CN112812156A - 一种新型冠状病毒covid-19-s1蛋白的表达和纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种新型冠状病毒COVID‑19‑S1蛋白的表达和纯化方法。本发明提供的方法，主要包括构建COVID‑19‑S1蛋白表达质粒、将COVID‑19‑S1蛋白表达质粒转化、培养表达COVID‑19‑S1蛋白、纯化COVID‑19‑S1蛋白等过程。本发明将能在293F细胞中高分泌表达蛋白的信号肽与Kozak区和编码人COVID‑19‑S1蛋白的基因进行重组，来提高目的蛋白的表达量和分泌量。采用本发明提供的方法，可以解决新型冠状病毒COVID‑19‑S1蛋白分泌量低、纯度低的问题，为免疫学快速诊断、制备单抗、开展解析蛋白结构研究等提供物质基础。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及涉及一种新型冠状病毒COVID-19-S1蛋白制备技术。
背景技术
冠状病毒肺炎是2019年新兴的一种传染病，目前正在全球范围内传播。它是由新型冠状病毒中引起严重急性呼吸系统综合症的冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起的。SARS-CoV-2的刺突蛋白(S)在受体识别和细胞膜融合过程中起关键作用，由两个亚基S1和S2组成。S1亚基中包含一个受体结合域，该域能识别并结合宿主受体血管紧张素转化酶2，而S2亚基能通过两七重复域形成六螺旋束，从而介导病毒细胞膜融合。大量糖基化的S蛋白覆盖SARS-CoV-2的表面并与宿主细胞受体血管紧张素转化酶2(ACE2)结合，介导病毒细胞进入。
对于冠状病毒来说，S蛋白在很大程度上决定了其种属特异性，因此也是冠状病毒表面最为重要的抗原决定簇。另外，由于S蛋白作为抗原能够诱导宿主体内产生特异性的抗体，这些特异性的抗体也可作为诊断冠状病毒感染的靶分子，直接从血清样品中进行检测。然而，哺乳动物细胞蛋白表达的S1蛋白的表达是相对较低的，通过增加细胞分泌表达的能力能够显著提高S1蛋白的产量，同时也更加便于蛋白的纯化。
在293F细胞表达分泌性蛋白质过程中，起初会合成由15-30个疏水性氨基酸组成的信号肽，信号肽随后被细胞质中的信号识别颗粒(Signal-Recognition Particle,SRP)所识别，识别后导致蛋白质合成暂停，随后核糖体与内质网膜结合，信号肽依靠其疏水性插入内质网膜腔内，在核糖体结合内质网膜后，SRP将会离开，处于暂停状态的蛋白质合成重新开始，而后信号肽酶对信号肽进行切割。所以，一个合适的信号肽也有助于提高重组蛋白的表达水平。
发明内容
为了解决现有技术中的不足，本发明的目的之一在于提供一种用人胚肾细胞表达外源蛋白时信号肽的选择方法，通过该方法可以选择适合重组新冠病毒刺突蛋白外分泌表达的信号肽；本发明的目的之二在于插入Kozak区，提高重组COVID-19-S1蛋白的表达量。本发明通过将能在293F细胞中高分泌表达蛋白的信号肽与Kozak区和外源目的蛋白基因进行重组，提高了目的蛋白的表达量和分泌量。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种新型冠状病毒COVID-19-S1蛋白表达和纯化的方法，包括如下步骤：
S1、构建COVID-19-S1蛋白表达质粒：选择编码COVID-19-S1蛋白的基因，根据293F细胞偏好进行密码子优化，选择信号肽，将目的基因与选择出的信号肽连接，在信号肽前端引入Kozak区，将优化后的基因序列克隆到pcDNA3.1-myc-HisA载体中，构建表达质粒，再用高纯度质粒小提试剂盒提取质粒，用无菌水洗脱，用分光光度计测得质粒浓度为1mg/mL，获得pcDNA3.1-myc-HisA-COVID-19-S1质粒的目的DNA；
S2、将COVID-19-S1蛋白表达质粒转化：取1μL步骤S1获得的pcDNA3.1-myc-HisA-COVID-19-S1质粒的目的DNA液转化到Escherichia coli DH5α感受态菌株中，冰浴30min，42℃热激90s，再冰浴5min后，加入500μL的LB液体培养基，放在温度为37℃，转速为150rpm的摇床培养1h；然后取30μL培养液涂布到含有氨苄抗生素LB固体培养板上，在温度为37℃的培养箱中培养16小时后，从中挑选出单一菌落加入到含有氨苄抗生素的LB液体培养基中，置于温度为37℃，转速为220rpm的摇床上培养16小时后，取状态良好的293F细胞于培养瓶中，用天根高纯度质粒小提中量试剂盒提取，获得含pcDNA3.1-myc-HisA-COVID-19-S1质粒的目的DNA；
