2012, PloS ONE 7, e40385)病毒原液相比較。ChAdV68病毒力價與Ad5及ChAdVY25相當(表7)。表 7. 在293F懸浮細胞中產生腺病毒載體 * SD僅在執行多個製造操作情況下報導XV.B.4. 評價在腫瘤模型中之免疫原性 在小鼠免疫原性研究中評價表現小鼠腫瘤抗原之C68載體以證實C68載體引起T細胞反應。在C57BL/6J雌性小鼠中量測針對I類MHC抗原決定基SIINFEKL之T細胞反應並在Balb/c小鼠中量測針對I類MHC抗原決定基AH1-A5(Slansky等人, 2000, Immunity13:529-538)之T細胞反應。如圖29中所示，在對小鼠免疫接種ChAdV68.5WTnt.MAG25mer之後量測到較強T細胞反應。當對C57BL/6J或Balb/c小鼠免疫接種ChAdV68.5WTnt.MAG25mer時，在免疫接種之後10天，在ELISpot分析中分別觀察到每106 個脾細胞8957個或4019個斑點形成細胞(SFC)之平均細胞免疫反應。XVI. α 病毒新抗原卡匣遞送載體 XVI.A. α 病毒遞送載體評價之材料及方法 活體外轉錄以產生 RNA 對於活體外測試 ： 藉由用PmeI限制性消化使質體DNA線性化，遵循製造商的方案(GeneJet DNA淨化套組, Thermo)進行管柱純化並用作模板。根據製造商的方案，使用RiboMAX大規模RNA生產系統(Promega)，利用m7 G帽類似物(Promega)進行活體外轉錄。根據製造商的方案，使用RNeasy套組(Qiagen)純化mRNA。 對於活體內研究 ： 產生RNA且由TriLInk Biotechnologies純化並用Enzymatic Cap1封端。RNA 轉染 轉染前約16小時，HEK293A細胞對於96孔係以6e4個細胞/孔接種且對於24孔係以2e5個細胞/孔接種。使用MessengerMAX脂染胺(Invitrogen)且遵循製造商的方案，用mRNA轉染細胞。對於96孔，每孔使用0.15 μL脂染胺及10 ng mRNA，且對於24孔，每孔使用0.75 μL脂染胺及150 ng mRNA。GFP表現mRNA(TriLink Biotechnologies)用作轉染對照。螢光素酶分析 使用ONE-Glo螢光素酶分析(Promega)，遵循製造商的方案，在每種條件下於白色壁96孔盤中一式三份進行螢光素酶報導體分析。使用SpectraMax量測發光。qRT-PCR 在轉染後2小時，用新鮮培養基沖洗經轉染之細胞並更換培養基以移除任何未經轉染之mRNA。接著，在各種時間點，將細胞收集於RLT plus溶解緩衝液(Qiagen)中，使用QiaShredder(Qiagen)均質化並使用RNeasy套組(Qiagen)提取RNA，所有操作均遵循製造商的方案。使用Nanodrop(Thermo Scientific)定量總RNA。根據製造商的方案，在qTower3 (Analytik Jena)上使用Quantitect探針一步法RT-PCR套組(Probe One-Step RT-PCR kit；Qiagen)進行qRT-PCR，每一反應使用20 ng 總RNA。對於每個探針，各樣品係一式三份地操作。肌動蛋白或GusB用作參考基因。定製引子/探針係由IDT產生(表8)。表 8. qPCR引子/探針 B16-OVA 腫瘤模型 在C57BL/6J小鼠左下方側腹部中注射105 個B16-OVA細胞/動物。在免疫接種之前，使腫瘤生長3天。CT26 腫瘤模型 在Balb/c小鼠左下方側腹部中注射106 個CT26細胞/動物。在免疫接種之前，使腫瘤生長7天。免疫接種 對於srRNA疫苗，經兩側肌肉內注射向小鼠注射10 μg RNA，體積100 μL(每條腿50 μL)。對於Ad5疫苗，經兩側肌肉內注射向小鼠注射5×1010 個病毒粒子(VP)，體積100 μL(每條腿50 μL)。每週2次，經由腹膜內注射向動物注射250 μg劑量的抗CTLA-4(純系9D9, BioXcell)、抗PD-1(純系RMP1-14, BioXcell)或抗IgG(純系MPC-11, BioXcell)。活體內生物發光成像 在每個時間點，經由腹膜內注射向小鼠注射150 mg/kg螢光素受質並在注射之後10-15分鐘，使用IVIS活體內成像系統(PerkinElmer)量測生物發光。脾細胞解離 將每隻小鼠之脾及淋巴結匯集於3 mL完全RPMI(RPMI、10% FBS、青黴素/鏈黴素)中。使用gentleMACS解離器(Miltenyi Biotec)，遵循製造商的方案進行機械解離。經由40微米過濾器過濾解離之細胞並用ACK溶解緩衝液(150mM NH4 Cl、10mM KHCO3 、0.1mM Na2 EDTA)溶解紅細胞。再次經由30微米過濾器過濾細胞且接著使其再懸浮於完全RPMI中。在Attune NxT流式細胞儀(Thermo Fisher)上使用碘化丙錠染色對細胞計數以排除死亡及凋亡之細胞。接著將細胞調整至適當活細胞濃度以供隨後分析。離體酶聯免疫斑點 (ELISPOT) 分析 ELISPOT分析係根據ELISPOT統一準則{DOI: 10.1038/nprot.2015.068}，利用小鼠IFNg ELISpotPLUS套組(MABTECH)進行。將5×104 個脾細胞與10 μM指定肽一起在塗有IFNg抗體之96孔盤中培育16小時。使用鹼性磷酸酶使斑點顯色。對反應定時10分鐘並藉由用自來水流過盤終止反應。使用AID vSpot讀取器譜圖對斑點計數。對於ELISPOT分析，將飽和度＞50%之孔記錄為「太多而無法計數」。將複製孔之偏差＞10%的樣品自分析中排除。接著，使用下式，針對孔匯合校正斑點計數：斑點計數+2 ×(斑點計數×%匯合/[100%-%匯合])。藉由用抗原刺激之孔減去陰性肽刺激孔中之斑點計數來校正陰性背景。最後，將標記為太多而無法計數之孔設定成最高觀察校正值，四捨五入至最接近之百分數。XVI.B. α 病毒載體 XVI.B.1. α 病毒載體活體外評價 在本發明之一個實施方案中，由基於委內瑞拉馬腦炎(Venezuelan Equine Encephalitis，VEE)(Kinney, 1986, Virology 152: 400-413)之自我複製RNA(srRNA)載體產生用於新抗原表現系統之RNA α病毒主鏈。在一個實例中，編碼位於26S亞基因組啟動子3'端的VEE結構蛋白之序列缺失(VEE序列7544至11,175缺失；編號基於Kinney等人1986；SEQ ID NO: 6)且經抗原序列(SEQ ID NO:14及SEQ ID NO: 4)或螢光素酶報導體(例如VEE-螢光素酶，SEQ ID NO: 15)替換(圖24)。由srRNA DNA載體活體外轉錄RNA，將其轉染至HEK293A細胞中並量測螢光素酶報導體表現。此外，用編碼螢光素酶之(非複製性)mRNA轉染以供比較。當比較23小時量測值與2小時量測值時，對於VEE-螢光素酶srRNA觀察到srRNA報導體信號有約30,000倍增加(表9)。相比之下，在相同時間段內，mRNA報導體展現＜10倍之信號增加(表9)。表 9 . 來自VEE自我複製載體之螢光素酶的表現隨時間增加。在96孔中用每孔10 ngVEE-螢光素酶srRNA或10 ng非複製性螢光素酶mRNA(TriLink L-6307)轉染HEK293A細胞。在轉染倍各種時間量測發光。螢光素酶表現係以相對發光單位(RLU)報導。每個資料點係3個轉染孔之平均值+/-SD。 在另一實例中，藉由使用定量逆轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)量測編碼螢光素酶之srRNA(VEE-螢光素酶)或編碼多抗原決定基卡匣之srRNA(VEE-MAG25mer)轉染之後的RNA含量來直接確定srRNA之複製。對於VEE-螢光素酶srRNA觀察到約150倍的RNA增加(表10)，而對於VEE-MAG25mer srRNA觀察到30-50倍的RNA增加(表11)。該等資料證實，當轉染至細胞中時，VEE srRNA載體複製。表 10. VEE-螢光素酶srRNA轉染之細胞中RNA複製的直接量測。用VEE-螢光素酶srRNA(150 ng/孔，24孔)轉染HEK293A細胞並在轉染之後各種時間，藉由qRT-PCR定量RNA含量。基於肌動蛋白參考基因使各量測值標準化並呈現相對於2小時時間點之倍數變化。 表 11 . VEE-MAG25mer srRNA轉染之細胞中RNA複製的直接量測。用VEE-MAG25mer srRNA(150 ng/孔，24孔)轉染HEK293細胞並在轉染之後各種時間，藉由qRT-PCR定量RNA含量。基於GusB參考基因使各量測值標準化並呈現相對於2小時時間點之倍數變化。圖上的不同線表示2個不同的qPCR引子/探針集，該兩個集合均偵測srRNA之抗原決定基卡匣區。 XVI.B.2. α 病毒載體之活體內評價 在另一實例中，在活體內評價VEE-螢光素酶報導體表現。對小鼠注射10 μg封裝於脂質奈米粒子(MC3)中之VEE-螢光素酶srRNA並在注射後24小時及48小時，以及7天及14天使其成像以測定生物發光信號。在注射後24小時偵測到螢光素酶信號且其隨時間增加，並在srRNA注射之後7天出現峰值(圖25)。XVI.B.3. α 病毒載體腫瘤模型評價 在一個實施方案中，為了確定VEE srRNA載體在活體內引導抗原特異性免疫反應，產生表現2種不同I類MHC小鼠腫瘤抗原決定基SIINFEKL及AH1-A5之VEE srRNA載體(VEE-UbAAY，SEQ ID NO: 14)(Slansky等人, 2000, Immunity 13:529-538)。利用B16-OVA黑素瘤細胞株表現SFL(SIINFEKL)抗原決定基，且AH1-A5(SPSYAYHQF；Slansky等人, 2000, Immunity)抗原決定基誘導T細胞靶向由CT26結腸癌細胞株表現之相關抗原決定基(AH1/SPSYVYHQF；Huang等人, 1996, Proc Natl Acad Sci USA 93:9730-9735)。在一個實例中，對於活體內研究，藉由使用T7聚合酶(TriLink Biotechnologies)活體外轉錄來產生VEE-UbAAY srRNA並將其封裝於脂質奈米粒子(MC3)中。 在用MC3調配之VEE-UbAAY srRNA免疫接種帶有B16-OVA腫瘤之小鼠之後兩週，觀察到靶向SFL的強烈抗原特異性T細胞反應。在一個實例中，在用SFL肽刺激之後，在ELISpot分析中量測到每106 個脾細胞3835個(中值)斑點形成細胞(SFC) (圖26A，表12)並且如藉由五聚體染色所量測，1.8%(中值)之CD8 T細胞具有SFL抗原特異性(圖26B，表12)。在另一實例中，共投與抗CTLA-4單株抗體(mAb)及VEE srRNA疫苗引起總體T細胞反應之中度增加，且在ELISpot分析中量測到每106 個脾細胞的4794.5個(中值)SFC (圖26A，表12)。表 12 . 在帶有B16-OVA腫瘤之C57BL/6J小鼠中VEE srRNA免疫接種後14天ELISPOT及MHCI-五聚體染色分析之結果。 *應注意 ， 自 Vax 組中小鼠 #6 得到的結果由於三個重複孔之間變化較大而自分析排除。 在另一實施方案中，為反映臨床方法，在B16-OVA及CT26小鼠腫瘤模型中進行異源初免/追加免疫，其中帶有腫瘤之小鼠先用表現相同抗原卡匣之腺病毒載體(Ad5-UbAAY)免疫接種，隨後在Ad5-UbAAY初免之後14天，用VEE-UbAAY srRNA疫苗追加免疫。在一個實例中，藉由Ad5-UbAAY疫苗誘導抗原特異性免疫反應，由此在ELISpot分析中量測到每106 個脾細胞7330個(中值)SFC(圖27A，表13)且藉由五聚體染色量測到2.9%(中值)之CD8 T細胞靶向SFL抗原(圖27C，表13)。