PL208588B1 - Rekombinowane adenowirusy, wyizolowane kwasy nukleinowe, komórki pakujące oraz sposoby zwiększania stabilności i/lub pojemności upakowania rekombinowanego adenowirusa - Google Patents
Rekombinowane adenowirusy, wyizolowane kwasy nukleinowe, komórki pakujące oraz sposoby zwiększania stabilności i/lub pojemności upakowania rekombinowanego adenowirusaInfo
- Publication number
- PL208588B1 PL208588B1 PL373337A PL37333703A PL208588B1 PL 208588 B1 PL208588 B1 PL 208588B1 PL 373337 A PL373337 A PL 373337A PL 37333703 A PL37333703 A PL 37333703A PL 208588 B1 PL208588 B1 PL 208588B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- promoter
- pix
- adenovirus
- sequence
- sequences
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 70
- 239000013598 vector Substances 0.000 title abstract description 134
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims abstract description 207
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims abstract description 76
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 63
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 28
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims abstract description 25
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 101150075174 E1B gene Proteins 0.000 claims description 78
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 78
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 67
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 51
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 51
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 50
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 39
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 35
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 35
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 29
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 29
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 27
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 claims description 25
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 23
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 16
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 8
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 claims description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 6
- 241000701124 Human adenovirus 35 Species 0.000 claims description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 abstract description 24
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 abstract description 5
- 101150029662 E1 gene Proteins 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 170
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 163
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 99
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 75
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 70
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 54
- 101710114676 E1B 55 kDa protein Proteins 0.000 description 43
- 101150088856 pix gene Proteins 0.000 description 42
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 40
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 37
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 35
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 31
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 28
- 239000000047 product Substances 0.000 description 26
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 24
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 24
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 23
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 19
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 18
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 15
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 15
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 13
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 13
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 11
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 description 10
- 108010019653 Pwo polymerase Proteins 0.000 description 10
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 10
- NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 20-hydroxyecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)(O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 8
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 7
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 7
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- 201000005569 Gout Diseases 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 6
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 5
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 4
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 4
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 4
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 4
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 4
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 4
- CXURGFRDGROIKG-UHFFFAOYSA-N 3,3-bis(chloromethyl)oxetane Chemical compound ClCC1(CCl)COC1 CXURGFRDGROIKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 3
- 101710199711 Early E1A protein Proteins 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 3
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 3
- 108010045649 agarase Proteins 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 3
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000005100 tissue tropism Effects 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- 241001244729 Apalis Species 0.000 description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010019673 Darbepoetin alfa Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000011001 Ebola Hemorrhagic Fever Diseases 0.000 description 2
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001135572 Human adenovirus E4 Species 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701076 Macacine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 2
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 2
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 2
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 2
- 238000003120 Steady-Glo Luciferase Assay System Methods 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 241000990167 unclassified Simian adenoviruses Species 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 206010001258 Adenoviral infections Diseases 0.000 description 1
- 108010087905 Adenovirus E1B Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 101100189935 Arabidopsis thaliana PER55 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101100282369 Caenorhabditis elegans gcc-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 241001217856 Chimpanzee adenovirus Species 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 101150059079 EBNA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 101150034814 F gene Proteins 0.000 description 1
- 101150082239 G gene Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 208000031448 Genomic Instability Diseases 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- 241000701096 Human adenovirus 7 Species 0.000 description 1
- 241000701135 Human adenovirus D9 Species 0.000 description 1
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 108010068964 Intracellular Signaling Peptides and Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000001702 Intracellular Signaling Peptides and Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 241001045988 Neogene Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 102000011755 Phosphoglycerate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 241000224016 Plasmodium Species 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 102000009609 Pyrophosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108010009413 Pyrophosphatases Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000745906 Simian adenovirus 25 Species 0.000 description 1
- 108010052160 Site-specific recombinase Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 1
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000000956 alloy Substances 0.000 description 1
- 229910045601 alloy Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000005667 attractant Substances 0.000 description 1
- 241000701792 avian adenovirus Species 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- -1 deletion Chemical compound 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000003208 gene overexpression Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 101150091879 neo gene Proteins 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000006490 viral transcription Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
- C12N15/861—Adenoviral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
- C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
- C12N2840/44—Vectors comprising a special translation-regulating system being a specific part of the splice mechanism, e.g. donor, acceptor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Lubricants (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Niniejszy wynalazek dostarcza sposobów i środków do zwiększenia stabilności i/lub pojemności pakowania zrekombinowanych adenowirusów, przez nadekspresję pIX w komórkach pakujących adenowirusa, przez zachowanie przynajmniej części rejonu E1B 55K w zrekombinowanym wektorze adenowirusowym lub przez regulowanie pIX przy pomocy heterologicznego promotora. Wynalazek ponadto dotyczy sposobów i środków do wytwarzania takich adenowirusów w komplementujących liniach komórkowych, przy czym w adenowirusie występuje kwas nukleinowy kodujący 6 otwartą ramkę odczytu z wczesnego rejonu 4 (E4-orf6) i przy czym produkt genu E4-orf6 jest zgodny z jednym lub większą ilością produktów genu E1 w komórce komplementującej tak, że wektor adenowirusowy może być wydajnie wytwarzany przez komórkę komplementującą.
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są rekombinowane adenowirusy z podgrupy B, wyizolowane kwasy nukleinowe, komórki pakujące rekombinowanego adenowirusa oraz sposoby zwiększania stabilności i/lub pojemności upakowania rekombinowanego adenowirusa z podgrupy B.
Dziedzina wynalazku
Wynalazek dotyczy dziedziny medycyny, a w szczególności rekombinowanych wektorów adenowirusowych i ich zastosowania.
Stan techniki
Ludzkie adenowirusy są nieposiadającymi otoczek ikozahedralnymi cząstkami o wielkości 6090 nm. Do chwili obecnej zidentyfikowano 51 serotypów, które na podstawie zdolności do hemaglutynacji i homologii sekwencji dzieli się sześć podgrup (Francki i wsp., 1991). Genom ma długość 34 do 36 tys. par zasad (kb) i jest otoczony po obu stronach przez sekwencje odwróconych powtórzeń końcowych (ITR). Cykl zakaźny wirusa dzieli się na fazę wczesną i późną. We wczesnej fazie (6-8 godzin po infekcji) wirus jest pozbawiany kapsydu a jego genom jest przenoszony do jądra, po czym regiony wczesnych genów E1-E4 staja się transkrypcyjnie aktywne.
Wczesny region 1 (E1) zawiera dwa obszary ulegające transkrypcji nazwane E1A i E1B. Obszar E1A koduje dwa główne białka uczestniczące w modyfikacji cyklu komórki gospodarza i aktywowaniu innych regionów transkrypcji wirusa (przeglądu dokonał Russell, 2000), region E1B koduje dwa główne białka 19K i 55K zapobiegające, różnymi sposobami, indukcji apoptozy spowodowanej aktywnością białek E1A (Rao i wsp., 1992; Yew i Berg, 1992; przegląd w Shenk, 1996). Ponadto, białko E1B55K jest wymagane w fazie późnej do selektywnego transportu wirusowego mRNA i hamowania ekspresji białka gospodarza (Pilder i wsp., 1986). Białko pośrednie, pIX, jest częścią kapsydu i wiadomo o nim, że stabilizuje oddziaływania hekson-hekson (Furcinitti i wsp., 1989). Ponadto, pIX zostało opisane jako transaktywujące promotory zawierające TATA, takie jak promotor E1A i MLP (Lutz i wsp., 1997).
Dzięki rozległej wiedzy o biologii wirusa i wysokiej wydajności dostarczania do jądra po wniknięciu do komórek, adenowirusy stały się popularnymi narzędziami do dostarczania genów do komórek człowieka. Ponadto, wektory adenowirusowe są stabilne i można je względnie prosto wytwarzać na dużą skalę. W większości przypadków wektory takie mają usunięty przynajmniej region E1, co sprawia, że są one niezdolne do replikacji. Wytwarzanie wektorów z delecją E1 opartych na serotypach Ad5 lub Ad2 z podgrupy C można przeprowadzić w liniach komórkowych komplementujących E1, takich jak 293 (Graham i wsp., 1970), 911 (Fallaux i wsp., 1996) i PER.C6TM (Fallaux i wsp., 1998). Jak ujawniono w patencie US 5,994,128, wektory i linie komórkowe należy uważnie dopasowywać, aby uniknąć wytwarzania zdolnych do replikacji adenowirusów poprzez rekombinację homologiczną między sekwencjami adenowirusowymi w linii komórkowej i wektorze. Dlatego komórki PER.C6™ i dopasowane do nich wektory adenowirusowe dostarczają dogodnego systemu wytwarzania wektorów adenowirusowych z grupy C (Fallaux i wsp., 1998). Delecja sekwencji E1 dostarcza miejsca do wprowadzenia obcych genów do wektora wirusowego. Ponieważ maksymalna wielkość genomów Ad5, które mogą być wbudowane do wirionów jest ograniczona do około 105% długości wirusa typu dzikiego, wirus z delecją El może pomieścić około 4,8 kb obcego DNA (Bett i wsp., 1993).
Maksymalna pojemność upakowania w wirionach, które utraciły pIX jest ograniczona do około 95% długości normalnego genomu (Ghosh-Choudhury i wsp., 1987). Jest to najprawdopodobniej spowodowane obniżoną stabilnością wirionów pIX- („pIX-minus). Niedobory w mutantach Ad5 pIXminus mogą być komplementowane przez ekspresję z episomu pIX w linii komórek pakujących użytych do wytwarzania wirionów (Caravokyri i wsp., 1995).
Chociaż jako wektory do przenoszenia genów najpowszechniej stosowane są serotypy Ad5 i Ad2 są, to inne serotypy mogą mieć dogodne właściwości sprawiające, że będą one bardziej użyteczne jako narzędzie terapeutyczne lub profilaktyczne. Wirusy Ad35 i Ad11 z podgrupy B są znacznie mniej podatne na neutralizację przez ludzkie surowice niż wirusy Ad5 i Ad2 (ujawniono w WO 00/70071). Neutralizacja transferowych wektorów adenowirusowych zmniejsza wydajność transdukcji in vivo. Ponadto, wydajność infekcji komórek prezentujących antygen, takich jak komórki dendrytyczne, przez rekombinowane wirusy niosące włókno Ad35 okazała się in vitro znacznie większa w porównaniu z wirusami Ad5 (WO 00/70071, WO 02/24730). Zatem wektory oparte na Ad35 cechują się zarówno znacznie poprawioną wydajnością infekcji, jak i niską neutralizacją przez ludzkie surowice, co sprawia, że wektory takie są użyteczne do szczepień.
PL 208 588 B1
Wytwarzanie i propagacja wektorów opartych na Ad35 z całkowitą delecją E1 jest możliwa (zobacz np. międzynarodowe zgłoszenie patentowe PCT/EP03/50125, na rzecz Crucell Holland B.V., złożone 24 kwietnia 2003 r., opublikowane jako WO 03/104407, 18 grudnia 2003 r.). Jednakże, uważna analiza różnorodnych, rekombinowanych wektorów opartych na Ad35 ujawnia, że takie wektory są mniej stabilne, tj. mogą zawierać mniej obcego DNA w porównaniu z wektorami opartymi na Ad5. W niniejszym zgłoszeniu patentowym przedstawiono środki i sposoby, które przezwyciężają ten problem.
Opis Fig.
Fig. 1. Mapa pWE.Ad35.pIX-rITRΔE3
Fig. 2. Analiza w żelu fragmentów PCR wytworzonych na matrycy wirusów Ad35 z delecją E1, z i bez regionu E3. P1 = plazmid kontrolny; M = marker: drabinka 1kb plus (Invitrogen); mQ = H2O. Długości genomów są podane w kb.
Fig. 3A. Przyrównania sekwencji proksymalnych regionów poprzedzających pIX różnych adenowirusów sporządzone przy pomocy oprogramowania MEGalign(DNAstar) z użyciem metody Clustal. Źródło sekwencji podano w tekście. Blokami zaznaczono miejsce Spl i kasetę TATA w Ad5 i Ad2 (jak w Babiss i Vales, 1991).
Fig. 3B. Schematyczne porównanie przypuszczalnych kaset Spl i TATA w proksymalnej części regionów pIX z sekwencji podanych na Fig. 3A.
Fig. 4. Mapa pAdApt535.Luc
Fig. 5. Mapa pAdApt535
Fig. 6A. Analiza w żelu fragmentów PCR wytworzonych na DNA wyizolowanych z wirusów Ad35.AdApt.Luc i Ad35.AdApt535.Luc lub wytworzonych na plazmidach kontrolnych. M = marker (drabinka 1 kb plus, Invitrogen). Każdy preparat wirusa lub plazmid kontrolny jest badany przy pomocy dwóch specyficznych amplifikacji PCR.
Fig. 6B. Analiza w żelu fragmentów PCR wytworzonych na wirusach Ad35.AdApt.LacZΔE3 (35LacZ) i Ad35.AdApt535.LacZΔE3 (535LacZ) lub wytworzonych na plazmidach kontrolnych.
Fig. 7. Mapa pBr.Ad35ASM.AdApt.LacZ
Fig. 8. Schematyczne przedstawienie przypuszczalnych promotorów w regionie promotora E1B i kodującym 55K.
Fig. 9. Schematyczne przedstawienie miejsc restrykcyjnych w regionie 55K, których można użyć do wytwarzania oddzielnych fragmentów do identyfikacji przypuszczalnego promotora. Numeracja miejsc jest zgodna z ich umiejscowieniem w Ad35 typu dzikiego.
Fig. 10. Przyrównanie sekwencji pomiędzy sygnałami poliA regionu E1A i regionu E1B/pIX w trzech różnych serotypach podgrupy B.
Fig. 11. Schematyczne przedstawienie pBr.Ad35.PRn.
Fig. 12. Schematyczne przedstawienie pBr.Ad35.PRnΔE3.
Fig. 13. Schematyczne przedstawienie systemu do wytwarzania rekombinowanych cząsteczek adenowirusowych w komórkach, takich jak PER.C6 przez podwójna rekombinację homologiczną.
Fig. 14. Przyrównanie sekwencji cDNA pIX z Ad35 i Ad11 z sekwencją Ad35 typu dzikiego. Sekwencje uzyskane ze sklonowanych fragmentów cDNA jak opisano w Przykładzie 13 przyrównano przy pomocy programu SeqMan z DNASTAR. Sekwencje cDNA Ad35 pochodziły z RNA wyizolowanych z hodowli zakażonych wtAd35- lub Ad35E1B+Luc (przedstawiono sekwencję jednego z siedmiu klonów), sekwencja cDNA Ad11 z RNA wyizolowanego z hodowli zakażonej wtAd11. Numeracja sekwencji jest dowolna. Dla sekwencji Ad35 typu dzikiego pokazano sekwencję od nukleotydu 3339 do 3628 z sekwencji Ad35 typu dzikiego. Sekwencja intronu (przedstawiona jako luka w sekwencjach cDNA) jest otoczona przez donorowe miejsce składania (SD) i akceptorowe miejsce składania (SA) ściśle odpowiadające znanym sekwencjom najwyższej zgodności. Program SeqMan umieścił pierwsze dwa nukleotydy z SD (AG) w sekwencjach cDNA na 3' końcu sekwencji intronu zamiast na 5' końcu.
Fig. 15. Lokalizacja miejsca przyłączania czapeczki pIX w wirusach Ad35.
Schematyczne przedstawienie organizacji genomu wokół genu E1B i sekwencji pIX w Ad35; przedstawiono miejsce inicjacji transkrypcji i złącza intronów w mRNA pIX. Sekwencje nukleotydowe są zgodne z DNA dzikiego typu Ad35 (WO 00/70071). M = MunI, B = Bsu36l, SD = miejsce donorowe składania RNA i SA = miejsce akceptorowe składania RNA.
Miejsce inicjacji transkrypcji (nukleotyd 3339, miejsce przyłączenia czapeczki), kodon stop 55K (TAA) i kodon start pIX (nukleotyd 3484, ATG) podano pogrubioną czcionką. Kropkowana linia wskazuje, że sekwencji nie przedstawiono.
PL 208 588 B1
Fig. 16. Wyniki PCR transgenu z wirusów Ad35 z zachowanymi 166 parami zasad (pz) 3' sekwencji E1B.
Reprezentatywny przykład wyników oznaczenia transgenu przez PCR na Ad35.AdAptBsuLuc50rf6 (ścieżki 1-9) i wirusów Ad35.AdAptBsuLuc (ścieżki 10-14). M = marker 1kb+ (Invitrogen), P = plazmid kontrolny pAdAptBsuLuc.
Podsumowanie wynalazku
W niniejszym wynalazku pokazano, że rekombinowany adenowirus z grupy B z delecją w regionie E1, aż do kodonu stop E1B 55K, może przyjąć mniej egzogennych sekwencji niż podobny rekombinowany adenowirus Ad5. Okazało się, że jest to konsekwencją względnie obniżonej ekspresji genu pIX u wspomnianego wirusa z grupy B w danej komórce pakującej, gdzie region kodujący pIX jest poprzedzony jedynie przez sekwencje pomiędzy kodonem stop E1B-55K i kodonem start pIX. Wykazano, że takie wirusy można uczynić bardziej stabilnymi i/lub zdolnymi do przyjęcia większej liczby sekwencji egzogennych, albo przez odtworzenie co najmniej częściowo promotora pIX poprzez włączenie sekwencji z regionu kodującego E1B-55K do takiego wirusa, albo przez zastosowanie promotora heterologicznego do regulacji pIX w taki sposób, żeby uzyskać normalną lub nawet względną nadekspresję pIX w danej komórce pakującej.
Niniejszy wynalazek dostarcza rekombinowanych adenowirusów z podgrupy B, kwasu nukleinowego, który po wprowadzeniu do komórki pakującej odtwarza genom takich adenowirusów, sposobu zwiększania stabilności i/lub pojemności upakowania takich adenowirusów, oraz komórek pakujących zawierających takie adenowirusy.
Przedmiotem wynalazku jest rekombinowany adenowirus z podgrupy B z delecją w regionie E1, przy czym ten adenowirus nie koduje funkcjonalnego produktu genu E1B 55K i przy czym ten adenowirus zawiera:
- sekwencję adenowirusową zlokalizowaną pomiędzy kodonem stop sekwencji kodującej E1B 55K a kodonem start sekwencji kodującej pIX; i
- sekwencję kodują c ą funkcjonalne pIX pod kontrolą sekwencji o aktywnoś ci promotorowej, przy czym ta sekwencja o aktywności promotorowej składa się z do 0,7 kb sekwencji adenowirusowych, które znajdują się bezpośrednio powyżej kodonu start pIX, i przy czym ta sekwencja zawiera minimalną sekwencję wymaganą dla aktywności promotorowej, która występuje w obrębie ostatnich 166 pz sekwencji kodującej E1B 55K.
Korzystnie wspomniana sekwencja o aktywności promotorowej zawiera do 600 nukleotydów sekwencji adenowirusowych, które znajdują się bezpośrednio powyżej sekwencji kodującej pIX.
Korzystnie wspomniana sekwencja o aktywności promotorowej zawiera do 300 nukleotydów sekwencji adenowirusowych, które znajdują się bezpośrednio powyżej sekwencji kodującej pIX.
Korzystnie wspomniana sekwencja o aktywności promotorowej zawiera do 250 nukleotydów sekwencji adenowirusowych, które znajdują się bezpośrednio powyżej sekwencji kodującej pIX.
Korzystnie wspomniany adenowirus pochodzi z adenowirusa serotypu 35 lub adenowirusa serotypu 11.
Korzystnie zawiera on ponadto sekwencję kodującą funkcjonalne białko E4-orf6 pochodzące z adenowirusa z podgrupy C.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto wyizolowany kwas nukleinowy, charakteryzujący się tym, że po wprowadzeniu do odpowiedniej komórki pakującej stanowi genom rekombinowanego adenowirusa opisanego powyżej.
Przedmiotem wynalazku jest także komórka pakująca rekombinowany adenowirus, charakteryzująca się tym, że zawiera rekombinowanego adenowirusa jak określono powyżej.
Przedmiotem wynalazku jest również rekombinowany adenowirus z podgrupy B zawierający sekwencję kodującą funkcjonalne pIX i delecję w regionie E1, przy czym sekwencja kodująca pIX znajduje się pod kontrolą promotora heterologicznego w celu kierowania ekspresją w danej komórce pakującej.
Korzystnie promotor heterologiczny zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z nie-endogennego, proksymalnego promotora pIX, promotora wirusowego, promotora komórkowego, promotora syntetycznego i promotora hybrydowego.
Korzystniej wspomniany promotor heterologiczny wybrany jest z grupy składającej się z sekwencji, które przynajmniej w części pochodzą z proksymalnego promotora pIX z Ad5, promotora wirusa mięsaka Rousa i adenowirusowego promotora E1B.
Korzystnie wspomniany adenowirus pochodzi z adenowirusa serotypu 35 lub adenowirusa serotypu 11.
PL 208 588 B1
Korzystnie zawiera on ponadto sekwencję kodującą funkcjonalne białko E4-orf6 pochodzące z adenowirusa z podgrupy C.
Przedmiotem wynalazku jest także wyizolowany kwas nukleinowy, charakteryzujący się tym, że po wprowadzeniu do odpowiedniej komórki pakującej stanowi genom rekombinowanego adenowirusa z podgrupy B zawierają cego sekwencję kodują c ą funkcjonalne pIX i delecję w rejonie E1, przy czym sekwencja kodująca pIX znajduje się pod kontrolą promotora heterologicznego w celu kierowania ekspresją w danej komórce pakującej, jak opisano powyżej.
Przedmiotem wynalazku jest także komórka pakująca rekombinowany adenowirus, charakteryzująca się tym, że zawiera rekombinowanego adenowirusa z podgrupy B zawierającego sekwencję kodującą funkcjonalne pIX i delecję w rejonie E1, przy czym sekwencja kodująca pIX znajduje się pod kontrolą promotora heterologicznego w celu kierowania ekspresją w danej komórce pakującej, jak określono powyżej.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób zwiększa niastabilności i/lub pojemności upakowania rekombinowanego adenowirusa z podgrupy B z delecją w regionie E1, obejmujący etapy, w których poddaje się ekspresji elementy niezbędne do wytwarzania i składania wspomnianego rekombinowanego adenowirusa do cząstek wirusa w komórce pakującej, polegający na tym, że następujące elementy utrzymuje się lub wprowadza ponownie do wspomnianego adenowirusa:
- sekwencję adenowirusową zlokalizowaną pomiędzy kodonem stop sekwencji kodującej E1B 55K a kodonem start sekwencji kodującej pIX; i
- sekwencję kodującą funkcjonalne pIX pod kontrolą sekwencji o aktywności promotorowej, przy czym ta sekwencja o aktywności promotorowej składa się z do 0,7 kb sekwencji adenowirusowych, które znajdują się bezpośrednio powyżej kodonu start pIX, i przy czym ta sekwencja zawiera minimalną sekwencję wymaganą dla aktywności promotorowej, która występuje w obrębie ostatnich 166 pz sekwencji kodującej E1B 55K.
Korzystnie wspomniana sekwencja o aktywności promotorowej zawiera do 600 nukleotydów sekwencji adenowirusowych bezpośrednio powyżej sekwencji kodującej pIX.
Korzystnie wspomniana sekwencja o aktywności promotorowej zawiera do 300 nukleotydów sekwencji adenowirusowych bezpośrednio powyżej sekwencji kodującej pIX.
Korzystnie wspomniana sekwencja o aktywności promotorowej zawiera do 250 nukleotydów sekwencji adenowirusowych bezpośrednio powyżej sekwencji kodującej pIX.
Korzystnie wspomniany rekombinowany adenowirus pochodzi z adenowirusa serotypu 35 lub adenowirusa serotypu 11.
Korzystnie wspomniany promotor heterologiczny wybrany jest z grupy składającej się z nieendogennego, proksymalnego promotora pIX, promotora wirusowego, promotora komórkowego, promotora syntetycznego i promotora hybrydowego.
Korzystniej wspomniany promotor heterologiczny wybrany jest z grupy składającej się z sekwencji, które w przynajmniej części pochodzą z proksymalnego promotora pIX z Ad5, promotora wirusa mięsaka Rousa i adenowirusowego promotora E1B.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób zwiększania stabilności i/lub pojemności upakowania rekombinowanego adenowirusa z podgrupy B z delecją w regionie E1, obejmujący etap ekspresji elementów niezbędnych do wytwarzania i składania wspomnianego rekombinowanego adenowirusa do cząstek wirusa w komórce pakującej, w którym sekwencje kodujące pIX znajdują się pod kontrolą promotora heterologicznego.
Korzystnie wspomniany rekombinowany adenowirus pochodzi z adenowirusa serotypu 35 lub adenowirusa serotypu 11.
Korzystnie wspomniany promotor heterologiczny wybrany jest z grupy składającej się z nieendogennego, proksymalnego promotora pIX, promotora wirusowego, promotora komórkowego, promotora syntetycznego i promotora hybrydowego.
Korzystniej wspomniany promotor heterologiczny wybrany jest z grupy składającej się z sekwencji, które w przynajmniej części pochodzą z proksymalnego promotora pIX z Ad5, promotora wirusa mięsaka Rousa i adenowirusowego promotora E1B.
Szczegółowy opis wynalazku
W jednym aspekcie wynalazek dostarcza sposobu zwiększania stabilności i/lub pojemności upakowania rekombinowanego adenowirusa posiadającego przynajmniej delecję w regionie El, obejmującego etap ekspresji elementów niezbędnych do produkcji i składania wspomnianego, rekombinowanego adenowirusa do cząstek wirusowych w komórce pakującej w obecności podwyższonego
PL 208 588 B1 poziomu produktu genu pIX we wspomnianej komórce pakującej, w porównaniu z poziomem produktu genu pIX uzyskiwanym gdy sekwencja kodująca pIX znajduje się za jego endogenną proksymalną sekwencją poprzedzającą bez sekwencji E1B 55K. W określonych postaciach realizacji sposobu według wynalazku, wspomniany podwyższony poziom produktu genu pIX uzyskuje się przez zachowanie lub ponowne wprowadzenie części sekwencji E1B-55K do wspomnianego adenowirusa. W kolejnych postaciach, wspomniany podwyższony poziom produktu genu pIX uzyskuje się przez ekspresję sekwencji kodujących pIX pod kontrolą promotora heterologicznego.
Ponadto, wynalazek dostarcza rekombinowanego adenowirusa zawierającego funkcjonalną sekwencję kodującą pIX pod kontrolą sekwencji ekspresyjnej, przy czym wspomniana sekwencja ekspresyjna zawiera część sekwencji E1B-55K zdolną do zwiększenia ekspresji sekwencji kodującej pIX w danej komórce pakują cej, w porównaniu z ekspresją wspomnianej sekwencji kodują cej pIX pod kontrolą jej endogennej, proksymalnej sekwencji poprzedzającej pIX bez części wspomnianej sekwencji EIB 55K, pod warunkiem, że wspomniana część sekwencji E1B-55K nie koduje funkcjonalnego produktu genu E1B 55K. W niniejszym wynalazku pokazano, że sekwencje promotora pIX mogą występować we wspomnianych sekwencjach E1B-55K, i że włączenie tych sekwencji do wspomnianej sekwencji ekspresyjnej może zwiększać ekspresję pIX. Obecność wspomnianych sekwencji E1B-55K zwiększa stabilność i/lub pojemność upakowania wspomnianego rekombinowanego adenowirusa, w porównaniu z sytuacją gdy wspomniana sekwencja kodująca pIX jest za jej endogenną proksymalną sekwencją poprzedzającą pIX bez części wspomnianej sekwencji E1B 55K.
