CN111821433A

CN111821433A - mRNA疫苗及其合成方法、试剂盒

Info

Publication number: CN111821433A
Application number: CN202010273020.1A
Authority: CN
Inventors: 张苗苗
Original assignee: Shenzhen Ruiji Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shenzhen Ruiji Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-02-06
Filing date: 2020-04-08
Publication date: 2020-10-27
Anticipated expiration: 2040-04-08
Also published as: CN111821433B

Abstract

本发明公开一种mRNA疫苗及其合成方法、试剂盒，所述mRNA疫苗由：三聚体刺突糖蛋白S的表位抗原基因序列，和/或，跨膜蛋白‑包膜E的表位抗原基因序列，和/或，膜糖蛋白M的表位抗原基因序列，和/或，核衣壳N的表位抗原基因序列，和/或，三聚体刺突糖蛋白中的受体结合域RBD的表位抗原基因序列制备得到。本发明技术方案通过基因工程的方法设计mRNA疫苗，以实现对新型冠状病毒的免疫。

Description

mRNA疫苗及其合成方法、试剂盒

本申请要求2020年02月06日申请的，申请号为202010083614.6，发明名称为“mRNA疫苗及其合成方法、试剂盒”中国专利申请的优先权。

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，特别涉及一种mRNA疫苗及其合成方法、试剂盒。

背景技术

冠状病毒(Coronavirus)是自然界广泛存在的一类RNA病毒，因该病毒形态在电镜下观察类似王冠而得名。冠状病毒是一个成员众多的大家族，仅感染脊椎动物，可引起人和动物呼吸道、消化道和神经系统疾病。新型冠状病毒(2019-nCoV)呈现球形椭球形，直径在80-120nm。在电子显微镜下，病毒粒表面有球棒状的突出部分，由三聚体刺突糖蛋白(Spike，S)组成。病毒的包膜由膜糖蛋白(membrane glycoprotein，M)构成，通过三个跨膜结构域嵌入病毒包膜里中。此外，少量的小的跨膜蛋白-包膜(envelope，E)蛋白也出现在包膜中。最后，核衣壳(nucleocapsid，N)蛋白以串珠的形式结合到 RNA基因组上，形成螺旋对称的核衣壳。研究结果显示，S、M、E和N蛋白是冠状病毒引起机体免疫反应的主要成分。此外，S蛋白中的受体结合域 (receptor binding domain,RBD)通过与人的ACE2蛋白相互作用从而感染人的呼吸道上皮细胞。

mRNA疫苗在安全性、快速制备和免疫原性方面具有颠覆性的优势。传统的灭活疫苗、减毒疫苗以及多肽疫苗，研发周期长、生产工艺复杂，通常生产一种传统流感疫苗至少需要5-6个月的时间；但是mRNA疫苗可以实现标准化生产，从抗原序列设计到生产只需要6周时间。且mRNA疫苗不存在减毒疫苗潜在的逆转危险；不存在灭活疫苗的恢复突变问题。在免疫原性上，mRNA 疫苗能够诱导B细胞和T细胞免疫应答，能引起免疫记忆效果，传递更多有效抗原，并且能一次表达多个抗原。

此外，与DNA疫苗相比，mRNA疫苗有着明显优势：首先，mRNA疫苗比DNA疫苗药效更加明显，具体表现为DNA疫苗需要穿过细胞膜和核膜才能表达成抗原，当没有足够剂量的DNA到达细胞核时，疫苗将无法激活体内免疫系统以及诱导抗体的产生；而mRNA只需要穿过细胞膜在细胞质中就可以高效表达抗原蛋白。其次，mRNA疫苗比DNA疫苗生物安全性更高，具体地，外源DNA有一定几率整合到人体基因组中，因此DNA疫苗有引起基因组突变的风险；而mRNA没有基因整合到基因组中的风险。再次，mRNA被翻译成蛋白质后易被降解，其瞬时表达的特性不仅确保了mRNA药物的安全性，而且使其剂量可控，避免了疫苗药物长期暴露引起的抗原免疫耐受(对特定抗原无反应的状态)。并且，由于不需要动物来源的病毒参与到疫苗研发过程中，规避了病毒和动物使用风险，同时可以短期内获得有效抗原。

相关技术中，未发现能应对新型冠状病毒(2019-nCoV)的mRNA疫苗。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种mRNA疫苗，旨在至少解决上述出现的至少一个技术问题。

为实现上述目的，本发明提出一种mRNA疫苗，所述mRNA疫苗由：

三聚体刺突糖蛋白S的表位抗原基因序列，和/或

跨膜蛋白-包膜E的表位抗原基因序列，和/或

膜糖蛋白M的表位抗原基因序列，和/或

核衣壳N的表位抗原基因序列，和/或

三聚体刺突糖蛋白中的受体结合域RBD的表位抗原基因序列制备得到，

其中，三聚体刺突糖蛋白S的表位抗原基因序列选自SEQ ID：1或2，跨膜蛋白-包膜E的表位抗原基因序列选自SEQ ID：3或4，膜糖蛋白M的表位抗原基因序列选自SEQ ID：5或6，核衣壳N的表位抗原基因序列选自SEQ ID：7或8，三聚体刺突糖蛋白中的受体结合域RBD的表位抗原基因序列选自SEQ ID：9或10。具体地，所述SEQ ID：1～10的DNA序列如下列表1所示。

表1

可选地，所述mRNA疫苗由跨膜蛋白-包膜E的表位抗原基因序列、膜糖蛋白M的表位抗原基因序列和核衣壳N的表位抗原基因序列制备得到。

可选地，所述mRNA疫苗由三聚体刺突糖蛋白S的表位抗原基因序列、膜糖蛋白M的表位抗原基因序列、跨膜蛋白-包膜E的表位抗原基因序列和核衣壳N的表位抗原基因序列制备得到。

可选地，所述mRNA疫苗由三聚体刺突糖蛋白S的表位抗原基因序列、膜糖蛋白M的表位抗原基因序列、跨膜蛋白-包膜E的表位抗原基因序列、核衣壳N的表位抗原基因序列和三聚体刺突糖蛋白中的受体结合域RBD的表位抗原基因序列制备得到。

可选地，所述表位抗原基因序列之间由连接肽隔开。

本发明还提供一种规模化合成mRNA疫苗的方法，该方法包括：

a、根据新型冠状病毒的基因组测序结果，设计并人源化三聚体刺突糖蛋白S的表位抗原基因序列，和/或

跨膜蛋白-包膜E的表位抗原基因序列，和/或

膜糖蛋白M的表位抗原基因序列，和/或

核衣壳N的表位抗原基因序列，和/或

三聚体刺突糖蛋白中的受体结合域RBD的表位抗原基因序列；

b、根据步骤a中人源化后的表位抗原基因序列合成编码三聚体刺突糖蛋白S，和/或

跨膜蛋白-包膜E，和/或

膜糖蛋白M，和/或

核衣壳N，和/或

三聚体刺突糖蛋白中的受体结合域RBD的DNA片段，并将所述DNA片段连接到DNA载体上，酶切后进行体外转录，以获得如上所述的mRNA疫苗；

c、将步骤b中获得的mRNA疫苗进行纯化，所纯化方法包括氯化锂/乙醇沉淀、离心柱、氯萃取/乙醇沉淀、凝胶纯化或高效液相色谱纯化中的一种或其组合，以获得纯化后的mRNA疫苗。

