CN111218458A - 编码SARS-CoV-2病毒抗原的mRNA和疫苗及疫苗的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种编码SARS‑CoV‑2病毒抗原的mRNA和疫苗及疫苗的制备方法，涉及疫苗的技术领域。该编码SARS‑CoV‑2病毒抗原的mRNA至少含有编码SARS‑CoV‑2病毒的S蛋白和N蛋白中的至少一个蛋白，和/或至少一个蛋白的片段的编码区，该mRNA递送至体内可以使机体产生免疫反应。

Description

编码SARS-CoV-2病毒抗原的mRNA和疫苗及疫苗的制备方法

技术领域

本发明涉及疫苗技术领域，尤其是涉及一种编码SARS-CoV-2病毒抗原的mRNA和疫苗及疫苗的制备方法。

背景技术

非典型肺炎被世界卫生组织定名为COVID-19，最终确认是由一种新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的，和2003年的SARS冠状病毒(SARS-CoV)以及2012年的MERS冠状病毒(MERS-CoV)同属于冠状病毒β属。

冠状病毒为单链RNA病毒，基因组序列在所有的RNA病毒中最长(范围从26至32kb)。冠状病毒可以感染哺乳动物、鸟类和爬行动物，包括人、猪、牛、马、骆驼、猫、狗、蝙蝠等。大多数冠状病毒不会引起临床症状。SARS和MERS冠状病毒是人畜共患病原，可在人体引起严重的呼吸疾病。新型冠状病毒SARS-CoV-2与2003年“非典”SARS-CoV比对，有约70％的序列相似性，而与MERS-CoV有40％的序列相似性。目前没有特异的治疗方法，只能根据患者的临床状况进行一些对症处理。

新冠肺炎COVID-19传染性极强，确诊者中有约15％的病人是重症，目前还无特效药物。为了有效防护疫情蔓延，疫苗的开发势在必行。研究发现新型冠状病毒SARS-CoV-2在人体内感染的途径与SARS-CoV类似，病毒的棘突蛋白(Spike protein)与人的血管紧张素转化酶2(ACE2)相互作用来感染人的呼吸道上皮细胞。针对SARS，研究者尝试了类病毒、蛋白亚单位等形式来制备疫苗，在动物实验中检测到中和抗体的产生，但由于SARS疫情自2004年后没有爆发，该类疫苗没有迫切需求，所以还没有任何针对SARS的疫苗进入临床阶段。

目前还没有任何针对新冠肺炎的疫苗面世，传统疫苗采用的多为灭活病毒形式，然而，不论所使用的方法以及尽管做了技术改进，通常在其应用时有许多缺点，特别是：(1)制备工艺复杂，需要用细胞培养的方法生产病毒，存在一定的安全性隐患。(2)质量控制和工艺放大要求高，控制不好会引发产品质量事故。(3)病毒产生的有效抗原量低，为了保证效果，要求提高病毒滴度，从而增加了生产成本。因此，提供一种改进的针对新冠肺炎的疫苗是目前需要的。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种编码SARS-CoV-2病毒抗原的mRNA，该mRNA递送至体内可以使机体产生免疫反应。

本发明的第二目的在于提供一种疫苗，该疫苗包括编码上述SARS-CoV-2病毒抗原的mRNA，或与其相关的生物材料。

本发明的第三目的在于提供上述疫苗的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种编码SARS-CoV-2病毒抗原的mRNA，所述mRNA至少含有编码SARS-CoV-2病毒的S蛋白和N蛋白中的至少一个蛋白，和/或至少一个蛋白的片段的编码区。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种生物材料，所述生物材料包括如下(x1)～(x4)中的至少一种；

(x1)编码所述mRNA的DNA分子；(x2)含有(x1)的表达盒或载体；(x3)包含所述mRNA、(x1)和(x2)中至少一种的微生物；(x4)包含所述mRNA、(x1)和(x2)中至少一种的细胞。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种疫苗，该疫苗包含所述mRNA或所述生物材料。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述疫苗的制备方法，包括将所述mRNA和递送制剂混合，得到所述疫苗。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的编码SARS-CoV-2病毒抗原的mRNA至少含有编码SARS-CoV-2病毒的S蛋白和N蛋白中的至少一个蛋白，和/或至少一个蛋白的片段的编码区。该mRNA编码具有较强免疫原性的S蛋白和/或N蛋白，以及这两个蛋白中至少一个蛋白的片段，使mRNA递送至体内后能够在机体内表达S蛋白和/或N蛋白，或作为抗原的S蛋白和N蛋白的至少一个片段，触发机体的免疫反应。本发明通过实验发现编码SARS-CoV-2病毒S蛋白、S蛋白的亚基和S蛋白上受体结合区的mRNA递送至小鼠体内能够使小鼠体内产生抗体。基于上述编码SARS-CoV-2病毒抗原的mRNA的发明构思和其产生的技术效果，本发明还利用该mRNA开发了一种疫苗，以mRNA作为疫苗的主要成分具有研发快速、安全性高、易产业化等优点；以mRNA作为疫苗的主要成分制备工艺简单，无需使用细胞增殖病毒或生产重组蛋白；使用极小剂量能达到足够的保护效果，在安全性、有效性方面优于现有的疫苗技术。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中SF-0表面抗原信号；

图2为本发明实施例1中SF-1表面抗原信号；

图3为本发明实施例1中SF-2表面抗原信号；

图4为本发明实施例2中S蛋白、S1亚基和RBD的免疫印迹结果；

图5为本发明实施例2中转染了S蛋白全长的mRNA后细胞表面结合S抗体后的表面抗原信号；

图6为本发明实施例2中转染了S蛋白全长的mRNA后细胞表面结合ACE受体后的表面抗原信号；

图7为本发明实施例3中编码S蛋白全长的mRNA和编码S1亚基的mRNA免疫小鼠后的产生的抗体水平；

图8为本发明实施例3中编码RBD的mRNA免疫小鼠后的产生的抗体水平。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种编码SARS-CoV-2病毒抗原的mRNA，该mRNA至少含有编码SARS-CoV-2病毒的S蛋白和N蛋白中的至少一个蛋白，和/或至少一个蛋白的片段的编码区。蛋白的片段例如可以为但不限于为蛋白的亚基、功能区域或提供稳定抗原功能的片段。

冠状病毒基因组依次编码棘突蛋白(spike protein)、包膜蛋白(Envelopeprotein)、膜蛋白(Membrane protein)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid)。其中棘突蛋白(spike protein，S)被认为是冠状病毒侵入细胞使用的最重要的病毒表面膜蛋白。核衣壳蛋白(N)是冠状病毒中含量最丰富的蛋白。在病毒体组装过程中，N蛋白与病毒RNA结合并导致螺旋核衣壳的形成。核衣壳蛋白是一种高度免疫原性的磷蛋白，与病毒基因组复制和调节细胞信号通路有关。由于N蛋白的序列保守性和强大的免疫原性，N蛋白常被作为冠状病毒诊断检测工具。S蛋白和N蛋白具有较好的免疫原性。编码SARS-CoV-2病毒抗原的mRNA递送至体内能够产生SARS-CoV-2病毒S蛋白、S蛋白的片段、N蛋白和N蛋白的片段中的至少一种，作为SARS-CoV-2病毒使机体产生免疫反应。

在一些可选的实施方式中，SARS-CoV-2病毒抗原的mRNA编码的S蛋白和N蛋白中的至少一个蛋白，和/或至少一个蛋白的片段的编码区的氨基酸序列来源的毒株参考如下毒株中的一种或多种：SARS-CoV-2isolate Wuhan-Hu-1、2019-nCoV WHU01、2019-nCoV_HKU-SZ-002a_2020、2019-nCoV_HKU-SZ-005b_2020、2019-nCoV/Japan/AI/I-004/2020、2019-nCoV/Japan/KY/V-029/2020、2019-nCoV/Japan/TY/WK-012/2020、BetaCoV/Korea/KCDC03/2020和2019-nCoV/USA-WA1/2020。

在一些优选的实施方式中，编码区的核苷酸序列经过优化，包括：针对在人体内表达时的密码子偏好性进行调整、常用密码子的使用频率进行调整、提高序列的G/C含量等，以使mRNA结构更稳定，在哺乳动物和人体内的目标蛋白翻译效率更高。

在一些优选的实施方式中，S蛋白含有两个亚基(subunit)，S1和S2。其中S1主要包含有受体结合区(receptor binding domain，RBD)，负责识别细胞的受体。S2含有膜融合过程所需的基本元件。在一些优选的实施方式中，编码区编码S蛋白全长、S1亚基或S1亚基中受体结合区(receptor binding domain，RBD)。

在一些优选的实施方式中，编码区编码S蛋白的全长，序列优选如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示，其中如SEQ ID NO.1所示序列的编码区效果更佳。

在一些优选的实施方式中，编码区编码S蛋白的S1亚基，序列优选如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示，其中如SEQ ID NO.4所示序列的编码区效果更佳。

在一些优选的实施方式中，编码区编码S蛋白的受体结合区，序列优选如SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9所示序列，其中如SEQ ID NO.7所示序列的编码区效果更佳。

在一些优选的实施方式中，编码N蛋白的编码区序列如SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.11或SEQ ID NO.12所示序列，其中如SEQ ID NO.10所示序列的编码区效果更佳。

在一些优选的实施方式中，编码SARS-CoV-2病毒抗原的mRNA除去编码区外还含有5’-帽结构、3’端聚腺苷酸序列、5’UTR和3’UTR中的至少一种，优选同时含有5’-帽结构、3’端聚腺苷酸序列、5’UTR和3’UTR。

5’-帽结构可以增加mRNA的稳定性，避免mRNA被核酸外切酶降解，优选包括ARCA、m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG、m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG、m7(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeG)pG、m7(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeA)pG、mCAP、dmCAP、tmCAP或dmCAP。

3’端聚腺苷酸序列能够避免mRNA被核酸外切酶降解，同时终结转录，其长度优选为50-200个A，例如可以为但不限于为50、80、100、120、150、180或200个A，更优选为80-200个A。

5’UTR对mRNA的翻译具有调控作用，其长度优选为10-200个核苷酸，例如可以为但不限于为10、15、50、100、120、150或200个核苷酸，更优选为15-100个核苷酸。5’UTR优选包括DNAH25’UTR序列或KOZAK序列；KOZAK序列优选如SEQ ID NO.17所示，DNAH2 5’UTR序列优选如SEQ ID NO.18所示。

3’UTR优选包括来源于提供稳定的mRNA的基因的3’UTR或来源于提供稳定的mRNA的基因的3’UTR的同源物，片段或变体。提供稳定的mRNA的基因优选包括白蛋白基因、α-珠蛋白基因、β-珠蛋白基因、酪氨酸羟化酶基因、脂氧合酶基因或胶原蛋白α基因。更优选地，3’UTR包括血红蛋白HBA2的3’UTR序列或β-珠蛋白3’-UTR序列；所述血红蛋白HBA2的3’UTR序列如SEQ ID NO.19所示。

在一些优选的实施方式中，所述mRNA含有5’-帽结构、3’端聚腺苷酸序列、5’UTR和3’UTR，以及经过密码子优化和调整了G/C含量的编码区，其中含有S蛋白全长编码区的mRNA的序列如SEQ ID NO.13所示，长度为4090nt；含有S蛋白的S1亚基编码区的mRNA的序列如SEQ ID NO.14所示，长度为2362nt；含有S蛋白的受体结合区编码区的mRNA的序列如SEQ IDNO.15所示，长度为934nt；含有N蛋白编码区的mRNA的序列如SEQ ID NO.16所示，长度为1528nt。

