WO2022193552A1 - 新型冠状病毒Ad26腺病毒载体疫苗及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
提供了一种新型冠状病毒Ad26腺病毒载体疫苗及其制备方法,该Ad26腺病毒载体负载有如SEQ ID NO.1所示的新冠病毒Spikes优化序列。
Description
本发明涉及基因工程领域,具体涉及新型冠状病毒Ad26腺病毒载体疫苗及其制备方法与应用。
冠状病毒(Coronavirus)在病毒学分类上属于巢状病毒目(order Nidovirals)、冠状病毒科(family Coronavirade)、冠状病毒属(genus Coronavirus)的成员,基因组为单股、正链的RNA,基因组全长在26~32kb之间,是目前已知基因组最大的RNA病毒。人冠状病毒目前已知有六种,分别是二十世纪60年代发现的人冠状病毒229E(HCoV-229E)和HCoV-OC43,2003年出现的SARS-CoV,2004年在荷兰分离的HCoV-NL63,2005年在中国香港鉴定的HCoV-HKU1以及2012年在中东地区出现的新型中东呼吸综合征(Middle East respiratory syndrome virus,MERS)冠状病毒MERS-CoV。冠状病毒能够感染机体的呼吸道、消化道、肝脏、肾脏以及神经系统,造成不同程度的病理性损伤,严重者甚至造成死亡。
在SARS-CoV-2冠状病毒的病毒颗粒结构中,S蛋白(spike protein,S protein)是一个十分重要的靶点。SARS-CoV-2冠状病毒的S蛋白存在融合前构象和融合后构象,其会识别细胞膜上受体蛋白ACE2(angiotensin converting enzyme 2),通过宿主细胞的弗林蛋白酶进行切割,使蛋白分为S1和S2,进而介导并促使病毒包膜与细胞膜发生融合,融合后产生的抗体多为结合抗体,没有中和作用,使疫苗免疫原性大打折扣。
相关技术中,采用的新型冠状病毒的刺突蛋白S基因(序列号NC_045512.2)作为靶序列,但该基因在人肾细胞HEK293表达水平很低,通过其制备得到的疫苗可能无效或是效价很低,不足以抵抗病毒的感染。
因此,开发一种有效且高效的新型冠状病毒疫苗对于新型冠状病毒的防治与控制具有极为重要的意义。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此,本发明提出一种新型冠状病毒Ad26腺病毒载体疫苗,该疫苗采用人Ad26型腺病毒载体,解决了人体内Ad5预存抗体水平高的难题,提高了疫苗免疫效果,扩大了适应人群。
本发明的第一个方面,提供一种新型冠状病毒Ad26腺病毒载体,该Ad26腺病毒载体负 载有新冠病毒Spikes优化序列。
真核细胞转录的mRNA前体能够通过不同剪接方式(选择不同的剪接位点组合)产生不同的mRNA剪接异构体的过程,最终导致同一个基因序列产生的不同的蛋白质,这对蛋白的表达是非常不利的。发明人通过对野生型的天然核酸序列(新冠病毒Spikes蛋白)进行密码子优化,同时基于自有技术去除潜在的可变剪切位点,保证了新冠病毒Spikes蛋白表达的唯一性,减少了蛋白后续纯化的难度。
本发明通过将密码子优化后,S基因的弗林蛋白酶切位点发生突变(RRAR突变为GSAS),同时在S基因的986aa~987aa的KV突变为PP,使S蛋白维持稳定的融合前构象,大大提升了疫苗的免疫原性。将突变后的S基因整合到复制缺陷型Ad26载体上,通过腺病毒感染细胞,呈递新冠病毒抗原,免疫后使机体产生特异性免疫反应,从而阻断新冠病毒的感染。
根据本发明的第一个方面,在本发明的一些实施方式中,所述新冠病毒Spikes优化序列如SEQ ID NO.1所示。
根据本发明的第一个方面,在本发明的一些实施方式中,所述Ad26腺病毒载体为复制缺陷型Ad26腺病毒载体。
在本发明的一些更优选实施方式中,所述复制缺陷型Ad26腺病毒载体为缺失E1和E3区基因的复制缺陷型Ad26腺病毒载体。
