CN114752631B - Rna及包含其的新型冠状病毒疫苗和制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了RNA及包含其的新型冠状病毒疫苗和制备方法，属于医用的配置品领域。该RNA包括5’‑UTR、目的基因的mRNA、3’‑UTR和PolyA，mRNA为编码新型冠状病毒omicron突变株的抗原性多肽或其抗原性片段，抗原性多肽或其抗原性片段至少包含所述突变株的S蛋白或S蛋白的受体结合结构域片段；5’‑UTR、3’‑UTR和Poly A的序列分别为序列1的第1至52位、第806至931位和第932至1051位。本发明的RNA在体外细胞中能够表达抗原蛋白，且免疫小鼠后能够检测到高效价的新型冠状病毒Omicron突变株假病毒中和抗体，可用于预防和/或治疗新型冠状病毒感染。

Description

RNA及包含其的新型冠状病毒疫苗和制备方法
技术领域
本发明属于医用的配置品领域，尤其是涉及RNA及包含其的新型冠状病毒疫苗和制备方法。
背景技术
安全有效疫苗的普及是抵御新型冠状病毒新型冠状病毒的最强力武器，也是阻击新型冠状病毒肺炎疫情的关键。虽然目前现有疫苗的广泛接种在一定程度上建立起群体免疫，但至今由新型冠状病毒持续引发的公共卫生危机仍未解除。
新型冠状病毒突变株Omicron (B.1.1.529) BA.1.1亚型的S蛋白上出现37个突变位点，是目前突变最多的毒株。S蛋白RBD受体结合区出现G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y、Y505H，共15个突变位点；非RBD区出现A67V, H69-, V70-, T95I, G142D, V143-, Y144-, Y145-, N211-,L212I, ins214EPE, T547K, D614G, H655Y, N679K, P681H, N764K, D796Y, N856K,Q954H, N969K, L981F，共22个突变位点。与之前的全球VOC变体相比，Omicron共有K417N、T478K、N501Y突变，但也存在G339D、N440K、S447N、Q498R等额外的突变。Omicron突变株在保留ACE2受体结合能力的同时，增强了对中和抗体的逃逸能力。因此，新型冠状病毒疫苗需要及时更新，以抵御新型冠状病毒Omicron突变株病毒。
发明内容
本发明的目的在于丰富现有技术中新型冠状病毒疫苗的种类，提供一种针对新型冠状病毒omicron突变株的mRNA疫苗、药物组合物和试剂盒。新型冠状病毒的mRNA疫苗的设计难度较高，尤其是病毒完整和高效表达的实现会受到多种因素的影响。本发明提供的mRNA在体外细胞中均能够表达抗原蛋白，且免疫小鼠后能够检测到高效价的新型冠状病毒Omicron突变株假病毒中和抗体，具有良好的免疫原性。
本发明提供的技术方案如下：
在第一方面，本发明提供了一种RNA，所述RNA包括依次连接的5’-UTR、目的基因的mRNA和3’-UTR和Poly A，所述目的基因的mRNA为编码新型冠状病毒omicron突变株的抗原性多肽或其抗原性片段、变体或衍生物的序列，所述抗原性多肽或其抗原性片段至少包含新型冠状病毒omicron突变株的S蛋白或S蛋白的受体结合结构域（RBD）片段；所述5’-UTR的序列为序列表中序列1的第1至52位的序列；所述3’-UTR的序列为序列表中序列1的第806至931位的序列；所述Poly A的序列为序列表中序列1的第932至1051位的序列。
在本发明中，新型冠状病毒是指严重急性呼吸系统综合症冠状病毒(SARS-CoV-2)，其中，S蛋白是指表面刺突(S)蛋白，S蛋白质（spike）由于是介导病毒入侵的主要蛋白质，也是中和抗体的主要靶点。S蛋白包含两个亚基，S1和S2。其中，S1主要包含有受体结合区(RBD结构域)，冠状病毒正是通过RBD结构域与细胞表面受体结合来感染细胞；S2介导细胞膜融合，故S蛋白或S蛋白的受体结合结构域RBD也是中和抗体的主要靶点。
在一个实施方案中，所述抗原性多肽或其抗原性片段包含S蛋白的信号肽、NTD和RBD。在本发明中，NTD即N-terminal domain，为新型冠状病毒S蛋白N端的一段序列，冠状病毒的NTD可与宿主细胞的蛋白或糖蛋白结合，帮助病毒对宿主细胞的粘附和入侵，介导病毒入侵宿主细胞，该段区域可能包含诱导中和抗体产生的表位。S蛋白的NTD和RBD在结构上相邻。
本发明中，所述RNA至少包含编码新型冠状病毒的RBD的mRNA序列；优选地，所述RNA包含至少编码新型冠状病毒的的信号肽、NTD和RBD的mRNA序列。
所述RNA的序列为如下A1）-A20）中的至少一种：
A1）SEQ ID No. 1所示的RNA序列；
A2）与SEQ ID No. 1所示序列具有90%以上同源性的且功能相同的序列；
A3）SEQ ID No. 2所示的RNA序列；
A4）与SEQ ID No. 2所示序列具有90%以上同源性的且功能相同的序列；
A5）SEQ ID No. 3所示的RNA序列；
A6）与SEQ ID No. 3所示序列具有90%以上同源性的且功能相同的序列；
A7）SEQ ID No. 4所示的RNA序列；
A8）与SEQ ID No. 4所示序列具有90%以上同源性的且功能相同的序列；
A9）SEQ ID No. 5所示的RNA序列；
A10）与SEQ ID No. 5所示序列具有90%以上同源性的且功能相同的序列；
A11）SEQ ID No. 6所示的RNA序列；
A12）与SEQ ID No. 6所示序列具有90%以上同源性的且功能相同的序列；
A13）SEQ ID No. 7所示的RNA序列；
A14）与SEQ ID No. 7所示序列具有90%以上同源性的且功能相同的序列；
A15）SEQ ID No. 8所示的RNA序列；
A16）与SEQ ID No. 8所示序列具有90%以上同源性的且功能相同的序列；
A17）SEQ ID No. 9所示的RNA序列；
A18）与SEQ ID No. 9所示序列具有90%以上同源性的且功能相同的序列；
A19）SEQ ID No. 10所示的RNA序列；
A20）与SEQ ID No. 10所示序列具有90%以上同源性的且功能相同的序列。
上述方案中的A9）-A20），所述RNA包含编码新型冠状病毒的S蛋白的mRNA序列。
本发明中，新冠Omicron突变株mRNA的CDS由优化的密码子构成，在细胞水平可以高效表达蛋白（转染细胞后均表达较高水平的蛋白），其中，SEQ ID No. 4所示的序列在SEQID No. 1至SEQ ID No. 4所示的序列中蛋白表达的水平最高。将本发明的mRNA制备成疫苗（表达S蛋白RBD区的疫苗）后，经小鼠免疫验证，有效性好，具有免疫原性。SEQ ID No. 8所示的序列在SEQ ID No. 5至SEQ ID No. 10所示的序列中蛋白表达的水平最高。将本发明的mRNA制备成疫苗（表达S蛋白的疫苗）后，经小鼠免疫验证，有效性好，具有免疫原性。
本发明所述的“同源性”与“同一性”同义，是指在使用氨基酸序列或核苷酸序列的方面，使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%的相似度，且依然具有与原氨基酸序列或核苷酸序列相同的功能。
本发明的mRNA包括抗原编码区和抗原编码区以外的骨架部分，包含1083骨架代码序列以及不同抗原编码序列构成。本发明中，所述1083骨架代码序列由5’-Cap结构、5’-UTR、3’-UTR以及Poly A所构成。
在本发明的序列SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 4中，所述5’-UTR的序列为序列表中序列的第1至52位的序列；所述3’-UTR的序列为序列表中序列的第806至931位的序列；所述Poly A的序列为序列表中序列的第932至1051位的序列；所述目的基因的mRNA为序列表中序列的第53至805位的序列。
在一个实施方案中，编码新型冠状病毒的S蛋白mRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.5至SEQ ID No. 10所示的序列中的任一条所示。
本发明的mRNA包括抗原编码区和抗原编码区以外的骨架部分，包含1083骨架代码序列以及不同抗原编码序列构成。本发明中，所述1083骨架代码序列由5’-Cap结构、5’-UTR、3’-UTR以及Poly A所构成。
本发明的mRNA序列自5’端第1至52为5’-UTR；mRNA-S1（SEQ ID No. 5）和mRNA-S3（SEQ ID No. 7）第3866至3991为3’-UTR，第3992至4111为Poly A尾；mRNA-S2（SEQ ID No.6）、mRNA-S4（SEQ ID No. 8）、mRNA-S5（SEQ ID No. 9）和mRNA-S6（SEQ ID No. 10）第3869至3994为3’-UTR，第3995至4114为Poly A尾。mRNA-S1（SEQ ID No. 5）第53至3865为目的基因CDS-1（编码新冠Omicron突变株S蛋白，K983P，V984P）；mRNA-S2（SEQ ID No. 6）第53至3868为目的基因CDS-2（编码新冠Omicron突变株S蛋白，ins2V，K984P，V985P）；mRNA-S3（SEQID No. 7）第53至3865为目的基因CDS-3（编码新冠Omicron突变株S蛋白，R679G，R680S，R682G，K983P，V984P）；mRNA-S4（SEQ ID No. 8）第53至3868为目的基因CDS-4（编码新冠Omicron突变株S蛋白，ins2V，R680G，R681S，R683G，K984P，V985P）；mRNA-S5（SEQ ID No. 9）第53至3865为目的基因CDS-5（编码新冠Omicron突变株S蛋白，ins2V，R680G，R681S，R683G，F815P，A890P，A897P，A940P，K984P，V985P）；mRNA-S6（SEQ ID No. 10）第53至3868为目的基因CDS-6（编码新冠Omicron突变株S蛋白，ins2V，R680G，R681S，R683G，K812A，R813G，F815P，A890P，A897P，A940P，K984P，V985P）。
在本发明所提供的序列中，50-52位为kozak序列。本领域技术人员可通过常规技术手段选择和替换与本发明不同的kozak序列或将其删除，例如kozak序列可替换为GCC、ACC、GCCACC或GCCANN。
在本发明提供序列的第52位5’UTR末端和第53位CDS的起始密码子首位A之间，本领域技术人员可通过常规技术手段加入克隆用酶切位点及额外的Kozak序列，在CDS的终止密码子TAA末端（mRNA-S1（SEQ ID No. 5）和mRNA-S3（SEQ ID No. 7）的第3865位或mRNA-S2（SEQ ID No. 6）、mRNA-S4（SEQ ID No. 8）、mRNA-S5（SEQ ID No. 9）和mRNA-S6（SEQ IDNo. 10）第3868位）或mRNA-1058a（SEQ ID No.1）、mRNA-1058b（SEQ ID No.2）、mRNA-1058c（SEQ ID No.3）、mRNA-1058d（SEQ ID No.4）的第805位）和3’UTR的首个碱基（mRNA-S1（SEQID No. 1）和mRNA-S3（SEQ ID No. 3）的第3866位或mRNA-S2（SEQ ID No. 2）、mRNA-S4（SEQID No. 4）、mRNA-S5（SEQ ID No. 5）和mRNA-S6（SEQ ID No. 6）第3866位）或mRNA-1058a（SEQ ID No.1）、mRNA-1058b（SEQ ID No.2）、mRNA-1058c（SEQ ID No.3）、mRNA-1058d（SEQID No.4的第806位）之间以及3 ’UTR的最后一个碱基（mRNA-S1（SEQ ID No. 1）和mRNA-S3（SEQ ID No. 3）的第3991位或mRNA-S2（SEQ ID No. 2）、mRNA-S4（SEQ ID No. 4）、mRNA-S5（SEQ ID No. 5）和mRNA-S6（SEQ ID No. 6的第3994位）或mRNA-1058a（SEQ ID No.1）、mRNA-1058b（SEQ ID No.2）、mRNA-1058c（SEQ ID No.3）、mRNA-1058d（SEQ ID No.4的第931位）与PolyA之间，本领域技术人员可通过常规技术手段加入克隆用酶切位点。因此，本发明的序列涵盖与本发明在这些位点加入不同酶切位点及Kozak序列不同的其他所有序列。
本发明中，mRNA-1058a（如SEQ ID No.1所示），mRNA-1058b（如SEQ ID No. 2所示），mRNA-1058c（如SEQ ID No. 3所示），mRNA-1058d（如SEQ ID No. 4所示），mRNA-S1（如SEQ ID No. 5所示），mRNA-S2（如SEQ ID No. 6所示），mRNA-S3（如SEQ ID No. 7所示），mRNA-S4（如SEQ ID No. 8所示），mRNA-S5（如SEQ ID No. 9所示）和mRNA-S6（如SEQ ID No.10所示）可以作为疫苗的活性成分。
本发明提供了前述RNA对应的核酸分子或其所编码的蛋白。所述基因（即DNA分子）的脱氧核苷酸序列包含SEQ ID No. 11至SEQ ID No. 20所示的序列中的一条或多条。
本发明提供了前述核酸分子或蛋白相关的生物材料，所述生物材料包括下述B1)至B6)中的任一种：
B1)编码所述蛋白的核酸分子，所述核酸分子为编码前述mRNA的DNA分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体，或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物，或含有B2)所述表达盒的重组微生物，或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因细胞系。
