CN115716866A - 新型冠状病毒疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents
新型冠状病毒疫苗及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115716866A CN115716866A CN202211207683.9A CN202211207683A CN115716866A CN 115716866 A CN115716866 A CN 115716866A CN 202211207683 A CN202211207683 A CN 202211207683A CN 115716866 A CN115716866 A CN 115716866A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- nucleic acid
- reading frame
- open reading
- novel coronavirus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 title claims abstract description 197
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 129
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 163
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 163
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 127
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 claims abstract description 92
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 claims abstract description 92
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 127
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 60
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 56
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 52
- -1 nucleic acid lipid Chemical class 0.000 claims description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 27
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 25
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 25
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 24
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 23
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 claims description 21
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 20
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 claims description 16
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 claims description 16
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 14
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 12
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 12
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims description 11
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- DSNRWDQKZIEDDB-SQYFZQSCSA-N 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-sn-glycerol) Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@@H](O)CO)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC DSNRWDQKZIEDDB-SQYFZQSCSA-N 0.000 claims description 10
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 claims description 10
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 7
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 claims description 6
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 claims description 6
- 101710183681 Uncharacterized protein 7 Proteins 0.000 claims description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 6
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 6
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 6
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 claims description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 5
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 claims description 5
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 3
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 claims description 3
- WTBFLCSPLLEDEM-JIDRGYQWSA-N 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC WTBFLCSPLLEDEM-JIDRGYQWSA-N 0.000 claims description 2
- SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 0.000 claims description 2
- NRJAVPSFFCBXDT-HUESYALOSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC NRJAVPSFFCBXDT-HUESYALOSA-N 0.000 claims description 2
- RVHYPUORVDKRTM-UHFFFAOYSA-N 1-[2-[bis(2-hydroxydodecyl)amino]ethyl-[2-[4-[2-[bis(2-hydroxydodecyl)amino]ethyl]piperazin-1-yl]ethyl]amino]dodecan-2-ol Chemical compound CCCCCCCCCCC(O)CN(CC(O)CCCCCCCCCC)CCN(CC(O)CCCCCCCCCC)CCN1CCN(CCN(CC(O)CCCCCCCCCC)CC(O)CCCCCCCCCC)CC1 RVHYPUORVDKRTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 claims description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims description 2
- AOBORMOPSGHCAX-UHFFFAOYSA-N Tocophersolan Chemical compound OCCOC(=O)CCC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C AOBORMOPSGHCAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000001841 cholesterols Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 2
- GLGLUQVVDHRLQK-WRBBJXAJSA-N n,n-dimethyl-2,3-bis[(z)-octadec-9-enoxy]propan-1-amine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(CN(C)C)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC GLGLUQVVDHRLQK-WRBBJXAJSA-N 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims 2
- 229940124447 delivery agent Drugs 0.000 claims 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 claims 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 1
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 abstract description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 abstract 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 64
