CN110974950A - 一种用于预防SARS-CoV-2感染的腺病毒载体疫苗 - Google Patents

一种用于预防SARS-CoV-2感染的腺病毒载体疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于预防SARS‑CoV‑2感染的腺病毒载体疫苗，所述疫苗包括如SEQ ID NO：1所示的核酸序列。本发明一些实例的疫苗，其含有的S蛋白核酸序列易于在人体细胞表达，可以诱导产生更多的S蛋白，有望作为一种重组病毒疫苗，用于预防SARS‑CoV‑2感染。本发明的一些实例，具有较好的安全性。

Description

一种用于预防SARS-CoV-2感染的腺病毒载体疫苗
技术领域
本发明涉及一种用于预防SARS-CoV-2感染的腺病毒载体疫苗。
背景技术
新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的潜伏期可长达24天，传染性强，与引发非典的SARS病毒不同，部分病例潜伏期具有传染性，另有一些病毒携带者没有表现出任何明显症状。这对疫情的防控增加了难度。因此，快速研制出能够提升群体免疫水平并阻断病毒传播的预防疫苗已成为我国当前最为紧迫的重大需求。
针对新型冠状病毒，目前国内外尚无明确验证的特效抗病毒药物和预防性疫苗。因此做好预防，阻断病毒的传播是控制疫情的关键。而疫苗的应用已在消除多种传染病中发挥了不可替代的作用。已公布的十几个SARS-CoV-2病毒基因组比对的结果显示病毒之间的差异非常小，目前还没发现发生变异。因此，如果SARS-CoV-2疫苗研发成功，必将能在很大程度上抑制新疫情的暴发。
腺病毒是疫苗研发与基因治疗中常用的载体，被广泛应用于生物医学领域。与其它载体(如细菌或其它病毒)相比，腺病毒的毒性低，感染腺病毒只引起轻微的感冒症状。Ad5空载体病毒为缺失E1和E3区基因的复制缺陷型Ad5载体，不携带任何外源基因。以Ad5为载体的基因治疗产品已在多个临床试验上证实了其安全性。
SARS-CoV-2的全序列如NC_045512.2所示，该序列的21563..25384核酸为刺突蛋白(Spike protein，S)的编码序列。S蛋白是病毒粒子的一种主要结构蛋白，在介导病毒粒子与宿主细胞受体的结合以及诱导中和抗体中起重要作用。因此，以S蛋白为抗原的疫苗，包括核酸疫苗，亚单位疫苗和病毒载体疫苗，其S蛋白的表达水平、蛋白结构决定了疫苗的有效性。
然而实验表面，天然的SARS-CoV-2的刺突蛋白S基因在人体内的表达量较低，如果以原始的S密码子来表达为抗原，不足以产生足够的抗原，其疫苗可能无效或是效价很低，不足以抵抗病毒的感染。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种优化的S蛋白核酸序列。该核酸序列在1) DNA质粒；2）整合到腺病毒载体之后，转染人细胞株后可以表达生产更多的S蛋白，有望作为核酸疫苗或重组病毒疫苗的抗原基因，用于预防SARS-CoV-2感染。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
一种用于预防SARS-CoV-2感染的疫苗，所述疫苗包括：
a)如SEQ ID NO：1所示的核酸序列；或
b)具有与SEQ ID NO：1至少85％，优选90%、95%、98%序列相同性的核酸序列。
在一些实例中，所述核酸序列可在人源细胞或人体内表达蛋白。
在一些实例中，所述蛋白可在人体内：
诱导免疫应答；或
产生生物报告分子；或
用于检测的追踪分子；或
调节基因功能；或
作为治疗性分子。
所述诱导免疫应答包括抗体与细胞介导的免疫应答；
在一些实例中，所述疫苗还包括药学上可接受的佐剂、载体、稀释剂或赋形剂。
在一些实例中，所述疫苗还包括至少一种对COVID-19有治疗作用的药物。
本发明的第二个方面，提供：
一种表达载体，所述的载体含有本发明第一方面所述的核酸序列。
在一些实例中，本发明第一方面所述的核酸序列转录方向与所述载体其它基因的转录方向相反。这样可以进一步保证表达得到的蛋白具有更高的纯度。
在一些实例中，所述的载体为DNA质粒或RNA表达质粒或病毒载体。
在一些实例中，所述的病毒载体为腺病毒载体。特别的，所述腺病毒载体为复制缺陷型Ad5载体。
本发明的第三个方面，提供：
本发明第一方面所述的疫苗的应用，所述应用包括：
制备COVID-19检测试剂；
制备基因功能调节剂。
本发明的有益效果是：
本发明一些实例的疫苗，其含有的S蛋白核酸序列易于在人体细胞表达，可以诱导产生更多的S蛋白，有望作为一种重组病毒疫苗，用于预防SARS-CoV-2感染。
本发明的一些实例，具有较好的安全性。
附图说明
图1是含有密码子优化的S基因核酸序列的质粒转染人源细胞后表达S蛋白的检测结果。
图2是动物免疫原性评价的实验结果，表明Ad5-NB2能够诱异小鼠产生抗体。
具体实施方式
SARS-CoV-2的刺突蛋白(Spike protein，S)的氨基酸序列如YP_009724390.1所示，记为NB1。
真核细胞转录的mRNA前体能够通过不同剪接方式（选择不同的剪接位点组合）产生不同的mRNA剪接异构体的过程，最终导致同一个基因序列产生的不同的蛋白质。这对蛋白的表达是非常不利的。发明人通过对野生型的天然核酸序列进行密码子优化，同时基于自有技术去除潜在的可变剪切位点，保证了蛋白表达的唯一性，减少了蛋白后续纯化的难度。优化得到的核酸序列记为NB2，其具体序列如SEQ ID NO：1所示：
ATGTTCGTGTTTCTGGTGCTGCTGCCTCTGGTGAGCTCCCAGTGCGTGAACCTGACCACAAGGACCCAGCTGCCACCTGCCTATACCAATAGCTTCACACGGGGCGTGTACTATCCCGACAAGGTGTTTAGATCTAGCGTGCTGCACTCCACCCAGGATCTGTTTCTGCCTTTCTTTTCTAACGTGACATGGTTCCACGCCATCCACGTGTCCGGCACCAATGGCACAAAGCGGTTCGACAATCCAGTGCTGCCCTTTAACGATGGCGTGTACTTCGCCTCCACCGAGAAGTCTAACATCATCAGAGGCTGGATCTTTGGCACCACACTGGACAGCAAGACCCAGTCCCTGCTGATCGTGAACAATGCCACAAACGTGGTCATCAAGGTGTGCGAGTTCCAGTTTTGTAATGATCCCTTCCTGGGCGTGTACTATCACAAGAACAATAAGTCTTGGATGGAGAGCGAGTTTAGGGTGTATTCCTCTGCCAACAATTGCACCTTTGAGTACGTGAGCCAGCCTTTCCTGATGGACCTGGAGGGCAAGCAGGGCAATTTCAAGAACCTGAGGGAGTTCGTGTTTAAGAATATCGATGGCTACTTCAAGATCTACTCCAAGCACACACCAATCAACCTGGTGCGCGACCTGCCACAGGGCTTCTCTGCCCTGGAGCCACTGGTGGATCTGCCCATCGGCATCAACATCACCCGGTTTCAGACACTGCTGGCCCTGCACAGAAGCTACCTGACCCCAGGCGACAGCTCCTCTGGATGGACAGCAGGAGCTGCCGCCTACTATGTGGGCTATCTGCAGCCCCGCACCTTCCTGCTGAAGTACAACGAGAATGGCACCATCACAGACGCAGTGGATTGCGCCCTGGACCCCCTGTCTGAGACCAAGTGTACACTGAAGAGCTTTACAGTGGAGAAGGGCATCTACCAGACCAGCAACTTCAGGGTGCAGCCAACAGAGTCCATCGTGCGCTTTCCCAATATCACCAACCTGTGCCCTTTTGGCGAGGTGTTCAATGCCACACGCTTCGCCAGCGTGTACGCCTGGAATAGGAAGCGCATCTCCAACTGCGTGGCCGACTATTCTGTGCTGTACAACAGCGCCTCCTTCTCTACCTTTAAGTGTTATGGCGTGAGCCCCACCAAGCTGAATGATCTGTGCTTTACAAACGTGTACGCCGATTCCTTCGTGATCAGGGGCGACGAGGTGCGCCAGATCGCACCAGGACAGACCGGCAAGATCGCAGACTACAATTATAAGCTGCCTGACGATTTCACAGGCTGCGTGATCGCCTGGAACTCTAACAATCTGGATAGCAAAGTGGGCGGCAACTACAATTATCTGTACCGGCTGTTTAGAAAGTCTAATCTGAAGCCATTCGAGCGGGACATCTCCACCGAGATCTACCAGGCCGGCTCTACACCCTGCAATGGCGTGGAGGGCTTTAACTGTTATTTCCCTCTGCAGTCCTACGGCTTCCAGCCAACCAACGGCGTGGGCTATCAGCCCTACAGAGTGGTGGTGCTGTCTTTTGAGCTGCTGCACGCACCTGCAACCGTGTGCGGCCCAAAGAAGAGCACAAATCTGGTGAAGAACAAGTGCGTGAACTTCAACTTCAACGGACTGACCGGCACAGGCGTGCTGACCGAGAGCAACAAGAAGTTCCTGCCATTTCAGCAGTTCGGCAGGGACATCGCAGATACCACAGACGCCGTGCGCGACCCTCAGACCCTGGAGATCCTGGACATCACACCATGTTCCTTCGGCGGCGTGTCTGTGATCACCCCAGGCACCAATACATCCAACCAGGTGGCCGTGCTGTATCAGGACGTGAATTGCACAGAGGTGCCCGTGGCAATCCACGCAGATCAGCTGACCCCTACATGGCGGGTGTACTCTACCGGCAGCAACGTGTTCCAGACAAGAGCCGGATGCCTGATCGGAGCAGAGCACGTGAACAATAGCTATGAGTGCGACATCCCTATCGGCGCCGGCATCTGTGCCTCCTACCAGACCCAGACAAACTCCCCAAGGAGAGCCCGGTCTGTGGCCAGCCAGTCCATCATCGCCTATACCATGAGCCTGGGCGCCGAGAACAGCGTGGCCTACTCCAACAATTCTATCGCCATCCCTACCAACTTCACAATCAGCGTGACCACAGAGATCCTGCCAGTGAGCATGACCAAGACATCCGTGGACTGCACCATGTATATCTGTGGCGATTCCACAGAGTGTTCTAACCTGCTGCTGCAGTACGGCTCCTTTTGCACCCAGCTGAATAGAGCCCTGACAGGCATCGCCGTGGAGCAGGACAAGAACACCCAGGAGGTGTTCGCCCAGGTGAAGCAGATCTACAAGACACCACCCATCAAGGACTTTGGCGGCTTCAACTTCAGCCAGATCCTGCCCGATCCTAGCAAGCCATCCAAGCGGTCTTTTATCGAGGACCTGCTGTTCAACAAGGTGACCCTGGCCGATGCCGGCTTCATCAAGCAGTATGGCGATTGTCTGGGCGACATCGCCGCCAGAGACCTGATCTGCGCCCAGAAGTTTAATGGCCTGACCGTGCTGCCTCCACTGCTGACAGATGAGATGATCGCACAGTACACCTCTGCCCTGCTGGCCGGCACCATCACAAGCGGATGGACATTCGGCGCAGGAGCCGCCCTGCAGATCCCCTTTGCCATGCAGATGGCCTATCGGTTCAACGGCATCGGCGTGACCCAGAATGTGCTGTACGAGAACCAGAAGCTGATCGCCAATCAGTTTAACAGCGCCATCGGCAAGATCCAGGACTCTCTGAGCTCCACCGCCAGCGCCCTGGGCAAGCTGCAGGATGTGGTGAATCAGAACGCCCAGGCCCTGAATACACTGGTGAAGCAGCTGTCTAGCAACTTCGGCGCCATCTCCTCTGTGCTGAATGACATCCTGAGCCGGCTGGACAAGGTGGAGGCAGAGGTGCAGATCGACCGGCTGATCACCGGCAGACTGCAGTCCCTGCAGACCTACGTGACACAGCAGCTGATCAGGGCAGCAGAGATCAGGGCCTCTGCCAATCTGGCCGCCACAAAGATGAGCGAGTGCGTGCTGGGACAGTCCAAGAGGGTGGACTTTTGCGGCAAGGGCTATCACCTGATGAGCTTCCCACAGTCCGCCCCTCACGGAGTGGTGTTTCTGCACGTGACCTACGTGCCAGCCCAGGAGAAGAACTTCACCACAGCCCCCGCCATCTGTCACGATGGCAAGGCCCACTTTCCTAGGGAGGGCGTGTTCGTGAGCAACGGCACCCACTGGTTTGTGACACAGCGCAATTTCTACGAGCCACAGATCATCACCACAGACAATACCTTCGTGTCCGGCAACTGCGACGTGGTCATCGGCATCGTGAACAATACAGTGTATGATCCTCTGCAGCCAGAGCTGGACTCTTTTAAGGAGGAGCTGGATAAGTACTTCAAGAATCACACCAGCCCCGACGTGGATCTGGGCGACATCTCTGGCATCAATGCCAGCGTGGTGAACATCCAGAAGGAGATCGACAGACTGAACGAGGTGGCCAAGAATCTGAACGAGAGCCTGATCGATCTGCAGGAGCTGGGCAAGTATGAGCAGTACATCAAGTGGCCCTGGTATATCTGGCTGGGCTTCATCGCCGGCCTGATCGCCATCGTGATGGTGACCATCATGCTGTGCTGTATGACAAGCTGCTGTTCCTGCCTGAAGGGCTGCTGTTCTTGTGGCAGCTGCTGTAAGTTTGATGAGGACGATTCCGAGCCTGTGCTGAAGGGCGTGAAGCTGCACTACACCTAA（SEQ ID NO.：1）。
