CN115725612A - Rna、rna组合及其应用、多价猴痘疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种RNA、RNA组合及其应用、多价猴痘疫苗,涉及生物技术领域。本发明提供的mRNA经过密码子优化后得到,其在体外细胞中均能够高效表达抗原蛋白;本发明提供的mRNA组合表达量高,且免疫小鼠后能够检测到高效价的抗牛痘天坛株活病毒中和抗体,具有良好的免疫原性,对于猴痘病毒的预防有重要意义。本发明提供的多价猴痘mRNA疫苗可在体内实现稳定安全的表达和有效激活免疫反应,可引起中和抗体应答,在免疫的小鼠血清中可检测到高效价的抗牛痘天坛株活病毒中和抗体。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其是涉及一种RNA、RNA组合及其应用、多价猴痘疫苗。
背景技术
在全球范围内普及安全有效的疫苗是阻击猴痘病毒的最强力武器,也是终结猴痘疫情的关键。到目前为止,猴痘暂时没有特效疫苗,猴痘病毒与天花病毒、牛痘病毒同属正痘病毒,天花疫苗可以提供交叉保护,接种天花疫苗在预防猴痘的有效率为85%,或者降低感染后的严重程度。目前仅有两款被FDA批准用于预防猴痘病毒的疫苗:ACAM2000和JYNNEOS。然而,这些疫苗会引起罕见的副作用,例如心肌炎和心包炎,对湿疹患者和孕妇的影响较高。因此,仍需要开发有效和安全的新一代猴痘专用疫苗。且至今猴痘病毒仍未在肆虐,由猴痘病毒持续引发的公共卫生危机也仍未解除。
猴痘病毒是一种包膜双链DNA病毒,猴痘病毒共有两个不同的遗传进化分支——中非分支和西非分支。其中,西非分支病死率约为3.6%;中非分支历史上引起的疾病更严重,病死率约为10.6%,并被认为更具传染性。此次猴痘疫情,除非洲以外报告的病例,包括目前正在传播的病例都是由西非分支引起的。自1980年消灭天花以及随后人类停止接种天花疫苗,猴痘已成为公共卫生中最重要的正痘病毒。也有报道指出,当前疫情感染的患者,只有9%曾经接种过天花疫苗。
mRNA疫苗具有研发周期短、产能增速快等技术优势,更适合猴痘病毒的预防性疫苗的应急研制与开发。然而,猴痘病毒的mRNA疫苗的设计难度较高,尤其是病毒完整和高效表达的实现会受到多种因素的影响。
鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种mRNA,该mRNA表达水平高。
本发明的第二目的在于提供一种mRNA组合,其在体外细胞中均能够表达抗原蛋白,且免疫小鼠后能够检测到高效价的抗牛痘天坛株活病毒中和抗体,具有良好的免疫原性,对于猴痘病毒的预防有重要意义。
本发明的第三目的在于提供一种生物材料。
本发明的第四目的在于提供一种mRNA组合在制备猴痘疫苗中的应用。
本发明的第五目的在于提供一种mRNA复合物。
本发明的第六目的在于提供一种多价猴痘mRNA疫苗。
本发明的第七目的在于提供一种药物组合物。
本发明的第八目的在于提供一种试剂盒。
第一方面,本发明提供了一种mRNA,所述mRNA从5’到3’依次包括5’UTR、Kozak序列、编码区、3’UTR和Poly A尾;
所述5’UTR的核酸序列如SEQ ID NO.1所示,或者与SEQ ID NO.1具有95%以上同源性的序列;
所述3’UTR的核酸序列如SEQ ID NO.2所示,或者与SEQ ID NO.2具有95%以上同源性的序列;
所述编码区的核酸序列如SEQ ID NO.4~SEQ ID NO.9中的任一种所示,或者与SEQ ID NO.4~SEQ ID NO.9中的任一种具有95%以上同源性的序列。
作为进一步技术方案,所述Kozak序列包括GCC、ACC、GCCACC或GCCANN;
优选地,所述Poly A尾的核酸序列如SEQ ID NO.3所示,或者与SEQ ID NO.3具有95%以上同源性的序列。
第二方面,本发明提供了一种mRNA组合,包括:编码猴痘病毒A29L的mRNA、编码猴痘病毒A35R的mRNA、编码猴痘病毒M1R的mRNA和编码猴痘病毒B6R的mRNA;
所述编码猴痘病毒A29L的mRNA序列如SEQ ID NO.10所示,或者与SEQ ID NO.10具有95%以上同源性的序列;
所述编码猴痘病毒A35R的mRNA序列如SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12所示,或者与SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12具有95%以上同源性的序列;
所述编码猴痘病毒M1R的mRNA序列如SEQ ID NO.13所示,或者与SEQ ID NO.13具有95%以上同源性的序列;
所述编码猴痘病毒B6R的mRNA序列如SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.15所示,或者与SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.15具有95%以上同源性的序列。
第三方面,本发明提供了生物材料,包括如下B1)至B6)中至少一种:
B1)转录所述mRNA的核酸分子,或者转录所述mRNA组合的核酸分子;
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒;
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体,或含有B2)所述表达盒的重组载体;
B4)含有B1)所述核酸分子的重组质粒,或含有B2)所述表达盒的重组质粒;
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物,或含有B2)所述表达盒的重组微生物,或含有B3)所述重组载体的重组微生物;
