JP2005523730A - 安定なアデノウイルスベクターおよびその増殖方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、組み換えアデノウイルスベクター中でE1B 55K領域の少なくとも一部分を保持することにより、または異種プロモーターによってpIXを制御することにより、アデノウイルスのパッケージング細胞中でpIXの過剰発現させ、組み換えアデノウイルスの安定性および/またはパッケージング容量を増加させるための方法および手段を提供する。本発明は更に、相補細胞株上でそのようなアデノウイルスを産生するための方法と手段に関するものであり、ここで早期領域4読み枠6（E4-Orf6）をコードしている核酸が該アデノウイルス中に存在し、アデノウイルスベクターが相補細胞中で効率的に産生されるように、E4-Orf6遺伝子産物は相補細胞中のE1遺伝子産物の一つまたはそれ以上の産物と適合性を有する。
Description
本発明は医薬の分野に属し、より特異的には、本発明は組み換えアデノウイルスベクターおよびその使用方法に関するものである。
ヒトのアデノウイルスは、大きさが60-90nMの外皮に覆されていない正二十面体の微粒子である。現在までに51の抗原型（serotype）が同定され、それは血球凝集反応の性質と配列相同性に基づいて6つのサブグループに分けられている（Francki et al. 1991）。ゲノムは34から36kbの長さを有しており、逆方向末端反復（ITR）によって両末端がフランキングされている。ウイルス感染サイクルは早期相と後期相に分けられる。早期相（感染後6-8時間）においてはウイルスは被覆されておらず、早期の遺伝子領域E1-E4が転写的に活性となった後に、ゲノムは核に輸送される。
早期領域-1（E1）はE1AとE1Bと名付けられている2つの転写領域を含む。E1A領域は、宿主細胞サイクルの修飾と他のウイルス転写領域の活性化の修飾に関与した2つの主要蛋白質をコードする（Russell.2000の総説）。E1B領域は2つの主要蛋白質：19Kおよび55Kをコードし、それらはE1A蛋白質の活性により生じるアポトーシスの誘導を異なった経路を介して防ぐ（Rao et al. 1992; Yew and Berk 1992; Shenk 1996の総説）。加えて、E1B-55K蛋白質は選択的なウイルスmRNA輸送と宿主蛋白質発現のために後期相において必要とされる（Pilder et al. 1986）。早期領域-2（E2）もE1AとE1Bに分けられ、それは共に3つの蛋白質をコードし（DNA結合蛋白質、ウイルスポリメラーゼおよび末端前蛋白質）、それは全てウイルスゲノムの複製に関与している（Van der Vliet 1995の総説）。E3領域はインビトロにおける複製には必須でないが、ウイルス感染に対抗する宿主防御機構を覆すいくつかの蛋白質をコードしている（Hoewitz 2001の総説）。E4領域は、ウイルスmRNAスプライシングおよび輸送、宿主細胞mRNA輸送、ウイルスと細胞の転写および形質転換に関連する、いくつかの異なった機能に関与している少なくとも6つの蛋白質をコードする。（Leppard 1999の総説）。
ウイルスカプシドの形成とウイルスゲノムのパッケージングに必要な後期蛋白質は、主要な後期転写単位（MLTU）から全て生成し、それは複製が始まった後に完全に活性となる。ディファレンシャル・スプライシングおよびポリアデニル化の複雑な過程は、三者からなる（tripartite）リーダー配列を分かち合う15以上のmRNA種を生じる。早期蛋白質E1B -55k、E4-orf3とorf6は、後期ウイルスmRNAプロセッシングと核からの輸送において極めて重要な役割を果たす（Leppard 1998の総説）。
予備形成したカプシドにおける新たに形成したウイルスゲノム中のパッケージングは少なくとも2つのアデノウイルス蛋白質である後期蛋白質52/55Kと中間蛋白質IVa2により、ゲノムの左末端に位置するパッケージング配列との相互作用を通じて仲介される（Grable and Hearing,1990; Gustin and Imperiale,1998; Zang et al.,2001）。第2の中間蛋白質pIXはカプシドの一部分であり、ヘキソン-ヘキソン相互作用を安定化すると知られている（Furcinittiら1989）。加えてpIXは、E1AプロモーターとMLPのように、TATAを含んでいるプロモーターをトランス活性化すると述べられている（Lutzら1997）。
ウイルス生物学の広範な知識および細胞内に入った後の核運搬の高い効率により、アデノウイルスはヒト細胞へ遺伝子を運搬するための一般的な道具となった。加えて、アデノウイルスベクターは安定であって比較的容易に大量生産ができる。多くの場合、アデノウイルスベクターは少なくともE1領域が欠失しており、それによってベクターの複製ができなくなる。サブグループC抗原型Ad5またはAd2に基づいたE1欠失ベクターの作製は、293（Grahamら1970）、911（Fallauxら1996）、およびPER.C6（登録商標）（Fallauxら1998）などのE1相補細胞株において達成される。米国特許5,994,128において開示されているように、ベクターと細胞株を注意深く適合させて、細胞株中のアデノウイルス配列とベクターとの相同組み換えを介して、複製能を有するアデノウイルスが生成するのを避ける必要がある。そこで、PER.C6（登録商標）および適合したアデノウイルスベクターは、グループCのアデノウイルスベクターを作製するための好適なシステムを提供する（Fallauxら1998）。E1配列の欠失はウイルスベクター中に外来遺伝子を導入するための空間を提供する。ビリオンに組み込むことができるAd5ゲノムの最大の大きさは野生型（wt）の長さのおよそ105％に限られているから、E1欠失ウイルスはおよそ4.8kbの外来遺伝子を受け入れることができる（Bettら1993）。
pIXを欠失しているビリオン中での最大パッケージング容量は、正常なゲノム長さのおよそ95％まで低下した（Ghosh-Choudhuryら1987）。それは、pIX-（pIXマイナス）ビリオンの安定性が低下していることによって引き起こされているようである。pIXマイナス変異株Ad5における欠損は、ウイルスを産生するために使用されるパッケージング細胞株中でのpIXのエピソームの発現によって補うことができる（Caravokyriら1995）。
抗原型Ad5とAd2は遺伝子運搬ベクターとして最も一般的に使用されているが、治療または予防の道具としてより有用となるような好適な特性を、他の抗原型が有していることもある。例えばサブグループBのウイルスであるAd35とAd11は、Ad5とAd2ウイルスよりもヒト血清によってずっと中和されにくい（WO 00/70071中に開示されている）。アデノウイルス運搬ベクターの中和はインビボで形質導入効率を低下させる。更に、Ad35のファイバーを有する組み換えウイルスによる樹状細胞のような抗原提示細胞の感染効率は、Ad5ウイルスと比較してインビトロで大きく促進されることが見出された（WO 00/70071、WO 02/24730）。そこで、Ad35に基づいたベクターは非常に改善された感染効率とヒト血清中での低い中和を併せ持ち、そのようなベクターはワクチン接種の目的に適したものとなっている。
下記で議論される技術を用いて、十分にE1が欠失したAd35に基づいたベクターの産生と増殖が可能である。しかし、種々の組み換えたAd35に基づいたベクターを注意深く解析すると、そのようなベクターはあまり適切ではなく、即ち、Ad5に基づいたベクターと比較して含むことができる外来DNAが少ないことが判った。本特許出願においてこの問題を克服するための手段および方法が提示されている。
加えて、より広い抗原型の用途を有するアデノウイルスのために、現在において利用可能な技術を更に開発する必要性がある。現存するパッケージング細胞株は、典型的にはアデノウイルス抗原型5由来のE1にコードされた蛋白質を備える。そのような「標準的な」パッケージング細胞株の例は、293,911およびPER.C6（登録商標）である。これらの標準的なパッケージング細胞株において他の抗原型由来のベクターを作製しようという試みは、もし成功しないならば、困難であると証明される。使用された特定の抗原型に依り、時たまいくつかの産生が見られる。しかし、サブグループC以外のアデノウイルスサブグループから得られ、形質転換された細胞株上に作製され、Ad5由来のE1により不死化された組み換えアデノウイルスベクターの収率は乏しい。Abrahamsenら（1997）による論文において、Ad5由来のorf-6配列を欠く293細胞と比較して、アデノウイルス抗原型5由来のE4-orf6を備えた293細胞において、E1Aが欠失したアデノウイルス抗原型7ベクター（サブグループB）のプラーク精製が改良されていることが観察された。しかし、プラーク精製されたストックにおいて、予期せぬ再組み換えとしてのベクターの安定性の問題に遭遇した。加えて、産生の間に野生型ウイルスは混入するという問題に遭遇した。更に、アデノウイルスを大規模に産生するために、E4-orf6と共トランスフェクトを行って適用のために十分に高い力価を得るというのは有用ではない。そのようなアデノウイルスを生育させるための一つのオプションは、細胞に、相補/パッケージ細胞株のゲノム中に安定に結合されたE4-orf6遺伝子を提供する事である。そのような細胞は本技術分野で述べられている（例えば、WO 96/22378）。そのシステムの不利益な点は、新たな安定な細胞株を作製しなければならず、安定であって適切な細胞が作製される前には膨大な選抜ラウンドを行わなければならないという事実である。この過程は骨がおれるものであり、時間もかかる。一般的には、サブグループBウイルスなど、抗原型5（サブグループC）以外の抗原型由来のアデノウイルスの作製と増殖は、Ad5相補細胞においては困難であると証明されたと言える。WO 00/70071において出願人によって開示されているように、サブグループBウイルスAd35に基づいた組み換えウイルスは、Ad35早期領域-1配列（Ad35-E1）を含んでいる発現コンストラクトの共トランスフェクションによって作ることができる。更に、E1A配列のみが欠失し、E1B配列は欠失していないAd35に基づいたウイルスは、PER.C6細胞上で効率的に発現すると示され、Ad5のE1A蛋白質はAd35-E1A機能を相補することができると示唆している（出願人の国際出願WO 02/40665）。更にその実験により、Ad5-E1Bが欠如すると、Ad5相補細胞の収率が乏しくなるという結果となることが示された。WO 00/70071は、アデノウイルス抗原型5を相補できる細胞株を更に修飾することにより、E1が除去された非クループCのアデノウイルスベクターを作製することも開示する。WO 00/70071は更に、E1領域を欠いている組み換えアデノウイルス抗原型35ベクターを相補するために、Ad35-E1配列を有している新たな細胞株を確立するべきであることを示唆している（WO 02/40665も見よ）。しかし上記でも議論したように、もし特定の必要性のために特定の抗原型の適用を望むならば、あらゆる特定の抗原型のために新たな細胞株を確立しなければならないか、あるいは、興味の対象である抗原型を相補するために、アデノウイルス抗原型5を相補できる利用可能な細胞株を改変しなければならないであろう。本技術分野で利用可能な確立された細胞株を使用し、これらを改変せずに、本技術分野において知られている確立された効率的な方法を適用して、それらを他の全て、非Ad-5抗原型の産生のために使用することは明らかに有利である。
サブグループCの抗原型とは異なったアデノウイルス抗原型の有用な収率を作るための産生システムの必要性は、未だ存在していると結論付けられた。更に、便利なパッケージング細胞、および適切であってそのようなパッケージング上で増殖できる組み換えサブグループBアデノウイルスを備える適切なパッケージングシステムの必要性は、未だ存在する。
（発明の概要）
本発明において、E1B 55Kの停止コドンまでにE1領域中に欠失を有する組み換えグループBアデノウイルスは、類似したAd5組み換えアデノウイルスよりも少ない外来配列を提供できることが示されている。これは、pIXコード領域の先に、E1B 55K停止コドンとpIX開始コドンの間の配列のみがあるときに、所定のパッケージング細胞中で前記グループBのウイルス中でのpIX遺伝子の発現が比較的低いことに依るようである。そのようなウイルスにより高い安定性を付与すること、および/または、より多くの外来配列を入れることができることが示され、そのようなウイルス中にE1B 55Kコード領域由来の配列を含むことによってpIXプロモーターが少なくとも部分的に回復した時か、あるいはpIXを制御するための異種プロモーターを使用することのいづれかにより、所定のパッケージング細胞中においてpIXの正常な、あるいは相対的に過剰であるような発現さえ達成される。
本発明において、E1B 55Kの停止コドンまでにE1領域中に欠失を有する組み換えグループBアデノウイルスは、類似したAd5組み換えアデノウイルスよりも少ない外来配列を提供できることが示されている。これは、pIXコード領域の先に、E1B 55K停止コドンとpIX開始コドンの間の配列のみがあるときに、所定のパッケージング細胞中で前記グループBのウイルス中でのpIX遺伝子の発現が比較的低いことに依るようである。そのようなウイルスにより高い安定性を付与すること、および/または、より多くの外来配列を入れることができることが示され、そのようなウイルス中にE1B 55Kコード領域由来の配列を含むことによってpIXプロモーターが少なくとも部分的に回復した時か、あるいはpIXを制御するための異種プロモーターを使用することのいづれかにより、所定のパッケージング細胞中においてpIXの正常な、あるいは相対的に過剰であるような発現さえ達成される。
本発明は少なくともE1領域において欠失を有し、pIX遺伝子の発現を増加させるE1B 55K遺伝子産物をコードする配列の少なくとも一部分が前記アデノウイルス中に存在するという特徴を有するが、但し、前記組み換えアデノウイルスは機能を有するE1B 55K遺伝子産物を発現しない、上記組み換えアデノウイルスを提供する。そのようなアデノウイルスは安定性がより高く、および/または、E1Bコード配列を全て欠いている対応するアデノウイルスよりもより多くの外来DNAを有することができる。好ましくは前記アデノウイルスは、pIXコード配列の直接上流にある配列のおよそ700塩基対またはそれ以下を備える。好適な態様においては、前記アデノウイルスはグループBのアデノウイルスであり、より好ましくは、Ad35またはAd11から得られた又はそれに基づいたアデノウイルスである。本発明は更に、少なくともE1領域に欠失を有する組み換えアデノウイルスの、安定性および/またはパッケージング容量を増加させるための方法を提供するものであり、前記方法は、E1B 55K遺伝子産物をコードする配列の少なくとも一部分を保持するか、または再導入することを備え、前記アデノウイルス中でpIX遺伝子の発現を増加させる。pIX遺伝子の発現を増加させるE1B 55K配列が存在することに代えて、またはそれに加えて、pIXコード配列の先にある配列をより強力なプロモーターに変えてpIXの発現を増加させることも可能であり、それは、組み換えアデノウイルスの安定性の増加、および/または、本発明の方法により作製されたアデノウイルス微粒子のパッケージング容量の増加という結果をもたらす。そこで本発明は更に、少なくともE1領域を欠いており且つ外来遺伝情報を有する組み換えアデノウイルスベクターの、安定性および/またはパッケージング容量を増加させるための方法と手段を提供するものであり、その方法は、前記パッケージング細胞中でpIX遺伝子産物のレベルが上昇したもとで、前記組み換えアデノウイルスベクタ−の産生とアッセンブリーのために必要な要素をパッケージング細胞中のウイルス微粒子中へ発現させる過程からなり、ここで前記のpIX遺伝子産物のレベルの上昇は、前記ベクター中で改変されたpIX遺伝子を使用することにより、pIX蛋白質をコードする遺伝情報の過剰発現によりもたらされ、前記改変はpIX遺伝子産物の過剰発現をもたらす。好適な態様においては、前記改変されたpIX遺伝子は、pIXをコードする遺伝情報の発現を駆動する異種プロモーターを備え、前記異種プロモーターは、前記パッケージング細胞中でpIXをコードする前記遺伝情報の過剰発現を引き起こすプロモーターである。一つの態様において、前記異種プロモーターの少なくとも一部分は、前記組み換えアデノウイルスベクターの内在性の近接したpIX上流配列よりも高いレベルのpIX発現を与えるアデノウイルス抗原型のpIXプロモーターから得られるか、あるいはそれに基づいている。一つの態様において、前記異種プロモーターの少なくとも一部分は、Ad5のpIXプロモーターから得られるか、あるいはそれに基づいている。一つの観点において本発明は、少なくともE１領域を欠いており、且つ、興味の対象である遺伝子を備える組み換えアデノウイルスベクターを提供し、ここでpIX遺伝子は改変され、且つ、前記組み換えアデノウイルスベクターはアデノウイルス抗原型5から得られたものではない。なお本発明の他の観点は、改変されたアデノウイルスpIX遺伝子を備える組み換え核酸配列を提供するものであり、ここでpIX蛋白質をコードする遺伝情報はアデノウイルス抗原型5またはアデノウイルス抗原型7のpIXコード配列から得られたものではない。好適な態様において、前記改変されたpIX遺伝子は、pIXをコードする遺伝情報の発現を駆動する異種プロモーターを備える。
本発明は更に、第１抗原型のアデノウイルスの構造的および非構造的な要素を備える組み換えアデノウイルスベクターを提供するものであり、ここで前記ベクターはE4-orf6蛋白質をコードする配列を更に備え、ここで前記配列は、a)前記第1抗原型とは異なる第2抗原型のアデノウイルスから得られたE4-orf6コード配列；b)一つまたはそれ以上のコドンにおける欠失、変異、付加および/または置換の方法により前記第1抗原型のアデノウイルスから得られたE4-orf6コード配列、およびc)前記第1抗原型とは異なる第2抗原型から得られたE4-orf6コード配列の一部と、第3抗原型から得られたE4-orf6コード配列の一部の間の融合を備えるE4-orf6コード配列であって、ここで前記第3抗原型は前記第1抗原型と同一であっても異なっていてもよい上記E4-orf6コード配列、からなる群から選択される。
本発明は更に、第１抗原型のアデノウイルスの構造的および非構造的な要素を備えるような組み換えアデノウイルスベクターを作製するための方法を提供するものであり、前記方法は、a)第2抗原型のアデノウイルスから得られたE1B-55Kコード配列を発現可能な型で有する相補細胞に、前記相補細胞により前記組み換えアデノウイルスベクターのアッセンブリーを可能とするようなアデノウイルスの必要な要素を提供する過程であって、ここで前記要素は、前記第2抗原型とは異なる前記第１抗原型のアデノウイルスに由来する少なくともいくつかの構造的および非構造的な要素、および機能を有するE4-orf6蛋白質、または機能を有するその一部分、誘導体および/または類似物をコードする配列を備え、前記E4-orf6蛋白質は前記相補細胞において前記発現可能なE1B-55K蛋白質と適合性を有する、上記提供過程；b)アデノウイルスベクターの生成およびアッセンブリーが起こるのを可能とする条件下で、前記相補細胞を培地中で培養する過程、および、c)該培地および/または該相補細胞からそのように作製された組み換えアデノウイルスを回収する過程を備え、ここで適合性があるE4-orf6蛋白質をコードする配列が、そのような作製された組み換えアデノウイルスベクター中に存在する。
本発明は更に、アデノウイルスから得られた組み換え核酸分子を備える組み換えアデノウイルスを提供するものであり、前記組み換え核酸分子はE1領域中に少なくとも欠失を有し、E1B-55K遺伝子産物をコードする配列の少なくとも一部分は前記組み換え核酸分子中に存在し、および/またはpIXコード配列は異種プロモーターの制御下にあり、前記組み換えアデノウイルスは第１抗原型のアデノウイルスの構造的および非構造的要素を更に備えるという特徴を有し、ここで前記組み換えアデノウイルスは、機能を有するE4-orf6蛋白質、または機能を有するその一部分、誘導体および/または類似物をコードする配列を更に備え、ここで前記配列は、a)前記第1抗原型とは異なる第2抗原型のアデノウイルスから得られたE4-orf6配列コード配列；b)一つまたはそれ以上のコドンにおいて欠失、変異、付加および/または置換を有する、前記第1抗原型のアデノウイルスから得られたE4-orf6配列コード配列；およびc)第2抗原型から得られたE4-orf6コード配列の一部と、第3抗原型から得られたE4-orf6コード配列の一部の間の融合を備えるE4-orf6コード配列であって、ここで前記第3抗原型は前記第1抗原型と同一であっても異なっていてもよい、上記E4-orf6コード配列、からなる群から選択される。本発明は更に、本発明の組み換えアデノウイルスおよびパッケージング細胞を供えるパッケージングシステムも提供するものであり、ここで前記パッケージング細胞および前記組み換えアデノウイルスは共に、前記パッケージング細胞中で前記組み換えアデノウイルスの産生およびアッセンブリーを可能とする全ての必要な要素を備え、ここで前記パッケージング細胞は、アデノウイルスのE1B-55K蛋白質、または機能を有するその一部分、誘導体および/または類似物を少なくともコードする核酸を発現し、前記E1B-55K蛋白質は、前記組み換えアデノウイルスのE4-orf6蛋白質、または機能を有するその一部分、誘導体および/または類似物と適合性を有する。
本発明は更に、第1抗原型のアデノウイルスの構造的および非構造的な要素を備える安定な組み換えアデノウイルスを産生するための方法も提供するものであり、ここで前記組み換えアデノウイルスはアデノウイルスから得られた組み換え核酸分子を備え、その核酸分子はE1領域に欠失を有し、且つ、前記核酸分子から機能を有するE1B-55K蛋白質の発現を導くことなくpIX蛋白質の発現を増加させるE1B-55K遺伝子産物をコードする配列の少なくとも一部分から得られた核酸を備え、および/または、異種プロモーターの制御下でpIXコード配列を有し、前記工程は、a)第2抗原型のアデノウイルスから得られたE1B-55Kコード配列、機能を有するその一部分、誘導体および/または類似物を発現可能な型で発現している相補細胞に、前記相補細胞により前記組み換えアデノウイルスベクターのアッセンブリーを可能とするようなアデノウイルスの必要な要素を提供する過程であって、ここで前記要素は、前記第2抗原型とは異なる前記第１抗原型のアデノウイルスに由来する少なくともいくつかの構造的および非構造的な要素、および機能を有するE4-orf6蛋白質、または機能を有するその一部分、誘導体および/または類似物をコードする配列を備え、前記E4-orf6蛋白質は前記相補細胞において前記発現可能なE1B-55K蛋白質と適合性を有する、上記提供過程；b)組み換えアデノウイルスの生成およびアッセンブリーが起こるのを可能とする条件下で、前記相補細胞を培地中で培養する過程、および、c)該培地および/または該相補細胞からそのように作製された組み換えアデノウイルスを回収する過程を備える。
本発明は更に、複製能を有するアデノウイルスを産生することなく、外来性遺伝情報を含んでいる安定なアデノウイルスベクターを作製するための方法も提供するものであり、ここで前記ベクターはアデノウイルス5以外の抗原型のものであり、アデノウイルスベクターの産生につながる条件下で細胞を生育する過程を含み、前記細胞またはその祖先は、アデノウイルスベクターの産生およびパッケージングのために必須の全ての要素をコードする核酸が提供され且つ発現し、複製可能なアデノウイルスベクターの産生のために必須の要素は、分子間の再組み換えを引き起こすことがない少なくとも2つの分離した核酸分子上に存在し、その必須の要素は少なくとも一つの抗原型決定構造および一つのAd5以外の第1抗原型のアデノウイルスに由来する非構造的な要素を備え、且つ、第1抗原型とは異なっている第2抗原型由来のE1B-55K遺伝子産物および前記E1B-55K遺伝子産物と適合するE4-orf6遺伝子産物を備える。特定の態様において、アデノウイルスベクターの産生およびパッケージングのために必須な全ての必須の要素をコードする核酸は、組み換えpIX遺伝子を備える。一つの態様において、組み換えpIX遺伝子は異種プロモーターの制御下にあるpIXコード配列である。
他の観点において本発明は、ヒトまたは動物被験体における病気または疾患の治療または防御のための方法を提供するものであり、その方法は、本発明の組み換えアデノウイルスベクターをヒトまたは動物被験体に投与する過程からなる。他の観点において本発明は、本発明のアデノウイルスベクターを含むワクチンおよび薬剤組成物を提供する。他の観点において本発明は、ヒトまたは動物被験体における病気または疾患の防御または治療のための医薬を調製するために、本発明の組み換えアデノウイルスベクターを使用する方法を提供する。本発明はまた、本発明により提供された方法を実行するための、本発明により提供された細胞株とアデノウイルスベクターを備えた部品のキットに関する。
（発明の詳細な説明）
本発明の一つの観点は、少なくともE1領域に欠失を有する組み換えアデノウイルスの安定性および/またはパッケージング容量を増加させるための方法を提供するものであり、該方法は、pIXコード配列が、E1B 55K配列がないその内在性の近接した上流配列の背後にあるときに得られるpIX遺伝子産物のレベルと比較して、前記パッケージング細胞中でのpIX遺伝子産物のレベルが増加する下で、前記組み換えアデノウイルスの産生およびアッセンブリーに必要な要素を、パッケージング細胞中のウイルス微粒子中に発現させる過程からなる。本発明の方法のある態様において、前記のpIX遺伝子産物のレベルの増加は、前記アデノウイルス中でE1B 55K配列の一部分を保持するか、または再導入することによりもたらされる。他の態様において、前記のpIX遺伝子産物のレベルの増加は、異種プロモーターの制御下でpIXコード配列を発現させることによりもたらされる。本発明は更に、発現配列の制御下で機能を有するpIXコード配列を備える組み換えアデノウイルスを提供するものであり、前記発現配列はE1B 55K配列の一部分を備えるが、そのE1B 55K配列は、前記pIXコード配列が、前記E1B 55K配列のその一部分がないその内在性の近接したpIX上流配列の背後にある前記pIXコード配列の発現と比較して、所定のパッケージング細胞の中でpIXコード配列の発現を増加させることができるが、但し前記E1B 55K配列の一部分は機能を有するE1B 55K遺伝子産物をコードしない。本発明において、前記E1B 55K配列中にpIXプロモーター配列が存在し得、そのために、前記発現配列中にこれらの配列を含みことはpIX発現を増加させることができることが示された。前記pIXコード配列が、前記E1B 55K配列のその一部分がないその内在性の近接したpIX上流配列の背後にあるときの状況と比較して、前記E1B 55K配列が存在すると、前記組み換えアデノウイルスの安定性および/またはパッケージング容量を増加させることができる。
本発明の一つの観点は、少なくともE1領域に欠失を有する組み換えアデノウイルスの安定性および/またはパッケージング容量を増加させるための方法を提供するものであり、該方法は、pIXコード配列が、E1B 55K配列がないその内在性の近接した上流配列の背後にあるときに得られるpIX遺伝子産物のレベルと比較して、前記パッケージング細胞中でのpIX遺伝子産物のレベルが増加する下で、前記組み換えアデノウイルスの産生およびアッセンブリーに必要な要素を、パッケージング細胞中のウイルス微粒子中に発現させる過程からなる。本発明の方法のある態様において、前記のpIX遺伝子産物のレベルの増加は、前記アデノウイルス中でE1B 55K配列の一部分を保持するか、または再導入することによりもたらされる。他の態様において、前記のpIX遺伝子産物のレベルの増加は、異種プロモーターの制御下でpIXコード配列を発現させることによりもたらされる。本発明は更に、発現配列の制御下で機能を有するpIXコード配列を備える組み換えアデノウイルスを提供するものであり、前記発現配列はE1B 55K配列の一部分を備えるが、そのE1B 55K配列は、前記pIXコード配列が、前記E1B 55K配列のその一部分がないその内在性の近接したpIX上流配列の背後にある前記pIXコード配列の発現と比較して、所定のパッケージング細胞の中でpIXコード配列の発現を増加させることができるが、但し前記E1B 55K配列の一部分は機能を有するE1B 55K遺伝子産物をコードしない。本発明において、前記E1B 55K配列中にpIXプロモーター配列が存在し得、そのために、前記発現配列中にこれらの配列を含みことはpIX発現を増加させることができることが示された。前記pIXコード配列が、前記E1B 55K配列のその一部分がないその内在性の近接したpIX上流配列の背後にあるときの状況と比較して、前記E1B 55K配列が存在すると、前記組み換えアデノウイルスの安定性および/またはパッケージング容量を増加させることができる。
E1領域中に欠失を有するが、無傷のE1B 55Kコード領域を有する抗原型35のアデノウイルス（pBr.Ad35.leftITR.△E1A△21K）は、WO 02/40665中に開示されている。しかし、開示されたベクター中に存在するような機能を有する55K遺伝子産物はアポトーシスを阻害し、従って、例えばE1B 55K遺伝子を変異させることにより、または好ましくはE1B 55K配列の一部分のみを含むことにより、より好ましくはE1B 55K開始コドンの下流配列のみを含むことにより、機能を有するE1B 55K発現を欠いている組み換えアデノウイルスを得ることが望まれる。より多くの外来性の核酸を入れるために、E1の欠失を最大としたウイルスの産生を目的として、前記ベクター中でE1B 55K配列の量を最小化することは有益であることは当業者によって明らかであるが、一方同時に、組み換えアデノウイルス中での安定性が増加する、および/または、パッケージング容量が増加するという本発明の利点を有するのに十分なE1B 55K配列を維持している。本発明の教示により本分野の当業者は、例えば標準的な分子クローニング技術を用いて、開示されたベクター（pBr.Ad35.leftITR.△E1A△21K）から出発してE1B 55K領域中の一連の欠失を得て、安定性またはパッケージング容量を決定することにより、組み換えアデノウイルスの安定化および/またはパッケージング容量の増加へ至る、E1B 55K中において必要とされる最小の配列を見出すことができるであろう。そこで本発明の目的は本発明の組み換えアデノウイルスベクターを提供することであり、ここでE1B 55K遺伝子産物をコードする前記配列は、pIX読み枠のすぐ上流にある0.7kbまたはそれ以下のアデノウイルス配列を備える。他の態様において前記配列は、pIX読み枠のすぐ上流にあるアデノウイルス配列のヌクレオチドの、約680, 600, 550 ,500 ,450, 400, 350, 300, 250, 200, 150または100以下を備える。一つの態様においてそのような組み換えアデノウイルスベクターは、55Kコード配列の3’末端の166bpを保持する。当業者には明らかなように本発明は、天然のアデノウイルス中のpIXコード配列のすぐ上流の隣接する鎖の中で見出される配列が存在することに限定されるものではない。代わりに本発明においては、より近接したpIX制御配列と融合したより上流の配列、すなわちE1B 55K領域由来の配列（例えば制限またはPCR断片、例えば実施例１０および図９を見よ）を有することが可能であり、それによって、いずれのE1B 55K配列も存在しないのと比較したときに、所定のパッケージング細胞においてpIXの発現が増加するという結果となる限り、制御配列の人工的な組み合わせが作られる。好適な態様において、前記アデノウイルスはサブグループBのアデノウイルスであり、より好ましくはAd35またはAd11アデノウイルスである。抗原型35または11のアデノウイルスはヒトに投与するのに特に有用であると示されているが、これまでに最も使用されてきた抗原型5よりも、これらの抗原型に対して中和抗体を有する個体はずっと少ないからである（WO 00/70071）。本発明の他の観点は、本発明のアデノウイルスのゲノムとして作用できる核酸を提供することである。
pIX遺伝子の発現を増加させるE1B 55K配列の存在に代えて、またはそれに加えて、pIX遺伝子、好ましくはそのプロモーターを変異させることによりpIXそれ自身を過剰発現させ、組み換えアデノウイルスの安定性および/またはパッケージング容量を増加させることも可能である。改変されたpIX遺伝子は異なったプロモーターおよび/または転写終結因子、および/または変異したコード配列を有するpIX遺伝子であり、例えば、コドンの最適化、RNAを安定化するイントロンの導入などにより得られる。本発明のpIX遺伝子はpIXをコードする遺伝情報を有し、天然のアデノウイルス中において見出されるようなpIX遺伝子などの核酸、cDNA，および変異したpIXをコードする情報を、アレルバリアントまたは変異体pIXをコードする核酸の形で含み、それは定性的または定量的な観点において、正常なpIXとは異なっているpIXの機能の少なくとも一部分を有し、アミノ酸の変異、欠損、付加、または転座、あるいはその組み合わせによって、pIXからまたはそれに基づいて得られる。