在另一實例中，在VEE-UbAAY srRNA追加免疫之後2週，B16-OVA模型中仍維持T細胞反應，且在ELISpot分析中量測到每106 個脾細胞3960個(中值)SFL特異性SFC(圖27B，表13)且藉由五聚體染色量測到3.1%(中值)之CD8 T細胞靶向SFL抗原(圖27D，表13)。表 13 . 用Ad5疫苗初免及srRNA追加免疫進行異源初免/追加免疫之後B16-OVA小鼠之免疫監測。 在另一實施方案中，在Ad5-UbAAY初免及VEE-UbAAY srRNA追加免疫之後，在CT26小鼠模型中觀察到類似結果。在一個實例中，在Ad5-UbAAY初免(第14天)之後觀察到AH1抗原特異性反應且在ELISpot分析中量測到每106 個脾細胞平均5187個SFC(圖28A，表14)且在VEE-UbAAY srRNA追加免疫(第28天)之後於ELISpot分析中量測到每106 個脾細胞平均3799個SFC(圖28B，表14)。表 14 . 在CT26腫瘤小鼠模型中異源初免/追加免疫之後的免疫監測。 XVII. ChAdV/srRNA 組合腫瘤模型評價 在鼠類CT26腫瘤模型中評價使用ChAdV68及自我複製RNA(srRNA)之各種給藥方案。XVII.A ChAdV/srRNA 組合腫瘤模型評價之方法及材料 腫瘤注射 對Balb/c小鼠注射CT26腫瘤細胞株。腫瘤細胞注射之後7天，將小鼠隨機分成不同研究組(28-40隻小鼠/組)並開始治療。在Balb/c小鼠左下方側腹部中注射106 個CT26細胞/動物。在免疫接種之前，使腫瘤生長7天。研究組詳細地描述於表15中。 表15 - ChAdV/srRNA組合腫瘤模型評價研究組 免疫接種 對於srRNA疫苗，經兩側肌肉內注射對小鼠注射10 μg VEE-MAG25mer srRNA，體積100 μL(每條腿50 μL)。對於C68疫苗，經兩側肌肉內注射對小鼠注射1×1011 個ChAdV68.5WTnt.MAG25mer病毒粒子(VP)，體積100 μL(每條腿50 μL)。每週2次，經由腹膜內注射對動物注射250 μg劑量的抗PD-1(純系RMP1-14，BioXcell)或抗IgG(純系MPC-11，BioXcell)。脾細胞解離 將每隻小鼠之脾及淋巴結匯集於3 mL完全RPMI(RPMI、10% FBS、青黴素/鏈黴素)中。使用gentleMACS解離器(Miltenyi Biotec)，遵循製造商的方案進行機械解離。經由40微米過濾器過濾解離之細胞並用ACK溶解緩衝液(150mM NH4 Cl、10mM KHCO3 、0.1mM Na2 EDTA)溶解紅細胞。再次經由30微米過濾器過濾細胞且接著使其再懸浮於完全RPMI中。在Attune NxT流式細胞儀(Thermo Fisher)上使用碘化丙錠染色對細胞計數以排除死亡及凋亡之細胞。接著將細胞調整至適當活細胞濃度以供隨後分析。離體酶聯免疫斑點 (ELISPOT) 分析 ELISPOT分析係根據ELISPOT統一準則{DOI: 10.1038/nprot.2015.068}，利用小鼠IFNg ELISpotPLUS套組(MABTECH)進行。將5×104 個脾細胞與10 μM指定肽一起在塗有IFNg抗體之96孔盤中培育16小時。使用鹼性磷酸酶使斑點顯色。對反應定時10分鐘並藉由用自來水流過盤終止反應。使用AID vSpot讀取器譜圖對斑點計數。對於ELISPOT分析，將飽和度＞50%之孔記錄為「太多而無法計數」。將複製孔之偏差＞10%的樣品自分析中排除。接著，使用下式，針對孔匯合校正斑點計數：斑點計數+2 ×(斑點計數×%匯合/[100%-%匯合])。藉由用抗原刺激之孔減去陰性肽刺激孔中之斑點計數來校正陰性背景。最後，將標記為太多而無法計數之孔設定成最高觀察校正值，四捨五入至最接近之百分數。XVII.B 在 CT26 腫瘤模型中 ChAdV/srRNA 組合之評價 在CT26小鼠腫瘤模型中評價ChAdV68.5WTnt.MAG25mer/ VEE-MAG25mer srRNA異源初免/追加免疫或VEE-MAG25mer srRNA同源初免/追加免疫疫苗之免疫原性及功效。對Balb/c小鼠注射CT26腫瘤細胞株。注射腫瘤細胞之後7天，將小鼠隨機分成不同研究組並開始治療。研究組詳細地描述於表15中且較粗略地描述於表16中。 表16 - 初免/追加免疫研究組 在初始疫苗接種之後14天收集脾進行免疫監測。一週兩次獲取腫瘤及體重量測值並監測存活情況。在所有活性疫苗組中觀察到強烈的免疫反應。 在第一次免疫接種之後14天，在ELISpot分析中，在分別免疫接種ChAdV68.5WTnt.MAG25mer(ChAdV/第3組)、ChAdV68.5WTnt.MAG25mer+抗PD-1(ChAdV+PD-1/第4組)、VEE-MAG25mer srRNA(srRNA/第5組與第7組之組合之中值)或VEE-MAG25mer srRNA+抗PD-1(srRNA+PD-1/第6組與第8組之組合之中值)之小鼠中觀察到每106 個脾細胞10,630個、12,976個、3319個或3745個斑點形成細胞(SFC)之中值細胞免疫反應(圖30及表17)。相比之下，疫苗對照(第1組)或疫苗對照與抗PD-1之組合(第2組)分別展現每106 個脾細胞296個或285個SFC之中值細胞免疫反應。 表17 - 在CT26腫瘤模型中之細胞免疫反應 與ELISpot資料相符，在第一次免疫接種之後14天，免疫接種ChAdV68.5WTnt.MAG25mer(ChAdV/第3組)、ChAdV68.5WTnt.MAG25mer+抗PD-1(ChAdV+PD-1/第4組)、VEE-MAG25mer srRNA(srRNA/第5組與第7組之組合之中值)或VEE-MAG25mer srRNA+抗PD-1(srRNA+PD-1/第6組與第8組之組合之中值)之小鼠中分別有5.6%、7.8%、1.8%或1.9%之CD8 T細胞(中值)在細胞內細胞因子染色(ICS)分析中展現抗原特異性反應(圖31及表18)。免疫接種疫苗對照或疫苗對照與抗PD-1之組合的小鼠分別顯示0.2%及0.1%之抗原特異性CD8反應。 表18 - CT26腫瘤模型中之CD8 T細胞反應 在CT26結腸腫瘤模型中量測所有組之腫瘤生長情況，且到開始治療後21天(注射CT-26腫瘤細胞之後28天)，出現腫瘤生長。在開始治療後21天，基於較大腫瘤尺寸(＞2500 mm3 )處死小鼠；因此，僅呈現前21天以避免分析偏差。ChAdV68.5WTnt.MAG25mer初免/VEE-MAG25mer srRNA追加免疫(第3組)、ChAdV68.5WTnt.MAG25mer初免/VEE-MAG25mer srRNA追加免疫+抗PD-1(第4組)、VEE-MAG25mer srRNA初免/ChAdV68.5WTnt.MAG25mer追加免疫(第5組)、VEE-MAG25mer srRNA初免/ChAdV68.5WTnt.MAG25mer追加免疫+抗PD-1(第6組)、VEE-MAG25mer srRNA初免/VEE-MAG25mer srRNA追加免疫(第7組)及VEE-MAG25mer srRNA初免/VEE-MAG25mer srRNA追加免疫+抗PD-1(第8組)在21天時的平均腫瘤體積分別為1129、848、2142、1418、2198及1606 mm3 (圖32及表19)。疫苗對照疫苗對照與抗PD-1之組合的平均腫瘤體積分別為2361或2067 mm3 。基於該等資料，用ChAdV68.5WTnt.MAG25mer/VEE-MAG25mer srRNA(第3組)、ChAdV68.5WTnt.MAG25mer/VEE-MAG25mer srRNA+抗PD-1(第4組)、VEE-MAG25mer srRNA/ChAdV68.5WTnt.MAG25mer+抗PD-1(第6組)及VEE-MAG25mer srRNA/VEE-MAG25mer srRNA+抗PD-1(第8組)之疫苗治療在21天時引起腫瘤生長減慢，明顯不同於對照(第1組)。 表19 - 第21天量測之CT26模型之腫瘤尺寸 在CT-26腫瘤模型中，在開始治療後，監測存活情況35天(注射CT-26腫瘤細胞之後42天)。在小鼠疫苗接種4個測試組合之後，觀察到存活率提高。在疫苗接種之後，利用ChAdV68.5WTnt.MAG25mer初免/VEE-MAG25mer srRNA追加免疫與抗PD-1之組合(第4組；相對於對照組1，P＜0.0001)、VEE-MAG25mer srRNA初免/VEE-MAG25mer srRNA追加免疫與抗PD-1之組合(第8組；相對於對照組1，P=0.0006)、ChAdV68.5WTnt.MAG25mer初免/VEE-MAG25mer srRNA追加免疫(第3組；相對於對照組1，P=0.0003)及VEE-MAG25mer srRNA初免/ChAdV68.5WTnt.MAG25mer追加免疫與抗PD-1之組合(第6組；相對於對照組1，P=0.0016)之小鼠的存活率分別為64%、46%、41%及36%(圖33及表20)。其餘治療組[VEE-MAG25mer srRNA初免/ChAdV68.5WTnt.MAG25mer追加免疫(第5組)、VEE-MAG25mer srRNA初免/VEE-MAG25mer srRNA追加免疫(第7組)及單獨抗PD-1(第2組)]的存活率與對照組1無明顯不同(≤14%)。 表20 - CT26模型中之存活率 總之，ChAdV68.5WTnt.MAG25mer及VEE-MAG25mer srRNA引起針對由疫苗編碼之小鼠腫瘤抗原的強烈T細胞反應。向帶有腫瘤之小鼠投與ChAdV68.5WTnt.MAG25mer初免及VEE-MAG25mer srRNA追加免疫並且共投與或不共投與抗PD-1、投與VEE-MAG25mer srRNA初免及ChAdV68.5WTnt.MAG25mer追加免疫與抗PD-1之組合或投與VEE-MAG25mer srRNA同源初免追加免疫與抗PD-1之組合使存活率提高。XVIII. 非人類靈長類動物研究 在非人類靈長類動物(NHP)中評價使用ChAdV68及自我複製RNA(srRNA)之各種給藥方案。XVIII.A. 非人類靈長類動物研究之材料及方法 免疫接種 向各NHP中肌肉內注射初免疫苗以起始研究(疫苗初免)。對Mamu A01印度恆河猴兩側免疫接種1×1012 個ChAdV68.5WTnt.MAG25mer病毒粒子(每側注射5×1011 個病毒粒子)、30 μg VEE-MAG25MER srRNA、100 μg VEE-MAG25mer srRNA或300 μg以LNP-1或LNP調配之VEE-MAG25mer srRNA，在初始疫苗接種之後4週，經肌肉內投與2.30 μg、100 μg或300 μg VEE-MAG25mer srRNA疫苗追加免疫。在其他研究組中，在起初的初始疫苗接種之後8週，經肌肉內投與30 μg、100 μg或300 μg VEE-MAG25mer srRNA疫苗作為二次追加免疫。在疫苗免疫接種部位附近皮下投與或靜脈內遞送抗CTLA-4至指定組。根據表21及23中概述之組，投與每劑兩側注射液。免疫監測 在初始疫苗接種之後7、14、28或35天，使用淋巴細胞分離培養基(Lymphocyte Separation Medium，LSM；MP Biomedicals)及LeucoSep分離管(Greiner Bio-One)分離PBMC並使其再懸浮於含有10% FBS及青黴素/鏈黴素之RPMI中。在Attune NxT流式細胞儀(Thermo Fisher)上使用碘化丙錠染色對細胞計數以排除死亡及凋亡之細胞。接著將細胞調整至適當活細胞濃度以供隨後分析。對於研究中的每隻猴，使用ELISpot或流式細胞測量方法量測T細胞反應。藉由使用離體酶聯免疫斑點(ELISpot)分析量測諸如IFN-γ之細胞介素之誘導來監測PBMC中針對疫苗中編碼之6個不同恆河猴Mamu-A*01之I類抗原決定基之T細胞反應。