- 241001112090 Pseudovirus Species 0.000 description 36
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 23
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 22
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 22
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 20
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 20
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 16
- 108700021021 mRNA Vaccine Proteins 0.000 description 16
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 16
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 15
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 15
- 229940126582 mRNA vaccine Drugs 0.000 description 15
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 15
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 13
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 13
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 13
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 13
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 13
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 13
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 7
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 6
- 229940031416 bivalent vaccine Drugs 0.000 description 6
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 101710145634 Antigen 1 Proteins 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 5
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 5
- 231100000645 Reed–Muench method Toxicity 0.000 description 4
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 4
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000012772 sequence design Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 2
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 description 2
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 2
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 description 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000214054 Equine rhinitis A virus Species 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 241001672814 Porcine teschovirus 1 Species 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940022005 RNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000985245 Spodoptera litura Species 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 239000012646 vaccine adjuvant Substances 0.000 description 1
- 229940124931 vaccine adjuvant Drugs 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
- A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
- A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
- A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
- A61K9/5123—Organic compounds, e.g. fats, sugars
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
- A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
- A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
- A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
- A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
- A61K9/5146—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/20011—Coronaviridae
- C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/20011—Coronaviridae
- C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
本发明提供了一种新型冠状病毒疫苗及其制备方法和应用，涉及疫苗的技术领域。该新型冠状病毒疫苗包含编码新型冠状病毒Delta变异株S蛋白和编码新型冠状病毒奥密克戎子变异株BA.5 S蛋白的核酸分子，为一种多价疫苗，缓解了现有技术的新型冠状疫苗对变异株的保护效果不佳的技术问题。
Description
技术领域
本发明涉及疫苗技术领域，尤其是涉及一种新型冠状病毒疫苗及其制备方法和应用。
背景技术
新冠病毒极易变异，从被发现至今，新冠病毒原始株、新冠病毒Alpha株、新冠病毒Beta株、新冠病毒Gamma变异株、新冠病毒Kappa株、新冠病毒Delta株和新冠病毒Omicron株等毒株相继出现。
目前上市和大多数处在临床试验阶段的新冠疫苗均是针对新冠病毒原始毒株进行的抗原设计。与最初的新冠病毒原始株序列相比，奥密克戎（Omicron）变异株至少新增了60个突变点，其中刺突蛋白（S蛋白）超过35个突变，而刺突蛋白（S蛋白）内最关键的受体结合结构域上携带15个突变，相对而言，德尔塔（Delta）变异株在该区域仅有2个突变。根据突变位点的差异，奥密克戎变异株可分为至少5个子变异株，分别是BA.1、BA.2.12.1、BA.2、BA.4和BA.5等。
研究发现，现有疫苗对变异株的保护效果出现不同程度的下降，尤其是针对新冠病毒奥密克戎株。因此针对变异株具有更好保护效果的新冠疫苗亟待研发。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种新型冠状病毒疫苗，缓解了现有技术中存在的新型冠状疫苗对变异株的保护效果不佳的技术问题。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种新型冠状病毒疫苗，所述新型冠状病毒疫苗包含含有第一阅读框和含有第二阅读框的核酸分子；
所述第一开放阅读框编码新型冠状病毒Delta变异株S蛋白；所述第二开放阅读框编码新型冠状病毒奥密克戎子变异株BA.5 S蛋白。
优选地，所述新型冠状病毒疫苗包含：含有第一开放阅读框的核酸分子；和，含有第二开放阅读框的核酸分子；或，所述新型冠状病毒疫苗包含：同时含有第一开放阅读框和第二开放阅读框的融合核酸分子。
优选地，新型冠状病毒Delta变异株S蛋白的氨基酸序列如Seq_8所示；
优选地，所述新型冠状病毒奥密克戎子变异株BA.5 S蛋白的氨基酸序列如Seq_26所示；
优选地，所述核酸分子为RNA；
优选地，RNA中开放阅读框的部分总GC%含量为30~70%，所述开放阅读框的片段中任意一长度为60bp的片段中GC%含量不低于40%；
优选地，RNA中开放阅读框的部分总GC%含量为50%~60%，更优选为54%~60%；
优选地，所述RNA还包括5’帽子、5’UTR、3’UTR、polyA尾、起始区、终止区、信号序列区和linker序列中的一种或多种；
优选地，所述第一开放阅读框的核苷酸序列如Seq_9、Seq_36、Seq_37、Seq_38、Seq_39、Seq_40、Seq_41、Seq_42或Seq_29所示；
优选地，所述第二开放阅读框的核苷酸序列如Seq_27、Seq_32、Seq_20、Seq_21、Seq_22、Seq_23、Seq_24、Seq_25、Seq_28所示；
优选地，第一开放阅读框和第二阅读框的组合方式选自：Seq_9和Seq_27、Seq_9和Seq_32；Seq_36和Seq_32、Seq_37和Seq_20、Seq_38和Seq_21、Seq_39和Seq_22、Seq_40和Seq_23、Seq_41和Seq_24、Seq_42和Seq_25、Seq_29和Seq_28、Seq_29和Seq_28、Seq_42和Seq_25、Seq_41和Seq_24、Seq_40和Seq_23、Seq_39和Seq_32、Seq_38和Seq_22、Seq_37和Seq_21、Seq_36和Seq_20。
优选地，含有编码第一开放阅读框的核酸分子和含有编码第二开放阅读框的核酸分子的质量比为（1:9）~（9:1），优选为（1:1）~（9:1），更优选为3:1；