もし組み換えアデノウイルスが、E1B 55K遺伝子産物の停止コドンに至るまで、及びそれを含んでいるE1B 55K領域の欠失を少なくとも有するならば、そのpIX読み枠の先にE1B 55K停止コドンとpIXの開始コドンの間の配列があるであろう。これらの配列を本願明細書中において、「内在性の近接したpIX上流配列」と称する（例えば、Ad35に基づいた組み換えアデノウイルスベクター中のAd35 pIX上流配列、Ad11に基づいた組み換えアデノウイルスベクター中のAd11 pIX上流配列などは、この観点において内在性であるといわれており；その定義は天然において見出されるが実験室において作られないアレルバリアントを含み；いくつかの近接したpIX上流配列については図３Ａを見よ）。
本願明細書中において使われる「異種プロモーター」とは、E1B 55K領域の配列および内在性の近接したpIX上流配列を含む、pIX遺伝子の上流配列において天然に見出される配列とは異なっている任意の配列であると規定され、プロモーターとして作用することが可能であって、それによってpIXコード配列の転写を制御する。一つの観点において、異種プロモーターは少なくとも一部分において、それから組み換えアデノウイルスベクターが得られた抗原型以外の他の抗原型のアデノウイルスに由来する（例えば、Ad35組み換えアデノウイルスベクター中のAd5 pIX上流配列）、近接したpIX上流配列から得られたか、またはそれに基づいている（即ち、E1B 55K停止コドンおよびpIXの開始コドンの間の配列）配列であってもよい。本願明細書中でこれを「非内在性の近接pIXプロモーター」と称する。
本発明の一つの態様において、Ad35由来のpIX発現はAd5の非内在性の近接pIXプロモーターにより駆動されている。アデノウイルスベクターの内在性のpIX近接配列よりも高レベルのpIX発現を付与する抗原型に由来する近接したpIX上流配列から得られたあるいはそれに基づいた、任意の非内在性の近接pIXプロモーターを使用することができる。そのような非内在性の近接pIXプロモーターの同定は配列情報に基づいてもよく、そのようなものは実施例４から当業者にとって明らかであろう。特定の態様において本発明のアデノウイルスベクターは、アデノウイルスのサブグループE抗原型、または好適にはサブグループB抗原型に由来し、あるいはそれに基づいて得られる。特定の態様において、前記のアデノウイルスベクターはアデノウイルス抗原型35(Ad35), Ad11, Ad7またはAd4に由来し、またはそれに基づいて得られる。代わりとなる態様において、前記の非内在性の近接pIXプロモーターは少なくともその一部分が、サブグループC, A, DまたはFに分類されたアデノウイルスの近接したpIX上流配列に由来するか、またはそれに基づいている。特定の態様において、前記の非内在性の近接pIXプロモーターは少なくともその一部分が、アデノウイルス抗原型12(Ad12), Ad9またはAd40、好ましくはAd5またはAd2の近接したpIX上流配列に由来するか、またはそれに基づいている。代わりに、非内在性の近接pIXプロモーターとして作用する配列を、プロモーターの強度を日常的に試験する転写アッセイなどの当業者にとっては既知である一般的な分子生物学の方法により、実験的に見出すことが可能である。プロモーター全体を変えることなくプロモーター由来の要素を交換できることは当業者にとって明らかであり、例えば、プロモーターに対する既知の転写因子結合配列の付加、欠失または変異は、その強度に影響するであろう。プロモーター配列の少なくとも一部の変異は、機能が既知のヌクレオチド鎖を含む、一つまたはそれ以上のヌクレオチドの付加、欠失、または変換などをすることにより配列を変化させることにより行われる。プロモーター配列の変換は、種々のプロモーターによりこれらの配列の一部または全部を置換することにより行われる。そのような置換は、本分野の当業者に全て良く知
られた標準的な分子生物学の技術に従って行うことができる。選択されたpIX遺伝子と作動可能に連結させて任意のプロモーターを構築することが可能であり、その効果を試験した。
られた標準的な分子生物学の技術に従って行うことができる。選択されたpIX遺伝子と作動可能に連結させて任意のプロモーターを構築することが可能であり、その効果を試験した。
他の観点において異種プロモーターはアデノウイルスの非内在性の近接pIXプロモーターと関連していない。そこで、異種プロモーターはウイルスのプロモーターであってもよく、サイトメガロウイルス（CMV, 例えばヒトCMV前初期遺伝子プロモーター、本願明細書において更にCMVプロモーターと称する）、ラウス肉腫ウイルス（RSV, 例えばRSVの長い末端反復プロモーター、本願明細書において更にRSVプロモーターと称する）、TK, HBS, SV40およびそのようなものに基づいた又はそれから得られたプロモーターを含むが、それに限定されるものではない。一つの態様において、アデノウイルスのE1Bプロモーターは異種プロモーターとして使用されている。細胞のプロモーターを異種プロモーターとして使用することもできるが、これらにはPGK, メタロチオネイン、EF1-α,β-アクチン、およびそのようなものを含むが、それに限定されるものではない。合成のまたはハイブリッドプロモーターは、一つ以上のプロモーターに由来する要素を備え、本発明のために使用することが可能であり、そして全ては異種プロモーターの用語の範囲内に含まれる。使用されるプロモーターは構成的または誘導性であることもできる。誘導可能なプロモーターとの関連で、あるプロモーターがその誘導された状態で過剰発現を与えるならば、そのプロモーターは本発明のために適切であると見做される。本発明においてpIXが過剰発現するという結果となる任意のプロモーター配列は、本発明の異種プロモーターとして使用することができる。プロモーターの強度に加えて、組み換えアデノウイルスベクターそれ自身の中に存在するときに、特定のプロモーターの有用性を決定する一つの他の観点はその大きさであるが、それは、より長いプロモーターは導入遺伝子のために利用できる空間をとるであろうからである。本分野の当業者は本発明を使用して、挿入サイズに関してプロモーターの長さおよび強度について実験的にベクターの最適化を行い、最も安定な組み換えベクターを見出すことを可能とするであろう。
本発明の異種プロモーターがpIXをコードする遺伝情報の過剰発現を選択したパッケージング細胞中で引き起こすことができる限り、異種プロモーターはなお、内在性の近接したpIX上流配列の一部分または全部を包含するか又は含むか、あるいは代わりにこれらの配列全体を置換できることは、明らかであろう。本分野の当業者にとって、非pIXアデノウイルス遺伝子または導入遺伝子、およびpIXコード配列（いづれかの順序において）の間の内部リボソームエントリー部位（IRES）を使用することにより、例えば導入遺伝子を制御する内在性の非pIXアデノウイルスプロモーター（例えば、E1A, E2Aなどのプロモーター）または異種プロモーターが、pIXの発現を駆動するために使用されるときに、これは本発明の「異種プロモーター」の範囲内であると見做されることは明らかであろう。
本発明においてpIX遺伝子産物のレベルが上昇または増加すると、選択したパッケージング細胞中でpIX遺伝子が過剰発現するという結果となる。本願明細書中でpIX遺伝子の過剰発現とは、RNAレベルまたは蛋白質レベルまたは両者のいずれにせよ、所定のパッケージング細胞中で、pIXのコード領域が本願明細書中で定義された「内在性の近接pIX上流配列」の背後にあるときに得られるpIX発現レベルより高い、pIXの発現レベルとして定義されている。「過剰発現」とは、選択された特定のパッケージング細胞との組合わせの中で、アデノウイルスの特定の異種プロモーターとpIXの組み合わせにおいて、本発明との関連で意味深い。発現レベルを決定する方法は当業者に一般的に良く知られており、RT-PCR、ノザンブロッティング、ウエスタンブロッティングなどを含むが、それに限定されるものではない。本発明において、選択された所定のパッケージング細胞中で、所定の挿入（例えば、ルシフェラーゼ）を有する組み換えアデノウイルスの中で発現レベルを決定することにより過剰発現は測定されるであろうが、ここでpIXをコードする遺伝情報はE1B 55K配列を有さない内在性の近接pIX上流配列の背後にあり、pIXコード領域が異種プロモーターまたは内在性のE1B 55K遺伝子（少なくとも一部分が再構築されたその「天然の」プロモーター）由来の配列によって制御されていること以外は、これらの発現レベルを同様の組み換えアデノウイルス中での発現レベルと比較している。pIXの過剰発現は、E1B 55K配列を有さない内在性の近接pIX上流配列によって得られる発現レベルに対する、異種のまたは「天然の」プロモーターによって得られる発現レベルについての比が1以上であることで示される。パッケージング細胞の選択は、パッケージング細胞の中で相補するアデノウイルスの機能と相互作用する組み換えアデノウイルスの要素の抗原型、産物の純度（作製されたバッチに由来する複製能を有するアデノウイルスが存在下しないなど）、使用の容易さ、生育特性などのような因子によって決定される。パッケージング細胞の例は本技術分野の当業者に良く知られており、293細胞、911細胞、および本願明細書中で使用されるPER.C6（登録商標）細胞のみならず、PER55Kなどの特定の抗原型のアデノウイルスベ
クターの相補に使用されているそれらの誘導体が含まれる。
クターの相補に使用されているそれらの誘導体が含まれる。
本発明の全ての態様において、pIXコード配列およびpIXの発現を駆動する制御配列は、アデノウイルスゲノム中のそれらの天然の位置のみならず、例えば元々はE3配列を含んでいた領域の中など、アデノウイルスゲノムの他の部分に置くことができることは明らかである。
安定性が増加した組み換えアデノウイルスに、ウイルス微粒子（ビリオン）中により大きなゲノムを導入することができる。そのために、本願明細書中で使用されたように組み換えアデノウイルスの安定性を増加させると、本発明における組み換えアデノウイルスに、興味の対象である遺伝子を備えるより多くの外来遺伝情報を含ませることができるようになる。更に本発明の安定性が増加した組み換えアデノウイルスは、不安定さの兆候を示さずに、より多くの継代の間増殖させることができる。本技術分野の当業者に既知のいくつかの方法によって安定性を測定することが可能であり、それには望む組み換えアデノウイルスベクターの存在を示す組み換えウイルス上でのPCRが含まれるが、それに限定されるものではない。不安定さは、やはりPCR法などによって可視化できる副生成物へ繋がるであろう。ウイルスDNAの制限解析、ウイルス微粒子の相対的な感染性の測定、アデノウイルス微粒子の熱安定性の測定も、組み換えアデノウイルスベクターの安定性の測定に使用することができる（Caravokyri and Leppard, 1995）。組み換えアデノウイルスベクターの安定性/不安定性を測定する方法は、本出願の実施例３の中でも与えられるであろう。本願明細書中で組み換えアデノウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターとも呼ばれる組み換えアデノウイルスは、アデノウイルスから得られるか又はそれに基づいており、アデノウイルスのE1領域（E1AおよびE1B遺伝子を備える）の少なくとも一部分を欠損し、前記ベクターによる運搬および/または発現が望まれる外来遺伝情報を備えることができる。本願明細書における外因性の（外来の）遺伝情報とは、アデノウイルス中に天然には存在しない任意の遺伝情報であり、導入遺伝子ともいわれている。これには興味の対象である遺伝子、発現カセットなどが含まれるが、それに限定されるものではない。そのような外来遺伝情報は、アデノウイルスのE1配列の欠失により利用可能となったゲノム中の空間を埋めることができる。組み換えアデノウイルスベクターは、遺伝子療法の適用、ワクチンの調製などの種々の目的のために有用である。E1領域の欠失に加えて、ある好適な態様において外来遺伝情報についての能力を増加すさせるために、E3配列もそのようなアデノウイルスベクターから欠失させることが可能である。アデノウイルスベクターの複製のために必要なときには、もし必要ならばアデノウイルスベクター中で欠失している遺伝情報を備えるパッケージング細胞と組合わせて、他の欠失、および、E1欠損と組合わせたE2, E3およびE4領域の部分的または完全な欠失の種々の組み合わせを使用することが可能である。必要に応じてアデノウイルスゲノム中の任意の他の欠失と組合わせた、E1領域に欠失を有する全ての組み換えアデノウイルスは、本発明の範囲内に含まれることを意味する。本発明のアデノウイルスは、癌ワクチン接種および抗ウイルスワクチン接種を含む、遺伝子療法または予防上のおよび/または治療上のワクチン接種などの、種々の状況で使用することが可能である。このために、アデノウイルスベクターは遺伝子運搬のベヒクルとして機能し、ここで非天然遺伝子はアデノウイルスゲノム中に導入される。続いてアデノウイルス微粒子は、興味の対象である標的細胞に特異的に標的化することが可能であり；カプシド受容体結合または他の手段のいずれかを通じてアデノウイルスはその特異的な細胞に結合し、導入遺伝子を運搬する。アデノウイルスの標的化は多くの種々の方法によって行うことが可能である。アデノウイルスベクターの標的化の技術分野の当業者は、アデノウイルスベクターを興味の対象である細胞へ運搬するために適用される、全ての種々の可能性を承知しているであろう。そのような可能性にはカプシド改変（ファイバー、ヘキソンおよび/またはペントン修飾であって、欠失、異なった抗原型のファイバーの間の交換、およびペプチドおよび/または他の結合部分の付加など）が含まれるが、それに限定されるものではなく、ここでキメラファイバーは興味の対象である細胞上に存在する受容体を認識するように作製され、またはここでペントン塩基（penton-base）の結合が利用される。他の可能性は標的部分をカプシド蛋白質と連結させることであり、ここで例えば結合ペプチド、既知で強力な結合蛋白質あるいは抗体またはその一部分がカプシド蛋白質に連結され、特定の標的化を達成する。そのようなベクターは全て、本発明により提供される方法および手段を用いて産生することができる。そこで本発明は、非アデノウイルス蛋白質をコードする配列を更に備える、本発明による組み換えアデノウイルスベクターも開示するものである。そのような配列はアデノウイルス骨格（backbone）中の種々の位置に存在することも可能であるが、好ましくはそれは、本発明の組み換えアデノウイルスベクター中で欠損しているE1領域中に位置する。E1領域は相補細胞中に存在する相補要素により補なわれる。プロモーター、導入遺伝子および他の制御配列の方向性は左に向けてのみならず、右逆方向末端反復へ方向付けられることもできる。
本発明はアデノウイルスおよび/またはアデノ随伴ウイルス（AAV）などの他のウイルスに基づいたウイルスベクターの産生のために使用することも可能であり、ここでAd-AAVキメラウイルスなどの組み合わせを宿主細胞ゲノム中へ結合することができる。結合したアデノウイルスを産生するためのいくつかの方法が、本技術分野で知られている。一般的に本発明は、結合可能な型（特異的に、または非特異的に）のアデノウイルスの産生にも有用である。
述べたように、いくつかの非アデノウイルス導入遺伝子を、本発明の組み換えアデノウイルスベクター中にクローン化することができる。これらはエンハンサー、プロモーター（例えば、サイトメガロウイルスプロモーター、SV40プロモーターおよびRSVプロモーターなどの強力な非アデノウイルスプロモーター）およびポリアデニル化シグナルなどの制御核酸配列を含むのみならず、治療目的のための異種遺伝子も含む。そこで本発明の一態様において本発明の組み換えアデノウイルスが提供され、ここで前記非アデノウイルス蛋白質は下記の；細胞死誘導ポリペプチド、癌特異的抗原、ウイルス蛋白質、ホルモンおよびサイトカイン、からなる群から選択される。非アデノウイルス因子、蛋白質、ポリペプチドおよびペプチドの非限定的な例は、転写因子、細胞内シグナリング蛋白質、フォスファターゼ、キナーゼ、アポトーシス阻害因子、受容体アンタゴニスト、可溶性型の膜結合受容体、RNA阻害剤、アンチセンスRNA、デコイ因子、リボゾーム、およびより特異的にはチミジンキナーゼ、エリスロポエチン、新規赤血球産生刺激蛋白質（NESP）、IL3、ceNOS、ガンマ-インターフェロンおよびgp100である。ワクチン接種の目的で、本発明の方法と手段によって提供される組み換えアデノウイルスベクター中へ、非アデノウイルスのウイルス蛋白質をクローン化できる。そのようなウイルス蛋白質にはHIVワクチンのためのgag, pol, env, nefなど、ヒト乳頭腫ウイルスワクチンのためのE6およびE7蛋白質、マラリアワクチンのためのプラスモジウム原虫由来のスポロゾイト周囲蛋白質、ロタウイルスワクチンのためのロタウイルス成分、エボラワクチンのためのエボラ蛋白質、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）ワクチンのためのRSV由来のFおよびG遺伝子産物、インフルエンザワクチンのためのHAおよびNAなどが含まれるが、それらに限定されるものではない。
本発明のアデノウイルスは好ましくはヒトアデノウイルスであり、即ち、ヒト細胞に感染することができるアデノウイルスから得られたか又はそれに基づいているが、本発明は非ヒトアデノウイルスにも同等に有用である。本技術分野の当業者は、全てのヒトアデノウイルスに加えて、多くの非ヒトアデノウイルスが本技術分野で同定されてきた事実に気が付くであろう。明らかに、本発明により開示されたのと同じ結果に到達するために、非ヒトアデノウイルスを利用することもできる。本発明の方法および手段を用いて産生できる非ヒトアデノウイルスの非限定的な例は、イヌ、ウシ、サルおよびおよび鳥のアデノウイルスである。そこで本願明細書中で使用される抗原型は、種に限定された抗原型と超えるものである。
本願明細書で「得られた」とは、アデノウイルス中で通常見出される核酸配列、遺伝子、または蛋白質を意味するものであり、本発明の組み換えアデノウイルスの生成のために使用される。そのような組み換えアデノウイルスを作製する方法は本技術分野の当業者に良く知られており、制限酵素およびそのようなものを使用することによって、望むコンステレイションへ遺伝情報をクローニングするなどの通常の分子生物学の方法を含むが、それに限定されるものではない。組み換えアデノウイルスはアデノウイルス配列に基づくことも可能である。本願明細書において使用される「基づいた」とは、そのような遺伝情報の知識に基づいた、遺伝情報の合成的な構築を含む意味である。そのような方法には、アデノウイルスの遺伝的な材料をPCRの鋳型として使用して、鋳型アデノウイルスの配列に基づいた新しいアデノウイルスのコンストラクトを構築することを含み、望みの配列を有する完全に合成的な遺伝情報の構築は、例えば、望みのコンストラクトに合成のオリゴヌクレオチドを連結させることなどによるが、それに限定されるものではない。「得られた」とは、必ずしも野生型DNAの直接的なクローニングを意味するものではないことを理解するべきである。本技術分野の当業者は、ある核酸断片の変異型を得るという分子生物学の可能性にも気が付くであろう。これらの変異は異なった機能性を付与するかもしれないが、ある変異がその特定のDNA断片とそれにコードされる蛋白質の機能性を変えないという意味で、それらはサイレントであるかもしれない。そこで「機能を有するその一部分、誘導体および/または類似物」という用語は、それらが関連している核酸の同等物であると理解されるべきである。本技術分野の当業者は、ある欠失、交換、（点）変異、付加などはなお、元の核酸と類似した機能を有する核酸をもたらす結果となるかもしれない事実を理解するであろう。そのために、pIX蛋白質、E4-orf6とE1B-55K遺伝子産物などの蛋白質の機能性を顕著に変化させないような改変も、本発明の範囲内であることは理解されるべきである。本技術分野の当業者にとって、組み換えアデノウイルスをコードする遺伝情報を得るための方法は、本発明の範囲から離れることなく改変できることは明らかである。
ヒトのアデノウイルスは、51の抗原型を包含するサブグル−プA〜Fに分類されている（例えばEP 0978566を見よ）。いくつかの適用のために、特定のサブグループに由来する、あるいは例えば樹状細胞（WO 02/24730）などの望みの細胞型への組織指向性を有するある抗原型に由来するアデノウイルスから得られた又はそれに基づいたアデノウイルスベクタ−を使用することは、有益であり得る。あるサブグループに由来する、または特定の抗原型に由来するアデノウイルスに対する中和抗体が、集団中に全般的に不在であることは、選んだ抗原型を決定するための重要なパラメーターでもある（WO 00/70071）。サブグループBのウイルス間で類似しているために（例えば実施例４と１１を見よ）、本発明はサブグループBのアデノウイルスに特に適していると予期される。そのために本発明の好適な態様は、サブグループBに分類されるアデノウイルスから得られた又はそれに基づいたアデノウイルスベクタ−に関連する。サブグループBのヒトアデノウイルスは、Ad3, Ad7, Ad11, Ad14, Ad16, Ad21, Ad34, Ad35およびAd50からなる。本出願の好適な態様は、Ad35またはAd11抗原型から得られた又はそれに基づいた組み換えアデノウイルスベクターに関連する。特定の用途のために抗原型について選ぶのに加えて、所謂キメラアデノウイルスを使用することができる。これらは、他の抗原型に由来する残りの遺伝情報（「主たる」アデノウイルスベクター部分）と結合した一つまたはそれ以上のアデノウイルス抗原型に由来し、ファイバー、ペントン、またはヘキソンなどの被覆蛋白質をコードする遺伝配列の一部分または全てを備え、それを用いて「主たる」アデノウイルスベクターの免疫原性または組織指向性を低下させることができる（EP 0978566）。本願明細書において使用される「主たる」部分とは、それが前記のキメラウイルスの遺伝情報の大部分に寄与し、そのために、キメラアデノウイルスはそのようなウイルスの「主たる」部分の抗原型グループ中に含まれるであろうことを意味する。これらが類似の不安定性の問題に直面したときに、本発明はそのようなキメラアデノウイルスのためにも使用できることは本技術分野の当業者にとって明らかであろう。例えば主たる部分としてAd35配列を備え、且つ、例えばAd11アデノウイルスから得られた又はそれに基づいたファイバーを備えるキメラアデノウイルスは、ここで述べられたAd35組み換えアデノウイルスベクターについて報告されたように、増殖において類似した不安定性を有するかもしれないことは予期できる。そのために、本出願中で組み換えアデノウイルスに言及されるときには、キメラアデノウイルスベクターも本発明に含まれる意図である。
組み換えアデノウイルスベクターの産生とアッセンブリーのために必要な要素は、本技術分野の当業者に良く知られている（上述；米国特許5,994,128, Russell, 2000）。E1が欠失した組み換えアデノウイルスのビリオンの形での産生は、相補細胞とも呼ばれているパッケージング細胞内で行われる。そのような細胞は、組み換えアウイルス（組み換えビリオン）の産生に必要な、前記の組み換えアデノウイルス中で欠失しているアデノウイルスの遺伝情報をイントランスで提供する。良く知られたパッケージング細胞には、293細胞、911細胞およびPER.C6（登録商標）細胞（上記）がある。多くの目的のために、パッケージング細胞および、重複配列を欠損している組み換えアデノウイルスベクターを使用することは好適であり、その重複配列は、さもなければ相同性組み換えを引き起こし、複製能を有するアデノウイルスが生じる結果となるであろう（米国特許5,994,128
）。応用微生物学研究センター（Applied Microbiology and Research）の欧州動物細胞培養コレクションにNo. 96022940として寄託されたPER.C6（登録商標）は、そのために、組み換えアデノウイルスを増殖させるための非常に適切なパッケージング細胞である。複製能を有するアデノウイルスの産生を減らすための他の方法も認識されており、例えば、パッケージング細胞とベクターの中に存在する配列の間の相同性を減らすために、アデノウイルスの配列を操作するための関心事であった（例えば、Hehir et al., 1996; Robert et al., 2001）。例えばE2, E4などの一部分または全部など、使用された組み換えアデノウイルス中でこれらの機能が機能的に欠損しているとき、必須のE1領域に加えて、パッケージング細胞は、他のアデノウイルスの機能を補うためのアデノウイルス配列を備える。パッケージング細胞中の相補情報は、ゲノム中に組み込まれているか、あるいは例えばプラスミド、ベクター、コスミドなど、細胞外のコピーとしてかのいずれかで存在することができる。他の方法では、組み換えアデノウイルス中では欠損している遺伝情報を備える、所謂ヘルパーウイルスが使用される。組み換えアデノウイルスベクターは、大部分または全てのアデノウイルス遺伝子が除去されたゲノムを含む、組み換えアデノウイルスの産生のために使用される所謂ヘルパーウイルスとしても使用される（ガッツレス（gutless）ベクターまたはヘルパー依存性アデノウイルス）。そのようなガッツレスアデノウイルスの最終作製において、ヘルパーアデノウイルスのパッケージングを避ける必要がある。本技術分野の当業者はこれを達成する方法に精通しており、例えば部位特異的な組み換え酵素をパッケージングシグナル中の加工部位に使用してこのパッケージングシグナルを除去する。しばしば、CsClグラジエント分離を用いて、望みのガッツレスウイルスから残っているヘルパーウイルスを分離する必要がある。ヘルパーおよびガッツレスウイルスのゲノム長さが最大限に異なっているときには、これを達成することは容易となる。そこで大きなヘルパーウイルスは、小さいものよりも好適である。本技術分野の当業者にとって明らかであるように、pIXの発現が増加した組み換えヘルパーウイルスを使用することによって組み換えアデノウイルスの安定性を増加させるために、本発明を同様に適用することが可能であり、それは本発明で述べられた方法により達成できる。組み換えアデノウイルスを相補するのに使用できる遺伝情報を含んでいる任意の細胞を、組み換えアデノウイルスを相補するために使用して、組み換えウイルス微粒子を産生することが可能であり、それはパッケージング細胞の意味の範囲内に含まれるという意図である。本発明によって得られる利点は使用されるパッケージング細胞に依存していないことは、本技術分野の当業者に明らかであろう。
）。応用微生物学研究センター（Applied Microbiology and Research）の欧州動物細胞培養コレクションにNo. 96022940として寄託されたPER.C6（登録商標）は、そのために、組み換えアデノウイルスを増殖させるための非常に適切なパッケージング細胞である。複製能を有するアデノウイルスの産生を減らすための他の方法も認識されており、例えば、パッケージング細胞とベクターの中に存在する配列の間の相同性を減らすために、アデノウイルスの配列を操作するための関心事であった（例えば、Hehir et al., 1996; Robert et al., 2001）。例えばE2, E4などの一部分または全部など、使用された組み換えアデノウイルス中でこれらの機能が機能的に欠損しているとき、必須のE1領域に加えて、パッケージング細胞は、他のアデノウイルスの機能を補うためのアデノウイルス配列を備える。パッケージング細胞中の相補情報は、ゲノム中に組み込まれているか、あるいは例えばプラスミド、ベクター、コスミドなど、細胞外のコピーとしてかのいずれかで存在することができる。他の方法では、組み換えアデノウイルス中では欠損している遺伝情報を備える、所謂ヘルパーウイルスが使用される。組み換えアデノウイルスベクターは、大部分または全てのアデノウイルス遺伝子が除去されたゲノムを含む、組み換えアデノウイルスの産生のために使用される所謂ヘルパーウイルスとしても使用される（ガッツレス（gutless）ベクターまたはヘルパー依存性アデノウイルス）。そのようなガッツレスアデノウイルスの最終作製において、ヘルパーアデノウイルスのパッケージングを避ける必要がある。本技術分野の当業者はこれを達成する方法に精通しており、例えば部位特異的な組み換え酵素をパッケージングシグナル中の加工部位に使用してこのパッケージングシグナルを除去する。しばしば、CsClグラジエント分離を用いて、望みのガッツレスウイルスから残っているヘルパーウイルスを分離する必要がある。ヘルパーおよびガッツレスウイルスのゲノム長さが最大限に異なっているときには、これを達成することは容易となる。そこで大きなヘルパーウイルスは、小さいものよりも好適である。本技術分野の当業者にとって明らかであるように、pIXの発現が増加した組み換えヘルパーウイルスを使用することによって組み換えアデノウイルスの安定性を増加させるために、本発明を同様に適用することが可能であり、それは本発明で述べられた方法により達成できる。組み換えアデノウイルスを相補するのに使用できる遺伝情報を含んでいる任意の細胞を、組み換えアデノウイルスを相補するために使用して、組み換えウイルス微粒子を産生することが可能であり、それはパッケージング細胞の意味の範囲内に含まれるという意図である。本発明によって得られる利点は使用されるパッケージング細胞に依存していないことは、本技術分野の当業者に明らかであろう。
pIXをコードする遺伝情報は組み換えアデノウイルスベクター上に存在できるが、前記組み換えアデノウイルスベクターから独立して存在することも可能であり、そのようなウイルス外遺伝情報はゲノム中に組み込まれてか、あるいはプラスミド、ベクター、コスミドなどの染色体外のコピーとしてのいずれかで存在できる。パッケージング細胞中に遺伝情報を導入することは、リポフェクタミン、リン酸カルシウム沈殿、ウイルス感染などの種々の方法で行うことができる。そのような方法は本技術分野の当業者に一般的に良く知られており、遺伝情報を導入するために使用される方法は本発明の範囲において重大ではない。本願明細書中で使用される発現可能な形で機能を有するpIXとは、プロモーターまたは他の制御配列と機能を有するような結合しているpIXをコードする遺伝情報を意味するものであり、そのような制御配列はパッケージング細胞中でpIXをコードする前記遺伝情報の発現を駆動することができる。パッケージング細胞中に遺伝情報を導入することは、組み換えアデノウイルスベクターの導入に先立って、それに付随して、またはその後にいずれかにおいて行うことができる。293塩基のパッケージング細胞株中でpIXを構成的にエピソームで発現させると、pIX変異したアデノウイルス型5の欠損を補うことが見出された（Caravokyri and Leppard, 1995）。しかしながら、そのような適用のためにはEBNAI発現カセットを含んでいる特別なエピゾームのプラスミドが必要であり、そのような細胞株中におけるアデノウイルスベクターの増殖は、エピゾームの一部分は組み換えアデノウイルスベクターの一部分に非常になり易いという不利益を受ける。そのために、本発明の好適な態様において、機能を有するpIXをコードする遺伝情報はアデノウイルスベクター上に存在している。
複製可能なアデノウイルスへ至る再組み換えの量を減らす試みにおいて、何人かの著者は、Ad5の変異したpIXプロモーターにより駆動されるAd7（グループBウイルス）から得られたpIX遺伝子を使用し、パッケージング細胞の核酸（Ad5由来の配列を含む）と組み換えアデノウイルスベクターの間の重複を減少させた（Robert et al., 2001）。しかしこれらの実験は、ウイルスベクターの安定性を増加させるために行ったのではなく、これらの実験においてこの安定性は測定されていない。本出願において、アデノウイルスベクター中のpIXの転写制御配列を、ウイルスの安定性の増加および/またはビリオン中で外来遺伝材料の受容力を増加させる目的で変化させた。本発明は、Ad5から得られたAd5由来の近接したpIXプロモーターの制御下にあるpIX遺伝子を備えている、Ad35から得られた組み換えアデノウイルスベクターは、内在性の（即ち、Ad35由来）近接したpIX上流配列を有する対応ウイルスよりも、より安定であり/より多くの外来遺伝情報を持つことができることを示す。そこで本発明は組み換えアデノウイルスも提供するものであって、その組み換えアデノウイルスは、機能を有するpIXコード配列を備え、少なくともE1領域に欠失を有する組み換えアデノウイルスも提供するものであり、ここでpIXコード配列は異種プロモーターの制御下にあり、前記組み換えアデノウイルスはアデノウイルス抗原型5以外のアデノウイルスから得られ又はそれに基づいている。ある態様において、前記異種プロモーターは非内在性の近接pIXプロモーターである。好適な態様において、pIXをコードしている遺伝情報はAd35またはAd11から得られ又はそれに基づいている。そのような態様において、好適な非内在性pIXプロモーターはAd5プロモーターである。