在本发明中，可以将所述蛋白的编码序列通过基因工程技术克隆到质粒中，进行体外转录，用于mRNA合成；优选包括：1）将mRNA对应的DNA片段克隆至载体上获得重组质粒；2）将所述重组质粒转入宿主细胞获得重组细胞，从扩繁后的重组细胞中提取质粒，并进行酶切线性化获得体外表达mRNA的DNA模板；3）构建包括所述DNA模板的RNA体外合成体系进行mRNA的体外合成获得所述活性成分mRNA。在本发明中，所述DNA片段的具体序列可根据碱基互补配对原则确定。
进一步的，在体外转录后，需对转录RNA产物进行加帽反应，获得的RNA的5’端连接有帽子（Cap-1）结构。
本发明所述重组载体，优选地，可为载体pVAX1或pcDNA3.1。具体地，mRNA疫苗序列的DNA模板序列替换到载体所述载体T7启动子序列与XbaI位点之间的序列得到重组质粒，利用载体序列上的T7启动子序列，在T7转录酶作用下启动体外转录。
其中，所述B3)为如下b1)-b10）任一所述的载体：
b1)用序列表中序列11的所示的DNA替换载体pVAX1的T7启动子序列与XbaI识别位点之间的片段（小片段），并保持载体其他核苷酸序列不变的重组载体；
b2)用序列表中序列12的所示的DNA替换载体pVAX1的T7启动子序列与XbaI位点之间的片段（小片段），并保持载体其他核苷酸序列不变的重组载体；
b3)用序列表中序列13的所示的DNA替换载体pVAX1的T7启动子序列与XbaI位点之间的片段（小片段），并保持载体其他核苷酸序列不变的重组载体；
b4)用序列表中序列14的所示的DNA替换载体pVAX1的T7启动子序列与XbaI位点之间的片段（小片段），并保持载体其他核苷酸序列不变的重组载体；
b5)用序列表中序列15的所示的DNA替换载体pVAX1的T7启动子序列与XbaI位点之间的片段（小片段），并保持载体其他核苷酸序列不变的重组载体；
b6)用序列表中序列16的所示的DNA替换载体pVAX1的T7启动子序列与XbaI位点之间的片段（小片段），并保持载体其他核苷酸序列不变的重组载体；
b7)用序列表中序列17的所示的DNA替换载体pVAX1的T7启动子序列与XbaI位点之间的片段（小片段），并保持载体其他核苷酸序列不变的重组载体；
b8)用序列表中序列18的所示的DNA替换载体pVAX1的T7启动子序列与XbaI位点之间的片段（小片段），并保持载体其他核苷酸序列不变的重组载体；
b9)用序列表中序列19的所示的DNA替换载体pVAX1的T7启动子序列与XbaI位点之间的片段（小片段），并保持载体其他核苷酸序列不变的重组载体；
b10)用序列表中序列20的所示的DNA替换载体pVAX1的T7启动子序列与XbaI位点之间的片段（小片段），并保持载体其他核苷酸序列不变的重组载体。
进一步的，将mRNA转入细胞中进行表达，优选地，细胞选自HEK293T细胞、293FTX细胞、HEK293A细胞。
本发明还提供了一种mRNA-脂质复合物，所述mRNA-脂质复合物包含递送载体以及前述的mRNA；
优选地，所述递送载体包括可离子化脂质体、阳离子脂质体、可离子化蛋白、阳离子蛋白、可离子化聚合物、阳离子聚合物、可离子化胶束、阳离子胶束、可离子化脂质纳米粒、阳离子脂质纳米颗粒中的任一种；
更优选地，所述递送载体选自可离子化阳离子脂质体（LPX）或可离子化脂质纳米粒（LNP）。
在一个实施方案中，所述mRNA-脂质复合物选自可离子化脂质-mRNA复合物、阳离子脂质-mRNA复合物或可阳离子化脂质-mRNA复合物、可离子化脂质-mRNA脂质纳米粒、阳离子脂质-mRNA脂质纳米粒或可阳离子化脂质-mRNA脂质纳米粒；
所述mRNA-脂质复合物为以下C1-C6中的任一种：
所述RNA-脂质复合物为以下C1-C4中的任一种：
C1)可离子化脂质-mRNA复合物，所述可离子化脂质-mRNA复合物中包含可离子化脂质、所述的RNA、鱼精蛋白、PEG化脂质、1,2-二油酯-sn-甘油-3-磷酸乙醇铵和/或胆固醇；
C2)阳离子脂质-mRNA复合物，所述阳离子脂质-mRNA复合物中包含阳离子脂质、所述的RNA、鱼精蛋白、PEG化脂质、1,2-二油酯-sn-甘油-3-磷酸乙醇铵和/或胆固醇；
C3)可离子化脂质-mRNA脂质纳米粒，所述可离子化脂质-mRNA纳米粒中包含可离子化脂质、所述的RNA、PEG化脂质、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱和胆固醇；
C4)阳离子脂质-mRNA脂质纳米粒，所述阳离子脂质-mRNA脂质纳米粒中包含可离子化脂质、所述的RNA、PEG化脂质、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱和胆固醇；
所述阳离子脂质可为2-辛基癸基-6-((4-(癸氧基)-4-氧丁基)(2-羟乙基)氨基)己酸酯（简称YK009）。
进一步的，所述mRNA-脂质复合物包括由RNA结合鱼精蛋白制备脂质多聚复合物、由RNA结合可离子化脂质于制备的脂质纳米颗粒LNP-mRNA、由RNA结合阳离子化脂质YK009制备的新型可阳离子化脂材-RNA脂质纳米粒。
进一步的，所述mRNA-脂质复合物的制备方法包括：将所述的RNA与可离子化脂材混合后用脂质包装；其中，可离子化脂材可以是MC3、SM102、ALC0315、Lipid 5、DOTAP等；
进一步的，所述制备方法包括将可离子化脂材与1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、DMG-PEG2000溶解后混合，然后将RNA与所述混合得到的脂材混合。
在一个具体的实施方案中，mRNA-脂质复合物的制备方法包括：将鱼精蛋白的醋酸钠缓冲液溶液与mRNA（如SEQ ID No. 4所示）的柠檬酸缓冲液溶液混合制备出鱼精蛋白-mRNA复合物；然后将可离子化阳离子脂材（如SM102）、1,2-二油酯-sn-甘油-3-磷酸乙醇铵（DOPE）、DMG-PEG2000按质量比混合，与前述鱼精蛋白-mRNA复合物再进行混合。在具体的实施方案中，还包括混合后在缓冲液中稀释以及离心超滤浓缩等步骤。
本发明提供了一种新型冠状病毒mRNA疫苗，其包含前述的RNA、前述的生物材料或前述的mRNA-脂质复合物；
优选地，所述mRNA疫苗诱导细胞产生病毒样颗粒；和/或，所述mRNA疫苗还包括佐剂。
术语“佐剂”指在细胞水平或体液水平增加、刺激、活化、加强或调节针对组合物的活性成分的免疫应答的试剂。
本发明人通过大量实验，最终发现本发明特定的框架序列与编码序列的特定组合能够使得所制备的疫苗取得较好的免疫原性和稳定性。
所述新型冠状病毒mRNA疫苗为针对新型冠状病毒omicron突变株的疫苗，其施用对象包括但不限于哺乳动物和人。所述的哺乳动物包括但不限于猴、骆驼、牛、马、山羊、绵羊、猪、猫、狗、兔、小鼠或大鼠等。优选地，所述疫苗为传染病疫苗，用于预防新型冠状病毒omicron的感染。本发明所述的“预防”指在疾病开始发展之前或之后通过施用本发明所述的产品来避免症状或者延缓特定症状紧张的所有行为。
本发明提供了一种药物组合物，其包含前述的mRNA、前述的生物材料或前述的mRNA-脂质复合物和/或前述的mRNA疫苗，以及任选地药用载体。本发明提供了包含前述的mRNA、前述的生物材料或前述的mRNA-脂质复合物和/或前述的mRNA疫苗的产品在制备预防和/或治疗COVID-19型冠状病毒感染的药物中的应用。
本发明提供了一种试剂盒，其包含前述的mRNA、前述的生物材料或前述的mRNA-脂质复合物、前述的mRNA疫苗和/或前述的药物组合物。
本发明中，术语“中和抗体”一般是指微生物入侵人体后，会刺激产生很多种抗体，但只有部分抗体能迅速识别微生物，并在其入侵人体细胞前将其“抓住”，保护人体不被感染。这个过程就叫中和作用，发挥作用的抗体就是中和抗体。
本发明的有益效果在于：在本发明中，疫苗活性成分mRNA-1058d结合鱼精蛋白制备脂质多聚复合物LPX-mRNA疫苗制剂可实现体外细胞新型冠状病毒Omicron突变株病毒刺突蛋白受体结合域RBD抗原表达；疫苗活性成分mRNA-1058d由可离子化脂质或可阳离子化脂质YK009制备脂质纳米颗粒LNP-mRNA疫苗制剂可实现体外细胞新型冠状病毒Omicron突变株病毒刺突蛋白受体结合域RBD抗原蛋白表达。
在本发明中，疫苗活性成分mRNA-S4由可离子化脂质或可阳离子化脂质YK009制备脂质纳米颗粒LNP-mRNA疫苗制剂可实现体外细胞新型冠状病毒Omicron突变株病毒S蛋白抗原蛋白表达。
mRNA疫苗的成功研制很大程度上取决于mRNA自身序列的优化，本发明提供的作为疫苗活性成分的mRNA包含1083骨架代码序列以及不同抗原编码序列构成，mRNA序列是经过密码子优化后的mRNA，通过转染通过商用转染试剂包载转染HEK293T细胞，发现其各自单独在细胞中都可以大量表达抗原蛋白，即在体外细胞具备很好的抗原表达效能。其中表达新型冠状病毒Omicron突变病毒刺突蛋白受体结合域(RBD)抗原蛋白效能最优的疫苗活性成分为mRNA-1058d（SEQ ID No. 4所示）；表达新型冠状病毒Omicron突变病毒刺突蛋白(S)抗原蛋白效能最优的疫苗活性成分为mRNA-S4（SEQ ID No. 8所示）。
本发明所提供的mRNA-1058d疫苗可在体内实现稳定安全的表达和有效激活免疫反应，可引起中和抗体应答，在单次免疫后10天的小鼠血清中可检测到高效价的新型冠状病毒Omicron突变株假病毒中和抗体平均NT50分别为1:925 (LNP-mRNA-1058d)和1:871(YK009 LNP-mRNA-1058d)，说明mRNA-1058d具备良好的免疫原性，可发挥疫苗的作用。
本发明所提供的mRNA-S4疫苗可在体内实现稳定安全的表达和有效激活免疫反应，可引起中和抗体应答，在免疫的小鼠血清中可检测到高效价的新型冠状病毒Omicron突变株假病毒中和抗体平均NT50分别为1:8641 (N-1-甲基-假尿苷修饰的mRNA)和1:5079（未修饰mRNA），说明mRNA-S4具备良好的免疫原性，可发挥疫苗的作用，可用于预防和/或治疗新型冠状病毒感染。
附图说明
图1为本发明提供的新型冠状病毒Omicron突变株病毒mRNA疫苗活性成分mRNA-1058a、mRNA-1058b、mRNA-1058c、mRNA-1058d、mRNA-S1、mRNA-S2、mRNA-S3、mRNA-S4、mRNA-S5和mRNA-S6的结构示意图；
图2为本发明的实施例1中mRNA-1058a的质量分析结果图；
图3为本发明的实施例1中mRNA-1058b的质量分析结果图；
图4为本发明的实施例1中mRNA-1058c从的质量分析结果图；
图5为本发明的实施例1中mRNA-1058d的质量分析结果图；
图6为本发明的实施例1中mRNA-S1的质量分析结果图；
图7为本发明的实施例1中mRNA-S2的质量分析结果图；
图8为本发明的实施例1中mRNA-S3的质量分析结果图；
图9为本发明的实施例1中mRNA-S4的质量分析结果图；
图10为本发明的实施例1中mRNA-S5的质量分析结果图；
图11为本发明的实施例1中mRNA-S6的质量分析结果图；
图12为本发明的实施例1中的细胞转染蛋白表达检测结果图；
图13为本发明的实施例1中的LPX-mRNA-1058d疫苗制剂粒径电位表征图；
图14为本发明的实施例1中的YK009 LNP-mRNA-S4疫苗制剂粒径电位表征图；
图15为本发明的实施例1中的LNP-mRNA-1058d疫苗制剂粒径电位表征图；
图16为本发明的实施例1中的LNP-mRNA-S4疫苗制剂粒径电位表征图；
图17为本发明的实施例1中的YK009 LNP-mRNA-1058d疫苗制剂粒径电位表征图；
图18为本发明的实施例4中的细胞转染蛋白表达检测结果图；
图19为本发明的实施例4中的免疫小鼠血清新型冠状病毒Omicron突变株假病毒中和抗体NT50的检测结果图；
图20为本发明中使用的可阳离子化脂质YK009的结构示意图；
图21为mRNA的体外转录反应体系；
图22为mRNA的Cap1加帽反应体系。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、新型冠状病毒Omicron突变株病毒（新冠Omicron突变株）mRNA疫苗的序列设计、制备和体外细胞的抗原表达检测。
一、新冠Omicron突变株mRNA疫苗的序列设计。
新冠Omicron突变株mRNA疫苗的序列设计采用优化的mRNA骨架代码序列，加强mRNA的稳定性与蛋白表达效能。新冠Omicron突变株mRNA（GISAID数据库）的CDS由优化的密码子构成，决定了新冠Omicron突变株刺突蛋白（S）的氨基酸序列或刺突蛋白（S）受体结合域蛋白（RBD）的氨基酸序列。
为实现mRNA的体外转录，将新冠Omicron突变株mRNA疫苗序列模板构建在载体pVAX1的T7启动子序列--XbaI位点之间得到重组质粒，利用载体序列上的T7启动子序列，在T7转录酶作用下启动体外转录。
由此，设计优化得到新冠Omicron突变株mRNA疫苗活性成分mRNA-1058a、mRNA-1058b、mRNA-1058c、mRNA-1058d、mRNA-S1、mRNA-S2、mRNA-S3、mRNA-S4、mRNA-S5和mRNA-S6。如图1所示：新冠Omicron突变株mRNA疫苗mRNA-1058a（图1中SEQ No.1）、mRNA-1058b（图1中SEQ No.2）、mRNA-1058c（图1中SEQ No.3）、mRNA-1058d（图1中SEQ No.4）、mRNA-S1（图1中SEQ No.5）、mRNA-S2（图1中SEQ No.6）、mRNA-S3（图1中SEQ No.7）、mRNA-S4（图1中SEQNo.8）、mRNA-S5（图1中SEQ No.9）和mRNA- S6（图1中SEQ No.10）的序列如序列SEQ ID No.1至SEQ ID No.10所示。
mRNA-1058a序列（SEQ ID No.1）：自5’端第1至52为5’-UTR，第50至52位为kozak序列，本领域技术人员可通过常规技术手段选择和替换与本发明不同kozak序列，例如kozak序列可替换为GCC、ACC、GCCACC或GCCANN，第53至805为CDS-a（编码新冠Omicron突变株S蛋白的信号肽的1-14位氨基酸、NTD的306-318位氨基酸和RBD的319-541位氨基酸），第806至931为3’-UTR，第932至1051为Poly A尾。
