JP2002541855A

JP2002541855A - 免疫調節分子コード核酸を含むアデノウイルスベクター

Info

Publication number: JP2002541855A
Application number: JP2000612484A
Authority: JP
Inventors: スカリア，エイブラハム; ワヅワース，サミュエル・シー
Original assignee: Genzyme Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 1999-04-21
Filing date: 2000-04-19
Publication date: 2002-12-10
Also published as: EP1210447A2; WO2000063406A3; AU4250600A; WO2000063406A2; US20040023389A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ベクターが個体の細胞の宿主免疫応答を軽減または回避するのを可能にする免疫調節分子コード核酸を個体の細胞に送達するために使用する組換えアデノウイルスベクターに関する。本発明のベクターを用いて、個体の抗原提示細胞のトランスダクションによりアデノウイルス抗原またはトランスジーン生成物に対する免疫寛容を誘導し、および／または腫瘍抗原に対する免疫応答を高めるために抗原提示細胞の半減期を延長することができる。本発明はさらに、目的とする療法用トランスジーンを患者の細胞に送達するために使用する組換えアデノウイルスベクターに関するものであり、該ベクターは少なくとも１つの免疫調節分子コード核酸を含み、これは該核酸を含むベクターがアデノウイルスおよび１以上のトランスジーンに対する宿主抗ウイルス免疫応答を軽減または回避するのを可能にする。これらのベクターはそれらを投与した個体において持続性を高めることができ、トランスジーンの長期投与が容易になり、投与に際しての免疫応答が軽減する。本発明はまた、療法のために患者にトランスジーンを送達する際にそれらのベクターを使用する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】緒言本発明は、個体の細胞に免疫調節分子（１以上）をコードする核酸（免疫調節
分子コード核酸）を送達するために使用できる組換えアデノウイルスベクターに
関する。免疫調節分子コード核酸は、そのベクターがベクターまたはベクターを
宿した細胞に対する免疫応答を軽減または回避するのを可能にする。本発明のベ
クターを用いて、ベクターを投与した個体の抗原提示細胞においてアデノウイル
ス抗原および／または生物活性トランスジーン生成物に対する免疫寛容を誘導し
、ベクターを取り込んで抗原および／またはトランスジーン生成物を発現する身
体細胞（たとえば抗原提示細胞）の半減期を延長することができる。

【０００２】本発明はさらに、目的トランスジーンを個体の細胞に送達するために使用でき
る組換えアデノウイルスベクターに関するものであり、該ベクターは少なくとも
１つの免疫調節分子コード核酸を含み、これは該ベクターがアデノウイルスおよ
び／またはトランスジーンに対する宿主抗ウイルス免疫応答を軽減または回避す
るのを可能にする。これらのベクターはそれらを投与した個体において持続性を
高めることができ、これにより多数回再投与の必要性が少なくなり、かつ投与ま
たは再投与に際しての免疫応答が軽減する。本発明はまた、個体の細胞における
発現のために細胞に遺伝子を送達する際にそれらのベクターを使用する方法に関
する。

【０００３】背景技術トランスジーンをターゲット細胞または組織に送達し、そこでトランスジーン
を発現させて目的表現型効果を得る可能性は、外因性核酸（トランスジーン）を
安全かつ効率的にレシピエント細胞に送達できる遺伝子伝達ビヒクルの開発にか
かっている。このための大部分の試みは、ウイルスがその遺伝子含有物をターゲ
ット細胞に送達する自然の能力を利用するためにウイルス由来ベクターの利用に
注目している。

【０００４】初期の方式はレトロウイルスベクターに注目し、それらが遺伝子療法のための
療法用トランスジーンを送達するために選択されたベクターであった。レトロウ
イルスベクターは細胞ゲノム中へ組み込まれうるからである。しかしレトロウイ
ルスベクターの欠点が明らかになってきた。これには、分裂中の細胞のみに対す
る指向性、ベクター核酸が宿主ゲノムに組み込まれる際に宿主ゲノムに挿入変異
が起きる可能性、トランスジーン発現の経時低下、血清補体系による急速なレト
ロウイルス不活性化、および複製能をもつ（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐ
ｅｔｅｎｔ）レトロウイルスの発生の可能性が含まれる（Ｊｏｌｌｙ，Ｄ．，Ｃ
ａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，１：５１−６４，１９９４；Ｈｏｄｇ
ｓｏｎ，Ｃ．Ｐ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３：２２２−２２５，１
９９５）。

【０００５】約３６ｋｂのゲノムをもつ核二本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノウイルスは、
古典的遺伝学および分子生物学における研究によって十分に解明されている（Ｈ
ｏｒｗｉｔｚ，Ｍ．Ｓ．，”アデノウイルスとそれらの複製”，Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ，第２版，Ｆｉｅｌｄｓｅｔａｌ．編，ＲａｖａｎＰｒｅｓｓ，ニュー
ヨーク，１９９０）。アデノウイルスゲノムは、ウイルスタンパク質の２つの時
間的クラスを考慮して初期転写単位（Ｅ１〜Ｅ４として知られる）と後期転写単
位（Ｌ１〜Ｌ５として知られる）に分類される。これらの事象間を区別するのは
ウイルスＤＮＡ複製である。

【０００６】アデノウイルスベクターのクローニング容量は、そのベクター中に存在するア
デノウイルスゲノムのサイズに比例する。たとえば約８ｋｂのクローニング容量
は、ウイルス増殖に必須でない特定のウイルスゲノム領域（たとえばＥ３）の欠
失、およびその機能が２９３細胞から（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．
Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９−７２，１９７７）またはＡ５４９細胞から（たとえ
ばＩｍｌｅｒｅｔａｌ．，ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，３：７５−８４，１
９９６）ｉｎｔｒａｎｓで回復する可能性のあるゲノム領域（たとえばＥ１）
の欠失により形成できる。そのようなＥ１欠失ベクターは複製欠陥性にされる。
最適保有容量のためのベクターＤＮＡ容量の上限は、野生型ゲノムの長さの約１
０５〜１０８％である。他のウイルス遺伝子生成物をｉｎｔｒａｎｓで供給す
る細胞系を用いたベクター設計において、アデノウイルスゲノムをさらに修飾す
ることができる：たとえばＥ２ａの補足（Ｚｈｏｕｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ
ｏｌ．，７０：７０３０−７０３８，１９９６）、Ｅ４の補足（Ｋｒｏｕｇｌｉ
ａｋｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，６：１５７５−１５８６
，１９９５；Ｗａｎｇｅｔａｌ．，ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，２：７７５−７
８３，１９９５）、またはプロテインＩＸの補足（Ｃａｒａｖｏｋｙｒｉｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６９：６６２７−６６３３，１９９５；Ｋｒｏｕ
ｇｌｉａｋｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，６：１５７５−１
５８６，１９９５）。

【０００７】アデノウイルス由来のベクターは幾つかの利点をもち、これには分裂中および
非分裂中の両方の細胞に対する指向性、病原性の減少、ベクターストック調製の
ために高力価にまで複製する能力、および大きなＤＮＡ挿入配列を保有する能力
が含まれる（Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．，１５８：３９−６６，１９９２；Ｊｏｌｌｙ，Ｄ．，Ｃａｎｃｅ
ｒＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，１：５１−６４，１９９４）。アデノウイルス
ベクターのクローニング容量は、ウイルス増殖に必須でない特定のウイルスゲノ
ム領域（たとえばＥ３）の欠失、またはその機能が２９３細胞によるＥ１機能補
足によりパッケージング細胞系からｉｎｔｒａｎｓで回復するゲノム領域（た
とえばＥ１）の欠失のファクターである（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ
．Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９−７２，１９７７）。最適パッケージングのための
上限は、ベクターの保有容量を増大させるために野生型ゲノムの長さの約１０５
〜１０８％にまで拡大できる。

【０００８】現在までにアデノウイルスベクターにより発現させた遺伝子には、下記のもの
が含まれる：ｐ３５（Ｗｉｌｌｓｅｔａｌ．，ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈ
ｅｒａｐｙ，５：１０７９−１８８，１９９４）；ジストロフィン（Ｖｉｎｃｅ
ｎｔｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ，５：１３０−１３４，
１９９３）；エリスロポエチン（Ｄｅｓｃａｍｐｓｅｔａｌ．，Ｈｕｍａｎ
ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，５：９７９−９８５，１９９４）；オルニチント
ランスカルバミラーゼ（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔｅｔ
ａｌ．，ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，１：２４１−２５６，１９９
０；Ｗｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：３６３９−３６
４６，１９９６）；アデノシンデアミナーゼ（Ｍｉｔａｎｉｅｔａｌ．，Ｈ
ｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，５：９４１−９４８，１９９４）；イン
ターロイキン−２（Ｈａｄｄａｄａｅｔａｌ．，ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴ
ｈｅｒａｐｙ，４：７０３−７１１，１９９３）；ａ１−アンチトリプシン（Ｊ
ａｆｆｅｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ，１：３７２−３７
８，１９９２）；トロンボポエチン（Ｏｈｗａｄａｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ
，８８：７７８−７８４，１９９６）；シトシンデアミナーゼ（Ｏｈｗａｄａ
ｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，７：１５６７−１５７６，１９
９６）；ヒトα−ガラクトシダーゼＡ（ＰＣＴ／ＵＳ９８／２２８８６）；ヒト
β−ガラクトシダーゼＡ（Ａｒｔｈｕｒｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＧｅｎ
ｅＴｈｅｒａｐｙ，４：１７−２５，１９９７）；インターロイキン−７（Ａ
ｒｔｈｕｒｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，４：１
７−２５，１９９７）；単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ遺伝子（ＵＳ
Ｐ５，７６３，４１５）；および嚢胞性線維形成性の膜貫通伝導調節タンパク質
（ＣＦＴＲ）（ＵＳＰ５，６７０，４８８および５，８８２，８７７；Ｚａｂｎ
ｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９７：１５０４−１５１
１，１９９６）。

【０００９】アデノウイルスは気道の細胞に対して指向性をもつため、コーカソイドに最も
一般的にみられる常染色体劣性疾患である嚢胞性線維症（ＣＦ）の療法にはアデ
ノウイルスベクターを使用するのが特に好適である。ＣＦを伴う個体では、気道
上皮のｃＡＭＰ−調節によるＣｌ^-チャンネルの適正な機能を撹乱する膜貫通伝
導調節タンパク質（ＣＦＴＲ）遺伝子変異により起きる肺機能障害が持続する（
ＺａｂｎｅｒＪ．ｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ，６：７５
−８３，１９９４）。ＣＦＴＲ遺伝子を保有するアデノウイルスベクターが開発
され（Ｒｉｃｈ，Ｄ．ｅｔａｌ．，ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，
４：４６１−４７６，１９９３）、これらのベクターはＣＦＴＲをＣＦ患者の気
道上皮（ＺａｂｎｅｒＪ．ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，７５：２０７−２１６，
１９９３；ＺａｂｎｅｒＪ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，
９７：１５０４−１５１１，１９９６）、コトンラットおよび霊長類の気道上皮
（ＺａｂｎｅｒＪ．ｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ，６：７
５−８３，１９９４）、ＣＦ患者の呼吸器上皮（Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｒ．Ｇ．ｅｔ
ａｌ．，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ，８：４２−５１，１９９４）に送
達しうることが研究により示された。最近の研究で、ＣＦＴＲをコードするＤＮ
Ａを含むアデノウイルスベクターをＣＦ患者の気道上皮に投与すると、治療した
上皮細胞に機能性塩素イオンチャンネルを再生しうることが示された（Ｚａｂｎ
ｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９７：１５０４−１５１
１，１９９６）。

【００１０】しかし、アデノウイルスベクターを遺伝子療法に用いてこれまでに行われた臨
床前研究および臨床試験で、これらのベクターの投与には抗ウイルス宿主免疫応
答が伴い、これが陽性結果を制限する可能性のあることが示唆された。免疫系は
、”外来”高分子の存在を検知することにより身体を感染に対して保護する機能
をもつ。外来分子はウイルスまたは他の寄生体のタンパク質であってよい；これ
らのタンパク質は身体の循環系中に存在するか、あるいは身体の特定細胞内にの
み存在する可能性がある。この形の免疫は、身体が外来物質を認識し、抗体の産
生（いわゆる体液性免疫）または死滅活性をもつリンパ球の産生（いわゆる細胞
性免疫）により応答する能力に基づく。体液性免疫および細胞性免疫のエフェク
ターは、高度の特異性および免疫記憶をもつ。さらに、身体が予め外来物質に暴
露されることによらない、より一般的な防御機構もある；これは自然免疫と呼ば
れる。マクロファージが粒子を貪食する能力、炎症反応の一部としてのサイトカ
イン応答、および細菌性ＤＮＡメチル化パターンの認識は、すべて自然免疫の例
である。

