CN114150004B - 表达SARS-CoV-2奥密克戎突变株病毒抗原肽的核酸序列及其应用 - Google Patents

表达SARS-CoV-2奥密克戎突变株病毒抗原肽的核酸序列及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供表达SARS‑CoV‑2奥密克戎突变株病毒抗原肽的核酸序列及其应用。奥密克戎株原始的S基因序列蛋白不能有效在细胞内高效表达；本发明采用密码子偏好性进行优化得到新的S基因序，使其能高效在人源细胞内高效表达，产生相应的多肽，诱导产生相应的免疫保护反应，为SARS‑CoV‑2奥密克戎株的疫苗的研发提供基础。

Description

表达SARS-CoV-2奥密克戎突变株病毒抗原肽的核酸序列及其 应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及表达SARS-CoV-2奥密克戎突变株病毒抗原肽的核酸序列及其应用。
背景技术
面对新冠肺炎疫情，做好预防，阻断病毒的传播是控制疫情的关键。疫苗是预防和控制新型冠状病毒感染最经济有效的干预措施。SARS-CoV-2冠状病毒的病毒颗粒结构中，组成“皇冠”的S-蛋白是一个明显的靶点，成为大多数研究团队研究的重点。已有研究团队通过对S蛋白三维结构计算机模拟，成功地揭示了S蛋白与其侵入细胞过程中的受体ACE2的关系。因此，S蛋白在介导病毒粒子与宿主细胞受体的结合以及诱导中和抗体中起重要作用。根据研究报道，S蛋白存在融合前构象和融合后构象，S蛋白与宿主细胞的ACEII受体结合，通过宿主细胞的弗林蛋白酶进行切割，使蛋白分为S1和S2，促进病毒囊膜与宿主细胞膜融合实现病毒的感染入侵，融合后产生的抗体多为结合抗体，没有中和作用，所以在疫苗研发设计中如何维持S蛋白保持融合前构象是疫苗研发成功的关键。
根据世界卫生组织报告，有一最新突变株，奥密克戎株，其致病力和传播力均大大的增强。并且奥密克戎突变株其S基因发生至少27个突变之多，现有的疫苗对奥密克戎突变株免疫保护效果极差，极易逃逸现有疫苗中和抗体的中和作用，极大的削弱了目前疫苗的免疫保护作用，有取代Delta突变株的趋势。目前上市疫苗为灭活疫苗、亚单位蛋白疫苗、mRNA疫苗和腺病毒载体疫苗，这些疫苗主要针对的是原始株SARS-CoV-2，其对奥密克戎突变株的保护效果均有下降，都不能做到免疫后对奥密克戎株产生十分理想的免疫效果。此外，天然的SARS-CoV-2的刺突蛋白S基因在人肾细胞HEK293表达水平很低，因此如果以SARS-CoV-2奥密克戎株原始的S密码子来表达为抗原，其SARS-CoV-2奥密克戎株原始的S基因序列蛋白不能有效在细胞内高效表达，其疫苗可能无效或效价很低，不足以抵抗病毒的感染。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能表达对SARS-CoV-2，特别是奥密克戎（Omicron）突变株，引起免疫原性的多肽的核酸序列及其应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种核酸分子，所述核酸分子包含以下核酸序列：
ａ）SEQ ID NO：2所示核酸序列；或
ｂ）与SEQ ID NO：2具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%序列同源性的核酸序列。
在一些实例中，所述核酸分子用于表达对SARS-CoV-2引起免疫原性的蛋白。在一些实例中，所述核酸分子用于表达对SARS-CoV-2奥密克戎突变株引起免疫原性的蛋白。在一些实例中，所述核酸分子用于表达对SARS-CoV-2原始株、SARS-CoV-2 Delta突变株、SARS-CoV-2 Alpha突变株、SARS-CoV-2 Beta突变株、SARS-CoV-2 Gamma突变株中的一种或多种引起免疫原性的蛋白。
在一些实例中，所述核酸分子或其表达的蛋白用于预防或治疗SARS-CoV-2引发的感染。在一些实例中，所述核酸分子或其表达的蛋白用于预防或治疗SARS-CoV-2奥密克戎突变株引发的感染。在一些实例中，所述核酸分子或其表达的多肽用于预防或治疗SARS-CoV-2原始株、SARS-CoV-2 Delta突变株、SARS-CoV-2 Alpha突变株、SARS-CoV-2 Beta突变株、SARS-CoV-2 Gamma突变株中的一种或多种引发的感染。
在一些实例中，所述蛋白可在人体内：
诱导免疫应答；和／或
产生生物报告分子；和／或
产生用于检测的分子；和／或
调节基因功能；和／或
成为治疗性分子。
所述诱导免疫应答包括抗体与细胞介导的免疫应答。
本发明的第二个方面，提供：一种表达载体，所述的载体含有本发明第一方面的核酸分子。
在一些实例中，所述的载体为DNA质粒、RNA表达质粒或病毒载体。
在一些实例中，所述的病毒载体为腺病毒载体。
本发明的第三个方面，提供：一种表达细胞，所述表达细胞可基于本发明第一方面的核酸分子表达蛋白。
在一些实例中，所述表达细胞是采用本发明第二方面所述表达载体转化或转染的宿主细胞。在一些实施方式中，所述表达细胞不包括繁殖材料。
本发明的第四个方面，提供：一种核酸组合物，所述核酸组合物包括本发明第一方面的核酸分子、或本发明第二方面所述表达载体。
在一些实例中，所述核酸组合物还包括药学上可接受的佐剂、载体、稀释剂或赋形剂中的至少一种。
本方面的第五个方面，提供，本发明第四方面所述核酸组合物在预防或治疗SARS-CoV-2引发的感染的药物中的应用。
在一些实例中，所述感染是SARS-CoV-2奥密克戎突变株引发的感染。
在一些实例中，所述感染是SARS-CoV-2原始株、SARS-CoV-2 Delta突变株、SARS-CoV-2 Alpha突变株、SARS-CoV-2 Beta突变株、SARS-CoV-2 Gamma突变株中的一种或多种引发的感染。