mRNA-1058b序列（SEQ ID No.2）：自5’端第1至52为5’-UTR，第50至52位为kozak序列，本领域技术人员可通过常规技术手段选择和替换与本发明不同kozak序列，例如kozak序列可替换为GCC、ACC、GCCACC或GCCANN，第53至805为CDS-b（编码新冠Omicron突变株S蛋白的信号肽的1-14位氨基酸、NTD的306-318位氨基酸和RBD的319-541位氨基酸），第806至931为3’-UTR，第932至1051为Poly A尾。
mRNA-1058c序列（SEQ ID No.3）：自5’端第1至52为5’-UTR，第50至52位为kozak序列，本领域技术人员可通过常规技术手段选择和替换与本发明不同kozak序列，例如kozak序列可替换为GCC、ACC、GCCACC或GCCANN，第53至805为CDS-c（编码新冠Omicron突变株S蛋白的信号肽的1-14位氨基酸、NTD的306-318位氨基酸和RBD的319-541位氨基酸），第806至931为3’-UTR，第932至1051为Poly A尾。
mRNA-1058d序列（SEQ ID No.4）：自5’端第1至52为5’-UTR，第50至52位为kozak序列，本领域技术人员可通过常规技术手段选择和替换与本发明不同kozak序列，例如kozak序列可替换为GCC、ACC、GCCACC或GCCANN，第53至805为CDS-d（编码新冠Omicron突变株S蛋白的信号肽的1-14位氨基酸、NTD的306-318位氨基酸和RBD的319-541位氨基酸），第806至931为3’-UTR，第932至1051为Poly A尾。
mRNA-S1（SEQ ID No. 5）：自5’端第1至52为5’-UTR，第50至52位为kozak序列，本领域技术人员可通过常规技术手段选择和替换与本发明不同kozak序列，例如kozak序列可替换为GCC、ACC、GCCACC或GCCANN，第53至3865为CDS-1（编码新冠Omicron突变株S蛋白，K983P，V984P），第3866至3991为3’-UTR，第3992至4111为Poly A尾。
mRNA-S2（SEQ ID No. 6）：自5’端第1至52为5’-UTR，第50至52位为kozak序列，本领域技术人员可通过常规技术手段选择和替换与本发明不同kozak序列，例如kozak序列可替换为GCC、ACC、GCCACC或GCCANN，第53至3868为CDS-2（编码新冠Omicron突变株S蛋白，ins2V，K984P，V985P），第3869至3994为3’-UTR，第3995至4114为Poly A尾。
mRNA-S3（SEQ ID No. 7）：自5’端第1至52为5’-UTR，第50至52位为kozak序列，本领域技术人员可通过常规技术手段选择和替换与本发明不同kozak序列，例如kozak序列可替换为GCC、ACC、GCCACC或GCCANN，第53至3865为CDS-3（编码新冠Omicron突变株S蛋白，R679G，R680S，R682G，K983P，V984P），第3866至3991为3’-UTR，第3992至4111为Poly A尾。
mRNA-S4（SEQ ID No. 8）：自5’端第1至52为5’-UTR，第50至52位为kozak序列，本领域技术人员可通过常规技术手段选择和替换与本发明不同kozak序列，例如kozak序列可替换为GCC、ACC、GCCACC或GCCANN，第53至3868为CDS-4（编码新冠Omicron突变株S蛋白，ins2V，R680G，R681S，R683G，K984P，V985P），第3869至3994为3’-UTR，第3995至4114为PolyA尾。
mRNA-S5（SEQ ID No. 9）：自5’端第1至52为5’-UTR，第50至52位为kozak序列，本领域技术人员可通过常规技术手段选择和替换与本发明不同kozak序列，例如kozak序列可替换为GCC、ACC、GCCACC或GCCANN，第53至3868为CDS-5（编码新冠Omicron突变株S蛋白，ins2V，R680G，R681S，R683G，F815P，A890P，A897P，A940P，K984P，V985P），第3869至3994为3’-UTR，第3995至4114为Poly A尾。
mRNA-S6（SEQ ID No. 10）：自5’端第1至52为5’-UTR，第50至52位为kozak序列，本领域技术人员可通过常规技术手段选择和替换与本发明不同kozak序列，例如kozak序列可替换为GCC、ACC、GCCACC或GCCANN，第53至3868为CDS-6（编码新冠Omicron突变株S蛋白，ins2V，R680G，R681S，R683G，K812A，R813G，F815P，A890P，A897P，A940P，K984P，V985P），第3869至3994为3’-UTR，第3995至4114为Poly A尾。
二、新冠Omicron突变株mRNA疫苗的体外合成。
1. 将设计的新冠Omicron突变株mRNA疫苗序列进行DNA模板（mRNA-1058a的编码DNA、mRNA-1058b的编码DNA、mRNA-1058c的编码DNA、mRNA-1058d的编码DNA、mRNA-S1的编码DNA、mRNA-S2的编码DNA、mRNA-S3的编码DNA、mRNA-S4的编码DNA、mRNA-S5的编码DNA和mRNA-S6的编码DNA）合成，并通过测序验证。
其中，mRNA-1058a的编码DNA的编码链的核苷酸序列是将SEQ ID No.11所示的DNA序列；mRNA-1058b的编码DNA的编码链的核苷酸序列是SEQ ID No.12所示的DNA序列；mRNA-1058c的编码DNA的编码链的核苷酸序列是SEQ ID No.13所示的DNA序列；mRNA-1058d的编码DNA的编码链的核苷酸序列是SEQ ID No.14所示的DNA序列；mRNA-S1的编码DNA的编码链的核苷酸序列是SEQ ID No.15所示的DNA序列；mRNA-S2的编码DNA的编码链的核苷酸序列是SEQ ID No.16所示的DNA序列；mRNA-S3的编码DNA的编码链的核苷酸序列是SEQ IDNo.17所示的DNA序列；mRNA-S4的编码DNA的编码链的核苷酸序列是SEQ ID No.18所示的DNA序列；mRNA-S5的编码DNA的编码链的核苷酸序列是SEQ ID No.19所示的DNA序列和mRNA-S6的编码DNA的编码链的核苷酸序列是SEQ ID No.20所示的DNA序列。
2. 将步骤1合成的DNA模板进行扩增：将DNA模板连接到载体pVAX1（Invitrogen，V260-20）的T7启动子序列--XbaI位点之间，得到重组质粒。具体为：用序列表中序列11的所示的DNA替换载体pVAX1的T7启动子序列与XbaI识别位点之间的片段（小片段），并保持载体其他核苷酸序列不变的重组载体pVAX1-1058a；用序列表中序列12的所示的DNA替换载体pVAX1的T7启动子序列与XbaI位点之间的片段（小片段），并保持载体其他核苷酸序列不变的重组载体pVAX1-1058b；用序列表中序列13的所示的DNA替换载体pVAX1的T7启动子序列与XbaI位点之间的片段（小片段），并保持载体其他核苷酸序列不变的重组载体pVAX1-1058c；用序列表中序列14的所示的DNA替换载体pVAX1的T7启动子序列与XbaI位点之间的片段（小片段），并保持载体其他核苷酸序列不变的重组载体pVAX1-1058d；用序列表中序列15的所示的DNA替换载体pVAX1的T7启动子序列与XbaI位点之间的片段（小片段），并保持载体其他核苷酸序列不变的重组载体pVAX1-S1；序列表中序列16的所示的DNA替换载体pVAX1的T7启动子序列与XbaI位点之间的片段（小片段），并保持载体其他核苷酸序列不变的重组载体pVAX1-S2；用序列表中序列17的所示的DNA替换载体pVAX1的T7启动子序列与XbaI位点之间的片段（小片段），并保持载体其他核苷酸序列不变的重组载体pVAX1-S3；用序列表中序列18的所示的DNA替换载体pVAX1的T7启动子序列与XbaI位点之间的片段（小片段），并保持载体其他核苷酸序列不变的重组载体pVAX1-S4；用序列表中序列19的所示的DNA替换载体pVAX1的T7启动子序列与XbaI位点之间的片段（小片段），并保持载体其他核苷酸序列不变的重组载体pVAX1-S5；用序列表中序列20的所示的DNA替换载体pVAX1的T7启动子序列与XbaI位点之间的片段（小片段），并保持载体其他核苷酸序列不变的重组载体pVAX1-S6。
将上述重组载体转化感受态细胞DH5α，通过对宿主大肠杆菌的培养，得到大量扩增菌体。借助无内毒素质粒大提试剂盒（天根生物科技（北京）有限公司，DP117）提取扩增菌体中扩增的重组质粒。
将扩增的重组质粒进行线性化：利用BsaI对提取的重组质粒进行酶切线性化，经纯化得到可用于mRNA体外合成的模板，并采用Qubit™ dsDNA BR Assay Kit(Invitrogen，Q32850)试剂盒进行定量。
3. 以步骤2扩增的DNA为mRNA的体外合成模板，配制如图21中所示的反应体系（图21为mRNA的体外转录反应体系），采用T7-FlashScribeTM Transcription试剂盒（Cellscript，C-ASF3507），37℃孵育1 h进行体外转录，得到大量体外转录RNA，并采用Qubit™ dsDNA BR Assay Kit (Invitrogen，Q32850)试剂盒进行定量。
4、将步骤3体外转录RNA产物进行纯化：向转录反应体系中加入1 μL RNase-FreeDNase I，37℃孵育15 min，以去除体外转录产物体系中的DNA模板，得到转录产物。再对得到的转录产物进行纯化，纯化方法如下：
（1）向转录产物中加入RNase-Free H2O补足体积200 μL；
（2）加入200 μL混合液A（水饱和酚：氯仿：异戊醇，v:v:v，25:24:1），涡旋10 s，4℃，13800×g离心5 min，然后将管中上层水相移至新管中；
（3）向新管中加入等体积混合液B（体积比为24:1的氯仿和异戊醇的混合液），涡旋10 s，4℃，13800×g离心5 min，然后将管中上层水相移至新管中；
（4）向新管中加入等体积5 M乙酸铵溶液，涡旋混匀后冰上放置15 min后，4℃、13800×g离心15 min，弃上清；
（5）加入70%冰乙醇对RNA进行清理后，弃去70%乙醇；加适量RNase-Free水（Solarbio，R1600）重悬，并采用Qubit™ RNA BR Assay Kit (Invitrogen，Q10211)试剂盒进行定量。
5. 对步骤4得到的RNA转录纯化产物进行mRNA加帽反应，具体步骤如下：
（1）RNA变性：取60 µg转录纯化产物，65℃孵育15 min进行变性处理，然后移至冰上；
（2）mRNA加帽反应：加入RNA变性产物后，按照图22中所示配制反应体系，配制采用ScriptCap™ Cap 1 Capping System 试剂盒(Cellscript，C-SCCS1710)，37 ℃孵育0.5h，得到mRNA具有Cap 1型结构的加帽产物。
6. mRNA加帽产物纯化：同步骤4。
7. mRNA的质量分析：采用安捷伦2100生物分析仪和RNA Nano 6000 Assay Kit(Aglient，5067-1511)对合成mRNA进行质量分析，具体步骤如下：
（1）mRNA变性：将mRNA和mRNA Ladder，70℃变性2 min，然后立即冰浴；
（2）准备凝胶：按说明将RNA gel matrix加入过滤管中，1500×g室温离心10 min，4℃保存备用；
（3）准备凝胶-染料混合物：RNA染料避光平衡30 min，然后涡旋数秒，瞬时离心后以65:1比例配制凝胶染料混合物，将混合物涡旋混匀，13000×g室温离心10 min；
（4）加载凝胶-染料混合物：使用RNA nano芯片之前，调节芯片制备器夹子到最上方的位置。将RNA芯片放入芯片槽，在注明黑色G的孔中加入9 μL凝胶-染料混合物（不要有气泡）；注射器活塞在1 mL位置处时关闭注胶器，按压注射器，用夹子固定30 s后再松开，5s后将活塞拉回1 mL处的位置；打开注胶器，在其它注明白色G的孔中加入9 μL凝胶-染料混合物；
（5）加载Marker：在所有样品孔与ladder孔中各加入6 μL RNA Marker；
（6）加载Ladder与mRNA：在标有梯子图样的孔中加入1 μL ladder，将mRNA加入到剩余12个孔中（没有用到的孔可用RNase-free water代替），将芯片放到芯片涡旋振荡器上，2400 r/min振荡1 min，然后5 min内将芯片放到Agilent 2100仪中进行检测。
结果如图2至图11所示：体外合成的新冠Omicron突变株mRNA-1058a、mRNA-1058b、mRNA-1058c和mRNA-1058d条带与目标条带一致，浓度分别为2340 ng/μL、2700 ng/μL、2550ng/μL和2030 ng/μL；体外合成的新冠Omicron突变株mRNA-S1、mRNA-S2、mRNA-S3、mRNA-S4、mRNA-S5和mRNA-S6条带与目标条带一致，浓度分别为2680 ng/μL、1240 ng/μL、3340 ng/μL、3180 ng/μL、2520 ng/μL和2980 ng/μL。
按照上述方法，将步骤3中的100mM的UTP替换为100mM的N-1-甲基-假尿苷，其他步骤与制备mRNA-S4相同，得到N-1-甲基-假尿苷修饰的mRNA-S4（简称：modmRNA-S4）。
三、mRNA的细胞转染蛋白表达检测。
1. 接种细胞：将293T细胞（ATCC）分别接种于12孔板中，每孔3×105个细胞，37℃，5%CO2培养箱中至细胞达到80-90%融合度即可进行转染。
2. 配制转染复合物：采用TransIT®-mRNA Transfection kit (Mirus，MIR2250)：100 μL Opti-MEM+1 μg mRNA+2μL mRNA boost reagent+2μL TransIT-mRNAreagent，混匀、室温静置2-5 min形成转染复合物。
3. 转染细胞：将转染复合物滴加到细胞并上下左右晃动使转染复合物均匀分布，37℃，5% CO2孵育18h后收取细胞，转染前后无需更换细胞培养液。
