CN114668837A - 一种基于mRNA的新冠病毒野生型和变异型联合疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于mRNA的新冠病毒野生型和变异型联合疫苗及其制备方法。本发明将脂质递送系统包裹的新冠病毒野生型mRNA序列和变异毒株mRNA序列的混合疫苗，或野生型S蛋白或其中的RBD‑变异体S蛋白或其中的RBD的嵌合抗原联合mRNA疫苗；本发明还提供了高效的脂质体纳米递送系统；提供了疫苗成品前的纯化方法，以及自动化一体化疫苗生产线系统设计。本发明设计生产的新型联合疫苗精准针对变异毒株的突变表位抗原和与野生型的共享表位抗原，实现精准中和，精准预防，提高生产效率和降低成本。

Description

一种基于mRNA的新冠病毒野生型和变异型联合疫苗及其制备 方法

技术领域

本发明涉及疫苗研制应用及生物医药领域，尤其涉及一种基于mRNA的新冠病毒野生型和变异型联合疫苗及其制备方法。

背景技术

在过去20年间，报道了诸多由病毒引起的大流行，包括2002年至2003 年的Sars冠状病毒、2009年的H1N1流感和2012年的中东呼吸综合征冠状病毒，严重影响了世界卫生保健。就新型冠状病毒(SARS-CoV-2)而言，其已传播到223个国家，全球确诊病例超过2.65亿例，死亡病例超过520万例。截至2021年12月，从SARS-CoV-2大流行开始已发现了5种相关变异(VoCs， variants of concern):Alpha(B.1.1.7)、Beta(B.1.351)、Gamma(P.1)、Delta(B.1.617.2)和Omicron(B.1.1.529)。根据WHO的每周流行病学报告，Alpha (B.1.1.7)病毒扩散到了170个国家，Beta(B.1.351)病毒扩散到了119个国家， Gamma(P.1)病毒扩散到了71个国家，Delta(B.1.617.2)病毒扩散到了85个国家。Omicron已经导致欧洲近半数人感染，美国每天上百万人感染。据世界卫生组织估计，全球COVID-19的死亡率为2.2％。

SARS-CoV-2在整个单链RNA基因组中有29891个核苷酸，编码9860 个氨基酸，其在结构上和系统发育上与SARS-CoV和MERS-CoV相似，由 spike(S)、envelope(E)、核衣壳(N)、膜蛋白(M)等4种主要结构蛋白，以及16 种非结构蛋白和5 8种辅助蛋白组成。位于病毒粒子外部的表面刺突(S)糖蛋白，模仿冠状突起，被切割成氨基n端S1亚基，帮助病毒进入宿主细胞；S1 亚基进一步细分为RBD和NTD，其中，RBD作为人类ACE2(HACE2)受体的结合位点，是感染发生的关键肽域。SARS-CoV-2通过附着于ACE2受体的SARS-CoV-2刺突或s蛋白(S1)进入宿主细胞，ACE2受体普遍存在于呼吸上皮细胞，包括II型肺泡上皮细胞；也存在于食管上段、回肠细胞、心脏细胞、近端肾小管细胞和尿路上皮膀胱细胞等。病毒的粘附机制是伴随着宿主跨膜丝氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)，触发刺突蛋白S2亚基，促进细胞增殖和病毒繁殖的连续内吞，使ACE2受体接受刺突RBD；此外，人蛋白酶furin(蛋白酶)对刺突蛋白氨基酸位置(多碱基位点)的有效消化，导致病毒和细胞膜融合，为病毒穿透细胞创造了通道条件。

就新冠病毒的相关变异，特别是Omicron变种携带大量突变，包括15个在spike受体结合域(RBD)的突变；并与之前的VOC Alpha、Beta和Gamma 变种共享一些受体结合域(RBD)和N-末端域(NTD)的突变。除delta突变株外，所有菌株通常都有位于RBD上的N501Y突变，导致刺突蛋白和血管紧张素转换酶2(ACE2)受体之间的结合更高，增强病毒粘附和进入宿主细胞。面对 SARS-CoV-2Omicron变异毒株的发现，立即引起了全球对病毒传播性、致病性和免疫逃避的关注。系统发育研究的结果表明，Omicron变体可能早于其它 SARS-CoV-2变体，而不是由以前的VOCs发展而来。据推测，Omicron变体可能是在免疫缺陷个体(例如，HIV患者合并感染SARS-CoV-2)中孕育了一段时间，或者它可能在非人类物种中进化，最近才扩散回人类。

对Omicron变异的基因组序列分析发现了大量的非同义突变，包括几个已被证明与传播性、疾病严重程度和免疫逃逸有关的穗状突变。总的来说，在Omicron变体中已经确定了60多个替换/删除/插入，其中12个使得Omicron 变体成为迄今为止所确定的所有SARS-CoV-2变体中拥有最多突变位点的变体。在ORF1a中，Omicron变种含有6个取代基(K856R,L2084I,A2710T, T3255I,P3395H和I3758V)，以及4个氨基酸(氨基酸2083和氨基酸3674 3676) 中的2个缺失。在ORF1b中，该变体包含两个替换(P314L和I1566V)。此外，在ORF9b中，27 29号位点有P10S取代和三个残基缺失。结构蛋白E中有1 个取代基(T9I)，M中有3个取代基(D3G、Q19E和A63T)，N中有3个取代基和3个残基缺失。虽然上述的突变出现在整个病毒基因组中，但剩下的占已识别的Omicron总突变的一半以上的突变是在峰值中积累的。这包括A67V, T95I,Y145D,L212I,G339D,S371L,S373P,S375F,K417N,N440K,G446S,S477N,T478K,E484A,Q493R,G496S,Q498R,N501Y,Y505H,T547K,D614G, H655Y,N679K,P681H,N764K,D796Y,N856K,Q954H,N969K,L981F的30 个取代，H69/V70,G142/V143/Y144和N211的3个缺失，在214位插入3个氨基酸(EPE)(部分报道称V143/Y144/Y145与G142D结合缺失，以及与N211I 结合缺失L212)。与其他4个VOC变异相比，Omicron中发现的spike突变的数量约为前者的3-4倍。所有5个VOCs中都含有spike中氨基酸D614G 变化，既往研究已明确D614G与上呼吸道病毒载量增高和患者年龄年轻化有关。Omicron变种也与Alpha,Beta和Gamma变种共享N501Y，这种突变被认为增强了刺突和血管紧张素转换酶2(ACE2)之间的结合，并诱导更高的传播率；当与H69/V70缺失结合时，可进一步增加其传递性。此外，Omicron在 furin裂解位点附近也有N679K和P681H突变，furin裂解位点周围碱性氨基酸的掺入可促进刺突裂解成S1和S2，从而增强融合和病毒感染；另外，在 Alpha变体中也发现了P681H突变，该突变被认为增强了SARS-CoV-2的传染性。此外值得关注的是，刺突受体结合域(RBD)是真正的病毒实体，它识别 ACE2受体介导病毒进入细胞，虽然目前占主导地位的Delta型在RBD中仅具有L452R和T478K突变，但Omicron型在RBD中积累了15个突变。

由于Omicron变种更易在人群中传播，同时，针对刺突基因的PCR检测失败的情况也在增加，提高诊断准确性，对于切断欧米克隆变种的传播也很重要；SARS-CoV-2再次感染风险的增加与在南非出现的Omicron变异有关，这表明Omicron变异可能与逃避先前感染的免疫能力有关；目前的COVID- 19疫苗是否能预防Omicron变种引起了广泛关注，最新证据表明，当前的 COVID-19疫苗对omicron变种的免疫力低于其他VOCs；与野生型SARS- CoV-2相比，接种过疫苗的人的血清对Omicron变种的中和能力也降低了，说明目前的COVID 19疫苗可能对Omicron变体不如其他SARS-CoV-2变体有效。Omicron的一些刺突突变也在其他VOC变体中被发现，如D614G、 N501Y、K417N、P681H和E484A的残基取代，这些突变已被证明与ACE2 具有更高的结合亲和力，增强了传播性和致病性，并降低了单克隆抗体的中和能力和免疫逃避改变。然而，其他突变的功能以及这些突变是否存在联合效应尚不清楚，这导致了对病毒行为和易感性将如何发展的巨大不确定性。Omicron变种不会是SARS-CoV-2的最后一个变种，尽管Omicron刺突突变对现有疫苗有效性的影响仍有待研究，但有充分的证据表明，基于野生型 SARS-CoV-2开发的疫苗在预防变异型感染方面效果较差。