Adenowirusa serotypu 35 z delecją w regionie E1, lecz z niezmienionym regionem kodującym
E1B-55K (pBrAd35JeftITR.ΔE1AΔ21K) ujawniono w WO 02/40665. Jednakże, funkcjonalny produkt genu 55K, taki jak występujący w ujawnionym wektorze, hamuje apoptozę i co za tym idzie jest pożądany w celu uzyskania rekombinowanego adenowirusa, który funkcjonalnie utracił ekspresję E1B 55K, np. przez mutację genu E1B-55K lub w szczególności przez uwzględnienie jedynie części sekwencji E1B 55K, zwłaszcza uwzględnienie jedynie sekwencji położonych poniżej kodonu start E1B 55K. Dla specjalisty w dziedzinie jasnym będzie, że w celu przyjęcia większej ilości obcego kwasu nukleinowego i równocześnie zachowania dostatecznej ilości sekwencji E1B 55K po to, by rekombinowany adenowirus miał zwiększoną stabilność i/lub zwiększoną pojemność upakowania zalecane jest zminimalizowanie ilości sekwencji E1B-55K we wspomnianym wektorze do wytwarzania wirusów z maksymalną delecją E1. Przy pomocy ujawnienia niniejszego wynalazku specjalista w dziedzinie będzie mógł znaleźć minimalne wymagane sekwencje w obrębie E1B-55K powodujące stabilizację i/lub zwiększające pojemność upakowania rekombinowanego adenowirusa, np. przy pomocy standardowych technik klonowania molekularnego w celu uzyskania serii delecji w regionie E1B-55K wychodząc z ujawnionego wektora (pBr.Ad35.ie1tITR.ΔE1AΔ21 K) i określając stabilność lub pojemność upakowania. Co za tym idzie, celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie rekombinowanego wektora adenowirusowego, w którym wspomniane sekwencje kodujące produkt genu E1B-55K zawierają około 0,7 kb lub mniej sekwencji adenowirusowych, które znajdują się bezpośrednio powyżej otwartej ramki odczytu pIX. W innych postaciach, wspomniane sekwencje zawierają nie więcej niż około 680, 600, 550, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150 lub 100 nt sekwencji adenowirusowych, które są bezpośrednio powyżej otwartej ramki odczytu pIX. W pewnej postaci, taki rekombinowany wektor adenowirusowy zachowuje 166 pz 3' końcowej sekwencji kodującej 55K. Dla specjalisty w dziedzinie oczywistym będzie, że wynalazek nie jest ograniczony do obecności sekwencji, którą znajduje się w ciągu bezpośrednio przed pIX w naturalnym adenowirusie. W rzeczywistości zgodnie z wynalazkiem możliwe również będzie posiadanie sekwencji, które bardziej poprzedzają te sekwencje kodujące, np. z regionu E1B55K (np. fragment restrykcyjny lub PCR, patrz np. przykład 10 i Fig. 9), przyłączonych do bardziej proksymalnych sekwencji regulatorowych pIX, z wytworzeniem sztucznej kombinacji sekwencji regulatorowych, pod warunkiem, że efektem tego jest zwiększona ekspresja pIX w danej komórce pakującej, w porównaniu z sytuacją gdy nie ma jakichkolwiek sekwencji E1B 55K. Wspomniany adenowirus jest adenowirusem z podgrupy B, korzystnie adenowirusem Ad35 lub Ad11. Pokazano, że adenowirusy serotypów 35 lub 11 są szczególnie użyteczne do podawania ludziom, ponieważ istnieje znacznie mniej osób posiadających przeciwciała neutralizujące przeciw tym serotypom niż przeciw serotypowi 5, używanemu dotąd najczęściej (WO 00/70071). W kolejnym aspekcie wynalazek dostarcza kwasu nukleinowego, który może funkcjonować jako genom adenowirusa według niniejszego wynalazku.
Alternatywnie, albo oprócz, obecności sekwencji E1B-55K zwiększających ekspresję genu pIX, możliwa jest również nadekspresja samego pIX przez mutację genu pIX, w szczególności jego promotora, w celu zwiększenia stabilności i/lub pojemności upakowania rekombinowanego adenowirusa.
PL 208 588 B1
Zmodyfikowany gen pIX jest genem pIX posiadającym odmienny promotor i/lub terminator transkrypcji i/lub zmutowane sekwencje kodujące, np. otrzymane przez optymalizacje kodonu, wprowadzenie intronów stabilizujących RNA i podobnych. Gen pIX tu opisany zawiera informację genetyczną kodującą pIX i obejmuje kwas nukleinowy, taki jak gen pIX występujący w naturalnym adenowirusie, cDNA i informację kodując ą zmutowaną postać pIX w formie wariantów allelicznych lub kwas nukleinowy kodujący zmutowany pIX, który posiada przynajmniej część funkcji pIX, które mogą różnić się od normalnego pIX w aspektach ilościowych lub jakościowych, pochodzić z pIX przez mutację, delecję, insercję lub translokację aminokwasów, lub kombinacje powyższych.
Jeśli rekombinowany adenowirus posiada delecję przynajmniej regionu E1B-55K aż do kodonu stop produktu genu E1B 55K, i włącznie z nim, to otwarta ramka odczytu pIX będzie poprzedzona przez sekwencje pomiędzy kodonem stop E1B-55K i kodonem start pIX. Sekwencje te są określane tu jako „endogenne proksymalne sekwencje poprzedzające pIX (np. sekwencja poprzedzająca pIX z Ad35 w rekombinowanych wektorach adenowirusowych opartych na Ad35, sekwencja poprzedzają ca pIX z Ad11 w rekombinowanych wektorach adenowirusowych opartych na Ad11, itp. określanych tu z tego względu jako sekwencje endogenne; definicja obejmuje warianty alleliczne, które mogą występować w naturze i które nie zostały wytworzone w laboratorium; patrz Fig. 3A pod kątem pewnych proksymalnych sekwencji poprzedzających pIX).
„Promotor heterologiczny w stosowanym tu znaczeniu jest definiowany jako jakakolwiek sekwencja odmienna od sekwencji naturalnie występujących powyżej genu pIX, włącznie z sekwencjami regionu E1B-55K i endogennymi proksymalnymi sekwencjami poprzedzającymi pIX, a ponadto zdolnymi do działania jako promotor i co za tym idzie regulująca transkrypcję sekwencji kodujących pIX. W pewnym aspekcie, promotor heterologiczny mo ż e być sekwencją przynajmniej częściowo pochodzącą z proksymalnej sekwencji poprzedzającej pIX (np. sekwencji pomiędzy kodonem stop E1B-55K i kodonem start pIX) z adenowirusa innego serotypu niż serotyp, z którego pochodzi rekombinowany wektor adenowirusowy (np. sekwencja poprzedzająca pIX z Ad5 w rekombinowanym wektorze adenowirusowym Ad35). Jest ona określona tu jako „nie-endogenny proksymalny promotor pIX. W pewnej postaci realizacji ekspresja pIX pochodzącego z Ad35 jest kierowana przez nie-endogenny proksymalny promotor pIX z Ad5. Zastosować można dowolny nie-endogenny proksymalny promotor pIX pochodzący z proksymalnej sekwencji poprzedzającej pIX z serotypu ustanawiającego wyższy poziom ekspresji pIX niż endogenne proksymalne sekwencje pIX wektora adenowirusowego. Identyfikacja takich nie-endogennych proksymalnych promotorów pIX może być oparta na informacji o sekwencji, takiej jaka będzie oczywista dla specjalisty w dziedzinie z Przykładu 4. W szczególnych postaciach realizacji, wektor adenowirusowy tu opisany pochodzi z adenowirusa serotypu z podgrupy E lub korzystnie serotypu z podgrupy B. W specyficznych postaciach realizacji, wspomniany wektor adenowirusowy pochodzi z adenowirusa serotypu 35 (Ad35), Ad11, Ad7 lub Ad4. W alternatywnych postaciach realizacji wspomniany nie-endogenny proksymalny promotor pIX przynajmniej częściowo pochodzi z proksymalnej sekwencji poprzedzającej pIX adenowirusa klasyfikowanego do podgrupy C, A, D lub F. W szczególnych postaciach realizacji wspomniany nie-endogenny proksymalny promotor pIX przynajmniej częściowo pochodzi z proksymalnej sekwencji poprzedzającej pIX z adenowirusa serotypu 12 (Ad12), Ad9 lub Ad40 lub w szczególności Ad5 lub Ad2. Alternatywnie, sekwencje działające jako nie-endogenny proksymalny promotor pIX można znaleźć empirycznie przy pomocy ogólnych metod biologii molekularnej znanych specjaliście w dziedzinie, takich jak oznaczenia transkrypcji, gdzie promotory można rutynowo testować z uwagi na ich siłę. Dla specjalisty w dziedzinie oczywistym będzie, że elementy promotora można wymieniać bez zmiany całego promotora, np. poprzez addycję, delecję czy mutację znanych sekwencji wiążących czynnik transkrypcyjny z promotorem można wpływać na jego siłę. Mutację przynajmniej części sekwencji promotora można uzyskać poprzez zmianę sekwencji przez mutacje, takie jak insercje, delecję albo poprzez zmianę jednego lub większej liczby nukleotydów, włącznie z ciągami nukleotydów o znanej funkcji. Substytucję sekwencji promotora wprowadza się poprzez zastąpienie części lub całej tej sekwencji innym promotorem. Takie zastąpienia można wprowadzić przy pomocy typowych technik biologii molekularnej dobrze znanych specjaliście w dziedzinie. Skonstruować można dowolny promotor w funkcjonalnym związku z wybranym genem pIX i sprawdzić go pod kątem jego działania.
W kolejnym aspekcie wynalazku promotor heterologiczny jest niespokrewniony z adenowirusowymi nie-endogennymi proksymalnymi promotorami pIX. Co za tym idzie, promotory heterologiczne mogą być również promotorami wirusowymi, w tym nieograniczająco promotorami pochodzącymi z cytomegalowirusa (CMV, np. promotora wczesnego genu ludzkiego CMV, dalej określanego tu jako
PL 208 588 B1 promotor CMV), wirusa mięsaka Rousa (RSV, np. promotor długiego końcowego powtórzenia RSV, dalej określanego tu jako promotor RSV), TK, HBV, SV40 i podobnych. W pewnej postaci realizacji jako promotor heterologiczny użyty jest adenowirusowy promotor E1B. Jako heterologiczne promotory zastosować można również promotory komórkowe, w tym nieograniczająco promotory PGK, metalotioneiny, EFI-α, β-aktyny i tym podobnych. W wynalazku można również zastosować promotory syntetyczne lub hybrydowe, zawierające elementy z więcej niż jednego promotora i wszystkie one są objęte terminem promotor heterologiczny. Zastosowane promotory mogą być konstytutywne lub indukowalne. W kontekście indukowalnego promotora przyjmuje się, że rozważany promotor jest użyteczny w wynalazku jeśli w stanie indukowanym skutkuje nadekspresją.
Zgodnie z wynalazkiem jako promotor heterologiczny tu opisany można zastosować dowolną sekwencję promotorową dającą nadekspresję pIX. Oprócz siły promotora jednym z innych aspektów określających użyteczność rozważanego promotora, gdy występuje on w rekombinowanym wektorze adenowirusowym, jest jego wielkość, bowiem długie promotory będą zajmowały przestrzeń dostępną dla transgenu. W celu znalezienia najbardziej stabilnego rekombinowanego wektora specjalista w dziedzinie będzie mógł zastosować niniejszy wynalazek do eksperymentalnej optymalizacji wektora pod względem długości i siły promotora w stosunku do wielkości wstawki.
Oczywistym będzie, że promotor heterologiczny może nadal posiadać lub obejmować część lub całość endogennych proksymalnych sekwencji poprzedzających pIX, lub alternatywnie całkowicie zastępować te sekwencje, pod warunkiem, że opisany tu promotor heterologiczny może powodować nadekspresję informacji genetycznej kodującej pIX w wybranej komórce pakującej. Dla specjalisty w dziedzinie jasnym również będzie, że gdy endogenny promotor adenowirusowy niebędący promotorem pIX (np. promotor E1A, E2A, itp.) lub promotor heterologiczny, który przykładowo reguluje transgen, zostanie użyty do wywoływania ekspresji pIX przez zastosowanie wewnętrznego miejsca wiązania rybosomu (IRES) pomiędzy nie-adenowirusowym genem pIX lub transgenem a sekwencją kodującą pIX (w dowolnej kolejności), to zgodnie z wynalazkiem należy traktować go jako objęty zakresem terminu „promotor heterologiczny.
Podwyższony lub podniesiony poziom produktu genu pIX w wynalazku jest wynikiem nadekspresji genu pIX w wybranej komórce pakującej. Nadekspresja genu pIX w stosowanym tu znaczeniu jest definiowana jako poziom ekspresji pIX zarówno na poziomie RNA, jak i poziomie białka, lub obu, który jest wyższy niż poziom ekspresji pIX uzyskiwany gdy region kodujący pIX znajduje się za „endogennymi proksymalnymi sekwencjami poprzedzającymi pIX jak tu określono, w danej komórce pakującej. W kontekście niniejszego wynalazku „nadekspresja dotyczy szczególnej heterologicznej kombinacji promotor-pIX adenowirusa w połączeniu ze szczególną, wybraną komórką pakującą. Sposoby określenia poziomów ekspresji są ogólnie dobrze znane specjalistom w dziedzinie i nieograniczająco obejmują RT-PCR, Northern blot, Western blot i podobne. W niniejszym wynalazku nadekspresję mierzy się przez określanie poziomów ekspresji rekombinowanego adenowirusa z określoną wstawką (np. lucyferaza) w określonej wybranej komórce pakującej, gdzie informacja genetyczna kodująca pIX znajduje się za endogennymi proksymalnymi sekwencjami poprzedzającymi pIX bez sekwencji E1B55K i w porównaniu z poziomem ekspresji rekombinowanego adenowirusa, który jest taki sam z tym wyjątkiem, że region kodujący pIX jest regulowany przez promotor heterologiczny lub przez sekwencje z endogennego genu E1B-55K (jego „naturalny promotor, który został przynajmniej częściowo odtworzony). Na nadekspresję pIX wskazuje proporcja wyższa niż 1 dla poziomu ekspresji otrzymanego przez heterologiczny lub „naturalny promotor w stosunku do otrzymanej dla endogennych proksymalnych sekwencji poprzedzających pIX bez sekwencji E1B 55K. Wybór komórki pakującej jest zdeterminowany przez czynniki takie jak serotyp elementów rekombinowanego adenowirusa, które oddziałują z funkcjami komplementującymi adenowirusa w komórce pakującej, czystość produktu (taka jak brak adenowirusa zdolnego do replikacji w wytworzonej partii), łatwość użycia, charakterystyka wzrostu i tym podobne. Przykłady komórek pakujących są znane specjaliście w dziedzinie i obejmują komórki 293, komórki 911 i użyte tu komórki PER.C6™, jak również ich pochodne zaadaptowane do komplementowania wektorów adenowirusowych o specyficznych serotypach, takich jak PER55K.
Jasnym będzie, że we wszystkich postaciach wynalazku sekwencje kodujące pIX i sekwencje regulatorowe kierujące ekspresją pIX mogą być umiejscowione w ich naturalnej lokalizacji w genomie adenowirusa, jak również w innych miejscach genomu adenowirusa, np. w regionie, który oryginalnie zawiera sekwencje E3.
Rekombinowane adenowirusy o zwiększonej stabilności są zdolne do włączania większych genomów do cząsteczek wirusa (wirionów). Zatem zwiększanie stabilności stosowanych tu rekombinoPL 208 588 B1 wanych adenowirusów pozwoli rekombinowanemu adenowirusówi według wynalazku na przyjęcie większej ilości obcej informacji genetycznej, zawierającej gen będący przedmiotem zainteresowania. Ponadto, rekombinowany adenowirus o zwiększonej stabilności, zgodnie z wynalazkiem, może być zdolny do propagacji przez większą liczbę pasaży bez objawów niestabilności. Stabilność można mierzyć szeregiem sposobów znanych specjalistom w dziedzinie, w tym nieograniczająco PCR na rekombinowanym wirusie w celu wykazania obecności pożądanych rekombinowanych wektorów adenowirusowych. Niestabilność będzie prowadziła do produktów ubocznych, które również mogą można uwidocznić sposobami PCR i podobnymi. Do określania stabilności rekombinowanych wektorów adenowirusowych można również zastosować analizę restrykcyjną wirusowego DNA, określanie względnej zakaźności cząsteczek wirusa i określanie termostabilności cząsteczek wirusa (Caravokyri i Leppard, 1995). Sposoby określania stabilności/niestabilności rekombinowanych wektorów adenowirusowych są również podane w Przykładzie 3 niniejszego zgłoszenia. Rekombinowany adenowirus, również nazywany rekombinowanym wektorem adenowirusowym lub wektorem adenowirusowym, w stosowanym tu znaczeniu pochodzi z adenowirusa, jest pozbawiony przynajmniej części regionu E1 (zawierającego geny E1A i E1B) adenowirusa i może zawierać obcą informację genetyczną, której dostarczenie i/lub ekspresja przez wspomniany wektor jest pożądana. Egzogenna (lub obca) informacja genetyczna w stosowanym tu znaczeniu oznacza jakąkolwiek informację genetyczną, która naturalnie nie występuje w adenowirusie i jest również określana jako transgen. Obejmuje ona nieograniczająco geny będące przedmiotem zainteresowania, kasetki ekspresyjne i tym podobne. Taka egzogenna informacja genetyczna może wypełniać przestrzeń w genomie, która stała się dostępna po usunięciu adenowirusowych sekwencji E1. Rekombinowane wektory adenowirusowe są użyteczne do różnych celów, takich jak zastosowania w terapii genowej, wytwarzanie szczepionek i tym podobne. W celu zwiększenia pojemności dla obcej informacji genetycznej w określonych, korzystnych postaciach realizacji oprócz delecji regionu E1 z takich wektorów adenowirusowych można usunąć również sekwencje E3. Można także wprowadzić inne delecje i różne kombinacje częściowych lub pełnych delecji regionów E2, E3 i E4 w połączeniu z delecją E1, jeśli jest to potrzebne w połączeniu z komórką pakującą zawierającą informację genetyczną, niewystępującą w wektorze adenowirusowym, gdy jest to niezbędne dla replikacji wektora adenowirusowego. Zakresem niniejszego wynalazku objęte są wszystkie rekombinowane adenowirusy posiadające delecję w regionie E1 delecjami w genomie adenowirusa. Adenowirusy według niniejszego wynalazku mogą być użyte w różnych układach, takich jak terapia genowa lub profilaktyka i/lub szczepienie terapeutyczne, włącznie ze szczepieniem przeciw nowotworowi i szczepieniem przeciw wirusowym. Dla tych celów wektor adenowirusowy funkcjonuje jako nośnik dostarczający gen, w którym nienatywny gen jest włączony do genomu adenowirusa. Cząsteczka adenowirusa może być następnie specyficznie adresowana do komórek docelowych będących przedmiotem zainteresowania; adenowirus wiąże się z tą specyficzną komórką albo przez wiązanie kapsyd-receptor, albo w inny sposób, i dostarcza transgen. Adresowanie adenowirusów można przeprowadzić wieloma różnymi sposobami. Specjaliści w dziedzinie adresowania wektorów adenowirusowych będą zorientowani we wszystkich różnych możliwościach, które są stosowane do dostarczenia wektorów adenowirusowych do komórek będących przedmiotem zainteresowania. Takie możliwości obejmują nieograniczająco zmiany kapsydu (modyfikacje włókna, heksonu i/lub pentonu, takie jak delecję, zamiana pomiędzy włóknami różnych serotypów i dodanie peptydów i/lub innych cząsteczek wiążących), przy czym wytwarzane są włókna chimerowe rozpoznające receptor obecny na komórce będącej przedmiotem zainteresowania, lub wykorzystywane jest wiązanie oparte na pentonie. Inne możliwości to wiązanie cząsteczek adresujących z białkami kapsydu, przy czym przykładowo peptydy wiążące, znane i silnie wiążące białka lub przeciwciała, lub ich części, są przyłączane do białek kapsydu w celu uzyskania specyficznego adresowania. Wszystkie takie wektory można wytworzyć przy pomocy sposobów i środków tu ujawnionych. Co za tym idzie, niniejszy wynalazek ujawnia również rekombinowane wektory adenowirusowe według wynalazku zawierające ponadto sekwencję kodującą białko niepochodzące z adenowirusa. Takie sekwencje mogą występować w różnych miejscach w szkielecie adenowirusa, lecz dogodnie są one umiejscowione w regionie E1, którego nie ma w rekombinowanych wektorach adenowirusowych według wynalazku. Region E1 jest komplementowany przez elementy komplementujące, występujące w komórkach komplementujących. Orientacja promotora, transgenu i innych sekwencji regulatorowych może być skierowana do lewego, jak również do prawego końcowego powtórzenia.
W niniejszym wynalazku rozważane jest również wytwarzanie wektorów wirusowych opartych na adenowirusie i/lub innych wirusach, takich jak wirus adenosatelitarny (AAV), przy czym kombinacja
PL 208 588 B1 taka jak chimerowy wirus Ad-AAV może być wbudowana do genomu komórki gospodarza. W dziedzinie znanych jest szereg sposobów wytwarzania adenowirusów integrujących. Ogólnie, wynalazek jest również użyteczny do wytwarzania integrujących (specyficznie lub nie specyficznie) postaci adenowirusa.
Jak wspomniano powyżej, w rekombinowanych wektorach adenowirusowych według niniejszego wynalazku sklonować można szereg transgenów nie-adenowirusowych. Obejmują one nie tylko regulatorowe sekwencje kwasu nukleinowego, takie jak wzmacniacze, promotory (np. silne promotory nie-adenowirusowe, takie jak promotor cytomegalowirusa, promotor SV40 i promotor RSV) i sygnały poliadenylacji, lecz również geny heterologiczne do celów terapeutycznych. Dlatego, w jednym aspekcie wynalazku dostarczone są rekombinowane wektory adenowirusowe według wynalazku, w których wspomniane białko nie-adenowirusowe jest wybrane z grupy składającej się z polipeptydu indukującego śmierć komórki, antygenu specyficznego dla guza, białka wirusowego, hormonu i cytokiny. Nieograniczającymi przykładami czynników, białek, polipeptydów i peptydów nie-adenowirusowych są czynniki transkrypcyjne, wewnątrzkomórkowe białka sygnalizacyjne, fosfatazy, kinazy, czynniki hamujące apoptozę, receptory antagonistów, rozpuszczalne postaci receptorów związanych z błoną, inhibitory RNA, antysensowny RNA, czynniki przyciągające, rybozymy, a dokładniej kinaza tymidynowa, erytropoetyna, białko pobudzające nową erytropoezę (NESP), IL3, ceNOS, gamma-interferon i gp100. Wirusowe białka nie-adenowirusowe można sklonować do rekombinowanych wektorów adenowirusowych otrzymanych sposobami i środkami tu opisanymi w celu zastosowania ich jako szczepionek. Takie białka wirusowe nieograniczająco obejmują gag, pol, env, nef, itd. do szczepień przeciw HIV, białka E6 i E7 do szczepień przeciwko ludzkiemu wirusowi brodawczaka, białka cirkumsporozoidu pierwotniaka Plasmodium do szczepień przeciw malarii, składniki rotawirusa do szczepień przeciw rotawirusowi, białka ebola do szczepień przeciw ebola, produkty genu F i G z syncytialnego wirusa układu oddechowego do szczepień przeciw syncytialnemu wirusowi układu oddechowego, HA i NA do szczepień przeciw grypie itd.
Adenowirusy według wynalazku są dogodnie adenowirusami ludzkimi, tj. pochodzą z adenowirusów, które są zdolne do zakażenia ludzkich komórek, lecz wynalazek jest również użyteczny w przypadku adenowirusów nie-ludzkich. Specjalista w dziedzinie bę dzie ś wiadomy faktu, ż e w dziedzinie poza wszystkimi adenowirusami ludzkimi zidentyfikowano wiele adenowirusów nie-ludzkich. Oczywiście, do uzyskania tych samych wyników jakie ujawniono w niniejszym wynalazku, zastosować można również adenowirusy nie-ludzkie. Nieograniczającymi przykładami wirusów nie-ludzkich, które można wytwarzać przy pomocy sposobów i środków tu opisanych są adenowirusy psie, bydlęce, małpie i ptasie. Serotypy w stosowanym tu znaczeniu nie są zatem ograniczone gatunkowo.
„Pochodzący z (lub „oparty na) w stosowanym tu znaczeniu oznacza, że sekwencje kwasu nukleinowego, geny lub białka, które normalnie występują w adenowirusach są stosowane do wytwarzania rekombinowanych adenowirusów według wynalazku. Sposoby wytwarzania takich rekombinowanych adenowirusów są dobrze znane specjalistom w dziedzinie i obejmują nieograniczająco ogólne sposoby biologii molekularnej, takie jak klonowanie informacji genetycznej w pożądanym kontekś cie przy zastosowaniu enzymów restrykcyjnych i tym podobne. Okreś lenie „pochodzą z w stosowanym tu znaczeniu ma także obejmować syntetyczne konstrukty informacji genetycznej oparte na znajomości takiej informacji genetycznej. Takie sposoby obejmują nieograniczająco zastosowanie adenowirusowego materiału genetycznego jako matrycy do PCRw celu konstrukcji nowych konstruktów adenowirusowych, opartych na sekwencji matrycy adenowirusa, konstrukcji całkowicie syntetycznej informacji genetycznej o pożądanej sekwencji np. przez łączenie syntetycznych oligonukleotydów z pożądanym konstruktem i tym podobnie. Należy rozumieć, że określenie „pochodzący z niekoniecznie oznacza bezpośrednie klonowanie DNA typu dzikiego. Specjalista w dziedzinie dostrzeże również możliwości biologii molekularnej w otrzymywaniu zmutowanych postaci określonego miejsca kwasu nukleinowego. Mutacje te mogą nieść różne właściwości funkcjonalne, lecz również mogą być milczące w tym sensie, że określone mutacje nie zmieniają funkcjonalności szczególnego fragmentu DNA i kodowanego przez nie białka. Co za tym idzie, określenia „jego funkcjonalna część, pochodna i/lub analog należy rozumieć jako równoważniki kwasu nukleinowego, z którym są spokrewnione. Specjalista w dziedzinie dostrzeże fakt, że określone delecję, zamiany, mutacje (punktowe), insercje itp. mogą wciąż skutkować powstaniem kwasu nukleinowego o podobnej funkcji co oryginalny kwas nukleinowy. Należ y zatem rozumieć, że takie zmiany, które nie zmieniają znacząco funkcjonalności białek, takich jak białko pIX, E-orf6 i produkt genu E1B-55K są w zakresie niniejszego wynalazku. Dla specjalisty w dziedzinie
PL 208 588 B1 jasnym będzie, że sposób uzyskania informacji genetycznej kodującej rekombinowany adenowirus może być różny, ale nie spowoduje to wykroczenia poza zakres niniejszego wynalazku.
Ludzkie adenowirusy zostały zaklasyfikowane do podgrup A-F, obejmujących 51 serotypów (patrz np. EP 0978566). Przy pewnych zastosowaniach zalecane może być zastosowanie wektorów adenowirusowych pochodzących z adenowirusów ze specyficznych podgrup lub z określonych serotypów posiadających tropizm tkankowy do pożądanego typu komórki, np. komórek dendrytycznych (WO 02/24730). Ogólny brak w populacji przeciwciał neutralizujących przeciwko adenowirusom z określonych podgrup lub specyficznych serotypów jest również ważnym parametrem dla dokonania wyboru serotypu (WO 00/70071). Z uwagi na podobieństwo pomiędzy wirusami z podgrupy B (patrz np. Przykłady 4 i 11) uważa się, że wynalazek jest szczególnie dostosowany do adenowirusów z grupy B. Zatem, niniejszy wynalazek dotyczy wektorów adenowirusowych pochodzących z adenowirusa zaklasyfikowanego do podgrupy B. Podgrupa B ludzkich adenowirusów obejmuje Ad3, Ad7, Ad11, Ad14, Ad16, Ad21, Ad34, Ad35 i Ad50. Korzystne postaci realizacji niniejszego zgłoszenia dotyczą wektorów adenowirusowych pochodzących z serotypów Ad35 i Ad11. W specyficznych zastosowaniach oprócz wyboru serotypu, zastosować można tzw. adenowirusy chimerowe. Obejmują one części lub pełne sekwencje genetyczne kodujące białka kapsydu, takie jak włókno, penton lub hekson, z jednego lub większej liczby serotypów adenowirusowych związane z pozostałą informacją genetyczną („właściwą częścią wektora adenowirusowego) z innych serotypów, co można wykorzystać do zwiększenia immunogenności lub zmiany tropizmu tkankowego „właściwego wektora adenowirusowego (EP 0978566). „Właściwa część w stosowanym tu znaczeniu oznacza, że stanowi ona większość informacji genetyczne] wspomnianego wirusa chimerowego i co za tym idzie, adenowirus chimerowy będzie należał do grupy serotypu „właściwej części takiego wirusa. Dla specjalisty w dziedzinie jasnym będzie, że niniejszy wynalazek może również być zastosowany w przypadku takich adenowirusów chimerowych, gdy będą ich dotyczyć podobne problemy z niestabilnością. Przykładowo, można oczekiwać, że adenowirus chimerowy zawierający sekwencje Ad35 jako właściwą część i zawierający włókno pochodzące z np. adenowirusa Ad11 może wykazywać podobną niestabilność podczas propagacji jak donoszono dla opisanych tu rekombinowanych wektorów adenowirusowych Ad35. Zatem gdy wspomina się w niniejszym zgłoszeniu rekombinowane adenowirusy to należy rozumieć, że niniejszym wynalazkiem objęte są także chimerowe wektory adenowirusowe.