4. 提取细胞总蛋白：细胞用PBS清洗两次后，利用细胞裂解液RIPA（金普莱，P06M11）+蛋白酶抑制剂100×（金普莱，P01C01），涡旋，以充分裂解细胞。冰浴30 min后，4℃，离心13800×g，15 min，取上清液。
5. 细胞总蛋白定量：利用BCA蛋白定量试剂盒（金普莱，P06M16）对细胞裂解上清液中总蛋白进行定量。将细胞裂解上清液与BCA工作液混匀，37℃，孵育45 min，A562 nm下检测吸光度，并计算细胞总蛋白浓度。
6. Western blotting（WB）检测目标蛋白表达：利用蛋白电泳预制胶Bolt™ 4 to12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel（Invitrogen, NW04120BOX）电泳（200 V，22min）进行总蛋白（20 μg）分离。将凝胶上的分离蛋白在梯度电压（20 V，1 min；23 V，4 min；25 V，2 min）作用下转移到iBlot 2 Transfer Stacks，PVDF（Invitrogen，IB24001）膜上后，在含5%脱脂奶粉的1×TBST中室温摇育，20 r/min，封闭1 h。
新冠Omicron突变株刺突蛋白S鼠单抗稀释液（1:2000），SARS-CoV-2 SpikeAntibody，Omicron Reactive, Mouse MAb（义翘神州，40592-MM117），20 r/min，室温摇育2h。用1×TBST清洗膜，60 r/min，室温摇育10 min，并重复3次，以彻底去除一抗残余。二抗采用辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗鼠IgG二抗稀释液（1:10000），Goat Anti-Mouse IgGSecondary Antibody (HRP)（义翘神州，SSA007），20 r/min，室温摇育1 h。用1×TBST清洗膜，60 r/min，室温摇育10 min，并重复3次，以彻底去除二抗残余。
利用ECL化学发光超敏显色试剂盒（翊圣生物，36208ES60）与膜室温避光孵育3min，在化学发光仪中检测HRP标记的抗体结合抗原。通过曝光显现条带与蛋白marker，PageRuler™ Prestained Protein Ladder（Invitrogen，26617）条带比对，验证目标抗原蛋白的表达。利用膜再生液（索莱宝，SW3020）去除膜上抗体，再次对膜进行封闭后，孵育内参抗体，以检测蛋白上样量的一致性。一抗采用β-actin兔单抗稀释液（1:50000），ACTBRabbit mAb（Abclonal, AC038），二抗采用辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG二抗稀释液（1:10000），Goat Anti-Rabbit IgG Secondary Antibody (HRP)（义翘神州，SSA004）。
结果如图12所示：体外合成的新冠Omicron突变株mRNA-1058a、mRNA-1058b、mRNA-1058c和mRNA-1058d转染HEK293T细胞后，WB均检测到高效表达的新冠Omicron突变株刺突蛋白受体结合域（RBD）蛋白目的抗原（图12中1所示）。体外合成的新冠Omicron突变株mRNA-S1、mRNA-S2、mRNA-S3、mRNA-S4、mRNA-S5和mRNA-S6转染HEK293T细胞后，WB均检测到高效表达的新冠Omicron突变株S蛋白目的抗原（图12中3所示）。通过灰度值分析，mRNA-1058d的RBD蛋白目的抗原表达最高（图12中2所示），mRNA-S4的S蛋白目的抗原表达量最高（图12中4所示）。
四、新冠Omicron突变株mRNA疫苗的细胞转染蛋白表达检测。
1. 接种细胞：将293T细胞细胞（ATCC）分别接种于12孔板中，每孔3×105个细胞，37℃，5% CO2培养箱中至细胞达到80-90 %融合度即可进行转染。
2. 新冠Omicron突变株mRNA疫苗的制备。
（1）LPX-mRNA-1058d脂质多聚物疫苗制备。
采用两步法制备LPX-mRNA-1058d脂质多聚物疫苗。
将鱼精蛋白的25mM醋酸钠缓冲液（pH 5.2）溶液与mRNA-1058d的10 mM柠檬酸缓冲液（pH 4.0）溶液按体积比1:5 (鱼精蛋白：mRNA)以12 mL/min的流速在迈安纳纳米药物制备系统进行混合制备出鱼精蛋白-mRNA-1058d复合物。
可离子化阳离子脂材（SM10，赛诺邦格2089251-47-6）、1,2-二油酯-sn-甘油-3-磷酸乙醇铵（DOPE）和DMG-PEG2000均在乙醇中完全溶解，按SM10、DOPE和DMG-PEG2000的质量比49:49:2混合得到脂材，将脂材与鱼精蛋白-mRNA-1058d复合物按体积比1:3的比例以12mL/min的流速在迈安纳纳米药物制备系统进行混合制备。收集到的样液在DPBS缓冲液中10倍体积稀释后通过100 kDa PES超滤管，4℃，2000×g离心超滤浓缩，去除样液中的乙醇。最后将通过0.22 μm滤膜的疫苗制剂以DPBS缓冲液调整到适用浓度，得到LPX-mRNA-1058d脂质多聚物疫苗，继续下述实验。
（2）YK009 LNP- mRNA-1058d脂质纳米颗粒疫苗制备。
可阳离子化脂材（YK009）的制备，按照专利202210034449.4 一种阳离子脂质化合物、包含其的组合物及用途中的方法制备合成癸氧基)-4-氧代丁基)(2-羟乙基)氨基)己酸2-辛基癸酯（YK-009），具体为：将4-((2-羟乙基)氨基)丁酸正癸酯和6-溴代己酸2-辛基癸酯溶于乙腈中，向上述体系加入碳酸钾和碘化钾加热至70℃搅拌反应20小时。反应液冷却至室温后过滤，滤液经真空减压浓缩除去溶剂。将残余物通过硅胶色谱法纯化，得所述目标化合物2-辛基癸基-6-((4-(癸氧基)-4-氧丁基)(2-羟乙基)氨基)己酸酯，其结构式如图20所示。
可阳离子化脂材（YK009）、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、胆固醇、DMG-PEG2000乙醇中完全溶解。所述新型可离子化阳离子脂材化合物2-辛基癸基6-((4-(癸氧基)-4-氧代基丁基)(2-羟基乙基)氨基)己酸酯（YK009），CH40H79NO5（结构式如下(I)所示），通过将4-((2-羟乙基)氨基)丁酸正癸酯和6-溴代己酸2-辛基癸酯溶于乙腈，加入碳酸钾和碘化钾加热至70℃搅拌反应20 h，冷却至室温后过滤，滤液经真空减压浓缩除去溶剂，残余物经硅胶色谱法纯化，得所述可离子化阳离子脂材化合物（具体方法参见CN202210034449.4 ）。上述脂材乙醇溶液按摩尔比50:10:38.5:1.5混合，与mRNA-1058d的20 mM柠檬酸钠缓冲液（pH 4.0）按体积比1:3(脂材:mRNA)以12 mL/min的流速在迈安纳纳米药物制备系统进行混合制备。收集到的样液在DPBS缓冲液中10倍体积稀释后通过50 kDaPES超滤管，4℃，2000×g离心超滤浓缩，去除样液中的乙醇含量。最后将通过0.22 μm滤膜的疫苗制剂以DPBS缓冲液调整到适用浓度继续实验。
（3）YK009 LNP- mRNA-S4脂质纳米颗粒疫苗制备。
将阳离子化脂材（YK009）、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、胆固醇、DMG-PEG2000乙醇中完全溶解。上述脂材乙醇溶液按摩尔比50:10:38.5:1.5混合，与mRNA-S4的20 mM柠檬酸钠缓冲液（pH 4.0）按体积比1:3(脂材:mRNA)以12 mL/min的流速在迈安纳纳米药物制备系统进行混合制备。收集到的样液在DPBS缓冲液中10倍体积稀释后通过50kDa PES超滤管，4℃，2000×g离心超滤浓缩，去除样液中的乙醇含量。最后将通过0.22 μm滤膜的疫苗制剂以DPBS缓冲液调整到适用浓度继续实验。
（4）LNP-mRNA-1058d脂质纳米颗粒疫苗制备。
可离子化阳离子脂材（SM102，赛诺邦格2089251-47-6）、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、胆固醇、DMG-PEG2000乙醇中完全溶解。上述脂材乙醇溶液按摩尔比50:10:38.5:1.5混合，与mRNA-1058d的20 mM柠檬酸钠缓冲液（pH 4.0）按体积比1:3(脂材:mRNA)以12 mL/min的流速在迈安纳纳米药物制备系统进行混合制备。收集到的样液在DPBS缓冲液中10倍体积稀释后通过50 kDa PES超滤管，4℃，2000×g离心超滤浓缩，去除样液中的乙醇含量。最后将通过0.22 μm滤膜的疫苗制剂以DPBS缓冲液调整到适用浓度，得到LNP-mRNA-1058d脂质纳米颗粒疫苗，以备后续实验使用。
（5）LNP-mRNA-S4脂质纳米颗粒疫苗制备。
可离子化阳离子脂材（SM102）、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、胆固醇、DMG-PEG2000乙醇中完全溶解。脂材乙醇溶液按摩尔比50:10:38.5:1.5混合，与mRNA-S4的20 mM柠檬酸钠缓冲液（pH 4.0）按体积比1:3(脂材:mRNA)以12 mL/min的流速在迈安纳纳米药物制备系统进行混合制备。收集到的样液在DPBS缓冲液中10倍体积稀释后通过50kDa PES超滤管，4℃，2000×g离心超滤浓缩，去除样液中的乙醇含量。最后将通过0.22 μm滤膜的疫苗制剂以DPBS缓冲液调整到适用浓度继续实验。
（6）YK009 LNP-modmRNA-S4脂质纳米颗粒疫苗制备。
将阳离子化脂材（YK009）、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、胆固醇、DMG-PEG2000乙醇中完全溶解。上述脂材乙醇溶液按摩尔比50:10:38.5:1.5混合，与modmRNA-S4的20 mM柠檬酸钠缓冲液（pH 4.0）按体积比1:3(脂材:mRNA)以12 mL/min的流速在迈安纳纳米药物制备系统进行混合制备。收集到的样液在DPBS缓冲液中10倍体积稀释后通过50 kDa PES超滤管，4℃，2000×g离心超滤浓缩，去除样液中的乙醇含量。最后将通过0.22 μm滤膜的疫苗制剂以DPBS缓冲液调整到适用浓度继续实验。
3. 新冠Omicron突变株mRNA疫苗制剂的粒径检测
新冠Omicron突变株mRNA疫苗制剂用无RNA酶去离子水稀释100倍，取1 mL疫苗稀释液于比色皿在Anton Paar粒度仪Litesizer 500中检测，结果由Anton Paar Kalliope软件进行分析。
结果如图13至图17所示显示：新冠Omicron突变株mRNA疫苗制剂LPX-mRNA-1058d的粒径为（140.3 ± 2.5）nm，PDI为（14.9 ± 2.6）%（图13所示）；LNP-mRNA-1058d的粒径为（76.9 ± 3.5）nm，PDI为（9.8 ± 1.4）%（图15所示）；YK009 LNP-mRNA- 1058d的粒径为（89.5 ± 1.0）nm，PDI为（22.2 ± 0.8）%（图17所示）；YK009 LNP-mRNA-S4的粒径为（86.54± 1.71）nm，PDI为（16.4 ± 3.5）%（图14所示）；LNP-mRNA- S4的粒径为（85.52 ± 1.59）nm，PDI为（19.7 ± 1.3）%（图16所示）。
4. 新冠Omicron突变株mRNA疫苗制剂的细胞转染蛋白表达检测
（1）转染细胞：将新冠Omicron突变株mRNA疫苗制剂滴加到细胞并上下左右晃动使转染复合物均匀分布，37℃，5% CO2孵育18h后收取细胞，转染前后无需更换细胞培养液。
（2）提取细胞总蛋白：细胞用PBS清洗两次后，利用细胞裂解液RIPA（金普莱，P06M11）+蛋白酶抑制剂100×（金普莱，P01C01），涡旋，以充分裂解细胞。冰浴30 min 后，4℃，离心13800×g，15 min，取上清液。
（3）细胞总蛋白定量：利用BCA蛋白定量试剂盒（金普莱，P06M16）对细胞裂解上清液中总蛋白进行定量。将细胞裂解上清液与BCA工作液混匀，37℃，孵育45 min，A562 nm 下检测吸光度，并计算细胞总蛋白浓度。
（4）Western blotting（WB）检测目标蛋白表达：利用蛋白电泳预制胶Bolt™ 4 to12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel（Invitrogen, NW04120BOX）电泳（200 V，22min）进行总蛋白（20 μg）分离。将凝胶上的分离蛋白在梯度电压（20 V，1 min；23 V，4 min；25 V，2 min）作用下转移到iBlot 2 Transfer Stacks，PVDF（Invitrogen， IB24001）膜上后，在含5 %脱脂奶粉的1×TBST中室温摇育，20 r/min, 封闭1 h。新冠Omicron突变株刺突蛋白S鼠单抗稀释液（1:2000），SARS-CoV-2 Spike Antibody, Omicron Reactive, MouseMAb（义翘神州，40592-MM117），20 r/min，室温摇育2 h。用1×TBST清洗膜，60 r/min，室温摇育10 min，并重复3次，以彻底去除一抗残余。二抗采用辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗鼠IgG二抗稀释液（1:10000），Goat Anti-Mouse IgG Secondary Antibody (HRP)（义翘神州，SSA007），20 r/min，室温摇育1 h。用1×TBST清洗膜，60 r/min，室温摇育10 min，并重复3次，以彻底去除二抗残余。利用ECL化学发光超敏显色试剂盒（翊圣生物，36208ES60）与膜室温避光孵育3 min，在化学发光仪中检测HRP标记的抗体结合抗原。通过曝光显现条带与蛋白marker，PageRuler™ Prestained Protein Ladder（Invitrogen，26617）条带比对，验证目标抗原蛋白的表达。利用膜再生液（索莱宝，SW3020）去除膜上抗体，再次对膜进行封闭后，孵育内参抗体，以检测蛋白上样量的一致性。一抗采用β-actin兔单抗稀释液（1:50000），ACTB Rabbit mAb（Abclonal, AC038），二抗采用辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG二抗稀释液（1:10000），Goat Anti-Rabbit IgG Secondary Antibody (HRP)（义翘神州，SSA004）。