优选地，所述核酸分子为融合核酸分子，第一开放阅读框和第二开放阅读框在所述融合核酸分子中的重复数为（1:9）~（9:1）；优选为（1:1）~（9:1），更优选为3:1。
优选地，所述疫苗还包括递送制剂；
优选地，所述新型冠状病毒疫苗含有由所述核酸分子和脂质成分构成的核酸脂质纳米颗粒；
优选地，所述新型冠状病毒疫苗选自（a）、（b）或（c）：
（a）、所述新型冠状病毒疫苗包含:包裹有含有第一开放阅读框的核酸分子的核酸脂质纳米颗粒，和，包裹有含有第二开放阅读框的核酸分子的核酸脂质纳米颗粒；
（b）、所述新型冠状病毒疫苗包含:包裹有含有第一开放阅读框的核酸分子，和含有第二开放阅读框的核酸分子的核酸脂质纳米颗粒；
（c）、所述新型冠状病毒疫苗包含：包裹有同时含有第一开放阅读框和第二开放阅读框的融合核酸分子的核酸脂质纳米颗粒。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种上述新型冠状病毒疫苗的制备方法，该制备方法包括将所述核酸分子与任选地辅料混合，得到所述新型冠状病毒疫苗。
优选地，所述新型冠状病毒疫苗包括核酸脂质纳米颗粒，所述制备方法包括：
分别制备包裹有含有第一开放阅读框的核酸分子的核酸脂质纳米颗粒，和，包裹有含有第二开放阅读框的核酸分子的核酸脂质纳米颗粒；然后按配方量将两种核酸脂质纳米颗粒混合；
或，先将含有第一开放阅读框的核酸分子和含有第二开放阅读框的核酸分子按照配方量混合，再制备得到包裹有含有两种核酸分子的核酸脂质纳米颗粒；
或，制备包裹有同时含有第一开放阅读框和第二开放阅读框的核酸分子的核酸脂质纳米颗粒。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述新型冠状病毒疫苗，或上述制备方法在制备用于预防或治疗新型冠状病毒引发的疾病的产品中的应用。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种用于预防或治疗新型冠状病毒引发的疾病的产品，所述产品包含上述新型冠状病毒疫苗。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的新型冠状病毒疫苗以核酸作为疫苗的主要免疫原物质，包含含有第一阅读框和含有第二阅读框的核酸分子，其中第一开放阅读框编码新型冠状病毒Delta变异株S蛋白，第二开放阅读框编码新型冠状病毒奥密克戎（Omicron）子变异株BA.5 S蛋白。该新型冠状病毒疫苗免疫机体后，能够在机体内表达新型冠状病毒Delta变异株和奥密克戎子变异株BA.5的S蛋白，对于新冠病毒各变异株产生的抗体活性下降较少，为一种多价疫苗。
含有编码新型冠状病毒Delta变异株S蛋白的核酸分子免疫动物后，动物血清中产生的抗体对新冠病毒的原始株、Alpha变异株、Beta变异株、Gamma变异株、Delta变异株和Omicron变异株6种毒株假病毒都具有较强的中和活性；含有编码新型冠状病毒奥密克戎变异株S蛋白的核酸分子免疫动物后，动物血清中产生的抗体对Omicron变异株具有较强的中和活性；结合新冠病毒世界流行毒株分布，使新型冠状病毒疫苗的免疫原能够编码Delta变异株S蛋白和奥密克戎变异株S蛋白，能兼具对新型冠状病毒各流行株的预防作用。
本发明通过实验发现，含有编码新型冠状病毒Delta变异株和Omicron变异株的S蛋白免疫动物后，产生的抗体对流行的新冠病毒Delta变异株、新冠病毒Omicron BA.5变异株、新冠病毒Omicron BA.2变异株和新冠病毒Omicron BA.5变异株具有较好的中和活性，实现了预防的新型冠状病毒变异株种类增加的效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1-1为实施例4中各疫苗制剂免疫食蟹猴后产生的血清对新型冠状病毒的假病毒中和活性测试结果；图1-2为实施例4中疫苗制剂免疫食蟹猴后产生的血清对新型冠状病毒的假病毒中和活性测试结果。
图2为实施例5中各疫苗制剂的假病毒中和活性测试结果。
图3为实施例6各疫苗制剂的假病毒中和活性测试结果。
图4为实施例8中各疫苗制剂的假病毒中和活性测试结果。
图5为实施例9中各疫苗制剂的假病毒中和活性测试结果。
图6为实施例10中各疫苗制剂的假病毒中和活性测试结果。
图7为实施例11中各疫苗制剂的假病毒中和活性测试结果。
图8为实施例12中各疫苗制剂的假病毒中和活性测试结果。
图9为实施例13中各疫苗制剂的假病毒中和活性测试结果。
图10为实施例14中各疫苗制剂的假病毒中和活性测试结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需说明的是：本发明中如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方法可以相互组合形成新的技术方案；本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案；所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合形成新的技术方案。
本发明所公开的“范围”以下限和上限的形式，可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限；除非另有说明，操作步骤可以顺序进行，也可以不按照顺序进行。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种新型冠状病毒疫苗，所述新型冠状病毒疫苗主要以核酸分子作为免疫原物质，包含含有第一阅读框和含有第二阅读框的核酸分子，其中第一开放阅读框编码新型冠状病毒Delta变异株S蛋白，第二开放阅读框编码新型冠状病毒奥密克戎（Omicron）子变异株BA.5 S蛋白。该新型冠状病毒疫苗免疫机体后，能够在机体内表达新型冠状病毒Delta变异株和奥密克戎子变异株BA.5 S蛋白，为一种多价疫苗。
本发明中所述的“核酸分子”指的是任何长度的核苷酸的聚合物形式，核苷酸包括核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸。核酸的实例包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA；整合由外源基因的载体DNA，例如表达盒或质粒；DNA-RNA杂合体或者包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然、化学或生化修饰、非天然或衍生的核苷酸碱基的聚合物。
需要说明的是，所述包含含有第一阅读框和含有第二阅读框的核酸分子中，第一阅读框和第二阅读框可以存在于同一核酸分子，也可以存在于不同的核酸分子。因此，只要新型冠状病毒疫苗包含的核酸分子中含有第一阅读框和第二阅读框，施用于机体后能够在机体内产生新型冠状病毒Delta变异株和奥密克戎子变异株BA.5S蛋白，即属于本发明提供的新型冠状病毒疫苗。
在一些可选的实施方式中，所述新型冠状病毒疫苗包含：含有第一开放阅读框的核酸分子；和，含有第二开放阅读框的核酸分子；或，所述新型冠状病毒疫苗包含：同时含有第一开放阅读框和第二开放阅读框的融合核酸分子。
本发明通过实验发现，含有编码新型冠状病毒Delta变异株S蛋白的核酸分子免疫动物后，动物血清中产生的抗体对新冠病毒的原始株、Alpha变异株、Beta变异株、Gamma变异株、Delta变异株和Omicron变异株6种毒株假病毒都具有较强的中和活性；含有编码新型冠状病毒奥密克戎变异株S蛋白的核酸分子免疫动物后，动物血清中产生的抗体对Omicron变异株具有较强的中和活性；结合新冠病毒世界流行毒株分布，使新型冠状病毒疫苗含有能够编码Delta变异株S蛋白和奥密克戎变异株S蛋白的核酸分子，能兼具对新型冠状病毒各流行株的预防作用。
本发明提供的新型冠状病毒疫苗中，开放阅读框编码的新型冠状病毒的S蛋白可选地为Delta变异株和/或奥密克戎变异株在自然条件下突变得到的S蛋白；也可选地为经人工突变和改造的S蛋白，所述突变和改造可以为经野生型突变和改造得到符合Delta变异株或奥密克戎变异株的S蛋白的氨基酸序列；或，也可以为在Delta变异株和奥密克戎变异株的S蛋白的氨基酸序列的基础上，进一步进行突变和改造而获得的S蛋白的氨基酸序列。
开放阅读框编码的新型冠状病毒的S蛋白的氨基酸序列优选如下：新型冠状病毒Delta变异株S蛋白的氨基酸序列优选如Seq_8所示；
新型冠状病毒奥密克戎变异株的S蛋白的氨基酸序列来源于BA.5子变异株、BA.2子变异株、BA.3子变异株的S蛋白或BA.5子变异株的S蛋白；或，所述奥密克戎变异株的S蛋白的氨基酸序列可选地来源于野生型S蛋白经突变后得到的氨基酸序列。
在一些优选地实施方式中，所述新型冠状病毒奥密克戎变异株为BA.2子变异株或BA.1子变异株或BA.5子变异株的S蛋白；更优选为BA.5子变异株。
新型冠状病毒奥密克戎BA.1子变异株S蛋白的氨基酸序列优选如Seq_16所示。
新型冠状病毒奥密克戎BA.2子变异株S蛋白的氨基酸序列优选如Seq_14所示。
新型冠状病毒奥密克戎BA.5子变异株S蛋白的氨基酸序列优选如Seq_26所示。
Seq_26为在Omicron BA.5毒株的野生型S蛋白的基础上，在氨基酸序列位置981和982处具有两处脯氨酸残基取代获得，使得Seq_26所示序列具有更高的表达量。
本发明提供的新型冠状病毒疫苗以核酸分子作为主要功效成分，该新型冠状病毒疫苗施用于机体后在体内表达产生新型冠状病毒Delta变异株和病毒奥密克戎株的S蛋白。为了进一步提高疫苗的免疫效果，本发明还对核酸分子、两种编码S蛋白的核酸比例以及疫苗制剂进行了优化。
核酸分子的优化：
新型冠状病毒疫苗中含有的核酸分子优选为RNA，所述新型冠状病毒疫苗优选为RNA疫苗。
在一些优选地实施方式中，RNA中的开放阅读框部分的总GC%含量为30~70%，例如可以为但不限于为30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%或70%，或其任意两点之间的范围值，优选为50%~60%，更优选为54%~60%。同时，开放阅读框部分中任意一长度为60 bp的片段中GC%含量不低于40%，本发明通过实验发现，符合上述条件的RNA的新型冠状病毒S蛋白的表达量更高。
在一些优选地实施方式中，所述RNA还包括5’帽子、5’UTR、3’UTR、polyA尾、起始区、终止区、信号序列区和linker序列中的一种或多种；新型冠状病毒疫苗中的RNA的结构优选如下：
可选地，RNA从5’端到3’端依次包括：5’帽子-5’UTR-第一开放阅读框和/或第二开放阅读框-3’UTR-3’polyA尾；依次包括表示RNA从5’端到3’依次含有上述片段，各片段之间可以含有也可以不含有至少一个核糖核苷酸或具有功能的核酸片段。
可选地，RNA同时含有第一开放阅读框和第二开放阅读框，为融合RNA，融合RNA的结构优选如下：一种可选地示例结构如下：5’帽子-5’UTR-起始区-第一开放阅读框-linker序列-第二开放阅读框-3’UTR-终止区-3’polyA尾；
或，5’帽子-5’UTR-第一开放阅读框-linker序列-第二开放阅读框-3’UTR-3’polyA尾；
一种可选地示例结构如下：5’帽子-5’UTR-起始区-（第一编码区-linker序列）n-（linker序列-第二编码区）m-3’UTR-终止区-3’polyA尾；或，5’帽子-5’UTR-（第一编码区-linker序列）n-（linker序列-第二编码区）m-3’UTR-3’polyA尾；
