CN110616199A - 一种复制缺陷型重组人7型腺病毒及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种复制缺陷型人7型腺病毒及其制备方法和应用。所述复制缺陷型人7型腺病毒删除了E1基因和E3基因，且E4基因开放阅读框2、3、4、6、6/7改换为Ad5基因组的相应阅读框，其E1基因区可整合外源基因表达框。所述复制缺陷型7型腺病毒可在HEK293中成功拯救并大量生产，但在人正常细胞株中不具备复制能力；以所述复制缺陷型7型腺病毒携带外源基因感染细胞后可实现外源基因的高效表达。本发明所描述的复制缺陷型7型腺病毒可潜在地应用于：抗人7型腺病毒感染的预防性疫苗研发；抗人7型腺病毒感染的中和抗体及药物筛选；作为基因载体应用于其它病原体疫苗的研发；生物学研究的报告示踪系统等。

Description

一种复制缺陷型重组人7型腺病毒及其制备方法和应用
技术领域
本项发明属于生物技术领域，涉及一种复制缺陷型重组人7型腺病毒及其制备方法和应用。
背景技术
人腺病毒(Human adenovirus，Ad)属于腺病毒科、哺乳动物腺病毒属，是无包膜的双链DNA病毒。人腺病毒感染常导致急性呼吸道疾病、结膜炎、胃肠炎等。人腺病毒可分为A-G七个亚群，目前报道的超过90个基因型。B亚群腺病毒常在人群中爆发并引起急性呼吸道疾病。B亚群腺病毒包括3、7、11、14、16、21、34、35、50、55等基因型。其中7型腺病毒(Ad7)感染常会导致急性呼吸道疾病、咽结膜热、神经性疾病，甚至重症肺炎。全球约有1/5腺病毒感染是由Ad7引起的。Ad7常在密集人群中感染爆发，如军队、学校、医院等，严重威胁人类健康，是公共卫生安全的重要隐患。目前，尚无特效抗腺病毒药物。
20世纪60年代，腺病毒开始在美军中流行，主要以Ad4、Ad7为主，感染了美军中80％受训的新兵，其中20％的新兵需要住院治疗。为应对腺病毒感染引起的死亡和对军队战斗力的影响，美军新兵广泛接种Ad4和Ad7口服活疫苗，使腺病毒引起的感染和死亡得到了有效控制。然而，美军使用的Ad4、Ad7双价活疫苗使用的是野生型毒株，未做减毒处理，肠道排毒后会污染周围环境，因此该疫苗仅限于军队中使用，不能应用于普通人群的预防。复制缺陷型腺病毒有潜力成为更加安全、有效的新型腺病毒疫苗。
复制缺陷型腺病毒还可作为基因载体广泛应用于基因治疗和疫苗研发。腺病毒的基因组是线性双链DNA，根据基因转录的先后顺序，可分为早期、中期和晚期转录基因。早期基因包括E1、E2、E3、E4，其中E1基因最先转录，是腺病毒复制的总开关，E3基因产物则主要对抗宿主的抗病毒免疫反应而与病毒在细胞内的转录复制关系不大。因此，复制缺陷型腺病毒的制备一般是通过删除E1、E3基因来实现。HEK293细胞整合了Ad5E1基因的序列，因此可以反向支持E1、E3同时删除的复制缺陷型Ad5的复制。然而，据报道E1、E3基因同时删除的B亚群腺病毒无法在HEK293中复制，我们的研究也发现E1、E3同时删除的Ad7等无法在HEK293细胞中复制。腺病毒E1基因的转录产物E1B-55K蛋白具有抑制细胞凋亡的功能，E4基因的ORF6可以促进腺病毒DNA的复制和稳定腺病毒晚期基因mRNA在核内的状态，并且E1B-55K和E4ORF6可形成复合物，促进腺病毒晚期基因mRNA的转运和表达，对腺病毒的复制至关重要。Ad7E1、E3同时删除后，其E4ORF6无法与HEK293细胞中的Ad5E1B-55K形成复合物，因此腺病毒无法完成复制。传统复制缺陷型B亚群腺病毒的生产依赖于可表达相应病毒的E4ORF6的稳定细胞株。有研究表明，Ad26和Ad35敲除E1后，将其E4ORF6改造成Ad5E4ORF6即可实现在HEK293细胞中复制，大大提升了载体的生产性能并简化了基于这些载体的疫苗的研发进程。因此，复制缺陷型Ad7的构建不但需要敲除E1、E3基因，还需要将其E4阅读框进行改造，一方面有利于复制缺陷型Ad7在HEK293中复制，另一方面Ad7E4基因的毒力可能比Ad5E4基因的毒力作用强，替换E4的Ad7具有一定的减毒作用。