S3、培养表达COVID-19-S1蛋白：通过PEI转染法将步骤S2所得pcDNA3.1-myc-HisA-COVID-19-S1质粒的目的DNA转染进293F细胞，转染成功后，置于37℃、8％CO2、120rpm培养箱中培养24h后，补加与培养液等体积的OPM-293CD05新鲜培养基，待细胞生长至4×106/mL密度时，每天添加1％体积比的OPM-293ProFeed补料培养基，放回37℃、8％CO2、120rpm培养箱中继续培养96h，获得表达COVID-19-S1蛋白的293F细胞培养液；
S4、纯化COVID-19-S1蛋白：将步骤S3所得表达COVID-19-S1蛋白的293F细胞培养液在转速为1500rpm的条件下离心15min，收集上清，用0.45μm的滤膜过滤，选用镍柱进行蛋白纯化；镍柱使用前用50倍柱体积含有100mM Tris pH为7.5的HCl、300mM NaCl、10mMimidazole的平衡缓冲液对柱子进行平衡，再将离心取得的上清液流过柱子，再依次用20倍柱体积含0mM、50mM、150mM、300mM的咪唑浓度的洗脱液进行洗脱，收集不同咪唑浓度的洗脱液，其中150mM咪唑的洗脱液中含有目的蛋白COVID-19-S1蛋白，将纯化的COVID-19-S1蛋白进行透析，即得。
优选的，所述步骤S1中的信号肽为TPA信号肽，TPA信号肽序列信息如SEQ ID NO.1所示。
ATGGACGCCATGAAGAGGGGGCTGTGCTGCGTGCTGCTGCTGTGCGGGGCCGTGTTCGTGAGCCCC(SEQ ID NO.1)
优选的，所述步骤S1中引入的Kozak区序列信息如SEQ ID NO.2所示。
GCCACCATGG(SEQ ID NO.2)
优选的，步骤S1所述编码COVID-19-S1蛋白为新冠病毒刺突蛋白S1，大小约为120kDa，编码所述新冠病毒刺突蛋白S1的基因序列信息如SEQ ID NO.3所示。
GTGAACCTGACCACAAGAACCCAGCTGCCCCCTGCCTATACAAATAGCTTTACCCGGGGCGTGTACTATCCTGATAAGGTGTTCAGATCTAGCGTGCTGCACTCCACCCAGGACCTGTTTCTGCCATTCTTTTCTAACGTGACATGGTTCCACGCCATCCACGTGTCCGGCACAAATGGCACCAAGCGGTTTGATAACCCTGTGCTGCCCTTCAACGACGGCGTGTACTTCGCCTCTACCGAGAAGAGCAACATCATCAGAGGCTGGATCTTCGGCACCACACTGGATTCCAAGACCCAGTCTCTGCTGATCGTGAACAATGCCACAAACGTGGTCATCAAGGTGTGCGAGTTCCAGTTTTGTAATGACCCTTTTCTGGGCGTGTACTATCACAAGAACAATAAGAGCTGGATGGAGTCCGAGTTCCGGGTGTATTCCTCTGCCAACAATTGCACCTTTGAGTACGTGAGCCAGCCATTCCTGATGGATCTGGAGGGCAAGCAGGGCAACTTCAAGAACCTGAGGGAGTTCGTGTTTAAGAACATCGACGGCTATTTCAAGATCTACTCCAAGCACACCCCAATCAATCTGGTGCGCGATCTGCCCCAGGGCTTTTCTGCCCTGGAGCCTCTGGTGGACCTGCCAATCGGCATCAACATCACAAGGTTCCAGACCCTGCTGGCCCTGCACCGCAGCTACCTGACCCCAGGCGATAGCTCCTCTGGATGGACAGCAGGAGCAGCAGCATACTATGTGGGCTATCTGCAGCCTAGGACCTTTCTGCTGAAGTACAACGAGAATGGCACCATCACAGACGCCGTGGATTGCGCCCTGGACCCACTGTCTGAGACAAAGTGTACCCTGAAGAGCTTCACAGTGGAGAAGGGCATCTATCAGACCAGCAACTTTCGGGTGCAGCCCACAGAGTCCATCGTGAGATTCCCCAATATCACCAACCTGTGCCCTTTTGGCGAGGTGTTCAATGCCACACGCTTCGCCAGCGTGTACGCCTGGAACAGGAAGCGCATCTCCAATTGCGTGGCCGATTATTCTGTGCTGTACAACTCTGCCAGCTTCTCCACCTTTAAGTGCTATGGCGTGAGCCCCACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTTACAAACGTGTACGCCGATTCCTTCGTGATCAGGGGCGACGAGGTGCGCCAGATCGCACCAGGACAGACCGGCAAGATCGCAGATTACAACTATAAGCTGCCCGACGATTTCACAGGCTGCGTGATCGCCTGGAATTCTAACAATCTGGACAGCAAAGTGGGCGGCAACTACAATTATCTGTACCGGCTGTTTAGAAAGTCTAACCTGAAGCCTTTCGAGCGGGACATCTCCACCGAGATCTACCAGGCCGGCTCTACACCATGCAACGGCGTGGAGGGCTTTAATTGTTATTTCCCTCTGCAGTCCTACGGCTTTCAGCCAACCAATGGCGTGGGCTATCAGCCCTACAGAGTGGTGGTGCTGTCTTTCGAGCTGCTGCACGCACCAGCAACCGTGTGCGGACCCAAGAAGAGCACAAATCTGGTGAAGAACAAGTGCGTGAACTTCAACTTCAACGGACTGACCGGAACAGGCGTGCTGACCGAGAGCAACAAGAAGTTCCTGCCCTTTCAGCAGTTCGGCAGGGACATCGCCGATACCACAGACGCCGTGCGCGATCCCCAGACACTGGAGATCCTGGACATCACCCCTTGCTCCTTCGGCGGCGTGTCTGTGATCACCCCTGGCACCAATACATCCAACCAGGTGGCCGTGCTGTATCAGGATGTGAACTGTACAGAGGTGCCAGTGGCAATCCACGCAGACCAGCTGACCCCAACATGGCGGGTGTACAGCACAGGCTCCAACGTGTTCCAGACCAGAGCAGGATGCCTGATCGGAGCAGAGCACGTGAACAATAGCTATGAGTGCGATATCCCCATCGGCGCCGGCATCTGTGCCAGCTACCAGACCCAGACAAACTCCCCTAGGAGAGCAAGG(SEQ ID NO.3)
优选的，所述步骤S3中采用PEI转染法转染COVID-19-S1目的DNA的步骤是：将DNA和PEI分别溶解于opti-MEM培养基中，DNA或PEI与培养基的比例为1:20，混匀后，再将PEI溶液缓慢滴加到DNA溶液中，混匀，室温静置30min，再缓慢滴加到293F细胞液中。
优选的，所述步骤S4中透析袋大小为10kDa，温度为4℃，透析时间为12h，透析缓冲液为20mM PBS，pH为7.4。
优选的，步骤S1所述选择信号肽的过程为：
1)选择新冠病毒刺突蛋白S1作为蛋白序列，将编码蛋白的基因序列针对293F细胞宿主进行密码子优化，优化后的基因序列如SEQ ID NO.4所述，其中，加粗部分为Kozak区，波浪线为TPA信号肽区，下划线部分为酶切位点序列，然后将所述基因序列构建进pcDNA3.1-myc-HisA载体，获得目的基因载体；
2)从已报道的文献(宋倩倩,王文玲,詹瑛,鲁福娜,邓瑶,谭文杰.真核表达MERS-CoV刺突蛋白亚单位的信号肽序列优化研究[J].病毒学报,2019,35(01):20-26.)中选取能有效分泌表达外源目的基因的信号肽作为待选择信号肽，将待选择信号肽分别与步骤1)所得目的基因载体连接，连接时在待选择信号肽前分别选用引入Kozak区和不引入Kozak区两种连接方式，获得重组蛋白；
3)使用信号肽分析工具分析步骤2)所得重组蛋白的氨基酸序列，选择切割位点分析准确且落在所述蛋白序列前的信号肽，即为适合新冠病毒刺突蛋白表达的信号肽。
优选的，步骤1)所述的蛋白序列为新冠病毒刺突蛋白S1的16-685位氨基酸序列。
优选的，所述信号肽分析方法为Western Blot检测方法。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明将能在293F细胞中高分泌表达蛋白的信号肽与Kozak区和外源目的蛋白基因进行重组，来提高目的蛋白的表达量和分泌量。采用本发明提供的新型状病毒COVID-19-S1蛋白表达和纯化的方法，可以解决新型状病毒COVID-19-S1蛋白分泌量低、纯度低的问题为免疫学快速诊断、制备单抗、开展解析蛋白结构研究等提供物质基础。
附图说明
图1为引入Kozak区293F细胞COVID-19-S1蛋白的分泌表达图；
图2为不同信号肽介导COVID-19-S1蛋白293F细胞蛋白分泌表达水平和效率的差异图。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。所述信号肽由广州擎科生物技术有限公司合成；
所述目的质粒的提取试剂盒为高纯度质粒小提中量试剂盒(DP107)，购自天根生化科技(北京)有限公司；所述293F细胞来自厦门大学；所述新冠病毒刺突蛋白S1(16-685aa)由广州擎科生物技术有限公司合成；所述Escherichia coli DH5a感受态菌株购自天根生化科技(北京)有限公司；所述LB液体培养基试剂购自sigma公司；所述新鲜培养基为OPM-293CD05培养基，购自上海奥浦迈生物科技有限公司；所述补料培养基为OPM-293ProFeed培养基，购自上海奥浦迈生物科技有限公司；所述opti-MEM培养基购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；所述镍柱购自汇研生物科技有限公司；所述洗脱液试剂购自国药集团；所述信号肽分析方法为Western Blot检测方法。