【００１１】ウイルスは、身体が自然免疫と特異免疫の両方で応答する感染物質の例である
。ウイルスの構造タンパク質はウイルス感染性を中和しうる抗体反応を刺激し、
細胞内で合成されたウイルスタンパク質はウイルス感染細胞を破壊のためにター
ゲティングしうる細胞性免疫応答を刺激する。さらに、ウイルスは非特異的炎症
反応も誘発する可能性がある。ウイルス系ベクターは、ベクター内にウイルス遺
伝子が保持されているか否か、またウイルス遺伝子が免疫応答を誘発するのに十
分なレベルで発現するか否かに応じて、理論的には特異免疫応答と自然免疫応答
による影響を受ける可能性がある。炎症反応および免疫応答は量に比例するので
、ウイルス遺伝子の発現レベルはきわめて重要となる可能性がある。少量の抗原
は身体による検知を逃れる可能性があるが、大量であれば検知されて応答を誘発
する可能性ははるかに高い。あるウイルス系ベクターは免疫学的問題の発生がよ
り少ないと考えられる。たとえばＡＡＶおよびレトロウイルスベクターは、大部
分の場合すべてのウイルス遺伝子を欠失し、したがってウイルス遺伝子生成物に
対して細胞性免疫応答を生じる可能性が除かれる。それにもかかわらずこれらの
ベクターは、十分な量のベクターが体内に導入されるとウイルス粒子コートタン
パク質に対する抗体反応を刺激する。

【００１２】一般的なＥ１欠失アデノウイルスベクターは、通常は多数のウイルス遺伝子を
保有する。残りの遺伝子の強い発現は、欠失したＥ１遺伝子生成物（産生細胞に
よりｉｎｔｒａｎｓで供給される）の活性に依存するからである。さらに、ア
デノウイルスは細胞ゲノムに組み込まれないので、ウイルス粒子またはウイルス
感染細胞を破壊する宿主免疫応答は、ベクターおよび／またはトランスジーンお
よび／またはターゲット細胞に対する病的炎症反応（アデノウイルス感染細胞を
破壊し、または有害な影響を及ぼす可能性がある）の引き金を引く可能性のある
免疫原分子（特にタンパク質）の産生を始動させるベクターを用いた、ターゲッ
ト細胞におけるトランスジーンの長期送達および発現を制限する可能性がある（
Ｙａｎｇｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ，７：３６２−３６
９，１９９４；Ｙａｎｇｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．，９１：４４０７−４４１１，１９９４；Ｚｓｅｎｇｅｌｌｅｒｅｔａ
ｌ．，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，６：４５７−４６７，１９９５；Ｗｏｒ
ｇａｌｌｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，８：３７−４４，１
９９７；Ｋａｐｌａｎｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，８：４
５−５６，１９９７）。この有害な免疫応答は、トランスジーン発現のためのア
デノウイルスベクターの高用量投与または反復投与もしくは長期投与にとって著
しい障害となる（Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７０：４０４−４
１０，１９９５）。

【００１３】アデノウイルス感染に対する宿主免疫原応答には特に、ウイルス抗原を提示す
る感染細胞を溶解する細胞毒性Ｔ−リンパ球（ＣＴＬ）の発生、腫瘍壊死因子（
ＴＮＦ）によるウイルス感染細胞の溶解、インターフェロンの合成、アポトーシ
スの誘導、および他の免疫機序が含まれる（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｌ．，Ｔｒｅｎｄ
ｓＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２：８１−８８，１９９４）。

【００１４】さらに、トランスジーン生成物がターゲット細胞内で変異するか、または細胞
内に存在しない場合、ベクター投与に対する身体応答にトランスジーン生成物が
及ぼす影響を考慮することが重要である。トランスジーン生成物に対する免疫応
答は、ベクターがウイルス系または非ウイルス系のいずれであろうとベクターの
種類に関係なく起きる可能性がある。たとえば、血友病などの血液凝固障害を伴
う個体は、それらのＶＩＩＩ因子またはＩＸ因子遺伝子に変異がある。ある患者
は欠陥タンパク質を産生し、または活性タンパク質の産生量が少ない。これらの
場合、患者の免疫系はそのタンパク質（ＶＩＩＩまたはＩＸ因子）を自己タンパ
ク質と”みる”。他の個体は凝固因子に対する完全に非機能性の遺伝子をもち、
このため関連タンパク質を正常に産生できない。その結果、患者の免疫系はその
タンパク質を”みる”ことがない。若干の凝固因子を発現する個体の細胞にＶＩ
ＩＩ因子またはＩＸ因子をコードするトランスジーンをベクターにより供給する
場合、このベクターによりコードされるタンパク質に対して患者が免疫応答する
確率は低い。しかし、凝固因子を発現しない個体にＶＩＩＩ因子またはＩＸ因子
をコードするトランスジーンをベクターにより供給する場合、このベクターによ
りコードされるタンパク質に対してこの個体が免疫応答する確率は高い。この免
疫応答は体液性および／または細胞性レベルのものである可能性がある；すなわ
ち抗体が生成してこれが血液からそのタンパク質を排除し、および／または細胞
毒性リンパ球が発生して、ベクターを含み療法タンパク質を発現するベクターを
破壊する可能性がある。

【００１５】トランスジーン発現の持続性を制限する宿主免疫応答を逃れるために、多様な
方策が用いられた。それらは一般に免疫応答自体の調節、または免疫応答を軽減
するベクターの工学的作製を伴う。ベクター投与と一緒に免疫抑制剤を投与する
と、トランスジーンの持続性が延長されることが示された（Ｆａｎｇｅｔａ
ｌ．，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，６：１０３９−１０４４，１９９５；Ｋ
ａｙｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ，１１：１９１−１９７
，１９９５；Ｚｓｅｌｌｅｎｇｅｒｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅ
ｒ．，６：４５７−４６７，１９９５；Ｓｃａｒｉａｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ，４：６１１−６１７，１９９７；ＷＯ９８／０８５４１）。

【００１６】宿主免疫応答を軽減するために、組換えベクターに含まれるアデノウイルスゲ
ノム配列に対する修飾が試みられた（Ｙａｎｇｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，７：３６２−３６９，１９９４；Ｌｉｅｂｅｒｅｔａｌ
．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：８９４４−８９６０，１９９６；Ｇｏｒｚｉｇｌ
ｉａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：４１７３−４１７８；Ｋｏｃｈ
ａｎｅｋｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，
９３：５７３１−５７３６，１９９６；Ｆｉｓｈｅｒｅｔａｌ．，Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ，２１７：１１−２２，１９９６）。アデノウイルスＥ３ｇｐ１９Ｋ
タンパク質は、ＭＨＣクラスＩ抗原とコンプレックス形成してそれらを小胞体内
に保持することができ、これにより細胞表面提示および細胞毒性Ｔリンパ球（Ｃ
ＴＬ）による感染細胞死滅が阻止される（Ｗｏｌｄｅｔａｌ．，Ｔｒｅｎｄ
ｓＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２：４３７−４４３，１９９４）。これは、組換え
アデノウイルスベクターにｇｐ１９Ｋが存在すると有益であることを示唆する。
アデノウイルスベクターが送達するトランスジーンの発現が持続しないのは、転
写ユニットに含まれるプロモーターまたはトランスジーンの選択により生じる制
限のためでもあろう（Ｇｕｏｅｔａｌ．，ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，３：
８０２−８０１，１９９６；Ｔｒｉｐａｔｈｙｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ
Ｍｅｄ．，２：５４５−５５０，１９９６）。最小アデノウイルスベクターをタ
ーゲット細胞および組織における持続的なトランスジーン発現に最適なものにす
るための他の方法も、機能可能な状態で結合したトランスジーンを持続発現させ
る、発現制御要素（たとえばプロモーター）の設計を伴う。独立して個々のウイ
ルス遺伝子にトランスジーンを持続発現させる機能をもつプロモーター要素によ
り、少ないウイルスゲノムを含むベクターの使用が可能になる（たとえばＵＳＰ
５，８８２，８７７参照）。

【００１７】多くのウイルスが、宿主の抗ウイルス反応に対処する機序、たとえば免疫調節
タンパク質をコードするウイルス遺伝子を発現する能力を進化させた。これらの
タンパク質は異種グループであり、多様な機序により抗ウイルス免疫応答を妨害
する能力を特色とする。たとえばポックスウイルスおよびヘルペスウイルスのウ
イルスタンパク質は、補体活性化を遮断することができる。アデノウイルス、ポ
ックスウイルス、ヘルペスウイルスおよびＨＩＶ−１はそれぞれ、インターフェ
ロン仲介によるウイルス複製阻害に対してウイルスを抵抗可能にするタンパク質
をコードする（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｌ．，ＴｒｅｎｄｓＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．，
２：８１−８８，１９９４）。ワクシニアウイルスのＢ１５Ｒ遺伝子はインター
ロイキン−１を結合しうるタンパク質をコードし、これによりインターロイキン
−１の抗ウイルス効果を低下させる（Ｓｐｒｉｇｇｓｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ
，７１：１４５−１５２，１９９２；Ａｌｃａｍｉｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，
７１：１５３−１６７，１９９２）。

【００１８】ウシポックスウイルスのｃｒｍＡ遺伝子は、あるセルピンをコードする。これ
はインターロイキン−１β変換酵素の特異的インヒビターであり（Ｒａｙｅｔ
ａｌ．，Ｃｅｌｌ，６９：５９７−６０４，１９９２）、ウイルス感染細胞の
アポトーシスを阻害する（Ｔｅｗａｒｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２７０：３２５５−３２６０，１９９５）。エプスタイン・バーウイルス
のＢＣＲＦ１遺伝子は、インターロイキン−１０に相同なタンパク質をコードし
、これがインターロイキン−γの合成を阻害する（Ｍｏｏｒｅｔａｌ．，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ，２４８：１２３０−１２３４，１９９０；Ｈｓｕｅｔａｌ．
，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５０：８３０−８３２，１９９０）。単純ヘルペスウイル
スのＩＣＰ４７遺伝子は、ＭＨＣクラスＩ制限細胞へのウイルスペプチドの提示
を遮断するタンパク質をコードする（Ｈｉｌｌｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，
３７５：４１１−４１５，１９９５）。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）はＵＳ
１１を含む；これは、新たに合成されたＭＨＣクラスＩ生成物をタンパク質分解
のためにＥＲから細胞質ゾルへ輸送する小胞体（ＥＲ）膜貫通タンパク質をコー
ドする遺伝子である（Ｗｉｅｒｔｚｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，８４：７６９−
７７９，１９９６）。

【００１９】ウイルスＥ３領域によりコードされる遺伝子（たとえばｇｐ１９Ｋ）がアデノ
ウイルス感染細胞に対する宿主免疫応答を軽減する能力を利用するために、Ｅ３
領域を特異的に保持するアデノウイルスベクターが設計された（Ｒｉｃｈｅｔ
ａｌ．，ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，４：４６１−４７６，１９
９３）。アデノウイルス抗原に対する免疫応答を最小限にするために、クラスＩ
抗原の提示を抑制するタンパク質をコードする非アデノウイルス遺伝子をアデノ
ウイルスベクターに取り込ませることも示唆された。

【００２０】バキュロウイルスのｐ３５遺伝子は、バキュロウイルス感染細胞のアポトーシ
スを遮断するタンパク質をコードする（Ｃｌｅｍｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２５４：１３８８−１３８９，１９９１；Ｈｅｒｓｈｂｅｒｇｅｒｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６８：３４６７−３４７７，１９９４；Ｂｕｍｐ
ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９：１８８５−１８８８，１９９５；Ｘｕ
ｅｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７７：２４８−２５１，１９９５）。

【００２１】アデノウイルスは、感染細胞をＴＮＦ誘導性細胞溶解から保護しうる、ＥＩＢ１９ＫならびにＥ３１４．７Ｋ、１４．５Ｋおよび１０．４Ｋタンパク質を
コードする。前記のように、アデノウイルスＥ３ｇｐ１９Ｋタンパク質はＭＨ
ＣクラスＩ抗原とコンプレックス形成してそれらを小胞体内に保持することがで
き、これにより細胞表面提示および細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）による感染細
胞死滅が阻止される（Ｗｏｌｄｅｔａｌ．，ＴｒｅｎｄｓＭｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ．，２：４３７−４４３，１９９４）。