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因细胞系。
第四方面,本发明提供了上述mRNA或者mRNA组合在制备猴痘疫苗中的应用。
第五方面,本发明提供了一种mRNA复合物,包括递送载体和所述的mRNA或者所述的mRNA组合。
作为进一步技术方案,所述递送载体包括可离子化脂质体、阳离子脂质体、可离子化蛋白、阳离子蛋白、可离子化聚合物、阳离子聚合物、可离子化胶束、阳离子胶束、可离子化脂质纳米粒或阳离子脂质纳米颗粒中的任一种;
优选地,所述递送载体为YK009;
优选地,所述mRNA复合物还包括1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、胆固醇和DMG-PEG2000。
第六方面,本发明提供了一种价猴痘mRNA疫苗,包括所述的mRNA、所述的mRNA组合或者所述的mRNA复合物。
优选地,所述mRNA组合中,编码猴痘病毒A35R的mRNA的序列如SEQ ID NO.11所示,编码猴痘病毒B6R的mRNA的序列如SEQ ID NO.14所示;
或,编码猴痘病毒A35R的mRNA的序列如SEQ ID NO.12所示;编码猴痘病毒B6R的mRNA的序列如SEQ ID NO.15所示。
第七方面,本发明提供了一种药物组合物,包括所述的mRNA、所述的mRNA组合、所述的生物材料、所述的mRNA复合物或所述的多价猴痘mRNA疫苗中的至少一种,以及任选的药用载体。
第八方面,本发明提供了一种试剂盒,包括所述的mRNA、权所述的mRNA组合、所述的生物材料、所述的mRNA复合物或所述的多价猴痘mRNA疫苗中的至少一种。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
mRNA疫苗的成功研制很大程度上取决于mRNA自身序列的优化,本发明提供的作为疫苗活性成分的mRNA,经过密码子优化后得到,其在体外细胞中均能够高效表达抗原蛋白。本发明提供的mRNA组合表达量高,且免疫小鼠后能够检测到高效价的抗牛痘天坛株活病毒中和抗体,具有良好的免疫原性,对于猴痘病毒的预防有重要意义。
本发明提供的多价猴痘mRNA疫苗可在体内实现稳定安全的表达和有效激活免疫反应,可引起中和抗体应答,在免疫的小鼠血清中可检测到高效价的抗牛痘天坛株活病毒中和抗体。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的猴痘病毒mRNA疫苗活性成分mRNA-M351、mRNA-M564、mRNA-M630、mRNA-M837、mNRA-M972和mRNA-M1038的结构示意图;
图2为本发明的实施例1中的质量分析结果图;
图3为本发明的实施例1中的细胞转染蛋白表达检测结果图;
图4为本发明的实施例2中的小鼠免疫后血清中特异性抗体IgG检测;
图5为本发明的实施例2中的免疫小鼠血清抗牛痘天坛株活病毒中和抗体NT50的检测结果图。
具体实施方式
下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施方式和实施例仅用于说明本发明,而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
术语“中和抗体”一般是指微生物入侵人体后,会刺激产生很多种抗体,但只有部分抗体能迅速识别微生物,并在其入侵人体细胞前将其“抓住”,保护人体不被感染。这个过程就叫中和作用,发挥作用的抗体就是中和抗体。
术语“佐剂”指在细胞水平或体液水平增加、刺激、活化、加强或调节针对组合物的活性成分的免疫应答的试剂。
第一方面,本发明提供了一种mRNA,所述mRNA从5’到3’依次包括5’UTR、Kozak序列、编码区、3’UTR和Poly A尾;
所述5’UTR的核酸序列如SEQ ID NO.1所示,或者与SEQ ID NO.1具有95%以上同源性的序列;
所述3’UTR的核酸序列如SEQ ID NO.2所示,或者与SEQ ID NO.2具有95%以上同源性的序列;
所述编码区的核酸序列如SEQ ID NO.4~SEQ ID NO.9中的任一种所示,或者与SEQ ID NO.4~SEQ ID NO.9中的任一种具有95%以上同源性的序列。
需要说明的是,本发明所述的“同源性”与“同一性”同义,是指在使用氨基酸序列或核苷酸序列的方面,与本发明公开的序列相比,具有(包括但不限于)90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%的相似度,且依然具有与原氨基酸序列或核苷酸序列相同的功能。本发明中5’UTR是指不包括Kozak序列的5’UTR。
本发明提供的作为疫苗活性成分的mRNA,经过密码子优化后得到,其在体外细胞中均能够高效表达抗原蛋白。
在一些优选的实施方式中,所述Kozak序列包括GCC、ACC、GCCACC或GCCANN;
优选地,所述Poly A尾的核酸序列如SEQ ID NO.3所示,或者与SEQ ID NO.3具有95%以上同源性的序列。
第二方面,本发明提供了一种mRNA组合,包括:编码猴痘病毒A29L的mRNA、编码猴痘病毒A35R的mRNA、编码猴痘病毒M1R的mRNA和编码猴痘病毒B6R的mRNA;
所述编码猴痘病毒A29L的mRNA序列如SEQ ID NO.10所示,或者与SEQ ID NO.10具有95%以上同源性的序列;
所述编码猴痘病毒A35R的mRNA序列如SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12所示,或者与SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12具有95%以上同源性的序列;
所述编码猴痘病毒M1R的mRNA序列如SEQ ID NO.13所示,或者与SEQ ID NO.13具有95%以上同源性的序列;