可选地，所述步骤b中将所述DNA片段连接到DNA载体上，酶切后进行体外转录，以获得mRNA疫苗的步骤具体包括：

将所述DNA片段连接到pcDNA3.3载体上，酶切后进行体外转录，得到未加帽的mRNA，然后向所述未加帽的mRNA中加入加帽酶，给未加帽的 mRNA的5'端加上帽子结构，以获得具有帽子1结构和帽子2结构的常规 mRNA疫苗，和/或加入抗反向帽类似物ARCA进行体外共转录，得到具有帽子0结构的常规mRNA疫苗；或，

将所述DNA片段连接到pcDNA3.3-nsPs载体上，酶切后进行体外转录，得到未加帽的mRNA，然后向所述未加帽的mRNA中加入加帽酶，给未加帽的mRNA的5'端加上帽子结构，以获得具有帽子1结构和帽子2结构的能实现自我复制的长效mRNA疫苗，和/或加入抗反向帽类似物ARCA进行体外共转录，得到具有帽子0结构的能实现自我复制的长效mRNA疫苗。

可选地，所述加帽酶包括RNA三磷酸酶、RNA谷氨酸转移酶、鸟嘌呤-7- 甲基转移酶或二氧基甲基化转移酶中的一种或其组合。

可选地，所述帽子结构为帽子1结构和帽子2结构中的一种或其组合。

本发明还提供了一种试剂盒，包括如上所述的mRNA疫苗。

本发明技术方案通过基因工程的方法设计并优化新型冠状病毒 2019-nCoV中具有免疫源性的三聚体刺突糖蛋白S、跨膜蛋白-包膜E、膜糖蛋白M、核衣壳N以及三聚体刺突糖蛋白中的受体结合域RBD的基因序列，以实现人源细胞高效表达增加免疫源性，然后通过IVT方法合成编码病毒抗原片段的mRNA，以实现对新型冠状病毒的免疫。整个mRNA疫苗生产周期短、工艺操作简单、生产成本低，保存时间久，不需要冷链，便于运输。且 mRNA疫苗适用性更广，序列可以灵活设计，以应对不同的病原体，针对急性传染病疫苗快速研发有及其重要的作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明常规mRNA疫苗(图中A)和长效mRNA疫苗(图中B)的原理图；

图2为本发明实施例中新型冠状病毒(2019-nCoV)基因组注释图；

图3为本发明实施例中编码不同抗原片段的常规mRNA疫苗(图中A)和长效mRNA疫苗(图中B)的表达结果图；

图4为本发明实施例中小鼠体内mRNA疫苗的抗原表达图；

图5为图4中的结果数据图；

图6为本发明实施例中常规mRNA疫苗接种后小鼠免疫反应结果图；

图7为本发明实施例中长效mRNA疫苗接种后小鼠免疫反应结果图；

图8为本发明实施例中常规mRNA疫苗接种后小鼠对灭活的新型冠状病毒 (2019-nCoV)的免疫反应结果图；

图9为本发明实施例中长效mRNA疫苗接种后小鼠对灭活的新型冠状病毒(2019-nCoV)的免疫反应结果图；

图10为本发明实施例中接种常规mRNA疫苗后实验猴血清中和抗体检测结果图；

图11为本发明实施例中接种长效mRNA疫苗后实验猴血清中和抗体检测结果图；

图12为本发明实施例中接种常规mRNA疫苗后，实验猴体内细胞免疫和反应抗体的检测结果图；

图13为本发明实施例中接种长效mRNA疫苗后，实验猴体内细胞免疫和反应抗体的检测结果图。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例及附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。且下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法等。

参见图1和图2，其中，图1为本发明实施例中规模化合成mRNA疫苗的方法的原理图，图2为实施例中新型冠状病毒(2019-nCoV)基因组注释图。本发明实施例中根据新型冠状病毒(2019-nCoV)的基因组测序结果，设计mRNA 序列，以使其能编码具有免疫源性的病毒蛋白片段(包括三聚体刺突糖蛋白S (以下简称S蛋白)、膜糖蛋白M(以下简称M蛋白)、跨膜蛋白-包膜E(以下简称E蛋白)、核衣壳N(以下简称N蛋白)以及三聚体刺突糖蛋白中的受体结合域RBD(以下简称RBD)，也即能编码相应的抗原多肽片段；然后对设计的mRNA序列进行人源化优化，以增强该mRNA在哺乳动物细胞中的表达水平，并通过优化UTR序列增强mRNA分子的稳定性和翻译效率，以获得优化后的mRNA序列；最后将优化后的mRNA序列对应的DNA序列克隆至 pcDNA3.3质粒(以获得常规的mRNA疫苗)或pcDNA3.3-nsPs质粒(以获得长效的mRNA疫苗)上，酶切、核苷酸修饰、体外转录、加帽酶加帽，以得到加帽的mRNA分子；纯化，获得纯化后的mRNA疫苗。

同时，本发明拟通过生物信息学和基因工程学方法，分别将S蛋白、E蛋白、M蛋白、N蛋白及RBD的金银序列进行序列优化，并将其克隆到pcDNA3.3 载体中进行mRNA合成，以获得一种优化的mRNA疫苗。基于此，本发明提出了一种mRNA疫苗、规模化合成mRNA疫苗的方法及试剂盒。下述内容将针对所述mRNA疫苗的抗原表达及动物活体实验作详细介绍。

应当理解，本发明实施例中涉及的常规mRNA疫苗和长效mRNA疫苗的区别在于：长效mRNA分子能在细胞质中进行自我复制，以增强编码抗原片段的 mRNA含量，并且延长了mRNA分子的半衰期，相较于常规mRNA分子能表达更多的抗原产物。mRNA分子进入细胞后的工作原理如下：mRNA分子进入细胞后经过内体逃逸、核糖体识别、蛋白翻译、蛋白酶体剪切、抗原呈递或抗原外泌等步骤在体内实现新型冠状病毒(2019-nCoV)抗原的表达，并引起体内自体免疫反应。

实施例1常规mRNA疫苗和长效mRNA疫苗的抗原

本实施例中将编码不同抗原片段的常规mRNA疫苗和能实现自我复制的长效mRNA疫苗转染293T细胞，12小时后通过蛋白印迹检测疫苗所编码的抗原的表达结果。

1)转染试剂的准备。将100ng mRNA与转染试剂TransIT充分混合后加入 50uL无血清培养基，室温静置5min。

2)细胞转染。除去培养板中的培养基，用PBS或无血清培养基清洗一次，加入200uL新鲜培养基；然后将步骤1)中制备的转染试剂均匀加入细胞培养基中。

3)蛋白质印迹实验。24小时后，将步骤2)中的细胞裂解并收集裂解液进行蛋白质印迹实验。按常规分子生物学实验方法，检测常规mRNA疫苗和长效mRNA疫苗在293T细胞中的表达量。并得到如图3所示的结果。