ELISpot分析係根據ELISPOT統一準則{DOI: 10.1038/nprot.2015.068}，利用猴IFNg ELISpotPLUS套組(MABTECH)進行。將200,000個PBMC與10 μM指定肽一起在塗有IFNg抗體之96孔盤中培育16小時。使用鹼性磷酸酶使斑點顯色。對反應定時10分鐘並藉由用自來水流過盤終止反應。使用AID vSpot讀取器譜圖對斑點計數。對於ELISPOT分析，將飽和度＞50%之孔記錄為「太多而無法計數」。將複製孔之偏差＞10%的樣品自分析中排除。接著，使用下式，針對孔匯合校正斑點計數：斑點計數+2 ×(斑點計數×%匯合/[100%-%匯合])。藉由用抗原刺激之孔減去陰性肽刺激孔中之斑點計數來校正陰性背景。最後，將標記為太多而無法計數之孔設定成最高觀察校正值，四捨五入至最接近之百分數。 藉由使用流式細胞測量術量測諸如IFN-γ之細胞內細胞介素之誘導來監測PBMC中針對疫苗中編碼之6個不同恆河猴Mamu-A*01之I類抗原決定基的特異性CD4及CD8 T細胞反應。由兩種方法得到的結果指示，以抗原特異性方式誘導針對抗原決定基之細胞介素。XVIII.B. 在非人類靈長類動物中免疫原性之評價 ( 低及中等 srRNA 劑量 ) 本研究經設計以(a)評價ChAdV68.5WTnt.MAG25mer初始免疫接種隨後VEE-MAG25mer srRNA 100 µg劑量的異源初免/追加免疫組合之免疫原性及初步安全性；(b)評價針對ChAdV68.5WTnt.MAG25mer/VEE-MAG25mer srRNA初免/追加免疫組合之T細胞反應之動力學。此研究組係在mamu A01印度恆河猴中進行以便展示免疫原性。選擇用於本研究中之抗原僅在恆河猴中識別到，具體言之，係具有mamu A*01之I類MHC單倍型之抗原。將Mamu A01印度恆河猴隨機分成不同研究組(6隻獼猴/組)並經IM注射投與編碼包括多個mamu A01限制性抗原決定基之模型抗原的ChAdV68.5WTnt.MAG25mer或VEE-MAG25mer srRNA載體。該等研究組如表21中所描述。 本研究亦設計用於評價30 µg及100 µg劑量VEE-MAG25mer srRNA之同源初免/追加免疫的免疫原性、初步安全性及T細胞反應動力學並比較在使用LNP1與使用LNP2之脂質奈米粒子中VEE-MAG25mer srRNA之免疫反應。該等研究組係以與以上描述之ChAdV68/srRNA初免/追加免疫類似之方式進行。該等研究組如表21中所描述。 表21 - 低及中等srRNA劑量NHP免疫原性研究組 在免疫接種之前以及在初次免疫接種之後的前6週中每週收集PBMC進行免疫監測。此外，在初次免疫接種之後8週及10週，收集PBMC進行免疫監測。 在免疫接種之前以及在初次初始免疫接種ChAdV68.5WTnt.MAG25mer之後7、14、21、28或35天，量測外周血液單核細胞(PBMC)中針對六個不同的mamu A01限制性抗原決定基之抗原特異性細胞免疫反應。標繪在各免疫監測時間點下針對全部六個抗原決定基之組合免疫反應(圖34及表22)。在初次ChAdV68.5WTnt.MAG25mer初始免疫接種之後7、14、21或28天，觀察到組合抗原特異性免疫反應，其全部量測值分別為每106 個PBMC有1256個、1823個、1905個、987個SFC(組合之六個抗原決定基)。免疫反應顯示出預期之型態，其中在初始免疫接種之後7-14天量測到峰值免疫反應，隨後在28天之後免疫反應縮減。 另外，在用VEE-MAG25mer srRNA第一次追加免疫之後7天(亦即，初次免疫接種ChAdV68.5WTnt.MAG25mer之後35天)，量測到每106 個PBMC有1851個SFC的組合抗原特異性細胞免疫反應(組合之六個抗原決定基)。在用VEE-MAG25mer srRNA第一次追加免疫之後7天(第35天)量測的免疫反應與所量測的ChAdV68.5WTnt.MAG25mer初始免疫接種(第14天)之峰值免疫反應相當且比在ChAdV68.5WTnt.MAG25mer初始免疫接種之後28天量測的免疫反應高約2倍。 表22 - 利用低及中等量srRNA之細胞免疫反應 XVIII.C. 在非人類靈長類動物中免疫原性之評價 ( 高 srRNA 劑量及抗 CTLA4) 本研究係設計用於評價抗CTLA4之投與途徑對疫苗誘導之免疫反應的影響(例如，比較在緊密相鄰疫苗引流淋巴結處局部(SC)遞送抗CTLA4與全身(IV)投與)。此研究組係在mamu A01印度恆河猴中進行以展示免疫原性。在諸如恆河猴之非人類靈長類動物物種中之疫苗免疫原性係在人體中疫苗效力之最佳預測器。另外，選擇用於本研究中之抗原僅在恆河猴中識別到，具體言之，係具有mamu A*01之I類MHC單倍型之抗原。將Mamu A01印度恆河猴隨機成不同研究組(6隻獼猴/組)並經IM注射投與編碼包括多個mamu A01限制性抗原之模型抗原的ChAdV68.5WTnt.MAG25mer。在疫苗免疫接種部位附近皮下投與或靜脈內遞送抗CTLA-4至指定組。該等研究組如表23中所描述。 本研究亦設計用於(a)評價300 µg劑量VEE-MAG25mer srRNA之同源初免/追加免疫或異源初免/追加免疫與ChAdV68.5WTnt.MAG25mer之組合的免疫原性及初步安全性；(b)比較在使用300 µg劑量LNP1與LNP2之脂質奈米粒子中VEE-MAG25mer srRNA之免疫反應；及(c)評價針對VEE-MAG25mer srRNA及ChAdV68.5WTnt.MAG25mer免疫接種之T細胞反應的動力學。該等研究組係在mamu A01印度恆河猴中進行以便展示免疫原性。在諸如恆河猴之非人類靈長類動物物種中之疫苗免疫原性係在人體中疫苗效力之最佳預測器。另外，選擇用於本研究中之抗原僅在恆河猴中識別到，具體言之，係具有mamu A*01之I類MHC單倍型之抗原。將Mamu A01印度恆河猴隨機分成不同研究組(6隻獼猴/組)並經IM注射投與編碼包括多個mamu A01限制性抗原之模型抗原的ChAdV68.5WTnt.MAG25mer或VEE-MAG25mer srRNA。抗CTLA-4係在疫苗免疫接種部位附近皮下投與或靜脈內遞送至指定組。該等研究組如表23中所描述。 表23 - 高等srRNA劑量NHP免疫原性研究組 對Mamu A01印度恆河猴免疫接種ChAdV68.5WTnt.MAG25mer，並IV或SC投與或不投與抗CTLA-4。在初次免疫接種之後14天，量測外周血液單核細胞(PBMC)中針對六個不同的mamu A01限制性抗原決定基之抗原特異性細胞免疫反應且標繪針對全部六個抗原決定基之組合免疫反應(圖35及表24)。在用ChAdV68.5WTnt.MAG25mer、ChAdV68.5WTnt.MAG25mer及抗CTLA-4(IV)或ChAdV68.5WTnt.MAG25mer(SC)單次免疫接種之後，分別觀察到每106 個PBMC之2257個、5887個或3984個SFC之組合抗原特異性免疫反應(組合之六個抗原決定基)。 表24 - 利用ChAdV68及抗CTLA-4之細胞免疫反應 某些序列 載體、卡匣及抗體之序列如下所示。 泛素(SEQ ID NO:38) ＞UbG76 0-228泛素A76 (SEQ ID NO:39) ＞UbA76 0-228HLA-A2 (I類MHC)信號肽(SEQ ID NO:40) ＞MHC信號肽0-78HLA-A2 (I類MHC)跨膜域(SEQ ID NO:41) ＞HLA A2跨膜域0-201IgK前導序列(SEQ ID NO:42) ＞IgK前導序列0-60人類DC-Lamp (SEQ ID NO:43) ＞人類DCLAMP 0-3178 小鼠LAMP1 (SEQ ID NO:44) ＞小鼠Lamp1 0-1858人類Lamp1 cDNA (SEQ ID NO:45) ＞人類Lamp1 0-2339 破傷風類毒素核酸序列(SEQ ID NO:46)破傷風類毒素胺基酸序列(SEQ ID NO:47)PADRE核苷酸序列(SEQ ID NO:48)PADRE胺基酸序列(SEQ ID NO:49)WPRE (SEQ ID NO:50) ＞WPRE 0-593IRES (SEQ ID NO:51) ＞eGFP_IRES_SEAP_Insert 1746-2335GFP (SEQ ID NO:52) SEAP (SEQ ID NO:53)螢火蟲螢光素酶(SEQ ID NO:54)FMDV 2A (SEQ ID NO:55) 參考文獻 1. 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Epub 2004 Nov 12. 85. Riley, Michael K. II, and Wilfred Vermerris. Recent Advances in Nanomaterials for Gene Delivery—A Review. Nanomaterials 2017, 7(5), 94. 86. Frolov I, Hardy R, Rice CM. Cis-acting RNA elements at the 5' end of Sindbis virus genome RNA regulate minus- and plus-strand RNA synthesis. RNA. 2001 Nov;7(11):1638-51. 87. Jose J, Snyder JE, Kuhn RJ. A structural and functional perspective of alphavirus replication and assembly. Future Microbiol. 2009 Sep;4(7):837-56.各種實施例 1. 本文揭示一種包含新抗原或複數個新抗原之病毒載體。在某些實施例中，新抗原係使用本文所揭示之方法鑑別，例如下文。在某些實施例中，新抗原具有如本文所揭示之至少一個特徵或特性，例如下文。 2. 本文揭示一種用於鑑別來自個體之腫瘤細胞、可能在腫瘤細胞表面上呈現之一或多個新抗原的方法，其包含以下步驟： 自個體之腫瘤細胞獲得外顯子組、轉錄組或全基因組腫瘤核苷酸定序資料中之至少一者，其中該腫瘤核苷酸定序資料用於獲得代表新抗原集合中之每一者之肽序列的資料，且其中各新抗原之肽序列包含至少一個使其不同於相應野生型親本肽序列之改變； 將各新抗原之肽序列輸入至一或多個呈現模型中，以產生新抗原中之每一者在個體腫瘤細胞之腫瘤細胞表面上由一或多個MHC等位基因呈現的數值可能性集合，該數值可能性集合已至少基於所接受之質譜資料進行鑑別；及 基於數值可能性集合選擇新抗原集合之子集，以產生經選擇之新抗原集合。 3. 在某些實施例中，經選擇之新抗原集合的數目為20個。 4. 在某些實施例中，呈現模型表示以下兩者之間的依賴性： MHC等位基因中之一對特定等位基因及在肽序列之特定位置處之特定胺基酸的存在；及 在腫瘤細胞表面上由該對MHC等位基因中之一特定者呈現在特定位置處包含特定胺基酸之此類肽序列的可能性。 5. 在某些實施例中，輸入肽序列包含： 將一或多種呈現模型應用於相應新抗原之肽序列，以產生一或多個MHC等位基因中之每一者的依賴性評分，指示MHC等位基因是否將至少基於相應新抗原之肽序列的胺基酸位置呈現相應新抗原。 6. 在某些實施例中，該方法另外包含： 變換依賴性評分以產生各MHC等位基因之相應的獨立等位基因的可能性，指示相應的MHC等位基因將呈現相應的新抗原的可能性；及 組合獨立等位基因的可能性以產生數值可能性。 7. 在某些實施例中，變換依賴性評分使相應新抗原之肽序列的呈現模型化為相互排斥的。 8. 在某些實施例中，該方法另外包含： 變換依賴性評分組合以產生數值可能性。 9. 