CN117821405A - 基因嵌合型人腺病毒及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本申请涉及生物技术领域，特别涉及一种基因嵌合型人腺病毒及其构建方法和应用。所述基因嵌合型人腺病毒，其基因组中的E4orf6区域被替换为HAd5的E4orf6区域，所述基因嵌合型人腺病毒与所述人Ad5腺病毒属于不同的亚群。本申请实施例制备的基因嵌合型人腺病毒：相对野生型腺病毒实现了显著减毒，用其制备药物具有更高的安全性和更大的使用范围；能够作为疫苗载体和转基因治疗载体，基因组能够复制，具有更高效表达外源基因、成本更低等特征；能够在常用的HEK‑293细胞等中高效制备，不需要另外制备互补细胞系。

Description

基因嵌合型人腺病毒及其构建方法和应用

技术领域

本申请涉及生物技术领域，特别涉及一种基因嵌合型人腺病毒及其构建方法和应用。

背景技术

人腺病毒(HAdV)于1953年在荷兰首次分离，已知人腺病毒分为七个组(A-G)，50多个血清型及100多个基因型。人腺病毒感染可以引起急性呼吸道疾病、结膜炎、胃肠炎、出血性膀胱炎等多种疾病，呼吸道疾病相关的腺病毒主要有腺病毒3型、7型、55型、4型等，感染的常见临床症状包括发热、咳嗽、咽痛，部分婴幼儿产生肺炎并在感染后有长期呼吸道并发症。病原学监测数据显示，B组HAdV-7和HAdV-3是引起呼吸道感染性疾病主要的腺病毒型别。HAdV-7和HAdV-4可以导致重症肺炎，。目前没有治疗腺病毒感染的特效药物，临床只能对症治疗。

目前腺病毒疫苗在部分地区批准使用，该疫苗为野生型HAdV-7和HAdV-4口服肠溶活病毒疫苗，该疫苗的使用极大降低了该地区的爆发流行。但该疫苗为野生活病毒组成，存在较大的风险，特别是有肠道排出活病毒污染环境的风险，不能用于普通人群。因此非常有必要研制安全、有效的新型腺病毒疫苗。减毒疫苗具有安全、高效、成本低等优点，目前还没有腺病毒减毒疫苗的研究报道。

发明内容

基于此，本申请一个或者多个实施例提供一种基因嵌合型人腺病毒及其构建方法和应用。

本申请的实施例的第一方面，提供一种基因嵌合型人腺病毒，其基因组中的E4orf6区域被替换为HAd5的E4 orf6区域，所述基因嵌合型人腺病毒与所述人Ad5腺病毒属于不同的亚群。

在本申请的一些实施方式中，其基因组中的E3区域还被缺失替换为外源基因表达框。

在本申请的一些实施方式中，所述外源基因表达框中的外源基因编码蛋白药物或者蛋白标签。

在本申请的一些实施方式中，所述的基因嵌合型人腺病毒，其属于B亚群病毒。

在本申请的一些实施方式中，所述的基因嵌合型人腺病毒，其包括HAd7、HAd55或者HAd11。

本申请的实施例的第二方面，提供所述的基因嵌合型人腺病毒的构建方法，其包括将目标人腺病毒的基因组中的E4 orf6区域被替换为HAd5的E4 orf6区域构建基因嵌合型人腺病毒的步骤。

本申请的实施例的第三方面，提供一种载体，其包括第一方面中定义的基因组。

本申请的实施例的第四方面，提供一种细胞，其包装第一方面中所述的基因嵌合型人腺病毒。

本申请的实施例的第五方面，提供所述的基因嵌合型人腺病毒、所述的载体或者所述的细胞在药物制备中的应用。

在本申请的一些实施方式中，所述药物包括疫苗。

本申请的实施例的第六方面，提供一种药物，其包括所述的基因嵌合型人腺病毒。

在本申请的一些实施方式中，所述药物包括疫苗。

本申请的一个或多个实施例细节在下面的描述中提出，本申请的其他特征、目的和优点将从说明书及其权利要求书变得明显。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案、更完整地理解本申请及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为人7型腺病毒E4-orf6基因替换载体(pAd7E-A5E4orf6)的构建流程图；

图2为pAd7EGFP质粒酶切鉴定；

图3为pAd7E-A5E4orf6质粒EcoRV酶切鉴定；

图4为rAd7E-A5E4orf6感染293T细胞后在荧光显微镜下观察；

图5为免疫印迹实验检测重组病毒感染细胞后六邻体蛋白的表达；

图6为rAd7E-A5E4orf6在293细胞中正常复制；

图7为rAd7E-A5E4orf6在人胚肺细胞MRC-5和人肺癌细胞系A549细胞中的感染和复制；

图8为荧光显微镜下观察重组腺病毒的荧光灶；

图9为重组腺病毒的空斑实验；

图10为重组腺病毒免疫血清ELISA检测。

具体实施方式

下面结合附图、实施方式和实施例，对本申请作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本申请公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本申请更为充分地理解，应理解，本申请可以无需一个或多个这些细节而得以实施。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述实施方式和实施例的目的，不是旨在于限制本申请。

术语

除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：

本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。

本申请中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。

本文中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。

本文中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本申请的技术方案、解决本申请的技术问题、实现本申请预期的技术效果为准。

本文中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本申请保护范围的限制。

本申请中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本申请保护范围的限制。

本申请中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。

本申请中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等中，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。

本申请中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。

本申请中，涉及到数值区间(也即数值范围)，如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点(即最小值及最大值)，以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1～10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。

本申请中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是，所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。

本申请中，％(w/w)与wt％均表示重量百分比，％(v/v)指体积百分比，％(w/v)指质量体积百分数。

在本申请提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非和本申请的申请目的和/或技术方案相冲突，否则，本申请涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本申请中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本申请中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中，但以能够实施本申请为限。应当理解，当引用内容与本申请中的描述相冲突时，以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。

人腺病毒被广泛用作基因治疗、疫苗载体，目前在临床使用的或在研发的人腺病毒载体均为复制缺陷型载体，即载体去掉了病毒基因组复制的关键基因E1区基因，E1基因由互补细胞系提供。因此这种复制缺陷型载体在正常细胞和体内其基因组不能复制，外源基因表达效率受到限制，通常需要较高用量。