4)结果分析。其中，图中A实验组为常规mRNA疫苗的抗原检测实验组，其包括5小组实验，该5小组实验分别为采用S蛋白、M蛋白、E蛋白、N蛋白及 RBD的基因序列制备的常规mRNA疫苗在293T细胞中对应的抗原产量印迹实验，每小组实验中包含3个WB(蛋白质印迹实验)结果，从左至右分别表示：空白对照组，未转染mRNA疫苗的293T细胞；标签抗体WB结果，mRNA编码的抗原在293T细胞中表达后，用His标签抗体杂交得到的结果；抗血清WB结果，mRNA编码的抗原在293T细胞中表达后，用恢复的病人的血清(含有针对新型冠状病毒2019-nCoV的抗体)得到的结果。图中B实验组为长效mRNA 疫苗的抗原检测试验组。由图3可知，由S蛋白、M蛋白、E蛋白、N蛋白及RBD 的基因序列制备的mRNA疫苗均能在293T细胞中表达对应的抗原，且该mRNA 疫苗在293T细胞中表达的抗原与针对新型冠状病毒2019-nCoV的抗体存在特异性结合。其中，根据S蛋白基因序列制备的mRNA疫苗在293T细胞中表达的抗原分子量为120～170kDa，根据E蛋白基因序列制备的mRNA疫苗在293T细胞中表达的抗原分子量为10kDa，根据M蛋白基因序列制备的mRNA疫苗在293T 细胞中表达的抗原分子量为20kDa，根据N蛋白基因序列制备的mRNA疫苗在 293T细胞中表达的抗原分子量为30～50kDa，根据RBD基因序列制备的mRNA 疫苗在293T细胞中表达的抗原分子量为30kDa。

实施例2mRNA疫苗在细胞中的表达产量

1、根据表1将SEQ ID：1、SEQ ID：3、SEQ ID：5、SEQ ID：7和SEQ ID： 9通过连接肽连接成一个序列Opti-1，和将SEQ ID：2、SEQ ID：4、SEQ ID： 6、SEQ ID：8和SEQ ID：10通过连接肽连接成一个序列Opti-2以合成编码S蛋白、M蛋白、E蛋白、N蛋白和RBD的DNA片段，并将所述DNA片段和编码荧光素酶的DNA序列的片段同时克隆到DNA质粒载体上，使得抗原与荧光素酶形成融合蛋白，将所述DNA质粒载体线性化后，体外转录合成mRNA疫苗。同时，设立对照组，寻找市场上存在的新型冠状病毒mRNA的优化方案(Other 1～5)，合成对照mRNA疫苗。并将上述制备的mRNA疫苗注射至小鼠体内，得到如图4和图5所示的结果。具体地，Other 1～5序列根据表2所示序列进行优化。

2、结果分析。其中，图4为接种mRNA疫苗后的小鼠体内荧光素酶(即抗原)的表达，图中从左至右的小鼠分别为Opti-1、Opti-2、Other 1、Other 2、 Other 3、Other 4和Other5小鼠，由图4可知，在6小时时，Opti-1和Opti-2小鼠体内均能检测到大量荧光物质，而Other 1～5小鼠体内未检测到荧光物质，说明通过本发明优化的序列制备的mRNA疫苗能更快的在体内实现表达；在24 小时时，Other 1～5小鼠体内也检测到荧光物质；168小时时，Opti-1和Opti-2 小鼠体内仍能检测到荧光物质，而Other 1～5小鼠体内检测不到荧光物质，说明通过本发明优化的序列制备的mRNA疫苗在体内表达维持的时间比通过市场上存在的新型冠状病毒mRNA的优化方案合成的普通mRNA疫苗维持的时间长。图5为Opti-1、Opti-2、Other 1、Other 2、Other 3、Other 4和Other 5小鼠体内抗原表达的数据图，由图5可知，Opti-1和Opti-2小鼠在6小时时可检测到体内的荧光信号强度高达10⁶～10⁷，而Other 1～5小鼠检测不到荧光信号；在24 小时时，Opti-1和Opti-2小鼠体内的荧光信号强度仍然维持在10⁶～10⁷，只有 Other 1和Other 2小鼠体内检测到10⁵～10⁶的荧光信号；在168小时时，Opti-1和 Opti-2小鼠体内的荧光信号强度仍有10⁴～10⁵，而Other 1～5小鼠体内检测不到荧光信号，说明由本发明优化的序列制备的mRNA疫苗在体内的抗原表达量高，抗原表达维持的时间长，mRNA疫苗在体内的稳定性好。

实施例3mRNA疫苗的免疫应答

1、接种疫苗。对小鼠接种新型冠状病毒2019-nCoV mRNA疫苗(具体地，分别接种实施例1中制备的常规mRNA疫苗(参见图6)和长效mRNA疫苗(参见图7))，对细胞内的细胞因子染色，以量化在CD4(左)和CD8(右)中不同抗原mRNA序列制备的mRNA疫苗刺激小鼠T细胞后产生IFN-g(干扰素γ)或TNF-a(肿瘤坏死因子)的活化T细胞百分比。检测在第0、1和2周时，用荧光素酶mRNA免疫的小鼠T细胞(每组n＝5)或mRNA疫苗免疫的小鼠T细胞(每组n＝5)的活化T细胞的百分比，得到如图6中A和图7中A所示的数据结果。

2、mRNA疫苗诱导的抗体应答。采用光密度测定免疫小鼠血清中新型冠状病毒2019-nCoV抗体的终点稀释ELISA滴度，得到如图6中B(左)和图7 中B(左)所示的数据结果。采用微量中和实验对热灭活血清的两倍稀释液进行测定，以检测抗体是否能中和Vero细胞单层细胞中新型冠状病毒2019-nCoV 假病毒的50％感染单位(简称CCID50)；于96孔板上稀释4孔，在第3天和第4 天时检测细胞的病毒性病变作用(cpe)，通过Reed Muench公式计算出完全抑制cpe的血清在50％终点法中测定的血清稀释度；采用非参数双尾t检测 (Mann-Whiteny)进行统计分析，得到如图6中B(右)和图7中B(右)所示的数据结果。

3、结果分析。

如图6中A和图7中A所示，其中，Control为未使用mRNA疫苗的活化T细胞占比，S表示能编码S蛋白的mRNA疫苗，E表示能编码E蛋白的mRNA疫苗，M表示能编码M蛋白的mRNA疫苗，N表示能编码N蛋白的mRNA疫苗，RBD 表示能编码RBD的mRNA疫苗，S/E/M/N/RBD表示能同时编码S蛋白、E蛋白、 M蛋白、N蛋白和RBD的mRNA疫苗，S/E/M/N表示能同时编码S蛋白、E蛋白、 M蛋白和N蛋白mRNA疫苗，E/M/N表示能同时编码E蛋白、M蛋白和N蛋白 mRNA疫苗。可知，小鼠T细胞在S、E、M、N、RBD、S/E/M/N/RBD、S/E/M/N 和E/M/N mRNA疫苗刺激下均能产生IFN-g(干扰素γ)或TNF-a(肿瘤坏死因子)，其中，在S/E/M/N/RBD mRNA疫苗中检测到的活化T细胞百分比占比最高，并且长效S/E/M/N/RBD mRNA疫苗中检测到的活化T细胞百分比占比高于常规S/E/M/N/RBD mRNA疫苗中检测到的活化T细胞百分比占比，在CD4中产生的IFN-g(干扰素γ)或TNF-a(肿瘤坏死因子)能达到1.5％附近，在CD8 中产生的IFN-g(干扰素γ)或TNF-a(肿瘤坏死因子)能达到2.5％附近，远远高于未使用疫苗刺激时T细胞产生的IFN-g(干扰素γ)或TNF-a(肿瘤坏死因子)，提高了细胞的免疫性。如图6中B和图7中B所示，其中，B(左)表示终点稀释滴度，B(右)表示中和滴度。由B(左)图可知，免疫血清的基因转移减少呈剂量依赖性。由B(右)可知，mRNA疫苗诱导的抗体能中和半数Vero细胞单层细胞中感染新型冠状病毒2019-nCoV假病毒的细胞。