在某些實施例中，變換依賴性評分組合使相應新抗原之肽序列的呈現作為MHC等位基因之間的干擾而模型化。 10. 在某些實施例中，數值可能性集合藉由至少一個等位基因非相互作用特徵進一步鑑別，且另外包含： 將不與一或多個呈現模型中之一者相互作用的等位基因應用於等位基因非相互作用特徵，以產生等位基因非相互作用特徵之依賴性評分，指示相應新抗原之肽序列是否將基於等位基因非相互作用特徵呈現。 11. 在某些實施例中，該方法另外包含： 將一或多個MHC等位基因中之每個MHC等位基因的依賴性評分與等位基因非相互作用特徵的依賴性評分組合； 變換每個MHC等位基因之組合依賴性評分以產生MHC等位基因中相應的獨立等位基因的可能性，指示相應的MHC等位基因將呈現相應的新抗原的可能性；及 組合獨立等位基因的可能性以產生數值可能性。 12. 在某些實施例中，該方法另外包含： 變換每個MHC等位基因之依賴性評分與等位基因非相互作用特徵之依賴性評分的組合以產生數值可能性。 13. 在某些實施例中，用於呈現模型之數值參數集合係基於訓練資料集來訓練，該訓練資料集包括鑑別為存在於複數個樣品中之至少一個訓練肽序列集合及與每個訓練肽序列相關之一或多個MHC等位基因，其中訓練肽序列係經由對自源於複數個樣品之MHC等位基因溶離的經分離之肽進行質譜法來鑑別。 14. 在某些實施例中，訓練資料集另外包括關於腫瘤細胞之mRNA表現量的資料。 15. 在某些實施例中，樣品包含經工程改造以表現單個MHC I類或II類等位基因之細胞株。 16. 在某些實施例中，樣品包含經工程改造以表現複數個MHC I類或II類等位基因之細胞株。 17. 在某些實施例中，樣品包含獲自或源於複數個患者之人類細胞株。 18. 在某些實施例中，樣品包含獲自複數個患者之新鮮或冷凍的腫瘤樣品。 19. 在某些實施例中，樣品包含獲自複數個患者之新鮮或冷凍的組織樣品。 20. 在某些實施例中，樣品包含使用T細胞分析鑑別之肽。 21. 在某些實施例中，訓練資料集另外包含與以下相關之資料： 樣品中存在之訓練肽集合的肽豐度； 樣品中之訓練肽集合的肽長度。 22. 在某些實施例中，訓練資料集係藉由將訓練肽序列集合與包含已知蛋白質序列集合之資料庫經由比對進行比較來產生，其中訓練蛋白質序列集合比訓練肽序列更長且包括訓練肽序列。 23. 在某些實施例中，訓練資料集係基於對細胞株執行或已執行質譜法以獲得該細胞株之外顯子組、轉錄組或全基因組肽定序資料中之至少一者來產生，該肽定序資料包括至少一個包括改變之蛋白質序列。 24. 在某些實施例中，訓練資料集係基於自正常組織樣品獲得外顯子組、轉錄組及全基因組正常核苷酸定序資料中之至少一者來產生。 25. 在某些實施例中，訓練資料集另外包含與樣品相關之蛋白質組序列相關的資料。 26. 在某些實施例中，訓練資料集另外包含與樣品相關之MHC肽組序列相關的資料。 27. 在某些實施例中，訓練資料集另外包含與至少一種經分離之肽的肽-MHC結合親和力量測相關的資料。 28. 在某些實施例中，訓練資料集另外包含與至少一種經分離之肽的肽-MHC結合穩定性量測相關的資料。 29. 在某些實施例中，訓練資料集另外包含與樣品相關之轉錄組相關的資料。 30. 在某些實施例中，訓練資料集另外包含與樣品相關之基因組相關的資料。 31. 在某些實施例中，訓練肽序列之長度在k聚體之範圍內，其中k在8-15之間，包括端點。 32. 在某些實施例中，該方法另外包含使用獨熱編碼方案編碼肽序列。 33. 在某些實施例中，該方法另外包含使用左填充獨熱編碼方案編碼訓練肽序列。 34. 本文亦揭示一種治療具有腫瘤之個體的方法，其包含執行本文所揭示之方法之步驟中之任一者，且另外包含獲得包含經選擇之新抗原集合的腫瘤疫苗，及向該個體投與該腫瘤疫苗。 35. 本文亦揭示一種製造腫瘤疫苗之方法，其包含執行本文所揭示之方法之步驟中之任一者，且另外包含產生或已產生包含經選擇之新抗原集合的腫瘤疫苗。 36. 本文亦揭示一種包含經選擇之新抗原集合的腫瘤疫苗，該經選擇之新抗原集合係藉由執行本文所揭示之方法選擇。 37. 在某些實施例中，腫瘤疫苗包含核苷酸序列、多肽序列、RNA、DNA、細胞、質體或載體中之一或多者。 38. 在某些實施例中，腫瘤疫苗包含在腫瘤細胞表面上呈現之一或多個新抗原。 39. 在某些實施例中，腫瘤疫苗包含在個體中具有免疫原性之一或多個新抗原。 40. 在某些實施例中，腫瘤疫苗不包含在個體中誘導針對正常組織之自體免疫反應的一或多個新抗原。 41. 在某些實施例中，腫瘤疫苗另外包含佐劑。 42. 在某些實施例中，腫瘤疫苗另外包含賦形劑。 43. 在某些實施例中，選擇經選擇之新抗原集合包含基於呈現模型選擇相對於未經選擇之新抗原在腫瘤細胞表面上呈現之可能性增加的新抗原。 44. 在某些實施例中，選擇經選擇之新抗原集合包含基於呈現模型選擇相對於未經選擇之新抗原在個體中能夠誘導腫瘤特異性免疫反應之可能性增加的新抗原。 45. 在某些實施例中，選擇經選擇之新抗原集合包含基於呈現模型選擇相對於未經選擇之新抗原能夠由專職抗原呈現細胞(APC)呈現於初始T細胞之可能性增加的新抗原，視情況其中該APC為樹突狀細胞(DC)。 46. 在某些實施例中，選擇經選擇之新抗原集合包含基於呈現模型選擇相對於未經選擇之新抗原經由中心或外周耐受性受抑制之可能性降低的新抗原。 47. 在某些實施例中，選擇經選擇之新抗原集合包含基於呈現模型選擇相對於未經選擇之新抗原能夠誘導針對個體正常組織之自體免疫反應之可能性降低的新抗原。 48. 在某些實施例中，外顯子組或轉錄組核苷酸定序資料係藉由對腫瘤組織進行定序而獲得。 49. 在某些實施例中，定序為下一代定序(NGS)或任何大規模平行定序方法。 50. 在某些實施例中，數值可能性集合藉由至少MHC-等位基因相互作用特徵來進一步鑑別，該等特徵包含以下中之至少一者： a. 經預測之MHC等位基因與新抗原編碼肽結合之親和力。 b. 經預測之新抗原編碼肽-MHC複合物之穩定性。 c. 新抗原編碼肽之序列及長度。 d. 如藉由質譜蛋白質組學或其他手段所評定，在來自表現特定MHC等位基因之其他個體的細胞中呈現具有類似序列之新抗原編碼肽的機率。 e. 所討論之個體中特定MHC等位基因之表現量(例如，如藉由RNA-seq或質譜法所量測)。 f. 在表現特定MHC等位基因之其他不同個體中由特定MHC等位基因呈現之總體新抗原編碼肽序列獨立性機率。 g. 在其他不同個體中由同一家族分子(例如HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-DP)中之MHC等位基因呈現之總體新抗原編碼肽序列獨立性機率。 51. 在某些實施例中，數值可能性集合藉由至少MHC-等位基因非相互作用特徵來進一步鑑別，該等特徵包含以下中之至少一者： a. 在其源蛋白序列內側接新抗原編碼肽之C端及N端序列。 b. 新抗原編碼肽中蛋白酶裂解基元之存在，視情況根據相應蛋白酶在腫瘤細胞中之表現加權(如藉由RNA-seq或質譜法所量測)。 c. 如在適當細胞類型中所量測，源蛋白之周轉率。 d. 源蛋白之長度，視情況考慮在腫瘤細胞中最高度表現之特異性剪接變體(「同功異型物」)，如藉由RNA-seq或蛋白質組質譜法所量測，或如DNA或RNA序列資料中所偵測之生殖系或體細胞剪接突變的註解所預測。 e. 蛋白酶體、免疫蛋白酶體、胸腺蛋白酶體或其他蛋白酶在腫瘤細胞中之表現量(其可藉由RNA-seq、蛋白質組質譜法或免疫組織化學量測)。 f. 新抗原編碼肽之源基因的表現(例如，如藉由RNA-seq或質譜法所量測)。 g. 新抗原編碼肽之源基因在細胞週期之各種階段期間的典型組織特異性表現。 h. 源蛋白及/或其域之綜合特徵目錄，如例如uniProt或PDB http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do中可見。 i. 描述含有該肽之源蛋白之域特性的特徵，例如：二級或三級結構(例如α螺旋對β摺疊)；替代性剪接。 j. 在其他不同個體中由所討論之新抗原編碼肽之源蛋白呈現肽的機率。 k. 由於技術偏差，肽將不會由質譜法偵測到或過量表示之機率。 l. 藉由RNASeq (其無需含有肽之源蛋白)所量測之提供關於腫瘤細胞、基質或腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)狀態之資訊的各種基因模組/通路之表現。 m. 新抗原編碼肽之源基因在腫瘤細胞中之複本數。 n. 肽結合於TAP之機率或經量測或經預測之肽對TAP之結合親和力。 o. TAP在腫瘤細胞中之表現量(其可藉由RNA-seq、蛋白質組質譜法、免疫組織化學量測)。 p. 存在或不存在腫瘤突變，其包括(但不限於)： i. 已知癌症驅動基因(諸如EGFR、KRAS、ALK、RET、ROS1、TP53、CDKN2A、CDKN2B、NTRK1、NTRK2、NTRK3)中之驅動突變 ii. 在編碼抗原呈現機制中所涉及之蛋白質的基因(例如B2M、HLA-A、HLA-B、HLA-C、TAP-1、TAP-2、TAPBP、CALR、CNX、ERP57、HLA-DM、HLA-DMA、HLA-DMB、HLA-DO、HLA-DOA、HLA-DOBHLA-DP、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQ、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DR、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5或編碼蛋白酶體或免疫蛋白酶體組分之基因中之任一者)中。呈現依賴於腫瘤中經受功能喪失性突變之抗原呈現機制之組分的肽具有降低的呈現機率。 q. 存在或不存在功能性生殖系多形現象，其包括(但不限於)： i. 在編碼抗原呈現機制中所涉及之蛋白質的基因(例如B2M、HLA-A、HLA-B、HLA-C、TAP-1、TAP-2、TAPBP、CALR、CNX、ERP57、HLA-DM、HLA-DMA、HLA-DMB、HLA-DO、HLA-DOA、HLA-DOBHLA-DP、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQ、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DR、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5或編碼蛋白酶體或免疫蛋白酶體組分之基因中之任一者)中 r. 腫瘤類型(例如NSCLC、黑素瘤)。 s. 臨床腫瘤亞型(例如鱗狀肺癌對非鱗狀)。 t. 吸菸史。 u. 肽之源基因在相關腫瘤類型或臨床亞型中之典型表現，視情況藉由驅動突變分層。 52. 在某些實施例中，至少一個改變為讀框轉移或非讀框轉移插入缺失、誤義或無義取代、剪接位點改變、基因組重排或基因融合、或產生neoORF之任何基因組或表現改變。 53. 在某些實施例中，腫瘤細胞係選自由以下組成之群：肺癌、黑素瘤、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、胃癌、結腸癌、睪丸癌、頭頸癌、胰臟癌、腦癌、B細胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴球性白血病、T細胞淋巴球性白血病、非小細胞肺癌及小細胞肺癌。 54. 在某些實施例中，該方法另外包含獲得包含經選擇之新抗原集合或其子集的腫瘤疫苗，視情況另外包含向個體投與該腫瘤疫苗。 55. 在某些實施例中，當呈多肽形式時，經選擇之新抗原集合中之至少一種新抗原包含以下中之至少一者：在小於1000 nM之IC50值下與MHC之結合親和力，對於長度為8-15、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸之MHC 1類多肽，在親本蛋白質序列中在該多肽內部或附近存在促進蛋白酶體裂解之序列基元，及存在促進TAP轉運之序列基元。 