实施例
S1、构建COVID-19-S1蛋白表达质粒：选择编码COVID-19-S1蛋白的基因根据293F细胞偏好进行密码子优化，选择信号肽，将目的基因与选择出的信号肽连接，在信号肽前段引入Kozak区，将优化后的基因序列克隆到pcDNA3.1-myc-HisA载体中，以构建表达质粒，用天根小量质粒提取试剂盒DP103提取质粒，再用无菌水洗脱，用分光光度计测得质粒浓度为1mg/mL，获得pcDNA3.1-myc-HisA-COVID-19-S1质粒的目的DNA。
S2、将COVID-19-S1蛋白表达质粒转化：取1μL步骤S1获得的pcDNA3.1-myc-HisA-COVID-19-S1质粒的目的DNA液转化到Escherichia coli DH5α感受态菌株中，冰浴30min，42℃热激90s，再冰浴5min后，加入500μL的LB液体培养基，放在温度为37℃，转速为150rpm的摇床培养1h；然后取30μL培养液涂布到含有氨苄抗生素LB固体培养板上，在温度为37℃的培养箱中培养16小时后，从中挑选出单一菌落加入到含有氨苄抗生素的LB液体培养基中，置于温度为37℃，转速为220rpm的摇床上培养16小时后，取状态良好的293F细胞于培养瓶中，用天根高纯度质粒小提中量试剂盒(DP107)提取，获得含pcDNA3.1-myc-HisA-COVID-19-S1质粒的目的DNA；
S3、培养表达COVID-19-S1蛋白：通过PEI转染法将步骤S2所得pcDNA3.1-myc-HisA-COVID-19-S1质粒的目的DNA转染进293F细胞，转染成功后，置于37℃、8％CO2、120rpm培养箱中培养，培养24h后，补加与培养液等体积的OPM-293CD05新鲜培养基，待细胞生长至4x106cells/mL密度时，每天添加1％体积比的OPM-293ProFeed补料培养基，放回37℃、8％CO2、120rpm培养箱中继续培养96h，获得表达COVID-19-S1蛋白的293F细胞培养液；
S4、纯化COVID-19-S1蛋白：将步骤S3所得表达COVID-19-S1蛋白的293F细胞培养液在转速为1500rpm的条件下离心15min，收集上清，用0.45μm的滤膜过滤，选用镍柱进行蛋白纯化；镍柱使用前用50倍柱体积含有100mM Tris pH为7.5的HCl、300mM NaCl、10mMimidazole的平衡缓冲液对柱子进行平衡，再将离心取得的上清液流过柱子，再依次用20倍柱体积含0mM、50mM、150mM、300mM的咪唑浓度的洗脱液进行洗脱，收集不同咪唑浓度的洗脱液，其中150mM咪唑的洗脱液中含有目的蛋白COVID-19-S1蛋白，将纯化的COVID-19-S1蛋白进行透析，即得。
图1为在293F细胞中，未引入和引入Kozak区的COVID-19-S1质粒的蛋白分泌表达情况，其中对照为没有目的基因的空载体，通过Western Blot检测到293F细胞的细胞上清液和细胞裂解液中COVID-19-S1蛋白的表达情况，COVID-19-S1蛋白的表达量增加，说明目的DNA在引入Kozak区后能够促进COVID-19-S1蛋白的分泌和表达。
图2为不同信号肽介导COVID-19-S1蛋白293F细胞蛋白分泌表达水平和效率的差异图，同样采用western blot实验，使用的信号肽分别为人组织纤溶酶原激活剂(Tissueplasminogen activator,tPA)、高斯荧光素酶(Gaussia luciferase,GLuc)、人类白细胞分化抗原(hCD14)，对照组为无添加信号肽的S1蛋白，其中TPA信号肽的表达水平和效率(表达效率通过western blot检测到的蛋白质分泌到细胞外的含量确定)最高，说明TPA信号肽是更适合人胚肾细胞的表达。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
序列表
<110> 厦门宝太生物科技有限公司
<120> 一种新型冠状病毒COVID-19-S1蛋白的表达和纯化方法
<130> 2021.4.1
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 66
<212> DNA
<213> 编码TPA信号肽的核苷酸序列信息(TPA signal peptide gene sequence)
<400> 1