实施例4mRNA疫苗对2019-nCoV假病毒的免疫应答

1、接种疫苗。分别在0、1、2周时，于PBS(pH＝7.4)中对6～8周龄的雌性小鼠接种5ug新型冠状病毒2019-nCoV mRNA疫苗；用异氟醚轻度麻醉新型冠状病毒2019-nCoV免疫小鼠，根据动物保护机构和使用指南，用50mL 稀释病毒(2019-nCoV假病毒的104tcid50)在小鼠鼻内接种；第二日将小鼠安乐死亡，并将小鼠的肺和鼻移除，储存在-80℃下，直至研究结束；用10％ (肺)或5％(鼻)的莱博维茨15培养基悬液解冻组织匀浆，用24孔板和96孔板检测病毒滴度，并得到如图8和图9所示的结果数据，非参数双尾t检验用于统计分析，并比较对数转化病毒的病毒滴度，对差异进行统计学显著性分析， P值均为0.0079，远远低于0.05，其显著性较高。

其中，新型冠状病毒2019-nCoV mRNA疫苗包括S、E、M、N、RBD、 S/E/M/N/RBD、S/E/M/N和E/M/N mRNA疫苗。

2、结果分析。其中，图8为接种常规mRNA疫苗后细胞中的病毒滴定结果，图9为接种长效mRNA疫苗后细胞中的病毒滴定结果；病毒滴度表示每克组织中的tcid50(tcid50表示组织培养物(细胞)半数致死计量)。由图8 和图9可知，经过新型冠状病毒2019-nCoV mRNA疫苗免疫的小鼠组织细胞的致死率远远低于未经mRNA疫苗免疫的细胞的致死率，经检测P＝0.0079，显著性较高；其中，经S/E/M/N/RBD mRNA疫苗免疫的10％(肺)和5％(鼻) w/v混悬液检出感染性病毒的下限分别为：肺部1.5tcid 50/g，鼻腔1.8tcid 50/g。说明经过mRNA疫苗对新型冠状病毒2019-nCoV具有较高的免疫性。实施例5接种mRNA疫苗后，实验猴血清中2019-nCoV中和抗体的检测

1、接种疫苗。分别在0、1、2周时，于PBS(pH＝7.4)中对2.5-3岁的实验猴接种100ug新型冠状病毒2019-nCoV mRNA疫苗；在第4周抽血，提取血清，利用新冠假病毒进行中和抗体检测；待测血清于56℃水浴灭活 30min，上清转移至1.5mL离心管中待用。取96孔板，加入DMEM完全培养基150uL/孔，分别设置病毒对照，受试样品组。用DMEM完全培养基将假病毒稀释至1.3×10⁴(1×10⁴～2×10⁴)TCID₅₀/mL，使每孔含假病毒的量为约500/ 孔。将上述96孔板置于细胞培养箱中(37℃，5％CO₂)孵育1小时。加入 Huh-7细胞。5％CO₂培24小时后从细胞培养箱中取出96孔板，用多道移液器从每个上样孔中吸弃150uL上清，然后加入100uL荧光素酶检测试剂，室温避光反应2min。反应结束后，反复吹吸6～8次，使细胞充分裂解，从每孔中吸出150uL液体，加于对应96孔化学发光检测板中，置于化学发光检测仪中读取发光值。并得到如表3和表4所示的结果数据，根据表3和表4 所示的结果数据做图，分别得到如图10和图11所示的结果数据。非参数双尾t检验用于统计分析，并比较对数转化病毒的病毒滴度，对差异进行统计学显著性分析，P值均为0.0079，远远低于0.05，其显著性较高。具体地，表3 和表4如下：

表3接种常规mRNA疫苗后实验猴血清中和抗体检测结果数据表

表4接种长效mRNA疫苗后实验猴血清中和抗体检测结果数据表

2、结果分析。图10为接种常规mRNA疫苗后实验猴血清中和抗体检测结果，图11为接种长效mRNA疫苗后实验猴血清中和抗体检测结果。其中， Control为未使用mRNA疫苗的发光值，S/E/M/N/RBD表示接种能同时编码 S蛋白、E蛋白、M蛋白、N蛋白和RBD的mRNA疫苗后的发光值。结果显示，与对照组相比，接种常规mRNA疫苗和长效mRNA疫苗后实验猴体内均能产生针对病毒的中和抗体。

实施例6接种mRNA疫苗后，实验猴体内细胞免疫和反应抗体的检测

1、接种疫苗。对实验猴接种新型冠状病毒2019-nCoV mRNA疫苗后，对细胞内的细胞因子染色，以量化在CD₄ ⁺细胞中mRNA疫苗刺激猴T细胞后产生IFN-g(干扰素γ)或TNF-a(肿瘤坏死因子)或IL-2(白介素-2)的活化 T细胞百分比。检测在第4周时，用荧光素酶mRNA免疫的实验猴T细胞或 mRNA疫苗免疫的实验猴T细胞的活化T细胞的百分比，得到如表5(常规) 和表6(长效)所示的结果数据表。采用光密度测定免疫猴血清中新型冠状病毒2019-nCoV抗体的终点稀释ELISA滴度，得到如表7(常规)和表8(长效)所示的结果数据表。采用微量中和实验对热灭活血清的十倍稀释液进行测定，通过与对照组数据对比，以检测抗体最终稀释滴度，得到如表7(常规) 和表8(长效)所示的结果数据表。根据表5和表7做图，得到如图12(常规)所示的数据结果；根据表6和表8做图，得到如图13(长效)所示的数据结果。具体地，表5至表8如下：

表5接种常规mRNA疫苗后，实验猴体内细胞免疫检测结果数据表

表6接种长效mRNA疫苗后，实验猴体内细胞免疫检测结果数据表

表7接种常规mRNA疫苗后，实验猴体内反应抗体检测结果数据表

表8接种长效mRNA疫苗后，实验猴体内反应抗体检测结果数据表

2、结果分析。图12为接种常规mRNA疫苗后检测结果，图13为接种长效mRNA疫苗后检测结果。其中，Control为未使用mRNA疫苗的活化T细胞占比，S/E/M/N/RBD表示接种能同时编码S蛋白、E蛋白、M蛋白、N蛋白和RBD的mRNA疫苗后的活化T细胞占比。可知，实验猴的T细胞在 S/E/M/N/RBD mRNA疫苗刺激下均能产生IFN-g(干扰素γ)或TNF-a(肿瘤坏死因子)或IL-2(白介素-2)，其中，在S/E/M/N/RBD mRNA疫苗中检测到的活化T细胞百分比占比显著高于对照组，证明接种疫苗提高了细胞的免疫性。通过终点稀释法测量经接种mRNA疫苗后实验猴体内产生抗体的有效效价。如图12和图13所示，S/E/M/N/RBD mRNA在实验猴体内能有效诱导针对S蛋白、E蛋白、N蛋白和RBD蛋白的抗体。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