56. 本文亦揭示一種產生用於鑑別可能在腫瘤細胞之腫瘤細胞表面上呈現之一或多個新抗原之模型的方法，其包含執行以下步驟： 接收包含與自源於複數個樣品之主要組織相容複合體(MHC)溶離的複數個經分離之肽相關之資料的質譜資料； 藉由至少鑑別樣品中存在之訓練肽序列集合及與各訓練肽序列相關之一或多個MHC獲得訓練資料集； 使用包含訓練肽序列之訓練資料集來訓練呈現模型之數值參數集合，呈現模型提供來自腫瘤細胞之肽序列在腫瘤細胞表面上由一或多個MHC等位基因呈現之複數個數值可能性。 57. 在某些實施例中，呈現模型表示以下兩者之間的依賴性： 在肽序列之特定位置處存在特定胺基酸；及 由腫瘤細胞上之MHC等位基因中之一者呈現在該特定位置處含有該特定胺基酸之肽序列的可能性。 58. 在某些實施例中，樣品包含經工程改造以表現單個MHC I類或II類等位基因之細胞株。 59. 在某些實施例中，樣品包含經工程改造以表現複數個MHC I類或II類等位基因之細胞株。 60. 在某些實施例中，樣品包含獲自或源於複數個患者之人類細胞株。 61. 在某些實施例中，樣品包含獲自複數個患者之新鮮或冷凍的腫瘤樣品。 62. 在某些實施例中，樣品包含使用T細胞分析鑑別之肽。 63. 在某些實施例中，訓練資料集另外包含與以下相關之資料： 樣品中存在之訓練肽集合的肽豐度； 樣品中之訓練肽集合的肽長度。 64. 在某些實施例中，獲得訓練資料集包含： 藉由將訓練肽序列集合與包含已知蛋白質序列集合之資料庫經由比對進行比較來獲得基於訓練肽序列之訓練蛋白質序列集合，其中訓練蛋白質序列集合比訓練肽序列更長且包括訓練肽序列。 65. 在某些實施例中，獲得訓練資料集包含： 對細胞株執行或已執行質譜法以獲得該細胞株之外顯子組、轉錄組或全基因組核苷酸定序資料中之至少一者，該核苷酸定序資料包括至少一個包括突變之蛋白質序列。 66. 在某些實施例中，訓練呈現模型之參數集合包含： 使用獨熱編碼方案編碼訓練肽序列。 67. 在某些實施例中，該方法另外包含： 自正常組織樣品獲得外顯子組、轉錄組及全基因組正常核苷酸定序資料中之至少一者；及 使用正常核苷酸定序資料訓練呈現模型之參數集合。 68. 在某些實施例中，訓練資料集另外包含與樣品相關之蛋白質組序列相關的資料。 69. 在某些實施例中，訓練資料集另外包含與樣品相關之MHC肽組序列相關的資料。 70. 在某些實施例中，訓練資料集另外包含與至少一種經分離之肽的肽-MHC結合親和力量測相關的資料。 71. 在某些實施例中，訓練資料集另外包含與至少一種經分離之肽的肽-MHC結合穩定性量測相關的資料。 72. 在某些實施例中，訓練資料集另外包含與樣品相關之轉錄組相關的資料。 73. 在某些實施例中，訓練資料集另外包含與樣品相關之基因組相關的資料。 74. 在某些實施例中，訓練數值參數集合另外包含： 使參數集合邏輯回歸。 75. 在某些實施例中，訓練肽序列之長度在k聚體之範圍內，其中k在8-15之間，包括端點。 76. 在某些實施例中，訓練呈現模型之數值參數集合包含： 使用左填充獨熱編碼方案編碼訓練肽序列。 77. 在某些實施例中，訓練數值參數集合另外包含： 使用深度學習算法確定參數集合之值。 78. 本文亦揭示一種產生用於鑑別可能在腫瘤細胞之腫瘤細胞表面上呈現之一或多個新抗原之模型的方法，其包含執行以下步驟： 接收包含與自源於複數個新鮮或冷凍腫瘤樣品之主要組織相容複合體(MHC)溶離的複數個經分離之肽相關之資料的質譜資料； 藉由至少鑑別腫瘤樣品中存在且呈現在與各訓練肽序列相關之一或多個MHC等位基因上的訓練肽序列集合來獲得訓練資料集； 基於訓練肽序列獲得訓練蛋白質序列集合；及 使用訓練蛋白質序列及訓練肽序列訓練呈現模型之數值參數集合，呈現模型提供來自腫瘤細胞之肽序列在腫瘤細胞表面上由一或多個MHC等位基因呈現之複數個數值可能性。 79. 在某些實施例中，呈現模型表示以下兩者之間的依賴性： MHC等位基因中之一對特定等位基因及在肽序列之特定位置處之特定胺基酸的存在；及 在腫瘤細胞表面上由該對MHC等位基因中之一特定者呈現在特定位置處包含特定胺基酸之此類肽序列的可能性。
110‧‧‧患者
114‧‧‧候選新抗原序列
118‧‧‧疫苗
160‧‧‧呈現鑑別系統
165‧‧‧呈現資訊
170‧‧‧訓練資料存儲
170A‧‧‧訓練資料
175‧‧‧呈現模型
312‧‧‧資料管理模組
314‧‧‧編碼模組
316‧‧‧訓練模組
320‧‧‧預測模組
324‧‧‧卡匣設計模組
1400‧‧‧電腦
1402‧‧‧處理器
1404‧‧‧晶片組
1406‧‧‧記憶體
1408‧‧‧存儲裝置
1410‧‧‧鍵盤
1412‧‧‧圖形配接器
1414‧‧‧指向裝置
1416‧‧‧網路配接器
1418‧‧‧顯示器
1420‧‧‧記憶體控制器集線器
1422‧‧‧I/O控制器集線器
關於以下描述及隨附圖式將更好地理解本發明之此等及其他特徵、態樣及優勢，其中：圖 1A 顯示當前用於鑑別新抗原之臨床方法。圖 1B 顯示＜5%之預測結合肽呈現於腫瘤細胞上。圖 1C 顯示新抗原預測特異性問題之影響。圖 1D 顯示結合預測不足以進行新抗原鑑別。圖 1E 顯示MHC-I呈現之機率隨肽長度之變化。圖 1F 顯示由普洛麥格之動態範圍標準(Promega's dynamic range standard)生成的示例肽譜圖。圖 1G 顯示添加何種特徵增加模型陽性預測值。圖 2A 係根據一個實施例，用於鑑別患者中肽呈現之可能性之環境的概述。圖 2B 及圖 2C 說明根據一個實施例，獲得呈現資訊之方法。圖 3 係說明根據一個實施例的呈現鑑別系統之電腦邏輯組件的高級框圖。圖 4 說明根據一個實施例的一組示例訓練資料。圖 5 說明與MHC等位基因相關聯之示例網路模型。圖 6A-6B 說明MHC等位基因共享的示例網路模型。圖 7 說明使用示例網路模型產生與MHC等位基因相關聯之肽之呈現的可能性。圖 8 說明使用示例網路模型產生與MHC等位基因相關聯之肽之呈現的可能性。圖 9 說明使用示例網路模型產生與MHC等位基因相關聯之肽之呈現的可能性。圖 10 說明使用示例網路模型產生與MHC等位基因相關聯之肽之呈現的可能性。圖 11 說明使用示例網路模型產生與MHC等位基因相關聯之肽之呈現的可能性。圖 12 說明使用示例網路模型產生與MHC等位基因相關聯之肽之呈現的可能性。圖 13A-13J 說明各種示例呈現模型之效能結果。圖 14 說明用於實施圖1及3中所示之實體的示例電腦。圖 15 說明活體外T細胞活化分析之開發。示意性展示該分析，其中將疫苗盒遞送至抗原呈現細胞引起獨特肽抗原之表現、加工及MHC限制性呈現。經工程改造成具有匹配特定肽-MHC組合之T細胞受體的報導體T細胞經活化，引起螢光素酶表現。圖 16A 說明對短卡匣中連接子序列之評價且顯示在相對於彼此相同之位置中串接的五個I類MHC限制性抗原決定基(抗原決定基1至5)，繼之以兩個通用的II類MHC抗原決定基(MHC-II)。使用不同連接子產生各種迭代。在一些情況下，T細胞抗原決定基彼此直接連接。在其他情況下，T細胞抗原決定基側接於其天然序列之一側或兩側上。在其他迭代中，T細胞抗原決定基藉由非天然序列AAY、RR及DPP連接。圖 16B 說明對短卡匣中連接子序列之評價且顯示有關嵌入該等短卡匣中之T細胞抗原決定基的序列資訊。圖 17 說明對添加至模型疫苗卡匣中之細胞靶向序列之評價。該等靶向卡匣用泛素(Ub)、信號肽(SP)及/或跨膜(TM)域延伸該短卡匣設計，特徵在於緊鄰該五個標記物人類T細胞抗原決定基(抗原決定基1至5)以及兩個小鼠T細胞抗原決定基SIINFEKL(SII)及SPSYAYHQF(A5)，且使用非天然連接子AAY-或天然連接子側接兩側上的T細胞抗原決定基(25聚體)。圖 18 說明對短卡匣中連接子序列之活體內評價。A)使用HLA-A2轉殖基因小鼠進行疫苗卡匣之活體內評價的實驗設計。圖 19A 說明對21聚體長卡匣中抗原決定基位置之影響的活體內評價且顯示長卡匣之設計需要用25聚體天然序列中所包含之另外的熟知T細胞I類抗原決定基(抗原決定基6至21)隔開的包含在25聚體天然序列中之五個標記物I類抗原決定基(抗原決定基1至5)(連接子=天然側接序列)，及兩個通用的II類抗原決定基(MHC-II)，其中僅I類抗原決定基之相對位置變化。圖 19B 說明對21聚體長卡匣中抗原決定基位置之影響的活體內評價且顯示有關所用T細胞抗原決定基之序列資訊。圖 20A 說明臨床前IND授權研究(IND-enabling study)之最終卡匣設計且顯示最終卡匣之設計包含在25聚體天然序列中所包含之20個I類MHC抗原決定基(連接子=天然側接序列)以及2個通用II類MHC抗原決定基，該20個I類MHC抗原決定基由6個非人類靈長類動物(NHP)抗原決定基、5個人類抗原決定基、9個鼠類抗原決定基構成。圖 20B 說明臨床前IND授權研究之最終卡匣設計且顯示呈現於非人類靈長類動物、小鼠及人類來源之I類MHC上的所用T細胞抗原決定基之序列資訊，以及2個通用II類MHC抗原決定基PADRE及破傷風類毒素之序列。圖 21A 說明在轉染之後產生ChAdV68.4WTnt.GFP病毒。使用磷酸鈣方案，用ChAdV68.4WTnt.GFP DNA轉染HEK293A細胞。在轉染之後10天，觀察到病毒複製且使用光學顯微鏡檢查(40×放大率)觀測到ChAdV68.4WTnt.GFP病毒蝕斑。圖 21B 說明在轉染之後產生ChAdV68.4WTnt.GFP病毒。使用磷酸鈣方案，用ChAdV68.4WTnt.GFP DNA轉染HEK293A細胞。在轉染之後10天，觀察到病毒複製且使用螢光顯微鏡檢查，在40×放大率下觀測到ChAdV68.4WTnt.GFP病毒蝕斑。圖 21C 說明在轉染之後產生ChAdV68.4WTnt.GFP病毒。使用磷酸鈣方案，用ChAdV68.4WTnt.GFP DNA轉染HEK293A細胞。在轉染之後10天，觀察到病毒複製且使用螢光顯微鏡檢查，在100×放大率下觀測到ChAdV68.4WTnt.GFP病毒蝕斑。圖 22A 說明轉染之後產生ChAdV68.5WTnt.GFP病毒。使用脂染胺方案，用ChAdV68.5WTnt.GFP DNA轉染HEK293A細胞。在轉染之後10天，觀察到病毒複製(蝕斑)。製備溶解產物且用於再感染T25燒瓶中之293A細胞。3天後，使用光學顯微鏡檢查(40×放大率)觀測到ChAdV68.5WTnt.GFP病毒蝕斑並拍照。圖 22B 說明轉染之後產生ChAdV68.5WTnt.GFP病毒。使用脂染胺方案，用ChAdV68.5WTnt.GFP DNA轉染HEK293A細胞。在轉染之後10天，觀察到病毒複製(蝕斑)。製備溶解產物且用於再感染T25燒瓶中之293A細胞。3天後，使用螢光顯微鏡檢查，在40×放大率下觀測到ChAdV68.5WTnt.GFP病毒蝕斑並拍照。圖 22C 說明轉染之後產生ChAdV68.5WTnt.GFP病毒。使用脂染胺方案，用ChAdV68.5WTnt.GFP DNA轉染HEK293A細胞。在轉染之後10天，觀察到病毒複製(蝕斑)。製備溶解產物且用於再感染T25燒瓶中之293A細胞。3天後，使用螢光顯微鏡檢查，在100×放大率下觀測到ChAdV68.5WTnt.GFP病毒蝕斑並拍照。圖 23 說明病毒粒子製造方案。圖 24 說明α病毒源性VEE自我複製型RNA(srRNA)載體。圖 25 說明在用VEE-螢光素酶srRNA接種C57BL/6J小鼠之後的活體內報導體表現。顯示出在各種時間點用VEE-螢光素酶srRNA免疫接種C57BL/6J小鼠(每隻小鼠10 μg，兩側肌肉內注射，MC3封裝)之後的代表性螢光素酶信號圖像。圖 26A 說明在帶有B16-OVA腫瘤之小鼠中免疫接種用MC3 LNP調配之VEE srRNA之後14天量測的T細胞反應。