根据本发明的第一个方面,在本发明的一些实施方式中,外源基因启动子选自人巨细胞病毒CMV启动子、鼠巨细胞病毒CMV启动子、EF1a或PGK1中的至少一种。
在本发明的一些优选实施方式中,外源基因启动子选自人巨细胞病毒CMV启动子或、鼠巨细胞病毒CMV启动子。
根据本发明的第一个方面,在本发明的一些实施方式中,所述Ad26腺病毒载体可以调控SEQ ID NO:1所示核酸序列的表达。
本发明的第二个方面,提供一种新型冠状病毒Ad26腺病毒载体的制备方法,包括如下步骤:
(1)扩增SEQ ID NO.1所示序列,重组构建穿梭质粒1;
(2)扩增穿梭质粒1基因组,重组构建穿梭质粒2;
(3)扩增穿梭质粒2基因组,重组构建穿梭质粒3;
(4)扩增穿梭质粒3基因组,得到目的片段CMV-SPd-BGH,将目的片段CMV-SPd-BGH与去除E1和E3基因的pAd26质粒共转染至细胞中,即得新型冠状病毒Ad26腺病毒载体。
本发明的第三个方面,提供一种新型冠状病毒Ad26腺病毒疫苗,该疫苗包括本发明第 一个方面所述载体或本发明第二个方面所述制备方法制备得到的载体。
本发明是基于复制缺陷型Ad26载体的新冠疫苗,Ad26在人群中预存抗体的比例低于Ad5,因此,基于复制缺陷型Ad26载体的新冠疫苗可避免载体被人体内预存抗体中和,免疫效果高于Ad5载体疫苗。而且,Ad26复制能力高于Ad5。因此,在疫苗生产方面,Ad26载体疫苗的成本有望低于Ad5载体疫苗。
根据本发明的第三个方面,在本发明的一些实施方式中,所述新型冠状病毒Ad26腺病毒载体可在人源细胞或人体内表达蛋白。
在本发明的一些优选实施方式中,所述蛋白可在人体内:
诱导免疫应答;或
产生生物报告分子;或
用于检测的追踪分子;或
调节基因功能;或
作为治疗性分子。
在本发明的一些优选实施方式中,所述的疫苗为DNA质粒或RNA表达质粒。
可在本发明中的新型冠状病毒Ad26腺病毒载体中加入EGFP、SEAP、shRNA等基团或基因,从而使其获得诱导免疫应答;或产生生物报告分子;或用于检测的追踪分子;或调节基因功能;或作为治疗性分子的作用。
根据本发明的第三个方面,在本发明的一些实施方式中,所述新型冠状病毒Ad26腺病毒载体疫苗中还包括药学上可接受的免疫调节剂、载体、稀释剂、赋形剂或至少一种对COV ID-19有治疗作用的药物。
本发明的有益效果是:
1.本发明是基于复制缺陷型Ad26载体,由于Ad26在人群中预存抗体的比例低于Ad5,因此可避免载体被人体内预存抗体中和,免疫效果高于常规的Ad5载体疫苗;而且,Ad26复制能力高于Ad5,从而可以在同等时间内获得更多的载体,疫苗制备成本更低。
2.本发明中的疫苗是基于密码子优化后的S基因制备得到的,由于密码子优化后的S基因的弗林蛋白酶切位点突变,以及986aa~987aa的KV突变为PP,使S蛋白维持稳定的融合前构象,大大提升了疫苗的免疫原性。
3.本发明中的载体制备方法操作步骤简单易行,仅通过PCR扩增即可获得新型冠状病毒Ad26腺病毒载体,有效节约了人工成本。
图1为本发明实施例中的新型冠状病毒Ad26腺病毒载体的构建具体技术原理图。
图2为本发明实施例中的病毒纯化图片,其中,1为HEK293,2为Ad26空载体(Ad26-empty),3为Ad26-SPd,4为S(ΔTM)。
图3为本发明实施例中的新型冠状病毒Ad26腺病毒侵染A549细胞后S蛋白的表达的凝胶电泳图。
图4为本发明实施例中的小鼠血清中抗体检测结果。
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰,以下结合具体实施方式,对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是,本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明,并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂,若无特别说明,均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
新型冠状病毒Spike基因的优化
