CN115232825B

CN115232825B - 一种基于1083骨架的新冠病毒疫苗

Info

Publication number: CN115232825B
Application number: CN202110434284.5A
Authority: CN
Inventors: 杨静; 王升启; 李蕾; 王鑫; 龙晋蓉; 桑野; 曹艺明; 任晋; 雷恩
Original assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2021-04-22
Filing date: 2021-04-22
Publication date: 2023-09-26
Anticipated expiration: 2041-04-22
Also published as: CN115232825A

Abstract

本发明公开了提供了一种基于1083骨架的新冠病毒疫苗，可以提高抗原表达效能。所述疫苗的活性成分为mRNA‑1083，所述mRNA‑1083包括依次连接的5’‑UTR、目的基因的mRNA和3’‑UTR和Poly A，所述5’‑UTR的序列为序列表中序列7的第1至46位中的T替换为U所得到的序列；所述3’‑UTR的序列为序列表中序列7的第818至943位中的T替换为U所得到的序列；所述Poly A的序列为序列表中序列7的第944至1063位中的T替换为U所得到的序列。

Description

一种基于1083骨架的新冠病毒疫苗

技术领域

本发明涉及核酸疫苗领域，具体涉及一种基于1083骨架的新冠病毒疫苗。

背景技术

近年兴起的mRNA疫苗是新型核酸疫苗的一种。它直接免疫目的抗原的基因编码脚本，再由机体自身合成目的抗原蛋白，可以同时迅速诱导体液免疫和细胞免疫应答。 mRNA疫苗在概念上比传统的灭活疫苗、减毒疫苗，新型的亚单位疫苗、病毒载体疫苗和DNA疫苗都更具有优势：1)mRNA疫苗技术研发速度快，可以在三个月内完成GMP 生产和质量控制，有利于突发性传染病流行的应急防控；2)mRNA疫苗相对安全，其自身无感染性，且不需要进入细胞核，没有改变基因的风险。mRNA疫苗在体内短暂停留瞬间实现抗原蛋白翻译后被酶解清除；3)mRNA疫苗的免疫原性较强，可以诱导较强的体液免疫应答和细胞免疫应答，因而既可以防毒于胞外，也可以消毒于胞内；4) mRNA疫苗研发制备平台具有通用性、生物安全风险低、产业化能力强，可以实现疫苗标准化安全生产。只需要改变mRNA的核苷酸序列即可进行大规模生产，并不需要更改其他生产设备和条件项目。

目前，获得紧急使用授权的新冠mRNA疫苗有辉瑞/BioNTech研制的 “BNT162b2”mRNA疫苗与美国Moderna公司研制的“mRNA-1273”疫苗。2020年12 月1日，“BNT162b2”mRNA疫苗在英国获批紧急使用，该疫苗也成为了首个获得西方国家许可的新冠疫苗，后于2020年12月14日开始在美国投放。早在2020年3月5 日，“mRNA-1273”疫苗获批成为全球首款进入临床试验的新冠疫苗，该疫苗于2020 年12月18日获得FDA紧急使用授权。

研发我国具有自主知识产权新型冠状病毒mRNA疫苗，不仅对应对当前疫情有重要意义，还能丰富常态化防控的疫苗储备。新冠mRNA疫苗的成功研制很大程度上取决于其自身序列的优化。mRNA疫苗的序列除抗原基因编码区域以外部分可被看作mRNA疫苗的骨架。对mRNA疫苗骨架序列的优化，可以提高抗原表达效能，也可以实现不同 mRNA疫苗的迅速研发，以应对不同传染性疾病的突发与病毒的变异。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于1083骨架的mRNA及其应用。

本发明提供一种疫苗，所述疫苗的活性成分为mRNA-1083，所述mRNA-1083包括依次连接的5’-UTR、目的基因的mRNA和3’-UTR和Poly A，所述5’-UTR的序列为序列表中序列7的第1至46位中的T替换为U所得到的序列；所述3’-UTR的序列为序列表中序列7的第818至943位中的T替换为U所得到的序列；所述Poly A的序列为序列表中序列7的第944至1063位中的T替换为U所得到的序列。

本发明还要求保护一种mRNA,所述mRNA为上述mRNA-1083。

本发明还要求保护mRNA-1083骨架序列，所述的mRNA-1083骨架序列在如下任一中的应用：

1)制备mRNA疫苗；

2)制备mRNA抗体；

3)制备mRNA细胞因子；

4)制备mRNA疗法中使用的相关药物。

其中，mRNA-1083骨架序列在制备mRNA疫苗、制备mRNA抗体、制备mRNA细胞因子或者其他应用，对应的mRNA-1083骨架中的目的基因的mRNA不同，根据目的基因的 mRNA的不同性质，可以应用在不同领域。

其中，所述疫苗可以为新型冠状肺炎疫苗。

其中，所述目的基因的mRNA为如下(1)-(6)中的任一所示：

(1)序列表中序列7的第47至817位中的T替换为U所得到的序列；

(2)序列表中序列9的第47至1444位中的T替换为U所得到的序列；

(3)序列表中序列10的第47至1675位中的T替换为U所得到的序列；

(4)序列表中序列11的第47至1807位中的T替换为U所得到的序列；

(5)序列表中序列12的第47至2320位中的T替换为U所得到的序列；

(6)序列表中序列13的第56至3913位中的T替换为U所得到的序列。

其中，所述mRNA的5’端连接有Cap结构，所述Cap结构可以为Cap1也可以根据需求选取其他Cap结构。

其中，所述mRNA的PolyA尾结构下游连接有识别位点序列，所述识别位点序列可以为SapI序列也可以根据需求选取其他识别位点序列。

上述疫苗在制备新型冠状肺炎疫苗产品中的应用也应在本发明的保护范围之内。

本发明还提供一种与所述的疫苗相关的生物材料，其特征在于，所述生物材料为B1)-B6)中的任一种：

B1)编码权利要求1所述mRNA的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组质粒、或含有B2)所述表达盒的重组质粒；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组菌、或含有B2)所述表达盒的重组菌、或含有B3)所述重组载体的重组菌；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因细胞系。

其中，所述重组载体为C1)-C6)中的任一种：

C1)将序列表中序列7的所示序列插入到载体pcDNA3.1(+)的NheI--XhoI位点之间，并保持载体其他位点不变的序列；

C2)将序列表中序列9的所示序列插入到载体pcDNA3.1(+)的NheI--XhoI位点之间，并保持载体其他位点不变的序列；

C3)将序列表中序列10的所示序列插入到载体pcDNA3.1(+)的NheI--XhoI位点之间，并保持载体其他位点不变的序列；

C4)将序列表中序列11的所示序列插入到载体pcDNA3.1(+)的NheI--XhoI位点之间，并保持载体其他位点不变的序列；

C5)将序列表中序列12的所示序列插入到载体pcDNA3.1(+)的NheI--XhoI位点之间，并保持载体其他位点不变的序列；

C6)将序列表中序列13的所示序列插入到载体pcDNA3.1(+)的NheI--XhoI位点之间，并保持载体其他位点不变的序列。

其中，所述重组菌为转化了所述的重组质粒的大肠杆菌感受态细胞。

上述生物材料在制备疫苗产品中的应用也应在本发明的保护范围之内，所述疫苗为新型冠状病毒疫苗。

本发明的有益效果在于，提供了一种优化后的mRNA疫苗骨架序列的1083骨架，可以提高抗原表达效能，也可以实现不同mRNA疫苗的迅速研发，以应对不同传染性疾病的突发与病毒的变异。

附图说明

图1为本发明的疫苗的结构示意图。

图2为本发明的实施例中的重组载体结构示意图。

图3为本发明实施例1中的13种疫苗的结构示意图。

图4为本发明的实施例1中的质量分析结果图。

图5为本发明的实施例1中的细胞转染蛋白表达检测结果图。

图6为本发明的实施例2中的新冠mRNA疫苗的小鼠体内效力评价。

图7为本发明的实施例2中的新冠mRNA-1083、mRNA-1710、mRNA-2568及mRNA-4185疫苗序列免疫小鼠血清新冠假病毒中和抗体(NT₅₀)情况。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、新型冠状病毒mRNA的序列设计、制备和体外多种细胞的抗原表达检测一、新冠mRNA疫苗的序列设计