Elementy niezbędne do wytwarzania i składania rekombinowanych wektorów adenowirusowych są dobrze znane specjalistom w dziedzinie (opisane powyżej; patent US 5,994,128; Russell, 2000). Wytwarzanie rekombinowanych adenowirusów z delecją E1 w postaci wirionów jest dokonywane w komórkach pakujących, zwanych również komórkami komplementującymi. Takie komórki dostarczają in trans informację genetyczną adenowirusa, której nie ma we wspomnianych rekombinowanych adenowirusach, a która jest niezbędna do wytwarzania takich rekombinowanych wirusów (rekombinowanych wirionów). Dobrze znane komórki pakujące to komórki 293, 291 i PER.C6™ (powyżej). W przypadku większości celów zalecane jest zastosowanie komórki pakującej i rekombinowanego wektora adenowirusowego, które nie mają zachodzących na siebie sekwencji, które w innym wypadku powodowałyby rekombinację homologiczną prowadzącą do replikacji kompetentnych adenowirusów (patent US 5,994,128). Komórka PER.C6™ zdeponowana pod numerem dostępu 96022940 w Europejskiej Kolekcji Hodowli Komórkowych w Centrum Mikrobiologii Stosowanej i Badań jest co za tym idzie, bardzo dogodną komórką pakującą do namnażania rekombinowanych adenowirusów. Opracowano także inne sposoby zmniejszania wytwarzania adenowirusów zdolnych do replikacji i obejmują one przykładowo manipulację sekwencjami adenowirusowymi celem ograniczenia homologii pomiędzy sekwencjami obecnymi w komórce pakującej i wektorze (np. Hehir i wsp., 1996; Robert i wsp., 2001). Komórki pakujące mogą, poza obligatoryjnym regionem E1, zawierać inne sekwencje adenowirusowe do komplementowania innych funkcji adenowirusowych, gdy tych funkcjonalnie nie ma w zastosowanym rekombinowanym adenowirusie, takich jak np. części lub całe E2, E4 i tym podobne. Komplementująca informacja w komórkach pakujących może występować albo w postaci wbudowanej do genomu, albo w postaci kopii pozachromosomowych, np. na plazmidach, wektorach, kosmidach i tym podobnych. W innych sposobach wykorzystywane są tzw. wirusy pomocnicze zawierające informację genetyczną, które nie występują w rekombinowanym adenowirusie. Rekombinowane wektory adenowirusowe stosowane są również jako tzw. wirusy pomocnicze używane do wytwarzania rekombinowanych adenowirusów posiadających genom z usuniętą większością genów lub wszystkimi genami adenowirusowymi (wektory typu gutless lub adenowirusy zależne od elementu pomocniczego). Przy wytwarzaniu takich adenowirusów typu gutless należy uniknąć pakowania adenowirusa pomoc12
PL 208 588 B1 niczego. Specjalista w dziedzinie jest zorientowany w sposobach osiągnięcia tego, przykładowo, przy pomocy rekombinazy miejscowo-specyficznej dla skonstruowanego miejsca w sygnale do pakowania, w celu usunięcia tego sygnału do pakowania. Często niezbędne jest rozdzielenie pozostałości wirusa pomocniczego od pożądanego wirusa typu gutless przy pomocy rozdziału w gradiencie CsCl. Łatwiej to osiągnąć, gdy długości genomu wirusa pomocniczego i wirusa typu gutless różnią się maksymalnie. Co za tym idzie, zalecany jest duży wirus pomocniczy niż mniejszy. Oczywistym dla specjalisty w dziedzinie będzie, że niniejszy wynalazek moż e w równym stopniu być zastosowany do zwiększenia stabilności rekombinowanego adenowirusa, który będzie stosowany z rekombinowanym wirusem pomocniczym o zwiększonej ekspresji pIX, co można osiągnąć sposobami opisanymi w niniejszym wynalazku. Należy rozumieć, że zakresem znaczenia określenia komórka pakująca objęta jest dowolna komórka zawierająca informację genetyczną, która może być użyta do komplementacji rekombinowanego adenowirusa, w celu wytworzenia cząsteczki rekombinowanego wirusa. Dla specjalisty w dziedzinie jasnym będzie, że zalety niniejszego wynalazku nie zależą od użytej komórki pakującej.
Informacja genetyczna kodująca pIX może występować albo na wektorze adenowirusowym, albo może być niezależna od wspomnianego wektora adenowirusowego, i taka poza-wirusowa informacja genetyczna może występować albo jako wbudowana do genomu, albo jako kopie pozachromosomowe, np. plazmidy, wektory, kosmidy i tym podobne. Wprowadzenie informacji genetycznej do komórki pakującej można przeprowadzić różnymi sposobami, takimi jak transfekcja lipofektaminą, precypitacja fosforanem wapnia, infekcja wirusem i tym podobne. Takie sposoby są ogólnie dobrze znane specjaliście w dziedzinie, a sposób zastosowany do wprowadzenia informacji genetycznej nie jest krytyczny dla zakresu wynalazku. W stosowanym tym znaczeniu funkcjonalny pIX w postaci ulegającej ekspresji oznacza informację genetyczną kodującą pIX w związku funkcjonalnym z promotorem lub inną sekwencją regulatorową zdolną do kierowania ekspresją wspomnianej informacji genetycznej kodującej pIX w komórce pakującej. Wprowadzanie informacji genetycznej do komórki pakującej można przeprowadzić albo przed, albo równocześnie, albo po wprowadzeniu rekombinowanego wektora adenowirusowego. Stwierdzono, że konstytutywna ekspresja pIX z episomu w pakującej linii komórkowej opartej na komórkach 293, komplementuje brak pIX w adenowirusie typu 5 (Caravokyri i eppard, 1995). Jednakże, dla takich zastosowań wymagane są specjalne plazmidy episomowe zawierające kasetkę ekspresyjną EBNA1 i propagacja wektorów adenowirusowych w takich liniach komórkowych ma tę wadę, że części episomów bardzo prawdopodobnie staną się częścią rekombinowanego wektora adenowirusowego. Dlatego w zalecanych postaciach realizacji informacja genetyczna kodująca funkcjonalny pIX występuje w wektorze adenowirusowym.
Przy próbach zmniejszenia rekombinacji prowadzącej do powstania adenowirusa zdolnego do replikacji niektórzy autorzy stosowali gen pIX pochodzący z Ad7 - wirusa z grupy B, którego ekspresja jest wywoływana przez zmutowany promotor pIX z Ad5, co miało na celu zmniejszenie zachodzących na siebie części kwasów nukleinowych (zawierających sekwencje pochodzące z Ad5) komórki pakującej i rekombinowanego wektora adenowirusowego (Robert i wsp., 2001). Jednakże, doświadczenia te nie miały na celu zwiększenia stabilności wektora wirusowego i stabilność ta nie była mierzona w tych doświadczeniach. W niniejszym zgłoszeniu regulujące transkrypcję sekwencje z pIX w wektorze adenowirusowym są zmienione w celu zwiększenia stabilności wirusa i/lub zwiększenia pojemności obcego materiału genetycznego w wirionach. Wynalazek pokazuje, że rekombinowany wektor adenowirusowy pochodzący z Ad35 zawiera gen pIX pod kontrolą pochodzącego z Ad5 proksymalnego promotora pIX i jest on bardziej stabilny / może przenieść więcej obcej informacji genetycznej niż odpowiadający mu wirus z endogennymi (np. pochodzącymi z Ad35) proksymalnymi sekwencjami poprzedzającymi pIX. Co za tym idzie, niniejszy wynalazek dostarcza również rekombinowanego adenowirusa zawierającego funkcjonalną sekwencję kodującą pIX i posiadającego przynajmniej delecję w regionie E1, przy czym sekwencja kodująca pIX znajduje się pod kontrolą promotora heterologicznego i przy czym wspomniany, rekombinowany adenowirus pochodzi z adenowirusa innego niż adenowirus serotypu 5. W określonych postaciach realizacji wspomniany promotor heterologiczny jest nieendogennym, proksymalnym promotorem pIX. W korzystnych postaciach realizacji informacja genetyczna kodująca pIX pochodzi z Ad35 lub Ad11. W takich postaciach realizacji zalecanym nieendogennym promotorem pIX jest promotor z Ad5.
W kolejnym aspekcie, wynalazek dostarcza rekombinowanego wektora adenowirusowego, który można otrzymać sposobami według wynalazku. Takie rekombinowane wektory adenowirusowe są użyteczne, np. przy wytwarzaniu szczepionek (WO 00/70071, WO 01/38362; WO 02/24730) jako nośniki dostarczające geny i tym podobne. Wybrany pożądany, główny serotyp takich rekombinowanych
PL 208 588 B1 wektorów adenowirusowych może być wykorzystany do uzyskania wektorów o zmienionym tropizmie tkankowym w porównaniu z najczęściej używanymi wektorami adenowirusowymi Ad5 i/lub może być wykorzystany ze względu na to, że jest mniej immunogenny niż wektory pochodzące z Ad5 (WO 00/70071).
Przy wytwarzaniu rekombinowanych wektorów adenowirusowych zalecane jest klonowanie transgenu do plazmidu (plazmid adaptorowy), zawierającego lewą część adenowirusa bez sekwencji E1 i posiadającego miejsca dla enzymów restrykcyjnych do klonowania. Rekombinowany wektor adenowirusowy jest następnie wytwarzany poprzez rekombinację homologiczną z kosmidem zawierającym prawą część adenowirusa posiadającą sekwencje nakładające się na 5' końcu z 3' końcem plazmidu adaptorowego (patrz Przykłady w niniejszym zgłoszeniu; sposób opisany w WO 99/38362). Tak więc, kolejnym aspektem niniejszego wynalazku jest dostarczenie rekombinowanej sekwencji kwasu nukleinowego zawierającej lewy ITR adenowirusa, sygnał pakowania, inne sekwencje adenowirusowe z delecją w regionie E1, przynajmniej część otwartej ramki odczytu E1B-55K i sekwencje kodujące pIX.
Wynalazek dostarcza ponadto komórkę pakującą rekombinowany adenowirus zawierającą rekombinowany adenowirus według wynalazku. W jednej postaci realizacji wspomniana komórka pakująca rekombinowany adenowirus zawiera kwas nukleinowy zdolny do komplementowania niedoboru E1B-55K wspomnianego rekombinowanego adenowirusa, przy czym wspomniany rekombinowany adenowirus zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą część sekwencji kodującej produkt genu E1B-55K zwiększającą ekspresję genu pIX, pod warunkiem, że ta rekombinowana cząsteczka kwasu nukleinowego nie koduje funkcjonalnego produktu genu E1B-55K i przy czym wspomniana komórka i wspomniany rekombinowany adenowirus nie zawierają nakładających się sekwencji powodujących tworzenie rekombinowanego adenowirusa zawierającego kwas nukleinowy kodujący funkcjonalne białko E1B 55K. Ta postać jest szczególnie użyteczna do zapobiegania tworzeniu rekombinowanych adenowirusów posiadających dodatkową funkcję adenowirusa.
Wynalazek jest zilustrowany przez pewne przykłady, które nie mają na celu ograniczenia zakresu wynalazku.
P r z y k ł a d y
W przykładach stosowano typowe metody biologii molekularnej (np. Sambrook i Russel, 2001), chyba że podano inaczej. Sekwencje starterów podano w Tabeli 4.
P r z y k ł a d 1. Oparte na PER.C6™ linie komórek komplementujących dla wirusów Ad35 z delecją E1.
Komórki PER.C6 wysiewano na 10 cm szalki hodowlane przy gęstości 3x106 komórek/szalkę w pożywce hodowlanej dla PER.C6 (DMEM (Gibco BRL) uzupełnione] FBS (Gibco BRL) do 10% i 10 mM MgCl2 (4,9 M roztwór wyjściowy, Sigma)). Dwa dni później 9 szalek transfekowano 1 μg DNA pIG35.55K zlinearyzowanym Scal (opisano poniżej) i 9 szalek transfekowano 1,5 μq DNA pIG35.55K zlinearyzowanym Scal. Oddzielne, szalki kontrolne transfekowano 1 lub 1,5 μg pAdApt35.LacZ zlinearyzowanego Scal (opisano w WO 00/70071) aby monitorować wydajność transfekcji przy 1 lub 1,5 μg pcDNA. nlsLacZ zlinearyzowanym. Scal. Konstrukt pcDNA.nlsLacZ (opisany w WO 99/55132) jest plazmidem opartym na pcDNA3 (Invitrogen) z genem nlsLacZ kontrolowanym przez promotor CMV. Konstrukt pcDNA.nlsLacZ zawiera również kasetkę ekspresyjną neor. Jako kontrolę negatywną transfekowano jedną dodatkową szalkę zlinearyzowanym pAdApt35.LacZ, konstruktem, który nie ma genu selekcyjnego neor. Wszystkie transfekcje przeprowadzono przy pomocy zestawu do transfekcji LipofectAmine (Invitrogen/Life Technologies) zgodnie z zaleceniami producenta stosując 5 ml odczynnika LipofectAmine^g DNA. Komórki inkubowano przez 4 godziny z mieszaniną do transfekcji, po czym pożywkę zastąpiono pożywką do hodowli PER.C6. Następnego dnia pożywkę zastąpiono pożywką do hodowli zawierającą 0,5 mg/ml G418 (Gibco BRL) z wyjątkiem dwóch szalek, które transfekowano 1 lub 1,5 μg pAdApt35.LacZ. Te ostatnie szalki stosowano do monitorowania ekspresji LacZ dwa dni po transfekcji. Po wybarwieniu X-gal oceniano wydajność transfekcji na około 40% przy czym nieznacznie więcej niebieskich komórek zaobserwowano na szalkach transfekowanych 1,5 jag DNA. Pożywkę selekcyjną odnawiano w przypadku pozostałych szalek dwa razy w tygodniu. W ciągu dwóch tygodni po pierwszym dodaniu pożywki selekcyjnej zginęła większość komórek na szalce z kontrolą negatywną (transfekcja 1,5 μg pAdApt35.LacZ). Na szalkach, gdzie wykonano transfekcje pcDNA.nlsLacZ klony komórek stały się widoczne. Ponieważ komórki transfekowane pIG35.55K wydawały się być bardziej oporne na G418, stężenie jego zwiększono do 0,75 mg/ml w trzy tygodnie po transfekcji. 3 i 7 dni później przeniesiono łącznie 196 klonów komórek z szalek, gdzie wykonano transfekcje przy pomocy pIG35.55K i wysiewano je do oddzielnych studzienek 96-studzienkowych płytek.
PL 208 588 B1
Komórki pozostałe po wysianiu kolonii na dwóch 10 cm szalkach otrzymanych w wyniku transfekcji 1 μg DNA pIG35.55K strawiono trypsyną, połączono i namnożono otrzymując pulę PER55K(1.0). To samo wykonano dla 2 szalek po transfekcji 1,5 μg. Pulę komórek PER55K(1.0) namnożono i wysiano do 4 kolb T25 przy gęstości 3,5x106 komórek/kolbe w celu testowania wytwarzania wirusa. Ponadto, trzy kolby T25 zaszczepiono przy tej samej gęstości wyjściowymi komórkami PER.C6. Plazmid pAdApt35.eGFP (plazmid adaptorowy oparty na pAdApt35IP1 (opisany w WO 00/70071), lecz również zawierający białko zielonej fluorescencji jako gen markerowy, który sklonowano w pAdApt35IP1 jako fragment HindIII-BamHI pochodzący z piPspAdeapt.eGFP (opisany w WO 02/24933)) trawiono PacI w celu uwolnienia sekwencji adenowirusowych z szkieletu plazmidowego. Plazmid pWE.Ad35.pIX-rITR (opisany w WO 00/70071) trawiono Notl w celu uwolnienia sekwencji adenowirusowych ze szkieletu kosmidowego. Dwie kolby komórek PER.C6 i 2 kolby komórek PER55K(1.0) transfekowano 2 μg trawionego pAdApt35.eGFP i 6 μg trawionego pWE.Ad35.pIX-rITR. Jedną kolbę każdej linii komórkowej transfekowano 8 μg pAdApt35.LacZ w celu monitorowania wydajności transfekcji. Pozostała kolba z komórkami PER55K(1.0) służyła jako kontrola negatywna i traktowano ją jak inne, lecz nie dodano do niej mieszaniny transfekcyjnej. Wszystkie transfekcje przeprowadzono przy pomocy LipofectAmine (Invitrogen/Life Techn.) zgodnie z zaleceniami producenta używając do każdej transfekcji 8 μg DNA i 40 μl odczynnika LipofectAmine. Mieszaninę transfekcyjną usunięto po 4 godzinach inkubacji i dodano świeżą pożywkę hodowlaną. Transfekcje wykonano w dzień po wysianiu komórek i dwa dni później komórki z kolb T25 przeniesiono do kolby T80, z wyjątkiem kontroli transfekcji LacZ. Wybarwiono je roztworem X-gal po łagodnym utrwaleniu. Po 5 godzinach inkubacji w roztworze barwiącym procent niebieskich komórek oszacowano na około 90% w obu kolbach, co pokazuje że transfekcja zaszła dobrze w przypadku obu linii komórkowych. Cztery dni po przeszczepieniu do kolb T80 transfekowane hodowle PER55K(1.0) wykazywały początkowy CPE (efekt cytopatyczny, wskazujący na replikację wirusa) wynoszący około 100 przypadków/kolbę. Nietransfekowane komórki PER55K(1.0) rosły do konfluencji bez objawów CPE. W transfekowanych hodowlach PER.C6 w konfluentnej, pojedynczej warstwie komórek widoczne były jedynie trzy przypadki CPE. Ponownie, 3 dni później w transfekowanych hodowlach PER55K(1.0) wystąpił pełny CPE, przy czym wszystkie komórki były zaokrąglone i odczepione od podłoża w postaci grudek. Przeciwnie, w hodowlach PER.C6 jedynie w kilku przypadkach CPE nie postępował i komórki nadal tworzyły pojedynczą warstwę. Potwierdziło to wcześniejsze obserwacje, że wytwarzanie wirusów opartych na Ad35 z delecją E1 w PER.C6 jest bardzo niewydajne. Również nietransfekowane hodowle PER55K(1.0) występowały, jak oczekiwano, w postaci konfluentnej, pojedynczej warstwy komórek bez CPE. Komórki i pożywkę w kolbach PER55K(1.0) z pełnym CPE zebrano i poddano dwóm cyklom mrożenia/rozmrażania, po czym szczątki komórek usunięto przez wirowanie przy 3000 obr/min przez 10 min w mikrowirówce. Jeden z otrzymanych, nieoczyszczonych lizatów zastosowano do zakażenia świeżej hodowli komórek PER55K(1.0) w kolbie T175 (1,5 ml/kolbę). Komórki i pożywkę zebrano przy pełnym CPE, 4 dni później. Pokazało to, że w wyjściowych transfekcjach powstał zakaźny wirus. Ekspresję GFP potwierdzono przez mikroskopię fluorescencyjną komórek A549 zakażonych nieoczyszczonym lizatem. Nieoczyszczony lizat zastosowano następnie do analizy komplementacji wirusa Ad35.AdApt.eGFP z delecją E1 w poszczególnych klonach, jak to opisano poniżej.
Wyżej opisane klony, które wysiewano z komórek PER.C6 transfekowanych pIG35.55K namnażano i zbadano funkcjonalnie pod kątem na ich zdolności do utrzymania replikacji Ad35.AdApt.eGFP. Klony te wysiewano przy dwóch gęstościach na 6-studzienkowe szalki i dzień później zakażono 15 ml wyżej opisanego nieoczyszczonego lizatu. Dzień później sprawdzono CPE. Ze 140 zbadanych w ten sposób klonów w przypadku 19 wystąpił pełny CPE w dniu 2 lub 3, a w przypadku 68 wystąpił pełny CPE w dniu 5 lub 6. W przypadku pozostałych klonów wystąpił jedynie częściowy CPE lub wystąpiło kilka niepostępujących przypadków. Te ostatnie były nie do odróżnienia od komórek PER.C6, których użyto jako kontroli negatywnej.
Opierając się na tych wynikach dokonano selekcji 24 klonów, które dalej badano pod kątem ich zdolności do wytwarzania rekombinowanych wirusów z delecją E1 po transfekcji plazmidem adaptorowym pAdApt35.GFP i dużym klonem kosmidowym pWE.Ad35.pIX-rITR. Klony te wysiewano do kolb T25 i transfekowano 2 μg adaptorowego i 6 μg szkieletowego plazmidu, stosując odczynnik LipofectAmine jak opisano powyżej. Dwa dni po transfekcji komórki przeniesiono do kolb T80 aby uniknąć nadmiernej konfluencji hodowli. W przypadku 5 z 24 klonów wystąpił pełny CPE w 3 dni po przeniesieniu do T80, a w przypadku kolejnych 13 klonów wystąpił postępujący do pełnego CPE 3 dni później. W przypadku pozostałych 6 klonów CPE nie wystąpił lub wystąpił jedynie początkowy CPE. Dla
PL 208 588 B1 porównania: w przypadku rutynowo wytwarzanych wektorów ad5 z delecją E1 na komórkach PER.C6 zazwyczaj pełny CPE występuje w 4 do 6 dni po przeniesieniu do kolb T80.
Pokazuje to, że nowe klony wydajnie komplementują wektory adenowirusowe z delecją E1. Jeden z opisanych powyżej klonów (klon #16) zastosowano do wytwarzania i produkcji wielu porcji wirusów Ad35 z delecją E1 i E1/3 zawierających różne transgeny. Tak więc, wirusa w nieoczyszczonych lizatach uzyskanych w wyniku transfekcji, jak opisano powyżej, lecz przy pomocy różnych plazmidów adaptorowych, oczyszczano w oznaczeniu łysinkowym na nowej linii komórkowej. Pojedyncze łysinki sprawdzano pod kątem aktywności transgenu i następnie namnażano na średnią skalę w 4-8 trójwarstwowych kolbach (3x175 cm/kolbę). Komórki zebrano przy pełnym CPE, wirusy uwolniono i oczyszczono sposobem rutynowym dla adenowirusów. Ilość cząstek wirusa określono przez HPLC (Shabram i wsp., 1997). W tabeli I przedstawiono wydajność otrzymywania po obróbce na ś rednią skalę produkcji wirusów Ad35 z delecją E1 i E1/3 w trójwarstwowych kolbach z komórkami PER55K klonu #16. Ilość oczyszczonych cząstek wirusa jest porównywalna z wydajnością wektorów opartych na Ad5 na komórkach PER.C6.
Wyciągnięto stąd wniosek, że wytworzono liczne linie komórkowe, które skutecznie komplementują wektory oparte na Ad35 z pełną delecją E1. Tak więc ekspresja Ad35 E1B-55K w linii komórkowej komplementującej Ad5 umożliwia replikację wektorów Ad35.
P r z y k ł a d 2. Wytwarzanie pWE.Ad.pIX-rITRΔE3.
Wczesny region 3 ludzkich adenowirusów zawiera wiele regionów kodujących dla białek interferujących z odpowiedzią immunologiczną gospodarza podczas infekcji adenowirusowej. W przypadku gdy wektory adenowirusowe stosowane są jako nośnik szczepionki, taka interferencja jest niepożądana. Dlatego skonstruowano kosmid o szkielecie Ad35 pozbawiony regionu E3.
W tym celu konstrukt pBr.Ad35.PRn (Fig. 11; opisany w Przykładzie 13 w publikacji EP 1054064) trawiono Stul i Mlul, i 17,3 kb fragment wektora oczyszczono z niskotopliwego żelu (LMP) przy pomocy enzymu agarazy (Roche) zgodnie z zaleceniami producenta. Następnie wytworzono fragment PCR na matrycy pBr.Ad35.PRn przy pomocy starterów 35E3for i 35E3rev. Do amplifikacji użyto polimerazę DNA Pwo (Roche) zgodnie z zaleceniami producenta i program ustawiono na: 94°C przez 2 min, 30 cykli (94°C przez 30 s, 58°C przez 30 s i 72°C przez 1 min) i końcową inkubację w 68°C przez 8 minut. Produkt PCR o długości 833 pz oczyszczono przy pomocy zestawu do oczyszczania produktów PCR Qiaquick (Qiagen) i trawiono Mlul i Stul. Strawiony DNA oczyszczono z żelu przy pomocy zestawu do ekstrakcji z żelu Qiaquick (Qiagen). Oba wyizolowane fragmenty połączono przy pomocy ligazy i wprowadzono przez transformację do kompetentnych komórek DH5a (Invitrogen/Life Technologies) co dało pBr.Ad35.PRnΔE3 (Fig. 12). Plazmid sprawdzono przez analizę restrykcyjną i sekwencjonowanie namnożonej przez PCR wstawki. Delecję E3 sklonowano następnie do szkieletu kosmidowego pWE.Ad35.pIX-rITR. W tym celu pWE.Ad35.pIX-rITR strawiono PacI i DNA oczyszczono przez wytrącenie izopropanolem i płukanie 70% EtOH. Po zawieszeniu w wodzie MiliQ DNA strawiono Swal, i 22,8 kb fragment zawierający wektor oczyszczono z żelu LMP przy pomocy enzymu agarazy jak powyżej. Konstrukt pBr. Ad35. PRnAE3 strawiono PacI i Swal w ten sam sposób, i fragment 16,6 kb wyizolowano również przy pomocy enzymu agarazy. Oba wyizolowane fragmenty połączono przy pomocy ligazy stosując 0,5-0,6 μg każdego fragmentu. Połączone przy pomocy ligazy fragmenty zapakowano następnie stosując ekstrakty do pakowania faga λ (Stratagene) zgodnie z zaleceniami producenta i zmieszano z komórkami STBL-2. Bakterie wysiewano na szalki LB-amp i otrzymane kolonie zbadano pod kątem obecności prawidłowego konstruktu. Dały one konstrukt pWE.Ad35.pIX-rITRΔE3 (Fig. 1). Delecją E3 ciągnie się od nukleotydu 27648 do 30320 sekwencji Ad35 (opisanej w WO 00/70071) i tym samym obejmuje region 2,6 kb.
Kotransfekcja trawionych Notl pWE.Ad35.pIX-rITRΔE3 i trawionego pIPsp-1 (New England Biolabs) pAdApt35.eGFP do komórek PER55 klonu #16 (opisany powyżej) spowodowała otrzymanie wirusów opartych na Ad35 wyrażających GFP. Po wyizolowaniu wirusowego DNA z tych wirusów, amplifikacja PCR regionu E3 pokazała, że wirusy te, jak oczekiwano, mają usunięte 2,6 kb sekwencji E3.
P r z y k ł a d 3. Ograniczenia pojemności upakowania wektorów opartych na Ad35 z delecją E1.
Wektory oparte na Ad35 z delecją E1 i E1/E3 zawierające różne wstawki wytworzono przez transfekcję komórek PER55K klonu #16 (patrz Przykład 1) z użyciem 1,5 μg plazmidu adaptorowego Ad35 niosącego specyficzny transgen trawionego enzymem PacI lub enzymem pIPsp-1 w celu uwolnienia wstawek adenowirusa z sekwencji plazmidowego wektora, i 4,5 μg albo pWE.Ad35.pIX-rITR strawionego Notl albo pWE.Ad35.pIX-rITRΔE3 strawionego enzymem Notl.
PL 208 588 B1
Prawa flanka plazmidu adaptorowego i lewy koniec plazmidu szkieletowego zawierają homologiczne sekwencje pośredniczące w rekombinacji prowadzącej do otrzymania genomu wirusa z całkowitą delecją E1 (jak opisano w WO 00/70071).
Transfekcje wykonano przy pomocy 30 μl odczynnika Lipofectamine (Invitrogen/Life Technologies) dla każdego zestawu konstruktów, zgodnie z instrukcjami producenta. Mieszaninę transfekcyjną dodano do komórek PER55K klonu 16 przy 70% konfluencji w kolbach T25. Przeprowadzono transfekcję poniższych kombinacji:
1. pAdApt35IP1 + pWE.Ad35.pIX-rITR
2. pAdApt35IP1 + pWE.Ad35.pIX-rITRΔE3
3. pAdApt35eGFP + pWE.Ad35.pIX-rITR
4. pAdApt35eGFP + pWE.Ad35.pIX-rITRΔE3
5. pAdApt35Luc + pWE.Ad35.pIX-rITR
6. pAdApt35Luc + pWE.Ad35.pIX-rITRΔE3
7. pAdApt35LacZ + pWE.Ad35.pIX-rITR
8. pAdApt35LacZ + pWE.Ad35.pIX-rITRΔE3
Plazmidy adaptorowe strawiono enzymem pIPsp-1 aby uwolnić sekwencję adenowirusa ze szkieletu wektora plazmidowego. Z tych samych powodów pWE.Ad35.pIX-rITR i pWE.Ad35.pIXrITRΔE3 strawiono Notl przed transfekcją. Wytwarzanie plazmidów adaptorowych i szkieletu kosmidowego pWE.Ad35.pIX-rITR opisano wcześniej w WO 00/70071. Wytwarzanie pWE.Ad35.pIXrITRΔE3 opisano powyżej.