在一些可选的实施方式中，所述mRNA含有经过修饰的核苷酸和/或未经修饰的核苷酸。可选地，所述mRNA的全序列均使用未经修饰的核苷酸。可选地，所述mRNA的全序列中含有经过修饰的核苷酸。含有经过修饰的核苷酸指的是mRNA中的核苷酸经过修饰，例如经2’-O-甲基化修饰核苷酸和/或L-核苷修饰的核苷酸，或含有修饰的UTP和/或CTP，或者使用其他种类的核苷酸替换mRNA中常规的核苷酸，例如使用假尿嘧啶(pseudo-UTP)替换mRNA中的常规核苷酸。修饰的核苷酸的位置例如可以为但不限于为编码区、5’-UTR区、3’-UTR区和帽子区中至少一种。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种生物材料，所述生物材料包括编码所述mRNA的DNA分子，所述DNA分子能够转录得到所述mRNA；所述生物材料还可以是含有上述DNA分子的表达盒或载体，例如含有编码所述mRNA的质粒，以用来贮存所述mRNA的序列信息，或用于克隆所述DNA分子或表达DNA分子编码的蛋白；所述生物材料还可以为含有上述mRNA和/或DNA分子的微生物和/或细胞，以表达所述mRNA或DNA编码的蛋白，或实现DNA分子的克隆。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种疫苗，该疫苗以上述编码SARS-CoV-2病毒抗原的mRNA或与其相关的生物材料作为疫苗的活性成分，例如可以为但不限于为以所述编码SARS-CoV-2病毒抗原的mRNA，能够转录所述mRNA的DNA，含有所述DNA的载体或含有所述mRNA或DNA的微生物或细胞系作为疫苗的主要活性成分。所述疫苗能够在体内表达出S蛋白和N蛋白中的至少一个蛋白或蛋白的片段作为疫苗的抗原，使机体产生免疫反应，产生SARS-CoV-2病毒的抗体。

在一些优选的实施方式中，以所述编码SARS-CoV-2病毒抗原的mRNA作为主要的活性成分，mRNA递送至体内能够表达S蛋白、S1亚基、S蛋白的受体结合区和N蛋白中的至少一种作为抗原，使用极小剂量能达到足够的保护效果，在安全性和有效性方面优于现有的疫苗技术，且mRNA核酸疫苗还具有研发快速、安全性高和易产业化等优点。实验发现以mRNA作为主要活性成分的疫苗在动物体内能够有效的产生SARS-CoV-2病毒的抗体。

在一些优选的实施方式中，以mRNA作为主要活性成分的疫苗中的mRNA溶解于缓冲液中，缓冲液优选使用PBS或pH在3～7的酸性或中性缓冲液，例如可以为但不限于为PBS，柠檬酸盐缓冲液或乙酸盐缓冲液。缓冲液中mRNA的浓度优选为0.05～0.5mg/mL，例如可以为但不限于为0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/ml或0.5mg/ml。

在一些优选的实施方式中，所述疫苗中还含有用于促进mRNA递送的递送制剂，其中递送制剂优选使用脂质，mRNA和递送制剂的质量比优选为1:1-40:1，例如可以为但不限于为1:1、5:1、10:1、15:1、20:1、25:1，30:1或40:1。

在一些优选的实施方式中，所述疫苗还含有能够提高疫苗的免疫应答效果的佐剂。本实施方式中可以使用本领域可接受的佐剂，例如可以为但不限于为用于提高免疫刺激的核酸、蛋白、脂多糖和小分子化合物中的至少一种。其中核酸优选包括CpG，也可以包括编码并能够在体内表达用于提高免疫刺激的物质的mRNA，例如编码具有佐剂作用的蛋白的mRNA和编码具有佐剂作用的多肽的mRNA等，优选编码细胞因子的mRNA，其中编码的细胞因子例如可以但不限于包括肿瘤坏死因子家族、白介素家族、干扰素家族和集落刺激因子家族中的至少一种，优选包括干扰素，更优选包括IFN-α。当用于佐剂的mRNA编码IFN-α时，编码SARS-CoV-2病毒抗原的mRNA和编码IFN-α的mRNA的摩尔比为10:1-1:1，例如可以为但不限于为10:1、8:1、5:1、2.5:1或1:1。

当所述疫苗含有编码SARS-CoV-2病毒抗原的mRNA、递送制剂和佐剂时，该疫苗的制备方法优选先将所述编码SARS-CoV-2病毒抗原的mRNA与佐剂混合，再与递送制剂混合，得到所述疫苗；或，先将所述编码SARS-CoV-2病毒抗原的mRNA与递送制剂混合，再与佐剂混合，得到所述疫苗。

在一些优选的实施方式中，所述佐剂包括所述编码并在体内表达用于提高免疫刺激的物质的mRNA，所述制备方法包括先将所述编码并在体内表达用于提高免疫刺激的物质的mRNA和所述编码SARS-CoV-2病毒抗原的mRNA先混合的到mRNA混合物，再将所述mRNA混合物与所述递送制剂混合，得到所述疫苗。

在一些实施方案中，所述疫苗以上述编码SARS-CoV-2病毒抗原的mRNA作为主要活性成分，以阳离子脂质纳米颗粒作为递送制剂。mRNA和脂质纳米颗粒的质量比优选为1:1-40:1，例如可以为但不限于为1:1、5:1、10:1、15:1、20:1、25:1，30:1或40:1。

在一些优选的实施方式中，按摩尔百分比计所述阳离子脂质纳米颗粒包括20-50％可质子化阳离子脂质，例如可以为但不限于为20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％，可质子化阳离子脂质优选包括Dlin-MC3-DMA、DODMA、C12-200和DlinDMA中的至少一种，优选包括Dlin-MC3-DMA；20-50％结构脂质，例如可以为但不限于为20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％，结构脂质优选包括胆固醇和/或胆固醇衍生物，更优选包括胆固醇；5-20％辅助脂质，例如可以为但不限于为5％、10％、15％或20％，辅助脂质优选包括DSPC、DOPE、DOPC、DOPG和DOPS中的至少一种；和1-5％表面活性剂，例如可以为但不限于为1％、2％、3％、4％或5％，表面活性剂包括PEG-DMG、PEG-DSPE和TPGS中的至少一种。其中，可质子化阳离子脂质、结构脂质、辅助脂质和表面活性剂的摩尔含量合计100％。该实施方案中的疫苗的给药方式优选包括静脉注射、肌肉注射或皮内注射，更优选采用肌肉注射给药。

以阳离子脂质纳米颗粒作为递送制剂递送mRNA的疫苗的制备方法优选包括将阳离子脂质纳米颗粒和mRNA混合，得到所述疫苗。在一些优选的实施方式中，参考如下制备方法实施：

(a)按配方量将可质子化阳离子脂质、结构脂质、辅助脂质和表面活性剂溶于有机溶液，得到有机相；有机相优选包括C1～C4低碳醇，优选为乙醇。有机相中的可质子化阳离子脂质、结构脂质、辅助脂质和表面活性剂的总浓度为5-7mg/ml，例如可以为但不限于为5mg/ml、5.5mg/ml、6mg/ml、6.5mg/ml或7mg/ml。

(b)将mRNA溶于缓冲液中，得到水相。水相中的mRNA的浓度优选为0.08-1.2mg/ml，例如可以为但不限于为0.08mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.5mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml、1.1mg/ml或1.2mg/ml。

(c)将有机相和水相混匀得到混合液，替换混合液中的溶媒为缓冲液，得到疫苗；有机相和水相的体积比优选为1：2-4，例如可以为但不限于为1:2、1:3或1:4；混匀优选采用微流控设备进行，流速控制为>3ml/min。替换混合液中的溶媒为缓冲液优选包括用缓冲液将混合液稀释50-100倍，例如可以为但不限于为50、60、70、80、90或100倍，再浓缩。

在另一些实施方案中，所述疫苗以上述编码SARS-CoV-2病毒抗原的mRNA作为主要活性成分，以阳离子脂质体作为递送制剂。阳离子脂质体优选主要由中性辅助脂质和阳离子脂质组成，中性辅助脂质优选包括DOPE、DOPC和cholesterol中的至少一种，更优选包括DOPE；阳离子脂质优选包括DOTAP、DOTMA、DC-chol和DOSPA中的至少一种，更优选包括DOTAP或DOTMA。阳离子脂质和中性辅助脂质的摩尔比优选为1:1～3:1，例如可以为但不限于为2:1、2.5:1或3:1。

以阳离子脂质体作为递送制剂递送mRNA的疫苗的制备方法优选包括：将mRNA和阳离子脂质体在工作液中混合得到所述疫苗。其中工作液优选包括去离子水、超纯水、氯化钠溶液或PBS。mRNA在工作液中的浓度优选为0.01-0.5mg/ml。工作液优选为PBS，当工作液为PBS时阳离子脂质体和mRNA的质量比为1:1-4:1。

在一些优选的实施方式中，阳离子脂质体的制备方法包括提供含有中性辅助脂质和阳离子脂质的溶液，将所述溶液依次去除溶剂、干燥、水化和超声，得到阳离子脂质体。其中溶剂优选包括氯仿和/或二氯甲烷与甲醇的混合液；干燥的时间优选为1.5～2.5小时；水花优选包括采用无RNA酶超纯水在35-39℃震荡8-12分钟，水化后阳离子脂质体浓度为2.5-3.5mg/ml；超声的工艺参数优选为38-42℃超声35-45分钟。

下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。

实施例1

根据SARS-CoV-2病毒S蛋白的天然编码区序列，本实施例设计了SARS-CoV-2病毒S蛋白全长序列(SF mRNA序列)，除了编码区外，SF mRNA序列特征还包括DNAH2 5’UTR、HBA23’UTR和50个polyA，SF-1和SF-2mRNA序列在S蛋白编码区做了优化，相比SF-0mRNA，GC含量均有提高，而在UTR区域保持一致，序列信息如表1所示。

表1

目标抗原产生检测方法(流式细胞仪)如下：

1.为检测SARS-CoV-2病毒S蛋白mRNA在人类细胞中的表达及细胞膜上的定位，本实施例将培养24小时以上的293细胞消化并种入6孔板中，将细胞密度控制在400000个每孔。

2.将六孔板于37度孵育24小时后利用显微镜观察细胞状态。细胞汇合度达到80％以上即可进行mRNA转染。

3.利用lipofectamine2000试剂盒转染相应mRNA到293细胞中(每孔转染2μg的mRNA)，具体操作参考试剂盒说明。并于37摄氏度继续培养24小时。

4.待mRNA持续表达24小时后表达量接近峰值，此时将细胞上清液除去，利用PBS清洗一次，加入200μl胰蛋白酶消化细胞，并用3ml完全培养基中和胰酶。将细胞悬浮液移入15ml离心管中，离心机1400rpm离心5分钟，弃去上清液，利用3ml的1％BSA溶液(BSA溶解于PBS中)重悬细胞，然后继续用离心机1400rpm离心5分钟，弃去上清液。

5.利用0.5ml的1％BSA溶液重悬细胞，离心机1400rpm离心5分钟，弃去上清液。此时利用150μl抗体溶液(利用1％的BSA溶液1:250倍稀释抗体)重悬细胞并转移至1.5ml离心管，室温孵育2小时。