他の観点において、本発明は本発明の方法により取得できる組み換えアデノウイルスベクターを提供する。そのような組み換えアデノウイルスベクターは、例えばワクチンの調製において（WO 00/70071; WO 01/38362; WO 02/24730）、遺伝子運搬ベヒクルなどとして有用である。そのような組み換えアデノウイルスベクターのために望まれる主たる抗原型を選択することは、ずっと使用されるAd5アデノウイルスベクターと比較して組織指向性が変化したベクターを取得するために使用され、および/または、それらはAd5から得られたベクターよりも免疫原性が低いために使用することができる（WO 00/70071）。組み換えアデノウイルスベクターの生成において、アデノウイルスが欠失しているE1配列の左部分を含み、クローニングのための制限酵素部位を有しているプラスミド（アダプタープラスミド）中に、導入遺伝子をクローン化することは便利である。それから、コスミドとの相同組み換えにより組み換えアデノウイルスベクターを生成し、そのコスミドは、アダプタープラスミドの3’末端と共に5’末端重複配列を有しているアデノウイルスの右部分を備える（本願の実施例を見よ；方法はWO 99/38362において述べられている）。そこで本発明の他の観点は、アデノウイルスの左ITR、パッケージングシグナル、E1領域に欠失を有する他のアデノウイルスの配列、E1B 55K読み枠の少なくとも一部分、およびpIXコード配列を備える組み換え核酸配列を提供するものである。本発明の更なる他の観点は改変されたアデノウイルスのpIX遺伝子を提供するものであり、ここでpIX蛋白質をコードしている遺伝情報はアデノウイルス抗原型5またはアデノウイルス抗原型7のpIXコード配列から得られたものではない。好適な態様において、前記の改変されたpIX遺伝子は異種プロモーターを備える。本発明は、本発明による、または本発明により提供された方法により得られる、組み換えアデノウイルスベクターを含む薬剤組成物にも関する。該薬剤組成物は、薬剤調製の分野の当業者によって一般的に適用される、受容可能な薬学的担体を更に備える。更に本発明は、本発明による組み換えアデノウイルスベクター、または本発明により提供された薬剤組成物を人体に投与することよりなる、人体の治療方法に関する。
本発明は更に、本発明の組み換えアデノウイルスを備える組み換えアデノウイルスパッケージング細胞も提供するものである。一つの態様において、前記組み換えアデノウイルスパッケージング細胞は、前記組み換えアデノウイルスのE1B 55Kの欠失を補うことができる核酸を備え、ここで前記組み換えアデノウイルスはpIX遺伝子の発現を増加させるE1B 55K遺伝子産物をコードする配列の一部分を含む核酸分子を備えるが、但し、後者の組み換え核酸分子は機能を有するE1B 55Kをコードせず、前記細胞と前記組み換えアデノウイルスは、機能を有するE1B 55K蛋白質をコードする核酸を有する組み換えアデノウイルスの生成に至る配列重複を含まない。この態様は付加されたアデノウイルス機能を備える組み換えアデノウイルスの生成を防ぐのに、特に有用である。
本発明は更に、Ad5パッケージ/相補細胞における非グループCアデノウイルスベクターの相補の低下に関連するある困難を解決するための方法および手段を開示するものである。Ad5相補細胞株において機能を有するAd5 E1B-55Kの発現が存在するが、アデノウイルスの骨格が非グループCアデノウイルス起源であるとき、アデノウイルスベクターにより作製される力価は非常に低いことが見出され；この発見はE1B-55Kと他の（ウイルス）蛋白質の相互作用における抗原型特異性を意味する。この抗原型依存性は、相補細胞株によって提供されたE1B-55K蛋白質と適合するE4-orf6蛋白質を提供することにより回避できることがこの中で述べられている。この中で議論されるようにE1B-55KとE4-orf6は、核から細胞質へのmRNAの細胞内輸送の阻害に関与している複合体を形成し、一方その複合体は核から細胞質へのウイルスmRNAの輸送の刺激にも関与している（Leppard 1997と1998の総説）。本発明者らによって、パッケージング細胞中のウイルスベクターの適切な相補には、適合性を有するE1B-55KとE4-orf6の遺伝子産物の存在が必要である事が観察された。もし細胞がパッケージされるべきベクターにより提供されない機能を補う蛋白質をコードするある配列を備えるならば、パッケージング細胞は相補細胞とも呼ばれる。そこで本願明細書中で「適合する」とは、利用可能なE1B-55K遺伝子産物の間の複合体が利用可能なE4-orf6の遺伝子産物と機能を有する複合体を形成できる事を意味し、それは、野生型の場合に匹敵する、あるいは組み換えアデノウイルス抗原型5ベクターが293またはPER.C6（登録商標）などのAd5相補細胞株で作製された時に見出される場合に匹敵する程度まで、この蛋白質複合体はウイルスの複製、増殖、および/またはパッケージングを支援するという意味である。もしウイルスが形成される産生期間の間に、少なくとも適合するE1B-55K蛋白質とE4-orf6蛋白質を細胞が備えるならば、パッケージング細胞中におけるベクター複製は効率的である。好ましくは、E1B-55KとE4-orf6配列は同じアデノウイルスサブグループ（A,B,C,D,EまたはFなど）中のアデノウイルス由来である。より好ましくは、E1B-55KとE4-orf6配列は同じ抗原型に由来する。抗原型5のようなサブグループCのアデノウイルスの成長を支持することが可能な、確立された細胞株を本技術分野で入手することが可能であり、E1B-55KとE4-orf6遺伝子がアデノウイルス抗原型5から得られる事はより好ましい。当業者に理解されるように適合性は、相補試験または、アデノウイルスベクター産生の技術分野の当業者の範囲内であるアッセイによって測定される。本技術分野の当業者は、E1B-55KとE4-orf6蛋白質が適合性を有する限り、任意の相補細胞株における任意のアデノウイルス抗原型の産生のために、本発明を使用できる事も理解するであろう。
更に、相補細胞株中のE1Bと「マッチング」するE4-orf6遺伝子産物は、アデノウイルスベクターにより、最適なアデノウイルスベクター中のE4-orf6を、パッケージング細胞株中に存在するE1B遺伝子と適合するE4-orf6コード配列と置き換えることにより提供されることが観察された。驚くべきことにこの改変は、ベクターの安定性、複製、パッケージング、アッセンブリーおよび産生に重大な影響を及ぼさないことが見出された。
本発明のある観点は、アデノウイルス抗原型5またはサブルグープC由来の他の抗原型（アデノウイルス抗原型1,2,6など）の産生のために普通に適用される細胞株上で、サブルグープC由来のものとは異なったアデノウイルス抗原型を、今や効率的に産生できるというものである。本発明は、E4-orf6を有する相補（パッケージ）細胞を別途提供する必要なく、非グループCアデノウイルスを産生するための方法を提供するものであり、なぜならば、相補E1B-55K配列と適合するE4-orf6配列がアデノウイルスの骨格中に導入されるからである。
本発明は、第1抗原型のアデノウイルスの構造的および非構造的な要素を備える組み換えアデノウイルスベクターを提供するものであり、ここで前記ベクターは機能を有するE4-orf6蛋白質、または機能を有するその一部分、誘導体および/または類似物をコードする配列を更に備え、ここで前記配列は、a)前記第1抗原型とは異なる第2抗原型のアデノウイルスから得られたE4-orf6コード配列；b)一つまたはそれ以上のコドンにおいて欠失、変異、付加および/または置換を有する、前記第1抗原型のアデノウイルスから得られたE4-orf6コード配列；およびc)前記第1抗原型とは異なる第2抗原型から得られたE4-orf6コード配列の一部と、第3抗原型から得られたE4-orf6コード配列の一部の間の融合を備えるE4-orf6コード配列であって、ここで前記前記第3抗原型は前記第1抗原型と同一であっても、異なっていてもよい、上記E4-orf6コード配列、からなる群から選択される。一つの態様において本発明は、前記第1抗原型と前記第2抗原型は異なったアデノウイルスサブグループに由来する、本発明による組み換えアデノウイルスベクターを提供する。好適な態様において、前記第1抗原型はサブグループC以外のサブグループに由来し、前記E4-orf6コード配列はサブグループCの抗原型のアデノウイルスから得られる、本発明の組み換えアデノウイルスベクターが提供される。より好適なのは、前記第1抗原型はサブグループBに由来し、前記第2の抗原型はサブグループCから得られる、本発明の組み換えアデノウイルスである。更により好適には、前記E4-orf6コード配列はアデノウイルス抗原型5から得られる。本発明の組み換えアデノウイルスは構造的および非構造的な要素を備える。構造的な要素の例は、ファイバー、ヘキソン、およびペントン蛋白質などのカプシド蛋白質をコードする遺伝子のみならず、その遺伝子産物そのものである。非構造的な要素の例は早期遺伝子であり、早期遺伝子は感染することにより細胞中へ発現し、感染サイクルが進行する時にダウンレギュレートされる。非構造的な要素の他の例は、polおよびpTPなどの、複製の間に蛋白質を活性にコードする遺伝子である。
一つまたはそれ以上のコドンにおける欠失、変異、付加および/または置換などの核酸におけるいくつかの改変は、コードされた遺伝子産物の構造および/または機能性も顕著に変えるかもしれない。そこで本発明は、例えば構造的および非構造的な要素などの遺伝子を有する骨格と同じアデノウイルス抗原型から得られたE4-orf6によりコードされた配列にも関連するが、E4-orf6コード配列は変異し、アデノウイルスベクターがその中で産生される相補細胞中に存在するE1蛋白質（E1B-55K遺伝子産物など）と適合するようになっている。そのコドンは変異してコードされるアミノ酸を完全に変化させることもあるが、それは部分的に変異してコードされたアミノ酸を変化させてもよい。核酸が欠失するとコードされたアミノ酸を一つまたはそれ以上損失するという結果となり；一方、それはフレームシフトを起こす結果となってもよい。本発明は、種々の抗原型から得られた種々の部分を備えるアデノウイルス核酸中に存在するE4-orf6配列にも関連し、ここで蛋白質に適合した中で機能を付与するドメインは、一つの抗原型から使用されてもよく、一方、E4-orf6配列の残りの部分またはその一部分は、他の関連した（関連していない）抗原型（例えば、同じサブクループから、異なったサブクループからまたは異なった種から、あるいはその組合わせ）から得られる。そこで、適合性を有するE4-orf6融合蛋白質を適用することも本発明の範囲内である。そのような融合蛋白質は核酸のいくつかの断片の産物であってもよい。
本技術分野の当業者は、全てのヒトアデノウイルスに加えて、多くの非ヒトアデノウイルスが本技術分野で同定されてきた事実に気が付くであろう。明らかに、本発明により開示されたのと同じ結果に到達するために、非ヒトアデノウイルスを利用することもできる。E1B-55KとE4-orf6の間の適合性はヒトアデノウイルスに限定されないが、種々の種において特異的なアデノウイルス由来の要素も適合性を有することができることは、当業者に明らかであろう。そこで、E1B-55KとE4-orf6遺伝子産物が適合性を有する限り、非ヒトアデノウイルスを、本技術分野において入手可能な既知のパッケージング細胞株において高力価に産生できるというのも、本発明の他の観点である。本発明の方法および手段を用いて産生できる非ヒトアデノウイルスの非限定的な例は、イヌ、ウシ、ヒツジ、カエル、ブタ、ウマ、サルおよび鳥のアデノウイルスである。そこで本願明細書中における抗原型とは、種に限定された抗原型を超えるものである。例えば、もしサルのアデウイルスE4-orf6遺伝子産物がパッケージング細胞により提供されるE1B-55Kと適合するならば、この組合わせは本発明の範囲内である。また異なった抗原型の間に、または、例えばパッケージング細胞のE1B遺伝子と適合するヒトおよび鳥のアデノウイルスから得られたE4-orf6配列の間に融合が適用されるならば、その特定の組み合わせも本発明の範囲内であろう。
本発明は第1抗原型のアデノウイルスの構造的および非構造的要素を備える組み換えアデノウイルスベクターを産生するための方法を提供するものであり、前記方法は下記の過程：a) 第2抗原型のアデノウイルスから得られたE1B-55Kコード配列、または機能を有するその一部分、誘導体および/または類似物を発現可能な型で有する相補細胞に、前記相補細胞により前記組み換えアデノウイルスベクターのアッセンブリーを可能とするようなアデノウイルスの必要な要素を提供する過程であって、ここで前記要素は、前記第2抗原型とは異なる前記第１抗原型のアデノウイルスに由来する少なくともいくつかの構造的および非構造的な要素、および機能を有するE4-orf6蛋白質、または機能を有するその一部分、誘導体および/または類似物をコードする配列を備え、前記E4-orf6蛋白質は前記相補細胞において前記発現可能なE1B-55K蛋白質と適合性を有する、上記提供過程；b) アデノウイルスベクターの生成およびアッセンブリーが起こるのを可能とする条件下で、前記相補細胞を培地中で培養する過程、および、c) 該培地および/または該相補細胞からそのように作製された組み換えアデノウイルスベクターを回収する過程、を備え、ここで適合性を有するE4-orf6蛋白質をコードする配列が、そのような作製された組み換えアデノウイルスベクター中に存在する。
本発明の一つの観点において本発明の方法が提供され、ここで前記E4-orf6コード配列は下記の群：i)前記第2抗原型のアデノウイルスから得られたE4-orf6コード配列；ii)前記第1および第2抗原型とは異なっている第3抗原型のアデノウイルスから得られたE4-orf6コード配列；iii)前記第1抗原型のアデノウイルスから得られ、一つまたはそれ以上のコドンにおいて欠失、変異、付加および/または置換を有するE4-orf6コード配列；およびiv)第3抗原型から得られたE4-orf6コード配列の一部分と、前記第2抗原型のアデノウイルスから得られたE4-orf6コード配列の一部分の間に融合を備えるE4-orf6コード配列であって、ここで前記第3抗原型は前記第1抗原型と同じであってもよく、異なっていてもよい、上記E4-orf6コード配列、からなる群から選択される。好ましい態様において、前記第1および前記第2抗原型は異なったサブグループに由来する。より好ましい態様において、前記第2抗原型はサブグループCのアデノウイルス抗原型である。尚より好ましい態様においては、前記第2抗原型はアデノウイルス抗原型5である。本発明の他の特定の観点において、前記第1抗原型はサブグループBのアデノウイルス抗原型である。好ましくは、前記第1の抗原型はアデノウイルス抗原型11, 14, 16, 21, 34, 35および50からなる群から選択される。
組み換えアデノウイルスベクターを相補し、アデノウイルス微粒子を産生し、アッセンブリーし、およびパッケージするために使用されるパッケージング細胞は、本技術分野においていくつか知られている。そのような細胞株の非限定的な例は、HEK-293, 911およびPER.C6（登録商標）細胞である。高力価のアデノウイルスのストックを運搬することが既に証明されている細胞株を使用することは好ましい。そのような細胞株は安定した態様でE1蛋白質を発現し、そこで、それは細胞株と方法を使用するための本発明の好適な態様であり、ここで前記E1B-55Kコード配列は、前記相補細胞のゲノム中に結合する。より好ましいのは、初代の、二倍体のヒト細胞、またはその前駆細胞から得られた相補細胞である。尚更に好ましくは前記相補細胞は、初代ヒト網膜芽細胞、初代ヒト胚腎臓細胞、初代ヒト神経細胞、または初代ヒト羊膜細胞から得られる。非常に好ましいのは、本発明により提供された方法において相補細胞を使用することであり、ここで前記相補細胞はPER.C6細胞（登録商標）またはその誘導体である。PER.C6（登録商標）細胞は、その細胞により提供された核酸と重複を有さないアデノウイルスDNAを使用したときに、複製可能なアデノウイルスを起こすことがないと本技術分野でよく知られている。本技術分野で使用されるアデノウイルスベクターの多くはE1領域を欠き、そこで本発明の一つの観点において、前記相補細胞は、そのゲノム中に結合した、少なくとも一つのアデノウイルスE1A蛋白質をコードする核酸を備える。好ましくは、少なくとも一つのアデノウイルスE1A蛋白質をコードする前記核酸は、サブグループBとは異なったサブグループのアデノウイルス抗原型から得られる。より好ましくは、少なくとも一つのアデノウイルスE1A蛋白質をコードする前記核酸は、サブグループCのアデノウイルス抗原型から得られる。非常に好ましいのは、少なくとも一つのアデノウイルスE1A蛋白質をコードする前記核酸は、アデノウイルス抗原型5から得られるという態様である。本発明の他の態様において、本発明は方法を提供するものであり、その方法において、前記E4-orf6コード配列および前記E1B-55Kコード配列が異なったアデノウイルス抗原型から得られ、前記異なったアデノウイルス抗原型は同じアデノウイルスサブグループのメンバーである。好ましくは、前記E4-orf6コード配列および前記E1B-55Kコード配列は異なったアデノウイルス抗原型から得られ、ここで前記異なったアデノウイルス抗原型は両者ともサブグループCのメンバーである。より好ましくは、前記E4-orf6コード配列および前記E1B-55Kコード配列は同じアデノウイルス抗原型から得られる。非常に好適なのは、前記E4-orf6コード配列および前記E1B-55Kコード配列がアデノウイルス抗原型5から得られる方法である。
本発明は、適切な相補/パッケージング細胞および興味の対象であるアデノウイルスベクターを用いて、アデノウイルスベクターを作製することができる方法にも関する。効率的な作製工程のために、適切なアデノウイルスベクターと共に正しい細胞を適用することは有用である。そこで本発明は部品のキット（「パッケージングシステムとも呼ばれる」）にも関連し、その部品のキットは、a) 第1抗原型のアデノウイルスの構造的および非構造的な要素を備える組み換えアデノウイルスベクターを産生するための相補細胞であって、前記細胞は、第2抗原型のアデノウイルスから得られた、E1B-55Kコード配列、または機能を有するその一部分、誘導体および/または類似物を発現可能な型で有する、上記相補細胞；および、b) 前記相補細胞によって前記組み換えアデノウイルスベクターのアッセンブリーを可能とするような、全て必要なアデノウイルスの要素である一つまたはそれ以上の複製可能な核酸ベクターであって、ここで前記要素は、前記第2抗原型とは異なっている前記第1抗原型のアデノウイルスに由来する少なくともいくつかの構造的および非構造的な要素、および機能を有するE4-Orf6蛋白質、または機能を有するその一部分、誘導体および/または類似物をコードする配列を備え、該E4-Orf6蛋白質は前記相補細胞中で前記発現可能なE1B-55K蛋白質と適合性を有する上記核酸ベクターを備える。好ましくは部品のキットが使用され、ここで前記E4-orf6コード配列は下記の群：a)前記第2抗原型のアデノウイルスから得られたE4-orf6コード配列；b)前記第1および第2抗原型とは異なった第3抗原型のアデノウイルスから得られたE4-orf6コード配列；c)一つ又はその以上のコドンの欠失、変異、付加および/または置換を有する前記第1抗原型のアデノウイルスから得られたE4-orf6コード配列；および、d)第3抗原型から得られたE4-orf6コード配列の一部分と前記第2抗原型のアデノウイルスから得られたE4-orf6コード配列の一部分の間の融合を備えるE4-orf6コード配列であって、ここで前記第3抗原型は前記第1抗原型と同一であっても、異なっていてもよい上記E4-orf6コード配列、から選択される。
本発明は特に、殆ど全てがアデノウイルス5以外の抗原型から得られた、E1欠損キメラアデノウイルスの複製のために有用である。そのようなベクターは、アデノウイルス5 E4-orf6または機能を有するその一部分、誘導体および/または類似体をコードする核酸から提供される事のみが必要である。一度それが提供されると正常なアデノウイルス5 E1相補パッケージング細胞株上で効率的にベクターを複製することができる。ベクターの安定性が改善され、そしてE1AとE1Bの両者においてベクターの欠失は相補されるであろう。そのようなベクターにアデノウイルスE4-orf6をコードする核酸を提供することにより、293または911細胞上で生育させたときに、効率的なプラーク精製、および加えての野生型の混入の問題なしに良い収率を得ることが可能となる。PER.C6細胞において、もちろん、野生型アデノウイルス混入は他の方法でも防ぐことができる。
本発明の組み換えベクターの更なる利点は、核酸由来のアデノウイルスE4-orf6がゲノム中に結合した、特別の細胞株を産生する必要がないということである。そのような細胞株は存在するが、スケールアップなどの産生パラメーター、および/または制御課題は、PER.C6（登録商標）のような細胞株に対するのと同程度まで解決されていない。その少なくとも一部分は、より多くの外来遺伝子が細胞株のゲノム中に挿入されることにより、全ての外来配列の安定性（またはその発現）を維持することは困難となるいう事実による。本発明において、非アデノウイルス抗原型5に基づいたベクターの収率の低さと、アデノウイルス抗原型5パッケージ細胞株上のアデノウイルス抗原型７, 11および35のような、サブグループB由来のアデノウイルス抗原型ベクターの安定性に関連した問題の少なくともいくつかは、本発明の組み換えアデノウイルスベクターによって克服できることが見出された。
本発明の２つの主たる観点を組合わせて、容易に入手可能な便利なパッケージング細胞上で生育できる安定な組み換えアデノウイルスを提供できることは明らかであろう。そこで本発明は、少なくともE1領域に欠失を有する組み換え核酸分子を備える組み換えアデノウイルスを提供するものであり、pIX遺伝子の発現を増加させるE1B 55K遺伝子産物をコードする配列の少なくとも一部分が前記組み換え核酸分子中に存在するという特徴を有するが、但し、前記組み換え核酸分子は機能を有するE1B 55K遺伝子産物をコードせず；前記組み換えアデノウイルスは第１抗原型のアデノウイルスの構造的および非構造的な要素を更に備え、ここで前記アデノウイルスは、機能を有するE4-orf6蛋白質、または機能を有するその一部分、誘導体および/または類似物をコードする配列を更に備え、ここで前記配列は、前記第1抗原型とは異なっている第2抗原型のアデノウイルスから得られたE4-orf6コード配列である。E1B 55K配列の一部分を少なくとも有する事に代えて又はそれに加えて、前記核酸配列は異種プロモーターによって制御されるpIX遺伝子産物を有することがある。好ましくは、前記第2抗原型および従ってE4-orf6配列はグループCのアデノウイルスから、より好ましくはアデノウイルス抗原型5から得られる。好ましくは、前記第1抗原型はグループC以外のサブグループに、好ましくはAd11, Ad14, Ad16, Ad21, Ad34, Ad35またはAd50などのグループBの抗原型に由来する。一つの態様において、組み換えアデノウイルスは非アデノウイルス蛋白質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする配列を更に含む。組み換えアデノウイルス中のE4-orf6がAd5 E1遺伝子産物と適合するとき、例えば前記アデノウイルス中のE4-orf6がAd5から得られるとき、そのような組み換えアデノウイルスは安定であって、好ましくはPER.C6（登録商標）細胞であるAd5 E1-含有パッケージング細胞などの容易に入手できるパッケージング細胞上で容易に生育可能である。アデノウイルスの微粒子を含んでいる複製可能なアデノウイルスまたは機能を有するE1蛋白質の産生を防ぐことは、本技術分野で認識されている問題であるが、アデノウイルス中に存在するE1配列とパッケージング細胞中のその配列の間の重複を防ぐことによって解決されてきた（米国特許5,994,128）。本発明の態様において、例えば、pIX発現に影響することによりウイルスの安定性を増加させるE1B 55K配列を備えるAd35由来アデノウイルスと、A5由来のE1領域を備えるパッケージング細胞との組み合わせは、機能を有するE1B 55K蛋白質をコードする核酸を備える組み換えアデノウイルスを同時に形成する相同組み換えへ至ることはないであろう。そこで本発明の他の観点は、パッケージング細胞、および、第1抗原型のアデノウイルスの構造的および非構造的な要素を備える組み換えアデノウイルスを含むパッケージングシステムを提供するものであり、ここで前記パッケージング細胞は、第2抗原型のアデノウイルスから得られたE1B 55K蛋白質、または機能を有するその一部分、誘導体および/または類似物を少なくともコードする核酸を発現し、前記組み換えアデノウイルスは前記パッケージング細胞中で複製可能であって安定な組み換えアデノウイルスを生成し、前記アデノウイルスはE1領域に欠失を有する核酸分子と備え、且つ、E1B 55K遺伝子産物をコードする配列の一部分を更に備え、前記核酸分子は機能を有するE4-orf6蛋白質、または機能を有するその一部分、誘導体および/または類似物をコードする配列を更に備え、そのE4-orf6蛋白質はパッケージング細胞中で前記の発現可能なE1B 55K蛋白質と適合性を有する。好ましくは、前記第1抗原型はAd35またはAd11である。好ましくは、前記第2抗原型はAd5である。より好ましくは、前記パッケージング細胞はPER.C6（登録商標）である。好ましくは、機能を有するE4-orf6蛋白質、または機能を有するその一部分、誘導体および/または類似物をコードする前記配列は、第1抗原型のアデノウイルスから得られる。このシステムは、機能を有するE1蛋白質を含んでいるアデノウイルスを同時に産生することなく、組み換えアデノウイルスの複製を可能とするであろう。代わりに又はそれに加えて、前記核酸は外来プロモーターの制御下にpIXコード配列を含むことができる。本発明の他の観点は、第1抗原型のアデノウイルスの構造的および非構造的な要素を備える、安定な組み換えアデノウイルスを作製するための方法を提供することであり、ここで前記組み換えアデノウイルスはアデノウイルス由来の組み換え核酸分子を備え、そのアデノウイルスの核酸分子はE1領域に欠失を有し、且つ、E1B-55K遺伝子産物をコードする配列の少なくとも一部分から得られた核酸を備え、そのE1B-55K遺伝子産物は、前記核酸分子から機能を有するE1B-55K蛋白質の発現をもたらすことのないpIX蛋白質の発現を増加させ、および/または、異種プロモーターの制御下にpIXコード配列を有し、前記方法は下記の過程：a) 第2抗原型のアデノウイルスから得られたE1B-55Kコード配列、または機能を有するその一部分、誘導体および/または類似物を発現可能な型で発現している相補細胞に、前記相補細胞により前記組み換えアデノウイルスベクターのアッセンブリーを可能とするようなアデノウイルスの必要な要素を提供する過程であって、ここで前記要素は、前記第2抗原型とは異なる前記第１抗原型のアデノウイルスに由来する少なくともいくつかの構造的および非構造的な要素、および機能を有するE4-orf6蛋白質、または機能を有するその一部分、誘導体および/または類似物をコードする配列を備え、前記E4-orf6蛋白質は前記相補細胞において前記発現可能なE1B-55K蛋白質と適合性を有する、上記提供過程；b)組み換えアデノウイルスの生成およびアッセンブリーが起こるのを可能とする条件下で、前記相補細胞を培地中で培養する過程、および、c) 該培地および/または該相補細胞からそのように作製された組み換えアデノウイルスを回収する過程を備える。更に本発明は、本発明由来の組み換えアデノウイルスを、ヒトまたは動物の体の治療のために、ワクチン接種のために、遺伝子治療のために、疾患または病気の治療のために医薬を調製するために使用する方法を提供するものである。本発明は、本発明によるアデノウイルスを含む薬剤調製物も提供するものである。
本発明をいくつかの実施例と共に描写するが、それは本発明の範囲を限定する事を意図するものではない。
示した場合以外には標準的な分子生物学の方法を使用した（例えば、Sambrook and Russel, 2001）。プライマーの配列を表IVに提供する。
実施例１．Ｅ１を欠失したＡｄ３５ウイルスのためのＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）を基にした相補細胞株
ＰＥＲ．Ｃ６培養培地［１０％までのＦＢＳ（ギブコＢＲＬ）及び１０ｍＭのＭｇＣｌ２（４．９Ｍのストック溶液、シグマ）を補ったＤＭＥＭ（ギブコＢＲＬ）］中で、３ｘ１０６個の細胞／培養皿の密度で、１０ｃｍの培養皿にＰＥＲ．Ｃ６細胞を播いた。２日後、ＳｃａＩで直鎖状化したｐＩＧ３５．５５ＫのＤＮＡ（下に記載）の１μｇで９つの培養皿をトランスフェクトし、ＳｃａＩで直鎖状にしたｐＩＧ３５．５５ＫのＤＮＡの１．５μｇで９枚の培養をトランスフェクトした。別の対照の培養皿では、ＳｃａＩで直鎖状にしたｐＡｄＡｐｔ３５．ＬａｃＺ（ＷＯ ００／７００７１に記載）の１μｇ又は１．５μｇでトランスフェクトし、形質質移入効率をモニターし、また、ＳｃａＩで直鎖状にしたｐｃＤＮＡ．ｎｌｓＬａｃＺの１μｇ又は１．５μｇでトランスフェクトした。ｐｃＤＮＡ．ｎｌｓＬａｃＺ（ＷＯ９９／５５１３２に記載）は、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるｎｌｓＬａｃＺ遺伝子を有するｐｃＤＮＡ３を基にしたプラスミド（インビトロゲン）である。ｐｃＤＮＡ．ｎｌｓＬａｃＺはまた、ｎｅｏｒ発現カセットを含有する。陰性対照として、余分の培養皿１枚を、ｎｅｏｒ選抜遺伝子を欠くコンストラクトである直鎖状にしたｐＡｄＡｐｔ３５．ＬａｃＺでトランスフェクトした。全てのトランスフェクションは、製造元の指示書に従って、ＤＮＡμｇ当たり５ｍｌのリポフェクトアミン試薬を用いて、リポフェクトアミン形質移入キット（インビトロゲン／ライフテクノロジーズ）により行った。トランスフェクション混合物と共に細胞を４時間インキュベートし、その後、培地をＰＥＲ．Ｃ６培養培地に置き換えた。翌日、１μｇ又は１．５μｇのｐＡｄＡｐｔ３５．ＬａｃＺでトランスフェクトした２枚の培養皿を除いて、培地を、０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（ギブコＢＲＬ）を含有する培養培地に置き換えた。これらの後者の培養皿は、トランスフェクトして２日のＬａｃＺの発現をモニターするのに用いた。これらの培養物をＸ−ｇａｌ染色した後、形質移入効率は、１．５μｇのＤＮＡでトランスフェクトした培養皿の中のやや青色が多い細胞により、およそ４０％であると概算された。トランスフェクトされた残りの培養皿では、選抜培地を週に２回取り替えた。選抜培地を最初に添加した後の２週間以内に、陰性対照の培養皿（１．５μｇのｐＡｄＡｐｔ３５．ＬａｃＺでトランスフェクトした）における細胞はほとんど死滅した。ｐｃＤＮＡ．ｎｌｓＬａｃＺでトランスフェクトした培養皿では、細胞クローンが見えるようになった。ｐＩＧ３５．５５Ｋでトランスフェクトした細胞の方がＧ４１８に対してさらに耐性を有すると思われたので、トランスフェクトの３週間後、濃度を０．７５ｍｇ／ｍｌに上げた。３日後及び７日後に、ｐＩＧ３５．５５Ｋでトランスフェクトした培養皿から合計１９６の細胞クローンを選び、９６穴プレートの別々のウエルに播いた。
ＰＥＲ．Ｃ６培養培地［１０％までのＦＢＳ（ギブコＢＲＬ）及び１０ｍＭのＭｇＣｌ２（４．９Ｍのストック溶液、シグマ）を補ったＤＭＥＭ（ギブコＢＲＬ）］中で、３ｘ１０６個の細胞／培養皿の密度で、１０ｃｍの培養皿にＰＥＲ．Ｃ６細胞を播いた。２日後、ＳｃａＩで直鎖状化したｐＩＧ３５．５５ＫのＤＮＡ（下に記載）の１μｇで９つの培養皿をトランスフェクトし、ＳｃａＩで直鎖状にしたｐＩＧ３５．５５ＫのＤＮＡの１．５μｇで９枚の培養をトランスフェクトした。別の対照の培養皿では、ＳｃａＩで直鎖状にしたｐＡｄＡｐｔ３５．ＬａｃＺ（ＷＯ ００／７００７１に記載）の１μｇ又は１．５μｇでトランスフェクトし、形質質移入効率をモニターし、また、ＳｃａＩで直鎖状にしたｐｃＤＮＡ．ｎｌｓＬａｃＺの１μｇ又は１．５μｇでトランスフェクトした。ｐｃＤＮＡ．ｎｌｓＬａｃＺ（ＷＯ９９／５５１３２に記載）は、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるｎｌｓＬａｃＺ遺伝子を有するｐｃＤＮＡ３を基にしたプラスミド（インビトロゲン）である。ｐｃＤＮＡ．ｎｌｓＬａｃＺはまた、ｎｅｏｒ発現カセットを含有する。陰性対照として、余分の培養皿１枚を、ｎｅｏｒ選抜遺伝子を欠くコンストラクトである直鎖状にしたｐＡｄＡｐｔ３５．ＬａｃＺでトランスフェクトした。全てのトランスフェクションは、製造元の指示書に従って、ＤＮＡμｇ当たり５ｍｌのリポフェクトアミン試薬を用いて、リポフェクトアミン形質移入キット（インビトロゲン／ライフテクノロジーズ）により行った。トランスフェクション混合物と共に細胞を４時間インキュベートし、その後、培地をＰＥＲ．Ｃ６培養培地に置き換えた。翌日、１μｇ又は１．５μｇのｐＡｄＡｐｔ３５．ＬａｃＺでトランスフェクトした２枚の培養皿を除いて、培地を、０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（ギブコＢＲＬ）を含有する培養培地に置き換えた。これらの後者の培養皿は、トランスフェクトして２日のＬａｃＺの発現をモニターするのに用いた。これらの培養物をＸ−ｇａｌ染色した後、形質移入効率は、１．５μｇのＤＮＡでトランスフェクトした培養皿の中のやや青色が多い細胞により、およそ４０％であると概算された。トランスフェクトされた残りの培養皿では、選抜培地を週に２回取り替えた。選抜培地を最初に添加した後の２週間以内に、陰性対照の培養皿（１．５μｇのｐＡｄＡｐｔ３５．ＬａｃＺでトランスフェクトした）における細胞はほとんど死滅した。ｐｃＤＮＡ．ｎｌｓＬａｃＺでトランスフェクトした培養皿では、細胞クローンが見えるようになった。ｐＩＧ３５．５５Ｋでトランスフェクトした細胞の方がＧ４１８に対してさらに耐性を有すると思われたので、トランスフェクトの３週間後、濃度を０．７５ｍｇ／ｍｌに上げた。３日後及び７日後に、ｐＩＧ３５．５５Ｋでトランスフェクトした培養皿から合計１９６の細胞クローンを選び、９６穴プレートの別々のウエルに播いた。