所述编码猴痘病毒B6R的mRNA序列如SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.15所示,或者与SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.15具有95%以上同源性的序列。
本发明中,传染性疾病猴痘(Monkeypox,MPX)是由猴痘病毒(Monkeypox virus,MPXV)感染导致的一种病毒性人兽共患病。细胞内成熟病毒(IMVs)和细胞外囊膜病毒(EEVs)表达不同的病毒蛋白。A29L和M1R为成熟病毒粒子表面蛋白,A35R和B6R为囊膜病毒粒子的表面蛋白。其中,A29L蛋白是MPXV(猴痘病毒)的单抗靶点,介导识别宿主细胞使病毒与宿主细胞催化融合。A35R是囊膜病毒粒子的重要成分,同时也是血清学潜在的检测靶点。B6R蛋白存在于EEV粒子的膜上,负调控补体激活,与A33或A34的互作决定了其细胞内的定位。利用细胞内成熟病毒粒子和细胞外囊膜病毒粒子的组合能提供更好的保护效果。
本发明提供的作为疫苗活性成分的mRNA组合,经过密码子优化后得到,其在体外细胞中均能够高效表达抗原蛋白,且免疫小鼠后能够检测到高效价的抗牛痘天坛株活病毒中和抗体,具有良好的免疫原性,对于猴痘病毒的预防有重要意义。
第三方面,本发明提供了生物材料,包括如下B1)至B6)中至少一种:
B1)转录所述mRNA的核酸分子,或者转录所述mRNA组合的核酸分子;
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒;
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体,或含有B2)所述表达盒的重组载体;
B4)含有B1)所述核酸分子的重组质粒,或含有B2)所述表达盒的重组质粒;
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物,或含有B2)所述表达盒的重组微生物,或含有B3)所述重组载体的重组微生物;
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因细胞系。
在本发明中,可以将蛋白的编码序列通过基因工程技术克隆到质粒中,进行体外转录,用于mRNA合成;优选包括:1)将mRNA对应的DNA片段克隆至表达质粒获得重组质粒;2)将所述重组质粒转入宿主细胞获得重组细胞,从扩繁后的重组细胞中提取质粒,并进行PCR扩增获得体外表达mRNA的DNA模板;3)构建包括所述DNA模板的RNA体外合成体系进行mRNA的体外合成获得所述活性成分mRNA。在本发明中,所述DNA片段的具体序列可根据碱基互补配对原则确定。
在一个实施方案中,在体外转录后,需对转录RNA产物进行加帽反应,获得的mRNA的5'端连接有帽子(Cap-1)结构。
在一个实施方案中,所述重组载体为载体PVAX1。具体地,mRNA序列的DNA模板构建在载体pVAX1的T7启动子最后一个碱基—多克隆位点XbaI位点之间得到重组质粒,利用载体序列上的T7启动子序列,在T7转录酶作用下启动体外转录。
在一个实施方案中,将重组载体转入表达所述病毒蛋白的细胞中进行表达,优选地,细胞选自HEK293T细胞、293FTX细胞、HEK293A细胞。
第四方面,本发明提供了上述mRNA或者mRNA组合在制备猴痘疫苗中的应用。
本发明提供的mRNA表达量高,免疫原性好,能够用于猴痘疫苗中的制备。
第五方面,本发明提供了一种mRNA复合物,包括递送载体和所述的mRNA或者所述的mRNA组合。
在一些优选的实施方式中,所述递送载体包括可离子化脂质(MC3、SM102、ALC0315、Lipid 5、DOTAP)、阳离子脂质、可离子化蛋白、阳离子蛋白、可离子化聚合物、阳离子聚合物、可离子化胶束、阳离子胶束、可离子化脂质纳米粒或阳离子脂质纳米颗粒中的任一种,优选为可离子化脂质纳米粒(LPN),更优选为YK009(2-辛基癸基6-((4-(癸氧基)-4-氧代基丁基)(2-羟基乙基)氨基)己酸酯)。
在一个实施方案中,所述mRNA复合物选自可离子化脂质-mRNA复合物、阳离子脂质-mRNA复合物或新型可阳离子化脂质-mRNA复合物、可离子化脂质-mRNA脂质纳米粒、阳离子脂质-mRNA脂质纳米粒或新型可阳离子化脂质-mRNA脂质纳米粒。需要说明的是,可离子化脂质-mRNA复合物是指可离子化脂质与本发明mRNA的混合物,阳离子脂质-mRNA复合物和新型可阳离子化脂质-mRNA复合物同理;可离子化脂质-mRNA脂质纳米粒是指可离子化脂质、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、胆固醇和DMG-PEG2000与本发明mRNA共同形成的脂质纳米粒,阳离子脂质-mRNA脂质纳米粒或新型可阳离子化脂质-mRNA脂质纳米粒同理。
优选地,所述可离子化脂质-mRNA复合物、阳离子脂质-mRNA复合物或新型可阳离子化脂质-mRNA复合物还包含鱼精蛋白、PEG化脂质、1,2-二油酯-sn-甘油-3-磷酸乙醇铵和胆固醇。
优选地,所述可离子化脂质-mRNA复合物纳米粒、阳离子脂质-mRNA脂质纳米粒或新型可阳离子化脂质-mRNA脂质纳米粒还包括PEG化脂质、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱和胆固醇。
在一个实施方案中,所述mRNA复合物包括由mRNA结合可离子化脂质等制备的脂质纳米颗粒LNP-mRNA、由mRNA结合可离子化脂质YK009制备的新型可阳离子化脂材-mRNA脂质纳米粒。
在一个实施方案中,所述mRNA复合物的制备方法包括:将所述的mRNA与可离子化脂材混合后用脂质包装;其中,可离子化脂材可以是MC3、SM102、ALC0315、Lipid 5、DOTAP等;