新冠mRNA疫苗的序列设计包括mRNA的骨架代码序列：5’-帽子(5’-Cap)；5’- 非翻译区(5’-UTR)；3’-非翻译区(3’-UTR)及多聚A尾(Poly A)和mRNA的基因编码区(CDS)结构序列，如图1所示。新冠mRNA的CDS是由起始密码子AUG到终止密码子结束的三联体密码子构成，决定不同新冠抗原蛋白的氨基酸序列。为实现mRNA的体外转录，将新冠mRNA序列模板构建在载体pcDNA3.1(+)的多克隆位点区域NheI--XhoI 位点之间得到重组质粒，利用T7启动子序列，在T7转录酶作用下启动体外转录，如图2 所示。由此，设计优化得到13条不同新冠mRNA疫苗序列，如图3所示。这13条mRNA的序列如序列表中序列所示。

1.序列1(mRNA-1029)：

自5’端第1至49为5’-UTR1，第50至820为CDS(编码新冠S蛋白NTD的306-318AA 和RBD区域)，第821至889为3’-UTR1，第890至1009为PolyA尾。

2.序列2(mRNA-1060)：

自5’端第1至37为5’-UTR2，第38至808为CDS(编码新冠S蛋白的NTD的306-318A A和RBD区域)，第809至920为3’-UTR2，第921至1040为Poly A尾。

3.序列3(mRNA-1069)：

自5’端第1至46为5’-UTR3，第47至817为CDS(编码新冠S蛋白的NTD的306-318A A和RBD区域)，第818至929为3’-UTR3，第930至1049为Poly A尾。

4.序列4(mRNA-1069H)：

自5’端第1至46为5’-UTR4，第47至817为CDS(编码新冠S蛋白的NTD的306-318A A和RBD区域)，第818至929为3’-UTR4，第930至1049为Poly A尾。

5.序列5(mRNA-1072)：

自5’端第1至49为5’-UTR5，第50至820为CDS(编码新冠S蛋白的NTD的306-318A A和RBD区域)，第821至932为3’-UTR5，第933至1052为Poly A尾。

6.序列6(mRNA-1073)：

自5’端第1至50为5’-UTR6，第51至821为CDS(编码新冠S蛋白的NTD的306-318A A和RBD区域)，第822至933为3’-UTR6，第934至1053为Poly A尾。

7.序列7(mRNA-1083)：

自5’端第1至46为5’-UTR7，第47至817为CDS(编码新冠S蛋白的NTD的306-318A A和RBD区域)，第818至943为3’-UTR7，第944至1063为Poly A尾。

8.序列8(mRNA-1096)：

自5’端第1至50为5’-UTR8，第51至821为CDS(编码新冠S蛋白的NTD的306-318A A和RBD区域)，第822至956为3’-UTR8，第957至1076为Poly A尾。

9.序列9(mRNA-1710)：

自5’端第1至46为5’-UTR7，第47至1444为CDS(编码新冠S蛋白的NTD的306-318 AA和两段受体结合区域RBD)，第1445至1570为3’-UTR7，第1571至1690为Poly A尾。

10.序列10(mRNA-1941)：

自5’端第1至46为5’-UTR7，第47至1675为CDS(编码新冠S蛋白的NTD的15-318A A和受体结合区域RBD)，第1676至1801为3’-UTR7，第1802至1921为Poly A尾。

11.序列11(mRNA-2073)：

自5’端第1至46为5’-UTR7，第47至1807为CDS(编码新冠S蛋白的NTD的15-318A A、受体结合区域RBD和HR2)，第1808至1933为3’-UTR7，第1934至2053为Poly A尾。

12.序列12(mRNA-2586)：

自5’端第1至46为5’-UTR7，第47至2320为CDS(编码新冠S蛋白的NTD的15-318A A和两段受体结合区域RBD)，第2321至2446为3’-UTR7，第2447至2566为Poly A尾。

13.序列13(mRNA-4185)：

自5’端第1至46为5’-UTR7，第47至3913为CDS(编码新冠S蛋白)，第3920至40 45为3’-UTR7，第4046至4165为Poly A尾。

二、新冠mRNA疫苗的体外合成

1.将设计的13种新冠mRNA疫苗序列进行DNA模板合成，并通过测序验证。

2.将步骤1合成的DNA模板进行扩增：将DNA模板连接到载体pcDNA3.1(+)的NheI--XhoI位点之间，得到重组质粒。将重组质粒转化感受态细胞DH5α，通过对宿主大肠杆菌的培养，得到大量扩增菌体。借助无内毒素质粒大提试剂盒(天根生物科技 (北京)有限公司，DP117)提取扩增菌体中扩增的重组质粒。将扩增的重组质粒进行线性化：利用相应的酶对提取的重组质粒进行酶切线性化，经纯化得到可用于mRNA体外合成的模板，并采用Qubit^TM dsDNA BR Assay Kit(Invitrogen,Q32850)试剂盒进行定量。

3.以步骤2扩增的DNA为mRNA的体外合成模板，配制表1所示的反应体系，37℃孵育1h进行体外转录，得到大量体外转录RNA，并采用Qubit^TM dsDNA BR Assay Kit(Invitrogen,Q32850)试剂盒进行定量。

表1.体外转录反应采用T7-FlashScribe^TM Transcription试剂盒(Cellscript,C-ASF3507)

4、将步骤3体外转录RNA产物进行纯化：向转录反应体系中加入1μl RNase-FreeDNase I，37℃孵育15min，以去除体外转录产物体系中的DNA模板，得到转录产物。再对得到的转录产物进行纯化，纯化方法如下：

(1)向转录产物中加入RNase-Free H₂O补足体积200μl；

(2)加入200μl混合液A(水饱和酚：氯仿：异戊醇，v:v:v，25:24:1)，涡旋10s，4℃，13800×g离心5min，然后将管中上层水相移至新管中；

(3)向新管中加入等体积混合液B(氯仿：异戊醇，v:v，24:1)，涡旋10s， 4℃，13800×g离心5min，然后将管中上层水相移至新管中；

(4)向新管中加入等体积5M乙酸铵溶液，涡旋混匀后冰上放置15min后，4℃、13800×g离心15min，弃上清。

(5)加入70％冰乙醇对RNA进行清理后，弃去70％乙醇；，加适量RNase-Free水(Solarbio，R1600)重悬,并采用Qubit^TM RNA BR Assay Kit(Invitrogen,Q10211) 试剂盒进行定量。

5.对步骤4得到的RNA转录纯化产物进行mRNA加帽反应，具体步骤如下：

(1)RNA变性：取60μg转录纯化产物，65℃孵育15min进行变性处理，然后移至冰上。

(2)mRNA加帽反应:加入RNA变性产物后，按照表2所示的配制反应体系，37℃ 孵育0.5h，得到mRNA具有Cap 0的加帽产物。

表2 mRNA的Cap 0加帽反应体系配制采用ScriptCap^TM Cap 1Capping System

6.mRNA加帽产物纯化：同步骤4。

7.mRNA的质量分析

采用安捷伦2100生物分析仪和RNA Nano 6000Assay Kit(Aglient,5067-1511)对合成mRNA进行质量分析，具体步骤如下：

(1)mRNA变性：将mRNA和mRNA Ladder，70℃变性2min，然后立即冰浴。

(2)准备凝胶：按说明将RNA gel matrix加入过滤管中，1500×g室温离心10min，4℃保存备用。

(3)准备凝胶-染料混合物：RNA染料避光平衡30min，然后涡旋数秒，瞬时离心后以65:1比例配制凝胶染料混合物，将混合物涡旋混匀，13000×g室温离心10min。

(4)加载凝胶-染料混合物：使用RNA nano芯片之前，调节芯片制备器夹子到最上方的位置。将RNA芯片放入芯片槽，在注明黑色G的孔中加入9μl凝胶-染料混合物(不要有气泡)；注射器活塞在1ml位置处时关闭注胶器，按压注射器，用夹子固定30s后再松开，5s后将活塞拉回1ml处的位置；打开注胶器，在其它注明白色G 的孔中加入9μl凝胶-染料混合物。

(5)加载Marker：在所有样品孔与ladder孔中各加入6μl RNA Marker。

(6)加载Ladder与mRNA：在标有梯子图样的孔中加入1μl ladder，将mRNA 加入到剩余12个孔中(没有用到的孔可用RNase-free water代替)，将芯片放到芯片涡旋振荡器上，2400r/min振荡1min，然后5min内将芯片放到Agilent 2100 仪中进行检测。