向帶有B16-OVA腫瘤之C57BL/6J小鼠注射10 μg VEE-螢光素酶srRNA(對照)、VEE-UbAAY srRNA(Vax)、VEE-螢光素酶srRNA及抗CTLA-4(aCTLA-4)或VEE-UbAAY srRNA及抗CTLA-4(Vax+aCTLA-4)。此外，自第7天開始，用抗PD1 mAb治療所有小鼠。每組由8隻小鼠組成。在免疫接種之後14天，處死小鼠並收集脾及淋巴結。藉由IFN-γ ELISPOT評估SIINFEKL特異性T細胞反應且以每106 個脾細胞之斑點形成細胞(SFC)數報導。線表示中值。圖 26B 說明在帶有B16-OVA腫瘤之小鼠中免疫接種用MC3 LNP調配之VEE srRNA之後14天量測的T細胞反應。向帶有B16-OVA腫瘤之C57BL/6J小鼠注射10 μg VEE-螢光素酶srRNA(對照)、VEE-UbAAY srRNA(Vax)、VEE-螢光素酶srRNA及抗CTLA-4(aCTLA-4)或VEE-UbAAY srRNA及抗CTLA-4(Vax+aCTLA-4)。此外，自第7天開始，用抗PD1 mAb治療所有小鼠。每組由8隻小鼠組成。在免疫接種之後14天，處死小鼠並收集脾及淋巴結。藉由MHCI-五聚體染色評估SIINFEKL特異性T細胞反應，以五聚體陽性細胞佔CD8陽性細胞之百分比報導。線表示中值。圖 27A 說明在帶有B16-OVA腫瘤之小鼠中進行異源初免/追加免疫之後的抗原特異性T細胞反應。向帶有B16-OVA腫瘤之C57BL/6J小鼠注射表現GFP之腺病毒(Ad5-GFP)並用經MC3 LNP調配之VEE-螢光素酶srRNA(對照)追加免疫或注射Ad5-UbAAY並用VEE-UbAAY srRNA(Vax)追加免疫。還用IgG對照mAb治療對照組及Vax組。第三組用Ad5-GFP初免/VEE-螢光素酶srRNA追加免疫與抗CTLA-4之組合(aCTLA-4)治療，而第四組用Ad5-UbAAY初免/VEE-UbAAY追加免疫與抗CTLA-4之組合(Vax+aCTLA-4)治療。此外，自第21天開始，用抗PD-1 mAb治療所有小鼠。藉由IFN-γ ELISPOT量測T細胞反應。在用腺病毒免疫接種後14天，處死小鼠並收集脾及淋巴結。圖 27B 說明在帶有B16-OVA腫瘤之小鼠中進行異源初免/追加免疫之後的抗原特異性T細胞反應。向帶有B16-OVA腫瘤之C57BL/6J小鼠注射表現GFP之腺病毒(Ad5-GFP)並用經MC3 LNP調配之VEE-螢光素酶srRNA(對照)追加免疫或注射Ad5-UbAAY並用VEE-UbAAY srRNA(Vax)追加免疫。還用IgG對照mAb治療對照組及Vax組。第三組用Ad5-GFP初免/VEE-螢光素酶srRNA追加免疫與抗CTLA-4之組合(aCTLA-4)治療，而第四組用Ad5-UbAAY初免/VEE-UbAAY追加免疫與抗CTLA-4之組合(Vax+aCTLA-4)治療。此外，自第21天開始，用抗PD-1 mAb治療所有小鼠。藉由IFN-γ ELISPOT量測T細胞反應。在用腺病毒免疫接種後14天及在用srRNA追加免疫後14天(初免之後第28天)，處死小鼠並收集脾及淋巴結。圖 27C 說明在帶有B16-OVA腫瘤之小鼠中進行異源初免/追加免疫之後的抗原特異性T細胞反應。向帶有B16-OVA腫瘤之C57BL/6J小鼠注射表現GFP之腺病毒(Ad5-GFP)並用經MC3 LNP調配之VEE-螢光素酶srRNA(對照)追加免疫或注射Ad5-UbAAY並用VEE-UbAAY srRNA(Vax)追加免疫。還用IgG對照mAb治療對照組及Vax組。第三組用Ad5-GFP初免/VEE-螢光素酶srRNA追加免疫與抗CTLA-4之組合(aCTLA-4)治療，而第四組用Ad5-UbAAY初免/VEE-UbAAY追加免疫與抗CTLA-4之組合(Vax+aCTLA-4)治療。此外，自第21天開始，用抗PD-1 mAb治療所有小鼠。藉由I類MHC五聚體染色量測T細胞反應。在用腺病毒免疫接種後14天，處死小鼠並收集脾及淋巴結。圖 27D 說明在帶有B16-OVA腫瘤之小鼠中進行異源初免/追加免疫之後的抗原特異性T細胞反應。向帶有B16-OVA腫瘤之C57BL/6J小鼠注射表現GFP之腺病毒(Ad5-GFP)並用經MC3 LNP調配之VEE-螢光素酶srRNA(對照)追加免疫或注射Ad5-UbAAY並用VEE-UbAAY srRNA(Vax)追加免疫。還用IgG對照mAb治療對照組及Vax組。第三組用Ad5-GFP初免/VEE-螢光素酶srRNA追加免疫與抗CTLA-4之組合(aCTLA-4)治療，而第四組用Ad5-UbAAY初免/VEE-UbAAY追加免疫與抗CTLA-4之組合(Vax+aCTLA-4)治療。此外，自第21天開始，用抗PD-1 mAb治療所有小鼠。藉由I類MHC五聚體染色量測T細胞反應。在用腺病毒免疫接種後14天及在用srRNA追加免疫後14天(初免之後第28天)，處死小鼠並收集脾及淋巴結。圖 28A 說明在帶有CT26(Balb/c)腫瘤之小鼠中進行異源初免/追加免疫之後的抗原特異性T細胞反應。對小鼠免疫接種Ad5-GFP且在腺病毒初免之後15天，用經MC3 LNP調配之VEE-螢光素酶srRNA(對照)追加免疫，或用Ad5-UbAAY進行初免且用VEE-UbAAY srRNA(Vax)追加免疫。還用IgG對照mAb治療對照組及Vax組。向一個獨立組投與Ad5-GFP/VEE-螢光素酶srRNA初免/追加免疫與抗PD-1之組合(aPD1)，而第四組接受Ad5-UbAAY/VEE-UbAAY srRNA初免/追加免疫與抗PD-1 mAb之組合(Vax+aPD1)。使用IFN-γ ELISPOT量測T細胞對AH1肽之反應。在用腺病毒免疫接種後12天，處死小鼠並收集脾及淋巴結。圖 28B 說明在帶有CT26(Balb/c)腫瘤之小鼠中進行異源初免/追加免疫之後的抗原特異性T細胞反應。對小鼠免疫接種Ad5-GFP且在腺病毒初免之後15天，用經MC3 LNP調配之VEE-螢光素酶srRNA(對照)追加免疫，或用Ad5-UbAAY進行初免且用VEE-UbAAY srRNA(Vax)追加免疫。還用IgG對照mAb治療對照組及Vax組。向一個獨立組投與Ad5-GFP/VEE-螢光素酶srRNA初免/追加免疫與抗PD-1之組合(aPD1)，而第四組接受Ad5-UbAAY/VEE-UbAAY srRNA初免/追加免疫與抗PD-1 mAb之組合(Vax+aPD1)。使用IFN-γ ELISPOT量測T細胞對AH1肽之反應。在用腺病毒免疫接種後12天及在用srRNA追加免疫後6天(初免之後第21天)，處死小鼠並收集脾及淋巴結。圖 29 說明ChAdV68引起針對小鼠中小鼠腫瘤抗原之T細胞反應。對小鼠免疫接種ChAdV68.5WTnt.MAG25mer，且在C57BL/6J雌性小鼠中量測針對I類MHC抗原決定基SIINFEKL(OVA)之T細胞反應並在Balb/c小鼠中量測針對I類MHC抗原決定基AH1-A5之T細胞反應。呈現在ELISpot分析中量測的每106 個脾細胞之平均斑點形成細胞(SFC)數。誤差條表示標準差。圖 30 說明在CT26腫瘤模型中單次免疫接種ChAdV6、ChAdV+抗PD-1、srRNA、srRNA+抗PD-1或單獨抗PD-1之後的細胞免疫反應。使用ELISpot量測來自每組之6隻小鼠之脾細胞中抗原特異性IFN-γ的產生。結果呈現為每106 個脾細胞之斑點形成細胞(SFC)數。每個組之中值以水平線指示。P值使用鄧尼特氏多重比較(Dunnett's multiple comparison)測試測定；*** P＜0.0001，**P＜0.001，*P＜0.05。ChAdV= ChAdV68.5WTnt.MAG25mer；srRNA= VEE-MAG25mer srRNA。圖 31 說明在CT26腫瘤模型中單次免疫接種ChAdV6、ChAdV+抗PD-1、srRNA、srRNA+抗PD-1或單獨抗PD-1之後的CD8 T細胞反應。使用ICS量測CD8 T細胞中抗原特異性IFN-γ的產生且結果呈現為抗原特異性CD8 T細胞佔總CD8T細胞之百分含量。每個組之中值以水平線指示。P值使用鄧尼特氏多重比較測試測定；*** P＜0.0001，**P＜0.001，*P＜0.05。ChAdV= ChAdV68.5WTnt.MAG25mer；srRNA= VEE-MAG25mer srRNA。圖 32 說明在CT26腫瘤模型中用ChAdV/srRNA異源初免/追加免疫、srRNA/ChAdV異源初免/追加免疫或srRNA/srRNA同源初免/追加免疫進行免疫接種之後的腫瘤生長情況。亦示出與在初免及追加免疫期間投與或不投與抗PD1的初免/追加免疫之比較。每週兩次量測腫瘤體積且呈現研究之前21天之平均腫瘤體積。研究起始時每組22-28隻小鼠。誤差條表示平均值之標準誤差(SEM)。P值使用鄧尼特氏測試測定；*** P＜0.0001，**P＜0.001， *P＜0.05。ChAdV= ChAdV68.5WTnt.MAG25mer；srRNA= VEE-MAG25mersrRNA。圖 33 說明在CT26腫瘤模型中用ChAdV/srRNA異源初免/追加免疫、srRNA/ChAdV異源初免/追加免疫或srRNA/srRNA同源初免/追加免疫進行免疫接種之後的存活情況。亦示出與在初免及追加免疫期間投與或不投與抗PD1的初免/追加免疫之比較。P值使用對數秩測試測定；*** P＜0.0001，**P＜0.001，*P＜0.01。ChAdV= ChAdV68.5WTnt.MAG25mer；srRNA= VEE-MAG25mer srRNA。圖 34 說明在異源初免/追加免疫之後印度恆河猴中之細胞免疫反應。在初次初始免疫接種之後7、14、21、28或35天以及在第一次追加免疫之後7天，使用ELISpot量測ChAdV68.5WTnt.MAG25mer/ VEE-MAG25mersrRNA異源初免/追加免疫組(6隻恆河猴)之PBMC中針對六個不同mamu A01限制性抗原決定基之抗原特異性IFN-γ產生情況。結果以堆疊條形圖形式呈現對於各抗原決定基，每106 個PBMC之平均斑點形成細胞(SFC)數。圖 35 說明在利用或不利用抗CTLA4情況下免疫接種ChAdV之後印度恆河猴中的細胞免疫反應。在初始免疫接種之後14天，使用ELISpot量測在添加或不添加靜脈內(IV)或局部(SC)投與之抗CTLA4情況下，用ChAdV68.5WTnt.MAG25mer免疫接種(6隻恆河猴/組)之後PBMC中針對六個不同mamu A01限制性抗原決定基的抗原特異性IFN-γ產生情況。結果以堆疊條形圖形式呈現對於各抗原決定基，每106 個PBMC之平均斑點形成細胞(SFC)數。

Claims (94)

  1. 一種包含新抗原卡匣之黑猩猩腺病毒載體，該新抗原卡匣包含： (1) 源於個體內存在之腫瘤的複數個新抗原編碼核酸序列，該複數個新抗原編碼核酸序列包含： 至少兩個腫瘤特異性及個體特異性MHC I類新抗原編碼核酸序列，各自包含： a. 具有至少一個改變之MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，該改變使所編碼之肽序列不同於野生型核酸序列編碼之相應肽序列， b. 視情況5'連接子序列，及 c. 視情況3'連接子序列； (2) 可操作地連接於該複數個序列中之至少一者的至少一個啟動子序列， (3) 視情況至少一個MHC II類抗原編碼核酸序列； (4) 視情況至少一個GPGPG連接子序列(SEQ ID NO:56)；及 (5) 視情況至少一個聚腺苷酸化序列。