以往研究表明，基于突变刺突的疫苗对突变病毒的中和抗体水平较高，但对野生型SARS-CoV-2的中和抗体水平较低，这些观察结果突出了基于野生型和突变型刺突开发新型特异性联合疫苗的重要性，特别是针对Omicron 变异疫苗，同时兼顾野生型和变异型的抗体中和水平。因此，基于Omicron变种的突变型和兼顾野生型的S蛋白，包括其中的RBD，开发针对SARS-CoV- 2的mRNA新型联合嵌合疫苗成为本领域技术人员亟需解决的技术问题。

发明内容

鉴于解决现有技术mRNA新冠病毒疫苗对变异毒株免疫力不足，导致变异毒株反复大流行、人类生命安全受到严重威胁的缺陷，本发明的目的之一是提供提出一种基于mRNA的新冠病毒野生型和变异型联合疫苗；

本发明的目的之二是提供特别是针对Omicron的变异疫苗，同时兼顾野生型和变异型的抗体中和水平；

本发明的目的之三是提供基于mRNA的新冠病毒野生型和变异型联合疫苗的制备方法。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案为：提出一种针对野生型和变异型毒株的新型mRNA联合疫苗，所述联合疫苗为基于mRNA的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)野生型和变异体序列的联合疫苗，并提出其制备方法；所述联合疫苗为脂质递送系统包裹的新冠病毒野生型mRNA序列(特别是S蛋白，包括其中的RBD)和变异毒株mRNA序列(特别是OmicronS蛋白序列，包括其中的RBD)的混合疫苗，或野生型S蛋白或其中的RBD-变异体S蛋白或其中的RBD的嵌合抗原联合mRNA疫苗；本发明还提供了高效的脂质体纳米递送系统；提供了疫苗成品前的纯化方法，以及自动化一体化疫苗生产线系统设计。

进一步地，所述联合疫苗包括新冠病毒野生型和变异体mRNA序列，所述新冠病毒野生型为SARS-CoV-2，所述新冠病毒变异型包括但不限于SARS- CoV-2的相关变异Alpha、Beta、Gamma、Delta和Omicron；优选地，所述新冠病毒变异型为Omicron。

进一步地，所述新冠病毒野生型和变异型mRNA序列包括但不限于编码新冠病毒野生型和变异型SARS-CoV-2的S蛋白以及编码S蛋白中的RBD 的mRNA序列；优选地，所述新冠病毒野生型为首先发布的病毒序列GenBank： MN908947.3，NCBI Reference Sequence:NC_045512.2(见SEQ ID NO：1所示)；所述新冠病毒变异型mRNA序列为Omicron序列。

进一步地，所述新冠病毒野生型和变异型mRNA序列分别包括S蛋白、 E蛋白、M蛋白和核衣壳N蛋白；所述S蛋白包括其中的受体结合阈RBD 和N-末端结构域NTD。

进一步地，所述联合疫苗为脂质体分别包裹新冠病毒野生型和变异型 mRNA序列的混合疫苗，或野生型S蛋白或其中的RBD-变异体S蛋白或其中的RBD的嵌合抗原mRNA联合疫苗。

进一步地，所述联合疫苗包括：

(1)分别构建野生型和变异型SARS-CoV-2片段S刺突蛋白基因和嵌合抗原DNA质粒载体；

(2)在大肠杆菌或真核细胞中表达纯化；

其中，所述嵌合型质粒抗原分别包含野生型RBD+变异型S蛋白，或野生型S蛋白+变异型RBD，野生型RBD+变异型RBD，以及野生型S蛋白+ 变异型S蛋白。

进一步地，所述联合疫苗制备过程还包括用于构建所需的mRNA链的 DNA质粒模板；所述用于体外转录的质粒DNA模板，至少包含：

(1)噬菌体或CMV启动子；

(2)ORF；

(3)转录成poly(A)的多聚[d(A/T)]序列；

(4)质粒线性化的唯一限制位点NotI/XbaI，用以确保明确的转录终止。

进一步地，所述联合疫苗制备过程还包括体外转录IVT mRNA，通过纯化质粒的线性化或通过PCR扩增所需区域；所述IVT部分包括但不限于线性 DNA模板、RNA聚合酶、核苷三磷酸底物、聚合酶辅因子、MgCl2、含有多胺和抗氧化剂的pH缓冲液。

进一步地，所述联合疫苗制备过程还包括核苷修饰，修饰的核苷酸在 mRNA序列中的结合，可有效降低内源性mRNA的免疫调节能力；所述核苷修饰包括但不限于甲基化的核苷或伪尿嘧啶。

所述核苷修饰的mRNA在体外比未修饰的mRNA能更有效地翻译，特别是在初级树突细胞(DCs)中，以及在小鼠体内。

所述核苷修饰还包括：胞苷可被诸多化学修饰所取代，包括5-甲基胞苷 (m5C)；尿苷可以转化为5-甲基尿苷(m5U)，2-硫脲(s2U)，5-甲氧基尿苷(5moU)，伪尿苷(ψ)和n1-甲基伪尿苷(m1ψ)，而腺苷可被n1-甲基腺苷(m1A)和n6- 甲基腺苷(m6A)所取代；或将一个mΨ修饰的核苷酸整合到mRNA中，并在 mRNA产生过程中去除dsRNA片段，通过降低TLR信号和胞质RNA传感器的激活，显著降低响应mRNA的先天免疫信号。

进一步地，所述联合疫苗mRNA为自扩增RNA，包括编码抗原和RNA 复制酶，扩增重组mRNA；所述自扩增RNA包括体外转录mRNA，由抗原编码的开放阅读框ORF、5’和3’端未翻译区utr、一个7甲基鸟苷5’帽结构、合并到第一个核苷酸的序列和3’端多聚腺苷酸尾部。

所述5-帽结构的特征为，CAP0：m7G(5)pppN1pN2p，保护内源性mRNA 免受核酸酶的攻击，并参与核输出和翻译起始；CAP1：m7G(5)pppN1mpNp和 CAP2:m7G(5)pppN1mpN2mp在第二或第三核糖核苷酸上含有额外的甲基，比 CAP0的免疫原性低；还包括Cap类似物((N7MeGpppN)结构，Clean Cap (N7MeGpppN2-OMe)结构，或(m7G+5-ppp-5-Am)结构。

5’端UTR区域结构：(ΨCΨΨCΨGGΨCCCCACAGACΨ CAGAGAGAACCCGCC)，来自高表达的人类基因α-球蛋白的5-UTR，以及一个优化的下游Kozak共识序列GCCACCAUG。

3'端UTR结构：3'UTR(核苷酸3880-4174)，为由AES(Amino-terminal enhancer ofsplit)基因序列和mtRNR1(线粒体12S核糖体RNA)组合而成，选择用于增加蛋白质表达和mRNA稳定性。

Poly-A尾巴的合成，为高效翻译的必要元素。根据早期的研究，加入长 poly-A序列约30-300个核甘酸单位，有利于增强mRNA的稳定性。在人类单核细胞来源的DCs中，120个单位的poly-A序列提供了更稳定的ivt-mrna 和更高效的翻译，而在人类原代T细胞中，一个超过300个核苷酸的poly-A 序列更有利于高效翻译。本发明经试验优选，所用为30-300聚合物的多聚(a) 尾巴。

进一步地，所述联合疫苗还包括密码子优化；所述密码子优化的编码 SARS-CoV-2全长刺突蛋白(核苷酸55-3879)的ORF，还包括信号肽(核苷酸 55-102)。

进一步地，所述联合疫苗还包括两个连续的脯氨酸置换，所述脯氨酸取代基分别为K986P和V987P；后者导致刺突采用预压稳定构象，降低其膜融合能力，导致中和抗体表达增加和刺激。

进一步地，所述联合疫苗还包括一个10核苷酸连接序列GCAUAUGACU；还包括联合疫苗序列的最后70个其他腺苷残基，以增加和延长蛋白质表达。

进一步地，所述联合疫苗制备还包括色谱纯化，所述色谱纯化通过去除短链或双链RNA分子，生成纯单mRNA产物；在mRNA的产生过程中，这一纯化步骤可使其在体内的表达量增加数倍。

进一步地，所述联合疫苗制备还包括灭菌含有mRNA的脂质纳米颗粒，并使用四种脂质成分包裹mRNA形成纳米颗粒复合物。

进一步地，所述联合疫苗制备还包括脂质系统配方的制备，所述脂质系统配方包含但不限于可电离的阳离子脂质、磷脂、胆固醇和脂质锚定的聚乙二醇(PEG)；优选地，LNP配方包括RNA-脂质复合物、提供结构刚性的脂质以及能够修饰颗粒表面特性的脂质化聚合物涂层。