其中，n为：片段“第一编码区-linker序列”的重复数；m为：片段“linker序列-第二编码区”的重复数；n和m分别独立的为正整数。
在上述示例中，可以通过调节片段“第一编码区-linker序列”和片段“linker序列-第二编码区”的重复数，即n和m的值，或调整n和m的比值来调整编码新型冠状病毒Delta变异株S蛋白的开放阅读框和编码新型冠状病毒奥密克戎变异株S蛋白的开放阅读框的含量，从而实现新型冠状病毒中RNA免疫机体后，能够产生不同含量和比例的Delta变异株S蛋白和奥密克戎变异株S蛋白。
RNA中其他功能片段优选如下：
5’帽子结构用于增加mRNA稳定性，避免mRNA被核酸外切酶降解，5’帽子结构优选为m7G（5’）（2’-OMeA）pG。
5’UTR和3’UTR用于调控mRNA的翻译，
5’UTR序列优选为：GGGAGAAAGCUUACC（如Seq_1所示）。
3’UTR序列优选为：
GGACUAGUUAUAAGACUGACUAGCCCGAUGGGCCUCCCAACGGGCCCUCCUCCCCUCCUUGCACCGAGAUUAAU（如Seq_2所示）。
3’polyA尾用于避免mRNA被核酸外切酶降解，同时终结转录，polyA的长度为80-150bp，优选100 bp，序列如Seq_3所示。
在一些可选地实施方式中，Linker序列含有至少一个编码蛋白质切割信号的部分，所述蛋白质切割信号例如可以为但不限于为如下具有切割功能物质的切割信号：蛋白前体转化酶、激素前体转化酶、凝血酶和因子Xa蛋白中。蛋白质切割信号优选包括Furin切割位点（furin cleavage site，FCS，参考US7374930B2）。Furin切割位点广泛分布在大多数细胞类型中，上述融合RNA可以在体内几乎任何类型的细胞中有效表达活性多肽，因此采用Furin切割位点可以使上述融合RNA在体内表达的活性多肽得到有效的切割，使融合于同一RNA上的第一和第二开放阅读框分别表达Delta变异株S蛋白和奥密克戎变异株S蛋白。
Furin切割位点的DNA序列优选为CGTCAACGTCGT（Seq_6）；RNA序列优选为CGUCAACGUCGU（Seq_7）。
在一些可选地实施方式中，Linker为可切割接头或蛋白酶敏感接头。可切割接头优选采用2A肽，2A肽（2A self-cleaving peptides）是一类长18~22个氨基酸残基的肽片段，能诱导细胞内含有2A肽的重组蛋白自我剪切。若干病毒使用2A肽通过核糖体跳跃由一种转录物产生两种蛋白质，使得正常肽键在2A肽序列处削弱，导致由一个翻译事件产生两种不连续的蛋白质。
2A肽的实例例如可以为但不限于为：
F2A接头（口蹄疫病毒（FMDV）2A肽），氨基酸序列为：（GSG）VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（如Seq_43或Seq_44所示）；
P2A接头（猪捷申病毒-1 2A肽），氨基酸序列为：（GSG）ATNFSLLKQAGDVEENPGP（如Seq_45或Seq_46所示）；
E2A接头（马鼻炎A病毒2A肽），氨基酸序列为：（GSG）QCTNYALLKLAGDVESNPGP（如Seq_47或Seq_48所示）；
T2A接头（明脉扁刺蛾病毒2A肽），氨基酸序列为：（GSG）EGRGSLLTCGDVEENPGP（如Seq_49或Seq_50所示）。
编码2A肽的核苷酸序列包括但不限于以下序列，或以以下序列为基础，通过本文上述和/或本领域中已知的方法对2A肽的多核苷酸序列进行修饰或密码子优化：
GGAAGCGGAGCUACUAACUUCAGCCUGCUGAAGCAGGCUGGAGACGUGGAGGAGAACCCUGGACCU（如Seq_30所示）；或，
UCCGGACUCAGAUCCGGGGAUCUCAAAAUUGUCGCUCCUGUCAAACAAACUCUUAACUUUGAUUUACUCAAACUGGCTGGGGAUGUAGAAAGCAAUCCAGGTCCACUC（如Seq_31所示）。
片段“第一编码区-linker序列”中的linker序列和片段“linker序列-第二编码区”中的linker序列可以相同也可以不同。
具体的开放阅读框的序列和组合方式优选如下：
在一些可选的实施方式中，编码新型冠状病毒Delta变异株S蛋白的第一开放阅读框的核苷酸序列如Seq_9、Seq_36、Seq_37、Seq_38、Seq_39、Seq_40、Seq_41、Seq_42或Seq_29所示。
在一些可选的实施方式中，第二开放阅读框编码新型冠状病毒奥密克戎变异株BA.5子变异株，第二开放阅读框的核苷酸序列如Seq_27、Seq_32、Seq_20、Seq_21、Seq_22、Seq_23、Seq_24、Seq_25或Seq_28所示。
第一开放阅读框和第二开放阅读框可选的组合方式如下：
第一开放阅读框的核苷酸序列选自表达Delta变异株S蛋白的Seq_9、Seq_36、Seq_37、Seq_38、Seq_39、Seq_40、Seq_41、Seq_42或Seq_29所示所示中的一种；且，第二开放阅读框的核苷酸序列选自表达奥密克戎BA.2子变异株S蛋白的Seq_27、Seq_32、Seq_20、Seq_21、Seq_22、Seq_23、Seq_24、Seq_25或Seq_28所示中的一种。
第一开放阅读框和第二阅读框的具体的组合方式例如可以为但不限于为：Seq_9和Seq_27、Seq_9和Seq_32；Seq_36和Seq_32、Seq_37和Seq_20、Seq_38和Seq_21、Seq_39和Seq_22、Seq_40和Seq_23、Seq_41和Seq_24、Seq_42和Seq_25、Seq_29和Seq_28、Seq_29和Seq_28、Seq_42和Seq_25、Seq_41和Seq_24、Seq_40和Seq_23、Seq_39和Seq_32、Seq_38和Seq_22、Seq_37和Seq_21、Seq_36和Seq_20。
编码S蛋白的核酸比例：
在一些可选的实施方式中，通过调节新型冠状病毒疫苗中编码Delta变异株S蛋白的核酸含量和编码奥密克戎变异株S蛋白的含量来调节疫苗免疫机体后，在机体中产生的两种S蛋白的比例。
在一些可选的实施方式中，第一开放阅读框和第二开放阅读框位于不同的核酸分子，含有编码第一开放阅读框的核酸分子和含有编码第二开放阅读框的核酸分子的质量比为（1:9）~（9:1）；例如可以为但不限于为1:9、1:4、1:3、1:1、3:1、4:1或9:1，优选为（1:1）~（9:1），更优选为3:1。在该实施方式中，所述核酸分子优选为RNA分子，且具有如从5’端到3’端依次包括：5’帽子-5’UTR-第一开放阅读框和/或第二开放阅读框-3’UTR-3’polyA尾的结构。
在一些可选的实施方式中，所述核酸分子为融合核酸分子，即同一核酸分子中同时含有第一开放阅读框和第二开放阅读框，第一开放阅读框和第二开放阅读框在所述融合核酸分子中的重复数为（1:9）~（9:1）；例如可以为但不限于为1:9、1:4、1:3、1:1、3:1、4:1或9:1，优选为（1:1）~（9:1），更优选为3:1。
疫苗制剂优化：
可以理解的是，本发明提供的新型冠状病毒疫苗还可以含有本领域可接受的其他用于制备疫苗的辅料或功能性成分，包括但不限于疫苗佐剂、递送制剂、溶剂、防腐剂、稳定剂、pH调节剂、缓冲物质和冻干保护剂中的至少一种或多种。
在一些优选地实施方式中，所述疫苗还包括递送制剂，所述递送制剂优选为脂质成分，所述脂质成分优选和新型冠状病毒疫苗的核酸分子构成核酸脂质纳米颗粒（LNP），LNP是使用脂质成分包裹核酸形成的纳米颗粒，LNP能够使包裹其中的核酸更有效的递送至细胞内。
所述疫苗优选还包括递送制剂，所述递送制剂优选为脂质成分，所述脂质成分优选和新型冠状病毒疫苗的核酸分子构成核酸脂质纳米颗粒（LNP），LNP是使用脂质成分包裹核酸形成的纳米颗粒，LNP能够使包裹其中的核酸更有效的递送至细胞内。
所述新型冠状病毒疫苗中含有LNP可选地为如下（a）、（b）或（c）：
（a）、第一阅读框和第二阅读框分别存在与不同的核酸分子，含有第一阅读框的核酸分子和含有第二阅读框的核酸分子分别包裹于不同的LNP中，即所述新型冠状病毒疫苗包含:包裹有含有第一开放阅读框的核酸分子的LNP，和，包裹有含有第二开放阅读框的核酸分子的LNP。
（b）、第一阅读框和第二阅读框分别存在与不同的核酸分子，含有第一阅读框的核酸分子和含有第二阅读框的核酸分子混合后包裹于同一LNP中，即所述新型冠状病毒疫苗包含:包裹有含有第一开放阅读框的核酸分子，和含有第二开放阅读框的核酸分子的LNP。
（c）、第一阅读框和第二阅读框存在于同一核酸分子中，该核酸分子包裹于LNP中，即所述新型冠状病毒疫苗包含：包裹有同时含有第一开放阅读框和第二开放阅读框的核酸分子的LNP。
用于构成LNP的脂质成分优选如下：按摩尔百分比计，形成LNP的脂质成分包括20~50%可质子化阳离子脂质，例如可以为但不限于为20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%；20~50％结构脂质，例如可以为但不限于为20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%；5~20％辅助脂质，例如可以为但不限于为5%、10%、15%或20%；和1~5％表面活性剂，例如可以为但不限于为1%、2%、3%、4%或5%。其中，可质子化阳离子脂质、结构脂质、辅助脂质和表面活性剂的摩尔含量合计100％。
可质子化阳离子脂质优选包括DlinMC3-DMA、DODMA、C12-200和DlinDMA中的至少一种。
辅助脂质优选包括DSPC、DOPE、DOPC、DOPG和DOPS中的至少一种。
结构脂质优选包括胆固醇和/或胆固醇衍生物。
表面活性剂优选包括PEG-DMG、PEG-DSPE和TPGS中的至少一种。
在一些优选的实施方式中，按照摩尔百分比计，所述脂质成分包括Dlin-MC3-DMA50％、DOPG 10％、胆固醇38.5％和PEG-DMG 1.5％。
在一些优选的实施方式中，按照摩尔百分比计，所述脂质成分包括Dlin-MC3-DMA50％、DOPG 20％、胆固醇29％和PEG-DMG 1％。
在一些可选的实施方式中，所述疫苗中的LNP按照如下方法制备得到：将含有核酸分子的水相和含有所述脂质成分的有机相混合均匀得到混合液，去除有机相并使体系中的核酸分子浓度为1~100 μg/ml，例如可以为但不限于为1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100 μg/ml，优选浓度为55 μg/ml，得到所述核酸脂质纳米颗粒。
水相和有机相的混合优选使用微流控设备进行，流速控制为>3 ml/min。
去除有机相优选采用先使用缓冲液将混合液稀释50~100倍，例如可以为但不限于为50、60、70、80、90或100倍，并使用切向流过滤（TFF）去除溶液中有机相，然后浓缩使体系中的核酸分子至目标浓度。
所述水相为含有0.08~1.2 mg/L所述核酸分子的水相缓冲液，水相中的核酸分子的浓度例如可以为但不限于为0.08、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、1.1或1.2 mg/L；所述水相缓冲液为柠檬酸盐缓冲液或醋酸钠缓冲液。
