CN118109494A - 一种构建含有mRNA体外转录元件的通用型mRNA体外转录模版骨架 - Google Patents

一种构建含有mRNA体外转录元件的通用型mRNA体外转录模版骨架 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种可以体外构建mRNA转录本的质粒骨架，具体的来说本发明提供了一种用于体外构建mRNA转录本的通用型骨架，广泛用于各种体外转录mRNA疫苗的制备和优化。此质粒骨架能够有效增强mRNA疫苗的稳定性及相关蛋白的翻译活性，从而保证了mRNA疫苗和核酸药物的稳定性和效用性。使用本发明的通用型体外转录骨架可加快对各类传染性疾病mRNA疫苗，及治疗性mRNA药物的研发制备。

Description

一种构建含有mRNA体外转录元件的通用型mRNA体外转录模版 骨架
技术领域
本发明属于纳米生物预防医学领域，具体涉及一种含有mRNA体外转录元件的mRNA体外转录模版的构建及其在mRNA序列优化中的应用。
背景技术
mRNA疗法在传染性疾病预防和癌症免疫治疗领域具有重大前景，其在应对这些医学挑战方面的潜力在30多年就得到了认可。2018年美国食品药品监督管理局（FAD）批准了首个具有里程碑意义的mRNA治疗药物Onpattro™，用于治疗遗传性淀粉样变性，标志着一个关键时刻，正式将mRNA疗法引入制药市场。2020美国紧急获批上市的两款mRNA疫苗，重新点燃了人们对mRNA治疗技术的研究兴趣和探索。
mRNA疫苗的成功研发和应用关键取决于两项技术的突破：体外转录（IVT）中的mRNA结构序列的优化和化学性修饰，以及高效mRNA递送载体的设计和发现。其中mRNA 序列的设计和优化是mRNA疗法中最为核心和关键的方面，也和mRNA疗法效果和mRNA疫苗的预防性密不可分。序列的设计和优化至关重要，它影响mRNA体外转录的产量，mRNA分子的免疫原性，翻译效率和mRNA分子的稳定性。mRNA序列设计的目的主要是提高蛋白表达的强度，增加蛋白的存留时间，减少mRNA分子的使用剂量，降低药物的成本。
目前RNA的序列可以通过多种方式获取，体外转录技术（in vitro transcribed,IVT）在mRNA序列的获取中最为广泛，IVT mRNA是指以DNA为模板,由RNA聚合酶在无细胞体系下催化转录出的mRNA。IVT mRNA序列包括五个部分5＇Cap（帽子结构）、5＇UTR（非编码区域）、ORF（编码蛋白的开放阅读框）、3＇UTR（非编码区域）和3＇poly A尾巴（多聚腺苷酸尾巴），帽子结构可以参与阻止IVT mRNA被核酸外切酶降解，降低mRNA的免疫原性，调解mRNA的半衰期以及翻译调控等过程，现已有专门的加帽试剂盒可以对IVT mRNA进行体外加帽，5＇UTR和3＇UTR参与调控翻译，增加mRNA稳定性，辅助蛋白产物的定位，因此需要对其序列进行针对性的优化和选择，ORF的设计设计密码子的优化及信号肽的选择。
基于以上的要求，本发明设计了一种具备IVT mRNA所必须元件通用型质粒载体骨架
用于制备副作用更低免疫原性更高的mRNA疫苗及mRNA治疗性药物。
发明内容
本发明的目的在于构建一种含有mRNA体外转录必须原件的通用型骨架，在于通过采用相关抗原的基因序列的替换增加mRNA疫苗及mRNA药物的泛用性，同时可增强相关目的蛋白的表达量，减少在体内潜在的副作用，借助通用型的骨架可进一步加快对多种传染性疾病的研发。
在本发明的第一方面，提供了一种通用型骨架的用途，所述泛用性骨架用于构建mRNA转录本，其中，所述转录本包括待表达的ORF序列以及位于所述ORF序列两侧的5＇UTR区域和3＇UTR区域，其中所述5＇UTR区域和3＇UTR区域中可替换为其他高表达蛋白的不同物种基因的UTR。
在另一优选例中，所述的mRNA转录本包括mRNA疫苗中的mRNA转录本。
在另一优选例中，所述抗体基因的UTR保守序列的核苷酸序列如SEQID NO：1或3
在另一优选例中，所述抗体基因的UTR保守序列包括5’抗体保守序列和3’抗体保守序列。
在另一优选例中，所述5’抗体保守序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在另一优选例中，所述3’抗体保守序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在本发明的第二方面，提供了一种通用型骨架，所述通用型骨架具有式I结构：
Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10-Z11(Ⅰ)
式中，
Z1、Z3、Z5、Z7、Z9或Z11为无或酶切位点；
Z2为5＇UTR区域；
Z4为信号肽序列；
Z6为可替换的ORF区；
Z8为3＇UTR区域；
Z10为polyA尾部元件。
在另一优选例中，所述Z1、Z3、Z5、Z7、Z9、Z11为平末端酶切位点或粘性末端酶切位点。
在另一优选例中，所述通用型骨架包括启动子、酶切位点、5＇UTR区域、酶切位点、信号肽、酶切位点、ORF、酶切位点、3＇UTR区域、酶切位点、 polyA、酶切位点。
在另一优选例中，所述粘性末端酶选自下组：SacI、EcoRI、HindIII、XhoI、或其组合。
在另一优选例中，所述Z6可替换为选自下组的基因：猫传染性腹膜炎病毒的N蛋白、猫细小病毒的S蛋白、猫瘟病毒的S蛋白、狂犬病毒G蛋白、登革热病毒E蛋白、结核分支杆菌ESAT-6蛋白、Ag85A蛋白、或其组合。
在另一优选例中，所述Z6可替换为选自下组病原的抗原基因：巨细胞病毒 (CMV)、寨卡病毒(Zika)、流感病毒(Influenza)、 呼吸道合胞病毒(RSV)、狂犬病(Rabies) 、 艾滋病毒(HIV)、埃博拉病毒(Ebola virus)、链球菌 (streptococci) 、猫传染性腹膜炎病毒（Feline Infectious Peritonitis virus）疟疾 (malaria) 、岗地弓形虫 (Toxoplasmagondii)、登革热、鼠疫、黄热病、结核病、单纯疱疹病毒、带状病毒、支原体、衣原体、口蹄疫病毒、绿脓杆菌、或其组合
在另一优选例中，所述Z6被替换为猫传染性腹膜炎病毒的N蛋白。