  2. 一種黑猩猩腺病毒載體，其包含： a. 包含具有E1 (nt 577至3403)缺失及E3 (nt 27,125-31,825)缺失之SEQ ID NO:1序列的經修飾之ChAdV68序列； b. CMV啟動子序列； c. SV40聚腺苷酸化信號核苷酸序列；及 d. 新抗原卡匣，該新抗原卡匣包含： (1) 源於個體內存在之腫瘤的複數個新抗原編碼核酸序列，該複數個新抗原編碼核酸序列包含： 至少20個彼此線性連接之腫瘤特異性及個體特異性MHC I類新抗原編碼核酸序列，且各自包含： (A) 具有至少一個改變之MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，該改變使所編碼之肽序列不同於野生型核酸序列編碼之相應肽序列，其中該MHC I抗原決定基編碼核酸序列編碼7-15個胺基酸長之MHC I類抗原決定基， (B) 5'連接子序列，其中該5'連接子序列為該MHC I抗原決定基之天然5'核酸序列，且其中該5'連接子序列編碼至少5個胺基酸長之肽， (C) 3'連接子序列，其中該3'連接子序列為該MHC I抗原決定基之天然3'核酸序列，且其中該3'連接子序列編碼至少5個胺基酸長之肽，及 其中該等MHC I類新抗原編碼核酸序列中之每一者編碼25個胺基酸長之多肽，且其中各MHC I類新抗原編碼核酸序列之各3'端連接於後續MHC I類新抗原編碼核酸序列之5'端，該複數個新抗原編碼核酸序列中最後的MHC I類新抗原編碼核酸序列除外；及 (2) 至少兩個MHC II類抗原編碼核酸序列，其包含： (A) PADRE MHC II類序列(SEQ ID NO:48)， (B) 破傷風類毒素MHC II類序列(SEQ ID NO:46)， (C) 連接該PADRE MHC II類序列及該破傷風類毒素MHC II類序列之第一GPGPG連接子序列， (D) 使該至少兩個MHC II類抗原編碼核酸序列之5'端連接於該複數個新抗原編碼核酸序列之第二GPGPG連接子序列， (E) 使該至少兩個MHC II類抗原編碼核酸序列之3'端連接於該SV40聚腺苷酸化信號核苷酸序列之第三GPGPG連接子序列；及 其中該新抗原卡匣插入該E1缺失內且該CMV啟動子序列可操作地連接於該新抗原卡匣。
  3. 如請求項1之載體，其中該載體之各元件的有序序列描述於下式中，自5'至3'包含： Pa -(L5b -Nc -L3d )X -(G5e -Uf )Y -G3g -Ah 其中P包含可操作地連接於該複數個序列中之至少一者的至少一個啟動子序列，其中a = 1， N包含具有至少一個改變之MHC I類抗原決定基編碼核酸序列中之一者，該改變使所編碼之肽序列不同於野生型核酸序列編碼之相應肽序列，其中c = 1， L5包含該5'連接子序列，其中b = 0或1， L3包含該3'連接子序列，其中d = 0或1， G5包含該至少一個GPGPG連接子序列中之一者，其中e = 0或1， G3包含該至少一個GPGPG連接子序列中之一者，其中g = 0或1， U包含該至少一個MHC II類抗原編碼核酸序列中之一者，其中f = 1， A包含該至少一個聚腺苷酸化序列，其中h = 0或1， X = 2至400，其中對於各X，相應Nc 為不同MHC I類抗原決定基編碼核酸序列，及 Y = 0-2，其中對於各Y，相應Uf 為MHC II類抗原編碼核酸序列。
  4. 如請求項3之載體，其中 b = 1，d = 1，e = 1，g = 1，h = 1，X = 20，Y = 2， P為CMV啟動子序列， 各N編碼7-15個胺基酸長之MHC I類抗原決定基， L5為該MHC I抗原決定基之天然5'核酸序列，且其中該5'連接子序列編碼至少5個胺基酸長之肽， L3為該MHC I抗原決定基之天然3'核酸序列，且其中該3'連接子序列編碼至少5個胺基酸長之肽， U為PADRE MHC II類序列及破傷風類毒素MHC II類序列中之一者， 該黑猩猩腺病毒載體包含經修飾之ChAdV68序列，其包含具有E1 (nt 577至3403)缺失及E3 (nt 27,125-31,825)缺失之SEQ ID NO:1序列，且該新抗原卡匣插入該E1缺失內，及 該等MHC I類新抗原編碼核酸序列中之每一者編碼25個胺基酸長之多肽。
  5. 如請求項1之載體，其中該複數個新抗原編碼核酸序列中之至少一者編碼該腫瘤細胞表面上由MHC I類呈現之多肽序列或其部分。
  6. 如上述請求項中任一項排除請求項2或4之載體，其中該複數個抗原編碼核酸序列中之每一者彼此直接連接。
  7. 如上述請求項中任一項排除請求項2或4之載體，其中該複數個抗原編碼核酸序列中之至少一者用連接子連接於該複數個抗原編碼核酸序列中之不同抗原編碼核酸序列。
  8. 如請求項7之載體，其中該連接子連接兩個MHC I類序列或將MHC I類序列連接於MHC II類序列。
  9. 如請求項8之載體，其中該連接子係選自由以下組成之群：(1)連續甘胺酸殘基，至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個殘基長；(2)連續丙胺酸殘基，至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個殘基長；(3)兩個精胺酸殘基(RR)；(4)丙胺酸、丙胺酸、酪胺酸(AAY)；(5)由哺乳動物蛋白酶體有效加工之至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基長之共同序列；及(6)側接源於同源蛋白的抗原且至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或2-20個胺基酸殘基長之一或多個天然序列。
  10. 如請求項7之載體，其中該連接子連接兩個MHC II類序列或將MHC II類序列連接於MHC I類序列。
  11. 如請求項10之載體，其中該連接子包含序列GPGPG。
  12. 如上述請求項中任一項排除請求項2或4之載體，其中該複數個序列中之至少一者可操作地或直接地連接於增強該複數個序列之表現、穩定性、細胞運輸、加工及呈現及/或免疫原性的分離或連續序列。
  13. 如請求項12之載體，其中該分離或連續序列包含以下中之至少一者：泛素序列、經修飾以增加蛋白酶體靶向之泛素序列(例如該泛素序列在位置76含有Gly至Ala取代)、免疫球蛋白信號序列(例如IgK)、主要組織相容性I類序列、溶酶體相關膜蛋白(LAMP)-1、人類樹突狀細胞溶酶體相關膜蛋白及主要組織相容性II類序列；視情況其中該經修飾以增加蛋白酶體靶向之泛素序列為A76。
  14. 如上述請求項中任一項之載體，其中該複數個新抗原編碼核酸序列中之至少一者編碼相對於經轉譯之相應野生型核酸序列對其相應MHC等位基因之結合親和力增加的多肽序列或其部分。
  15. 如上述請求項中任一項之載體，其中該複數個新抗原編碼核酸序列中之至少一者編碼相對於經轉譯之相應野生型核酸序列對其相應MHC等位基因之結合穩定性增加的多肽序列或其部分。
  16. 如上述請求項中任一項之載體，其中該複數個新抗原編碼核酸序列中之至少一者編碼相對於經轉譯之相應野生型核酸序列在其相應MHC等位基因上呈現之可能性增加的多肽序列或其部分。
  17. 如上述請求項中任一項之載體，其中該至少一個改變包含點突變、讀框轉移突變、非讀框轉移突變、缺失突變、插入突變、剪接變體、基因組重排或蛋白酶體產生之剪接抗原。
  18. 如上述請求項中任一項之載體，其中該腫瘤係選自由以下組成之群：肺癌、黑素瘤、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、胃癌、結腸癌、睪丸癌、頭頸癌、胰臟癌、腦癌、B細胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴球性白血病、T細胞淋巴球性白血病、非小細胞肺癌及小細胞肺癌。
  19. 如上述請求項中任一項排除請求項2或4之載體，其中該複數個序列中之每一者的表現係由該至少一個啟動子驅動。
  20. 如上述請求項中任一項排除請求項2或4之載體，其中該複數個序列包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個核酸序列。
  21. 如上述請求項中任一項排除請求項2或4之載體，其中該複數個序列包含至少11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或多至400個核酸序列。
  22. 如上述請求項中任一項排除請求項2或4之載體，其中該複數個序列包含至少2-400個核酸序列，且其中該複數個新抗原編碼核酸序列中之至少兩者編碼該腫瘤細胞表面上由MHC I類呈現之多肽序列或其部分。
  23. 如上述請求項中任一項排除請求項2或4之載體，其中該複數個序列包含至少2-400個核酸序列，且其中當投與該個體且轉譯時，該等新抗原中之至少一者呈現在抗原呈現細胞上，引起靶向該腫瘤細胞表面上之該等新抗原中之至少一者的免疫反應。
  24. 如上述請求項中任一項排除請求項2或4之載體，其中該複數個序列包含至少2-400個MHC I類及/或II類新抗原編碼核酸序列，其中當投與該個體且轉譯時，該等MHC I類或II類新抗原中之至少一者呈現在抗原呈現細胞上，引起靶向該腫瘤細胞表面上之該等新抗原中之至少一者的免疫反應，且視情況其中該至少2-400個MHC I類或II類新抗原編碼核酸序列中之每一者的表現係由該至少一個啟動子驅動。
  25. 如上述請求項中任一項排除請求項2或4之載體，其中各MHC I類新抗原編碼核酸序列編碼8至35個間胺基酸長、視情況9-17、9-25、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35個胺基酸長之多肽序列。
  26. 如上述請求項中任一項排除請求項2或4之載體，其中存在該至少一個MHC II類抗原編碼核酸序列。
  27. 如上述請求項中任一項排除請求項2或4之載體，其中該至少一個MHC II類抗原編碼核酸序列存在且包含至少一個包含至少一個改變之MHC II類新抗原編碼核酸序列，該改變使所編碼之肽序列不同於野生型核酸序列編碼之相應肽序列。
  28. 如上述請求項中任一項排除請求項2或4之載體，其中該至少一個MHC II類抗原編碼核酸序列為12-20、12、13、14、15、16、17、18、19、20或20-40個胺基酸長。
  29. 如上述請求項中任一項排除請求項2或4之載體，其中該至少一個MHC II類抗原編碼核酸序列存在且包含至少一個通用MHC II類抗原編碼核酸序列，視情況其中該至少一個通用序列包含破傷風類毒素及PADRE中之至少一者。
  30. 如上述請求項中任一項排除請求項2或4之載體，其中該至少一個啟動子序列為誘導型。
  31. 如上述請求項中任一項排除請求項2或4之載體，其中該至少一個啟動子序列為非誘導型。
  32. 如上述請求項中任一項排除請求項2或4之載體，其中該至少一個啟動子序列為CMV、SV40、EF-1、RSV、PGK或EBV啟動子序列。
  33. 如上述請求項中任一項之載體，其中該新抗原卡匣另外包含可操作地連接於該複數個序列中之至少一者的至少一個聚腺苷酸化(polyA)序列，視情況其中該polyA序列位於該複數個序列中之至少一個序列的3'。
  34. 如請求項33之載體，其中該polyA序列包含SV40 polyA序列。
  35. 如上述請求項中任一項之載體，其中該新抗原卡匣另外包含以下中之至少一者：內含子序列、土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE)序列、內部核糖體入口序列(IRES)序列，或已知增強可操作地連接於該複數個序列中之至少一者的mRNA的核輸出、穩定性或轉譯效率的5'或3'非編碼區中之序列。
  36. 如上述請求項中任一項之載體，其中該新抗原卡匣另外包含報導基因，其包括(但不限於)綠色螢光蛋白(GFP)、GFP變體、分泌型鹼性磷酸酶、螢光素酶或螢光素酶變體。
  37. 如上述請求項中任一項之載體，其中該載體另外包含編碼至少一種免疫調節物之一或多個核酸序列。