结果如图18显示：新冠Omicron突变株mRNA疫苗制剂LPX-mRNA-1058d、LNP-mRNA-1058d和YK009 LNP-mRNA-1058d转染HEK293T细胞后，WB均检测到高效表达的新冠Omicron突变株刺突蛋白受体结合域（RBD）蛋白目的抗原（图18中1所示）；新冠Omicron突变株mRNA疫苗制剂YK009 LNP-mRNA-S4和LNP-mRNA-S4转染HEK293T细胞后，WB均检测到高效表达的新冠Omicron突变株S蛋白目的抗原（图18中3所示）。通过灰度值分析，YK009 LNP-mRNA-1058d的RBD蛋白目的抗原表达较高（图18中2所示）；YK009 LNP-mRNA-S4的S蛋白目的抗原表达量较高（图18中4所示）。
实施例2、新冠Omicron突变株mRNA疫苗免疫小鼠后的血清抗体检测
一、新冠Omicron突变株mRNA-1058d疫苗的小鼠肌肉免疫
将实验动物BALB/c小鼠（雌，6-8周，16-18 g，北京维通利华）随机分为新冠Omicron突变株LNP-mRNA-1058d疫苗免疫剂组，新冠Omicron突变株YK009 LNP-mRNA-1058d疫苗免疫剂组和阴性对照组（每组5只，正常喂养），以肌肉注射方式免疫小鼠。免疫一次，于免疫后的第10天采用眼眶取血获得足够量的小鼠血清。
其中，对照组的每只小鼠以肌肉注射0.2 mL的pH为7.4的DPBS。
新冠Omicron突变株LNP-mRNA-1058d疫苗免疫剂组的每只小鼠以肌肉注射0.2 mL的新冠Omicron突变株LNP-mRNA-1058d疫苗溶液（溶质为实施例1中步骤四制备的LNP-mRNA-1058d脂质纳米颗粒疫苗，溶剂为pH为7.4的DPBS），给药剂量以mRNA-1058d计为10 µg/只。
新冠Omicron突变株YK009 LNP-mRNA-1058d疫苗免疫剂组的每只小鼠以肌肉注射0.2 mL 的新冠Omicron突变株YK009 LNP-mRNA-1058d疫苗溶液（溶质为实施例1中步骤四制备的YK009 LNP-mRNA-1058脂质纳米颗粒疫苗，溶剂为pH为7.4的DPBS），给药剂量以mRNA-1058d计为10 µg/只。
二、新冠Omicron突变株mRNA-S4疫苗的小鼠肌肉免疫
将实验动物BALB/c小鼠（雌，6-8周，16-18 g，北京维通利华）随机分为新冠Omicron突变株YK009 LNP-modmRNA-S4疫苗免疫剂组（mRNA=25 µg/只）、新冠Omicron突变株YK009 LNP-mRNA-S4疫苗免疫剂组（mRNA=25 µg/只）和阴性对照组（DPBS, pH=7.4）（每组5只，正常喂养），以肌肉注射方式免疫小鼠， 0和7天各免疫一次，于初次免疫后的第10天采用眼眶取血获得足够量的小鼠血清。
其中，对照组的每只小鼠以肌肉注射0.2 mL 的pH为7.4的DPBS。
新冠Omicron突变株LNP-mRNA-1058d疫苗免疫剂组的每只小鼠以肌肉注射0.2 mL的新冠Omicron突变株YK009 LNP-modmRNA-S4疫苗溶液（溶质为实施例1中步骤四制备的YK009 LNP-modmRNA-S4脂质纳米颗粒疫苗，溶剂为pH为7.4的DPBS），给药剂量以mRNA-S4计为25µg/只。
新冠Omicron突变株YK009 LNP-mRNA-S4d疫苗免疫剂组的每只小鼠以肌肉注射0.2 mL 的新冠Omicron突变株YK009 LNP-mRNA-S4疫苗溶液（溶质为实施例1中步骤四制备的YK009 LNP-mRNA-S4脂质纳米颗粒疫苗，溶剂为pH为7.4的DPBS），给药剂量以mRNA-1058d计为25 µg/只。
三、新冠Omicron突变株mRNA疫苗的免疫小鼠血清假病毒中和抗体检测
通过新冠Omicron突变株假病毒评价小鼠免疫血清对新冠Omicron突变株假病毒的中和作用以及测定中和抗体效价NT50，从而对新冠Omicron突变株LNP-mRNA-1058d疫苗、YK009 LNP-mRNA-1058d疫苗、YK009 LNP-modmRNA-S4（N-1-甲基-假尿苷修饰的mRNA-S4）疫苗、YK009 LNP-mRNA-S4疫苗的体内免疫效力进行评价。
新冠Omicron突变株假病毒中和抗体NT50效价测定。
利用新冠Omicron突变株假病毒（达瑞 DR-XG-C010），对新冠Omicron突变株mRNA疫苗免疫小鼠血清的抗体中和作用进行评价。评价方法学参照文献“基于假病毒的新型冠状病毒临床血清及相应生物制品中和活性抗体定量检测方法”，DOI: 10.1038/s41596-020-0394-5。具体检测方法如下：用DMEM完全培养基对小鼠免疫血清从1/30进行连续3倍稀释，得到6个不同稀释度血清，与650×TCID50假病毒37℃孵育。同时设有无假病毒的细胞对照组和无血清样品的假病毒对照组。孵育1h后，各孔加入2×104个Huh 7细胞，37℃，5% CO2下进行细胞培养。因假病毒进入细胞会表达萤火虫荧光素酶，24小时后，与发光底物反应并进行发光检测。通过与假病毒对照组发光值比较，计算假病毒被抑制的百分比。采用Reed-Munench法计算中和抗体滴度，中和抗体滴度被表示为抑制率为50%时对应的血清稀释度的倒数，故用血清半数抑制稀释度来表示半数中和稀释度NT50，即血清抗体对假病毒中和活性的情况。
结果如图19显示：新冠Omicron突变株LNP-mRNA-1058d疫苗和YK009 LNP-mRNA-1058d疫苗免疫的小鼠血清均对新冠Omicron突变株假病毒具有中和作用（图19中1所示）。单次免疫后，平均假病毒中和抗体滴度NT50分别为1:925和1:871。新冠Omicron突变株YK009LNP-modmRNA-S4（N-1-甲基-假尿苷修饰的mRNA-S4）疫苗、新冠Omicron突变株YK009 LNP-mRNA-S4疫苗免疫的小鼠血清均对新冠Omicron突变株假病毒具有中和作用（图19中2所示）。加强免疫后第三天的平均假病毒中和抗体滴度NT50分别为1:8641和1:5079。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> RNA及包含其的新型冠状病毒疫苗和制备方法
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1058
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gggagcacuu guucuuuuug cagaagcuca gaauaaacgc ucaacuuugg ccaugguguu 60
cguguuccug gugcugcugc cccuggugag cagcuucacc guggagaagg gcaucuacca 120
gaccagcaac uuccgcgugc agcccaccga gagcaucgug cgcuucccca acaucaccaa 180
ccugcugccc uucgacgagg uguucaacgc cacccgcuuc gccagcgugu acgccuggaa 240
ccgcaagcgc aucagcaacu gcguggccga cuacagcgug cuauacaacc uagcccccuu 300
cuucaccuuc aagugcuacg gcgugagccc caccaagcua aacgacuugu gcuucaccaa 360
cguguacgcc gacagcuucg ugauccgcgg cgacgaggug cgccagaucg cccccggcca 420
gaccggcaac aucgccgacu acaacuacaa gcuacccgac gacuucaccg gcugcgugau 480
cgccuggaac agcaacaagc uagacagcaa ggugagcggc aacuacaacu accuauaccg 540
ccuauuccgc aagagcaacc uaaagcccuu cgagcgcgac aucagcaccg agaucuacca 600
ggccggcaac aagcccugca acggcguggc cggcuucaac ugcuacuucc cccuaagaag 660
cuacagcuuc agacccaccu acggcguggg ccaccagccc uaccgcgugg uggugcuaag 720
cuucgagcua cuacacgccc ccgccaccgu gugcggcccc aagaagucca ccaaccuagu 780
gaagaacaag ugcgugaacu ucuaaaccag ccucaagaac acccgaaugg agucucuaag 840
cuacauaaua ccaacuuaca cuuuacaaaa uguugucccc caaaauguag ccauucguau 900
cugcuccuaa uaaaaagaaa guuucuucac aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aagagacc 1058
<210> 2
<211> 1058
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gggagcacuu guucuuuuug cagaagcuca gaauaaacgc ucaacuuugg ccaugguguu 60
cguguuccua gugcuacuac cccuagugag cagcuucacc guggagaagg gcaucuacca 120
gaccaguaac uuccgcgugc agcccaccga gaguaucgug cgcuucccca acaucaccaa 180
ccuacuaccc uucgacgagg uguucaacgc cacccgcuuc gccagugugu acgccuggaa 240
ccgcaagcgc aucaguaacu gcguggccga cuacucggug cuauacaacc uagcccccuu 300
cuucaccuuc aagugcuacg gcgugucgcc caccaagcua aacgacuugu gcuucaccaa 360
cguguacgcc gacucguucg ugauccgcgg cgacgaggug cgccagaucg cccccggcca 420
gaccggcaac aucgccgacu acaacuacaa gcuacccgac gacuucaccg gcugcgugau 480
cgccuggaac ucgaacaagc uagacucgaa ggugucgggc aacuacaacu accuauaccg 540
ccuauuccgc aagucgaacc uaaagcccuu cgagcgcgac aucucgaccg agaucuacca 600
ggccggcaac aagcccugca acggcguggc cggcuucaac ugcuacuucc cccuaagauc 660
guacucguuc agacccaccu acggcguggg ccaccagccc uaccgcgugg uggugcuauc 720
guucgagcua cuacacgccc ccgccaccgu gugcggcccc aagaagucga ccaaccuagu 780
gaagaacaag ugcgugaacu ucuaaaccag ccucaagaac acccgaaugg agucucuaag 840
cuacauaaua ccaacuuaca cuuuacaaaa uguugucccc caaaauguag ccauucguau 900
cugcuccuaa uaaaaagaaa guuucuucac aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aagagacc 1058
<210> 3
<211> 1058
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gggagcacuu guucuuuuug cagaagcuca gaauaaacgc ucaacuuugg ccaugguguu 60
cguguuccug gugcugcugc cccuggugag cagcuucacc guggagaagg gcaucuacca 120
gaccagcaac uucagagugc agcccaccga gagcaucgug agauucccca acaucaccaa 180
ccugugcccc uucgacgagg uguucaacgc caccagauuc gccagcgugu acgccuggaa 240
cagaaagaga aucagcaacu gcguggccga cuacagcgug cuguacaacc uggcccccuu 300
cuucaccuuc aagugcuacg gcgugagccc caccaagcug aacgaccugu gcuucaccaa 360
cguguacgcc gacagcuucg ugaucagagg cgacgaggug agacagaucg cccccggcca 420
gaccggcaac aucgccgacu acaacuacaa gcugcccgac gacuucaccg gcugcgugau 480
cgccuggaac agcaacaagc uggacagcaa ggugagcggc aacuacaacu accuguacag 540
acuguucaga aagagcaacc ugaagcccuu cgagcgcgac aucagcaccg agaucuacca 600