本发明的第六个方面，提供，一种预防或治疗SARS-CoV-2株引发的感染的方法，包括给予有需要的受试者预防有效量或治疗有效量的本发明第四方面所述的核酸组合物。
在一些实例中，所述感染是SARS-CoV-2奥密克戎突变株引发的感染。
在一些实例中，所述感染是SARS-CoV-2原始株、SARS-CoV-2 Delta突变株、SARS-CoV-2 Alpha突变株、SARS-CoV-2 Beta突变株、SARS-CoV-2 Gamma突变株中的一种或多种引发的感染。
根据本发明的前述方面，在一些实例中，本发明所述SARS-CoV-2原始株的刺突蛋白（Spike protein，S）的氨基酸序列如NCBI登录号YP_009724390.1所示。在一些实例中，本发明所述SARS-CoV-2原始株的全基因组序列如NCBI登录号NC_045512.2所示。
本发明的有益效果是：
1）SARS-CoV-2奥密克戎株原始的S基因序列蛋白不能有效在细胞内高效表达，我们采用密码子偏好性进行优化得到新的S基因序，其能高效在人源细胞内高效表达，产生相应的多肽，诱导产生相应的免疫保护反应。
2）优化的序列在人体或人源性细胞内表达后，可诱导产生较高滴度的针对奥密克戎株SARS-CoV-2的中和抗体，可以有效保护机体免受奥密克戎株的侵染；还可诱导针对SARS-CoV-2原始株以及其他类型突变株的特异性抗体，发挥多重保护作用。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图，而并不超出本申请要求保护的范围。
图1是pAd35-S50构建的流程图。
图2是分别转染等量的pGA1-S-Ori、PGA1-S50，PGA261-S50和PGA351-S50后 S 蛋白的表达结果。
图3是pAd35-S50的病毒纯化图。
图4是Ad35-S50免疫小鼠针对新冠病毒Omicron株的血清结合抗体水平。
图5是Ad35-S50免疫小鼠针对新冠病毒原始株的血清结合抗体水平。
图6是Ad35-S50免疫小鼠针对新冠病毒Delta株的血清结合抗体水平。
图7是Ad35-S50免疫小鼠的血清中和抗体水平。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
SARS-CoV-2的刺突蛋白（Spike protein，S）的核酸序列如GISAID：EPI_ISL_6640916所示, 命名为SEQ ID NO：1。真核细胞转录的mRNA前体能够通过不同剪接方式（选择不同的剪接位点组合）产生不同的mRNA剪接异构体的过程，最终导致同一个基因序列产生的不同的蛋白质。这对蛋白的表达是非常不利的。发明人通过对野生型的天然核酸序列进行密码子优化，同时基于自有技术去除潜在的可变剪切位点，保证了蛋白表达的唯一性，减少了蛋白表达错误剪切的发生。优化得到的核酸序列记为SEQ ID NO：2（下文载体命名为S50）。
SEQ ID NO：1：
ATGTTTGTTTTTCTTGTTTTATTGCCACTAGTCTCTAGTCAGTGTGTTAATCTTACAACCAGAACTCAATTACCCCCTGCATACACTAATTCTTTCACACGTGGTGTTTATTACCCTGACAAAGTTTTCAGATCCTCAGTTTTACATTCAACTCAGGACTTGTTCTTACCTTTCTTTTCCAATGTTACTTGGTTCCATGTTATCTCTGGGACCAATGGTACTAAGAGGTTTGATAACCCTGTCCTACCATTTAATGATGGTGTTTATTTTGCTTCCATTGAGAAGTCTAACATAATAAGAGGCTGGATTTTTGGTACTACTTTAGATTCGAAGACCCAGTCCCTACTTATTGTTAATAACGCTACTAATGTTGTTATTAAAGTCTGTGAATTTCAATTTTGTAATGATCCATTTTTGGACCACAAAAACAACAAAAGTTGGATGGAAAGTGAGTTCAGAGTTTATTCTAGTGCGAATAATTGCACTTTTGAATATGTCTCTCAGCCTTTTCTTATGGACCTTGAAGGAAAACAGGGTAATTTCAAAAATCTTAGGGAATTTGTGTTTAAGAATATTGATGGTTATTTTAAAATATATTCTAAGCACACGCCTATTATAGTGCGTGAGCCAGAAGATCTCCCTCAGGGTTTTTCGGCTTTAGAACCATTGGTAGATTTGCCAATAGGTATTAACATCACTAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTACATAGAAGTTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAGCTGGTGCTGCAGCTTATTATGTGGGTTATCTTCAACCTAGGACTTTTCTATTAAAATATAATGAAAATGGAACCATTACAGATGCTGTAGACTGTGCACTTGACCCTCTCTCAGAAACAAAGTGTACGTTGAAATCCTTCACTGTAGAAAAAGGAATCTATCAAACTTCTAACTTTAGAGTCCAACCAACAGAATCTATTGTTAGATTTCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGATGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATCTCGCACCATTTTTCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAATATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAATTCTAACAAGCTTGATTCTAAGGTTAGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAACAAACCTTGTAATGGTGTTGCAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACGATCATATAGTTTCCGACCCACTTATGGTGTTGGTCACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTCAACTTCAATGGTTTAAAAGGCACAGGTGTTCTTACTGAGTCTAACAAAAAGTTTCTGCCTTTCCAACAATTTGGCAGAGACATTGCTGACACTACTGATGCTGTCCGTGATCCACAGACACTTGAGATTCTTGACATTACACCATGTTCTTTTGGTGGTGTCAGTGTTATAACACCAGGAACAAATACTTCTAACCAGGTTGCTGTTCTTTATCAGGGTGTTAACTGCACAGAAGTCCCTGTTGCTATTCATGCAGATCAACTTACTCCTACTTGGCGTGTTTATTCTACAGGTTCTAATGTTTTTCAAACACGTGCAGGCTGTTTAATAGGGGCTGAATATGTCAACAACTCATATGAGTGTGACATACCCATTGGTGCAGGTATATGCGCTAGTTATCAGACTCAGACTAAGTCTCATCGGCGGGCACGTAGTGTAGCTAGTCAATCCATCATTGCCTACACTATGTCACTTGGTGCAGAAAATTCAGTTGCTTACTCTAATAACTCTATTGCCATACCCACAAATTTTACTATTAGTGTTACCACAGAAATTCTACCAGTGTCTATGACCAAGACATCAGTAGATTGTACAATGTACATTTGTGGTGATTCAACTGAATGCAGCAATCTTTTGTTGCAATATGGCAGTTTTTGTACACAATTAAAACGTGCTTTAACTGGAATAGCTGTTGAACAAGACAAAAACACCCAAGAAGTTTTTGCACAAGTCAAACAAATTTACAAAACACCACCAATTAAATATTTTGGTGGTTTTAATTTTTCACAAATATTACCAGATCCATCAAAACCAAGCAAGAGGTCATTTATTGAAGATCTACTTTTCAACAAAGTGACACTTGCAGATGCTGGCTTCATCAAACAATATGGTGATTGCCTTGGTGATATTGCTGCTAGAGACCTCATTTGTGCACAAAAGTTTAAAGGCCTTACTGTTTTGCCACCTTTGCTCACAGATGAAATGATTGCTCAATACACTTCTGCACTGTTAGCGGGTACAATCACTTCTGGTTGGACCTTTGGTGCAGGTGCTGCATTACAAATACCATTTGCTATGCAAATGGCTTATAGGTTTAATGGTATTGGAGTTACACAGAATGTTCTCTATGAGAACCAAAAATTGATTGCCAACCAATTTAATAGTGCTATTGGCAAAATTCAAGACTCACTTTCTTCCACAGCAAGTGCACTTGGAAAACTTCAAGATGTGGTCAACCATAATGCACAAGCTTTAAACACGCTTGTTAAACAACTTAGCTCCAAATTTGGTGCAATTTCAAGTGTTTTAAATGATATCNTTTCACGTCTTGACAAAGTTGAGGCTGAAGTGCAAATTGATAGGTTGATCACAGGCAGACTTCAAAGTTTGCAGACATATGTGACTCAACAATTAATTAGAGCTGCAGAAATCAGAGCTTCTGCTAATCTTGCTGCTACTAAAATGTCAGAGTGTGTACTTGGACAATCAAAAAGAGTTGATTTTTGTGGAAAGGGCTATCATCTTATGTCCTTCCCTCAGTCAGCACCTCATGGTGTAGTCTTCTTGCATGTGACTTATGTCCCTGCACAAGAAAAGAACTTCACAACTGCTCCTGCCATTTGTCATGATGGAAAAGCACACTTTCCTCGTGAAGGTGTCTTTGTTTCAAATGGCACACACTGGTTTGTAACACAAAGGAATTTTTATGAACCACAAATCATTACTACAGACAACACATTTGTGTCTGGTAACTGTGATGTTGTAATAGGAATTGTCAACAACACAGTTTATGATCCTTTGCAACCTGAATTAGATTCATTCAAGGAGGAGTTAGATAAATATTTTAAGAATCATACATCACCAGATGTTGATTTAGGTGACATCTCTGGCATTAATGCTTCAGTTGTAAACATTCAAAAAGAAATTGACCGCCTCAATGAGGTTGCCAAGAATTTAAATGAATCTCTCATCGATCTCCAAGAACTTGGAAAGTATGAGCAGTATATAAAATGGCCATGGTACATTTGGCTAGGTTTTATAGCTGGCTTGATTGCCATAGTAATGGTGACAATTATGCTTTGCTGTATGACCAGTTGCTGTAGTTGTCTCAAGGGCTGTTGTTCTTGTGGATCCTGCTGCAAATTTGATGAAGACGACTCTGAGCCAGTGCTCAAAGGAGTCAAATTACATTACACATAA。
SEQ ID NO：2：