在另一优选例中，所述Z6经过密码子优化。
在另一优选例中，所述Z6的替换方法包括同源重组和酶切。
在另一优选例中，所述Z6的终止密码子为多个终止密码子。
在另一优选例中，所述Z6的终止密码子为1个终止密码子。
在另一优选例中，所述Z10的长度较佳地为100nt-150nt，更佳地为110nt-130nt,更佳地为120nt。
在本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体含有如本发明第二方面所述的通用型骨架。
在另一优选例中，所述载体选自下组：DNA、RNA、病毒载体、质粒、转座子、其他基因转移系统，或其组合。优选地，所述载体为质粒。
在另一优选例中，所述载体为pBluscript KS II(+)载体。
在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如本发明第四方面所述的载体，或其基因组中整合有如本发明第二方面所述的通用型骨架。
在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。
在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞。
在本发明的第五方面，提供了一种工程化细胞，所述工程化细胞含有：如本发明第三方面所述的载体，或其基因组中整合有如本发明第二方面所述的通用型骨架，并且含有目的基因片段。
在另一优选例中，所述工程化细胞为Top10大肠杆菌感受态细胞。
在另一优选例中，所述目的基因片段含有EcoRI和HindIII酶切位点序列。
在另一优选例中，所述载体或通用型骨架含有EcoRI和HindIII酶切位点序列。
在另一优选例中，所述目的基因片段与所述载体或通用型骨架通过T4连接酶进行基因重组。
在另一优选例中，所述目的基因片段与所述载体或通用型骨架连接环化。
在另一优选例中，所述目的基因选自下组：巨细胞病毒 (CMV)、寨卡病毒(Zika)、流感病毒(Influenza)、 呼吸道合胞病毒(RSV)、狂犬病(Rabies) 、 艾滋病毒(HIV)、埃博拉病毒(Ebola virus)、链球菌 (streptococci) 、猫传染性腹膜炎病毒（FelineInfectious Peritonitis virus）疟疾 (malaria) 、岗地弓形虫 (Toxoplasma gondii)、登革热、鼠疫、黄热病、结核病、单纯疱疹病毒、带状病毒、支原体、衣原体、口蹄疫病毒、绿脓杆菌、或其组合。
在本发明的第六方面，提供了一种用于制备疫苗的mRNA的制备方法，即一种mRNA的制备方法，且该mRNA是用于制备疫苗用的，其包括步骤：
(a)在适合的条件下，培养如本发明第六方面所述的工程化细胞，将工程化细胞进行扩大培养，得到培养物，该培养物中含有DNA模板的载体；
(b) 从所述培养物中分离和/或回收含有DNA模板的载体，并酶切为单链DNA模板；
(c) 将 (b)中所述DNA模板纯化回收后进行体外转录，从而获得所述优化目的基因的mRNA;
(d)任选地，对步骤(c) 获得的优化mRNA进行纯化和/或修饰，添加5’帽子。
在对优化mRNA进行纯化和/或修饰时，采用现有的纯化方法、修饰方法即可。
在本发明的第七方面，提供了一种mRNA疫苗的制备方法，所述方法包括步骤：
(i)通过如本发明第七方面所述的方法获得优化mRNA;
(ii)将(i)中获得的优化mRNA与药学上可接受的载体混合，从而获得所述mRNA疫
苗或者mRNA治疗性药物。
其中，药学上可接受的载体，可采用：如脂质体纳米颗LNP，基因递送载体Lipofectamine3000，Lipofectamine2000,聚合物纳米颗粒转运体CART，外泌体exoSTNG。
在本发明的第八方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：
(a)第一质粒，所述第一质粒含有目的基因；和
(b) 第二质粒，所述第二质粒含有如本发明第二方面所述的通用型骨架；和
(c) 说明书，所述说明书描述了使用所述第一质粒和第二质粒生产可用于制备疫苗的优化mRNA的方法。
第二质粒上负载上相关病毒抗原的基因就是第一质粒，第一质粒是包含了特定病毒抗原基因序列的质粒。
其中，此处的“目的基因”，是指与该试剂盒所测试内容相对应的基因或序列。比如，若为新冠病毒试剂盒，则目的基因即为与新冠病毒相匹配的基因或序列。工程化细胞处记载的目的基因，同理。
在另一优选例中，所述说明书中还记载了使用第一质粒为模板扩增出带有相同酶切位点序列的第一片段的方法。
在另一优选例中，所述说明书中还记载了使用相同酶切位点双酶切第二质粒获得mRNA体外转录必须元件的序列片段的方法。
在另一优选例中，所述说明书中还记载了将所述第一片段和所述第二片段通过T4连接酶连接环化并转入一合适的宿主细胞的方法。
在另一优选例中，所述说明书中还记载了从所述宿主细胞获得优化mRNA的方法。
在本发明的第九方面，提供了一种mRNA疫苗组合物，所述疫苗组合物含有：
(a) 用于表达免疫原的mRNA,所述mRNA包含如本发明第二方面所述的泛用性骨架；和
(b)药学上可接受的载体。
巨细胞病毒 (CMV)、寨卡病毒(Zika)、流感病毒(Influenza)、 呼吸道合胞病毒(RSV)、狂犬病(Rabies) 、 艾滋病毒(HIV)、埃博拉病毒(Ebola virus)、链球菌(streptococci) 、猫传染性腹膜炎病毒（Feline Infectious Peritonitis virus）疟疾(malaria) 、岗地弓形虫 (Toxoplasma gondii)、登革热、鼠疫、黄热病、结核病、单纯疱疹病毒、带状病毒、支原体、衣原体、口蹄疫病毒、绿脓杆菌、或其组合
在另一优选例中，所述疫苗组合物中mRNA本身还可以充当佐剂。
在另一优选例中，所述疫苗组合物的剂型选自下组：注射剂、冻干剂。
在另一优选例中，所述疫苗组合物包括0.01～99.99%的如本发明第二方面所述的通用型骨架和0.01～99.99%的药学上可接受的载体，所述百分比为占所述疫苗组合物的质量百分比。
在本发明的第十方面，提供了一种如本发明第九方面所述的mRNA疫苗组合物， 或如本发明第五方面所述的工程化细胞的用途，其被用于制备一药物，所述药物用于预防选自下组的病原体：巨细胞病毒 (CMV)、寨卡病毒(Zika)、流感病毒(Influenza)、 呼吸道合胞病毒(RSV)、狂犬病(Rabies) 、 艾滋病毒(HIV)、埃博拉病毒(Ebola virus)、链球菌(streptococci) 、猫传染性腹膜炎病毒（Feline Infectious Peritonitis virus）、疟疾(malaria) 、岗地弓形虫 (Toxoplasma gondii)、登革热、鼠疫、黄热病、结核病、单纯疱疹病毒、带状病毒、支原体、衣原体、口蹄疫病毒、绿脓杆菌、或其组合。
本发明的有益效果在于，提供了一种通用型质粒骨架，通过构建带有可替换ORF模板骨架的质粒，能够加快mRNA疫苗的研发速度；通过在mRNA体外转录必须元件上添加酶切位点可替换选择合适的UTR，信号肽和PolyA尾作为通用型质粒骨架的可变部分，根据不同的抗原序列选择最优组合元件，增强了mRNA的稳定性和翻译活性，主要是保证了该质粒骨架的通用型性和 mRNA疫苗的稳定性。
附图说明
图1为本发明中的通用型载体的结构示意图；
图2为本发明中构建的含有猫传染性腹膜炎N蛋白（FIPV N）mRNA体外转录质粒的示意图；
图3为本发明中构建的含有绿色荧光蛋白（EGFP）mRNA体外转录质粒的示意图；
图4为本发明中优化前后mRNA转录必须元件的二级结构示意图；
图5为本发明中优化前后mRNA转录必须元件的键能大小自由能示意图；
其中，图4、图5的左图为未进行优化前mRNA转录必须元件二级结构示意图及键能大小自由能为-47.6 kcal/mol，图4、图5的右图为序列优化后mRNA体外转录必须元件二级结构示意图和优化后的自由能为-51.6 kcal/mol，从两个图中可以看出序列优化后自由能明显降低二级结构减少。
图6为本发明中ORF区优化前后目的基因序列FIPV N的序列的示意图；
图7为本发明中ORF区优化前后的GC含量变化示意图；
从图7可以看出，对FIPV N基因的CDS区域优化前后的序列和优化前CAI指数从0.46上升为0.83，优化后GC的含量增加为52.96；
图8为本发明中以PUC57-EGFP为模版扩增出的EGFP基因序列、及通过EcoRI和HindIII双酶切后获取的EGFP基因的电泳鉴定示意图；
图9为本发明中pBluscript KS II(+)-FIPV N质粒双酶切产物凝胶图；
图10为本发明中纯化后的EGFP和回收纯化含有mRNA体外转录元件的线性质粒凝胶图；
图11为本发明中转化出的单克隆阳性菌落pBluscript KS II(+)-EGFP质粒示意图；
图12为本发明中单克隆测序正确的部分质粒图谱的示意图；
图13为本发明中pBluscript KS II(+)-EGFP和pBluscript KS II(+)-FIPV N质粒XhoI单酶结果、以线性化的pBluscript KS II(+)-EGFP和pBluscript KS II(+)-FIPV N质粒为模版体外转录的到的EGFP-mRNA和FIPV N-mRNA的凝胶图；
图14为本发明中将EGFP-mRNA转入哺乳动物细胞，转染12h，EGFP(绿色荧光蛋白)表达情况示意图；
图15为本发明中将EGFP-mRNA转入哺乳动物细胞，转染24h，EGFP(绿色荧光蛋白)表达情况示意图；
图16为本发明中将FIPV N-mRNA转染哺乳动物细胞，FIPV N蛋白（猫传染性腹膜炎核衣壳蛋白）的表达情况示意图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，并经过大量的筛选，首次开发了一种通用型含有mRNA体外转录必须元件的通用型骨架，用于构建mRNA转录本，从而获得稳定性和翻译活性提高的优化mRNA,从而实 现在mRNA疫苗制备和/或优化等方面的应用。使用本发明的泛用性骨架可加快对多种传染性疾病的mRNA疫苗研发。在此基础上完成了本发明
术语
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。
如本文所用，“本发明的通用性骨架”、“通用型骨架”、“本发明的骨架”、“骨架”可互换使用，均指包含酶切位点、信号肽序列、UTR区域、ORF区和PloyA尾巴序列的可替换的用于构建mRNA转录本的骨架。“ 5＇UTR区”、“ 5＇UTR区域”、“ 5＇UTR元件”可互换使用，“3＇UTR区”、“3＇UTR区域”、“3＇UTR元件”可互换使用。
通用型骨架及表达载体；
如本文所用，术语“本发明的通用型骨架”、“本发明的骨架”可互换使用，指本发明第二方面中所述的通用型骨架。
该通用型骨架用于构建mRNA转录本，所述的mRNA转录本包括代表达的ORF序列及位于所述ORF序列两侧的5＇UTR区域和3＇UTR区域。
该ORF序列是现有序列，其可以从NCBI基因数据库中根据需要下载对应的基因序列即可。
典型地，本发明的通用型骨架具有式I结构：
Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10-Z11(I)
其中，Z1～Z11如上所述；
Z1、Z3、Z5、Z7、Z9或Z11为无或酶切位点；此处的“无”，表示没有这个区域，比如Z1为无时，骨架结构为：Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10-Z11。
Z2为5＇UTR区域；
Z4为信号肽序列；Z6为ORF区；
Z8为3＇UTR区域；
Z10为polyA尾部元件。
其中，
一种代表性的含有本发明泛用性骨架的载体的结构示意图如图1所示。
应理解，适合用本发明的泛用性骨架表达的蛋白或多肽没有特别限制，包括抗原蛋白或抗原肽，或其他有用的蛋白。在本发明中，可将外源蛋白的ORF置于本发明通用型骨架之中，从而实现高效的表达。
mRNA疫苗类型；
mRNA 疫苗分为自我扩增RNA(self-amplifying RNA,saRNA)和非扩增RNA(non-replicating mRNA)。经典的非扩增RNA疫苗，包括cap帽子、5’非编码区(5’-untranslated
regions,5＇UTR区域) 、 开放阅读框(open reading frame,ORF) 、3’ 非编码区(3'-untranslated
regions,3＇UTR区域)和多聚A尾 (polyA tail) 。ORF区负责编码抗原表达，但以上5个区域共同 决定mRNA的稳定性、表达活性和免疫原性。
而saRNA的结构来源于a病毒基因组。saRNA疫苗利用a病毒的基因组能够自我复制的特性使进入体细胞的DNA或RNA先自我扩增，再转录出抗原编码mRNA。saRNA疫苗目前有以DNA质粒为基础的saRNA和病毒样颗粒递送的saRNA两种。基于saRNA,Beissert等人还发展了转基因扩增RNA(trans-amplifying RNA,taRNA),其将编码抗原的基因放在a病毒基因组中，增加了疫苗的安全性。与自我扩增RNA相比，非扩增RNA具有更小，表达抗原更特异不引起非特异性免疫的特点。
mRNA疫苗免疫原性；
mRNA疫苗的一大挑战是减少外源mRNA本身的免疫原性。自然情况下，外源mRNA进入细胞后，能够被维甲酸诱导基因I(retinoic acid-iinducible gene I,RIG-I)识别，激活固有免疫反应，进而被降解。体外转录(in vitro transcription,IVT)mRNA能够激活免疫细胞和Toll样受体(Toll-like receptor)介导的炎症反应。mRNA的U富集(U-rich)序列是激活Toll样受体的关键因素。通过核苷酸化学修饰、添加polyA尾和优化mRNA GC含量等均能够减少mRNA的免疫原性。
化学修饰的核苷酸包括5-甲基胞苷(5-methylcytidine,m5C)、5- 甲基尿苷(5-methyluridine,m5U) 、N1-甲基腺苷(N1-methyladenosine,mlA) 、N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A) 、2-硫尿核苷(2-thiouridine,s2U) 、5-氧甲基尿苷(5-methoxyuridine,5moU) 、假尿苷 (pseudouridine,ψ)和N1-甲基假尿苷(N1-methylpseudouridine,mly)。
此外，添加polyA尾也能减少U含量进而减小mRNA的免疫原性。CureVac 和AcuitaTherapeutics公司尝试通过脂质纳米颗粒运输红细胞生成素编码mRNA进入猪体内，该mRNA 具有较高GC含量，结果能够引起红细胞生成素相关反应而没有免疫原性。然而，过高的GC含量会抑制mRNA的翻译活性，这也是疫苗研发过程中需要注意的。
mRNA的纯化方式在减少mRNA自身的免疫原性中也相当重要。目前常用的纯化方法包括高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)、阴离子交换色谱法、亲和色谱法和粒子大小分离法。纯化的目的主要是去除截短的转录本。 一个好的例子 是Pardi等人设计的通过HPLC纯化mlψ修饰的编码抗HIV-1抗体的mRNA通过脂质纳米颗粒 (lipid nanoparticles,LNP)帮助小鼠避免了HIV-1的感染。
mRNA的序列优化；
mRNA的序列优化是帮助mRNA稳定的方法之一。mRNA的5'UTR和3'UTR的序列优化能够增加mRNA的半衰期和翻译活性。Cap结构采用不同的类似物能够增加mRNA的稳定性，利用牛痘病毒加帽系统使mRNA的5’端加上Cap结构能够比不同形式的Cap类似物有更好的效能。mRNA的polyA尾的稳定mRNA效果也是非常重要的，有研究去除了mRNA的polyA使得mRNA极度不稳定，同时也降低了mRNA的多聚核糖体数目、延伸速度和翻译轮数。因而polyA对mRNA 的稳定和有效翻译至关重要。另外，核苷酸的修饰和密码子的同义替换也能影响mRNA的稳定性和翻译活性。 同时序列的优化可能影响mRNA的二级结构和翻译后修饰。此外，增加mRNA的GC含量也能增加mRNA稳定性。综上所述，5'UTR、3'UTR、5'Cap、polyA尾、密码子优化和GC含量是增强 mRNA稳定性的所有可调节位点。
mRNA递送；
mRNA目前的递送方法有很多，科学家们建立了脂质体运输、聚合物运输、肽链运输、病毒样复制子颗粒运输和阳离子纳米乳化剂运输等方法，此外裸mRNA也能够被直接注射进细胞。在研的mRNA疫苗最常用的递送方法是脂质纳米颗粒(lipidnanoparticles LNP)运输。该方法具有毒性小、递送效率高等优势。
mRNA疫苗激活固有免疫和适应性免疫；
mRNA疫苗通过在体细胞内表达抗原，并通过抗原呈递系统呈递，能够激活固有免疫系统和适应性免疫系统。mRNA直接被体细胞内的模式识别受体如TLR识别会导致mRNA的降解，同时能够增强IFN通路。
mRNA疫苗通过激发适应性免疫反应发挥主要作用。mRNA翻译出的抗原，通过MHC-I直接呈递激活CD4+T细胞(Helper T细胞)或抗原分泌后，其他细胞吞噬后以MHC-II通路呈递抗原激活CD8+T细胞(细胞毒性T细胞)。抗原表达于细胞表面后也能够被B细胞受体识别激活B细胞的抗体表达和记忆B细胞形成，进而引起感染细胞凋亡和病原体的中和。
mRNA 接种后产生适应性免疫反应的事件；
(a)疫苗的含mRNA颗粒被注射部位局部细胞吸收后，mRNA被模式识别受体识别，同时也开始翻译抗原，导致注射部位的局部炎症，促进免疫细胞的浸润，包括中性粒细胞、单核细胞、髓系树突状细胞(myeloid dendritic cells,MDCs) 和浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cells,PDCs)。中性粒细胞可以有效地吸收LNPs,但单核细胞和MDCs更有效地翻译mRNA。I型干扰素(interferon,IFN)的分泌受到刺激。
(b)mRNA/LNP和蛋白质抗原将传播，细胞将迁移到接种疫苗的淋巴结。
(c)抗原呈递到T细胞和抗原与B细胞的相互作用发生的导致生发中心的形成，记忆 B细胞和生产抗体的浆细胞在此产生，这些细胞驻留在骨髓中。
mRNA疫苗面对传染性疾病的优势；
由于mRNA疫苗的机制是通过将编码抗原蛋白的mRNA接种到宿主，然后在体内细胞中利用宿主的遗传物质进行表达合成抗原蛋白，通过抗原蛋白诱导和激活机体的免疫系统产生免疫反应，从而达到预防和治疗疾病的目的。其独特的优势为：1)所有生产过程的监测和质控可以轻松实现；2)mRNA的研发和生产周期短，容易实现量产，疫苗的产能较高，这对快速应对全球范围的新发传染病至关重要；3)mRNA由于自身的特性，免疫后能很快降解，安全风险较低；4)免疫效力好，能够同时诱导产生体液免疫和细胞免疫，对目前没有较好疫苗的传染性疾病而言可能存在研发出更有效疫苗的潜力。
mRNA疫苗优化策略；
mRNA疫苗发挥作用需要面对的挑战包括：1)延长自身半衰期，增强稳定性；2)增强翻译活性；3)减少mRNA的免疫原性，避免被快速清除。
达到这些作用的方法就是设计特殊的5'UTR、3'UTR、特别是对ORF区序列的优化和polyA 数量的选择等。对于5'UTR和3'UTR的设计，有三种有效的手段：(1)采用高表达的人类基因的UTR; (2)使用抗原蛋白自身的UTR; (3) 指数富集配体系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)。前两种方法均较为简单，第三种方法相对复杂，要求通过体外实验不断尝试并优化序列，因此需要很长时间，但第三种方法仍是时间充裕时的最佳选择。
目前已经FDA批准上市的辉瑞(Pfizer/BioNTech)的BNT162b2疫苗的5'UTR采用了人α珠蛋白的5'UTR并优化了Kozak序列和5’端序列，调整了5'UTR的二级结构，而莫得纳(Moderna) 的mRNA-1273疫苗的5'UTR则采用了其通过计算机设计并优化的序列。对于 3'UTR, 莫得那的mRNA-1273疫苗采用了人α珠蛋白(HBA1)的3'UTR中的110nt 碱基，而辉瑞的BNT162b2疫苗采用了基于自然基因进行SELEX的方法，挑选出了人12S rRNA(mtRNR1)和AES/TLE5基因的3'UTR。辉瑞疫苗在此基础上选用了AES 3'UTR的136nt 序列并进行了两个C→型的改变，随后接续139nt的mtRNR1序列。目前真正有效的UTR设计方法还是借鉴自然基因并基于经验进行优化(PMID:34358150)。
此外，在抗原蛋白的终止密码子后加入1-2个终止密码子的方法也被采用，以更有效的翻译延伸复合物解聚，利于mRNA的翻译和稳定。辉瑞的BNT162b2疫苗采用了终止信号UGAUGA,而莫得那的mRNA-1273疫苗采用了UGAUAAUAG。
polyA的数量是影响mRNA稳定性的重要因素，80nt-150nt或100nt-150nt为宜，更佳地120nt。适宜数量的polyA数量能够比不适宜数量的mRNA具有更高的蛋白表达能力和mRNA 稳定性。
感染性疾病mRNA疫苗；
本发明的构建mRNA转录本的骨架可用于构建针对感染性疾病的mRNA疫苗。
采用本发明mRNA转录本的骨架的疫苗可适用于各种不同的病原体，代表性的病原体包括(但并不限于):冠状病毒(如新冠病毒)、巨细胞病毒 (CMV)、寨卡病毒(Zika)、流感病毒(Influenza)、 呼吸道合胞病毒(RSV)、狂犬病(Rabies) 、 艾滋病毒(HIV)、埃博拉病毒(Ebola virus)、链球菌 (streptococci) 、猫传染性腹膜炎病毒（Feline InfectiousPeritonitis virus）、疟疾 (malaria) 、岗地弓形虫 (Toxoplasma gondii)。
此外，很多感染性疾病缺乏有效的灭活疫苗和重组蛋白疫苗，因而可能寄希望于mRNA疫苗能否激发人体对这些病原体的预防性免疫，进而研发出有效的疫苗。这些疾病包括登革热(现有疫苗只能保护一种血清型)、鼠疫、黄热病、结核疫苗、单纯疱疹病毒、带状病毒、支原体、衣原体、口蹄疫病毒等，还可以用于一些抗肿瘤药物的治疗中。
为提高UTR的泛用性并减少免疫原性，发明人还采用了人体广泛表达的高蛋白的基因的UTR作为原始UTR。 在本发明中，优选的5'UTR和3'UTR是经序列优化的UTR,优选了自人羟基类固醇 17-β脱氢酶 4 基因 （HSD17B4） 的 5'UTR和来自人蛋白酶体 20S 亚基β3基因（PSMB3）的 3'UTR，在之前的报道中已经证明以此体内的野生型序列做UTR时，可有效降低此mRNA序列自身免疫原性的同时增强抗原序列的表达和保护效用，因此在本通用型mRNA体外转录骨架中优选了序列优化后的HSD17B4的 5'UTR和PSMB3的 3'UTR。
本发明的主要优点包括：
(1)通过构建带有可替换ORF模板骨架的质粒，能够加快mRNA疫苗的研发速度。
(2)通过在mRNA体外转录必须元件上添加酶切位点可替换选择合适的UTR，信号肽和PolyA尾作为通用型质粒骨架的可变部分，根据不同的抗原序列选择最优组合元件，增强了mRNA的稳定性和翻译活性，主要是保证了该质粒骨架的通用型性和 mRNA疫苗的稳定性。
下面结合实施例对本发明作进一步的描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，并不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域的普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他所用实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例1：mRNA体外转录载体的构建；
从GenBank（登录号为：NC_002306.3）中检索FIPV N基因序列，选取CDS区进行人源性密码子的优化后，添加EcoRI和HindIII酶切位点，并在上游端添加5'UTR序列和IgE信号肽序列，下游端添加3'UTR序列120bp长度的ployA序列，将设计好的序列合成后插入pBluescript II KS(+)载体的SacI和XhoI酶切位点之间，如图2。
序列插入后将修饰的载体转化至感受态Top10细胞在培养物中扩增以供后续实验分析。
使用T4连接酶将回收的EGFP基因和回收的pBluescript II KS(+)体外转录载体连接后转化至大肠杆菌感受态Top10细胞中，选取阳性单克隆并送去测序以确保准确性，随后在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中扩增培养后提取正确的质粒。
实施例2：报告基因EGFP(绿色荧光蛋白)的体外扩增；
同时利用本实验室保存完整的PUC57-EGFP质粒序列，按照质粒序列，如图3所示，设计引物扩增EGFP基因，其相应的引物如下表所示：
表格1.EGFP基因序列引物的设计
按照PCR体外扩增试剂盒准备如下反应体系：
表格2.EGFP体外扩增体系
将上述配置好的反应体系涡旋10秒后混匀，置于常规PCR仪上，设置如下反应条件：95℃，5min(95℃，10sec60℃，30sec72℃，1min)×30 (循环30次)72℃，5min 通过1%琼脂糖凝胶实验检测EGFP的体外扩增结果。
实施例3：EGFP基因和mRNA体外转录载体的双酶切及纯化回收；
将上述步骤中扩增的EGFP基因和含有mRNA体外转录元件的质粒载体pBluscriptKS II(+)进行EcoRI和HindIII双酶切,根据快速性内切酶的说明书在冰上配置如下所示的反应体系：
(1)在洁净的200μl的EP管内按照顺序配置如下反应体系：
(2)将上述体系置于涡旋器上涡旋5 s, 混匀上述反应体系。
(3)将反应体系置于37℃的恒温金属浴中，反应30 min。
(4)反应结束后将混合体系置于80 ℃的恒温金属浴内反应10 min，以灭活快切酶结束反应。
(5)EGFP基因的回收采用PCR产物纯化试剂盒进行快速回收，而质粒载体的回收需要胶回收试剂盒进行载体片段的回收。
(6)按照PCR产物纯化试剂盒的说明步骤进行EGFP基因的回收。1) 将酶切后的混合反应液转移至洁净的1.5 ml 的离心管内，加入5倍体积的 Buffer B3溶液充分混匀。2)将上述反应中的混合液全部移入吸附柱内，8000 Xg 离心30 s，倒掉收集管内的液体，将吸附柱放回收集管内。3) 向吸附柱内加入500μl Wash Solution，9000 Xg离心30 s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放回收集管内，并且重复此步骤一次。4) 将空的吸附柱和收集管共同放入离心机内，9000 Xg，空转离心1 min后，取出吸附柱和管并打开吸附柱盖子室温静置约5 min 以彻底晾干吸附柱内膜。5) 在吸附膜中央滴入50μl Elution Buffer，室温静置2 min 后，9000 Xg 离心1 min后，将所得到的DNA溶液测取浓度后放置于 -20℃保存备用。6) 所纯化的EGFP 基因DNA的浓度为5 ng/μl。
(7)将质粒载体酶切后的反应产物装载至1%的琼脂糖凝胶上，在电泳液中以100 V的电压下电泳40 min，凝胶曝光仪下曝光后切取含有mRNA体外转录必须元件的目的载体胶块采用胶回收试剂盒进行目的载体的胶回收，其回收步骤如下：1) 将切取的目的胶块放入至洁净的离心管内，称取重量。2) 向胶块中加入3倍体积的溶胶液PE(胶重0.1 g ，体积视为100μl，则加入300 μl 的 PE 溶液)，放入50℃的水浴锅中溶胶10 min，期间每隔2 min温和的上下翻转离心管使胶块充分溶解。3) 将上述溶液冷却至室温后，转移至吸附柱CA5(吸附柱放入收集管内)中，室温静置2 min，12000 rpm离心60 s，倒掉收集管内的废液，将吸附柱CA5重新放回收集管内。4) 向吸附柱CA5内加入600μl漂洗液 PW，静置5 min ，12000rpm离心60 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA5重新放回收集管内，此步骤可重复一次。5) 将空的吸附柱CA5和收集管共同放入离心机内，12000 rpm，空转离心2 min后，取出吸附柱和收集管并打开吸附柱盖子室温静置约5 min 以彻底晾干吸附柱内膜。6) 将CA5吸附柱放到干净的离心管内，向吸附膜中央滴入50μl TB溶液，室温静置2 min 后，12000 rpm 离心2 min后，将所收集到的DNA溶液测取浓度后放置于 -20℃保存备用。7) 所纯化的回收的含有mRNA体外转录必须元件的目的载体的浓度为10 ng/μl。
实施例4：EGFP目的基因与mRNA体外转录载体的连接转化；
(1)取洁净的200μl小指管，在冰上准备以下反应混合物：
(2)将上述反应混合物置于涡旋器上涡旋5 s，彻底混匀上述混合物。
(3)小指管置于22℃的金属浴上孵育10 min 后结束反应。
(4)取5μl反应产物添加至含有50μl TOP 10感受态细胞的离心管中，轻轻摇晃2-3次混匀，立即冰浴静置30 min。
(5)冰浴结束后立即轻柔的将离心管放置于42℃的水浴锅中热激45 s，随后将离心管快速置于冰上2 min快速冷却至0℃，整个过程注意轻柔操作防止离心管晃动。
(6)加入不含抗生素的LB液体培养基900μl，颠倒数次混匀，37℃摇床190rpm复苏培养1 h。
(7)取100 ul复苏菌液，将其涂布至含有氨苄青霉素的固体平板上进行平板涂布。
(8)将平板正置20 min后，倒置于37℃大肠杆菌培养箱中过夜培养约14h。
实施例5：pBluscript KS II(+)-EGFP和pBluscript KS II(+)-FIPV N质粒的扩大培养；
挑选上述固体培养基中的单克隆菌落至约10ml的含氨苄霉素的LB液体培养基中200rpm，37℃的摇床扩大培养约12h后，吸取2ml菌液送去测序，从测序正确的菌液中提取pBluscript KS II(+)-EGFP和pBluscript KS II(+)-FIPV N质粒，按照质粒中提试剂盒说明书进行以下实验步骤：
(1)取10 ml过夜培养的菌液于离心管中，12000 rpm离心5 min，弃去上清液。
(2)向留有菌体的离心管中加入500μl溶液P1,涡旋振荡器涡旋震荡2 min，彻底悬浮细菌细胞沉淀。
(3)向离心管内加入500μl溶液P2，轻柔温和的上下翻转6-8次，使菌体充分裂解。
(4)向离心管中500μl溶液P4，立即温和轻柔的上下翻转6-8次，充分混匀，此时溶液中会出现白色絮状沉淀，室温静置10 min后，12000 rpm离心30 min，离心管底部出现沉淀。
(5)取离心管内的上清液分次加入过滤柱CS中(过滤柱放入收集管内)，12000 rpm离心2 min，将收集的滤液转移至洁净的2 ml的EP管内。
(6)向EP管内加入0.3倍滤液体积的异丙醇，上下颠倒混匀后转移至吸附柱CP4中(CP4最大容积为700μl，可分次转移滤液)。
(7)室温12000 rpm离心2 min，弃去收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(8)向吸附柱CP4中加入500 μl去蛋白液PD，12000 rpm离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中。
(9)向吸附柱CP4中加入600 μl漂洗液PW，12000 rpm离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4重新放入收集管中，此步骤可重复一次。
(10)12000 rpm离心2 min，以彻底去除吸附柱中的漂洗液，打开吸附柱CP4的盖子，静置于室温10 min以彻底晾干吸附柱中残余的漂洗液。
(11)将吸附柱重新放入一个洁净的离心管中，向吸附膜的中央部位悬空滴加100μl 洗脱缓冲液TB，室温静置2 min，12000 rpm离心1 min将质粒溶液收集到离心管中。
(12)经过检测pBluscript KS II(+)-EGFP质粒的浓度为1 μg/ μl和pBluscriptKS II(+)-FIPV N质粒基因DNA的浓度为800 ng/μl。
实施例7：EGFP-mRNA和FIPV N mRNA 的体外转录及纯化；
质粒的单酶切：使用快速性内切酶XhoI对pBluscript KS II(+)-EGFP质粒和pBluscript KS II(+)-FIPV N质粒进行线性化单酶切根据快速性内切酶的说明书在冰上配置如下所示的反应体系：
(1)在洁净的200μl的EP管内按照顺序配置如下反应体系：
(2)将上述体系置于涡旋器上涡旋5 s, 混匀上述反应体系。
(3)将反应体系置于37℃的恒温金属浴中，反应10 min。
(4)反应结束后将混合体系置于80 ℃的恒温金属浴内反应10 min，以灭活快切酶结束反应。
(5)线性化的质粒模版的纯化采用PCR产物纯化试剂盒进行快速回收，具体实验步骤参考实例3中步骤(6)的具体步骤。
EGFP-mRNA和FIPV N mRNA的体外转录：采用高产量的T7 RNA聚合酶进行mRNA的体外转录，其具体实验步骤如下：
(1)取无菌无酶的200μl的小指管在冰上配置以下反应体系：
将上述反应体系在涡旋仪中涡旋5 s，以充分混匀反应混合液，37℃的孵箱内孵育混合物2 h，反应结束后使用DNA酶消化模板DNA以初步纯反应产物：
(2)在上述20μl的体系中加入70μl Nuclease-free Water用于稀释结束转录的反应产物，10 μl 10×DNase I buffer，2 μl DNase I充分混匀，瞬时离心3 s，37℃孵箱中消化15 min，以去除DNA模版。LiCl沉淀法纯化转录产物EGFP-mRNA和FIPV N-mRNA：
(1)将上述100 μl的反应体系转移至无菌无酶的1.5ml的EP管中，向其中加入50μl的LiCl，充分震荡混匀，在-20℃冰箱内静置1 h。
(2)静置结束后取出EP管，放置于高速离心机中在4℃，13000 rpm离心30 min，离心结束后可见EP管底附着白色RNA沉淀。
(3)去除EP管内的上清液，加入约1 ml预冷的70%的乙醇溶液，上下吹洗沉淀3-5次，放置于4℃离心机中13000 rpm离心30 min。
(4)去除离心后的上清液，将1.5ml的EP管打开盖子放置于超净工作台内晾干沉淀约10min后，加入50μl 65℃预热的 Nuclease-free Water，反复吹打溶解白色沉淀，当RNA沉淀完全溶解时，取1μl RNA溶液稀释10倍后检测RNA溶液的浓度。
(5)经检测EGFP-mRNA溶液的浓度是1μg/μl ，FIPV N-mRNA溶液的浓度为2μg/μl。
实施例8：EGFP-mRNA和FIPV N mRNA 的体外加帽反应及纯化；
mRNA 的二级结构对mRNA的加帽效率影响较大，故采用热变性的方法减少mRNA二级结构对mRNA加帽反应的影响：
mRNA加帽步骤为：
(1)取14 μl上述反应产物调整其浓度为700 ng/μl，将其放置于65℃金属浴上热变性5 min后，立即取出放置于冰上5 min。
(2)取洁净无菌无酶的200 μl的小指管在冰上配置如下反应体系：
(3)将上述反应体系置于涡旋器中涡旋5 s，以充分混匀反应体系，混匀后放置于37℃孵箱中反应1 h。
(4)LiCl沉淀纯化RNA实验步骤参考实例7中RNA纯化步骤，经检测纯化后EGFP-mRNA和FIPV N-mRNA浓度均为500 ng/μl。
实施例9：293T细胞转染EGFP-mRNA和FIPV N mRNA；
为考察体外转录的两种mRNA在体内表达蛋白的情况，选取293T细胞以Lipofectamine3000作为转染剂转染EGFP-mRNA和FIPV N-mRNA，EGFP蛋白可通过观测绿色荧光的强度检测其表达的EGFP蛋白，而FIPV N 蛋白表达可通过使用FIPV N 蛋白的特异性抗体，采用Western blot检测蛋白的表达。
具体实验步骤为下：
(1)将293T细胞复苏后，接种于T75细胞培养瓶中，待其密度长到75%时，使用胰酶将细胞消化下来，调整细胞密度将细胞接种于六孔板中，过夜培养细胞至细胞密度长至85%时，将培养基换成无血清培养基。
(2)向两个装有125 μl Opti-MEM的1.5 ml 离心管中分别加入7.5 μlLipofectmaine3000和2.5 μg mRNA，涡旋震荡混匀后，混合两个离心管内的溶液，混匀后，在室温下静置30 min。
(3)将上述混匀的复合物逐滴、缓慢、均匀的滴加入六孔板内，随后将六孔板放置于37℃，5%CO2的孵箱中培养24 h后于倒置荧光显微镜下观测EGFP蛋白的表达情况，并拍照记录，同时收集转染FIPV N-mRNA细胞内的蛋白。
实施例10：293T细胞中EGFP和FIPV N蛋白的表达情况；