为了降低基因的GC含量，发明人在NB2基础上进一步将密码子优化，合成的序列命名为NB4，具体如下SEQ ID NO.：2所示，NB4和NB2的序列相同性为85.93%。
ATGTTTGTCTTCCTGGTGCTGCTGCCTCTGGTCTCTTCTCAGTGTGTGAACCTGACCACCAGGACACAGCTGCCTCCTGCTTACACCAACTCCTTCACACGGGGCGTCTACTACCCTGACAAGGTCTTCAGGTCCTCTGTGCTGCACTCCACACAAGACCTGTTCCTGCCATTCTTCTCCAACGTGACCTGGTTCCATGCCATCCATGTCTCTGGCACCAATGGCACCAAGAGGTTCGACAACCCTGTGCTGCCATTCAACGACGGCGTCTACTTTGCCTCCACCGAGAAGTCCAACATCATCAGGGGCTGGATCTTTGGCACCACCCTGGACTCCAAGACCCAGTCCCTGCTGATTGTGAACAATGCCACCAACGTGGTGATCAAAGTCTGCGAGTTCCAGTTCTGCAATGACCCATTCCTGGGCGTCTACTACCACAAGAACAACAAGTCCTGGATGGAGTCTGAGTTCAGGGTCTACTCCTCTGCCAACAACTGCACCTTTGAATATGTCTCCCAGCCATTCCTGATGGACCTGGAGGGCAAGCAGGGCAACTTCAAGAACCTGAGGGAGTTCGTCTTCAAGAACATCGACGGCTACTTCAAGATCTACTCCAAGCACACACCCATTAATCTCGTCCGGGATCTGCCTCAGGGCTTCTCTGCCCTGGAGCCCCTGGTGGACCTGCCCATTGGCATCAACATCACACGCTTTCAGACCCTGCTGGCTCTGCACCGGTCTTACCTGACACCTGGCGACTCCTCCTCTGGCTGGACAGCTGGCGCTGCTGCCTACTATGTCGGCTACCTGCAGCCTAGGACCTTCCTGCTGAAGTACAATGAGAATGGCACCATCACAGATGCTGTGGACTGTGCCCTGGACCCCCTGTCTGAGACCAAGTGCACCCTGAAGTCCTTCACAGTCGAGAAGGGCATCTACCAGACCTCCAACTTCCGGGTGCAGCCCACAGAGTCCATTGTCAGGTTCCCCAACATCACCAACCTGTGCCCATTTGGCGAGGTCTTCAATGCCACACGCTTTGCCTCTGTCTATGCCTGGAACAGGAAGAGGATCTCCAACTGTGTGGCTGACTACTCTGTGCTGTACAACTCTGCCTCCTTCTCCACATTTAAGTGCTATGGCGTCTCCCCCACCAAGCTGAATGACCTGTGCTTCACCAATGTCTATGCTGACTCCTTTGTGATCCGGGGCGATGAAGTTAGGCAGATTGCCCCTGGCCAGACAGGCAAGATTGCTGACTACAACTACAAGCTGCCTGATGACTTCACCGGCTGTGTGATTGCCTGGAACTCCAACAACCTGGACTCTAAAGTTGGCGGCAACTACAACTACCTGTACAGGCTGTTCAGGAAGTCCAACCTGAAGCCATTTGAGAGGGACATCTCCACAGAGATCTACCAGGCTGGCTCCACCCCATGCAATGGCGTGGAGGGCTTCAACTGCTACTTCCCCCTGCAATCCTATGGCTTCCAACCCACCAATGGCGTGGGCTACCAGCCATACAGGGTGGTGGTGCTGTCCTTTGAGCTGCTGCATGCCCCTGCCACCGTCTGTGGCCCCAAGAAGTCCACCAACCTCGTGAAGAACAAATGTGTGAACTTCAACTTCAACGGCCTGACAGGCACAGGCGTGCTGACAGAGTCCAACAAGAAGTTCCTGCCATTCCAACAGTTTGGCAGGGACATTGCTGACACCACCGATGCTGTCAGGGACCCCCAGACCCTGGAGATCCTGGACATCACCCCATGCTCCTTTGGCGGCGTCTCTGTGATCACCCCTGGCACCAACACCTCTAATCAAGTCGCTGTGCTGTACCAGGACGTGAACTGCACAGAGGTTCCTGTGGCCATCCATGCTGACCAGCTGACCCCCACCTGGAGGGTCTACTCCACCGGCTCCAATGTCTTCCAAACACGGGCTGGCTGCCTGATTGGCGCTGAGCATGTGAACAACTCCTATGAGTGTGACATCCCCATTGGCGCTGGCATCTGTGCCTCCTACCAAACCCAGACCAACTCCCCTCGGAGGGCTCGCTCTGTGGCTTCTCAGTCTATCATTGCCTACACCATGTCCCTGGGCGCTGAGAACTCTGTGGCCTACTCCAACAACTCCATTGCCATCCCCACCAACTTCACCATCTCTGTGACCACCGAGATCCTGCCTGTCTCCATGACCAAGACCTCTGTGGACTGCACCATGTACATCTGTGGCGACTCCACAGAGTGCTCCAACCTGCTGCTGCAGTATGGCTCCTTCTGCACCCAACTGAACAGGGCCCTGACAGGCATTGCTGTGGAGCAGGACAAGAACACCCAGGAGGTCTTTGCCCAAGTCAAGCAGATCTACAAGACCCCCCCCATCAAGGACTTTGGCGGCTTCAACTTCTCCCAAATCCTGCCTGACCCATCCAAGCCATCCAAGAGGTCCTTCATTGAGGACCTGCTGTTCAACAAGGTTACCCTGGCTGATGCTGGCTTCATCAAGCAGTATGGCGACTGCCTGGGCGACATTGCTGCCAGGGACCTGATCTGTGCCCAAAAGTTCAATGGCCTGACAGTGCTGCCCCCCCTGCTGACCGATGAGATGATTGCCCAGTACACATCTGCTCTGCTGGCTGGCACAATCACCTCTGGCTGGACCTTTGGCGCTGGCGCTGCCCTGCAAATCCCATTTGCCATGCAAATGGCCTACAGGTTCAATGGCATTGGCGTGACCCAGAACGTGCTGTATGAGAACCAGAAGCTGATTGCCAACCAGTTCAACTCTGCCATTGGCAAGATCCAGGACTCCCTGTCCTCCACCGCCTCTGCCCTGGGCAAGCTGCAGGATGTGGTGAACCAGAATGCCCAGGCCCTGAACACCCTGGTGAAGCAGCTGTCCTCCAACTTTGGCGCCATCTCCTCTGTGCTGAATGACATCCTGTCCCGGCTGGACAAGGTGGAGGCTGAGGTGCAGATTGACAGGCTGATCACAGGCAGGCTGCAGTCCCTGCAAACCTATGTGACCCAGCAGCTGATCAGGGCTGCTGAGATCAGGGCCTCTGCCAACCTGGCTGCCACCAAGATGTCTGAATGTGTGCTGGGCCAGTCCAAGAGGGTGGACTTCTGTGGCAAGGGCTACCATCTGATGTCCTTCCCCCAATCTGCCCCCCATGGCGTGGTCTTCCTGCATGTGACCTATGTGCCTGCTCAGGAGAAGAACTTCACCACAGCCCCTGCCATCTGCCATGATGGCAAGGCCCACTTCCCTCGGGAGGGCGTCTTTGTCTCCAATGGCACCCACTGGTTTGTGACCCAGAGGAACTTCTATGAGCCTCAGATCATCACCACAGACAACACCTTTGTCTCTGGCAACTGTGATGTGGTGATTGGCATTGTGAACAACACAGTCTATGACCCCCTGCAGCCTGAGCTGGACTCCTTCAAAGAGGAGCTGGACAAGTACTTCAAGAACCACACCTCCCCTGATGTGGACCTGGGCGACATCTCTGGCATCAATGCCTCTGTGGTGAACATCCAGAAGGAGATTGACAGGCTGAATGAGGTGGCCAAGAACCTGAATGAGTCCCTGATTGACCTGCAAGAGCTGGGCAAGTATGAGCAGTACATCAAGTGGCCATGGTACATCTGGCTGGGCTTCATTGCTGGCCTGATTGCCATTGTGATGGTGACCATCATGCTGTGCTGCATGACCTCCTGCTGCTCCTGCCTGAAAGGCTGCTGCTCCTGTGGCTCCTGCTGCAAGTTTGATGAGGATGACTCTGAGCCTGTGCTGAAGGGCGTGAAGCTGCACTACACCTAATAA（SEQ ID NO.：2）
Spike基因表达载体的构建：
分别以NB1，NB2和NB4为模板，以NB1-F和NB1-R为引物PCR扩增获得NB1片段，以NB2-F和NB2-R为引物PCR扩增获得NB2片段，以NB4-F和NB4-R为引物PCR扩增获得NB4片段后，再分别以各CMV-R和BGH-F为引物，以本公司已有的pGA1-EGFP质粒为模板，PCR扩增载体质粒骨架pGA1后，采用同源重组酶（Exnase）分别与NB1，NB2和NB4片段进行体外二片段重组，得到pGA1-NB1， pGA1-NB2和pGA1-NB4。 将pGA1-NB2采用Bstz17I和SgarAI线性化，采用BJ5183感受态与对应删除E1区唯一酶切位点酶切线性化的pAd5△E1△E3(即Ad5空载体)进行同源重组，构建pAd5-NB2疫苗载体。
扩增NB1的引物序列：
NB1-F：GCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGTTTGTTTTTCTTGT（SEQ IDNO.：3）
NB1-R：AGAATAGGGCCCTCTAGACTAGTTTATGTGTAATGTAATTTG（SEQ ID NO.：4）
扩增NB2的引物序列：
NB2-F：GCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGTTCGTGTTTCTGGT（SEQ IDNO.：5）
NB2-R：AGAATAGGGCCCTCTAGACTAGTTTATCAGGTGTAGTGCAGCTTC（SEQ ID NO.：6）
扩增NB4的引物序列：
NB4-F：GCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGTTTGTCTTCCTGGT（SEQ IDNO.：7）
NB4-R：AGAATAGGGCCCTCTAGACTAGTTTAGGTGTAGTGCAGCTTC（SEQ ID NO.：8）
扩增pGA1的引物序列：
BGH-F: TCTAGAGGGCCCTATTCTATAGTGTC（SEQ ID NO.：9）
CMV-R:GGATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTAAGTTTAAACGCTAGAGTCCGG（SEQ ID NO.：10）
PCR条件：95℃，3min;95℃，30s；60℃ 30s；72℃ 2min；cycles 30； 72℃，5min。
Ad5-NB2载体的拯救与生产
1)按照常规方法，pAd5-NB2以AsiSI线性化，乙醇沉淀回收，阳离子脂质体转染法转染293细胞，转染后8小时，加入2毫升含5%胎牛血清的DMEM培养基，孵育7-10天，观察细胞病变；
2)出毒后，收集细胞及培养上清，在37度水浴及液氮中反复冻融3次并离心去除细胞碎片，上清感染10厘米皿；
3)2-3天后，收集细胞及培养上清，反复冻融3次并离心去除细胞碎片，上清感染3-5个15厘米皿；
4)2-3天后，收集细胞，反复冻融3次并离心去除细胞碎片；上清感染30个15厘米皿2-3天后，收集细胞，反复冻融3次并离心去除细胞碎片；
5)上清加至氯化铯密度梯度离心管；4℃，40000转，离心4小时；
6)吸出病毒条带，脱盐，分装。
以OD260吸光度测定病毒粒子滴度，计算公式为：病毒浓度=OD260×稀释倍数×36/基因组长度(Kb)；病毒储存液于-80℃冻存。