atgttcgtgttcctggtcctactgccactggtcagcagccagtgcgtgaatctgacgactaggacccaactgcctccagcctataccaacagcttcaccagaggagtctactaccccgacaaggtgtttcggtcttctgtgctgcattctacacaggacctgttcctgcccttcttcagcaatgtcacctggttccacgtgatctccggcaccaacggaaccaaacgatttgataatcctgtgctgcctttcaacgacggagtgtacttcgcctctatcgagaagagcaatatcatccggggctggatcttcggcacaacgctggacagcaagacccagagcctgctgatcgttaacaatgctaccaacgttgttatcaaggtgtgcgagttccagttttgcaacgaccctttcctggaccacaagaacaacaagagttggatggaaagcgagttcagagtgtactctagcgctaataactgcacattcgagtacgtctctcagcctttcctgatggacctggaaggcaaacagggaaatttcaaaaatctgagagaattcgtgttcaagaacatcgacggctactttaagatctactctaagcacacacccatcatcgtgcgggaaccagaggacctgccccagggcttcagcgctctggagccactggttgacctgcccatcggcatcaacattacaagattccaaactctgcttgcactgcatagatcctatctgacccctggcgattcctcaagcggatggaccgccggcgccgctgcctactacgtgggatacctgcaacctcggacctttctgctgaagtataacgagaacggcaccattaccgacgccgtggactgcgccctggaccccctgagcgagacaaagtgcaccctgaaaagcttcaccgtggaaaagggcatctaccaaaccagcaactttcgggtgcagcctaccgaatctatcgtgcggttccccaacatcacaaacctgtgccctttcgacgaggtgttcaacgccaccagattcgccagcgtgtatgcctggaacagaaagagaatctcgaattgcgtggccgattactccgtgctctataacctcgcccctttcttcacattcaagtgctacggcgtgagccccaccaagctcaacgacctgtgttttaccaacgtgtacgccgacagctttgtgatcagaggtgacgaggtgcggcagatcgcaccaggacagacaggcaacattgctgactacaactacaaactgcctgacgatttcaccggctgcgtgatcgcctggaattctaacaagctggatagcaaggtgtctggcaattacaactacctgtaccggctgtttagaaagagcaacctgaagcctttcgagagagacatctctaccgagatataccaggccggcaacaaaccttgtaacggcgttgcgggattcaactgctacttccctctgagaagctacagctttcggcctacatacggcgtcggccaccagccctaccgggtggtggtactgagcttcgagttactgcacgctcctgcgaccgtctgcggccctaagaagagcaccaatctggtgaagaacaagtgcgtcaacttcaactttaacggcctgaagggcacaggtgtgctgaccgagagcaacaagaaattcctcccattccaacaattcggtagagatatcgccgacaccactgatgcagttagggacccccagaccctggaaatcctggatatcaccccttgctcattcggcggtgtgagcgtcatcacccctggcaccaacacctccaaccaggtggccgtcctgtaccagggcgttaattgtaccgaggtgcctgtggccatccacgccgaccagctcacccctacgtggagagtgtacagcacaggcagtaacgtgtttcagactcgggccggctgcctcatcggtgccgagtacgtgaataatagttatgagtgtgacattcccattggcgccggcatctgcgccagctaccagacccagacaaagagtcacggcagcgctagctctgtggccagccagagcattatcgcctacaccatgtctctgggcgctgaaaacagcgtggcctactctaacaactccatcgccatccctaccaacttcacaatctccgtgaccacagagattctgcccgtgtctatgaccaagacctctgtggactgtacaatgtacatctgcggcgatagcaccgaatgcagcaacctgctcctgcaatacggcagcttctgcacccagctgaaaagagctctgaccggtatcgctgtggaacaggacaagaacacacaggaggtgttcgcccaggttaagcagatctacaagacccctcctatcaaatacttcggcggcttcaacttcagccagatcctgcctgatccaagcaaacctagcaagcgcagcttcatcgaggaccttctgtttaataaagttaccctggccgatgccggatttatcaagcaatacggagattgcttaggcgatatcgctgccagagatctgatctgtgctcagaaattcaagggcctgaccgtcctgcctcctctcctgaccgacgagatgatcgctcagtacacctctgccctgctggccggcacaatcacatcaggctggaccttcggagccggagccgctctgcagatcccctttgcaatgcaaatggcctacagattcaacggcattggcgtcacacagaacgtgctgtacgagaatcagaagctgatagccaaccagttcaactccgctatcggcaagatccaggacagcctgagctccaccgcctccgccctcggaaaactgcaggacgtggtgaaccataatgcccaggctctgaacaccctggtgaagcaactgagcagcaagttcggcgccatcagctctgtcctgaacgacatcttctcaagattggatcctcccgaagccgaagtccagatcgatagactgataaccggcaggctgcaaagcctccagacatacgtgacacagcaactgatcagagccgctgagatccgagccagcgctaacctggccgccaccaagatgtcagagtgcgtcctggggcagagcaaaagagtggacttctgtggcaagggctatcacctgatgagcttccctcagagcgccccgcacggagtggtgttcctgcacgtgacctacgtgcccgctcaggaaaaaaacttcaccacagccccagctatctgtcacgacggcaaggcccacttcccaagggaaggcgtgttcgtgagcaatggcacacactggtttgtgacccagagaaacttctacgagcctcagatcatcacaaccgacaacacctttgtgagcggcaattgcgatgtggtgatcggcatcgtgaacaacaccgtgtacgaccccctgcagcctgaactcgatagtttcaaagaagagctggacaagtacttcaaaaaccacacgagccctgacgtggacctcggcgacatcagcggtatcaacgccagcgtcgtcaacatccaaaaagagatcgacagactgaacgaggtggccaagaacctgaatgagagtctgatcgacctgcaggagctgggaaagtacgaacagtacatcaagtggccctggtacatctggctgggattcatcgccggcctgatcgctatcgtcatggttactattatgctgtgctgtatgacatcatgttgtagctgtctcaaaggctgctgcagctgtggcagctgctgcaagttcgacgaagatgactctgagccagtgctcaagggcgtaaagctgcactacacctgataaactag。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本申请所要求保护的范围。
实施例1携带奥密克戎突变株的S抗原载体构建
1、构建奥密克戎突变株的S基因的穿梭质粒pGA1-S50
以pcDNA3.1-S50（由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，S50即为SEQ ID NO：2）质粒为模板，以S50-F和S50-R为引物，采用Primer Star Mix（TaKaRa）PCR扩增得到目的片段S50。
S50扩增引物序列：
S50-F：gtaccgagctcggatccgccaccatgttcgtgttcctggtcctactgcc（SEQ ID NO：3）；
S50-R：agaatagggccctctagactagtttatcaggtgtagtgcagcttt（SEQ ID NO：4）。
PCR程序：98℃ 3min； 98℃ 10 s，60℃ 5 s，72℃ 30 s， 28个循环；72℃ 5min，4℃保存。
以PGA1-EGFP质粒（由广州恩宝生物医药科技有限公司保存）为模板，以CMV-R和BGH-F为引物，采用Primer Star Mix（TaKaRa） PCR扩增得到目的片段PGA1。
pGA1骨架扩增引物序列：
CMV-R：ggatccgagctcggtaccaagcttaagtttaaacgctagagtccgg（SEQ ID NO：5）；
BGH-F：tctagagggccctattctatagtgtc（SEQ ID NO：6）。
PCR程序： 98℃ 3min； 98℃ 10 s，60℃ 5 s，72℃ 30 s， 28个循环；72℃ 5min，4℃保存。
将目的片段S50和载体骨架pGA1采用同源重组酶（Vazyme）进行重组，得到携带奥密克戎突变株S基因的穿梭质粒pGA1-S50。
2、构建奥密克戎突变株的S基因的穿梭质粒pGA261-S50
以pcDNA3.1-S50（由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，S50即为SEQ ID NO：2）质粒为模板，以S50-F和S50-R为引物，采用Primer Star Mix（TaKaRa） PCR扩增得到目的片段S50。
S50扩增引物序列：
S50-F：gtaccgagctcggatccgccaccatgttcgtgttcctggtcctactgcc（SEQ ID NO：3）；
S50-R：agaatagggccctctagactagtttatcaggtgtagtgcagcttt（SEQ ID NO：4）。
PCR程序：98℃ 3min； 98℃ 10 s，60℃ 5 s，72℃ 30 s， 28个循环；72℃ 5min，4℃保存。
以PGA261-EGFP质粒（由广州恩宝生物医药科技有限公司保存）为模板，以CMV-R和BGH-F为引物，采用Primer Star Mix（TaKaRa） PCR扩增得到目的片段PGA261。