所述有机相为含有5~7 mg/L所述脂质成分的无水C1~C4低碳醇，脂质成分的浓度例如可以为但不限于为5、5.5、6、6.5或7mg/ml；无水C1~C4低碳醇优选为乙醇。
所述水相和所述有机相的体积比为1:2~4，例如可以为但不限于为1:2、1:3或1:4。
需要说明的是，上述对核酸分子的优化、编码S蛋白的核酸比例的优化和疫苗制剂优化中所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。例如，在优化的编码S蛋白的核酸比例的方案中，可选地采用（a）、（b）或（c）方式制备LNP，也可选地采用或不采用其他递送方式；在疫苗制剂优化的方案中，采用不同的第一开放阅读框和第二开放阅读框的组合，制备得到多种包裹有不同核酸的LNP；当所述核酸分子采用其他类型分子时，如整合有DNA的表达盒或载体，也可以采用（a）、（b）或（c）方式制备成包裹有DNA的LNP，以作为疫苗的主要功效成分。具体的实例例如可以为但不限于为
在一些可选地实施方式中，所述新型冠状病毒疫苗中含有两种RNA分子，两种RNA分子分别含有第一阅读框和第二阅读框，第一阅读框的核苷酸序列如Seq_9所示，第二阅读框的核苷酸序列如Seq_27所示。两种RNA分子序列特征还包括5’帽子（m7G（5’）（2’-OMeA）pG）、5’UTR（如Seq_1所示）、3’UTR（如Seq_2所示）和100个polyA的3’尾（如Seq_3所示）。含有第一阅读框的RNA分子和含有第二阅读框的RNA分子的质量比（1:9）~（9:1）；例如可以为但不限于为1:9、1:4、1:3、1:1、3:1、4:1或9:1。两种RNA分子先分别制成LNP，再以RNA质量计，按照配方量混合，得到所述新型冠状病毒疫苗中的有效成分。
该实施方式中，第一阅读框的核苷酸序列还可以选自Seq_9、Seq_36、Seq_37、Seq_38、Seq_39、Seq_40、Seq_41、Seq_42或Seq_29所示中的任意一种；第二阅读框的核苷酸序列还可以选自Seq_27、Seq_32、Seq_20、Seq_21、Seq_22、Seq_23、Seq_24、Seq_25或Seq_28所示中的任意一种。
上述实施方式中，第一开放阅读框和第二阅读框的具体的组合方式例如可以为但不限于为：Seq_9和Seq_27、Seq_9和Seq_32；Seq_36和Seq_32、Seq_37和Seq_20、Seq_38和Seq_21、Seq_39和Seq_22、Seq_40和Seq_23、Seq_41和Seq_24、Seq_42和Seq_25、Seq_29和Seq_28、Seq_29和Seq_28、Seq_42和Seq_25、Seq_41和Seq_24、Seq_40和Seq_23、Seq_39和Seq_32、Seq_38和Seq_22、Seq_37和Seq_21、Seq_36和Seq_20。
在另一些可选地实施方式中，所述新型冠状病毒疫苗中含有两种RNA分子，两种RNA分子分别含有第一阅读框和第二阅读框，第一阅读框的核苷酸序列如Seq_9所示，第二阅读框的核苷酸序列如Seq_27所示。两种RNA分子序列特征还包括5’帽子（m7G（5’）（2’-OMeA）pG）、5’UTR（如Seq_1所示）、3’UTR（如Seq_2所示）和100个polyA的3’尾（如Seq_3所示）。含有第一阅读框的RNA分子和含有第二阅读框的RNA分子的质量比（1:9）~（9:1）；例如可以为但不限于为1:9、1:4、1:3、1:1、3:1、4:1或9:1。先将两种RNA分子按照配方量混合，然后制备包裹有两种RNA分子的LNP，得到所述新型冠状病毒疫苗中的有效成分。
上述实施方式中，第一阅读框的核苷酸序列还可以选自Seq_9、Seq_36、Seq_37、Seq_38、Seq_39、Seq_40、Seq_41、Seq_42或Seq_29所示中的任意一种；第二阅读框的核苷酸序列还可以选自Seq_27、Seq_32、Seq_20、Seq_21、Seq_22、Seq_23、Seq_24、Seq_25或Seq_28所示中的任意一种。
上述实施方式中，第一开放阅读框和第二阅读框的具体的组合方式例如可以为但不限于为：Seq_9和Seq_27、Seq_9和Seq_32；Seq_36和Seq_32、Seq_37和Seq_20、Seq_38和Seq_21、Seq_39和Seq_22、Seq_40和Seq_23、Seq_41和Seq_24、Seq_42和Seq_25、Seq_29和Seq_28、Seq_29和Seq_28、Seq_42和Seq_25、Seq_41和Seq_24、Seq_40和Seq_23、Seq_39和Seq_32、Seq_38和Seq_22、Seq_37和Seq_21、Seq_36和Seq_20。
在另一些可选地实施方式中，所述新型冠状病毒疫苗中含有融合RNA分子，融合RNA分子含有至少含有第一开放阅读框和第二开放阅读框的两个编码区，其中第一开放阅读框序列选自Seq_9所示核苷酸序列，第二开放阅读框序列选自Seq_27所示核苷酸序列。
融合RNA分子的结构为5’帽子-5’UTR-（第一编码区-linker序列）n-（linker序列-第二编码区）m-3’UTR-3’polyA尾，n和m分别独立的为正整数。其中5’帽子为m7G（5’）（2’-OMeA）pG、5’UTR如Seq_1所示、3’UTR如Seq_2所示和polyA如Seq_3所示，Linker序列均如Seq_21所示。n和m的比为（1:9）~（9:1）；例如可以为但不限于为1:9、1:4、1:3、1:1、3:1、4:1或9:1。将上述融合RNA分子制备得到LNP，作为新型冠状病毒疫苗中的有效成分。
上述实施方式中，第一开放阅读框的核苷酸序列还可以选自第一阅读框的核苷酸序列还可以选自Seq_9、Seq_36、Seq_37、Seq_38、Seq_39、Seq_40、Seq_41、Seq_42或Seq_29所示中的任意一种；第二阅读框的核苷酸序列还可以选自Seq_27、Seq_32、Seq_20、Seq_21、Seq_22、Seq_23、Seq_24、Seq_25或Seq_28所示中的任意一种。
上述实施方式中，第一开放阅读框和第二阅读框的具体的组合方式例如可以为但不限于为：Seq_9和Seq_27、Seq_9和Seq_32；Seq_36和Seq_32、Seq_37和Seq_20、Seq_38和Seq_21、Seq_39和Seq_22、Seq_40和Seq_23、Seq_41和Seq_24、Seq_42和Seq_25、Seq_29和Seq_28、Seq_29和Seq_28、Seq_42和Seq_25、Seq_41和Seq_24、Seq_40和Seq_23、Seq_39和Seq_32、Seq_38和Seq_22、Seq_37和Seq_21、Seq_36和Seq_20。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述新型冠状病毒疫苗的制备方法，所述制备方法包括将所述核酸分子与任选地辅料混合，得到所述新型冠状病毒疫苗。
在一些可选地实施方式中，所述新型冠状病毒疫苗包括核酸脂质纳米颗粒，所述制备方法包括：
分别制备包裹有含有第一开放阅读框的核酸分子的核酸脂质纳米颗粒，和，包裹有含有第二开放阅读框的核酸分子的核酸脂质纳米颗粒，得到分别包裹不同开放阅读框的核酸脂质纳米颗粒，然后按照配方量将两种核酸脂质纳米颗粒混合。
或者，先将含有第一开放阅读框的核酸分子和含有第二开放阅读框的核酸分子按照配方量混合，再制备得到包裹有含有两种核酸分子的核酸脂质纳米颗粒。
或者，制备包裹有同时含有第一开放阅读框和第二开放阅读框的核酸分子的核酸脂质纳米颗粒。
上述核酸脂质纳米颗粒的制备方法优选按照上述新型冠状病毒疫苗技术方案部分记载的脂质纳米颗粒（LNP）的方法，在此不再赘述。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述新型冠状病毒疫苗，或上述新型冠状病毒疫苗的制备方法在制备用于预防或治疗新型冠状病毒引发的疾病的产品中的应用。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种用于预防或治疗新型冠状病毒引发的疾病的产品，该产品包含上述新型冠状病毒疫苗。
上述用于预防或治疗新型冠状病毒引发的疾病的产品例如可以为但不限于为还含有用于接种上述新型冠状病毒疫苗装置的试剂盒；还含有其他预防或治疗活性成分的试剂盒；或，还含有用于评价上述新型冠状病毒疫苗有效性物质的试剂盒等。
下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。
实施例1
本实施例提供了一种包含RNA的脂质纳米颗粒的制备方法，其中脂质纳米颗粒按照摩尔百分比计包括：Dlin-MC3-DMA 50％、DOPG 20％、胆固醇29％和PEG-DMG 1％，制备方法如下：
（a）将RNA溶解于pH4的柠檬酸盐缓冲液，将浓度调整为0.1 mg/ml，得到水相。
（b）按照配方量将Dlin-MC3-DMA、DOPG、胆固醇和PEG-DMG按照配方量溶解于无水乙醇，将有机相中的脂质成分的浓度调整至6 mg/mL，得到有机相。
（c）将步骤（a）的水相和步骤（b）的有机相按照1:3的体积比，使用微流控设备，按照12 mL/min的流速混合，混合液立刻用pH7.4的PBS溶液稀释100倍，并使用切向流过滤（TFF）除去溶液中乙醇成分，然后浓缩至体系中的mRNA的浓度为55 μg/ml，得到包含编码SARS-CoV-2病毒抗原的RNA的脂质纳米颗粒。
实施例2
利用荧光素酶作为报告基因，通过活体荧光成像技术研究不同疫苗载体的配方(如下表1所示，“MC3”是指Dlin-MC3-DMA，“+”：给药后通过小动物活体荧光成相系统检测到小鼠体内荧光素酶表达)在小鼠体内递送编码荧光素酶基因的mRNA的效率，并检测不同复合制剂(制备方法参见实施例1)的理化指标，结果如表1所示。通过研究发现，提高脂质与mRNA质量比有利于增加mRNA在脂质纳米颗粒中的包封率从而使其具有更高的稳定性，此外适度提高配方中聚乙二醇(PEG)的含量有利于提高mRNA在体内的表达效率。因此综合考虑mRNA包封率以及mRNA体内递送效率等因素，选取了3和4号配方用于后续mRNA疫苗的研究。
表1
实施例3
不同配方的阳离子脂质纳米颗粒包裹编码S蛋白全长的mRNA的能力及形成纳米颗粒的粒度数据如表2所示，几种配方均能将S蛋白mRNA压缩成粒径100nm以下表面电位净中性的纳米颗粒，同时均能包裹至少50%的mRNA，因此均可具备一定的体内递送效果。“MC3”是指Dlin-MC3-DMA。
表2
实施例4
本实施例设计了一系列mRNA序列，其中阅读框的序列如表3所示；除阅读框序列外，该系列mRNA序列特征还包括5’帽子、5’UTR（如Seq_1所示）、3’UTR（如Seq_2所示）和100个polyA的3’尾（如Seq_3所示）。
表3 mRNA序列设计方案
将上述各个mRNA按照实施例1提供的制备方法制备为脂质纳米颗粒。
实验A：选取5~8岁龄左右正常食蟹猴，进行疫苗免疫原性评价。动物被随机分为5组，即原始株组（Seq_13）（50 µg/只）、Delta组（Seq_9）（50 µg/只）、Beta组（Seq_5）（50 µg/只）、Omicron组（Seq_11）（50 µg/只）和阴性对照组，每组12只，雌雄各半。