【００２２】免疫調節タンパク質は哺乳動物細胞によっても産生される。たとえば細胞毒性
リンパ球細胞質セルピンであるプロテイナーゼインヒビター９（Ｐ−Ｉ−９）は
、細胞毒性リンパ球の細胞質において高レベルで発現するタンパク質である。Ｐ
−Ｉ−９は、ｉｎｖｉｔｒｏでグランザイムＢにより誘導される死滅を効果的
に阻害するプロテイナーゼインヒビターである（Ｂｉｒｄｅｔａｌ．，Ｍｏ
ｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，１８：６３８７−６３９８，１９９８；およびＳｕ
ｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：２７８０２−２７８０
９，１９９６）。Ｐ−Ｉ−９は不適性指向（ｍｉｓｄｉｒｅｃｔｅｄ）または不
適性画分化（ｍｉｓｃｏｍｐａｒｔｍｅｔａｌｉｚｅｄ）グランザイムＢが引き
金を引く早期死滅に対して細胞毒性リンパ球を保護するという仮説がある（Ｂｉ
ｒｄｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，１８：６３８７−６３９
８，１９９８）。

【００２３】哺乳動物ｆａｓ／ＣＤ９５リガンド（ｆａｓＬ）細胞表面タンパク質は、移植
に際して外来抗原に応答するＴ細胞のアポトーシスを誘導し、このためｆａｓＬ
を発現するドナー組織は、不適性移植片の場合ですら宿主免疫応答による拒絶に
対して保護される（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７０
：１１８９−１１９２，１９９５；Ｂｅｌｌｇｒａｕｅｔａｌ．，Ｎａｔｕ
ｒｅ，３７７：６３０−６３２，１９９５）。

【００２４】アデノウイルスベクターのタンパク質およびトランスジーン生成物に対する免
疫応答を克服するために用いる方策の１つは、多くの場合、患者にとって新抗原
である可能性をもつアデノウイルスベクターおよびトランスジーン生成物の両方
に対する末梢Ｔ細胞寛容の誘導である。Ｔ細胞の活性化誘導による細胞死（これ
はＴ細胞のアポトーシスがｆａｓおよびｆａｓリガンドのアップレギュレーショ
ンにより仲介される）はＴ細胞応答およびＴ細胞恒常性のダウンレギュレーショ
ンに関与することが知られている（Ｗａｔａｎａｂｅ−Ｆｕｋｕｎａｇａｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１４−３１７，１９９２；Ｚｈｏｕｅｔａｌ．
，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７６：１０６３−１０７２，１９９２；Ｎａｇａｔ
ａ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５７：１２９−１４４，１９９４；およびＤｈ
ｅｉｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７３：４３８−４４１，１９９５）。
最近、アデノウイルスベクターで前免疫化した動物においてすら、バルーン傷害
ラットの頚動脈におけるアデノウイルス仲介ｆａｓＬ発現により、新内膜（ｎｅ
ｏｉｎｔｉｍａ）形成が効果的に阻害され、かつＡｄ／ｆａｓＬ感染細胞が免疫
破壊から保護されることが示された（Ｓａｔａｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９５：１２１３−１２１７，１９９８）。

【００２５】免疫寛容の機序の１つは、免疫特権部位（ｉｍｍｕｎｅｐｒｉｖｉｌｅｇｅ
ｄｓｉｔｅ）の自然発生の利用である。ｆａｓ−ｆａｓＬ経路によるＴ細胞ア
ポトーシスにより仲介される抗原特異Ｔ細胞のクローン消失は、免疫特権部位の
形成、ならびに末梢免疫寛容の維持、および移植片拒絶の阻止に際して、重要な
機序であることが示された（Ｎａｇａｔａ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５７：
１２９−１４４，１９９４；Ｄｈｅｉｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７３
：４３８−４４１，１９９５；Ｂｅｌｌｇｒａｕ，Ｎａｔｕｒｅ，３７７：６３
０−６３２，１９９５；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２
７０：１１８９−１１９２，１９９５；およびＬａｕｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ，２７３：１０９−１１２，１９９６）。これらの部位にアデノウイルス
を挿入すると、アデノウイルスおよびそのトランスジーン生成物に対する免疫寛
容が生じる。網膜下腔にＥ１欠失アデノウイルスを注入すると、細胞性および体
液性免疫応答が最小限に抑えられた（Ｂｅｎｎｅｔｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇ
ｅｎｅＴｈｅｒａｐ．，８：１６２５−１６３４，１９９６）。

【００２６】最近、Ａｄ／ｆａｓＬを発現する抗原提示系統でマウスを前処理すると、Ａｄ
特異Ｔ細胞免疫寛容を誘導しうることが示された（ＷＯ９８／５２６１５、ＷＯ
９８／５１３４０およびＺｈａｎｇｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏＴｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６：１０４５−１０４９）。その後Ａｄ／ｌａｃＺベクタ
ーを静脈内投与すると、肝臓においてｌａｃＺ遺伝子発現が５０日間持続した。
しかし、この方法には２つの主な欠点がある。第１は、抗原提示細胞系において
ｆａｓＬ遺伝子を発現するために用いた方法が、２つの異なるアデノウイルスベ
クター、ＡｄＬｏｘｐｆａｓＬ（Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．
，７２：２４８３−２４９０，１９９８）およびＡｘＣＡＮＣｒｅ（Ｋａｎｅｇ
ａｅｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２３：３８１６−３８
２１，１９９５）の共感染を伴うことである。この方法において、ＡｘＣＡＮＣ
ｒｅはＣｒｅ組換え酵素を発現し、ＡｄＬｏｘｐｆａｓＬベクターからｆａｓＬ
遺伝子の発現を開始させるのに必要である。このように、ｆａｓ遺伝子を含むベ
クターのほかにそれの効率的送達のために余分な成分が必要となる。ｆａｓＬは
Ａｄベクターの増殖に用いる２９３細胞のアポトーシスを誘導するので、ｆａｓ
Ｌを構成的に発現するＡｄベクターは高力価にまで増殖することができない（Ｌ
ａｒｒｅｇｉｎａｅｔａｌ．，ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，５：５６３−５６８
，１９９８）。第２に、ｆａｓ受容体を発現する正常細胞はｆａｓＬ発現により
死滅する可能性があるので、用いる抗原提示細胞系はｆａｓ−変異体Ｂ６−ｌｐ
ｒ／ｌｐｒマウス由来のものであった（Ｍｕｒｕｖｅｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．
ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，８：９５５−９６３，１９９７；Ｋａｎｇｅｔａｌ
．，ＮａｔｕｒｅＭｅｄ．，３：７３８−７４３，１９９７；およびＬａｒｒ
ｅｇｉｎａｅｔａｌ．，ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，５：５６３−５６８，１９
９８）。したがって、正常個体に由来する細胞においてｆａｓＬ発現を達成する
のはきわめて難しい。

【００２７】個体のターゲット細胞にトランスジーンを送達して発現させるのに用いる他の
アデノウイルスベクター構築体であって、トランスジーンに対する免疫応答、お
よびウイルス遺伝子を含むベクターから発現する可能性のある他の非宿主関連遺
伝子に対する免疫応答を、軽減する構築体が求められている。アデノウイルスに
対する宿主免疫応答を軽減または回避することにより宿主における目的トランス
ジーン発現の持続性を高める、他のアデノウイルスベクターも求められている。

【００２８】発明の概要本発明は、少なくともアデノウイルスＥ１領域を欠失し、ベクターの欠失部位
に少なくとも１つの免疫調節分子コード核酸が挿入されたアデノウイルスゲノム
を含む組換えアデノウイルスベクターであって、個体の細胞の宿主免疫応答を軽
減または回避するベクターに関する。本発明の組換えアデノウイルスベクターは
、所望により生物活性トランスジーン、たとえば嚢胞性線維形成性膜貫通タンパ
ク質、生物活性ヒトリソソーム酵素または腫瘍抗原をも含むことができる。先行
技術の方法およびベクターと異なり、本発明のベクターは個体の細胞に免疫調節
分子コード核酸を送達し、該ベクターを送達された細胞において免疫調節分子コ
ード核酸を発現することができる。免疫調節分子コード核酸を発現または送達す
るために他の成分または因子を必要としない。このベクターは、抗原提示細胞の
半減期を延長するのに有効な量のベクターを該細胞に導入することにより、癌免
疫療法用としての抗原提示細胞の半減期を延長するのに使用できる。

【００２９】具体的態様において本発明は、少なくともアデノウイルスＥ１領域およびアデ
ノウイルスゲノムの第２領域を欠失し、ベクターの欠失部位の１つにｆａｓＬ遺
伝子が挿入され、アポトーシスまたはＣＴＬ溶解を阻止する分子をコードするト
ランスジーンがベクターの第２欠失領域に挿入されたアデノウイルスゲノムを含
む組換えアデノウイルスベクターであって、該ベクターが細胞に取り込まれ、そ
してｆａｓＬ遺伝子およびアポトーシスまたはＣＴＬ溶解を阻止するトランスジ
ーンを発現するベクターに関する。本発明のベクターは、ベクターを投与した個
体の抗原提示細胞において、ベクターが発現したアデノウイルス抗原またはトラ
ンスジーン生成物に対する免疫寛容を誘導するために使用できる。最も具体的態
様においてベクターは、アデノウイルスゲノムの欠失Ｅ１領域に挿入されたｆａ
ｓＬ遺伝子、および欠失Ｅ３領域に挿入されたバキュロウイルスｐ３５遺伝子ま
たはＰ−Ｉ−９遺伝子を含む。

【００３０】本発明はさらに、アデノウイルスＥ１領域およびアデノウイルスゲノムの少な
くとも１つの他の領域を欠失し、目的トランスジーンが一方の欠失部位に挿入さ
れ、少なくとも１つの免疫調節分子コード核酸が他方の欠失部位に挿入されたア
デノウイルスゲノムを含む組換えアデノウイルスベクターであって、該ベクター
を投与した個体の細胞にトランスジーンを送達して発現することができ、該個体
の細胞の宿主免疫応答を軽減または回避するベクターに関する。その結果、目的
トランスジーンおよび免疫調節分子コード核酸の両方を含む本発明のベクターは
、ベクターを投与した細胞および組織におけるアデノウイルスベクターおよびト
ランスジーン発現の持続性を高める。本発明は、個体のターゲット細胞にトラン
スジーンを供給し、そこでトランスジーンを発現させてターゲット細胞の表現型
を変更する方法にも関する。本発明は、ベクターからトランスジーンの有効な投
与および発現に必要なウイルス遺伝子を排除することなく、アデノウイルスベク
ターに対する有害な宿主免疫応答の問題に対する解決策を提供する。さらに本発
明の利点は、アデノウイルスベクターに対する免疫応答を軽減するための宿主免
疫抑制の必要性が著しく軽減し、または回避されることである。

【００３１】発明の詳細な記述本発明の１態様において、アデノウイルスベクターは、宿主の抗ウイルス免疫
機構と相互作用して、ウイルス粒子および感染細胞を破壊する免疫応答を軽減ま
たは回避する免疫調節分子（１以上）をコードする１以上の核酸を含む。免疫調
節分子は、特にタンパク質、リボザイムまたはアンチセンスＲＮＡであってよい
。その結果、これらのベクターは、ベクターを投与した細胞および組織における
アデノウイルスベクターおよびトランスジーン発現の持続性を高める。宿主免疫
応答の回避は、本発明のアデノウイルスベクターが宿主細胞にそこでのトランス
ジーン発現のためにトランスジーンを効率的に反復送達して、細胞におけるトラ
ンスジーン生成物に関連する表現型を変更し、かつベクターを投与した抗原提示
細胞に対する免疫寛容を誘導する能力にとって有利である。本発明は、アデノウ
イルスベクターに対する有害な宿主免疫応答という現在の問題に対する解決策を
提供する。この免疫応答のため、個体にベクターを反復投与することができなか
った。本発明はさらに、ベクターからすべてのウイルスゲノムを排除するという
必要がなく、宿主免疫抑制の必要性が大幅に低下し、または排除すらされるとい
う利点をもつ。本発明には、本発明のベクターを用いて宿主免疫応答を軽減また
は回避する方法、および本発明のベクターを用いてトランスジーンをターゲット
細胞に送達し、そこで発現させる方法も含まれる。