检测Spike基因表达：
按照常规方法，利用阳离子脂质体，分别将2.5ug的pGA-NB1， pGA-NB2和pGA-NB4转染48小时后，收集细胞。用Ad5-NB2和Ad5空载体病毒侵染HEK293细胞，24h后收集细胞。上述四个样品按照常规的Western Blot方法处理样品，并进行蛋白检测（图1）。
可以看出，pGA1-NB1样品中没有检测到S蛋白的表达，而经过密码子优化的pGA1-NB2、pGA1-NB4和疫苗候选株Ad5-NB2样品中能够观察到S蛋白的表达，说明NB2的序列具有意料之外的效果。pGA1-NB4也可以观察到S蛋白的表达，说明与NB2至少85%以上，进一步为86%、90%、95%、98%以上序列相同性的核酸序列均能有限表达相应的蛋白。
动物免疫原性评价
6-8周龄Balb/c小鼠分为5组，每组5只；第0天，分别肌注免疫Ad5-NB2剂量：5×109vp/只，采用肌注和滴鼻两种接种方式；第8天，眼眶取血并分离血清。采用酶联免疫吸附测定（ELISA），以新冠病毒的S蛋白为抗原检测血清中的抗体水平。具体操作为：
1)96孔板，每孔加100ul的 PBS和50ng S蛋白，4℃过夜，16-18小时；
2)吸掉上清，PBST洗一遍，加入200ul 5%脱脂牛奶室温封闭2h；
3)PBST洗2次；
4)加样：加入100ul稀释后的血清样品，37℃孵育2h，用PBST洗5次；
5)加酶标抗体：加入100ul稀释后 HRP标记IgM或IgG二抗，37℃孵育2h；
6)PBST洗6-8次；
7)加底物液显色：加入100ul TMB显色；
8)终止反应：加入50ul 1M硫酸终止反应；
9)结果判定：测OD值，OD值控制在0.1-4。
实验结果表明，Ad5-NB2能够诱异小鼠产生抗体（图2）。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州恩宝生物医药科技有限公司
<120> 一种用于预防SARS-CoV-2感染的腺病毒载体疫苗
<130>
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3822
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgttcgtgt ttctggtgct gctgcctctg gtgagctccc agtgcgtgaa cctgaccaca 60
aggacccagc tgccacctgc ctataccaat agcttcacac ggggcgtgta ctatcccgac 120
aaggtgttta gatctagcgt gctgcactcc acccaggatc tgtttctgcc tttcttttct 180
aacgtgacat ggttccacgc catccacgtg tccggcacca atggcacaaa gcggttcgac 240
aatccagtgc tgccctttaa cgatggcgtg tacttcgcct ccaccgagaa gtctaacatc 300
atcagaggct ggatctttgg caccacactg gacagcaaga cccagtccct gctgatcgtg 360
aacaatgcca caaacgtggt catcaaggtg tgcgagttcc agttttgtaa tgatcccttc 420
ctgggcgtgt actatcacaa gaacaataag tcttggatgg agagcgagtt tagggtgtat 480
tcctctgcca acaattgcac ctttgagtac gtgagccagc ctttcctgat ggacctggag 540
ggcaagcagg gcaatttcaa gaacctgagg gagttcgtgt ttaagaatat cgatggctac 600
ttcaagatct actccaagca cacaccaatc aacctggtgc gcgacctgcc acagggcttc 660
tctgccctgg agccactggt ggatctgccc atcggcatca acatcacccg gtttcagaca 720
ctgctggccc tgcacagaag ctacctgacc ccaggcgaca gctcctctgg atggacagca 780
ggagctgccg cctactatgt gggctatctg cagccccgca ccttcctgct gaagtacaac 840
gagaatggca ccatcacaga cgcagtggat tgcgccctgg accccctgtc tgagaccaag 900
tgtacactga agagctttac agtggagaag ggcatctacc agaccagcaa cttcagggtg 960
cagccaacag agtccatcgt gcgctttccc aatatcacca acctgtgccc ttttggcgag 1020
gtgttcaatg ccacacgctt cgccagcgtg tacgcctgga ataggaagcg catctccaac 1080
tgcgtggccg actattctgt gctgtacaac agcgcctcct tctctacctt taagtgttat 1140
ggcgtgagcc ccaccaagct gaatgatctg tgctttacaa acgtgtacgc cgattccttc 1200
gtgatcaggg gcgacgaggt gcgccagatc gcaccaggac agaccggcaa gatcgcagac 1260
tacaattata agctgcctga cgatttcaca ggctgcgtga tcgcctggaa ctctaacaat 1320
ctggatagca aagtgggcgg caactacaat tatctgtacc ggctgtttag aaagtctaat 1380
ctgaagccat tcgagcggga catctccacc gagatctacc aggccggctc tacaccctgc 1440
aatggcgtgg agggctttaa ctgttatttc cctctgcagt cctacggctt ccagccaacc 1500
aacggcgtgg gctatcagcc ctacagagtg gtggtgctgt cttttgagct gctgcacgca 1560
cctgcaaccg tgtgcggccc aaagaagagc acaaatctgg tgaagaacaa gtgcgtgaac 1620
