WO2021184987A1

WO2021184987A1 - 一种用于预防SARS-CoV-2感染的Ad7载体疫苗

Info

Publication number: WO2021184987A1
Application number: PCT/CN2021/074837
Authority: WO
Inventors: 陈凌; 关素华; 杨臣臣; 汪乾
Original assignee: 广州恩宝生物医药科技有限公司
Priority date: 2020-03-16
Filing date: 2021-02-02
Publication date: 2021-09-23
Also published as: EP3922263A4; EP3922263A1; US20230127808A1

Abstract

提供了一种用于预防SARS-CoV-2感染的Ad7载体疫苗，该疫苗包括负载有SEQ ID NO：1所示核酸序列的Ad7载体。该疫苗可以和其他疫苗联用，也可以作为新冠肺炎的治疗性疫苗。

Description

一种用于预防SARS-CoV-2感染的Ad7载体疫苗

技术领域

本发明涉及一种用于预防SARS-CoV-2感染的Ad7载体疫苗。

背景技术

疫苗是预防和控制新型冠状病毒感染最经济有效的干预措施。已公布的一百多个SARS-CoV-2病毒基因组比对的结果显示病毒整体突变程度较低，未发生重组现象。因此，如果SARS-CoV-2疫苗研发成功，必将能够保护人群免受新冠病毒的感染，从而抑制新疫情的暴发。

SARS-CoV-2冠状病毒的病毒颗粒结构中，组成“皇冠”的S-蛋白是一个明显的靶点，成为大多数研究团队研究的重点。已有研究团队通过对S蛋白三维结构计算机模拟，成功地揭示了S蛋白与其侵入细胞过程中的受体ACE2的关系。因此，S蛋白在介导病毒粒子与宿主细胞受体的结合以及诱导中和抗体中起重要作用。

SARS-CoV-2的全序列如NC_045512.2所示，该序列的21563..25384核酸为刺突蛋白(Spike protein，S)的编码序列。S蛋白是病毒粒子的一种主要结构蛋白，在介导病毒粒子与宿主细胞受体的结合以及诱导中和抗体中起重要作用。因此，以S蛋白为抗原的疫苗，包括核酸疫苗，亚单位疫苗和病毒载体疫苗，其S蛋白的表达水平、蛋白结构决定了疫苗的有效性。

然而实验表面，天然的SARS-CoV-2的刺突蛋白S基因在人肾细胞HEK293表达水平很低，因此如果以原始的S密码子来表达为抗原，其疫苗可能无效或是效价很低，不足以抵抗病毒的感染。

腺病毒是疫苗研发与基因治疗中常用的载体，被广泛应用于生物医学领域。与其它病毒载体比，腺病毒低毒性，感染腺病毒只引起轻微的感冒症状。目前大多数研究团队开发的腺病毒载体疫苗都是基于5型腺病毒。人群中针对5型腺病毒载体的预存抗体比例很高，一定程度影响5型腺病毒载体疫苗效价。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种有望用于预防SARS-CoV-2感染的腺病毒载体疫苗。

本发明通过将优化的S基因整合到Ad7载体，特别是复制缺陷型Ad7载体上，通过腺病毒感染细胞，呈递新冠病毒抗原，免疫后使机体产生特异性免疫反应，从而阻断新冠病毒的感染。