结果如图4所示。结果显示,合成mRNA-1029(图4-1)、mRNA-1060(图4-2)、 mRNA-1083(图4-3)、mRNA-1096(图4-4)、mRNA-1710(图4-5)、mRNA-1941(图 4-6)、mRNA-2073(图4-7)、mRNA-2568(图4-8)及mRNA-4185(图4-9)的条带且均与目标条带一致。

三、mRNA细胞转染蛋白表达检测

1.接种细胞：将293T细胞(ATCC)分别接种于6孔板中，每孔1×10⁶个细胞， 37℃，5％CO₂培养箱中至细胞达到80-90％融合度即可进行转染。

2.配制转染复合物：采用-mRNA Transfection kit(Mirus，MIR 2250)：250μl Opti-MEM+2.5μg mRNA+5μl mRNA boost reagent+5μl TransIT-mRNA reagent，混匀、室温静置2-5min形成转染复合物。

3.转染细胞：将转染复合物滴加到细胞并上下左右晃动使转染复合物均匀分布，37℃，5％CO₂孵育18h后收取细胞，转染前后无需更换细胞培养液。

4.提取细胞总蛋白：细胞用PBS清洗两次后，利用细胞裂解液RIPA(金普莱，P06M11)+蛋白酶抑制剂100×(金普莱，P01C01)，涡旋，以充分裂解细胞。冰浴 30min后，4℃，离心13800×g，15min，取上清液。

5.细胞总蛋白定量：利用BCA蛋白定量试剂盒(金普莱，P06M16)对细胞裂解上清液中总蛋白进行定量。将细胞裂解上清液与BCA工作液混匀，37℃，孵育45min， A₅₆₂ _nm下检测吸光度，并计算细胞总蛋白浓度。

6.Western blotting(WB)检测目标蛋白表达：利用蛋白电泳预制胶Bolt^TM 4 to12％,Bis-Tris,1.0mm,Mini Protein Gel(Invitrogen,NW04120BOX)电泳(200V， 22min)进行总蛋白(30μg)分离。将凝胶上的分离蛋白在梯度电压(20V，1min； 23V，4min；25V，2min)作用下转移到iBlot 2Transfer Stacks，PVDF(Invitrogen， IB24001)膜上后，在含5％脱脂奶粉的1×TBST中室温摇育，20r/min,封闭1h。一抗采用新冠病毒刺突蛋白受体结合区RBD兔多抗稀释液(1:2000)，SARS-CoV-2 (2019-nCoV)Spike RBD Antibody,RabbitPAb,Antigen Affinity Purified(义翘神州，40592-T62)，20r/min，室温摇育2h。用1×TBST清洗膜，60r/min，室温摇育10min，并重复3次，以彻底去除一抗残余。二抗采用辣根过氧化物酶(HRP) 标记的山羊抗兔IgG二抗稀释液(1:10000)，Goat Anti-Rabbit IgGSecondary Antibody(HRP)(义翘神州，SSA004)，20r/min，室温摇育1h。用1×TBST清洗膜，60r/min，室温摇育10min，并重复3次，以彻底去除二抗残余。利用ECL化学发光超敏显色试剂盒(翊圣生物，36208ES60)与膜室温避光孵育3min，在化学发光仪中检测HRP标记的抗体结合抗原。通过曝光显现条带与蛋白marker，PageRuler^TM Prestained Protein Ladder(Invitrogen，26617)条带比对，验证目标抗原蛋白的表达。利用膜再生液(索莱宝，SW3020)去除膜上抗体，再次对膜进行封闭后，孵育内参抗体，以检测蛋白上样量的一致性。一抗采用β-actin兔单抗稀释液(1:5000)， ACTB Rabbit mAb(Abclonal,AC038)，二抗采用辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗稀释液(1:10000)，Goat Anti-Rabbit IgGSecondary Antibody(HRP)(义翘神州，SSA004)。

结果如图5所示，结果显示：mRNA-1029、mRNA-1060、mRNA-1069、mRNA-1069H、mRNA-1072、mRNA-1073、mRNA-1083、mRNA-1096转染HEK-293t细胞(图5-1)，WB 均检测到目的抗原的表达；基于mRNA-1083骨架代码序列设计的mRNA-1710、 mRNA-1941、mRNA-2073、mRNA-2568(图5-2)及mRNA-4185(图5-3)转染HEK-293t细胞后，WB均检测到目的抗原的表达。筛选得到mRNA-1083、mRNA-1096、mRNA-1710、 mRNA-1941、mRNA-2073、mRNA-2568及mRNA-4185作为新冠mRNA疫苗候选序列进行体内有效性评价。

实施例2、新冠mRNA疫苗免疫小鼠后抗体产生的情况

一、新冠mRNA疫苗的高效递送制剂制备

制剂制备与上海斯微生物公司合作制备新冠mRNA-LPPs脂质多聚物疫苗。

二、新冠mRNA疫苗的体内效力评价

将实验动物BALB/c小鼠(雌，6-8周，16-18g,北京斯贝福)随机分为如表3 所示(每组5只)，以肌肉注射方式免疫小鼠。每次免疫后的第10天采用眼眶取血方法获得足够量的小鼠血清。通过ELISA法检测免疫小鼠血清中RBD特异性抗体的产生与滴度；再借用新冠S蛋白假病毒检测免疫小鼠血清中的假病毒中和抗体的产生与滴度，对新冠mRNA疫苗的体内免疫效力进行评价。

ELISA法检测免疫小鼠血清中RBD特异性抗体情况，具体检测方法如下：

(1)包被：RBD蛋白(义翘神州，40592-VNAH)用碳酸盐缓冲液(50mM，pH 9.6， 0.22μm滤膜过滤)稀释至1ng/μl。96孔板每孔中加入100μg RBD蛋白稀释液，密封、4℃过夜；

(2)洗板：包被过夜后，倾倒96孔板去除蛋白包被液，每孔加入200μL洗涤液(含0.2％Tween-20的1×TBS)，手轻轻摇动30s后在纸上拍干，重复6次；

(3)封闭：每孔加入200μl封闭液(含2％BSA的1×TBS)，37℃温箱孵育2h；

(4)洗板：倾倒96孔板去除封闭液，每孔加入200μl洗涤液(含0.2％Tween-20 的1×TBS)，手轻轻摇动30s后在纸上拍干，重复6次；

(5)孵育一抗：将免疫小鼠血清用抗体稀释液(含0.5％BSA的洗涤液)进行 10倍梯度稀释得到10^-1至10^-6不同稀释度的血清，每孔加入100μl血清稀释液，37℃ 温箱孵育2h；

(6)洗板：倾倒96孔板去除血清稀释液，每孔加入200μL洗涤液(含0.2％ Tween-20的1×TBS)，手轻轻摇动30s后在纸上拍干，重复6次；

(7)孵育二抗：将辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(碧云天，A0216) 用抗体稀释液(含0.5％BSA的洗涤液)进行250倍稀释得到二抗稀释液，每孔加入 100μl二抗稀释液，37℃温箱孵育1h；

(8)洗板：倾倒96孔板去除二抗稀释液，每孔加入200μl洗涤液(含0.2％ Tween-20的1×TBS)，手轻轻摇动30s后在纸上拍干，重复6次；

(9)显色：每孔加入100μl TMB底物(天根)，室温、避光、孵育20min；

(10)终止显色：每孔加入50μL 2M H₂SO₄，在酶标仪上检测A₄₅₀的OD值；

(11)血清抗体滴度判断：某一稀释血清OD/阴性对照OD≥2.1，下一稀释倍数 OD/阴性对照OD＜2.1，该稀释倍数为该血清样品对应的抗体滴度(如果阴性对照OD ＜0.05则按0.05计算)。

表3：小鼠肌肉注射疫苗序列及免疫情况

结果如图6显示：mRNA-1083、mRNA-1710、mRNA-1941、mRNA-2073、mRNA-2568 及mRNA-4185的免疫小鼠血清中均检测到RBD特异性IgG抗体。其中mRNA-1083、 mRNA-1710免疫小鼠初免血清滴度达约1：10000；mRNA-1083免疫小鼠二免血清滴度均达约1:1000000，优于相同剂量下，纽约血中心RBD-mRNA-LNPs疫苗的二免血清RBD 特异性IgG抗体水平(1:230000)。