atggacgcca tgaagagggg gctgtgctgc gtgctgctgc tgtgcggggc cgtgttcgtg 60
agcccc 66
<210> 2
<211> 10
<212> DNA
<213> Kozak区序列信息(Kozak area gene sequence)
<400> 2
gccaccatgg 10
<210> 3
<211> 2010
<212> DNA
<213> 新冠病毒刺突蛋白S1的基因序列信息(The gene sequence information ofthe new coronavirus spike protein S1)
<400> 3
gtgaacctga ccacaagaac ccagctgccc cctgcctata caaatagctt tacccggggc 60
gtgtactatc ctgataaggt gttcagatct agcgtgctgc actccaccca ggacctgttt 120
ctgccattct tttctaacgt gacatggttc cacgccatcc acgtgtccgg cacaaatggc 180
accaagcggt ttgataaccc tgtgctgccc ttcaacgacg gcgtgtactt cgcctctacc 240
gagaagagca acatcatcag aggctggatc ttcggcacca cactggattc caagacccag 300
tctctgctga tcgtgaacaa tgccacaaac gtggtcatca aggtgtgcga gttccagttt 360
tgtaatgacc cttttctggg cgtgtactat cacaagaaca ataagagctg gatggagtcc 420
gagttccggg tgtattcctc tgccaacaat tgcacctttg agtacgtgag ccagccattc 480
ctgatggatc tggagggcaa gcagggcaac ttcaagaacc tgagggagtt cgtgtttaag 540
aacatcgacg gctatttcaa gatctactcc aagcacaccc caatcaatct ggtgcgcgat 600
ctgccccagg gcttttctgc cctggagcct ctggtggacc tgccaatcgg catcaacatc 660
acaaggttcc agaccctgct ggccctgcac cgcagctacc tgaccccagg cgatagctcc 720
tctggatgga cagcaggagc agcagcatac tatgtgggct atctgcagcc taggaccttt 780
ctgctgaagt acaacgagaa tggcaccatc acagacgccg tggattgcgc cctggaccca 840
ctgtctgaga caaagtgtac cctgaagagc ttcacagtgg agaagggcat ctatcagacc 900
agcaactttc gggtgcagcc cacagagtcc atcgtgagat tccccaatat caccaacctg 960
tgcccttttg gcgaggtgtt caatgccaca cgcttcgcca gcgtgtacgc ctggaacagg 1020
aagcgcatct ccaattgcgt ggccgattat tctgtgctgt acaactctgc cagcttctcc 1080
acctttaagt gctatggcgt gagccccacc aagctgaacg acctgtgctt tacaaacgtg 1140
tacgccgatt ccttcgtgat caggggcgac gaggtgcgcc agatcgcacc aggacagacc 1200
ggcaagatcg cagattacaa ctataagctg cccgacgatt tcacaggctg cgtgatcgcc 1260
tggaattcta acaatctgga cagcaaagtg ggcggcaact acaattatct gtaccggctg 1320
tttagaaagt ctaacctgaa gcctttcgag cgggacatct ccaccgagat ctaccaggcc 1380
ggctctacac catgcaacgg cgtggagggc tttaattgtt atttccctct gcagtcctac 1440
ggctttcagc caaccaatgg cgtgggctat cagccctaca gagtggtggt gctgtctttc 1500
gagctgctgc acgcaccagc aaccgtgtgc ggacccaaga agagcacaaa tctggtgaag 1560