表2

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市瑞吉生物科技有限公司

<120> mRNA疫苗及其合成方法、试剂盒

<130> 2020.02.03

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3822

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atgttcgtgt tcctggtgct gctgcctctg gtgtccagcc agtgcgtgaa cctgaccaca 60

aggacacagc tgccccccgc ctacaccaat agctttacca gaggcgtgta ctaccccgat 120

aaggtgttta gaagctccgt gctgcacagc acccaggatc tgtttctgcc cttcttctcc 180

aatgtgacat ggttccacgc catccacgtg tccggcacaa acggcacaaa gagattcgac 240

aaccccgtgc tgcccttcaa tgacggcgtg tacttcgcct ccaccgagaa gtccaatatc 300

atcaggggct ggatcttcgg cacaaccctg gactccaaga cacagagcct gctgatcgtg 360

aataacgcca caaacgtggt cattaaggtg tgtgagtttc agttctgcaa tgaccctttt 420

ctgggcgtgt actatcacaa gaataacaag tcctggatgg agtccgagtt cagagtgtac 480

agcagcgcca ataattgtac ctttgagtac gtgtcccagc ctttcctgat ggatctggag 540

ggcaagcagg gcaacttcaa gaacctgagg gagtttgtgt ttaagaatat cgatggctac 600

ttcaagatct actccaagca cacacccatc aatctggtga gagatctgcc ccagggcttt 660

tccgccctgg agcctctggt ggatctgcct atcggcatca acatcacaag attccagacc 720

ctgctggccc tgcacagaag ctacctgaca cctggcgact ccagctccgg ctggacagcc 780

ggagccgctg cttactacgt gggctacctg cagcctagaa cctttctgct gaagtacaat 840

gagaatggca ccatcaccga cgccgtggat tgtgccctgg accctctgag cgagacaaag 900

tgtaccctga agtcctttac agtggagaag ggcatctacc agacctccaa tttcagggtg 960

cagcctacag agagcatcgt gaggttcccc aatatcacaa atctgtgtcc ctttggcgag 1020

gtgttcaacg ccaccaggtt cgcctccgtg tacgcctgga atagaaagag aatcagcaac 1080

tgcgtggccg attacagcgt gctgtacaat agcgcctcct tcagcacctt caagtgctac 1140

ggcgtgtccc ccaccaagct gaatgacctg tgctttacca acgtgtacgc cgactccttc 1200

gtgatcaggg gcgatgaggt gagacagatc gcccctggcc agaccggcaa gatcgccgat 1260

tacaactaca agctgcccga tgatttcacc ggctgcgtga tcgcctggaa cagcaataac 1320

ctggattcca aggtgggcgg caactacaac tacctgtaca gactgtttag gaagagcaat 1380

ctgaagccct ttgagagaga tatctccaca gagatctacc aggccggctc cacaccctgt 1440

aacggcgtgg agggctttaa ctgctacttc cctctgcagt cctacggctt tcagcctacc 1500

aacggcgtgg gctaccagcc ttacagagtg gtggtgctga gcttcgagct gctgcacgcc 1560

cctgccacag tgtgcggccc taagaagtcc accaatctgg tgaagaataa gtgtgtgaac 1620

ttcaacttta acggcctgac cggcaccggc gtgctgacag agagcaacaa gaagttcctg 1680

cccttccagc agttcggcag agatatcgcc gacacaacag acgccgtgag ggaccctcag 1740

acactggaga tcctggacat cacaccttgc tccttcggcg gcgtgtccgt gatcaccccc 1800

ggcacaaaca ccagcaacca ggtggccgtg ctgtaccagg acgtgaattg taccgaggtg 1860

cccgtggcca tccacgccga tcagctgaca cccacctgga gagtgtactc cacaggcagc 1920

aacgtgttcc agacaagagc cggctgcctg atcggcgccg agcacgttaa taacagctac 1980

gagtgtgata tccccatcgg cgccggcatc tgtgccagct accagacaca gaccaattcc 2040

cccaggagag ccaggagcgt ggcctcccag agcatcatcg cctacaccat gagcctgggc 2100

gccgagaaca gcgtggccta cagcaataac agcatcgcca tccccaccaa tttcaccatc 2160

agcgtgacca cagagatcct gcctgtgtcc atgacaaaga cctccgtgga ctgtacaatg 2220

tacatctgcg gcgatagcac cgagtgctcc aacctgctgc tgcagtacgg cagcttttgc 2280

acacagctga atagagccct gaccggcatc gccgtggagc aggacaagaa cacacaggag 2340

gtgtttgccc aggtgaagca gatctacaag acccctccca tcaaggactt cggcggcttt 2400

aattttagcc agatcctgcc cgacccctcc aagcccagca agagaagctt tatcgaggat 2460

ctgctgttta ataaggtgac actggccgac gccggcttta tcaagcagta cggcgactgt 2520

ctgggcgaca tcgccgccag agacttgatc tgcgcccaga agtttaacgg cctcaccgtg 2580

ctgccccccc tgctgacaga cgagatgatc gcccagtaca ccagcgccct gctggccgga 2640

accatcacca gcggctggac cttcggcgcc ggcgctgctc tgcagatccc ttttgccatg 2700

cagatggcct acaggttcaa tggcatcggc gtgacccaga acgtgctgta cgagaaccag 2760

aagctgatcg ccaatcagtt caattccgcc atcggcaaga tccaggacag cctgagctcc 2820

acagcctccg ccctgggcaa gctgcaggac gtggtgaatc agaacgccca ggccctgaac 2880

accctggtga agcagctgag cagcaacttc ggcgccatca gcagcgtgct gaatgacatc 2940

ctgtccagac tggataaggt ggaggccgag gtgcagatcg atagactgat caccggcaga 3000

ctgcagtccc tgcagacata cgtgacacag cagctgatca gggccgccga gatcagagcc 3060

tccgccaacc tggccgccac aaagatgtcc gagtgtgtgc tgggccagtc caagagggtg 3120

gatttttgtg gcaagggcta ccacctgatg agcttccctc agtccgcccc ccacggcgtg 3180

gtgtttctgc acgtgacata cgtgcctgcc caggagaaga actttaccac agcccctgcc 3240

atctgccacg atggcaaggc ccactttccc agagagggcg tgtttgtgag caacggcaca 3300

cactggtttg tgacccagag gaatttttac gagccccaga tcatcacaac agacaacaca 3360

ttcgtgtccg gcaattgcga cgtggtcatt ggcatcgtga acaacaccgt gtacgatcct 3420

ctgcagcccg agctggattc ctttaaggag gagctggata agtacttcaa gaatcacacc 3480

tcccccgatg tggatctggg cgacatttcc ggcatcaatg ccagcgtggt gaacatccag 3540

aaggagatcg atagactcaa tgaggtggcc aagaatctga acgagagcct gatcgacctg 3600

caggagctgg gcaagtacga gcagtacatc aagtggccct ggtacatctg gctgggcttc 3660

atcgccggcc tgatcgccat cgtgatggtg accatcatgc tgtgctgtat gacaagctgc 3720

tgttcctgtc tgaagggctg ctgtagctgt ggctcctgtt gcaagtttga tgaggacgat 3780

tccgagcctg tgctgaaggg cgtgaagctg cactacacat ga 3822

<210> 2

<211> 3822

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

atgttcgtgt ttctggtgct gctgcctctg gtgagctccc agtgcgtgaa cctgaccaca 60

aggacccagc tgccccctgc ctataccaat tccttcacac ggggcgtgta ctatcccgac 120

aaggtgttta gatctagcgt gctgcactcc acacaggatc tgtttctgcc tttcttttct 180

aacgtgacct ggttccacgc catccacgtg agcggcacca atggcacaaa gcggttcgac 240

aatccagtgc tgccctttaa cgatggcgtg tacttcgcct ccaccgagaa gtctaacatc 300

atcagaggct ggatctttgg caccacactg gacagcaaga cacagtccct gctgatcgtg 360

aacaatgcca ccaacgtggt catcaaggtg tgcgagttcc agttttgtaa tgatccattc 420

ctgggcgtgt actatcacaa gaacaataag tcttggatgg agagcgagtt tcgcgtgtat 480

tcctctgcca acaattgcac atttgagtac gtgtcccagc ccttcctgat ggacctggag 540

ggcaagcagg gcaatttcaa gaacctgagg gagttcgtgt ttaagaatat cgatggctac 600

ttcaagatct actccaagca caccccaatc aacctggtgc gcgacctgcc acagggcttc 660

tctgccctgg agccactggt ggatctgccc atcggcatca acatcacccg gtttcagaca 720

ctgctggccc tgcacagaag ctacctgaca ccaggcgaca gctcctctgg atggaccgca 780

ggagctgccg cctactatgt gggctatctg cagcccagga ccttcctgct gaagtacaac 840

gagaatggca ccatcacaga cgcagtggat tgcgcactgg accccctgtc tgagaccaag 900

tgtacactga agagctttac cgtggagaag ggcatctatc agacaagcaa tttcagggtg 960

cagcctaccg agtccatcgt gcgctttccc aatatcacaa acctgtgccc ttttggcgag 1020

gtgttcaacg caaccaggtt cgcaagcgtg tacgcatgga ataggaagcg catctccaac 1080

tgcgtggccg actattctgt gctgtacaac agcgcctcct tctctacctt taagtgctat 1140

ggcgtgagcc ccacaaagct gaatgacctg tgctttacca acgtgtacgc cgattccttc 1200

gtgatcaggg gcgacgaggt gcgccagatc gcaccaggac agacaggcaa gatcgcagac 1260

tacaattata agctgcctga cgatttcacc ggctgcgtga tcgcctggaa ctctaacaat 1320

ctggatagca aagtgggcgg caactacaat tatctgtacc ggctgtttag aaagtctaat 1380

ctgaagccat tcgagaggga catctccaca gagatctacc aggccggctc taccccctgc 1440

aatggcgtgg agggctttaa ctgttatttc cctctgcaga gctacggctt ccagccaaca 1500

aacggcgtgg gctatcagcc ctaccgcgtg gtggtgctgt cttttgagct gctgcacgca 1560

cctgcaacag tgtgcggacc aaagaagagc accaatctgg tgaagaacaa gtgcgtgaac 1620

ttcaacttca acggactgac cggaacaggc gtgctgaccg agtccaacaa gaagttcctg 1680

ccttttcagc agttcggcag ggacatcgca gataccacag acgccgtgcg cgaccctcag 1740

accctggaga tcctggatat cacaccatgc tccttcggcg gcgtgtctgt gatcacacca 1800

ggcaccaata caagcaacca ggtggccgtg ctgtatcagg acgtgaattg taccgaggtg 1860

ccagtggcaa tccacgcaga tcagctgacc cctacatggc gggtgtactc taccggcagc 1920

aacgtgttcc agacaagagc aggatgcctg atcggagcag agcacgtgaa caatagctat 1980

gagtgcgaca tccctatcgg cgccggcatc tgtgcctcct accagaccca gacaaactcc 2040

ccaaggagag cacggtctgt ggcaagccag tccatcatcg cctataccat gagcctgggc 2100

gccgagaatt ccgtggccta ctccaacaat tctatcgcca tccctaccaa cttcacaatc 2160

tccgtgacca cagagatcct gccagtgagc atgaccaaga catccgtgga ctgcacaatg 2220

tatatctgtg gcgattccac cgagtgctct aacctgctgc tgcagtacgg ctctttttgt 2280

acccagctga atagagccct gacaggcatc gccgtggagc aggacaagaa cacacaggag 2340

gtgttcgccc aggtgaagca gatctacaag accccaccca tcaaggactt tggcggcttc 2400

aacttcagcc agatcctgcc cgatcctagc aagccatcca agcggtcttt tatcgaggac 2460

ctgctgttca acaaggtgac cctggccgat gccggcttca tcaagcagta tggcgattgc 2520

ctgggcgaca tcgccgccag agacctgatc tgtgcccaga agtttaatgg cctgaccgtg 2580

ctgcctccac tgctgacaga tgagatgatc gcccagtaca catctgccct gctggcagga 2640

accatcacaa gcggatggac cttcggcgca ggagccgccc tgcagatccc ctttgccatg 2700

cagatggcct atcggttcaa cggcatcggc gtgacccaga atgtgctgta cgagaaccag 2760

aagctgatcg ccaatcagtt taactccgcc atcggcaaga tccaggactc tctgagctcc 2820

acagcaagcg ccctgggcaa gctgcaggat gtggtgaatc agaacgccca ggccctgaat 2880

accctggtga agcagctgtc tagcaacttc ggcgccatct cctctgtgct gaatgatatc 2940

ctgagcaggc tggacaaggt ggaggcagag gtgcagatcg accggctgat cacaggcaga 3000

ctgcagtccc tgcagaccta cgtgacacag cagctgatca gggcagcaga gatcagggca 3060

tctgccaatc tggccgccac caagatgagc gagtgcgtgc tgggccagtc caagagagtg 3120

gacttttgtg gcaagggcta tcacctgatg agcttcccac agtccgcccc tcacggagtg 3180

gtgtttctgc acgtgaccta cgtgccagcc caggagaaga acttcaccac agcaccagca 3240

atctgccacg atggcaaggc acactttcct agggagggcg tgttcgtgag caacggcacc 3300

cactggtttg tgacacagcg caatttctac gagccacaga tcatcaccac agacaataca 3360

ttcgtgtccg gcaactgtga cgtggtcatc ggcatcgtga acaataccgt gtatgatcct 3420

ctgcagccag agctggactc ttttaaggag gagctggata agtacttcaa gaatcacacc 3480

agccccgacg tggatctggg cgacatctct ggcatcaatg ccagcgtggt gaacatccag 3540

aaggagatcg acaggctgaa cgaggtggcc aagaatctga acgagtccct gatcgatctg 3600

caggagctgg gcaagtatga gcagtacatc aagtggccct ggtatatctg gctgggcttc 3660

atcgccggcc tgatcgccat cgtgatggtg accatcatgc tgtgctgtat gacaagctgc 3720