pGA261骨架扩增引物序列：
CMV-R：ggatccgagctcggtaccaagcttaagtttaaacgctagagtccgg（SEQ ID NO：5）；
BGH-F：tctagagggccctattctatagtgtc（SEQ ID NO：6）。
PCR程序： 98℃ 3min； 98℃ 10 s，60℃ 5 s，72℃ 30 s， 28个循环；72℃ 5min，4℃保存。
将目的片段S50和载体骨架pGA261采用同源重组酶（Vazyme）进行重组，得到携带奥密克戎突变株S基因的穿梭质粒pGA261-S50。
3、构建奥密克戎突变株的S基因的穿梭质粒pGA351-S50
以pcDNA3.1-S50（由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，S50即为SEQ ID NO：2）质粒为模板，以S50-F和S50-R为引物，采用Primer Star Mix（TaKaRa）PCR扩增得到目的片段S50。
S50扩增引物序列：
S50-F：gtaccgagctcggatccgccaccatgttcgtgttcctggtcctactgcc（SEQ ID NO：3）；
S50-R：agaatagggccctctagactagtttatcaggtgtagtgcagcttt（SEQ ID NO：４）。
PCR程序：98℃ 3min； 98℃ 10 s，60℃ 5 s，72℃ 30 s， 28个循环；72℃ 5min，4℃保存。
以PGA351-EGFP质粒（携带Ad35E1区同源重组臂质粒，由广州恩宝生物医药科技有限公司保存）为模板，以CMV-R和BGH-F为引物，采用Primer Star Mix（TaKaRa）PCR扩增得到目的片段PGA351。
pGA351骨架扩增引物序列：
CMV-R：ggatccgagctcggtaccaagcttaagtttaaacgctagagtccgg（SEQ ID NO：5）；
BGH-F：tctagagggccctattctatagtgtc（SEQ ID NO：6）。
PCR程序： 98℃ 3min； 98℃ 10 s，60℃ 5 s，72℃ 30 s， 28个循环；72℃ 5min，4℃保存。
将目的片段S50和载体骨架pGA351采用同源重组酶（Vazyme）进行重组，得到携带奥密克戎突变株S基因的穿梭质粒pGA351-S50。
4、构建奥密克戎突变株的原始S基因的穿梭质粒pGA1-S-Ori
以pcDNA3.1-S-Ori（购自南京金斯瑞生物科技有限公司，S-Ori为奥密克戎株S基因原始序列，即 SEQ ID NO：1）质粒为模板，以SOri-F和SOri-R为引物，采用Primer StarMix （TaKaRa）PCR扩增得到目的片段S-Ori。
S-Ori扩增引物序列：
SOri-F：gtaccgagctcggatccgccaccatgtttgtttttcttgttttattgccact（SEQ IDNO：7）；
SOri-R：tagaatagggccctctagactagtttattatgtgtaatgtaatttgactcctt（SEQ IDNO：8）。
PCR程序：98℃ 3min； 98℃ 10 s，60℃ 5 s，72℃ 30 s， 28个循环；72℃ 5min，4℃保存。
以PGA1-EGFP质粒（由广州恩宝生物医药科技有限公司保存）为模板，以CMV-R和BGH-F为引物，采用Primer Star Mix（TaKaRa）PCR扩增得到目的片段PGA1。
pGA1骨架扩增引物序列：
CMV-R：ggatccgagctcggtaccaagcttaagtttaaacgctagagtccgg（SEQ ID NO：5）；
BGH-F：tctagagggccctattctatagtgtc（SEQ ID NO：6）。
PCR程序： 98℃ 3min； 98℃ 10 s，60℃ 5 s，72℃ 30 s， 28个循环；72℃ 5min，4℃保存。
将目的片段S-Ori和载体骨架pGA1采用同源重组酶（Vazyme）进行重组，得到携带奥密克戎突变株原始S基因的穿梭质粒pGA1-S-Ori。
5、构建携带奥密克戎突变株的S基因的pAd35-S50
以pGA351-S50质粒为模板，PCR扩增得到携带同源重组臂的CMV-S50-BGH目的片段，胶回收。
CMV-S50-BGH目的片段扩增引物序列：
Ad35-SB-F：agaattggatccgaattcgcggccgcgcgatcgccatcatcaataatatacctt（SEQID NO：9）；
Ad35-SB-R：gcgtcgcagatccgaattcgtatacccatccaagctgcacgataa（SEQ ID NO：10）。
PCR程序： 98℃ 3min； 98℃ 10 s，60℃ 5 s，72℃ 50 s， 28个循环；72℃ 5min，采用胶回收试剂盒回收目的片段，4℃保存。
pAd35ΔE1ΔE3以PmeI线性化后乙醇沉淀回收；将携带同源重组臂的CMV-S50-BGH目的片段和线性化的PAd35ΔE1ΔE3（5E4）共转化BJ5183，同源重组得到携带S50基因的pAd35-S50质粒，技术流程如图1所示。
实施例2携带奥密克戎突变株的Spike基因表达检测
按照常规方法，利用阳离子脂质体，分别2.5g的实施例1制备得到的pGA1-S-Ori（携带奥密克戎株S基因原始序列，即 SEQ ID NO：1）、PGA1-S50，PGA261-S50和PGA351-S50转染法转染HEK293细胞，转染48小时后，收集细胞，按照常规的WesternBlot方法处理样品，并进行蛋白检测。参见图2可以看出，pGA1-S-Ori 样品中没有检测到S蛋白的表达，而经过密码子优化的PGA1-S50，PGA261-S50和PGA351-S50样品中均能够观察到高效的S蛋白的表达，说明我们优化的S50序列具有意料之外的效果。