真核细胞转录的mRNA前体能够通过不同剪接方式(选择不同的剪接位点组合)产生不同的mRNA剪接异构体的过程,最终导致同一个基因序列产生的不同的蛋白质。这对蛋白的表达是非常不利的。
因此,发明人基于野生型SARS-CoV-2的刺突蛋白的天然核酸序列(氨基酸序列编号为YP_009724390.1)进行密码子优化,同时基于自有技术去除潜在的可变剪切位点,以保证蛋白表达的唯一性,减少了蛋白后续纯化的难度。
优化得到的核酸序列为:
利用SEQ ID NO.1所示序列构建模板质粒,或采用PGA1-S质粒(广州恩宝生物医药科技有限公司保存,携带有SEQ ID NO.1所示序列)作为模板质粒。
新型冠状病毒Ad26腺病毒载体的构建
本实施例构建的Ad26腺病毒载体为携带脯氨酸替换(S蛋白的986aa~987aa的KV突变为PP,下述实施例中简述为PP突变)和弗林酶切位点突变(弗林酶切位点RAAR突变为 GSAS)的S基因的pAd26-SPd载体。
1.构建携带PP突变的S抗原基因的穿梭质粒pGA1-SP:
(1)以上述实施例所述的PGA1-S质粒为模板,以S-F和SP-R为引物,采用Primer Star Mix(TaKaRa)PCR扩增得到目的片段SP-L。
其中,S-F的核苷酸序列为:5’-GCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGTTCGTGTTTCTGGT-3’(SEQ ID NO.2);
SP-R的核苷酸序列为:5’-TCTGCCTCGGGAGGGTCCAGCCGGCTCAGGATGTCATTCAGC-3’(SEQ ID NO.3)。
PCR扩增反应条件为:98℃预热3min;98℃变性10s;60℃退火5s;72℃延伸30s;28个循环,72℃终延伸5min。得到的扩增产物SP-R可于4℃保存。
(2)以上述实施例所述的PGA1-S质粒为模板,以SP-F和S-R为引物,采用Primer Star Mix(TaKaRa)PCR扩增得到目的片段SP-R。
其中,SP-F的核苷酸序列为:5’-GGACCCTCCCGAGGCAGAGGTGCAGATCGACCGGCTGATC-3’(SEQ ID NO.4);
S-R的核苷酸序列为:5’-AGAATAGGGCCCTCTAGACTAGTTTATCAGGTGTAGTGCAGCTTC-3’(SEQ ID NO.5)。
PCR扩增反应条件和保存条件同SP-L。
(3)将步骤(1)和(2)中得到的目的片段SP-L、SP-R与载体骨架pGA1使用同源重组酶(Vazyme)进行重组,得到穿梭质粒pGA1-SP。
2.构建携带PP和弗林酶切位点缺失的S抗原基因的穿梭质粒pGA1-SPd:
(1)以上述实施例制得的穿梭质粒pGA1-SP为模板,以S-F和Pd-R为引物,采用Primer Star Mix(TaKaRa)PCR扩增得到目的片段SPd-L。
其中,S-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
Pd-R的核苷酸序列为:5’-TGGGGAGTTTGTCTGGGTCTGGTAGGAGGCAC-3’(SEQ ID NO.6)。
PCR扩增反应条件和保存条件同SP-L。
(2)以上述实施例制得的穿梭质粒pGA1-SP为模板,以S-R和Pd-F为引物,采用Primer Star Mix(TaKaRa)PCR扩增得到目的片段SPd-R。
其中,S-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
Pd-F的核苷酸序列为:5’-ACCCAGACAAACTCCCCAGGCAGCGCTAGCTCTGTGGCC AGCCAGTCCATCATCGCCT-3’(SEQ ID NO.7)。
PCR扩增反应条件和保存条件同SP-L。
(3)将步骤(1)和(2)中得到的目的片段SPd-L、SPd-R与载体骨架pGA1使用同源重组酶(Vazyme)进行重组,得到穿梭质粒pGA1-SPd。
3.构建携带PP和弗林酶切位点缺失的S抗原基因穿梭质粒pGA261-SPd:
(1)以上述实施例制得的穿梭质粒pGA1-SPd为模板,以S-F(SEQ ID NO.2)和S-R(SEQ ID NO.5)为引物,采用Primer Star Mix(TaKaRa)PCR扩增得到目的片段SPd。
PCR扩增反应条件和保存条件同SP-L。
(2)以pGA261-EGFP质粒(广州恩宝生物医药科技公司保存)为模板,以PGA-R和PGA-F为引物,采用Primer Star Mix(TaKaRa)PCR扩增得到载体骨架pGA261。
其中,PGA-R的核苷酸序列为:5’-GGATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTAAGTTTAAACGCTAGAGTCCGG-3’(SEQ ID NO.8);
PGA-F的核苷酸序列为:5’-TCTAGAGGGCCCTATTCTATAGTGTC-3’(SEQ ID NO.9)。
PCR扩增反应条件和保存条件同SP-L。
(3)将步骤(1)和(2)中得到的目的片段SPd与载体骨架pGA261使用同源重组酶(Vazyme)进行重组,得到穿梭质粒pGA261-SPd。
4.构建携带PP和弗林酶切位点缺失的S抗原基因的pAd26-SPd质粒:
(1)以上述实施例制得的穿梭质粒pGA261-SPd为模板,以Ad26-SB-F和Ad26-SB-R为引物,PCR扩增得到携带同源重组臂的CMV-SPd-BGH目的片段,回收目的片段。
其中,Ad26-SB-F的核苷酸序列为:5’-CCTCTCAAGTCTGTATACCATCATCAATAATATACCCCACAAAGTAAACAAA-3’(SEQ ID NO.10);
Ad26-SB-R的核苷酸序列为:5’-TTTGGTGTGCGCCGGTGGCCCCTGCTATGACTGGATCATCTACAACACG-3’(SEQ ID NO.11)。
PCR扩增反应条件和保存条件同SP-L。
目的片段的回收采用胶回收试剂盒(购自广州美基生物科技有限公司)。
(2)将去除E1和E3基因的pAd26(pAd26ΔE1ΔE3)进行PmeI线性化处理,然后用乙醇沉淀回收。
(3)将步骤(1)中得到的目的片段CMV-SPd-BGH和步骤(2)中得到的pAd26ΔE1ΔE3(5E4)共转化BJ5183感受态细胞,同源重组得到pAd26-SPd质粒。
新型冠状病毒Ad26腺病毒载体的构建具体技术原理如图1所示。
新型冠状病毒Ad26腺病毒载体的拯救与生产
参照本领域常规方法,对上述实施例制备得到的pAd26-SPd质粒进行AsiSI线性化处理,然后用乙醇沉淀回收。采用阳离子脂质体转染法将回收的pAd26-SPd质粒转染至293细胞中。转染后4小时,加入2mL含5%胎牛血清的DMEM培养基,孵育7-10天,观察细胞病变。待出毒后,收集细胞及培养上清,在37℃水浴及液氮中反复冻融3次,并离心去除细胞碎片,收集上清,并感染10厘米皿,孵育2-3天。孵育2-3天后,收集细胞及培养上清,再次反复冻融3次并离心去除细胞碎片,收集上清,感染3-5个15厘米皿,孵育2-3天。重复该操作,感染30个15厘米皿。继续重复该操作,收集上清至氯化铯密度梯度离心管中,4℃、40000转,离心4小时。吸出病毒条带,脱盐,分装,以OD
260吸光度测定病毒粒子滴度,计算公式为:
病毒储存液于-80℃冻存。
病毒纯化图片如图2所示。
新型冠状病毒Ad26腺病毒载体的效果检测
1.Spike基因表达效果检测:
用上述实施例制备得到的新型冠状病毒Ad26腺病毒侵染A549细胞,孵育24h后收集细胞。按照常规的WesternBlot方法处理细胞样品,并进行蛋白检测。
结果如图3所示。
通过凝胶电泳图可以看出疫苗候选株Ad26-SPd样品中能够观察到S蛋白的表达,说明Ad26疫苗候选株构建正确,可以成功表达S抗原蛋白。
2.动物免疫原性评价:
本实施例以6-8周龄CD46转基因小鼠为对象,检测上述实施例制备得到的新型冠状病毒Ad26腺病毒载体的动物免疫原性。
具体操作为:
将CD46转基因小鼠分为2组,每组5只。在第0天,分别肌注免疫剂量的Ad26-SPd(1×10