【００３２】１態様において、本発明のベクターは１以上の免疫調節分子コード核酸を含む
。他の態様において、本発明のベクターはトランスジーンをも含む。本発明のベクターに取り込ませることができる免疫調節分子コード核酸には、
バキュロウイルスｐ３５、ｆａｓＬ／ＣＤ９５リガンド、ＣＬＰ−Ｉ−９タン
パク質が含まれるが、これらに限定されない。

【００３３】本発明のベクターは、複製欠損アデノウイルスベクターに基づく。これは、特
定のトランスジーンを細胞に送達することはできるが、安全のため宿主において
複製できない。本発明のアデノウイルスベクターは、多様なアデノウイルス血清
型のゲノムに由来する。これにはアデノウイルス２、４、５、６、７および１７
型、ならびに一般に非癌原性血清型が含まれるが、これらに限定されない。好ま
しくは、アデノウイルスはヒトアデノウイルスのＣ属から選択され、好ましくは
アデノウイルス２、５または６型である。本発明のベクターは異なるアデノウイ
ルス血清型からのゲノム領域を含むことができる。

【００３４】本発明のベクターにおいてそれらを複製不能（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｉｎ
ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）にするために欠失しうるアデノウイルスゲノム領域には、
Ｅ１ゲノム領域が含まれる；欠失しうる他のゲノム領域には、Ｅ２、Ｅ３および
Ｅ４が含まれる（Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．，１５８：３９−６６，１９９２）。

【００３５】免疫調節分子コード核酸は、目的トランスジーンをレシピエント細胞に送達す
るのに適した任意の組換えアデノウイルスベクター中へクローニングできる。そ
のようなベクターの１つは、Ｅ１領域、およびアデノウイルスゲノムのＥ３領域
のヌクレオチド２９２９２〜３０８４０を含む１．６ｋｂ部分を欠失した、アデ
ノウイルスゲノムを含む（ＵＳＳＮ０８／８３９，５５３に開示）。そのような
ベクターにおいて、アデノウイルスＥ４領域はベクターに保持されることが好ま
しい。好ましい態様において、このベクターはウイルスのＥ１ゲノム領域を欠失
し、これにより自律複製に必要なＥ１Ａタンパク質のコード配列は排除され、か
つウイルスゲノムのＥＩＢ領域の全部または一部が排除される可能性がある。パ
ッケージング容量を最適化するために、アデノウイルスゲノムのプロテインＩＸ
コード配列をこれらのベクターに保持させてもよい。具体的態様においては、こ
れらの配列がパッケージング細胞系において相同アデノウイルス配列との組換え
を仲介する能力（これによりベクター産生中に複製能をもつアデノウイルスを生
成する可能性がある）を低下させるために、プロテインＩＸコード配列をＥ１配
列のそれらの本来の位置からアデノウイルス内の他の位置へ再配置させることが
できる（ＵＳＰ５，８２４，５４４および５，７０７，６１８；Ｈｅｈｉｒｅ
ｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：８４５９−８４６７，１９９６）。これ
らのベクターは、アデノウイルスＥ２ゲノム領域の全部または一部を保持する。
Ｅ３領域の修飾、たとえばＥ３コード配列のトランケーション、または特定のオ
ープンリーディングフレームを排除する欠失は許容される。ただし、これらの変
更は、免疫調節分子コード核酸またはトランスジーンの持続発現を妨害しないも
のである。ｇｐ１９Ｋタンパク質はウイルス抗原提示において特別な免疫調節の
役割をもつため、好ましくはＥ３領域に対する修飾はｇｐ１９Ｋタンパク質に対
する遺伝子を保持するものであり、これによりアデノウイルス感染細胞に対する
ＣＴＬ応答が制限される（Ｗｏｌｄｅｔａｌ．，ＴｒｅｎｄｓＭｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．，４３７−４４３，１９９４）。他の免疫調節タンパク質、たとえば
１０．４Ｋ、１４．５Ｋおよび１４．７Ｋに対するアデノウイルス遺伝子の保持
も、Ｅ３領域に対して考慮される修飾の範囲に含まれる。あるいは、Ｅ３遺伝子
全部（ヌクレオチド２７，９７１〜３０，９３７）を欠失してもよい。

【００３６】具体的態様において、アデノウイルスベクターはＡｄ２／ＣＭＶ／Ｅ３△１．
６である。これはＣＭＶプロモーターを含み、これに免疫調節分子コード核酸が
機能可能な状態で結合することができ、さらにＥ１欠失、およびＥ３領域からの
１．６ｋｂの部分欠失を含む（ＵＳＳＮ０８／８３９，５５３に開示）。詳細に
は、それはＥ３のアデノウイルスヌクレオチド２９２９２〜３０８４０の１５４
９ヌクレオチドを含む領域を欠失している（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｊ．ｅｔａ
ｌ．，アデノウイルスＤＮＡ，ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｉｎＭｏｌｅｃｕ
ｌａｒＶｉｒｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｄｏｅｒｆｌｅｒ編，８：１−１５，１９８６
）。ベクターＡｄ２／ＣＭＶ／Ｅ３△１．６のＥ３領域に対するこれらの修飾に
より、下記の結果が得られる：（ａ）Ｅ３領域のすべての下流スプライス受容体
部位を欠失し、ｍＲＮＡ（ａ）のみがＥ３プロモーターから合成される（Ｔｏｌ
ｌｅｆｓｏｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：２２９６−２３０６，
１９９６；Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎｅｔａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２２０：１
５２−１６２，１９９６）；（ｂ）Ｅ３ＡポリＡ部位を欠失し、ただしＥ３Ｂポ
リＡ部位は保持されている；（ｃ）Ｅ３ｇｐ１９Ｋ（ＭＨＣＩ結合性タンパク
質）遺伝子は保持されている；および（ｄ）Ｅ３１１．６Ｋ（Ａｄ致死タンパ
ク質）遺伝子を欠失している。あるいは、Ｅ３遺伝子全部（ヌクレオチド２７，
９７１〜３０，９３７）を欠失してもよい。

【００３７】他の態様において、ベクターは部分欠失アデノウイルス（”ＤｅＡｄ”と呼ぶ
）ベクターであり、この場合、ウイルス複製に必要な大部分のアデノウイルス初
期遺伝子がベクターから欠失し、条件付きプロモーターの制御下で産生細胞染色
体内に配置されている（ＵＳＳＮ６０／０８３，８４１および６０／１１８，１
１８参照）。産生細胞内に配置される欠失可能なアデノウイルス遺伝子には、Ｅ
１Ａ／ＥＩＢ、Ｅ２、Ｅ４（ＯＲＦ６およびＯＲＦ６／７のみを細胞内に配置す
る必要がある）、ｐＩＸおよびｐＩＶａ２が含まれる。Ｅ３もベクターから欠失
でき、それはベクター産生に必要ないので、産生細胞から除外してもよい。普通
は主要後期プロモーター（ＭＬＰ）の制御下にあるアデノウイルス後期遺伝子は
ベクター内にあるが、ＭＬＰを条件付きプロモーターで置換してもよい。ＤｅＡ
ｄベクターおよび産生細胞系に用いるのに適した条件付きプロモーターには、二
量体化遺伝子制御系（免疫抑制剤ＦＫ５０６およびラパマイシンに基づく）、エ
クジソン遺伝子制御系、およびテトラサイクリン遺伝子制御系（ｔｅｔｏｎ／
ｔｅｔｏｆｆ）が含まれる。

【００３８】他の態様においては、アデノウイルスＥ４ゲノム領域をＥ４領域の全長配列ま
たは部分として備えていてもよく、あるいは全長配列と同様に機能して転写ユニ
ット内に含まれるトランスジーンの持続発現を高める個々のオープンリーディン
グフレームを用いてもよい。Ｅ４領域の個々のオープンリーディングフレームを
用いて転写のダウンレギュレーションを阻止する場合、そのような遺伝子を天然
Ｅ４プロモーターの制御下においてもよく、あるいは異種プロモーターの制御下
においてもよい。具体的態様において、ベクターはＡｄ２Ｅ４ＯＲＦ６である（
ＵＳＰ５，６７０，４８８；Ａｒｍｅｎｔａｎｏｅｔａｌ．，Ｈｕｍａｎ
ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，６：１３４３−１３５３，１９９５）。ベクターを
、ＷＯ９８／４６７８１に開示されるベクターから選択してもよい。

【００３９】免疫調節分子コード核酸またはトランスジーンは、高度発現を確実にするため
に、発現制御配列に機能可能な状態で結合することができる。これにはウイルス
または非ウイルスプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。本明細書
中で用いる”機能可能な状態で結合する”という句は、ポリヌクレオチド／トラ
ンスジーンと、ヌクレオチドの調節配列およびエフェクター配列、たとえばプロ
モーター、エンハンサー、転写および翻訳終止部位、ならびに他のシグナル配列
との機能関係を表す。たとえばプロモーターに対する核酸の機能可能な結合とは
、プロモーターからこのプロモーターを特異的に認識して結合するＲＮＡポリメ
ラーゼによりＤＮＡの転写が開始し、かつこのプロモーターがポリヌクレオチド
からのＲＮＡ転写を指令するような、ポリヌクレオチドとプロモーターの物理的
および機能的関係を表す。そのようなプロモーターには、サイトメガロウイルス
（ＣＭＶ）プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス長鎖末端重複（ＲＳＶ−Ｌ
ＴＲ）プロモーターなどのウイルスプロモーター、およびＰＧＫプロモーターな
どの非ウイルスプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。免疫調節分
子コード核酸またはトランスジーンを目的の療法関連細胞においてのみ発現させ
るために、組織特異プロモーターも使用できる。免疫調節分子コード核酸または
トランスジーンは、その天然プロモーターに機能可能な状態で結合することもで
きる。適切なウイルス−または非ウイルス−ポリアデニル化要素、たとえばＳＶ
４０またはＢＧＨのポリＡシグナルを遺伝子末端に工学的に配置してもよい。あ
るいは、アデノウイルスの、すなわち天然のポリＡを用いてもよい。

【００４０】ベクターが２つの免疫調節分子コード核酸、またはトランスジーンと免疫調節
分子コード核酸を含む場合、各タイプの遺伝子の特異的発現を最適化するために
、免疫調節分子コード核酸（１以上）および／または目的トランスジーン（１以
上）が異なるプロモーターから発現してもよい。たとえば、トランスジーンを構
成性プロモーターの制御下におき、免疫調節分子コード核酸を誘導性プロモータ
ーの制御下におくことができる。こうして発現を別個に調節することにより、ベ
クターの機能を特異的に制御できる。あるいは、トランスジーンと免疫調節分子
コード核酸が隣接している場合、それらを同一の発現制御配列の制御下におき、
両遺伝子の同時発現を達成することもできる。

【００４１】本発明の好ましい態様（実施例４に概説）においては、免疫調節分子コード核
酸をアデノウイルスベクターのＥ１欠失領域に挿入し、第２の免疫調節分子コー
ド核酸をベクターのＥ３欠失領域に挿入する。あるいは、隣接遺伝子の転写を妨
害しない限り、免疫調節分子コード核酸をアデノウイルスベクターの任意の部位
にクローニングすることができる。野生型アデノウイルスゲノム長さの１０５〜
１０８％を超えないベクターゲノムサイズをパッケージングすることができ、し
たがって本発明のアデノウイルスベクターに挿入される目的トランスジーンおよ
び免疫調節分子コード核酸をこの最適パッケージングに関する指針に従って選択
できる。１以上の免疫調節分子コード核酸を、本発明の組換えアデノウイルスベ
クターのゲノムの任意部位に挿入できる。

【００４２】目的トランスジーンおよび免疫調節分子コード核酸を含む本発明の組換えアデ
ノウイルスベクターを作製するためには、アデノウイルスゲノムフラグメントに
挿入された目的とする免疫調節分子コード核酸を含むプラスミドと、当該アデノ
ウイルスベクターに由来し、目的トランスジーンを含む線状ウイルスゲノムとを
同時に、免疫調節分子コード核酸を含むベクターゲノムフラグメントとトランス
ジーンを含むベクターとの間で相同組換えが起きる条件下に、レシピエント細胞
中へ共トランスフェクションする。その結果、免疫調節分子をコードする遺伝子
は、アデノウイルスベクターゲノムがプラスミド中へクローニングされた部位に
おいてアデノウイルスベクターゲノムに挿入される。これにより免疫調節分子コ
ード遺伝子と目的トランスジーンを保有する組換えアデノウイルスベクターが作
製される。相同組換えが起きた後、ウイルスプラークを同定および単離する。プ
ラークを拡張させ、この時点では免疫調節分子コード核酸および目的トランスジ
ーンを含む組換えアデノウイルスベクターを、たとえばウイルスゲノムＤＮＡの
制限酵素分析またはＰＣＲ増幅により同定する。次いで組換えウイルスを適切な
細胞系においてプラーク精製する。精製ウイルスを用いてベクターストックを調
製できる。