ttcaacttca acggactgac cggcacaggc gtgctgaccg agagcaacaa gaagttcctg 1680
ccatttcagc agttcggcag ggacatcgca gataccacag acgccgtgcg cgaccctcag 1740
accctggaga tcctggacat cacaccatgt tccttcggcg gcgtgtctgt gatcacccca 1800
ggcaccaata catccaacca ggtggccgtg ctgtatcagg acgtgaattg cacagaggtg 1860
cccgtggcaa tccacgcaga tcagctgacc cctacatggc gggtgtactc taccggcagc 1920
aacgtgttcc agacaagagc cggatgcctg atcggagcag agcacgtgaa caatagctat 1980
gagtgcgaca tccctatcgg cgccggcatc tgtgcctcct accagaccca gacaaactcc 2040
ccaaggagag cccggtctgt ggccagccag tccatcatcg cctataccat gagcctgggc 2100
gccgagaaca gcgtggccta ctccaacaat tctatcgcca tccctaccaa cttcacaatc 2160
agcgtgacca cagagatcct gccagtgagc atgaccaaga catccgtgga ctgcaccatg 2220
tatatctgtg gcgattccac agagtgttct aacctgctgc tgcagtacgg ctccttttgc 2280
acccagctga atagagccct gacaggcatc gccgtggagc aggacaagaa cacccaggag 2340
gtgttcgccc aggtgaagca gatctacaag acaccaccca tcaaggactt tggcggcttc 2400
aacttcagcc agatcctgcc cgatcctagc aagccatcca agcggtcttt tatcgaggac 2460
ctgctgttca acaaggtgac cctggccgat gccggcttca tcaagcagta tggcgattgt 2520
ctgggcgaca tcgccgccag agacctgatc tgcgcccaga agtttaatgg cctgaccgtg 2580
ctgcctccac tgctgacaga tgagatgatc gcacagtaca cctctgccct gctggccggc 2640
accatcacaa gcggatggac attcggcgca ggagccgccc tgcagatccc ctttgccatg 2700
cagatggcct atcggttcaa cggcatcggc gtgacccaga atgtgctgta cgagaaccag 2760
aagctgatcg ccaatcagtt taacagcgcc atcggcaaga tccaggactc tctgagctcc 2820
accgccagcg ccctgggcaa gctgcaggat gtggtgaatc agaacgccca ggccctgaat 2880
acactggtga agcagctgtc tagcaacttc ggcgccatct cctctgtgct gaatgacatc 2940
ctgagccggc tggacaaggt ggaggcagag gtgcagatcg accggctgat caccggcaga 3000
ctgcagtccc tgcagaccta cgtgacacag cagctgatca gggcagcaga gatcagggcc 3060
tctgccaatc tggccgccac aaagatgagc gagtgcgtgc tgggacagtc caagagggtg 3120
gacttttgcg gcaagggcta tcacctgatg agcttcccac agtccgcccc tcacggagtg 3180
gtgtttctgc acgtgaccta cgtgccagcc caggagaaga acttcaccac agcccccgcc 3240
atctgtcacg atggcaaggc ccactttcct agggagggcg tgttcgtgag caacggcacc 3300
cactggtttg tgacacagcg caatttctac gagccacaga tcatcaccac agacaatacc 3360
ttcgtgtccg gcaactgcga cgtggtcatc ggcatcgtga acaatacagt gtatgatcct 3420
ctgcagccag agctggactc ttttaaggag gagctggata agtacttcaa gaatcacacc 3480
agccccgacg tggatctggg cgacatctct ggcatcaatg ccagcgtggt gaacatccag 3540
aaggagatcg acagactgaa cgaggtggcc aagaatctga acgagagcct gatcgatctg 3600
caggagctgg gcaagtatga gcagtacatc aagtggccct ggtatatctg gctgggcttc 3660
atcgccggcc tgatcgccat cgtgatggtg accatcatgc tgtgctgtat gacaagctgc 3720
tgttcctgcc tgaagggctg ctgttcttgt ggcagctgct gtaagtttga tgaggacgat 3780
tccgagcctg tgctgaaggg cgtgaagctg cactacacct aa 3822
<210> 2
<211> 3825
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgtttgtct tcctggtgct gctgcctctg gtctcttctc agtgtgtgaa cctgaccacc 60
aggacacagc tgcctcctgc ttacaccaac tccttcacac ggggcgtcta ctaccctgac 120
aaggtcttca ggtcctctgt gctgcactcc acacaagacc tgttcctgcc attcttctcc 180