9vp/只)。在第14天,对实验小鼠进行眼眶取血并分离血清。采用酶联免疫吸附测定(ELISA),以新冠病毒的S蛋白为抗原,检测血清中的抗体水平。
其中,ELISA法检测抗体水平的步骤为:在96孔板上以50ng/孔的量加入S蛋白,4℃孵育过夜。吸掉上清,磷酸盐吐温缓冲液(PBST)洗3次,每孔加入200μL的5%BSA,室 温封闭2h。PBST洗3次,每孔分别加入稀释倍数为1:400,1:800,1:1600,1:3200,1:6400,1:12800,1:25600和,1:51200的小鼠血清(用PBS稀释)37℃孵育2h。加入100μL稀释过的HRP标记IgG二抗,37℃孵育2h。PBST洗6-8次。加入100μL TMB显色。加入50μL1M硫酸终止反应。450nm处吸光度测定OD值。
结果如图4所示。测定得到的OD值范围在0.1-4之间,说明Ad26-SPd质粒能够诱异小鼠产生新冠病毒S蛋白的特异性抗体。
综上所述,上述实施例中制备得到的新型冠状病毒Ad26腺病毒载体携带外源抗原基因表达盒子,在感染人体后能够表达抗原,可以起到疫苗的作用。而且,由于上述实施例中制备得到的新型冠状病毒Ad26腺病毒载体中插入的目的基因是新冠病毒Spikes的优化后序列,替代未优化的新冠病毒Spikes,具有更好的稳定性。上述实施例中制备得到的新型冠状病毒Ad26腺病毒载体解决了人体内Ad5预存抗体水平高的难题,提高了疫苗免疫效果,扩大了适应人群,有效降低的疫苗的生产成本。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (11)
- 一种新型冠状病毒Ad26腺病毒载体,其特征在于,所述Ad26腺病毒载体负载有新冠病毒Spikes优化序列;所述新冠病毒Spikes优化序列优选为如SEQ ID NO.1所示序列。
- 根据权利要求1所述的新型冠状病毒Ad26腺病毒载体,其特征在于,所述Ad26腺病毒载体为复制缺陷型Ad26腺病毒载体。
- 根据权利要求2所述的腺病毒载体疫苗,其特征在于:所述复制缺陷型Ad26腺病毒载体为缺失E1和E3区基因的复制缺陷型Ad26腺病毒载体。
- 根据权利要求1所述的新型冠状病毒Ad26腺病毒载体,其特征在于,外源基因启动子选自人巨细胞病毒CMV启动子、鼠巨细胞病毒CMV启动子、EF1a或PGK1中的至少一种。
- 根据权利要求1-4任一项所述的新型冠状病毒Ad26腺病毒载体,其特征在于,所述Ad26腺病毒载体可以调控SEQ ID NO:1所示核酸序列的表达。
- 一种新型冠状病毒Ad26腺病毒载体的制备方法,包括如下步骤:(1)扩增SEQ ID NO.1所示序列,重组构建穿梭质粒1;(2)扩增穿梭质粒1基因组,重组构建穿梭质粒2;(3)扩增穿梭质粒2基因组,重组构建穿梭质粒3;(4)扩增穿梭质粒3基因组,得到目的片段CMV-SPd-BGH,将目的片段CMV-SPd-BGH与去除E1和E3基因的pAd26质粒共转染至细胞中,即得新型冠状病毒Ad26腺病毒载体。
- 一种新型冠状病毒Ad26腺病毒载体疫苗,其特征在于,所述疫苗包括权利要求1-5任一项所述新型冠状病毒Ad26腺病毒载体或由权利要求6所述制备方法制备得到的载体。
- 根据权利要求7所述的新型冠状病毒Ad26腺病毒载体疫苗,其特征在于,所述新型冠状病毒Ad26腺病毒载体可在人源细胞或人体内表达蛋白。
- 根据权利要求7所述的新型冠状病毒Ad26腺病毒载体疫苗,其特征在于:所述的疫苗为DNA质粒或RNA表达质粒。
- 根据权利要求8所述的新型冠状病毒Ad26腺病毒载体疫苗,其特征在于,所述蛋白可在人体内:诱导免疫应答;或产生生物报告分子;或用于检测的追踪分子;或调节基因功能;或作为治疗性分子。
- 根据权利要求7-10任一项所述的新型冠状病毒Ad26腺病毒载体疫苗,其特征在于,所述新型冠状病毒Ad26腺病毒载体疫苗中还包括药学上可接受的免疫调节剂、载体、稀释剂、赋形剂或至少一种对COVID-19有治疗作用的药物。
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