在一个优选的方案中,所述mRNA复合物制备方法包括将可离子化脂材与1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、DMG-PEG2000溶解后混合,然后,与mRNA混合。
第六方面,本发明提供了一种价猴痘mRNA疫苗,包括所述的mRNA、所述的mRNA组合或者所述的mRNA复合物。
发明人通过大量实验,最终发现本发明特定的框架序列与编码序列的特定组合能够使得所制备的疫苗取得较好的免疫原性和稳定性。
本发明提供的多价猴痘病毒mRNA疫苗为针对猴痘病毒的疫苗,其施用对象包括但不限于哺乳动物和人。所述的哺乳动物包括但不限于猴、骆驼、牛、马、山羊、绵羊、猪、猫、狗、兔、小鼠或大鼠等。优选地,所述疫苗为传染病疫苗,用于预防猴痘病毒的感染。本发明所述的“预防”指在疾病开始发展之前或之后通过施用本发明所述的产品来避免症状或者延缓特定症状紧张的所有行为。
优选地,所述mRNA组合中,编码猴痘病毒A35R的mRNA的序列如SEQ ID NO.11所示,编码猴痘病毒B6R的mRNA的序列如SEQ ID NO.14所示;
或,编码猴痘病毒A35R的mRNA的序列如SEQ ID NO.12所示;编码猴痘病毒B6R的mRNA的序列如SEQ ID NO.15所示。
在一个优选的方案中,所述价猴痘mRNA疫苗还包括佐剂。
第七方面,本发明提供了一种药物组合物,包括所述的mRNA、所述的mRNA组合、所述的生物材料、所述的mRNA复合物或所述的多价猴痘mRNA疫苗中的至少一种,以及任选的药用载体。本发明提供了包括所述的mRNA、所述的mRNA组合、所述的生物材料、所述的mRNA复合物或所述的多价猴痘mRNA疫苗的产品在制备预防和/或治疗猴痘病毒感染的药物中的应用。
第八方面,本发明提供了一种试剂盒,包括所述的mRNA、权所述的mRNA组合、所述的生物材料、所述的mRNA复合物或所述的多价猴痘mRNA疫苗中的至少一种。
下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明,但是,应当理解为,这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用,而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1、猴痘病毒mRNA疫苗的序列设计、制备和体外细胞的抗原表达检测
一、猴痘mRNA疫苗的序列设计
猴痘mRNA疫苗的序列设计采用优化的mRNA骨架代码序列,加强mRNA的稳定性与蛋白表达效能。猴痘病毒mRNA的CDS由优化的密码子构成,决定了猴痘病毒IMV和EEV具有保护免疫原性蛋白的氨基酸序列。
为实现mRNA的体外转录,将猴痘病毒mRNA疫苗序列模板构建在载体PVAX1上的T7启动子最后一个碱基--多克隆位点XbaI位点之间,利用T7启动子序列,在T7转录酶作用下启动体外转录。
由此,设计优化得到猴痘mRNA疫苗活性成分mRNA-M351、mRNA-M564、mRNA-M630、mRNA-M837、mNRA-M972和mRNA-M1038。如图1所示:mRNA-M351(图1中1所示)、mRNA-M564(图1中2所示)、mRNA-M630(图1中3所示)、mRNA-M837(图1中4所示)、mRNA-M972(图1中5所示)、和mRNA-M1038(图1中6所示)的序列如序列SEQ ID NO.10至SEQ ID NO.15所示。
mRNA-M351 DNA模板序列(SEQ ID No.10):
自5’端第1至52为5’-UTR,49-52为Kozak序列,本领域技术人员可通过常规技术手段选择和替换与本发明不同kozak序列,例如kozak序列可替换为GCC、ACC、GCCACC或GCCANN,第53至385为CDS-A29L(编码猴痘病毒A29L蛋白的1-110位氨基酸),第386至511为3’-UTR,第512至631为Poly A尾。
mRNA-M564序列(SEQ ID No.11):
自5’端第1至52为5’-UTR,49-52为Kozak序列,本领域技术人员可通过常规技术手段选择和替换与本发明不同kozak序列,例如kozak序列可替换为GCC、ACC、GCCACC或GCCANN,第53至598为CDS-A29L(编码猴痘病毒A35R蛋白的1-181位氨基酸),第599至724为3’-UTR,第725至844为Poly A尾。
mRNA-M630序列(SEQ ID No.12):
自5’端第1至52为5’-UTR,49-52为Kozak序列,本领域技术人员可通过常规技术手段选择和替换与本发明不同kozak序列,例如kozak序列可替换为GCC、ACC、GCCACC或GCCANN,第53至664为CDS-A35R(53-121编码tPA信号肽,122-664编码猴痘病毒A35R蛋白的1-181位氨基酸),第665至790为3’-UTR,第791至910为Poly A尾。
mRNA-M837序列(SEQ ID No.13):
自5’端第1至52为5’-UTR,49-52为Kozak序列,本领域技术人员可通过常规技术手段选择和替换与本发明不同kozak序列,例如kozak序列可替换为GCC、ACC、GCCACC或GCCANN,第53至871为CDS-M1R(53-121编码tPA信号肽,122-871编码猴痘病毒M1R蛋白的1-249位氨基酸),第872至997为3’-UTR,第998至1117为Poly A尾。
mRNA-M972序列(SEQ ID No.14):
自5’端第1至52为5’-UTR,49-52为Kozak序列,本领域技术人员可通过常规技术手段选择和替换与本发明不同kozak序列,例如kozak序列可替换为GCC、ACC、GCCACC或GCCANN,第53至1006为CDS-B6R(编码猴痘病毒B6R蛋白的1-317位氨基酸),第1007至1132为3’-UTR,第1133至1252为Poly A尾。