ggccggcaac aagcccugca acggcguggc cggcuucaac ugcuacuucc cccugagaag 660
cuacagcuuc agacccaccu acggcguggg ccaccagccc uacagagugg uggugcugag 720
cuucgagcug cugcacgccc ccgccaccgu gugcggcccc aagaagucca ccaaccuggu 780
gaagaacaag ugcgugaacu ucuaaaccag ccucaagaac acccgaaugg agucucuaag 840
cuacauaaua ccaacuuaca cuuuacaaaa uguugucccc caaaauguag ccauucguau 900
cugcuccuaa uaaaaagaaa guuucuucac aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aagagacc 1058
<210> 4
<211> 1058
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gggagcacuu guucuuuuug cagaagcuca gaauaaacgc ucaacuuugg ccaugguguu 60
cguguuccug gugcugcugc cccuggugag cagcuucacc guggagaagg gcaucuacca 120
gaccagcaac uuccgcgugc agcccaccga gagcaucgug cgcuucccca acaucaccaa 180
ccugugcccc uucgacgagg uguucaacgc cacccgcuuc gccagcgugu acgccuggaa 240
ccgcaagcgc aucagcaacu gcguggccga cuacagcgug cuguacaacc uggcccccuu 300
cuucaccuuc aagugcuacg gcgugagccc caccaagcug aacgaccugu gcuucaccaa 360
cguguacgcc gacagcuucg ugauccgcgg cgacgaggug cgccagaucg cccccggcca 420
gaccggcaac aucgccgacu acaacuacaa gcugcccgac gacuucaccg gcugcgugau 480
cgccuggaac agcaacaagc uggacagcaa ggugagcggc aacuacaacu accuguaccg 540
ccuguuccgc aagagcaacc ugaagcccuu cgagcgcgac aucagcaccg agaucuacca 600
ggccggcaac aagcccugca acggcguggc cggcuucaac ugcuacuucc cccugagaag 660
cuacagcuuc agacccaccu acggcguggg ccaccagccc uaccgcgugg uggugcugag 720
cuucgagcug cugcacgccc ccgccaccgu gugcggcccc aagaagucca ccaaccuggu 780
gaagaacaag ugcgugaacu ucuaaaccag ccucaagaac acccgaaugg agucucuaag 840
cuacauaaua ccaacuuaca cuuuacaaaa uguugucccc caaaauguag ccauucguau 900
cugcuccuaa uaaaaagaaa guuucuucac aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aagagacc 1058
<210> 5
<211> 4118
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gggagcacuu guucuuuuug cagaagcuca gaauaaacgc ucaacuuugg ccauguucgu 60
guuccuggug cugcugcccc uggugagcag ccagugcgug aaccugacca ccagaaccca 120
gcugcccccc gccuacacca acagcuucac cagaggcgug uacuaccccg acaagguguu 180
cagaagcagc gugcugcaca gcacccagga ccuguuccug cccuucuuca gcaacgugac 240
cugguuccac gugaucagcg gcaccaacgg caccaagaga uucgacaacc ccgugcugcc 300
cuucaacgac ggcguguacu ucgccagcau cgagaagucc aacaucauca gaggcuggau 360
cuucggcacc acccuggaca gcaagaccca gagccugcug aucgugaaca acgccaccaa 420
cguggugauc aaggugugcg aguuccaguu cugcaacgac cccuuccugg accacaagaa 480
caacaagagc uggauggaga gcgaguucag aguguacagc agcgccaaca acugcaccuu 540
cgaguacgug agccagcccu uccugaugga ccuggagggc aagcagggca acuucaagaa 600
ccugagagag uucguguuca agaacaucga cggcuacuuc aagaucuaca gcaagcacac 660
ccccaucauc gugagagagc ccgaggaccu gccccagggc uucagcgccc uggagccccu 720
gguggaccug cccaucggca ucaacaucac cagauuccag acccugcugg cccugcacag 780
aagcuaccug acccccggcg acagcagcag cggcuggacc gccggcgccg ccgccuacua 840
cgugggcuac cugcagccca gaaccuuccu gcugaaguac aacgagaacg gcaccaucac 900
cgacgccgug gacugcgccc uggacccccu gagcgagaca aagugcaccc ugaaguccuu 960
caccguggag aagggcaucu accagaccag caacuucaga gugcagccca ccgagagcau 1020
cgugagauuc cccaacauca ccaaccugug ccccuucgac gagguguuca acgccaccag 1080
auucgccagc guguacgccu ggaacagaaa gagaaucagc aacugcgugg ccgacuacag 1140
cgugcuguac aaccuggccc ccuucuucac cuucaagugc uacggcguga gccccaccaa 1200
gcugaacgac cugugcuuca ccaacgugua cgccgacagc uucgugauca gaggcgacga 1260
ggugagacag aucgcccccg gccagaccgg caacaucgcc gacuacaacu acaagcugcc 1320
cgacgacuuc accggcugcg ugaucgccug gaacagcaac aagcuggaca gcaaggugag 1380
cggcaacuac aacuaccugu acagacuguu cagaaagagc aaccugaagc ccuucgagag 1440
agacaucagc accgagaucu accaggccgg caacaagccc ugcaacggcg uggccggcuu 1500
caacugcuac uucccccuga gaagcuacag cuucagaccc accuacggcg ugggccacca 1560
gcccuacaga gugguggugc ugagcuucga gcugcugcac gcccccgcca ccgugugcgg 1620
ccccaagaag uccaccaacc uggugaagaa caagugcgug aacuucaacu ucaacggccu 1680
gaagggcacc ggcgugcuga ccgagagcaa caagaaguuc cugcccuucc agcaguucgg 1740
cagagacauc gccgacacca ccgacgccgu gagggacccc cagacccugg agauccugga 1800
caucaccccc ugcagcuucg gcggcgugag cgugaucacc cccggcacca acaccagcaa 1860
ccagguggcc gugcuguacc agggcgugaa cugcaccgag gugcccgugg ccauccacgc 1920
cgaccagcug acccccaccu ggagagugua cagcaccggc agcaacgugu uccagaccag 1980
agccggcugc cugaucggcg ccgaguacgu gaacaacagc uacgagugcg acauccccau 2040
cggcgccggc aucugcgcca gcuaccagac ccagaccaag agccacagaa gggccaggag 2100
cguggccagc cagagcauca ucgccuacac caugagccug ggcgccgaga acagcguggc 2160
cuacagcaac aacagcaucg ccauccccac caacuucacc aucagcguga ccaccgagau 2220
ccugcccgug agcaugacca agaccagcgu ggacugcacc auguacaucu gcggcgacag 2280
caccgagugc agcaaccugc ugcugcagua cggcagcuuc ugcacccagc ugaagagagc 2340
ccugaccggc aucgccgugg agcaggacaa gaacacccag gagguguucg cccaggugaa 2400
gcagaucuac aagacccccc ccaucaagua cuucggcggc uucaacuuca gccagauccu 2460
gcccgacccc agcaagccca gcaagaggag cuucaucgag gaccugcugu ucaacaaggu 2520
gacccuggcc gacgccggcu ucaucaagca guacggcgac ugccugggcg acaucgccgc 2580
cagggaccug aucugcgccc agaaguucaa gggccugacc gugcugcccc cccugcugac 2640
cgacgagaug aucgcccagu acaccagcgc ccugcuggcc ggcaccauca ccagcggcug 2700
gaccuucggc gccggcgccg cccugcagau ccccuucgcc augcagaugg ccuacagauu 2760
caacggcauc ggcgugaccc agaacgugcu guacgagaac cagaagcuga ucgccaacca 2820
guucaacagc gccaucggca agauccagga cagccugagc agcaccgcca gcgcccuggg 2880
caagcugcag gacgugguga accacaacgc ccaggcccug aacacccugg ugaagcagcu 2940
gagcagcaag uucggcgcca ucagcagcgu gcugaacgac aucuucagca gacuggaccc 3000
ccccgaggcc gaggugcaga ucgacagacu gaucaccggc agacugcaga gccugcagac 3060
cuacgugacc cagcagcuga ucagagccgc cgagaucaga gccagcgcca accuggccgc 3120
caccaagaug agcgagugcg ugcugggcca gagcaagaga guggacuucu gcggcaaggg 3180
cuaccaccug augagcuucc cccagagcgc cccccacggc gugguguucc ugcacgugac 3240
cuacgugccc gcccaggaga agaacuucac caccgccccc gccaucugcc acgacggcaa 3300
ggcccacuuc cccagagagg gcguguucgu gagcaacggc acccacuggu ucgugaccca 3360
gagaaacuuc uacgagcccc agaucaucac caccgacaac accuucguga gcggcaacug 3420
cgacguggug aucggcaucg ugaacaacac cguguacgac ccccugcagc ccgagcugga 3480
cagcuucaag gaggagcugg acaaguacuu caagaaccac accagccccg acguggaccu 3540
gggcgacauc agcggcauca acgccagcgu ggugaacauc cagaaggaga ucgacagacu 3600
gaacgaggug gccaagaacc ugaacgagag ccugaucgac cugcaggagc ugggcaagua 3660
cgagcaguac aucaaguggc ccugguacau cuggcugggc uucaucgccg gccugaucgc 3720
caucgugaug gugaccauca ugcugugcug caugaccagc ugcugcagcu gccugaaggg 3780