例如，由阳离子脂质1,2-二油酰-3-三甲基丙烯铵(DOTAP)和辅助脂质1,2- 二油酰-sn甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)与mRNA结合而成的阳离子脂质体已被开发为mRNA疫苗的包裹。上述脂质组分为SM-102[庚烷-9-基8-((2-羟基乙基)(8-(壬氧基)8-氧辛基)氨基)辛酸]；PEG2000-DMG(1,2-二肉豆蔻酯-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000)；胆固醇；2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine 和DSPC(1)；该制剂还含有氨丁三醇、盐酸氨丁三醇、乙酸、醋酸钠和蔗糖； mRNA-1273-LNP遵循MC3 LNP的原型，但用脂质H(SM-102)取代MC3；取代MC3传递mRNA的可电离脂质通过诱导更多的分支进入烷基尾部，从而允许更显著的内溶活性，如脂质H和脂质5显示三个烷基尾部，而不是 MC3中的两个；这增强了圆锥形的形态，因此，脂质尾部的横切面大于其头部组，导致更大的内体释放。

进一步地，所述联合疫苗中野生型mRNA序列长度为3786个核苷酸，分子量约为1388kDa。

进一步地，所述生产流程为自动一体化生产流程；优选地，为微流控尺度生产流程；在这种规模下，反应速率可以在特定条件下加速，昂贵试剂的使用可以最小化，级联反应可以很容易地进行分隔。

优选地，所述流程还可实施现场产品去除ISPR、底物进料和产品回收 SFPR；以促进过程控制、再循环和化合物的重复使用，这些策略将允许分离分子，如酶(如果使用游离酶)、辅助因子或NTPs，这些分子可以在过程中再循环。

进一步地，所述生产流程为连续形式的两步酶反应，随后酶循环使用切向流过滤和两个多模态色谱，包括结合-洗脱模式用于中间纯化、通过流模式用于抛光；所述配方通过第三切向流过滤模块实现。

本发明所提出的微流体方法原位酶反应加上产品去除(ISPR)、底物上料和监控模块及多通道使用色谱法取代使用多个色谱步骤，该新的连续生产方法，结合高通量纯化和定义明确的分析方法的化合物再循环，可以实现可持续、灵活和成本效益高的疫苗生产，从而实现按需定制和规模化生产。

相对于现有技术，本发明的技术方案具有如下有益效果：本发明针对现行mRNA新冠病毒疫苗对变异毒株免疫力不足等缺陷，设计生产的新型联合疫苗精准针对变异毒株的突变表位抗原和与野生型的共享表位抗原，达到精准中和，精准预防，有效提高生产效率和降低成本。

附图说明

图1示出了RNA疫苗的分子结构特征和脂质纳米包裹递送系统图；

图2示出了mRNA疫苗连续生产的微流体方法图；其中，图中所示为生产mRNA疫苗的连续生产过程的概念设计，该过程由连续形式的两步酶反应组成，随后酶循环使用切向流过滤策略和两个多模态色谱步骤，其中一个结合-洗脱模式用于中间纯化，第二个通过流模式用于过滤纯化；配方是使用第三切向流过滤模块实现的；

图3示出了设计的野生型和突变型联合疫苗假病毒ACE2受体结合实验图；

图4示出了新型联合疫苗野生型和变异毒株抗原在细胞内的表达WB(蛋白质印迹实验)图；

图5示出了基于mRNA的新冠病毒野生型和变异型联合疫苗接种后在小鼠体内表达量与持续时间图；

图6示出了SARS-CoV-2野生型和突变型假病毒血清中和试验图；

图7示出了基于mRNA的新冠病毒野生型和变异型联合疫苗的细胞免疫应答图；

图8示出了接种mRNA联合疫苗后，恒河猴血清中SARS-CoV-2中和抗体的检测图；

图9示出了基于mRNA的新冠病毒野生型和变异型联合疫苗免疫接种后，病毒攻击，恒河猴呼吸道病毒防护实验图；

图10示出了恒河猴免疫接种后，记忆B细胞检测图；

图11示出了恒河猴免疫接种后，细胞免疫反应检测图。

具体实施方式

为了充分了解本发明的目的、技术方案及效果，通过下述具体实施方式，对本发明作详细说明。除非另有说明，否则本发明中涉及的技术术语均具有本领域技术人员通常理解的含义。

早期的研究结果表明，对初级疫苗接种的反应不足以有效地中和含有相对少量突变的病毒S蛋白刺突。与这一观察及其最近的研究相一致，临床发现Omicron变种比先前的变种具有更强的感染力，有效地逃脱了初级接种所诱导的体液免疫。因此，Omicron导致了新一轮的全球大流行。

此外，体外感染实验表明，Omicron假病毒继续依赖人类ACE2受体进入靶细胞，感染靶细胞的效率比野生型假病毒高4倍，比Delta假病毒高2 倍。不仅如此，目前已有证据表明，中和抗体反应和疫苗效力因疫苗剂而异，随着接种后时间的延长而减少，并受到新出现变种的负面影响。与Delta中发现的9个突变或缺失相比，Omicron家族在刺突蛋白中有34个突变(包括3个缺失和1个插入)，其中包括RBD区域内的15个突变。这些突变在结构上集中在尖峰的顶部，也就是抗体可触及的区域，提高了免疫逃避的可能性。前期的研究结果突出表明，在目前的疫苗方案下，SARS-CoV-2Omicron变体避免了疫苗诱导的中和免疫，并且比以前的变体更具传染性。

针对新冠病毒的不断变异和疫情反复导致全球流行的严重形势，为了发明更精准的针对变异病毒的疫苗、针对变种之间共享的新表位，本发明提供了一种野生型和变异型的新型联合疫苗，以进一步解决病毒变异、感染力增强和免疫逃避的问题，及早终止新冠病毒的大流行。

本发明首先提供了一种联合疫苗的设计及其生产制备过程。

(1)构建了新冠病毒野生型和变异型联合疫苗的表达质粒载体

本发明在野生型和变异型病毒WHO公开的基因库序列(GenBank: MN908947.3)和突变序列(见表1)的基础上，进行密码子优化和质粒构建的。 mRNA疫苗的分子结构特征见图1。本发明利用包含每个所需突变的寡核苷酸进行多重PCR片段扩增，并利用重叠片段组装生成每个菌株的完整突变体。进一步地，本发明在前述密码子优化基础上，对SARS-CoV-2刺突表达质粒优化构建的背景下获得相关突变，该质粒含有c-末端18个氨基酸的缺失，本发明在前期相关实验证明这些缺失可以导致更高的假病毒滴度。另外，本发明进行RNA自扩增设计和mRNA加帽一步完成设计。利用In-Fusion HD 克隆试剂盒(Takara)将组装好的片段插入NotI/XbaI消化后的ptwist-cmv- betagloin-wpre-neo载体中。研究中使用的所有质粒DNA均经过全质粒深度测序(Illumina)验证，以确认仅存在预期的突变。

表1SARS-CoV-2基因突变位点序列

(2)mRNA的体外转录(IVT)及纯化

用于生成mRNA的体外转录(IVT)酶促反应依赖于T7、SP6或T3 RNA 聚合酶催化从相应的DNA模板合成靶mRNA。通过纯化质粒的线性化或通过PCR扩增感兴趣的区域。除了线性DNA模板外，RNA聚合酶、核苷酸三磷酸(NTPs)底物、聚合酶辅因子MgCl₂、含有多胺和抗氧化剂加入pH缓冲液中完成，反应只需几个小时。此外，这种缩短的时间降低了污染发生的可能性。一般来说，每毫升反应可以得到毫克的mRNA。此外，由于其不依赖于编码在模板中的抗原，生产过程可以标准化。

mRNA的纯化：在实验室规模的mRNA纯化过程包括Dnase I酶切，然后LiCl沉淀。更大规模的净化是使用成熟的色谱策略结合切向流动过滤获得。另外，新型色谱法也可用来补充标准的纯化方法。由于相关反应杂质降低了翻译效率并修改了免疫刺激谱，因此，去除这些产物相关的反应杂质对mRNA 的性能至关重要。当核苷修饰的mRNA被反相高效液相色谱(reverse phase HPLC)纯化后，我们观察到蛋白质产量增加了数十倍。

(3)脂质纳米递送系统包裹

由阳离子脂质1,2-二油酰-3-三甲基丙烯铵(DOTAP)、一种辅助脂质1,2- 二硬脂酰-sn甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)]、胆固醇和聚乙二醇(PEG)-脂质[(2-[(聚乙二醇)2000]-n,n-二十二烷基乙酰胺(PEG2000-DMA)或1,2-二肉豆荚酰-丙三醇-甲氧基聚乙二醇-2000(PEG2000-DMG)]组成的脂质纳米递送系统，使纳米颗粒具有水合层，提高胶体稳定性，减少蛋白质吸收。