aacaagtgcg tgaacttcaa cttcaacgga ctgaccggaa caggcgtgct gaccgagagc 1620
aacaagaagt tcctgccctt tcagcagttc ggcagggaca tcgccgatac cacagacgcc 1680
gtgcgcgatc cccagacact ggagatcctg gacatcaccc cttgctcctt cggcggcgtg 1740
tctgtgatca cccctggcac caatacatcc aaccaggtgg ccgtgctgta tcaggatgtg 1800
aactgtacag aggtgccagt ggcaatccac gcagaccagc tgaccccaac atggcgggtg 1860
tacagcacag gctccaacgt gttccagacc agagcaggat gcctgatcgg agcagagcac 1920
gtgaacaata gctatgagtg cgatatcccc atcggcgccg gcatctgtgc cagctaccag 1980
acccagacaa actcccctag gagagcaagg 2010
<210> 4
<211> 2088
<212> DNA
<213> 优化后的基因序列(Optimized gene sequence)
<400> 4
gccaccatgg acgccatgaa gagggggctg tgctgcgtgc tgctgctgtg cggggccgtg 60
ttcgtgagcc ccggatccgt gaacctgacc acaagaaccc agctgccccc tgcctataca 120
aatagcttta cccggggcgt gtactatcct gataaggtgt tcagatctag cgtgctgcac 180
tccacccagg acctgtttct gccattcttt tctaacgtga catggttcca cgccatccac 240
gtgtccggca caaatggcac caagcggttt gataaccctg tgctgccctt caacgacggc 300
gtgtacttcg cctctaccga gaagagcaac atcatcagag gctggatctt cggcaccaca 360
ctggattcca agacccagtc tctgctgatc gtgaacaatg ccacaaacgt ggtcatcaag 420
gtgtgcgagt tccagttttg taatgaccct tttctgggcg tgtactatca caagaacaat 480
aagagctgga tggagtccga gttccgggtg tattcctctg ccaacaattg cacctttgag 540
tacgtgagcc agccattcct gatggatctg gagggcaagc agggcaactt caagaacctg 600
agggagttcg tgtttaagaa catcgacggc tatttcaaga tctactccaa gcacacccca 660
atcaatctgg tgcgcgatct gccccagggc ttttctgccc tggagcctct ggtggacctg 720
ccaatcggca tcaacatcac aaggttccag accctgctgg ccctgcaccg cagctacctg 780
accccaggcg atagctcctc tggatggaca gcaggagcag cagcatacta tgtgggctat 840
ctgcagccta ggacctttct gctgaagtac aacgagaatg gcaccatcac agacgccgtg 900
gattgcgccc tggacccact gtctgagaca aagtgtaccc tgaagagctt cacagtggag 960
aagggcatct atcagaccag caactttcgg gtgcagccca cagagtccat cgtgagattc 1020
cccaatatca ccaacctgtg cccttttggc gaggtgttca atgccacacg cttcgccagc 1080
gtgtacgcct ggaacaggaa gcgcatctcc aattgcgtgg ccgattattc tgtgctgtac 1140
aactctgcca gcttctccac ctttaagtgc tatggcgtga gccccaccaa gctgaacgac 1200