aacgtgacct ggttccatgc catccatgtc tctggcacca atggcaccaa gaggttcgac 240
aaccctgtgc tgccattcaa cgacggcgtc tactttgcct ccaccgagaa gtccaacatc 300
atcaggggct ggatctttgg caccaccctg gactccaaga cccagtccct gctgattgtg 360
aacaatgcca ccaacgtggt gatcaaagtc tgcgagttcc agttctgcaa tgacccattc 420
ctgggcgtct actaccacaa gaacaacaag tcctggatgg agtctgagtt cagggtctac 480
tcctctgcca acaactgcac ctttgaatat gtctcccagc cattcctgat ggacctggag 540
ggcaagcagg gcaacttcaa gaacctgagg gagttcgtct tcaagaacat cgacggctac 600
ttcaagatct actccaagca cacacccatt aatctcgtcc gggatctgcc tcagggcttc 660
tctgccctgg agcccctggt ggacctgccc attggcatca acatcacacg ctttcagacc 720
ctgctggctc tgcaccggtc ttacctgaca cctggcgact cctcctctgg ctggacagct 780
ggcgctgctg cctactatgt cggctacctg cagcctagga ccttcctgct gaagtacaat 840
gagaatggca ccatcacaga tgctgtggac tgtgccctgg accccctgtc tgagaccaag 900
tgcaccctga agtccttcac agtcgagaag ggcatctacc agacctccaa cttccgggtg 960
cagcccacag agtccattgt caggttcccc aacatcacca acctgtgccc atttggcgag 1020
gtcttcaatg ccacacgctt tgcctctgtc tatgcctgga acaggaagag gatctccaac 1080
tgtgtggctg actactctgt gctgtacaac tctgcctcct tctccacatt taagtgctat 1140
ggcgtctccc ccaccaagct gaatgacctg tgcttcacca atgtctatgc tgactccttt 1200
gtgatccggg gcgatgaagt taggcagatt gcccctggcc agacaggcaa gattgctgac 1260
tacaactaca agctgcctga tgacttcacc ggctgtgtga ttgcctggaa ctccaacaac 1320
ctggactcta aagttggcgg caactacaac tacctgtaca ggctgttcag gaagtccaac 1380
ctgaagccat ttgagaggga catctccaca gagatctacc aggctggctc caccccatgc 1440
aatggcgtgg agggcttcaa ctgctacttc cccctgcaat cctatggctt ccaacccacc 1500
aatggcgtgg gctaccagcc atacagggtg gtggtgctgt cctttgagct gctgcatgcc 1560
cctgccaccg tctgtggccc caagaagtcc accaacctcg tgaagaacaa atgtgtgaac 1620
ttcaacttca acggcctgac aggcacaggc gtgctgacag agtccaacaa gaagttcctg 1680
ccattccaac agtttggcag ggacattgct gacaccaccg atgctgtcag ggacccccag 1740
accctggaga tcctggacat caccccatgc tcctttggcg gcgtctctgt gatcacccct 1800
ggcaccaaca cctctaatca agtcgctgtg ctgtaccagg acgtgaactg cacagaggtt 1860
cctgtggcca tccatgctga ccagctgacc cccacctgga gggtctactc caccggctcc 1920
aatgtcttcc aaacacgggc tggctgcctg attggcgctg agcatgtgaa caactcctat 1980
gagtgtgaca tccccattgg cgctggcatc tgtgcctcct accaaaccca gaccaactcc 2040
cctcggaggg ctcgctctgt ggcttctcag tctatcattg cctacaccat gtccctgggc 2100
gctgagaact ctgtggccta ctccaacaac tccattgcca tccccaccaa cttcaccatc 2160
tctgtgacca ccgagatcct gcctgtctcc atgaccaaga cctctgtgga ctgcaccatg 2220
tacatctgtg gcgactccac agagtgctcc aacctgctgc tgcagtatgg ctccttctgc 2280
acccaactga acagggccct gacaggcatt gctgtggagc aggacaagaa cacccaggag 2340
gtctttgccc aagtcaagca gatctacaag acccccccca tcaaggactt tggcggcttc 2400
aacttctccc aaatcctgcc tgacccatcc aagccatcca agaggtcctt cattgaggac 2460
ctgctgttca acaaggttac cctggctgat gctggcttca tcaagcagta tggcgactgc 2520
ctgggcgaca ttgctgccag ggacctgatc tgtgcccaaa agttcaatgg cctgacagtg 2580
ctgccccccc tgctgaccga tgagatgatt gcccagtaca catctgctct gctggctggc 2640
acaatcacct ctggctggac ctttggcgct ggcgctgccc tgcaaatccc atttgccatg 2700
caaatggcct acaggttcaa tggcattggc gtgacccaga acgtgctgta tgagaaccag 2760
aagctgattg ccaaccagtt caactctgcc attggcaaga tccaggactc cctgtcctcc 2820
accgcctctg ccctgggcaa gctgcaggat gtggtgaacc agaatgccca ggccctgaac 2880
accctggtga agcagctgtc ctccaacttt ggcgccatct cctctgtgct gaatgacatc 2940
ctgtcccggc tggacaaggt ggaggctgag gtgcagattg acaggctgat cacaggcagg 3000
ctgcagtccc tgcaaaccta tgtgacccag cagctgatca gggctgctga gatcagggcc 3060
tctgccaacc tggctgccac caagatgtct gaatgtgtgc tgggccagtc caagagggtg 3120
gacttctgtg gcaagggcta ccatctgatg tccttccccc aatctgcccc ccatggcgtg 3180
gtcttcctgc atgtgaccta tgtgcctgct caggagaaga acttcaccac agcccctgcc 3240
atctgccatg atggcaaggc ccacttccct cgggagggcg tctttgtctc caatggcacc 3300
cactggtttg tgacccagag gaacttctat gagcctcaga tcatcaccac agacaacacc 3360
tttgtctctg gcaactgtga tgtggtgatt ggcattgtga acaacacagt ctatgacccc 3420
ctgcagcctg agctggactc cttcaaagag gagctggaca agtacttcaa gaaccacacc 3480
tcccctgatg tggacctggg cgacatctct ggcatcaatg cctctgtggt gaacatccag 3540
aaggagattg acaggctgaa tgaggtggcc aagaacctga atgagtccct gattgacctg 3600
caagagctgg gcaagtatga gcagtacatc aagtggccat ggtacatctg gctgggcttc 3660
attgctggcc tgattgccat tgtgatggtg accatcatgc tgtgctgcat gacctcctgc 3720
tgctcctgcc tgaaaggctg ctgctcctgt ggctcctgct gcaagtttga tgaggatgac 3780
tctgagcctg tgctgaaggg cgtgaagctg cactacacct aataa 3825
<210> 3
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcgtttaaac ttaagcttgg taccgagctc ggatccgcca ccatgtttgt ttttcttgt 59
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
agaatagggc cctctagact agtttatgtg taatgtaatt tg 42
<210> 5
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gcgtttaaac ttaagcttgg taccgagctc ggatccgcca ccatgttcgt gtttctggt 59
<210> 6
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
agaatagggc cctctagact agtttatcag gtgtagtgca gcttc 45
<210> 7
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gcgtttaaac ttaagcttgg taccgagctc ggatccgcca ccatgtttgt cttcctggt 59
<210> 8
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
agaatagggc cctctagact agtttaggtg tagtgcagct tc 42
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tctagagggc cctattctat agtgtc 26
<210> 10
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ggatccgagc tcggtaccaa gcttaagttt aaacgctaga gtccgg 46

Claims (10)

1.一种用于预防SARS-CoV-2感染的疫苗，其特征在于：所述疫苗包括：如SEQ ID NO：1所示的核酸序列。
2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述核酸序列可在人源细胞或人体内表达蛋白。
3.根据权利要求2所述疫苗，其特征在于：所述蛋白可在人体内：
诱导免疫应答；或
产生生物报告分子；或
用于检测的追踪分子；或
调节基因功能；或
作为治疗性分子。
4.根据权利要求1～3任一项所述疫苗，其特征在于：还包括药学上可接受的佐剂、载体、稀释剂或赋形剂。
5.根据权利要求1～3任一项所述疫苗，其特征在于：还包括至少一种对COVID-19有治疗作用的药物。
6.一种表达载体，其特征在于：所述的载体含有权利要求1所述的核酸序列。
7.权利要求6所述的表达载体，其特征在于：所述的载体为DNA质粒、RNA表达质粒或病毒载体。
8.权利要求7所述的表达载体，其特征在于：所述的病毒载体为腺病毒载体。
9.根据权利要求8所述的腺病毒载体，其特征在于：权利要求1所述的核酸分子转录方向与所述载体其它基因的转录方向相反。
10.权利要求1所述的疫苗的应用，所述应用包括：
制备COVID-19检测试剂；
制备基因功能调节剂。
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