  38. 如請求項37之載體，其中該免疫調節物為抗CTLA4抗體或其抗原結合片段、抗PD-1抗體或其抗原結合片段、抗PD-L1抗體或其抗原結合片段、抗4-1BB抗體或其抗原結合片段、或抗OX-40抗體或其抗原結合片段。
  39. 如請求項38之載體，其中該抗體或其抗原結合片段為Fab片段、Fab'片段、單鏈Fv (scFv)、單域抗體(sdAb)呈單特異性或多特異性連接在一起(例如駱駝科抗體域)、或全長單鏈抗體(例如具有藉由可撓性連接子連接之重鏈及輕鏈的全長IgG)。
  40. 如請求項38之載體，其中該抗體之重鏈及輕鏈序列為由自裂解序列(諸如2A)或IRES分開的連續序列；或該抗體之重鏈及輕鏈序列係由可撓性連接子(諸如連續甘胺酸殘基)連接。
  41. 如請求項37之載體，其中該免疫調節物為細胞介素。
  42. 如請求項41之載體，其中該細胞介素為IL-2、IL-7、IL-12、IL-15或IL-21或其各自變體中之至少一者。
  43. 如上述請求項中任一項排除請求項2或4之載體，其中該載體為黑猩猩腺病毒ChAdV68載體。
  44. 如上述請求項中任一項排除請求項2或4之載體，其中該載體包含SEQ ID NO:1中所列之序列。
  45. 如上述請求項中任一項排除請求項2或4之載體，其中該載體包含SEQ ID NO:1中所列之序列，但完全缺失或功能缺失選自由以下組成之群的至少一個基因中的序列：SEQ ID NO:1中所列序列的黑猩猩腺病毒E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4及L5基因，視情況其中完全缺失或功能缺失以下的序列：SEQ ID NO:1中所列序列的(1) E1A及E1B；(2) E1A、E1B及E3；或(3) E1A、E1B、E3及E4。
  46. 如上述請求項中任一項排除請求項2或4之載體，其中該載體包含獲自SEQ ID NO:1序列之基因或調節序列，視情況其中該基因係選自由以下組成之群：SEQ ID NO:1中所列序列的黑猩猩腺病毒反向末端重複序列(ITR)、E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4及L5基因。
  47. 如上述請求項中任一項排除請求項2或4之載體，其中該新抗原卡匣插入該載體中之E1區、E3區及/或允許併入該新抗原卡匣之任何缺失的AdV區。
  48. 如上述請求項中任一項排除請求項2或4之載體，其中該載體係由第一代、第二代或輔助病毒(helper)依賴性腺病毒載體中之一者產生。
  49. 如上述請求項中任一項排除請求項2或4之載體，其中該載體包含SEQ ID NO:1中所列序列的鹼基對編號577與3403之間或鹼基對456與3014之間的一或多個缺失，且視情況其中該載體另外包含鹼基對27,125與31,825之間或鹼基對27,816與31,333之間的一或多個缺失。
  50. 如上述請求項中任一項排除請求項2或4之載體，其中該載體另外包含SEQ ID NO:1中所列序列的鹼基對編號3957與10346、鹼基對編號21787與23370及鹼基對編號33486與36193之間的一或多個缺失。
  51. 如上述請求項中任一項排除請求項2或4之載體，其中該至少兩個MHC I類新抗原編碼核酸序列係藉由執行以下步驟來選擇： 自該腫瘤獲得外顯子組、轉錄組或全基因組腫瘤核苷酸定序資料中之至少一者，其中該腫瘤核苷酸定序資料用於獲得代表新抗原集合中每一者之肽序列的資料； 將各新抗原之肽序列輸入呈現模型中，以產生該等新抗原中之每一者在該腫瘤之腫瘤細胞表面上由該等MHC等位基因中之一或多者呈現的數值可能性集合，該數值可能性集合已至少基於所接收之質譜資料鑑別；及 基於該數值可能性集合選擇該新抗原集合之子集，以產生經選擇之新抗原集合，其用於產生該至少兩個MHC I類新抗原編碼核酸序列。
  52. 如請求項2之載體，其中該等MHC I類抗原決定基編碼核酸序列中之每一者係藉由執行以下步驟來選擇： 自該腫瘤獲得外顯子組、轉錄組或全基因組腫瘤核苷酸定序資料中之至少一者，其中該腫瘤核苷酸定序資料用於獲得代表新抗原集合中每一者之肽序列的資料； 將各新抗原之肽序列輸入呈現模型中，以產生該等新抗原中之每一者在該腫瘤之腫瘤細胞表面上由該等MHC等位基因中之一或多者呈現的數值可能性集合，該數值可能性集合已至少基於所接收之質譜資料鑑別；及 基於該數值可能性集合選擇該新抗原集合之子集，以產生經選擇之新抗原集合，其用於產生該至少兩個MHC I類新抗原編碼核酸序列。
  53. 如請求項51之載體，其中該經選擇之新抗原集合的數目為2-20個。
  54. 如請求項51或52之載體，其中該呈現模型表示以下兩者之間的依賴性： 該等MHC等位基因中之一對特定等位基因及在肽序列之特定位置之特定胺基酸的存在；及 在該腫瘤細胞表面上由該對MHC等位基因中之一特定者呈現包含該特定胺基酸在該特定位置之此類肽序列的可能性。
  55. 如請求項51或52之載體，其中選擇該經選擇之新抗原集合包含基於該呈現模型選擇相對於未經選擇之新抗原在該腫瘤細胞表面上呈現之可能性增加的新抗原。
  56. 如請求項51或52之載體，其中選擇該經選擇之新抗原集合包含基於該呈現模型選擇相對於未經選擇之新抗原能夠在該個體中誘導腫瘤特異性免疫反應之可能性增加的新抗原。
  57. 如請求項51或52之載體，其中選擇該經選擇之新抗原集合包含基於該呈現模型選擇相對於未經選擇之新抗原能夠由專職抗原呈現細胞(APC)呈現於初始T細胞之可能性增加的新抗原，視情況其中該APC為樹突狀細胞(DC)。
  58. 如請求項51或52之載體，其中選擇該經選擇之新抗原集合包含基於該呈現模型選擇相對於未經選擇之新抗原經由中心或外周耐受性受抑制之可能性降低的新抗原。
  59. 如請求項51或52之載體，其中選擇該經選擇之新抗原集合包含基於該呈現模型選擇相對於未經選擇之新抗原能夠在該個體中誘導對正常組織之自體免疫反應之可能性降低的新抗原。
  60. 如請求項51或52之載體，其中外顯子組或轉錄組核苷酸定序資料係藉由對該腫瘤組織進行定序而獲得。
  61. 如請求項51或52之載體，其中該定序為下一代定序(NGS)或任何大規模平行定序方法。
  62. 如上述請求項中任一項之載體，其中該新抗原卡匣包含由該新抗原卡匣中之相鄰序列形成的連接抗原決定基序列。
  63. 如請求項之載體，其中至少一個或每個連接抗原決定基序列對MHC之親和力大於500 nM。
  64. 如請求項之載體，其中每個連接抗原決定基序列為非自身的。
  65. 如上述請求項中任一項之載體，其中該新抗原卡匣不編碼包含轉譯之野生型核酸序列之非治療性MHC I類或II類抗原決定基核酸序列，其中該非治療性抗原決定基經預測顯示於該個體之MHC等位基因上。
  66. 如請求項65之載體，其中該經預測之非治療性MHC I類或II類抗原決定基序列為由該新抗原卡匣中之相鄰序列形成的連接抗原決定基序列。
  67. 如請求項62或66之載體，其中該預測係基於將非治療性抗原決定基之序列輸入呈現模型中而產生之呈現可能性。
  68. 如請求項62至67中任一項之載體，其中該新抗原卡匣中之複數個抗原編碼核酸序列的順序係藉由一系列步驟來確定，包含： 1. 產生對應於該複數個抗原編碼核酸序列之不同順序的候選新抗原卡匣序列集合； 2. 對於每個候選新抗原卡匣序列，基於該候選新抗原卡匣序列中非治療性抗原決定基之呈現來確定呈現分數；及 3. 選擇與低於預定閾值之呈現分數相關的候選卡匣序列作為新抗原疫苗之新抗原卡匣序列。
  69. 一種醫藥組合物，其包含如上述請求項中任一項之載體及醫藥學上可接受之載劑。
  70. 如請求項69之醫藥組合物，其中該組合物另外包含佐劑。
  71. 如請求項69或70之醫藥組合物，其中該組合物另外包含免疫調節物。
  72. 如請求項71之醫藥組合物，其中該免疫調節物為抗CTLA4抗體或其抗原結合片段、抗PD-1抗體或其抗原結合片段、抗PD-L1抗體或其抗原結合片段、抗4-1BB抗體或其抗原結合片段、或抗OX-40抗體或其抗原結合片段。
  73. 一種經分離之核苷酸序列，其包含上述載體請求項中任一項之新抗原卡匣及獲自SEQ ID NO:1序列之基因，視情況其中該基因係選自由以下組成之群：SEQ ID NO:1中所列序列的黑猩猩腺病毒ITR、E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4及L5基因，且視情況其中該核苷酸序列為cDNA。
  74. 一種經分離之細胞，其包含如請求項73之核苷酸序列，視情況其中該細胞為CHO、HEK293或其變體、911、HeLa、A549、LP-293、PER.C6或AE1-2a細胞。
  75. 一種載體，其包含如請求項73之核苷酸序列。
  76. 一種套組，其包含如上述載體請求項中任一項之載體及使用說明書。
  77. 一種治療患有癌症之個體之方法，該方法包含向該個體投與如上述載體請求項中任一項之載體或如請求項69至70中任一項之醫藥組合物。
  78. 如請求項77之方法，其中該載體或組合物係經肌內(IM)、皮內(ID)、或皮下(SC)投與。
  79. 如請求項77或78之方法，其另外包含向該個體投與免疫調節物，視情況其中該免疫調節物係在該載體或醫藥組合物投與之前、同時或之後投與。
  80. 如請求項79之方法，其中該免疫調節物為抗CTLA4抗體或其抗原結合片段、抗PD-1抗體或其抗原結合片段、抗PD-L1抗體或其抗原結合片段、抗4-1BB抗體或其抗原結合片段、或抗OX-40抗體或其抗原結合片段。
  81. 如請求項79之方法，其中該免疫調節物係靜脈內(IV)、肌內(IM)、皮內(ID)或皮下(SC)投與。
  82. 如請求項81之方法，其中該皮下投與係靠近該載體或組合物投與部位或非常接近於一或多個載體或組合物引流淋巴結。
  83. 如請求項77至82中任一項之方法，其另外包含向該個體投與第二疫苗組合物。
  84. 如請求項83之方法，其中該第二疫苗組合物係在投與如請求項77至82中任一項之載體或醫藥組合物之前投與。
  85. 如請求項83之方法，其中該第二疫苗組合物係在投與如請求項77至82中任一項之載體或醫藥組合物之後投與。
  86. 如請求項84或85之方法，其中該第二疫苗組合物與如請求項77至82中任一項之載體或醫藥組合物相同。
  87. 如請求項84或85之方法，其中該第二疫苗組合物不同於如請求項77至82中任一項之載體或醫藥組合物。
  88. 如請求項87之方法，其中該第二疫苗組合物包含編碼複數個新抗原編碼核酸序列之自我複製RNA (srRNA)載體。
  89. 如請求項88之方法，其中由該srRNA載體編碼之該複數個新抗原編碼核酸序列與上述載體請求項中任一項之複數個新抗原編碼核酸序列相同。
  90. 一種製造如上述載體請求項中任一項之載體的方法，該方法包含： 獲得包含該至少一個啟動子序列及該新抗原卡匣之質體序列； 將該質體序列轉染至一或多個宿主細胞中；及 自該一或多個宿主細胞分離該載體。
  91. 如請求項90之製造方法，其中分離包含： 溶解該宿主細胞以獲得包含該載體之細胞溶解物；及 自該細胞溶解物且視情況亦自用於培養該宿主細胞之培養基純化該載體。
  92. 如請求項90之製造方法，其中該質體序列係使用以下中之一者產生；在細菌細胞中DNA重組，或細菌重組，或全基因組DNA合成，或全基因組DNA合成與擴增合成之DNA。
  93. 如請求項66之製造方法，其中該一或多個宿主細胞為CHO、HEK293或其變體、911、HeLa、A549、LP-293、PER.C6及AE1-2a細胞中之至少一者。
  94. 如請求項91之製造方法，其中自該細胞溶解物純化該載體涉及層析分離、離心、病毒沈澱及過濾中之一或多者。
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