ctgtgcttta caaacgtgta cgccgattcc ttcgtgatca ggggcgacga ggtgcgccag 1260
atcgcaccag gacagaccgg caagatcgca gattacaact ataagctgcc cgacgatttc 1320
acaggctgcg tgatcgcctg gaattctaac aatctggaca gcaaagtggg cggcaactac 1380
aattatctgt accggctgtt tagaaagtct aacctgaagc ctttcgagcg ggacatctcc 1440
accgagatct accaggccgg ctctacacca tgcaacggcg tggagggctt taattgttat 1500
ttccctctgc agtcctacgg ctttcagcca accaatggcg tgggctatca gccctacaga 1560
gtggtggtgc tgtctttcga gctgctgcac gcaccagcaa ccgtgtgcgg acccaagaag 1620
agcacaaatc tggtgaagaa caagtgcgtg aacttcaact tcaacggact gaccggaaca 1680
ggcgtgctga ccgagagcaa caagaagttc ctgccctttc agcagttcgg cagggacatc 1740
gccgatacca cagacgccgt gcgcgatccc cagacactgg agatcctgga catcacccct 1800
tgctccttcg gcggcgtgtc tgtgatcacc cctggcacca atacatccaa ccaggtggcc 1860
gtgctgtatc aggatgtgaa ctgtacagag gtgccagtgg caatccacgc agaccagctg 1920
accccaacat ggcgggtgta cagcacaggc tccaacgtgt tccagaccag agcaggatgc 1980
ctgatcggag cagagcacgt gaacaatagc tatgagtgcg atatccccat cggcgccggc 2040
atctgtgcca gctaccagac ccagacaaac tcccctagga gagcaagg 2088
Claims (9)
1.一种新型冠状病毒COVID-19-S1蛋白表达和纯化的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、构建COVID-19-S1蛋白表达质粒：选择编码COVID-19-S1蛋白的基因，根据293F细胞偏好进行密码子优化，选择信号肽，将目的基因与选择出的信号肽连接，在信号肽前端引入Kozak区，将优化后的基因序列克隆到pcDNA3.1-myc-HisA载体中，构建表达质粒，再用高纯度质粒小提试剂盒提取质粒，用无菌水洗脱，用分光光度计测得质粒浓度为1mg/mL，获得pcDNA3.1-myc-HisA-COVID-19-S1质粒的目的DNA；
S2、将COVID-19-S1蛋白表达质粒转化：取1μL步骤S1获得的pcDNA3.1-myc-HisA-COVID-19-S1质粒的目的DNA转化到Escherichia coli DH5α感受态菌株中，冰浴30min，42℃热激90s，再冰浴5min后，加入500μL的LB液体培养基，放在温度为37℃，转速为150rpm的摇床培养1h；然后取30μL培养液涂布到含有氨苄抗生素LB固体培养板上，在温度为37℃的培养箱中培养16小时后，从中挑选出单一菌落加入到含有氨苄抗生素的LB液体培养基中，置于温度为37℃，转速为220rpm的摇床上培养16小时后，取状态良好的293F细胞于培养瓶中，用天根高纯度质粒小提中量试剂盒提取，获得pcDNA3.1-myc-HisA-COVID-19-S1质粒的目的DNA；
S3、培养表达COVID-19-S1蛋白：通过PEI转染法将步骤S2所得pcDNA3.1-myc-HisA-COVID-19-S1质粒的目的DNA转染进293F细胞，转染成功后，置于37℃、8％CO2、120rpm培养箱中培养24h后，补加与培养液等体积的OPM-293CD05新鲜培养基，待细胞生长至4×106个/mL密度时，每天添加1％体积比的OPM-293ProFeed补料培养基，放回37℃、8％CO2、120rpm培养箱中继续培养96h，获得表达COVID-19-S1蛋白的293F细胞培养液；