新冠S蛋白假病毒检测免疫小鼠血清中的假病毒中和抗体情况，具体检测方法如下：

(1)细胞铺板：实验前一天，将待感染HEK293T-ACE2细胞(Yeasen Biotech，HB200710)接种于96孔细胞培养板中，接种量约为1×10⁴个细胞/孔，第二日，待细胞密度在30％左右时进行假病毒感染。HEK293T-ACE2细胞培养液为90％DMEM+10％ FBS+1％双抗+0.75μg/mL嘌呤霉素；

(2)免疫血清抑制假病毒感染：将免疫小鼠血清用细胞培养液进行10倍梯度稀释得到10^-1至10^-6不同稀释度的血清。取出冻存的假病毒(滴度1×10⁶TU/mL，0.5μl) (YeasenBiotech，HB200707)置于冰上融化后与将稀释血清100μl混匀，37℃温箱孵育1h后，加入培养细胞。病毒感染6h后更换新鲜培养基继续培养；

(3)感染检测：细胞感染假病毒换液后48h，通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达和采用萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒(Yeasen Biotech，HB181218)检测荧光素酶的活性。

(4)血清假病毒中和抗体滴度(NT₅₀)检测：NT₅₀定义为假病毒对照组产生荧光相对光单位(RLUs)减少50％的血清稀释倍数。NT₅₀由GraphPad Prism 6.0软件非线性回归log(inhibitor)v.s.normalized response(Variable slope)决定。

结果如图7显示：mRNA-1083、mRNA-1710、mRNA-2568及mRNA-4185的免疫小鼠血清抗体均具有新冠S蛋白假病毒中和活性。上述mRNA疫苗的初免和二免血清新冠S蛋白假病毒中和抗体(NT₅₀)滴度统计于表4中，mRNA-1083、mRNA-1710、mRNA-2568的二免小鼠血清新冠S蛋白假病毒中和抗体(NT₅₀)滴度均优于相同剂量下，纽约血中心 RBD-mRNA-LNPs疫苗的二免小鼠血清假病毒NT₅₀滴度(1:10000)。其中mRNA-1083初免小鼠血清假病毒NT₅₀滴度超过1:20000；二免小鼠血清假病毒NT₅₀滴度超过1:100000。进一步说明，基于mRNA-1083的骨架代码序列可促进诱导体内适应性免疫应答。

表4.新冠mRNA-1083、mRNA-1096、mRNA-1710、mRNA-2568及mRNA-4185疫苗序列免疫小鼠血清新冠假病毒中和抗体(NT₅₀)滴度。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 一种基于1083骨架的新冠病毒疫苗

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1009

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cacaggctct ttttttgcag aagcttaaaa taaacgctca gctttgacca tggtgttcgt 60

gttcctggtg ctgctgcccc tggtgagcag cttcaccgtg gagaagggca tctaccagac 120

cagcaacttc cgcgtgcagc ccaccgagag catcgtgcgc ttccccaaca tcaccaacct 180

gtgccccttc ggcgaggtgt tcaacgccac ccgcttcgcc agcgtgtacg cctggaaccg 240

caagcgcatc agcaactgcg tggccgacta cagcgtgctg tacaacagcg ccagcttcag 300

caccttcaag tgctacggcg tgagccccac caagctgaac gacctgtgct tcaccaacgt 360

gtacgccgac agcttcgtga tccgcggcga cgaggtgcgc cagatcgccc ccggccagac 420

cggcaagatc gccgactaca actacaagct gcccgacgac ttcaccggct gcgtgatcgc 480

ctggaacagc aacaacctgg acagcaaggt gggcggcaac tacaactacc tgtaccgcct 540

gttccgcaag agcaacctga agcccttcga gcgcgacatc agcaccgaga tctaccaggc 600

cggcagcacc ccctgcaacg gcgtggaggg cttcaactgc tacttccccc tgcagagcta 660

cggcttccag cccaccaacg gcgtgggcta ccagccctac cgcgtggtgg tgctgagctt 720

cgagctgctg cacgcccccg ccaccgtgtg cggccccaag aagtccacca acctggtgaa 780

gaacaagtgc gtgaacttcc accaccacca ccaccactaa accaacctca agaacatgtg 840

actggagtct cttagctaca cagaaacaaa atctcgtttt ttttcaaaaa aaaaaaaaaa 900

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1009

<210> 2

<211> 1040

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

actcttctgg tccccacaga ctcagagaga acccaccatg gtgttcgtgt tcctggtgct 60

gctgcccctg gtgagcagct tcaccgtgga gaagggcatc taccagacca gcaacttccg 120

cgtgcagccc accgagagca tcgtgcgctt ccccaacatc accaacctgt gccccttcgg 180

cgaggtgttc aacgccaccc gcttcgccag cgtgtacgcc tggaaccgca agcgcatcag 240

caactgcgtg gccgactaca gcgtgctgta caacagcgcc agcttcagca ccttcaagtg 300

ctacggcgtg agccccacca agctgaacga cctgtgcttc accaacgtgt acgccgacag 360

cttcgtgatc cgcggcgacg aggtgcgcca gatcgccccc ggccagaccg gcaagatcgc 420

cgactacaac tacaagctgc ccgacgactt caccggctgc gtgatcgcct ggaacagcaa 480

caacctggac agcaaggtgg gcggcaacta caactacctg taccgcctgt tccgcaagag 540

caacctgaag cccttcgagc gcgacatcag caccgagatc taccaggccg gcagcacccc 600

ctgcaacggc gtggagggct tcaactgcta cttccccctg cagagctacg gcttccagcc 660

caccaacggc gtgggctacc agccctaccg cgtggtggtg ctgagcttcg agctgctgca 720

cgcccccgcc accgtgtgcg gccccaagaa gtccaccaac ctggtgaaga acaagtgcgt 780

gaacttccac caccaccacc accactaagc tggagcctcg gtggccatgc ttcttgcccc 840

ttgggcctcc ccccagcccc tcctcccctt cctgcacccg tacccccgtg gtctttgaat 900

aaagtctgag tgggcggcaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1040

<210> 3

<211> 1049

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acttgttctt tttgcagaag ctcagaataa acgctcaact ttggccatgg tgttcgtgtt 60

cctggtgctg ctgcccctgg tgagcagctt caccgtggag aagggcatct accagaccag 120

caacttccgc gtgcagccca ccgagagcat cgtgcgcttc cccaacatca ccaacctgtg 180

ccccttcggc gaggtgttca acgccacccg cttcgccagc gtgtacgcct ggaaccgcaa 240

gcgcatcagc aactgcgtgg ccgactacag cgtgctgtac aacagcgcca gcttcagcac 300

cttcaagtgc tacggcgtga gccccaccaa gctgaacgac ctgtgcttca ccaacgtgta 360

cgccgacagc ttcgtgatcc gcggcgacga ggtgcgccag atcgcccccg gccagaccgg 420

caagatcgcc gactacaact acaagctgcc cgacgacttc accggctgcg tgatcgcctg 480

gaacagcaac aacctggaca gcaaggtggg cggcaactac aactacctgt accgcctgtt 540

ccgcaagagc aacctgaagc ccttcgagcg cgacatcagc accgagatct accaggccgg 600

cagcaccccc tgcaacggcg tggagggctt caactgctac ttccccctgc agagctacgg 660

cttccagccc accaacggcg tgggctacca gccctaccgc gtggtggtgc tgagcttcga 720

gctgctgcac gcccccgcca ccgtgtgcgg ccccaagaag tccaccaacc tggtgaagaa 780

caagtgcgtg aacttccacc accaccacca ccactaaggc tcagcaacaa cagcagcaga 840

agtctcaaca tcagacatca gttaattata tgcaatcaaa ctgacaaagc ttgtgaaaga 900

atgttctgaa ataaacattt taaccattaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1049