目前，全球以腺病毒为载体进行的临床试验比例已达22.2％，居各类载体之首。Ad2和Ad5是使用最广泛的腺病毒载体，然而普通人群中广泛存在针对Ad2、Ad5的预存抗体。欧洲、南美、亚洲其它地区以及我国普通人群中都存在针对Ad2、Ad5的预存抗体，阳性率甚至高达90％以上。预存抗体的存在会降低腺病毒载体疫苗诱导的T、B细胞免疫反应，极大限制了这些载体的使用。为了突破体内预存腺病毒抗体的感染，研究者采取了一系列的措施:1)构建嵌合病毒，改造腺病毒的主要抗原蛋白Hexon的抗原表位，躲避抗体的中和作用；2)开发预存抗体反应较少的新型腺病毒，如黑猩猩腺病毒CAd68，CAd3等；3)改变载体进入途径，有研究发现滴鼻感染可绕过腺病毒的预存抗体；4)分离PBMC细胞后利用腺病毒感染，然后回输体内等措施。Ad7在人群中预存抗体水平较低，不受Ad2、Ad5抗体的影响，因此Ad7可能绕过针对Ad2和Ad5的预存免疫。此外，Ad7的感染受体是DSG2，而Ad2、Ad5的感染受体是CAR，它们感染的靶细胞谱系存在差异，诱导的免疫反应类型可能不同。因此，开发复制缺陷型Ad7载体将具有巨大的优势，不仅可以替代Ad2、Ad5载体，而且还可以与Ad2、Ad5载体形成互补，极具临床转化潜力。
因此，本发明所描述的复制缺陷型Ad7潜在的具有以下用途：1)可作为抗Ad7感染的预防性疫苗；2)可作为基因治疗和疫苗研究的载体；3)可作为抗Ad7药物和抗体筛选的有效工具；4)可作为Ad7体内感染特性及机制的生物示踪。
发明内容
本发明针对敲除Ad7E1、E3基因后难以在293细胞中进行有效扩增的技术问题，提供了一种改造Ad7E4基因的解决方案，产生了一种全新的可在293细胞进行大规模生产的复制缺陷型人7型腺病毒。
本发明所述技术问题通过以下方案予以解决：
将Ad7基因组质粒化，敲除Ad7的E1、E3基因，再将Ad7基因组中的E4基因开放阅读框2、3、4、6、6/7改换为Ad5基因组的相应阅读框。
优选地，所述复制缺陷型人7型腺病毒，还在E1基因区域整合外源基因表达框。
一种复制缺陷型人7型腺病毒载体的制备方法，包含如下步骤：
S1.PCR扩增获得Ad7基因组的左右两端，连接至氨苄抗性质粒得到pT-Ad7(L+R)，线性化后与Ad7基因组重组，得到基因组质粒pAd7；
S2.PCR扩增获得Ad7E3基因的左右臂并正向连接至卡那霉素抗性质粒，线性化后与酶切线性化的pAd7同源重组，得到去除E3基因的基因组质粒pAd7ΔE3；
S3.PCR扩增Ad7E1基因的左右臂并正向连接至含有氨苄抗性质粒，线性化后与酶切线性化的pAd7ΔE3同源重组，得到去除E1基因的基因组质粒pAd7ΔE1ΔE3；
S4.以Ad7基因组为模板PCR获得Ad7E4ORF2-6的左右臂连接至T载体得到p7SE4，然后以Ad5基因组为模板，PCR扩增得到Ad5E4Orf2-6，将其连接p7SE4左右臂之间得到p7SE4(5E4)，p7E4(5E4)线性化后与线性化的pAd7ΔE1ΔE3同源重组，将Ad7E4ORF2-6替换为Ad5E4ORF2-6，得到pAd7ΔE1ΔE3(5E4)。
优选地，步骤S1.的具体方法为：
以Ad7基因组为模板，PCR扩增得到Ad7基因组左右两端L-Ad7和R-Ad7作为重组臂连接到线性化的T载体上，得到pT-Ad7(L+R)，同时在pT-Ad7(L+R)的左右臂之间引入了BamHI作为酶切位点，BamHI酶切pT-Ad7(L+R)线性化后与Ad7基因组重组，得到pAd7。