mRNA-M1038序列(SEQ ID No.15):
自5’端第1至52为5’-UTR,49-52为Kozak序列,本领域技术人员可通过常规技术手段选择和替换与本发明不同kozak序列,例如kozak序列可替换为GCC、ACC、GCCACC或GCCANN,第53至1072为CDS-B6R(53-121编码tPA信号肽,122-1072编码猴痘病毒B6R蛋白的1-317位氨基酸),第1073至1198为3’-UTR,第1199至1318为Poly A尾。
二、猴痘病毒mRNA疫苗的体外合成
1.将设计的猴痘病毒mRNA疫苗序列进行DNA模板合成,并克隆到PVAX1载体上,获得mRNA的模板DNA质粒。
2.将模板DNA质粒转化感受态细胞DH5α,通过对宿主大肠杆菌的培养,得到大量扩增菌体。借助无内毒素质粒大提试剂盒(天根生物科技(北京)有限公司,DP117)提取扩增菌体中扩增的重组质粒。
将扩增的重组质粒进行线性化:利用Bsa I酶对提取的重组质粒进行酶切线性化,经纯化得到可用于mRNA体外合成的模板,并采用QubitTM dsDNA BR Assay Kit(Invitrogen,Q32850)试剂盒进行定量。
3.以步骤2制备的线性化DNA为mRNA的体外合成模板,配制表1所示的反应体系,37℃孵育1h进行体外转录,得到大量体外转录RNA,并采用QubitTM dsDNA BR Assay Kit(Invitrogen,Q32850)试剂盒进行定量。
表1.体外转录反应采用T7-FlashScribeTM Transcription试剂盒(Cellscript,C-ASF3507)
4.将步骤3体外转录RNA产物进行纯化:向转录反应体系中加入1μL RNase-FreeDNase I,37℃孵育15min,以去除体外转录产物体系中的DNA模板,得到转录产物。再对得到的转录产物进行纯化,纯化方法如下:
(1)向转录产物中加入RNase-Free H2O补足体积200μL;
(2)加入200μL混合液A(水饱和酚:氯仿:异戊醇,v:v:v,25:24:1),涡旋10s,4℃,13800×g离心5min,然后将管中上层水相移至新管中;
(3)向新管中加入等体积混合液B(氯仿:异戊醇,v:v,24:1),涡旋10s,4℃,13800×g离心5min,然后将管中上层水相移至新管中;
(4)向新管中加入等体积5M乙酸铵溶液,涡旋混匀后冰上放置15min后,4℃、13800×g离心15min,弃上清;
(5)加入70%冰乙醇对RNA进行清理后,弃去70%乙醇;加适量RNase-Free水(Solarbio,R1600)重悬,并采用QubitTM RNA BR Assay Kit(Invitrogen,Q10211)试剂盒进行定量。
5.对步骤4得到的RNA转录纯化产物进行mRNA加帽反应,具体步骤如下:
(1)RNA变性:取60μg转录纯化产物,65℃孵育15min进行变性处理,然后移至冰上。
(2)mRNA加帽反应:加入RNA变性产物后,按照表2所示配制反应体系,37℃孵育0.5h,得到mRNA具有Cap 1型结构的加帽产物。
表2.mRNA的Cap 1加帽反应体系配制采用ScriptCapTM Cap 1Capping System试剂盒(Cellscript,C-SCCS1710)
6.mRNA加帽产物纯化:同步骤4。
7.mRNA的质量分析:
采用安捷伦2100生物分析仪和RNA Nano 6000Assay Kit(Aglient,5067-1511)对合成mRNA进行质量分析,具体步骤如下:
(1)mRNA变性:将mRNA和mRNA Ladder,70℃变性2min,然后立即冰浴。
(2)准备凝胶:按说明将RNA gel matrix加入过滤管中,1500×g室温离心10min,4℃保存备用。
(3)准备凝胶-染料混合物:RNA染料避光平衡30min,然后涡旋数秒,瞬时离心后以65:1比例配制凝胶染料混合物,将混合物涡旋混匀,13000×g室温离心10min。
(4)加载凝胶-染料混合物:使用RNA nano芯片之前,调节芯片制备器夹子到最上方的位置。将RNA芯片放入芯片槽,在注明黑色G的孔中加入9μL凝胶-染料混合物(不要有气泡);注射器活塞在1mL位置处时关闭注胶器,按压注射器,用夹子固定30s后再松开,5s后将活塞拉回1mL处的位置;打开注胶器,在其它注明白色G的孔中加入9μL凝胶-染料混合物。
(5)加载Marker:在所有样品孔与ladder孔中各加入6μL RNA Marker。
(6)加载Ladder与mRNA:在标有梯子图样的孔中加入1μL ladder,将mRNA加入到剩余12个孔中(没有用到的孔可用RNase-free water代替),将芯片放到芯片涡旋振荡器上,2400r/min振荡1min,然后5min内将芯片放到Agilent 2100仪中进行检测。
结果如图2所示,结果显示,体外合成的猴痘mRNA-M351(图2中A29L-A和A29L-B所示)、mRNA-M564(图2中A35R-A所示)、mRNA-M630(图2中A35R-B所示)、mRNA-M837(图2中M1R-A、M1R-B所示)、mRNA-M972(图2中B6R-A所示)和mRNA-M1038(图2中B6R-B所示)条带与目标条带一致,浓度分别为2083ng/μL、1994ng/μL、2220ng/μL、1920ng/μL、1982ng/μL和1946ng/μL。
三、mRNA的细胞转染蛋白表达检测
1.接种细胞:将293T细胞(ATCC)分别接种于12孔板中,每孔3×105个细胞,37℃,5%CO2培养箱中至细胞达到80-90%融合度即可进行转染。
2.配制转染复合物:采用LipofectamineTM 2000Transfection Reagent(Invitrogen,11668-027):49μL Opti-MEM+1μL Lipo2000,49μL Opti-MEM+1ug mRNA静置5min后,然后将两管混匀、室温静置20min形成转染复合物。