<210> 4

<211> 1049

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acttgttctt tttgcagaag ctcagaataa acgctcaact ttggccatgg tgttcgtgtt 60

cctggtgctg ctgcccctgg tgagcagctt caccgtggag aagggcatct accagaccag 120

caacttccgc gtgcagccca ccgagagcat cgtgcgcttc cccaacatca ccaacctgtg 180

ccccttcggc gaggtgttca acgccacccg cttcgccagc gtgtacgcct ggaaccgcaa 240

gcgcatcagc aactgcgtgg ccgactacag cgtgctgtac aacagcgcca gcttcagcac 300

cttcaagtgc tacggcgtga gccccaccaa gctgaacgac ctgtgcttca ccaacgtgta 360

cgccgacagc ttcgtgatcc gcggcgacga ggtgcgccag atcgcccccg gccagaccgg 420

caagatcgcc gactacaact acaagctgcc cgacgacttc accggctgcg tgatcgcctg 480

gaacagcaac aacctggaca gcaaggtggg cggcaactac aactacctgt accgcctgtt 540

ccgcaagagc aacctgaagc ccttcgagcg cgacatcagc accgagatct accaggccgg 600

cagcaccccc tgcaacggcg tggagggctt caactgctac ttccccctgc agagctacgg 660

cttccagccc accaacggcg tgggctacca gccctaccgc gtggtggtgc tgagcttcga 720

gctgctgcac gcccccgcca ccgtgtgcgg ccccaagaag tccaccaacc tggtgaagaa 780

caagtgcgtg aacttccacc accaccacca ccactaagct ggagcctcgg tggccatgct 840

tcttgcccct tgggcctccc cccagcccct cctccccttc ctgcacccgt acccccgtgg 900

tctttgaata aagtctgagt gggcggcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1049

<210> 5

<211> 1052

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cacaggctct ttttttgcag aagcttaaaa taaacgctca gctttgacca tggtgttcgt 60

gttcctggtg ctgctgcccc tggtgagcag cttcaccgtg gagaagggca tctaccagac 120

cagcaacttc cgcgtgcagc ccaccgagag catcgtgcgc ttccccaaca tcaccaacct 180

gtgccccttc ggcgaggtgt tcaacgccac ccgcttcgcc agcgtgtacg cctggaaccg 240

caagcgcatc agcaactgcg tggccgacta cagcgtgctg tacaacagcg ccagcttcag 300

caccttcaag tgctacggcg tgagccccac caagctgaac gacctgtgct tcaccaacgt 360

gtacgccgac agcttcgtga tccgcggcga cgaggtgcgc cagatcgccc ccggccagac 420

cggcaagatc gccgactaca actacaagct gcccgacgac ttcaccggct gcgtgatcgc 480

ctggaacagc aacaacctgg acagcaaggt gggcggcaac tacaactacc tgtaccgcct 540

gttccgcaag agcaacctga agcccttcga gcgcgacatc agcaccgaga tctaccaggc 600

cggcagcacc ccctgcaacg gcgtggaggg cttcaactgc tacttccccc tgcagagcta 660

cggcttccag cccaccaacg gcgtgggcta ccagccctac cgcgtggtgg tgctgagctt 720

cgagctgctg cacgcccccg ccaccgtgtg cggccccaag aagtccacca acctggtgaa 780

gaacaagtgc gtgaacttcc accaccacca ccaccactaa ggctcagcag taacagtagc 840

agaagtttgg acatcagaca tcagttaatg acaaacaatc aaactgacac agcttgtgaa 900

agaatgttct gaaataaaca tttttaaaat taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1052

<210> 6

<211> 1053

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acatttgctt ctgacacaac tgtgttcact agcaacctca aacagacacc atggtgttcg 60

tgttcctggt gctgctgccc ctggtgagca gcttcaccgt ggagaagggc atctaccaga 120

ccagcaactt ccgcgtgcag cccaccgaga gcatcgtgcg cttccccaac atcaccaacc 180

tgtgcccctt cggcgaggtg ttcaacgcca cccgcttcgc cagcgtgtac gcctggaacc 240

gcaagcgcat cagcaactgc gtggccgact acagcgtgct gtacaacagc gccagcttca 300

gcaccttcaa gtgctacggc gtgagcccca ccaagctgaa cgacctgtgc ttcaccaacg 360

tgtacgccga cagcttcgtg atccgcggcg acgaggtgcg ccagatcgcc cccggccaga 420

ccggcaagat cgccgactac aactacaagc tgcccgacga cttcaccggc tgcgtgatcg 480

cctggaacag caacaacctg gacagcaagg tgggcggcaa ctacaactac ctgtaccgcc 540

tgttccgcaa gagcaacctg aagcccttcg agcgcgacat cagcaccgag atctaccagg 600

ccggcagcac cccctgcaac ggcgtggagg gcttcaactg ctacttcccc ctgcagagct 660

acggcttcca gcccaccaac ggcgtgggct accagcccta ccgcgtggtg gtgctgagct 720

tcgagctgct gcacgccccc gccaccgtgt gcggccccaa gaagtccacc aacctggtga 780

agaacaagtg cgtgaacttc caccaccacc accaccacta agctggagcc tcggtggcca 840

tgcttcttgc cccttgggcc tccccccagc ccctcctccc cttcctgcac ccgtaccccc 900

gtggtctttg aataaagtct gagtgggcgg caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1053

<210> 7

<211> 1063

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

acttgttctt tttgcagaag ctcagaataa acgctcaact ttggccatgg tgttcgtgtt 60

cctggtgctg ctgcccctgg tgagcagctt caccgtggag aagggcatct accagaccag 120

caacttccgc gtgcagccca ccgagagcat cgtgcgcttc cccaacatca ccaacctgtg 180

ccccttcggc gaggtgttca acgccacccg cttcgccagc gtgtacgcct ggaaccgcaa 240

gcgcatcagc aactgcgtgg ccgactacag cgtgctgtac aacagcgcca gcttcagcac 300

cttcaagtgc tacggcgtga gccccaccaa gctgaacgac ctgtgcttca ccaacgtgta 360

cgccgacagc ttcgtgatcc gcggcgacga ggtgcgccag atcgcccccg gccagaccgg 420

caagatcgcc gactacaact acaagctgcc cgacgacttc accggctgcg tgatcgcctg 480

gaacagcaac aacctggaca gcaaggtggg cggcaactac aactacctgt accgcctgtt 540

ccgcaagagc aacctgaagc ccttcgagcg cgacatcagc accgagatct accaggccgg 600

cagcaccccc tgcaacggcg tggagggctt caactgctac ttccccctgc agagctacgg 660

cttccagccc accaacggcg tgggctacca gccctaccgc gtggtggtgc tgagcttcga 720

gctgctgcac gcccccgcca ccgtgtgcgg ccccaagaag tccaccaacc tggtgaagaa 780

caagtgcgtg aacttccacc accaccacca ccactaaacc agcctcaaga acacccgaat 840

ggagtctcta agctacataa taccaactta cactttacaa aatgttgtcc cccaaaatgt 900

agccattcgt atctgctcct aataaaaaga aagtttcttc acaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1063