Dwa dni po transfekcji komórki przeniesiono do T80 i inkubowano dalej aż do uzyskania pełnego CPE. Komórki i pożywkę zebrano 1-2 dni po zaobserwowaniu pełnego CPE. Mieszaniny poddano jednemu cyklowi mrożenia/rozmrażania i wirowano przy 1500 obr/min przez 15 min aby osadzić szczątki komórek. Następnie zebrano nadsącza. Otrzymane w ten sposób nieoczyszczone lizaty użyto do izolowania wirusowego DNA. W tym celu 275 μl nieoczyszczonego lizatu inkubowano z 10 μl DNAzy I o stężeniu 10 mg/ml w 37°C przez 30 minut. Następnie dodano 6,0 μl 0,5 M EDTA (pH 8,0), 7,5 μl 20% SDS i 1,5 μl proteinazy K o stężeniu 20 mg/ml i zmieszano przez wytrząsanie. Następnie mieszaninę inkubowano w 50°C przez 1 godz. Ostatecznie wirusowy DNA wyizolowano przy pomocy zestawu GeneClean Spin (Bio 101, Inc.). Po elucji wirusowego DNA w 20 μl H2O miliQ region transgenu zbadano przez amplifikację PCR. W tym celu użyto starterów AdApt35CMVF i 35pIXR. Amplifikację wykonano na 2 μl wyizolowanego, wirusowego DNA stosując polimerazę DNA Taq (Invitrogen). Mieszanina reakcyjna zawierała 5 μl 10x bufor (Invitrogen), 2 μl 50 mM MgCl2, 5 μl 2 mM dNTP, 3 μl każdego startera (10 μM roztwór wyjściowy) i 2,5 jednostki enzymu Taq w łącznej objętości 50 pi. Program ustawiono na 94°C przez 2 minuty, a następnie 30 cykli (94°C przez 30 s, 60°C przez 30 s i 72°C przez 4 minuty). Reakcje kontrolne wykonano na 5 ng plazmidów adaptorowych. Po przeprowadzeniu PCR, 5 μl mieszaniny reakcyjnej naniesiono na żel do analizy. Fig. 2 przedstawia wyniki wyżej wspomnianej transfekcji. Startery amplifikowały sekwencje od 5' końca promotora CMV do 5' końca regionu kodującego pIX. Jak można zobaczyć z Fig. 2 wirusy bez transgenu lub ze wstawką GFP ujawniają oczekiwane pasmo (porównaj z plazmidami kontrolnymi; ścieżki PL dla każdego wirusa). Mniejsze fragmenty są widoczne z większymi wstawkami, lucyferaza i LacZ, i delecję te stają się bardziej znaczące wraz ze wzrostem całkowitej długości wirusa (porównanie wirusów LacZ lub Luc, z i bez E3). Tak więc, zwiększenie długości genomu koresponduje z wystąpieniem delecji w regionie transgenu. Fakt, że całkowita długość genomu (również podana na Fig. 2) dla Ad35.AdApt.eGFP i Ad35AdApt.LacZΔE3, wynosząca odpowiednio 33,7 i 33,4 kb, jest porównywalna, podczas gdy delecje występują jedynie w próbce wirusa LacZ, wskazuje że albo sekwencja albo wielkość wstawki w wyjściowym regionie E1 może również wpływać na występowanie delecji.
P r z y k ł a d 4. Porównanie sekwencji regionu genu pIX z adenowirusa serotypu 5 i 35.
Stwierdzenie, że wraz ze wzrostem długości genomu rekombinowanych wirusów Ad35 delecje występują w regionie transgenu może sugerować, przez analogię z wirusami Ad5 bez pIX (GhoshChoudhury i wsp., 1987), że istnieje problem ze stabilnością kapsydów. Fakt, że można wytworzyć wirusy Ad35.E1B+.AdApt.Luc (w których sekwencje E1A zastąpiono kasetką AdApt.Luc) o całkowitej długości 36,7 kb wskazuje, że rolę odgrywa delecja E1B. Może być wynikiem albo funkcji jednego z białek E1B albo funkcji nieznanych sekwencji regulatorowych w tym regionie, wpływających na ekspresję innych białek adenowirusowych. Zgodnie z wiedzą twórców niniejszego wynalazku nie opisano dotąd, by białka E1B jako takie wpływały na pojemność pakowania adenowirusów. Jednakże, opisano że białko E1B-21K niespecyficznie stabilizuje transfekowany DNA (Herrman i Mathews, 1989), i że
PL 208 588 B1 mutacje w białku 21K prowadzą do degradacji komórkowego i wirusowego DNA podczas infekcji (Pilder i wsp., 1984; White i wsp., 1984). Ze względu na to, że białko E1B-21K z Ad5 ulega ekspresji w komórkach PER.C6, to wyjaśnienia te nie wynikają z obserwacji uzyskanych przez twórców niniejszego wynalazku. Gen pIX jest umiejscowiony bezpośrednio na 3' końcu regionu kodującego E1B55K. W przypadku Ad5 wiadomo, że promotor pIX i sekwencje kodujące są umiejscowione w regionie transkrypcji E1B, oraz że pIX i E1B mają wspólny sygnał poliadenylacji. W przypadku Ad5 badano minimalną sekwencję promotora niezbędną dla ekspresji pIX (Babiss i Vales, 1991). Pokazano, że fragment promotora zawierający położone powyżej miejsce Sp1 i sekwencje bloku TATA, są wystarczające dla ekspresji pIX. Wykazano, że rozdzielenie miejsca Sp1 i bloku TATA jak również samej sekwencji bloku TATA wpływa na poziom ekspresji pIX. Nie wiadomo czy odpowiadający region w Ad35 jest również wystarczający do kierowania ekspresją pIX do poziomu dostatecznie wysokiego dla stabilnych wirusów. Porównanie sekwencji ujawniło, że zarówno miejsce Sp1, jak i sekwencja TATA są inne niż te, które występują w promotorze pIX z Ad5. Przy pomocy informacji o sekwencji dostępnej z Genbank wykonano porównanie proksymalnych sekwencji poprzedzających pIX (tj. pomiędzy kodonem stop E1B-55K i kodonem start genu pIX) serotypów z różnych grup. Do porównania użyto następujących adenowirusów oznaczonych SEQ.ID.NO. i sekwencjami referencyjnymi z Genbank: Ad2 (SEQ.ID.NO.45; Genbank NC_001405), Ad5 (SEQ.ID.NO.46; Genbank M73260), Ad12 (SEQ.ID.NO.47; Genbank NC_001460), Ad9 (SEQ.ID.NO.48; Genbank AF099665), Ad40 (SEQ.ID.NO.49; Genbank L19443), Ad4 (SEQ.ID.NO.50; Genbank NC_003266), małpi wirus 25 (SEQ.ID.NO.51; Genbank AF394196), Ad7 (SEQ.ID.NO.54; Genbank AD7001). Sekwencję Ad35 (SEQ.ID.NO.52) opublikowano w WO 00/70071. Sekwencję Ad11 (SEQ.ID.NO.53) nie publikowano wcześniej i dostarczono ją tutaj. Fig. 3A przedstawia przyrównanie wyżej wspomnianych sekwencji pomiędzy kodonem stop białka E1B-55K (pierwsze trzy nukleotydy we wszystkich sekwencjach) i kodonem start białka pIX (ostatnie trzy nukleotydy). Miejsce Sp1 i sekwencja TATA w Ad2 i Ad5 są ujęte w ramkę. W większości przypadków homologia jest niedostateczna aby wyznaczyć Sp1 i bloki TATA w innych sekwencjach. Dlatego użyto sekwencji najwyższych zgodności bloków GC i TATA jakie opublikował Bucher, P. (1990) dla identyfikacji przypuszczalnych sekwencji Sp1 i bloku TATA w rożnych sekwencjach. Na Fig. 3B pokazano przypuszczalne sekwencje Sp1 i bloku TATA oraz odległości między nimi. Ad12, Ad9 i Ad40 należą odpowiednio do podgrup A, D i F i mają sekwencje Sp1 i TATA znacząco odpowiadające sekwencji najwyższej zgodności. Jednakże, odległość pomiędzy dwoma blokami jest mniejsza niż w przypadku Ad5 i Ad2. Nie jest to czymś niezwykłym, ponieważ promotor z E1B z Ad5 również zawiera blok Sp1 i sekwencje TATA rozdzielone 11 nukleotydami. Jednakże, delecją 9 nukleotydów (z 20) w sekwencji promotora pIX z Ad5 pomiędzy blokami Sp1 i TATA ogranicza poziom pIX (Babiss i Vales, 1991). Serotypy Ad35, Ad11 i Ad7 z podgrupy B, jak również wirusa Ad4 z podgrupy E mają zróżnicowane sekwencje bloku TATA i różne odległości pomiędzy przypuszczalną sekwencją Sp1 i blokiem TATA. Proksymalny region pIX w ludzkim adenowirusie typu 4 jest identyczny z analogicznym regionem w małpim adenowirusie 25 (CV68), serotypie który obecnie został zaproponowany jako wektor terapeutyczny (Farin i wsp., 2001). Tak więc, również w przypadku wektorów z zaburzoną replikacją opartych na nie-ludzkich adenowirusach ekspresja pIX może być niedostateczna dla uzyskania stabilnych kapsydów.
Równie dobrze ekspresja pIX może być regulowana odmiennie w wirusach Ad35 i innych ludzkich nie-ludzkich adenowirusach, a ich sekwencje regulatorowe lub nawet same sekwencje promotora mogą być zlokalizowane bezpośrednio powyżej sekwencji E1B lub nawet dalej. Ewentualnie możliwe jest również, że ze względu na to, że ekspresja pIX jest aktywowana przez białka E1A, to wysokie poziomy ekspresji pIX uzyskuje się w obecności białek E1A należących do tego samego serotypu lub podgrupy.
Twórcy niniejszego wynalazku sprawdzili czy zmiana endogennych proksymalnych sekwencji poprzedzających pIX na promotor heterologiczny w celu zwiększenia ekspresji pIX w wektorze prowadzi do uzyskania stabilniejszych wirusów i lepszej pojemności upakowania. Alternatywnie, funkcję pIX można dostarczyć w trans przez linie komórek pakujących. Jako nieograniczający przykład opisano rekombinowane wirusy oparte na Ad35 posiadające nie-endogenny, proksymalny promotor pIX, jaki występuje w wirusach Ad5, i pokazano, że wirusy te mają lepszą stabilność niż niezmienione wektory rekombinowane.
PL 208 588 B1
P r z y k ł a d 5. Wytwarzanie plazmidów adaptorowych z promotorem pIX z Ad5.
pAdApt535 jest plazmidem adaptorowym Ad35 posiadającym część sekwencji promotora pIX z Ad5, lecz poza tym jest identyczny z plazmidem adaptorowym Ad35, pAdApt35IP1 (patrz WO 00/70071). Jego konstrukcję opisano poniżej:
Pierwszy fragment PCR wytworzono przy pomocy starterów SV40for i pIX5Rmfe. Reakcję przeprowadzono przy pomocy polimerazy DNA Pwo (Roche) zgodnie z zaleceniami producenta, lecz z 3% DMSO w mieszaninie końcowej. pAdApt, plazmid adaptorowy dla wirusów Ad5 z delecją E1 (100 ng; patrz WO 00/70071) użyto jako matrycę. Program ustawiono jak następuje: 2 min w 94°C i następnie 30 cykli (94°C przez 30 s (deneturacja), 52°C przez 30 s (przyłączanie starterów) i 72°C przez 30 s (wydłużanie)), a następnie 8 min w 72°C. Otrzymane fragmenty PCR zawierają na 3' końcu sygnał poliadenylacji SV40 z pAdApt i region promotora pIX z Ad5 jaki jest przedstawiony w Genbank pod nr dostępu M73260 od nukleotydu 3511 do nukleotydu 3586 i na 3' końcu miejsce Mfel.
Drugi fragment PCR wytworzono jak opisano powyżej, lecz przy pomocy starterów pIX35Fmfe i 35R4. Jako matrycę użyto 100 ng pAdApt35IP1, przyłączanie starterów prowadzono w 58°C przez 30 sekund i elongację programu PCR ustawiono na 72°C przez 90 sekund. Taka reakcja PCR amplifikuje sekwencje Ad35 od nukleotydu 3467 do nukleotydu 4669 (numeracja sekwencji jak w WO 00/70071) i dodaje miejsce Mfel na 5' końcu.
Oba fragmenty PCR strawiono następnie Mfel i oczyszczono przy pomocy zestawu do oczyszczania produktów PCR Qiagen (Qiagen) zgodnie z zaleceniami producenta. Stężenie oczyszczonych fragmentów oznaczono przez rozdział próbki w żelu agarozowym i w przybliżeniu równomolowe ilości dwóch fragmentów zmieszano w mieszaninie ligacyjnej zawierającej 5 μg DNA, 4 μΐ 10x bufor dla ligazy i 2 μl ligazy (New England Biolabs) w objętości 40 pi. Po inkubacji > 2 godz. w RT, mieszaninę naniesiono na 1,2% żel agarozowy z TAE i wyizolowano fragmenty DNA o długości 1,4 kb przy pomocy zestawu Genclean (Bio 101, Inc.) zgodnie z zaleceniami producenta.
DNA wypłukano w 30 pl jałowej H2O i 1 pl użyto w reakcji PCR ze starterami SV40for i 35R4 jak opisano powyżej. PCR wykonano jak opisano powyżej stosując temperaturę przyłączania starterów 52°C i czas wydłużania 90 sekund. Otrzymany produkt wyizolowano z żelu przy pomocy zestawu do ekstrakcji z żelu Qiagen i strawiono Agel i Bglll. Otrzymane pasmo 0,86 kb wyizolowano z żelu stosując zestaw, Geneclean II zgodnie z zaleceniami producenta.
pAdApt35.Luc (opisany w WO 00/70071) strawiono również Bglll i Agel i fragment wektora 5,8 kb wyizolowano z żelu, jak powyżej przy pomocy zestawu Geneclean II. Fragment ten połączono przy pomocy ligazy z opisanym powyżej wyizolowanym fragmentem Bglll-Agel zawierającym chimerowy promotor pIX Ad5-Ad35, co dało pAdApt535.Luc (Fig. 4).
Inne plazmidy adaptorowe zawierające promotor pIX z Ad5 sporządzono jak następuje: pAdApt335.Luc strawiono Bglll i Apal i następnie wstawkę 1,2 kb oczyszczono z żelu przy pomocy zestawu Geneclean II zgodnie z zaleceniami producenta. pAdApt35IP1 strawiono również Bglll i Apal, i wyizolowano jak wyżej fragment wektora 3,6 kb. Ligacja obu wyizolowanych fragmentów dała pAdApt535 (Fig. 5). Następnie, pAdApt535 użyto do sklonowania innych genów markerowych, takich jak eGFP (pochodzący z pAdApt35.eGFP) i LacZ (pochodzący z pAdApt35.LacZ) w miejsce wielokrotnego klonowania stosując standardowe techniki klonowania i otrzymując pAdApt535.eGFP i pAdApt535.LacZ.
P r z y k ł a d 6. Wytwarzanie wektorów opartych na Ad35 z delecją E1 z użyciem plazmidów adaptorowych zawierających promotor pIX z Ad5.
Rekombinowane wirusy wytwarzano przez transfekcje plazmidami adaptorowymi i kosmidowym wektorem szkieletowym Ad35 komórek PER55K klonu 16 jak to opisano powyżej. W tym celu użyto następujących zestawów plazmidów:
T1. pAdApt535eGFP + pWE.Ad35.pIX-rITR
T2. pAdApt535eGFP + pWE.Ad35.pIX-rITRΔE3
T3. pAdApt35Luc + pWE.Ad35.pIX-rITR
T4. pAdApt535Luc + pWE.Ad35.pIX-rITR
T5. pAdApt535Luc + pWE.Ad35.pIX-rITRΔE3
T6. pAdApt535LacZ + pWE.Ad35.pIX-rITR
T7. pAdApt535LacZ + pWE.Ad35.pIX-rITRΔE3
T8. pAdApt35LacZ + pWE.Ad35.pIX-rITR
T9. pAdApt35LacZ + pWE.Ad35.pIX-rITRΔE3
Plazmidy adaptorowe trawiono PacI z wyjątkiem pAdApt535.Luc i pAdApt35.Luc, które trawiono enzymem pIPsp-1 i pWE.Ad35.pIX-rITR i pWE.Ad35.pIX-rITRΔE3, które przed transfekcją strawiono
PL 208 588 B1
Notl. Zmieszano 2 μg każdego plazmidu adaptorowego i 6 μg szkieletowego DNA z 40 μl Lipofectamine (Invitrogen/Life Technologies) zgodnie z zaleceniami producenta i inkubowano z komórkami PER55K klonu 16 w kolbach T25 przy 70% konfluencji. Pożywkę transfekcyjną usunięto po 4 godzinach i komórki nadal inkubowano w 37°C/10%CO2. Dwa dni po transfekcji komórki przeniesiono do kolby T80 i oceniano z uwagi na występowanie efektu cytopatycznego (CPE) w kolejnych dniach. Pięć dni później we wszystkich hodowlach wystąpiły postępujące lub całkowite CPE z wyjątkiem T6 (brak CPE) i T8 (przypadki CPE). Po kolejnych 2 dniach w T6 i T8 wystąpił początkowy CPE, a we wszystkich innych wystąpił pełny CPE. Wszystkie hodowle zebrano przez zebranie pożywki i komórek. Mieszaniny przechowywano w -20°C. Po rozmrożeniu próbek mieszaniny odwirowano przy 1500 obr/min przez 15 min. W celu osadzenia szczątków komórek i zebrano nadsącz. Niektóre z próbek (4 wirusy wyrażające LacZ, T6-T9) w ilości 2 ml użyto do ponownego zakażenia komórek PER55K klonu 16 przy konfluencji 80% w kolbie T80 w celu dalszego zwielokrotnienia miana wirusa. Komórki i pożywkę zebrano przy postępującym (T6+T8) lub pełnym CPE (T7+T9) i nieoczyszczone lizaty przygotowano jak opisano powyżej.
Otrzymane w ten sposób nieoczyszczone lizaty użyto do izolowania wirusowego DNA. W tym celu 275 μl nieoczyszczonego lizatu inkubowano z 10 μl DNAzy I o stężeniu 10 mg/ml w 37°C przez 30 minut. Następnie dodano 6,0 μl 0,5 M EDTA (pH 8,0), 7,5 μl 20% SDS i 1,5 μl proteinazy K o stężeniu 20 mg/ml i zmieszano przez wytrząsanie. Następnie mieszaninę inkubowano w 50°C przez 1 godz. Ostatecznie wirusowy DNA wyizolowano przy pomocy zestawu GeneClean Spin (Bio 101, Inc.). Wirusowy DNA eluowano w 50 μl H2O miliQ, 5 μl próbki użyto do analizy regionu transgenu. Trzeba odnotować, że kosmidy ze szkieletem pWE.Ad35.pIX-rITR +/- E3 były niezmienione i nadal zawierały promotor pIX z Ad35. Ponieważ promotor ten jest umiejscowiony na samym 5' końcu kosmidu szansę na rekombinację dającą promotor Ad35wt uznano niewielką. Jednakże, nie można było wykluczyć w tym wypadku, że zostaną wytworzone wirusy, które nadal będą posiadały promotor pIX z Ad35. Dlatego, przeprowadzono dwie specyficzne amplifikacje PCR na każdym preparacie wirusa: pierwszą wykonano przy pomocy zestawu starterów 1 (specyficzny dla Ad35): AdApt35CMVF i AdApt35pIXrev. Ten PCR specyficznie amplifikuje region transgenu w wirusach zawierających promotor pIX z Ad35. Reakcję PCR przeprowadzono na 5 μl wyizolowanych próbek wirusowego DNA przy pomocy polimerazy Taq (Invitrogen) zgodnie z zaleceniami producenta, lecz stosując w reakcjach 4 mM MgCl2 i 4 jednostki enzymu Taq. Program PCR był ustawiony na 94°C przez 2 minuty, a następnie 30 cykli (94°C przez 30 s, 60°C przez 30 s i 72°C przez 5 min) i zakończony końcowym etapem 8 min w 68°C.
Drugą przeprowadzono przy pomocy starterów AdApt35CMVF i pIX5Rmfe i tak specyficznie zamplifikowano region transgenu w wirusach zawierających promotor pIX z Ad5 (zestaw starterów 2). Amplifikację PCR wykonano na matrycy 5 μl wyizolowanego wirusowego DNA przy pomocy polimerazy DNA Pwo (2,5 jednostki^ Genaxis) w objętości 50 μl zawierającej 0,3 μl każdego startera (100 μM roztwór wyjściowy), 5 μl mieszaniny 2 mM dNTP, 5 μl pełnego buforu 10x (zawierającego Mg2+), 1,5 μl DMSO i 0,8 μl enzymu Pwo. Program PCR ustawiono na 94°C przez 2 minuty, a następnie 30 cykli (94°C przez 30 s, 60°C przez 30 s i 72°C przez 5 min.) i na koniec etapem 8 min w 68°C. Podczas PCR profile grzania i chłodzenia były ustawione na 2°C/s Następnie do próbek dodano 5 μl buforu do nanoszenia i na żel naniesiono 8 μl mieszaniny do analizy.
Wirusy Ad35 z delecją E1 i E1/E3 zawierające sekwencje promotora pIX z Ad5 i transgen eGFP (transfekcja T1 i T2) dawały w wyniku amplifikacji pasma o oczekiwanej migracji i nie dawały krótszych fragmentów. Fig. 6a przedstawia wyniki amplifikacji PCR wirusów z delecją E1 niosących lucyferazę (transfekcje T3 i T4). Ścieżki 5-8 są kontrolnym PCR na matrycy plazmidów AdApt535Luc (ścieżki 5 i 6) i AdApt35Luc (ścieżki 7 i 8) przy pomocy obu zestawów starterów. Ścieżki 1-4 reprezentują PCR na matrycy DNA izolatów wirusowych. Zestaw starterów 1 (specyficzny dla regionu pIX z Ad35) amplifikował pasmo o oczekiwanej długości i dawał dodatkowe krótsze fragmenty na matrycy wirusów ad35.AdApt35.Luc (ścieżka 4; porównaj również Fig. 2 Lucyferaza + E3). Przeciwnie, zestaw starterów 2 (specyficzny dla promotora pIX z Ad5) pokazuje jedynie pasmo o oczekiwanej długości bez fragmentów z delecją gdy wirusy są otrzymywane z plazmidu AdApt535.Luc (ścieżka 1). Z tego wywnioskowano, że insercja sekwencji promotora pIX z Ad5 zwiększa stabilność i pojemność upakowania wirusów Ad35 z delecją E1. Fig. 6b potwierdza te wyniki dla wirusów Ad35 z delecją E1/E3 niosących jako transgen LacZ. Ścieżki 1-4 są kontrolnymi PCR na matrycy plazmidów AdApt535.LacZ i AdApt35.LacZ dla każdego zestawu startera. W tle widoczne są pewne pasma, szczególnie w przypadku zestawu starterów 1 (ścieżki 2 i 4), lecz silne specyficzne pasmo jest również widoczne na oczekiwanej wysokości dla każdego zestawu starterów i homologicznych próbek (ścieżka 1 i 4). Wiru20
PL 208 588 B1 sowy DNA wyizolowano po transfekcji i jednej rundzie amplifikacji jak opisano powyżej. Co uderzające, zestaw starterów 2 wytwarza oczekiwany fragment na matrycy wirusów Ad35.AdApt535.LacZ bez fragmentów z delecją (ścieżki 5 i 9), podczas gdy próbka z wirusami zawierającymi sekwencję promotora pIX z Ad35 ujawnia wyraźnie oprócz fragmentów o pożądanej długości fragmenty z delecjami (widoczne po amplifikacji (ścieżka 11)).
Wyniki te pokazują, że podstawienie sekwencji promotora Ad35-pIX sekwencjami promotora Ad5-pIX zwiększa stabilność regionu transgenu w wirusach o większych genomach. Silniejsze promotory lub dodatkowe elementy promotora mogą jeszcze zwiększyć ten efekt.
P r z y k ł a d 7. Wytwarzanie pWE.Ad35-3481.
Jak wykazano powyżej wstawka adenowirusa w kosmidzie pWE.Ad35.pIX-rITR zawiera na swym 5' końcu promotor pIX z Ad35. Może to prowadzić do ponownego wstawienia promotora pIX z Ad35 do wirusów wytworzonych w oparciu o plazmidy adaptorowe bazujące na pAdApt535. Dlatego wytworzono nową wersję kosmidu o szkielecie Ad35 pozbawionym sekwencji promotora pIX. W tym celu wytworzono fragment PCR przy pomocy starterów pIXcosF-2 i Adapt35-3. Amplifikację przeprowadzono przy pomocy polimerazy DNA Pwo (2,5 jednostek/μΐ; Genaxis) w objętości 50 μΐ zawierającej 3 μl każdego startera (10 μM roztwór wyjściowy), 5 μl mieszaniny 2 mM dNTP, 5 μl pełnego buforu 10x (zawierającego Mg2+), 1,5 μΐ DMSO, 0,5 μΐ enzymu Pwo i 10 ng matrycy pAdApt35IP1. Program PCR ustawiono na 94°C przez 2 minuty, a następnie 5 cykli (94°C przez 30 s, 58°C przez 30 s i 72°C przez 1,5 min) i następnie 25 cykli (94°C przez 30 s, 60°C przez 30 s i 72°C przez 1,5 min) i końcowy etap 8 min w 68°C. Otrzymany produkt PCR o wielkości 1,2 kb zawierał sekwencje Ad35 od nukleotydu 3481 do nukleotydu 4663 (numeracja według sekwencji Ad35 jaką opublikowano w WO 00/70071) z miejscami dla Aatll i Notl przyłączonymi do 5' końca. Produkt PCR oczyszczono przy pomocy zestawu do oczyszczania produktów PCR (Qiagen) zgodnie z zaleceniami producenta i sklonowano w wektorze pPCR-Script Amp (Stratagene) zgodnie z zaleceniami producenta. Następnie zweryfikowano sekwencję sklonowanego fragmentu przez sekwencjonowanie i następnie usunięto ją z konstruktu przez trawienie Aatll i Agel. Otrzymany fragment o wielkości 780 par zasad oczyszczono z żelu przy pomocy zestawu Geneclean (Bio 101, Inc.) zgodnie z zaleceniami producenta.
Konstrukt pWE.Ad35ΔNdeI (opisany poniżej) również strawiono Aatll i Agel i otrzymany fragment wektora 12 kb wyizolowano z żelu przy pomocy zestawu Geneclean Spin (Bio 101, Inc.) zgodnie z zaleceniami producenta. Ligacja obu wyizolowanych fragmentów daje konstrukt pWE.Ad353481ΔΝ0θΙ.
Konstrukcję konstruktu pWE.Ad35ΔNdeI opisano w WO 00/70071 i zawiera on sekwencje Ad35 od nukleotydu 3401 do miejsca Ndel przy nukleotydzie 6541 i sekwencje Ad35 od miejsca Ndel przy nukleotydzie 33167 do końca prawego ITR, przez co oba fragmenty Ad35 są połączone miejscem Ndel (patrz również Fig. 13 z WO 00/70071).
pWE. Ad35-348^Ndel zlinearyzowano następnie Ndel, zdefosforylowano enzymem CIP (New England Biolabs) i oczyszczono z żelu stosując zestaw Geneclean Spin (Bio 101, Inc.) zgodnie z zaleceniami producenta. Ten fragment wektora połączono następnie z fragmentem Ndel o wielkości 26,6 kb z DNA Ad35 typu dzikiego, po czym mieszaninę zastosowano do pakowania kosmidu przy pomocy zestawów pakujących faga λ (Stratagene) zgodnie z instrukcjami producentów. Otrzymaną mieszaninę użyto do transformacji bakterii STBL-2 (Invitrogen) skutkującej otrzymaniem pWE.Ad35-3481.
P r z y k ł a d 8. Konstrukcja pIG35.55K.
Konstrukt pIG.55K zawiera sekwencje kodujące genu E1B-55K z Ad35 połączone funkcjonalnie z promotorem ludzkiej kinazy fosfoglicerynowej (hPGK) i sekwencją poliadenylacji HBV. Ponadto, zawiera on gen oporności na neomycynę połączony funkcjonalnie z promotorem RBV i HBV pA. Konstrukt pIG35.55K jest opisany poniżej.
Konstrukt pIG270 (opisany w WO 00/70071) strawiono EcoRI, poddano działaniu enzymu Klenowa i oczyszczono przy pomocy zestawu do oczyszczania produktów PCR (Qiagen) zgodnie z zaleceniami producenta. Odzyskany DNA strawiono następnie Agel i wyizolowano fragment wektora ~5 kb z żelu przy pomocy zestawu Geneclean (Boi101, Inc.) zgodnie z zaleceniami producenta. Następnie sekwencje E1B-55K z Ad35 zamplifikowano przez PCR na matrycy DNA pIG270 stosując startery 35D21 i 35B3. Amplifikację DNA przeprowadzono stosując polimerazę DNA Pwo (Roche) i 2 ng matrycy DNA zgodnie z instrukcjami producenta, lecz z DMSO o końcowym stężeniu 3% w mieszaninie PCR. Program ustalono na: 94°C 2 minuty, następnie 25 cykli (94°C przez 30 s, 56°C przez 30 s, i 72°C przez 30 s), kończąc końcową inkubacją w 72°C przez 10 minut. Otrzymany fragment PCR oczyszczono przy pomocy zestawu do oczyszczania produktu PCR (Qiagen) i strawiono Ncol.