6.加入1ml的PBS溶液并离心机1400rpm离心5分钟，弃去上清液，加入0.5mlPBS溶液重悬细胞，离心机1400rpm离心5分钟，弃去上清液。加入0.5ml用PBS稀释好的PE荧光标记羊抗兔二抗(1:250倍稀释)，避光室温孵育1小时。

7.加入1ml的PBS溶液并离心机1400rpm离心5分钟，弃去上清液，加入0.5mlPBS溶液重悬细胞，离心机1400rpm离心5分钟，弃去上清液。加入0.5mlPBS溶液重悬细胞待检。

8.流式细胞检测：将没有转染mRNA的细胞设为阴性对照组，利用流式细胞仪检测阴性对照细胞并在点状图上圈出目的细胞信号，利用直方图读取PE荧光信号，并调整检测器灵敏度及电压在直方图上确定阳性细胞荧光信号的范围，以此圈门。

9.依次检测各样本记录阳性细胞百分比，每个样本读取10000个信号。

结果如图1～图3所示，SF-0，SF-1，SF-2mRNA转染细胞后，细胞可结合S蛋白抗体,且提高GC含量可优化抗原表达，提高抗原-抗体结合信号。

实施例2

将编码S蛋白全长的mRNA(SF mRNA如SEQ ID NO.13所示序列)，编码S1亚基的mRNA(如SEQ ID NO.14所示序列)和编码S蛋白的受体结合区RBD的mRNA(如SEQ ID NO.15所示序列)转染细胞，检测S、S1和RBD蛋白在细胞中的表达，结果如图4所示，转染各mRNA 24小时后的HEK293细胞进行裂解，按10μg的总蛋白在SDS-PAGE胶上样，用抗SARS-S1蛋白抗体进行免疫印迹，使用羊抗兔-HRP二抗进行标记，然后显色。蛋白表达量使用内参b-actin进行标化定量。未转染mRNA的细胞作为阴性对照。S蛋白全长、S1亚基和RBD蛋白均可以检测到表达。

使用实施例1中目标抗原产生检测方法检测抗原蛋白在细胞表面表达，结果如图5和图6所示，结果显示SF mRNA转染细胞后，细胞可同时结合S蛋白抗体和ACE2并产生信号，阴性对照皆无明显信号。

实施例3

将SF mRNA(如SEQ ID NO.13所示序列，产生抗体1)，编码S1亚基的mRNA(如SEQ IDNO.14所示序列，产生抗体2)和编码S蛋白的受体结合区RBD的mRNA(如SEQ ID NO.15所示序列，产生抗体3)分别和递送制剂制成疫苗，不同疫苗制剂中mRNA配方(摩尔比)如下表所示：

表2

组别	SF	S1	RBD	IFN-α
					A	1
B	1			1
					C	1	1	1
D	1	1	1	1

将不同组别mRNA混合物分别制备成LNP制剂(Dlin-MC3-DMA50％，cholesterol29％，DOPC20％，PEG-DMG1％。Lipid/mRNA(w/w)＝10:1。)，LNP制剂经检测包封率均90％以上，粒径约为70nm。将所得四组疫苗制剂用于KM小鼠给药实验，每只小鼠给药(A组：总15微克，B组：总18微克，C组：总27微克，D组：30微克mRNA)。给药后12天抽取小鼠血清通过ELISA法检测小鼠体内所产生抗体信号，结果如图7和图8所示，实验结果显示含有SFmRNA、S1亚基或RBD的mRNA的疫苗能够使小鼠体内产生抗体。

将所有小鼠中ELISA信号强阳性的小鼠血清送第三方P3实验室进行SARS-CoV-2病毒中和能力测试。将小鼠血清按照不同比例稀释后加入可感染SARS-CoV-2病毒的细胞模型中，同时加入SARS-CoV-2病毒颗粒，孵育一段时间后利用荧光染色技术观察病毒对细胞的侵染能力，及在有血清中和的情况下病毒侵染能力的变化，并计算相应血清的病毒中和率(inhibition rate，％)。血清对应分组编号及结果如表3所示。

表3 P3实验室病毒中和实验分组及结果。

以上结果可知，包含SF mRNA疫苗制剂可有效刺激小鼠产生具有中和病毒能力的抗体，此外加入编码IFN-α的mRNA可能具有提高中和抗体产生效率的作用。因此加入编码佐剂的mRNA可作为新冠疫苗产品设计的一个思路。

为更进一步验证疫苗效果，对血清编号A1-A4和B3组小鼠在第14天进行第二次免疫(剂量等同于第一次)，于第19天抽取小鼠血清通过ELISA法检测小鼠体内所产生抗体信号并将血清送第三方P3实验室再次进行SARS-CoV-2病毒中和能力测试。结果如表4所示，实验组小鼠ELISA抗体信号值呈强阳性，且小鼠血清在中和病毒实验中，显示出较强的抗病毒感染能力。ELISA数据和病毒中和数据呈现直接对应性。

表4

样品序号

A1

A2

A3

A4

B3

阴性对照

ELISA读数

3.395

3.250

3.423

3.411

3.467

0.321

中和活性FRNT<sub>50</sub>

1:5149

1:12.82

1:2138

1:4147

1:7429

0

实施例4

不同配方的阳离子脂质纳米颗粒包裹编码S蛋白全长的mRNA的能力及形成纳米颗粒的粒度数据如表5所示，几种配方均能将S蛋白mRNA压缩成粒径100nm以下表面电位净中性的纳米颗粒，同时均能包裹至少50％的mRNA，因此均可具备一定的体内递送效果。

表5

不同配方的阳离子脂质体配方包裹编码S蛋白全长的mRNA的能力及形成纳米脂质复合物后的粒度数据如表6所示。以下所有阳离子脂质体均能一定程度包裹S蛋白mRNA并形成200nm左右脂质复合物，因此在体内均可具有一定递送效果，但对比以上脂质纳米颗粒数据，阳离子脂质体荷载S蛋白mRNA能力较弱。

表6

DOTAP	DOTMA	DOTAP	DOPE	DOPC	粒径(nm)	表面电位(mV)	包封率(％)
								20			9		203	-42	36％
	3		1		245	-43.6	42％
								2			1		320	-53.4	43％
3			1		180	-32.8	57％
								20				9	189	-37.5	37％