<210> 8

<211> 1076

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

acatttgctt ctgacacaac tgtgttcact agcaacctca aacagacacc atggtgttcg 60

tgttcctggt gctgctgccc ctggtgagca gcttcaccgt ggagaagggc atctaccaga 120

ccagcaactt ccgcgtgcag cccaccgaga gcatcgtgcg cttccccaac atcaccaacc 180

tgtgcccctt cggcgaggtg ttcaacgcca cccgcttcgc cagcgtgtac gcctggaacc 240

gcaagcgcat cagcaactgc gtggccgact acagcgtgct gtacaacagc gccagcttca 300

gcaccttcaa gtgctacggc gtgagcccca ccaagctgaa cgacctgtgc ttcaccaacg 360

tgtacgccga cagcttcgtg atccgcggcg acgaggtgcg ccagatcgcc cccggccaga 420

ccggcaagat cgccgactac aactacaagc tgcccgacga cttcaccggc tgcgtgatcg 480

cctggaacag caacaacctg gacagcaagg tgggcggcaa ctacaactac ctgtaccgcc 540

tgttccgcaa gagcaacctg aagcccttcg agcgcgacat cagcaccgag atctaccagg 600

ccggcagcac cccctgcaac ggcgtggagg gcttcaactg ctacttcccc ctgcagagct 660

acggcttcca gcccaccaac ggcgtgggct accagcccta ccgcgtggtg gtgctgagct 720

tcgagctgct gcacgccccc gccaccgtgt gcggccccaa gaagtccacc aacctggtga 780

agaacaagtg cgtgaacttc caccaccacc accaccacta agctcgcttt cttgctgtcc 840

aatttctatt aaaggttcct ttgttcccta agtccaacta ctaaactggg ggatattatg 900

aagggccttg agcatctgga ttctgcctaa taaaaaacat ttattttcat tgcaaaaaaa 960

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1076

<210> 9

<211> 1690

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

acttgttctt tttgcagaag ctcagaataa acgctcaact ttggccatgg tgttcgtgtt 60

cctggtgctg ctgcccctgg tgagcagctt caccgtggag aagggcatct accagaccag 120

caacttccgc gtgcagccca ccgagagcat cgtgcgcttc cccaacatca ccaacctgtg 180

ccccttcggc gaggtgttca acgccacccg cttcgccagc gtgtacgcct ggaaccgcaa 240

gcgcatcagc aactgcgtgg ccgactacag cgtgctgtac aacagcgcca gcttcagcac 300

cttcaagtgc tacggcgtga gccccaccaa gctgaacgac ctgtgcttca ccaacgtgta 360

cgccgacagc ttcgtgatcc gcggcgacga ggtgcgccag atcgcccccg gccagaccgg 420

caagatcgcc gactacaact acaagctgcc cgacgacttc accggctgcg tgatcgcctg 480

gaacagcaac aacctggaca gcaaggtggg cggcaactac aactacctgt accgcctgtt 540

ccgcaagagc aacctgaagc ccttcgagcg cgacatcagc accgagatct accaggccgg 600

cagcaccccc tgcaacggcg tggagggctt caactgctac ttccccctgc agagctacgg 660

cttccagccc accaacggcg tgggctacca gccctaccgc gtggtggtgc tgagcttcga 720

gctgctgcac gcccccgcca ccgtgtgcgg ccccaagaag tccaccaacc tggtgaagaa 780

caagcgcgtg cagcccaccg agagcatcgt gcgcttcccc aacatcacca acctgtgccc 840

cttcggcgag gtgttcaacg ccacccgctt cgccagcgtg tacgcctgga accgcaagcg 900

catcagcaac tgcgtggccg actacagcgt gctgtacaac agcgccagct tcagcacctt 960

caagtgctac ggcgtgagcc ccaccaagct gaacgacctg tgcttcacca acgtgtacgc 1020

cgacagcttc gtgatccgcg gcgacgaggt gcgccagatc gcccccggcc agaccggcaa 1080

gatcgccgac tacaactaca agctgcccga cgacttcacc ggctgcgtga tcgcctggaa 1140

cagcaacaac ctggacagca aggtgggcgg caactacaac tacctgtacc gcctgttccg 1200

caagagcaac ctgaagccct tcgagcgcga catcagcacc gagatctacc aggccggcag 1260

caccccctgc aacggcgtgg agggcttcaa ctgctacttc cccctgcaga gctacggctt 1320

ccagcccacc aacggcgtgg gctaccagcc ctaccgcgtg gtggtgctga gcttcgagct 1380

gctgcacgcc cccgccaccg tgtgcggccc caagaagtcc accaacctgg tgaagaacaa 1440

gtaaaccagc ctcaagaaca cccgaatgga gtctctaagc tacataatac caacttacac 1500

tttacaaaat gttgtccccc aaaatgtagc cattcgtatc tgctcctaat aaaaagaaag 1560

tttcttcaca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1680

aaaaaaaaaa 1690

<210> 10

<211> 1921

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

acttgttctt tttgcagaag ctcagaataa acgctcaact ttggccatgg tgttcgtgtt 60

cctggtgctg ctgcccctgg tgagcagcca gtgcgtgaac ctgaccaccc gcacccagct 120

gccccccgcc tacaccaaca gcttcacccg cggcgtgtac taccccgaca aggtgttccg 180

cagcagcgtg ctgcacagca cccaggacct gttcctgccc ttcttcagca acgtgacctg 240

gttccacgcc atccacgtga gcggcaccaa cggcaccaag cgcttcgaca accccgtgct 300

gcccttcaac gacggcgtgt acttcgccag caccgagaaa agcaacatca tccgcggctg 360

gatcttcggc accaccctgg acagcaagac ccagagcctg ctgatcgtga acaacgccac 420

caacgtggtg atcaaggtgt gcgagttcca gttctgcaac gaccccttcc tgggcgtgta 480

ctaccacaag aacaacaaga gctggatgga gagcgagttc cgcgtgtaca gcagcgccaa 540

caactgcacc ttcgagtacg tgagccagcc cttcctgatg gacctggagg gcaagcaggg 600

caacttcaag aacctgcgcg agttcgtgtt caagaacatc gacggctact tcaagatcta 660

cagcaagcac acccccatca acctggtgcg cgacctgccc cagggcttca gcgccctgga 720

gcccctggtg gacctgccca tcggcatcaa catcacccgc ttccagaccc tgctggccct 780

gcaccgcagc tacctgaccc ccggcgacag cagcagcggc tggaccgccg gcgccgccgc 840

ctactacgtg ggctacctgc agccccgcac cttcctgctg aagtacaacg agaacggcac 900

catcaccgac gccgtggact gcgccctgga ccccctgagc gagaccaagt gcaccctgaa 960

gtccttcacc gtggagaagg gcatctacca gaccagcaac ttccgcgtgc agcccaccga 1020

gagcatcgtg cgcttcccca acatcaccaa cctgtgcccc ttcggcgagg tgttcaacgc 1080

cacccgcttc gccagcgtgt acgcctggaa ccgcaagcgc atcagcaact gcgtggccga 1140

ctacagcgtg ctgtacaaca gcgccagctt cagcaccttc aagtgctacg gcgtgagccc 1200

caccaagctg aacgacctgt gcttcaccaa cgtgtacgcc gacagcttcg tgatccgcgg 1260

cgacgaggtg cgccagatcg cccccggcca gaccggcaag atcgccgact acaactacaa 1320

gctgcccgac gacttcaccg gctgcgtgat cgcctggaac agcaacaacc tggacagcaa 1380

ggtgggcggc aactacaact acctgtaccg cctgttccgc aagagcaacc tgaagccctt 1440

cgagcgcgac atcagcaccg agatctacca ggccggcagc accccctgca acggcgtgga 1500

gggcttcaac tgctacttcc ccctgcagag ctacggcttc cagcccacca acggcgtggg 1560

ctaccagccc taccgcgtgg tggtgctgag cttcgagctg ctgcacgccc ccgccaccgt 1620

gtgcggcccc aagaagtcca ccaacctggt gaagaacaag tgcgtgaact tctaaaccag 1680

cctcaagaac acccgaatgg agtctctaag ctacataata ccaacttaca ctttacaaaa 1740

tgttgtcccc caaaatgtag ccattcgtat ctgctcctaa taaaaagaaa gtttcttcac 1800

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1860

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920

a 1921

<210> 11

<211> 2053

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

acttgttctt tttgcagaag ctcagaataa acgctcaact ttggccatgg tgttcgtgtt 60

cctggtgctg ctgcccctgg tgagcagcca gtgcgtgaac ctgaccaccc gcacccagct 120