１μｇのｐＩＧ３５．５５ＫのＤＮＡでトランスフェクトした２枚の１０ｃｍ培養皿でコロニーを選択した後に残っている細胞をトリプシン処理して集め、増殖させてプールＰＥＲ５５Ｋ（１．０）を得た。１．５μｇでトランスフェクトした２枚の培養皿についても同じことを行った。ＰＥＲ５５Ｋ（１．０）の細胞プールを増殖させ、トランスフェクションのために、３．５ｘ１０６個の細胞／フラスコの密度にて４つのＴ２５フラスコに播き、ウイルスの生成を調べた。さらに、同じ密度にて、親であるＰＥＲ．Ｃ６細胞を３つのＴ２５フラスコに播いた。ｐＡｄＡｐｔ３５．ｅＧＦＰ［ｐＡｄＡｐｔ３５ＩＰ１（ＷＯ ００／７００７１に記載）を基にしたアダプタープラスミドであるが、マーカー遺伝子として緑色蛍光タンパク質も含有し、ｐＩＰｓＡｄａｐｔ．ｅＧＦＰ（ＷＯ ０２／２４９３３に記載）に由来するＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片としてｐＡｄＡｐｔ３５ＩＰ１にクローニングされた］をＰａｃＩで消化し、プラスミドの骨格からアデノウイルスの配列を遊離させた。ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ（ＷＯ ００／７００７１に記載）をＮｏｔＩで消化し、コスミドの骨格からアデノウイルスの配列を遊離させた。ＰＥＲ．Ｃ６細胞の入った２つのフラスコ及びＰＥＲ５５Ｋ細胞（１．０）の入った２つのフラスコをそれぞれ、２μｇの消化したｐＡｄＡｐｔ３５．ｅＧＦＰ及び６μｇの消化したｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲでトランスフェクトした。各細胞株のフラスコの１つを８μｇのｐＡｄＡｐｔ３５．ＬａｃＺでトランスフェクトし、形質移入の効率をモニターした。ＰＥＲ．５５Ｋ（１．０）の入った残りのフラスコは陰性対照として使い、他と同様に処理したが、トランスフェクション混合物で処理されることはなかった。トランスフェクトはすべて、製造元の指示書に従って、それぞれのトランスフェクションについて合計で８μｇのＤＮＡ及び４０μｌのリポフェクトアミン試薬を用いて、リポフェクトアミン（インビトロゲン／ライフテクノロジーズ）により行った。４時間のインキュベートの後、トランスフェクション混合物を取り除き、新鮮な培養培地を加えた。細胞を播いた翌日、トランスフェクションを行い、２日後、再び、ＬａｃＺの対照トランスフェクションを除いて、Ｔ２５フラスコの細胞をＴ８０のフラスコに移した。緩やかに固定した後、これらをＸ−ｇａｌ溶液で染色した。染色溶液と共に５時間インキュベートした後、青色の細胞の比率は双方のフラスコでおよそ９０％と概算され、このことは、双方の細胞株でトランスフェクションが上手く行ったことを示していた。Ｔ８０フラスコに植えついで４日後、トランスフェクトされたＰＥＲ５５Ｋ（１．０）の培養は、およそ１００事象／フラスコでＣＰＥ（細胞変性効果、ウイルス複製の指標）が開始したことを示した。トランスフェクトされなかったＰＥＲ５５Ｋ（１．０）細胞は、ＣＰＥの証拠を示すことなく、集密に増殖した。トランスフェクトされたＰＥＲ．Ｃ６の培養物では、集密な単層の細胞においてたった３個のＣＰＥ事象が見られたにすぎなかった。再び、３日後、トランスフェクトされたＰＥＲ５５Ｋ（１．０）は完全なＣＰＥを示し、細胞はすべて丸く、塊になって浮いていた。対照的に、ＰＥＲ．Ｃ６の培養物では、わずかなＣＰＥも進行せず、細胞は依然として単層であった。このことは、ＰＥＲ．Ｃ６におけるＥ１欠失のＡｄ３５を基にしたウイルスの生成は極めて非効率的であるという以前の所見を裏付けている。また、トランスフェクトされていないＰＥＲ５５Ｋ（１．０）の培養物は、予想どおり、ＣＰＥのない集密な単層を示した。ＣＰＥで一杯になったＰＥＲ５５Ｋ（１．０）のフラスコの細胞と培地を回収し、２サイクルの凍結／溶解にかけ、その後、細胞残渣は卓上遠心機における３０００ｒｐｍ１０分間の遠心分離によって取り除いた。得られた粗溶解物の１つを用いて、Ｔ１７５フラスコ（１．５ｍｌ／フラスコ）におけるＰＥＲ５５Ｋ（１．０）細胞の新鮮培養物を感染させた。４日後、完全にＣＰＥとなった際、細胞及び培地を回収した。このことは、最初のトランスフェクションで感染性ウイルスが形成したことを示している。ＧＦＰの発現は、粗溶解物で感染させたＡ５４９細胞の蛍光顕微鏡検査により確認された。次いで、粗溶解物を用いて、以下に記載するように、個々のクローンにおいてこのＥ１欠失のＡｄ３５．ＡｄＡｐｔ．ｅＧＦＰウイルスの相補を分析した。
ｐＩＧ３５．５５ＫでトランスフェクトしたＰＥＲ．Ｃ６細胞から選択された上記のクローンを増殖させ、Ａｄ３５．ＡｄＡｐｔ．ｅＧＦＰの複製を持続する能力の機能を調べた。この点に関して、６穴プレートに２種類の密度でクローンを播き、１日後、１５ｍｌの上述の粗溶解物で感染させた。翌日ＣＰＥをモニターした。この方法で調べた１４６クローンのうち、１９個は２日又は３日目に全面的なＣＰＥを示し、６８個は５日又は６日目に全面的なＣＰＥを示した。残りのクローンは部分的なＣＰＥを示すか、又はわずかな進行事象しか示さなかった。後者は、陰性対照として持ってきたＰＥＲ．Ｃ６細胞と区別できなかった。
これらの結果を基にして２４のクローンを選択し、ｐＡｄＡｐｔ３５．ＧＦＰアダプタプラスミド及び大きなｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲコスミドクローンでトランスフェクトした後に、組換えＥ１欠失ウイルスを生成する能力についてさらにスクリーニングした。この点に関して、クローンをＴ２５フラスコに入れ、上述のようにリポフェクトアミンを用いて、２μｇのアダプタと６μｇの骨格プラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、細胞をＴ８０フラスコに移して培養の過集密を防いだ。Ｔ８０に植え継いで３日後、２４のうち５クローンが全面的なＣＰＥを示し、別の１３クローンが翌日全面的なＣＰＥに進行した。残りの６クローンは、ＣＰＥを示さなかったか、又はその開始のみであった。比較すると、ＰＥＲ．Ｃ６細胞におけるＥ１欠失したＡｄ５ベクターをルーチンに生成すると、一般的に、Ｔ８０フラスコに移して４〜６日後に全面的なＣＰＥを生じる結果となった。
このことは、新しいクローンがＥ１欠失アデノウイルスベクターを効率的に相補することを示している。上述のクローンの１つ（クローン＃１６）を用いて、異なった導入遺伝子を含有するＥ１欠失及びＥ１／Ｅ３欠失のＡｄ３５ウイルスの複数のバッチの生成と生産を行った。この点に関して、異なったアダプタプラスミドを用いたが、上述するような形質移入から生じた粗溶解物におけるウイルスを、新しい細胞株でプラーク精製した。導入遺伝子の活性について単一プラークを調べ、次いで、４〜８の三重層フラスコ（３ｘ１７５ｃｍフラスコ）における中規模生産のために増幅させた。全面的なＣＰＥ時に細胞を回収し、アデノウイルスについて日常行われているようにウイルスを放出させ、精製した。ＨＰＬＣにより、ウイルス粒子の量を測定した（Ｓｈａｂｒａｍ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。表Ｉは、ＰＥＲ５５Ｋクローン＃１６細胞と共に、三重層フラスコにてＥ１欠失及びＥ１／Ｅ３欠失のＡｄ３５ウイルスの中規模生産の下流処理の後の収量を表す。精製したウイルス粒子の量は、ＰＥＲ．Ｃ６細胞でのＡｄ５を基にしたベクターの収量に匹敵する。
我々は、完全にＥ１を欠失したＡｄ３５を基にしたベクターを効率的に相補する複数の細胞株を生成したと結論する。従って、Ａｄ５相補細胞株におけるＡｄ３５のＥ１Ｂ−５５Ｋの発現は、Ａｄ３５ベクターの複製を促進する。
実施例２．ｐＷＥ．Ａｄ．ｐＩＸ−ｒＩＴＲΔＥ３の生成
ヒトのアデノウイルスの初期領域−３は、アデノウイルスの感染に対する宿主免疫反応を妨害するタンパク質のための複数のコーディング領域を含有する。アデノウイルスベクターをワクチンのキャリアとして使用する場合、そのような妨害は望ましくない。従って、我々は、Ｅ３領域を欠くＡｄ３５骨格のコスミドを構築した。
ヒトのアデノウイルスの初期領域−３は、アデノウイルスの感染に対する宿主免疫反応を妨害するタンパク質のための複数のコーディング領域を含有する。アデノウイルスベクターをワクチンのキャリアとして使用する場合、そのような妨害は望ましくない。従って、我々は、Ｅ３領域を欠くＡｄ３５骨格のコスミドを構築した。
この点に関して、コンストラクトｐＢｒ．Ａｄ３５．ＰＲｎ（図１５、公開物ＥＰ１０５４０６４における実施例１３に記載）をＳｔｕＩとＭｌｕＩで消化し、製造元の指示書に従って、アガラーゼ酵素（ロシュ）を用いた低融点（ＬＭＰ）ゲルから１７．３ｋｂのベクター断片を精製した。次に、プライマー３５Ｅ３ｆｏｒ及び３５Ｅ３ｒｅｖを用いて、ｐＢｒ．Ａｄ３５．ＰＲｎでＰＣＲ断片を作成した。増幅には製造元の指示書に従って、ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ）を用い、プログラムは、９４℃で２分間、（９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間及び７２℃で１分間）を３０サイクル、及び６８℃で８分間の最終インキュベートに設定した。ＱＩＡクイックＰＣＲ精製キット（キアゲン）を用いて、８３３ｂｐのＰＣＲ産物を精製し、ＭｌｕＩ及びＳｔｕＩで消化した。ＱＩＡクイックゲル抽出キット（キアゲン）を用いて消化したＤＮＡをゲルから精製した。双方の単離した断片を連結して、ＤＨ５ａコンピテント細胞（インビトロゲン／ライフテクノロジーズ）を形質転換し、ｐＢｒ．Ａｄ３５．ＰＲｎΔＥ３を得た（図２５）。制限解析及びＰＣＲで増幅したインサートの配列決定によってプラスミドをチェックした。次いで、Ｅ３の欠失をｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲコスミド骨格にクローニングした。この点に関して、ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲをＰａｃＩで消化し、イソプロパノール沈殿及び７０％ＥｔＯＨ洗浄により精製した。ミリＱ水への再懸濁に続いて、ＤＮＡをＳｗａＩで消化し、２２．８ｋｂのベクターを含有する断片を、上記のようなアガラーゼ酵素を用いてＬＭＰゲルから精製した。コンストラクトｐＢｒ．Ａｄ３５．ＰＲｎΔＥ３を同様にＰａｃＩ及びＳｗａＩで消化し、アガラーゼ酵素を用いて１６．６ｋｂの断片も単離した。０．５〜０．６μｇの各断片を用いて、双方の単離した断片を連結した。製造元の指示書に従って、λファージパッケージング抽出物（ストラタジーン）を用いて、連結された断片のパッケージを行い、ＳＴＢＬ−２細胞と混合した。細菌をＬＢ＋Ａｍｐのプレートに入れ、得られたコロニーについて正しいコンストラクトが存在するか解析した。これにより、コンストラクトｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲΔＥ３（図１）が得られた。Ｅ３の欠失は、Ａｄ３５配列（ＷＯ ００／７００７１に記載）のヌクレオチド２７６４８〜３０３２０に広がり、従って、２．６ｋｂ領域の長さである。
ＮｏｔＩで消化したｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲΔＥ３とｐＩＰｓｐ−Ｉ（ニューイングランドバイオラボズ）で消化したｐＡｄＡｐｔ３５ｅＧＦＰの、ＰＥＲ５５クローン＃１６細胞（上に記載）へのコトランスフェクションは、ＧＦＰを発現するＡｄ３５を基にしたウイルスを生じた。これらのウイルスからのウイルスＤＮＡを単離する際に、予想どおり、Ｅ３領域のＰＣＲ増幅は、ウイルスが２．６ｋｂのＥ３配列を欠失していることを示した。
実施例３．Ｅ１欠失したＡｄ３５に基づくベクターのパッケージングサイズにおける限界
異なったインサートを含有するＡｄ３５に基づく、Ｅ１欠失及びＥ１／Ｅ３欠失のベクターを作成し、それは、ＰＥＲ５５Ｋクローン＃１６細胞（実施例１を参照のこと）を、
プラスミドベクターの配列からアデノウイルスインサートを遊離させるために、ＰａｃＩまたはｐＩＰｓｐ−１の酵素で消化した特異的な導入遺伝子を持つＡｄ３５アダプタプラスミド１．５μｇ及び、
ＮｏｔＩ酵素で消化したｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ又はＮｏｔＩで消化したｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲΔＥ３のいずれか４．５μｇでトランスフェクトすることにより行った。
異なったインサートを含有するＡｄ３５に基づく、Ｅ１欠失及びＥ１／Ｅ３欠失のベクターを作成し、それは、ＰＥＲ５５Ｋクローン＃１６細胞（実施例１を参照のこと）を、
プラスミドベクターの配列からアデノウイルスインサートを遊離させるために、ＰａｃＩまたはｐＩＰｓｐ−１の酵素で消化した特異的な導入遺伝子を持つＡｄ３５アダプタプラスミド１．５μｇ及び、
ＮｏｔＩ酵素で消化したｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ又はＮｏｔＩで消化したｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲΔＥ３のいずれか４．５μｇでトランスフェクトすることにより行った。
アダプタプラスミドの右側面及び骨格プラスミドの左端は、完全にＥ１を欠失したウイルスゲノム（ＷＯ ００／７００７１に記載）へ至る組換え事象が介在する相同配列を含有する。
製造元の指示書に従って、コンストラクトの各セットについて３０μｌのリポフェクトアミン試薬（インビトロゲン／ライフテクノロジーズ）によりトランスフェクションを行った。Ｔ２５フラスコにて７０％の集密度のＰＥＲ５５Ｋクローン１６細胞にトランスフェクション混合物を加えた。以下の組み合わせでトランスフェクトした。
１．ｐＡｄＡｐｔ３５ＩＰ１＋ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ
２．ｐＡｄＡｐｔ３５ＩＰ１＋ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲΔＥ３
３．ｐＡｄＡｐｔ３５ｅＧＦＰ＋ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ
４．ｐＡｄＡｐｔ３５ｅＧＦＰ＋ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲΔＥ３
５．ｐＡｄＡｐｔ３５Ｌｕｃ＋ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ
６．ｐＡｄＡｐｔ３５Ｌｕｃ＋ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲΔＥ３
７．ｐＡｄＡｐｔ３５ＬａｃＺ＋ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ
８．ｐＡｄＡｐｔ３５ＬａｃＺ＋ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲΔＥ３
１．ｐＡｄＡｐｔ３５ＩＰ１＋ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ
２．ｐＡｄＡｐｔ３５ＩＰ１＋ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲΔＥ３
３．ｐＡｄＡｐｔ３５ｅＧＦＰ＋ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ
４．ｐＡｄＡｐｔ３５ｅＧＦＰ＋ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲΔＥ３
５．ｐＡｄＡｐｔ３５Ｌｕｃ＋ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ
６．ｐＡｄＡｐｔ３５Ｌｕｃ＋ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲΔＥ３
７．ｐＡｄＡｐｔ３５ＬａｃＺ＋ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ
８．ｐＡｄＡｐｔ３５ＬａｃＺ＋ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲΔＥ３
アダプタープラスミドをｐＩＰｓｐ−１酵素で消化してプラスミドベクター骨格からアデノウイルスの配列を遊離させた。同じ理由でトランスフェクションの前に、ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ及びｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲΔＥ３をＮｏｔＩで消化した。アダプタープラスミド及びｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ骨格のコスミドの生成は、以前ＷＯ ００／７００７１に記載されている。ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲΔＥ３の生成は上に記載されている。
トランスフェクションの２日後、細胞をＴ８０に移し、全面的なＣＰＥが得られるまでさらにインキュベートした。全面的なＣＰＥに気づいてから１〜２日後に細胞及び培地を回収した。混合物を１サイクルの凍結／融解にかけ、１５００ｒｐｍで１５分間遠心して、細胞残渣をペレットにし、その後に上清を回収した。このようにして得られた粗溶解物を用いて、ウイルスＤＮＡを単離した。この点に関して、２７５μｌの粗溶解物材料を１０μｌの１０ｍｇ／ｍｌのＤＮＡ分解酵素Ｉと共に３７℃にて３０分間インキュベートした。それに続いて、０．５ＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）６．０μｌ、２０％ＳＤＳ７．５μｌ及び２０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ１．５μｌを加え、ボルテックスによって混合した。次いで、混合物を５０℃にて１時間インキュベートした。最終的には、ジーンクリーンスピンキット（バイオ１０１社）を用いて、ウイルスＤＮＡを単離した。２０μｌのミリＱ水におけるウイルスＤＮＡの溶出に続いて、ＰＣＲ増幅によって導入遺伝子を解析した。この点に関しては、プライマーＡｄＡｐｔ３５ＣＭＶＦ及び３５ｐＩＸＲを用いた。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（インビトロゲン）を用いて、２μｌの単離されたウイルスＤＮＡにより増幅を行った。反応混合物は、合計容積５０μｌに、１０ｘ緩衝液（インビトロゲン）５μｌ、５０ｍＭのＭｇＣｌ２２μｌ、２ｍＭのｄＮＴＰｓ５μｌ、各プライマー（１０μＭのストック）３μｌ及びＴａｑ酵素２．５単位を含有した。プログラムを９４℃で２分間、その後、（９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間及び７２℃で４分間）の３０サイクルに設定した。対照反応は、５ｎｇのアダプタープラスミドで行った。ＰＣＲの終了後、解析のために、５μｌの反応物をゲルにかけた。図２は、上述のトランスフェクションの結果を示す。プライマーは、ＣＭＶプロモーターの５’末端からｐＩＸコーディング領域の５’末端までの配列を増幅する。図２に見ることができるように、導入遺伝子のないウイルス又はＧＦＰインサートを伴うウイルスは予想されたバンドを示す（プラスミド対照と比べて；各ウイルスについてのレーンＰＬ）。より大きなインサート、ルシフェラーゼ及びＬａｃＺにおいてより小さな断片が見られ、これらの欠失は、ウイルスの全長が大きいほど目だってくる（Ｅ３有無のＬａｃＺウイルス又はＬｕｃウイルスを比較せよ）。従って、ゲノム長の増加は、導入遺伝子領域における欠失の発生に相当する。Ａｄ３５．ＡｄＡｐｔ．ｅＧＦＰ及びＡｄ３５．ＡｄＡｐｔ．ＬａｃＺΔＥ３のゲノム全長（それぞれ３３．７ｋｂ及び３３．４ｋｂ）（図２に示される）は匹敵するが、欠失はＬａｃＺウイルス試料においてのみ見い出されるという事実は、前者のＥ１領域におけるインサートの配列又はサイズのいずれかは、欠失の発生に影響しうることを示している。
実施例４．アデノウイルス抗原型５及び３５のｐＩＸ遺伝子領域の配列の比較
組換えＡｄ３５ウイルスのゲノム長が増えるにつれて、導入遺伝子に欠失が生じるという知見は、ｐＩＸ欠失Ａｄ５ウイルス（Ghosh-Choudhury et al., 1987）との類似において、カプシドの安定性の問題があることを示唆している。全長３６．７ｋｂのＡｄ３５．Ｅ１Ｂ＋ＡｄＡｐｔ．Ｌｕｃウイルス（Ｅ１Ａの配列がＡｄＡｐｔ．Ｌｕｃのカセットに置きかえられている）を作製することができるという事実は、Ｅ１Ｂの欠失が役目を担っていることを示唆する。これは、Ｅ１Ｂタンパク質自体の１つの機能を介して、又はほかのアデノウイルスタンパク質の発現に影響を有するこの領域における未知の調節性配列の機能を介して、のいずれかであってもよい。Ｅ１Ｂタンパク質自体がアデノウイルスのパッケージング容量に影響を与えることは、我々の知識では記載されていない。しかしながら、Ｅ１Ｂ−２１Ｋタンパク質はトランスフェクトされたＤＮＡ（Herrman and Mathews, 1989）を非特異的に安定化し、２１Ｋにおける突然変異は結果として、感染の間、細胞性ＤＮＡ及びウイルス性ＤＮＡの分解を生じる（Pilder et al., 1984; White et al., 1984）ことが記載されている。Ａｄ５のＥ１Ｂ−２１Ｋタンパク質は、ＰＥＲ．Ｃ６細胞で発現しているので、これらの知見は、我々の所見に説明を提供していない。ｐＩＸ遺伝子は、Ｅ１Ｂ−５５Ｋのコーディング領域の３’に直接位置する。Ａｄ５については、ｐＩＸとＥ１Ｂがポリアデニル化シグナルを共有するので、ｐＩＸのプロモータとコーディング配列がＥ１Ｂ転写領域の範囲内に位置することが知られている。Ａｄ５の場合、ｐＩＸの発現に必要な最小プロモーター配列が検討されている（Babiss and Vales, 1991）。上流のＳｐ１部位及びＴＡＴＡボックス配列を含有するプロモーター配列は、ｐＩＸの発現に十分であることが示された。Ｓｐ１部位とＴＡＴＡボックスとの間の間隔ならびにＴＡＴＡボックス自体の配列が、ｐＩＸの発現の程度に影響することが示された。Ａｄ３５における相当する領域は、安定なウイルスにおいて十分高い程度にｐＩＸを発現を駆動するかどうかは判っていない。配列の比較は、Ｓｐ１部位及びＴＡＴＡ配列の双方が、Ａｄ５のｐＩＸプロモーターで見い出されるものとは異なっていることを示した。ジェンバンクから利用可能な配列情報を用いて、異なったサブグループの抗原型の近位ｐＩＸの上流配列（すなわち、Ｅ１Ｂ−５５Ｋの停止コドンとｐＩＸ遺伝子の開始コドンの間）の比較を行った。比較には、配列番号及びジェンバンク参照配列を持つ以下のアデノウイルスを用いた：Ａｄ２（配列番号４５；ジェンバンクＮＣ＿００１４０５）、Ａｄ５（配列番号４６；ジェンバンクＭ７３２６０）、Ａｄ１２（配列番号４７；ジェンバンクＮＣ＿００１４６０）、Ａｄ９（配列番号４８；ジェンバンクＡＦ０９９６６５）、Ａｄ４０（配列番号４９；ジェンバンクＬ１９４４３）、Ａｄ４（配列番号５０；ジェンバンクＮＣ＿００３２６６）、サル２５（配列番号５１；ジェンバンクＡＦ３９４１９６）、Ａｄ７（配列番号５４；ジェンバンクＡＤ７００１）。Ａｄ３５の配列（配列番号５２）はＷＯ ００／７００７１に公開されている。Ａｄ１１の配列（配列番号５３）は、以前は公開されていなかったが、本願明細書で提供される。図３Ａは、Ｅ１Ｂ−５５Ｋタンパク質の停止コドン（すべての配列の最初の３つのヌクレオチド）とｐＩＸタンパク質の開始コドン（最後の３つのヌクレオチド）の間の上述の配列のアラインメントを示す。Ａｄ２及びＡｄ５におけるＳｐ１部位及びＴＡＴＡ配列を四角で囲う。ほとんどの場合他の配列においては、Ｓｐ１及びＴＡＴＡボックスを直接指すには不十分な相同性しかない。従って、Ｂｕｃｈｅｒ，Ｐ（１９９０年）によって公開されたようなＧＣ−及びＴＡＴＡボックスに対するコンセンサス配列を用いて、種々の配列における推定上のＳｐ１及びＴＡＴＡボックスを同定した。図３ｂは、推定上のＳｐ１及びＴＡＴＡボックスの配列及びそれらの間の間隔を示す。それぞれサブグループＡ、Ｄ、及びＦに属するＡｄ１２、Ａｄ９及びＡｄ４０は、コンセンサス配列にかなり一致するＳｐ１及びＴＡＴＡボックスの配列を有する。しかしながら、２つのボックスの間の距離は、Ａｄ５及びＡｄ２に対するよりも小さい。Ａｄ５のＥ１Ｂプロモーターも１１ヌクレオチドの間隔を持つＳｐ１ボックスとＴＡＴＡ配列を含有するので、これは特異なことではない。しかしながら、Ｓｐ１とＴＡＴＡボックスの間のＡｄ５ｐＩＸプロモーター配列における（２０のうちの）９ヌクレオチドの欠失は、ｐＩＸレベルの低下を生じた（Babiss and Vales, 1991）。サブグループＢの抗原型、Ａｄ３５、Ａｄ１１及びＡｄ７は、サブグループＥのウイルスＡｄ４と同様に、多様なＴＡＴＡボックス配列及び推定上のＳｐ１配列とＴＡＴＡボックスの間の異なった間隔を有する。ヒトのアデノウイルス４型における近位ｐＩＸ領域は、サルのアデノウイルス２５（ＣＶ６８）におけるものと同一であり、最近治療用ベクター（Farina et al., 2001）として提案された抗原型である。従って、非ヒト型アデノウイルスに基づく複製不全のベクターについても、ｐＩＸの発現は安定なカプシドには不十分である可能性がある。
組換えＡｄ３５ウイルスのゲノム長が増えるにつれて、導入遺伝子に欠失が生じるという知見は、ｐＩＸ欠失Ａｄ５ウイルス（Ghosh-Choudhury et al., 1987）との類似において、カプシドの安定性の問題があることを示唆している。全長３６．７ｋｂのＡｄ３５．Ｅ１Ｂ＋ＡｄＡｐｔ．Ｌｕｃウイルス（Ｅ１Ａの配列がＡｄＡｐｔ．Ｌｕｃのカセットに置きかえられている）を作製することができるという事実は、Ｅ１Ｂの欠失が役目を担っていることを示唆する。これは、Ｅ１Ｂタンパク質自体の１つの機能を介して、又はほかのアデノウイルスタンパク質の発現に影響を有するこの領域における未知の調節性配列の機能を介して、のいずれかであってもよい。Ｅ１Ｂタンパク質自体がアデノウイルスのパッケージング容量に影響を与えることは、我々の知識では記載されていない。しかしながら、Ｅ１Ｂ−２１Ｋタンパク質はトランスフェクトされたＤＮＡ（Herrman and Mathews, 1989）を非特異的に安定化し、２１Ｋにおける突然変異は結果として、感染の間、細胞性ＤＮＡ及びウイルス性ＤＮＡの分解を生じる（Pilder et al., 1984; White et al., 1984）ことが記載されている。Ａｄ５のＥ１Ｂ−２１Ｋタンパク質は、ＰＥＲ．Ｃ６細胞で発現しているので、これらの知見は、我々の所見に説明を提供していない。ｐＩＸ遺伝子は、Ｅ１Ｂ−５５Ｋのコーディング領域の３’に直接位置する。Ａｄ５については、ｐＩＸとＥ１Ｂがポリアデニル化シグナルを共有するので、ｐＩＸのプロモータとコーディング配列がＥ１Ｂ転写領域の範囲内に位置することが知られている。Ａｄ５の場合、ｐＩＸの発現に必要な最小プロモーター配列が検討されている（Babiss and Vales, 1991）。上流のＳｐ１部位及びＴＡＴＡボックス配列を含有するプロモーター配列は、ｐＩＸの発現に十分であることが示された。Ｓｐ１部位とＴＡＴＡボックスとの間の間隔ならびにＴＡＴＡボックス自体の配列が、ｐＩＸの発現の程度に影響することが示された。Ａｄ３５における相当する領域は、安定なウイルスにおいて十分高い程度にｐＩＸを発現を駆動するかどうかは判っていない。配列の比較は、Ｓｐ１部位及びＴＡＴＡ配列の双方が、Ａｄ５のｐＩＸプロモーターで見い出されるものとは異なっていることを示した。ジェンバンクから利用可能な配列情報を用いて、異なったサブグループの抗原型の近位ｐＩＸの上流配列（すなわち、Ｅ１Ｂ−５５Ｋの停止コドンとｐＩＸ遺伝子の開始コドンの間）の比較を行った。比較には、配列番号及びジェンバンク参照配列を持つ以下のアデノウイルスを用いた：Ａｄ２（配列番号４５；ジェンバンクＮＣ＿００１４０５）、Ａｄ５（配列番号４６；ジェンバンクＭ７３２６０）、Ａｄ１２（配列番号４７；ジェンバンクＮＣ＿００１４６０）、Ａｄ９（配列番号４８；ジェンバンクＡＦ０９９６６５）、Ａｄ４０（配列番号４９；ジェンバンクＬ１９４４３）、Ａｄ４（配列番号５０；ジェンバンクＮＣ＿００３２６６）、サル２５（配列番号５１；ジェンバンクＡＦ３９４１９６）、Ａｄ７（配列番号５４；ジェンバンクＡＤ７００１）。Ａｄ３５の配列（配列番号５２）はＷＯ ００／７００７１に公開されている。Ａｄ１１の配列（配列番号５３）は、以前は公開されていなかったが、本願明細書で提供される。図３Ａは、Ｅ１Ｂ−５５Ｋタンパク質の停止コドン（すべての配列の最初の３つのヌクレオチド）とｐＩＸタンパク質の開始コドン（最後の３つのヌクレオチド）の間の上述の配列のアラインメントを示す。Ａｄ２及びＡｄ５におけるＳｐ１部位及びＴＡＴＡ配列を四角で囲う。ほとんどの場合他の配列においては、Ｓｐ１及びＴＡＴＡボックスを直接指すには不十分な相同性しかない。従って、Ｂｕｃｈｅｒ，Ｐ（１９９０年）によって公開されたようなＧＣ−及びＴＡＴＡボックスに対するコンセンサス配列を用いて、種々の配列における推定上のＳｐ１及びＴＡＴＡボックスを同定した。図３ｂは、推定上のＳｐ１及びＴＡＴＡボックスの配列及びそれらの間の間隔を示す。それぞれサブグループＡ、Ｄ、及びＦに属するＡｄ１２、Ａｄ９及びＡｄ４０は、コンセンサス配列にかなり一致するＳｐ１及びＴＡＴＡボックスの配列を有する。しかしながら、２つのボックスの間の距離は、Ａｄ５及びＡｄ２に対するよりも小さい。Ａｄ５のＥ１Ｂプロモーターも１１ヌクレオチドの間隔を持つＳｐ１ボックスとＴＡＴＡ配列を含有するので、これは特異なことではない。しかしながら、Ｓｐ１とＴＡＴＡボックスの間のＡｄ５ｐＩＸプロモーター配列における（２０のうちの）９ヌクレオチドの欠失は、ｐＩＸレベルの低下を生じた（Babiss and Vales, 1991）。サブグループＢの抗原型、Ａｄ３５、Ａｄ１１及びＡｄ７は、サブグループＥのウイルスＡｄ４と同様に、多様なＴＡＴＡボックス配列及び推定上のＳｐ１配列とＴＡＴＡボックスの間の異なった間隔を有する。ヒトのアデノウイルス４型における近位ｐＩＸ領域は、サルのアデノウイルス２５（ＣＶ６８）におけるものと同一であり、最近治療用ベクター（Farina et al., 2001）として提案された抗原型である。従って、非ヒト型アデノウイルスに基づく複製不全のベクターについても、ｐＩＸの発現は安定なカプシドには不十分である可能性がある。
Ａｄ３５ウイルス及びそのほかのヒト型及び非ヒト型アデノウイルスでは、ｐＩＸの発現は異なって調節されており、調節配列、さらにはプロモータ配列自体がＥ１Ｂ配列の中のさらに上流に又はその上さらに上流に位置している。その代わり、ｐＩＸの発現はＥ１Ａタンパク質によって活性化されるので、同一の抗原型又はサブグループに属するＥ１Ａタンパク質の存在下で高レベルのｐＩＸの発現を得ることが可能である。
我々は、内因性の近位ｐＩＸの上流の配列を非相同性のプロモーターに改変してベクターにおけるｐＩＸの発現を高めることが、さらに安定なウイルスを生じ、さらに良好なパッケージング容量（下）を生じることになるかどうかを調べた。または、ｐＩＸの機能は、パッケージング細胞株を介してトランスでもたらされてもよい。非限定例として、我々は、Ａｄ５ウイルスで見い出されるような非内因性の近位ｐＩＸプロモーターを有する組換えのＡｄ３５に基づいたウイルスを記載し、これらのウイルスが改変のない組換えベクターよりもさらに良好な安定性を有することを示す。
実施例５．Ａｄ５のｐＩＸプロモーターを持つアダプタープラスミドの生成
ｐＡｄＡｐｔ５３５は、Ａｄ５のｐＩＸのプロモーターの一部を有するＡｄ３５アダプタープラスミドであるが、そうでなければ、Ａ３５アダプタープラスミドｐＡｄＡｐｔ３５ＩＰ１（ＷＯ ００／７００７１を参照のこと）と同一である。その構築を以下に記載する。
ｐＡｄＡｐｔ５３５は、Ａｄ５のｐＩＸのプロモーターの一部を有するＡｄ３５アダプタープラスミドであるが、そうでなければ、Ａ３５アダプタープラスミドｐＡｄＡｐｔ３５ＩＰ１（ＷＯ ００／７００７１を参照のこと）と同一である。その構築を以下に記載する。
プライマーＳＶ４０ｆｏｒ及びｐＩＸ５Ｒｍｆｅにより第１のＰＣＲ断片を生成する。製造元の指示書に従ってＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ）による反応を行ったが、最終混合物中では３％のＤＭＳＯを有して反応を行った。Ａｄ５のＥ１欠失ウイルスのアダプタープラスミドであるｐＡｄＡｐｔ（１００ｎｇ、ＷＯ ００／７００７１を参照のこと）を鋳型として利用した。プログラムを以下のように：９４℃で２分間、次いで、［９４℃で３０秒間（溶融）、５２℃で３０秒間（アニーリング）及び７２℃で３０秒間（伸長）］の３０サイクル、その後、７２℃で８分間に設定した。得られたＰＣＲ断片は、ｐＡｄＡｐｔ由来のＳＶ４０ポリアデニル化シグナルの３’末端、及びジェンバンクアクセッション番号Ｍ７３２６０のヌクレオチド３５１１〜ヌクレオチド３５８６に存在するＡｄ５のｐＩＸプロモーター領域及びＭｆｅＩ部位を３’末端にて含有する。