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 珠海丽凡达生物技术有限公司

<120> 编码SARS-CoV-2病毒抗原的mRNA和疫苗及疫苗的制备方法

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3777

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

gugaaucuga caaccagaac ccagcugcca ccagccuaua caaacuccuu cacacggggc 60

guguauuacc cugacaaggu guuucgcucu agcgugcugc acagcaccca ggaucuguuu 120

cugccauucu uuucuaacgu gacaugguuc cacgccaucc acguguccgg caccaacggc 180

acaaagcggu uugacaaccc ugugcugccc uuuaaugacg gcguguauuu cgccuccaca 240

gagaagagca auaucaucag gggcuggauc uuuggcacaa cccuggacuc uaagacccag 300

agccugcuga ucgugaacaa ugccaccaau gugguaauca aggugugcga guuccaguuu 360

ugcaaugacc ccuuccuggg cguguacuau cacaagaaca acaagucuug gauggagucc 420

gaguucagag uguacuccag cgccaauaac uguaccuucg aguacguguc ucagccauuu 480

cugauggauc uggagggcaa gcagggcaau uucaagaacc ugagagaguu cguguuuaag 540

aacaucgaug gcuacuucaa gaucuauucc aagcacaccc caaucaaccu ggugcgggau 600

cugccucagg gcuucucugc ccuggagcca cugguggacc ugccuaucgg caucaacauc 660

acacgguuuc agacacugcu ggcccugcac agguccuauc ugaccccagg cgacuccucu 720

ucuggcugga cagccggcgc cgccgccuac uaugugggcu accugcagcc uagaacauuc 780

cugcugaagu acaaugagaa cggcaccauc accgacgccg uggauugugc ccuggauccc 840

cugucugaga caaaguguac ccugaagucc uuuacagugg agaagggcau cuaucagacc 900

uccaacuuca gggugcagcc caccgagucu aucgugcggu uuccuaacau cacaaaucug 960

ugccccuuug gcgagguguu uaacgccacc agguuugccu ccguguaugc cuggaacagg 1020

aagcgcaucu cuaacugcgu ggccgauuac agcgugcugu acaauagcgc cagcuuuucc 1080

accuuuaagu guuauggcgu gucuccaaca aagcugaacg aucugugcuu caccaacgug 1140

uaugccgaca gcuuugugau ccgcggcgac gaggugaggc agaucgcccc cggccagacc 1200

ggcaagaucg ccgauuauaa cuacaagcug ccugacgacu uuaccggcug cgugaucgcc 1260

uggaacagca acaaccugga uucuaaggug ggcggcaacu auaauuaccu guaucgccug 1320

uuccggaagu cuaaccugaa gccuuucgag cgcgacaucu ccaccgagau cuaucaggcc 1380

ggcuccaccc cauguaaugg cguggagggc uucaacuguu acuuuccucu gcaguccuac 1440

ggcuuucagc cuacaaaugg cgugggcuac cagccuuaua gggugguggu gcugucuuuu 1500

gagcugcugc acgccccugc caccgugugc ggccccaaga agagcacaaa ccuggugaag 1560

aacaagugcg ugaauuucaa cuuuaauggc cugacaggca caggcgugcu gaccgagucc 1620

aauaagaagu uucugccuuu ccagcaguuu ggccgggaca ucgccgauac caccgacgcc 1680

gugagagacc cacagacacu ggagauccug gacaucacac cuugcuccuu cggcggcgug 1740

uccgugauca caccuggcac aaauaccucc aaucaggugg ccgugcugua ucaggacgug 1800

aacugcacag aggugccugu ggccauccac gccgaccagc ugacaccaac cuggcgggug 1860

uauucuaccg gcuccaacgu guuccagaca cgcgccggcu gccugaucgg cgccgagcac 1920

gugaauaacu cuuacgagug ugacaucccu aucggcgccg gcaucugugc cagcuaccag 1980

acccagacca acagcccacg cagagccagg uccguggccu cccagucuau caucgccuac 2040

accaugagcc ugggcgccga gaauagcgug gccuacucca auaauuccau cgccauccca 2100

accaacuuca caaucucugu gacaaccgag auccugcccg uguccaugac caagacaagc 2160

guggacugca caauguauau cuguggcgac ucuacagagu gcucuaaucu gcugcugcag 2220

uauggcuccu uuuguaccca gcugaacaga gcccugaccg gcaucgccgu ggagcaggac 2280

aagaacaccc aggagguguu cgcccaggug aagcagaucu acaagacccc accuaucaag 2340

gacuucggcg gcuucaauuu uucccagauc cugcccgacc caucuaagcc cagcaagcgg 2400

uccuuuaucg aggaucugcu guucaauaag gugacacugg ccgaugccgg cuuuaucaag 2460

caguacggcg acugucuggg cgauaucgcc gccagagacc ugaucugcgc ccagaaguuc 2520

aacggccuga ccgugcugcc cccacugcug accgaugaga ugaucgccca guacaccagc 2580

gcccugcugg ccggcaccau cacaucuggc uggaccuuug gcgccggcgc cgcccugcag 2640

aucccauuug ccaugcagau ggccuaucgc uucaacggca ucggcgugac ccagaaugug 2700

cuguaugaga aucagaagcu gaucgccaau caguuuaaua gcgccaucgg caagauccag 2760

gauucucuga gcuccacagc cucugcccug ggcaagcugc aggacguggu gaaucagaac 2820

gcccaggccc ugaauacccu ggugaagcag cuguccucua auuuuggcgc caucuccagc 2880

gugcugaacg acauccuguc ccggcuggau aagguggagg ccgaggugca gaucgacagg 2940

cugaucacag gcagacugca gucccugcag accuacguga cacagcagcu gauccgcgcc 3000

gccgagaucc gggccagcgc caaucuggcc gccaccaaga uguccgagug cgugcugggc 3060

cagagcaaga ggguggacuu uugcggcaag ggcuaccacc ugauguccuu uccacagagc 3120

gccccccacg gcgugguguu ccugcacgug acauacgugc cugcccagga gaagaacuuu 3180

acaaccgccc cagccaucug ucacgacggc aaggcccacu uuccccgcga gggcguguuc 3240

guguccaaug gcacccacug guucgugacc cagaggaauu ucuaugagcc acagaucauc 3300

acaaccgaca auacauucgu gucuggcaau ugcgacgugg uaaucggcau cgugaauaau 3360

acaguguacg acccucugca gcccgagcug gauuccuuca aggaggagcu ggacaaguau 3420

uucaagaacc acaccucccc agacguggac cugggcgaca ucagcggcau caaugccagc 3480

guggugaaca uccagaagga gaucgaucgc cugaaugagg uggccaagaa ccugaaugag 3540

ucccugaucg accugcagga gcugggcaag uacgagcagu auaucaagug gcccugguac 3600

aucuggcugg gcuuuaucgc cggccugauc gccaucguga uggugacaau caugcugugc 3660

uguaugaccu ccuguugcag cugccugaag ggcuguuguu ccugcggcag cuguuguaag 3720

uuugacgagg augacucuga gccugugcug aagggcguga agcugcacua uaccuga 3777

<210> 2

<211> 3777

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

guuaaucuua caaccagaac ucaguuaccc ccugcauaca cuaauuccuu cacacggggu 60

guuuauuacc ccgacaaggu uuucagaucc ucaguuuuac auuccacgca ggacuuguuc 120

uuaccguucu uuuccaacgu caccugguuc caugcuaucc augucucggg gaccaauggu 180

acuaagaggu uggauaaccc uguccuacca uuuaaugaug guguuuacuu cgcuuccacu 240

gagaagucga acaucauaag aggcuggauc uuugguacua cuuuagauuc gaagacccag 300

ucccuacuua uuguuaauaa cgcuacuaau guuguuauua aagucuguga auuucaauuu 360

uguaaugauc cauuuuuggg uguuuauuac cacaaaaaca acaaaaguug gauggaaagu 420

gaguucagag uuuauucuag ugcgaauaau ugcacuuuug aauaugucuc ucagccuuuu 480

cuuauggacc uugaaggaaa acaggguaau uucaaaaauc uuagggaauu uguguuuaag 540

aauauugaug guuauuuuaa aauauauucu aagcacacgc cuauuaauuu agugcgugau 600

cucccucagg guuuuucggc uuuagaacca uugguagauu ugccaauagg uauuaacauc 660

acuagguuuc aaacuuuacu ugcuuuacau agaaguuauu ugacuccugg ugauucuucu 720

ucagguugga cagcuggugc ugcagcuuau uauguggguu aucuucaacc uaggacuuuu 780

cuauuaaaau auaaugaaaa uggaaccauu acagaugcug uagacugugc acuugacccu 840

cucucagaaa caaaguguac guugaaaucc uucacuguag aaaaaggaau cuaucaaacu 900

ucuaacuuua gaguccaacc aacagaaucu auuguuagau uuccuaauau uacaaacuug 960

ugcccuuuug gugaaguuuu uaacgccacc agauuugcau cuguuuaugc uuggaacagg 1020

aagagaauca gcaacugugu ugcugauuau ucuguccuau auaauuccgc aucauuuucc 1080

acuuuuaagu guuauggagu gucuccuacu aaauuaaaug aucucugcuu uacuaauguc 1140

uaugcagauu cauuuguaau uagaggugau gaagucagac aaaucgcucc agggcaaacu 1200

ggaaagauug cugauuauaa uuauaaauua ccagaugauu uuacaggcug cguuauagcu 1260

uggaauucua acaaucuuga uucuaagguu ggugguaauu auaauuaccu guauagauug 1320

uuuaggaagu cuaaucucaa accuuuugag agagauauuu caacugaaau cuaucaggcc 1380

gguagcacac cuuguaaugg uguugaaggu uuuaauuguu acuuuccuuu acaaucauau 1440

gguuuccaac ccacuaaugg uguugguuac caaccauaca gaguaguagu acuuucuuuu 1500

gaacuucuac augcaccagc aacuguuugu ggaccuaaaa agucuacuaa uuugguuaaa 1560

aacaaaugug ucaauuucaa cuucaauggu uuaacaggca cagguguucu uacugagucu 1620

aacaaaaagu uucugccuuu ccaacaauuu ggcagagaca uugcugacac uacugaugcu 1680

guccgugauc cacagacacu ugagauucuu gacauuacac cauguucuuu uggugguguc 1740

aguguuauaa caccaggaac aaauacuucu aaccagguug cuguucuuua ucaggauguu 1800

aacugcaccg aggucccugu cgcuauccau gcagaccagc ugacuccuac uuggcguguc 1860

uacucuacag guucuaacgu cuugcagaca cgugcaggcu guuucaucgg ggcugagcac 1920

gucaacaacu cauacgagug cgacaucccc aucggcgcag gcaucugcgc uaguuaccag 1980

acgcagacga acucgccucg gcgggcacgu agcguagcua gucaguccau caucgccuau 2040

acgaugucac ucggcgcaga gaacucaguc gccuacucua acaacucuau cgccauaccc 2100

acgaacuuca cuaucagugu gaccacagag auucugccag uguccaugac caagacauca 2160

guagacugca caauguacau cuguggugac ucaacugagu gcagcaaccu guuguugcag 2220

uacggcaggu ucuguacaca guucaaccgu gcuuugacug gaaucgcugu ugagcaggac 2280

aagaacaccc acgacgucuu cgcacagguc aagcagaucu acaagacacc accaaucaaa 2340

gacuucggug guuucaauuu uucacaaaua uuaccagauc caucaaaacc aagcaagagg 2400

ucauuuauug aagaucuacu uuucaacaaa gugacacuug cagaugcugg cuucaucaaa 2460

caauauggug auugccuugg ugauauugcu gcuagagacc ucauuugugc acaaaaguuu 2520

aacggccuua cuguuuugcc accuuugcuc acagaugaaa ugauugcuca auacacuucu 2580

gcacuguuag cggguacaau cacuucuggu uggaccuuug gugcaggugc ugcauuacaa 2640

auaccauuug cuaugcaaau ggcuuauagg uuuaauggua uuggaguuac acagaauguu 2700

cucuaugaga accaaaaauu gauugccaac caauuuaaua gugcuauugg caaaauucaa 2760

gacucacuuu cuuccacagc aagugcacuu ggaaaacuuc aagauguggu caaccaaaau 2820

gcacaagcuu uaaacacgcu uguuaaacaa cuuagcucca auuuuggugc aauuucaagu 2880

guuuuaaaug auauccuuuc acgucuugac aaaguugagg cugaagugca aauugauagg 2940

uugaucacag gcagacuuca aaguuugcag acauauguga cucaacaauu aauuagagcu 3000

gcagaaauca gagcuucugc uaaucuugcu gcuacuaaaa ugucagagug uguacuugga 3060

caaucaaaaa gaguugauuu uuguggaaag ggcuaucauc uuauguccuu cccucaguca 3120

gcaccucaug guguagucuu cuugcaugug acuuaugucc cugcacaaga aaagaacuuc 3180

acaacugcuc cugccauuug ucaugaugga aaagcacacu uuccucguga aggugucuuu 3240

guuucaaaug gcacacacug guuuguaaca caaaggaauu uuuaugaacc acaaaucauu 3300

acuacagaca acacauuugu gucugguaac ugugauguug uaauaggaau ugucaacaac 3360

acaguuuaug auccuuugca accugaauua gacucauuca aggaggaguu agauaaauau 3420

uuuaagaauc auacaucacc agauguugau uuaggugaca ucucuggcau uaaugcuuca 3480

guuguaaaca uucaaaaaga aauugaccgc cucaaugagg uugccaagaa uuuaaaugaa 3540

ucucucaucg aucuccaaga acuuggaaag uaugagcagu auauaaaaug gccaugguac 3600

auuuggcuag guuuuauagc uggcuugauu gccauaguaa uggugacaau uaugcuuugc 3660

uguaugacca guugcuguag uugucucaag ggcuguuguu cuuguggauc cugcugcaaa 3720

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<210> 3

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<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 3

guuaaccuga ccacccguac ccagcugccg ccggcguaca ccaacagcuu cacccguggu 60

guuuacuacc cggacaaggu guuccguagc agcgugcugc acagcaccca agaccuguuu 120

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acccguuuuc agacccugcu ggcgcugcac cguagcuauc ugaccccggg cgauagcagc 720

agcggcugga ccgcgggugc ggcggcguac uacguggguu accugcagcc gcguaccuuu 780

cugcugaaau acaacgagaa cgguaccauu accgacgcgg uugacugcgc gcuggauccg 840

cugagcgaaa ccaaaugcac ccugaaaagc uucaccguug agaaagguau cuaucagacc 900

agcaacuuuc gugugcaacc gaccgagagc auuguucguu uuccgaacau uaccaaccug 960

ugcccguuug gcgaaguguu uaacgcgacc cguuuugcga gcguuuacgc guggaaccgu 1020

aagcguauua gcaacugcgu ugcggauuau agcguucugu auaacagcgc gagcuuuagc 1080

accuucaaau gcuacggcgu uagcccgacc aagcugaacg aucugugcuu caccaacgug 1140

uaugcggaua gcuucgugau ucguggugac gagguucguc aaaucgcgcc gggccagacc 1200

ggcaaaaucg cggacuacaa cuauaagcug ccggaugacu uuaccggcug cgugauugcg 1260

uggaacagca acaaccugga uagcaaaguu ggcggcaacu acaacuaucu guaccgucug 1320

uuucguaaaa gcaaccugaa accguuugaa cgugauauua gcaccgaaau cuaucaagcg 1380

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gguuuccaac cgaccaacgg cguuggcuau cagccguauc guguuguggu gcugagcuuc 1500

gagcugcugc acgcgccggc gaccguuugc ggcccgaaaa agagcaccaa ccuggugaaa 1560

aacaagugcg uuaacuucaa cuuuaacggu cugaccggua ccggcguucu gaccgagagc 1620

aacaaaaagu uucugccguu ucaacaguuc ggucgugaua uugcggacac caccgaugcg 1680

gugcgugauc cgcagacccu ggagauccug gauauuaccc cgugcagcuu ugguggcguu 1740

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uauagcaccg gcagcaacgu guuucagacc cgugcgggcu gccugaucgg ugcggaacac 1920