本发明所采取的技术方案是：

一种用于预防SARS-CoV-2感染的腺病毒载体疫苗，包括负载有SEQ ID NO：1所示核酸序列的Ad7载体。

为了进一步提高疫苗的安全性，在一些实例中，所述Ad7载体为复制缺陷型Ad7载体。

在一些实例中，所述复制缺陷型Ad7载体为缺失E1和E3区基因的复制缺陷型Ad7载体。

在一些实例中，所述核酸序列可在人源细胞或人体内表达蛋白。

在一些实例中，所述蛋白可在人体内：

诱导免疫应答；或

产生生物报告分子；或

用于检测的追踪分子；或

调节基因功能；或

作为治疗性分子。

在一些实例中，还包括药学上可接受的佐剂、载体、稀释剂或赋形剂。可以根据具体的需要选择适合的佐剂、载体、稀释剂或赋形剂中的至少一种。

在一些实例中，还包括至少一种对COVID-19有治疗作用的药物。

在一些实例中，所述腺病毒载体疫苗的剂型包括但不限于口服剂、注射剂、气雾吸入剂等常见的疫苗剂型。

在一些实例中，所述腺病毒载体疫苗还可以和其他疫苗联用。

为进一步提高产品的安全性，在一些实例中，所述Ad7载体可以调控SEQ ID NO：1所示核酸序列的表达。

为保证SEQ ID NO：1所示核酸序列更为高效的表达，在一些实例中，SEQ ID NO：1所示核酸序列的转录方向与所述Ad7载体其它基因的转录方向相反。

本发明的有益效果是：

本发明的一些实例，具有较好的安全性，使用方便。实验表明其在人体细胞中可以产生更多的S蛋白。有望开发为用于预防SARS-CoV-2感染的Ad7载体疫苗。

本发明的一些实例，可以和其他疫苗联用，也可作为新冠肺炎的治疗性疫苗，在患者被感染初期接种，快速诱导人体内免疫反应，达到治疗效果。

附图说明

图1是S蛋白表达的检测结果。

图2是小鼠免疫28天后血清中结合抗体的检测结果。

图3是猕猴免疫后不同时间血清中结合抗体检测结果。

图4是猕猴免疫18天后外周血PBMCs细胞ELISpot检测结果。

具体实施方式

SARS-CoV-2的刺突蛋白(Spike protein，S)的氨基酸序列如YP_009724390.1所示，记为NB1。

真核细胞转录的mRNA前体能够通过不同剪接方式(选择不同的剪接位点组合)产生不同的mRNA剪接异构体的过程，最终导致同一个基因序列产生的不同的蛋白质。这对蛋白的表达是非常不利的。发明人通过对野生型的天然核酸序列进行密码子优化，同时基于自有技术去除潜在的可变剪切位点，保证了蛋白表达的唯一性，减少了蛋白后续纯化的难度。优化得到的核酸序列记为NB2，其具体序列如SEQ ID NO：1所示：

Ad7表达S蛋白载体pAd7-NB2的构建：

分别以NB1和NB2为模板，以NB1-F和NB1-R为引物PCR扩增获得NB1片段，以 NB2-F和NB2-R为引物PCR扩增获得NB2片段后，再分别以各CMV-R和BGH-F为引物，以pGA1-EGFP质粒为模板，PCR扩增载体质粒骨架pGK后，采用同源重组酶(Exnase)分别与NB1和NB2片段进行体外二片段重组，得到pGK-NB1和pGK-NB2。将pGK-NB2采用Bstz17I和SgarAI线性化，采用BJ5183感受态与对应删除E1区唯一酶切位点酶切线性化的pAd7△E1△E3(即Ad7空载体)进行同源重组，构建pAd7-NB2疫苗载体。

扩增NB1的引物序列：

NB1-F：GCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGTTTGTTTTTCTTGT(SEQ ID NO.：2)

NB1-R：AGAATAGGGCCCTCTAGACTAGTTTATGTGTAATGTAATTTG(SEQ ID NO.：3)

扩增NB2的引物序列：

NB2-F：GCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGTTCGTGTTTCTGGT(SEQ ID NO.：4)

NB2-R：AGAATAGGGCCCTCTAGACTAGTTTATCAGGTGTAGTGCAGCTTC(SEQ ID NO.：5)

扩增pGK的引物序列：

BGH-F：TCTAGAGGGCCCTATTCTATAGTGTC(SEQ ID NO.：6)

CMV-R：GGATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTAAGTTTAAACGCTAGAGTCCGG(SEQ ID NO.：7)

PCR条件：95℃，3min；95℃，30s；60℃ 30s；72℃ 2min；cycles 30；72℃，5min。

Ad7-NB2载体的拯救与生产

1)按照常规方法，pAd7-NB2以AsiSI线性化，乙醇沉淀回收，阳离子脂质体转染法转染293细胞；

2)转染后8小时，加入2毫升含5％胎牛血清的DMEM培养基，孵育7～10天，观察细胞病变；

3)出毒后，收集细胞及培养上清，在37℃水浴及液氮中反复冻融3次并离心去除细胞碎片，上清感染10厘米皿；

4)2～3天后，收集细胞及培养上清，反复冻融3次并离心去除细胞碎片，上清感染3～5个15厘米皿；

5)2～3天后，收集细胞，反复冻融3次并离心去除细胞碎片；

6)上清感染30个15厘米皿2～3天后，收集细胞，反复冻融3次并离心去除细胞碎片；

7)上清加至氯化铯密度梯度离心管；4℃，40000转，离心4小时；吸出病毒条带，脱盐，分装；

8)以OD260吸光度测定病毒粒子滴度，计算公式为：病毒浓度＝OD260×稀释倍数×36/基因组长度(Kb)；病毒储存液于-80℃冻存。

检测Spike基因表达：

按照常规方法，利用阳离子脂质体，分别将2.5ug的pGK-NB1和pGK-NB2，转染48小时后，收集细胞。用Ad7-NB2和Ad7空载体病毒侵染HEK293细胞，24h后收集细胞。上述四个样品按照常规的WesternBlot方法处理样品，并进行蛋白检测(图1)。