3.转染细胞:将转染复合物滴加到细胞并上下左右晃动使转染复合物均匀分布,37℃,5% CO2孵育18h后收取细胞,转染前后无需更换细胞培养液。
4.提取细胞总蛋白:细胞用PBS清洗两次后,利用细胞裂解液RIPA(金普莱,P06M11)+蛋白酶抑制剂100×(金普莱,P01C01),涡旋,以充分裂解细胞。冰浴30min后,4℃,离心13800×g,15min,取上清液。
5.细胞总蛋白定量:利用BCA蛋白定量试剂盒(金普莱,P06M16)对细胞裂解上清液中总蛋白进行定量。将细胞裂解上清液与BCA工作液混匀,37℃,孵育45min,A562 nm下检测吸光度,并计算细胞总蛋白浓度。
6.Western blotting(WB)检测目标蛋白表达:利用蛋白电泳预制胶BoltTM 4to12%,Bis-Tris,1.0mm,Mini Protein Gel(Invitrogen,NW04120BOX)电泳(200V,22min)进行总蛋白(10μg)分离。将凝胶上的分离蛋白在梯度电压(20V,1min;23V,4min;25V,2min)作用下转移到iBlot 2Transfer Stacks,PVDF(Invitrogen,IB24001)膜上后,在含5%脱脂奶粉的1×TBST中室温摇育,20r/min,封闭1h。
抗His-tag鼠单抗稀释液(1:2000),Mouse anti His-tag mAb(Abclone,AE003),20r/min,室温摇育2h。用1×TBST清洗膜,60r/min,室温摇育10min,并重复3次,以彻底去除一抗残余。二抗采用辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG二抗稀释液(1:2000),HRPGoat anti-Mouse IgG(H+L)(Abclone,AS003),20r/min,室温摇育1h。用1×TBST清洗膜,60r/min,室温摇育10min,并重复3次,以彻底去除二抗残余。
利用ECL化学发光超敏显色试剂盒(翊圣生物,36208ES60)与膜室温避光孵育3min,在化学发光仪中检测HRP标记的抗体结合抗原。通过曝光显现条带与蛋白marker,PageRulerTM Prestained Protein Ladder(Invitrogen,26617)条带比对,验证目标抗原蛋白的表达。利用膜再生液(索莱宝,SW3020)去除膜上抗体,再次对膜进行封闭后,孵育内参抗体,以检测蛋白上样量的一致性。一抗采用β-actin兔单抗稀释液(1:50000),ACTBRabbit mAb(Abclonal,AC038),二抗采用辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗稀释液(1:10000),Goat Anti-Rabbit IgG Secondary Antibody(HRP)(义翘神州,SSA004)。
结果如图3所示,mRNA-A-mix组包括mRNA-M351、mRNA-M564、mRNA-M837和mRNA-M972;mRNA-B-mix组包括mRNA-M351、mRNA-M630、mRNA-M837和mRNA-M1038。结果显示:体外合成的猴痘病毒mRNA-M351、mRNA-M564、mRNA-M630、mRNA-M837、mNRA-M972和mRNA-M1038转染HEK293T细胞后,WB均检测到高效表达的猴痘病毒A29L、A35R、M1R和B6R目的抗原,表达水平优于序列优化前的mRNA。
四、多价猴痘mRNA疫苗的制备
(1)LNP-mRNAs脂质纳米颗粒疫苗制备
可离子化阳离子脂材(如SM102)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、胆固醇、DMG-PEG2000乙醇中完全溶解。脂材乙醇溶液按摩尔比50:10:38.5:1.5混合,分别与A组mRNA(mRNA-M351、mRNA-M564、mRNA-M837和mNRA-M972)、B组mRNA(mRNA-M351、mRNA-M630、mRNA-M837和mRNA-M1038)的20mM柠檬酸钠缓冲液(pH 4.0)按体积比1:3(脂材:mRNA)以12mL/min的流速在迈安纳纳米药物制备系统进行混合制备。收集到的样液在DPBS缓冲液中10倍体积稀释后通过50kDa PES超滤管,4℃,2000×g离心超滤浓缩,去除样液中的乙醇含量。最后将通过0.22μm滤膜的疫苗制剂以DPBS缓冲液调整到适用浓度继续实验。
(2)YK009 LNP-mRNAs脂质纳米颗粒疫苗制备
新型可阳离子化脂材(YK009)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、胆固醇、DMG-PEG2000乙醇中完全溶解。所述新型可离子化阳离子脂材化合物2-辛基癸基6-((4-(癸氧基)-4-氧代基丁基)(2-羟基乙基)氨基)己酸酯(YK009),CH40H79NO5(结构式如下(I)所示),通过将4-((2-羟乙基)氨基)丁酸正癸酯和6-溴代己酸2-辛基癸酯溶于乙腈,加入碳酸钾和碘化钾加热至70℃搅拌反应20h,冷却至室温后过滤,滤液经真空减压浓缩除去溶剂,残余物经硅胶色谱法纯化,得所述可离子化阳离子脂材化合物。上述脂材乙醇溶液按摩尔比50:10:38.5:1.5混合,分别与A组mRNA(mRNA-M351、mRNA-M564、mRNA-M837和mNRA-M972)、B组mRNA(mRNA-M351、mRNA-M630、mRNA-M837和mRNA-M1038)的20mM柠檬酸钠缓冲液(pH 4.0)按体积比1:3(脂材:mRNA)以12mL/min的流速在迈安纳纳米药物制备系统进行混合制备。收集到的样液在DPBS缓冲液中10倍体积稀释后通过50kDa PES超滤管,4℃,2000×g离心超滤浓缩,去除样液中的乙醇含量。最后将通过0.22μm滤膜的疫苗制剂以DPBS缓冲液调整到适用浓度继续实验。