实施例3 Ad35-S50载体的拯救与生产
1）按照常规方法，Ad35-S50以AsisI线性化，乙醇沉淀回收，阳离子脂质体转染法转染293细胞；2）转染后4小时，加入2毫升含5%胎牛血清的DMEM培养基，孵育7-10天，观察细胞病变；3）出毒后，收集细胞及培养上清，在37度水浴及液氮中反复冻融3次并离心去除细胞碎片，上清感染10厘米皿；4）2-3天后，收集细胞及培养上清，反复冻融3次并离心去除细胞碎片，上清感染3-5个15厘米皿；5）2-3天后，收集细胞，反复冻融3次并离心去除细胞碎片；6）上清感染30个15厘米皿2-3天后，收集细胞，反复冻融3次并离心去除细胞碎片；7）上清加至氯化铯密度梯度离心管；4℃，40000转，离心4小时；吸出病毒条带，脱盐，分装；8）以OD260吸光度测定病毒粒子滴度，计算公式为：病毒浓度=OD260×稀释倍数×36／基因组长度（Kb）；病毒储存液于-80℃冻存。病毒纯化结果如图3所示。
实施例4 动物免疫原性评价
6-8周龄Balb/c小鼠（购自北京维通利华实验动物技术有限公司）分为2组，每组10只；第0天，疫苗组（即样品组）肌注免疫Ad35-S50剂量：5×109vp/只，对照组（即阴性组）肌注免疫Ad35-empty剂量：5×109vp/只；第14天，眼眶取血并分离血清。
1、结合抗体
采用酶联免疫吸附测定（ELISA），分别以新冠病毒奥密克戎突变株、原始株、Delta突变株的RBD蛋白（购自北京义翘神州科技有限公司）为抗原检测血清中的抗体水平。
ELISA结合抗体测定的具体操作为：
1）96孔板，每孔加50ng的RBD蛋白，4℃过夜；
2）吸掉上清，采用PBST洗3次，每孔加入200μl 5%BSA室温封闭2h；
3）PBST洗3次；每孔加入采用PBS以1:400，1:800，1:1600，1:3200，1:6400，1:12800，1:25600和，1:51200稀释的小鼠血清，37℃孵育2h；
4）加酶标抗体：加入100μl稀释后 HRP标记IgG二抗，37℃孵育2h；
5）PBST洗6-8次；
6）加底物液显色：加入100μl TMB显色；
7）终止反应：加入50μl 1M硫酸终止反应；
8）结果判定：测OD值，OD值控制在0.1-4；
9）实验结果如图4、图5和图6所示，图4显示Ad35-S50能够诱异小鼠产生针对奥密克戎突变株RBD蛋白的特异性结合抗体。此外图5和图6显示Ad35-S50同样可以产生针对原始株新冠病毒和Delta突变株新冠病毒的的特异性结合抗体。
2、中和抗体
假病毒中和抗体的测定具体操作为：
1）将待检测的血清于56℃水浴灭活30min，6000g离心3min；将血清进行30倍梯度稀释；
2）用DMEM无血清培养基将奥密克戎假病毒（购买自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号DD1768-02）稀释至1.3×104TCID50/ml与上述稀释的血清充分混匀，置于细胞培养箱中（37℃，5%CO2）孵育1小时；
3）将孵育后的血清加入96孔板的ACEII细胞中，放入细胞培养箱中，37 ℃，5% CO2培养72小时；
4）培养72小时后从细胞培养箱中取出96孔板，用多道移液器从每个上样孔中吸弃100μl上清，然后加入100μl荧光素酶检测试剂，室温避光反应2min；
5）计算中和抑制率：抑制率＝［1－（样品组的发光强度均值－空白对照发光强度均值）/（阴性组的发光强度均值－空白对照值发光强度均值）］×100％；空白对照指的是96孔细胞背景值；阴性组指的是Ad35-empty免疫组；
6）根据中和抑制率结果，利用Reed-Muench法计算IC50。
结果如图7所示：该疫苗可以刺激小鼠机体产生较高滴度的针对奥密克戎株新冠病毒的特异性中和抗体。
以上对本申请实施例进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明仅用于帮助理解本申请的方法及其核心思想。同时，本领域技术人员依据本申请的思想，基于本申请的具体实施方式及应用范围上做出的改变或变形之处，都属于本申请保护的范围。综上所述，本说明书内容不应理解为对本申请的限制。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州恩宝生物医药科技有限公司
<120> 表达SARS-CoV-2奥密克戎突变株病毒抗原肽的核酸序列及其应用
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3813
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<220>
<221> misc_feature
<222> (2932)..(2932)
<223> n is a, c, g, t
<400> 1
atgtttgttt ttcttgtttt attgccacta gtctctagtc agtgtgttaa tcttacaacc 60
agaactcaat taccccctgc atacactaat tctttcacac gtggtgttta ttaccctgac 120
aaagttttca gatcctcagt tttacattca actcaggact tgttcttacc tttcttttcc 180
aatgttactt ggttccatgt tatctctggg accaatggta ctaagaggtt tgataaccct 240
gtcctaccat ttaatgatgg tgtttatttt gcttccattg agaagtctaa cataataaga 300
ggctggattt ttggtactac tttagattcg aagacccagt ccctacttat tgttaataac 360
gctactaatg ttgttattaa agtctgtgaa tttcaatttt gtaatgatcc atttttggac 420