gccccccgcc tacaccaaca gcttcacccg cggcgtgtac taccccgaca aggtgttccg 180

cagcagcgtg ctgcacagca cccaggacct gttcctgccc ttcttcagca acgtgacctg 240

gttccacgcc atccacgtga gcggcaccaa cggcaccaag cgcttcgaca accccgtgct 300

gcccttcaac gacggcgtgt acttcgccag caccgagaaa agcaacatca tccgcggctg 360

gatcttcggc accaccctgg acagcaagac ccagagcctg ctgatcgtga acaacgccac 420

caacgtggtg atcaaggtgt gcgagttcca gttctgcaac gaccccttcc tgggcgtgta 480

ctaccacaag aacaacaaga gctggatgga gagcgagttc cgcgtgtaca gcagcgccaa 540

caactgcacc ttcgagtacg tgagccagcc cttcctgatg gacctggagg gcaagcaggg 600

caacttcaag aacctgcgcg agttcgtgtt caagaacatc gacggctact tcaagatcta 660

cagcaagcac acccccatca acctggtgcg cgacctgccc cagggcttca gcgccctgga 720

gcccctggtg gacctgccca tcggcatcaa catcacccgc ttccagaccc tgctggccct 780

gcaccgcagc tacctgaccc ccggcgacag cagcagcggc tggaccgccg gcgccgccgc 840

ctactacgtg ggctacctgc agccccgcac cttcctgctg aagtacaacg agaacggcac 900

catcaccgac gccgtggact gcgccctgga ccccctgagc gagaccaagt gcaccctgaa 960

gtccttcacc gtggagaagg gcatctacca gaccagcaac ttccgcgtgc agcccaccga 1020

gagcatcgtg cgcttcccca acatcaccaa cctgtgcccc ttcggcgagg tgttcaacgc 1080

cacccgcttc gccagcgtgt acgcctggaa ccgcaagcgc atcagcaact gcgtggccga 1140

ctacagcgtg ctgtacaaca gcgccagctt cagcaccttc aagtgctacg gcgtgagccc 1200

caccaagctg aacgacctgt gcttcaccaa cgtgtacgcc gacagcttcg tgatccgcgg 1260

cgacgaggtg cgccagatcg cccccggcca gaccggcaag atcgccgact acaactacaa 1320

gctgcccgac gacttcaccg gctgcgtgat cgcctggaac agcaacaacc tggacagcaa 1380

ggtgggcggc aactacaact acctgtaccg cctgttccgc aagagcaacc tgaagccctt 1440

cgagcgcgac atcagcaccg agatctacca ggccggcagc accccctgca acggcgtgga 1500

gggcttcaac tgctacttcc ccctgcagag ctacggcttc cagcccacca acggcgtggg 1560

ctaccagccc taccgcgtgg tggtgctgag cttcgagctg ctgcacgccc ccgccaccgt 1620

gtgcggcccc aagaagtcca ccaacctggt gaagaacaag tgcgtgaact tcggcagcgc 1680

cagcgacgtg gacctgggcg acatcagcgg catcaacgcc agcgtggtga acatccagaa 1740

ggagatcgac cgcctgaacg aggtggccaa gaacctgaac gagagcctga tcgacctgca 1800

ggagtaaacc agcctcaaga acacccgaat ggagtctcta agctacataa taccaactta 1860

cactttacaa aatgttgtcc cccaaaatgt agccattcgt atctgctcct aataaaaaga 1920

aagtttcttc acaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2040

aaaaaaaaaa aaa 2053

<210> 12

<211> 2566

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

acttgttctt tttgcagaag ctcagaataa acgctcaact ttggccatgg tgttcgtgtt 60

cctggtgctg ctgcccctgg tgagcagcca gtgcgtgaac ctgaccaccc gcacccagct 120

gccccccgcc tacaccaaca gcttcacccg cggcgtgtac taccccgaca aggtgttccg 180

cagcagcgtg ctgcacagca cccaggacct gttcctgccc ttcttcagca acgtgacctg 240

gttccacgcc atccacgtga gcggcaccaa cggcaccaag cgcttcgaca accccgtgct 300

gcccttcaac gacggcgtgt acttcgccag caccgagaaa agcaacatca tccgcggctg 360

gatcttcggc accaccctgg acagcaagac ccagagcctg ctgatcgtga acaacgccac 420

caacgtggtg atcaaggtgt gcgagttcca gttctgcaac gaccccttcc tgggcgtgta 480

ctaccacaag aacaacaaga gctggatgga gagcgagttc cgcgtgtaca gcagcgccaa 540

caactgcacc ttcgagtacg tgagccagcc cttcctgatg gacctggagg gcaagcaggg 600

caacttcaag aacctgcgcg agttcgtgtt caagaacatc gacggctact tcaagatcta 660

cagcaagcac acccccatca acctggtgcg cgacctgccc cagggcttca gcgccctgga 720

gcccctggtg gacctgccca tcggcatcaa catcacccgc ttccagaccc tgctggccct 780

gcaccgcagc tacctgaccc ccggcgacag cagcagcggc tggaccgccg gcgccgccgc 840

ctactacgtg ggctacctgc agccccgcac cttcctgctg aagtacaacg agaacggcac 900

catcaccgac gccgtggact gcgccctgga ccccctgagc gagaccaagt gcaccctgaa 960

gtccttcacc gtggagaagg gcatctacca gaccagcaac ttccgcgtgc agcccaccga 1020

gagcatcgtg cgcttcccca acatcaccaa cctgtgcccc ttcggcgagg tgttcaacgc 1080

cacccgcttc gccagcgtgt acgcctggaa ccgcaagcgc atcagcaact gcgtggccga 1140

ctacagcgtg ctgtacaaca gcgccagctt cagcaccttc aagtgctacg gcgtgagccc 1200

caccaagctg aacgacctgt gcttcaccaa cgtgtacgcc gacagcttcg tgatccgcgg 1260

cgacgaggtg cgccagatcg cccccggcca gaccggcaag atcgccgact acaactacaa 1320

gctgcccgac gacttcaccg gctgcgtgat cgcctggaac agcaacaacc tggacagcaa 1380

ggtgggcggc aactacaact acctgtaccg cctgttccgc aagagcaacc tgaagccctt 1440

cgagcgcgac atcagcaccg agatctacca ggccggcagc accccctgca acggcgtgga 1500

gggcttcaac tgctacttcc ccctgcagag ctacggcttc cagcccacca acggcgtggg 1560

ctaccagccc taccgcgtgg tggtgctgag cttcgagctg ctgcacgccc ccgccaccgt 1620

gtgcggcccc aagaagtcca ccaacctggt gaagaacaag cgcgtgcagc ccaccgagag 1680

catcgtgcgc ttccccaaca tcaccaacct gtgccccttc ggcgaggtgt tcaacgccac 1740

ccgcttcgcc agcgtgtacg cctggaaccg caagcgcatc agcaactgcg tggccgacta 1800

cagcgtgctg tacaacagcg ccagcttcag caccttcaag tgctacggcg tgagccccac 1860

caagctgaac gacctgtgct tcaccaacgt gtacgccgac agcttcgtga tccgcggcga 1920

cgaggtgcgc cagatcgccc ccggccagac cggcaagatc gccgactaca actacaagct 1980

gcccgacgac ttcaccggct gcgtgatcgc ctggaacagc aacaacctgg acagcaaggt 2040

gggcggcaac tacaactacc tgtaccgcct gttccgcaag agcaacctga agcccttcga 2100

gcgcgacatc agcaccgaga tctaccaggc cggcagcacc ccctgcaacg gcgtggaggg 2160

cttcaactgc tacttccccc tgcagagcta cggcttccag cccaccaacg gcgtgggcta 2220

ccagccctac cgcgtggtgg tgctgagctt cgagctgctg cacgcccccg ccaccgtgtg 2280

cggccccaag aagtccacca acctggtgaa gaacaagtaa accagcctca agaacacccg 2340

aatggagtct ctaagctaca taataccaac ttacacttta caaaatgttg tcccccaaaa 2400

tgtagccatt cgtatctgct cctaataaaa agaaagtttc ttcacaaaaa aaaaaaaaaa 2460

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2520

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 2566

<210> 13

<211> 4165

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

acttgttctt tttgcagaag ctcagaataa acgctcaact ttggccggat ccgccatgtt 60

cgtgttcctg gtgctgctgc ccctggtgag cagccagtgc gtgaacctga ccacccgcac 120

ccagctgccc cccgcctaca ccaacagctt cacccgcggc gtgtactacc ccgacaaggt 180

gttccgcagc agcgtgctgc acagcaccca ggacctgttc ctgcccttct tcagcaacgt 240

gacctggttc cacgccatcc acgtgagcgg caccaacggc accaagcgct tcgacaaccc 300

cgtgctgccc ttcaacgacg gcgtgtactt cgccagcacc gagaagtcca acatcatccg 360