上記に記載されているように、しかし、プライマーｐＩＸ３５Ｆｍｆｅと３５Ｒ４によって、第２のＰＣＲ断片を生成した。１００ｎｇのｐＡｄＡｐｔ３５ＩＰ１を鋳型として利用し、アニーリングは５８℃で３０秒間に設定し、ＰＣＲプログラムの伸長は７２℃で９０秒間に設定した。このＰＣＲは、ヌクレオチド３４６７〜ヌクレオチド４６６９（ＷＯ ００／７００７１における配列番号付け）由来のＡｄ３５配列をＰＣＲ増幅し、５’末端にＭｆｅＩ部位を付加する。
双方のＰＣＲ断片を次いでＭｆｅＩで消化し、製造元の指示書に従ってキアゲンＰＣＲ精製キット（キアゲン）を用いて精製した。アガロースゲル上に試料を流すことによって精製した断片の濃度を推定し、４０μｌ容積中にＤＮＡ５μｇ、１０ｘリガーゼ緩衝液４μｌ及びリガーゼ酵素（ニューイングランドバイオラボズ）２μｌを含有するライゲーション反応物において、およそ等モル量の２つの断片を混合した。室温で２時間以上インキュベートを行うのに続いて、その混合物をＴＡＥ中の１．２％のアガロースゲルにかけ、製造元の指示書に従って、ジーンクリーンＩＩキット（バイオ１０１社）により、１．４ｋｂの長さのＤＮＡ断片を単離した。
３０μｌの無菌水中にＤＮＡを溶出し、上述したようなプライマーＳＶ４０ｆｏｒ及び３５Ｒ４によるＰＣＲ増幅反応に１μｌを用いた。アニーリング温度を５２℃及び伸長時間を９０秒間として上述のようにＰＣＲを行った。キアゲンゲル抽出キットを用いて、得られた産物をゲルから単離し、ＡｇｅＩ及びＢｇｌＩＩで消化した。製造元の指示書に従って、ジーンクリーンＩＩキットを用いて得られた０．８６ｋｂのバンドをゲルから単離した。
ｐＡｄＡｐｔ３５．Ｌｕｃ（ＷＯ ００／７００７１に記載）もＢｇｌＩＩ及びＡｇｅＩで消化し、上記のようにジーンクリーンＩＩキットを用いてゲルから５．８ｋｂのベクター断片を単離した。Ａｄ５−Ａｄ３５のキメラｐＩＸプロモーターを含有する上記の単離されたＢａｌＩＩ−ＡｇｅＩ断片にこの断片を連結して、ｐＡｄＡｐｔ５３５．Ｌｕｃ（図４）を得た。
次いで、Ａｄ５のｐＩＸプロモーターを含有するそのほかのアダプタープラスミドを以下のように作製した。
ｐＡｄＡｐｔ５３５．ＬｕｃをＢｇｌＩＩ及びＡｐａＩで消化し、製造元の指示書に従ってジーンクリーンＩＩキットを用いて１．２ｋｂのインサートをゲルから精製した。ｐＡｄＡｐｔ３５ＩＰ１もＢｇｌＩＩ及びＡｐａＩで消化し、上記のように３．６ｋｂのベクター断片を単離した。単離された双方の断片を連結することにより、ｐＡｄＡｐｔ５３５（図５）を生じた。次に、標準のクローニング技術を用いて、ｐＡｄＡｐｔ５３５を使用して、ｅＧＦＰ（ｐＡｄＡｐｔ３５．ｅＧＦＰに由来する）及びＬａｃＺ（ｐＡｄＡｐｔ３５．ＬａｃＺに由来する）のようなそのほかのマーカー遺伝子を複数のクローニング部位にクローニングし、ｐＡｄＡｐｔ５３５．ｅＧＦＰ及びｐＡｄＡｐｔ５３５．ＬａｃＺを生じた。
実施例６．Ａｄ５のｐＩＸプロモーターを含有するアダプタープラスミドを持つＥ１欠失のＡｄ３５に基づくベクターの生成
上述のようなＰＥＲ５５Ｋクローン１６細胞において、アダプタープラスミド及びＡｄ３５ベクターの骨格コスミドをトランスフェクトすることにより組換えウイルスを生成した。この点に関して以下のセットのプラスミドを使用した。
Ｔ１．ｐＡｄＡｐｔ５３５ｅＧＦＰ＋ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ
Ｔ２．ｐＡｄＡｐｔ５３５ｅＧＦＰ＋ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲΔＥ３
Ｔ３．ｐＡｄＡｐｔ３５Ｌｕｃ＋ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ
Ｔ４．ｐＡｄＡｐｔ５３５Ｌｕｃ＋ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ
Ｔ５．ｐＡｄＡｐｔ５３５Ｌｕｃ＋ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲΔＥ３
Ｔ６．ｐＡｄＡｐｔ５３５ＬａｃＺ＋ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ
Ｔ７．ｐＡｄＡｐｔ５３５ＬａｃＺ＋ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲΔＥ３
Ｔ８．ｐＡｄＡｐｔ３５ＬａｃＺ＋ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ
Ｔ９．ｐＡｄＡｐｔ３５ＬａｃＺ＋ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲΔＥ３
上述のようなＰＥＲ５５Ｋクローン１６細胞において、アダプタープラスミド及びＡｄ３５ベクターの骨格コスミドをトランスフェクトすることにより組換えウイルスを生成した。この点に関して以下のセットのプラスミドを使用した。
Ｔ１．ｐＡｄＡｐｔ５３５ｅＧＦＰ＋ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ
Ｔ２．ｐＡｄＡｐｔ５３５ｅＧＦＰ＋ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲΔＥ３
Ｔ３．ｐＡｄＡｐｔ３５Ｌｕｃ＋ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ
Ｔ４．ｐＡｄＡｐｔ５３５Ｌｕｃ＋ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ
Ｔ５．ｐＡｄＡｐｔ５３５Ｌｕｃ＋ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲΔＥ３
Ｔ６．ｐＡｄＡｐｔ５３５ＬａｃＺ＋ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ
Ｔ７．ｐＡｄＡｐｔ５３５ＬａｃＺ＋ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲΔＥ３
Ｔ８．ｐＡｄＡｐｔ３５ＬａｃＺ＋ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ
Ｔ９．ｐＡｄＡｐｔ３５ＬａｃＺ＋ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲΔＥ３
トランスフェクションに先立って、ｐＡｄＡｐｔ５３５Ｌｕｃ及びｐＡｄＡｐｔ３５ＬｕｃをｐＩＰｓｐ−１酵素で消化し、ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ及びｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲΔＥ３をＮｏｔＩで消化したことを除いて、アダプタープラスミドをＰａｃＩで消化した。各アダプタープラスミド２μｇ及び骨格ＤＮＡ６μｇを製造元の指示書に従って、４０μｌのリポフェクトアミン（インビトロゲン／ライフテクノロジーズ）と混合し、７０％集密度のＴ２５フラスコ中のＰＥＲ５５Ｋクローン１６細胞と共にインキュベートした。４時間後にトランスフェクション培地を取り除き、３７℃／１０％ＣＯ２にてさらにインキュベートした。トランスフェクションの２日後、細胞をＴ８０フラスコに移し、翌日、細胞変性効果（ＣＰＥ）の発生をスコア化した。５日後、Ｔ６（ＣＰＥなし）及びＴ８（ＣＰＥあり）を除いたすべての培養物で、進行した又は全面的なＣＰＥが見られた。再び２日後、Ｔ６及びＴ８はＣＰＥの開始を示し、他のすべては全面的なＣＰＥを示した。培地及び細胞を収集することにより培養物をすべて回収した。混合物は−２０℃にて保存した。試料を融解した際、混合物を１５００ｒｐｍで１５分間遠心し、細胞残渣をペレットにし、上清を回収した。試料のいくつかにおいては（４種のＬａｃＺを発現するウイルス、Ｔ６〜Ｔ９）、２ｍｌを用いてＴ８０フラスコにおける集密度８０％のＰＥＲ５５Ｋクローン１６細胞を再び感染させ、ウイルス力価をさらに増幅した。進行したＣＰＥ（Ｔ６＋Ｔ８）又は全面的なＣＰＥ（Ｔ７＋Ｔ９）において細胞及び培地を回収し、上述のように粗溶解物を調製した。
このようにして得られた粗溶解物を用いて、ウイルスＤＮＡを単離した。この点に関して、２７５μｌの粗溶解物材料を１０ｍｇ／ｍｌのＤＮＡ分解酵素Ｉ、１０μｌと共に３７℃にて３０分間インキュベートした。続いて、０．５ＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）６．０μｌ、７．５μｌの２０％ＳＤＳ及び２０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ１．５μｌを加え、ボルテックスによって混合した。次いで混合物を５０℃にて１時間インキュベートした。最終的には、ジーンクリーンスピンキット（バイオ１０１社）を用いて、ウイルスＤＮＡを単離した。５０μｌのミリＱ水にウイルスＤＮＡを溶出し、５μｌの試料を用いて、導入遺伝子領域を解析した。ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ＋／−Ｅ３の骨格コスミドは改変されなかったので依然としてＡｄ３５ｐＩＸプロモーターを含有することに注目すべきである。このプロモーターはコスミドの極めて５’末端寄りに位置するので、野生型Ａｄ３５プロモーターにおいて生じる組換え事象の機会は小さいと考えられた。しかしながら、この設定では、なおもＡｄ３５のｐＩＸプロモーターを含有するウイルスの生成を除外することはできなかった。従って、各ウイルスの調製において２回の特異的なＰＣＲ増幅を行った。第１は、プライマーセット１（Ａｄ３５に特異的）：ＡｄＡｐｔ３５ＣＭＶＦ及びＡｄＡｐｔ３５ｐＩＸｒｅｖにより行った。このＰＣＲは、Ａｄ３５ｐＩＸプロモーターを含有するウイルスにおける導入遺伝子領域を特異的に増幅する。製造元の指示書に従って組換えＴａｑポリメラーゼ（インビトロゲン）と共に、単離されたウイルスＤＮＡサンプル５μｌについてＰＣＲ反応を行ったが、ただし、反応において４ｍＭのＭｇＣｌ２及び４単位のＴａｑ酵素を用いた。ＰＣＲプログラムは、９４℃にて２分間、その後、（９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間及び７２℃で５分間）を３０サイクルに設定し、６８℃で８分間の最終工程で終了した。
第２は、プライマーＡｄＡｐｔ３５ＣＭＶＦとｐＩＸ５Ｒｍｆｅにより行ったので、Ａｄ５のｐＩＸプロモーターを含有するウイルスにおける導入遺伝子領域が特異的に増幅された（プライマーセット２）。
単離されたウイルスＤＮＡ５μｌについて、各プライマー（１００μＭのストック）０．３μｌ、２ｍＭのｄＮＴＰ混合物５μｌ、１０ｘ完全緩衝液（Ｍｇ２＋を含む）５μｌ、ＤＭＳＯ１．５μｌ及びＰｗｏ酵素０．８μｌを含有する５０μｌ容積におけるＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（２．５単位／μｌ、ゲナキシス）を用いて、ＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲプログラムは、９４℃にて２分間、その後、（９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間及び７２℃で５分間）を３０サイクルに設定し、６８℃で８分間の最終工程で終了した。ＰＣＲの間、加熱及び冷却の傾きは、２℃／秒に設定した。次いで、試料に５μｌの泳動緩衝液を加え、８μｌの混合物を解析のためにゲルにかけた。
Ａｄ５のｐＩＸプロモーター配列及びｅＧＦＰ導入遺伝子（トランスフェクションＴ１及びＴ２）を含有するＥ１欠失及びＥ１／Ｅ３欠失のＡｄ３５ウイルスは、さらに小さい断片を伴わずに予想通りの高さにてＰＣＲで増幅されたバンドを有した。図６ａは、Ｅ１欠失でルシフェラーゼを持つウイルス（トランスフェクションＴ３及びＴ４）におけるＰＣＲ増幅の結果を示す。レーン５〜８は、双方のプライマーセットによる、ＡｄＡｐｔ５３５Ｌｕｃプラスミド（レーン５及び６）ならびにＡｄＡｐｔ３５Ｌｕｃプラスミド（レーン７及び８）における対照ＰＣＲである。レーン１〜４は、ウイルスＤＮＡ単離物におけるＰＣＲである。プライマーセット１（Ａｄ３５のｐＩＸ領域に特異的）は予想した長さのバンドを増幅し、加えて、Ａｄ３５．ＡｄＡｐｔ３５．Ｌｕｃウイルスにおけるさらに短い断片を示す（レーン４；図２のルシフェラーゼ＋Ｅ３を比較すること）。対照的に、プライマーセット２（Ａｄ５のｐＩＸプロモーターに特異的）は、ウイルスがＡｄＡｐｔ５３５．Ｌｕｃプラスミドで作製されている場合、欠失断片のない予想通りの長さのバンドのみを示す（レーン１）。これから、我々は、Ａｄ５のｐＩＸプロモーター配列の挿入は、Ａｄ３５−Ｅ１欠失ウイルスの安定性及びパッケージング容量を高めると結論づけている。図６ｂは、導入遺伝子としてＬａｃＺを持つＡｄ３５Ｅ１／Ｅ３欠失ウイルスについてのこれらの結果を裏付けている。レーン１〜４は、各プライマーセットによるＡｄＡｐｔ５３５．ＬａｃＺ及びＡｄＡｐｔ３５．ＬａｃＺにおける対照ＰＣＲである。特にプライマーセット１では（レーン２及び４）ではバックグランドのバンドが幾つか見られるが、相同の試料では、各プライマーで予想された高さに強い特異的なバンドも見られる（レーン１及び４）。トランスフェクションの後、および上述のような１ラウンドの増幅の後、ウイルスＤＮＡを単離した。際立って、プライマーセット２は、欠失断片のないＡｄ３５．ＡｄＡｐｔ５３５．ＬａｃＺで予想される断片を生成したが（レーン５及び９）、Ａｄ３５のｐＩＸプロモーター配列を含有するウイルスを伴う試料は、正しい長さの断片に加えて欠失した断片を明らかに示す（増幅後見える（レーン１１））。
要するに、これらの結果は、Ａｄ５−ｐＩＸプロモーター配列のためのＡｄ３５−ｐＩＸプロモータ配列の置換は、さらに大きなゲノムを持つウイルスにおける導入遺伝子領域の安定性を高めることを示している。さらに強いプロモーター又は追加のプロモーター要素が、この効果をさらに高めてもよい。
実施例７．ｐＷＥ．Ａｄ３５−３４８１の生成
上記で示すように、コスミドｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲにおけるアデノウイルスインサートは、その５’末端でＡｄ３５のｐＩＸプロモーターを含有する。このことは、ｐＡｄＡｐｔ５３５に基づいたアダプタープラスミドで生成されたウイルスへのＡｄ３５ｐＩＸプロモータの再挿入を招く可能性があった。従って、ｐＩＸプロモーター配列を欠く、Ａｄ３５骨格コスミドの新しい種類を作製する。この点に関して、ＰＩＸｃｏｓＦ−２及びＡｄａｐｔ３５−３のプライマーでＰＣＲ断片を生成した。各プライマー（１００μＭのストック）３μｌ、２ｍＭのｄＮＴＰ混合物５μｌ、１０ｘ完全緩衝液（Ｍｇ２＋を含む）５μｌ、ＤＭＳＯ１．５μｌ、Ｐｗｏ酵素０．５μｌ及び１０ｎｇのｐＡｄＡｐｔ３５ＩＰ１鋳型を含有する５０μｌ容積において、ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（２．５単位／μｌ、ゲナキシス）による増幅を行った。ＰＣＲプログラムは、９４℃にて２分間、その後、（９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間及び７２℃で１．５分間）を５サイクル、次いで（９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間及び７２℃で１．５分間）を２５サイクルに設定し、６８℃で８分間の最終工程で終了した。得られた１．２ｋｂのＰＣＲ産物は、５’末端に結合したＡａｔＩＩ部位及びＮｏｔＩ部位を持つヌクレオチド３４８１〜ヌクレオチド４６６３（ＷＯ ００／７００７１に公開されているＡｄ３５の配列に基づいた番号付け）由来のＡｄ３５配列を含有する。製造元の指示書に従って、ＰＣＲ精製キット（キアゲン）を用いてＰＣＲ産物を精製し、製造元の指示書に従って、ｐＰＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＡｍｐベクター（ストラタジーン）にクローニングした。次いで配列決定によってクローニングした断片の配列を確認し、ＡａｔＩＩ及びＡｇｅＩによる消化によってコンストラクトから取り出した。製造元の指示書に従って、ジーンクリーンスピンキット（バイオ１０１社）を用いて、ゲルから、得られた７８０ｂｐの断片を精製する。
上記で示すように、コスミドｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲにおけるアデノウイルスインサートは、その５’末端でＡｄ３５のｐＩＸプロモーターを含有する。このことは、ｐＡｄＡｐｔ５３５に基づいたアダプタープラスミドで生成されたウイルスへのＡｄ３５ｐＩＸプロモータの再挿入を招く可能性があった。従って、ｐＩＸプロモーター配列を欠く、Ａｄ３５骨格コスミドの新しい種類を作製する。この点に関して、ＰＩＸｃｏｓＦ−２及びＡｄａｐｔ３５−３のプライマーでＰＣＲ断片を生成した。各プライマー（１００μＭのストック）３μｌ、２ｍＭのｄＮＴＰ混合物５μｌ、１０ｘ完全緩衝液（Ｍｇ２＋を含む）５μｌ、ＤＭＳＯ１．５μｌ、Ｐｗｏ酵素０．５μｌ及び１０ｎｇのｐＡｄＡｐｔ３５ＩＰ１鋳型を含有する５０μｌ容積において、ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（２．５単位／μｌ、ゲナキシス）による増幅を行った。ＰＣＲプログラムは、９４℃にて２分間、その後、（９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間及び７２℃で１．５分間）を５サイクル、次いで（９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間及び７２℃で１．５分間）を２５サイクルに設定し、６８℃で８分間の最終工程で終了した。得られた１．２ｋｂのＰＣＲ産物は、５’末端に結合したＡａｔＩＩ部位及びＮｏｔＩ部位を持つヌクレオチド３４８１〜ヌクレオチド４６６３（ＷＯ ００／７００７１に公開されているＡｄ３５の配列に基づいた番号付け）由来のＡｄ３５配列を含有する。製造元の指示書に従って、ＰＣＲ精製キット（キアゲン）を用いてＰＣＲ産物を精製し、製造元の指示書に従って、ｐＰＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＡｍｐベクター（ストラタジーン）にクローニングした。次いで配列決定によってクローニングした断片の配列を確認し、ＡａｔＩＩ及びＡｇｅＩによる消化によってコンストラクトから取り出した。製造元の指示書に従って、ジーンクリーンスピンキット（バイオ１０１社）を用いて、ゲルから、得られた７８０ｂｐの断片を精製する。
コンストラクトｐＷＥ．Ａｄ３５ΔＮｄｅＩ（下に記載）もＡａｔＩＩ及びＡｇｅＩで消化し、製造元の指示書に従って、ジーンクリーンスピンキット（バイオ１０１社）を用いて、得られた１２ｋｂのベクター断片をゲルから単離する。双方の断片を連結することにより、コンストラクトｐＷＥ．Ａｄ３５−３４８１ΔＮｄｅＩを生じる。
コンストラクトｐＷＥ．Ａｄ３５ΔＮｄｅＩの構築は、ＷＯ ００／７００７１に記載されており、ヌクレオチド３４０１からＮｄｅＩ部位のヌクレオチド６５４１までのＡｄ３５配列、及びＮｄｅＩ部位のヌクレオチド３３１６７から右ＩＴＲの末端までのＡｄ３５配列を含有し、それによって双方のＡｄ３５断片がＮｄｅＩ部位を介して接続される（ＷＯ ００／７００７１における図１３も参照のこと）。
次いで、ｐＷＥ．Ａｄ３５−３４８１ΔＮｄｅＩをＮｄｅＩにより直鎖状とし、ＣＩＰ酵素（ニューイングランドバイオラボズ）により脱リン酸化され、製造元の指示書に従って、ジーンクリーンスピンキット（バイオ１０１社）を用いてゲルから精製された。次いで、このベクター断片は、Ａｄ３５野生型ＤＮＡから単離された２６．６ｋｂのＮｄｅＩ断片に連結され、その後、混合物を用いて、製造元の指示書に従って、λファージパッケージング・エクストラクツ（ストラタジーン）を用いてコスミドのパッケージを行う。得られた混合物を用いてＳＴＢＬ−２細菌（インビトロゲン）を形質転換し、ｐＷＥ．Ａｄ３５−３４８１を生じる。
実施例８．ｐＩＧ３５．５５Ｋの構築
コンストラクトｐＩＧ３５．５５Ｋは、ヒトのホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ｈＰＧＫ）に操作可能に接続されたＡｄ３５のＥ１Ｂ−５５Ｋ遺伝子のコーディング配列及びＨＢＶのポリアデニル化配列を含有する。加えて、それは、ＲＳＶプロモーター及びＨＢＶｐＡに操作可能に接続されたネオマイシン耐性遺伝子を含有する。ｐＩＧ３５．５５Ｋの構築は以下のとおりである。
コンストラクトｐＩＧ３５．５５Ｋは、ヒトのホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ｈＰＧＫ）に操作可能に接続されたＡｄ３５のＥ１Ｂ−５５Ｋ遺伝子のコーディング配列及びＨＢＶのポリアデニル化配列を含有する。加えて、それは、ＲＳＶプロモーター及びＨＢＶｐＡに操作可能に接続されたネオマイシン耐性遺伝子を含有する。ｐＩＧ３５．５５Ｋの構築は以下のとおりである。
コンストラクトｐＩＧ２７０（ＷＯ ００／７００７１に記載）をＥｃｏＲＩで消化し、クレノウ酵素で処理し、製造元の指示書に従って、ＰＣＲ精製キット（キアゲン）を用いて精製した。回収したＤＮＡをＡｇｅＩで消化し、製造元の指示書に従って、ジーンクリーンキット（バイオ１０１社）を用いてゲルから５ｋｂ以下のベクター断片を単離した。次に、３５Ｄ２１と３５Ｂ３のプライマーを用いて、ｐＩＧ２７０鋳型ＤＮＡにてＡｄ３５のＥ１Ｂ−５５Ｋの配列をＰＣＲにより増幅した。製造元の指示書に従い、しかし、ＰＣＲ混合物においてＤＭＳＯを３％の最終濃度で用いて、２ｎｇの鋳型ＤＮＡにおいてＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ）によりＰＣＲ増幅を行った。プログラムは、９４℃で２分間、（９４℃で３０秒間、５６℃で３０秒間及び７２℃で３０秒間）を２５サイクルに設定し、７２℃で１０分間の最終インキュベートで終了した。ＰＣＲ精製キット（キアゲン）を用いて得られたＰＣＲ断片を精製し、ＮｃｏＩで消化した。突出末端を埋めるためのクレノウ処理に続いて、ＤＮＡをさらにＡｇｅＩで消化し、再びカラム精製した。次いでこのように処理したＰＣＲ断片を、上で調製したＥｃｏＲＩ／ＡｇｅＩで消化したベクター断片にクローニングしてｐＩＧ２７０．ΔＥ１ＡΔ２１Ｋを得た。ｐＩＧ２７０．ΔＥ１ＡΔ２１ＫをＡｖｒＩＩ及びＸｂａＩで消化し、クレノウ酵素を用いて突出末端を埋めた。ＰＧＫプロモーター及びＡｄ３５のＥ１Ｂ−５５Ｋ配列を含有する２．９ｋｂの断片を上述のようにゲルから単離した。次に、ｐＲＳＶｎｅｏ４（以下に記載する構築）をＢｇｌＩＩで消化し、クレノウ酵素で平滑化し、脱リン酸化して、ゲルから単離した。次いで、ｐＩＧ２７０．ΔＥ１ＡΔ２１Ｋの平滑化したＡｖｒＩＩ／ＸｂａＩ断片を上で調製したｐＲＳＶｎｅｏ４ベクター断片に連結してｐＩＧ３５．５５Ｋを得た。
ｐＲＳＶｎｅｏ４は以下のように生成した：コンストラクトｐＲＳＶｈｂｖＮｅｏ（ＷＯ ００／７００７１に記載）をＳｃａＩ及びＢａｍＨＩで消化し、突出末端をクレノウ酵素を用いて埋めた。ジーンクリーンキット（バイオ１０１社）を用いて、アンピシリン遺伝子の一部及びＲＳＶプロモータを含有する１０７０ｂｐの断片をゲルから単離した。次に、ｐＲＳＶｈｂｖＮｅｏをＳｃａＩとＥｃｏＲＩで消化し、クレノウで平滑化し、ネオ遺伝子、ＨＢＶｐＡ、ベクター及びアンピシリン遺伝子の一部を含有する３．２ｋｂの断片を上記のように単離した。次いで、２つの断片を連結してｐＲＳＶｎｅｏ４を得た。
実施例９．ＲＳＶプロモーターが介在するｐＩＸ発現の増加がＡｄ３５ウイルスの安定性を高める
ｐＩＸ遺伝子の発現を促進する異種プロモーターの例として、ＲＳＶプロモーターを、ＬａｃＺ又はルシフェラーゼのリポーター遺伝子を含有するＡｄ３５のアダプタープラスミドに挿入した。ＲＳＶプロモーターは、ｐＲｃ−ＲＳＶ（インビトロゲン）から入手可能なＮｒｕＩ／ＡｐａＬＩ断片に相当する。製造元の指示書に従って、クレノウ酵素（ニューイングランドバイオラボズ）を用いて突出末端を埋めた。ＱＩＡクイック・ゲルエクストラクションキット（キアゲン）を用いて、ＲＳＶプロモーターを含有する３８８ｂｐの断片をアガロースゲルから単離した。アダプタープラスミドｐＡｄＡｐｔ３５．Ｌｕｃ及びｐＡｄＡｐｔ３５．ＬａｃＺをＢｇｌＩＩで直鎖状にし、その後、クレノウ処理により末端を平滑化した。ＢｇｌＩＩは、導入遺伝子発現カセットのＳＶ４０ポリアデニル化配列のすぐ後ろで消化する。ｐＡｄＡｐｔ３５を基にしたアダプタープラスミドの記載についてはＷＯ ００／７００７１を参照のこと。次いで、製造元（ロシュ）の指示書に従って、シュリンクアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）を用いて、処理されたアダプタープラスミドを脱リン酸化した。次いで、単離したＲＳＶプロモーターを処理したベクターのそれぞれに連結し、ＤＨ５αコンピテント細菌（インビトロゲン）を形質転換した。ｐＩＸ遺伝子に対して正方向に挿入されたＲＳＶプロモーターについてコロニーを解析し、ｐＡｄＡｐｔ３５．Ｌｕｃ．ｒｓｖ及びｐＡｄＡｐｔ３５．ＬａｃＺ．ｒｓｖを生じた。
ｐＩＸ遺伝子の発現を促進する異種プロモーターの例として、ＲＳＶプロモーターを、ＬａｃＺ又はルシフェラーゼのリポーター遺伝子を含有するＡｄ３５のアダプタープラスミドに挿入した。ＲＳＶプロモーターは、ｐＲｃ−ＲＳＶ（インビトロゲン）から入手可能なＮｒｕＩ／ＡｐａＬＩ断片に相当する。製造元の指示書に従って、クレノウ酵素（ニューイングランドバイオラボズ）を用いて突出末端を埋めた。ＱＩＡクイック・ゲルエクストラクションキット（キアゲン）を用いて、ＲＳＶプロモーターを含有する３８８ｂｐの断片をアガロースゲルから単離した。アダプタープラスミドｐＡｄＡｐｔ３５．Ｌｕｃ及びｐＡｄＡｐｔ３５．ＬａｃＺをＢｇｌＩＩで直鎖状にし、その後、クレノウ処理により末端を平滑化した。ＢｇｌＩＩは、導入遺伝子発現カセットのＳＶ４０ポリアデニル化配列のすぐ後ろで消化する。ｐＡｄＡｐｔ３５を基にしたアダプタープラスミドの記載についてはＷＯ ００／７００７１を参照のこと。次いで、製造元（ロシュ）の指示書に従って、シュリンクアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）を用いて、処理されたアダプタープラスミドを脱リン酸化した。次いで、単離したＲＳＶプロモーターを処理したベクターのそれぞれに連結し、ＤＨ５αコンピテント細菌（インビトロゲン）を形質転換した。ｐＩＸ遺伝子に対して正方向に挿入されたＲＳＶプロモーターについてコロニーを解析し、ｐＡｄＡｐｔ３５．Ｌｕｃ．ｒｓｖ及びｐＡｄＡｐｔ３５．ＬａｃＺ．ｒｓｖを生じた。
さらに、導入遺伝子領域の欠失後生じたＡｄ３５組換えウイルスからＰＣＲによって単離した配列から、アダプタープラスミドを生成した。ｐＡｄＡｐｔ３５．ＬａｃＺ及びｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ Ａｄ３５の骨格コンストラクトのトランスフェクションおよびそれに続くプラーク精製の結果として生じた粗溶解物の調製物の解析により、ウイルスはおよそ２．８ｋｂの導入遺伝子領域において欠失を有することが示された。プライマー３５Ｆ１及び３５Ｒ４を用いて単離されたＤＮＡから、このウイルス由来の５’配列をＰＣＲ増幅した。製造元の指示書に従って、Ｐｗｏポリメラーゼ（ロシュ）によって反応を行った。プログラム設定は以下のとおりである。９４℃にて２分間、その後、（９４℃で３０秒間、４８℃で３０秒間及び７２℃で２．５分間）を５サイクル、次いで（９４℃で３０秒間、５６℃で３０秒間及び７２℃で２．５分間）を２５サイクル、および６８℃で８分間の最終工程で終了した。
ＰＣＲ精製キット（キアゲン）によって得られた２ｋｂの断片を精製し、製造元の指示書に従ってｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ−Ａｍｐベクター（ストラタジーン）にクローニングし、ｐＣＲ．Ａｄ３５Δ２．８ｋｂを生じた。このプラスミドの配列を決定して欠失の程度を決定した。欠失は、ＣＭＶプロモーター、導入遺伝子及びＳＶ４０のポリＡのほとんどに影響を及ぼした。これによって結果的に、ＣＭＶプロモーターの５’の３１７ｂｐはｐＩＸ遺伝子の上流のＡｄ３５配列へ連結した。このＣＭＶ断片は、３つのＧＣボックス及び２１ｂｐの反復を含有する（Boshart et al., 1985）。おそらく、ＣＭＶプロモーターの残りの配列はｐＩＸの発現を増強することができ、結果的にさらに安定なウイルスを生じることができた。もう１つの可能性は、ウイルス自体がより小さくなると、結果的として安定性が高まるということだった。このことを調べるために、下記のように完全な発現カセットの戻しクローニングし、この新しいアダプタープラスミドを持つウイルスを生成した。増幅された配列（ｐＣＲ．Ｃ４で改名された）を含有するｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔを基にしたベクターは、ΔＣＭＶ−ｐＩＸ配列に先行する独特のＡｖｒＩＩ部位を有していた。ベクターをＡｖｒＩＩで直鎖状し、クレノウ酵素で平滑化し、上述したようにＳＡＰ酵素（ロシュ）を用いて脱リン酸化した。アダプタープラスミドｐＡｄＡｐｔ５３５．ＬａｃＺ（実施例５）及びｐＡｄＡｐｔ．Ｌｕｃ（ＷＯ ００／７００７１）をＡｖｒＩＩ及びＢｇｌＩＩで消化し、ＤＮＡをクレノウで処理して突出末端を埋めた。ＬａｃＺ及びルシフェラーゼの発現カセット（ＣＭＶ−ＴＧ−ｐＡ））に相当する断片を上記のようにゲルから単離し、ＡｖｒＩＩで直鎖状したｐＣＲ．Ｃ４ベクターに連結した。上記のようなコンピテント細胞の形質転換及び左ＩＴＲに対して正方向にカセットを有するコロニーの選択によって、ｐＣＲ．Ｃ４．ＬａｃＺ及びｐＣＲ．Ｃ４．Ｌｕｃを生じた。
新しいアダプタープラスミド：ＰａｃＩで消化したｐＣＲ．Ｃ４．ＬａｃＺ、ＡｐａＩで消化したｐＣＲ．Ｃ４．Ｌｕｃ、ならびにそれぞれＰＩ−ＰｓｐＩで消化したｐＡｄＡｐｔ３５．ＬａｃＺ．ｒｓｖ及びｐＡｄＡｐｔ３５．Ｌｕｃ．ｒｓｖを用いて、実施例６で記載したように、Ａｄ３５のウイルスを生成した。
ＮｏｔＩで消化したｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ又はｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲΔＥ３と共に、アダプタープラスミドをＰＥＲ５５Ｋ細胞（ＷＯ ０２／４０６６５）にコトランスフェクトした。さらに、アダプタープラスミドｐＢｒ．Ａｄ３５．ΔＥ１ＡΔ２１Ｋ．Ｌｕｃ（以下で記載するコンストラクション）をＰＩ−ＰｓｐＩで消化し、ＮｏｔＩで消化したｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲと共にコトランスフェクトした。全面的な細胞変性効果（ＣＰＥ）において、１サイクルの凍結融解によって培養物を回収し、遠心分離して細胞残渣を取り除いた。次いで、得られた透明な溶解物３００μｌを用いて、前日にＴ８０フラスコに播いたＰＥＲ５５Ｋ細胞を再感染させた。全面的なＣＰＥにおいて、粗溶解物を調製し、それを用いてＡ５４９細胞を感染させ、導入遺伝子の発現を調べ、ＰＥＲ５５Ｋ細胞におけるプラークアッセイを行った。
Ａ５４９細胞を５ｘ１０５個の細胞／ウエルにて６穴プレートに播き、５時間後にＬａｃＺウイルスのストックの１０、１又は０．１μｌで感染させ、２日間インキュベートした。次いで、ＬａｃＺ活性についてＡ５４９細胞を染色し、青色細胞を数えた。青色細胞の比率を表ＩＩに示す。
欠失したＣＭＶプロモーターに比べて、ＲＳＶプロモーターがｐＩＸ遺伝子の発現を促進しているときには、ＬａｃＺを発現しているウイルスは明らかにより安定である。これらの結果は、ルシフェラーゼのウイルスによって裏付けられた。ルシフェラーゼウイルスの活性を測定するために、１ｘ１０５個の細胞／ウエルにて２４穴プレートにＡ５４９細胞を播き、ウイルスストックの１０、１、０．１又は０．０１μｌで感染させ、インキュベートした。２日後、ＰＢＳにて細胞を２回洗浄し、１００μｌの溶解緩衝液（プロメガ）中に再懸濁し、使用まで−２０℃に保存した。製造元の指示書に従って、ステディ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステムを用いて、ルシフェラーゼを測定した。結果を表ＩＩＩに提示する。
我々は実施例３において、Ｅ３領域及びＡｄＡｐｔ．Ｌｕｃ又はＡｄＡｐｔ．ＬａｃＺの発現カセットを含有する、Ｅ１を完全に欠失したＡｄ３５ウイルスは、安定ではないと記載した。明らかに、新しく記載されたコンストラクトでは、ｐＩＸの前の欠失したＣＭＶプロモーターは導入遺伝子領域の欠失を妨げなかった。しかしながら、ｐＩＸ遺伝子を駆動するＲＳＶプロモーターによって、我々は今や、野生型の長さを超えるウイルスを生成することができる。Ａｄ３５．ＡｄＡｐｔ．Ｌｕｃ．ｒｓｖ及びＡｄ３５．ＡｄＡｐｔ．ＬａｃＺ．ｒｓｖはそれぞれ３５ｋｂ及び３６．５ｋｂである（図２も参照のこと）。Ａｄ３５．ΔＥ１ＡΔ２１Ｋ．Ｌｕｃ（３６．４ｋｂ）は、高い導入遺伝子活性を示した。