【００４３】目的トランスジーンおよび免疫調節分子コード核酸（１以上）を含む本発明の
組換えアデノウイルスベクターを作製するためには、アデノウイルスゲノムフラ
グメントに挿入された目的とする免疫調節分子コード核酸を含むプラスミドと、
当該アデノウイルスベクターに由来し、目的トランスジーンを含む線状ウイルス
ゲノムとを同時に、免疫調節分子コード核酸を含むゲノムフラグメントとトラン
スジーンを含むベクターとの間で相同組換えが起きる条件下に、レシピエント細
胞中へ共トランスフェクションする。その結果、免疫調節分子をコードする遺伝
子は、アデノウイルスベクターゲノムがプラスミド中へクローニングされた部位
においてゲノムに挿入される。これにより免疫調節分子コード核酸と目的トラン
スジーンを保有する組換えアデノウイルスベクターが作製される。相同組換えが
起きた後、ウイルスプラークを同定および単離する。プラークを拡張させ、この
時点では免疫調節分子コード核酸および目的トランスジーンを含む組換えアデノ
ウイルスベクターを、たとえばウイルスゲノムＤＮＡの制限酵素分析またはＰＣ
Ｒ増幅により同定する。次いで組換えウイルスを適切な細胞系においてプラーク
精製する。精製ウイルスを用いてベクターストックを調製できる。

【００４４】本発明のアデノウイルスベクターが好ましくは複製欠陥ベクターである場合、
ベクターストックを調製するために組換えベクターゲノムの複製およびパッケー
ジングが可能なアデノウイルスゲノムの相補領域を含む細胞系を用いて、ベクタ
ーストックを調製できる。本発明のベクターを作製するために使用できる細胞系
には、たとえばＥ１欠失ベクターを用いる場合には２９３細胞系が含まれ、複製
欠陥アデノウイルスを用いてベクターを作製する場合は任意の適切な相補細胞系
であってよい。あるいは、複製欠陥ベクターのベクターストックは、相補アデノ
ウイルス遺伝子を供給するヘルパーウイルスを用いて調製できる。

【００４５】組換えアデノウイルスベクターは、ｐＡｄ_vantage迅速クローニング系を用い
て得ることもできる（ＳｏｕｚａａｎｄＡｒｍｅｎｔａｎｏ，１９９９，Ｂ
ｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２６：５０２−５０８）。この系は、安定なプラス
ミドとしての全長アデノウイルスゲノムを、イントロンコードされたエンドヌク
レアーゼにより大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で操作することに基づく。これらのイ
ントロンコードされたエンドヌクレアーゼは、１５〜３９ｂｐのそれらの認識配
列を高い特異性で切断する。３工程を伴う。トランスジーンおよび免疫調節分子
コード核酸をシャトルベクターｐＳＶ２−ＩＣＥＵＩ中へクローニングする（図
１Ｂ参照）。次いでこれをｐＳＶ２−ＩＣＥＵＩからＩ−ＣｅｕＩ消化によりウ
イルスベクターｐＡｄ_vantageのＩ部位中へサブクローニングする（図１Ａ参照
）。ｐＡｄ_vantageをベースとする組換えアデノウイルスベクターをＳｎａＢＩ
で開裂して逆方向末端反復配列を露出させ、次いでウイルス生成のために２９３
細胞中へトランスフェクションする。ウイルスプラークが７〜１０日以内に見え
るようになる。組換えウイルス生成までの全時間は約３週間である。

【００４６】本発明のベクターは、ｉｎｖｉｖｏ投与の前に適切な細胞系にベクターを感
染させることにより、免疫調節分子コード核酸の発現についてｉｎｖｉｔｒｏ
試験することができる。そのような細胞系には２９３細胞（Ｇｒａｈａｍｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９−７１，１９７７）、Ａ５４
９細胞（ヒト肺癌、ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ−１８５）、または正常なヒト気管
支上皮細胞（ＮＨＢＥ）が含まれるが、これに限定されない。ベクター中の免疫
調節分子コード核酸の発現は、タンパク質検出のための任意の既知方法、たとえ
ば免疫沈降法、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡアッセイ法、または当業者に
既知の他の方法により監視できる。

【００４７】宿主免疫応答の測定には、特に特異的細胞応答、たとえばアデノウイルス感染
細胞に対するＣＴＬ生成の同定が含まれる。しかし免疫応答は、感染部位へのＣ
ＴＬの浸潤などの組織損傷現象をも特色とする。たとえば嚢胞性線維症を伴う個
体の細胞にそれらの細胞において機能性塩素イオンチャンネルを得るためにＣＦ
ＴＲコード核酸を投与するアデノウイルスベクター投与部位が肺である場合、ベ
クター投与に対する炎症性免疫応答は、肺を上皮細胞損傷について検査し、また
気管支周囲、血管周囲および肺胞へのＣＴＬ浸潤を検査することにより検出でき
る（Ｇｉｎｓｂｅｒｇｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．，８８：１６５１−１６５５，１９９１；Ｙａｎｇｅｔａｌ．，Ｎａｔｕ
ｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ，７：３６２３６９，１９９４）。

【００４８】宿主免疫応答の程度を判定するための他のアッセイ法には、処置した個体の末
梢血または脾臓から単離した細胞（たとえば脾臓生検により採取）のＴ細胞増殖
アッセイおよびＣＴＬアッセイ（Ｋａｐｌａｎｅｔａｌ．，ＧｅｎｅＴｈ
ｅｒａｐｙ，３：１１７−１２７，１９９６）が含まれる。血清および気管支肺
胞洗浄（ＢＡＬ）液中の抗アデノウイルス抗体レベルを測定して、投与したベク
ターに対する宿主体液性応答を評価することもできる。細胞性サイトカインレベ
ルの低下、たとえば免疫調節タンパク質、リボザイムまたはアンチセンスＲＮＡ
を用いた合成低下により免疫調節が起きた場合、ベクター投与前と投与後の宿主
におけるサイトカインレベル測定値は有効な免疫調節の指標となりうる。

【００４９】本発明は、ベクターを投与した個体の抗原提示細胞においてアデノウイルス抗
原に対する免疫寛容を誘導するための本発明のベクターの使用方法であって、ア
デノウイルス抗原をコードする核酸を含むアデノウイルスゲノムを含むベクター
を抗原提示細胞にある量で投与し、該アデノウイルスゲノムはＥ１領域を欠失し
、かつ第２領域を欠失し、１つの欠失領域にｆａｓＬ遺伝子が挿入され、他方の
欠失領域にアポトーシスインヒビターをコードする核酸が挿入されており、該ベ
クターを細胞に取り込ませ、そしてｆａｓＬ遺伝子およびアポトーシスインヒビ
ターコード核酸を発現させることを含む方法を提供する。抗原提示細胞は、細胞
毒性Ｔリンパ球およびＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の活性化を刺激する細胞である。
適切な抗原提示細胞源には、全細胞、たとえば樹状細胞またはマクロファージお
よびフォスター抗原（ｆｏｓｔｅｒａｎｔｉｇｅｎ）提示細胞が含まれるが、
これらに限定されない。１態様において、個体は自己免疫疾患を伴う。他の態様
において、個体は細胞毒性Ｔ細胞レベル低下およびＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞減少
を伴う。さらに他の態様において、個体は臓器移植を受けている。

【００５０】本発明はまた、組換えアデノウイルスベクターを導入した細胞（たとえば抗原
提示細胞）の半減期を延長するための本発明ベクターの使用方法であって、少な
くともアデノウイルスＥ１領域を欠失し、該欠失部位に少なくとも１つの免疫調
節分子コード核酸が挿入されたアデノウイルスゲノムを含む組換えアデノウイル
スベクターをある量で細胞に導入し、ベクターを細胞に取り込ませ、そして免疫
調節核酸を発現させ、その際、発現生成物は抗原提示細胞の半減期を延長するの
に有効なものである方法に関する。これは、ベクターが免疫療法のための腫瘍関
連抗原、たとえばｇｐ１００、ＴＲＰ−２またはＭＡＲＴ−１およびｐ３５およ
び／またはＰ−Ｉ−９をコードする核酸を含む場合、特に有用である。その際の
利点は、患者において抗原提示細胞の半減期が延長され、これにより患者におい
て腫瘍抗原に対する免疫応答が高まることである。

【００５１】本発明は、個体の細胞にトランスジーンを供給し、該トランスジーンを細胞に
おいて発現させて、トランスジーン生成物に関して表現型を変更する方法であっ
て、アデノウイルスゲノムのＥ１領域および少なくとも１つの他の領域を欠失し
、目的トランスジーンが一方の欠失部位に挿入され、少なくとも１つの免疫調節
分子をコードする少なくとも１つの核酸が他方の欠失部位に挿入されたアデノウ
イルスゲノムを含む組換えアデノウイルスベクターを細胞に導入し、該ベクター
を細胞に取り込ませ、該トランスジーンおよび免疫調節分子コード核酸を送達し
、トランスジーンを細胞において発現させて表現型を変更し、該ベクターがベク
ターまたは細胞に対する宿主免疫応答を軽減または回避する方法をも含む。さら
に本発明は、個体のターゲット細胞にトランスジーンを持続発現させる方法であ
って、アデノウイルスゲノムのＥ１領域および少なくとも１つの他の領域を欠失
し、目的トランスジーンが一方の欠失部位に挿入され、少なくとも１つの免疫調
節分子コード核酸が他方の欠失部位に挿入されたアデノウイルスゲノムを含む組
換えアデノウイルスベクターを投与することを含み、該ベクターは個体の細胞に
トランスジーンおよび免疫調節核酸を送達することができ、そして該ベクターは
該個体の細胞の宿主免疫応答を軽減または回避し、該ベクターはターゲット細胞
においてトランスジーンを持続発現させ、かつターゲット生成物に関して表現型
を変更するものである方法を含む。

【００５２】本発明のアデノウイルスベクターに取り込ませることができるトランスジーン
には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：酵素、ホルモン、成長因
子、サイトカイン、抗原、抗体をコードするトランスジーン、ならびにＣＦＴＲ
、α−アンチトリプシン、可溶性ＣＤ４、ＡＤＡ、単純ヘルペスウイルスチミジ
ンキナーゼ、腫瘍抗原ｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１およびＴＲＰ−２などに特異的
なトランスジーン、ならびに当技術分野で認識されている他の任意の遺伝子。リ
ボザイムまたはアンチセンスＲＮＡなどの分子をコードするトランスジェニック
核酸も、個体のターゲット細胞に送達および発現させるために本発明のベクター
に挿入できる。

【００５３】具体的態様において、本発明のベクターはヒトリソソーム酵素、たとえばヒト
α−ガラクトシダーゼをコードするトランスジーンを含む。これらの酵素を欠損
細胞へ送達できる。そのようなベクターを用いて、特異的リソソーム加水分解酵
素をコードする核酸を供給できる。これらの酵素の欠損は、種々の蓄積障害に関
連づけられている。表Ｉにリソソーム蓄積症および関連の酵素欠損を挙げる。

【００５４】

【表１】

【００５５】ターゲティング分子をベクターに結合させることにより、本発明のベクターを
特定の細胞にターゲティングさせることができる（ＰＣＴ／ＵＳ９９／０２６８
０、１９９９年２月８日出願に開示）。ターゲティング分子は、目的とする細胞
または組織タイプに特異的な任意の物質であり、たとえばリガンド、抗体、糖、
受容体、または他の結合性分子がこれに含まれる。ターゲティングベクターの能
力により、本発明のベクターはリソソーム蓄積障害の処置に特に有用なものとな
る。たとえばＶＥＧＦ、またはＶＥＧＦ受容体に対する抗体などのターゲティン
グ分子を含有させると、ファブリー病を伴う個体の血管内皮細胞をターゲティン
グすることができる。