本申请实施例制备的基因嵌合型人腺病毒：相对野生型腺病毒实现了显著减毒，用其制备药物具有更高的安全性和更大的使用范围；能够作为疫苗载体和转基因治疗载体，基因组能够复制，具有更高效表达外源基因、成本更低等特征；能够在常用的HEK-293细胞等中高效制备，不需要另外制备互补细胞系。

本申请的实施例的第一方面，提供一种基因嵌合型人腺病毒，其基因组中的E4orf6区域被替换为HAd5的E4 orf6区域，所述基因嵌合型人腺病毒与所述人Ad5腺病毒属于不同的亚群。

本申请实施例的方案适用于人腺病毒减毒病毒，如Ad3、Ad55、Ad11等，而C组腺病毒(与Ad5同一个组)由于型间同源性较高，该方案不一定能实现减毒。Ad5 E4ORF6与同属C组内的Ad1、Ad2、Ad6等型别腺病毒E4ORF6蛋白的氨基酸序列相似性在98.30％至99.66％，具有高度同源性。而与非C组腺病毒E4ORF6蛋白的氨基酸序列相似性均低于65％，与B组Ad3、Ad7、Ad55等型别腺病毒E4ORF6蛋白的氨基酸序列相似性在58.30％至60.36％。B组内不同型别腺病毒E4ORF6蛋白的氨基酸序列相似性在83.55％至97.66％。

在本申请的一些实施方式中，其基因组中的E3区域还被缺失替换为外源基因表达框。

在本申请的一些实施方式中，所述外源基因表达框中的外源基因编码蛋白药物或者蛋白标签。

在本申请的一些实施方式中，所述的基因嵌合型人腺病毒，其属于B亚群病毒。

在本申请的一些实施方式中，所述的基因嵌合型人腺病毒，其包括HAd7、HAd55或者HAd11。

本申请的实施例的第二方面，提供所述的基因嵌合型人腺病毒的构建方法，其包括将目标人腺病毒的基因组中的E4 orf6区域被替换为HAd5的E4 orf6区域构建基因嵌合型人腺病毒的步骤。

本申请的实施例的第三方面，提供一种载体，其包括第一方面中定义的基因组。

本申请的实施例的第四方面，提供一种细胞，其包装第一方面中所述的基因嵌合型人腺病毒。

本申请的实施例的第五方面，提供所述的基因嵌合型人腺病毒、所述的载体或者所述的细胞在药物制备中的应用。

在本申请的一些实施方式中，所述药物包括疫苗。

本申请的实施例的第六方面，提供一种药物，其包括所述的基因嵌合型人腺病毒。

在本申请的一些实施方式中，所述药物包括疫苗。

E3区缺失替换外源基因表达框中EGFP可以替换为其他外源抗原，如新冠病毒S抗原等，作为疫苗载体；替换为其它外源基因作为转基因治疗载体。

下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本申请中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。

下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。

下述的具体实施例提供一种减毒人腺病毒及其构建方法，涉及制备人7型腺病毒的全基因组克隆，将E3区缺失替换为外源基因表达框Pcmv-EGFP-polyA(SV40)，再将其E4-orf6替换为Ad5的E4-orf6基因，制备一种嵌合型人7型腺病毒。这种基因嵌合型人7型腺病毒(Ad7-dE3E-A5E4)在HEK-293培养细胞中可以正常高效复制，在非293细胞如MRC-5、A549等细胞中基因组可以复制，但复制效率降低，并且可以生成感染性子代，感染性病毒粒子的复制效率极大降低，空斑实验表明从而实现了病毒减毒。不同于复制缺陷型腺病毒，这种基因嵌合型人7型腺病毒在正常细胞内基因组可以正常复制，外源基因可以高效表达。

1、人7型腺病毒载体(pAd7EGFP)的构建

人7型腺病毒E4-orf6基因替换载体(pAd7E-A5E4orf6)的构建流程图如图1所示：

(1)人7型腺病毒全基因组克隆pBRAd7CQ的构建

①用病毒基因组提取试剂盒(Takara，Lot#9766，大连)提取HADV7-CQ1198(保存于本室，GenBank号：JX625134)病毒基因组，以之为模板，以adv7-Lu2/adv7-Lr引物对PCR扩增左臂片段A7L；

②EcoRI+HindIII酶切pBR322质粒，MfeI+HindIII酶切A7L片段，连接，转化top10感受态细菌，菌落PCR鉴定后测序鉴定获得质粒pBRA7L；

③以HADV7-CQ1198病毒基因组为模板，以adv7-Ru/adv7-Rr2引物对PCR扩增右臂A7R，SalI+HindIII酶切pBRA7L质粒和A7R片段，连接，转化top10感受态细菌，菌落PCR鉴定后测序鉴定穿梭质粒pBRA7L-R；

④HindIII+SmaI酶切pBRA7L-R，与HADV7-CQ1198基因组共电转化BJ5183细菌，以特异性引物对a7-1403r/pBR-4188u进行菌落PCR鉴定，阳性单菌落摇培提取质粒转化top10感受态，菌落PCR鉴定后提取质粒pBRAd7CQ，PmeI酶切鉴定后线性化，转染293细胞拯救病毒进行验证。

引物序列如下：

adv7-Lu2(SEQ ID NO.1):5'-aatCaattGgtttaaactatcatcaataatataccttatagatgg

adv7-Lr(SEQ ID NO.2):5'-tcctcaagcttatccacagcaggg

adv7-Ru(SEQ ID NO.3):5'-acaaagcttCAATTATTCGTGTCAGTTCTTGTG

adv7-Rr2(SEQ ID NO.4):5'-AAGTCGAcgcgatcgcgtttaaactatcatcaataatataccttatagatgg

a7-1403r(SEQ ID NO.5)：5'-ccaccctccaacaagtcctcaag

pBR-4188u(SEQ ID NO.6)：5'-CAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGAT

(2)人7型腺病毒E3区缺失并插入外源基因表达框载体(pAd7EGFP)的构建

①用病毒基因组提取试剂盒提取HADV7-CQ1198病毒基因组，以之为模板，以Ad7-e3Lu/Ad7-e3Lr引物对PCR扩增左臂A7E3L；

②KpnI+ClaI酶切pSKCMVEGFP质粒(本室保存)和A7E3L片段，连接，转化top10感受态细菌，菌落PCR鉴定后测序鉴定pSKCMVEGFPA7L；

③以HADV7-CQ1198病毒基因组为模板，以Ad7-e3Ru/Ad7-e3Rr引物对PCR扩增左臂A7E3R，SpeI+NotI酶切pSKCMVEGFPA7L质粒和A7E3R片段，连接，转化top10感受态细菌，菌落PCR鉴定后测序鉴定穿梭质粒pSKE3A7L-R；

④EcoRV+NotI酶切pSKE3A7L-R，回收大片段(约3400bp)，EcoRI+MluI酶切质粒pBRAd7CQ，回收大片段(约39kbp)，两个回收片段共电转化BJ5183细菌，以引物对a7-30466u/cmv-r进行菌落PCR鉴定，提取质粒酶切鉴定(图2)，得到pAd7EGFP，酶切图谱与理论预期相符。

pAd7EGFP经PmeI酶切线性化后转染293细胞，观察荧光，成功拯救病毒rAd7E。

合成引物序列如下：

Ad7-e3Lu(SEQ ID NO.7)：5'-GaGGGTACCTCAATGATATCACGGGTTAATG

Ad7-e3Lr(SEQ ID NO.8)：5'-tgaatcgatGATCTGGTTGGTGTTGTAAAGTC

Ad7-e3Ru(SEQ ID NO.9)：5'-TCGactagtATATCCTACGAGATCACCGCTAC

Ad7-e3Rr(SEQ ID NO.10)：5'-aatgcggccgcATCATTAGATTCACTGGAGGC

a7-30466u(SEQ ID NO.11)：5'-caaatggggttggcagcaggc

cmv-r(SEQ ID NO.12)：5'-GGAAAGTCCCTATTGGCGTTA

图2.pAd7EGFP质粒酶切鉴定。泳道1，DL15000 DNA ladder；泳道2，pAd7EGFP-BamHI酶切；泳道3，pAd7EGFP-HindIII酶切。

(3)人7型腺病毒E3区缺失并插入外源基因表达框载体(pAd7Luc)的构建

以制备pAd7EGFP相同的方法制备了重组质粒pAd7Luc，其将EGFP基因替换为荧光素酶基因(luciferase)。pAd7Luc经PmeI酶切线性化后转染293细胞，观察荧光，成功拯救病毒rAd7Luc。rAd7Luc进行梯度稀释后接种96孔白板A549细胞，同时设置细胞对照孔，培养48h，弃上清，每孔加入50ul细胞裂解液，室温裂解10min，加入25ul荧光素酶反应底物，使用多功能酶标仪检测发光值。检测结果表明病毒接种量与发光值成线性相关，病毒孔是细胞对照孔的5-100倍。

2、人7型腺病毒E4-orf6基因替换载体(pAd7E-A5E4orf6)的构建

①以pAd7EGFP质粒为模板，引物对A7EcoRI-pCE-F/A7AsisI-pCE-R，使用高保真聚合酶Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase(Vazyme#P505)进行PCR扩增pAd7EGFP质粒上EcoRI-AsisI间片段，凝胶回收片段(约4687bp)，使用Ultra One StepCloning Kit(Vazyme公司，Lot#C115)，将片段连接到pCE-Zero线性化载体上，转化TOP10感受态，使用引物对A7E-33190B/A7E-37078F进行PCR鉴定(扩增产物约3kb)，提取质粒，命名为pCE-A7EA。

②以pCE-A7EA质粒为模板，引物对pA7E4F/pA7E4R2，用高保真聚合酶进行PCR扩增，获得片段1；以人5型腺病毒载体(pAdEASY-1载体，本室保存)为模板，使用引物对A5E4-F2/A5E4-R，PCR扩增人5型腺病毒的E4ORF6基因片段(片段2)，片段1和片段2用Ultra One Step Cloning Kit进行体外重组连接，转化TOP10感受态，测序鉴定，得到穿梭载体pCE-A7EA-A5E4。

③EcoRI+AsisI酶切大质粒pAd7E载体，回收大片段1(约32.8kbp)；以pCE-A7EA-A5E4为模板，A7EcoRI-pA7-F/A7AsisI-pA7-R引物对，用高保真聚合酶PCR扩增，回收大片段2(约4.6kbp)，连接，用Ultra One Step Cloning Kit进行体外重组连接，转化TOP10感受态，使用引物对cmv-f/A5E4-R进行菌落PCR鉴定，提取得到质粒pAd7E-A5E4orf6，质粒用EcoRV内切酶进行酶切鉴定，酶切图谱与理论预期相符(图3)。

A7EcoRI-pCE-F(SEQ ID NO.13)：

5'-GGATCTTCCAGAGATAAGCTTCGAATTCTGCAGTCGA

A7AsisI-pCE-R(SEQ ID NO.14)：5'-CTGCCGTTCGACGATGTCGACGCGATCGCGTTT

A7E-33190B(SEQ ID NO.15)：5'-ctccactttgctgagtgataac

A7E-37078F(SEQ ID NO.16)：5'-attagccatggcttaccaggca

A5E4-F2(SEQ ID NO.17):5'-cggagtctggatcacggCTACATGGGGGTAGAGTCATAATCG

A5E4-R(SEQ ID NO.18)：5'-gctatacaaaatacgagaATGACTACGTCCGGCGTTCC

pA7E4F(SEQ ID NO.19)：5'-TCTCGTATTTTGTATAGCAAAACGC

pA7E4R2(SEQ ID NO.20)：5'-CCGTGATCCAGACTCCGGA

A7EcoRI-pA7-F(SEQ ID NO.21)：tctcgagctcaagcttcGAATTCTGCAGTCGA

A7AsisI-pA7-R(SEQ ID NO.22)：tcaagggcatcggtcgacGTCGACGCGATCGCGTTT

cmv-f(SEQ ID NO.23)：ggaggtctatataagcagagctggt

图3.pAd7E-A5E4orf6质粒EcoRV酶切鉴定。泳道1，pAd7EGFP-EcoRV酶切；泳道2，pAd7E-A5E4orf6-EcoRV酶切；泳道3和4，pBRAd7CQ-EcoRV酶切。

rAd7E-A5E4orf6基因组序列的长度为33732bp，可以分为SEQ ID NO.24、SEQ IDNO.25、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27这依次连接的4个序列。

SEQ ID NO.24：

aaactatcatcaataatataccttatagatggaatggtgccaatatgcaaatgaggtaatttaaaaaagtgcgcgctgtgtggtgattggctgtggggtgaacggctaaaatgggcggggcggccgtgggaaaatgacgtgacttatgtgggaggagctatgttgcaagttattgcggtaaatgtgacgtaaaacgaggtgtggtttgaacacggaagtagacagttttcccacgcttactgacaggatatgaggtagttttgggcggatgcaagtaaaaattctccattttcgcgcgaaaactgaatgaggaagtgaatttctgagtcatttcgcggttatgacagggtggagtatttgccgagggccgagtagactttgaccgtttacgtggaggtttcgattaccgtgtttttcacctaaatttccgcgtacggtgtcaaagtcctgtgtttttacgtaggtgtcagctgatcgctagggtatttaaacctgacgagttccgtcaagaggccactcttgagtgccagcgagaagagttttctcctccgcgccgcaagtcagttctgcgctttgaaaatgagacacctgcgtttcctgccacaggagattatctccagtgagaccgggatcgaaatactggagtttgtggtaaataccctaatgggagacgacccggaaccgccagtgcagcctttcgatccacctacgctgcacgatctgtatgatttagaggtagacgggcctgaggatcccaatgaggaagctgtgaatgggttttttactgattctatgctgctagctgccgatgaaggattggacataaaccctcctcctgagacccttgttaccccaggggtggttgtggaaagcggcagaggtgggaaaaaattgcctgatctgggagcagctgaaatggacttgcgttgttatgaagagggttttcctccgagtgatgatgaagatggggaaactgagcagtccatccataccgcagtgaatgagggagtaaaagctgccagcgatgtttttaagttggactgtccggagctgcctggacatggctgtaagtcttgtgaatttcacaggaataacactggaatgaaagaactattgtgctcgctttgctatatgagaatgcactgccactttatttacagtaagtgtatttaagtgaaatttaaaggaatagtgtagctgtttaataactgttgaatggtagatttatgttttttacttgtgattttttgtaggtcctgtgtctgatgatgagtcaccttctcctgattcaactacctcacctcctgaaattcaggcgcccgcacctgcaaacgtatgcaagcccattcctgtaaagcctaagcctgggaaacgccctgctgtggataagcttgaggacttgttggagggtggggatggacctttggaccttagtacccggaaactaccaaggcaataagtgccctgcagctgtgtttatttaatgtgacgtcatgtaataaaattatgtcagctgctgagtgttttattacttcttgggtggggacttggatatataagtaggagcagatctgtgtggttagctcacagcaacctgctgccatccatggaggtttgggctatcttggaagacctcagacagactaggctactgctagaaaacgcctcggacggagtctctggcctttggagattctggttcggtggtgatctagctaggctagtgtttaggataaaacaggactacagcgtagaatttgaaaagttattggacgacagtccaggactttttgaagctcttaacttgggtcatcaggctcattttaaggagaaggttttatcagttttagatttttctactcctggtagaactgctgctgctgtagcttttcttacttttatattggataaatggatccgccaaactcacttcagcaagggatacgttttggatttcatagcagcagctttgtggagaacatggaaggctcgcaggatgaggacaatcttaaattactggccagtgcagcctctaggagtagcagggatactgagacacccaccgaccatgccagcggttctgcaggaggagcagcaggaggacaatccgagagccggcctggaccctccggtggaggagtagctgacctgtttcctgaactgcgacgggtgcttactaggtctacgaccagtggacagaacagaggcattaagagggagaggaatcctagtgggaataattcaagaaccgagttggctttaagtttaatgagccgcaggcgtcctgaaactgtttggtggcatgaggttcagagcgaaggcagggatgaagtttcaatattgcaggagaaatattcactagaacaacttaagacctgttggttggaacctgaggatgattgggaggtggccattaggaattatgctaagatatctctgaggcctgataaacaatatagaattactaagaagattaatattagaaatgcatgctacatatcagggaatggggcagaggttataatagatacacaagataaagcagcttttagatgttgtatgatgggtatgtggccaggggttgtcggcatggaagcagtaacacttatgaatattaggtttagaggggatgggtataatggcattgtatttatggctaacactaagctgattctacatggttgtagcttttttgggtttaataatacgtgtgtagaagcttgggggcaagttagtgtgaggggttgtagtttttatgcatgctggattgcaacatcaggtagggtcaagagtcagttgtctgtgaagaaatgcatgtttgagagatgtaatcttggcatactgaatgaaggtgaagcaaggatccgccactgcgcagctacagaaactggctgcttcattctaataaagggaaatgccagtgtgaagcataatatgatctgtggacattcggatgagaggccttatcagatgctgacctgcgctggtggacattgcaatattcttgctactgtgcatatcgtttcacatgcacgcaagaaatggcctgtatttgaacataatgtgattaccaagtgcaccatgcacataggtggtcgcaggggaatgtttatgccttaccagtgtaacatgaatcatgtgaaggtaatgttggaaccagatgccttttccagagtgagcttaacaggaatctttgatatgaatattcaactatggaagatcctgagatatgatgacactaaaccgagggtgcgcgcatgcgaatgcggaggcaagcatgctagattccagccggtgtgcgtggatgtgactgaagacctgagacccgatcatttggtgcttgcctgcactggagcggagttcggttccagtggtgaagaaactgactaaagtgagtagtggggcaagatgtggatggggactttcaggttggtaaggtggacagattgggtaaattttgttaatttctgtcttgcagctgccatgagtggaagcgcttcttttgaggggggagtatttagcccttatctgacgggcaggctcccaccatgggcaggagttcgtcagaatgtcatgggatccactgtggatgggagacccgtccagcccgccaattcctcaacgctgacctatgccactttgagttcgtcaccattggatgcagctgcagccgccgccgctactgctgccgccaacactatccttggaatgggctattacggaagcatcgttgccaattccagttcctctaataacccttcaaccctggctgaggacaagctacttgttctgttggctcagctcgaggccttaacccaacgcttaggcgaactgtctaagcaggtggcccagttgcgtgagcaaactgagtctgctgttgctacagcaaagtctaaataaagatctcaaatcaataaataaagaaatacttgtcataaaaacaaatgaatgtttatttgatttttcgcgcgcggtatgccctggaccatcggtctcgatcattgagaactcggtggatcttttccagtaccctgtaaaggtgggattgaatgtttagatacataggcattagtccgtctcgggggtggagatagctccattgaagagcctcttgctccggggtagtgttataaatcacccagtcatagcaaggtcggagtgcatggtgttgcacaatatcttttaggagcagactaattgcaacggggaggcccttagtgtaggtgtttacaaatctattgagctgggacgggtgcatccggggtgaaattatatgcattttggactggatcttgaggttggcaatgttgccgcctagatcccgtctcgggttcatattgtgcaggaccactaagacagtgtatccggtgcacttgggaaatttatcatgcagcttagagggaaaagcatgaaaaaatttggagacgcctttgtgaccccccagattctccatgcactcatccataatgatagcgatggggccgtgggcagcggcacgggcgaacacgttccgggggtctgaaacatcatagttatgctcctgagtcaggtcatcataagccattttaataaactttgggcggagggtgccagattgggggatgaaagttccctctggcccgggagcatagttcccctcacatatttgcatttcccaggctttcagttcagagggggggatcatgtccacctgcggggctataaaaaataccgtttctggagccggggtgattaactgggatgaaagcaaattcctaagcagctgagacttgccgcacccagtgggaccgtaaatgaccccaattacgggttgcagatggtagtttagggagcgacagctgccgtcctcccggagtaggggggccacttcgttcatcatttcccttacatagatattttcccgcaccaagtccgttaggaggcgctctcccccaagggatagaagctcctggagcgaggagaagtttttcagcggcttcagcccgtcagccatgggcatt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SEQ ID NO.25：

ccaggagcgccagctgttggggtaggtattccctctcgaaggcgggcatgacctctgcactcaggttgtcagtttctaggaacgaggaggatttgatattgacagtaccagcagagatgcctttcataagactctcgtccatttggtcagaaaacacaatcttcttgttgtccagcttggtagcaaatgatccatagagggcattggatagaagcttggcgatggagcgcatggtttggttcttttccttgtccgcgcgctccttggcggcgatgttaagctggacgtactcgcgcgccacacatttccattcagggaagatggttgtcagttcatccggaactattctgactcgccatcccctattgtgcagggttatcagatccacactggtggccacctcgcctcggaggggctcattggtccagcagagtcgacctccttttcttgaacagaaaggggggagggggtctagcatgagctcatcaggggggtccgcatctatggtaaatattcccggtaacaaatctttgtcaaaatagctaatggtggtgggatcatccaaggtcatctgccattctcgaactgccagcgcgcgctcataggggttaagaggggtgccccagggcatggggtgggtgagcgcggaggcatacatgccacagatatcgtatacatagaggggctcttcgaggatgccgatgtaagtgggataacagcgcccccctctgatgcttgctcgcacatagtcatagagttcatgtgagggggcgagaagacccgggcccagattggtgcggttgggtttttccgccctgtaaacgatctggcgaaagatggcatgggaatttgaagagatagtaggtctctggaatatgttaaaatgggcatgaggtaggcctacagagtcccttatgaagtgggcatatgactcttgcagcttggctaccagctcggcggtgacgagtacatccagggcacagtagtcgagagtttcctggatgatgtcataacgcggttggcttttcttttcccacagctcgcggttgagaaggtattcttcgcgatccttccagtactcttcgaggggaaacccgtctttttctgcacggtaagagcccaacatgtagaactgattgactgccttgtagggacagcatcccttctccactgggagagagtatgcttgggctgcattgcgcagcgaggtatgagtgagggcaaaagtgtccctgaccatgactttgaggaattgatacttgaagtccatgtcatcacaggccccctgttcccagagttggaagtccacccgcttcttgtaggcggggttgggcaaagcgaaagtaacatcattgaagaggatcttgccggccctgggcatgaaatttcgggtgattctgaaaggctgagggacctctgctcggttattgataacctgagcggccaagacgatctcatcaaagccattgatgttgtgccccactatgtacagttctaagaatcgaggggtgcccctgacatgaggcagcttcttgagttcttcaaaagtgagatctgtagggtcagtgagagcatagtgttcgagggcccattcgtgcacgtgagggttcgctttgaggaaggaggaccagaggtccactgccagtgctgtttgtaactggtcccggtattgacgaaaatgctgcccgactgccattttttctggggtgacgcaatagaaggtttgggggtcctgccgccagcgatcccacttaagtttcatggcgaggtcataggcgatgttgacgagccgctggtctccagagagtttcatgaccagcatgaaggggattagctgcttgccaaaggaccccatccaggtgtaggtttccacatcgtaggtgaggaagagcctttctgtgcgaggatgagagccaatcgggaagaactggatctcctgccaccagttggaggaatggctgttgatgtgatggaagtagaactccctgcgacgcgccgagcattcatgcttgtgcttgtacagacggccgcagtactcgcagcgattcacgggatgcacctcatgaatgagttgtacctgacttcctttgacgagaaatttcagtggaaaattgaggcctggcgtttgtacctggcgctctactatgttgtctgcatcggcatgaccatcttctgtctcgatggtggtcatgctgacgagccctcgcgggaggcaagtccagacctcggcgcggcaggggcggagctcgaggacgagagcgcgcaggccggagctgtccagggtcctgagacgctgcggagtcaggttagtaggcagtgtcaggagattgacttgcatgatcttttcgagggcgtgagggaggttcagatggtacttgatctccacgggtccgttggtggagatgtcaatggcttgcagggttccgtgccccttgggcgctaccaccgtgcccttgtttttccttttgggcggcggtggctctgttgcttcttgcatgtttaggagcggtgtcgagggcgcgcaccgggcggcaggggcggctcggcacccggcggcatggctggcagtggtacgtcggcgccgcgcgcgggtaggttctggtactgcgccctgagaagactcgcatgtgcgacgacgcggcggttgacatcctggatctgacgcctctgggtgaaagctaccggccccgtgagcttgaacctgaaagagagttcaacagaatcaatctcggtatcgttgacggcggcttgcctaaggatttcttgcacgtcgccagagttatcctggtaggcgatctcggccatgaactgctggatctcttcctcttgaagatctccgcggcccgctctctcgacggtggccgcgaggtcgttggagatgcgcccaatgagttgagagaatgcattcatgcccgcctcgttccagacgcggctgtagaccacagcccccacgggatctctcgcgcgcataaccacctgggcgaggttaagctctacgtggcgggtgaagaccgcatagttgcataggcgctggaaaaggtagttgagtgtggtggcgatgtgctcggtgacgaagaaatacatgatccatcgtctcagcggcatctcgctgacatcgcccagcgcttccaagcgctccatggcctcgtagaagtccacggcaaagttgaaaaactgggagttacgcgcggacacggtcaactcctcttccagaagacggatgagttcggcaatggtggtgcgcacctcgcgctcgaaatcccccgggatttcttcctcaatctcttcttcttccactaacatctcttcctcttcaggtggggctgcaggaggagggggaacgcggcgacgccggcggcgcacgggcagacggtcgatgaatctttcaatgacctctccgcggcggcggcgcatggtctcggtgacggcacgaccgttctccctgggtctcagagtgaagacgcctccgcgcatctccctgaagtggtgactgggaggctctccgttgggcagggacaccgcgctgattatgcattttatcaattgccccgtaggtactccgcgcaaggacctgatcgtttcaagatccacgggatctgaaaacctttcgacgaaagcgtctaaccagtcgcaatcgcaaggtaggctgagcactgtttcttgcgggcgggggcggctagacgctcggtcggggttctctctttcttttccttcctcctcttgggaggatgagacgatgctgctggtgatgaaattaaaataggcagttttgagacggcggatggtggcgaggagcaccaggtctttgggtccggcttgttggatgcgcaggcgatgggccattccccaagcattatcctgacatctggccagatctttatagtagtcttgcatgagtcgttccacgggcacttcttcttcgcccgctctgccatgcatgcgagtgatcccaaacccgcgcatgggctggacaagtgccaggtccgctacaaccctttcggcgaggatggcttgctgcacctgggtgagggtggcttggaagtcgtcaaagtctacaaagcggtggtaggccccggtgttgattgtgtaggagcagttggccatgactgaccagttgactgtctggtgcccagggcgcacgagctcggtgtacttgaggcgcgagtatgcgcgggtgtcaaagatgtaatcgttgcaggtgcgcaccaggtactggtagccgatgagaaagtgtggcggtggctggcggtacaggggccatcgctctgtagccggggctccgggggcaaggtcttccagcatgaggcggtggtaaccgtagatgtacctggacatccaggtgataccggaggcggtggtggatgcccgcgggaactcgcgtacgcggttccagatgttgcgcagcggcatgaagtagttcatggtaggcacggtttggcccgtaagacgtgcacagtcgttgatgctctagacatacgggcaaaaacgaaagcggtcagcggctcgtctccgtggcctggaggctaagcgaacgggttgggctgcgcgtgtaccccggttcgaatctcggatcaggctggagccgcagctaacgtggtactggcactcccgtctcgacccaggcctgcacaaaacctccaggatacggaggcgggtcgtttttttgctttttcctggatgggagccagtgctgcgtcaagctttagaacactcagttctcggggctgggagtggctcgcgcccgtagtctggagaattaatcgccagggttgcgttgcggtgtgccccggttcgagtcttagcgcgccggatcggccggtttccgcgacgtttctaagaccccgtcagccgacttctccagtttacgggagcgagccctctttttttttttgttttttgttgcccagatgcatcccgtgctgcgacagatgcgcccccagcaacagcccccttctcagcagcagctacaacgacagccacaaaaggctcttcctgctcct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SEQ ID NO.26：

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SEQ ID NO.27：

ctgctacctgttccgcctggccaactacctctcctaccactcggatgttatagaggatgtgagcggagacggtctgctggaatgccactgccgctgcaatctttgcacaccccaccgctcccttgcctgcaacccccagttgctgagcgagacccagatcatcggcaccttcgagttgcagggtcccagcagtgaaggcgaggggtcttctccggggcacagtctgaaactgacaccggggctgtggacctccgcctacctgcgcaagtttcatcccgaggattaccacccctatgagatcaggttctatgaggaccagtcacatcctcccaaagtcgagctctcagcctgcgtcatcacccagggagcaattctggcccaattgcaagccatccaaaaatcccgccaagaatttctactgaaaaagggaagcggggtctaccttgacccccagaccggtgaggagctcaacacaaggttcccccaggatgtcccatcgccgaggaagcaagaagctgaaggtgcagctgacgcccccagaggatatggaggaagactgggacagtcaggcagaggaggagatggaagattgggacagccaggcagaggaggtggacagcctggaggaagacagtttggaggaggaagacgaggaggcagaggaggtggaagaagcaaccgccgccaaacagttgtcatcggcggcggaaacaagcaagtccccagacagcagcacggctaccatctccgctccgggtcggggggtccagcggcggcccaacagtagatgggacgagaccgggcgattcccaaacccgaccaccgcttccaagaccggtaagaaggagcgacagggatacaagtcctggcgtggacacaaaaacgctatcatctcctgcttgcatgaatgcgggggcaacatatccttcacccggcgatacctgctcttccaccacggtgtgaacttcccccgcaatatcttgcattactaccgtcacctccacagcccctactgcagtcagcaagtcccggcaaccccgacagaaaaagacagcagcgacaacggtgaccagaaaaccagcagttagaaaatctacaacaagtgcagcaggaggaggactgaggatcacagcgaacgagccagcgcagaccagagagctgaggaaccggatctttccaaccctctatgccatcttccagcagagtcgggggcaagagcaggaattgaaagtaaaaaaccgatctctgcgctcgctcaccagaagttgtttgtatcacaagagcgaagaccaacttcagcgcactctcgaggacgccgaggctctcttcaacaagtactgcgcgctgactcttaaagagtagcccttgcccgcgcttattcgaaaacggcgggaatcacgtcaccattggcacctgtcctttgccctagtcatgagtaaagagattcccacgccttacatgtggagctatcagccccaaatggggttggcagcaggcgcctcccaggactactccacccgcatgaattggcttagcgccgggccctcaatgatatcacgggttaatgatatacgagcttatcgaaaccagttactcctagaacagtcagctctcaccaccacaccccgccaacaccttaatccccgaaattggcccgccgccctggtgtaccaggaaactcccgctcccaccaccgtactacttcctcgagacgcccaggccgaagttcagatgactaacgcaggtgtacagctggcgggcggttccgccctatgtcgtcaccgacctcaacagagtataaaacgcctggtgatcagaggccgaggtatccagctcaacgacgagtcggttagctcttcgcttggtctgcgaccagacggagtcttccagatcgccggctgtgggagatcttccttcacccctcgtcaggctgtactgactttggagagttcgtcctcgcagccacgctcgggcggcatcggaactctccagttcgtggaggagtttactccctctgtctacttcaaccccttctccggctctcctggccagtacccagacgagttcataccgaacttcgacgcaatcagcgagtcagtggatggctatgattgatgtctaatggtggcgcggctgagctagctcgactgcgacacctagaccactgccgccgctttcgctgcttcgcccgggaactcaccgagttcatctacttcgaactccccgaggagcaccctcagggtccggcccacggagtgcggattaccatcgaagggggaatagactctcgcctgcatcgaatcttctcccagcgacccgtgctgattgagcgcgaccagggaaatacaaccatctccatttactgcatctgtaaccaccccggattgcatgaaagcctttgctgtcttgtttgtgctgagtttaataaaaactgagttaagaccctcctacggactaccgcttcttcaatcaggactttacaacaccaaccagatctagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatccgctagcgctaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtccggccggactcagatctcgagctcaagcttcgaattctgcagtcgacggtaccgcgggcccgggatccaccggatctagataactgatcataatcagccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacataaaatgaatgcaattgttgttgttaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcatatcctacgagatcaccgctactgaccatcgcctctcttacgaacttggcccccaacgacaaaaatttacatgcatggtgggaatcacccctatagttatcactcagcaaagtggagatactaaggggtgcattcactgctcttgcgattccatcgagtgcacctacaccctgctaaagaccctatgcggcctaagagacctgctacccatgaattaaaaattaataaaaaatcacttacttgaaatcagcaataaggtctctgttgaaattttctcccagcagcacctcacttccctcttcccaactctggtattctaaaccccgttcagcggcatactttctccatactttaaaggggatgtcaaattttaactcctgtcctgtacccacaatcttcatgtctttcttcccagatgaccaagagagtccggctcagtgattccttcaaccctgtctacccctatgaagatgaaagcacctcccaacacccctttataaacccagggtttatttccccaaatggctttacacaaagcccagacggagttcttactttaaaatgtttaaccccactaacaaccacaggcgggtctctacagttaaaagtgggagggggtcttacaatagatgacaccgacggttttttgaaagaaaacataagtgccaccacaccactcgttaagactggtcactctataggtttgtcgctaggacccggattagaaacaaatgaaaacaaactttgtgccaaattgggagaaggacttacattcaattccaacaacatttgcattaatgacaatattaacaccctatggacaggagttaaccccaccagagccaactgtcaaataatggcctccagtgaatctaatgattgcaaattaattctaacac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3、E4-orf6基因替换型人7型腺病毒(rAd7E-A5E4orf6)的拯救

质粒pAd7E-A5E4orf6经PmeI酶切线性化后转染293细胞，观察荧光，7天后收获细胞，冻融3次后转接293细胞，结果表明成功拯救出病毒(图4)，命名为rAd7E-A5E4orf6。收集重组病毒感染的293细胞，进行免疫印迹实验，使用特异性识别人7型腺病毒六邻体的单抗3G5(本室保存，Liu M.#,Tian X.#,Li X.,Zhou Z.,Li C.*,and Zhou R.*,Generation ofneutralizing monoclonal antibodies against a conformational epitope of humanadenovirus type 7(HAdv-7)incorporated in capsid encoded in a HAdv-3-basedvector.PLoS One 2014,9:e103058.)进行检测，结果表明rAd7E-A5E4orf6与其母源病毒rAd7E一样，感染293细胞后有晚期结构蛋白的表达(图5)。将rAd7E-A5E4orf6病毒和对照病毒rAd7E以相同的感染性病毒颗粒数接种293T细胞，感染后不同时间点收集细胞，采用Q-PCR法检测病毒基因组拷贝数(GC)，采用梯度稀释后接种293T细胞检测病毒感染性病毒拷贝数(FFU)，结果表明rAd7E-A5E4orf6可以在293细胞中正常复制和增殖，病毒基因组拷贝数及感染性病毒数都与rAd7E没有显著差异(图6)。

图4.rAd7E-A5E4orf6感染293T细胞后在荧光显微镜下观察。

图5.免疫印迹实验检测重组病毒感染细胞后六邻体蛋白的表达。鼠抗六邻体蛋白单克隆抗体3G5作为一抗，泳道1为rAd7E，泳道2为rAd7E-A5E4orf6。

图6.rAd7E-A5E4orf6在293细胞中正常复制。病毒接种293T细胞后不同时间点收集感染细胞，检测病毒拷贝数。上图为病毒梯度稀释后接种293T细胞，计数感染性病毒颗粒数；下图采用Q-PCR法检测病毒基因组拷贝数。rAd7E病毒作为对照。

4、rAd7E-A5E4orf6在人细胞A549、MRC-5等中表现为减毒

rAd7E-A5E4orf6和rAd7E以相同的感染性病毒颗粒数接种人胚肺细胞MRC-5和人肺癌细胞系A549细胞，感染后不同时间点收集细胞，采用Q-PCR法检测病毒基因组拷贝数(GC)，采用梯度稀释后接种293T细胞检测病毒感染性病毒拷贝数(FFU)，结果表明rAd7E-A5E4orf6可以在MRC-5和A549细胞中感染、复制，其基因组复制效率与rAd7E没有显著差异(图7中C图和D图)，但是相对rAd7E，rAd7E-A5E4orf6复制产生感染性子代病毒的效率显著降低，在感染后48h、72h，rAd7E-A5E4orf6产生的感染性病毒数(FFU)只有rAd7E的1/10到1/1000(图7中A图和B图)。

图6和图7与下表对应：

表1

表2

空斑实验检测重组腺病毒的毒力。6孔板中铺板A549细胞，第二天接种10倍梯度稀释的重组腺病毒rAd7E-A5E4orf6和rAd7E，吸附2hr后用MEM洗涤一次，加入2ml的1％低熔点琼脂糖培养基，待凝固后倒置放入37度培养箱中培养，每隔3天补加1ml的1％低熔点琼脂糖培养基，隔天连续在荧光显微镜下观察拍照，感染后10天用考马斯亮蓝染色液染色。感染后第4天(4d.p.i.)和第8天(8d.p.i.)在荧光显微镜下观察病毒感染形成的荧光灶，可以见到rAd7E-A5E4orf6相较rAd7E，形成的荧光灶显著更小，向周围细胞扩散的更慢(图8)。感染后第10天进行的空斑染色，rAd7E-A5E4orf6形成的空斑显著比rAd7E的空斑要小，rAd7E已形成了肉眼明显可见的空斑，而rAd7E-A5E4orf6形成的空斑很小，几乎不可见(图9)。这些细胞实验证明rAd7E-A5E4orf6较rAd7E在MRC-5和A549细胞中表现为减毒。

图7.rAd7E-A5E4orf6在人胚肺细胞MRC-5和人肺癌细胞系A549细胞中的感染和复制。病毒接种MRC-5和A549细胞后不同时间点收集感染细胞，检测病毒拷贝数。A和B为采用Q-PCR法检测病毒基因组拷贝数；C和D为病毒梯度稀释后接种293T细胞，计数感染性病毒颗粒数。rAd7E病毒作为对照。

图8.荧光显微镜下观察重组腺病毒的荧光灶。rAd7E-A5E4orf6和rAd7E梯度稀释感染A549细胞后铺1％低熔点琼脂糖，感染后第4天(4d.p.i.)和第8天(8d.p.i.)在荧光显微镜下观察病毒感染形成的荧光灶。

图9.重组腺病毒的空斑实验。rAd7E-A5E4orf6和rAd7E梯度稀释感染A549细胞后铺1％低熔点琼脂糖，感染后第10天进行固定染色。rAd7E-A5E4orf6形成的空斑比rAd7E的空斑显著更小。

5、rAd7E-A5E4orf6相对Ad7灭活疫苗可以诱导更强的抗体应答

取纯化的rAd7E-A5E4orf6肌注免疫小鼠，2×10¹⁰VPs/只小鼠，间隔3周后肌注加强免疫一次，2周后采血清进行ELISA检测。纯化的对照病毒rAd7EGFP(rAd7E)用丙内酯(1：2000)在4摄氏度灭活24小时后，置37摄氏度水浴2小时，以2×10¹⁰VPs/只小鼠肌注免疫，同样方法间隔3周后肌注加强免疫一次，2周后采血清进行ELISA检测。图10为血清稀释1000倍后进行的ELISA检测读板结果，结果表明未灭活的rAd7E-A5E4orf6肌注免疫较灭活rAd7EGFP病毒可以诱导更强的抗体应答(P<0.05)。

图10.重组腺病毒免疫血清ELISA检测。未灭活病毒rAd7E-A5E4orf6和灭活病毒rAd7E(rAd7E-inactived)以相同剂量肌注免疫小鼠(n＝5/组)，加强免疫1次后采血清，血清1000倍稀释后进行ELISA检测。

以上实施例制备的人7型腺病毒减毒毒株，能够作为一种人7型腺病毒减毒疫苗候选。其相对野生型人7型腺病毒实现了显著减毒，与已有的野生型HAdV-7活疫苗相比较，上述实施例的减毒疫苗具有更高的安全性(减毒疫苗的特性)、使用范围。

以上实施例制备的人7型腺病毒减毒毒株，能够作为疫苗载体和转基因治疗载体，与已有的复制缺陷型腺病毒载体相比，本申请构建的复制型减毒腺病毒载体由于基因组能够复制，具有更高效表达外源基因、成本更低等特征。并且本申请实施例人7型腺病毒载体能够在常用的HEK-293细胞中高效制备，不需要另外制备互补细胞系。

以上所述实施方式和实施例的各技术特征可以进行任意合适方式的组合，为使描述简洁，未对上述实施方式和实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为在本说明书记载的范围中。

以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，便于具体和详细地理解本申请的技术方案，但并不能因此而理解为对申请专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。此外应理解，在阅读了本申请的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本申请作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本申请提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本申请所附权利要求的保护范围内。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (10)

1.基因嵌合型人腺病毒，其基因组中的E4 orf6区域被替换为HAd5的E4 orf6区域，所述基因嵌合型人腺病毒与所述人Ad5腺病毒属于不同的亚群。

2.根据权利要求1所述的基因嵌合型人腺病毒，其基因组中的E3区域还被缺失替换为外源基因表达框。

3.根据权利要求2所述的基因嵌合型人腺病毒，其中，所述外源基因表达框中的外源基因编码蛋白药物或者蛋白标签。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的基因嵌合型人腺病毒，其属于B亚群病毒。

5.根据权利要求4所述的基因嵌合型人腺病毒，其包括HAd7、HAd55或者HAd11。

6.权利要求1至5中任一项中所述的基因嵌合型人腺病毒的构建方法，其包括将目标人腺病毒的基因组中的E4 orf6区域被替换为HAd5的E4 orf6区域构建基因嵌合型人腺病毒的步骤。

7.载体，其包括权利要求1至5中任一项定义的基因组。

8.细胞，其包装权利要求1至5中任一项所述的基因嵌合型人腺病毒。

9.权利要求1至5中任一项所述的基因嵌合型人腺病毒、权利要求7所述的载体或者权利要求8所述的细胞在药物制备中的应用；可选地，所述药物包括疫苗。

10.一种药物，其包括权利要求1至5中任一项所述的基因嵌合型人腺病毒；可选地，所述药物包括疫苗。