其脂质体积/重量比例为：DOTAP：DSPC：胆固醇：PEG200-DMA＝10- 15:1：1-2:3-5。脂质纳米颗粒为100-300nm。

mRNA疫苗的脂质系统配方通常包含可电离的阳离子脂质、磷脂、胆固醇和脂质锚定的聚乙二醇(PEG)，Dlin-MC3-DMA，也被称为MC3，是为siRNA 开发的一种可离子化氨基脂，最近被用于mRNA疫苗递送的LNPs。磷脂是已知的促进膜的形成和破坏过程，促进内体逃逸。可电离脂质在生理pH值下为中性，避免了循环中的任何阳离子电荷，在pH 6.5时在内体中被质子化，从而促进核内体释放。可电离的脂质复合物与mRNA形成核心结构，而辅助脂质(如磷脂、胆固醇和/或peg脂质)包裹脂质信使RNA复合物。反过来，peg -脂质保护纳米颗粒外壳。因此，胆固醇在LNPs中起着稳定因素的作用，在细胞转染中起着至关重要的作用。脂锚定的peg优先沉积在LNP表面，使其在空间上稳定，也减少了与蛋白的非特异性结合。此外，较高的PEG含量可以减少LNPs对血浆蛋白的特异性吸收，减少细胞摄取以及与核内体膜的相互作用，从而增加LNPs的血液循环时间，提高mRNA的传递效率。

脂质纳米颗粒可以保护mRNA免受酶的攻击，并提高细胞对mRNA的摄取和表达，比裸体mRNA提高1000倍。可离子化脂质，在生理pH条件下具有中性到温和的阳离子电荷，从而减少非特异性脂质-蛋白质相互作用，促进核酸在细胞质中释放。与脂类相比，这种特性具有永久性的降低毒性和延长血液循环寿命的优点。其他脂质被认为是“辅助脂质”。因为它们可能会影响复合物LNP-mRNAs的结构特性，以提高其稳定性或促进其胞内摄取和胞质进入。因此，典型的LNP配方包括RNA-脂质复合物、提供结构刚性的脂质以及能够修饰颗粒表面特性的脂质化聚合物涂层。例如，由阳离子脂质1,2- 二油酰-3-三甲基丙烯铵(DOTAP)和辅助脂质1,2-二油酰-sn甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)与mRNA结合而成的阳离子脂质体包裹mRNA疫苗。

(4)mRNA疫苗连续生产的微流体方法

如图2所示，mRNA疫苗精确、安全、灵活，易于大规模生产，可用于临床级应用，这些疫苗可以在生产方面迅速应对流行病爆发。然而，为了达到这一结果，必须发展可持续和成本效益高的制造工艺。尽管mRNA的IVT 反应比大多数已建立的疫苗生产更安全、更快，但它依赖于使用昂贵和有限的材料。疫苗的下游加工仍然不完善，而且依赖于缺乏可扩展性和成本效益的方法。将这一过程转变为连续生产可以克服这些瓶颈。本发明提出一个微流体方法原位酶反应加上产品去除处(ISPR)、底物上料和监控模块及多通道使用色谱法取代使用多个色谱步骤(如图2)，该新的连续生产方法，结合高通量纯化和定义明确的分析方法的化合物再循环，可以实现可持续、灵活和成本效益高的疫苗生产，从而实现按需定制和规模化生产。

本发明设计的联合mRNA疫苗，特别是它针对变异病毒的表位精准性和中和病毒的强力有效性；易于大规模生产，可用于临床级应用；这些疫苗在生产方面可以迅速应对流行病的爆发。

本发明应用生物信息学和基因工程学方法，提出合成一种针对野生型和变异型的新型mRNA联合疫苗，精准针对变异毒株的突变表位抗原和与野生型的共享表位抗原，达到精准中和，精准预防。疫苗接种后，mRNA分子进入细胞后经过内体逃逸、核糖体识别、蛋白翻译、蛋白酶体剪切、抗原外泌及抗原呈递等步骤，在体内实现新型冠状病毒(2019SARS-CoV-2)野生型和变异型抗原的共表达，增强自体对新冠病毒野生型和变异型的免疫力。

实施例1

本实施例用于说明本发明设计的新型联合疫苗序列的正确性和有效性，同时也验证突变毒株对受体结合力更强，更具有传染性。

首先用该序列生产的假病毒与ACE2受体结合，予以验证。为此，制作了具有不同刺突蛋白的假型慢病毒颗粒。简单地说，通过PEI转染编码cmv -luciferasi-ires-zsgreen的慢病毒主干，以及慢病毒辅助质粒和每个刺突变异表达质粒，在293T细胞中产生了假病毒；在293T-ACE2细胞收集和过滤后，通过流式细胞仪滴度法定量运行。

(1)方法

采用流式细胞术滴度法确定SARS-CoV-2假病毒的感染单位和感染率。

在12孔板上每孔植40万个293T-ACE2细胞，将在相同条件下(如上所述)24小时后平行生产的SARS-CoV-2假病毒上清液，以3个10倍顺序稀释后加入；细胞在37℃/5％CO₂条件下孵育48小时，以表达ZsGreen报告基因，并用胰蛋白酶-edta(康宁公司)收集细胞；将细胞重悬于含2％胎牛血清 (PBS+)的PBS中，用Stratedigm S1300Exi流式细胞仪检测ZsGreen+细胞的百分比。感染单位的计算方法是：通过测定细胞中转导呈线性下降的感染细胞百分率，并乘以实验开始时测定的每孔平均细胞数。在低MOI(感染率<10％) 时，假设每个转导的ZsGreen+细胞代表一个单一的感染单位，用抗人ACE2 Alexa Fluor 647偶联抗体(R&amp；D)1μL染色，证实293T和293T-ACE2在细胞表面表达；细胞在25℃孵育10分钟，然后在Stratedigm S1300Exi流式细胞仪上运行。

(2)结果分析

如图3所示，采用流式细胞术，以未转染的293T细胞作对照，证实293T- ACE2转染成功后，对假病毒结合ACE2进行检测。(A)代表性点图显示共培养48小时后，感染野生型Swild、突变型Sw+Somi-MIX、Sw+Somi、 Sw+RBDomi、Somi+RBDw SARS-CoV-2假病毒(ZsGreen+gate内)的293T细胞(左图)和293T-ace2细胞(右图)的百分比。假病毒是在相同的条件下平行产生的。(B)在293T-ACE2细胞上对野生型Swild、突变型Sw+Somi-MIX、 Sw+Somi、Sw+RBDomi、Somi+RBDw变异的SARS-CoV-2假病毒进行滴度测定，并通过qPCR测定与基因组拷贝中假病毒浓度(GC)/mL相关计算。假设在感染率<10％时，病毒浓度与受感染细胞之间存在线性关系，进行线性回归来拟合数据(n＝3)。通过计算相对于野生型的每个假病毒相对于(B)的斜率的相对变化，对(B)中每个SARS-CoV-2变体的假病毒传染性进行了相对于野生型的测量。

体外感染实验表明，本发明设计的新型联合疫苗序列，经过包装生产的假病毒，能够与ACE2受体结合，说明根据突变序列进行设计优化的正确性和有效性。同时说明，Omicron假病毒继续依赖人类ACE2受体进入靶细胞，感染靶细胞的效率比野生型假病毒高4倍，比Delta伪病毒高2倍。研究显示，在目前的疫苗方案下，SARS-CoV-2Omicron变体比以前的变体更具传染性。

实施例2

本实施例通过设计构建多种新型联合疫苗野生型和变异型毒株抗原表达质粒，用于说明本发明新型联合疫苗野生型和变异毒株抗原在细胞内的表达情况。

(1)方法

SARS-CoV-2S蛋白野生型(Swild)，S蛋白突变型(Somicron),RBD 野生型(RBDw),RBD突变型(RBDomi),S蛋白野生型+S蛋白突变型(Sw+Somi),S蛋白野生型+RBD突变型(Sw+RBDomi)，S蛋白突变型 +RBD野生型(Somi+RBDw)疫苗蛋白,在悬浮培养的Expi293F细胞中产生，使用Expi293F表达培养基(Life Technologies)，温度33℃，湿度70％，8％CO₂，转速150rpm；使用PEI-MAX(Polyscience)转染培养细胞，细胞密度为300万细胞/mL，培养3天；离心澄清上清液(4000rcf,5min)，加入PDADMAC溶液至终浓度0.0375％(Sigma Aldrich，#409014)，SDS-PAGE检测。