我々は次に、プラーク精製した後にウイルスが無傷であるのかどうかを調べた。この点に関して、０．９ｘ１０６個の細胞／ウエルにて６穴プレートにＰＥＲ５５Ｋ細胞を播き、様々な１０倍希釈系列のＡｄ３５．ＡｄＡｐｔ．ＬａｃＺ粗溶解物で感染させた。１０−５〜１０−８の希釈でプレートに加え、翌日寒天の覆いを加えた。この点に関して、細胞を先ずＰＢＳで洗浄し、次いで事前に温めた寒天溶液３ｍｌを加えたが、その寒天溶液は２ｘＭＥＭ（ギブコＢＲＬ；９．１４ｍｌ）、ＦＢＳ（ギブコ；０．３６ｍｌ）、ＭｇＣｌ２（４．９Ｍ；０．０３７ｍｌ）をアガロース（シープラークＧＴＧ；Ｈ２Ｏ中２．５％、７．２ｍｌ）と混合することにより調製した。固化した後、３７℃／５％ＣＯ２にてプレートをさらにインキュベートした。４日後、プラークが見えるようになり、寒天の上でウエルにＬａｃＺ染色溶液を加え、水気を切った。ウイルスはすべて、１０−７〜１０−９の範囲で明瞭な分離したプラークを示したが、ｐＩＸ遺伝子を駆動するＲＳＶプロモーターを持つウイルスの場合のみ、プラークはすべて青色に染色された。欠失したＣＭＶプロモーターがｐＩＸを駆動する双方の場合では、プラークの少なくとも一部は染色しなかった。このことは、パッケージング可能なゲノムのサイズ／安定性が、ｐＩＸを調節するＲＳＶプロモーターを有するウイルスでは高められていることを明らかに示している。
本発明は、機能を有するＥ１Ｂ遺伝子の発現を欠くアデノウイルス抗原型３５に由来する又は基づいた安定な組換えアデノウイルスを初めて提供する。そのようなアデノウイルスはＥ１領域において少なくとも欠失を有する。本発明により提供される特定の実施形態では、本発明に係る方法を用いて、前記安定な組換えアデノウイルスは、４．２ｋｂを超える外来性の挿入配列及び３３．４ｋｂを超えるサイズのパッケージングゲノムを有する。従って本発明の目的は、ａ）４．２ｋｂを超える外来性の核酸配列を有し、及び／又はｂ）３３．４ｋｂ以上のパッケージされたゲノムサイズを有する、安定な組換えアデノウイルスを提供することである。特定の実施形態では、本発明は、ａ）少なくとも４．６ｋｂの外来性の核酸配列を有し、及び／又はｂ）３３．８ｋｂ以上のパッケージされたゲノムサイズを有する、Ａｄ３５又はＡｄ１１を基にした組み換えアデノウイルスを提供する。それに代えて、又はそれに加えて、前記パッケージされたゲノムサイズは、それぞれ少なくとも３４．６、３５．０、３６．１及び３６．５ｋｂである。これらの実施形態における外来性の配列は、ｐＩＸの発現を駆動する異種プロモーターを包含してもよい。もう１つの態様では、前記安定な組換えアデノウイルスは抗原型１１である。本発明のこの態様に係る安定なアデノウイルスは、パッケージング細胞において継代して組換えアデノウイルスのバッチを提供することが可能であり、そのバッチは、たとえば実施例３で例示されるＰＣＲ法により測定されるように、組換えアデノウイルスの中の外来性配列中において欠失を生じる分離クローンは１０％以下、好ましくは５％以下であり、好ましくはそれがない。
ｐＢｒ．Ａｄ３５．ΔＥ１ＡΔ２１Ｋ．Ｌｕｃ（上記を参照のこと）は以下のように作製した。コンストラクトｐＢｒ．Ａｄ３５．ΔＥ１ＡΔ２１Ｋ（ＷＯ ０２／４０６６５）をＨｐａＩで消化し、ＣＩＰ（ニューイングランドバイオラボズ）で脱リン酸化し、５ｋｂのベクター断片をゲルから単離した。コンストラクトｐＢｒ．Ａｄ３５．ΔＥ１Ａ．ＬｕｃもＨｐａＩで消化し、３．３ｋｂのインサートをゲルから単離し、単離されたベクター断片と連結した。コンピテントＳＴＢＬ−２細胞（インビトロゲン）を形質転換したのに続いて、正しい方向のインサートを有するコロニーを選択した。これによりコンストラクトｐＢｒ．Ａｄ３５．ΔＥ１Ｂ．Δ２１Ｋ．Ｌｕｃを得た。ｐＢｒ．Ａｄ３５．ΔＥＩＡ．Ｌｕｃ（未だにＥ１Ｂ領域を含有しているのでｐＢｒ．Ａｄ３５．Ｅ１Ｂ＋．Ｌｕｃとも呼ばれる）は、ＡｖｒＩＩとＢｇｌＩＩで消化してクレノウ酵素で平滑化した後にｐＡｄＡｐｔ．Ｌｕｃから採取したＡｄＡｐｔ．Ｌｕｃカセットを、ＳｎａＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化してクレノウで平滑化したベクター断片ｐＢｒ．Ａｄ３５．ｌｅｆｔＩＴＲ−ｐＩＸ（ＷＯ ０２／４０６６５）に挿入することにより作製した。発現カセットを正方向に持つコロニーを選抜し、ｐＢｒ．Ａｄ３５．ΔＥ１Ａ．Ｌｕｃが与えられた。
実施例１０．ｐＩＸ調節配列の同定
前の実施例は、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂをコードする領域が完全に取り除かれているＡ３５組換えアデノウイルスは、ゲノムサイズが増すと、漸次より不安定になることを示している。我々はこの応用において、ｐＩＸの発現を駆動する異種のプロモータを添加することによって不安定性を克服できることを示す。ＷＯ ０２／４０６６５及び上記において、我々は、完全なＥ１Ｂ−５５Ｋのコーディング配列を保持するＡｄ３５ウイルスをＰＥＲ．Ｃ６細胞で産生されることができ、安定であることを開示した。完全なＥ１Ｂコーディング配列を保持するウイルスについても同じことが真実である（ＷＯ ００／７００７１；Abrahamsen et al., 1997）。共にこれらの結果は、サブグループＣにおけるｐＩＸ遺伝子に比べて、サブグループＢのウイルスではｐＩＸ遺伝子の発現が異なって調節されている可能性を生じる。Ｅ１Ｂプロモーターにより駆動されるＥ１Ｂ−５５Ｋ遺伝子を保持するウイルスは安定なので（上記を参照のこと）、ｐＩＸ制御配列はおそらくこの領域に位置する。これを調べるために、我々は、５５Ｋ配列の様々な長さの３’末端を保持する一連のコンストラクトを生成する。この点に関して、ｐＢｒ．Ａｄ３５．ΔＡＭ．ＡｄＡｐｔＬａｃＺが以下のように先ず生成される。ＳｎａＢＩ及びＭｆｅＩによりコンストラクトｐＢｒ．Ａｄ３５．ｌＩＴＲ−ｐＩＸ（ＷＯ ００／７００７１に記載）を消化し、クレノウで平滑化し、ＳＡＦ酵素（ロシュ）により脱リン酸化する。次いで、４．４ｋｂのベクター断片をアガロースゲルから単離する。コンストラクトｐＡｄＡｐｔ．ＬａｃＺ（ＬａｃＺ導入遺伝子インサートを持つＡｄ５を基にしたアダプタープラスミドｐＡｄＡｐｔ；ＷＯ９９／５５１３２）を、ＡｖｒＩＩ及びＢｇｌＩＩ（及び断片サイズの差異を高めるために、必要に応じてＳａｌＩ）により消化し、クレノウ酵素で平滑化する。次いで、４．２ｋｂのＣＭＶ．ＬａｃＺ．ｐＡインサートをゲルから単離する。次いで、単離した双方の断片を連結してｐＢｒ．Ａｄ３５ΔＳＭ．ＡｄＡｐｔＬａｃＺを得る（図７）。正しい方向で連結するとＡｖｒＩＩ部位及びＭｆｅＩ部位の双方が復元するので、制限消化によって配向性をチェックすることができる。コンストラクトｐＢｒ．Ａｄ３５ΔＳＭ．ＡｄＡｐｔＬａｃＺは、ｐＩＸ遺伝子に対して野生型の位置に、０．６ｋｂの３’Ｅ１Ｂ−５５Ｋ配列（ｗｔ Ａｄ３５はヌクレオチド２８０４〜３４００を含む）を保持する。以前我々は、ＰＥＲ．Ｃ６細胞における増殖が可能であるとは思われなかったので、これらの５５Ｋ配列は、機能を有するＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質の発現へ至らないことを示した（ｐＢｒ．Ａｄ３５ΔＳＭ；ＷＯ ０２／４０６６５）。ｐＢｒ．Ａｄ３５ΔＳＭ．ＡｄＡｐｔＬａｃＺから出発して、６８０ｂｐ（０．７ｋｂ）のＥ１Ｂ−５５Ｋ領域の様々な欠失を作製することができ、それはそれぞれ、ＭｆｅＩ（ＭｕｎＩのアイソシゾマー）及びＳｔｕＩ、ＮｓｉＩ又はＢｇｌＩＩのいずれかによって消化し、続いて、クレノウを用いて突出末端を平滑化することにより、または５’又は３’の突出の場合はＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑化することにより行うことができる。消化したＤＮＡの再連結により機能を有するアダプタプラスミドが与えられ、その後それは上述のように、ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲと共にコトランスフェクションすることにより、ＰＥＲ５５Ｋ細胞で組換えウイルスを生成するのに使用される。酵素ＤｒａＩＩＩ、Ｂｓｕ３６Ｉ、ＢｓｓＨＩＩ又はＢａｍＨＩを用いて、本分野で公知の方法を用いて部分的にベクターを消化し（ＬａｃＺ遺伝子もこれら酵素の認識部位を含有する）、次いで正しいクローンを選抜することにより、追加のコンストラクトを作製する。上述のように、Ａｄ３５．ＡｄＡｐｔ．ＬａｃＺ．ｒｓｖコンストラクトについて安定性を調べる。安定である（すなわち、導入遺伝子領域において欠失を獲得しない）コンストラクトは、ｐＩＸの発現に対する適切な制御領域を含有する。さらに、リポーター遺伝子の上流に配列を挿入することにより所定の配列におけるプロモーター活性を直接調べることができる。ｐＧＬ３ベーシック（プロメガ）はそのようなリポーター遺伝子のコンストラクトである。ＭｕｎＩとｐＩＸ遺伝子の開始部位の間に領域を、プライマーセットＡｄ３５５５ＫｍｆｅＦとＡｄ３５ｐＩＸＮｃｏＲを用いて増幅した。このＰＣＲ［９４℃で２分間、次いで（９４℃で３０秒間、５９℃で３０秒間、７２℃で６０秒間）を３０サイクル、次いで６８℃で８分間；酵素：追加の３％ＤＭＳＯと共に、製造元の指示書に従ってＰｗｏ（ジェネキシス）］は、２８０４〜３４９１（ｗｔ Ａｄ３５におけるような番号付け）のＡｄ３５配列を増幅し、それによってｐＩＸの開始コドン付近の配列をＮｃｏＩ部位に変え、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を挿入した。この増幅した断片をＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｃＩで消化し、同じ酵素で消化したｐＧＬ３ベーシックにクローニングし、ｐＧＬ３−ＭＮを生成した。次いで、ｐＧＬ３−ＭＮを用いてルシフェラーゼのコーディング領域の上流の配列を欠失させ、それは、ＨｉｎｄＩＩＩの消化と、たとえば、ＰａｃＩ、ＮｓｉＩ、ＳｔｕＩ、Ｂｓｕ３６Ｉ、ＢｓｓＨＩＩ又はＢｇｌＩＩの消化を組み合わせて、続いて突出末端を平滑化し、再連結することによって行う。製造元の指示書に従って、リポフェクトアミン試薬を用いて、ＰＥＲ．Ｃ６細胞に得られたコンストラクトの一時的なトランスフェクションすることにより、プロモーター活性を調べる。製造元の指示書に従って、ステディ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ）を用いて、トランスフェクションの２日後にルシフェラーゼ活性を解析する。別の方法では、ｐＧＬ３ベーシックベクターに異なった領域が挿入され、その領域はＡｄ３５のＥ１Ｂ−５５領域中の特定の配列に向けられ、Ｎｃｏ−ｐＩＸｒｅｖプライマーと組み合わされた５’末端に結合したＨｉｎｄＩＩＩ部位を有する５’（正方向）プライマーを用いたＰＣＲ増幅によって生成される。この方法では、クローニングのための特異な制限部位が存在することによって限定されない。
前の実施例は、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂをコードする領域が完全に取り除かれているＡ３５組換えアデノウイルスは、ゲノムサイズが増すと、漸次より不安定になることを示している。我々はこの応用において、ｐＩＸの発現を駆動する異種のプロモータを添加することによって不安定性を克服できることを示す。ＷＯ ０２／４０６６５及び上記において、我々は、完全なＥ１Ｂ−５５Ｋのコーディング配列を保持するＡｄ３５ウイルスをＰＥＲ．Ｃ６細胞で産生されることができ、安定であることを開示した。完全なＥ１Ｂコーディング配列を保持するウイルスについても同じことが真実である（ＷＯ ００／７００７１；Abrahamsen et al., 1997）。共にこれらの結果は、サブグループＣにおけるｐＩＸ遺伝子に比べて、サブグループＢのウイルスではｐＩＸ遺伝子の発現が異なって調節されている可能性を生じる。Ｅ１Ｂプロモーターにより駆動されるＥ１Ｂ−５５Ｋ遺伝子を保持するウイルスは安定なので（上記を参照のこと）、ｐＩＸ制御配列はおそらくこの領域に位置する。これを調べるために、我々は、５５Ｋ配列の様々な長さの３’末端を保持する一連のコンストラクトを生成する。この点に関して、ｐＢｒ．Ａｄ３５．ΔＡＭ．ＡｄＡｐｔＬａｃＺが以下のように先ず生成される。ＳｎａＢＩ及びＭｆｅＩによりコンストラクトｐＢｒ．Ａｄ３５．ｌＩＴＲ−ｐＩＸ（ＷＯ ００／７００７１に記載）を消化し、クレノウで平滑化し、ＳＡＦ酵素（ロシュ）により脱リン酸化する。次いで、４．４ｋｂのベクター断片をアガロースゲルから単離する。コンストラクトｐＡｄＡｐｔ．ＬａｃＺ（ＬａｃＺ導入遺伝子インサートを持つＡｄ５を基にしたアダプタープラスミドｐＡｄＡｐｔ；ＷＯ９９／５５１３２）を、ＡｖｒＩＩ及びＢｇｌＩＩ（及び断片サイズの差異を高めるために、必要に応じてＳａｌＩ）により消化し、クレノウ酵素で平滑化する。次いで、４．２ｋｂのＣＭＶ．ＬａｃＺ．ｐＡインサートをゲルから単離する。次いで、単離した双方の断片を連結してｐＢｒ．Ａｄ３５ΔＳＭ．ＡｄＡｐｔＬａｃＺを得る（図７）。正しい方向で連結するとＡｖｒＩＩ部位及びＭｆｅＩ部位の双方が復元するので、制限消化によって配向性をチェックすることができる。コンストラクトｐＢｒ．Ａｄ３５ΔＳＭ．ＡｄＡｐｔＬａｃＺは、ｐＩＸ遺伝子に対して野生型の位置に、０．６ｋｂの３’Ｅ１Ｂ−５５Ｋ配列（ｗｔ Ａｄ３５はヌクレオチド２８０４〜３４００を含む）を保持する。以前我々は、ＰＥＲ．Ｃ６細胞における増殖が可能であるとは思われなかったので、これらの５５Ｋ配列は、機能を有するＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質の発現へ至らないことを示した（ｐＢｒ．Ａｄ３５ΔＳＭ；ＷＯ ０２／４０６６５）。ｐＢｒ．Ａｄ３５ΔＳＭ．ＡｄＡｐｔＬａｃＺから出発して、６８０ｂｐ（０．７ｋｂ）のＥ１Ｂ−５５Ｋ領域の様々な欠失を作製することができ、それはそれぞれ、ＭｆｅＩ（ＭｕｎＩのアイソシゾマー）及びＳｔｕＩ、ＮｓｉＩ又はＢｇｌＩＩのいずれかによって消化し、続いて、クレノウを用いて突出末端を平滑化することにより、または５’又は３’の突出の場合はＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑化することにより行うことができる。消化したＤＮＡの再連結により機能を有するアダプタプラスミドが与えられ、その後それは上述のように、ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲと共にコトランスフェクションすることにより、ＰＥＲ５５Ｋ細胞で組換えウイルスを生成するのに使用される。酵素ＤｒａＩＩＩ、Ｂｓｕ３６Ｉ、ＢｓｓＨＩＩ又はＢａｍＨＩを用いて、本分野で公知の方法を用いて部分的にベクターを消化し（ＬａｃＺ遺伝子もこれら酵素の認識部位を含有する）、次いで正しいクローンを選抜することにより、追加のコンストラクトを作製する。上述のように、Ａｄ３５．ＡｄＡｐｔ．ＬａｃＺ．ｒｓｖコンストラクトについて安定性を調べる。安定である（すなわち、導入遺伝子領域において欠失を獲得しない）コンストラクトは、ｐＩＸの発現に対する適切な制御領域を含有する。さらに、リポーター遺伝子の上流に配列を挿入することにより所定の配列におけるプロモーター活性を直接調べることができる。ｐＧＬ３ベーシック（プロメガ）はそのようなリポーター遺伝子のコンストラクトである。ＭｕｎＩとｐＩＸ遺伝子の開始部位の間に領域を、プライマーセットＡｄ３５５５ＫｍｆｅＦとＡｄ３５ｐＩＸＮｃｏＲを用いて増幅した。このＰＣＲ［９４℃で２分間、次いで（９４℃で３０秒間、５９℃で３０秒間、７２℃で６０秒間）を３０サイクル、次いで６８℃で８分間；酵素：追加の３％ＤＭＳＯと共に、製造元の指示書に従ってＰｗｏ（ジェネキシス）］は、２８０４〜３４９１（ｗｔ Ａｄ３５におけるような番号付け）のＡｄ３５配列を増幅し、それによってｐＩＸの開始コドン付近の配列をＮｃｏＩ部位に変え、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を挿入した。この増幅した断片をＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｃＩで消化し、同じ酵素で消化したｐＧＬ３ベーシックにクローニングし、ｐＧＬ３−ＭＮを生成した。次いで、ｐＧＬ３−ＭＮを用いてルシフェラーゼのコーディング領域の上流の配列を欠失させ、それは、ＨｉｎｄＩＩＩの消化と、たとえば、ＰａｃＩ、ＮｓｉＩ、ＳｔｕＩ、Ｂｓｕ３６Ｉ、ＢｓｓＨＩＩ又はＢｇｌＩＩの消化を組み合わせて、続いて突出末端を平滑化し、再連結することによって行う。製造元の指示書に従って、リポフェクトアミン試薬を用いて、ＰＥＲ．Ｃ６細胞に得られたコンストラクトの一時的なトランスフェクションすることにより、プロモーター活性を調べる。製造元の指示書に従って、ステディ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ）を用いて、トランスフェクションの２日後にルシフェラーゼ活性を解析する。別の方法では、ｐＧＬ３ベーシックベクターに異なった領域が挿入され、その領域はＡｄ３５のＥ１Ｂ−５５領域中の特定の配列に向けられ、Ｎｃｏ−ｐＩＸｒｅｖプライマーと組み合わされた５’末端に結合したＨｉｎｄＩＩＩ部位を有する５’（正方向）プライマーを用いたＰＣＲ増幅によって生成される。この方法では、クローニングのための特異な制限部位が存在することによって限定されない。
ソフトウエアを用いることによってｐＩＸプロモーターの位置をさらに調べ、推定上のプロモーター配列を見い出した（Reese and Eeckman, 1995）。図８は、５５Ｋのコーディング配列（ｐＢｒ．ＡＤ３５ΔＥ１ＡΔ２１Ｋにおけるような）に直接接続したＥ１Ｂプロモータのためのプロモータースコア（最低０．６５で設定される）を示す。Ａと印を付けた領域はＥ１Ｂプロモーターに相当し、領域Ｂ及びＣは、５５Ｋコーディング領域の中に位置する。ｐＩＸの上流領域は、プロモーター配列としては認識されない。領域Ｃは、３つの中で最高のスコア（０．９６）を有するので（既知のＥ１Ｂプロモーターよりもさらに高い）、ｐＩＸの発現に影響を及ぼす配列を含む可能性がある。
ありうるｐＩＸプロモーターを実験的に位置を決めて同定するために、５５Ｋコーディング配列の３’末端の様々な部分（重なり合う）に相当する一連の小さな断片を生成する。図９は、これらの断片と、推定上のプロモーター領域及びｐＩＸ遺伝子に対するそれらの位置を模式的に描く。示した酵素を用いた制限消化によって断片を生成する。断片をクレノウ（５’突出末端）又はＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（３’突出末端）により平滑化し、ｐＧＬ３ベーシックベクター（プロメガ）のＮｃｏＩ部位にクローニングし、ＳＡＰ処理（ロシュ）により脱リン酸化する。コンピテント細菌の形質転換に続いて、得られたプラスミドのインサートの配向性を、制限消化によりチェックする。次いで、製造元の指示書に従って、リポフェクトアミン試薬を用いて得られたルシフェラーゼコンストラクトをＰＥＲ．Ｃ６細胞に一時的にトランスフェクションすることにより、プロモーター活性を解析する。空のプラスミドを陰性対照とする。追加の対照は、ｉ）Ａｄ５のｐＩＸプロモーターを含有するｐＡｄＡｐｔ５３５由来のＢｇｌＩＩ−ＭｆｅＩ断片、ｉｉ）３８８ｂｐのＲＳＶプロモーターのＮｒｕＩ−ＡｐａＬＩ断片（上述）又はｉｉｉ）ＰＣＲ断片としてのＡｄ３５のｐＩＸ上流領域を上述したｐＧＬ３ベーシックの平滑化したＮｃｏＩ部位にクローニングすることによって作製する。プライマーＳＶ４０−ｆｏｒ及び５’がリン酸化したＡｄ３５ｐＩＸｒｅｖを用いて、ｐＡｄＡｐｔ３５ＩＰ１でＡｄ３５の上流ｐＩＸ領域を増幅する。増幅に続いてＤＮＡをＢｇｌＩＩで消化し、クレノウで処理する。
アデノウイルスのＥ１を含有しないヒト細胞（たとえば、Ａ５４９、Ｈｅｌａ）にもコンストラクトをトランスフェクトしてＥ１Ａの発現の依存性を調べる。
断片をアダプタープラスミドｐＢｒ．Ａ３５ΔＳＭ．ＡｄＡｐｔＬａｃＺ（上記を参照のこと）にクローニングし、組換えウイルスの生成とウイルスゲノムの安定性の検討を可能とする。この点に関して、コンストラクトＢｒ．Ａ３５ΔＳＭ．ＡｄＡｐｔＬａｃＺをＭｆｅＩとＢｇｌＩＩで消化し、クレノウ酵素で平滑化し、脱リン酸化する。ベクター断片のゲル単離を行った後、ＤＮＡを上述の断片（図９を参照のこと）と連結することができ、ｐＩＸ遺伝子の上流の５５Ｋ断片を様々な長さで有する一セットのアダプタープラスミドを生じる。上述のようなコンストラクトｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲによってウイルスを生成できる。ｐＢｒ．Ａｄ３５ΔＳＭ．ＡｄＡｐｔＬａｃＺ、ｐＡｄＡｐｔ３５．ＬａｃＺ及びｐＡｄＡｐｔ３５．ＬａｃＺ．ｒｓｖコンストラクトにより、対照のトランスフェクションを行う。全面的なＣＰＥが出現する際に、１サイクルの凍結／融解により細胞及び培地を回収し、新鮮なＰＥＲ５５Ｋ細胞を再感染するのに使用する。全面的なＣＰＥにおいて細胞及び培地を再び回収し、粗溶解物を調製し、プラークアッセイを行うのに使用する。プラークが出現した後、Ｘ−ｇａｌ染色溶液を加えてＬａｃＺの発現をチェックする。
上記の実験結果は、Ａｄ３５のＥ１Ｂ−５５Ｋ領域におけるｐＩＸの制御配列の位置を見い出すのに役立つ。
さらにもう1つの選択肢として、組換えウイルスの生成について、異種のプロモーターとしてのＥ１ＢプロモーターによってｐＩＸ遺伝子の発現が駆動されてもよい。この点に関して、ｐＡｄＡｐｔ５３５．ＬａｃＺをＢｇｌＩＩとＭｆｅＩで消化し、その後、クレノウ処理して末端を平滑化し、脱リン酸化する。次いで、こうして処理した４．８ｋｂのベクター断片をゲルから単離する。標的ＤＮＡとしてのｐＢｒ．Ａｄ３５．ｌｅｆｔＩＴＲ−ｐＩＸならびにプライマーＥｐｒ−Ｆ及びＥｐｒ−Ｒを用いて、ＰＣＲ断片としてＥ１Ｂプロモーター領域を単離するが、それによって双方のプライマーをリン酸化する。製造元の指示書に従って、ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（ゲナキシス／イノ−トレイン・ダイアグノスティック社）によりＰＣＲを行う。次いで、得られた１５１ｂｐの断片を単離したベクターにクローニングし、ｐＡｄＡｐｔ３５Ｅｐｒ．ＬａｃＺを得る。
次いで、このプラスミドを使用してＡｄ３５を基にしたウイルスを生成し、前述のように安定性を調べる。
ｐＩＸ配列を含有する様々な転写産物を同定するために、感染細胞からＲＮＡを単離し、標識した特異的なプローブとのハイブリダイゼーションによってｐＩＸを含有するＲＮＡを同定する。この点に関して、以下のウイルス：野生型（ｗｔ）Ａｄ３５、Ａｄ３５．Ｅ１Ｂ．ＡｄＡｐｔ．Ｌｕｃ、Ａｄ３５ΔＥ３．ＡｄＡｐｔ．Ｌｕｃ、Ａｄ３５ΔＥ３．ＡｄＡｐｔ５３５．Ｌｕｃ、Ａｄ３５．ＡｄＡｐｔ．Ｌｕｃ．ｒｓｖにより１０及び５０の感染多重度でＰＥＲ５５Ｋ細胞を感染させた。８時間後（ｗｔＡｄ３５は、２時間及び１８時間後も）感染細胞を回収し、ＴＲＩ−ｚｏｌ試薬（インビトロゲン）を用いてＲＮＡを単離する。このＲＮＡを１．５％のアガロースゲル上でサイズ分画し、ノーザンブロットに移し、ｐＩＸのコーディング領域に由来する３２Ｐで標識したプローブとハイブリダイゼーションする。手順は公知である［サムブルック及びラッセル著、「分子クローニング：実験室マニュアル」（２００１年又は以前の版）に記載］。既知のＲＮＡサイズマーカーが含まれていればＲＮＡの長さを決定することができ、それはｐＩＸ配列を含有するＲＮＡ種を指し示すであろう。Ｅ１Ｂプロモーターで開始するｍＲＮＡを同定するためにブロットを細片にし、５’２１Ｋプローブと再びハイブリッド形成をさせる。Ｅ１Ｂプロモーターとは異なるプロモーターによって、Ｅ１Ｂ−２１ＫプローブとハイブリダイズしないｐＩＸを含有する転写産物が生成されるであろう。
ありうる（及び予想される）スプライシングのために、この方法を介して転写開始部位を正確に決定するのはやはり難しい。これを以下のように達成することができる。単離したＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、ｃＤＮＡを用いて、ＲＮＡを含有するｐＩＸの５’末端を特異的に増幅し、それには、製造元の指示書に従ってジーンレーサーシステム（インビトロゲン）を、ｐＩＸコーディング配列に向けた逆方向プライマー：ｐＩＸｒｅｖ及びネスト化したプライマーｐＩＸｒｅｖ−Ｎ２と共に用いた。増幅した断片のクローニングと配列決定をすることにより、転写開始部位の位置及びｐＩＸ配列を含有するｍＲＮＡの５’配列を得る。このようにして、ｐＩＸをコードする可能性のあるｍＲＮＡを同定する。従って、ｐＩＸ発現のレベルと相当する組換えアデノウイルスの安定性との相関も決定することができる。
実施例１１．ＢグループアデノウイルスのＥ１Ｂ及びｐＩＸの配列
上記実施例は、例としてＡｄ３５ウイルスを使用する。サブグル−プＢにおけるその他のメンバーは互いにかなりの相同性を有し、匹敵するｐＩＸの調節を有することがある。
上記実施例は、例としてＡｄ３５ウイルスを使用する。サブグル−プＢにおけるその他のメンバーは互いにかなりの相同性を有し、匹敵するｐＩＸの調節を有することがある。
これを調べるために、サブグル−プＢのメンバーのＥ１Ｂ及びｐＩＸの配列のアラインメントを行った。Ａｄ７の配列（配列番号５７）はジェンバンクアクセッションＸ０３０００を介して入手可能である。Ａｄ１１の配列（配列番号５６）は、Ａｄ１１ｐ野生型ウイルスから単離されるＤＮＡのショットガン配列決定により明らかにされ、それは、Ａｄ３５の配列（配列番号５５）について記載されたもの（ＷＯ ００／７００７１）と類似するラークテクノロジーズ（英国）により行われる。Ａｄ１１及びＡｄ３５は、互いに相同性が高く（全体で９８．１％の類似性）、主な差異はヘキソン及びファイバーノブに位置する。Ａｄ１１の配列はＷＯ ０２／０５３７５９でも開示されている。Ｅ１Ａのポリアデニル化部位（ｐＡ）とｐＩＸ遺伝子のｐＡの下流との間の配列をアラインメントにおいて使用する（図１０）。Ａ３５は、Ａｄ１１とは９８．４％、及びＡｄ７とは８２．９％の全体的な類似性を有する。このことによって、これらのウイルスではｐＩＸの発現は同じ方法で調節されている可能性が非常に高くなる。
従って、前の実施例で例示されるような本発明に係る方法及び手段を用いて、本願明細書でＡｄ１１及びＡｄ７によって例示されるその他のサブグループＢの組換えアデノウイルスの安定性及び／又は挿入容量を結果的に増加させることができる。
実施例１２．Ａｄ５相補細胞株においてＡｄ５−Ｅ４／Ｏｒｆ６を発現するＥ１欠失のＡｄ３５ウイルスの生成
アデノウイルス抗原型３５ゲノムの配列決定のみならず、プラスミドを基にしたベクター系の構築及びＡｄ３５を基にした組換えウイルスの生成は、ＷＯ ００／７００７１に詳細に記載されている。
アデノウイルス抗原型３５ゲノムの配列決定のみならず、プラスミドを基にしたベクター系の構築及びＡｄ３５を基にした組換えウイルスの生成は、ＷＯ ００／７００７１に詳細に記載されている。
ｐＡｄＡｐｔ３５ＩＰ１（ＥＣＡＣＣ寄託番号Ｐ０２０４１２２８、このプラスミドのクローニングの詳細はＷＯ ００／７００７１を参照のこと）へのＡｄ５−Ｅ４−ｏｒｆ６コーディング配列のクローニングは、以下のように行なわれた。プラスミドをＮｈｅＩとＡｖｒＩＩで消化し、仔ウシ腸のホスファターゼ（ニューイングランドバイオラボズ）で脱リン酸化した。ジーンクリーンキットを用いて消化したＤＮＡをゲルから単離した。プラスミドｐΔＭＴ．Ｏｒｆ６．Ｈｙｇｒｏ（図１１、ＥＣＡＣＣ寄託番号Ｐ０２０４１２２６）をＮｈｅＩで消化し、続いてＸｂａＩで部分的に消化した。ゲル上で得られるバンドを分離した後、Ｅ４−ｏｒｆ６配列と連結したΔＭＴプロモーターに相当する１３５０ｂｐの断片をゲルから精製した。次に、単離した双方の断片を連結し、エレクトロ−コンピーテントなＤＨ１０Ｂ細胞（インビトロゲン／ライフテクノロジーズ）を形質転換し、その後、大規模なＤＮＡ調製のために、ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナルに関して正しい方向のインサートを持つコロニーを選択した。これによってコンストラクトｐＡｄ３５．ΔＭＴ．Ｏｒｆ６（図１２）を生じたが、それは、突然変異したメタロチオネインプロモーター（ΔＭＴ）に機能的に連結されたＡｄ５のＥ４−ｏｒｆ６コーディング配列を含有する。ΔＭＴプロモーターは、ハグメイヤーら（１９９６年）によって記載されている。Ａｄ５のＥ４−ｏｒｆ６配列は、Ａｄ５配列（ジェンバンクアクセッション番号Ｍ７３２６０）におけるヌクレオチド３３１９３〜ヌクレオチド３４０７７に相当する。Ａｄ５のＥ４−ｏｒｆ６タンパク質の発現により、Ａｄ５相補細胞において可能な、完全にＥ１を欠失したＡｄ３５ベクターが産生したかどうかを調べるために、ｐＡｄ３５．ΔＭＴ．Ｏｒｆ６をＡｄ３５の骨格コンストラクトｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲと共にＰＥＲ．Ｃ６細胞にコトランスフェクトした。この点に関して、ｐＡｄ３５．ΔＭＴ．Ｏｒｆ６をＰＩ−Ｐｓｐ−１で消化し、ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲをＮｏｔＩで消化して骨格からアデノウイルスインサートを遊離させた。リポフェクトアミンを用いて、２μｇの消化されたｐＡｄ３５．ΔＭＴ．Ｏｒｆ６及び６μｇの消化されたｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲでトランスフェクトした。Ｔ２５フラスコ当たり３．５ｘ１０６個の細胞密度で前日に播いたＰＥＲ．Ｃ６細胞に、トランスフェクション混合物を加えた。翌日、培地をＰＥＲ．Ｃ６培養培地（１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ及び１０ｍＭのＭｇＣｌ２）に置き換え、３７℃／１０％ＣＯ２で細胞をさらにインキュベートした。対照のトランスフェクションは、ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲと共にトランスフェクトしたｐＡｄＡｐｔ３５．Ｌｕｃ、及びｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ単独によりいった。トランスフェクションの２日後、細胞をＴ２５フラスコからＴ８０フラスコに継代し、記載されるようにインキュベートした。３日後に再び、Ａｄ３５骨格と共にｐＡｄ３５．ΔＭＴ．Ｏｒｆ６でトランスフェクトした培養物では、ウイルス複製の指標である細胞変性効果（ＣＰＥ）が見られ、さらに２日間のインキュベートした後に培養物を回収した（細胞及び培地を含む）。細胞懸濁液を２ラウンドの凍結／融解サイクルにかけ、さらに使用するまで得られた物質（粗溶解物）を−２０℃に保存した。ほかのフラスコはＣＰＥを示さず、Ｔ８０に移して６日後、Ｔ８０フラスコの中で１：３で継代した。再び５日後、ｐＡｄＡｐｔ３５．Ｌｕｃ＋ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲでトランスフェクトしたフラスコではＣＰＥ様の事象がわずかに見られたが、これはさらには進行しなかった。ｐＡｄ３５．ΔＭＴ．Ｏｒｆ６のトランスフェクションから得られた粗溶解物０．２ｍｌ及び０．５ｍｌを用いて、Ｔ８０フラスコでおよそ８５％の集密度のＰＥＲ．Ｃ６細胞を再感染させた。これにより１日のインキュベート後に全面的なＣＰＥを生じたが、それは、粗溶解物に感染性のウイルスが存在したことを示している。２サイクルの凍結／融解によってこれらの培養物を回収した。コンストラクトｐＡｄ３５．ΔＭＴ．Ｏｒｆ６単独によるＰＥＲ．Ｃ６への追加の対照のトランスフェクションを行い、ｏｒｆ６の発現自体が細胞毒性及びＣＰＥ様の細胞死を招かないことを確認した。結論的には、ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲを伴ったｐＡｄ３５．ΔＭＴ．Ｏｒｆ６によるトランスフェクションのみが、ＣＰＥ及びウイルスの複製を生じた。
ＰＣＲ解析を行って、前者のＥ１領域を置き換えるＡｄ５−Ｅ４−ｏｒｆ６を持つＡｄ３５を基にしたウイルスゲノムの存在を確認した。この点に関して、以下のような粗溶解物試料からウイルスＤＮＡを単離した。２７５μｌの粗溶解物材料を１０μｌのＤＮＡ分解酵素Ｉ（１０ｍｇ／ｍｌ）と共に３７℃にて３０分間インキュベートした。それに続いて、０．５ＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）６．０μｌ、７．５μｌの２０％ＳＤＳ及び２０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫの１．５μｌを加え、ボルテックスによって混合した。次いで、混合物を５０℃にて１時間インキュベートした。最終的には、ジーンクリーンスピンキット（バイオ１０１社）を用いて、ウイルスＤＮＡを単離した。次いで、プライマー３５ｐｓｉ−Ｆｏｒ及び３５Ｒ４を用いて、単離されたＤＮＡの２μｌをＰＣＲで増幅した。プログラムは、９４℃で２分間、続いて９４℃３０秒間、５８℃３０秒間及び７２℃５分間を３０サイクルで設定し、７２℃で１０分間のインキュベートで終了した。プライマーはＡｄ３５の配列に特異的であり、パッケージング配列からヌクレオチド４６６９（野生型Ａｄ３５の配列における番号付け）にわたる２．９ｋｂの断片を生成し、従って、Ａｄ５のｏｒｆ６導入遺伝子カセットを含む。得られたＰＣＲ断片の電気泳動は、断片が、アダプタープラスミドｐＡｄ３５．ΔＭＴ．Ｏｒｆ６上で生成された対照ＰＣＲ断片と一致する予想される長さを有することを示した。ウイルスがＡｄ５−Ｅ４ｏｒｆ６も発現していれば、Ａｄ５相補細胞上でＥ１を完全に欠失したＡｄ３５を基にしたウイルスを作製することができる。