实施例2、猴痘病毒mRNA疫苗免疫小鼠后的血清抗体检测
一、多价猴痘病毒mRNA疫苗的小鼠肌肉免疫:
将实验动物BALB/c小鼠(雌,6-8周,16-18g,北京维通利华)随机分为猴痘病毒LNP-mRNAs-A组(mRNA=40μg/只)、LNP-mRNAs-B组(mRNA=40μg/只)、YK009-mRNAs-A(mRNA=40μg/只)、YK009-mRNAs-B(mRNA=40μg/只)和阴性对照组(PBS,pH=7.4)(每组5只,正常喂养),以肌肉注射方式免疫小鼠。免疫两次,于免疫后的第10天采用眼眶取血获得足够量的小鼠血清。
二、多价猴痘病毒mRNA疫苗的小鼠肌肉免疫及血清抗体检测
将实验动物BALB/c小鼠(雌,6-8周,16-18g,北京维通利华)随机分为不同免疫方案组LNP-mRNAs-A(A组:mRNA-M351、mRNA-M564、mRNA-M837和mRNA-M972;mRNA=40μg/只)、LNP-mRNAs-B(B组:mRNA-M351、mRNA-M630、mRNA-M837和mRNA-M1038;mRNA=40μg/只)、YK009-mRNAs-A(A组:mRNA-M351、mRNA-M564、mRNA-M837和mRNA-M972;mRNA=40μg/只)、YK009-mRNAs-B(B组:mRNA-M351、mRNA-M630、mRNA-M837和mRNA-M1038;mRNA=40μg/只)的免疫组和阴性对照组(PBS,pH=7.4)(每组5只,正常喂养),以肌肉注射方式免疫小鼠。免疫两次,LNP-mRNA组免疫间隔14天,YK009-mRNA组间隔21天。每次免疫后的第10天采用眼眶取血获得足够量的小鼠血清。通过ELISA方法检测小鼠免疫血清猴痘病毒抗原特异性结合抗体IgG的产生,从而对多加猴痘病毒疫苗的体内免疫效力进行评价。
ELISA法检测免疫小鼠血清中猴痘病毒抗原特异性结合抗体IgG的产生情况,具体检测方法如下:
(1)包被:分别将A29L、A35R、B6R、M1R蛋白用碳酸盐缓冲液(50mM,pH 9.6,0.22μm滤膜过滤)稀释至1ng/μl。96孔板每孔中加入100ng RBD蛋白稀释液,密封、4℃过夜;
(2)洗板:包被过夜后,倾倒96孔板去除蛋白包被液,每孔加入200μL洗涤液(含0.2% Tween-20的1×TBS),手轻轻摇动30s后在纸上拍干,重复6次;
(3)封闭:每孔加入200μl封闭液(含2% BSA的1×TBS),37℃温箱孵育2h;
(4)洗板:倾倒96孔板去除封闭液,每孔加入200μl洗涤液(含0.2%Tween-20的1×TBS),手轻轻摇动30s后在纸上拍干,重复6次;
(5)孵育一抗:将免疫小鼠血清用抗体稀释液(含0.5% BSA的洗涤液)进行10倍梯度稀释得到10-1至10-6不同稀释度的血清,每孔加入100μl血清稀释液,37℃温箱孵育2h;
(6)洗板:倾倒96孔板去除血清稀释液,每孔加入200μL洗涤液(含0.2% Tween-20的1×TBS),手轻轻摇动30s后在纸上拍干,重复6次;
(7)孵育二抗:将辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(碧云天,A0216)用抗体稀释液(含0.5% BSA的洗涤液)进行250倍稀释得到二抗稀释液,每孔加入100μl二抗稀释液,37℃温箱孵育1h;
(8)洗板:倾倒96孔板去除二抗稀释液,每孔加入200μl洗涤液(含0.2% Tween-20的1×TBS),手轻轻摇动30s后在纸上拍干,重复6次;
(9)显色:每孔加入100μl TMB底物(天根,RA107),室温、避光、孵育20min;
(10)终止显色:每孔加入50μL 2M H2SO4,在酶标仪上检测A450的OD值;
(11)血清结合抗体IgG滴度判断:某一稀释血清OD/阴性对照OD≥2.1,下一稀释倍数OD/阴性对照OD<2.1,该稀释倍数为该血清样品对应的抗体滴度(如果阴性对照OD<0.05则按0.05计算)。
结果如图4显示:猴痘病毒mRNA疫苗LNP-mRNAs-A和LNP-mRNAs-B免疫小鼠血清均检测到高滴度抗原特异性结合抗体IgG的产生,A29L平均结合抗体IgG滴度约为1:48000(A组)、1:92000(B组)(结果如图4中1所示);M1R平均结合抗体IgG滴度约为1:4040000(A组)、1:3600000(B组)(图4中2所示);B6R平均结合抗体IgG滴度约为1:900000(A组)、1:600000(B组)(图4中3所示);A35R平均结合抗体IgG滴度约为1:1080000(A组)、1:1200000(B组)(图4中4所示);YK009-mRNAs-A和YK009-mRNAs-B免疫后小鼠血清中的平均结合抗体:A29L:1:64000(A组)、1:10000(B组);A35R:1:1000000(A组)、1:820000(B组);M1R:1:1000000(A组)、1:100000(B组);B6R:1:1000000(A组)、1:1000000(B组)(图4中5所示)。
三、猴痘病毒mRNA疫苗的免疫小鼠血清牛痘天坛株活病毒中和抗体检测
通过牛痘天坛株活病毒评价小鼠免疫血清对痘病毒活病毒的中和作用以及测定中和抗体效价NT50,从而对猴痘病毒LNP-mRNAs-A和LNP-mRNAs-B疫苗的体内免疫效力进行评价。
牛痘病毒中和抗体NT50效价测定:
利用牛痘天坛株活病毒,对猴痘病毒mRNA疫苗免疫小鼠血清的抗体中和作用进行评价。评价使用的牛痘天坛株活病毒由新由中国食品药品检定研究院提供。具体检测方法如下:
用DMEM完全培养基对小鼠免疫血清从1/30进行连续3倍稀释,得到6个不同稀释度血清,与650×TCID50假病毒37℃孵育。同时设有无假病毒的细胞对照组和无血清样品的假病毒对照组。孵育1h后,各孔加入2×104个Vero细胞,37℃,5% CO2下进行细胞培养。因天坛株活病毒进入细胞会表达萤火虫荧光素酶,48小时后,与发光底物反应并进行发光检测。通过与病毒对照组发光值比较,计算病毒被抑制的百分比。通过计算公式可以计算出当假病毒50%被抑制时血清的稀释倍数,从而来计算半数抑制稀释度。用半数抑制稀释度来表示半数中和稀释度NT50,即血清抗体对病毒中和活性的情况。
结果如图5显示:猴痘病毒LNP-mRNAs-A组/LNP-mRNAs-B组疫苗免疫的小鼠血清均对牛痘天坛株活病毒具有中和作用。两次免疫后,平均病毒中和抗体滴度NT50分别为~1:3276和~1:2066。
而经发明人研究发现,以未优化的mRNA为原料,按照实施例1中多价猴痘mRNA疫苗的制备方法制备得到的mRNA疫苗,抗原特异性IgG和中和抗体滴度基本检测不到。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种mRNA,其特征在于,所述mRNA从5’到3’依次包括5’UTR、Kozak序列、编码区、3’UTR和Poly A尾;
所述5’UTR的核酸序列如SEQ ID NO.1所示,或者与SEQ ID NO.1具有95%以上同源性的序列;
所述3’UTR的核酸序列如SEQ ID NO.2所示,或者与SEQ ID NO.2具有95%以上同源性的序列;
所述编码区的核酸序列如SEQ ID NO.4~SEQ ID NO.9中的任一种所示,或者与SEQ IDNO.4~SEQ ID NO.9中的任一种具有95%以上同源性的序列。
2.根据权利要求1所述的mRNA,其特征在于,所述Kozak序列包括GCC、ACC、GCCACC或GCCANN;
优选地,所述Poly A尾的核酸序列如SEQ ID NO.3所示,或者与SEQ ID NO.3具有95%以上同源性的序列。
3.一种mRNA组合,其特征在于,包括:编码猴痘病毒A29L的mRNA、编码猴痘病毒A35R的mRNA、编码猴痘病毒M1R的mRNA和编码猴痘病毒B6R的mRNA;
所述编码猴痘病毒A29L的mRNA序列如SEQ ID NO.10所示,或者与SEQ ID NO.10具有95%以上同源性的序列;
所述编码猴痘病毒A35R的mRNA序列如SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12所示,或者与SEQID NO.11或SEQ ID NO.12具有95%以上同源性的序列;
所述编码猴痘病毒M1R的mRNA序列如SEQ ID NO.13所示,或者与SEQ ID NO.13具有95%以上同源性的序列;
所述编码猴痘病毒B6R的mRNA序列如SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.15所示,或者与SEQID NO.14或SEQ ID NO.15具有95%以上同源性的序列。
4.生物材料,其特征在于,包括如下B1)至B6)中至少一种:
B1)转录权利要求1或2所述mRNA的核酸分子,或者转录权利要求3所述mRNA组合的核酸分子;
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒;
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体,或含有B2)所述表达盒的重组载体;
B4)含有B1)所述核酸分子的重组质粒,或含有B2)所述表达盒的重组质粒;
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物,或含有B2)所述表达盒的重组微生物,或含有B3)所述重组载体的重组微生物;
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因细胞系。
5.权利要求1或2所述的mRNA或者权利要求3所述的mRNA组合在制备猴痘疫苗中的应用。
6.一种mRNA复合物,其特征在于,包括递送载体和权利要求1或2所述的mRNA或者权利要求3所述的mRNA组合。
7.根据权利要求6所述的mRNA复合物,其特征在于,所述递送载体包括可离子化脂质体、阳离子脂质体、可离子化蛋白、阳离子蛋白、可离子化聚合物、阳离子聚合物、可离子化胶束、阳离子胶束、可离子化脂质纳米粒或阳离子脂质纳米颗粒中的任一种;
优选地,所述递送载体为YK009;
优选地,所述mRNA复合物还包括1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、胆固醇和DMG-PEG2000。
8.一种多价猴痘mRNA疫苗,其特征在于,包括权利要求1或2所述的mRNA、权利要求3所述的mRNA组合或者权利要求6或7所述的mRNA复合物;
优选地,所述mRNA组合中,编码猴痘病毒A35R的mRNA的序列如SEQ ID NO.11所示,编码猴痘病毒B6R的mRNA的序列如SEQ ID NO.14所示;
或,编码猴痘病毒A35R的mRNA的序列如SEQ ID NO.12所示;编码猴痘病毒B6R的mRNA的序列如SEQ ID NO.15所示。
9.一种药物组合物,其特征在于,包括权利要求1或2所述的mRNA、权利要求3所述的mRNA组合、权利要求4所述的生物材料、权利要求6或7所述的mRNA复合物或权利要求8所述的多价猴痘mRNA疫苗中的至少一种,以及任选的药用载体。
10.一种试剂盒,其特征在于,包括权利要求1或2所述的mRNA、权利要求3所述的mRNA组合、权利要求4所述的生物材料、权利要求6或7所述的mRNA复合物或权利要求8所述的多价猴痘mRNA疫苗中的至少一种。
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