优选地，步骤S2.的具体方法为：
以Ad7基因组为模板，PCR扩增得到E3基因同源重组臂ΔE3-7L及ΔE3-7R，正向连接至pVax载体得到pVax-Ad7-ΔE3(L+R)，SpeI+XbaI酶切线性化后，与经EcoRI或者MluI酶切线性化的pAd7同源重组，经氨苄青霉素抗性筛选得到敲除E3基因同时在E3基因区引入唯一的单酶切位点SwaI的质粒pAd7ΔE3。
优选地，步骤S3.的具体方法为：
以Ad7的基因组为模板，PCR获得E1基因的左右臂ΔE1-7L，ΔE1-7R和T载体使用Exnase重组酶进行三片段连接得到pT-Ad7ΔE1(L+R)。pVax-ΔE1(L+R)使用Bstz17I进行酶切线性化，pAd7ΔE3使用AatII进行酶切线性化，将两者回收得到的片段进行同源重组得到pAd7ΔE1ΔE3。
优选地，步骤S4.的具体方法为：
以Ad7基因组为模板PCR获得Ad7E4ORF2-6基因的左右臂连接至T载体得到p7SE4，然后以Ad5基因组为模板，PCR扩增得到Ad5E4Orf2-6，将其连接p7SE4左右臂之间得到p7SE4(5E4)，p7SE4(5E4)线性化后与线性化的pAd7ΔE1ΔE3同源重组，将Ad7E4基因的ORF2-6替换为Ad5E4基因的ORF2-6，得到pAd7ΔE1ΔE3(5E4)。
一种复制缺陷型人7型腺病毒的制备方法，还包含如下步骤：
S5.以Ad7基因组为模板PCR得到E1区同源重组臂L-SE1、R-SE1，酶切并连接至pVax载体得到pSE1LR；以pGA1-EGFP为模板PCR得到外源基因表达框CMV-EGFP-BGH，与pSE1LR经酶切、连接得到pGK71-EGFP，线性化后与线性化pAd7ΔE1ΔE3(5E4)同源重组得到pAd7ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP，进一步线性化后转染293细胞，经培养、纯化得到Ad7ΔE1ΔE3(5E4)以及Ad7ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP。
优选地，步骤S5.的具体方法为：
分别以pVax、Ad7基因组、pGA1-EGFP为模板PCR得到pVax骨架、E1区上下游同源重组臂L-SE1、R-SE1以及外源基因表达框CMV-EGFP-BGH，pVax骨架、SE1L、SE1R连接得到pSE1LR；CMV-EGFP-BGH与pSE1LR经酶切、连接得到携带外源基因表达框的目标穿梭质粒pGK71-EGFP；
pGK71-EGFP线性化后与线性化的pAd7ΔE1ΔE3(5E4)同源重组得到pAd7ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP；
AsisI酶切pAd7ΔE1ΔE3(5E4)和pAd7ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP进行线性化，然后转染293细胞进行病毒拯救、扩增培养，纯化得到Ad7ΔE1ΔE3(5E4)和Ad7ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP。
更为优选地，在其中一个实施例中，步骤S5.的具体方法为：
分别以pVax、Ad7基因组、pGA1-EGFP为模板PCR得到Vax骨架、E1区上下游同源重组臂L-SE1、R-SE1以及外源基因表达框CMV-EGFP-BGH，pVax骨架、L-SE1、R-SE1使用Exnase酶进行三片段连接得到pSE1LR；CMV-EGFP-BGH使用SpeI进行酶切，pSE1LR使用SpeI+EcoRV进行酶切，两者连接得到穿梭质粒pGK71-EGFP。