【００５６】さらに、カチオン両親媒性物質、たとえば前記カチオン脂質、ポリＬ−リシン
（ＰＬＬ）、およびジエチルアミノエチルデキストラン（ＤＥＡＥ−デキストラ
ン）とコンプレックス形成したウイルスベクター、特にアデノウイルスベクター
は、ターゲット細胞のウイルス感染非効率性を高める（たとえばＷＯ９８／２２
１４４参照）。本発明のベクターとのコンプレックス形成およびその伝達に有用
な他のカチオン両親媒性物質は、ＷＯ９６／１８３７２に記載される脂質である
。さらに、ウイルスベクターの反復投与はそのベクターに対する免疫応答を生じ
、これにより感染細胞への遺伝子送達の有効性が制限される可能性があるので、
アデノウイルスベクターその他のウイルスベクターをポリマー修飾し、たとえば
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とコンプレックス形成させて、そのベクター
のウイルス免疫原性を低下させ、反復投与することができる（たとえばＷＯ９８
／４４１４３参照）。あるいは、反復ベクター投与に対する免疫応答を低下させ
る物質と共にベクターを投与することができる。さらに、上記方法の組合わせを
使用できる。

【００５７】本発明のベクターによるトランスジーンのターゲット細胞への伝達は、ターゲ
ット細胞におけるトランスジーン生成物レベルを測定し、トランスジーン発現に
伴う表現型変更と相関させることにより評価できる。たとえば嚢胞性線維症を伴
う個体のターゲット細胞におけるＣＦＴＲトランスジーンの発現は、それらの細
胞における機能性塩素イオンチャンネルの産生と相関し、これは当技術分野で既
知の方法により測定できる。ターゲット細胞におけるトランスジーン生成物のレ
ベルは、本発明のベクターによるトランスジーン伝達効率と直接に相関する。ト
ランスジーン生成物の測定には当技術分野で既知の任意の方法、たとえばＥＬＩ
ＳＡ、ラジオイムノアッセイ、蛍光性および化学発光性の酵素基質を用いるアッ
セイを採用できる。

【００５８】トランスジーンの発現は当技術分野で既知の各種方法で監視することができ、
特に免疫学的、組織化学的および活性アッセイがこれに含まれる。試料中のトラ
ンスジーン生成物のｉｎｖｉｔｒｏ検出に有用な免疫学的方法には、検出可能
な抗体を用いるイムノアッセイ法が含まれる。そのようなイムノアッセイ法には
、たとえば当技術分野で周知のＥＬＩＳＡ、Ｐａｎｄｅｘ顕微鏡蛍光測光アッセ
イ、凝集アッセイ、フローサイトメトリー、血清診断アッセイおよび免疫組織化
学的染色法が含まれる。抗体を当技術分野で周知の各種方法で、検出可能にする
ことができる。たとえば検出可能なマーカーを抗体に直接または間接に付着させ
ることができる。有用なマーカーには、たとえば放射性核種、酵素、蛍光源、色
素源および化学発光性標識が含まれる。

【００５９】ｉｎｖｉｖｏ造影法のために、検出可能な抗体を対象に投与し、トランスジ
ーン生成物への抗体の結合を当技術分野で周知の造影法で検出することができる
。適切な造影剤は既知であり、たとえばガンマ線放出型放射性核種、たとえば¹¹ ¹ Ｉｎ、^99mＴｃ、⁵¹Ｃｒなど、およびＵＳＰ４，６４７，４４７に記載の常磁性
金属イオンがこれに含まれる。放射性核種は、ガンマシンチレーション測光法、
陽電子放射断層撮影法、単光子放射コンピュータ断層撮影法およびガンマカメラ
全身造影法による組織造影を可能にし、一方、常磁性金属イオンは磁気共鳴造影
法による視覚化を可能にする。

【００６０】動物モデルを用いて適切な宿主にベクターを投与した際の宿主免疫応答を軽減
または回避する能力について本発明のアデノウイルスベクターをアッセイし、本
発明のベクターによるｉｎｖｉｖｏトランスジーン発現の持続性を測定するこ
とができる。そのようなモデルは、送達しやすさ、トランスジーンの属性、関連
分子のアッセイ法、および臨床状態の評価などのパラメーターを考慮して選択で
きる。その欠損が特定の疾病状態に関連するタンパク質をトランスジーンがコー
ドする場合、特定の表現型発現および臨床改善の評価のために、その疾病状態を
表す動物モデル、たとえばファブリーノックアウトマウスを用いるのが適切であ
る（ＵＳＳＮ０９／１８２，２４５、１９９８年１０月２９日出願に開示）。

【００６１】トランスジーン発現系をアッセイしうる関連動物にはマウス、ラット、サルお
よびウサギが含まれるが、これらに限定されない。トランスジーン発現系を試験
するのに適したマウス系統にはＣ３Ｈ、Ｃ５７Ｂ１／６（野生型およびヌード）
、およびＢａｌｂ／ｃ（ＴａｃｏｎｉｃＦａｒｍｓから入手，ニューヨーク州
ジャーマンチウン）が含まれるが、これらに限定されない。

【００６２】ベクター投与に対する宿主免疫応答を評価するのが望ましい場合、免疫系によ
り生じる特異的有害応答を調べるために、免疫能をもつ動物と免疫欠損動物にお
ける試験を比較することができる。免疫欠損動物、たとえばヌードマウスを用い
て、獲得宿主応答と独立してベクター性能およびトランスジーン発現持続性を解
明し、トランスジーン持続性の他の決定因子を確認することができる。

【００６３】宿主におけるこれらのベクターの持続性を判定するために、当業者はトランス
ジーンまたは免疫調節分子コード核酸（およびその発現）を同定するいずれかの
手段でこれらのベクターの存在をアッセイできる：たとえばＲＴ−ＰＣＲ、ノー
ザンブロット法またはＳ１分析法によりトランスジーンまたは免疫調節分子コー
ド核酸のｍＲＮＡレベルをアッセイするか、あるいはウェスタンブロット法、免
疫沈降法またはラジオイムノアッセイによりトランスジーンタンパク質発現をア
ッセイする。あるいは、宿主におけるベクターまたは目的トランスジーンＤＮＡ
配列自体の存在を、ＤＮＡ配列を同定するいずれかの方法で測定でき、これには
サザンブロット法もしくはスロットブロット分析法、または当業者に既知の他の
方法が含まれる。ベクターがマーカー遺伝子、たとえば大腸菌β−ガラクトシダ
ーゼをコードするｌａｃＺを含む場合、ベクターの存在はこれらと同じアッセイ
法、またはマーカータンパク質（たとえばＸ−ｇａｌ）をスクリーニングする特
異的機能アッセイ法により測定できる。宿主における本発明のベクターの持続性
も、トランスジーンを含むベクターの投与により得られた療法上の益、たとえば
嚢胞性線維症を伴う個体にＣＦＴＲ遺伝子を含むベクターを投与した後の肺機能
の改善または安定化を連続観察することによって判定できる。これは、肺機能試
験（ＰＦＴ）のための肺活量測定法により行うことができる。ＣＦ患者のアデノ
ウイルスベクター処理細胞における塩素イオンチャンネル機能回復の立証も、ト
ランスジーンＣＦＴＲの持続性を評価するために採用できる（Ｚａｂｎｅｒｅ
ｔａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９７：１５０４−１５１１，１９
９６）。

【００６４】本発明は本発明のベクターを含有する組成物をも含み、これらの組成物を目的
トランスジーンおよび／または免疫調節分子コード核酸の送達に有効な、かつ免
疫調節分子（タンパク質、リボザイム、アンチセンスＲＮＡ）により宿主免疫応
答を軽減または回避するのに有効な量で投与できる。本発明の組成物は、関連溶
剤を含めた生理学的に許容できるキャリヤーを含むことができる。本明細書中で
用いる”生理学的に許容できるキャリヤー”には、任意かつすべての溶剤、分散
媒質、コーティング、抗菌薬および抗真菌薬、等張剤および吸収遅延剤などが含
まれる。慣用されるいずれかの媒質または物質が、有効成分、すなわち本発明の
アデノウイルスベクターと不適合でない限り、本発明の組成物におけるその使用
が考慮される。

【００６５】本発明のアデノウイルスベクターを含有する組成物の投与経路には、慣用され
る、かつ生理学的に許容できる経路、たとえばターゲット器官もしくは組織への
直接送達、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、経口、または他の非経口投与
経路が含まれる。

【００６６】本発明はさらに、細胞中へ本発明のアデノウイルスベクターを用いて１以上の
トランスジーンを送達し、これにより生物活性分子をコードするトランスジーン
を該細胞において発現させるのが望ましいｉｎｖｉｖｏまたはｅｘｖｉｖｏ
用途に、本発明の組成物を使用する方法に関する。ｉｎｖｉｖｏ用途は、組成
物に配合した本発明のアデノウイルスベクターを個体の細胞に直接に投与するこ
とを伴う。ｅｘｖｉｖｏ用途には、採集してｉｎｖｉｔｒｏで維持したオー
トロガス細胞に本発明のアデノウイルスベクターを直接に伝達し、次いでトラン
スダクションしたこれらの細胞をレシピエントに再投与することを伴う。

【００６７】具体的態様においては、抗原提示細胞にアデノウイルスベクターをトランスフ
ェクションする。適切な抗原提示細胞（ＡＰＣ）源には、全細胞、たとえば樹状
細胞またはマクロファージおよびフォスター抗原提示細胞が含まれるが、これら
に限定されない。

【００６８】抗原特異免疫応答の主要なイニシエーターである樹状細胞は、Ｔ細胞活性化に
重要な数種類の分子をその表面にもつ（ｖａｎＳｃｈｏｏｔｅｎｅｔａｌ
．，Ｍｏｌ．ＭｅｄｉｃｉｎｅＴｏｄａｙ，ｐｐ．２５４−２６０，１９９７
年６月に概説）。樹状細胞を単離するための１方法は、血液から骨髄前駆細胞（
ＣＤ３４＋）を単離し、それらを刺激して樹状細胞に分化させることによる。末
梢血中の循環ＣＤ３４＋幹細胞数を追加するために、ＧＭ−ＣＳＦなどのサイト
カインで患者を処置しなければならない。樹状細胞を単離するための第２の方法
は、既に血液中を循環している比較的多数の単分化能（ｐｒｅｃｏｍｍｉｔｔｅ
ｄ）樹状細胞を採集するものである。ヒト末梢血から成熟樹状細胞を調製するた
めの従来法は、メトリザミド勾配および接着／非接着工程などの物理的方法の組
合わせ（Ｆｒｅｕｄｅｎｔｈａｌｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８７：７６９８−７７０２，１９９０）；Ｐｅｒｃｏｌ
ｌ勾配分離法（Ｍｅｈｔａ−Ｄａｍａｎｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．，１５３：９９６−１００３，１９９４）；および蛍光活性化細胞選別法（Ｔ
ｈｏｍａｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：６８４０−６８５
２，１９９３）によるものであった。樹状細胞を単離および培養するのに好まし
い方法は、Ｂｅｎｄｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ．，１９６
：１２１−１３５，１９９６およびＲｏｍａｎｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎ．Ｍｅｔｈ．，１９６：１３７−１５１，１９９６に記載されている。

【００６９】 ”フォスター”抗原提示細胞は、ヒト細胞系１７４ｘＣＥＭ．Ｔ２由来の細胞
（Ｔ２と呼ばれる）であり、内因性ペプチドが細胞表面ＭＨＣクラスＩ分子と結
合するのを制限する変異をその抗原プロセシング経路中に含む（Ｚｗｅｅｒｉｎ
ｋｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．，１５０：１７６３−１７７１，１９９
３）。これは、ＭＨＣクラスＩＣＤ８＋ＣＴＬへの抗原提示に必要な遺伝子
ＴＡＰ１、ＴＡＰ２ＬＭＰ１およびＬＭＰ２を含むＭＨＣクラスＩＩ領域の大
幅なホモ接合欠失によるものである。事実、これらの細胞の表面には”空の”Ｍ
ＨＣクラスＩ分子のみが提示される。培地に添加した外因性ペプチドは、そのペ
プチドが対立遺伝子特異結合性モチーフを含む場合にはこれらのＭＨＣ分子と結
合する。

【００７０】特異的組換えＭＨＣ対立遺伝子によるＴ２細胞のレトロウイルス感染またはト
ランスフェクションにより、ＭＨＣ制限プロフィルのリダイレクション（ｒｅｄ
ｉｒｅｃｔｉｏｎ）が可能になる。それらにより、組換え対立遺伝子に合わせた
ライブラリーが優先的に提示されるであろう。アンカー残基が内因性対立遺伝子
への結合を効率的に阻止するからである。少なくとも１つの例で、細胞をＨ−２
Ｌｄ制限ＣＴＬクローンに対して感受性にするマウスＨ−２ＬｄＭＨＣ対立遺
伝子により、細胞系１７４ｘＣＥＭ．Ｔ２をトランスフェクションした（Ｃｒｕ
ｍｐａｃｋｅｒｅｔａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：３
００４）。この方法により、それに対しＭＨＣ対立遺伝子の可変鎖がクローニン
グされるいかなるＭＨＣ制限ＣＴＬにも特異的な組換えフォスター抗原提示細胞
（ＡＰＣ）が生成する。