gugaacaaca gcuacgagug cgacaucccg aucggugcgg gcauuugcgc gagcuaccaa 1980

acccagacca acagcccgcg ucgugcgcgu agcguggcga gccagagcau uauugcguau 2040

accaugagcc ugggcgcgga gaacagcgug gcguacagca acaacagcau ugcgauuccg 2100

accaacuuca ccauuagcgu gaccaccgaa auccugccgg ugagcaugac caagaccagc 2160

guugacugca ccauguacau uugcggcgau agcaccgagu gcagcaaccu gcugcugcaa 2220

uacgguagcu ucugcaccca gcugaaccgu gcgcugaccg gcauugcggu ggagcaagau 2280

aaaaacaccc aagagguguu ugcgcaaguu aaacagaucu acaagacccc gccgauuaag 2340

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caauacggug acugccuggg cgacaucgcg gcgcgugacc ugauuugcgc gcaaaaauuc 2520

aacggucuga ccguucugcc gccgcugcug accgaugaga ugaucgcgca guacaccagc 2580

gcgcugcugg cgggcaccau uaccagcggu uggaccuucg gcgcgggcgc ggcgcugcag 2640

aucccguuug cgaugcaaau ggcguaucgu uuuaacggca ucgguguuac ccaaaacgug 2700

cuguacgaga accagaaacu gaucgcgaac caauucaaca gcgcgauugg caaaauccag 2760

gauagccuga gcagcaccgc gagcgcgcug ggcaaacugc aggacguggu gaaccaaaac 2820

gcgcaggcgc ugaacacccu ggugaagcaa cugagcagca acuuuggugc gaucagcagc 2880

gugcugaacg auauccugag ccgucuggau aagguggaag cggagguuca gauugaucgu 2940

cugauuaccg gucgucugca aagccugcag accuacguga cccaacagcu gauucgugcg 3000

gcggagauuc gugcgagcgc gaaccuggcg gcgaccaaga ugagcgaaug cguucugggc 3060

caaagcaaac guguugauuu cugcgguaaa ggcuaccacc ugaugagcuu uccgcagagc 3120

gcgccgcacg gugugguuuu ccugcacguu accuacgugc cggcgcagga aaagaacuuc 3180

accaccgcgc cggcgauuug ccacgauggc aaggcgcacu uuccgcguga gggcguuuuu 3240

gugagcaacg guacccacug guuugugacc cagcguaacu ucuacgagcc gcaaaucauu 3300

accaccgaca acaccuucgu uagcgguaac ugcgacgugg uuaucgguau cgugaacaac 3360

accguuuaug auccgcugca gccggaacug gacagcuuca aggaagagcu ggacaaauac 3420

uucaagaacc acaccagccc ggauguggau cugggcgaua ucagcgguau caacgcgagc 3480

gugguuaaca uccagaagga aauugaucgu cugaacgagg uugcgaaaaa ccugaacgag 3540

agccugauug accugcagga acuggguaaa uacgagcagu acauuaagug gccgugguac 3600

aucuggcugg guuucauugc gggucugauc gcgauuguga ugguuaccau caugcugugc 3660

ugcaugacca gcugcugcag cugccugaag ggcugcugca gcugcgguag cugcugcaaa 3720

uuugacgagg augauagcga gccgguucug aaaggcguga agcugcacua caccuaa 3777

<210> 4

<211> 2013

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 4

gugaaucuga caacaagaac ccagcugccc ccagccuaca ccaacagcuu uaccagaggc 60

guguacuauc cagacaaggu guuccgcucc agcgugcugc acagcaccca ggaccuguuu 120

cugcccuuuu ucagcaaugu gaccugguuc cacgccaucc acguguccgg cacaaacggc 180

accaagaggu ucgacaaccc ugugcugccc uuuaaugaug gcguguacuu cgccuccaca 240

gagaagagca acaucaucag aggcuggauc uucggcacaa cccuggacag caagacccag 300

agccugcuga ucgugaacaa ugccaccaac gugguaauca aggugugcga guuucaguuu 360

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gaguuuaggg uguacagcuc ugccaacaac ugcacauucg aguacgugag ccagccuuuu 480

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aauaucgaug gcuacuucaa gaucuauucc aagcacaccc ccaucaaucu ggugagggau 600

cugccucagg gcuucagcgc ccuggagcca cugguggacc ugcccaucgg caucaacauc 660

accagguucc agacccugcu ggcccugcac aggagcuauc ugacccccgg cgauagcucu 720

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cugcugaagu acaacgagaa uggcaccauc acagacgccg uggauugcgc ccuggacccc 840

cugagcgaga ccaagugcac ccugaagagc uuuacagugg agaagggcau cuaccagacc 900

agcaauuuca gagugcagcc aaccgagagc aucgugagau uucccaauau caccaaccug 960

ugcccauuug gcgagguguu caaugccacc agauuugcca gcguguacgc cuggaauaga 1020

aagaggauca gcaacugcgu ggccgacuac agcgugcugu acaauucugc cagcuuuucu 1080

accuucaagu gcuauggcgu gagcccaacc aagcugaacg accugugcuu cacaaacgug 1140

uaugccgauu ccuucgugau cagaggcgac gaggugcgcc agaucgcccc cggccagacc 1200

ggcaagaucg ccgauuacaa cuauaagcug cccgaugacu uuaccggcug cgugaucgcc 1260

uggaauagca acaaucugga uagcaaggug ggcggcaacu acaacuaccu guauaggcug 1320

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ggcucuacac ccuguaaugg cguggagggc uuuaacuguu acuuuccccu gcaguccuac 1440