从图1可以看出，pGK-NB1样品中没有检测到S蛋白的表达，而经过密码子优化的pGK-NB2和疫苗候选株Ad7-NB2样品中能够观察到S蛋白的表达，说明NB2的序列具有意料之外的效果。

Ad7-NB2疫苗免疫原性评价：

1、免疫小鼠

设计Ad7-NB2疫苗在小鼠中免疫原性评价方案，如表1所示，按照设计的免疫方案进行免疫。

表1

选取6～8周龄Balb/c小鼠，分为2组，每组5只。采取肌注免疫的方式，G1组为实验对照组，免疫GT101(病毒保存液)，G2组为实验组免疫Ad7-NB2疫苗，每只免疫剂量为5×10 ⁹VP。免疫后第28天，眼眶采血分离血清，测定SARS-ncov2的S蛋白结合抗体水平。结果如图2所示，实验组免疫后可产生高效价抗SARS-ncov2 S 蛋白的结合抗体。

2、免疫猕猴

猕猴来自广东蓝岛生物技术有限公司。接种疫苗的猕猴年龄为2-3岁。随机分为3组，实验组每组2只，对照组4只，具体如表2：

表2

用Ad7-NB2毒株制备疫苗免疫猕猴，分别于免疫后14天、18天取血采用ELISA法测定抗体结合效价，分离外周血用ELISpot法检测细胞免疫反应。

实验结果：

(1)结合抗体

肌肉注射接种后14、18天，肌肉注射1×10 ¹¹VP的所有猕猴血清中均能检测到显著的S和RBD特异性IgG，免疫组2只中，有1只可检测出显著的针对S2的IgG(图3)。

滴鼻免疫接种14天后，接种1×10 ¹¹VP的免疫组2只重，有1只能检测到显著的S和RBD特异性IgG，免疫组重所有猕猴均能被检测出针对S2的IgG。免疫18天后，针对S，S2的特异性IgG均能被检出，免疫组2只中，有1只能被检出针对RBD的显著的特异性IgG反应(图3)。

肌注免疫和滴鼻免疫所诱导产生的抗体效价相差不大。

(2)细胞免疫

为了确定Ad7-NB2是否也能引起非人灵长类动物(NHPs)的细胞免疫反应，我们检测了外周血单个核细胞(PBMCs)中S-特异性IFN-γ分泌细胞对S1和S2肽库的反应。

结果表明：

1)肌注免疫接种后第18天，肌肉注射1×10 ¹¹VP的所有猕猴全部对S1和S2肽库有细胞免疫反应(图4)。

2)滴鼻免疫接种后第18天，2只接种的猕猴中，1只对S1肽库有弱的细胞免疫反应，第18天时对S2均无明显反应(图4)。

因此，在猕猴中，细胞免疫反应主要针对S1区。这一结果表明，疫苗肌注免疫可引起系统性细胞免疫反应对S蛋白的反应，特别是对S1区的反应，而在疫苗黏膜免疫接种引起的系统性细胞免疫反应要较弱。

以上实验结果表明，疫苗可刺激猕猴产生细胞免疫，可能进一步提升对机体的保护作用。

Claims

一种用于预防SARS-CoV-2感染的腺病毒载体疫苗，包括负载有SEQ ID NO：1所示核酸序列的Ad7载体。
根据权利要求1所述的腺病毒载体疫苗，其特征在于：所述Ad7载体为复制缺陷型Ad7载体。
根据权利要求2所述的腺病毒载体疫苗，其特征在于：所述复制缺陷型Ad7载体为缺失E1和E3区基因的复制缺陷型Ad7载体。
根据权利要求1～3任一项所述的腺病毒载体疫苗，其特征在于：所述核酸序列可在人源细胞或人体内表达蛋白。
根据权利要求4所述的腺病毒载体疫苗，其特征在于：所述蛋白可在人体内：

诱导免疫应答；或

产生生物报告分子；或

用于检测的追踪分子；或

调节基因功能；或

作为治疗性分子。
根据权利要求1～3任一项所述的腺病毒载体疫苗，其特征在于：还包括药学上可接受的佐剂、载体、稀释剂或赋形剂。
根据权利要求1～3任一项所述的腺病毒载体疫苗，其特征在于：还包括至少一种对COVID-19有治疗作用的药物。
根据权利要求1～3任一项所述的腺病毒载体疫苗，其特征在于：所述Ad7载体可以调控SEQ ID NO：1所示核酸序列的表达。
根据权利要求1～3任一项所述的腺病毒载体疫苗，其特征在于：SEQ ID NO：1所示核酸序列的转录方向与所述Ad7载体其它基因的转录方向相反。