S4、纯化COVID-19-S1蛋白：将步骤S3所得表达COVID-19-S1蛋白的293F细胞培养液在转速为1500rpm的条件下离心15min，收集上清，用0.45μm的滤膜过滤，选用镍柱进行蛋白纯化；镍柱使用前用50倍柱体积含有100mM Tris pH为7.5的HCl、300mM NaCl、10mMimidazole的平衡缓冲液对柱子进行平衡，再将离心取得的上清液流过柱子，再依次用20倍柱体积含0mM、50mM、150mM、300mM的咪唑浓度的洗脱液进行洗脱，收集不同咪唑浓度的洗脱液，其中150mM咪唑的洗脱液中含有目的蛋白COVID-19-S1蛋白，将纯化的COVID-19-S1蛋白进行透析，即得。
2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒COVID-19-S1蛋白表达和纯化的方法，其特征在于，所述步骤S1中的信号肽为TPA信号肽，编码TPA信号肽序列的核苷酸信息如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的新型冠状病毒COVID-19-S1蛋白表达和纯化的方法，其特征在于，所述步骤S1中引入的Kozak区序列信息如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1所述的新型冠状病毒COVID-19-S1蛋白表达和纯化的方法，其特征在于，步骤S1所述编码COVID-19-S1蛋白为新冠病毒刺突蛋白S1，大小约为120kDa，编码所述新冠病毒刺突蛋白S1的基因序列信息如SEQ ID NO.3所示。
5.根据权利要求1所述一种新型冠状病毒COVID-19-S1蛋白表达和纯化的方法，其特征在于，所述步骤S3中采用PEI转染法转染COVID-19-S1目的DNA的步骤是：将DNA和PEI分别溶解于opti-MEM培养基中，DNA或PEI的体积与培养基的比例为1:20，混匀后，再将PEI溶液缓慢滴加到DNA溶液中，混匀，室温静置30min，再缓慢滴加到293F细胞液中。
6.根据权利要求1所述的新型冠状病毒COVID-19-S1蛋白高效分泌表达和纯化的方法，其特征在于，所述步骤S4中透析袋大小为10kDa，温度为4℃，透析时间为12h，透析缓冲液为20mM PBS，pH为7.4。
7.根据权利要求1所述的新型冠状病毒COVID-19-S1蛋白高效分泌表达和纯化的方法，其特征在于，步骤S1所述选择信号肽的过程为：
1)选择新冠病毒刺突蛋白S1作为蛋白序列，将编码蛋白的基因序列针对293F细胞宿主进行密码子优化，优化后的基因序列如SEQ ID NO.4所述，然后将所述基因序列构建进pcDNA3.1-myc-HisA载体，获得目的基因载体；
2)从已报道的文献中选取能有效分泌表达外源目的基因的信号肽作为待选择信号肽，将待选择信号肽分别与步骤1)所得目的基因载体连接，连接时在待选择信号肽前分别选用引入Kozak区和不引入Kozak区两种连接方式，获得重组蛋白；
3)使用信号肽分析工具分析步骤2)所得重组蛋白的氨基酸序列，选择切割位点分析准确且落在所述蛋白序列前的信号肽，即为适合新冠病毒刺突蛋白表达的信号肽。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的蛋白序列为新冠病毒刺突蛋白S1的16-685位氨基酸序列。
9.根据权利要求7所述的方法，所述信号肽分析方法为Western Blot检测方法。
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| CN111218458A (zh) * | 2020-02-27 | 2020-06-02 | 珠海丽凡达生物技术有限公司 | 编码SARS-CoV-2病毒抗原的mRNA和疫苗及疫苗的制备方法 |
| CN111217917A (zh) * | 2020-02-26 | 2020-06-02 | 康希诺生物股份公司 | 一种新型冠状病毒SARS-CoV-2疫苗及其制备方法 |
| CN111499699A (zh) * | 2020-05-31 | 2020-08-07 | 深圳晶蛋生物医药科技有限公司 | 一种新型冠状病毒covid-19-n蛋白表达和纯化的方法 |
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2021
- 2021-04-02 CN CN202110359951.8A patent/CN112812156B/zh active Active
Patent Citations (3)
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Non-Patent Citations (2)
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Also Published As
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