tgttcctgcc tgaagggctg ctgttcttgt ggcagctgct gtaagtttga tgaggacgat 3780

agcgagcctg tgctgaaggg cgtgaagctg cactacacct ga 3822

<210> 3

<211> 228

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

atgtactcct tcgtgtccga ggagaccggc accctgatcg tgaatagcgt gctgctgttt 60

ctggcctttg tggtgttcct gctggtgaca ctggccatcc tgacagccct gaggctgtgt 120

gcctactgct gcaatatcgt gaacgtgtcc ctggtgaagc cttccttcta cgtgtactcc 180

agagtgaaga acctgaatag ctccagggtg cctgacctgc tggtgtga 228

<210> 4

<211> 228

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

atgtactctt ttgtgagcga ggagaccggc acactgatcg tgaactccgt gctgctgttc 60

ctggcctttg tggtgttcct gctggtgacc ctggcaatcc tgacagccct gaggctgtgc 120

gcctattgct gtaacatcgt gaacgtgagc ctggtgaagc cctctttcta cgtgtatagc 180

cgggtgaaga acctgaatag ctccagagtg cctgacctgc tggtgtga 228

<210> 5

<211> 669

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

atggccgact ccaatggcac catcacagtg gaggagctga agaagctgct ggagcagtgg 60

aatctggtca ttggcttcct gtttctgacc tggatctgtc tgctgcagtt cgcctacgcc 120

aataggaata ggttcctgta catcatcaag ctgatcttcc tgtggctgct gtggcctgtg 180

accctggcct gttttgtgct ggccgccgtg tacagaatca actggatcac aggcggcatc 240

gccatcgcta tggcttgcct ggtgggcctg atgtggctga gctacttcat cgccagcttc 300

agactgttcg ccagaaccag gagcatgtgg agcttcaacc ctgagaccaa tatcctgctg 360

aacgtgcccc tgcacggcac aatcctgacc agacccctgc tggagagcga gctggtcatt 420

ggagccgtga tcctgagggg ccacctgaga atcgccggcc accacctggg caggtgtgat 480

atcaaggacc tgcccaagga gatcacagtg gccacatcca ggaccctgtc ctactacaag 540

ctgggcgcct cccagagggt ggccggagat agcggcttcg ccgcctacag cagatacaga 600

atcggcaact acaagctgaa taccgaccac tcctccagct ccgataatat cgccctgctg 660

gtgcagtga 669

<210> 6

<211> 669

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

atggccgact ctaatggcac catcacagtg gaggagctga agaagctgct ggagcagtgg 60

aacctggtca tcggcttcct gtttctgaca tggatctgcc tgctgcagtt cgcctacgcc 120

aaccggaata gatttctgta tatcatcaag ctgatcttcc tgtggctgct gtggcccgtg 180

acactggcct gctttgtgct ggccgccgtg taccggatca attggatcac cggaggaatc 240

gcaatcgcaa tggcatgtct ggtgggcctg atgtggctgt cttacttcat cgccagcttc 300

agactgtttg ccaggacacg ctccatgtgg tctttcaacc ccgagaccaa tatcctgctg 360

aacgtgcctc tgcacggcac catcctgaca aggccactgc tggagagcga gctggtcatc 420

ggagccgtga tcctgagggg acacctgagg atcgcaggac accacctggg ccgctgtgac 480

atcaaggatc tgcccaagga gatcaccgtg gccacaagcc ggaccctgtc ctactataag 540

ctgggagcat cccagagagt ggcaggcgat tccggattcg cagcatactc tcggtataga 600

atcggcaatt acaagctgaa caccgaccac agctcctcta gcgataacat cgccctgctg 660

gtgcagtga 669

<210> 7

<211> 1260

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

atgagcgaca acggccccca gaaccagagg aacgccccca gaatcacctt cggcggccct 60

tccgattcca ccggctccaa ccagaatggc gagagaagcg gcgccaggtc caagcagaga 120

agacctcagg gcctgcctaa taacaccgcc agctggttca cagccctgac acagcacggc 180

aaggaggacc tgaagttccc tagaggccag ggcgtgccca tcaataccaa cagcagccct 240

gatgaccaga tcggctacta caggagggcc accaggagga tcaggggcgg cgacggaaag 300

atgaaggatc tgagccccag gtggtacttc tactacctgg gcaccggccc tgaggccggc 360

ctgccttatg gcgctaacaa ggacggcatc atctgggtgg ccaccgaggg cgccctgaac 420

accccaaagg atcacatcgg cacaaggaac cccgccaaca atgccgccat cgtgctgcag 480

ctgcctcagg gcacaacact gcctaagggc ttctacgccg agggcagcag aggcggctcc 540

caggcttcct ccaggtccag ctccagaagc agaaactcca gcagaaattc cacacctggc 600

tcctccagag gcacaagccc tgccaggatg gccggcaatg gcggcgacgc tgccctggct 660

ctgctgctgc tggacagact gaaccagctg gagagcaaga tgagcggcaa gggccagcag 720

cagcagggcc agacagtgac aaagaagagc gccgccgagg ccagcaagaa gcctagacag 780

aagagaaccg ccaccaaggc ctacaacgtg acccaggcct tcggcaggag aggccctgag 840

cagacccagg gcaacttcgg cgatcaggag ctgatcagac agggcacaga ttacaagcac 900

tggccccaga tcgcccagtt cgccccttcc gcctccgcct ttttcggcat gtccaggatc 960

ggcatggagg tgacaccctc cggcacctgg ctgacctaca ccggcgccat caagctggac 1020

gacaaggacc ctaacttcaa ggatcaggtc attctgctga acaagcacat cgatgcctac 1080

aagacctttc cccccaccga gcctaagaag gataagaaga agaaggccga tgagacacag 1140

gccctgcctc agaggcagaa gaagcagcag accgtgaccc tgctgcccgc cgctgatctg 1200

gatgatttct ccaagcagct gcagcagagc atgagctccg ccgattccac acaggcctga 1260

<210> 8

<211> 1260

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

atgtctgaca acggccctca gaaccagcgg aatgccccaa gaatcacctt cggcggcccc 60

tccgattcta caggctccaa ccagaatgga gagaggtccg gagcacgctc taagcagcgg 120

agaccacagg gcctgcccaa caataccgcc agctggttca ccgccctgac acagcacggc 180

aaggaggacc tgaagtttcc caggggccag ggcgtgccta tcaacaccaa tagctcccct 240

gacgatcaga tcggctacta taggagggca acaaggagaa tccggggagg cgacggcaag 300

atgaaggatc tgtcccccag atggtacttc tactatctgg gaaccggacc tgaggcagga 360

ctgccatatg gcgccaataa ggacggaatc atctgggtgg caaccgaggg cgccctgaac 420