ggcuuccagc ccaccaaugg cgugggcuau cagcccuaua gggugguggu gcuguccuuu 1500

gagcugcugc acgcccccgc caccgugugc ggccccaaga agagcacaaa ccuggugaag 1560

aacaagugcg ugaauuucaa cuucaacggc cugaccggca caggcgugcu gaccgagucc 1620

aauaagaagu uccugcccuu ucagcaguuc ggcagggaca ucgccgacac caccgaugcc 1680

gugagagauc cccagacacu ggagauccug gauaucaccc ccuguucuuu uggcggcgug 1740

ucugugauca caccuggcac aaauaccucu aaccaggugg ccgugcugua ucaggacgug 1800

aacuguaccg aggugcccgu ggccauccac gccgaucagc ugacccccac cuggagagug 1860

uacuccacag gcagcaacgu guuccagaca agggccggcu gucugaucgg cgccgagcac 1920

gugaacaacu ccuacgagug ugacaucccc aucggcgccg gcaucugugc cucuuaccag 1980

acccagacaa auagcccuag aagggccaga uga 2013

<210> 5

<211> 2013

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 5

gugaaccuga ccacaagaac ccagcugcca cccgccuaua ccaauagcuu uacaaggggc 60

guguauuacc ccgauaaggu guuucgcucc agcgugcugc acucuaccca ggaccuguuc 120

cugcccuuuu ucagcaacgu gaccugguuu cacgccaucc acgugagcgg cacaaacggc 180

accaagcggu ucgauaaucc agugcugccc uuuaaugacg gcguguacuu ugccucuacc 240

gagaagucca acaucauccg cggcuggauc uuuggcacca cacuggacag caagacccag 300

agccugcuga ucgugaauaa cgccaccaau gugguaauca aggugugcga guuccaguuu 360

ugcaaugacc ccuuucuggg cguguacuau cacaagaaca auaaguccug gauggagucu 420

gaguucagag uguacucuag cgccaauaac ugcaccuucg aguaugugag ccagcccuuc 480

cugauggacc uggagggcaa gcagggcaac uuuaagaacc ugagggaguu cguguucaag 540

aacaucgaug gcuacuucaa gaucuacucc aagcacaccc cuaucaaccu ggugcgggac 600

cugccacagg gcuuuuccgc ccuggagccc cugguggauc ugccaaucgg caucaauauc 660

acccgcuuuc agacccugcu ggcccugcac agaagcuacc ugacaccagg cgauuccucc 720

ucuggcugga ccgccggcgc cgccgccuau uacgugggcu aucugcagcc cagaacauuc 780

cugcugaagu acaacgagaa uggcacaauc accgaugccg uggauugugc ccuggaucca 840

cugucugaga caaagugcac ccugaagagc uucacagugg agaagggcau cuaccagacc 900

agcaauuucc gggugcagcc cacagagagc aucgugaggu ucccuaacau caccaaccug 960

ugccccuucg gcgagguguu uaaugccaca agguuugccu ccguguacgc cuggaaucgg 1020

aagaggaucu ccaacugcgu ggccgauuac uccgugcugu acaauuccgc cucuuuuagc 1080

accuucaagu guuauggcgu gucucccacc aagcugaaug aucugugcuu caccaacgug 1140

uaugccgacu cuuuugugau caggggcgac gaggugcgcc agaucgcccc uggccagacc 1200

ggcaagaucg ccgauuacaa cuacaagcug ccagaugacu uuacaggcug cgugaucgcc 1260

uggaacucca auaaucugga cuccaaggug ggcggcaauu auaauuaccu guauaggcug 1320

uuucgcaaga gcaaucugaa gcccuucgag agggauauca gcaccgagau cuaucaggcc 1380

ggcagcaccc cauguaacgg cguggagggc uucaauugcu acuucccacu gcagucuuac 1440

ggcuuccagc cuaccaacgg cgugggcuac cagccuuaua gggugguggu gcugagcuuc 1500

gagcugcugc acgccccagc caccgugugc ggcccaaaga aguccaccaa ucuggugaag 1560

aacaagugug ugaauuucaa cuuuaauggc cugacaggca ccggcgugcu gaccgagucu 1620

aacaagaagu uccugccuuu ucagcaguuu ggccgcgaca ucgccgacac cacagaugcc 1680

gugagagauc cacagacacu ggagauccug gauaucaccc ccugcagcuu uggcggcgug 1740

uccgugauca ccccaggcac aaauaccagc aaccaggugg ccgugcugua ccaggaugug 1800

aacuguaccg aggugccagu ggccauccac gccgaucagc ugacaccaac cuggagggug 1860

uacagcaccg gcuccaacgu guuucagacc agagccggcu gucugaucgg cgccgagcac 1920

gugaacaauu ccuacgagug cgacaucccu aucggcgccg gcaucugugc cagcuaucag 1980

acccagacaa acagccccag aagggcccgg uga 2013

<210> 6

<211> 2013

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 6

gugaaucuga caaccagaac ccagcugccu cccgccuaua caaacagcuu caccaggggc 60

guguacuauc cagacaaggu guucagaucu agcgugcugc acucuaccca ggaucuguuc 120

cugccuuucu uuuccaaugu gaccugguuc cacgccaucc acgugagcgg caccaauggc 180

acaaagagau ucgauaaccc ugugcugccu uuuaaugaug gcguguauuu ugccucuacc 240

gagaagagca acaucaucag gggcuggauc uuuggcacca cacuggauuc caagacccag 300

ucucugcuga ucgugaauaa ugccaccaau gugguaauca aggugugcga guuccaguuc 360

ugcaacgacc cuuuucuggg cguguauuac cacaagaaua auaagagcug gauggagucc 420

gaguuucggg uguauagcuc ugccaacaau ugcaccuucg aguacguguc ucagcccuuu 480

cugauggacc uggagggcaa gcagggcaau uucaagaacc ugagagaguu cguguucaag 540

aacaucgacg gcuauuucaa gaucuacagc aagcacaccc caaucaaccu ggugcgcgac 600

cugccucagg gcuucucugc ccuggagccc cugguggacc ugccuaucgg caucaauauc 660

accagauuuc agacccugcu ggcccugcac cggagcuacc ugacccccgg cgauagcagc 720

ucuggcugga cagccggcgc cgccgccuac uacgugggcu aucugcagcc ucggacauuc 780

cugcugaagu acaacgagaa cggcacaauc accgacgccg uggacugugc ccuggaccca 840

cugagcgaga caaagugcac ccugaagagc uuuaccgugg agaagggcau cuaucagaca 900

agcaacuuua gagugcagcc aaccgagucu aucgugagau uccccaacau caccaaccug 960

ugcccauucg gcgagguguu caacgccaca agauuugcca gcguguaugc cuggaacagg 1020

aagcggauca gcaauugcgu ggccgauuac agcgugcugu acaauuccgc cagcuucucc 1080

accuucaagu guuacggcgu guccccuaca aagcugaacg accugugcuu uaccaacgug 1140

uacgccgacu cuuuugugau caggggcgac gaggugcgcc agaucgcccc aggccagaca 1200

ggcaagaucg ccgauuauaa cuacaagcug ccagacgauu ucacaggcug cgugaucgcc 1260

uggaacagca auaaccugga cucuaaggug ggcggcaacu auaauuaucu guaccggcug 1320

uuuaggaagu ccaaucugaa gcccuuugag agggacauca gcacagagau cuaccaggcc 1380

ggcucuaccc ccuguaacgg cguggagggc uuuaacugcu acuucccccu gcagucuuac 1440

ggcuuccagc ccaccaacgg cgugggcuau cagccuuaua gggugguggu gcugucuuuc 1500

gagcugcugc acgccccugc caccgugugc ggcccaaaga aguccaccaa ucuggugaag 1560

aacaagugcg ugaacuuuaa cuucaacggc cugaccggca caggcgugcu gacagagagc 1620

aacaagaagu uccugcccuu ucagcaguuu ggccgcgaua ucgccgauac aaccgaugcc 1680

gugagagauc cccagacacu ggagauccug gauaucaccc cauguagcuu uggcggcgug 1740

ucugugauca cccccggcac aaacaccucc aaccaggugg ccgugcugua ucaggacgug 1800

aauugcaccg aggugccagu ggccauccac gccgaucagc ugaccccaac cuggagggug 1860

uacucuacag gcagcaacgu guuccagaca agagccggcu gccugaucgg cgccgagcac 1920

gugaacaauu cuuacgagug cgauaucccu aucggcgccg gcaucugugc cagcuaucag 1980

acccagacaa acuccccuag aagggcccgc uga 2013

<210> 7

<211> 597

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 7

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gccuggaaca gaaagcggau cuccaacugc guggccgauu acucugugcu guacaauagc 120

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cugcagagcu acggcuuuca gccuacaaac ggcgugggcu accagccuua ucggguggug 540

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<210> 8

<211> 597

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 8

aucaccaauc ugugcccuuu cggcgaggug uucaacgcca caagauucgc cagcguguau 60

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ugcgugaucg ccuggaacag caacaaucug gacagcaagg ugggcggcaa uuauaacuac 360

cuguaucggc uguuucgcaa guccaaccug aagccauucg agagggauau cagcaccgag 420

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<210> 9

<211> 597

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 9

aucaccaacc ugugcccauu uggcgaggug uuuaacgcca ccagauucgc cagcguguac 60

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cugcagucuu acggcuucca gccuacaaau ggcgugggcu aucagccuua cagaguggug 540

gugcugagcu ucgagcugcu gcacgccccu gccacagugu gcggcccuaa gaaguga 597

<210> 10

<211> 1260

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 10

auguccgaua auggcccaca gaaccagaga aaugccccua ggaucacauu cggcggcccu 60

uccgauucua caggcuccaa ucagaacggc gagagaucug gcgcccgguc caagcagagg 120

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gacgaucaga ucggcuauua ccgcagagcc acacggagaa ucagaggcgg cgauggcaag 300

augaaggacc uguccccuag augguacuuc uauuaccugg gcaccggccc cgaggccggc 360

cugccuuacg gcgccaauaa ggauggcauc aucugggugg ccaccgaggg cgcccugaau 420

accccuaagg accacaucgg cacaagaaau ccagccaaca augccgccau cgugcugcag 480

cugccccagg gcacaacccu gcccaagggc uuuuacgccg agggcagcag gggcggcucc 540

caggccucuu ccagaagcuc uagcagaucc agaaacagcu cccgcaacuc uacacccggc 600

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gcccugccac agagacagaa gaagcagcag acagugaccc ugcugccugc cgccgaucug 1200

gacgauuuca gcaagcagcu gcagcagucc augagcuccg ccgauucuac ccaggccuga 1260

<210> 11

<211> 1260

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 11

augagcgaua auggccccca gaaucagcgg aaugccccuc ggaucaccuu uggcggccca 60

uccgauagca caggcucuaa ucagaacggc gagcgcagcg gcgcccggag caagcagcgg 120

agaccacagg gccugccaaa caauaccgcc agcugguuca cagcccugac ccagcacggc 180

aaggaggauc ugaaguuucc cagaggccag ggcgugccaa ucaauacaaa cucuuccccc 240

gaugaccaga ucggcuacua uagaagggcc acacggagaa ucagaggcgg cgacggcaag 300

augaaggauc ugucuccccg cugguauuuc uacuaucugg gcacaggccc ugaggccggc 360

cugccauaug gcgccaacaa ggacggcauc aucugggugg ccacagaggg cgcccugaau 420

accccaaagg aucacaucgg cacaagaaac ccagccaaua acgccgccau cgugcugcag 480

cugccccagg gcaccacacu gccaaagggc uucuacgccg agggcucuag gggcggcucu 540

caggccucuu cccggucuag cuccagaucu cgcaauucca gccggaacuc uacacccggc 600

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uggccucaga ucgcccaguu ugccccuucu gccagcgccu ucuuuggcau guccagaauc 960

ggcauggagg ugacaccauc uggcacaugg cugaccuaca ccggcgccau caagcuggac 1020

gauaaggacc ccaauuucaa ggaccaggua auccugcuga acaagcacau cgaugccuau 1080

aagaccuuuc cacccacaga gccaaagaag gacaagaaga agaaggccga ugagacccag 1140

gcccugccuc agcggcagaa gaagcagcag acagugacac ugcugccagc cgccgaucug 1200

gacgauuucu cuaagcagcu gcagcagucc augucuuccg ccgacucuac ccaggccuga 1260

<210> 12

<211> 1260

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 12

augucugaua acggcccaca gaaccagagg aacgcccccc gcaucaccuu uggcggccca 60

ucugauucca ccggcucuaa ucagaacggc gagaggucug gcgccagguc caagcagaga 120

cggccacagg gccugcccaa caauaccgcc ucuugguuca cagcccugac ccagcacggc 180

aaggaggacc ugaaguuccc ccggggccag ggcgugccaa ucaauaccaa cucuuccccu 240

gaugaccaga ucggcuacua caggcgggcc acaagaagga uccggggcgg cgauggcaag 300

augaaggacc ugucccccag augguauuuc uacuaccugg gcaccggccc ugaggccggc 360

cugccuuaug gcgccaauaa ggauggcauc aucugggugg ccaccgaggg cgcccugaac 420

accccuaagg accacaucgg cacacgcaac ccugccaaua acgccgccau cgugcugcag 480

cugccucagg gcaccacacu gcccaagggc uucuaugccg agggcagccg gggcggcucu 540

caggccuccu cuaggagcuc cucuaggucc aggaacagcu cucgcaauag caccccuggc 600

uccagccgcg gcacaucucc cgcccgcaug gccggcaaug gcggcgacgc cgcccuggcc 660

cugcugcugc uggacagacu gaaucagcug gaguccaaga ugagcggcaa gggccagcag 720

cagcagggcc agacagugac caagaagucc gccgccgagg ccucuaagaa gccccgccag 780

aagaggacag ccaccaaggc cuacaacgug acccaggccu uuggcaggag aggcccugag 840

cagacccagg gcaacuucgg cgaccaggag cugaucaggc agggcacaga cuacaagcac 900

uggccacaga ucgcccaguu cgccccuagc gccucugccu uuuucggcau gucuaggauc 960

ggcauggagg ugaccccuuc cggcacaugg cugaccuaua ccggcgccau caagcuggac 1020

gauaaggacc cuaacuucaa ggaucaggua auccugcuga acaagcacau cgaugccuac 1080

aagacauuuc cacccacaga gccuaagaag gacaagaaga agaaggccga cgagacccag 1140

gcccugccuc agaggcagaa gaagcagcag accgugaccc ugcugccugc cgccgaccug 1200

gaugacuuca gcaagcagcu gcagcagagc augucuagcg ccgauucuac ccaggccuga 1260

<210> 13

<211> 4090

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 13

gggagaccca agcuggcuag cguuuaaacu uaagcuuggu accgagcucg gauccacuag 60

uccagugugg uggaauucgg gagaaagcuu accauguucg uguuccuggu gcugcugccu 120

cugguguccu cucagugcgu gaaucugaca accagaaccc agcugccacc agccuauaca 180

aacuccuuca cacggggcgu guauuacccu gacaaggugu uucgcucuag cgugcugcac 240

agcacccagg aucuguuucu gccauucuuu ucuaacguga caugguucca cgccauccac 300

guguccggca ccaacggcac aaagcgguuu gacaacccug ugcugcccuu uaaugacggc 360

guguauuucg ccuccacaga gaagagcaau aucaucaggg gcuggaucuu uggcacaacc 420

cuggacucua agacccagag ccugcugauc gugaacaaug ccaccaaugu gguaaucaag 480

gugugcgagu uccaguuuug caaugacccc uuccugggcg uguacuauca caagaacaac 540

aagucuugga uggaguccga guucagagug uacuccagcg ccaauaacug uaccuucgag 600

uacgugucuc agccauuucu gauggaucug gagggcaagc agggcaauuu caagaaccug 660

agagaguucg uguuuaagaa caucgauggc uacuucaaga ucuauuccaa gcacacccca 720

aucaaccugg ugcgggaucu gccucagggc uucucugccc uggagccacu gguggaccug 780

ccuaucggca ucaacaucac acgguuucag acacugcugg cccugcacag guccuaucug 840

accccaggcg acuccucuuc uggcuggaca gccggcgccg ccgccuacua ugugggcuac 900

cugcagccua gaacauuccu gcugaaguac aaugagaacg gcaccaucac cgacgccgug 960

gauugugccc uggauccccu gucugagaca aaguguaccc ugaaguccuu uacaguggag 1020

aagggcaucu aucagaccuc caacuucagg gugcagccca ccgagucuau cgugcgguuu 1080

ccuaacauca caaaucugug ccccuuuggc gagguguuua acgccaccag guuugccucc 1140

guguaugccu ggaacaggaa gcgcaucucu aacugcgugg ccgauuacag cgugcuguac 1200

aauagcgcca gcuuuuccac cuuuaagugu uauggcgugu cuccaacaaa gcugaacgau 1260

cugugcuuca ccaacgugua ugccgacagc uuugugaucc gcggcgacga ggugaggcag 1320

aucgcccccg gccagaccgg caagaucgcc gauuauaacu acaagcugcc ugacgacuuu 1380

accggcugcg ugaucgccug gaacagcaac aaccuggauu cuaagguggg cggcaacuau 1440

aauuaccugu aucgccuguu ccggaagucu aaccugaagc cuuucgagcg cgacaucucc 1500

accgagaucu aucaggccgg cuccacccca uguaauggcg uggagggcuu caacuguuac 1560

uuuccucugc aguccuacgg cuuucagccu acaaauggcg ugggcuacca gccuuauagg 1620

gugguggugc ugucuuuuga gcugcugcac gccccugcca ccgugugcgg ccccaagaag 1680

agcacaaacc uggugaagaa caagugcgug aauuucaacu uuaauggccu gacaggcaca 1740

ggcgugcuga ccgaguccaa uaagaaguuu cugccuuucc agcaguuugg ccgggacauc 1800

gccgauacca ccgacgccgu gagagaccca cagacacugg agauccugga caucacaccu 1860

ugcuccuucg gcggcguguc cgugaucaca ccuggcacaa auaccuccaa ucagguggcc 1920

gugcuguauc aggacgugaa cugcacagag gugccugugg ccauccacgc cgaccagcug 1980

acaccaaccu ggcgggugua uucuaccggc uccaacgugu uccagacacg cgccggcugc 2040

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aauuccaucg ccaucccaac caacuucaca aucucuguga caaccgagau ccugcccgug 2280