由于绿色荧光蛋白可在倒置荧光显微镜下通过蓝色激发光检测蛋白的表达情况，故只需要在倒置荧光显微镜观测EGFP蛋白的情况，而FIPV N蛋白则通过Western blot实验使用FIPV N蛋白的特异性抗体即可检测FIPV N 蛋白的表达情况，Western blot 实验具体步骤如下：细胞蛋白的裂解提取：
(1)使用预冷的PBS清洗2次293T细胞，按1ml裂解液加10 ul PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。
(2)每个六孔板内加入约100 ul含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解六孔板要经常来回摇动以充分。
(3)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行）。
(4)将离心管放置于高速离心机上在4℃，12000 rpm的条件下离心20 min。
(5)取离心后的上清液，分装至洁净的EP管内，放置于-80℃冰箱内备用。
BCA法检测蛋白的浓度：
(1)取10 ul上述实验步骤中提取的蛋白溶液，添加5倍体积的PBS稀释蛋白溶液。
(2)显色工作液配置：在15 ml离心管添加试剂A溶液7 ml，试剂B溶液140 ul，充分混合均匀。
(3)将BSA蛋白标准溶液①-⑧和待测蛋白溶液各20 ul，添加至96孔板中(蛋白标准品使用前必须充分溶解并摇匀)。
(4)每孔添加显色工作液200 ul，充分混匀，盖上盖子放置于37℃条件下孵育30min。
(5)取出96孔板冷却至室温后，使用酶标仪检测562 nm波长情况下，每孔吸光度并绘制标准浓度蛋白曲线图，根据待测蛋白溶液吸光度计算待测蛋白浓度。
(6)经计算提取蛋白浓度为5 mg/ml。
SDS-PAGE电泳：
(1)中添加1/5倍蛋白溶液体积的5 × 蛋白上样缓冲液，混匀后置于100℃的金属浴中热变性10 min，待其冷却至室温后上样。
(2)将热变性的蛋白样品加入到事先制备好的12%的SDS-PAGE凝胶中，120V条件下电泳90 min至溴酚蓝溶液到凝胶底部停止电泳。
(3)电泳结束后取出凝胶，分离玻璃板和凝胶，去除浓缩胶。
转膜：
(1)用甲醇提前浸润PVDF膜5 min，以使PVDF膜充分活化。
(2)在盘内加入适量的转膜液，将滤纸、海绵垫、转膜夹子和PVDF膜浸润，在转膜夹的黑色面依次放上海绵、滤纸、SDS-PAGE胶、PVDF膜、滤纸和海绵随后将夹子夹紧，放入转膜槽中，在冰浴，100V电压条件下转膜90 min。
封闭：转膜结束后，小心的取出PVDF膜放置到含有5%脱脂牛奶的TBST溶液(含有1%Tween 20)中进行封闭，室温封闭1 h后，随后用TBST溶液在室温摇床上清洗10 min，反复清洗三次。
抗体的孵育：
(1)封闭完成后将PVDF膜放到稀释好的一抗溶液中(一抗溶液和5%脱脂牛奶比例为1：1000)，4℃缓慢震荡过夜孵育。
(2)一抗孵育完成后，在TBST洗脱液中洗脱一抗，反复洗涤3次，每次10 min。
(3)将洗脱好的PVDF膜放到稀释好的含有HRP标记的羊抗鼠的二抗溶液中(二抗溶液和5%脱脂牛奶的比值为1:5000)，室温条件下缓慢震荡孵育1 h 。
(4)二抗孵育完成后，在TBST洗脱液中洗脱一抗，反复洗涤3次，每次10 min。
蛋白显色：
(1)使用碧云天生物公司的ECL超敏化学发光液对印记蛋白进行发光显色。
(2)将超敏试剂A液50 ul和B液50 ul等比例混合后，滴加至PVDF膜上(含有蛋白的一面)，随后在蛋白化学发光仪上曝光图像并保存图像。
以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。

Claims (10)

1.一种通用型骨架，其特征在于，所述的通用型骨架用于构建mRNA转录本，所述的mRNA转录本包括代表达的ORF序列及位于所述ORF序列两侧的5＇UTR区域和3＇UTR区域。
2.如权利要求1所述的通用型骨架，其特征在于，所述的通用型骨架具有式Ⅰ结构：
Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10-Z11(Ⅰ)式中，Z1、Z3、Z5、Z7、Z9或Z11为无或酶切位点；Z2为5＇UTR区域；
Z4为信号肽序列；Z6为ORF区；
Z8为3＇UTR区域；
Z10为polyA尾部元件。
3.一种载体，其特征在于，所述载体含有如权利要求1或2所述的通用型骨架。
4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞的基因组中包括如权利要求1或2所述的通用型骨架。
5.一种工程化细胞，其特征在于，所述工程化细胞的基因组中包括如权利要求1或2所述的通用型骨架，并且含有目的基因片段。
6.一种用于制备疫苗的mRNA的制备方法，包括步骤：(a)培养如权利要求5所述的工程化细胞，将工程化细胞进行扩大培养，得到培养物；(b)从所述培养物中分离和/或回收含有DNA模板的载体，并酶切为单链DNA模板；(c)将(b)中所述DNA模板进行转录，从而获得所述优化mRNA。
7.如权利要求6所述的产生用于制备疫苗的优化mRNA的方法，其特征在于：对步骤(c)获得的优化mRNA进行纯化和/或修饰。
8.一种mRNA疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法包括步骤：(i)通过如权利要求6或7所述的方法获得优化mRNA；(ii)将(i)中获得的优化mRNA与药学上可接受的载体混合，从而获得所述mRNA疫苗。
9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：(a)第一质粒，所述第一质粒含有目的基因；和(b)第二质粒，所述第二质粒含有如权利要求1或2所述的通用型骨架。
10.一种mRNA疫苗，其特征在于，所述疫苗组合物含有：用于表达免疫原的mRNA，所述mRNA包含如权利要求1或2所述的通用型骨架；和
药学上可接受的载体。
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