将实施例2制备的mRNA LNP制剂用于食蟹猴免疫实验，每只食蟹猴通过后肢大腿肌肉注射50 微克（以mRNA计），分别于D0（给药当天即为D0）和D21通过后肢大腿肌肉注射对应受试疫苗及对照疫苗，其中，阴性对照组注射0.5 mL的PBS。首次免疫后28天抽取食蟹猴血清送第三方实验室进行SARS-CoV-2假病毒中和活性测试。在96孔板内将食蟹猴血清按照不同比例稀释后（初始稀释倍数为30）加入可感染SARS-CoV-2假病毒，并同时设置细胞对照和病毒对照，孵育1小时，加入事先准备好的细胞，于细胞培养箱中培养20~28小时，吸弃一部分上清，加入荧光素酶检测试剂，室温避光反应后，反复吹吸孔内细胞，使细胞充分裂解后，置于化学发光检测仪中读取发光值。确保病毒对照和细胞对照成立的前提下，采用Reed-Muench法计算EC50值。血清对应分组编号及结果如图1-1所示。
从图1-1可以看出：（1）4种抗原制备而成疫苗制剂可刺激食蟹猴产生对目标毒株假病毒具有中和能力的抗体。
（2）编码新冠病毒Delta变异株S蛋白的mRNA（Seq_9）疫苗制剂刺激食蟹猴产生的抗体对新冠病毒的原始株、Alpha变异株、Beta变异株、Gamma变异株、Delta变异株和Omicron变异株6种毒株假病毒都具有较强的中和活性；
编码新冠病毒原始株S蛋白的mRNA（Seq_13）疫苗制剂刺激食蟹猴产生的抗体对新冠病毒的原始株、Alpha变异株、Beta变异株、Gamma变异株和Delta变异株5种毒株假病毒同样都具有较强的中和活性，而对Omicron变异株的中和活性则较弱；
编码新冠病毒Beta变异株S蛋白的mRNA（Seq_5）疫苗制剂刺激食蟹猴产生的抗体对新冠病毒的Beta变异株、Gamma变异株和Delta变异株3种毒株假病毒具有较强的中和活性，而对原始株、Alpha变异株和Omicron变异株的中和活性则较弱。
从刺激食蟹猴产生的抗体对各新冠病毒毒株及变异株的假病毒中和活性来看，编码新冠病毒Delta变异株和编码新冠病毒原始株S蛋白的mRNA疫苗制剂产生的抗体具备更广泛的中和活性。
实验B：选取5~8岁龄左右正常食蟹猴，进行疫苗免疫原性评价。动物被随机分为3组，即原始株组（Seq_13）（50 µg/只）、Delta组（Seq_9）（50 µg/只）、和阴性对照组，每组36只，雌雄各半。按照实验A所述方法开展SARS-CoV-2假病毒中和活性测试。确保病毒对照和细胞对照成立的前提下，采用Reed-Muench法计算EC50值。血清对应分组编号及结果如图1-2所示。编码新冠病毒Delta变异株S蛋白的mRNA疫苗制剂样品记为样品1-1，编码新冠病毒原始株S蛋白的mRNA疫苗制剂样品记为样品1-2。
编码新冠病毒Delta变异株S蛋白的mRNA疫苗制剂对流行毒株如Beta变异株和Omicron变异株具有更好的中和活性。
实施例5
本实施例设计了一系列mRNA序列信息，其中阅读框的序列如表4所示；除阅读框序列外，该系列mRNA序列特征还包括5’帽子、5’UTR（如Seq_1所示）、3’UTR（如Seq_2所示）和100个polyA的3’尾（如Seq_3所示）。
表4 mRNA序列设计方案
将样品1-4共四种不同抗原分别按照实施例1的方法制成疫苗，将不同组别mRNA混合物分别制备成LNP制剂，LNP制剂经检测包封率均90%以上，粒径约为70nm左右。
将制备的mRNA LNP制剂用于C57小鼠免疫实验，每只小鼠通过后肢外侧大腿肌肉注射5微克（以mRNA计），在间隔7天后进行二次免疫，每组3只小鼠。首次免疫后后14天抽取小鼠血清送第三方实验室进行SARS-CoV-2假病毒中和活性测试。在96孔板内将小鼠血清按照不同比例稀释后（初始稀释倍数为30）加入可感染SARS-CoV-2假病毒，并同时设置细胞对照和病毒对照，孵育1小时，加入事先准备好的细胞，于细胞培养箱中培养20~28小时，吸弃一部分上清，加入荧光素酶检测试剂，室温避光反应后，反复吹吸孔内细胞，使细胞充分裂解后，置于化学发光检测仪中读取发光值。确保病毒对照和细胞对照成立的前提下，采用Reed-Muench法计算EC50值。样品1-4制备的不同抗原的假病毒毒株的EC50值，结果如图2所示。
从图2结果可以看出：在mRNA疫苗阅读框编码不同的S蛋白（氨基酸序列如Seq_14、Seq_16、Seq_18、Seq_27所示）制备而成疫苗制剂中，编码氨基酸序列如Seq_27（编码氨基酸为新冠病毒Omicron BA.5毒株的S蛋白）的S蛋白的mRNA疫苗刺激小鼠产生对新冠病毒Omicron各个子变异株假病毒的中和抗体活性降低较少。
实施例6
本实施例提供了一系列新冠病毒二价疫苗，制备方法如下：
（a）按照实施例1的方法制备编码新冠病毒Omicron BA.1变异株S蛋白、编码新冠病毒Omicron BA.2变异株S蛋白和编码新冠病毒Omicron BA.5变异株S蛋白的mRNA（阅读框序列分别如Seq_14、Seq_16和Seq_27）脂质纳米颗粒样品1.1、1.2和1.3。
（b）按照实施例1的方法制备编码新冠病毒Delta变异株S蛋白的mRNA（Seq_9）脂质纳米颗粒样品2；
（c）将样品1.1、1.2和1.3分别与样品2以质量比3:1混合制备新冠病毒二价mRNA疫苗样品1、2和3。编码新冠病毒Omicron 变异株和Delta变异株S蛋白的mRNA除了上述阅读框序列外，还包括5’帽子、5’UTR（如Seq_1所示）、3’UTR（如Seq_2所示）和100个polyA的3’尾（如Seq_3所示）。
将上述制备的3个样品用于C57小鼠免疫实验，每只小鼠通过后肢外侧大腿肌肉注射5微克（以mRNA计），在间隔7天后进行二次免疫，每组3只小鼠。首次免疫后14天抽取小鼠血清送第三方实验室进行SARS-CoV-2假病毒中和活性测试。在96孔板内将小鼠血清按照不同比例稀释后（初始稀释倍数为30）加入可感染SARS-CoV-2假病毒，并同时设置细胞对照和病毒对照，孵育1小时，加入事先准备好的细胞，于细胞培养箱中培养20~28小时，吸弃一部分上清，加入荧光素酶检测试剂，室温避光反应后，反复吹吸孔内细胞，使细胞充分裂解后，置于化学发光检测仪中读取发光值。确保病毒对照和细胞对照成立的前提下，采用Reed-Muench法计算EC50值。血清对应分组编号及结果如图3所示。
从图上可以看到，新冠病毒二价mRNA疫苗样品3（包括编码新冠病毒Omicron BA.5变异株S蛋白的mRNA脂质纳米颗粒和编码新冠病毒Delta变异株S蛋白的mRNA脂质纳米颗粒）在假病毒测试中，针对各病毒变异株所产生的抗体活性下降较少。
实施例7
本实施例根据新冠病毒Omicron毒株S蛋白（氨基酸序列如Seq_26所示）及mRNA序列优化原则，设计了一系列mRNA序列，其中阅读框信息如下表5所示。
除了表5的阅读框外，该系列mRNA序列特征还包括5’帽子、5’UTR（如Seq_1所示）、3’UTR（如Seq_2所示）和100个polyA的3’尾（如Seq_3所示）。
表5 mRNA序列设计方案及相对表达量
表5中“局部的GC%含量”：从ORF的3’端到5’端，以60bp作为window size的局部序列中GC%含量。
将表5所示的mRNA转染细胞，检测S全长蛋白在细胞中的表达，结果如表5所示。详细方法如下：转染各mRNA 24小时后的HEK293细胞进行裂解，按10μg总蛋白的上样量，采用SDS-PAGE免疫印记法对目的蛋白进行特异性检测，在本实施例中，分别使用抗SARS-S1蛋白抗体作为一抗、用羊抗鼠-HRP抗体作为二抗进行孵育，然后显色。对蛋白表达量检测结果进行分析时，使用内参β-actin进行标化定量，同时设置未转染mRNA的细胞作为阴性对照，比较不同mRNA转染细胞后表达蛋白量的差异。检测结果显示，均可以检测到S蛋白全长的表达以及S1亚基。各个序列的表达量以相对OD值计量，如表5所示；其中相对OD值的计算方法为：样品OD值/样品1的OD值。
从表5可以看出：当mRNA阅读框序列总体的GC%含量为54-60%时，局部的GC%含量不低于40%时，S蛋白的相对表达量较高（见Seq_27和32）；另外相比于mRNA阅读框序列Seq_32，mRNA阅读框序列为Seq_27的S蛋白表达量更高一些。
实施例8
将实施例7中的样品1和2共两种不同抗原分别按照实施例1的方法制成疫苗，将不同组别mRNA混合物分别制备成LNP制剂，LNP制剂经检测包封率均90%以上，粒径约为70nm。将所得两组疫苗制剂用于C57小鼠免疫实验，实验方法见实施例6所示。血清对应分组编号及结果如图4所示。
从图4中可以看出：由于mRNA序列Seq ID NO.27的表达量较高，由mRNA序列Seq IDNO.27制备的mRNA疫苗制剂产生的抗体中和能力最优。
实施例9
本实施例提供了一系列新冠病毒二价疫苗，制备方法如下：
（a）按照实施例1的方法制备编码新冠病毒Omicron BA.5变异株S蛋白的mRNA（Seq_27）脂质纳米颗粒样品1。
（b）按照实施例1的方法制备编码新冠病毒Delta变异株S蛋白的mRNA（Seq_9）脂质纳米颗粒样品2；
（c）将样品1与样品2以质量比1:15、1:10、1:9、1:4、1:3、1:1、3:1、4:1、9:1、10:1和15:1混合制备新冠病毒二价mRNA疫苗样品2-1~2-11。编码新冠病毒Omicron BA.5变异株和Delta变异株S蛋白的mRNA除了Seq_27和Seq_9阅读框外，还包括5’帽子、5’UTR（如Seq_1所示）、3’UTR（如Seq_2所示）和100个polyA的3’尾（如Seq_3所示）。
将上述制备的11个样品用于C57小鼠免疫实验，实验方法见实施例6所述。血清对应分组编号及结果如图5所示。
假病毒毒株EC50值不低于200时，认为所测试的疫苗产生的抗体中和活性更佳。图5中的条形图展示了样品2-1~2-11的假病毒毒株EC50值；虚线为指示线，指示假病毒毒株EC50值为200的位置。
实施例10
本实施例提供了一系列新冠病毒二价疫苗，制备方法如下：
本实施例提供的新冠病毒二价疫苗包含编码抗原1和抗原2的RNA的脂质纳米颗粒，其中脂质纳米颗粒按照摩尔百分比计包括 Dlin-MC3-DMA 50％、DOPG 10％、胆固醇38.5％和PEG-DMG 1.5％。
制备方法如下：
（a）将编码不同抗原的RNA溶解于pH4的柠檬酸盐缓冲液，将浓度调整为0.1 mg/ml，得到水相；
（b）按照配方量将Dlin-MC3-DMA、DOPG、胆固醇和PEG-DMG按照配方量溶解于无水乙醇，将有机相中的脂质成分的浓度调整至6 mg/mL，得到有机相。
（c）将步骤（a）的水相和步骤（b）的有机相按照1:3的体积比，使用微流控设备，按照12 mL/min的流速混合，混合液立刻用pH7.4的PBS溶液稀释100倍，并使用切向流过滤（TFF）除去溶液中乙醇成分，然后浓缩至体系中的mRNA的浓度为0.55 mg/ml，得到包含编码抗原1和抗原2的RNA的脂质纳米颗粒。
当编码抗原1的核苷酸阅读框序列为Seq_9（编码新冠病毒Delta变异株的S蛋白）、编码抗原2的核苷酸阅读框序列为Seq_27（编码新冠病毒Omicron BA.5变异株的S蛋白）时，抗原1和抗原2以1:15、1:10、1:9、1:4、1:3、1:1、3:1、4:1、9:1、10:1和15:1制备样品1-11。当编码抗原1和2的核苷酸序列除了阅读框外，还包括5’帽子、5’UTR（如Seq_1所示）、3’UTR（如Seq_2所示）和100个polyA的3’尾（如Seq_3所示）。M1和M2分别为包括5’帽子、5’UTR、阅读框、3’UTR和3’尾的编码抗原1的mRNA质量和编码抗原2的mRNA质量。
将上述制备的11个样品用于C57小鼠免疫实验，实验方法见实施例6所述。血清对应分组编号及结果如图6。