uccaugacca agacaagcgu ggacugcaca auguauaucu guggcgacuc uacagagugc 2340

ucuaaucugc ugcugcagua uggcuccuuu uguacccagc ugaacagagc ccugaccggc 2400

aucgccgugg agcaggacaa gaacacccag gagguguucg cccaggugaa gcagaucuac 2460

aagaccccac cuaucaagga cuucggcggc uucaauuuuu cccagauccu gcccgaccca 2520

ucuaagccca gcaagcgguc cuuuaucgag gaucugcugu ucaauaaggu gacacuggcc 2580

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aucgcccagu acaccagcgc ccugcuggcc ggcaccauca caucuggcug gaccuuuggc 2760

gccggcgccg cccugcagau cccauuugcc augcagaugg ccuaucgcuu caacggcauc 2820

ggcgugaccc agaaugugcu guaugagaau cagaagcuga ucgccaauca guuuaauagc 2880

gccaucggca agauccagga uucucugagc uccacagccu cugcccuggg caagcugcag 2940

gacgugguga aucagaacgc ccaggcccug aauacccugg ugaagcagcu guccucuaau 3000

uuuggcgcca ucuccagcgu gcugaacgac auccuguccc ggcuggauaa gguggaggcc 3060

gaggugcaga ucgacaggcu gaucacaggc agacugcagu cccugcagac cuacgugaca 3120

cagcagcuga uccgcgccgc cgagauccgg gccagcgcca aucuggccgc caccaagaug 3180

uccgagugcg ugcugggcca gagcaagagg guggacuuuu gcggcaaggg cuaccaccug 3240

auguccuuuc cacagagcgc cccccacggc gugguguucc ugcacgugac auacgugccu 3300

gcccaggaga agaacuuuac aaccgcccca gccaucuguc acgacggcaa ggcccacuuu 3360

ccccgcgagg gcguguucgu guccaauggc acccacuggu ucgugaccca gaggaauuuc 3420

uaugagccac agaucaucac aaccgacaau acauucgugu cuggcaauug cgacguggua 3480

aucggcaucg ugaauaauac aguguacgac ccucugcagc ccgagcugga uuccuucaag 3540

gaggagcugg acaaguauuu caagaaccac accuccccag acguggaccu gggcgacauc 3600

agcggcauca augccagcgu ggugaacauc cagaaggaga ucgaucgccu gaaugaggug 3660

gccaagaacc ugaaugaguc ccugaucgac cugcaggagc ugggcaagua cgagcaguau 3720

aucaaguggc ccugguacau cuggcugggc uuuaucgccg gccugaucgc caucgugaug 3780

gugacaauca ugcugugcug uaugaccucc uguugcagcu gccugaaggg cuguuguucc 3840

ugcggcagcu guuguaaguu ugacgaggau gacucugagc cugugcugaa gggcgugaag 3900

cugcacuaua ccugaggacu aguuauaaga cugacuagcc cgaugggccu cccaacgggc 3960

ccuccucccc uccuugcacc gagauuaaua aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4020

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4080

aaaaaaaaau 4090

<210> 14

<211> 2362

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 14

gggagaccca agcuggcuag cguuuaaacu uaagcuuggu accgagcucg gauccacuag 60

uccagugugg uggaauucgg gagaaagcuu accauggaug ccaugaagag aggccugugc 120

ugcgugcugc ugcugugcgg cgccguguuc gugagcaaca gcagcucuca gugcgugaau 180

cugacaacaa gaacccagcu gcccccagcc uacaccaaca gcuuuaccag aggcguguac 240

uauccagaca agguguuccg cuccagcgug cugcacagca cccaggaccu guuucugccc 300

uuuuucagca augugaccug guuccacgcc auccacgugu ccggcacaaa cggcaccaag 360

agguucgaca acccugugcu gcccuuuaau gauggcgugu acuucgccuc cacagagaag 420

agcaacauca ucagaggcug gaucuucggc acaacccugg acagcaagac ccagagccug 480

cugaucguga acaaugccac caacguggua aucaaggugu gcgaguuuca guuuuguaau 540

gacccuuuuc ugggcgugua cuaccacaag aacaauaaga gcuggaugga gagcgaguuu 600

aggguguaca gcucugccaa caacugcaca uucgaguacg ugagccagcc uuuucugaug 660

gaucuggagg gcaagcaggg caacuuuaag aaucugagag aguucguguu caagaauauc 720

gauggcuacu ucaagaucua uuccaagcac acccccauca aucuggugag ggaucugccu 780

cagggcuuca gcgcccugga gccacuggug gaccugccca ucggcaucaa caucaccagg 840

uuccagaccc ugcuggcccu gcacaggagc uaucugaccc ccggcgauag cucuuccggc 900

uggaccgccg gcgccgccgc cuacuacgug ggcuaucugc agccuaggac cuuucugcug 960

aaguacaacg agaauggcac caucacagac gccguggauu gcgcccugga cccccugagc 1020

gagaccaagu gcacccugaa gagcuuuaca guggagaagg gcaucuacca gaccagcaau 1080

uucagagugc agccaaccga gagcaucgug agauuuccca auaucaccaa ccugugccca 1140

uuuggcgagg uguucaaugc caccagauuu gccagcgugu acgccuggaa uagaaagagg 1200

aucagcaacu gcguggccga cuacagcgug cuguacaauu cugccagcuu uucuaccuuc 1260

aagugcuaug gcgugagccc aaccaagcug aacgaccugu gcuucacaaa cguguaugcc 1320

gauuccuucg ugaucagagg cgacgaggug cgccagaucg cccccggcca gaccggcaag 1380

aucgccgauu acaacuauaa gcugcccgau gacuuuaccg gcugcgugau cgccuggaau 1440

agcaacaauc uggauagcaa ggugggcggc aacuacaacu accuguauag gcuguuuaga 1500

aagagcaacc ugaagccauu cgagagagac aucagcacag agaucuacca ggccggcucu 1560

acacccugua auggcgugga gggcuuuaac uguuacuuuc cccugcaguc cuacggcuuc 1620

cagcccacca auggcguggg cuaucagccc uauagggugg uggugcuguc cuuugagcug 1680

cugcacgccc ccgccaccgu gugcggcccc aagaagagca caaaccuggu gaagaacaag 1740

ugcgugaauu ucaacuucaa cggccugacc ggcacaggcg ugcugaccga guccaauaag 1800

aaguuccugc ccuuucagca guucggcagg gacaucgccg acaccaccga ugccgugaga 1860

gauccccaga cacuggagau ccuggauauc acccccuguu cuuuuggcgg cgugucugug 1920

aucacaccug gcacaaauac cucuaaccag guggccgugc uguaucagga cgugaacugu 1980

accgaggugc ccguggccau ccacgccgau cagcugaccc ccaccuggag aguguacucc 2040

acaggcagca acguguucca gacaagggcc ggcugucuga ucggcgccga gcacgugaac 2100

aacuccuacg agugugacau ccccaucggc gccggcaucu gugccucuua ccagacccag 2160

acaaauagcc cuagaagggc cagaugagga cuaguuauaa gacugacuag cccgaugggc 2220

cucccaacgg gcccuccucc ccuccuugca ccgagauuaa uaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2280

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2340

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa au 2362

<210> 15

<211> 934

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 15

gggagaccca agcuggcuag cguuuaaacu uaagcuuggu accgagcucg gauccacuag 60

uccagugugg uggaauucgg gagaaagcuu accauggaug ccaugaagag gggccugugc 120

ugcgugcugc ugcugugcgg cgccguguuc gugagcaacu ccaucaccaa ucugugcccu 180

uuuggcgagg uguucaaugc caccagauuc gccuccgugu augccuggaa cagaaagcgg 240

aucuccaacu gcguggccga uuacucugug cuguacaaua gcgccucuuu cuccaccuuu 300

aaguguuacg gcgugucccc uaccaagcug aaugaccugu gcuucaccaa cguguacgcc 360

gauuccuuug ugauccgcgg cgacgaggug cgccagaucg ccccuggcca gacaggcaag 420

aucgccgacu auaacuacaa gcugccugac gauuucacag gcugcgugau cgccuggaac 480

agcaauaacc uggacucuaa ggugggcggc aauuacaacu accuguaucg gcuguuccgc 540

aagagcaauc ugaagcccuu ugagcgggau aucuccaccg agaucuauca ggccggcucu 600

acaccaugca auggcgugga gggcuucaac ugcuacuucc cucugcagag cuacggcuuu 660

cagccuacaa acggcguggg cuaccagccu uaucgggugg uggugcugag cuuugagcug 720

cugcacgccc cugccacagu gugcggcccu aagaagugag gacuaguuau aagacugacu 780

agcccgaugg gccucccaac gggcccuccu ccccuccuug caccgagauu aauaaaaaaa 840

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaau 934

<210> 16

<211> 1528

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 16

gggagaccca agcuggcuag cguuuaaacu uaagcuuggu accgagcucg gauccacuag 60

uccagugugg uggaauucgg gagaaagcuu accauguccg auaauggccc acagaaccag 120

agaaaugccc cuaggaucac auucggcggc ccuuccgauu cuacaggcuc caaucagaac 180

ggcgagagau cuggcgcccg guccaagcag aggagaccac agggccugcc caacaauacc 240

gccagcuggu uuaccgcccu gacccagcac ggcaaggagg aucugaaguu ucccaggggc 300

cagggcgugc cuaucaacac caauuccagc ccagacgauc agaucggcua uuaccgcaga 360

gccacacgga gaaucagagg cggcgauggc aagaugaagg accugucccc uagaugguac 420

uucuauuacc ugggcaccgg ccccgaggcc ggccugccuu acggcgccaa uaaggauggc 480

aucaucuggg uggccaccga gggcgcccug aauaccccua aggaccacau cggcacaaga 540

aauccagcca acaaugccgc caucgugcug cagcugcccc agggcacaac ccugcccaag 600

ggcuuuuacg ccgagggcag caggggcggc ucccaggccu cuuccagaag cucuagcaga 660

uccagaaaca gcucccgcaa cucuacaccc ggcuccagca ggggcacaag cccugccaga 720

auggccggca acggcggcga cgccgcccug gcccugcugc ugcuggauag acugaaccag 780

cuggagagca agaugagcgg caagggccag cagcagcagg gccagaccgu gacaaagaag 840

ucugccgccg aggccagcaa gaagccuaga cagaagagaa ccgccacaaa ggccuacaac 900

gugacccagg ccuucggcag aagaggcccc gagcagaccc agggcaacuu uggcgaccag 960

gagcugaucc ggcagggcac cgauuacaag cacuggccuc agaucgccca guucgccccu 1020

ucugccuccg ccuucuuugg cauguccaga aucggcaugg aggugacccc cuccggcaca 1080

uggcugacau auaccggcgc caucaagcug gaugacaagg auccaaacuu caaggaccag 1140

guaauccugc ugaauaagca caucgacgcc uauaagaccu uuccacccac agagccaaag 1200

aaggacaaga agaagaaggc cgacgagacc caggcccugc cacagagaca gaagaagcag 1260

cagacaguga cccugcugcc ugccgccgau cuggacgauu ucagcaagca gcugcagcag 1320

uccaugagcu ccgccgauuc uacccaggcc ugaggacuag uuauaagacu gacuagcccg 1380

augggccucc caacgggccc uccuccccuc cuugcaccga gauuaauaaa aaaaaaaaaa 1440

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1500

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaau 1528

<210> 17

<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 17

ggcuagcgcc gccacc 16

<210> 18

<211> 34

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 18

gagacccaag cuggcuagcg ggagaaagcu uacc 34

<210> 19

<211> 109

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 19

gcuggagccu cgguagccgu uccuccugcc cgcugggccu cccaacgggc ccuccucccc 60

uccuugcacc ggcccuuccu ggucuuugaa uaaagucuga gugggcagc 109

Claims (10)