cugcugcagc ugcggcagcu gcugcaaguu cgacgaggac gacagcgagc ccgugcugaa 3840
gggcgugaag cugcacuaca ccuaaaccag ccucaagaac acccgaaugg agucucuaag 3900
cuacauaaua ccaacuuaca cuuuacaaaa uguugucccc caaaauguag ccauucguau 3960
cugcuccuaa uaaaaagaaa guuucuucac aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4020
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4080
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aagagacc 4118
<210> 6
<211> 4121
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gggagcacuu guucuuuuug cagaagcuca gaauaaacgc ucaacuuugg ccaugguguu 60
cguguuccug gugcugcugc cccuggugag cagccagugc gugaaccuga ccaccagaac 120
ccagcugccc cccgccuaca ccaacagcuu caccagaggc guguacuacc ccgacaaggu 180
guucagaagc agcgugcugc acagcaccca ggaccuguuc cugcccuucu ucagcaacgu 240
gaccugguuc cacgugauca gcggcaccaa cggcaccaag agauucgaca accccgugcu 300
gcccuucaac gacggcgugu acuucgccag caucgagaag uccaacauca ucagaggcug 360
gaucuucggc accacccugg acagcaagac ccagagccug cugaucguga acaacgccac 420
caacguggug aucaaggugu gcgaguucca guucugcaac gaccccuucc uggaccacaa 480
gaacaacaag agcuggaugg agagcgaguu cagaguguac agcagcgcca acaacugcac 540
cuucgaguac gugagccagc ccuuccugau ggaccuggag ggcaagcagg gcaacuucaa 600
gaaccugaga gaguucgugu ucaagaacau cgacggcuac uucaagaucu acagcaagca 660
cacccccauc aucgugagag agcccgagga ccugccccag ggcuucagcg cccuggagcc 720
ccugguggac cugcccaucg gcaucaacau caccagauuc cagacccugc uggcccugca 780
cagaagcuac cugacccccg gcgacagcag cagcggcugg accgccggcg ccgccgccua 840
cuacgugggc uaccugcagc ccagaaccuu ccugcugaag uacaacgaga acggcaccau 900
caccgacgcc guggacugcg cccuggaccc ccugagcgag acaaagugca cccugaaguc 960
cuucaccgug gagaagggca ucuaccagac cagcaacuuc agagugcagc ccaccgagag 1020
caucgugaga uuccccaaca ucaccaaccu gugccccuuc gacgaggugu ucaacgccac 1080
cagauucgcc agcguguacg ccuggaacag aaagagaauc agcaacugcg uggccgacua 1140
cagcgugcug uacaaccugg cccccuucuu caccuucaag ugcuacggcg ugagccccac 1200
caagcugaac gaccugugcu ucaccaacgu guacgccgac agcuucguga ucagaggcga 1260
cgaggugaga cagaucgccc ccggccagac cggcaacauc gccgacuaca acuacaagcu 1320
gcccgacgac uucaccggcu gcgugaucgc cuggaacagc aacaagcugg acagcaaggu 1380
gagcggcaac uacaacuacc uguacagacu guucagaaag agcaaccuga agcccuucga 1440
gagagacauc agcaccgaga ucuaccaggc cggcaacaag cccugcaacg gcguggccgg 1500
cuucaacugc uacuuccccc ugagaagcua cagcuucaga cccaccuacg gcgugggcca 1560
ccagcccuac agaguggugg ugcugagcuu cgagcugcug cacgcccccg ccaccgugug 1620
cggccccaag aaguccacca accuggugaa gaacaagugc gugaacuuca acuucaacgg 1680
ccugaagggc accggcgugc ugaccgagag caacaagaag uuccugcccu uccagcaguu 1740
cggcagagac aucgccgaca ccaccgacgc cgugagggac ccccagaccc uggagauccu 1800
ggacaucacc cccugcagcu ucggcggcgu gagcgugauc acccccggca ccaacaccag 1860
caaccaggug gccgugcugu accagggcgu gaacugcacc gaggugcccg uggccaucca 1920
cgccgaccag cugaccccca ccuggagagu guacagcacc ggcagcaacg uguuccagac 1980
cagagccggc ugccugaucg gcgccgagua cgugaacaac agcuacgagu gcgacauccc 2040
caucggcgcc ggcaucugcg ccagcuacca gacccagacc aagagccaca gaagggccag 2100
gagcguggcc agccagagca ucaucgccua caccaugagc cugggcgccg agaacagcgu 2160
ggccuacagc aacaacagca ucgccauccc caccaacuuc accaucagcg ugaccaccga 2220
gauccugccc gugagcauga ccaagaccag cguggacugc accauguaca ucugcggcga 2280
cagcaccgag ugcagcaacc ugcugcugca guacggcagc uucugcaccc agcugaagag 2340
agcccugacc ggcaucgccg uggagcagga caagaacacc caggaggugu ucgcccaggu 2400
gaagcagauc uacaagaccc cccccaucaa guacuucggc ggcuucaacu ucagccagau 2460
ccugcccgac cccagcaagc ccagcaagag gagcuucauc gaggaccugc uguucaacaa 2520
ggugacccug gccgacgccg gcuucaucaa gcaguacggc gacugccugg gcgacaucgc 2580
cgccagggac cugaucugcg cccagaaguu caagggccug accgugcugc ccccccugcu 2640
gaccgacgag augaucgccc aguacaccag cgcccugcug gccggcacca ucaccagcgg 2700
cuggaccuuc ggcgccggcg ccgcccugca gauccccuuc gccaugcaga uggccuacag 2760
auucaacggc aucggcguga cccagaacgu gcuguacgag aaccagaagc ugaucgccaa 2820
ccaguucaac agcgccaucg gcaagaucca ggacagccug agcagcaccg ccagcgcccu 2880
gggcaagcug caggacgugg ugaaccacaa cgcccaggcc cugaacaccc uggugaagca 2940
gcugagcagc aaguucggcg ccaucagcag cgugcugaac gacaucuuca gcagacugga 3000
cccccccgag gccgaggugc agaucgacag acugaucacc ggcagacugc agagccugca 3060
gaccuacgug acccagcagc ugaucagagc cgccgagauc agagccagcg ccaaccuggc 3120
cgccaccaag augagcgagu gcgugcuggg ccagagcaag agaguggacu ucugcggcaa 3180
gggcuaccac cugaugagcu ucccccagag cgccccccac ggcguggugu uccugcacgu 3240
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgccatcgtg atggtgacca tcatgctgtg ctgcatgacc agctgctgca gctgcctgaa 3780
gggctgctgc agctgcggca gctgctgcaa gttcgacgag gacgacagcg agcccgtgct 3840
gaagggcgtg aagctgcact acacctaaac cagcctcaag aacacccgaa tggagtctct 3900
aagctacata ataccaactt acactttaca aaatgttgtc ccccaaaatg tagccattcg 3960
tatctgctcc taataaaaag aaagtttctt cacaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4020
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4080
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaagagac c 4121
<210> 20
<211> 4121
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gggagcactt gttctttttg cagaagctca gaataaacgc tcaactttgg ccatggtgtt 60
cgtgttcctg gtgctgctgc ccctggtgag cagccagtgc gtgaacctga ccaccagaac 120
ccagctgccc cccgcctaca ccaacagctt caccagaggc gtgtactacc ccgacaaggt 180
gttcagaagc agcgtgctgc acagcaccca ggacctgttc ctgcccttct tcagcaacgt 240
gacctggttc cacgtgatca gcggcaccaa cggcaccaag agattcgaca accccgtgct 300
gcccttcaac gacggcgtgt acttcgccag catcgagaag tccaacatca tcagaggctg 360
gatcttcggc accaccctgg acagcaagac ccagagcctg ctgatcgtga acaacgccac 420
caacgtggtg atcaaggtgt gcgagttcca gttctgcaac gaccccttcc tggaccacaa 480
gaacaacaag agctggatgg agagcgagtt cagagtgtac agcagcgcca acaactgcac 540
cttcgagtac gtgagccagc ccttcctgat ggacctggag ggcaagcagg gcaacttcaa 600
gaacctgaga gagttcgtgt tcaagaacat cgacggctac ttcaagatct acagcaagca 660
cacccccatc atcgtgagag agcccgagga cctgccccag ggcttcagcg ccctggagcc 720
cctggtggac ctgcccatcg gcatcaacat caccagattc cagaccctgc tggccctgca 780
cagaagctac ctgacccccg gcgacagcag cagcggctgg accgccggcg ccgccgccta 840
ctacgtgggc tacctgcagc ccagaacctt cctgctgaag tacaacgaga acggcaccat 900
caccgacgcc gtggactgcg ccctggaccc cctgagcgag acaaagtgca ccctgaagtc 960
cttcaccgtg gagaagggca tctaccagac cagcaacttc agagtgcagc ccaccgagag 1020