実施例１３．ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ５Ｅ４の構築
プライマーＤＦ３５−１及び３５ＦＲを用いて第１のＰＣＲ断片を増幅した。追加のＤＭＳＯ（シグマ、最終濃度３％）と共にＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ）を用いて鋳型ＤＮＡとしてのｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ（ＷＯ ００／７００７１を参照のこと）により増幅を行った。プログラムは以下のとおりであった：９４℃で２分間、続いて（９４℃で３０秒間、５２℃で３０秒間及び７２℃で３分間）を３０サイクル、及び確実に完全な断片にするための７２℃で８分間の最終工程である。増幅により、Ａｄ３５の配列のヌクレオチド３０２２４からヌクレオチド３１８０５に相当する１．６ｋｂの断片を生じた。ＢａｍＨＩ部位を３’末端に導入した。ジーンクリーンキットを用いて増幅したＤＮＡをゲルから精製し、ｐＣＲＳｃｒｉｐｔ／Ａｍｐクローニングベクターキット（ストラタジーン）に連結した。エレクトロコンピーテントなＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換した後、さらなる解析のために白色のコロニーを選択した。これにより、コンストラクトｐＣＲ−ｆｉｂｅｒ３５を生じた。平滑クローニングのために、ＰＣＲ断片を２方向で挿入できた。５’末端にてｐＣＲＳｃｒｉｐｔ／ＡｍｐベクターのポリリンカーでＢａｍＨＩ部位を持つインサートを有するクローンを選択した。従って、ＢａｍＨＩによる消化は１．６ｋｂの断片を生じる。配列決定によって、ＰＣＲ断片の正しい増幅が裏付けられた。プライマー５Ｅ４Ｆ及び５Ｅ４Ｒを用いて第２のＰＣＲ断片を増幅した。ｐＷＥ．Ａｄ５．Ａｆ１ＩＩ−ｒＩＴＲ（ＥＣＡＣＣ寄託番号Ｐ９７０８２１１６、ＷＯ ０２／４０６６５に記載）中の余分のＰａｃＩ部位を含有するコスミドベクターである、ｐＷＥ．Ａｄ５．Ａｆ１ＩＩ−ｒＩＴＲｓｐにより増幅を行った。上記のようなＰｗｏＤＮＡポリメラーゼを用いて、ｐＷＥ．Ａｄ５．Ａｆ１ＩＩ−ｒＩＴＲｓｐは鋳型として作用したが、ｐＷＥ．Ａｄ５．Ａｆ１ＩＩ−ｒＩＴＲは同じ目的で使用することもできた。ゲルからの精製の後、ＳｓｔＩ及びＢａｍＨＩ（ＰＣＲ中に導入された双方の部位）でＤＮＡを消化し、ジーンクリーンキットを用いてアガロースゲルから３ｋｂの断片を精製した。増幅されたＡｄ５のＥ４領域は、Ａｄ５の配列の塩基対３２７９４から塩基対３５８２８に相当する。プライマー：３５５ＩＴＲ及び３５３ＩＴＲを用いて、ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ上で第３のＰＣＲ断片を生成した。上述のようにＰＣＲ増幅を行った。得られる１６０ｂｐの断片には、ＳｓｔＩ部位（５’末端）及びＥｃｏＲＩ部位（３’末端）が隣接する。上記のようにゲルから精製した後、ＳｓｔＩとＥｃｏＲＩでＤＮＡを消化した。次いでＡｄ３５の右ＩＴＲに相当する１６０ｂｐの断片を低融点アガロースゲル上で消化した末端から分離し、ゲル中に回収した。次に、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩでｐＵＣ１１９を消化し、ジーンクリーンキットを用いてゲルから３．１ｋｂの断片を精製した。次いで、上記で処理した第２のＰＣＲ断片及び第３のＰＣＲ断片をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで消化したｐＵＣ１１９と連結して、ｐＵＣ．Ａｄ５Ｅ４−３５ＩＴＲを生じた。クローニングしたＰＣＲ由来のインサートを配列決定して正しい増幅を確認した。次にｐＣＲ−ｆｉｂｅｒ３５における１．６ｋｂのインサートをＢａｍＨＩで切り取り、上記のようにゲルから断片を精製した。ｐＵＣ．Ａｄ５Ｅ４−３５ＩＴＲもＢａｍＨＩで消化し、直鎖状の断片をゲルから精製した。双方の断片を連結し、互いに対して正しい方向を有するクローンを選択することによって、ｐＵＣ．３５−５Ｅ４を生じた（図１４）。ｐＵＣ．３５−５Ｅ４の構築を導く工程を図１３に模式的に表す。ｐＵＣ．３５−５Ｅ４中のアデノウイルスインサートを、Ａｄ３５の３’配列を有するｐＢｒ．Ａｄ３５．ＰＲｎ（図１５；ＷＯ ００／７００７１を参照のこと）中にサブクローニングした。この点に関して、コンストラクトｐＵＣ．３５−５Ｅ４をＭｌｕＩとＮｏｔＩで消化し、ジーンクリーンキットを用いて４．７ｋｂの断片をゲルから精製する。次いで、コンストラクトｐＢｒ．Ａｄ３５．ＰＲｎのＭｌｕＩ及びＮｏｔＩによる消化により生じる断片に、この断片を連結する。アガラーゼ酵素（ロシュ）を用いて、この１６．３ｋｂの断片をゲルから精製した。次いで、連結物でコンピテントＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換した。得られたコンストラクトを、ｐＢｒ．Ａｄ３５．ＰＲ５Ｅ４（図１６、ＥＣＡＣＣ寄託番号Ｐ０２０４１２２９）と命名した。最後の工程は、ウイルスコスミドクローンｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲへの、Ａｄ３５配列の修飾された３’末端のクローニングを伴う。この点に関して、製造元の指示書に従って、λファージパッケージング反応（ストラタジーン）において２つの断片を組み合わせる。第１は、ＰａｃＩとＳｗａＩによる消化によって得られるｐＢｒ．Ａｄ３５．ＰＲ５Ｅ４からの１６．８ｋｂの修飾されたＡ３５のインサートであり、第２は、ＰａｃＩとＳｗａＩによるｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲの消化によって得られる２２．８ｋｂの断片である。２つの断片の正しい組み合わせによって、ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ５Ｅ４（図１７）が得られる。従って、このコンストラクトにおいて、Ａｄ３５の骨格におけるＥ４領域は、Ａｄ５に由来する相当する領域で置き換えられる。
プライマーＤＦ３５−１及び３５ＦＲを用いて第１のＰＣＲ断片を増幅した。追加のＤＭＳＯ（シグマ、最終濃度３％）と共にＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ）を用いて鋳型ＤＮＡとしてのｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ（ＷＯ ００／７００７１を参照のこと）により増幅を行った。プログラムは以下のとおりであった：９４℃で２分間、続いて（９４℃で３０秒間、５２℃で３０秒間及び７２℃で３分間）を３０サイクル、及び確実に完全な断片にするための７２℃で８分間の最終工程である。増幅により、Ａｄ３５の配列のヌクレオチド３０２２４からヌクレオチド３１８０５に相当する１．６ｋｂの断片を生じた。ＢａｍＨＩ部位を３’末端に導入した。ジーンクリーンキットを用いて増幅したＤＮＡをゲルから精製し、ｐＣＲＳｃｒｉｐｔ／Ａｍｐクローニングベクターキット（ストラタジーン）に連結した。エレクトロコンピーテントなＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換した後、さらなる解析のために白色のコロニーを選択した。これにより、コンストラクトｐＣＲ−ｆｉｂｅｒ３５を生じた。平滑クローニングのために、ＰＣＲ断片を２方向で挿入できた。５’末端にてｐＣＲＳｃｒｉｐｔ／ＡｍｐベクターのポリリンカーでＢａｍＨＩ部位を持つインサートを有するクローンを選択した。従って、ＢａｍＨＩによる消化は１．６ｋｂの断片を生じる。配列決定によって、ＰＣＲ断片の正しい増幅が裏付けられた。プライマー５Ｅ４Ｆ及び５Ｅ４Ｒを用いて第２のＰＣＲ断片を増幅した。ｐＷＥ．Ａｄ５．Ａｆ１ＩＩ−ｒＩＴＲ（ＥＣＡＣＣ寄託番号Ｐ９７０８２１１６、ＷＯ ０２／４０６６５に記載）中の余分のＰａｃＩ部位を含有するコスミドベクターである、ｐＷＥ．Ａｄ５．Ａｆ１ＩＩ−ｒＩＴＲｓｐにより増幅を行った。上記のようなＰｗｏＤＮＡポリメラーゼを用いて、ｐＷＥ．Ａｄ５．Ａｆ１ＩＩ−ｒＩＴＲｓｐは鋳型として作用したが、ｐＷＥ．Ａｄ５．Ａｆ１ＩＩ−ｒＩＴＲは同じ目的で使用することもできた。ゲルからの精製の後、ＳｓｔＩ及びＢａｍＨＩ（ＰＣＲ中に導入された双方の部位）でＤＮＡを消化し、ジーンクリーンキットを用いてアガロースゲルから３ｋｂの断片を精製した。増幅されたＡｄ５のＥ４領域は、Ａｄ５の配列の塩基対３２７９４から塩基対３５８２８に相当する。プライマー：３５５ＩＴＲ及び３５３ＩＴＲを用いて、ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ上で第３のＰＣＲ断片を生成した。上述のようにＰＣＲ増幅を行った。得られる１６０ｂｐの断片には、ＳｓｔＩ部位（５’末端）及びＥｃｏＲＩ部位（３’末端）が隣接する。上記のようにゲルから精製した後、ＳｓｔＩとＥｃｏＲＩでＤＮＡを消化した。次いでＡｄ３５の右ＩＴＲに相当する１６０ｂｐの断片を低融点アガロースゲル上で消化した末端から分離し、ゲル中に回収した。次に、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩでｐＵＣ１１９を消化し、ジーンクリーンキットを用いてゲルから３．１ｋｂの断片を精製した。次いで、上記で処理した第２のＰＣＲ断片及び第３のＰＣＲ断片をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで消化したｐＵＣ１１９と連結して、ｐＵＣ．Ａｄ５Ｅ４−３５ＩＴＲを生じた。クローニングしたＰＣＲ由来のインサートを配列決定して正しい増幅を確認した。次にｐＣＲ−ｆｉｂｅｒ３５における１．６ｋｂのインサートをＢａｍＨＩで切り取り、上記のようにゲルから断片を精製した。ｐＵＣ．Ａｄ５Ｅ４−３５ＩＴＲもＢａｍＨＩで消化し、直鎖状の断片をゲルから精製した。双方の断片を連結し、互いに対して正しい方向を有するクローンを選択することによって、ｐＵＣ．３５−５Ｅ４を生じた（図１４）。ｐＵＣ．３５−５Ｅ４の構築を導く工程を図１３に模式的に表す。ｐＵＣ．３５−５Ｅ４中のアデノウイルスインサートを、Ａｄ３５の３’配列を有するｐＢｒ．Ａｄ３５．ＰＲｎ（図１５；ＷＯ ００／７００７１を参照のこと）中にサブクローニングした。この点に関して、コンストラクトｐＵＣ．３５−５Ｅ４をＭｌｕＩとＮｏｔＩで消化し、ジーンクリーンキットを用いて４．７ｋｂの断片をゲルから精製する。次いで、コンストラクトｐＢｒ．Ａｄ３５．ＰＲｎのＭｌｕＩ及びＮｏｔＩによる消化により生じる断片に、この断片を連結する。アガラーゼ酵素（ロシュ）を用いて、この１６．３ｋｂの断片をゲルから精製した。次いで、連結物でコンピテントＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換した。得られたコンストラクトを、ｐＢｒ．Ａｄ３５．ＰＲ５Ｅ４（図１６、ＥＣＡＣＣ寄託番号Ｐ０２０４１２２９）と命名した。最後の工程は、ウイルスコスミドクローンｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲへの、Ａｄ３５配列の修飾された３’末端のクローニングを伴う。この点に関して、製造元の指示書に従って、λファージパッケージング反応（ストラタジーン）において２つの断片を組み合わせる。第１は、ＰａｃＩとＳｗａＩによる消化によって得られるｐＢｒ．Ａｄ３５．ＰＲ５Ｅ４からの１６．８ｋｂの修飾されたＡ３５のインサートであり、第２は、ＰａｃＩとＳｗａＩによるｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲの消化によって得られる２２．８ｋｂの断片である。２つの断片の正しい組み合わせによって、ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ５Ｅ４（図１７）が得られる。従って、このコンストラクトにおいて、Ａｄ３５の骨格におけるＥ４領域は、Ａｄ５に由来する相当する領域で置き換えられる。
実施例１４．ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ５Ｏｒｆ６の構築
ｐＩＸ遺伝子（Ａｄ３５の配列のヌクレオチド３４０１）から右ＩＴＲの末端を含有するが、Ａｄ５の相当する配列について変換されているＥ４−ｏｒｆ６及びＥ４−ｏｒｆ６／７を持つアデノウイルスの骨格コンストラクトを得るために、以下に記載するように、Ａｄ３５及びＡｄ５をＰＣＲで増幅し、組み合わせた。３％までのＤＭＳＯを加えて、ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼによってＰＣＲ断片を生成した。第１のＰＣＲは、ｐＢｒ．Ａｄ３５．ＰＲｎ（図１５；ＷＯ ００／７００７１を参照のこと）を鋳型として、プライマーＥ４−Ｆ１及びＥ４−Ｒ２を用いて行った。プログラムは、９４℃にて２分間、（９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間及び７２℃で１分間）を５サイクル、次いで（９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間及び７２℃で１分間）を３０サイクルに設定し、６８℃で８分間の最終工程で終了した。ジーンクリーンキットを用いて、得られた１．８ｋｂの断片を精製した。第２のＰＣＲは、ｐＷＥ．Ａｄ５．Ａｆ１ＩＩ−ｒＩＴＲ（ＥＣＡＣＣ供託番号Ｐ９７０８２１１６、ＷＯ ０２／４０６６５に記載）におけるＰａｃＩ部位を含有するコスミドベクターである、鋳型としてのｐＷＥ．Ａｄ５．Ａｆ１ＩＩ−ｒＩＴＲｓｐならびにプライマーのＥ４−Ｆ３及びＥ４−Ｒ４により行った。プログラムは以下のように：９４℃にて２分間、次いで（９４℃で３０秒間、６２℃で３０秒間及び７２℃で１分間）を３０サイクルに設定し、６８℃で８分間の最終工程で終了した。１．１ｋｂの断片を上記のように精製した。第３のＰＣＲは、鋳型としてのｐＢｒ．Ａｄ３５．ＰＲｎならびにプライマーのＥ４−Ｆ５及びＥ４−Ｒ６により行った。プログラムは以下のように：９４℃にて２分間、（９４℃で３０秒間、４８℃で３０秒間及び７２℃で４５秒間）を５サイクル、次いで（９４℃で３０秒間、５６℃で３０秒間及び７２℃で４５秒間）を３０サイクルに設定し、６８℃で８分間の最終工程で終了した。上記のように３６６ｂｐの断片を精製した。精製した断片の試料をゲルにかけて濃度を推定し、次いで、断片を一緒に混合し、合計３０μｌ中に７００ｎｇのＰＣＲ−１、６５０ｎｇのＰＣＲ−２及び４３０ｎｇのＰＣＲ−３を含むようにした。この混合物に、ＥｃｏＰｏｌ緩衝液（ニューイングランドバイオラボズ）３μｌ、２ｍＭのｄＮＴＰ溶液３μｌ及びミリＱ水３μｌを加えた。得られた混合物を９４℃で３分間インキュベートし、ＰＣＲ機にて０．５℃／秒の割合で６５℃に冷却した。６５℃で１０分間のインキュベートに続いて、０．０５℃／秒の割合で２０℃まで、混合物をさらに冷却し、２０℃にて１０分間インキュベートした。次いで、１μｌ（５単位）のクレノウ酵素（ニューイングランドバイオラボズ）を加え、続いて３７℃にて６０分間インキュベートした。このクレノウ混合物５μｌを鋳型として用いて、以下のように２つの断片を別途増幅した。最終濃度３％にＤＭＳＯを加えたＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ）を用いた反応において、プライマーセット１：ＮＦ−１及びＮｃｏＩ−Ｒを使用し、ＰＣＲ機の以下の設定：９４℃にて２分間、次いで（９４℃で３０秒間、６６℃で３０秒間及び７２℃で３分間）を３０サイクル、続いて６８℃で８分間の最終工程を使用した。最終濃度３％にＤＭＳＯを加えたＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ）を用いた反応において、プライマーセット２：ＮｃｏＩ−Ｆ及びＮＲ−２を使用し、ＰＣＲ機の以下の設定：９４℃にて２分間、次いで（９４℃で３０秒間、６２℃で３０秒間及び７２℃で９０秒間）を３０サイクル、続いて６８℃で８分間の最終工程を使用した。ジーンクリーンキットを用いて、２．７ｋｂ（プライマーセット１）及び１．１ｋｂ（プライマーセット２）の得られた断片をゲルから精製し、それぞれをｐＣＲｓｃｒｉｐｔＡｍｐベクター（ストラタジーン）に連結し、エレクトロコンピーテントなＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換した。これにより、コンストラクトｐＣＲｓｃｒｉｐｔＡｍｐ．ＮＦＩ−ＮｃｏＩＲ（図１８）及びコンストラクトｐＣＲｓｃｒｉｐｔＡｍｐ．ＮｃｏＩＦ−ＮＲ２（図１９）が得られた。インサートは平滑末端を含有していたので、各クローニングについて２つの配向性が得られた。ＫｐｎＩ消化を用いて、さらなるクローニングに必要な配向性を持つコンストラクトを選択した（図１８及び１９を参照のこと）。次いで、インサートを配列決定して正しい増幅を確認した。次に、ＢａｍＨＩとＮｃｏＩを用いて、ｐＣＲｓｃｒｉｐｔＡｍｐ．ＮｃｏＩＦ−ＮＲ２のインサートの一部を切り出し、上記のようにゲルから精製した。同じ酵素でｐＣＲｓｃｒｉｐｔＡｍｐ．ＮＦＩ−ＮｃｏＩＲを消化し、断片を含有するベクターをゲルから精製した。これらの断片を連結してｐＣＲ．ＮＦ１−ＮＲ２（図２０）を得た。ｐＣＲ．ＮＦ１−ＮＲ２は、ジェンバンクにおいて公開されているＡｄ５の配列（受入番号Ｍ７３２６０）の３２９６８から３４０７７の間に位置する配列に由来するＡｄ５について置き換えられたヌクレオチド３１８７９〜ヌクレオチド３２９７４の間のＥ４−ｏｒｆ６及びＥ４−ｏｒｆ６／７の配列を持つＡｄ３５の配列のヌクレオチド３０１６２からヌクレオチド３３２３４の間のＡｄ３５の配列を含有する。従って、図２１及び２２に提示されるアミノ酸アラインメントに見ることができるように、クローニングしたＥ４−ｏｒｆ６タンパク質のアミノ酸配列は、Ａｄ５に見い出されるＥ４−ｏｒｆ６の配列（配列番号６１；Ａｄ３５のＥ４−ｏｒｆ６のアミノ酸配列は配列番号６２）と同一であり、Ｅ４−ｏｒｆ６／７のアミノ酸配列の大部分は、Ａｄ５中に存在するＥ４−ｏｒｆ６／７と同一である（Ｅ４−ｏｒｆ６／７の配列は、Ａｄ５については配列番号６３、Ａｄ３５については配列番号６４、クローニングした融合タンパク質については配列番号６５）。明らかに、本発明から逸脱することなく、上記で概説した一般的な方法を用いて、様々なハイブリッドＡｄ３５−Ａｄ５のＥ４コンストラクトを設計することができる。次いでｐＣＲ．ＮＦ−ＮＲ−２に由来するこのキメラインサートをｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲにクローニングし：ｐＣＲ．ＮＦ−ＮＲ−２をＭｌｕＩとＮｄｅＩで消化し、ジーンクリーンキットを用いて、得られた２．８ｋｂの断片をゲルから精製した。コンストラクトｐＢｒ．Ａｄ３５．ＰＲｎもＭｌｕＩとＮｄｅＩで消化し、アガラーゼ酵素（ロシュ）を用いて１８ｋｂのベクター断片をゲルから単離した。双方の断片の連結によりコンストラクトｐＢｒ．Ａｄ３５．ＰＲ．５Ｏｒｆ６（図２３、ＥＣＡＣＣ寄託番号Ｐ０２０４１２２７）を生じた。次いで、上記のようなλファージパッケージングを用いて、このコンストラクト中におけるキメラＥ４領域を含有するＰａｃＩおよびＳｗａＩの間のＡ３５配列を、コンストラクトｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲにクローニングする。次いで、得られるｐＷＥ．Ａｄ３５ｐＩＸ−ｒＩＴＲ．５Ｏｒｆ６（図２４）を用いて、Ａ３５アダプタープラスミドと共に、ＰＥＲ．Ｃ６パッケージング細胞上にコトランスフェクションすることにより、Ａｄ３５を基にした組換えウイルスを生成する。
ｐＩＸ遺伝子（Ａｄ３５の配列のヌクレオチド３４０１）から右ＩＴＲの末端を含有するが、Ａｄ５の相当する配列について変換されているＥ４−ｏｒｆ６及びＥ４−ｏｒｆ６／７を持つアデノウイルスの骨格コンストラクトを得るために、以下に記載するように、Ａｄ３５及びＡｄ５をＰＣＲで増幅し、組み合わせた。３％までのＤＭＳＯを加えて、ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼによってＰＣＲ断片を生成した。第１のＰＣＲは、ｐＢｒ．Ａｄ３５．ＰＲｎ（図１５；ＷＯ ００／７００７１を参照のこと）を鋳型として、プライマーＥ４−Ｆ１及びＥ４−Ｒ２を用いて行った。プログラムは、９４℃にて２分間、（９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間及び７２℃で１分間）を５サイクル、次いで（９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間及び７２℃で１分間）を３０サイクルに設定し、６８℃で８分間の最終工程で終了した。ジーンクリーンキットを用いて、得られた１．８ｋｂの断片を精製した。第２のＰＣＲは、ｐＷＥ．Ａｄ５．Ａｆ１ＩＩ−ｒＩＴＲ（ＥＣＡＣＣ供託番号Ｐ９７０８２１１６、ＷＯ ０２／４０６６５に記載）におけるＰａｃＩ部位を含有するコスミドベクターである、鋳型としてのｐＷＥ．Ａｄ５．Ａｆ１ＩＩ−ｒＩＴＲｓｐならびにプライマーのＥ４−Ｆ３及びＥ４−Ｒ４により行った。プログラムは以下のように：９４℃にて２分間、次いで（９４℃で３０秒間、６２℃で３０秒間及び７２℃で１分間）を３０サイクルに設定し、６８℃で８分間の最終工程で終了した。１．１ｋｂの断片を上記のように精製した。第３のＰＣＲは、鋳型としてのｐＢｒ．Ａｄ３５．ＰＲｎならびにプライマーのＥ４−Ｆ５及びＥ４−Ｒ６により行った。プログラムは以下のように：９４℃にて２分間、（９４℃で３０秒間、４８℃で３０秒間及び７２℃で４５秒間）を５サイクル、次いで（９４℃で３０秒間、５６℃で３０秒間及び７２℃で４５秒間）を３０サイクルに設定し、６８℃で８分間の最終工程で終了した。上記のように３６６ｂｐの断片を精製した。精製した断片の試料をゲルにかけて濃度を推定し、次いで、断片を一緒に混合し、合計３０μｌ中に７００ｎｇのＰＣＲ−１、６５０ｎｇのＰＣＲ−２及び４３０ｎｇのＰＣＲ−３を含むようにした。この混合物に、ＥｃｏＰｏｌ緩衝液（ニューイングランドバイオラボズ）３μｌ、２ｍＭのｄＮＴＰ溶液３μｌ及びミリＱ水３μｌを加えた。得られた混合物を９４℃で３分間インキュベートし、ＰＣＲ機にて０．５℃／秒の割合で６５℃に冷却した。６５℃で１０分間のインキュベートに続いて、０．０５℃／秒の割合で２０℃まで、混合物をさらに冷却し、２０℃にて１０分間インキュベートした。次いで、１μｌ（５単位）のクレノウ酵素（ニューイングランドバイオラボズ）を加え、続いて３７℃にて６０分間インキュベートした。このクレノウ混合物５μｌを鋳型として用いて、以下のように２つの断片を別途増幅した。最終濃度３％にＤＭＳＯを加えたＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ）を用いた反応において、プライマーセット１：ＮＦ−１及びＮｃｏＩ−Ｒを使用し、ＰＣＲ機の以下の設定：９４℃にて２分間、次いで（９４℃で３０秒間、６６℃で３０秒間及び７２℃で３分間）を３０サイクル、続いて６８℃で８分間の最終工程を使用した。最終濃度３％にＤＭＳＯを加えたＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ）を用いた反応において、プライマーセット２：ＮｃｏＩ−Ｆ及びＮＲ−２を使用し、ＰＣＲ機の以下の設定：９４℃にて２分間、次いで（９４℃で３０秒間、６２℃で３０秒間及び７２℃で９０秒間）を３０サイクル、続いて６８℃で８分間の最終工程を使用した。ジーンクリーンキットを用いて、２．７ｋｂ（プライマーセット１）及び１．１ｋｂ（プライマーセット２）の得られた断片をゲルから精製し、それぞれをｐＣＲｓｃｒｉｐｔＡｍｐベクター（ストラタジーン）に連結し、エレクトロコンピーテントなＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換した。これにより、コンストラクトｐＣＲｓｃｒｉｐｔＡｍｐ．ＮＦＩ−ＮｃｏＩＲ（図１８）及びコンストラクトｐＣＲｓｃｒｉｐｔＡｍｐ．ＮｃｏＩＦ−ＮＲ２（図１９）が得られた。インサートは平滑末端を含有していたので、各クローニングについて２つの配向性が得られた。ＫｐｎＩ消化を用いて、さらなるクローニングに必要な配向性を持つコンストラクトを選択した（図１８及び１９を参照のこと）。次いで、インサートを配列決定して正しい増幅を確認した。次に、ＢａｍＨＩとＮｃｏＩを用いて、ｐＣＲｓｃｒｉｐｔＡｍｐ．ＮｃｏＩＦ−ＮＲ２のインサートの一部を切り出し、上記のようにゲルから精製した。同じ酵素でｐＣＲｓｃｒｉｐｔＡｍｐ．ＮＦＩ−ＮｃｏＩＲを消化し、断片を含有するベクターをゲルから精製した。これらの断片を連結してｐＣＲ．ＮＦ１−ＮＲ２（図２０）を得た。ｐＣＲ．ＮＦ１−ＮＲ２は、ジェンバンクにおいて公開されているＡｄ５の配列（受入番号Ｍ７３２６０）の３２９６８から３４０７７の間に位置する配列に由来するＡｄ５について置き換えられたヌクレオチド３１８７９〜ヌクレオチド３２９７４の間のＥ４−ｏｒｆ６及びＥ４−ｏｒｆ６／７の配列を持つＡｄ３５の配列のヌクレオチド３０１６２からヌクレオチド３３２３４の間のＡｄ３５の配列を含有する。従って、図２１及び２２に提示されるアミノ酸アラインメントに見ることができるように、クローニングしたＥ４−ｏｒｆ６タンパク質のアミノ酸配列は、Ａｄ５に見い出されるＥ４−ｏｒｆ６の配列（配列番号６１；Ａｄ３５のＥ４−ｏｒｆ６のアミノ酸配列は配列番号６２）と同一であり、Ｅ４−ｏｒｆ６／７のアミノ酸配列の大部分は、Ａｄ５中に存在するＥ４−ｏｒｆ６／７と同一である（Ｅ４−ｏｒｆ６／７の配列は、Ａｄ５については配列番号６３、Ａｄ３５については配列番号６４、クローニングした融合タンパク質については配列番号６５）。明らかに、本発明から逸脱することなく、上記で概説した一般的な方法を用いて、様々なハイブリッドＡｄ３５−Ａｄ５のＥ４コンストラクトを設計することができる。次いでｐＣＲ．ＮＦ−ＮＲ−２に由来するこのキメラインサートをｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲにクローニングし：ｐＣＲ．ＮＦ−ＮＲ−２をＭｌｕＩとＮｄｅＩで消化し、ジーンクリーンキットを用いて、得られた２．８ｋｂの断片をゲルから精製した。コンストラクトｐＢｒ．Ａｄ３５．ＰＲｎもＭｌｕＩとＮｄｅＩで消化し、アガラーゼ酵素（ロシュ）を用いて１８ｋｂのベクター断片をゲルから単離した。双方の断片の連結によりコンストラクトｐＢｒ．Ａｄ３５．ＰＲ．５Ｏｒｆ６（図２３、ＥＣＡＣＣ寄託番号Ｐ０２０４１２２７）を生じた。次いで、上記のようなλファージパッケージングを用いて、このコンストラクト中におけるキメラＥ４領域を含有するＰａｃＩおよびＳｗａＩの間のＡ３５配列を、コンストラクトｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲにクローニングする。次いで、得られるｐＷＥ．Ａｄ３５ｐＩＸ−ｒＩＴＲ．５Ｏｒｆ６（図２４）を用いて、Ａ３５アダプタープラスミドと共に、ＰＥＲ．Ｃ６パッケージング細胞上にコトランスフェクションすることにより、Ａｄ３５を基にした組換えウイルスを生成する。
実施例１５．ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲΔＥ３．５Ｅ４及びｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲΔＥ３５Ｏｒｆ６の構築
Ｅ３配列の欠失によりａｄ３５の骨格をさらに改変した。Ｅ３タンパク質は、アデノウイルス感染に対する宿主免疫応答を調節することが知られているので、組換えウイルスの生体外増殖には必要ではない。さらに、Ｅ３配列の欠失により、パッケージング効率を落とすことなく、さらに大きな異種の配列を挿入することができる。また、ワクチン用ベヒクルとしてのアデノウイルスベクターの応用については、Ｅ３にコードされる免疫調節性遺伝子の発現は好ましくない。
Ｅ３配列の欠失によりａｄ３５の骨格をさらに改変した。Ｅ３タンパク質は、アデノウイルス感染に対する宿主免疫応答を調節することが知られているので、組換えウイルスの生体外増殖には必要ではない。さらに、Ｅ３配列の欠失により、パッケージング効率を落とすことなく、さらに大きな異種の配列を挿入することができる。また、ワクチン用ベヒクルとしてのアデノウイルスベクターの応用については、Ｅ３にコードされる免疫調節性遺伝子の発現は好ましくない。
ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲΔ３（図１）の構築は上で記載した。上述のＥ４が改変された骨格のコンストラクトのＥ３欠失型を構築するために、以下のようにｐＢｒ．Ａｄ３５．ＰＲｎΔＥ３（図２５）コンストラクトにＥ４改変物を導入した。コンストラクトｐＵＣ．３５−５Ｅ４（図１３）をＭｌｕＩとＮｏｔＩで消化し、ジーンクリーンＩＩキットを用いて４．７ｋｂの断片をゲルから単離した。コンストラクトｐＢｒ．Ａｄ３５．ＰＲｎΔＥ３もＭｌｕＩとＮｏｔＩで消化し、ジーンクリーンスピンキットを用いて、１３．６ｋｂのベクター断片をゲルから単離した。これらの断片を連結してｐＢｒ．Ａｄ３５．ΔＥ３．ＰＲ５Ｅ４（図２６）を生じた。コンストラクトｐＣＲ．ＮＦ１−ＮＲ２（図２０）をＭｌｕＩ，ＮｄｅＩ及びＢｇｌＩ（後者はベクター断片をさらに小さな断片に消化するため）で消化し、ジーンクリーンスピンキットを用いて２．８ｋｂの断片を単離した。コンストラクトｐＢｒ．Ａｄ３５．ＰＲｎΔＥ３をＭｌｕＩとＮｄｅＩで消化し、ＣＩＰ酵素（ニューイングランドバイオラボズ）を用いて脱リン酸化し、ジーンクリーンスピンキットを用いて１５．２ｋｂのベクター断片を単離した。これらの断片を連結することにより、コンストラクト、ｐＢｒ．Ａｄ３５．ΔＥ３．ＰＲ５Ｏｒｆ６（図２７）が得られた。
次いで、ｐＢｒ．Ａｄ３５．ΔＥ３．ＰＲ５Ｅ４及びｐＢｒ．Ａｄ３５．ΔＥ３．ＰＲ５Ｏｒｆ６を用いて、ｐＢｒ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲにおける３’ＰａｃＩ−ＳｗａＩ断片を、中に記載したような、ｐＢｒ．Ａｄ３５．ΔＥ３．ＰＲ５Ｅ４及びｐＢｒ．Ａｄ３５．ΔＥ３．ＰＲ５Ｏｒｆ６の相当する領域に交換する。これにより、ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲΔＥ３．５Ｅ４及びｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲΔＥ３．５Ｏｒｆ６が導かれる。これらの大きなコスミドを生成する別の方法は、パッケージングのための連結反応において３つの断片を使用することである：ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ由来の１４．７ｋｂのＮｏｔＩ−ＰａｃＩ断片、ｐＢｒ．Ａｄ３５．ΔＥ３．ＰＲ５Ｅ４又はｐＢｒ．Ａｄ３５．ΔＥ３．ＰＲ５Ｏｒｆ６のＰａｃＩ−ＮｏｔＩインサート及びＮｏｔＩ消化したｐＷＥ１５コスミドのベクター断片（ストラタジーン）。この後者の断片は、ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲのＮｏｔＩ／ＰａｃＩ消化からも単離することができる。たとえば、ＮｏｔＩ消化したｐＢｒ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲΔＥ３．５Ｏｒｆ６を、たとえば、ＰＩ−ＰｓｐＩ消化したｐＡｄＡｐｔ３５．ＬａｃＺ．ｒｓｖ（実施例９）と共に、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞にコトランスフェクトすることによって、Ａｄ３５に由来する組換えアデノウイルスを生成し、その組換えアデノウイルスは、Ａｄ５に由来するＥ４−ｏｒｆ６（ＰＥＲ．Ｃ６に増殖能を与える）を含み、前記組換えアデノウイルスはさらに異種ｐＩＸプロモーターを有し、その結果、増加したｐＩＸの発現レベル及び安定したビリオンを生じる。
実施例１６．ＰＥＲ．Ｃ６細胞におけるＥ１欠失及びＥ１／Ｅ３欠失のＡｄ３５を基にしたベクターの生成