1.编码SARS-CoV-2病毒抗原的mRNA，其特征在于，所述mRNA至少含有编码SARS-CoV-2病毒的S蛋白和N蛋白中的至少一个蛋白，和/或至少一个蛋白的片段的编码区。

2.根据权利要求1所述的mRNA，其特征在于，编码区编码的S蛋白和N蛋白中的至少一个蛋白，和/或至少一个蛋白的片段的氨基酸序列来源于如下毒株中的至少一种：SARS-CoV-2isolate Wuhan-Hu-1、2019-nCoV WHU01、2019-nCoV_HKU-SZ-002a_2020、2019-nCoV_HKU-SZ-005b_2020、2019-nCoV/Japan/AI/I-004/2020、2019-nCoV/Japan/KY/V-029/2020、2019-nCoV/Japan/TY/WK-012/2020、BetaCoV/Korea/KCDC03/2020和2019-nCoV/USA-WA1/2020；

优选地，编码区的核苷酸序列经过优化，所述优化包括提高编码区的G/C含量和/或密码子优化；

优选地，编码区编码S蛋白的全长；

优选地，编码S蛋白全长的编码区如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示；

优选地，编码区编码S蛋白的S1亚基；

优选地，编码S1亚基的编码区如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示；

优选地，编码区编码S蛋白的受体结合区；

优选地，编码受体结合区的编码区如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9所示；

优选地，编码N蛋白的编码区如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12所示。

3.根据权利要求1或2所述的mRNA，其特征在于，所述mRNA还包括5’-帽结构、3’端聚腺苷酸序列、5’UTR和3’UTR中的至少一种；

优选地，5’-帽结构优选包括ARCA、m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG、m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG、m7(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeG)pG、m7(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeA)pG、mCAP、dmCAP、tmCAP或dmCAP；

优选地，3’端聚腺苷酸序列的长度为50-200个A，更优选为80-200个A；

优选地，5’UTR的长度为10-200个核苷酸，更优选为15-100个核苷酸；

优选地，5’UTR包括DNAH2 5’UTR序列或KOZAK序列；KOZAK序列优选如SEQ ID NO.17所示，DNAH2 5’UTR序列优选如SEQ ID NO.18所示；

优选地，3’UTR包括来源于提供稳定的mRNA的基因的3’UTR或来源于提供稳定的mRNA的基因的3’UTR的同源物，片段或变体；

优选地，所述提供稳定的mRNA的基因包括白蛋白基因、α-珠蛋白基因、β-珠蛋白基因、酪氨酸羟化酶基因、脂氧合酶基因或胶原蛋白α基因；

优选地，3’UTR包括血红蛋白HBA2的3’UTR序列或β-珠蛋白3’-UTR序列；所述血红蛋白HBA2的3’UTR序列如SEQ ID NO.19所示；

优选地，所述mRNA包括5’-帽结构、3’端聚腺苷酸序列、5’UTR和3’UTR；

优选地，所述mRNA编码S蛋白全长，序列如SEQ ID NO.13所示；

优选地，所述mRNA编码S1亚基，序列如SEQ ID NO.14所示；

优选地，所述mRNA编码S蛋白的受体结合区，序列如SEQ ID NO.15所示；

优选地，所述mRNA编码N蛋白，序列如SEQ ID NO.16所示；

优选地，所述mRNA含有经过修饰的核苷酸和/或未经修饰的核苷酸；

优选地，全序列使用未经修饰的核苷酸；

优选地，所述修饰包括L-核苷修饰和/或2’-O-甲基化修饰；

优选地，所述mRNA含有修饰的UTP和/或CTP；

优选地，修饰的核苷酸包括将UTP替换为pseudo-UTP；

优选地，修饰的核苷酸位于编码区、5’-UTR区、3’-UTR区和帽子区中至少一种。

4.生物材料，其特征在于，所述生物材料包括如下(x1)～(x4)中的至少一种；

(x1)编码权利要求1-3任一项所述的mRNA的DNA分子；

(x2)含有(x1)的表达盒或载体；

(x3)包含权利要求1-3任一项所述的mRNA、(x1)和(x2)中至少一种的微生物；

(x4)包含权利要求1-3任一项所述的mRNA、(x1)和(x2)中至少一种的细胞。

5.疫苗，其特征在于，所述疫苗包括权利要求1-3任一项所述的mRNA或权利要求4所述的生物材料；

优选地，所述mRNA溶解于缓冲液；

优选地，所述缓冲液包括PBS；

优选地，所述缓冲液的pH为3～7；

优选地，pH为3～7的缓冲液包括柠檬酸盐缓冲液或乙酸盐缓冲液；

优选地，所述mRNA在缓冲液中的浓度为0.05～0.5mg/mL。

6.根据权利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗还包括递送制剂；

优选地，所述递送制剂优选包括脂质；

优选地，脂质和mRNA的质量比为1:1-40:1；

优选地，所述疫苗还包括佐剂；

优选地，所述佐剂包括药学上可接受的用于提高免疫刺激的核酸、蛋白、脂多糖和小分子化合物中的至少一种；

优选地，所述核酸包括CpG和/或编码并在体内表达用于提高免疫刺激的物质的mRNA；

优选地，所述编码并在体内表达用于提高免疫刺激的物质的mRNA编码细胞因子；

优选地，所述细胞因子包括肿瘤坏死因子家族、白介素家族、干扰素家族和集落刺激因子家族中的至少一种，优选包括干扰素，更优选包括IFN-α；

优选地，所述编码并在体内表达用于提高免疫刺激的物质的mRNA编码IFN-α，编码SARS-CoV-2病毒抗原的mRNA和编码IFN-α的mRNA的摩尔比为10:1-1:1。

7.根据权利要求6所述的疫苗，其特征在于，所述递送制剂包括阳离子脂质纳米颗粒或阳离子脂质体；

优选地，阳离子脂质纳米颗粒和mRNA的质量比为1:1-40:1；

优选地，按摩尔百分比计所述阳离子脂质纳米颗粒包括20-50％可质子化阳离子脂质、20-50％结构脂质、5-20％辅助脂质和1-5％表面活性剂，其中，可质子化阳离子脂质、结构脂质、辅助脂质和表面活性剂的摩尔含量合计100％；

优选地，所述可质子化阳离子脂质包括Dlin-MC3-DMA、DODMA、C12-200和DlinDMA中的至少一种，优选包括Dlin-MC3-DMA；

优选地，所述结构脂质包括胆固醇和/或胆固醇衍生物，优选包括胆固醇；

优选地，所述辅助脂质包括DSPC、DOPE、DOPC、DOPG和DOPS中的至少一种；

优选地，所述表面活性剂包括PEG-DMG、PEG-DSPE和TPGS中的至少一种；

优选地，递送制剂包括阳离子脂质纳米颗粒的疫苗的给药方式包括静脉注射、肌肉注射或皮内注射，优选为肌肉注射；

优选地，所述阳离子脂质体包括中性辅助脂质和阳离子脂质；

优选地，所述中性辅助脂质包括DOPE、DOPC和cholesterol中的至少一种，优选包括DOPE；

优选地，所述阳离子脂质包括DOTAP、DOTMA、DC-chol和DOSPA中的至少一种，优选包括DOTAP或DOTMA；

优选地，阳离子脂质和中性辅助脂质的摩尔比为2:1～3:1。

8.权利要求5-7任一项所述的疫苗的制备方法，其特征在于，包括将权利要求1-3任一项所述的mRNA和递送制剂混合，得到所述疫苗；

优选地，先将所述编码SARS-CoV-2病毒抗原的mRNA与佐剂混合，再与递送制剂混合，得到所述疫苗；或，

先将所述编码SARS-CoV-2病毒抗原的mRNA与递送制剂混合，再与佐剂混合，得到所述疫苗；

优选地，所述佐剂包括所述编码并在体内表达用于提高免疫刺激的物质的mRNA，所述制备方法包括先将所述编码并在体内表达用于提高免疫刺激的物质的mRNA和所述编码SARS-CoV-2病毒抗原的mRNA先混合的到mRNA混合物，再将所述mRNA混合物与所述递送制剂混合，得到所述疫苗。

9.根据权利要求8所述的疫苗的制备方法，其特征在于，包括将阳离子脂质纳米颗粒和mRNA混合，得到所述疫苗；

优选地，所述制备方法包括：

(a)按配方量将可质子化阳离子脂质、结构脂质、辅助脂质和表面活性剂溶于有机溶液，得到有机相；

(b)将mRNA溶于缓冲液中，得到水相；

(c)将有机相和水相混匀得到混合液，替换混合液中的溶媒为缓冲液，得到疫苗；

优选地，所述有机相包括C1～C4低碳醇，优选包括乙醇；

优选地，有机相中可质子化阳离子脂质、结构脂质、辅助脂质和表面活性剂的总浓度为5-7mg/ml；

优选地，步骤(b)中的缓冲液包括柠檬酸盐缓冲液或醋酸钠溶液；

优选地，水相中mRNA的浓度为0.08-1.2mg/ml；

优选地，有机相和水相的体积比为1：2-4；

优选地，混匀采用微流控设备，流速控制为>3ml/min；

优选地，替换混合液中的溶媒为缓冲液包括：用缓冲液将混合液稀释50-100倍，再浓缩。

10.根据权利要求8所述的疫苗的制备方法，其特征在于，包括将mRNA和阳离子脂质体在工作液中混合得到所述疫苗；

优选地，所述工作液包括去离子水、超纯水、氯化钠溶液或PBS；

优选地，mRNA在工作液中的浓度为0.01-0.5mg/ml；

优选地，所述工作液为PBS时，阳离子脂质体和mRNA的质量比为1:1-4:1；

优选地，阳离子脂质体的制备方法包括提供含有中性辅助脂质和阳离子脂质的溶液，将所述溶液依次去除溶剂、干燥、水化和超声，得到阳离子脂质体；

优选地，所述溶剂包括氯仿和/或二氯甲烷与甲醇的混合液；

优选地，所述干燥包括：真空干燥1.5-2.5小时；

优选地，所述水化包括：采用无RNA酶超纯水在35-39℃震荡8-12分钟，水化后阳离子脂质体浓度为2.5-3.5mg/ml；

优选地，所述超声包括：38-42℃超声35-45分钟。

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