【００７１】同種ＭＨＣ対立遺伝子による非プロフェッショナルＡＰＣのトランスフェクシ
ョンが組換え細胞系の免疫原性を著しく助成することは、幾つかの例で証明され
た（Ｌｅｏｎｇｅｔａｌ．，１９９４，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５９：
２１２−２１６およびＯｓｔｒａｎｄ−Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｔａｌ．，１
９９１，Ｉｎｔ．Ｊ．ＣａｎｃｅｒＳｕｐｐｌ．，６：６１−６８）。詳細に
は、免疫感受性はＭＨＣタンパク質の発現レベルに比例する。

【００７２】ＭＨＣ分子の高度発現により、ＡＰＣはＣＴＬに”より見える”ようになる。
強力な転写プロモーター（たとえばＣＭＶプロモーター）を用いて当該ＭＨＣ対
立遺伝子をＴ２において発現させると、より反応性の高い抗原提示細胞が得られ
る（細胞表面の反応性ＭＨＣ−ペプチドコンプレックス濃度がより高いことが原
因である可能性が最も高い）。１つのタイプのＭＨＣ対立遺伝子のみがそのライ
ブラリーと相互作用するので、新たにトランスフェクションされた対立遺伝子に
結合するようにライブラリーを設計すれば、内因性対立遺伝子の存在または発現
レベルによって特異性が損なわれることはないであろう。

【００７３】本発明のアデノウイルスベクターを個体に投与する量は、処置すべき状態、個
体の年齢、体重および臨床状態、ならびに生物活性タンパク質の供給を必要とす
る具体的な分子欠損を含めた、多様なパラメーターを考慮して決定される。投与
量は、前記の分子アッセイ法または臨床マーカーにより測定して、投与により特
定の表現型が生成するように選ぶことが好ましい。たとえば、トランスジーンに
よりコードされる生物活性タンパク質を持続発現させるために、また特定の表現
型発現を達成するために、ベクターに含まれるトランスジーンを個体に供給する
際に使用できる本発明のアデノウイルスベクターの投与量は、ヒトについては約
１０⁸〜１０¹¹感染単位（Ｉ．Ｕ．）である。

【００７４】投与しやすさおよび投与量の均一性のために、非経口組成物を投与単位剤形に
配合することが特に有利である。本明細書中で用いる”投与単位剤形”とは、処
置すべき対象に対する単位投与量として適した、物理的に別個の単位を表し、各
単位は、特定の表現型発現を生じるように計算した予め定めた量の有効成分を、
必要な生理学的に許容できるキャリヤーと一緒に含有する。本発明の新規な投与
単位剤形の詳細は、配合物に用いるアデノウイルスベクターの特異な特性および
配合物調製技術分野に固有の制限により指示され、それらに依存する。主要な有
効成分（本発明のアデノウイルスベクター）を、簡便かつ効果的な投与のために
、生理学的に許容できるキャリヤーと共に前記投与単位剤形中に配合する。

【００７５】１以上のトランスジーンを個体に送達するための本発明のアデノウイルスベク
ター投与により得られる最大の益および特定の表現型発現の達成には、反復投与
が必要な場合がある。そのような反復投与は、同一アデノウイルスベクターの使
用によってもよく、あるいは同一トランスジーンを保有するが、ウイルス抗原提
示を変更して宿主免疫応答を軽減するように工学的に作製された異なるベクター
の使用によってもよい。

【００７６】本発明の実施には、別途指示しない限り、当業者に周知の一般的な組換えＤＮ
Ａ技術、タンパク質化学、微生物学およびウイルス学を用いる。そのような技術
については文献に十分に説明されている。たとえばＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌｅｔ
ａｌ．編，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ社，ニューヨーク，１９９５
参照。

【００７７】本発明を以下の実施例により説明する。実施例実施例１：バキュロウイルスタンパク質ｐ３５を発現するＡｄベクターＡｄ／ｐ３５ベクターの構築バキュロウイルスｐ３５遺伝子をバキュロウイルスゲノムＤＮＡからＰＣＲに
よりクローニングし、発現カセットプラスミドｐＣＭＶ（図２参照）中へ、Ｘｈ
ｏＩおよびＮｏｔＩ制限部位を利用して、目的遺伝子がＣＭＶプロモーターの後
方にクローニングされ、ＳＶ４０ポリＡ配列を利用するように挿入する（図３）
。次いで、発現カセット全体をカセット両端のユニークＲｓｒＩＩ部位を利用し
て切り取り、Ａｄ２の右末端を含むアデノウイルスプラスミドｐＡｄ／Ｅ４＋／
Ｅ３△２．９（図４）のＥ３△２．９欠失部位にクローニングする。次いでこの
プラスミドとベクターの間で相同組換えが起きるように、プラスミドをＡｄ２／
ＣＦＴＲ５由来の消化ＤＮＡと共トランスフェクションして、ベクターＡｄ／Ｃ
ＦＴＲ／ＣＭＶｐ３５を得る。これはＣＦＴＲを発現でき、かつＣＭＶプロモー
ターからバキュロウイルスｐ３５を発現することができる。

【００７８】ｉｎｖｉｔｒｏＴＮＦ細胞毒性アッセイＡ５４９細胞およびＨｅＬａ細胞をこのアッセイ法で調べる。６ウェル皿に２
．５×１０⁵または３×１０⁵個／ウェルの細胞を接種する。細胞にＡｄ／ＣＦＴ
Ｒ／ｐ３５ベクターまたは対照Ａｄ２／ＣＦＴＲベクターを１００〜１５０の感
染多重度（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ｍｏｉ）で
感染させる。同時に、細胞にＡｄ２／ｂ−Ｇａｌ２レポターベクター（ここでは
単に細胞死または生存のレポター遺伝子として使用）を１００〜１５０のｍｏｉ
で共感染させる。感染の２４時間後、２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦおよび１５〜２０
ｍｇ／ｍｌのシクロヘキシミドで細胞を処理する。細胞を固定し、ＴＮＦ添加の
２４時間後にｂ−ガラクトシダーゼ発現を調べるために染色する。細胞フィール
ドを計数すると、ｐ３５の存在により阻止されたＴＮＦ仲介による細胞溶解は、
細胞の９０％を超える。対照細胞では、＞９０％の細胞が溶解する。

【００７９】ｉｎｖｉｔｒｏｆａｓリガンド死滅アッセイヒト（Ａ５４９、ＨｅＬａ）、サル（ＣＶ１）およびマウス（ＳＶＢａｌｂ）
細胞系をこのアッセイ法で調べた。６ウェル皿に０．９×１０⁵〜２×１０⁵個／
ウェルの細胞を接種した。細胞にＡｄ／ｐ３５ベクターまたは対照Ａｄベクター
を１００〜１５０回のｍｏｉで感染させた。２４時間後、同一細胞にｆａｓリガ
ンドとｂ−ガラクトシダーゼレポター遺伝子の両方を発現するＡｄベクターを５
０ｍｏｉ感染させた。Ａｄ／ｂｇａｌ／ｆａｓＬベクター添加の２４時間後、細
胞を固定し、ｂ−ガラクトシダーゼ発現を調べるために染色した。細胞フィール
ドを計数すると、ｐ３５の存在によりｆａｓリガンド仲介による死滅は細胞の約
９０％において阻止された。

【００８０】ｉｎｖｉｖｏ肝毒性試験６．６×１０⁹Ｉ．Ｕ．のＡｄ／ＣＦＴＲ／ｐ３５ベクターまたは対照Ａｄ／
ＣＦＴＲベクターをＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注射して、肝臓にＡｄベクター
を送達した。肝毒性を評価するために、血清トランスアミナーゼＡＬＴおよびＡ
ＳＴレベルを測定した（Ｒｏｂｉｎｓ，ＰａｔｈｏｌｏｇｉｃＢａｓｉｓｏ
ｆＤｉｓｅａｓｅ，Ｗ．Ｂ．ＳａｕｎｄｅｒｓＣｏｍｐａｎｙ，第５版）。
図５および６に示すように、Ａｄベクターにｐ３５を取り込ませると、肝臓に送
達されたＡｄベクターによる肝毒性が低下した。

【００８１】実施例２：リンパ球プロテイナーゼインヒビターＰ−Ｉ−９を発現するＡｄベクターヒト白血球ｑｕｉｃｋ−ｃｌｏｎｅｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｅｔｅ
ｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からＰＣＲによりＰ−Ｉ−９ｃＤＮＡをク
ローニングし、発現プラスミドｐＣＭＶ中へ、ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩ制限部位
を利用して（図２参照）、ｃＤＮＡがＣＭＶプロモーターの後方にクローニング
され、ＳＶ４０ポリＡ部位を利用するように挿入する。次いで、発現カセット全
体をカセット両端のユニークＲｓｒＩＩ部位を利用して切り取り、ｆｉｂｅｒ遺
伝子およびＥ４領域を含めたＡｄ２の右末端を含むプレ−アデノウイルスプラス
ミドｐＡｄ／Ｅ４＋／Ｅ３△２．９（図４）のＥ３△２．９欠失部位にクローニ
ングする。次いでこのプラスミドを２９３細胞中へ、Ｅ１領域からのＡｄ２／Ｃ
ＭＶ α−ガラクトシダーゼ由来の制限消化ＤＮＡおよびＥ３領域のＰ−Ｉ−９
と共トランスフェクションする；両遺伝子ともＣＭＶプロモーターにより駆動さ
れる（図７）。

【００８２】実施例３：癌ワクチンを得るための樹状細胞の半減期延長バキュロウイルスゲノムＤＮＡからＰＣＲによりバキュロウイルスＰ−Ｉ−９
遺伝子をクローニングし、発現カセットプラスミドｐＣＭＶ（図２参照）中へ、
ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩ制限部位を利用して、ｇｐ１００がＣＭＶプロモーター
の後方にクローニングされ、ＳＶ４０ポリＡ部位を利用するように挿入する。次
いで、発現カセット全体をカセット両端のユニークＲｓｒＩＩ部位を利用して切
り取り、Ａｄ２の右末端を含むアデノウイルスプラスミドｐＡｄ／Ｅ４＋／Ｅ３
△２．９（図４）のＥ３△２．９欠失部位にクローニングする。次いでこのプラ
スミドを２９３細胞中へ、Ｅ１領域からのＡｄ２／ＣＭＶｇｐ１００由来の消
化ＤＮＡおよびＥ３領域からのＰ−Ｉ−９と共トランスフェクションする；両遺
伝子ともＣＭＶプロモーターにより駆動される（図８）。樹状細胞を患者から単
離し、図８に記載したベクターに暴露して、樹状細胞内で腫瘍抗原ｇｐ１００の
発現およびＰ−Ｉ−９の発現を達成する。次いでそれらの細胞を、それらが単離
された患者に再注入する。このような細胞は腫瘍抗原に対する細胞毒性Ｔリンパ
球応答を誘発する。これは患者にとって有益である。Ｐ−Ｉ−９遺伝子の存在お
よびＰ−Ｉ−９タンパク質の発現により、それらの細胞はｇｐ１００特異的細胞
毒性Ｔリンパ球の攻撃に抵抗する。したがって、腫瘍抗原のみを発現するように
修飾され、Ｐ−Ｉ−９タンパク質を発現しない類似の細胞と比較して、それらの
細胞は患者内でより長期間生存し、抗原をより長期間提示することができる。

【００８３】実施例４：ｆａｓＬ／ｐ３５ベクターＡｄ／ｆａｓＬ／ｐ３５ベクターの構築マウス精巣ｑｕｉｃｋ−ｃｌｏｎｅｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｅｔｅ
ｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からＰＣＲによりマウスｆａｓリガンドｃＤ
ＮＡをクローニングし、発現プラスミドｐＣＭＶ中へ、ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩ
制限部位を利用して（図２参照）、このｃＤＮＡがＣＭＶプロモーターの後方に
クローニングされ、ＳＶ４０ポリＡ部位を利用するように挿入する。次いで、発
現カセット全体をカセット両端のユニークＲｓｒＩＩ部位を利用して切り取り、
プロテインＩＸ遺伝子およびＥ２Ｂ配列を含めたＡｄ２の左末端を含むＥ１欠失
（Ａｄ２ヌクレオチド３５８〜３３２８を欠失）プレ−アデノウイルスプラスミ
ド（ｐＡｄＥ１−Ｒと呼ぶ）（図９および１０参照）のＲｓｒＩＩ部位にクロー
ニングする。次いでこのプラスミドを２９３細胞中へ、Ｅ１領域からのＡｄ２／
ＣＦＴＲ／ｐ３５ベクター由来の制限消化ＤＮＡと共トランスフェクションする
。これによりプラスミドとＡｄベクターの間で相同組換えが起きてＡｄ／ｆａｓ
Ｌ／ｐ３５が得られ、これはＥ１領域からｆａｓＬを発現し、かつＥ３領域から
ｐ３５を発現する；両遺伝子ともＣＭＶプロモーターにより駆動される（図９お
よび１１）。