PL 208 588 B1
Następnie lepkie końce wypełniono działając Klenowem, DNA następnie strawiono Agel i ponownie oczyszczono z zastosowaniem kolumny. Tak przygotowany fragment PCR sklonowano do przygotowanego fragmentu wektora strawionego EcoRI/Agel, aby otrzymać pIG270.ΔE1AΔ21K. pIG270.ΔE1AΔ21K trawiono AvrII i Xbal, a lepkie końce wypełniono przy pomocy enzymu Klenowa. Fragment o wielkości 2,9 kb zawierający promotor PGK i sekwencje E1B-55K z Ad35 wyizolowano z żelu jak opisano powyżej. Następnie, pRSVneo4 (konstrukt opisany poniżej) trawiono Bglll, końce wytępiono przy pomocy enzymu Klenowa, zdefosforylowano i wyizolowano z żelu. Fragment AvrII/XbaI o tępych końcach z pIG270.ΔE1AΔ21K włączono następnie przy pomocy ligazy do przygotowanego jak wyżej fragmentu wektora pRSVneo4 otrzymując pIG35.55K.
pRSVneo otrzymano jak następuje: konstrukt pRSVhbvNeo (opisany w WO 00/70071) trawiono Scal i BamHI, a lepkie końce wypełniono przy pomocy enzymu Klenowa. Fragment 1070 pz zawierający część genu oporności na ampicylinę i promotor RSV wyizolowano z żelu przy pomocy zestawu Geneclean (Bio 101, Inc.). Następnie pRSVhbvNeo strawiono Scal i EcoRI, końce stępiono Klenowem i fragment 3,2 kb zawierający gen neo, HBVpA, wektor i część genu oporności na ampicylinę wyizolowano jak wyżej. Te dwa fragmenty połączono przy pomocy ligazy, otrzymując pRSVneo4.
P r z y k ł a d 9. Zwiększona ekspresja pIX przy udziale promotora RSV zwiększa stabilność wirusów Ad35.
Jako przykład promotora heterologicznego kierującego ekspresją genu pIX do plazmidów adaptorowych Ad35 zawierających LacZ lub gen reporterowy lucyferazy wbudowano promotor RSV. Promotor RSV odpowiada fragmentowi NruI/ApaLI, który można otrzymać z pRc-RSV (Invitrogen). Lepkie końce wypełniono przy pomocy enzymu Klenowa (New England Biolabs) zgodnie z zaleceniami producenta. Fragment 388 pz zawierający promotor RSV wyizolowano z żelu agarozowego przy pomocy zestawu do ekstrakcji z żelu Qiaquick (Qiagen). Plazmidy adaptorowe pAdApt35.Luc i pAdApt35.LacZ zlinearyzowano Bglll i następnie uzyskano tępe końce działając Klenowem. Bglll trawi bezpośrednio za sekwencją poliadenylacji SV40 kasetki ekspresyjnej transgenu. Dla opisu plazmidów adaptorowych opartych na pAdApt35 patrz WO 00/70071. Traktowane plazmidy adaptorowe zdefosforylowano przy pomocy alkaliczne] fosfatazy z krewetki (SAP) zgodnie z zaleceniami producenta. Wyizolowany fragment promotora RSV połączono następnie przy pomocy ligazy z każdym z przygotowanych wektorów i wprowadzono przez transformację do kompetentnych bakterii DH5a (Invitrogen). Kolonie sprawdzano pod kątem prawidłowej (zgodnej) orientacji promotora RSV względem genu pIX, otrzymując pAdApt35.Luc.rsv i pAdApt35.LacZ.rsv.
Ponadto, z sekwencji, którą wyizolowano przez PCR z rekombinowanego wirusa Ad35, który otrzymano po delecji obszaru transgenu, wytworzono plazmid adaptorowy. Analiza preparatu nieoczyszczonego lizatu otrzymanego z transfekcji szkieletowymi konstruktami pAdApt35.LacZ i pWE.Ad35.pIX-rITR Ad35 i dalsze oczyszczanie z łysinek pokazało, że wirus posiada delecję w regionie transgenu, o długości około 2,8 kb. Sekwencje 5' z tego wirusa zamplifikowano przez PCR na wyizolowanym DNA używając starterów 35F1 i 35R4. Reakcję przeprowadzono przy pomocy polimerazy Pwo (Roche) zgodnie z zaleceniami producenta. Program PCR ustawiono jak następuje: 94°C przez 2', następnie 5 cykli (94°C przez 30 s, 48°C przez 30 s, 72°C przez 2,5 min), następnie 25 cykli (94°C przez 30 s, 56°C przez 30 s, 72°C przez 2,5 min) i końcowy etap 8 min w 68°C.
Otrzymany fragment 2 kb oczyszczono przy pomocy zestawu do oczyszczania produktu PCR (Qiagen) i sklonowano w wektorze pCR-Script-Amp (Stratagene) zgodnie z zaleceniami producenta, otrzymując pCR.Ad35Δ2.8kb. W celu określenia zasięgu delecji plazmid ten zsekwencjonowano. Delecja dotyczyła większej części promotora CMV, transgenu i poliA z SV4G. Wynikiem tego było połączenie 317 pz 5' wobec promotora CMV z sekwencjami Ad35 poprzedzającymi gen pIX. Ten fragment CMV zawiera trzy bloki GC i powtórzenie o 21 pz (Boshard i wsp., 1985). Przypuszczalnie pozostałe sekwencje promotora CMV mogą wzmagać ekspresję pIX czego wynikiem jest bardziej stabilny wirus. Alternatywną możliwością było to, że wirus jest mniejszy i że, samo to powoduje zwiększenie stabilności. Dla zbadania tego pełną kasetkę ekspresyjną sklonowano ponownie niżej opisanym sposobem i wytworzono wirusy z tym nowym plazmidem adaptorowym. Wektor oparty na pCR-Script zawierający zamplifikowane sekwencje (przemianowane w pCR.C4) posiadał unikalne miejsce AvrII poprzedzające sekwencje ΔCMV-pIX. Wektor zlinearyzowano AvrII, końce wytępiono enzymem Klenowa i zdefosforylowano przy pomocy enzymu SAP (Roche) jak opisano powyżej. Plazmidy adaptorowe pAdApt535.LacZ (Przykład 5) i pAdApt.Luc (WO 00/70071) trawiono AvrII i Bglll, a DNA poddano działaniu Klenowa wypełniając lepkie końce. Fragmenty odpowiadające kasetkom ekspresyjnym LacZ i lucyferazy (CMV-TG-pA) wyizolowano z żelu jak wyżej i połączono przy pomocy ligazy ze zlineary22
PL 208 588 B1 zowanym AvrII wektorem pCR.C4. Transformowano do kompetentnych komórek jak wyżej i selekcjonowano kolonie posiadające kasetki w prawidłowej orientacji względem lewego ITR, otrzymując pCR.C4.LacZ i pCR.C4.Luc.
Wirusy Ad35 wytworzono jak opisano w Przykładzie 6 stosując nowe plazmidy adaptorowe: pCR.C4.LacZ trawione PacI, pCR.C4.Luc trawiony Apal oraz pAdApt35.LacZ.rsv i pAdApt35.Luc.rsv trawione PI-PspI.
Plazmidy adaptorowe kotransfekowano do komórek PER55K (WO 02/40665) przy pomocy pWE.Ad35.pIX.rITR lub pWE.Ad35.pIX.rITRΔE3 trawionych Notl. Dodatkowo, plazmid adaptorowy pBr.Ad35.ΔE1AΔ21K.Luc (konstrukcja opisana poniżej) trawiono Pl-Pspl i kotransdukowano z pWE.Ad35.pIX.rITR trawionym Notl. Przy pełnym efekcie cytopatycznym (CPE) hodowle zebrano przez cykle mrożenia/rozmrażenia i przez wirowanie usunięto szczątki komórek. 300 μl otrzymanych oczyszczonych lizatów użyto następnie do ponownego zakażenia komórek PER55K przeniesionych dzień wcześniej do kolb T80. Przy pełnym CPE przygotowano nieoczyszczone lizaty i użyto ich do zakażenia komórek A549 celem sprawdzenia ekspresji transgenu i przeprowadzenia analizy łysinek na komórkach PER55K.
Komórki A549 wysiewano na 6-studzienkowe płytki w ilości 5x105 komórek na studzienkę i po 5 godzinach zakażano 10,1 lub 0,1 μl każdego z wyjściowych roztworów wirusa LacZ, i inkubowano przez dwa dni. Następnie komórki A549 wybarwiano z uwagi na aktywność LacZ i zliczano niebieskie komórki. Procent niebieskich komórek podano w Tabeli II. Wirusy wyrażające LacZ są jednoznacznie bardziej stabilne, gdy ekspresją genu pIX kieruje promotor RSV, w porównaniu z poddanym delecji promotorem CMV. Wyniki te potwierdzono przy pomocy wirusów z lucyferazą. Aby zmierzyć aktywność wirusów z lucyferazą komórki A549 wysiewano na 24-studzienkowe płytki w ilości 1x105 komórek na studzienkę i zakażono 10, 1, 01 lub 0,01 μl wyjściowego roztworu wirusa i inkubowano. Po 2 dniach komórki wypłukano dwukrotnie PBS i zawieszono w 100 μl buforu do lizy (Promega) i do czasu użycia przechowywano w -20°C. Lucyferazę oznaczono przy pomocy systemu oznaczenia lucyferazy Steady-Glo (Promega) zgodnie z zaleceniami producenta. Wyniki przedstawiono w Tabeli III.
W Przykładzie 3 opisano, że wirusy Ad35 z pełną delecją E1 zawierające region E3 i kasetkę AdApt.Luc lub AdApt.LacZ nie były stabilne. Najwyraźniej w nowo opisanych konstruktach delecją promotora CMV przed pIX nie zapobiega delecji regionu transgenu. Jednakże, z promotorem RSV kontrolującym gen pIX można było wytworzyć wirusy o długości większej niż wirus typu dzikiego. Ad35AdApt.Luc.rsv i Ad35AdApt.LacZ.rsv mają odpowiednio 35 kb i 35,5 kb (patrz również Fig. 2). Ad35.ΔE1AΔ21K.Luc (36,4 kb) również wykazuje wysoką aktywność transgenu.
Następnie sprawdzono czy wirusy pozostaną niezmienione po oczyszczeniu z łysinek. W tym celu, komórki PER55K wysiewano na 6-studzienkowe płytki w ilości 0,9x106 komórek/studzienkę i zakażono różnymi 10-krotnymi rozcieńczeniami nieoczyszczonych lizatów Ad35.AdApt.LacZ. Rozcieńczenia od 10-5 do 10-8 wysiano na szalki, a następnego dnia zalano agarem. W tym celu komórki najpierw płukano PBS i następnie dodano 3 ml wstępnie ogrzanego roztworu agaru przygotowanego przez mieszanie 2xMEM (Gibco BRL; 9,14 ml), FBS (Gibco; 0,36 ml), MgCl2 (4,9 M; 0, 037 ml) z agarozą (SeaPlaque GTG; 2,5% w H2O, 7,2 ml). Po zestaleniu płytki dalej inkubowano w 37°C/5% CO2. Cztery dni później płytki uwidoczniono i dodano do studzienek roztwór barwiący LacZ na powierzchniowy agar pozwalając na wsiąknięcie. Wszystkie wirusy pokazywały klarowne, oddzielne łysinki w zakresie 10-7 do 10-9, lecz jedynie w przypadku wirusów z promotorem RSV kierującym genem pIX wszystkie łysinki barwiły się na niebiesko. W obu przypadkach, w których wydeletowany promotor CMV kontrolował pIX przynajmniej część łysinek nie barwiła się. Pokazuje to jasno, że zdolność do pakowania genomu, wielkość/stabilność zwiększa się w przypadku wirusów posiadających promotor RSV regulujący pIX.
Wynalazek ten po raz pierwszy dostarcza stabilnie rekombinowanych adenowirusów pochodzących z adenowirusa serotypu 35, lub opartych na nim, pozbawionych ekspresji funkcjonalnego genu E1B. Taki adenowirus posiada przynajmniej delecję w regionie E1. W szczególnych postaciach realizacji dostarczone przez wynalazek wspomniane stabilnie rekombinowane adenowirusy posiadają sekwencje obcej wstawki większą niż 4,2 kb i wielkość upakowanego genomu większą niż 33,4 kb, otrzymane przy pomocy sposobów według wynalazku. Co za tym idzie, celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie stabilnie rekombinowanego adenowirusa, który: a) niesie obcą sekwencję kwasu nukleinowego większą niż 4,2 kb i/lub b) ma wielkość upakowanego genomu większą niż 33,4 kb. W szczególnych realizacjach wynalazek dostarcza rekombinowanych adenowirusów opartych na Ad35 lub Ad11, które: a) niosą obcą sekwencję kwasu nukleinowego o wielkości przynajmniej 4,6 kb
PL 208 588 B1 i/lub b) mają upakowany genom o wielkości większej niż 33,8 kb. Alternatywnie lub oprócz tego wspomniane wielkości upakowanego genomu wynoszą odpowiednio przynajmniej 34,6, 35,0, 36,1 i 36,5 kb. W tych postaciach realizacji obce sekwencje mogą obejmować promotor heterologiczny kierujący ekspresją pIX. W kolejnym aspekcie, wspomniany stabilnie rekombinowany adenowirus jest serotypu 11. Stabilny adenowirus zgodny z tym aspektem wynalazku może być pasażowany na komórkach pakujących z otrzymaniem porcji rekombinowanych adenowirusów z mniej niż 10%, dogodnie mniej niż 5%, dogodniej bez oddzielnych klonów posiadających delecję w obcych sekwencjach w rekombinowanym adenowirusie, co można zmierzyć, np. przez PCR podany przykładowo w Przykładzie 3.
pBr.Ad35.ΔE1AΔ21 K.Luc (patrz powyżej) otrzymano jak następuje. Konstrukt pBr.Ad35^E1ΑΔ21Κ (WO 02/40665) trawiono Hpal, zdefosforylowano CIP (New England Biolabs) i z żelu wyizolowano fragment wektora 5 kb. Konstrukt pBr.Ad35^E1A.Luc również trawiono Hpal i z żelu wyizolowano fragment 3,3 kb, który połączono przy pomocy ligazy z wyizolowanym fragmentem wektora. Po transformacji do kompetentnych komórek STBL-2 (Invitrogen) wyselekcjonowano kolonie ze wstawką w prawidłowej orientacji. Dało to konstrukt pBr.Ad35.ΔE1AΔ21K.Luc. pBr.Ad35^E1A.Luc (nazywany również pBr.Ad35.E1B+.Luc, ponieważ nadal zawiera region E1B) przygotowano przez wbudowanie kasetki AdApt.Luc pobranej z pAdApt.Luc po trawieniu AvrII i Bglll i wytępieniu lepkich końców enzymem Klenowa, do fragmentu wektora pBr.Ad35.leftITR-pIX (WO 02/40665) trawionego SnaBI i Hindlll, i wytępionego Klenowem. Wyselekcjonowane kolonie z kasetką ekspresyjną w prawidłowej orientacji dały pBr.Ad35. ΔΕ1Α.Ιαο.
P r z y k ł a d 10. Identyfikacja sekwencji regulatorowych pIX.
Poprzednie przykłady pokazują, że rekombinowane wirusy Ad35, z których całkowicie usunięto regiony kodujące E1A i E1B stają się w sposób progresywny bardziej niestabilne jeśli zwiększa się wielkość genomu. W niniejszym zgłoszeniu pokazano, że dodanie promotora heterologicznego kierującego ekspresją pIX może przełamać tę niestabilność. W WO 02/40665 i powyżej ujawniono, że wirusy Ad35, które zachowały pełną sekwencję kodującą E1B-55K można wytwarzać w PER.C6 i że są one stabilne. To samo jest prawdą dla wirusów, które zachowały pełnej długości sekwencję kodującą E1B (WO 00/70071; Abrahamsen i wsp., 1997). Łącznie wyniki te stwarzają możliwość, że ekspresja genu pIX jest regulowana odmiennie w wirusach z podgrupy B w porównaniu z genem pIX w podgrupie C. Ponieważ wirusy, które zachowały gen E1B-55K kontrolowany przez promotor E1B są stabilne (patrz powyżej), sekwencje regulatorowe pIX będą przypuszczalnie zlokalizowane w tym regionie. Aby to zbadać wytworzono serię konstruktów, które zachowały różnej długości 3' końce sekwencji 55K. W tym celu najpierw wytworzono pBrAd35ΔSM.AdAptLacZ w następujący sposób. Konstrukt pBr.Ad35. 1ITR-pIX (opisany w WO 00/70071) strawiono SnaBI i Mfel, lepkie końce wypełniono Klenowem i zdefosforylowano enzymem SAP (Roche). Następnie z żelu agarozowego wyizolowano fragment wektora 4,4 kb. Konstrukt pAdApt.LacZ (plazmid adaptorowy pAdApt oparty na Ad5 ze wstawką transgenu LacZ; WO 99/55132) strawiono AvrII i Bglll (i ewentualnie Sall w celu zwiększenia różnicy w wielkości fragmentów) i wytępiono enzymem Klenowa. Następnie wstawkę 4,2 kb CMV.LacZ.pA wyizolowano z żelu. Oba wyizolowane fragmenty następnie połączono przy pomocy ligazy otrzymując pBr.Ad35ΔSM.AdAptLacZ (Fig. 7). Orientację można sprawdzić przez trawienie restrykcyjne, bowiem ligacja w prawidłowej orientacji odtwarza zarówno miejsce AvrII, jak i Mfal. Konstrukt pBr.Ad35ΔSM.AdAptLacZ zachowuje 0,6 kb 3' sekwencje E1B-55K (nukleotydy 2804-3400 Ad35 dzikiego typu) w miejscu szczepu dzikiego względem genu pIX. Wcześniej pokazano, że te sekwencje 55K nie prowadzą do ekspresji funkcjonalnego białka E1B-55K, bowiem okazało się niemożliwym namnażanie ich na komórkach PER.C6 (pBr.Ad35ΔSM; WO 02/40665). Wychodząc z pBr. Ad35ΔSM.AdAptLacZ można dokonać różnych delecji regionu E1B-55K o długości 680 pz (0,7 kb) przez trawienie Mfel (izoschizomer MunI), albo równocześnie Stul, Nsil lub Bglll, a następnie tępienie lepkich końców przy pomocy Klenowa lub polimerazy DNA z bakteriofaga T4 odpowiednio w przypadku 5' lub 3' lepkich końców. Ponowna ligacja strawionego DNA da funkcjonalne plazmidy adaptorowe, które następnie stosuje się do wytwarzania rekombinowanych wirusów w komórkach PER55K przez kofekcję z pWE.Ad35.pIX-rITR jak opisano powyżej. Dodatkowe konstrukty sporządzono przy pomocy enzymów Dralll, Bsu36l, BssHII lub BamHI i trawienie niekompletnego wektora (gen LacZ również zawiera miejsca rozpoznawane przez te enzymy) stosując sposoby znane w dziedzinie, a następnie selekcję prawidłowego klonu. Stabilność zbadano jak opisano powyżej dla konstruktu Ad35.AdApt.LacZ.rsv. Konstrukty, które są stabilne (tj. nie posiadają delecji w regionie transgenu) zawierają odpowiednie regiony regulatorowe ekspresji pIX. Ponadto, możliwe jest bezpośrednie zbadanie aktywności promotora o danej sekwencji przez wstawienie sekwencji przed gen reporterowy.
PL 208 588 B1
PGL3basic (Promega) jest takim konstruktem genu reporterowego. Region pomiędzy MunI i początkiem genu pIX amplifikowano przy pomocy zestawu starterów Ad3555KmfeF i Ad35pIXNcoR. PCR (2 min 94°C; następnie 30 cykli [30 s 94°C, 30 s 59°C, 60 s 72°C]; a następnie 8 minut 68°C; enzym: Pwo (Genexis) zgodnie z instrukcjami producentów z 3% dodatkiem DMSO) amplifikowała sekwencje Ad35 od 2804 do 3491 (numeracja jak w Ad35 typu dzikiego), co za tym idzie, zmieniła sekwencję wokół kodonu start pIX w miejsce Ncol i wprowadziła miejsce dla Hindlll na 5' końcu. Ten zamplifikowany fragment trawiono Hindlll i Ncol, i klonowano do pGL3basic trawionego tymi samymi enzymami otrzymując pGL3-MN. pGL3-MN użyto następnie do delecji sekwencji powyżej regionu kodującego lucyferazę przez kombinację trawienia Hindlll z np. PacI, Nsil, Stul, Bsu36I; BssHII lub Bglll, a następnie tępienie lepkich końców i religację. Aktywność promotora zbadano przez przejściową transfekcje otrzymanymi konstruktami do komórek PER.C6 przy pomocy odczynnika Lipofectamine zgodnie z zaleceniami producenta. Aktywność lucyferazy zbadano dwa dni po transfekcji stosując system oznaczenia lucyferazy Steady-Glo (Promega) zgodnie z zaleceniami producenta.
Alternatywnie, do wektora pGL3basic wbudowano różne regiony, które to regiony wytworzono przez amplifikację PCR przy pomocy 5' (lewego) startera adresowanego do specyficznej sekwencji w regionie E1B-55K Ad35 i przyłączając miejsce Hindlll na 5' końcu połączone ze starterem NcopIXrev. W ten sposób nie istnieje ograniczenie związane z obecnością unikalnego miejsca restrykcyjnego do klonowania.
Lokalizację promotora pIX badano następnie przy pomocy programu komputerowego do wyszukiwania potencjalnych sekwencji promotora (Reese i Eeckman, 1995). Fig. 8 przedstawia punktację promotora (za minimum przyjęto 0,65) dla promotora E1B bezpośrednio związanego z sekwencją kodującą 55K (jak w pBr.Ad35.ΔE1AΔ21K). Obszary zaznaczone A odpowiadają promotorowi E1B, a regiony B i C zlokalizowane są w obrębie sekwencji kodującej 55K. Regionu poprzedzającego pIX nie rozpoznano jako sekwencji promotorowej. Region C miał najwyższą punktację (0,96) z trzech (nawet wyższą niż znany promotor E1B) i co za tym idzie może zawierać sekwencje wpływające na ekspresję pIX. Aby zlokalizować i zidentyfikować doświadczalnie przypuszczalny promotor pIX wytworzono serię małych fragmentów odpowiadających różnym (zachodzącym) częściom 3' końca sekwencji kodującej 55K. Fig. 9 przedstawia schematycznie te fragmenty i ich lokalizację względem przypuszczalnego regionu promotorowego i genu pIX. Fragmenty wytworzono przez trawienie restrykcyjne przy pomocy wskazanych enzymów. Fragmenty wytępiono Klenowem (5' lepkie końce) lub T4 polimerazą DNA (3' lepkie końce) i sklonowano w miejsce Ncol wektora pGL3basic (Promega) również o tępych końcach otrzymanych przez działanie Klenowa i zdefosforylowanych przez działanie SAP (Roche). Po transformacji do kompetentnych bakterii otrzymane plazmidy sprawdzono ze względu na orientację wstawki przez trawienie restrykcyjne. Następnie zbadano aktywność promotora przez przejściową transfekcję otrzymanych konstruktów kodujących lucyferazę do komórek PER.C6 przy pomocy odczynnika Lipofectamine zgodnie z zaleceniami producenta. Pusty plazmid pGL3basic służył jako kontrola negatywna. Dodatkowe kontrole sporządzono przez klonowanie i) fragmentu Bglll-Mfel z pAdApt535 zawierającego promotor pIX z Ad5, ii) fragmentu 388 pz NruI-ApaLI promotora RSV (opisany powyżej) lub iii) regionu poprzedzającego powyżej pIX z Ad35 jako fragment PCR do miejsca Ncol z pGL3basic o wytępionych końcach jak opisano powyżej. Region poprzedzający pIX z Ad35 zamplifikowano na pAdApt35IP1 stosując startery SV40-for i 5' fosforylowany Ad35pIXrev. Po amplifikacji DNA trawiono Bglll i poddano działaniu Klenowa.
Konstrukty wprowadzono również przez transfekcje do ludzkich komórek niezawierających adenowirusa E1 (np. A549, HeLa), aby zbadać zależność ekspresji od E1A.
Aby umożliwić wytwarzanie rekombinowanych wirusów i badanie stabilności genomu wirusa w plazmidzie adaptorowym pBr.Ad35ΔSM.AdAptLacZ (patrz powyżej) sklonowano również fragmenty. W tym celu konstrukt pBr.Ad35ΔSM.AdAptLacZ trawiono Mfel i Bglll, końce wytępiono enzymem Klenowa i zdefosforylowano. Po wyizolowaniu z żelu fragmentu wektora, DNA można połączyć przy pomocy ligazy z wyżej opisanymi fragmentami (patrz Fig. 9) otrzymując zestaw plazmidów adaptorowych posiadających fragment 55K o różnej długości, który poprzedza gen pIX. Wirusy można wytworzyć z konstruktem pWE.Ad35.pIX-rITR jak opisano powyżej. Kontrolne transfekcje wykonano z użyciem konstruktów pBr.Ad35ΔSM.AdAptLacZ, pAdApt35.LacZ i pAdApt35.LacZ.rsv. Po wystąpieniu pełnego CPE komórki i pożywkę zebrano przez jeden cykl zamrożenie/rozmrożenie i użyto do ponownej infekcji świeżych komórek PER55K. Komórki i pożywkę ponownie zamrożono przy pełnym CPE, przygotowano nieoczyszczone lizaty i użyto do przeprowadzenia oznaczenia łysinkowego. Po wystąpieniu łysinek dodano roztwór barwiący X-gal aby sprawdzić ekspresję LacZ.
PL 208 588 B1
Wyniki powyższych doświadczeń pomogły znaleźć miejsce sekwencji regulatorowych pIX w regionie Ad35 E1B-55K.
Alternatywnie ekspresja genu pIX może być kierowana przez promotor E1B jako promotor heterologiczny dla rekombinowanych wirusów. W tym celu, pAdApt535.LacZ trawi się Bglll i Mfel, a następnie działa na niego Klenowem, aby wytępić końce i zdefosforylować. W ten sposób potraktowany fragment wektora o wielkości 4,8 kb następnie izoluje się z żelu. Region promotora E1B izoluje się jako fragment PCR przy użyciu pBr.Ad35.leftITR-pIX jako matrycowego DNA i starterów Epr-F i Epr-R, przy czym oba startery są fosforylowane. PCR przeprowadza się przy użyciu polimerazy DNA Pwo (Genaxis/Inno-Train Diagnostic Gmbh) zgodnie z zaleceniami producenta. Otrzymany fragment o długości 151 pz następnie klonuje się do wyizolowanego wektora otrzymując pAdApt35Epr.LacZ.
Plazmid ten następnie stosuje się do wytwarzania wirusów opartych na Ad35 i testu stabilności jak wcześniej opisano.
Aby zidentyfikować różne transkrypty zawierające sekwencje pIX z zakażonych komórek izoluje się i przez hybrydyzację z wyznakowaną sondą identyfikuje RNA zawierające pIX. W tym celu komórki PER55K zakaża się przy wielokrotności infekcji 10 i 50 następującymi wirusami: wtAd35, Ad35.E1B.AdApt.Luc, Ad35ΔE3.AdApt.Luc, Ad35ΔE3.AdApt535.Luc, Ad35.AdApt.Luc.rsv. Zakażone komórki zbiera się po 8 godzinach (wtAd35 również po 2 i 18 godzinach) i RNA izoluje przy pomocy odczynnika Tri-zol (Invitrogen). RNA rozdziela się pod względem wielkości w 1,5% żelu agarozowym, przenosi na Northern biot i hybrydyzuje z wyznakowaną 32P sondą pochodzącą z regionu kodującego pIX. Procedury są znane w dziedzinie (opisane w Molecular Cloning: A Laboratory Manual przez Sambrook i Russell, 2001 lub wersje wcześniejsze). Długość RNA można określić jeśli włączy się znane markery wielkości RNA i poda się wskazówki o rodzajach RNA zawierających sekwencje pIX. Aby zidentyfikować mRNA rozpoczynający się promotorem E1B blot może być pocięty i ponownie shybrydyzowany z sondą 5' 21K. Transkrypty zawierające pIX, które nie hybrydyzują z sondą E1B21K są przypuszczalnie wytworzone przez promotor inny niż promotor E1B.