cacaaaaaca acaaaagttg gatggaaagt gagttcagag tttattctag tgcgaataat 480
tgcacttttg aatatgtctc tcagcctttt cttatggacc ttgaaggaaa acagggtaat 540
ttcaaaaatc ttagggaatt tgtgtttaag aatattgatg gttattttaa aatatattct 600
aagcacacgc ctattatagt gcgtgagcca gaagatctcc ctcagggttt ttcggcttta 660
gaaccattgg tagatttgcc aataggtatt aacatcacta ggtttcaaac tttacttgct 720
ttacatagaa gttatttgac tcctggtgat tcttcttcag gttggacagc tggtgctgca 780
gcttattatg tgggttatct tcaacctagg acttttctat taaaatataa tgaaaatgga 840
accattacag atgctgtaga ctgtgcactt gaccctctct cagaaacaaa gtgtacgttg 900
aaatccttca ctgtagaaaa aggaatctat caaacttcta actttagagt ccaaccaaca 960
gaatctattg ttagatttcc taatattaca aacttgtgcc cttttgatga agtttttaac 1020
gccaccagat ttgcatctgt ttatgcttgg aacaggaaga gaatcagcaa ctgtgttgct 1080
gattattctg tcctatataa tctcgcacca tttttcactt ttaagtgtta tggagtgtct 1140
cctactaaat taaatgatct ctgctttact aatgtctatg cagattcatt tgtaattaga 1200
ggtgatgaag tcagacaaat cgctccaggg caaactggaa atattgctga ttataattat 1260
aaattaccag atgattttac aggctgcgtt atagcttgga attctaacaa gcttgattct 1320
aaggttagtg gtaattataa ttacctgtat agattgttta ggaagtctaa tctcaaacct 1380
tttgagagag atatttcaac tgaaatctat caggccggta acaaaccttg taatggtgtt 1440
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gtgctcaaag gagtcaaatt acattacaca taa 3813
<210> 2
<211> 3821
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 2
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<210> 3
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
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<212> DNA
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<212> DNA
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<400> 10
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Claims (10)

1.一种编码SARS-CoV-2奥密克戎突变株的S蛋白的核酸分子，所述的核酸分子为：如SEQ ID NO：2所示核酸序列。
2.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子可在人源细胞或人体内表达蛋白，所述的蛋白可在人体内：
诱导免疫应答；和／或
产生生物报告分子；和／或
产生用于检测的分子；和／或
调节基因功能；和／或
成为治疗性分子。
3.一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体含有权利要求1或2所述的核酸分子。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于：所述的表达载体为DNA质粒、RNA表达质粒。
5.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于：所述的表达载体为病毒载体。
6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于：所述的病毒载体为腺病毒载体。
7.一种表达细胞，其特征在于：所述的表达细胞可基于权利要求 1 或2所述的核酸分子表达蛋白。
8.一种核酸组合物，其特征在于：所述的核酸组合物包括权利要求 1 或2所述的核酸分子、或权利要求3-6任一项所述的表达载体。
9.根据权利要求8所述的核酸组合物，其特征在于：还包括药学上可接受的佐剂、载体、稀释剂或赋形剂中的至少一种。
10.权利要求8或9所述的核酸组合物在制备预防或治疗SARS-CoV-2奥密克戎突变株引发的感染的药物中的应用。
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