【００８４】Ａｄ／ｆａｓＬ／ｐ３５ベクターは、Ｅ１欠失Ａｄベクターの作製に用いた正
常２９３細胞において１０¹¹Ｉ．Ｕ．／ｍｌの高力価で産生される。これに対し
ｆａｓＬを構成的に発現する他のＡｄベクターによれば１０⁹Ｉ．Ｕ．／ｍｌの
力価が得られる。

【００８５】Ａｄ／ｆａｓＬ／ｐ３５ベクターが感染細胞を死滅させるか否かを判定するた
めに、ＣＶ−１細胞においてＰｒｏｍｅｇａから購入したＬＤＨキットを用いて
細胞死滅アッセイを実施する。結果を図１２に示す。これはＡｄ／ｆａｓＬ／ｐ
３５ベクターが対照Ａｄ／ｆａｓＬベクターのようには感染細胞を死滅させない
ことを示す。

【００８６】本明細書に記載した具体的態様は本発明の態様の数例を説明するためのもので
あるから、本明細書に記載および特許請求する発明の範囲はこれらにより限定さ
れない。均等な態様はいずれも本発明の範囲に含まれる。以上の記載から、本明
細書に記載した態様のほかに本発明の多様な変更が当業者に明らかであろう。そ
のような変更も本発明の範囲に含まれるものとする。

【００８７】多数の参考文献を本明細書に引用したが、それらの全体を参考として援用する
。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１Ａは、アデノウイルスクローニングベクターｐＡｄ_vantageおよびその構
築を示す。図１Ｂは、シャトルベクターｐＳＶ２−ＩＣＥＵＩを示す。

【図２】プラスミドｐＣＭＶの地図を示す。

【図３】ＣＦＴＲおよびｐ３５遺伝子を含むアデノウイルスゲノムの発現カセットを示
す。

【図４】プラスミドｐＡｄ／Ｅ４＋／Ｅ３△２．９の地図を示す。

【図５】ＡＬＴアッセイの結果を示す。

【図６】ＡＳＴアッセイの結果を示す。

【図７】 α−ガラクトシダーゼおよびＰ−Ｉ−９遺伝子を含むアデノウイルスゲノムの
発現カセットを示す。

【図８】ｇｐ１００およびＰ−Ｉ−９遺伝子を含むアデノウイルスゲノムの発現カセッ
トを示す。

【図９】ｆａｓＬおよびｐ３５遺伝子を含むアデノウイルスゲノムの発現カセットを示
す。

【図１０】プラスミドｐＡｄ２／Ｅ１−Ｒを示す。

【図１１】プラスミドｐＡｄ２／Ｅ１−Ｒ／ｆａｓＬを示す。

【図１２】ＬＤＨアッセイの結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続きＦターム(参考） 4B024 AA01 BA31 BA36 BA40 CA04 DA03 EA02 FA02 HA17 4C084 AA14 ZB07 ZB26 4C087 AA01 BC83 CA12 ZB07 ZB26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】少なくともアデノウイルスＥ１領域を欠失し、該欠失部位に少
なくとも１つの免疫調節分子コード核酸が挿入されたアデノウイルスゲノムを含
む組換えアデノウイルスベクターであって、該ベクターは個体の細胞に免疫調節
分子コード核酸を送達し、該ベクターを送達された個体の細胞において免疫調節
分子コード核酸を発現し、そして該個体の細胞の宿主免疫応答を軽減または回避
するベクター。
【請求項２】免疫調節分子コード核酸が、バキュロウイルスｐ３５、ｆａｓ
Ｌ／ＣＤ９５リガンド、および細胞毒性リンパ球セルピンプロテイナーゼインヒ
ビター９に対する遺伝子よりなる群から選択される、請求項１に記載のベクター
。
【請求項３】免疫調節分子コード核酸が、機能可能な状態で発現制御配列に
結合している、請求項１に記載のベクター。
【請求項４】発現制御配列がサイトメガロウイルス極初期プロモーターを含
む、請求項３に記載のベクター。
【請求項５】アデノウイルスゲノムのＥ３領域のヌクレオチド２９２９２〜
３０８４０を含む１．６ｋｂ部分を欠失した、請求項１に記載のベクター。
【請求項６】ベクターが２つの免疫調節分子コード核酸を含み、一方はＥ１
領域の欠失部位に挿入され、他方はＥ３領域の欠失部位に挿入された、請求項５
に記載のベクター。
【請求項７】ベクターが、Ｅ１領域の欠失部位に挿入されたｆａｓＬ遺伝子
、およびＥ３領域の欠失部位に挿入されたバキュロウイルスｐ３５遺伝子を含む
、請求項５に記載のベクター。
【請求項８】アデノウイルスゲノムのＥ３領域のヌクレオチド２７９７１〜
３０９３７を含む約３．０ｋｂ部分を欠失した、請求項１に記載のベクター。
【請求項９】（ａ）アデノウイルス抗原を含み、（ｂ）さらに、アデノウイ
ルスＥ１領域およびアデノウイルスゲノムの第２領域を欠失し、１つの欠失領域
にｆａｓＬ遺伝子が挿入され、第２欠失領域にアポトーシスを阻止する分子をコ
ードするトランスジーンが挿入されたアデノウイルスゲノムを含む、組換えアデ
ノウイルスベクターを投与し、該ベクターを細胞に取り込ませ、そしてｆａｓＬ
遺伝子およびアポトーシスを阻止するトランスジーンを発現させる個体の細胞に
おいて、少なくとも１つのアデノウイルス抗原および／またはトランスジーン生
成物に対する免疫寛容を誘導する方法であって、該組換えアデノウイルスベクタ
ーを投与した個体において該アデノウイルス抗原に対する免疫寛容を誘導するの
に有効な量で、該ベクターを個体に投与することを含む方法。
【請求項１０】抗原提示細胞において免疫寛容を誘導する、請求項９に記載
の方法。
【請求項１１】採集してインビトロで維持したオートロガス細胞にベクター
を伝達し、そして該細胞を個体に投与する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】ベクターを個体に直接投与する、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】アポトーシスを阻止する遺伝子が、バキュロウイルスｐ３５
遺伝子、または細胞毒性リンパ球セルピンプロテイナーゼインヒビター９である
、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】組換えアデノウイルスベクターを取り込ませた細胞の半減期
を延長する方法であって、アデノウイルスＥ１領域を欠失し、該欠失部位に少な
くとも１つの免疫調節分子コード核酸が挿入されたアデノウイルスゲノムを含む
組換えアデノウイルスベクターを細胞に導入し、ベクターを細胞に取り込ませ、
そして該抗原提示細胞の半減期を延長するのに有効な量で免疫調節核酸を発現さ
せる方法。
【請求項１５】細胞が抗原提示細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】アデノウイルスＥ１領域およびアデノウイルスゲノムの少な
くとも１つの他の領域を欠失し、目的トランスジーンが一方の欠失部位に挿入さ
れ、少なくとも１つの免疫調節分子コード核酸が他方の欠失部位に挿入されたア
デノウイルスゲノムを含む組換えアデノウイルスベクターであって、該ベクター
を投与した個体の細胞にトランスジーンを送達して発現することができ、そして
該個体の細胞の宿主免疫応答を軽減または回避するベクター。
【請求項１８】トランスジーンが、嚢胞性線維形成性膜貫通タンパク質、生
物活性ヒトリソソーム酵素、および腫瘍抗原よりなる群から選択されるタンパク
質をコードするヌクレオチド配列である、請求項１７に記載のベクター。
【請求項１９】トランスジーンが、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１およびＴＲＰ
−２よりなる群から選択される腫瘍抗原をコードするヌクレオチド配列である、
請求項１７に記載のベクター。
【請求項２０】ベクターが、アデノウイルスゲノムのＥ３領域のヌクレオチ
ド２９２９２〜３０８４０を含む１．６ｋｂ部分を欠失したアデノウイルスゲノ
ムを含む、請求項１７に記載のベクター。
【請求項２１】免疫調節分子が、バキュロウイルスｐ３５、ｆａｓＬ／ＣＤ
９５リガンド、および細胞毒性リンパ球セルピンプロテイナーゼインヒビター９
よりなる群から選択される、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２２】トランスジーンが欠失Ｅ１領域に挿入され、免疫調節分子コ
ード核酸が欠失Ｅ３領域に挿入された、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２３】アデノウイルスゲノムのＥ３領域のヌクレオチド２７９７１
〜３０９３７を含む約３．０ｋｂ部分を欠失した、請求項１７に記載のベクター
。
【請求項２４】トランスジーンが機能可能な状態で発現制御配列に結合して
いる、請求項１７に記載のベクター。
【請求項２５】免疫調節分子コード核酸が、機能可能な状態で発現制御配列
に結合している、請求項１７に記載のベクター。
【請求項２６】トランスジーンおよび免疫調節分子コード核酸が、機能可能
な状態で同じ発現制御配列に結合している、請求項１７に記載のベクター。
【請求項２７】発現制御配列がサイトメガロウイルスプロモーターである、
請求項２６に記載のベクター。
【請求項２８】個体の細胞にトランスジーンを供給し、該トランスジーンを
細胞において発現させて表現型を変更する方法であって、アデノウイルスＥ１領
域およびアデノウイルスゲノムの少なくとも１つの他の領域を欠失し、目的トラ
ンスジーンが一方の欠失部位に挿入され、少なくとも１つの免疫調節分子コード
核酸が他方の欠失部位に挿入されたアデノウイルスゲノムを含む、組換えアデノ
ウイルスベクターを細胞に導入し、該ベクターを細胞に取り込ませ、該トランス
ジーンおよび免疫調節分子コード核酸を送達してトランスジーンを細胞において
発現させ、該ベクターがベクターまたは細胞に対する宿主免疫応答を軽減または
回避する方法。
【請求項２９】個体のターゲット細胞にトランスジーンを持続発現させる方
法であって、下記のものを含む組成物：アデノウイルスＥ１領域およびアデノウイルスゲノムの少なくとも１つの他の
領域を欠失し、目的トランスジーンが一方の欠失部位に挿入され、少なくとも１
つの免疫調節分子コード核酸が他方の欠失部位に挿入されたアデノウイルスゲノ
ムを含む、組換えアデノウイルスベクター：該ベクターは個体の細胞にトランス
ジーンおよび免疫調節分子コード核酸を送達することができ、そして該ベクター
は該個体の細胞の宿主免疫応答を軽減または回避するものである；ならびに生理学的に有効なキャリヤーを、個体のターゲット細胞にトランスジーンの持続発現を生じさせるのに有効な
量で投与することを含む方法。
【請求項３０】下記のものを含む組成物：少なくともアデノウイルスＥ１領域を欠失し、該欠失部位に少なくとも１つの
免疫調節分子コード核酸が挿入されたアデノウイルスゲノムを含む、組換えアデ
ノウイルスベクター：該ベクターは個体の細胞に免疫調節分子コード核酸を送達
して、該ベクターを送達された細胞において免疫調節分子コード核酸を発現し、
そして該ベクターは該個体の細胞の宿主免疫応答を軽減または回避すものである
；ならびに生理学的に有効なキャリヤー。
【請求項３１】下記のものを含む組成物：アデノウイルスＥ１領域およびアデノウイルスゲノムの少なくとも１つの他の
領域を欠失し、目的トランスジーンが一方の欠失部位に挿入され、少なくとも１
つの免疫調節分子コード核酸が他方の欠失部位に挿入されたアデノウイルスゲノ
ムを含む、組換えアデノウイルスベクター：該ベクターは該ベクターを投与され
た個体の細胞にトランスジーンを送達することができ、そして該ベクターが該個
体の細胞の宿主免疫応答を軽減または回避するものである；ならびに生理学的に有効なキャリヤー。