Z uwagi na możliwe (i oczekiwane) przypadki alternatywnego składania nadal trudno jest precyzyjnie określić tym sposobem miejsce startu transkrypcji. Można to osiągnąć jak następuje. Wyizolowany RNA poddaje się odwrotnej transkrypcji do cDNA i cDNA stosuje się do specyficznej amplifikacji RNA zawierających 5' końce pIX przy pomocy systemu GeneRacer (Invitrogen) zgodnie z zaleceniami producenta z użyciem prawych starterów adresowanych do sekwencji kodujących pIX: pIXrev i zagnieżdżonego startera pIXrevN2. Klonowanie i sekwencjonowanie zamplifikowanych fragmentów pozwala na lokalizację miejsc startu transkrypcji i 5' sekwencji mRNA zawierających sekwencje pIX. W ten sposób zidentyfikować można przypuszczalne mRNA kodujące pIX. W ten sposób określić można także zależność pomiędzy poziomem ekspresji pIX i stabilnością odpowiednich rekombinowanych adenowirusów.
P r z y k ł a d 11. Sekwencje E1B i pIX z adenowirusów z grupy B.
W powyższych przykłady wykorzystuje się jako przykład wirusa Ad35. Inni przedstawiciele podgrupy B posiadający znaczącą homologię do siebie mogą posiadać porównywalną regulację pIX.
Aby to zbadać przyrównano sekwencje E1B i pIX przedstawicieli podgrupy B. Sekwencja Ad7 (SEQ ID NO.57) jest dostępna z Genbank pod numerem dostępu X03000. Sekwencja Adll (SEQ ID NO.56) została ujawniona przy pomocy losowego sekwencjonowania typu shotgut DNA wyizolowanego z dzikiego typu wirusów Ad11p, przeprowadzonego przez Lark Technologies (UK) podobnie jak to opisano (WO 00/70071) dla sekwencji Ad35 (SEQ ID NO.55). Ad11 i Ad35 są wysoce homologiczne względem siebie (ogółem 98,1% podobieństwa), przy czym główne różnice są umiejscowione w heksonie i węźle włókna.
Sekwencja Ad11 jest również ujawniona w WO 02/053759.
Do przyrównania użyto sekwencji pomiędzy miejscem poliadenylacji (pA) E1A i pA poniżej genu pIX (Fig. 10). Ad35 posiada ogólne podobieństwo (w tym regionie) wynoszące 98,4% do Ad11 i 82,9% do Ad7, przez co bardzo prawdopodobne jest, że u tych wirusów ekspresja pIX jest regulowana w ten sam sposób.
W tym celu sposoby i środki tu opisane, jakie przykładowo podano we wcześniejszych przykładach, można użyć do zwiększenia stabilności i/lub pojemności wstawki innych rekombinowanych adenowirusów z podgrupy B, na przykład przedstawionych tu Ad11 i Ad7.
PL 208 588 B1
P r z y k ł a d 12. Wirusy Ad35 z delecją E1 z heterologicznym promotorem kierującym ekspresją pIX.
W celu zbadania wpływu sekwencji promotora heterologicznego aktywującego gen pIX w wirusach z delecją całego E1 do wytwarzania rekombinowanych wirusów Ad35 zastosowano serie plazmidów adaptorowych. W tym celu pAdApt35LacZ, pAdApt35.LacZ.rsv (Przykład 9), pAdApt535.LacZ (Przykład 5) i pAdApt35BLacZ (zawierający sekwencję promotora E1B z Ad35 przed genem pIX; opisany poniżej) strawiono pIPsp-1 i użyto do wytwarzania wirusów ze strawionym Notl kosmidem pWE/Ad35-3431 i pWE/Ad35-348^E3 (Przykład 7) jak opisano w Przykładzie 2 (i w WO 00/70071). Ponadto wytworzono wirusy z plazmidem adaptorowym pBr.Ad35ΔSM.AdAptLacZ (Fig. 7; Przykład 10). Ten plazmid adaptorowy ma usunięty E1 i znaczną część sekwencji E1B. Zachowuje on 0,6 kb sekwencję 3' E1B-55K i również posiada dzikiego typu sekwencję pomiędzy kodonem stop 55K i kodonem start pIX.
Przy pełnym CPE komórki i pożywkę zebrano, zamrożono/rozmrożono i odwirowano, aby usunąć szczątki komórek. Nadsącz (sklarowane lizaty) z każdej transfekcji użyto następnie do przeprowadzenia oznaczenia łysinkowego, jak opisano w Przykładzie 9. Sklarowane lizaty rozcieńczono seryjnie 10-krotnie i wysiano rozcieńczenia 10-5 do 10-9.
Tydzień po dodaniu górnej warstwy agaru łysinki stały się widoczne i wybarwiono je X-gal, aby monitorować aktywność LacZ. Wyniki tych doświadczeń podsumowano w Tabeli V. W przeprowadzonym oznaczeniu w porównaniu z wirusami Ad35.AdApt.LacZ z delecją E1 wszystkie wirusy Ad35 posiadają dodatkowe lub inne sekwencje niż tylko endogenna, proksymalna sekwencja poprzedzająca pIX, regulujące działanie pIX lepiej i dające większą liczbę łysinek z ekspresją. Należy zauważyć, że całkowita długość genomu wirusów Ad35ΔSM.LacZ (106% w porównaniu z Ad35 typu dzikiego) przekracza maksymalną długość upakowanego genomu określoną dla wirusów Ad5 (105%). Może to wpływać na wyniki otrzymane dla tych wirusów. Ad35.AdApt.LacZ.rsv (105%) również znajduje się na granicy (105%) teoretycznej wielkości upakowanej cząsteczki. Łącznie, wyniki te pokazują, że promotor heterologiczny kierujący ekspresją pIX poprawia maksymalnie tolerowaną wielkość upakowanej cząsteczki i stabilność wirusów Ad35 z delecją E1. Pozostaje to prawdą dla wirusów posiadających dłuższą, proksymalną, endogenną sekwencję (Ad35ΔSM.LacZ), co sugeruje, że dodatkowe tu sekwencje (E1B 55K) zawierają elementy regulatorowe ekspresji pIX.
pAdapt35BlacZ jest plazmidem adaptorowym Ad35 z sekwencją promotora Ad35 E1B regulującą gen pIX. Plazmid adaptorowy pAdApt35BlacZ wytworzono jak następuje: Fragment promotora E1B zamplifikowano przy pomocy starterów 35E1Blong i Ad35E1bpromrev. Oba startery były ufosforylowane. Reakcję przeprowadzono z użyciem polimerazy DNA Pwo (Inno-train, Diagnostic GmbH) zgodnie z zaleceniami producenta. pBr.Ad35.leftITR-pIX użyto jako matrycowy DNA (25 ng, opisany w WO 02/40665). Program ustawiono jak następuje: 94°C przez 2 min, a następnie 30 cykli (94°C przez 30 s, 60°C przez 30 s, i 72°C przez 1 min), i końcowy etsp przez 10 minut w 72°C. Szybkość schładzania/podgrzewania ustawiono na 2°C/s Ten PCR doprowadził do amplifikacji potencjalnego promotora E1B z Ad35, o długości 125 nukleotydów. Następnie konstrukt pAdapt535.LacZ (Przykład 5) trawiono Mfel i Bglll. Po trawieniu wektor poddano działaniu enzymu Klenowa w celu utworzenia tępych końców. Etap defosforylacji przeprowadzono przy pomocy SAP (Roche). Tak przygotowany fragment wektora 8 kb wyizolowano z żelu. Region promotora E1B również wyizolowano z żelu. Te dwa fragmenty połączono przy pomocy ligazy i wprowadzono przez transformację do kompetentnych komórek DH5a-Tlr (Invitrogen). Poprawną orientację promotora E1B w otrzymanym plazmidzie potwierdzono przez trawienie Hpal i ApaLI. Po selekcji poprawnego klonu wbudowaną sekwencję promotora E1B potwierdzono również przez sekwencjonowanie.
P r z y k ł a d 13. Promotor genu pIX jest zlokalizowany na 3' końcu sekwencji kodującej E1B55K w wirusach Ad35 i Ad11.
Opierając się na wynikach opisanych powyżej oczekiwano, że promotor pIX u wirusów z podgrupy B będzie umiejscowiony w regionie kodującym E1B-55K. W celu bezpośredniego zbadania tego postanowiono zidentyfikować miejsce przyłączenia czapeczki w mRNA pIX jak opisano w Przykładzie 10. W tym celu wirusów wtAd35, wtAd11 i Ad35.E1B+.AdApt.Luc użyto do zakażenia komórek PER55K klonu 16 przy wielokrotności infekcji 50 cząsteczek wirusa/komórkę. Jako kontrolę użyto wtAd5, bowiem znany jest promotor i miejsce startu mRNA tego wirusa. RNA wyizolowano z zakażonych hodowli 16-18 godzin po zakażeniu przy pomocy czynnika TRIzol (Invitrogen) jak opisano przez producentów. Na końcu procedury wyizolowany RNA przechowywano w 100% formamidzie. Zestaw GeneRacer (Invitrogen) użyto do amplifikacji 5' końca transkryptów pIX celem umiejscowienia początku transkrypcji. Przed rozpoczęciem postępowania zgodnie z protokołem GeneRace, 5 μg RNA oczyszczono z formamidu przez wytrącenie octanem sodu, jak opisano w protokole GeneRace.
PL 208 588 B1
Oczyszczony RNA potraktowano zgodnie z zaleceniami producenta dla amplifikacji 5' końca pIX mRNA. Po działaniu fosfatazą i następnie usunięciu struktury czapeczki kwaśną pirofosfatazą z tytoniu i ligacji GeneRacer RNA oligo, użyto odwrotnej transkryptazy SuperScriptTM II do syntezy cDNA. cDNA zsyntetyzowano przez odwrotną transkrypcję przy pomocy specyficznego dla genu (lewego) startera dla pIX. Dla Ad35 (wirus dziki i E1B+.Luc), dla wtAd11 użyto startera pIXrev, a dla Ad9 użyto startera pIXrev-Ad5. Otrzymany cDNA (1 pl o nieznanym stężeniu) użyto jako matrycę do PCR w celu wytworzenia dsDNA. PCR przeprowadzono przy pomocy polimerazy DNA Pwo (Roche) zgodnie z zaleceniami producenta i z dodatkiem DMSO (Sigma; 3% obj/obj). Amplifikację przeprowadzono przy pomocy 5' startera GeneRacer z zestawu, który jest specyficzny dla oligonukleotydu przyłączonego do 5' końca mRNA i specyficznych dla genu starterów lewych, jak wspomniano powyżej. Warunki reakcji były jak następuje: denaturacja w 94°C przez 2 min, a następnie 30 cykli (94°C przez 30 s, 60°C przez 30 s, 72°C przez 2 min), i na koniec elongacja w 68°C przez 8 minut. Otrzymane fragmenty DNA rozdzielono pod względem wielkości przez elektroforezę w 1,0% żelu agarozowym. Dla Ad5 uzyskano fragment 480 pz, a dla Ad35 (dwa wirusy) i Ad11 200 pz. Ad11 dał również fragment 2 kb. Wszystkie fragmenty wycięto i oczyszczono z żelu agarozowego. Oczyszczone fragmenty DNA sklonowano w wektorze pCR4Blunt-TOPO® (Invitrogen). Wektory zsekwencjonowano przy pomocy komercyjnych starterów M13 Forward i Reverse. Otrzymane sekwencje ponownie przyrównano do sekwencji typu dzikiego aby zlokalizować start transkrypcji pIX. Prążek 200 pz wyizolowany z preparatów cDNA Ad35 i Ad11 stanowił czysty mRNA pIX, fragment 2 kb wyizolowany z Ad11 z kolei pochodził z promotora E1B. Fig. 14 przedstawia przyrównanie sekwencji cDNA Ad35 (SEQ.ID.NO.59) i Ad11 (SEQ.ID.NO.58) z sekwencją wtAd35 (SEQ.ID.NO.60). Przyrównanie ujawnia lokalizację wyciętej przy składaniu sekwencji intronu w mRNA pIX. Na Fig. 15 pokazano schematycznie lokalizację miejsca przyłączenia czapeczki i miejsc składania w regionie E1B-pIX z Ad35. W przypadku Ad5 oczekiwany mRNA pIX (Babiss i Vales, 1991) zidentyfikowano od miejsca przyłączenia czapeczki umiejscowionego w pozycji 3580 (nie pokazano; numeracja jak w Genbank, numer dostępu M73260). W przypadku Ad35 miejsce przyłączenia czapeczki zlokalizowano na 3' końcu genu E1B-55K w pozycji 3339 na reszcie A (sekwencja Ad35 WO 00/70071). W przypadku Ad11 miejsce przyłączenia czapeczki umiejscowione było podobnie, na zasadzie T (pozycja 3339 w Genbank, nr dostępu AY163756). Co interesujące, sekwencja pomiędzy kodonem stop genu 55K i kodonem start pIX, gdzie w wirusach Ad5 zlokalizowany jest promotor pIX jest wycinana przy składaniu z mRNA w wirusach Ad35 i Ad11. Wyniki te stanowią silne dowody na okoliczność, że ekspresja genu pIX w Ad35 i Ad11 jest regulowana z promotora umiejscowionego na 3' końcu genu 55K.
P r z y k ł a d 14. Wirusy Ad35 z delecją E1, które zachowały krótki ciąg 3' sekwencji E1B-55K mają większą pojemność upakowania.
Identyfikacja miejsca przyłączenia czapeczki mRNA pIX umożliwia uwzględnienie naturalnego promotora Ad35 dla prawidłowej ekspresji pIX, i również ograniczenie, na tyle na ile jest to możliwe, sekwencji E1B-55K w wektorze wirusowym. Pokazano tu, na zasadzie nieograniczającego przykładu konstrukcję plazmidu adaptorowego Ad35, który zachował 166 pz 3' końca sekwencji kodującej 55K (pAdApt35Bsu.Luc) i wytwarzanie wirusa Ad35Luc z delecją E1 o zwiększonej stabilności i/lub pojemności upakowania. Ta, 166 pz, sekwencja nie koduje funkcjonalnego produktu genu 55K, lecz zawiera miejsce przyłączenia czapeczki mRNA pIX zidentyfikowane we wcześniejszym przykładzie w jego naturalnej pozycji względem sekwencji kodującej pIX.
Konstrukt pAdApt35psu.Luc wytworzono jak następuje: najpierw wytworzono fragment PCR przy pomocy 40 ng pBr.Ad35.leftITR-pIX jako matrycowego DNA (opisany w WO 02/40665) i starterów Bsu55KF i Age-pIXR. PCR przeprowadzono przy pomocy polimerazy DNA Pwo (Genaxis) zgodnie z zaleceniami producenta. Dodatkowo użyto 3% obj./obj. DMSO (Sigma). Program ustawiono jak następuje: 2 min w 94°C, a następnie 30 cykli (94°C przez 30 s, 60°C przez 30 s, 72°C przez 1,5 min), i na koniec 6 minut w 68°C. Otrzymany produkt 1,2 kb sklonowano bezpośrednio do wektora pCR4BluntTOPO (Invitrogen) zgodnie z protokołem producenta, otrzymując pCR4Blunt-TOPO.Bsu-Age. Konstrukt sprawdzono przez trawienie PvuII (New England Biolabs). Fragment Bsu-Age wyizolowano z plazmidu pCR4Blunt-TOPO.Bsu-Age przez trawienie Bsu36l (New England Biolabs) i działanie enzymem Klenowa (New England Biolabs) celem otrzymania tępych końców. DNA oczyszczono przy pomocy zestawu do oczyszczania produktów PCR (Qiagen) i trawiono Agel (New England Biolabs). Fragment 1 kb wyizolowano z żelu przy pomocy zestawu Gene clean II (Bio 101, Inc.). Równocześnie konstrukt pAdApt35.Luc (opisany w WO 00/70071) trawiono Bglll i poddano działaniu enzymu Klenowa. DNA oczyszczono przy pomocy zestawu do oczyszczania produktu PCR (Qiagen). Oczyszczony DNA tra28
PL 208 588 B1 wiono Agel (New England Biolabs) i zdefosforylowano SAP (Roche). Fragment 5,8-kb wyizolowano z żelu przy użyciu zestawu Gene clean II (Bio 101). Dwa fragmenty zmieszano w równomolarnych ilościach w reakcji ligacji i wprowadzono przez transformację do opornych na T1 komórek EM DH10B (Invitrogen). Dzięki temu otrzymano plazmid pAdApt35Bsu.Luc.
Celem wytworzenia wirusów z delecją E1, pAdApt35bsu.Luc trawiono pIPsp-I i kotransfekowano do komórek PER55K klonu 16 z trawionym Notl pWE.Ad35-3481 (Przykład 7) i z pWE.Ad35-348^E3 jak opisano wcześniej. pWE.Ad35-348^E3 zawiera tę samą delecję E3 jaką opisano dla pWE.Ad35.pIXrITRΔE3 (Przykład 2) i został wytworzony zgodnie ze sposobem opisanym w Przykładzie 7 przy pomocy konstruktu pWE.Ad35-348^NdeI i fragmentu Ndel 26,6 kb z pWE.Ad35-pIX-rITRΔE3.
Ponadto wytworzono wirusy Ad35 z delecją E1 zawierające sekwencje E4-Orf6 i E4-Orf6/7 z Ad5 w szkielecie wirusa zastępując naturalne sekwencje Ad35 (patrz WO 03/104467 w celu wytwarzania takich wirusów w niezmodyfikowanych komórkach PER.C6). W niniejszym przykładzie pAdApt35Bsu.Luc trawiony pIPsp-I kotransformowano z trawionym NotI/EcoRV pWE.Ad35.pIX-EcoRV i z trawionym Pacl/Notl pBr.Ad35.PR5)rf6 (z i bez regionu E3). Wszystkie transfekcje skutkowały wystąpieniem pełnego CPE w ciągu tygodnia po transfekcji, a komórki oraz pożywkę zebrano jak opisano powyżej. Następnie wirusy i łysinki oczyszczono, i wirusowe roztwory wyjściowe namnożono na odpowiednich komórkach komplementujących i pochodzące z pojedynczych łysinek zbadano przez PCR pod kątem integralności regionu transgenu. PCR transgenu przeprowadzono jak opisano w Przykładzie 3 przy pomocy starterów AdApt35CMVF i pIXrevN2. Fig. 16 przedstawia przykład wyników PCR na łysinkach pochodzących z wirusów Ad35Bsu.Luc i z Ad35Bsu.Luc.5Orf6.
Niezależnie od obecności regionu E3 lub sekwencji E4-Orf6 w szkielecie wirusa, wszystkie zbadane łysinki (5-10 dla każdego wirusa) zawierały niezmieniony transgen. Jedynym wyjątkiem była jedna łysinka z wirusów Ad35Bsu.Luc, w której wykazano słaby prążek o wielkości około 1,6 kb (Fig. 16; ścieżka 12), przypuszczalnie pochodzący z niewielkiej ilości wirusów z delecją. Słaby prążek o wielkości około 500 pz występujący w próbkach wszystkich wirusów stanowi prążek tła starterów na wirusie szkieletowym. Obserwacja, że wirusy Ad35 zawierające E3 z kasetką ekspresyjną lucyferazy okazały się stabilne po oczyszczeniu z łysinek, pozostaje w sprzeczności z wcześniejszymi wynikami dotyczących wirusów Ad35.AdApt.Luc o całkowitej delecji E1 i niezawierających 166 pz 5' sekwencji kodującej 55K. Używając standardowych plazmidów pAdApt35.Luc nie można było wytworzyć wirusów oczyszczonych z łysinek zawierających region E3. Dlatego, wbudowując dodatkową sekwencję 55K do szkieletu można było otrzymać wirusy o łącznej długości większej niż 34,6 kb bez istotnej niestabilności. Odpowiada to ściśle długości dzikiego wirusa Ad35. Jeśli użyto by szkieletu z delecją E3, teoretyczna pojemność dla obcych sekwencji wyniosłaby ponad 5 kb. Oczywiście, możliwe jest wbudowanie większej sekwencji E1B-55K niż w niniejszym przykładzie i/lub połączenie 3' sekwencji 55K z heterologicznymi sekwencjami wzmacniaczy, nie odchodząc od uBio 10 ujawnionego tu wynalazku.
PL 208 588 B1
T a b e l e
T a b e l a I: Wydajność otrzymywania wirusów Ad35 z delecją E1 i E1/E3 na komórkach klonu #16 uzyskana w trójwarstwowych kolbach.
| Wirus | Skala (kolby T175III) | Łączna # cząsteczek wirusów po DSP | VP/komórkę |
| Ad35.AdApt.eGFP | 4 | 7.5x1011 | 2500 |
| Ad35.AE3AdApt.empty | 8 | 2x1012 | 3300 |
| Ad35.AE3.AdApt.Lac7 | 8 | 3.8x1011 | 600 |
| Ad35.AE3.AdApt. MV-F | 4 | 8.8x1011 | 2900 |
| Ad35.AE3.AdApt.MV-H | 8 | 2.6x1012 | 4250 |
T a b e l a II: Test aktywnoś ci transgenu (LacZ) na A545 przy pomocy nieoczyszczonych lizatów z drugiego pasażu wirusa. % niebieskich komórek podano dla każdej ilości wirusa użytego do infekcji.
| Wirus | 10 μ! | 1 pl | 0.1 pl |
| Ad35.AdApt.LacZ.rsv | 95 | 15 | <1 |
| Ad35. AE3. AdApt. LacZ. rsv | 90 | 10 | <1 |
| Ad35.AdApt.LacZ.C4 | 2 | <0.1 | 0 |
| Ad35.AE3.AdApt.LacZ.C4 | 15 | <1 | <0.1 |
T a b e l a III: Aktywność transgenu (lucyferaza) zbadana na A549 przy pomocy nieoczyszczonych lizatów z drugiego pasażu wirusa. Aktywność wyrażono we wzglę dnych jednostkach jasności (RLU)
| Wirus | 10 pl | 1pl | 0.1 pl | 0.01 pl |
| Ad35.AdApt.Luc.rsv | 845453 | 27940 | 178 | 26 |
| Ad35.AE3.AdApt.Luc.rsv | 258269 | 2217 | 46 | 6 |
| Ad35. AdApt. Luc.C4 | 6130 | 175 | 18 | 33 |
| Ad35.AE3.AdApt.Luc.C4 | 814642 | 6278 | 147 | 23 |
| Ad35.AE1AA21K.Luc | 1514698 | 50196 | 503 | 57 |
T a b e l a IV: Sekwencje starterów.
| Nazwa | Sekwencja | SEQ. ID. NO. |
| 1 | 2 | 3 |
| 35E3for | 5-AATGACTAATGCAGGTGCGC-3' | 19 |
| 35E3rev | 5'-CGACGCGTTGTAGTCGTTGAGCTTCTAG-3' | 20 |
| AdApt35CMVF | 5-GTAGGTGTCAGCCTAGGTGGTC-3' | 21 |
| 35pIXR | 5'-TCATGTCAGCTGCAAGAC AG-3' | 22 |
| SV40for | 5-CAATGTATCTTATCATGTCTAG-3' | 23 |
| pIX5Rmfe | 5-CTCTCTCAATTGCAGATACAAAACTACATAAGACC-3' | 24 |
PL 208 588 B1 cd. tabeli IV
| 1 | 2 | 3 |
| pIX35Fmfe | 5'-CTCTCTCAATTGTCTGTCTTGCAGCTGACATG-3' | 25 |
| AdApt35pIXrev | 5'-CAATCTGTCCATCTGAAAATCC-3' | 26 |
| pIXcosF-2 | 5'-CTGCTGGACGTCGCGGCCGCGACATGAGTGGAAATGCTTC-3' | 27 |
| Adapt35-3 | 5'-TGCAAATCTGTGAGGGGAAC-3' | 28 |
| 35D21 | 5'-TTAGATCCATGGATCCCGCAGACTC-3' | 29 |
| 35B3 | 5'-CCTCAGCCCCATTTCCAG-3' | 30 |
| 35F1 | 5'-CGGAATTCTTAATTAATCGACATCATCAATAATATACCTTATAG-3' | 31 |
| 35R4 | 5'-CGGAATTCTTCTTAATTAAGGGAAATGCAAATCTGTGAGG-3' | 32 |
| Ad3555KMfeF | 5'-AACCAAGCTTCAATTGTCTCTGAA-3' | 33 |
| Ad35pIXNcoR | 5'-CCACCCATGGCAGCTGCAAGACAG-3' | 34 |
| Ad35pIXrev | 5'-TCAGCTGCAAGACAGAAAAAAC-3' | 35 |
| Epr-F | 5'-GTGTTTACTTAAGGTGACGTC-3' | 36 |
| Epr-R | 5'-GAAAGCCAGCTCCTATGAGC-3' | 37 |
| piXrev | 5'-GGCGGGTTGAACGGGTCTTCCA-3 | 38 |
| plXrev-N2 | 5'-GATGGGAGACGCCCTGTCAGATAAGG-3' | 39 |
| 35E1Biong | 5'-AAGGTGACGTCAATATTTGTGTG-3 | 40 |
| Ad35E1bpromrev | 5'-ATGAAAGCCAGCTCCTATGAG-3' | 41 |
| plXrev-Ad5 | 5'-AGGGGAGGAAGCCTTCAGG-3' | 42 |
| Bsu55KF | 5'-AGGTGGGCGTAGAGGAATG-3' | 43 |
| Age-plXR | 5*-CAAGACGGGATCTTGGCGG-3' | 44 |
T a b e l a V: Procent łysinek LacZ-dodatnich dla wirusów Ad35 o różnych sekwencjach promotora kierującego ekspresją pIX (NP = nie zaobserwowano łysinek). %
| % niebieskich łysinek | |||
| Nazwa wirusa | z rejonem E3 | bez rejonu E3 | długość wirusa (z rejonem E3) |
| Ad35.AdApt.LacZ | 0% | 50% | 36.1 kb |
| Ad535.AdApt.LacZ | NP | 100% | 36,1 kb |
| Ad35.AdApt.B.LacZ | 5% | 80% | 36,2 kb |
| Ad35 Ad Apt.LacZ.rsv | 90% | 100% | 36,5 kb |
| Ad35.ASM.LacZ | 50% | 100% | 36,7 kb |
PL 208 588 B1
L i t e r a t u r a:
Abrahamsen K, Kong H-L, Mastrangeli A, Brough D, Lizonova A, Crystal R i Falck-Pedersen E. (1997) Construction of an adenovirus type 7a ELK vector. . J Virol 11:6946-6951.
Babiss, L.E. i Vales, L.D. (1991). Promoter of the adenoviral polypeptide IX gene: Similarity to ELB and inactivation by substitution of the simian virus PATA element. J.Virol. 65(2), str 598-605.
Bett, A.J., Prevec, L. i Graham, F.L. (1993). Packaging capacity and stability of human adenovirus type 5 vectors. J. Virol. 67(10), str 5911-5921.
Boshart, M., Weber, F., Jahn, S., Dorsch-Hasler, K., Fleckenstein B. i Schaffner N. (1965). A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus. Cell 41, 521-530.
Caravokyri, C. iLeppard, K.N. (1995). Constitutive episomal expression of polypeptide IX (p1)0 in a 293-based cell line complements the deficiency of piX mutant adenovirus type 5. J. Virol. 69(11), str 6627—6633.
Fallaux, F.J., Kranenburg, O., Cramer, S.J., Houweling, A., van Ormondt, H., Hoeben, R.C. and van der Eb, A.J. (1996). Characterization of 911: A new helper cell line for the titration and propagation of early region 1-deleted adenoviral vectors. Hum. Gene Ther. 7, str 215-222.
Fallaux, F.J., Bout, A., van der Velde, I., van den Wollenberg, D.J., Hehir, K.M., Keegan, .J., Auger, C, Cramer, S.J.,van Ormondt, H., van der Eb, A.J., Valerio, D. i Hoeben, R.C. (1998) . New helper cells and matched early region 1-deleted adenovirus vectors prevent generatjon of replication competent adenoviruses. Hum. Gene Ther. 9, str 1909-1917.
Farina, S.F., Gao, G.P., Xiang, Z.Q., Rux, J.J. Burnett, R.M., Alvira, M.R., Marsh, J., Ertl, H.C. i Wilson, J.M. (2001). Replication-detective vector based on a chimpanzee adenovirus. J. Virol. 75(23), str. 11603—11613.
Francki, R.I.B., Fauquet, G.M., KnudsOn, L. i Brown, F. (1991). Classification and nomenclature Of viruses. Fifth report of the International committee on taxonomy of viruses. Arch. Virol. Suppl. 2, str. 140—144.
Furcinitti, P.S., van Oostrom, J. i Burnett R.M. (1989). Adenovirus polypeptide IX revealed as capsid cement by difference images from electron microscopy and crystallography. EMBO J. 6(12), str. 3563-3570.
Graham, F.O., Smiley, J., Russell, N. i Nairn, R. (1970. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. J. Gen. Virol. 36, str. 59-72.
Ghosh-Choudhury, C, Haj-Ahmad, Y. i Graham, F.L. (1987). Protein IX, a minor component of the human adenovirus capsid, is essential for the packaging of full length genomes. EMEO J. 6(6), str. 1733-1739.