(2)结果分析

如图4A所示，为mRNA疫苗刺突蛋白的抗原检测实验，其包括10组实验，分别采用S蛋白野生型+S蛋白突变型(Sw+Somi),S蛋白野生型+RBD 突变型(Sw+RBDomi)，S蛋白突变型+RBD野生型(Somi+RBDw)，S蛋白野生型(Swild)，和Omicron突变型(Somicron)疫苗表达实验，以及空白对照(N)和细胞对照(C)及S蛋白野生型质粒(plasmid)表达实验。

如图4B所示，为RBD野生型(RBDw),RBD突变型(RBDomi)疫苗表达实验。

本发明设计生产的mRNA疫苗,在293F细胞中对应抗原表达的WB(蛋白质印迹实验)实验结果。从左至右分别表示∶N，C，Plasmid，Sw+Somi； Sw+RBDomi；Somi+RBDw；Swild；Sgamma,Sdelta,Somicron疫苗蛋白表达的 WB结果。根据新冠病毒的基因序列，Spike蛋白的分子量在130-150KDa；而RBD的分子量在30-50KDa。说明本发明设计生产的mRNA疫苗，在293F 细胞中表达的相应蛋白抗原均符合序列设计的分子量要求。

该WB结果采用恢复病人的血清(含有针对新型冠状病毒2019-nCoV的抗体，包括突变型gamma,delta和Omicron恢复病人的血清)进行抗原抗体反应杂交，均呈现阳性结合，说明本发明设计生产的新冠病毒新型联合疫苗表达的蛋白抗原，无论对野生型还是突变型恢复期血清抗体均有结合效果。

实施例3

本实施例通过本发明mRNA疫苗接种后在小鼠体内的表达量与持续时间研究，用于说明在体内免疫力上升的速度高度和持续时间。

(1)方法

将上述新冠病毒野生型和突变型的DNA片段和编码荧光素酶的DNA序列的质粒载体线性化，体外转录合成mRNA-LNP疫苗。将上述制备的mRNA 疫苗注射至小鼠体内，按照观察时间进行体内荧光素检测。

为了检测FLuc mRNA-LNPs的体内分布和持续时间，以S-wild野生型为对照，取6周龄雌性BALB/c小鼠(n＝36)分别通过肌肉注射(i.m.)接种10μg 的FLuc mRNA-LNP。在接种后的6h,12h,24h,2至7天，动物腹腔注射荧光素酶底物(Promega)。反应3min后，用IVIS光谱仪(PerkinElmer)采集60s的荧光信号，体外成像；另外，取6周龄雌性BALB/c小鼠(n＝2)分别肌注10 μg FLuc mRNA-LNP和LNP，6小时后，腹腔注射荧光素酶底物(Promega)，反应3分钟，立即采集脑、心、肝、脾、肺、肾、肌肉等组织，用IVIS成象仪采集各组织60s的荧光信号，使用Living Image 3.0对感兴趣区域(roi)的荧光信号进行量化。

(2)结果分析

如图5A和图5B所示，在进行疫苗接种后6小时，发现本发明的所有野生型和突变型疫苗均在小鼠体内能检测到大量荧光物质，以突变型S- Omicron+RBDw疫苗的结果最强，而且持续高强度表达，7天以后仍然有较强表达。而对照组野生型刺突蛋白疫苗S-wild的表达量这时已经几乎消失。这说明Omicron突变体不仅与受体的结合力增强，而且结合后表达量持续增强，并且持续的时间更长。还要强调的是与S-wild相比，本发明设计生产的突变型疫苗在动物体内的结合力与表达量均要好于野生型疫苗。为联合疫苗的未来应用奠定了重要实验基础。

实施例4

本实施例通过SARS-CoV-2野生型和突变型联合疫苗假病毒血清中和试验，用于说明本发明的联合疫苗接种动物后，其产生的中和抗体对假病毒的中和能力。

(1)方法

接种疫苗。分别在0、1、2周时，对6～8周龄的雌性小鼠接种10ug针对新型冠状病毒SARS-CoV-2的野生型和突变型mRNA疫苗；用异氟醚轻度麻醉新型冠状病毒SARS-CoV-2免疫小鼠，颈静脉取血制备血清低温保存。

简而言之，编码荧光素酶和携带SARS-CoV-2变异刺突蛋白的假病毒在添加到表达ace2的靶细胞之前，暴露于稀释的疫苗血清中。共培养48小时后，测量稀释系列荧光素酶活性以量化感染率，并计算达到50％假病毒中和的滴度(pNT50)。随后，采用平行运行的WHO参考标准进行校正，将pNT50 值转换为WHO IU/mL。

中和分析和读数在Fluent自动化工作站(Tecan)流式处理机上进行，使用 384孔板(Grenier)进行。每个血清样本进行1:12～1:8 748的三倍系列稀释，然后加入250个感染单位的假病毒，1小时后，每个孔中加入293T-ACE2细胞，含聚苯乙烯，在37℃/5％CO₂中孵育48小时。使用含有荧光素的缓冲液裂解细胞，振荡5分钟，然后使用Spectramax L光度计(Molecular Devices)，定量加入缓冲液后1小时内分析荧光素酶的表达。中和率是通过样品孔中细胞发光量减去对照孔(仅细胞)的背景发光量，并除以对照孔病毒(仅和细胞)来确定的。使用Graphpad Prism对数据进行分析，在血清中和值为80％及以上的所有病毒样本中，取50％抑制浓度值的倒数计算NT50值。NT50值转换为世卫组织国际单位，(使用从美国国家癌症研究研究院弗雷德里克国家实验室获得的人类SARS-CoV-2血清学标准(Lot#COVID-NS01097))，该标准被校准为世卫组织SARS-CoV-2血清学国际标准(20/136)。

(2)结果分析

如图6所示，本发明的疫苗，无论野生型还是突变型假病毒结合力均很高。野生型SW疫苗，假病毒结合率为3190IU/ml,而突变型疫苗SwSomi- MIX 8854IU/ml,Sw+Somi11000IU/ml,Sw+RBDomi 12000IU/ml,Somi+RBDw 21000IU/ml。特别是疫苗Somi+RBDw针对Omicron毒株，明显高出野生型 6倍多(据资料报道，mRNA-1273的几何平均中和滴度(GMNTs)为1,362 IU/mL,BNT162b的几何平均中和滴度为2,402IU/mL,Ad26.COV2的几何平均中和滴度为42IU/mL)。这更进一步说明了本发明的联合疫苗未来针对突变型毒株的流行，有一定的免疫防护强度。

实施例5

本实施例通过观察野生型和突变型联合疫苗接种后，疫苗抗原对T细胞刺激活化的百分比，用于说明本发明联合疫苗的细胞免疫应答。

(1)方法

1)接种疫苗

对小鼠接种上述新型冠状病毒2019-nCoV野生型和突变型mRNA疫苗，对细胞内的细胞因子染色，以量化在CD4(左)和CD8(右)中不同抗原mRNA 序列制备的mRNA疫苗，刺激小鼠T细胞后产生IFN-g(干扰素γ)或TNF- a(肿瘤坏死因子)的活化T细胞百分比。检测在第0、1和2周时，用野生型和突变型mRNA疫苗免疫的小鼠T细胞(每组n＝12)的活化T细胞的百分比，得到如图4A和图4B所示的数据结果。

2)细胞内细胞因子染色(ICS)法测定

通过聚合肽刺激细胞内细胞因子染色(ICS)测定CD4+和CD8+T细胞反应。肽库包含了SARS-CoV-2WA1/2020、B.1.617.2(Delta)或B.1.1.529 (Omicron)Spike蛋白(21stCentury Biochemicals)上由11个氨基酸重叠的15个氨基酸肽段。106个外周血单个核细胞复悬于100μL含有CD49d单克隆抗体(1μg/mL)和CD28单克隆抗体(1μg/mL)的R10培养基中。每个样品用mock (100μL R10+0.5％DMSO；背景对照)，多肽(2μg/mL)，和/或10pg/mL的肉豆蔻酸乙酸甲酯(PMA)和1μg/mL的离子霉素(Sigma-Aldrich)(100μL；孵育后，分别加入高尔基stop 0.25μL和R10 50μL中高尔基plug 0.25μL,37℃孵育8h,4℃过夜。次日，用DPBS洗涤细胞2次，水活/死染色10分钟，然后用CD279(克隆EH12.1,BB700)、CD4(克隆L200,BV711)、CD27(克隆M- T271,BUV563)、CD8(克隆SK1,BUV805)、CD45RA(克隆5H9,BV711)单克隆抗体预定滴度染色。然后用2％的FBS/DPBS缓冲液洗涤细胞2次，用200 μL BD CytoFix/cytooperm固定/渗透溶液孵育15min。用1X Perm Wash buffer (BD Perm/WashTM buffer10X，置于用MilliQ水稀释的CytoFix/CytoPerm固定/渗透试剂盒中，通过0.22μm滤膜)洗涤细胞2次，细胞内用抗IFN-γ单克隆抗体染色(克隆B27；用1X Perm Wash缓冲液洗涤两次细胞，并用250μL新鲜制备的1.5％甲醛固定。将固定细胞转移到96孔圆形底板上，用BDFACSymphony系统进行分析。使用FlowJo v9.9对数据进行统计分析。