cggctggatc ttcggcacca ccctggacag caagacccag agcctgctga tcgtgaacaa 420

cgccaccaac gtggtgatca aggtgtgcga gttccagttc tgcaacgacc ccttcctggg 480

cgtgtactac cacaagaaca acaagagctg gatggagagc gagttccgcg tgtacagcag 540

cgccaacaac tgcaccttcg agtacgtgag ccagcccttc ctgatggacc tggagggcaa 600

gcagggcaac ttcaagaacc tgcgcgagtt cgtgttcaag aacatcgacg gctacttcaa 660

gatctacagc aagcacaccc ccatcaacct ggtgcgcgac ctgccccagg gcttcagcgc 720

cctggagccc ctggtggacc tgcccatcgg catcaacatc acccgcttcc agaccctgct 780

ggccctgcac cgcagctacc tgacccccgg cgacagcagc agcggctgga ccgccggcgc 840

cgccgcctac tacgtgggct acctgcagcc ccgcaccttc ctgctgaagt acaacgagaa 900

cggcaccatc accgacgccg tggactgcgc cctggacccc ctgagcgaga ccaagtgcac 960

cctgaagtcc ttcaccgtgg agaagggcat ctaccagacc agcaacttcc gcgtgcagcc 1020

caccgagagc atcgtgcgct tccccaacat caccaacctg tgccccttcg gcgaggtgtt 1080

caacgccacc cgcttcgcca gcgtgtacgc ctggaaccgc aagcgcatca gcaactgcgt 1140

ggccgactac agcgtgctgt acaacagcgc cagcttcagc accttcaagt gctacggcgt 1200

gagccccacc aagctgaacg acctgtgctt caccaacgtg tacgccgaca gcttcgtgat 1260

ccgcggcgac gaggtgcgcc agatcgcccc cggccagacc ggcaagatcg ccgactacaa 1320

ctacaagctg cccgacgact tcaccggctg cgtgatcgcc tggaacagca acaacctgga 1380

cagcaaggtg ggcggcaact acaactacct gtaccgcctg ttccgcaaga gcaacctgaa 1440

gcccttcgag cgcgacatca gcaccgagat ctaccaggcc ggcagcaccc cctgcaacgg 1500

cgtggagggc ttcaactgct acttccccct gcagagctac ggcttccagc ccaccaacgg 1560

cgtgggctac cagccctacc gcgtggtggt gctgagcttc gagctgctgc acgcccccgc 1620

caccgtgtgc ggccccaaga agtccaccaa cctggtgaag aacaagtgcg tgaacttcaa 1680

cttcaacggc ctgaccggca ccggcgtgct gaccgagagc aacaagaagt tcctgccctt 1740

ccagcagttc ggccgcgaca tcgccgacac caccgacgcc gtgcgcgacc cccagaccct 1800

ggagatcctg gacatcaccc cctgcagctt cggcggcgtg agcgtgatca cccccggcac 1860

caacaccagc aaccaggtgg ccgtgctgta ccaggacgtg aactgcaccg aggtgcccgt 1920

ggccatccac gccgaccagc tgacccccac ctggcgcgtg tacagcaccg gcagcaacgt 1980

gttccagacc cgcgccggct gcctgatcgg cgccgagcac gtgaacaaca gctacgagtg 2040

cgacatcccc atcggcgccg gcatctgcgc cagctaccag acccagacca acagcccccg 2100

ccgcgcccgc agcgtggcca gccagagcat catcgcctac accatgagcc tgggcgccga 2160

gaacagcgtg gcctacagca acaacagcat cgccatcccc accaacttca ccatcagcgt 2220

gaccaccgag atcctgcccg tgagcatgac caagaccagc gtggactgca ccatgtacat 2280

ctgcggcgac agcaccgagt gcagcaacct gctgctgcag tacggcagct tctgcaccca 2340

gctgaaccgc gccctgaccg gcatcgccgt ggagcaggac aagaacaccc aggaggtgtt 2400

cgcccaggtg aagcagatct acaagacccc ccccatcaag gacttcggcg gcttcaactt 2460

cagccagatc ctgcccgacc ccagcaagcc cagcaagcgc agcttcatcg aggacctgct 2520

gttcaacaag gtgaccctgg ccgacgccgg cttcatcaag cagtacggcg actgcctggg 2580

cgacatcgcc gcccgcgacc tgatctgcgc ccagaagttc aacggcctga ccgtgctgcc 2640

ccccctgctg accgacgaga tgatcgccca gtacaccagc gccctgctgg ccggcaccat 2700

caccagcggc tggaccttcg gcgccggcgc cgccctgcag atccccttcg ccatgcagat 2760

ggcctaccgc ttcaacggca tcggcgtgac ccagaacgtg ctgtacgaga accagaagct 2820

gatcgccaac cagttcaaca gcgccatcgg caagatccag gacagcctga gcagcaccgc 2880

cagcgccctg ggcaagctgc aggacgtggt gaaccagaac gcccaggccc tgaacaccct 2940

ggtgaagcag ctgagcagca acttcggcgc catcagcagc gtgctgaacg acatcctgag 3000

ccgcctggac aaggtggagg ccgaggtgca gatcgaccgc ctgatcaccg gccgcctgca 3060

gagcctgcag acctacgtga cccagcagct gatccgcgcc gccgagatcc gcgccagcgc 3120

caacctggcc gccaccaaga tgagcgagtg cgtgctgggc cagagcaagc gcgtggactt 3180

ctgcggcaag ggctaccacc tgatgagctt cccccagagc gccccccacg gcgtggtgtt 3240

cctgcacgtg acctacgtgc ccgcccagga gaagaacttc accaccgccc ccgccatctg 3300

ccacgacggc aaggcccact tcccccgcga gggcgtgttc gtgagcaacg gcacccactg 3360

gttcgtgacc cagcgcaact tctacgagcc ccagatcatc accaccgaca acaccttcgt 3420

gagcggcaac tgcgacgtgg tgatcggcat cgtgaacaac accgtgtacg accccctgca 3480

gcccgagctg gacagcttca aggaggagct ggacaagtac ttcaagaacc acaccagccc 3540

cgacgtggac ctgggcgaca tcagcggcat caacgccagc gtggtgaaca tccagaagga 3600

gatcgaccgc ctgaacgagg tggccaagaa cctgaacgag agcctgatcg acctgcagga 3660

gctgggcaag tacgagcagt acatcaagtg gccctggtac atctggctgg gcttcatcgc 3720

cggcctgatc gccatcgtga tggtgaccat catgctgtgc tgcatgacca gctgctgcag 3780

ctgcctgaag ggctgctgca gctgcggcag ctgctgcaag ttcgacgagg acgacagcga 3840

gcccgtgctg aagggcgtga agctgcacta caccggcagg aagaggagtc acgcaggcta 3900

ccagactatc tagggtacca ccagcctcaa gaacacccga atggagtctc taagctacat 3960

aataccaact tacactttac aaaatgttgt cccccaaaat gtagccattc gtatctgctc 4020

ctaataaaaa gaaagtttct tcacaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4080

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4140

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 4165

Claims

1.一种疫苗，其特征在于，所述疫苗的活性成分为mRNA-1083，所述mRNA-1083包括依次连接的5’-UTR、目的基因的mRNA和3’-UTR和Poly A，所述5’-UTR的序列为序列表中序列7的第1至46位中的T替换为U所得到的序列；所述3’-UTR的序列为序列表中序列7的第818至943位中的T替换为U所得到的序列；所述Poly A的序列为序列表中序列7的第944至1063位中的T替换为U所得到的序列。

2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述目的mRNA的基因编码区为如下（1）-（6）中的任一所示：

（1）序列表中序列7的第47至817位中的T替换为U所得到的序列；

（2）序列表中序列9的第47至1444位中的T替换为U所得到的序列；

（3）序列表中序列10的第47至1675位中的T替换为U所得到的序列；

（4）序列表中序列11的第47至1807位中的T替换为U所得到的序列；

（5）序列表中序列12的第47至2320位中的T替换为U所得到的序列；

（6）序列表中序列13的第56至3913位中的T替换为U所得到的序列。

3.根据权利要求1-2任一所述的疫苗，其特征在于，所述mRNA-1083的5’端连接有Cap结构。

4.权利要求1-3中任一所述疫苗在制备新型冠状肺炎疫苗产品中的应用。

5.权利要求1-3中任一所述的mRNA-1083。

6.权利要求5所述的mRNA-1083在如下任一中的应用：

1）制备mRNA疫苗；

2）制备mRNA抗体。

7.一种与权利要求1-3任一所述的疫苗相关的生物材料，其特征在于，所述生物材料为B1)-B6)中的任一种：

B1)编码权利要求1中所述mRNA-1083的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因细胞系。

8.根据权利要求7所述的生物材料，其特征在于，所述重组载体为C1)-C6)中的任一种：

C1）将序列表中序列7的所示序列插入到载体pcDNA3.1（+）的NheI--XhoI位点之间，并保持载体其他位点不变的序列；

C2）将序列表中序列9的所示序列插入到载体pcDNA3.1（+）的NheI--XhoI位点之间，并保持载体其他位点不变的序列；

C3）将序列表中序列10的所示序列插入到载体pcDNA3.1（+）的NheI--XhoI位点之间，并保持载体其他位点不变的序列；

C4）将序列表中序列11的所示序列插入到载体pcDNA3.1（+）的NheI--XhoI位点之间，并保持载体其他位点不变的序列；

C5）将序列表中序列12的所示序列插入到载体pcDNA3.1（+）的NheI--XhoI位点之间，并保持载体其他位点不变的序列；

C6）将序列表中序列13的所示序列插入到载体pcDNA3.1（+）的NheI--XhoI位点之间，并保持载体其他位点不变的序列。

9.权利要求7-8中任一所述生物材料在制备疫苗产品中的应用。