pGK71-EGFP使用PacI进行酶切进行线性化,pAd7ΔE1ΔE3(5E4)使用PmeI进行线性化，两者进行同源重组得到pAd7ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP。
pAd7ΔE1ΔE3(5E4)、pAd7ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP使用AsisI酶切进行线性化，乙醇沉淀回收后转染293细胞进行病毒拯救、扩增培养，以CsCl2密度梯度离心法纯化得到pAd7ΔE1ΔE3(5E4)和Ad7ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP。
所述复制缺陷型人7型腺病毒在制备腺病毒疫苗中的应用。
所述复制缺陷型人7型腺病毒在制备腺病毒中和抗体中的应用。
所述复制缺陷型人7型腺病毒载体在生物学报告示踪系统中的应用。
有益效果：(1)本发明所述的复制缺陷型人7型腺病毒能够在293、PerC6等细胞株中大量生产，在正常人体细胞不具备复制能力因此具备良好的生产能力与减毒表型；(2)该重组载体可在靶细胞内高效表达外源基因；(3)本发明所述重组载体可作为疫苗或基因治疗载体，应用于药物及中和抗体的研发，以及报告示踪系统等。
附图说明
附图1是Ad7基因组环化成质粒的原理，及pAd7质粒的酶切鉴定结果。
附图2敲除pAd7质粒中E3基因的原理，及pAd7ΔE3质粒的酶切鉴定结果。
附图3是敲除pAd7ΔE3质粒中E1的原理，及、pAd7ΔE1ΔE3质粒的酶切结果。
附图4是pAd7ΔE1ΔE3中E4基因中ORF2-6替换为Ad5E4基因ORF2-6相应序列的原理，置换Ad7E4基因中ORF2-6的穿梭质粒及pAd7ΔE1ΔE3(5E4)的酶切结果。
附图5是构建携带外源基因表达框的pAd7ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP的过程示意图及酶切结果。
附图6是复制缺陷型Ad7载体的生产及纯化结果。
附图7是复制缺陷型Ad7载体在293和A549细胞中形成病毒噬斑的结果。
附图8是复制缺陷型Ad7ΔE1ΔE3(5E4)免疫小鼠后的中和抗体效价水平。
具体实施方法
本发明公开了一种复制缺陷型7型腺病毒及其制备方法。本发明构建复制缺陷型7型腺病毒载体的方法同样适用于其他型腺病毒载体的构建。本发明是以Ad7GZ08临床分离株为例进行构建的，并不局限为该特定基因型，同样适用其他基因型的Ad7分离株。
本发明中复制缺陷型7型腺病毒可作为外源基因表达载体表达外源基因，同时该载体可作为疫苗载体携带不同来源的外源抗原基因感染靶细胞诱导免疫反应。所述外源基因通常指外源基因表达框。
为了更清晰地介绍本项发明的内容，采用以下实例结合附图进行说明。采用实例对本项发明进行说明，但实例不用于限制本项发明的范围。下面实例如未特殊说明，均采用常规生物实验室的操作方法，所用试剂均为市售产品。
本项发明所使用的科学术语、技术方法与本项发明研究领域科研人员理解的含义一致，除非另有定义。本项发明采用的实例仅用于对本项发明内容的说明，不用于限制本项发明。
实施例1：Ad7基因组的环化。
1.构建环化Ad7基因组的穿梭质粒pT-Ad7(L+R)。
以Ad7的基因组为模板，PCR获得Ad7基因组的左臂(L-Ad7)和右臂(R-Ad7)。
L-Ad7引物：
L-Ad7-F：ACTGCGATCGCCTCTCTATTTAATATACCTTATAGATGG
L-Ad7-R：ACATGGATCCTCACTGAAGATAATCTCCTGTGG
PCR条件：95℃，3min；95℃，30s；56℃30s；72℃，40s；cycles30；72℃，5min；12℃保存。
R-Ad7引物：
R-Ad7-F：AGCTGGATCCGAACCACCAGTAATATCATCAAAG
R-Ad7-R：TGAGCGATCGCCTCTCTATATAATATACCTTATAGATGGAA
PCR条件：95℃，3min；95℃，30s；56℃30s；72℃，1min；cycles30；72℃，5min；12℃保存。
PCR产物和T载体使用Exnase重组酶进行三片段连接得到pT-Ad7(L+R)。
2.构建pAd7。
pT-Ad7(L+R)使用BamHI进行酶切线性化，然后和Ad7的基因组共转化BJ5183感受态细胞进行重组，氨苄抗性平板进行抗性筛选，将筛选得到的单克隆扩增后提取其质粒转化XL-Blue化学感受态细胞，提取质粒得到pAd7，使用不同的酶切方式进行鉴定，pAd7在基因组的两侧引入了两个AsisI酶切位点，方便后续对改造后的Ad7基因组进行线性化进行病毒拯救。具体构建过程及鉴定结果如附图1。
实施例2：E3基因的敲除及pAd7ΔE3质粒的构建。
1.构建E3基因敲除的穿梭质粒pVax-ΔE3(L+R)。
E3基因敲除穿梭质粒pVax-ΔE3(L+R)的构建。以Ad7的基因组为模板，PCR获得E3基因的左臂(L-ΔE3)和右臂(R-ΔE3)。
L-ΔE3引物：
L-ΔE3-F：CATACTAGTCTGTCTACTTCAACCCCTTCTCCG
L-ΔE3-R:GCAGAATTCATTTAAATGGAGGAAGGGTCTGGGTCTTCTG
PCR条件：95℃，3min；95℃，30s；63℃30s；72℃，30s；cycles30；72℃，5min；12℃保存。
R-ΔE3引物：
R-ΔE3-F:GCAGATATCATTTAAATAGACCCTATGCGGCCTAAGAGAC
R-ΔE3-R：ACATCTAGAGACAGTTGGCTCTGGTGGGGT
PCR条件：95℃，3min；95℃，30s；61℃30s；72℃，40s；cycles30；72℃，5min；12℃保存。
L-ΔE3使用SpeI+EcoRI酶切后，连接至相同酶切的pVax载体上，得到pVax-L-ΔE3。R-ΔE3使用EcoRV+XbaI进行酶切，连接至相同酶切的pVax-L-ΔE3骨架上得到pVax-ΔE3(L+R)。
2.pAd7ΔE3质粒的构建。
pVax-ΔE3(L+R)以SpeI+XbaI线性化，pAd7以EcoRI线性化，乙醇沉淀法回收后共转化BJ5183感受态细胞，涂至氨苄抗性平板，手提取质粒后，继续转化XL-Blue感受态细胞，手提取质粒并进行酶切鉴定。得到敲除E3基因并在E3区引入唯一的单酶切位点SwaI的基因组质粒pAd7ΔE3。SwaI酶切位点的插入，方便在E3基因区进行线性化。穿梭质粒及pAd7ΔE3质粒的构建示意图及大质粒的酶切鉴定结果如附图2所示。
实施例3：E1基因的敲除及pAd7ΔE1ΔE3质粒的构建。
1.构建E1基因敲除的穿梭质粒pT-Ad7ΔE1(L+R)。
E1基因敲除穿梭质粒pT-Ad7ΔE1(L+R)的构建。以Ad7的基因组为模板，PCR获得E1基因的左臂(L-ΔE1)和右臂(R-ΔE1)。
L-ΔE1引物：
L-ΔE1-F：ACTCACCGGCGGCGATCGCCTCTCTATTTAATATACCTTATAGATGG
L-ΔE1-R：ATCACAATTGAATTCGTTTAAACGTAATCGAAACCTCCACGTAA
PCR条件：95℃，3min；95℃，30s；54℃30s；72℃，30s；cycles30；72℃，5min；12℃保存。
R-SE1引物：
R-SE1-F：ATAGAATTCACTAGTGAGGCCCGATCATTTGGTGCT
R-SE1-R：ACGTATACCTATCATTATGGATGAGTGCATGG
PCR条件：95℃，3min；95℃，30s；61℃30s；72℃，1min 10s；cycles30；72℃，5min；12℃保存。
PCR产物和T载体使用Exnase重组酶进行三片段连接得到pT-Ad7(L+R)。
2.pAd7ΔE1ΔE3质粒的构建。
pT-Ad7-ΔE1(L+R)以Bstz17I线性化，pAd7以AatII线性化，乙醇沉淀法回收后共转化BJ5183感受态细胞，涂至氨苄抗性平板，手提取质粒后，继续转化XL-Blue感受态细胞，手提取质粒并进行酶切鉴定。敲除E1基因并在E1区引入单酶切位点PmeI的基因组质粒pAd7ΔE1ΔE3。PmeI酶切位点的插入，方便在E1基因区进行线性化。穿梭质粒及pAd7ΔE1ΔE3质粒的构建示意图及大质粒的酶切鉴定结果如附图3所示。
实施例4：构建整合Ad5E4ORF2-6序列的质粒pAd7ΔE1ΔE3(5E4)。
1.构建E4基因区的穿梭质粒p7SE4。以Ad7的基因组为模板PCR获得E4基因区的左臂(L-SE4)和右臂(R-SE4)。
扩增Ad7L-SE4的引物序列：
L-SE4-F:CGCGGATCTTCCAGAGATGTTTAAAC AACCAGTTACTCCTAGAACAGTCAGC
L-SE4-R:ACGCGTATGGATTTAAAT CGATGCAGGCGAGAGTCTATTC
PCR条件：95℃，3min；95℃，30s；60℃30s；72℃,45s；cycles30；72℃,5min；
扩增Ad7R-SE4的引物序列：
R-SE4-F:ATTTAAATCCATACGCG TGGAGTTCTTATTAAGTGCGGATGG
R-SE4-R:GCCTGCCGTTCGACGATGTTTAAAC CAGCTGGCACGACAGGTTTC
PCR条件：95℃，3min；95℃，30s；60℃30s；72℃,30s；cycles30；72℃,5min；
PCR获得的L-SE4、R-SE4片段和平末端的T载体进行三片段连接得到得到p7SE4。
2.构建携带Ad5E4ORF2-6序列的E4基因区的穿梭质粒p7SE4(5E4)。以Ad5的基因组为模板PCR获得Ad5E4Orf(2-6)。
Ad5ORF6-F:TCACAGTCCAACTGCTCCTACATGGGGGTAGAGTCATAATCG
Ad5ORF2-R:GCGCGGTAACCTATTGCATGCAGAAACCCGCAGACATG
PCR条件：95℃，3min；95℃，30s；65℃30s；72℃,2min；cycles30；72℃,5min；
以p7SE4为模板PCR获得其骨架序列
p7SE4-F:CAATAGGTTACCGCGCTGCG
P7SE4-R:AGCAGTTGGACTGTGAAAGCGC
PCR条件：95℃，3min；95℃，30s；60℃30s；72℃,6min；cycles30；72℃,6min；
将上述PCR获得的片段利用Exnase酶进行双片段连接得到p7SE4(5E4)；
3.构建质粒pAd7ΔE1ΔE3(5E4)。
p7SE4(5E4)使用PmeI进行酶切线性化，pAd7ΔE1ΔE3使用SwaI进行酶切线性化，利用乙醇沉淀法回收上述两种酶切产物，共转化BJ5183感受态细胞进行重组，将氨苄平板进行抗性筛选，将筛选得到单克隆扩增后提取其质粒转化XL-Blue感受态细胞，提取质粒得到pAd7ΔE1ΔE3(5E4)，提取质粒进行酶切鉴定，pAd7ΔE1ΔE3(5E4)具体构建过程及大质粒的鉴定结果参见附图3。
实施例5：携带外源基因的E1基因区穿梭质粒及pAd7ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP质粒的构建。
1.构建携带外源基因表达框的E1基因区穿梭质粒pGK71-EGFP。
1)以Ad7的基因组为模板PCR获得E1基因区穿梭质粒的左臂SE1L和右臂SE1R。
SE1L的扩增：
SE1L-F:CCAGATATACGCGTGTATACTTAATTAACGGCATCAGAGCAGATTGTACTG
SE1L-R:GTTTAAACAAGATTTAAATGTAATCGAAACCTCCACGTAAACG
SE1R的扩增：
SE1R-F:ATTTAAATCTTGTTTAAACGAATTCACTAGTGAGGCCCGATC
SE1R-R:GCCCAGTAGAAGCGCCGGTGTTAATTAACAAGTAGCTTGTCCTCAGCCAGG
2)构建携带E1基因区重组臂的穿梭质粒pSE1LR。
使用Bstz17I+SgraI双酶切质粒pVax回收质粒骨架，然后和上述PCR获得SE1L、SE1R使用Exnase酶进行三片段连接得到pSE1LR。
3)构建携带EGFP表达框的穿梭质粒pGK71-EGFP。
以实验室保存的pGA1-EGFP质粒为模板，PCR扩增获得CMV-EGFP-BGH的表达框。
扩增CMV-EGFP-BGH的引物序列：
CMV-EGFP-BGH-F:ACTAGTGAATTCGTTTACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGG
CMV-EGFP-BGH-R:CATTTAAATCTTGTTTCCTGCTATTGTCTTCCCAATC
PCR条件：95℃，3min；95℃，30s；60℃30s；72℃2min；cycles30；72℃,5min；
pSE1LR使用PmeI酶切进行线性化，然后和PCR扩增获得的CMV-EGFP-BGH表达框使用Exnase酶进行连接得到pGK71-EGFP。
2.构建插入外源基因EGFP的腺病毒重组质粒pAd7ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP。
pGK71-EGFP使用PacI进行线性化，pAd7ΔE1ΔE3(5E4)使用PmeI酶切进行线性化，利用乙醇沉淀法回收上述两种酶切产物，共转化BJ5183感受态细胞进行重组，将氨苄平板进行抗性筛选，将筛选得到单克隆扩增后提取其质粒转化XL-Blue感受态细胞，提取质粒得到pAd7ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP，提取质粒进行酶切鉴定，pAd7ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP具体构建过程及大质粒的鉴定结果参见附图5。
实施例6：复制缺陷型Ad7载体的拯救与生产。
按照常规方法，pAd7ΔE1ΔE3(5E4)、pAd7ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP分别以AsiSI线性化，乙醇沉淀回收，阳离子脂质体转染法转染293细胞，转染后4-6小时后，加入2毫升含5％胎牛血清的DMEM培养基，孵育7-10天，观察细胞病变；出毒后，收集细胞及培养上清，在37度水浴及液氮中反复冻融3次并离心去除细胞碎片，上清感染10厘米皿；2-3天后，收集细胞及培养上清，反复冻融3次并离心去除细胞碎片，上清感染10-15个15厘米皿；2-3天后，收集细胞，反复冻融3次并离心去除细胞碎片，上清加至氯化铯密度梯度离心管；4℃,35000转，离心4小时；吸出病毒条带，脱盐，分装；以OD260吸光度测定病毒粒子滴度，计算公式为：病毒浓度＝OD260×稀释倍数×36/基因组长度(Kb)；病毒储存液于-80℃冻存。复制缺陷型Ad7载体的生产及纯化结果如附图5所示。
实施例7：复制缺陷型Ad7在293和A549细胞中复制能力测定
采用噬斑实验测定复制缺陷型Ad7载体在辅助细胞293和非辅助细胞A549中的复制能力。在6孔细胞板中接种293或者A549细胞，待到细胞密度接近100％时，将收获的的P1代Ad7ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP病毒原液梯度稀释后分别感染293或者A549细胞，每个病毒浓度做两个重复。病毒感染细胞2h后，吸去培养基，每孔铺上2ml左右的琼脂糖凝胶(含1ml1.4％琼脂糖，1ml 1×MEM培养基，200ul BSA，1×青链霉素抗生素)。培养9-12天左右，利用荧光显微镜观察病毒携带的绿色荧光表达，并寻找病毒克隆的形成，拍照记录。结果如附图所示，Ad14ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP同时删除了E1和E3基因，只能在辅助细胞293中形成病毒噬斑，却无法在人正常的A549细胞形成病毒噬斑。以上结果表明复制缺陷型Ad7载体可在辅助细胞293中复制，却无法在人的正常细胞如A549细胞中复制，具有减毒表型。此外，复制缺陷型Ad7载体可在感染的细胞中表达携带的报告基因，运用于生物示踪系统中。
实施例8：复制缺陷型Ad7载体在小鼠中免疫原性评价
设计复制缺陷型Ad7在小鼠体内的免疫原性评价方案，如附图，按照设计的免疫方案对复制缺陷型Ad7的免疫原性进行评价。
选取6-8周龄的Balb/c小鼠分为3组，每组6只。采取肌注免疫的方式，第1组免疫低剂量的Ad7ΔE1ΔE3(5E4)，第2组免疫高剂量的Ad7ΔE1ΔE3(5E4)，第3组免疫热灭活的Ad7ΔE1ΔE3(5E4)。免疫后第21天，眼眶采血分离血清，测定抗Ad7的中和抗体。同时按上述方案第28天加强免疫；第42天，眼眶取血并分离血清，测定抗Ad7的中和抗体；结果如图所示，免疫组初免后即可产生抗Ad7的中和抗体，与免疫灭活的Ad7ΔE1ΔE3(5E4)相比，免疫复制缺陷型Ad7ΔE1ΔE3(5E4)可诱导更高水平的抗Ad7中和抗体；而加强后抗体水平显著提升；免疫灭活Ad7ΔE1ΔE3(5E4)产生的中和抗体滴度相对其他组较低，结果说明，与灭活的Ad7ΔE1ΔE3(5E4)相比，复制缺陷型Ad7ΔE1ΔE3(5E4)可在免疫小鼠中诱发更高水平的针对Ad7的中和抗体。
以上所述实施例仅表达了本项发明的几种实施方式，这些实施例的描述清晰、具体，这些实施例的表述不可理解为对本项发明专利的限制。需要强调的是，对于本研究领域的科研技术人员，在根据本项发明构思的前提下，还能够做出若干变化和改进，这些属于本项发明的保护范围。因此，本项专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (6)

1.一种复制缺陷型人7型腺病毒，其特征在于，E1和E3基因缺失，且E4基因开放阅读框2、3、4、6、6/7改换为Ad5 E4基因的相应阅读框。
2.根据权利要求1所述的复制缺陷型人7型腺病毒，其特征在于，在原E1基因区域整合外源基因表达框。
3.根据权利要求2所述的外源基因表达框，其特征在于，包含真核基因启动子、任意一段外源DNA序列、转录终止子。
4.权利要求1、2、3所述复制缺陷型人7型腺病毒在制备抗人7型腺病毒感染的疫苗或中和抗体中的应用。
5.权利要求1、2、3所述复制缺陷型人7型腺病毒在制备抗其他病原体疫苗中的应用。
6.权利要求1、2、3所述复制缺陷型人7型腺病毒在生物学报告示踪系统中的应用。
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