Hehir, K.M., Armentaflo, D., Cardoza, L.M., Choquette, T.L., Berthelette, PB., White, G.A., Couture, L.A., Everton, M.B., Keegan, J., Martin, J.M., Pratt, D.A., Smith, M.P., Smith, A.E. i Wadsworth, S.C. (1996) Molecular characterization of replication-competent variants of adenovirus vectors and genome modifications to prevent their occurrence. J. Virol. 70(12), str. 8459-8467.
Herrman, C.H. i Mathews, M.B. (1989). The adenovirus E1B 19-kilodalton protein stimulates gene expression by increasing DNA levels. Mol. Cell. Biol. 9, str. 5412-5423.
Lutz, P., Rosa-Calatrava, M. i Kedinger, G. (1997). The product of the adenovirus intermediate gene IX is a transcriptional activator. J. Virol. 71(7), str. 5102-5109.
Pilder, S., Logan, J. i Shenk, T. (1984). Deletion of the gene encoding the adenovirus type 5 early region 1B 21,000-molecular-weight polypeptide leads to degradation of viral and host celi DNA. J. Virol. 32(2), str. 664-671.
Pilder, S., Moore, M. , Logan, J. i Shenk, T. (1986). The adenovirus E1B-55K transforming polypeptide modulates transport or cytoplasmic stabilization of viral and host cell mRNAs. Mol. Cell. Biol. 6, str. 470-476.
Rao, L., Debbas, M., Sabbatini, P., Hockenbery, D.,
Korsmeyer, S. i White, E. (1992). The adenovirus E1A proteins induce apoptosis, which is inhibited by the E1B 19-kDa and Bcl-2 proteins: Proc. Natl. Acad. Sci. USA tom 89, str. 7742-7746.
Reese, M.G. i Eeckman, F.H. (1995). Novel neural network algorithms for improved eukaryotic promoter site recognition. Talk and Abstract from The seventh international genome sequencing and analysis conference. Hyatt Regency, Hilton Head Island, South Carolina, wrzesień 16-20, 1995.
(http: //www. fruitfly.org/seq_toolS/promoter.html).
PL 208 588 B1
Robert, J.-J., Gauffeny, I., Maccario, J. , Jullien, C., Benoit, P., Vigne, E., Crouzet, J. , Perricaudet, M. i Yeh, P. (2001). Degenerated pIX-IVa2 adenoviral vector sequences lowers reacquisition of the E1genes during virus amplification in 293 cells. Gene Ther. 8, str. 1713-1720.
Russell, W.C. (2000). Update on adenoviruses and its vectors. J. Gen. Virol. 81, str. 2573-2604.
Sambrook, S. i Russell, D. Molecular Cloning: A laboratory manual. Trzecie wydanie. Cold Spring Harbor Press (2001). ISBN 0-87969-576-5.
Shabram, P.W., Giroux, D.D., Goudreau, A.M., Gregory, R.J., Horn, M.T., Huyghe, B.G., Liu, X., Nunnally, M.H., Sugarman, B.J. i Sutjipto, S. (1997) Analytical anion-exchange RPLC of recombinant type-S adenoviral particles. Hum. Gene Ther. 8(4): 453-465.
Shenk, T. (1996). Adenoviridae: The viruses and their replication. In virology, wyd. Fields, B.N., Knipe, D.M. i Howley, P.M. (Lippincott-RaVent Nowy Jork), tom 2, str. 2111-2148.
White, FL, Grodzicker, T. i Stillman, B.W. (1984). Mutations in the gene encoding the adenovirus early region IB 19,000 molecular-weight tumor antigen cause degradation of chromosomal DNA. J. Virol. 52(2), str. 410-419.
Yew, P.R. i Berk, A.J. (1992). Inhibition of p53 transactivation required for transformation by adenovirus early region IB protein. Nature 357, str. 62-85.
PL 208 588 B1
LISTA SEKWENCJI <110> Crucell Holland B.V.
vogels, Ronald
Havenga, Menzo J.E.
zuijdgeest, David A.T.M.
<120> Rekombinowane adenowirusy, wyizolowane kwasy nukleinowe, komórki pakujące i sposoby zwiększania stabilności i/lub pojemności upakowania rekombinowanego adenowirusa <130> 0076WO00ORD
<210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Sztuczna <220>
<223> Starter AoApt35CMVF
PL 208 588 B1 <400> 21 gtaggtgtca gcctaggtgg tc 22 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna <220>
<223> Starter 35pIXR <400> 22 tcatgtcagc tgcaagacag 20 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Sztuczna <220>
<223> Starter sv40for <400> 23 caatgtatct tatcatgtct ag 22 <210> 24 <211> 35 <212> DNA <213> Sztuczna <220>
<223> Starter pIX5Rmfe <400> 24 ctctctcaat tgcagataca aaactacata agacc 35 <210> 25 <211> 32 <212> DNA <213> Sztuczna <220>
<223> Starter pIX35Fmfe <400> 25 ctctctcaat tgtctgtctt gcagctgaca tg 32 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Sztuczna <220>
<223> Starter AdApt35pIXr <400> 26 caatctgtcc atctgaaaat cc 22
PL 208 588 B1 <210> 27 <211> 40 <212> DNA <213> Sztuczna <220>
<223> Starter pIXcosF-2 <400> 27 ctgctggacg tcgcggccgc gacatgagtg gaaatgcttc 4C <210> 28 <211> 20 <212> DNA<213> Sztuczna <220>
<223> Starter Adapt35-3 <400> 28 tgcaaatctg tgaggggaac 20 <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> Sztuczna <220>
<223> Starter 35D21 <400> 29 ttagatccat ggatcccgca gactc 25 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Sztuczna <220>
<223> Starter 35B3 <400> 30 cctcagcccc atttccag 18 <210> 31 <211> 44 <212> DNA <213> Sztuczna <220>
<223> Starter 35F1 <400> 31 cggaattctt aattaatcga catcatcaat aatatacctt atag 44 <210> 32 <211> 40
PL 208 588 B1 <212> DNA <213> Sztuczna <220>
<223> Starter 35R4 <400> 32 cggaattctt cttaattaag ggaaatgcaa atctgtgagg 40 <210> 33 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna <220>
<223> Starter Ad3555KMfeF <400> 33 aaccaagctz caattgtctc tgaa 24 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna <220>
<223> Starter Ad35pIXNCOR <400> 34 ccacccatgg cagctgcaag acag 24 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Sztuczna <220>
<223> Starter Ad35pIXrev <400> 35 tcagctgcaa gacagaaaaa ac 22 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna <220>
<223> Starter Epr-F <400> 36 gtgtttactt aaggtgacgt c 21 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna
PL 208 588 B1 <220>
<223> Starter Epr-R <400> 37 gaaagccagc tcctatgagc 20 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Sztuczna <220>
<223> Starter pIXrev <400> 38 ggcgggttga acgggtcttc ca 22 <210> 39 <211> 26 <212> DNA <213> Sztuczna <220>
<223> Starter pIxrev-N2 <400> 39 gatgggagac gccctgtcag ataagg 26 <210> 40 <211> 23 <212> DNA <213> Sztuczna <220>
<223> Starter 35ElBlong <400> 40 aaggtgacgt caatatttgt gtg 23 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna <220>
<223> Starter Ad35Elbpromrev <400> 41 atgaaagcca gctcctatga g 21 <210> 42 <211> 19 <212> DNA <213> Sztuczna <220>
<223> Starter p!xrev-Ad5
PL 208 588 B1 < 4 Ο O 42 agęggaggaa gccttcagg 19
| <210> <211> <212> <213> | 43 19 DNA Sztuczna |
| <220> | |
| <223> | Starter |
| <400> | 43 |
aggtgggcgt agaggaatg 19 <210> 44 <211> 19 <212> DNA <213> Sztuczna <220>
<223> Starter Age-pIXR <400> 44 caagacggga tcttggcgg 19 <210> 45 <211> 102 <212> DNA <213> Adenowirus typu 2 <220>
<221> cecha_dcdatkowa <223> proksymalna sekwencja poprzedzająca pix z Ad2 <220>
<221> kodon stop E1B 55K <222> (1)..(3) <220>
<221> miejsce spl <222> (18) .. (24) <220>
<221> sygnał TATA (45) (51) <222>
<220>
<221> kodon start pIX <222> (99)..(102) <400> 45 tgaggtactg aaatgtgtgg gcgtggctta agggtgggaa agaatatata aggtgggggt 60 ctcatgtagt tttgtatctg ttttgcagca gccgccgcca tg 102
| <210> | 46 |
| <211> | 105 |
| <212> | DNA |
| <213> | Adenowirus typu 5 |
| <220> | |
| <221> | cecha dodatkowa |
PL 208 588 B1 <223> proksymalna sekwencja poprzedzająca pIX z Ad5 <220>
<221> kodon stop E1B 55K <222> (1)..(3) <220>
<221> miejsce Spl <222> (18)..(24) <220>
<221> sygnał_TATA <222> (45)..(51) <220>
<221> kodon start pIX <222> (103)..(105) <400> 46 tgaggtactg aaatgtgtgg gcgtggctta agggtgggaa agaatatata aggtgggggt 60 cttatgtagt tttgtatctg ttttgcagca gccgccgccg ccatg 105 <210> 47 <211> 84 <212> DNA <213> Adenowirus typu 12 <220>
<221> cecha_dodatkowa <223> proksymalna sekwencja poprzedzająca pIX z Adl2 <220>
| <221> <222> | kodon (1) · · | stop (3) | E1B |
| <220> | |||
| <221> | kodon | start | pIX |
| <222> | (81) . | • (84) |
<400> 47 tgaggtaagt gggtggagct aggtgggatt ataaaaggct ggaagtcaac taaaaattgt 60 ttttgttctt ttaacagcac gatg 84 <210> 48 <211> 93 <212> DNA <213> Adenowirus typu 9 <220>
<221> cecha_dodatkowa <223> proksymalna sekwencja poprzedzająca pIX z Ad9 <220>
PL 208 588 B1
| <221> | kodon | step E1B 55K | |||
| <222> | (1)..( | )3) | |||
| <220> | |||||
| <221> | kodon | start pIX | |||
| <222> | (91) . . | . (93) | |||
| <400> | 43 | ||||
| tagaggtagg | tcgagtgagt agtgggcgtg | gctaaggtga ctataaaggc | gggtgtctta | 60 | |
| cgagggtctt | tttgcttttc tgęagacatc | atg | 93 | ||
| <210> | 49 | ||||
| <211> | 73 | ||||
| <212> | DNA | ||||
| <213> | Adenowirus typu 40 | ||||
| <220> | |||||
| <221> | cecha | dodatkowa | |||
| <223> | proksymalna sekwencja poprzedzająca pIX z Ad40 | ||||
| <220> | |||||
| <221> | kodon | stop E1B 55K | |||
| <222> | (1) .. | (3) | |||
| <220> | |||||
| <221> | kodon | start pIX | |||
| <222> | (71) | . (73) | |||
| <400> | 49 | ||||
| taagggtaag | gggeggagee tattacaggt | ataaaggttg gggtagagta | aaaaaaaggg | 60 | |
| aagttacaaa | atg | 73 |
<210> 50 <211> 90 <212> DNA <213> Adenowirus typu 4 <220>
<221> cecha_dodatkowa <223> proksymalna sekwencja poprzedzająca ρΙΧ z Ad4 <220>
<221> kodon stop E1B 55K <222> (1)..(3) <220>
<221> kodon start pIX <222> (38)..(90) <400> 50 tagagtgagt agtgttctgg ggcgggggag gacctgcatg agggccagaa taactgaaat 60 ctgtgctttt ctgtgtgttg cagcagcatg 90
PL 208 588 B1 <210> 51 <211> 90 <212> DNA <213> małpi adenowirus typu 25 <220>
<221> cecha_dodatkowa <223> proksymalna sekwencja poprzedzająca pIX z sAd25 <220> ’ <221> kodon stop E1B 55K <222> (1)..(3) <220>
<221> kodon start pIX <222> (88)..(90) <400> 51 tagagtgagt agtgttctgg ggcgggggag gacctgcatg agggccagaa taactgaaat 60 ctgtgctttt ctgtgtgttg cagcagcatg 90 <210> 52 <211> 89 <212> DNA <213> Adenowirus typu 35 <220>
<221> cecha_dodatkowa <223> proksymalna sekwencja poprzedzająca pIX z Ad35 <220>
<221> kodon stop E1B 55K <222> (1)..(3) <220>
<221> kodon start pIX <222> (87)..(39) <400> 52 taaggtgagt attgggaaaa ctttggggtg ggattttcag atggacagat tgagtaaaaa 60 tttgtttttt ctgtcttgca gctgacatg 89 <210> 53 <211> 89 <212> DNA <213> Adenowirus typu 11 <220>
<221> cecha_dodatkowa <223> proksymalna sekwencja poprzedzająca pIX z Adll <220>
<221> kodon stop E1B 55K <222> (1)..(3) <220>
<221> kodon stop pIX
PL 208 588 B1 <222> (87)..(89) <400> 53 taaggtgagt attgggaaaa ctttggggtg ggattttcag atggacagat tgagtaaaaa 60 tttgtttttt ctgtcttgca gctgtcatg 89 <210> 54 <211> 100 <212> DNA <213> Adenowirus typu 7 <220>
<221> cecna_dodatkowa <223> proksymalna sekwencja poprzedzająca pIX z Ad7 <220>
<221> kodon stop E1B 55K <222> (1)..(3) <220>
<221> kodon start pIX <222> (98)..(100) <400> 54 taaagtaagt agtgggggca aaatgtggat ggggactttc aggttggtaa ggtggacaaa 60 ttgggtaaat tttgttaatt tctgtcttgc agctgccatg 100 <210> 55 <211> 2430 <212> DNA <213> Adenowirus typu 35 <220>
<221> cecha_dodatkowa <223> region ElB-ρΙΧ z Ad35 <400> 55 aataaaaata tgttaactgt tcactggttt ttattgcttt ttgggcgggg actcaggtat 60 ataagtagaa gcagacctgt gtggttagct cataggagct ggctttcatc catggaggtt 120 tgggccattt tggaagacct taggaagact aggcaactgt tagagagcgc ttcggacgga 180 gtctccggtt tttggagatt ctggttcgct agtgaattag ctagggtagt ttttaggata 240
PL 208 588 B1
| aaacaggact | ataaacaaga | atttgaaaag | ttgttggtag | attgcccagg | actttttgaa | 300 |
| gctcttaatt | tgggccatca | ggttcacttt | aaagaaaaag | ttttatcagt | tttagacttt | 360 |
| tcaaceccag | gtagaactgc | tgctgctgtg | gcttttctta | cttttatatt | agataaatgg | 420 |
| atcccgcaga | ctcatttcag | caggggatac | gttttggatt | tcatagccac | agcattgtgg | 480 |
| agaacatgga | aggttcgcaa | gatgaggaca | atcttaggtt | actggccagt | gcagcctttg | 540 |
| ggtgtagcgg | gaatcctgag | gcatccaccg | gtcatgccag | cggttctgga | ggaggaacag | 600 |
| caagaggaca | acccgagagc | cggcctggac | cctccagtgg | aggaggcgga | gtagctgact | 660 |
| tgtctcctga | actgcaacgg | gtgcttactg | gatctacgtc | cactggacgg | gataggggcg | 720 |
| ttaagaggga | gagggcatcc | agtggtactg | atgctagatc | tgagttggct | ttaagtttaa | 780 |
| tgagtcgcag | acgtcctgaa | accatttggt | ggcatgaggt | tcagaaagag | ggaagggatg | 840 |
| aagtttctgt | attgcaggag | aaatattcac | tggaacaggt | gaaaacatgt | tggttggagc | 900 |
| cagaggatga | ttgggcggtg | gccattaaaa | attatgccaa | gatagctttg | aggcctgata | 960 |
| aacagtataa | gatcagtaga | cggattaata | tccggaatgc | ttgttacata | tctggaaatg | 1020 |
| gggctgaggt | ggtaatagat | actcaagaca | agacagttat | tagatgctgc | atgatggata | 1080 |
| tgtggcctgg | agtagtcggt | atggaagcag | tcacttttgt | aaatgttaag | tttaggggag | 1140 |
| atggttataa | tggaatagtg | tttatggcca | ataccaaact | tatattgcat | ggttgtagct | 1200 |
| tttttggttt | caacaatacc | tgtgtagatg | cctggggaca | ggttagtgta | cgggggtgta | 1260 |
| gtttctatgc | gtgttggatt | gccacagctg | gcagaaccaa | gagtcaattg | tctctgaaga | 1320 |
| aatgcatatt | ccaaagatgt | aacctgggca | ttctgaatga | aggcgaagca | agggtccgtc | 1380 |
| actgcgcttc | tacagatact | ggatgtttta | ttttaattaa | gggaaatgcc | agcgtaaagc | 1440 |
| ataacatgat | ttgtggtgct | tccgatgaga | ggccttatca | aatgctcact | tgtgctggtg | 1500 |
| ggcattgtaa | tatgctggct | actgtgcata | ttgtttccca | tcaacgcaaa | aaatggcctg | 1560 |
| tttttgatca | caatgtgttg | accaagtgca | ccatgcatgc | aggtgggcgt | agaggaatgt | 1620 |
| ttatgcctta | ccagtgtaac | atgaatcatg | tgaaagtgtt | gttggaacca | gatgcctttt | 1680 |
| ccagaatgag | cctaacagga | atctttgaca | tgaacacgca | aatctggaag | atcctgaggt | 1740 |
| atgatgatac | gagatcgagg | gtgcgcgcat | gcgaatgcgg | aggcaagcat | gccaggttcc | 1800 |
| agccggtgtg | tgtagatgtg | accgaagatc | tcagaccgga | tcatttggtt | attgcccgca | 1860 |
| ctggagcaga | gttcggatcc | agtggagaag | aaactgacta | aggtgagtat | tgggaaaact | 1920 |
| ttggggtggg | attttcagat | ggacagattg | agtaaaaatt | tgttttttct | gtcttgcagc | 1980 |
| tgacatgagt | ggaaatgctt | cttttaaggg | gggagtcttc | agcccttatc | tgacagggcg | 2040 |
| tctcccatcc | tgggcaggag | ttcgtcagaa | tgttatggga | tctactgtgg | atggaagacc | 2100 |
| cgttcaaccc | gccaattctt | caacgctgac | ctatgctact | ttaagttctt | cacctttgga | 2160 |
| cgcagctgca | gccgctgccg | ccgcctctgt | cgccgctaac | actgtgcttg | gaatgggtta | 2220 |
| ctatggaagc | atcgtggcta | attccacttc | ctctaataac | ccttctacac | tgactcagga | 2280 |
PL 208 588 B1 caagttactt gtccttttgg cccagctgga ggctttgacc caacgtctgg gtgaactttc tcagcaggtg gccgagttgc gagtacaaac tgagtctgct gtcggcacgg caaagtctaa ataaaaaaaa ttccagaatc aatgaataaa
| <210> | 56 |
| <211> | 2429 |
| <212> | DNA |
| <213> | Adenowirus typu 11 |
| <220> | |
| <221> | cecha dodatkowa |
| <223> | region ElB-ρΙΧ z Adll |
| <400> | 56 |
aataaaaata tgttaactgt tcactggttt ttattgcttt ttgggcgggg actcaggtat nu ataagtagaa gcagacctgt gtggttagct cataggagct ggctttcatc catggaggtt 120 tgggccattt tggaagacct taggaagact aggcaactgt tagagaacgc ttcggacgga 180 gtctccggtt tttggagatt ctggttcgct agtgaattag ctagggtagt ttttaggata 240 aaacaggact ataaacaaga atttgaaaag ttgttggtag attgcccagg actttttgaa 300 gctcttaatt tgggccatca ggttcacttt aaagaaaaag ttttatcagt tttagacttt 360 tcaaccccag gtagaactgc tgctgctgtg gcttttctta cttttatatt agataaatgg 420 atcccgcaga ctcatttcag caggggatac gttttggatt tcatagccac agcattgtgg 480 agaacatgga aggttcgcaa gatgaggaca atcttaggtt actggccagt gcagcctttg S40 ggtgtagcgg gaatcctgag gcatccaccg gtcatgccag cggttctgga ggaggaacag 600 caagaggaca acccgagagc cggcctggac cctccagtgg aggaggcgga gtagctgact 660 tgtctcctga actgcaacgg gtgcttactg gatctacgtc cactggacgg gataggggcg 720 ttaagaggga gagggcatct agtggtactg atgctagatc tgagttggct ttaagtttaa 780 tgagtcgcag acgtcctgaa accatttggt ggcatgaggt tcagaaagag ggaagggatg 840 aagtttctgt attgcaggag aaatattcac tggaacaggt gaaaacatgt tggttggagc 900 ctgaggatga ttgggaggtg gccattaaaa attatgccaa gatagctttg aggcctgata 960 aacagtataa gattactaga cggattaata tccggaatgc ttgttacata tctggaaatg 1020 gggctgaggt ggtaatagat actcaagaca aggcagttat tagatgctgc atgatggata 1080 tgtggcctgg ggtagtcggt atggaagcag taacttttgt aaatgttaag tttaggggag 1140 atggttataa tggaatagtg tttatggcca ataccaaact tatattgcat ggttgtagct 1200 tttttggttt caacaatacc tgtgtagatg cctggggaca ggttagtgta cggggatgta 1260 gtttctatgc gtgttggatt gccacagctg gcagaaccaa gagtcaattg tctctgaaga 1320 aatgcatatt tcaaagatgt aacctgggca ttctgaatga aggcgaagca agggtccgcc 1380 actgcgcttc tacagatact ggatgtttta ttttgattaa gggaaatgcc agcgtaaagc 1440 ataacatgat ttgcggtgct tccgatgaga ggccttatca aatgctcact tgtgctggtg 1500
PL 208 588 B1
| ggcattgtaa | tatgctggct | actgtgcata | ttgtttccca | tcaacgcaaa | aaatggcctg | 1560 |
| tttttgatca | caatgtgatg | acgaagtgta | ccatgcatgc | aggtgggcgt | agaggaatgt | 1620 |
| ttatgcctta | ccagtgtaac | atgaatcatg | tgaaagtgtt | gttggaacca | gatgcctttt | 1680 |
| ccagaatgag | cctaacagga | atttttgaca | tgaacatgca | aatctggaag | atcctgaggr | 1740 |
| atgatgatac | gagatcgagg | gtacgcgcat | gcgaatgcgg | aggcaagcat | gccaggttcc | 1800 |
| agccggtgtg | tgtagatgtg | actgaagatc | tcagaccgga | tcatttggtt | attgcccgca | 1860 |
| ctggagcaga | gttcggatcc | agtggagaag | aaactgacta | aggtgagtat | tgggaaaact | 1920 |
| ttggggtggg | attttcagat | ggacagattg | agtaaaaatt | tgttttttct | gtcttgcagc | 1980 |
| tgtcatgagt | ggaaacgctt | cttttaaggg | gggagtcttc | agcccttatc | tgacagggcg | 2040 |
| tctcccatcc | tgggcaggag | ttcgtcagaa | tgttatggga | tctactgtgg | atggaagacc | 2100 |
| cgtccaaccc | gccaattctt | caacgctgac | ctatgctact | ttaagttctt | cacctttgga | 2160 |
| cgcagctgca | gctgccgccg | ccgcttctgt | tgccgctaac | actgtgcttg | gaatgggtta | 2220 |
| ctatggaagc | atcatggcta | attccacttc | ctctaataac | ccttctaccc | tgactcagga | 2280 |
| caagttactt | gtccttttgg | cccagctgga | ggctttgacc | caacgtctgg | gtgaactttc | 2340 |
| tcagcaggtg | gtcgagttgc | gagtacaaac | tgagtctgct | gtcggcacgg | caaagtctaa | 2400 |
| ataaaaaaat | cccagaatca | atgaataaa | 2429 |
| <210> | 57 |
| <211> | 2426 |
| <212> | DNA |
| <213> | Adenowirus typu 7 |
| <220> | |
| <221> | cecha dodatkowa |
| <223> | region ElB-ρΙΧ z |
| <400> | 57 |
aataaaatta tgtcagctgc tgagtgtttt attacttctt gggtggggtc ttggatatat 60 aagtaggagc agatctgtgt ggttagctca cagcaacttg ctgccatcca tggaggtttg 120 ggctatcttg gaagacctca gacagactag gctactacta gaaaacgcct cggacggagt 180 ctctggcctt tggagattct ggttcggtgg tgatctagct aggctagtgt ttaggataaa 240 acaggactac agggaagaat ttgaaaagtt attggacgac attccaggac tttttgaagc 300 tcttaacttg ggccatcagg ctcattttaa ggagaaggtt ttatcagttt tagatttttc 360 tactcctggt agaactgctg ctgctgtagc ttttcttact tttatattgg ataaatggat 420 ccgccaaact cacttcagca agggatacgt tttggatttc atagćagcag ctttgtggag 480 aacatggaag gctcgcagga tgaggacaat cttagattac tggccagtgc agcctctggg 540 agtagcaggg atactgagac acccaccgac catgccagcg gttctgcagg aggagcagca 600 ggaggacaat ccgagagccg gcctggaccc tccggtggag gagtagctga cctgtttcct 660 gaactgcgac gggtgcttac taggtctacg accagtggac agaacagggg aattaagagg 720
PL 208 588 B1
| gagaggaatc | ctagtgggaa | taattcaaga | accgagttgg | ctttaagttt | aatgagccgc | 780 |
| aggcgtcctg | aaactgtttg | gtggcatgag | gttcagagcg | aaggcaggga | tgaagtttca | 840 |
| atattgcagg | agaaatattc | actagaacaa | cttaagacct | gttggttgga | acctgaggat | 900 |
| gattgggagg | tggccattag | gaattatgct | aagatatctc | tgaggcctga | taaacaatat | 960 |
| agaattacta | agaagattaa | tattagaaat | gcatgctaca | tatcagggaa | tggggcagag | 1020 |
| gttataatag | atacacaaga | taaagcagct | tttagatgtt | gtatgatggg | tatgtggcca | 1080 |
| ggggttgtcg | gcatggaagc | aataacactt | atgaatatta | ggtttagagg | ggatgggtat | 1140 |
| aatggcattg | tatttatggc | taacactaag | ctgattctac | atggttgtag | cttttttggg | 1200 |
| tttaataata | cgtgtgtaga | agcttggggg | caagttagtg | tgaggggttg | tagtttttat | 1260 |
| gcatgctgga | ttgcaacatc | aggtagggtg | aagagtcagt | tgtctgtgaa | gaaatgcatg | 1320 |
| tttgagagat | gtaatcttgg | catactgaat | gaaggtgaag | caagggtccg | ccactgcgca | 1380 |
| gctacagaaa | ctgcctgctt | cattctaata | aagggaaatg | ccagtgtgaa | gcataatatg | 1440 |
| atctgrggac | attcggatga | gaggccttat | cagatgctaa | cctgcgctgg | tggacattgc | 1500 |
| aatattcttg | ctaccgtgca | tatcgtttca | catgcacgca | agaaatggcc | tgtatttgaa | 1560 |
| cataatgtga | ttaccaagtg | caccatgcat | ataggtggtc | gcaggggaat | gtttatgcct | 1620 |
| taccagtgta | acatgaatca | tgtgaaggta | atgttggaac | cagatgcctt | ttccagagtg | 1680 |
| agcgtaacag | gaatctttga | tatgaatatt | caactatgga | agatcctgag | atatgatgac | 1740 |
| actaaaccaa | gggtgcgcgc | atgcgaatgc | ggaggcaagc | atgctagatt | ccagccggtg | 1800 |
| tgcgtggatg | tgactgaaga | cctgaggccc | gatcatttgg | tgcttgcctg | cactggagcg | 1860 |
| gagttcggtt | ctagtggtga | agaaactgac | taaagtaagt | agtgggggca | aaatgtggat | 1920 |
| ggggactttc | aggttggtaa | ggtggacaaa | ttgggtaaat | tttgttaatt | tctgtcttgc | 1980 |
| ągctgccatg | agtggaagcg | cttcttttga | ggggggagta | tttagccctt | atctgacggg | 2040 |
| caggctccca | ccatgggcag | gagttcgtca | gaatgtcatg | ggatccactg | tggatgggag | 2100 |
| acccgtccag | cccgccaatt | cctcaacgct | gacctatgcc | actttgagtt | cgtcaccatt | 2160 |
| ggatgcagct | gcagccgccg | ccgctactgc | tgccgccaac | accatccttg | gaatgggcta | 2220 |
| ttacggaagc | attgttgcca | attccagttc | ctctaataat | ccttcaaccc | cggctgagga | 2280 |
| caagctactt | gttctcttgg | ctcagctcga | ggccttaacc | caacgcttag | gcgaactgtc | 2340 |
| taagcaggtg | gcccagttgc | gtgagcaaac | tgagtctgct | gttgccacag | caaagtctaa | 2400 |
| ataaagatct | caaatcaata | aataaa | 2426 |
| <210 | 58 |
| <210 | 240 |
| <212> | DNA |
| <213> | Adenowirus typu 11 |
| <220 | |
| <221> | cecha dodatkowa |
PL 208 588 B1 <223> sekwencja cDNA pIX z Adll <400> 53 cgactggagc acgaggacac tgacatggac tgaaggagta gaaatcattt ggttattgcc 60 cgcactggag cagagttcgg atccagtgga gaagaaactg actaagctgt catgagtgga 120 aacgcttctt ttaagggggg agtcttcagc ccttatctga cagggcgtct cccatcctgg 180 gcaggagttc gtcagaatgt tatgggatct actgtggatg gaacacccgt tcaacccgcc 240 <210> 59 <211> 227 <212> DNA <213> Adenowirus typu 35 <220>
<221> cecha_dodatkowa <223> sekwencja cDNA pIX z Ad35 <400> 59 ggacactgac atggactgaa ggagtagaaa atcatttggt tattgcccgc actggagcag 60 agttcggatc cagtggagaa gaaactgact aagctgacat gagtggaaat gcttctttta 120 aggggggagt cttcagccct tatctgacag ggcgtctccc atcctgggca ggagttcgtc 180 agaatgttat gggatctact gtggatggaa gacccgttca acccgcc 227 <210> 60 <211> 289 <212> DNA <213> Adenowirus typu 35 <220>
<221> cecha_dodatkowa <223> sekwencja nt 3339-3628 z dzikiego typu Ad35 <220>
<221> Intron <222> (62)..(138) <220>
<221> kodon start pIX <222> (146) .. (148) <400> 60 atcatttggt tattgcccgc actggagcag agttcggatc cagtggagaa gaaactgact 60 aaggtgagta ttgggaaaac tttggggtgg gattttcaga tggacagatt gagtaaaaat 120 ttgttttttc tgtcttgcag ctgacatgag tggaaatgct tcttttaagg ggggagtctt 180 cagcccttat ctgacagggc gtctcccatc ctgggcagga gttcgtcaga atgttatggg 240 atctactgtg gatggaagac ccgttcaacc cgccaattct tcaacgctg 289
Claims (26)
- Zastrzeżenia patentowe1. Rekombinowany adenowirus z podgrupy B z delecją w regionie E1, przy czym ten adenowirus nie koduje funkcjonalnego produktu genu E1B 55K i przy czym ten adenowirus zawiera:- sekwencję adenowirusową zlokalizowaną pomiędzy kodonem stop sekwencji kodującej E1B 55K a kodonem start sekwencji kodującej pIX; i- sekwencję kodującą funkcjonalne pIX pod kontrolą sekwencji o aktywności promotorowej, przy czym ta sekwencja o aktywności promotorowej składa się z do 0,7 kb sekwencji adenowirusowych, które znajdują się bezpośrednio powyżej kodonu start pIX, i przy czym ta sekwencja zawiera minimalną sekwencję wymaganą dla aktywności promotorowej, która występuje w obrębie ostatnich 166 pz sekwencji kodującej E1B 55K.
- 2. Adenowirus według zastrz. 1, znamienny tym, że wspomniana sekwencja o aktywności promotorowej zawiera do 600 nukleotydów sekwencji adenowirusowych, które znajdują się bezpośrednio powyżej sekwencji kodującej pIX.
- 3. Adenowirus według zastrz. 1, znamienny tym, że wspomniana sekwencja o aktywności promotorowej zawiera do 300 nukleotydów sekwencji adenowirusowych, które znajdują się bezpośrednio powyżej sekwencji kodującej pIX.
- 4. Adenowirus według zastrz. 1, znamienny tym, że wspomniana sekwencja o aktywności promotorowej zawiera do 250 nukleotydów sekwencji adenowirusowych, które znajdują się bezpośrednio powyżej sekwencji kodującej pIX.
- 5. Adenowirus według jednego z zastrz. 1 - 4, znamienny tym, że wspomniany adenowirus pochodzi z adenowirusa serotypu 35 lub adenowirusa serotypu 11.
- 6. Adenowirus według jednego z zastrz. 1 - 5, znamienny tym, że zawiera ponadto sekwencję kodującą funkcjonalne białko E4-orf6 pochodzące z adenowirusa z podgrupy C.
- 7. Wyizolowany kwas nukleinowy, znamienny tym, że po wprowadzeniu do odpowiedniej komórki pakującej stanowi genom rekombinowanego adenowirusa opisanego w jednym z zastrz. 2-6.
- 8. Komórka pakująca rekombinowany adenowirus, znamienna tym, że zawiera rekombinowanego adenowirusa jak określono w jednym z zastrz. 1-6.
- 9. Rekombinowany adenowirus z podgrupy B zawierający sekwencję kodującą funkcjonalne pIX i delecję w rejonie E1, przy czym sekwencja kodująca pIX znajduje się pod kontrolą promotora heterologicznego w celu kierowania ekspresją w danej komórce pakującej.
- 10. Adenowirus według zastrz. 9, znamienny tym, że heterologiczny promotor zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z nieendogennego, proksymalnego promotora pIX, promotora wirusowego, promotora komórkowego, promotora syntetycznego i promotora hybrydowego.
- 11. Adenowirus według zastrz. 10, znamienny tym, że wspomniany heterologiczny promotor wybrany jest z grupy składającej się z sekwencji, które przynajmniej w części pochodzą z proksymalnego promotora pIX z Ad5, promotora wirusa mięsaka Rousa i adenowirusowego promotora E1B.
- 12. Adenowirus według jednego z zastrz. 9 - 11, znamienny tym, że wspomniany adenowirus pochodzi z adenowirusa serotypu 35 lub adenowirusa serotypu 11.
- 13. Adenowirus według jednego z zastrz. 9 - 12, znamienny tym, że zawiera ponadto sekwencję kodującą funkcjonalne białko E4-orf6 pochodzące z adenowirusa z podgrupy C.
- 14. Wyizolowany kwas nukleinowy, znamienny tym, że po wprowadzeniu do odpowiedniej komórki pakującej stanowi genom rekombinowanego adenowirusa opisanego w jednym z zastrz. 9-13.
- 15. Komórka pakująca rekombinowany adenowirus, znamienna tym, że zawiera rekombinowanego adenowirusa jak określono w jednym z zastrz. 9-13.
- 16. Sposób zwiększania stabilności i/lub pojemności upakowania rekombinowanego adenowirusa z podgrupy B z delecją w regionie E1, obejmujący etapy, w których poddaje się ekspresji elementy niezbędne do wytwarzania i składania wspomnianego rekombinowanego adenowirusa do cząstek wirusa w komórce pakującej, znamienny tym, że następujące elementy utrzymuje się lub wprowadza ponownie do wspomnianego adenowirusa:- sekwencję adenowirusową zlokalizowaną pomiędzy kodonem stop sekwencji kodującej E1B 55K a kodonem start sekwencji kodującej pIX; i- sekwencję kodującą funkcjonalne pIX pod kontrolą sekwencji o aktywności promotorowej, przy czym ta sekwencja o aktywności promotorowej składa się z do 0,7 kb sekwencji adenowirusowych, które znajdują się bezpośrednio powyżej kodonu start pIX, i przy czym ta sekwencja zawiera minimalPL 208 588 B1 ną sekwencję wymaganą dla aktywności promotorowej, która występuje w obrębie ostatnich 166 pz sekwencji kodującej E1B 55K.
- 17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że wspomniana sekwencja o aktywności promotorowej zawiera do 600 nukleotydów sekwencji adenowirusowych bezpośrednio powyżej sekwencji kodującej pIX.
- 18. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że wspomniana sekwencja o aktywności promotorowej zawiera do 300 nukleotydów sekwencji adenowirusowych bezpośrednio powyżej sekwencji kodującej pIX.
- 19. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że wspomniana sekwencja o aktywności promotorowej zawiera do 250 nukleotydów sekwencji adenowirusowych bezpośrednio powyżej sekwencji kodującej pIX.
- 20. Sposób według jednego z zastrz. 16 do 19, znamienny tym, że wspomniany rekombinowany adenowirus pochodzi z adenowirusa serotypu 35 lub adenowirusa serotypu 11.
- 21. Sposób według zastrz. 16 albo 20, znamienny tym, że wspomniany promotor heterologiczny wybrany jest z grupy składającej się z nieendogennego, proksymalnego promotora pIX, promotora wirusowego, promotora komórkowego, promotora syntetycznego i promotora hybrydowego.
- 22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że wspomniany heterologiczny promotor wybrany jest z grupy składającej się z sekwencji, które w przynajmniej części pochodzą z proksymalnego promotora pIX z Ad5, promotora wirusa mięsaka Rousa i adenowirusowego promotora E1B.
- 23. Sposób zwiększania stabilności i/lub pojemności upakowania rekombinowanego adenowirusa z podgrupy B z delecją w regionie E1, obejmujący etap ekspresji elementów niezbędnych do wytwarzania i składania wspomnianego rekombinowanego adenowirusa do cząstek wirusa w komórce pakującej, w którym sekwencje kodujące pIX znajdują się pod kontrolą promotora heterologicznego.
- 24. Sposób według jednego z zastrz. 23, znamienny tym, że wspomniany rekombinowany adenowirus pochodzi z adenowirusa serotypu 35 lub adenowirusa serotypu 11.
- 25. Sposób według zastrz. 23 albo 24, znamienny tym, że wspomniany promotor heterologiczny wybrany jest z grupy składającej się z nie-endogennego, proksymalnego promotora pIX, promotora wirusowego, promotora komórkowego, promotora syntetycznego i promotora hybrydowego.
- 26. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że wspomniany heterologiczny promotor wybrany jest z grupy składającej się z sekwencji, które w przynajmniej części pochodzą z proksymalnego promotora pIX z Ad5, promotora wirusa mięsaka Rousa i adenowirusowego promotora E1B.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL0200281 | 2002-04-25 | ||
| NL0200656 | 2002-10-15 | ||
| EP02102631 | 2002-11-25 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL373337A1 PL373337A1 (pl) | 2005-08-22 |
| PL208588B1 true PL208588B1 (pl) | 2011-05-31 |
Family
ID=34068720
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL373337A PL208588B1 (pl) | 2002-04-25 | 2003-04-24 | Rekombinowane adenowirusy, wyizolowane kwasy nukleinowe, komórki pakujące oraz sposoby zwiększania stabilności i/lub pojemności upakowania rekombinowanego adenowirusa |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7285265B2 (pl) |
| EP (1) | EP1497440B1 (pl) |
| JP (1) | JP4495588B2 (pl) |
| KR (1) | KR101006594B1 (pl) |
| CN (1) | CN100374574C (pl) |
| AT (1) | ATE405663T1 (pl) |
| AU (1) | AU2003271738C1 (pl) |
| CA (1) | CA2478508C (pl) |
| DE (1) | DE60323080D1 (pl) |
| DK (1) | DK1497440T3 (pl) |
| ES (1) | ES2310247T3 (pl) |
| IL (1) | IL164802A0 (pl) |
| NO (1) | NO334299B1 (pl) |
| NZ (1) | NZ534865A (pl) |
| PL (1) | PL208588B1 (pl) |
| SI (1) | SI1497440T1 (pl) |
| WO (1) | WO2004001032A2 (pl) |
Families Citing this family (73)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE445705T1 (de) | 1995-06-15 | 2009-10-15 | Crucell Holland Bv | Verpackungssysteme für humane rekombinante adenoviren zur gentherapie |
| US6929946B1 (en) * | 1998-11-20 | 2005-08-16 | Crucell Holland B.V. | Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for smooth muscle cells, and/or endothelial cells |
| US20050232900A1 (en) * | 1999-05-18 | 2005-10-20 | Crucell Holland B.V. | Serotype of adenovirus and uses thereof |
| US6913922B1 (en) * | 1999-05-18 | 2005-07-05 | Crucell Holland B.V. | Serotype of adenovirus and uses thereof |
| US6492169B1 (en) | 1999-05-18 | 2002-12-10 | Crucell Holland, B.V. | Complementing cell lines |
| PT1497438E (pt) * | 2002-04-25 | 2010-02-04 | Crucell Holland Bv | Meios e métodos para a produção de vectores de adenovírus |
| US20060099178A1 (en) | 2002-05-27 | 2006-05-11 | Holm Per S | Novel use of adenoviruses and nucleic acids coding therefor |
| CA2495546A1 (en) * | 2002-08-22 | 2004-03-04 | Merck & Co., Inc. | Methods for propagating adenovirus and virus produced thereby |
| WO2005010149A2 (en) * | 2003-07-18 | 2005-02-03 | Onyx Pharmaceuticals, Inc. | Subgroup b adenoviral vectors for treating disease |
| JP2007511211A (ja) | 2003-11-14 | 2007-05-10 | ホルム，ペル・ゾンネ | アデノウイルスおよびそれをコードしている核酸の新たな使用 |
| CN1922308A (zh) | 2004-02-23 | 2007-02-28 | 克鲁塞尔荷兰公司 | 病毒纯化方法 |
| EA012037B1 (ru) | 2004-11-16 | 2009-06-30 | Круселл Холланд Б.В. | Поливалентные вакцины, содержащие рекомбинантные вирусные векторы |
| EP1831382B1 (en) | 2004-12-31 | 2023-01-18 | Per Sonne Holm | Method for reversing multiple resistance in animal cells |
| US20090232800A1 (en) * | 2004-12-31 | 2009-09-17 | Per Sonne Holm | E1-minus adenoviruses and use thereof |
| CA2602944C (en) | 2005-04-11 | 2015-08-11 | Crucell Holland B.V. | Virus purification using ultrafiltration |
| CN101248186A (zh) * | 2005-05-23 | 2008-08-20 | 瓦克辛公司 | 不含腺病毒的重组腺病毒载体的快速生产 |
| EP1998804B1 (en) * | 2006-03-27 | 2014-04-16 | Crucell Holland B.V. | Compositions comprising a recombinant adenovirus and an adjuvant |
| CN101631454A (zh) | 2006-12-08 | 2010-01-20 | 衣阿华州立大学研究基金公司 | 参与硝酸盐吸收和代谢的植物基因 |
| WO2010060719A1 (en) | 2008-11-03 | 2010-06-03 | Crucell Holland B.V. | Method for the production of adenoviral vectors |
| HRP20181776T1 (hr) | 2008-11-18 | 2019-02-08 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Antivirusna cjepiva sa poboljšanom staničnom imunogenosti |
| KR20120052352A (ko) | 2009-08-07 | 2012-05-23 | 트랜스진 에스.에이. | Ｈｂｖ 감염을 치료하는 조성물 |
| EP2618838A1 (en) | 2010-09-20 | 2013-07-31 | Crucell Holland B.V. | Therapeutic vaccination against active tuberculosis |
| US9168292B2 (en) | 2010-09-27 | 2015-10-27 | Crucell Holland B.V. | Heterologous prime boost vaccination regimen against malaria |
| WO2012082918A1 (en) | 2010-12-14 | 2012-06-21 | The Goverment Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Adenovirus serotype 26 and serotype 35 filovirus vaccines |
| MY170927A (en) | 2011-11-28 | 2019-09-19 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Influenza virus vaccines and uses thereof |
| US8932607B2 (en) | 2012-03-12 | 2015-01-13 | Crucell Holland B.V. | Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends |
| CA2864956C (en) | 2012-03-12 | 2021-11-09 | Crucell Holland B.V. | Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends |
| US9119813B2 (en) | 2012-03-22 | 2015-09-01 | Crucell Holland B.V. | Vaccine against RSV |
| AP2014007993A0 (en) | 2012-03-22 | 2014-10-31 | Crucell Holland Bv | Vaccine against RSV |
| US10240128B2 (en) * | 2012-07-04 | 2019-03-26 | Sirion Biotech Gmbh | Means and methods to increase adenovirus production |
| WO2014078688A2 (en) * | 2012-11-16 | 2014-05-22 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Recombinant adenoviruses and use thereof |
| CN110590916A (zh) | 2013-04-25 | 2019-12-20 | 扬森疫苗与预防公司 | 稳定化的可溶性融合前rsv f多肽 |
| BR112017003891A2 (pt) | 2014-09-03 | 2017-12-26 | Bavarian Nordic As | métodos e composições para induzir imunidade protetora contra infecção por filovírus |
| KR20190062617A (ko) | 2014-09-03 | 2019-06-05 | 버베리안 노딕 에이/에스 | 면역 반응을 증대시키기 위한 방법 및 조성물 |
| PT3197489T (pt) | 2014-09-26 | 2021-04-30 | Beth Israel Deaconess Medical Ct Inc | Métodos e composições para induzir a imunidade protetora contra a infeção pelo vírus da imunodeficiência humana |
| TWI710635B (zh) * | 2014-10-09 | 2020-11-21 | 美商珍維克公司 | 編碼人類無調同源物-1(hath1)之腺病毒載體 |
| SI3283634T1 (sl) | 2015-04-14 | 2019-08-30 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Rekombinantni adenovirus, ki izraža dva transgena z dvosmernim promotorjem |
| BE1023877B1 (fr) | 2015-05-21 | 2017-09-01 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Procédés et compositions pour l’induction d’une immunité protectrice contre une maladie et/ou une infection à filovirus |
| US10457708B2 (en) | 2015-07-07 | 2019-10-29 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stabilized soluble pre-fusion RSV F polypeptides |
| JP7189014B2 (ja) | 2015-07-07 | 2022-12-13 | ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー | Ｒｓｖに対するワクチン |
| CN108368157B (zh) | 2015-12-15 | 2022-04-15 | 扬森疫苗与预防公司 | 人类免疫缺陷病毒抗原、载体、组合物、及其使用方法 |
| KR20220041966A (ko) | 2016-04-05 | 2022-04-01 | 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. | 안정화된 용해성 융합-전 rsv f 단백질 |
| BR112018070323A2 (pt) | 2016-04-05 | 2019-01-29 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | vacina contra rsv |
| WO2017194655A1 (en) | 2016-05-12 | 2017-11-16 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Potent and balanced bidirectional promoter |
| IL264119B2 (en) | 2016-05-30 | 2023-04-01 | Janssen Vaccines Prevention B V | f proteins of rsv are stabilized before fusion |
| MX392862B (es) | 2016-06-16 | 2025-03-24 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Formulación de vacuna contra el vih. |
| EP3472327B1 (en) | 2016-06-20 | 2020-08-19 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Potent and balanced bidirectional promoter |
| EP3484506A1 (en) | 2016-07-14 | 2019-05-22 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Hpv vaccines |
| US10925955B2 (en) | 2016-07-15 | 2021-02-23 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Methods and compositions for inducing protective immunity against a Marburg virus infection |
| EP3484507A1 (en) | 2016-07-15 | 2019-05-22 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Methods and compositions for inducing protective immunity against a marburg virus infection |
| EP3526236B1 (en) | 2016-10-17 | 2025-12-10 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Signature-based human immunodeficiency virus (hiv) envelope (env) trimer vaccines and methods of using the same |
| CN110268061B (zh) | 2017-02-09 | 2024-07-16 | 扬森疫苗与预防公司 | 用于表达异源基因的有效的短启动子 |
| WO2018185732A1 (en) | 2017-04-06 | 2018-10-11 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Mva-bn and ad26.zebov or ad26.filo prime-boost regimen |
| MX2019013259A (es) | 2017-05-08 | 2020-01-13 | Gritstone Oncology Inc | Vectores de neoantigeno de alfavirus. |
| WO2018210871A1 (en) | 2017-05-17 | 2018-11-22 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Methods and compositions for inducing protective immunity against rsv infection |
| AU2018267971A1 (en) | 2017-05-17 | 2019-11-07 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Methods and compositions for inducing protective immunity against RSV infection |
| WO2018229711A1 (en) | 2017-06-15 | 2018-12-20 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Poxvirus vectors encoding hiv antigens, and methods of use thereof |
| AU2018306614B2 (en) | 2017-07-28 | 2024-08-29 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Methods and compositions for heterologous repRNA immunizations |
| SG11202001458SA (en) | 2017-09-15 | 2020-03-30 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Method for the safe induction of immunity against rsv |
| BR112020007884A2 (pt) | 2017-11-20 | 2020-11-03 | Janssen Pharmaceuticals, Inc. | método de proporcionar uma administração segura de vetores adenovirais que codificam um antígeno de vírus zika |
| EP3723771A4 (en) | 2017-12-11 | 2022-04-06 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Recombinant adenoviruses and uses thereof |
| MX2020006471A (es) | 2017-12-19 | 2020-09-22 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Co | Metodos y composiciones para inducir una respuesta inmune contra el virus de hepatitis b (hbv). |
| EP4495597A3 (en) | 2018-01-04 | 2025-04-30 | Iconic Therapeutics LLC | Anti-tissue factor antibodies, antibody-drug conjugates, and related methods |
| BR112021000274A2 (pt) | 2018-07-20 | 2021-04-06 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Vetor adenoviral recombinante expressando antígeno de zika com produtividade melhorada |
| JOP20210106A1 (ar) | 2018-11-13 | 2023-01-30 | Janssen Vaccines And Prevention B V | بروتينات rsv f سابقة الاندماج مستقرة |
| KR20220008816A (ko) | 2019-05-15 | 2022-01-21 | 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. | 아데노바이러스 기반 백신을 사용한 호흡기 세포융합 바이러스 감염의 예방적 치료 |
| BR112021022087A2 (pt) | 2019-05-15 | 2021-12-28 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Coadministração de vacina sazonal contra influenza e vacina contra vírus respiratório sincicial à base de adenovírus |
| JP7457733B2 (ja) | 2019-05-30 | 2024-03-28 | グリットストーン バイオ インコーポレイテッド | 改変アデノウイルス |
| CN110714027A (zh) * | 2019-10-28 | 2020-01-21 | 嘉铭(固安)生物科技有限公司 | 一种表达质粒、用于包装二代腺病毒的细胞株及其应用 |
| IL299571A (en) | 2020-07-08 | 2023-02-01 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Co | Rna replicon vaccines against hbv |
| EP4192496A4 (en) | 2020-08-06 | 2025-01-01 | Gritstone bio, Inc. | MULTIEPITOP VACCINE CASSETTES |
| WO2023198815A1 (en) | 2022-04-14 | 2023-10-19 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Sequential administration of adenoviruses |
| CN117821405B (zh) * | 2023-11-24 | 2024-11-26 | 广州医科大学 | 基因嵌合型人腺病毒及其构建方法和应用 |
Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2705686B1 (fr) * | 1993-05-28 | 1995-08-18 | Transgene Sa | Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes. |
| IL116816A (en) * | 1995-01-20 | 2003-05-29 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Cell for the production of a defective recombinant adenovirus or an adeno-associated virus and the various uses thereof |
| US5770442A (en) | 1995-02-21 | 1998-06-23 | Cornell Research Foundation, Inc. | Chimeric adenoviral fiber protein and methods of using same |
| ATE445705T1 (de) * | 1995-06-15 | 2009-10-15 | Crucell Holland Bv | Verpackungssysteme für humane rekombinante adenoviren zur gentherapie |
| US5922315A (en) | 1997-01-24 | 1999-07-13 | Genetic Therapy, Inc. | Adenoviruses having altered hexon proteins |
| JP2002513290A (ja) | 1997-05-08 | 2002-05-08 | ジェネティック・セラピー・インコーポレテッド | 修飾されたファイバー蛋白質を有するアデノウイルスによる遺伝子移入 |
| US6670188B1 (en) | 1998-04-24 | 2003-12-30 | Crucell Holland B.V. | Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy |
| US20030017138A1 (en) | 1998-07-08 | 2003-01-23 | Menzo Havenga | Chimeric adenoviruses |
| DE60039683D1 (de) | 1999-03-04 | 2008-09-11 | Crucell Holland Bv | Verwendung eines adenovirusvektors zur transduktion von synovialen zellen |
| DK1818408T3 (da) * | 1999-05-17 | 2011-10-17 | Crucell Holland Bv | Rekombinant adenovirus af serotypen Ad11 |
| US6492169B1 (en) * | 1999-05-18 | 2002-12-10 | Crucell Holland, B.V. | Complementing cell lines |
| US6365394B1 (en) * | 1999-09-29 | 2002-04-02 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Cell lines and constructs useful in production of E1-deleted adenoviruses in absence of replication competent adenovirus |
| EP1103610A1 (en) | 1999-11-26 | 2001-05-30 | Introgene B.V. | Production of vaccines from immortalised mammalian cell lines |
| DE10045687B4 (de) * | 2000-09-15 | 2006-07-06 | MICROMUN Privates Institut für Mikrobiologische Forschung GmbH Biotechnikum Greifswald | Expressionskassetten und Adenovirusvektoren |
| WO2002024730A2 (en) | 2000-09-20 | 2002-03-28 | Crucell Holland B.V. | Transduction of dendritic cells using adenoviral vectors |
| WO2002053759A1 (en) | 2001-01-04 | 2002-07-11 | Wadell Goeran | Viral vector for gene therapy |
| PT1497438E (pt) | 2002-04-25 | 2010-02-04 | Crucell Holland Bv | Meios e métodos para a produção de vectores de adenovírus |
-
2003
- 2003-04-24 DK DK03753569T patent/DK1497440T3/da active
- 2003-04-24 NZ NZ534865A patent/NZ534865A/en not_active IP Right Cessation
- 2003-04-24 CN CNB038092085A patent/CN100374574C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2003-04-24 IL IL16480203A patent/IL164802A0/xx active IP Right Grant
- 2003-04-24 WO PCT/EP2003/050126 patent/WO2004001032A2/en not_active Ceased
- 2003-04-24 JP JP2004514868A patent/JP4495588B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2003-04-24 ES ES03753569T patent/ES2310247T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-04-24 AU AU2003271738A patent/AU2003271738C1/en not_active Ceased
- 2003-04-24 PL PL373337A patent/PL208588B1/pl unknown
- 2003-04-24 KR KR1020047016964A patent/KR101006594B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2003-04-24 DE DE60323080T patent/DE60323080D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-04-24 US US10/512,602 patent/US7285265B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-04-24 SI SI200331429T patent/SI1497440T1/sl unknown
- 2003-04-24 CA CA2478508A patent/CA2478508C/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-04-24 AT AT03753569T patent/ATE405663T1/de active
- 2003-04-24 EP EP03753569A patent/EP1497440B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2004
- 2004-11-24 NO NO20045131A patent/NO334299B1/no not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-09-05 US US11/899,572 patent/US8052967B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US8052967B2 (en) | 2011-11-08 |
| CN100374574C (zh) | 2008-03-12 |
| WO2004001032A2 (en) | 2003-12-31 |
| JP2005523730A (ja) | 2005-08-11 |
| US20080206837A1 (en) | 2008-08-28 |
| KR101006594B1 (ko) | 2011-01-07 |
| NZ534865A (en) | 2008-07-31 |
| AU2003271738B2 (en) | 2007-10-11 |
| US7285265B2 (en) | 2007-10-23 |
| CA2478508A1 (en) | 2003-12-31 |
| NO334299B1 (no) | 2014-02-03 |
| CN1650021A (zh) | 2005-08-03 |
| EP1497440B1 (en) | 2008-08-20 |
| JP4495588B2 (ja) | 2010-07-07 |
| CA2478508C (en) | 2013-07-02 |
| EP1497440A2 (en) | 2005-01-19 |
| ES2310247T3 (es) | 2009-01-01 |
| ATE405663T1 (de) | 2008-09-15 |
| DK1497440T3 (da) | 2008-12-01 |
| KR20040106365A (ko) | 2004-12-17 |
| AU2003271738C1 (en) | 2008-04-17 |
| HK1069185A1 (en) | 2005-05-13 |
| NO20045131L (no) | 2005-01-21 |
| US20050163753A1 (en) | 2005-07-28 |
| SI1497440T1 (sl) | 2009-02-28 |
| DE60323080D1 (de) | 2008-10-02 |
| PL373337A1 (pl) | 2005-08-22 |
| AU2003271738A1 (en) | 2004-01-06 |
| IL164802A0 (en) | 2005-12-18 |
| WO2004001032A3 (en) | 2004-04-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL208588B1 (pl) | Rekombinowane adenowirusy, wyizolowane kwasy nukleinowe, komórki pakujące oraz sposoby zwiększania stabilności i/lub pojemności upakowania rekombinowanego adenowirusa | |
| EP1497438B1 (en) | Means and methods for the production of adenovirus vectors | |
| AU763187B2 (en) | Generation of packaging system for human recombinant adenoviral vectors | |
| CZ182798A3 (cs) | Komplementární adenovirové vektorové systémy a buněčné linie | |
| US20050232900A1 (en) | Serotype of adenovirus and uses thereof | |
| Murakami et al. | An adenoviral vector expressing human adenovirus 5 and 3 fiber proteins for targeting heterogeneous cell populations | |
| US20050095231A1 (en) | Modified adenovirus containing a fiber replacement protein | |
| JP2002535986A (ja) | 遺伝子治療用の改良ヘルパーディペンデントベクター系 | |
| HK1069185B (en) | Stable adenoviral vectors and methods for propagation thereof | |
| HK1068371B (en) | Means and methods for the production of adenovirus vectors |