acaccaaagg atcacatcgg cacacgcaat cccgccaaca atgcagcaat cgtgctgcag 480

ctgccacagg gaaccacact gcccaagggc ttttacgcag agggcagcag gggaggctcc 540

caggcctcta gccgctcctc tagccggtcc agaaactcct ctaggaattc taccccaggc 600

agctccaggg gcacaagccc tgcaagaatg gcaggaaacg gaggcgacgc cgccctggcc 660

ctgctgctgc tggatagact gaatcagctg gagtctaaga tgagcggcaa gggacagcag 720

cagcagggac agaccgtgac aaagaagtct gccgccgagg ccagcaagaa gccaaggcag 780

aagcgcaccg ccacaaaggc ctacaacgtg acccaggcct tcggcaggcg cggaccagag 840

cagacacagg gcaattttgg cgaccaggag ctgatcaggc agggcaccga ttataagcac 900

tggcctcaga tcgcacagtt cgcaccaagc gcctccgcct tctttggcat gagcaggatc 960

ggaatggagg tgaccccatc cggcacatgg ctgacctaca caggcgccat caagctggac 1020

gataaggacc ctaacttcaa ggatcaggtc atcctgctga acaagcacat cgatgcctat 1080

aagacctttc cccctacaga gcccaagaag gacaagaaga agaaggccga tgagacccag 1140

gccctgcctc agagacagaa gaagcagcag accgtgacac tgctgccagc agcagacctg 1200

gacgattttt ccaagcagct gcagcagtct atgtctagcg ccgatagcac ccaggcctga 1260

<210> 9

<211> 831

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

gctggagctg ccgcttacta cgtgggctac ctgcagccca ggacatttct gctgaagtac 60

aatgagaacg gcaccatcac agatgccgtg gactgtgccc tggaccctct gagcgagaca 120

aagtgtaccc tgaagagctt caccgtggag aagggcatct accagaccag caacttcaga 180

gtgcagccca cagagagcat cgtgaggttc cccaatatca ccaacctgtg tcctttcggc 240

gaggtgttca atgccaccag gttcgccagc gtgtacgcct ggaatagaaa gagaatcagc 300

aactgtgtgg ccgactactc cgtgctgtac aactccgcct cctttagcac ctttaagtgc 360

tacggcgtga gccccaccaa gctgaatgac ctgtgcttta caaacgtgta cgccgatagc 420

tttgtgatca gaggcgatga ggtgaggcag atcgcccccg gccagacagg caagatcgcc 480

gattacaatt acaagctgcc tgacgatttc accggctgtg tgatcgcctg gaactccaac 540

aatctggata gcaaggtggg cggcaattac aactacctgt acagactgtt taggaagagc 600

aacctgaagc ctttcgagag agacatcagc acagagatct accaggccgg ctccacccct 660

tgcaatggcg tggagggctt caactgttac ttccccctgc agagctacgg ctttcagcct 720

accaatggcg tgggctacca gccttacaga gtggtggtgc tgagctttga gctgctgcac 780

gcccctgcca cagtgtgcgg ccctaagaag agcacaaacc tggtgaagaa t 831

<210> 10

<211> 831

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

gccggcgctg ccgcctacta tgtgggctat ctgcagccaa ggacattcct gctgaagtac 60

aacgagaatg gcaccatcac agacgcagtg gattgcgcac tggaccccct gtccgagacc 120

aagtgtacac tgaagtcttt taccgtggag aagggcatct atcagacatc taacttcagg 180

gtgcagccta ccgagagcat cgtgcgcttt ccaaacatca caaatctgtg ccccttcggc 240

gaggtgttta atgcaaccag gttcgcatcc gtgtacgcat ggaaccggaa gagaatctct 300

aattgcgtgg ccgactatag cgtgctgtac aacagcgcct ccttctctac ctttaagtgc 360

tatggcgtgt cccccacaaa gctgaacgac ctgtgcttca ccaacgtgta cgccgactct 420

tttgtgatcc ggggcgatga ggtgagacag atcgcccctg gccagacagg caagatcgcc 480

gactacaact ataagctgcc agacgacttc accggctgcg tgatcgcctg gaatagcaac 540

aatctggatt ccaaagtggg cggcaactac aattatctgt acaggctgtt ccgcaagtct 600

aacctgaagc cctttgagcg ggatatcagc acagagatct accaggcagg ctccacccct 660

tgcaacggag tggagggctt caattgttat tttcctctgc agagctacgg cttccagcca 720

accaatggcg tgggctatca gccctacaga gtggtggtgc tgagctttga gctgctgcac 780

gcaccagcaa ccgtgtgcgg acctaagaag tccaccaacc tggtgaagaa t 831

Claims

1.一种mRNA疫苗，其特征在于，所述mRNA疫苗由：

三聚体刺突糖蛋白S的表位抗原基因序列，和/或

跨膜蛋白-包膜E的表位抗原基因序列，和/或

膜糖蛋白M的表位抗原基因序列，和/或

核衣壳N的表位抗原基因序列，和/或

其中，三聚体刺突糖蛋白S的表位抗原基因序列选自SEQ ID：1或2，跨膜蛋白-包膜E的表位抗原基因序列选自SEQ ID：3或4，膜糖蛋白M的表位抗原基因序列选自SEQ ID：5或6，核衣壳N的表位抗原基因序列选自SEQ ID：7或8，三聚体刺突糖蛋白中的受体结合域RBD的表位抗原基因序列选自SEQ ID：9或10。

2.如权利要求1所述的mRNA疫苗，其特征在于，所述mRNA疫苗由跨膜蛋白-包膜E的表位抗原基因序列、膜糖蛋白M的表位抗原基因序列和核衣壳N的表位抗原基因序列制备得到。

3.如权利要求2所述的mRNA疫苗，其特征在于，所述mRNA疫苗由三聚体刺突糖蛋白S的表位抗原基因序列、跨膜蛋白-包膜E的表位抗原基因序、膜糖蛋白M的表位抗原基因序列列和核衣壳N的表位抗原基因序列制备得到。

4.如权利要求3所述的mRNA疫苗，其特征在于，所述mRNA疫苗由三聚体刺突糖蛋白S的表位抗原基因序列、跨膜蛋白-包膜E的表位抗原基因序列、膜糖蛋白M的表位抗原基因序列、核衣壳N的表位抗原基因序列和三聚体刺突糖蛋白中的受体结合域RBD的表位抗原基因序列制备得到。

5.如权利要求2-4任一项所述的mRNA疫苗，其特征在于，所述表位抗原基因序列之间由连接肽隔开。

6.一种规模化合成mRNA疫苗的方法，其特征在于，该方法包括：

跨膜蛋白-包膜E的表位抗原基因序列，和/或

膜糖蛋白M的表位抗原基因序列，和/或

核衣壳N的表位抗原基因序列，和/或

三聚体刺突糖蛋白中的受体结合域RBD的表位抗原基因序列；

跨膜蛋白-包膜E，和/或

膜糖蛋白M，和/或

核衣壳N，和/或

三聚体刺突糖蛋白中的受体结合域RBD的DNA片段，并将所述DNA片段连接到DNA载体上，酶切后进行体外转录，以获得如权利要求1至5任一项所述的mRNA疫苗；

7.如权利要求6所述的规模化合成mRNA疫苗的方法，其特征在于，所述步骤b中将所述DNA片段连接到DNA载体上，酶切后进行体外转录，以获得mRNA疫苗的步骤具体包括：

将所述DNA片段连接到pcDNA3.3载体上，酶切后进行体外转录，得到未加帽的mRNA，然后向所述未加帽的mRNA中加入加帽酶，给未加帽的mRNA的5'端加上帽子结构，以获得具有帽子1结构和帽子2结构的常规mRNA疫苗，和/或酶切后加入抗反向帽类似物ARCA进行体外共转录，得到具有帽子0结构的常规mRNA疫苗；或，

将所述DNA片段连接到pcDNA3.3-nsPs载体上，酶切后进行体外转录，得到未加帽的mRNA，然后向所述未加帽的mRNA中加入加帽酶，给未加帽的mRNA的5'端加上帽子结构，以获得具有帽子1结构和帽子2结构的能实现自我复制的长效mRNA疫苗，和/或酶切后加入抗反向帽类似物ARCA进行体外共转录，得到具有帽子0结构的能实现自我复制的长效mRNA疫苗。

8.如权利要求7所述的规模化合成mRNA疫苗的方法，其特征在于，所述加帽酶包括RNA三磷酸酶、RNA谷氨酸转移酶、鸟嘌呤-7-甲基转移酶或二氧基甲基化转移酶中的一种或其组合。

9.如权利要求7所述的规模化合成mRNA疫苗的方法，其特征在于，所述帽子结构为帽子1结构和帽子2结构中的一种或其组合。

10.一种试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1至5任一项所述的mRNA疫苗。