(2)结果分析

如图7A和图7B所示，分别为野生型和突变型联合疫苗接种后3周T细胞活化的百分比。图中显示，无论是CD4 T细胞，还是CD8T细胞的活化百分比，联合疫苗均高于野生型疫苗。另外，接种疫苗后，无论是CD4 T还是 CD8 T细胞，疫苗抗原刺激的INF-G，TNFalpha和IL-2水平，在联合疫苗均高于野生型疫苗。说明本发明设计生产的联合疫苗较野生型疫苗，对细胞免疫刺激具有优势。

实施例6

本实施例用于说明本发明接种mRNA联合疫苗后，恒河猴血清中2019- nCoV中和抗体水平。

本实施例所有实验均是根据人道关怀和使用实验动物的规定和标准以及疫苗研究中心和动物关怀和使用委员会的规定进行的。

4岁的印度裔雄性恒河猴，根据体重将NHP分层分为2组(每组n＝8NHP)。各组分别给予1×10⁵或1×10⁶个SARS-CoV-2野生型和联合疫苗的假病毒攻击。75％的激发剂量重悬在3mL PBS中气管内给药，剩余的病毒重悬在1mL PBS中经鼻内给药，每个鼻孔各占一半的体积。在攻毒后第2、4，7，14天采集血液和鼻拭子进行次基因组RNA(sgRNA)定量。

(1)方法

接种疫苗过程为分别在0、1、2周时，对3-4岁的实验恒河猴接种100ug 新型冠状病毒2019-nCoV野生型和联合mRNA疫苗，接种后第2，4，6周抽血，提取血清，利用新冠假病毒进行中和抗体检测。待测血清于56℃水浴灭活30min，上清转移至1.5mL离心管中待用。取96孔板，加入DMEM完全培养基150uL/孔，分别设置病毒对照，受试样品组。用DMEM完全培养基将假病毒稀释至1.3×10⁴(1×10⁴～2×10⁴)TCID50/mL，使每孔含假病毒的量为约500/孔。将上述96孔板置于细胞培养箱中(37℃，5％CO2)孵育1小时。加入Huh-7细胞。5％CO₂培养24小时后从细胞培养箱中取出96孔板，用多道移液器从每个上样孔中吸弃150uL上清，加入100uL荧光素酶检测试剂，室温避光反应2min。反应结束后，使细胞充分裂解，从每孔中吸出150uL 液体，加于对应96孔化学发光检测板中，置于化学发光检测仪中读取发光值。

血清抗体亲和力检测：

如之前所述(Francica et al.，2021)，在一种适应性ELISA试验中测量了亲和力程度。简单地说，在没有或存在硫氰酸钠(NaSCN)的情况下，用酶标标记的山羊抗猴IgG(H+L)二抗(Invitrogen)和SureBlue 3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB) 微孔过氧化物酶底物(1-Component；SeraCare)，通过测定有无NaSCN时IgG与 S-2P的结合率来计算抗体的亲和力指数(AI)。每个实验均包含重复的样本。

(2)结果分析

如图8所示，分别于免疫后第2，4，6周和攻毒后第2、4、7、14天采集血清。IgG结合滴度分别为(A)Sw S-2P、(B)Somi-RBDw。图中的IgG结合滴度以WHO单位表示。图中的圈表示单个NHP。方框表示四分位数范围，中间值由水平线表示。每组8个NHPs。图中的虚线为可视化目的，表示1- log10(A)或4-log10(B)结合滴度的增加。仅对野生型和联合型疫苗队列进行了统计分析。

从图8A和图8B的比较发现，联合型疫苗免疫后IgG结合滴度明显高于野生型疫苗，是野生型的3倍多。虽然两者均在接种后6周内显著增高。而且，攻毒后2-14天IgG结合抗体反应高度显示，联合型疫苗也明显高于野生型疫苗。说明联合疫苗的IgG结合的反应速度和高度均好于野生型疫苗。

图8C测定免疫后IgG的亲和力指数，每组8个NHPs，图8C的结果与图8A和图8B的结果一致，说明接种后IgG的亲和力指数也是联合疫苗好于野生型疫苗。

实施例7

本实施例通过联合疫苗免疫接种后，病毒攻击，恒河猴呼吸道病毒防护实验，用于说明本发明在联合疫苗接种后，呼吸道的防护能力。

(1)方法

采用上述实施例所述动物免疫接种及病毒攻击方法，并测定：

1)血清和粘膜抗体滴定

按照粘膜抗体反应测量方法，测定血液和粘膜中的抗体反应。简单地说，热灭活血浆被按1:4的顺序稀释。用Amicon Ultra离心过滤装置(Millipore Sigma)将血液和鼻洗液浓缩10倍，然后按1:5顺序稀释。采用MULTI-ARRAY 384孔链霉亲和素包被板(Meso ScaleDiscovery,MSD)酶联免疫吸附试验 (ELISA)检测SARS-CoV-2rbd衍生抗原的总IgG和IgA抗原特异性抗体。用 Blocker A试剂盒(MSD)在室温(RT)下封片30分钟并冲洗。然后用浓度为0.18 μg/mL的1％BSA/PBS包被变异特异性生物素化抗原，rt 1小时，洗板后，系列稀释鼻腔冲洗1％BSA和0.05％Tween-20(1x PBS)添加，rt1小时,洗盘 5次,然后1μg/mL抗人类免疫球蛋白g sulfo-tag或2μg/mL抗IgA sulfo- tag(MSD)添加在1％BSA和0.05％Tween-20(1xPBS)，1小时后洗板5次，加入1x Read Buffer T(MSD)，并使用MSD读板器(扇区成像仪600)测量化学发光。使用MSD参考标准1和来自V-Plex SARS-CoV-2 384Panel 2(IgG)试剂盒(MSD)的WHO国际标准(NIBSC代码:20/136)计算世卫组织国际单位。总 IgG抗体滴度测定采用Human/NHP IgG Kit(MSD)。

2)病毒Subgenomic RNA(sgRNA)定量

sgRNA被分离并定量。简单地说，使用RNAzol BD柱试剂盒(Molecular ResearchCenter)从鼻拭子中提取总RNA。采用TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix(AppliedBiosystems)、5′前导区正向引物、基因特异性探针和反向引物探针进行PCR反应，反应方式如下:

sgLeadSARSCoV2_F:“5′-CGATCTCTTGTAGATCTGTTCTC-3′”

E_Sarbeco_P:5′-FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BHQ1- 3′

E_Sarbeco_R:5′-ATATTGCAGCAGTACGCACACA-3′

wtN_P:5′-FAM-TAACCAGAATGGAGAACGCAGTGGG-BHQ1-3′

wtN_R:5′-GGTGAACCAAGACGCAGTAT-3′

用QuantStudio 6Pro Real-Time PCR系统(Applied Biosystems)进行扩增。

(2)结果分析

该研究表明，皮下疫苗所产生的抗体在鼻子中至少可检测6个月(Clements andMurphy,1986)。图9A和图9B表明，接种疫苗后，上呼吸道的 S2-P抗体结合抑制能力联合疫苗明显高于野生型疫苗。无论是2-14天的快速反应速度和抑制高度，以及持续6周的抗体抑制能力，联合疫苗均好于野生型疫苗。

图9C和图9D表明，接种联合疫苗Somi-RBDw后，第二天，呼吸道的病毒滴度和病毒RNA copy数明显下降，至第14天时，已经完全阴性。说明接种联合疫苗后，呼吸道得到较好防护。

实施例8

本实施例用于说明恒河猴免疫接种后，记忆B细胞的水平。

(1)方法

通过B细胞探针结合，将之前分离和低温保存的pbmc离心至温RPMI/10％胎牛血清中，并在洗涤缓冲液中重悬(4％热灭活新生小牛血清/0.02％NaN₃/无酚RPMI)。将pmcs转移到96孔中，在1X PBS中洗涤两次，并与Aqua Blue 活/死细胞染色剂(Thermo FisherScientific)在室温下孵育20分钟。洗涤后，细胞与一抗在室温下孵育20分钟。使用以下抗体(单克隆抗体，除非注明):IgD FITC(山羊多克隆，南方生物科技)，IgM PerCP-Cy5.5(克隆G20-127,BD Biosciences)，IgA Dylight 405(山羊多克隆，Jackson ImmunoresearchInc)， CD20 BV570(克隆2H7,Biolegend)，CD27 BV650(克隆O323,Biolegend)， CD14BV785(克隆M5E2,Biolegend)，CD16 BUV496(克隆3G8,BD Biosciences)，IgG Alexa 700(克隆G18-145，BD Biosciences)，CD3 APC- Cy7(克隆SP34-2,BD Biosciences)，CD38 PE(克隆OKT10,Caprico Biotechnologies)，CD21 PE-cy5(克隆B-ly4,BD Biosciences)，和CXCR5 PE- cy7(克隆MU5UBEE,Thermo Fisher Scientific)。细胞在洗涤缓冲液中洗涤两次，然后与streptavidin-BV605(BD Biosciences)标记为Swild S-2P和 streptavidin-BUV661(BD Biosciences)标记为Somi+RBDw S-2P在4℃(避光) 条件下孵育30分钟。细胞在洗涤液中洗涤两次，剩余的红细胞用BD FACS 裂解液(BD Biosciences)在室温下裂解10分钟。最后两次洗涤后，细胞被固定在0.5％甲醛中(Tousimis Research Corp)。所有抗体滴定以确定最佳浓度。在 BD FACSymphony细胞仪上采集样本，并使用FlowJo version10.7.2(BD, Ashland,OR)进行分析。

(2)结果分析

本实验的结果见图10A和图10B。从图中可以看出，联合疫苗Somi-RBDw 产生的记忆B细胞百分比，无论在攻毒后的28天内，还是接种后的6周内，均高于野生型的产生量。本结果也进一步说明，免疫接种后的保护相关性可能与组织驻留记忆B细胞在感染后扩展的能力相关。由此推论，联合疫苗可能好于野生型疫苗。另外，肺部B细胞短暂的先天刺激可能是对呼吸道病原体的初始适应性免疫反应的关键，记忆性B细胞激活的程度可能取决于病毒激发剂量和随后的病毒复制。

实施例9

本实施例通过恒河猴免疫接种后，细胞免疫反应检测，用于说明本发明联合疫苗接种后对细胞免疫的刺激程度，由此推断其细胞免疫的防护能力。

(1)方法

采用上述实施例所述动物免疫及病毒攻击方法。

采用细胞内细胞因子染色：低温保存的外周血单个核细胞(pbmc)解冻并在37℃/5％CO₂培养箱中复苏一夜。次日，用SARS-CoV-2S蛋白(S1和S2 (与疫苗插入物匹配))和N肽库(JPT多肽)在3mM莫能菌素存在下，以2 μg/ml的终浓度刺激细胞6小时。S1、S2和N肽库分别由158、157和102 个肽段组成，在100％DMSO中，15个肽段与11个氨基酸重叠。阴性对照组给予相同浓度的DMSO代替肽(终浓度为0.5％)。使用的单克隆抗体如下:CD3 APC-Cy7(克隆SP34-2,BD Biosciences)，CD4 PE-cy5.5(克隆s5-3,Invitrogen)， CD8 BV570(克隆RPA-T8,BD Biosciences)，CD45RA PE-cy5(克隆5H9,BD Biosciences)，CCR7 BV650(克隆G043H7,biolegene)，CXCR5 PE(克隆 MU5UBEE,Thermo Fisher)，CXCR3 BV711(克隆1C6/CXCR3,BD Biosciences)， PD-1BUV737(克隆EH12.1,BD Biosciences)，ICOS Pe-Cy7(克隆C398.4A, BioLegend)，CD69 ECD(克隆etp1.55.3,Beckman Coulter)，IFN-g Ax700(克隆B27,BioLegend)，IL-2BV750(克隆MQ1-17H12,BD Biosciences)，IL-4 BB700(克隆MP4-25D2,BD Biosciences)，TNF-FITC(克隆Mab11,BD Biosciences)，IL-13BV421(克隆JES10-5A2,BD Biosciences)，IL-17BV605(克隆BL168,BioLegend)，IL-21Ax647(克隆3A3-N2.1,BD Biosciences)和CD154 BV785(克隆24-31,BioLegend)。Aqua活/死固定死细胞染色试剂盒(Thermo Fisher Scientific)用于排除死细胞。所有抗体都预先滴定以确定最佳浓度，样品在BD FACSymphony流式细胞仪上采集，并使用FlowJo version 10.8.0(BD, Ashland,OR)进行分析。

(2)结果分析

如图11所示，在mRNA接种后，T细胞有多种潜在的作用，可以诱导 TH1和TFH以及低频率的CD8+T细胞。TFH细胞对于诱导和维持抗体反应非常重要。在这里，我们发现联合疫苗Somi-RBDw的s-特异性T细胞，TH1， TFH和CD8在免疫接种后几乎均有显著性升高，特别是在接种后的6周内，攻毒后的反应也较明显。说明该联合疫苗对细胞免疫反应的刺激在未来的临床防护中能够发挥积极的作用。T细胞的第二个潜在作用是对介导病毒在下呼吸道复制的控制，以限制严重疾病的发生，从本结果可以看出，联合疫苗在防护严重病例方面效果可能更好。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，对于本领域技述人员而言，凡在本发明的精神和原则之内，所做出的任何修改、等同替换及改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 苏州祥龙生物医药科技有限公司

<120> 一种基于mRNA的新冠病毒野生型和变异型联合疫苗及其制备方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3822

<212> DNA

<213> 严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 型(SARS-CoV-2)

<400> 1

atgtttgttt ttcttgtttt attgccacta gtctctagtc agtgtgttaa tcttacaacc 60

agaactcaat taccccctgc atacactaat tctttcacac gtggtgttta ttaccctgac 120

aaagttttca gatcctcagt tttacattca actcaggact tgttcttacc tttcttttcc 180

aatgttactt ggttccatgc tatacatgtc tctgggacca atggtactaa gaggtttgat 240

aaccctgtcc taccatttaa tgatggtgtt tattttgctt ccactgagaa gtctaacata 300

ataagaggct ggatttttgg tactacttta gattcgaaga cccagtccct acttattgtt 360

aataacgcta ctaatgttgt tattaaagtc tgtgaatttc aattttgtaa tgatccattt 420

ttgggtgttt attaccacaa aaacaacaaa agttggatgg aaagtgagtt cagagtttat 480

tctagtgcga ataattgcac ttttgaatat gtctctcagc cttttcttat ggaccttgaa 540

ggaaaacagg gtaatttcaa aaatcttagg gaatttgtgt ttaagaatat tgatggttat 600

tttaaaatat attctaagca cacgcctatt aatttagtgc gtgatctccc tcagggtttt 660

tcggctttag aaccattggt agatttgcca ataggtatta acatcactag gtttcaaact 720

ttacttgctt tacatagaag ttatttgact cctggtgatt cttcttcagg ttggacagct 780

ggtgctgcag cttattatgt gggttatctt caacctagga cttttctatt aaaatataat 840

gaaaatggaa ccattacaga tgctgtagac tgtgcacttg accctctctc agaaacaaag 900

tgtacgttga aatccttcac tgtagaaaaa ggaatctatc aaacttctaa ctttagagtc 960

caaccaacag aatctattgt tagatttcct aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa 1020

gtttttaacg ccaccagatt tgcatctgtt tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac 1080

tgtgttgctg attattctgt cctatataat tccgcatcat tttccacttt taagtgttat 1140

ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc tgctttacta atgtctatgc agattcattt 1200

gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc gctccagggc aaactggaaa gattgctgat 1260

tataattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat 1320

cttgattcta aggttggtgg taattataat tacctgtata gattgtttag gaagtctaat 1380

ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt 1440

aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catatggttt ccaacccact 1500

aatggtgttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca 1560

ccagcaactg tttgtggacc taaaaagtct actaatttgg ttaaaaacaa atgtgtcaat 1620

ttcaacttca atggtttaac aggcacaggt gttcttactg agtctaacaa aaagtttctg 1680

cctttccaac aatttggcag agacattgct gacactactg atgctgtccg tgatccacag 1740

acacttgaga ttcttgacat tacaccatgt tcttttggtg gtgtcagtgt tataacacca 1800

ggaacaaata cttctaacca ggttgctgtt ctttatcagg atgttaactg cacagaagtc 1860

cctgttgcta ttcatgcaga tcaacttact cctacttggc gtgtttattc tacaggttct 1920

aatgtttttc aaacacgtgc aggctgttta ataggggctg aacatgtcaa caactcatat 1980

gagtgtgaca tacccattgg tgcaggtata tgcgctagtt atcagactca gactaattct 2040

cctcggcggg cacgtagtgt agctagtcaa tccatcattg cctacactat gtcacttggt 2100

gcagaaaatt cagttgctta ctctaataac tctattgcca tacccacaaa ttttactatt 2160

agtgttacca cagaaattct accagtgtct atgaccaaga catcagtaga ttgtacaatg 2220

tacatttgtg gtgattcaac tgaatgcagc aatcttttgt tgcaatatgg cagtttttgt 2280

acacaattaa accgtgcttt aactggaata gctgttgaac aagacaaaaa cacccaagaa 2340

gtttttgcac aagtcaaaca aatttacaaa acaccaccaa ttaaagattt tggtggtttt 2400

aatttttcac aaatattacc agatccatca aaaccaagca agaggtcatt tattgaagat 2460

ctacttttca acaaagtgac acttgcagat gctggcttca tcaaacaata tggtgattgc 2520

cttggtgata ttgctgctag agacctcatt tgtgcacaaa agtttaacgg ccttactgtt 2580

ttgccacctt tgctcacaga tgaaatgatt gctcaataca cttctgcact gttagcgggt 2640

acaatcactt ctggttggac ctttggtgca ggtgctgcat tacaaatacc atttgctatg 2700

caaatggctt ataggtttaa tggtattgga gttacacaga atgttctcta tgagaaccaa 2760

aaattgattg ccaaccaatt taatagtgct attggcaaaa ttcaagactc actttcttcc 2820

acagcaagtg cacttggaaa acttcaagat gtggtcaacc aaaatgcaca agctttaaac 2880

acgcttgtta aacaacttag ctccaatttt ggtgcaattt caagtgtttt aaatgatatc 2940

ctttcacgtc ttgacaaagt tgaggctgaa gtgcaaattg ataggttgat cacaggcaga 3000

cttcaaagtt tgcagacata tgtgactcaa caattaatta gagctgcaga aatcagagct 3060

tctgctaatc ttgctgctac taaaatgtca gagtgtgtac ttggacaatc aaaaagagtt 3120

gatttttgtg gaaagggcta tcatcttatg tccttccctc agtcagcacc tcatggtgta 3180

gtcttcttgc atgtgactta tgtccctgca caagaaaaga acttcacaac tgctcctgcc 3240

atttgtcatg atggaaaagc acactttcct cgtgaaggtg tctttgtttc aaatggcaca 3300

cactggtttg taacacaaag gaatttttat gaaccacaaa tcattactac agacaacaca 3360

tttgtgtctg gtaactgtga tgttgtaata ggaattgtca acaacacagt ttatgatcct 3420

ttgcaacctg aattagactc attcaaggag gagttagata aatattttaa gaatcataca 3480

tcaccagatg ttgatttagg tgacatctct ggcattaatg cttcagttgt aaacattcaa 3540

aaagaaattg accgcctcaa tgaggttgcc aagaatttaa atgaatctct catcgatctc 3600

caagaacttg gaaagtatga gcagtatata aaatggccat ggtacatttg gctaggtttt 3660

atagctggct tgattgccat agtaatggtg acaattatgc tttgctgtat gaccagttgc 3720

tgtagttgtc tcaagggctg ttgttcttgt ggatcctgct gcaaatttga tgaagacgac 3780

tctgagccag tgctcaaagg agtcaaatta cattacacat aa 3822

Claims (10)

1.一种基于mRNA的新冠病毒野生型和变异型联合疫苗，其特征在于，所述联合疫苗包括新冠病毒野生型和变异体mRNA序列，所述新冠病毒野生型为SARS-CoV-2，所述新冠病毒变异型包括但不限于SARS-CoV-2的相关变异Alpha、Beta、Gamma、Delta和Omicron。

2.根据权利要求1所述的基于mRNA的新冠病毒野生型和变异型联合疫苗，其特征在于，所述新冠病毒野生型和变异型mRNA序列包括但不限于编码新冠病毒野生型和变异型SARS-CoV-2的S蛋白以及编码S蛋白中的RBD的mRNA序列；优选地，所述新冠病毒野生型为首先发布的病毒序列GenBank：MN908947.3，所述新冠病毒变异型mRNA序列为Omicron序列。

3.根据权利要求1或2所述的基于mRNA的新冠病毒野生型和变异型联合疫苗，其特征在于，所述新冠病毒野生型和变异型mRNA序列分别包括S蛋白、E蛋白、M蛋白和核衣壳N蛋白；所述S蛋白包括其中的受体结合阈RBD和N-末端结构域NTD。

4.根据权利要求1～3任意一项所述的基于mRNA的新冠病毒野生型和变异型联合疫苗，其特征在于，所述联合疫苗为脂质体分别包裹新冠病毒野生型和变异型mRNA序列的混合疫苗，或野生型S蛋白或其中的RBD-变异体S蛋白或其中的RBD的嵌合抗原mRNA联合疫苗。

5.根据权利要求4所述的基于mRNA的新冠病毒野生型和变异型联合疫苗，其特征在于，所述联合疫苗包括：

(1)分别构建野生型和变异型SARS-CoV-2片段S刺突蛋白基因和嵌合抗原DNA质粒载体；

(2)在大肠杆菌或真核细胞中表达纯化；

其中，所述嵌合型质粒抗原分别包含野生型RBD+变异型S蛋白，或野生型S蛋白+变异型RBD，野生型RBD+变异型RBD，以及野生型S蛋白+变异型S蛋白。

6.根据权利要求5所述的基于mRNA的新冠病毒野生型和变异型联合疫苗，其特征在于，所述联合疫苗制备过程还包括用于构建所需的mRNA链的DNA质粒模板；所述用于体外转录的质粒DNA模板，至少包含：

(1)噬菌体或CMV启动子；

(2)ORF；

(3)转录成poly(A)的多聚[d(A/T)]序列；

(4)质粒线性化的唯一限制位点NotI/XbaI，用以确保明确的转录终止。

7.根据权利要求6所述的基于mRNA的新冠病毒野生型和变异型联合疫苗，其特征在于，所述联合疫苗制备过程还包括：

(1)体外转录IVT mRNA，通过纯化质粒的线性化或通过PCR扩增所需区域；所述IVT部分包括但不限于线性DNA模板、RNA聚合酶、核苷三磷酸底物、聚合酶辅因子、MgCl₂、含有多胺和抗氧化剂的pH缓冲液；

(2)核苷修饰，修饰的核苷酸在mRNA序列中的结合，可有效降低内源性mRNA的免疫调节能力；所述核苷修饰包括但不限于甲基化的核苷或伪尿嘧啶；

(3)选用联合疫苗mRNA为自扩增RNA，包括编码抗原和RNA复制酶，扩增重组mRNA；所述自扩增RNA包括体外转录mRNA，由抗原编码的开放阅读框ORF、5’和3’端未翻译区utr、一个7甲基鸟苷5’帽结构、合并到第一个核苷酸的序列和3’端多聚腺苷酸尾部；

(4)密码子优化；

(5)两个连续的脯氨酸置换，所述脯氨酸取代基分别为K986P和V987P；

(6)一个10核苷酸连接序列GCAUAUGACU；还包括联合疫苗序列的最后70个其他腺苷残基；

(7)色谱纯化，所述色谱纯化通过去除短链或双链RNA分子，生成纯单mRNA产物；

(8)灭菌含有mRNA的脂质纳米颗粒，并使用四种脂质成分包裹mRNA形成纳米颗粒复合物；

(9)脂质系统配方的制备，所述脂质系统配方包含但不限于可电离的阳离子脂质、磷脂、胆固醇和脂质锚定的聚乙二醇(PEG)；优选地，LNP配方包括RNA-脂质复合物、提供结构刚性的脂质以及能够修饰颗粒表面特性的脂质化聚合物涂层；

8.根据权利要求1～7中任意一项所述的基于mRNA的新冠病毒野生型和变异型联合疫苗，其特征在于，所述联合疫苗中野生型mRNA序列长度为3786个核苷酸，分子量约为1388kDa。

9.根据权利要求1～8中任意一项所述的基于mRNA的新冠病毒野生型和变异型联合疫苗生产流程设计，其特征在于，所述生产流程为自动一体化生产流程；优选地，为微流控尺度生产流程；优选地，所述流程还可实施现场产品去除ISPR、底物进料和产品回收SFPR。

10.根据权利要求9所述的基于mRNA的新冠病毒野生型和变异型联合疫苗生产流程设计，其特征在于，所述生产流程为连续形式的两步酶反应，随后酶循环使用切向流过滤和两个多模态色谱，包括结合-洗脱模式用于中间纯化、通过流模式用于净化；所述配方通过第三切向流过滤模块实现。

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