ｐＢｒ．Ａｄ３５．ＰＲｎを基にしたコンストラクトを用いた相補細胞株であるＰＥＲ．Ｃ６において組換えＡｄ３５ウイルスの生成を可能にするために、我々は、先ず、Ａｄ３５配列（ＷＯ ００／７００７１）を、Ａｄ３５の配列の塩基対３４０１から塩基対２４６５０まで、従って、アダプタープラスミド及びｐＢｒ．Ａｄ３５．ＰＲｎを基にしたコンストラクトの双方との重なり合いを含有する新しいコンストラクトを作製した。これら３つのプラスミドのＰＥＲ．Ｃ６細胞へのトランスフェクション及び二重相同組換え事象によって、図１８に概略するように、完全なウイルスゲノム及び組換えウイルスの複製がもたらされる。必要なプラスミドは、ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲにおけるＡｄ３５配列の大部分の欠失によって作製した。この点に関して、ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲをＥｃｏＲＶで消化し、ジーンクリーンスピンキットを用いて、２９ｋｂのベクターを含有する断片を低融点ゲルから精製した。精製したＤＮＡを自己連結し、電気的にエレクトロコンピーテントなＤＨ１０Ｂ細菌（インビトロゲン／ＬＴＩ）を形質転換するのに用い、ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ＥｃｏＲＶ（図２９）を生じた。
ｐＢｒ．Ａｄ３５．ＰＲｎを基にしたコンストラクトを用いた相補細胞株であるＰＥＲ．Ｃ６において組換えＡｄ３５ウイルスの生成を可能にするために、我々は、先ず、Ａｄ３５配列（ＷＯ ００／７００７１）を、Ａｄ３５の配列の塩基対３４０１から塩基対２４６５０まで、従って、アダプタープラスミド及びｐＢｒ．Ａｄ３５．ＰＲｎを基にしたコンストラクトの双方との重なり合いを含有する新しいコンストラクトを作製した。これら３つのプラスミドのＰＥＲ．Ｃ６細胞へのトランスフェクション及び二重相同組換え事象によって、図１８に概略するように、完全なウイルスゲノム及び組換えウイルスの複製がもたらされる。必要なプラスミドは、ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲにおけるＡｄ３５配列の大部分の欠失によって作製した。この点に関して、ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲをＥｃｏＲＶで消化し、ジーンクリーンスピンキットを用いて、２９ｋｂのベクターを含有する断片を低融点ゲルから精製した。精製したＤＮＡを自己連結し、電気的にエレクトロコンピーテントなＤＨ１０Ｂ細菌（インビトロゲン／ＬＴＩ）を形質転換するのに用い、ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ＥｃｏＲＶ（図２９）を生じた。
トランスフェクションに使用したＤＮＡは全て、表Ｖに示すように消化し、６５℃にて１５分間、熱で非働化し、さらに処理することなくトランスフェクションに使用した。トランスフェクションの前日に、ＰＥＲ．Ｃ６細胞を３ｘ１０６個の細胞／フラスコの密度にてＴ２５フラスコに播き、５時間後、無血清のＤＭＥＭ培地（ギブコ／ＢＲＬ）におけるトランスフェクション混合物をＰＥＲ．Ｃ６培養培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ及び１０ｍＭのＭｇＣｌ２）に置き換えた以外は、製造元の指示書に従って、リポフェクトアミン（インビトロゲン／ＬＴＩ）を用いて表Ｖに示すようにトランスフェクトした。翌日、蛍光顕微鏡により、トランスフェクション効率は５０％と推定された。２日後、細胞をトリプシン処理し、Ｔ８０フラスコに再び播き、３７℃／１０％ＣＯ２でさらにインキュベートした。トランスフェクションの６日後、Ａｄ３５．Ａｐｔ．ｅＧＦＰ＋ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲでトランスフェクトしたＰＥＲ．Ｃ６の培養物を除いて、すべての培養物は全面的な細胞変性効果（ＣＰＥ、ウイルス増殖の指標）を示した。１日後、ＣＰＥのあるフラスコにおける細胞及び培地を回収し、２サイクルの凍結融解にかけ、遠心分離（１５００ｒｐｍで１０分間）により、細胞残渣を除き、これら粗溶解物１００μｌを用いて、Ｔ８０フラスコにて８５％の集密度の新鮮なＰＥＲ．Ｃ６を再感染させた。ＣＰＥの徴候を示さなかったＡｄ３５．ＡｄＡｐｔ．ｅＧＦＰ＋ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲの形質転換物もトリプシン処理により回収し、上記のように処理した。新鮮なＰＥＲ．Ｃ６を感染させて２日後、最初の回収時点でＣＰＥの徴候を示さなかった１つを除いて、すべてのフラスコが全面的なＣＰＥを示した。このことは、Ａｄ５のＥ４−ｏｒｆ６遺伝子産物がＡｄ３５の骨格から発現される場合、ＰＥＲ．Ｃ６にて完全にＥ１を欠失したＡｄ３５に基づくウイルスを作製できることを明瞭に示している。
実施例１７．ｐＩＸの発現を促進する異種プロモーターを持つ、Ｅ１欠失のＡｄ３５ウイルス
完全にＥ１を欠失したウイルスにおけるｐＩＸ遺伝子を活性化する異種プロモーターの配列の効果を調べるために、一連のアダプタープラスミドを用いて組換えＡｄ３５ウイルスを生成した。この点に関して、ｐＡｄＡｐｔ３５ＬａｃＺ、ｐＡｄＡｐｔ３５．ＬａｃＺ．ｒｓｖ（実施例９）、ｐＡｄＡｐｔ５３５．ＬａｃＺ（実施例５）及びｐＡｄＡｐｔ３５ＢＬａｃＺ（ｐＩＸ遺伝子の前でＡｄ３５のＥ１Ｂプロモーター配列を含有する；以下に記載）をｐＩＰｓｐ−Ｉで消化し、実施例２（及びＷＯ ００／７００７１）に記載するように、ＮｏｔＩで消化したコスミドｐＷＥ／Ａｄ３５−３４８１及びｐＷＥ／Ａｄ３５−３４８１ΔＥ３（実施例７）を持つウイルスを生成するのに使用した。さらにアダプタープラスミドｐＢｒ．Ａｄ３５ΔＳＭ．ＡｄＡｐｔＬａｃＺ（図７；実施例１０）によりウイルスを生成した。このアダプタープラスミドは、Ｅ１Ａ配列及びＥ１Ｂ配列の大部分を欠失する。それは３’Ｅ１Ｂ−５５Ｋ配列の０．６ｋｂを保持し、５５Ｋの停止コドンとｐＩＸの開始コドンとの間の野生型配列も有する。
完全にＥ１を欠失したウイルスにおけるｐＩＸ遺伝子を活性化する異種プロモーターの配列の効果を調べるために、一連のアダプタープラスミドを用いて組換えＡｄ３５ウイルスを生成した。この点に関して、ｐＡｄＡｐｔ３５ＬａｃＺ、ｐＡｄＡｐｔ３５．ＬａｃＺ．ｒｓｖ（実施例９）、ｐＡｄＡｐｔ５３５．ＬａｃＺ（実施例５）及びｐＡｄＡｐｔ３５ＢＬａｃＺ（ｐＩＸ遺伝子の前でＡｄ３５のＥ１Ｂプロモーター配列を含有する；以下に記載）をｐＩＰｓｐ−Ｉで消化し、実施例２（及びＷＯ ００／７００７１）に記載するように、ＮｏｔＩで消化したコスミドｐＷＥ／Ａｄ３５−３４８１及びｐＷＥ／Ａｄ３５−３４８１ΔＥ３（実施例７）を持つウイルスを生成するのに使用した。さらにアダプタープラスミドｐＢｒ．Ａｄ３５ΔＳＭ．ＡｄＡｐｔＬａｃＺ（図７；実施例１０）によりウイルスを生成した。このアダプタープラスミドは、Ｅ１Ａ配列及びＥ１Ｂ配列の大部分を欠失する。それは３’Ｅ１Ｂ−５５Ｋ配列の０．６ｋｂを保持し、５５Ｋの停止コドンとｐＩＸの開始コドンとの間の野生型配列も有する。
全面的なＣＰＥの際、細胞及び培地を回収し、凍結／融解し、遠心分離して細胞残渣を除いた。次いで、各トランスフェクタントの上清（透明な溶解物）を用いて、実施例９に記載されるようにプラークアッセイを行った。透明な溶解物を１０倍で連続希釈し、１０−５〜１０−９の希釈をプレートに入れた。
寒天を上に載せた１週間後、プラークが目に見えるようになったが、Ｘ−ｇａｌで染色してＬａｃＺ活性をモニターした。表ＶＩは、これらの実験の結果を要約する。ｐＩＸを調節する内因性の近位ｐＩＸの上流の配列以外の追加の又は他の配列を有するＡｄ３５ウイルスは全てより良く機能し、Ｅ１欠失のＡｄ３５．ＡｄＡｐｔ．ＬａｃＺウイルスに比べて、我々のアッセイでは、さらに多数のプラーク発現を有する。Ａｄ３５ΔＳＭ．ＬａｃＺウイルスのゲノム全長（野生型Ａｄ３５に比べて１０６％）が、Ａｄ５ウイルスで決定された（１０５％）パッケージ可能な最大長を超えていることに注目すること。このことは、このウイルスについて得られる結果に影響を及ぼしてもよい。Ａｄ３５．ＡｄＡｐｔ．ＬａｃＺ．ｒｓｖ（１０５％）も理論的にパッケージ可能なサイズの境界である。要するに、結果は、ｐＩＸの発現を駆動する異種プロモーターは、最大に認容されるパッケージ可能なサイズ及びＥ１欠失のＡｄ３５ウイルスの安定性を改善することを示している。さらに長い内因性の近位配列を有する（Ａｄ３５ΔＳＭ．ＬａｃＺ）ウイルスについても同じことが真実であるということは、この中の追加の（Ｅ１Ｂ５５Ｋ）配列がｐＩＸの発現に対する調節要素を含有することを示唆している。
ｐＡｄＡｐｔ３５ＢＬａｃＺは、ｐＩＸ遺伝子を調節するＡｄ３５のＥ１Ｂプロモーター配列を持つＡｄ３５のアダプタープラスミドである。アダプタープラスミドｐＡｄＡｐｔ３５ＢＬａｃＺは以下のように生成した：プライマー３５Ｅ１Ｂｌｏｎｇ及びＡｄ３５Ｅ１ｂｐｒｏｍｒｅｖを用いて、Ｅ１Ｂプロモーター断片を増幅した。双方のプライマーを脱リン酸化した。製造元の指示書に従って、ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（イノ−トレイン・ダイアグノスティック社）により反応を行った。鋳型ＤＮＡとしてｐＢｒ．Ａｄ３５．ｌｅｆｔＩＴＲ−ｐＩＸを用いた（２５ｎｇ、ＷＯ ０２／４０６６５に記載）。プログラムは以下のように：９４℃にて２分間、次いで（９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間及び７２℃で１分間）を３０サイクルに設定し、７２℃で１０分間で終了した。冷却／加熱の傾きは２℃／秒に設定した。このＰＣＲは、１２５ヌクレオチドのＡｄ３５の潜在的Ｅ１Ｂプロモータの増幅を生じる。次いで、コンストラクトｐＡｄＡｐｔ５３５．ＬａｃＺ（実施例５）をＭｆｅＩとＢｇｌＩＩで消化した。消化の後、ベクターをクレノウ酵素で処理して平滑末端を創った。ＳＡＰ（ロシュ）を用いて、脱リン酸化工程を行った。次いで、このように処理した８ｋｂのベクター断片をゲルから単離した。Ｅ１Ｂプロモーター領域もゲルから単離した。これら２つの断片を連結し、ＤＨ５α−Ｔｌｒコンピテント細胞（インビトロゲン）を形質転換した。ＨｐａＩ及びＡｐａＬＩにより消化することによって、得られたプラスミドにおける正しい方向性のＥ１Ｂプロモーターを確認した。正しいクローンを選択した後、配列決定により、挿入されたＥ１Ｂプロモーター配列も確認した。
実施例１８．ｐＩＸ遺伝子のプロモーターはＡｄ３５及びＡｄ１１ウイルスにおけるＥ１Ｂ−５５Ｋコーディング配列の３’末端に位置する
上に記載された結果に基づいて、我々は、サブグループＢのウイルスにおけるｐＩＸプロモーターは、Ｅ１Ｂ−５５Ｋのコーディング領域に位置するであろうと予測した。これを直接調べるために、我々は、実施例１０に記載されるように、ｐＩＸのｍＲＮＡのキャップ部位を同定しようと計画した。この点に関して、野生型Ａｄ３５、野生型Ａｄ１１及びＡ３５．Ｅ１Ｂ+．ＡｄＡｐｔ．Ｌｕｃのウイルスを用いて、５０ＶＰ／細胞のＭＯＩにてＰＥＲ５５Ｋクローン１６細胞を感染させた。このウイルスのプロモータ−及びｍＲＮＡ開始部位が分かっているので、対照として、野生型Ａｄ５を共に用いた。製造元により記載されているように、ＴＲＩｚｏｌ試薬（インビトロゲン）を用いて、感染後１６〜１８時間での感染培養物からＲＮＡを単離した。手順の終わりに、１００％ホルムアミド中に単離したＲＮＡを保存した。転写開始の位置を決定するために、ジーンレーサーキット（インビトロゲン）を用いて、ｐＩＸ転写物の５’末端を増幅した。ジーンレーサーのプロトコールを開始する前に、ジーンレーサーのプロトコールに記載されるように酢酸ナトリウム沈殿によって５μｇのＲＮＡをホルムアミドから精製した。ｐＩＸｍＲＮＡの５’末端を増幅するための製造元のプロトコールに従って、精製されたＲＮＡを処理した。ホスファターゼ処理、それに続くタバコ酸性ピロホスファターゼによるキャップ構造の除去及びジーンレーサーＲＮＡオリゴの連結の後、ｃＤＮＡの合成にキットのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩ逆転写酵素を用いた。ｐＩＸのための遺伝子特異的な（逆）プライマーを用いた逆転写によってｃＤＮＡを合成した。Ａｄ３５（野生型及びＥ１Ｂ＋．Ｌｕｃウイルス）及び野生型Ａｄ１１についてはプライマーｐＩＸｒｅｖを用い、Ａｄ５については、プライマーｐＩＸｒｅｖ−Ａｄ５を用いた。得られたｃＤＮＡ（未知の濃度で１μｌ）をＰＣＲの鋳型として用い、ｄｓＤＮＡを生成した。このＰＣＲは、製造元の指示書に従ってＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ）を用い、ＤＭＳＯ（シグマ；３％ｖ／ｖ）を添加して行った。ｍＲＮＡの５’末端に連結されるオリゴヌクレオチドに特異的なキット由来のジーンレーサー５’プライマー、及び上述のような遺伝子特異的な逆プライマーによって増幅を行った。反応条件は以下のとおりであった：９４℃で２分間の変性、続いて、（９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間及び７２℃で２分間）を３０サイクル、及び６８℃で８分間の伸長で終了した。１．０％のアガロースゲル上での電気泳動によって得られたＤＮＡ断片のサイズ分離を行った。Ａｄ５については４８０ｂｐの断片が得られ、Ａｄ３５（両方のウイルス）及びＡｄ１１については、２００ｂｐの断片が得られた。Ａｄ１１は２ｋｂの断片も示した。断片をすべて切り出し、アガロースゲルから精製した。精製したＤＮＡ断片をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（インビトロゲン）にクローニングした。市販のＭ１３正方向プライマー及び逆方向プライマーを用いてベクターの配列決定を行った。野性型配列に対して得られた配列を並べ、ｐＩＸの転写開始の位置を決定した。Ａｄ３５及びＡｄ１１のｃＤＮＡ調製物から単離された２００ｂｐのバンドは、本物のｐＩＸｍＲＮＡを構成しており、Ａｄ１１から単離された２ｋｂの断片はＥ１Ｂプロモーターをもたらすことが判明した。図３０は、野生型のＡｄ３５の配列（配列番号６０）と共にＡｄ３５（配列番号５９）及びＡｄ１１（配列番号５８）のｃＤＮＡの配列を示す。配置は、ｐＩＸｍＲＮＡにおいてスプライシングされたイントロンの配列の位置を示す。図３１において、同定されたキャップ部位及びスプライシング部位の位置がＡｄ３５のＥ１Ｂ−ｐＩＸ領域に模式的に示されている。Ａｄ５については、予想されるｐＩＸｍＲＮＡ（Babiss and Vales, 1991）は、３５８０位（示さず；ジェンバンク受入番号Ｍ７３２６０の番号付け）に位置するキャップ部位と共に同定された。Ａｄ３５については、キャップ部位は、Ａ残基における３３３９位（Ａｄ３５の配列、ＷＯ ００／７００７１）におけるＥ１Ｂ−５５Ｋ遺伝子の３’末端に位置していた。Ａｄ１１では、キャップ部位は、同様にＴ残基で見い出された（ジェンバンク受入番号ＡＹ１６３７５６の３３３９位）。興味深いことに、５５Ｋ遺伝子の停止コドンとｐＩＸの開始コドンの間の配列には、Ａｄ５ウイルスにおいてｐＩＸのプロモーターが位置しているが、その配列は、Ａｄ３５ウイルス及びＡｄ１１ウイルスでスプライシングを受けている。これらの結果は、Ａｄ３５及びＡｄ１１では、ｐＩＸ遺伝子の発現は、５５Ｋ遺伝子の３’末端に位置するプロモーターに調節されているという強い証拠を提供している。
上に記載された結果に基づいて、我々は、サブグループＢのウイルスにおけるｐＩＸプロモーターは、Ｅ１Ｂ−５５Ｋのコーディング領域に位置するであろうと予測した。これを直接調べるために、我々は、実施例１０に記載されるように、ｐＩＸのｍＲＮＡのキャップ部位を同定しようと計画した。この点に関して、野生型Ａｄ３５、野生型Ａｄ１１及びＡ３５．Ｅ１Ｂ+．ＡｄＡｐｔ．Ｌｕｃのウイルスを用いて、５０ＶＰ／細胞のＭＯＩにてＰＥＲ５５Ｋクローン１６細胞を感染させた。このウイルスのプロモータ−及びｍＲＮＡ開始部位が分かっているので、対照として、野生型Ａｄ５を共に用いた。製造元により記載されているように、ＴＲＩｚｏｌ試薬（インビトロゲン）を用いて、感染後１６〜１８時間での感染培養物からＲＮＡを単離した。手順の終わりに、１００％ホルムアミド中に単離したＲＮＡを保存した。転写開始の位置を決定するために、ジーンレーサーキット（インビトロゲン）を用いて、ｐＩＸ転写物の５’末端を増幅した。ジーンレーサーのプロトコールを開始する前に、ジーンレーサーのプロトコールに記載されるように酢酸ナトリウム沈殿によって５μｇのＲＮＡをホルムアミドから精製した。ｐＩＸｍＲＮＡの５’末端を増幅するための製造元のプロトコールに従って、精製されたＲＮＡを処理した。ホスファターゼ処理、それに続くタバコ酸性ピロホスファターゼによるキャップ構造の除去及びジーンレーサーＲＮＡオリゴの連結の後、ｃＤＮＡの合成にキットのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩ逆転写酵素を用いた。ｐＩＸのための遺伝子特異的な（逆）プライマーを用いた逆転写によってｃＤＮＡを合成した。Ａｄ３５（野生型及びＥ１Ｂ＋．Ｌｕｃウイルス）及び野生型Ａｄ１１についてはプライマーｐＩＸｒｅｖを用い、Ａｄ５については、プライマーｐＩＸｒｅｖ−Ａｄ５を用いた。得られたｃＤＮＡ（未知の濃度で１μｌ）をＰＣＲの鋳型として用い、ｄｓＤＮＡを生成した。このＰＣＲは、製造元の指示書に従ってＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ）を用い、ＤＭＳＯ（シグマ；３％ｖ／ｖ）を添加して行った。ｍＲＮＡの５’末端に連結されるオリゴヌクレオチドに特異的なキット由来のジーンレーサー５’プライマー、及び上述のような遺伝子特異的な逆プライマーによって増幅を行った。反応条件は以下のとおりであった：９４℃で２分間の変性、続いて、（９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間及び７２℃で２分間）を３０サイクル、及び６８℃で８分間の伸長で終了した。１．０％のアガロースゲル上での電気泳動によって得られたＤＮＡ断片のサイズ分離を行った。Ａｄ５については４８０ｂｐの断片が得られ、Ａｄ３５（両方のウイルス）及びＡｄ１１については、２００ｂｐの断片が得られた。Ａｄ１１は２ｋｂの断片も示した。断片をすべて切り出し、アガロースゲルから精製した。精製したＤＮＡ断片をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（インビトロゲン）にクローニングした。市販のＭ１３正方向プライマー及び逆方向プライマーを用いてベクターの配列決定を行った。野性型配列に対して得られた配列を並べ、ｐＩＸの転写開始の位置を決定した。Ａｄ３５及びＡｄ１１のｃＤＮＡ調製物から単離された２００ｂｐのバンドは、本物のｐＩＸｍＲＮＡを構成しており、Ａｄ１１から単離された２ｋｂの断片はＥ１Ｂプロモーターをもたらすことが判明した。図３０は、野生型のＡｄ３５の配列（配列番号６０）と共にＡｄ３５（配列番号５９）及びＡｄ１１（配列番号５８）のｃＤＮＡの配列を示す。配置は、ｐＩＸｍＲＮＡにおいてスプライシングされたイントロンの配列の位置を示す。図３１において、同定されたキャップ部位及びスプライシング部位の位置がＡｄ３５のＥ１Ｂ−ｐＩＸ領域に模式的に示されている。Ａｄ５については、予想されるｐＩＸｍＲＮＡ（Babiss and Vales, 1991）は、３５８０位（示さず；ジェンバンク受入番号Ｍ７３２６０の番号付け）に位置するキャップ部位と共に同定された。Ａｄ３５については、キャップ部位は、Ａ残基における３３３９位（Ａｄ３５の配列、ＷＯ ００／７００７１）におけるＥ１Ｂ−５５Ｋ遺伝子の３’末端に位置していた。Ａｄ１１では、キャップ部位は、同様にＴ残基で見い出された（ジェンバンク受入番号ＡＹ１６３７５６の３３３９位）。興味深いことに、５５Ｋ遺伝子の停止コドンとｐＩＸの開始コドンの間の配列には、Ａｄ５ウイルスにおいてｐＩＸのプロモーターが位置しているが、その配列は、Ａｄ３５ウイルス及びＡｄ１１ウイルスでスプライシングを受けている。これらの結果は、Ａｄ３５及びＡｄ１１では、ｐＩＸ遺伝子の発現は、５５Ｋ遺伝子の３’末端に位置するプロモーターに調節されているという強い証拠を提供している。
実施例１９．３‘Ｅ１Ｂ−５５Ｋ配列の短い鎖を保持するＥ１欠失Ａｄ３５ウイルスは、さらに大きなパッケージング容量を有する
ｐＩＸｍＲＮＡのキャップ部位の同定と共に、正しいｐＩＸ発現のために天然のＡｄ３５プロモーターを包含することも、ウイルスベクターにおいてＥ１Ｂ−５５Ｋの配列をできるだけ多く限定することも可能になる。ここで、我々は、非限定例として、５５Ｋコーディング配列の３’末端の１６６ｂｐを保持するＡｄ３５のアダプタープラスミド（ｐＡｄＡｐｔ３５Ｂｓｕ．Ｌｕｃ）の構築、及び安定性及び／又はパッケージング容量を高めたＥ１欠失のＡｄ３５Ｌｕｃウイルスの生成を示す。この１６６ｂｐの配列は、機能的な５５Ｋ遺伝子産物をコードしているのではないが、ｐＩＸのコーディング配列に対するその天然の位置において、前の実施例で同定したｐＩＸｍＲＮＡのキャップ部位を含有する。
ｐＩＸｍＲＮＡのキャップ部位の同定と共に、正しいｐＩＸ発現のために天然のＡｄ３５プロモーターを包含することも、ウイルスベクターにおいてＥ１Ｂ−５５Ｋの配列をできるだけ多く限定することも可能になる。ここで、我々は、非限定例として、５５Ｋコーディング配列の３’末端の１６６ｂｐを保持するＡｄ３５のアダプタープラスミド（ｐＡｄＡｐｔ３５Ｂｓｕ．Ｌｕｃ）の構築、及び安定性及び／又はパッケージング容量を高めたＥ１欠失のＡｄ３５Ｌｕｃウイルスの生成を示す。この１６６ｂｐの配列は、機能的な５５Ｋ遺伝子産物をコードしているのではないが、ｐＩＸのコーディング配列に対するその天然の位置において、前の実施例で同定したｐＩＸｍＲＮＡのキャップ部位を含有する。
コンストラクトｐＡｄＡｐｔ３５Ｂｓｕ．Ｌｕｃは以下のように生成した。先ず、標的ＤＮＡとして４０ｎｇのｐＢｒ．Ａｄ３５．ｌｅｆｔＩＴＲ−ｐＩＸ（ＷＯ ０２／４０６６５に記載）及びプライマーＢｓｕ５５ＫＦ及びＡｇｅ−ｐＩＸＲを用いてＰＣＲ断片を生成した。製造元の指示書に従って、ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（ゲナキシス）によりＰＣＲを行った。さらに、３％ｖ／ｖのＤＭＳＯ（シグマ）を用いた。プログラムは以下のように：９４℃で２分間、次いで（９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間及び７２℃で１．５分間）を３０サイクルに設定し、６８℃で８分間により終了した。製造元のプロトコールに従って、得られた１．２ｋｂの産物をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター（インビトロゲン）に直接クローニングし、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ．Ｂｓｕ−Ａｇｅを生じた。ＰｖｕＩＩ（ニューイングランドバイオラボズ）による消化によってコンストラクトをチェックした。Ｂｓｕ３６Ｉ（ニューイングランドバイオラボズ）による消化によって、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ．Ｂｓｕ−ＡｇｅプラスミドからＢｓｕ−Ａｇｅ断片を単離し、クレノウ酵素（ニューイングランドバイオラボズ）で処理して末端を平滑化した。次いでＰＣＲ精製キット（キアゲン）を用いて、ＤＮＡを精製し、ＡｇｅＩ（ニューイングランドバイオラボズ）で消化した。ジーンクリーンＩＩキット（バイオ１０１社）を用いて、１ｋｂの断片をゲルから単離した。並行して、コンストラクトｐＡｄＡｐｔ３５．Ｌｕｃ（ＷＯ ００／７００７１に記載）をＢｇｌＩＩで消化し、クレノウ酵素で処理した。ＰＣＲ精製キット（キアゲン）を用いて、ＤＮＡを精製した。精製したＤＮＡをＡｇｅＩ（ニューイングランドバイオラボズ）で消化し、ＳＡＰ（ロシュ）で脱リン酸化した。ジーンクリーンＩＩキット（バイオ１０１社）により５．８ｋｂの断片をゲルから単離した。２つの断片を連結反応において等モル量で混合し、Ｔ１耐性のＥＭ ＤＨ１０Ｂ細胞（インビトロゲン）を形質転換した。これにより、プラスミドｐＡｄＡｐｔ３５Ｂｓｕ．Ｌｕｃを生じた。
Ｅ１欠失のウイルスを生成するために、ｐＡｄＡｐｔ３５Ｂｓｕ．ＬｕｃをｐＩＰｓｐ−Ｉで消化し、ＮｏｔＩで消化したｐＷＥ．Ａｄ３５−３４８１（実施例７）及び前述のｐＷＥ．Ａｄ３５−３４８１ΔＥ３と共に、ＰＥＲ５５Ｋクローン１６細胞にコトランスフェクションした。ｐＷＥ．Ａｄ３５−３４８１ΔＥ３は、ｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲΔＥ３（実施例２）で記載したのと同じＥ３欠失を含有し、コンストラクトｐＷＥ．Ａｄ３５−３４８１ΔＮｄｅＩ及びｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲΔＥ３由来の２６．６ｋｂのＮｄｅＩ断片を用いて、実施例７に記載される方法に従って生成された。
さらに、天然のＡｄ３５配列を置き換えるウイルス骨格において、Ａｄ５由来のＥ４−Ｏｒｆ６及びＥ４−Ｏｒｆ６／７を含有するＥ１欠失Ａｄ３５ウイルスを生成した（無改変のＰＥＲ．Ｃ６細胞におけるそのようなウイルスの生成については実施例１６を参照のこと）。現在の実施例では、ｐＩＰｓｐ−Ｉで消化したｐＡｄＡｐｔ３５Ｂｓｕ．Ｌｕｃを、ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶ消化したｐＷＥ．Ａｄ３５．ｐＩＸ−ＥｃｏＲＶ及びＰａｃＩ／ＮｏｔＩ消化のｐＢｒ．Ａｄ３５．ＰＲ５Ｏｒｆ６と共にコトランスフェクションする（Ｅ３領域の有りまたは無しにて）。トランスフェクション物はすべて、トランスフェクション後１週間以内に全面的なＣＰＥを生じ、前述のように、細胞及び培地を回収した。次いで、ウイルスをプラーク精製し、適当な相補細胞上で増幅され、且つ、単一のプラークを生じるウイルスストックについて、導入遺伝子の完全性についてＰＣＲで解析した。導入遺伝子のＰＣＲは、プライマーＡｄＡｐｔ３５ＣＭＶＦ及びｐＩＸｒｅｖＮ２を用いて、実施例３で記載されたように行った。図３２は、Ａｄ３５Ｂｓｕ．Ｌｕｃウイルス及びＡｄ３５Ｂｓｕ．Ｌｕｃ．５Ｏｒｆ６ウイルスを起源とするプラークにおけるＰＣＲの結果の一例を示す。
ウイルス骨格におけるＥ３領域又はＥ４−Ｏｒｆ６配列の存在に関係なく、調べたプラーク（各ウイルスにつき５から１０）はすべて無傷の導入遺伝子を含有していた。１つの例外がＡｄ３５Ｂｓｕ．Ｌｕｃウイルス由来のプラークに生じたが、それは、欠失を持つ微量のウイルスをおそらく起源とするおよそ１．６ｋｂ（図３２；レーン１２）に弱いバンドを示した。ウイルス試料の全てにおいて生じるおよそ５００ｂｐの弱いバンドは、ウイルス骨格におけるプライマーのバックグランドのバンドである。ルシフェラーゼ発現カセットを持つＥ３含有のＡｄ３５ウイルスがプラーク精製後、安定であることが分かったという所見は、完全にＥ１を欠失し、且つ１６６ｂｐの３’の５５Ｋコーディング配列を含有しないＡｄ３５．ＡｄＡｐｔ．Ｌｕｃウイルスでの以前の結果と対照的である。標準のｐＡｄＡｐｔ３５．Ｌｕｃプラスミドを用いて、我々は、Ｅ３領域を含有するプラーク精製したウイルスを生成することができなかった。従って、骨格における余分な５５Ｋの配列と共同して、我々は、深刻な不安定性のない、全長３４．６ｋｂを超えるウイルスを今や作製することができる。これは、野生型のＡｄ３５ウイルスの長さにきっちりと一致している。Ｅ３欠失の骨格を使用すれば、外来性配列のための容量は理論的には５ｋｂを超えるだろう。明らかに、現在の実施例よりも多くのＥ１Ｂ−５５Ｋ配列を組み入れることができ、及び／又は開示された本発明から逸脱することなく、異種のエンハンサー配列を持つ３’５５Ｋ配列と組み合わせることができる。
表I：三重層のフラスコ上で作製されたクローン＃１６細胞上でのE1-およびE1-/E3-欠失したAd35ウイルスの収量
表II：第二継代ウイルス由来の租溶解物を用いたA549上での導入遺伝子（LacZ）活性試験。青色細胞％は感染のために使用されたウイルスの各量のために与えられている。
表III：第二継代ウイルス由来の租溶解物を用いた導入遺伝子（ルシフェラーゼ）活性試験。活性を相対ライトユニットで表した（RLU）。
表IV：プライマー配列
表V：実施例において述べたようにPER.C6細胞上でE1-欠失したAd35に基づいたウイルスを作製するのに使用したコンストラクトのリスト。アダプタープラスミドをPacIで消化し、pWE.Ad35.pIX-EcoRVはNotIとEcoRVで消化し、E4-改変したpBrに基づいたコンストラクトはPacIとNotIで消化した。
表VI：pIX発現を駆動する種々のプロモーター配列を有するAd35ウイルスのLacZ陽性プラークのパーセンテージ。
（NPは見えるプラークなし）
（参考文献）
【配列表】
Claims (19)
- 発現配列の制御下で機能を有するpIXコード配列を備える組み換えアデノウイルスであって、前記発現配列はE1B 55K配列の一部分であって、前記E1B 55K配列のその一部分がないその内在性の近接したpIX上流配列の背後の前記pIXコード配列の発現と比較して、所定のパッケージング細胞の中でpIXコード配列の発現を増加させることが可能な上記E1B 55K配列の一部分を備えるが、但し前記E1B 55K配列の一部分は機能を有するE1B 55K遺伝子産物をコードしない、上記組み換えアデノウイルス。
- 前記発現配列は、pIX読み枠のすぐ上流にある約0.7kbまたはそれ以下のアデノウイルス配列を含む、請求項１記載の組み換えアデノウイルス。
- 機能を有するpIXコード配列を備え、かつ、少なくともE1領域に欠失を有する組み換えアデノウイルスであって、ここで該pIXコード配列は異種プロモーターの制御下にあり、かつ、前記組み換えアデノウイルスはアデノウイルス抗原型5以外のアデノウイルスから得られ又はそれに基づいている、上記組み換えアデノウイルス。
- 前記異種プロモーターは、非内在性の近接したpIXプロモーター、ウイルスプロモーター、細胞プロモーター、合成プロモーターおよびハイブリッドプロモーターからなる群から選択された核酸配列を備える、請求項３記載の組み換えアデノウイルス。
- 前記異種プロモーターは、少なくとも一部分が、Ad5近接pIXプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーターおよびアデノウイルスE1Bプロモーターから得られた又はそれに基づいた配列からなる群から選択された、請求項４記載の組み換えアデノウイルス。
- 前記アデノウイルスは、サブグループBに分類されるアデノウイルスから得られた又はそれに基づいている、請求項１から５のいずれか一つの請求項記載の組み換えアデノウイルス。
- 前記アデノウイルスは、アデノウイルス抗原型35または抗原型11から得られた又はそれに基づいている、請求項１から６のいずれか一つの請求項記載の組み換えアデノウイルス。
- 機能を有するE1B遺伝子の発現を欠いているアデノウイルス抗原型35またはアデノウイルス抗原型11から得られた又はそれに基づいている組み換えアデノウイルスであって、ここで前記アデノウイルスは：
a) 少なくとも4.6kbの異種DNAを含み；および/または
b) 少なくとも33.8kbのパッケージされたゲノムを有する、
上記組み換えアデノウイルス。 - サブグループCのアデノウイルスから得られた又はそれに基づいた機能を有するE4-orf6蛋白質をコードする配列を更に備える事を特徴とする、請求項６から８のいずれか一つの請求項記載の組み換えアデノウイルス。
- 適切なパッケージング細胞中への導入により、請求項１から９のいずれか一つの請求項記載の組み換えアデノウイルスのゲノムを構成する、単離された核酸。
- 少なくともE1-領域中に欠失を有する組み換えアデノウイルスの安定性および/またはパッケージング容量を増加させるための方法であって、該方法は、pIXコード配列がE1B 55K配列がないその内在性の近接した上流配列の背後にある時に得られるpIX遺伝子産物のレベルと比較して、前記パッケージング細胞中でのpIX遺伝子産物のレベルが増加する下で、前記組み換えアデノウイルスの産生およびアッセンブリーに必要な要素を、パッケージング細胞中のウイルス微粒子中に発現させる過程からなる、上記方法。
- 前記pIX遺伝子産物のレベルの増加は、前記アデノウイルス中でのE1B 55K配列の一部分の保持または再導入によってもたらされる、請求項１１記載の方法。
- 前記pIX遺伝子産物のレベルの増加は、異種プロモーターの制御下でのpIXコード配列の発現によってもたらされる、請求項１１記載の方法。
- 前記組み換えアデノウイルスは、サブグループBに分類されるアデノウイルスから得られた又はそれに基づいている、請求項１１から１３のいずれか一つの請求項記載の方法。
- 前記組み換えアデノウイルスは、アデノウイルス抗原型35またはアデノウイルス抗原型11から得られた又はそれに基づいている、請求項１１から１４のいずれか一つの請求項記載の方法。
- 前記異種プロモーターは、非内在性の近接したpIXプロモーター、ウイルスプロモーター、細胞プロモーター、合成プロモーターおよびハイブリッドプロモーターからなる群から選択された、請求項１３から１５のいずれか一つの請求項記載の方法。
- 前記異種プロモーターは、Ad5近接pIXプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーターおよびアデノウイルスE1Bプロモーターからなる群から選択された、請求項１６記載の方法。
- 請求項１から９のいずれか一つの請求項記載の組み換えアデノウイルス、および必要に応じて適切な担体またはアジュバントを含む、ワクチン。
- 請求項１から９のいずれか一つの請求項記載の組み換えアデノウイルスを備える、組み換えアデノウイルスパッケージング細胞。
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