假病毒毒株EC50值不低于200时，认为所测试的疫苗产生的抗体中和活性更佳。图6中的条形图展示了样品1-11的假病毒毒株EC50值；虚线为指示线，指示假病毒毒株EC50值为200的位置。
从图6中可以看出：当M1：M2为（1：9）~（9:1）时（样品3~9），新冠病毒二价mRNA疫苗刺激小鼠产生的抗体对流行的新冠病毒各变异株的中和活性较好。其中M1：M2为（1：1）~（9:1）时（样品6~9），抗体的中和活性更优。
实施例11
按照实施例7所述的方法制备编码新冠病毒Delta变异株S蛋白的mRNA（Seq_9）和编码新冠病毒Omicron BA.5变异株S蛋白的mRNA（Seq_27）的新冠二价mRNA脂质纳米颗粒疫苗，2种脂质纳米颗粒的质量比例分别为1:1和3:1，分别记作样品a和b。
按照实施例8所述的方法制备编码新冠病毒Delta变异株S蛋白的mRNA（Seq_9）和编码新冠病毒Omicron BA.5变异株S蛋白的mRNA（Seq_27）的新冠二价mRNA脂质纳米颗粒疫苗，2种mRNA的质量比为1:1和3:1，记作样品c和样品d。
上述的mRNA序列特征还包括5’帽子、5’UTR（如Seq_1所示）、3’UTR（如Seq_2所示）和100个polyA的3’尾（如Seq_3所示）。
按照实施例6的方法测试本实施例中制备的新冠病毒二价mRNA疫苗样品a、b、c和d的假病毒毒株EC50值，实验结果如图7所示。
实施例12
本实施例提供的新型冠状病毒疫苗中的RNA分子为融合RNA的结构，具体结构如下：
5’帽子-5’UTR-（第一编码区-linker序列）n-（linker序列-第二编码区）m-3’UTR--3’polyA尾；n=3，m=1;
其中，第一编码区的核苷酸序列如Seq_9所示；第二编码区的核苷酸序列如Seq_27所示；
5’帽子为m7G（5’）（2’-OMeA）pG；5’UTR如Seq_1所示；3’UTR如Seq_2所示；100个polyA的3’尾如Seq_3所示；
Linker序列均如Seq_31所示。
将上述融合RNA按照实施例1提供的制备方法制备成LNP，按照实施例6的方法测试本实施例中制备的新冠病毒二价mRNA疫苗样品的假病毒毒株EC50值，实验结果如图8所示。
实施例13
本实施例提供了一系列新冠病毒二价疫苗，按照实施例7所述的方法制备，其中编码新冠病毒Omicron BA.5变异株S蛋白的mRNA阅读框序列和编码新冠病毒Delta变异株S蛋白的mRNA阅读框序列、以及质量比如下表所示：
表6
按照实施例6的方法测试本实施例中制备的新冠病毒二价mRNA疫苗样品12-1~12-11的假病毒毒株EC50值，实验结果如图9所示。
实施例14
本实施例提供了一系列新冠病毒二价疫苗，按照实施例8所述的方法制备，其中编码新冠病毒Omicron BA.5变异株S蛋白的mRNA阅读框序列和编码新冠病毒Delta变异株S蛋白的mRNA阅读框序列、以及质量比如下表所示：
表7
按照实施例6的方法测试本实施例中制备的新冠病毒二价mRNA疫苗样品13-1~13-11的假病毒毒株EC50值，实验结果如图10所示。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.新型冠状病毒疫苗，其特征在于，所述新型冠状病毒疫苗包含含有第一阅读框和含有第二阅读框的核酸分子；
所述第一开放阅读框编码新型冠状病毒Delta变异株S蛋白；
所述第二开放阅读框编码新型冠状病毒奥密克戎子变异株BA.5 S蛋白。
2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒疫苗，其特征在于，所述新型冠状病毒疫苗包含：含有第一开放阅读框的核酸分子；和，含有第二开放阅读框的核酸分子；
或，所述新型冠状病毒疫苗包含：同时含有第一开放阅读框和第二开放阅读框的融合核酸分子。
3.根据权利要求1所述的新型冠状病毒疫苗，其特征在于，新型冠状病毒Delta变异株S蛋白的氨基酸序列如Seq_8所示；所述新型冠状病毒奥密克戎子变异株BA.5 S蛋白的氨基酸序列如Seq_26所示。
4.根据权利要求1所述的新型冠状病毒疫苗，其特征在于，所述核酸分子为RNA；
优选地，RNA中开放阅读框的部分总GC%含量为30~70%，所述开放阅读框的片段中任意一长度为60bp的片段中GC%含量不低于40%；
优选地，RNA中开放阅读框的部分总GC%含量为50%~60%，更优选为54%~60%；
优选地，所述RNA还包括5’帽子、5’UTR、3’UTR、polyA尾、起始区、终止区、信号序列区和linker序列中的一种或多种；
优选地，所述RNA从5’端到3’端依次包括：5’帽子-5’UTR-第一开放阅读框和/或第二开放阅读框-3’UTR-3’polyA尾；
优选地，所述RNA含有第一开放阅读框和第二开放阅读框；
优选地，所述RNA从5’端到3’端依次包括：5’帽子-5’UTR-起始区-第一开放阅读框-linker序列-第二开放阅读框-3’UTR-终止区-3’polyA尾；
优选地，所述RNA从5’端到3’端依次包括：5’帽子-5’UTR-（第一开放阅读框-linker 序列）n-（linker 序列-第二开放阅读框）m-3’UTR-3’polyA尾；
n为片段第一编码区-linker序列的重复数；m为片段linker序列-第二编码区的重复数；n和m分别独立的为正整数；
优选地，所述5’帽子为：m7G（5’）（2’-OMeA）pG；
优选地，所述5’UTR的序列如Seq_1所示；优选地，所述3’UTR的序列如Seq_2所示；
优选地，所述3’polyA尾的序列如Seq_3所示；
优选地，linker序列中含有蛋白质切割信号；
优选地，所述蛋白质切割信号包括蛋白前体转化酶、激素前体转化酶、凝血酶、因子Xa蛋白酶中至少一种的切割信号；
优选地，所述蛋白质切割信号为Furin切割位点；
优选地，所述Furin切割位点的RNA核苷酸序列如Seq_7所示；
优选地，所述linker序列为可切割接头或蛋白酶敏感接头；
优选地，所述可切割接头包括F2A接头、P2A接头、T2A切割接头或E2A切割接头。
5.根据权利要求4所述的新型冠状病毒疫苗，其特征在于，所述第一开放阅读框的核苷酸序列如Seq_9、Seq_36、Seq_37、Seq_38、Seq_39、Seq_40、Seq_41、Seq_42或Seq_29所示；
优选地，所述第二开放阅读框编码新型冠状病毒奥密克戎变异株为BA.5子变异株；所述第二开放阅读框的核苷酸序列如Seq_27、Seq_32、Seq_20、Seq_21、Seq_22、Seq_23、Seq_24、Seq_25或Seq_28所示；
优选地，第一开放阅读框和第二阅读框的组合方式选自：Seq_9和Seq_27、Seq_9和Seq_32；Seq_36和Seq_32、Seq_37和Seq_20、Seq_38和Seq_21、Seq_39和Seq_22、Seq_40和Seq_23、Seq_41和Seq_24、 Seq_42和Seq_25、Seq_29和Seq_28、Seq_29和Seq_28、Seq_42和Seq_25、Seq_41和Seq_24、Seq_40和Seq_23、Seq_39和Seq_32、Seq_38和Seq_22、Seq_37和Seq_21、Seq_36和Seq_20。
6.根据权利要求1-5任一项所述的新型冠状病毒疫苗，其特征在于，含有编码第一开放阅读框的核酸分子和含有编码第二开放阅读框的核酸分子的质量比为（1:9）~（9:1），优选为（1:1）~（9:1），更优选为3:1；
优选地，所述核酸分子为融合核酸分子，第一开放阅读框和第二开放阅读框在所述融合核酸分子中的重复数为（1:9）~（9:1）；优选为（1:1）~（9:1），更优选为3:1。
7.根据权利要求1-5任一项所述的新型冠状病毒疫苗，其特征在于，所述疫苗还包括递送制剂；
优选地，所述新型冠状病毒疫苗含有由所述核酸分子和脂质成分构成的核酸脂质纳米颗粒；
优选地，所述新型冠状病毒疫苗选自（a）、（b）或（c）：
（a）、所述新型冠状病毒疫苗包含:包裹有含有第一开放阅读框的核酸分子的核酸脂质纳米颗粒，和，包裹有含有第二开放阅读框的核酸分子的核酸脂质纳米颗粒；
（b）、所述新型冠状病毒疫苗包含:包裹有含有第一开放阅读框的核酸分子，和含有第二开放阅读框的核酸分子的核酸脂质纳米颗粒；
（c）、所述新型冠状病毒疫苗包含：包裹有同时含有第一开放阅读框和第二开放阅读框的融合核酸分子的核酸脂质纳米颗粒；
优选地，含有编码第一开放阅读框的核酸分子和含有编码第二开放阅读框的核酸分子的质量比为（1:9）~（9:1），优选为（1:1）~（9:1），更优选为3:1；
优选地，所述核酸分子为融合核酸分子，第一开放阅读框和第二开放阅读框在所述融合核酸分子中的重复数为（1:9）~（9:1）；优选为（1:1）~（9:1），更优选为3:1；
优选地，按摩尔百分比计，所述脂质成分包括20~50%可质子化阳离子脂质、20~50％结构脂质、5~20％辅助脂质和1~5％表面活性剂，其中，可质子化阳离子脂质、结构脂质、辅助脂质和表面活性剂的摩尔含量合计100％；
优选地，所述可质子化阳离子脂质包括DlinMC3-DMA、DODMA、C12-200和DlinDMA中的至少一种；
优选地，所述辅助脂质包括DSPC、DOPE、DOPC、DOPG和DOPS中的至少一种；
优选地，所述结构脂质包括胆固醇和/或胆固醇衍生物；
优选地，所述表面活性剂包括PEG-DMG、PEG-DSPE和TPGS中的至少一种；
优选地，按照摩尔百分比计所述脂质成分包括Dlin-MC3-DMA 50％、DOPG 10％、胆固醇38.5％和PEG-DMG 1.5％；
优选地，按照摩尔百分比计，所述脂质成分包括Dlin-MC3-DMA 50％、DOPG 20％、胆固醇29％和PEG-DMG 1％；
优选地，所述核酸脂质纳米颗粒按照如下方法制备得到：
将含有核酸分子的水相和含有所述脂质成分的有机相混合均匀得到混合液，去除有机相后使体系中的核酸分子的浓度为1~100 μg/ml，得到所述核酸脂质纳米颗粒；
所述水相为含有0.08~1.2 mg/L 核酸分子的水相缓冲液，所述水相缓冲液为柠檬酸盐缓冲液或醋酸钠缓冲液；
所述有机相为含有5~7 mg/L所述脂质成分的无水C1~C4低碳醇；
所述水相和所述有机相的体积比为1:2~4。
8.权利要求1-7任一项所述的新型冠状病毒疫苗的制备方法，其特征在于，包括将所述核酸分子与任选地辅料混合，得到所述新型冠状病毒疫苗；
优选地，所述新型冠状病毒疫苗包括核酸脂质纳米颗粒，所述制备方法包括：
分别制备包裹有含有第一开放阅读框的核酸分子的核酸脂质纳米颗粒，和，包裹有含有第二开放阅读框的核酸分子的核酸脂质纳米颗粒；然后按照配方量将两种核酸脂质纳米颗粒混合；
或，先将含有第一开放阅读框的核酸分子和含有第二开放阅读框的核酸分子按照配方量混合，再制备得到包裹有含有两种核酸分子的核酸脂质纳米颗粒；
或，制备包裹有同时含有第一开放阅读框和第二开放阅读框的核酸分子的核酸脂质纳米颗粒；
优选地，所述核酸脂质纳米颗粒按照如下方法制备得到：
将含有核酸分子的水相和含有脂质成分的有机相混合均匀得到混合液，去除有机相后使体系中的RNA的浓度为1~100 μg/ml，得到所述核酸脂质纳米颗粒；
所述水相为含有0.08~1.2 mg/L 核酸分子的水相缓冲液，所述水相缓冲液为柠檬酸盐缓冲液或醋酸钠缓冲液；
所述有机相为含有5~7 mg/L所述脂质成分的无水C1~C4低碳醇；
所述水相和所述有机相的体积比为1:2~4。