catcgtgaga ttccccaaca tcaccaacct gtgccccttc gacgaggtgt tcaacgccac 1080
cagattcgcc agcgtgtacg cctggaacag aaagagaatc agcaactgcg tggccgacta 1140
cagcgtgctg tacaacctgg cccccttctt caccttcaag tgctacggcg tgagccccac 1200
caagctgaac gacctgtgct tcaccaacgt gtacgccgac agcttcgtga tcagaggcga 1260
cgaggtgaga cagatcgccc ccggccagac cggcaacatc gccgactaca actacaagct 1320
gcccgacgac ttcaccggct gcgtgatcgc ctggaacagc aacaagctgg acagcaaggt 1380
gagcggcaac tacaactacc tgtacagact gttcagaaag agcaacctga agcccttcga 1440
gagagacatc agcaccgaga tctaccaggc cggcaacaag ccctgcaacg gcgtggccgg 1500
cttcaactgc tacttccccc tgagaagcta cagcttcaga cccacctacg gcgtgggcca 1560
ccagccctac agagtggtgg tgctgagctt cgagctgctg cacgcccccg ccaccgtgtg 1620
cggccccaag aagtccacca acctggtgaa gaacaagtgc gtgaacttca acttcaacgg 1680
cctgaagggc accggcgtgc tgaccgagag caacaagaag ttcctgccct tccagcagtt 1740
cggcagagac atcgccgaca ccaccgacgc cgtgagggac ccccagaccc tggagatcct 1800
ggacatcacc ccctgcagct tcggcggcgt gagcgtgatc acccccggca ccaacaccag 1860
caaccaggtg gccgtgctgt accagggcgt gaactgcacc gaggtgcccg tggccatcca 1920
cgccgaccag ctgaccccca cctggagagt gtacagcacc ggcagcaacg tgttccagac 1980
cagagccggc tgcctgatcg gcgccgagta cgtgaacaac agctacgagt gcgacatccc 2040
catcggcgcc ggcatctgcg ccagctacca gacccagacc aagagccacg gcagcgccag 2100
cagcgtggcc agccagagca tcatcgccta caccatgagc ctgggcgccg agaacagcgt 2160
ggcctacagc aacaacagca tcgccatccc caccaacttc accatcagcg tgaccaccga 2220
gatcctgccc gtgagcatga ccaagaccag cgtggactgc accatgtaca tctgcggcga 2280
cagcaccgag tgcagcaacc tgctgctgca gtacggcagc ttctgcaccc agctgaagag 2340
agccctgacc ggcatcgccg tggagcagga caagaacacc caggaggtgt tcgcccaggt 2400
gaagcagatc tacaagaccc cccccatcaa gtacttcggc ggcttcaact tcagccagat 2460
cctgcccgac cccagcaagc ccagcgccgg cagccccatc gaggacctgc tgttcaacaa 2520
ggtgaccctg gccgacgccg gcttcatcaa gcagtacggc gactgcctgg gcgacatcgc 2580
cgccagggac ctgatctgcg cccagaagtt caagggcctg accgtgctgc cccccctgct 2640
gaccgacgag atgatcgccc agtacaccag cgccctgctg gccggcacca tcaccagcgg 2700
ctggaccttc ggcgccggcc ccgccctgca gatccccttc cccatgcaga tggcctacag 2760
attcaacggc atcggcgtga cccagaacgt gctgtacgag aaccagaagc tgatcgccaa 2820
ccagttcaac agcgccatcg gcaagatcca ggacagcctg agcagcaccc ccagcgccct 2880
gggcaagctg caggacgtgg tgaaccacaa cgcccaggcc ctgaacaccc tggtgaagca 2940
gctgagcagc aagttcggcg ccatcagcag cgtgctgaac gacatcttca gcagactgga 3000
cccccccgag gccgaggtgc agatcgacag actgatcacc ggcagactgc agagcctgca 3060
gacctacgtg acccagcagc tgatcagagc cgccgagatc agagccagcg ccaacctggc 3120
cgccaccaag atgagcgagt gcgtgctggg ccagagcaag agagtggact tctgcggcaa 3180
gggctaccac ctgatgagct tcccccagag cgccccccac ggcgtggtgt tcctgcacgt 3240
gacctacgtg cccgcccagg agaagaactt caccaccgcc cccgccatct gccacgacgg 3300
caaggcccac ttccccagag agggcgtgtt cgtgagcaac ggcacccact ggttcgtgac 3360
ccagagaaac ttctacgagc cccagatcat caccaccgac aacaccttcg tgagcggcaa 3420
ctgcgacgtg gtgatcggca tcgtgaacaa caccgtgtac gaccccctgc agcccgagct 3480
ggacagcttc aaggaggagc tggacaagta cttcaagaac cacaccagcc ccgacgtgga 3540
cctgggcgac atcagcggca tcaacgccag cgtggtgaac atccagaagg agatcgacag 3600
actgaacgag gtggccaaga acctgaacga gagcctgatc gacctgcagg agctgggcaa 3660
gtacgagcag tacatcaagt ggccctggta catctggctg ggcttcatcg ccggcctgat 3720
cgccatcgtg atggtgacca tcatgctgtg ctgcatgacc agctgctgca gctgcctgaa 3780
gggctgctgc agctgcggca gctgctgcaa gttcgacgag gacgacagcg agcccgtgct 3840
gaagggcgtg aagctgcact acacctaaac cagcctcaag aacacccgaa tggagtctct 3900
aagctacata ataccaactt acactttaca aaatgttgtc ccccaaaatg tagccattcg 3960
tatctgctcc taataaaaag aaagtttctt cacaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4020
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4080
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaagagac c 4121

Claims (10)

1.一种RNA，其特征在于，所述RNA包括5’-UTR、目的基因的mRNA、3’-UTR和Poly A，所述mRNA为编码新型冠状病毒omicron突变株的抗原性多肽或其抗原性片段、变体或衍生物，所述抗原性多肽或其抗原性片段至少包含新型冠状病毒omicron突变株的S蛋白或S蛋白的受体结合结构域片段；所述5’-UTR的序列为序列表中序列1的第1至52位；所述3’-UTR的序列为序列表中序列1的第806至931位；所述Poly A的序列为序列表中序列1的第932至1051位；
所述RNA的序列为如下A1）-A10）中的至少一种：
A1）SEQ ID No. 1所示的RNA序列；
A2）SEQ ID No. 2所示的RNA序列；
A3）SEQ ID No. 3所示的RNA序列；
A4）SEQ ID No. 4所示的RNA序列；
A5）SEQ ID No. 5所示的RNA序列；
A6）SEQ ID No. 6所示的RNA序列；
A7）SEQ ID No. 7所示的RNA序列；
A8）SEQ ID No. 8所示的RNA序列；
A9）SEQ ID No. 9所示的RNA序列；
A10）SEQ ID No. 10所示的RNA序列。
2.与权利要求1所述RNA相关的生物材料，其特征在于，所述生物材料为B1)至B5)中的任一种：
B1)编码权利要求1所述RNA的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体，或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物，或含有B2)所述表达盒的重组微生物，或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因细胞系。
3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于，所述B3)为如下b1)-b10）任一所述的载体：
b1)用序列表中序列11的所示的DNA替换载体pVAX1的T7启动子序列与XbaI识别位点之间的片段，并保持载体其他核苷酸序列不变的重组载体；
b2)用序列表中序列12的所示的DNA替换载体pVAX1的T7启动子序列与XbaI位点之间的片段，并保持载体其他核苷酸序列不变的重组载体；
b3)用序列表中序列13的所示的DNA替换载体pVAX1的T7启动子序列与XbaI位点之间的片段，并保持载体其他核苷酸序列不变的重组载体；
b4)用序列表中序列14的所示的DNA替换载体pVAX1的T7启动子序列与XbaI位点之间的片段，并保持载体其他核苷酸序列不变的重组载体；
b5)用序列表中序列15的所示的DNA替换载体pVAX1的T7启动子序列与XbaI位点之间的片段，并保持载体其他核苷酸序列不变的重组载体；
b6)用序列表中序列16的所示的DNA替换载体pVAX1的T7启动子序列与XbaI位点之间的片段，并保持载体其他核苷酸序列不变的重组载体；
b7)用序列表中序列17的所示的DNA替换载体pVAX1的T7启动子序列与XbaI位点之间的片段，并保持载体其他核苷酸序列不变的重组载体；
b8)用序列表中序列18的所示的DNA替换载体pVAX1的T7启动子序列与XbaI位点之间的片段，并保持载体其他核苷酸序列不变的重组载体；
b9)用序列表中序列19的所示的DNA替换载体pVAX1的T7启动子序列与XbaI位点之间的片段，并保持载体其他核苷酸序列不变的重组载体；
b10)用序列表中序列20的所示的DNA替换载体pVAX1的T7启动子序列与XbaI位点之间的片段，并保持载体其他核苷酸序列不变的重组载体。
4.一种RNA-脂质复合物，其特征在于，所述RNA-脂质复合物包含递送载体以及权利要求1所述的RNA；
所述递送载体包括可离子化脂质体、可离子化蛋白、可离子化聚合物、可离子化胶束和可离子化脂质纳米粒中的任一种。
5.根据权利要求4所述的RNA-脂质复合物，其特征在于，所述可离子化脂质体为阳离子脂质体、所述可离子化蛋白为阳离子蛋白、所述可离子化聚合物为阳离子聚合物、所述可离子化胶束为阳离子胶束、所述可离子化脂质纳米粒为阳离子脂质纳米粒。
6.根据权利要求5所述的RNA-脂质复合物，其特征在于，所述RNA-脂质复合物为以下C1-C2中的任一种：
C1)可离子化脂质-mRNA复合物，所述可离子化脂质-mRNA复合物中包含可离子化脂质、权利要求1所述的RNA、鱼精蛋白、PEG化脂质和1,2-二油酯-sn-甘油-3-磷酸乙醇铵；
C2)可离子化脂质-mRNA脂质纳米粒，所述可离子化脂质-mRNA纳米粒中包含可离子化脂质、权利要求1所述的RNA、PEG化脂质、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱和胆固醇。
7.制备权利要求6所述的RNA-脂质复合物的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1所述的RNA与鱼精蛋白混合后用递送载体包装的步骤。
8.用于预防或治疗新型冠状病毒感染的RNA疫苗，其特征在于，所述疫苗的活性成分包含权利要求1所述的RNA、权利要求2或3所述的生物材料或权利要求4-6任一所述的RNA-脂质复合物。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的活性成分包含如权利要求1所述的RNA、权利要求2或3所述的生物材料、权利要求4-6任一所述的RNA-脂质复合物或权利要求8所述的RNA疫苗。
10.一种试剂盒，其包含权利要求1所述的RNA、权利要求2或3所述的生物材料或者权利要求4-6任一所述的RNA-脂质复合物。
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