9.权利要求1-7任一项所述的新型冠状病毒疫苗，或权利要求8所述的制备方法在制备用于预防或治疗新型冠状病毒引发的疾病的产品中的应用。
10.用于预防或治疗新型冠状病毒引发的疾病的产品，其特征在于，包含权利要求1-7任一项所述的新型冠状病毒疫苗。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211207683.9A CN115716866A (zh) | 2022-09-30 | 2022-09-30 | 新型冠状病毒疫苗及其制备方法和应用 |
| PCT/CN2023/096148 WO2024021817A1 (zh) | 2022-07-27 | 2023-05-25 | 新型冠状病毒疫苗及其制备方法和应用 |
| CN202310792889.0A CN116617382B (zh) | 2022-09-30 | 2023-06-30 | 新型冠状病毒疫苗及其制备方法和应用 |
| CN202310792756.3A CN116808191A (zh) | 2022-09-30 | 2023-06-30 | 新型冠状病毒疫苗及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211207683.9A CN115716866A (zh) | 2022-09-30 | 2022-09-30 | 新型冠状病毒疫苗及其制备方法和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115716866A true CN115716866A (zh) | 2023-02-28 |
Family
ID=85253762
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211207683.9A Pending CN115716866A (zh) | 2022-07-27 | 2022-09-30 | 新型冠状病毒疫苗及其制备方法和应用 |
| CN202310792756.3A Pending CN116808191A (zh) | 2022-09-30 | 2023-06-30 | 新型冠状病毒疫苗及其制备方法和应用 |
| CN202310792889.0A Active CN116617382B (zh) | 2022-09-30 | 2023-06-30 | 新型冠状病毒疫苗及其制备方法和应用 |
Family Applications After (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310792756.3A Pending CN116808191A (zh) | 2022-09-30 | 2023-06-30 | 新型冠状病毒疫苗及其制备方法和应用 |
| CN202310792889.0A Active CN116617382B (zh) | 2022-09-30 | 2023-06-30 | 新型冠状病毒疫苗及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (3) | CN115716866A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024021817A1 (zh) * | 2022-07-27 | 2024-02-01 | 珠海丽凡达生物技术有限公司 | 新型冠状病毒疫苗及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7374930B2 (en) * | 2002-05-21 | 2008-05-20 | Expression Genetics, Inc. | GLP-1 gene delivery for the treatment of type 2 diabetes |
| CN111218458B (zh) * | 2020-02-27 | 2020-11-20 | 珠海丽凡达生物技术有限公司 | 编码SARS-CoV-2病毒抗原的mRNA和疫苗及疫苗的制备方法 |
| WO2021213924A1 (en) * | 2020-04-22 | 2021-10-28 | BioNTech SE | Coronavirus vaccine |
| CN112386684B (zh) * | 2020-11-12 | 2023-12-05 | 广东昭泰细胞生物科技有限公司 | 一种covid-19疫苗及其制备方法和应用 |
| CN114478718B (zh) * | 2022-01-21 | 2022-10-28 | 国药中生生物技术研究院有限公司 | 一种重组新型冠状病毒蛋白疫苗、其制备方法和应用 |
| CN114507675A (zh) * | 2022-01-29 | 2022-05-17 | 珠海丽凡达生物技术有限公司 | 一种新型冠状病毒mRNA疫苗及其制备方法 |
| CN114668837A (zh) * | 2022-01-30 | 2022-06-28 | 苏州祥龙生物医药科技有限公司 | 一种基于mRNA的新冠病毒野生型和变异型联合疫苗及其制备方法 |
| CN114150005B (zh) * | 2022-02-09 | 2022-04-22 | 广州恩宝生物医药科技有限公司 | 用于预防SARS-CoV-2奥密克戎株的腺病毒载体疫苗 |
| CN114150004B (zh) * | 2022-02-09 | 2022-04-22 | 广州恩宝生物医药科技有限公司 | 表达SARS-CoV-2奥密克戎突变株病毒抗原肽的核酸序列及其应用 |
| CN114634556B (zh) * | 2022-04-01 | 2023-12-19 | 中国科学院微生物研究所 | 一种新冠病毒Delta和Omicron变异株嵌合抗原、其制备方法和应用 |
| CN114989308B (zh) * | 2022-05-12 | 2023-04-04 | 中国科学院微生物研究所 | 新冠病毒嵌合核酸疫苗及其用途 |
| CN115089700A (zh) * | 2022-05-25 | 2022-09-23 | 永州中古生物技术有限公司 | 一种抗β属冠状病毒的疫苗组合物及其应用 |
| CN115043938A (zh) * | 2022-06-15 | 2022-09-13 | 段良伟 | SARS-CoV-2及其突变株的抗体及应用 |
-
2022
- 2022-09-30 CN CN202211207683.9A patent/CN115716866A/zh active Pending
-
2023
- 2023-06-30 CN CN202310792756.3A patent/CN116808191A/zh active Pending
- 2023-06-30 CN CN202310792889.0A patent/CN116617382B/zh active Active
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024021817A1 (zh) * | 2022-07-27 | 2024-02-01 | 珠海丽凡达生物技术有限公司 | 新型冠状病毒疫苗及其制备方法和应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116617382A (zh) | 2023-08-22 |
| CN116808191A (zh) | 2023-09-29 |
| CN116617382B (zh) | 2024-02-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111218458B (zh) | 编码SARS-CoV-2病毒抗原的mRNA和疫苗及疫苗的制备方法 | |
| US20230108894A1 (en) | Coronavirus rna vaccines | |
| US20230270836A1 (en) | Zoonotic disease rna vaccines | |
| CN110974954B (zh) | 一种用于增强核酸疫苗免疫效果的脂质纳米颗粒及其制备方法 | |
| US11351242B1 (en) | HMPV/hPIV3 mRNA vaccine composition | |
| WO2021159130A2 (en) | Coronavirus rna vaccines and methods of use | |
| WO2021211343A1 (en) | Zika virus mrna vaccines | |
| EP3746090A1 (en) | Rsv rna vaccines | |
| WO2022221336A1 (en) | Respiratory syncytial virus mrna vaccines | |
| WO2022266012A1 (en) | Coronavirus glycosylation variant vaccines | |
| WO2023283651A1 (en) | Pan-human coronavirus vaccines | |
| JPS6349077A (ja) | ベクターウイルスおよびベクターウイルスを含む薬用組成物 | |
| WO2021042944A1 (zh) | 肌肉靶向的微环dna基因治疗 | |
| CN116617382B (zh) | 新型冠状病毒疫苗及其制备方法和应用 | |
| TW202216739A (zh) | 一種mRNA及包含其的新型冠狀病毒mRNA疫苗 | |
| WO2023092069A1 (en) | Sars-cov-2 mrna domain vaccines and methods of use | |
| CN116390752A (zh) | 自扩增性sars-cov-2rna疫苗 | |
| WO2023098679A1 (zh) | 预防突变株的新型冠状病毒mRNA疫苗 | |
| CN114752631B (zh) | Rna及包含其的新型冠状病毒疫苗和制备方法 | |
| WO2024021817A1 (zh) | 新型冠状病毒疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN117700495A (zh) | 新型冠状病毒疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN117625651A (zh) | 狂犬病毒mRNA疫苗及其应用 | |
| CN117903263A (zh) | 一种抗新冠病毒的蛋白或mRNA疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN116769805A (zh) | mRNA及包含其的新冠病毒mRNA疫苗和制备方法 | |
| CN117467677A (zh) | 编码SARS-CoV-2病毒抗原的mRNA和疫苗 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20230228 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |