CN114213509A

CN114213509A - 基于SARS-CoV-2的S蛋白的疫苗及其用途

Info

Publication number: CN114213509A
Application number: CN202210159238.3A
Authority: CN
Inventors: 张必良; 马林
Original assignee: Guangzhou Ribobio Co ltd; Guangzhou National Laboratory
Current assignee: Guangzhou Ribobio Co ltd; Guangzhou National Laboratory
Priority date: 2022-02-22
Filing date: 2022-02-22
Publication date: 2022-03-22
Anticipated expiration: 2042-02-22
Also published as: CN114213509B

Abstract

本公开提供了基于SARS‑CoV‑2的S蛋白的疫苗及其用途，并具体涉及重组SARS‑CoV‑2刺突蛋白(S蛋白)及编码其的mRNA和DNA。本公开还涉及包含编码重组S蛋白的DNA序列的重组质粒。本公开的重组质粒经转录得到mRNA，其包含SEQ ID NO.12所示的序列。本公开进一步涉及包含前述mRNA的mRNA‑载体颗粒例如脂质纳米颗粒(LNP)和组合物例如疫苗组合物。

Description

基于SARS-CoV-2的S蛋白的疫苗及其用途

技术领域

本公开属于疫苗技术领域，更具体地涉及针对SARS-CoV-2，特别是SARS-CoV-2Lambda变异株的疫苗及其应用。

背景技术

SARS-CoV-2的基因组随着在不同宿主群体中的传播而不断发生变异，产生了多种亚型，其中最早在南美秘鲁发现的SARS-CoV-2 Lambda变异株(C.37)是具有高度传染性的SARS-CoV-2亚型。

SARS-CoV-2 Lambda变异株相对于早期报道的SARS-CoV-2，在基因组诸多位置发生了突变，包括在S蛋白、ORF1a、ORF1b、N蛋白中发生了突变。这些突变不仅能导致Lambda变异株传播能力更强，而且导致该病毒亚型对抗体保护作用的抵制力增强，使其对目前的SARS-CoV-2疫苗更具有抵抗力，能够逃避疫苗诱导的免疫反应。因此，迫切需要开发相应的针对性疫苗。

mRNA疫苗作为新一代疫苗，相对于其他类型的疫苗已彰显出独特的优势，它不仅能够通过诱导机体产生体液和细胞免疫来保护机体，而且由于其免疫后能够快速降解，因此安全风险相对较低。此外，mRNA疫苗的研发和生产周期相对于传统疫苗更短，容易实现量产，疫苗的产能较高。因此，急需针对SARS-CoV-2变异株，特别是Lambda变异株的mRNA疫苗。

发明内容

本发明提供了一种针对SARS-CoV-2，特别是针对SARS-CoV-2 Lambda变异株的mRNA疫苗，其递送至小鼠体内后能够在体内表达预融合稳定形式的重组S蛋白，触发机体的细胞免疫和体液免疫反应，从而诱导体内产生特异性抗体。与第1代针对SARS-CoV-2的mRNA疫苗、以及第2代针对SARS-CoV-2 Delta变异株的mRNA疫苗相比，经本发明的疫苗免疫的血清对SARS-CoV-2 Lambda变异株S蛋白的效价更高，而且对SARS-CoV-2 Lambda变异株的中和能力更强，同时对野生型和Delta变异株均有一定的抑制效果。

SARS-CoV-2与SARS-CoV和MERS-CoV同属于冠状病毒科的β-冠状病毒属。SARS-CoV-2基因组序列全长29903bp，与SARS-CoV基因序列同一性为79.5%，与MERS-CoV序列同一性为40%。SARS-CoV-2病毒颗粒的主要结构包括单股正链核酸(ssRNA)、刺突蛋白(spikeprotein，S)、膜蛋白(membrane protein，M)、包膜蛋白(envelop protein，E)和核衣壳蛋白(nucelocapsid protein，N)。与其他β-冠状病毒类似，SARS-CoV-2病毒的对细胞的吸附入侵过程主要依赖于S蛋白；在该过程中，S蛋白以同源三聚体的形式装配，其具有短的胞质尾和疏水跨膜结构域，将蛋白质锚定到膜中。

S蛋白可分为受体结合亚基S1和膜融合亚基S2，S1亚基可进一步分成信号肽区域(signal peptide，SP)、N-端区域(N-terminal domain，NTD)和受体结合域(receptorbinding domain，RBD)。S2亚基通过跨膜区锚定在膜上，它含有膜融合过程所需要的基本元件，包括：内在的膜融合肽(fusion peptide，FP)、两个7肽重复序列(heptad repeat，HR)、跨膜结构域(transmembrane domain，TM)，以及C末端的胞质结构域(cytoplasmic domain，CP)。

S蛋白从N端到C端由信号肽区域(SP)、胞外结构域(ECD)、跨膜结构域(TM)和胞质结构域(CP)组成。其中，胞外结构域可进一步分成N-端区域(NTD)、受体结合域(RBD)、一个内在的膜融合肽(FP)和两个7肽重复序列(HR1和HR2)，属于第一类病毒膜融合蛋白。S蛋白的信号肽区域对应于S蛋白的氨基酸位置1-13的区域；胞外结构域对应于S蛋白的氨基酸位置14-1213的区域；跨膜结构域对应于S蛋白的氨基酸位置1214-1237的区域；胞质结构域对应于S蛋白的氨基酸位置1238-1273的区域。

通过对S蛋白预融合结构进行解析，发现S1亚基的RBD结构域经历铰链类似的构象移动来隐藏或暴露受体结合的关键位点，“向下”为受体不可结合状态，“向上”为受体可结合状态，处于较为不稳定的状态。这种构象使得S蛋白能够容易地与宿主受体血管紧张素转换酶2(ACE2)结合。当RBD与受体结合后，S2亚基通过将FP插入宿主细胞膜而改变为融合后构象，HR1和HR2形成一个反平行的六螺旋束(6HB)，共同组成一个融合核心，最终导致病毒膜与细胞膜融合。使用冷冻电镜实验，在预融合构象中确定了大量的三聚体S糖蛋白结构域，预融合S蛋白上存在大量中和抗体敏感表位，而融合后构象使仅存在于预融合构象上的中和敏感表位的暴露量降至最低。因此，表达预融合稳定形式的SARS-CoV-2 S三聚体蛋白，是开发安全有效的SARS-CoV-2疫苗的关键。优化的疫苗抗原将保留存在于S蛋白的预融合构象形式中的表位，并诱导能够抑制病毒融合的抗体。

如本文所用的术语“SARS-CoV-2 Lambda变异株”、“C.37”、“Lambda型新冠病毒”、“拉姆达型新冠病毒”可互换使用，并且是指2020年8月在秘鲁首次出现的SARS-CoV-2亚型，其相对于SARS-CoV-2，在基因组诸多位置发生了突变。这些突变触发了新冠病毒的免疫逃逸，导致该病毒相对于其他早期的新冠病毒亚型具有对人体适应性更强、传播速度更快、病毒载量更高、治疗所需时间更长、更容易发展成重症等特点。

在一方面，本发明提供了重组SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)，所述重组S蛋白相对于野生型S蛋白在胞外结构域中包括以下突变：NTD区域的G75V、T76I、R246缺失、S247缺失、Y248缺失、L249缺失、T250缺失、P251缺失、G252缺失和D253N突变；RBD区域的L452Q和F490S突变；SD2区域的D614G突变；以及FP和HR1间隔区域的T859N突变。

在一些实施方案中，重组S蛋白的胞外结构域中的S1/S2切割位点RRAR(对应于S蛋白的氨基酸位置682-685)可以经突变以失去被蛋白酶例如弗林样(Furin-like)蛋白酶和溶酶体蛋白酶切割的能力。在一些实施方案中，可以将重组S蛋白中的S1/S2切割位点RRAR突变为GGSG。

在一些实施方案中，重组S蛋白的胞外结构域中的S2切割位点KR(对应于S蛋白的氨基酸位置814-815)可以经突变以失去被蛋白酶例如弗林样蛋白酶和溶酶体蛋白酶切割的能力。在一些实施方案中，可以将重组S蛋白或其抗原性片段中的S2切割位点KR突变为AN。

SARS-CoV-2病毒在细胞内的包装过程中，S蛋白可能会被蛋白酶例如弗林样蛋白酶或溶酶体蛋白切割，分泌出S1亚基和S2亚基呈非融合状态的S蛋白。通过对重组S蛋白中的切割位点例如S1/S2切割位点和/或S2切割位点进行突变，可以避免重组S蛋白被蛋白酶切割，从而进一步提高其稳定性。

在一些实施方案中，重组S蛋白还包括K986P和V987P突变。在重组S蛋白的胞外结构域中引入了2个脯氨酸突变K986P和V987P可以提高预融合构象的稳定性。

在一些实施方案中，重组S蛋白可以不包含跨膜结构域(对应于S蛋白的氨基酸位置1214-1237的区域)和/或胞质结构域(对应于S蛋白的氨基酸位置1238-1273的区域)。在一些实施方案中，重组S蛋白可以不包含胞质结构域。在一些实施方案中，重组S蛋白可以不包含跨膜结构域和胞质结构域。在一些实施方案中，重组S蛋白可以包含信号肽区域。

在一些实施方案中，重组S蛋白从N端到C端由以下组成：i)胞外结构域、任选的跨膜结构域和任选的胞质结构域；和ii) 信号序列、胞外结构域、任选的跨膜结构域和任选的胞质结构域。

在一些实施方案中，所述胞外结构域相对于野生型序列具有以下突变中的一种或多种：

1) G75V、T76I、R246缺失、S247缺失、Y248缺失、L249缺失、T250缺失、P251缺失、G252缺失、D253N、L452Q、F490S、D614G、T859N；

2) S1/S2切割位点RRAR经突变以失去被弗林样蛋白酶和溶酶体蛋白酶切割的能力，优选地，S1/S2切割位点突变为GGSG；

3) S2切割位点KR经突变以失去被弗林样蛋白酶和溶酶体蛋白酶切割的能力，优选地，S2切割位点突变为AN；

4) K986P和/或V987P突变。

在优选的实施方案中，重组S蛋白从N端到C端由信号序列、胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域组成，所述胞外结构域相对于野生型序列具有以下突变：G75V、T76I、R246缺失、S247缺失、Y248缺失、L249缺失、T250缺失、P251缺失、G252缺失、D253N、L452Q、F490S、D614G、T859N。

在另一优选的实施方案中，重组S蛋白从N端到C端由信号序列、胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域组成，所述胞外结构域相对于野生型序列具有以下突变：G75V、T76I、R246缺失、S247缺失、Y248缺失、L249缺失、T250缺失、P251缺失、G252缺失、D253N、L452Q、F490S、D614G、T859N、S1/S2切割位点RRAR突变为GGSG和S2切割位点KR突变为AN。例如，重组S蛋白具有如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。

在另一优选的实施方案中，重组S蛋白从N端到C端由信号序列、胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域组成，所述胞外结构域相对于野生型序列具有以下突变：G75V、T76I、R246缺失、S247缺失、Y248缺失、L249缺失、T250缺失、P251缺失、G252缺失、D253N、L452Q、F490S、D614G、T859N、K986P和V987P。例如，重组S蛋白具有如SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。

在又一优选的实施方案中，重组S蛋白从N端到C端由信号序列、胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域组成，所述胞外结构域相对于野生型序列具有以下突变：G75V、T76I、R246缺失、S247缺失、Y248缺失、L249缺失、T250缺失、P251缺失、G252缺失、D253N、L452Q、F490S、D614G、T859N、K986P、V987P和S1/S2切割位点RRAR突变为GGSG。例如，重组S蛋白具有如SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列。

在另一优选的实施方案中，重组S蛋白从N端到C端由信号序列、胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域组成，所述胞外结构域相对于野生型序列具有以下突变：G75V、T76I、R246缺失、S247缺失、Y248缺失、L249缺失、T250缺失、P251缺失、G252缺失、D253N、L452Q、F490S、D614G、T859N、K986P、V987P和S2切割位点KR突变为AN。例如，重组S蛋白具有如SEQID NO. 4所示的氨基酸序列。

在又一优选的实施方案中，重组S蛋白从N端到C端由信号序列、胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域组成，所述胞外结构域相对于野生型序列具有以下突变：G75V、T76I、R246缺失、S247缺失、Y248缺失、L249缺失、T250缺失、P251缺失、G252缺失、D253N、L452Q、F490S、D614G、T859N、K986P、V987P、S1/S2切割位点RRAR突变为GGSG和S2切割位点KR突变为AN。例如，重组S蛋白具有如SEQ ID NO. 5所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，重组S蛋白具有选自SEQ ID NO. 1-5中任一项所示的氨基酸序列。在优选的实施方案中，重组S蛋白具有选自SEQ ID NO. 3-5中任一项所示的氨基酸序列。在最优选的实施方案中，重组S蛋白具有如SEQ ID NO. 5所示的氨基酸序列。

在另一方面，本发明提供了mRNA，其编码本发明的重组S蛋白。

在一些实施方案中，mRNA从5’到3’方向包含帽结构、5’-UTR、编码本发明的重组S蛋白的开放阅读框(ORF)、3’-UTR和polyA尾。

在一些实施方案中，帽结构可以具有m⁷G5’ppp5’(2’-OMe)NpG，其中m⁷G为N7-甲基鸟嘌呤核苷；p为磷酸；ppp为三磷酸；2’-OMe为2’-甲氧基修饰；N为任意核苷，例如腺嘌呤核苷(A)、鸟嘌呤核苷(G)、胞嘧啶核苷(C)和尿嘧啶核苷(U)，或天然存在的其它核苷或经修饰的核苷。

在一些实施方案中，5’-UTR可以包含选自下组的基因的5’-UTR或其同源物、片段或变体：β-珠蛋白(HBB)基因、热休克蛋白70(Hsp70)基因、轴丝动力蛋白重链2(DNAH2)基因、17β-羟基类固醇脱氢酶4(HSD17B4)基因。例如，变体序列可以与相应基因的野生型5’-UTR序列具有至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少98%，或至少99%的序列同一性。

在一些实施方案中，5’-UTR包含衍生自17β-羟基类固醇脱氢酶4 (HSD17B4)基因的5’-UTR或其同源物、片段或变体。在一些实施方案中，5’-UTR包含KOZAK序列。在一些实施方案中，5’-UTR包含衍生自17β-羟基类固醇脱氢酶4 (HSD17B4)基因的5’-UTR或其同源物、片段或变体，和KOZAK序列。在一些实施方案中，5’-UTR包含如SEQ ID NO. 8和/或SEQ IDNO. 9所示的序列。

在一些实施方案中，3’-UTR可以包含选自下组的基因的3’-UTR或其同源物、片段或变体：白蛋白(ALB)基因、α-珠蛋白基因、β-珠蛋白(HBB)基因、酪氨酸羟化酶基因、热休克蛋白70(Hsp70)基因，脂氧合酶基因和胶原蛋白α基因。例如，变体序列可以与相应基因的野生型3’-UTR序列具有至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少98%，或至少99%的序列同一性。

在一些实施方案中，3’-UTR包含衍生自白蛋白(ALB)基因的3’-UTR或其同源物、片段或变体。优选地，3’-UTR包含如SEQ ID NO. 10所示的序列。

在一些实施方案中，poly A尾的长度可以为100-200个核苷酸，例如约100个核苷酸，约110个核苷酸，约120个核苷酸，约130个核苷酸，约140个核苷酸，约150个核苷酸，约160个核苷酸，约170个核苷酸，约180个核苷酸，约190个核苷酸，或约200个核苷酸。在一些实施方案中，polyA尾的长度可以为100-150个核苷酸。在一些实施方案中，所述poly A尾的长度可以为约120个核苷酸。

在一些实施方案中，本发明的mRNA包含如SEQ ID NO. 12所示的序列，或由SEQ IDNO. 12所示的序列组成。

在一些实施方案中，mRNA中的一个或多个核苷酸可以是经修饰的。例如，mRNA中的一个或多个核苷酸(例如所有核苷酸)可以各自独立替换为天然存在的核苷酸类似物或人工合成的核苷酸类似物。

在一些实施方案中，天然存在的核苷酸类似物选自假尿苷、2-硫尿苷、5-甲基尿苷、5-甲基胞苷和N6-甲基腺苷。在一些实施方案中，人工合成的核苷酸类似物选自N1-甲基假尿苷和5-乙炔基尿苷。

在一些实施方案中，mRNA中的一个或多个尿苷三磷酸可以各自独立替换为假尿苷三磷酸、1-甲基-假尿苷三磷酸或5-乙炔基尿苷三磷酸。在一些实施方案中，mRNA中的一个或多个胞苷三磷酸可以各自独立替换为5-甲基胞苷三磷酸。

在又一方面，本发明提供了DNA，其编码本发明的mRNA。在一些实施方案中，本发明的DNA可以用于在体外通过转录制备本发明的mRNA。

在一些实施方案中，本发明的DNA包含如SEQ ID NO. 11所示的序列，或由SEQ IDNO. 11所示的序列组成。

在又一方面，本发明提供了重组质粒，其包含本发明的DNA。

在一些实施方案中，重组质粒为pT7TS质粒。

在一些实施方案中，重组质粒还包含起始序列(Ori)、T7启动子、5’-UTR和3’-UTR。

在一些实施方案中，起始序列为ColE1型起始序列。优选地，起始序列包含如SEQID NO. 6所示的序列，或由SEQ ID NO. 6所示的序列组成。

在一些实施方案中，T7启动子包含如SEQ ID NO. 7所示的序列，或由SEQ ID NO.7所示的序列组成。

在一些实施方案中，5’-UTR可以包含选自下组的基因的5’-UTR或其同源物、片段或变体：β-珠蛋白(HBB)基因、热休克蛋白70(Hsp70)基因、轴丝动力蛋白重链2(DNAH2)基因、17β-羟基类固醇脱氢酶4 (HSD17B4)基因。例如，变体序列可以与相应基因的野生型5’-UTR序列具有至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少98%，或至少99%的序列同一性。

在一些实施方案中，重组质粒还包含polyA、抗性基因启动子和抗性基因。

在一些实施方案中，抗性基因启动子为氨苄青霉素抗性基因启动子。

在一些实施方案中，抗性基因为硫酸卡那霉素抗性基因。

在优选的实施方案中，重组质粒包含如SEQ ID NO. 13所示的核苷酸序列，或由SEQ ID NO. 13所示的核苷酸序列组成。

在另一方面，本发明提供了mRNA-载体颗粒，其包含本发明的mRNA和包封所述mRNA的载体材料。

在一些实施方案中，载体材料可以选自鱼精蛋白、脂质纳米颗粒(LNP)、高分子材料和无机纳米颗粒。在优选的实施方案中，所述载体材料是LNP。

在一些实施方案中，LNP可以包含离子化脂质、聚乙二醇化脂质、胆固醇及衍生物和磷脂中的一种或多种。例如，LNP可以包含离子化脂质、聚乙二醇化脂质、胆固醇及衍生物和磷脂中的任一种，其中任意两种、任意三种或全部四种的组合。在一些实施方案中，LNP可以包含离子化脂质、聚乙二醇化脂质、胆固醇及衍生物和磷脂中的一种或多种。

在又一方面，本发明提供了组合物，其包含本发明的重组S蛋白、mRNA、重组质粒、或RNA-载体颗粒，以及任选的一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

如本文所用的术语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断的范围内适合用于与人和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激性、变应性应答或其它问题或并发症，与合理的益处/风险比相称的载体、赋形剂或稀释剂。

用于本发明的组合物中的示例性载体包括盐水、缓冲盐水、葡萄糖和水。用于本发明的组合物中的示例性赋形剂包括填充剂、粘合剂、崩解剂、包衣剂、吸附剂、抗粘附剂、助流剂、防腐剂、抗氧化剂、调味剂、着色剂、甜味剂、溶剂、共溶剂、缓冲剂、螯合剂、粘度赋予剂、表面活性剂、稀释剂、润湿剂、载体、稀释剂、防腐剂、乳化剂、稳定剂和张力调节剂。本领域技术人员已知选择合适的赋形剂以制备本发明的组合物。通常，合适的赋形剂的选择尤其取决于所使用的活性剂、待治疗的疾病和组合物的期望剂型。

根据所采用的活性剂(如mRNA)，可将本公开的组合物制备成各种形式，如固态、液态、气态或冻干形式，特别可以是软膏剂、乳膏剂、透皮贴剂、凝胶剂、粉剂、片剂、溶液剂、气雾剂、颗粒剂、丸剂、混悬剂、乳剂、胶囊剂、糖浆剂、液体剂、酏剂、浸膏剂、酊剂或流浸膏提取物的形式，或者是特别适用于所需施用方法的形式。本发明已知的用于生产药物的过程在第22版的Remington’s Pharmaceutical Sciences(Ed.MaackPublishing Co，Easton，Pa.，2012)中显示，并可包括例如常规混合、溶解、制粒、制糖衣、研磨、乳化、包封、包埋或冻干过程。

在一些实施方案中，组合物可以是疫苗组合物，任选地，疫苗组合物还包含一种或多种佐剂。

如本文中使用的，术语“疫苗组合物”指诱导或改进对特定疾病的免疫的生物制剂。用疫苗组合物激发个体的免疫系统诱导免疫细胞的形成和/或增殖，该免疫细胞特异性识别由疫苗包含的化合物。所述免疫细胞的至少一部分保持存活一段时间，其可以延长至疫苗接种后10, 20或30年。如果个体的免疫系统在前述时间段内遇到衍生能引发免疫应答的化合物的病原体，那么通过疫苗接种生成的免疫细胞被再活化，且相比于尚未用疫苗激发和首次遇到病原体的免疫原性化合物的个体的免疫应答，增强针对该病原体的免疫应答。

在本文中，“疫苗接种”、“免疫接种”、“免疫”或“接种”是指向受试者施用疫苗，其目的是防止受试者发展出疾病的一种或多种症状。原则上，疫苗接种包括初次疫苗接种和任选地一次或多次加强疫苗接种。初次疫苗接种或初次免疫定义为施用本文公开的组合物或单位剂量以建立保护性免疫应答的初次施用计划。加强疫苗接种或加强免疫是指在初次疫苗接种之后，例如在初次疫苗接种计划的最后一次施用后至少一周、至少2周、至少一个月、至少6个月、至少1年或甚至5或10年之后进行的施用或施用计划。加强施用试图增强或重建初次疫苗接种的免疫应答。

对本发明的组合物或疫苗组合物的免疫应答是受试者中形成对组合物中存在的抗原蛋白的体液和/或细胞免疫应答。出于本发明的目的，“体液免疫应答”指由抗体分子，包括分泌性(IgA)或IgG分子介导的免疫应答，而“细胞免疫应答”指由T-淋巴细胞和/或其它白细胞介导的免疫应答。细胞免疫的一个重要方面牵涉细胞裂解T细胞(“CTL”)的抗原特异性应答。CTL对由主要组织相容性复合物(MHC)编码并且在细胞表面上表达的蛋白质结合呈递的肽抗原具有特异性。CTL帮助诱导并促进对胞内微生物的破坏，或者此类微生物感染的细胞的裂解。细胞免疫的另一个方面牵涉辅助T细胞的抗原特异性应答。辅助T细胞作用为帮助刺激功能，并且聚焦非特异性效应细胞针对在其表面上展示与MHC分子结合的肽抗原的细胞的活性。细胞免疫应答还涉及生成由活化的T细胞和/或其它白细胞，包括那些自CD4+和CD8+T细胞衍生的细胞生成的细胞因子、趋化因子和其它此类分子。

因此，免疫应答可以是刺激CTL，和/或辅助T细胞生成或活化的应答。也可以刺激趋化因子和/或细胞因子的生成。本发明的组合物或疫苗组合物也可以引发抗体介导的免疫应答。因此，免疫应答可以包括下列一种或多种效应：B细胞的抗体(例如IgA或IgG)生成；和/或抑制物、细胞毒性或辅助T细胞和/或特异性针对疫苗中存在的蛋白的T细胞的活化。这些应答可以用来中和感染性，和/或介导抗体-补体，或抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)以对经免疫个体提供保护。可以使用本领域中公知的标准免疫测定法和中和测定法测定此类应答。

如本文中使用的，术语“佐剂”指在细胞水平或体液水平增加、刺激、活化、加强或调节针对组合物的活性成分的免疫应答的试剂，例如，免疫佐剂刺激免疫系统针对实际抗原的应答但其本身没有免疫效应。这样的佐剂的实例包括但不限于无机佐剂(例如，无机金属盐例如磷酸铝或氢氧化铝)、有机佐剂(例如，皂角苷或鲨烯)、油基佐剂(如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂)、细胞因子(如IL-1β、IL-2、IL-7、IL-12、IL-18、GM-CFS和INF-γ)、颗粒状佐剂(例如，免疫刺激性复合物(ISCOMS)、脂质体或可生物降解的微球)、病毒颗粒、细菌佐剂(例如单磷酰脂质A或胞壁肽)、合成佐剂(例如，非离子型嵌段共聚物、胞壁肽类似物或合成脂质A)或合成多核苷酸佐剂(例如，多聚精氨酸或多聚赖氨酸)。优选地，佐剂选自铝佐剂（例如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝、明矾）、MF59、AS03、病毒体(例如肝炎病毒病毒体和流感病毒病毒体)、AS04、热可逆水包油乳液、ISA51、弗氏佐剂、IL-12、CpG基序、甘露糖或其任意组合。

在一些实施方案中，所述组合物或疫苗组合物还包含一种或多种另外的治疗剂。例如，所述治疗剂可以选自另外的抗原性蛋白或多肽、抗体、激素或激素类似物，和小分子药物。

在另一方面，本发明提供了预防和/或治疗受试者中与SARS-CoV-2感染相关的疾病或病症的方法，其包括向受试者施用有效量的本发明的重组S蛋白、mRNA、重组质粒、mRNA-载体颗粒、或组合物。

如本文所用的术语“预防”或“治疗”是指疾病或病症的获得或发展的风险的降低，即，使疾病的临床症状的至少一种在疾病发作之前易受疾病感染、或未暴露于致病原的受试者中不发展。例如，治疗可以包括：(i)在可能易患疾病、障碍和/或病症但尚未诊断患有所述疾病、障碍和/或病症的患者中预防所述疾病、障碍和/或病症；(ii)抑制所述疾病、障碍和/或病症，即阻止其发展；或(iii)减轻所述疾病、障碍和/或病症，即引起所述疾病、障碍和/或病症的消退。

如本文所用的术语“有效量”意指当施用到受试者用于治疗或预防疾病时足以实现这样的治疗或预防的化合物的量。“有效量”可取决于化合物、疾病及其严重度、以及待治疗的受试者的年龄、体重等改变。“治疗有效量”是指用于治疗性治疗的有效量。“预防有效量”是指用于预防性治疗的有效量。

如本文所用的术语“施用”是指使用本领域技术人员已知的任何各种方法和递送系统将药剂物理导入受试者。示例性施用途径包括静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、脊柱或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输液。

如本文中使用的，术语“受试者”、“个体”、和“患者”是本领域中公知的，并且在本文中可互换使用，指需要治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。实例包括但不限于人和其它灵长类，包括非人灵长类，诸如黑猩猩及其它猿和猴物种。术语个体、受试者和患者本身不表示特定年龄、性别、人种等。

在本发明的方法的实施方案中，所述疾病或病症为SARS-CoV-2 Lambda变异株感染引起的疾病或病症。

在又一方面，本发明提供了本发明的重组S蛋白、mRNA、重组质粒、mRNA-载体颗粒、或组合物在制备用于在受试者中预防和/或治疗与SARS-CoV-2感染相关的疾病或病症的药物中的用途。

在另一方面，本发明提供了本发明的重组S蛋白、mRNA、重组质粒、mRNA-载体颗粒、或组合物，其用于预防和/或治疗受试者中与SARS-CoV-2感染相关的疾病或病症。

在本发明的用途的实施方案中，所述疾病或病症为SARS-CoV-2 Lambda变异株感染引起的疾病或病症。

附图说明

图1为RBMRNA-Lambda质粒的结构示意图。

图2为RBMRNA-Lambda质粒转录得到的RBMRNA-Lambda mRNA的电泳结果图。

图3为检测由RBMRNA-Lambda mRNA表达的重组S蛋白的蛋白免疫印迹结果图。

图4为通过ELISPOT法检测的RBMRNA-Lambda疫苗在小鼠体内诱导T淋巴细胞分泌细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-5的结果图。*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001，****：P<0.0001。

图5为通过流式细胞术检测的RBMRNA-Lambda疫苗在小鼠体内诱导细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-5分泌的结果图。*：P<0.05，**：P<0.01。

图6为通过流式细胞术检测的RBMRNA-Lambda疫苗在小鼠体内诱导免疫应答的T细胞亚群结果图。*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001，****：P<0.0001。

图7为接种RBMRNA-Lambda疫苗后小鼠血清中IgG抗体水平的结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通过按照本领域的常规条件，例如，Sambrook和Russeii等人，分子克隆：实验室手册（第三版）（2001），CSHL出版社中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另有说明，否则以下实施例中所用的实验材料和试剂均可商购获得。

实施例1. mRNA的制备

在野生型SARS-CoV-2的S蛋白的基础上经过以下突变得到重组S蛋白（SEQ ID NO.5）：G75V、T76I、R246缺失、S247缺失、Y248缺失、L249缺失、T250缺失、P251缺失、G252缺失、D253N、L452Q、F490S、D614G、T859N；682-685位（S1/S2切割位点）RRAR突变为GGSG；814-815位（S2切割位点）KR突变为AN；986-987位的KV序列突变为两个脯氨酸PP。

以该重组S蛋白的序列为基础，设计DNA编码序列（SEQ ID NO. 11）。在DNA编码序列的基础上增加例如5’-UTR、3’-UTR、polyA序列后，通过同源重组插入至pT7TS质粒中进行构建，形成重组载体pT7TS-2.0，获得最终的重组质粒（命名为RBMRNA-Lambda质粒，其核苷酸序列为SEQ ID NO. 13）。

RBMRNA-Lambda质粒包含的元件包括起始序列（SEQ ID NO. 6），T7启动子序列(SEQ ID NO. 7)，5’-UTR序列(SEQ ID NO. 8)，3’-UTR序列(SEQ ID NO. 10)，3’端聚腺苷酸(polyA)序列，氨苄青霉素抗性基因启动子，硫酸卡那霉素抗性基因。通过这些非编码结构来调节RBMRNA-Lambda质粒经转录得到的mRNA的稳定性、翻译效率和免疫原性。

对RBMRNA-Lambda质粒的编码区及polyA区域进行测序，插入目的基因测序与参考序列完全一致，构建成功的整个质粒结构如图1所示。RBMRNA-Lambda质粒（SEQ ID NO. 13）经体外转录后得到mRNA（命名为RBMRNA-Lambda mRNA）（SEQ ID NO. 12），mRNA经翻译得到蛋白质（命名为RBMRNA-Lambda蛋白质）（SEQ ID NO. 5）。

由重组质粒RBMRNA-Lambda质粒转录得到的mRNA大小及完整性用Agilent 2200Tapestation电泳系统进行分析，结果显示转录的mRNA条带单一，无降解（图2）。

实施例2. mRNA的表达验证

参照Lipofectamine MessagerMAX (ThermoFisher Scientific)说明书，用实施例1得到的2.5μg的RBMRNA-Lambda mRNA （SEQ ID NO. 12）转染293T细胞，未转染mRNA的细胞作为阴性对照。转染24小时后，通过蛋白免疫印迹检测预融合拉姆达型SARS-CoV-2 S蛋白的表达，其中用兔抗SARS-CoV-2 S蛋白抗体（GeneTex，GTX632604）进行免疫印迹，使用羊抗兔-HRP二抗进行标记。结果如图3所示，成功在180 kDa处检测到大小与预期一致的预融合拉姆达型SARS-CoV-2 S蛋白的表达。

实施例3. mRNA疫苗诱导的Th1或Th2免疫应答

使用包括以下组分的脂质纳米颗粒包封实施例1得到的RBMRNA-Lambda mRNA（SEQID NO. 12）以制备mRNA疫苗：8-(3-羟基丙基)（9,12-二烯基-十八烷基-1）-胺基-辛酸十七烷-9-醇酯、二硬脂酰基磷脂酰胆碱（DSPC）、1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000（DMG-PEG2000）和胆固醇。制备方法包括将上述组分溶解在乙醇溶液中，通过微流控混合器将所述脂质乙醇溶液与mRNA水溶液混合得到脂质纳米颗粒，以及对混合物进行透析、超滤和微米膜过滤从而获得RBMRNA-Lambda疫苗。具体的疫苗制备方法参见例如中国专利申请号202011369776.2，其通过引用整体并入本文。

将RBMRNA-Lambda疫苗用于BALB/c小鼠免疫试验，免疫小鼠采用SPF级别健康的BALB/c小鼠(6-8周龄，雌性)。实验根据小鼠体重均衡随机分为溶剂对照（PBS）组，RBMRNA-Lambda疫苗低剂量组（1μg/只）、RBMRNA-Lambda疫苗中剂量组（5μg/只）、RBMRNA-Lambda疫苗高剂量组（20μg/只），每组12只。分组后分别于第0天和第14天，按照设定剂量通过肌肉注射向小鼠接种2次疫苗以进行初次免疫和加强免疫，溶剂对照组给予等体积的PBS。

在加强免疫后7天，以SARS-CoV-2 S蛋白作为刺激物，刺激分离的小鼠脾脏淋巴细胞，通过Elispot法检测分泌IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5细胞因子的T淋巴细胞数。如图4所示，与溶剂对照（PBS）组相比，低、中、高剂量RBMRNA-Lambda疫苗均可使分泌Th1型细胞因子IFN-γ和IL-2的T淋巴细胞数显著升高，而分泌Th2型细胞因子IL-4和IL-5的T淋巴细胞数无明显变化。

在加强免疫后9天，使用抗IFN-γ抗体(Biolegend，货号505808)、抗IL-2抗体(Biolegend，货号503808)、抗IL-4抗体(Biolegend，货号504104)和抗IL-5抗体(Biolegend，货号504304)，通过流式细胞术分别检测细胞内因子IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-5的水平，以进一步评估RBMRNA-Lambda疫苗诱导的Th1或Th2免疫反应。如图5所示, RBMRNA-Lambda疫苗导致CD4+T细胞内Th1型细胞因子IFN-γ和IL-2的水平呈剂量依赖性增加，而CD8+T细胞内细胞因子的水平无明显变化。

这些结果表明，RBMRNA-Lambda疫苗诱导的免疫反应为Th1型偏倚的免疫反应。

实施例4. T细胞亚群检测

参照实施例3的方法用RBMRNA-Lambda疫苗免疫小鼠，每组3只小鼠，取分离的小鼠脾脏淋巴细胞进行免疫实验。在加强免疫9天后，通过流式细胞术检测T细胞亚群，以评价RBMRNA-Lambda疫苗诱导的T淋巴细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、效应记忆T（Tem）细胞的免疫应答水平。

如图6所示，与溶剂对照（PBS）组比较，RBMRNA-Lambda疫苗可诱导机体产生CD4+ T细胞和CD8+ T细胞介导的细胞免疫应答，并且能产生特异性效应记忆T细胞，使机体获得免疫记忆保护。

实施例5. mRNA疫苗诱导产生的IgG抗体效价的评估

参照实施例3的方法用RBMRNA-Lambda疫苗免疫小鼠，每组6只小鼠，取6只小鼠的混合血清进行实验。在加强免疫后14天，通过间接ELISA检测小鼠血清中特异性IgG抗体的效价。

如图7所示，低、中、高剂量RBMRNA-Lambda疫苗均能够针对野生型、拉姆达型、德尔塔型SARS-CoV-2在小鼠体内诱导产生高滴度的IgG抗体。

实施例6. mRNA疫苗诱导产生的中和抗体的评估

参考实施例3方法制备RBMRNA-Delta疫苗，其mRNA序列如SEQ ID NO: 14所示，RBMRNA-Delta mRNA的制备参见例如中国专利申请号202210019169.6，其通过引用整体并入本文。参照实施例3的方法用RBMRNA-Lambda疫苗和RBMRNA-Delta疫苗免疫小鼠，每组6只小鼠，取6只小鼠的混合血清进行实验。疫苗组均采用高剂量（20μg/只）。在加强免疫后14天采集小鼠血清，对不同疫苗进行不同变异类型假病毒中和试验，以评估不同疫苗对不同假病毒的中和抑制率和中和效价。具体操作如下：

将血清水浴灭活后离心，收集上清液。用不含血清的DMEM培养基对灭活的血清进行稀释。向96孔板中加入稀释的血清和假病毒，在37℃下共孵育1小时。孵育结束后，向96孔板中加入293T-ACE2-p2A-mTagBFP2细胞。在37℃、5%CO₂下培养48小时。培养结束后，洗掉培养基，然后加入PBS和萤火虫萤光素酶底物，避光震荡后通过多功能酶标仪检测Luciferase化学发光值。具体操作参见例如中国专利申请号202210019169.6，其通过引用整体并入本文。

中和抑制率通过下式计算：

抑制率＝[1－(样品组的发光强度均值－空白对照发光强度均值)/(病毒对照组的发光强度均值－空白对照发光强度均值)]×100％。

中和效价通过Reed-muench法来计算。

RBMRNA-Lambda疫苗和RBMRNA-Delta疫苗诱导产生的抗体的中和效果分别如表1和表2所示。

表1. RBMRNA-Lambda疫苗和RBMRNA-Delta疫苗对不同假病毒的抑制率（%）

表2. RBMRNA-Lambda疫苗和RBMRNA-Delta疫苗对不同假病毒的中和效价

从表1和表2可以看出，RBMRNA-Lambda疫苗对野生型、Lambda型和Delta型假病毒均起到抑制效果；其中对于野生型和Lambda型假病毒的抑制效果更强。

综上，本发明的优异效果为：RBMRNA-Lambda疫苗递送至小鼠体内后能够在体内表达预融合稳定形式的Lambda型SARS-CoV-2 S蛋白，触发机体的细胞免疫和体液免疫反应，从而诱导体内产生特异性抗体。经本发明的RBMRNA-Lambda疫苗免疫的血清能够对多种SARS-CoV-2变异株起到抑制效果，其中对抗野生型、Lambda型SARS-CoV-2的中和能力更强。

本申请参考了各种发行的专利、公开的专利申请、期刊文章和其他出版物，将所有这些引入本申请作为参考。若任何引入的参考文献和本说明书有冲突，则以本说明书为准。此外，落入现有技术范围的本发明的任何具体实施方案可以明确地从任何一个或多个权利要求中排除。因为所述实施方案被认为是本领域技术人员已知的，它们可以被排除，即使所述排除没有在本申请中明确列出。本发明的任何具体实施方案可从任何权利要求中以任何理由排除，不管是否与现有技术的存在有关。

虽然已经参考其特定实施方案描述本发明，本领域的技术人员应当理解可以进行各种改变且可以替换等同物而不脱离本发明的真正的精神和范围。另外，可作出许多修改以使特定的情况，材料，组合物，方法，方法步骤适于本发明的目的，精神和范围。所有这些修改都旨在权利要求的范围内。

序列表

<110> 广州市锐博生物科技有限公司

广州国家实验室

<120> 基于SARS-CoV-2的S蛋白的疫苗及其用途

<130> C22P1395

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1266

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重组S蛋白的氨基酸序列

<400> 1

Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val

1 5 10 15

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20 25 30

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50 55 60

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Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu

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210 215 220

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225 230 235 240

Leu Leu Ala Leu His Asn Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala

245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly

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<210> 2

<211> 1266

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重组S蛋白的氨基酸序列

<400> 2

Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val

1 5 10 15

Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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145 150 155 160

Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu

165 170 175

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180 185 190

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565 570 575

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580 585 590

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595 600 605

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Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val

930 935 940

Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser

945 950 955 960

Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg

965 970 975

Leu Asp Pro Pro Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly

980 985 990

Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala

995 1000 1005

Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser

1010 1015 1020

Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys

1025 1030 1035

Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala Pro His Gly Val

1040 1045 1050

Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe

1055 1060 1065

Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His Phe Pro

1070 1075 1080

Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val Thr

1085 1090 1095

Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr

1100 1105 1110

Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn

1115 1120 1125

Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu

1130 1135 1140

Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp

1145 1150 1155

Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln

1160 1165 1170

Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu

1175 1180 1185

Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile

1190 1195 1200

Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile

1205 1210 1215

Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys

1220 1225 1230

Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys

1235 1240 1245

Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val Leu Lys Gly Val Lys Leu

1250 1255 1260

His Tyr Thr

1265

<210> 6

<211> 802

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 质粒复制起始序列

<400> 6

agtactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg 60

tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact 120

gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg 180

taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc 240

aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata 300

ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta 360

catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc 420

ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg 480

ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac 540

agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg 600

taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt 660

atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct 720

cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggtccctgg 780

ccttttgctg gccttttgct ca 802

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> T7启动子

<400> 7

taatacgact cactataatg 20

<210> 8

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 5'-UTR

<400> 8

gtcccgcagt cggcgtccag cggctctgct tgttcgtgtg tgtgtcgttg caggccttat 60

tc 62

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> kozak序列

<400> 9

agatctaccg gtggtaccgc cacc 24

<210> 10

<211> 89

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 3'-UTR

<400> 10

agccaacacc ctgtctaaaa aacataaatt tctttaatca ttttgcctct tttctctgtg 60

cttcaattaa taaaaaatgg aaagaacct 89

<210> 11

<211> 3801

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RBMRNA-Lambda疫苗的核酸序列

<400> 11

atgttcgtgt tcctggtgct gctgcctctg gtgagcagcc agtgcgtgaa tctgaccacc 60

agaacccagc tgcctcctgc ctacaccaat agcttcacca gaggagttta ttatcccgat 120

aaggtgttca gaagtagtgt attacatagt acccaggacc tgttcctacc tttcttcagt 180

aacgtgacct ggttccacgc catccacgtg agcggcacca atgtcatcaa gagattcgac 240

aatcctgtgc tgcctttcaa tgacggcgtg tacttcgcca gcaccgagaa gagcaatatc 300

atcagaggct ggatcttcgg caccaccttg gattccaaga ctcagagcct gctgattgta 360

aacaacgcta caaatgtggt gatcaaggtg tgcgagttcc agttctgcaa tgaccctttc 420

ctgggtgttt attatcataa gaacaacaag agctggatgg agagcgagtt ccgcgtatat 480

tcgtcggcta ataattgcac cttcgagtac gtgagccagc ctttcctgat ggacctggag 540

ggcaagcagg gcaatttcaa gaatctgaga gagttcgtgt tcaagaatat cgacggctac 600

ttcaagatct acagcaagca cacacccatt aatctggtga gagacctgcc tcagggcttc 660

agcgccctgg agcctctggt ggacctgcct atcggcatca atatcaccag attccagacc 720

ctgctggccc tgcacaactc gtcaagcggt tggaccgctg gagctgcggc atattacgtg 780

ggctacctgc agcctagaac cttcctgctg aagtacaatg agaatggtac gataaccgac 840

gcagttgatt gtgccctgga ccctctgagc gagaccaagt gcaccctgaa gagcttcacc 900

gtggagaagg gcatctacca gaccagcaat ttcagagtgc agcctaccga gagcatcgtg 960

agattcccta atatcaccaa tctgtgccct ttcggcgagg tgttcaatgc caccagattc 1020

gccagcgtgt acgcatggaa ccgcaagcgg ataagcaatt gcgtggccga ctacagcgtg 1080

ctgtacaata gcgccagctt cagcaccttc aaatgttatg gtgtttcgcc aacaaagctg 1140

aatgacctgt gcttcaccaa tgtgtacgcc gacagcttcg tgatcagagg cgacgaggtg 1200

agacagatcg cgccagggca gaccggcaag atcgccgact acaattacaa gctgcctgac 1260

gacttcaccg gctgcgtgat cgcgtggaac tctaacaacc tggactcgaa agttggaggc 1320

aattacaatt accagtacag actgttcaga aagagcaatc tgaagccttt cgagagagac 1380

atcagcaccg agatctacca ggccggcagc acaccgtgta atggcgtgga gggcttcaat 1440

tgctactccc ctctgcagag ctacggcttc cagcctacca atggcgtggg ctaccagcct 1500

tacagagtgg tggtgctgag cttcgagctg ctgcacgctc ccgctaccgt gtgcggccct 1560

aagaagagca ccaatctggt gaagaataag tgcgtgaatt tcaatttcaa tggtctaact 1620

ggaacgggcg tgctgaccga gagcaataag aagtttcttc cctttcaaca attcggcaga 1680

gacatcgccg acaccacaga tgctgtaaga gaccctcaga ccctggagat cctggacatc 1740

actccgtgta gcttcggcgg cgtgagcgtg atcacaccgg gcaccaatac cagcaatcag 1800

gtggccgtgc tgtaccaggg cgtgaattgc accgaggtgc ctgtggccat ccacgccgac 1860

cagctgactc ccacttggag ggtatattcc acgggaagca atgtgttcca gaccagagcc 1920

ggctgcctga tcggcgccga gcacgtgaat aatagctacg agtgcgacat ccctatcggc 1980

gccggcatct gcgccagcta ccagacccag accaatagcc ctggcggcag cggcagcgtg 2040

gccagccaga gcatcatcgc ctacaccatg agcctgggcg ccgagaatag cgtggcctac 2100

agcaataata gcatcgccat ccctaccaat ttcaccatca gcgtgaccac cgaaatatta 2160

ccagtctcca tgaccaagac cagcgtggac tgcaccatgt acatctgcgg cgacagcacc 2220

gagtgcagca atctgctgct gcagtacggc agcttctgca cccagctgaa tagagccctg 2280

accggcatcg ccgtggagca ggacaagaat acccaggagg tgttcgccca ggtgaagcag 2340

atctacaaga ctccgccgat caaggacttc ggcggcttca atttcagcca aatactccca 2400

gatccaagca agcctagcgc caacagcttc atcgaggacc tgctgttcaa taaggtgacc 2460

ctggccgacg ccggcttcat caagcagtac ggcgactgcc taggtgatat tgcggcaaga 2520

gacctgatct gcgcccagaa gtttaacggt ttgaacgtac tacctcctct gctgaccgac 2580

gagatgatag cacaatatac gtcggcattg ctcgctggca cgatcacatc gggctggact 2640

ttcggcgccg gagcagcgtt gcaaatccct ttcgccatgc agatggccta cagattcaat 2700

ggcatcggcg tgacccagaa tgtgctgtac gagaatcaga agctgatcgc caatcagttc 2760

aatagcgcca tcggcaagat ccaggacagc ctgagcagca ccgccagcgc cctgggcaag 2820

ctgcaggacg tggtgaatca gaatgcccag gccctgaata ccctggtgaa gcagctgagc 2880

agcaatttcg gcgccatcag tagtgtactc aacgacatcc tgagcagact ggacccacca 2940

gaggccgagg tgcaaattga tcgtcttatt actggcagac tgcagagcct gcagacctac 3000

gtgacccagc agctgatcag agccgccgag atcagagcca gcgccaatct ggccgccacc 3060

aagatgagcg agtgcgtgct gggccagagc aagagagtgg acttctgcgg caagggctac 3120

cacctgatga gcttccctca gagcgctcca catggcgtgg tgttcctgca cgtgacctac 3180

gtgcctgccc aggagaagaa tttcaccacc gcacccgcaa tctgccacga cggcaaggcc 3240

cacttcccta gagagggcgt gttcgtgagc aatggcaccc actggttcgt gacccagaga 3300

aatttctacg agcctcagat catcaccacc gacaatacct tcgtgagcgg caattgcgac 3360

gtggtgatcg ggatagtcaa taatactgtc tacgaccctc tgcagcctga gctggacagc 3420

ttcaaggagg agctggacaa gtacttcaag aatcacacca gccctgacgt ggacctcggt 3480

gatatttcgg gaatcaatgc cagcgtggtg aatatccaga aggaaattga tcggctcaac 3540

gaagtggcca agaatctgaa tgagagcctg atcgacctgc aggagctggg caagtacgag 3600

cagtacatca agtggccttg gtacatctgg ctgggcttca tcgccggcct gatcgccatc 3660

gtgatggtga ccatcatgct gtgctgcatg acctcctgtt gttcctgttt gaaagggtgt 3720

tgttcgtgtg ggtcctgctg caagttcgac gaggacgaca gcgagcctgt gctgaagggc 3780

gtgaagctgc actacaccta a 3801

<210> 12

<211> 4115

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RBMRNA-Lambda疫苗的mRNA序列

<400> 12

augagacaag cuugucccgc agucggcguc cagcggcucu gcuuguucgu gugugugucg 60

uugcaggccu uauucagauc uaccgguggu accgccacca uguucguguu ccuggugcug 120

cugccucugg ugagcagcca gugcgugaau cugaccacca gaacccagcu gccuccugcc 180

uacaccaaua gcuucaccag aggaguuuau uaucccgaua agguguucag aaguagugua 240

uuacauagua cccaggaccu guuccuaccu uucuucagua acgugaccug guuccacgcc 300

auccacguga gcggcaccaa ugucaucaag agauucgaca auccugugcu gccuuucaau 360

gacggcgugu acuucgccag caccgagaag agcaauauca ucagaggcug gaucuucggc 420

accaccuugg auuccaagac ucagagccug cugauuguaa acaacgcuac aaauguggug 480

aucaaggugu gcgaguucca guucugcaau gacccuuucc uggguguuua uuaucauaag 540

aacaacaaga gcuggaugga gagcgaguuc cgcguauauu cgucggcuaa uaauugcacc 600

uucgaguacg ugagccagcc uuuccugaug gaccuggagg gcaagcaggg caauuucaag 660

aaucugagag aguucguguu caagaauauc gacggcuacu ucaagaucua cagcaagcac 720

acacccauua aucuggugag agaccugccu cagggcuuca gcgcccugga gccucuggug 780

gaccugccua ucggcaucaa uaucaccaga uuccagaccc ugcuggcccu gcacaacucg 840

ucaagcgguu ggaccgcugg agcugcggca uauuacgugg gcuaccugca gccuagaacc 900

uuccugcuga aguacaauga gaaugguacg auaaccgacg caguugauug ugcccuggac 960

ccucugagcg agaccaagug cacccugaag agcuucaccg uggagaaggg caucuaccag 1020

accagcaauu ucagagugca gccuaccgag agcaucguga gauucccuaa uaucaccaau 1080

cugugcccuu ucggcgaggu guucaaugcc accagauucg ccagcgugua cgcauggaac 1140

cgcaagcgga uaagcaauug cguggccgac uacagcgugc uguacaauag cgccagcuuc 1200

agcaccuuca aauguuaugg uguuucgcca acaaagcuga augaccugug cuucaccaau 1260

guguacgccg acagcuucgu gaucagaggc gacgagguga gacagaucgc gccagggcag 1320

accggcaaga ucgccgacua caauuacaag cugccugacg acuucaccgg cugcgugauc 1380

gcguggaacu cuaacaaccu ggacucgaaa guuggaggca auuacaauua ccaguacaga 1440

cuguucagaa agagcaaucu gaagccuuuc gagagagaca ucagcaccga gaucuaccag 1500

gccggcagca caccguguaa uggcguggag ggcuucaauu gcuacucccc ucugcagagc 1560

uacggcuucc agccuaccaa uggcgugggc uaccagccuu acagaguggu ggugcugagc 1620

uucgagcugc ugcacgcucc cgcuaccgug ugcggcccua agaagagcac caaucuggug 1680

aagaauaagu gcgugaauuu caauuucaau ggucuaacug gaacgggcgu gcugaccgag 1740

agcaauaaga aguuucuucc cuuucaacaa uucggcagag acaucgccga caccacagau 1800

gcuguaagag acccucagac ccuggagauc cuggacauca cuccguguag cuucggcggc 1860

gugagcguga ucacaccggg caccaauacc agcaaucagg uggccgugcu guaccagggc 1920

gugaauugca ccgaggugcc uguggccauc cacgccgacc agcugacucc cacuuggagg 1980

guauauucca cgggaagcaa uguguuccag accagagccg gcugccugau cggcgccgag 2040

cacgugaaua auagcuacga gugcgacauc ccuaucggcg ccggcaucug cgccagcuac 2100

cagacccaga ccaauagccc uggcggcagc ggcagcgugg ccagccagag caucaucgcc 2160

uacaccauga gccugggcgc cgagaauagc guggccuaca gcaauaauag caucgccauc 2220

ccuaccaauu ucaccaucag cgugaccacc gaaauauuac cagucuccau gaccaagacc 2280

agcguggacu gcaccaugua caucugcggc gacagcaccg agugcagcaa ucugcugcug 2340

caguacggca gcuucugcac ccagcugaau agagcccuga ccggcaucgc cguggagcag 2400

gacaagaaua cccaggaggu guucgcccag gugaagcaga ucuacaagac uccgccgauc 2460

aaggacuucg gcggcuucaa uuucagccaa auacucccag auccaagcaa gccuagcgcc 2520

aacagcuuca ucgaggaccu gcuguucaau aaggugaccc uggccgacgc cggcuucauc 2580

aagcaguacg gcgacugccu aggugauauu gcggcaagag accugaucug cgcccagaag 2640

uuuaacgguu ugaacguacu accuccucug cugaccgacg agaugauagc acaauauacg 2700

ucggcauugc ucgcuggcac gaucacaucg ggcuggacuu ucggcgccgg agcagcguug 2760

caaaucccuu ucgccaugca gauggccuac agauucaaug gcaucggcgu gacccagaau 2820

gugcuguacg agaaucagaa gcugaucgcc aaucaguuca auagcgccau cggcaagauc 2880

caggacagcc ugagcagcac cgccagcgcc cugggcaagc ugcaggacgu ggugaaucag 2940

aaugcccagg cccugaauac ccuggugaag cagcugagca gcaauuucgg cgccaucagu 3000

aguguacuca acgacauccu gagcagacug gacccaccag aggccgaggu gcaaauugau 3060

cgucuuauua cuggcagacu gcagagccug cagaccuacg ugacccagca gcugaucaga 3120

gccgccgaga ucagagccag cgccaaucug gccgccacca agaugagcga gugcgugcug 3180

ggccagagca agagagugga cuucugcggc aagggcuacc accugaugag cuucccucag 3240

agcgcuccac auggcguggu guuccugcac gugaccuacg ugccugccca ggagaagaau 3300

uucaccaccg cacccgcaau cugccacgac ggcaaggccc acuucccuag agagggcgug 3360

uucgugagca auggcaccca cugguucgug acccagagaa auuucuacga gccucagauc 3420

aucaccaccg acaauaccuu cgugagcggc aauugcgacg uggugaucgg gauagucaau 3480

aauacugucu acgacccucu gcagccugag cuggacagcu ucaaggagga gcuggacaag 3540

uacuucaaga aucacaccag cccugacgug gaccucggug auauuucggg aaucaaugcc 3600

agcgugguga auauccagaa ggaaauugau cggcucaacg aaguggccaa gaaucugaau 3660

gagagccuga ucgaccugca ggagcugggc aaguacgagc aguacaucaa guggccuugg 3720

uacaucuggc ugggcuucau cgccggccug aucgccaucg ugauggugac caucaugcug 3780

ugcugcauga ccuccuguug uuccuguuug aaaggguguu guucgugugg guccugcugc 3840

aaguucgacg aggacgacag cgagccugug cugaagggcg ugaagcugca cuacaccuaa 3900

cucgagacua guagccaaca cccugucuaa aaaacauaaa uuucuuuaau cauuuugccu 3960

cuuuucucug ugcuucaauu aauaaaaaau ggaaagaacc uaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4020

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4080

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 4115

<210> 13

<211> 6788

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RBMRNA-Lambda疫苗的质粒模板DNA序列

<400> 13

tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca 60

cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag 120

agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc 180

gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga 240

aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca 300

tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag 360

ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg 420

aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct 480

ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt aatgtgagtt 540

agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt atgttgtgtg 600

gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat tacgccaagc 660

tctaatacga ctcactataa tgagacaagc ttgtcccgca gtcggcgtcc agcggctctg 720

cttgttcgtg tgtgtgtcgt tgcaggcctt attcagatct accggtggta ccgccaccat 780

gttcgtgttc ctggtgctgc tgcctctggt gagcagccag tgcgtgaatc tgaccaccag 840

aacccagctg cctcctgcct acaccaatag cttcaccaga ggagtttatt atcccgataa 900

ggtgttcaga agtagtgtat tacatagtac ccaggacctg ttcctacctt tcttcagtaa 960

cgtgacctgg ttccacgcca tccacgtgag cggcaccaat gtcatcaaga gattcgacaa 1020

tcctgtgctg cctttcaatg acggcgtgta cttcgccagc accgagaaga gcaatatcat 1080

cagaggctgg atcttcggca ccaccttgga ttccaagact cagagcctgc tgattgtaaa 1140

caacgctaca aatgtggtga tcaaggtgtg cgagttccag ttctgcaatg accctttcct 1200

gggtgtttat tatcataaga acaacaagag ctggatggag agcgagttcc gcgtatattc 1260

gtcggctaat aattgcacct tcgagtacgt gagccagcct ttcctgatgg acctggaggg 1320

caagcagggc aatttcaaga atctgagaga gttcgtgttc aagaatatcg acggctactt 1380

caagatctac agcaagcaca cacccattaa tctggtgaga gacctgcctc agggcttcag 1440

cgccctggag cctctggtgg acctgcctat cggcatcaat atcaccagat tccagaccct 1500

gctggccctg cacaactcgt caagcggttg gaccgctgga gctgcggcat attacgtggg 1560

ctacctgcag cctagaacct tcctgctgaa gtacaatgag aatggtacga taaccgacgc 1620

agttgattgt gccctggacc ctctgagcga gaccaagtgc accctgaaga gcttcaccgt 1680

ggagaagggc atctaccaga ccagcaattt cagagtgcag cctaccgaga gcatcgtgag 1740

attccctaat atcaccaatc tgtgcccttt cggcgaggtg ttcaatgcca ccagattcgc 1800

cagcgtgtac gcatggaacc gcaagcggat aagcaattgc gtggccgact acagcgtgct 1860

gtacaatagc gccagcttca gcaccttcaa atgttatggt gtttcgccaa caaagctgaa 1920

tgacctgtgc ttcaccaatg tgtacgccga cagcttcgtg atcagaggcg acgaggtgag 1980

acagatcgcg ccagggcaga ccggcaagat cgccgactac aattacaagc tgcctgacga 2040

cttcaccggc tgcgtgatcg cgtggaactc taacaacctg gactcgaaag ttggaggcaa 2100

ttacaattac cagtacagac tgttcagaaa gagcaatctg aagcctttcg agagagacat 2160

cagcaccgag atctaccagg ccggcagcac accgtgtaat ggcgtggagg gcttcaattg 2220

ctactcccct ctgcagagct acggcttcca gcctaccaat ggcgtgggct accagcctta 2280

cagagtggtg gtgctgagct tcgagctgct gcacgctccc gctaccgtgt gcggccctaa 2340

gaagagcacc aatctggtga agaataagtg cgtgaatttc aatttcaatg gtctaactgg 2400

aacgggcgtg ctgaccgaga gcaataagaa gtttcttccc tttcaacaat tcggcagaga 2460

catcgccgac accacagatg ctgtaagaga ccctcagacc ctggagatcc tggacatcac 2520

tccgtgtagc ttcggcggcg tgagcgtgat cacaccgggc accaatacca gcaatcaggt 2580

ggccgtgctg taccagggcg tgaattgcac cgaggtgcct gtggccatcc acgccgacca 2640

gctgactccc acttggaggg tatattccac gggaagcaat gtgttccaga ccagagccgg 2700

ctgcctgatc ggcgccgagc acgtgaataa tagctacgag tgcgacatcc ctatcggcgc 2760

cggcatctgc gccagctacc agacccagac caatagccct ggcggcagcg gcagcgtggc 2820

cagccagagc atcatcgcct acaccatgag cctgggcgcc gagaatagcg tggcctacag 2880

caataatagc atcgccatcc ctaccaattt caccatcagc gtgaccaccg aaatattacc 2940

agtctccatg accaagacca gcgtggactg caccatgtac atctgcggcg acagcaccga 3000

gtgcagcaat ctgctgctgc agtacggcag cttctgcacc cagctgaata gagccctgac 3060

cggcatcgcc gtggagcagg acaagaatac ccaggaggtg ttcgcccagg tgaagcagat 3120

ctacaagact ccgccgatca aggacttcgg cggcttcaat ttcagccaaa tactcccaga 3180

tccaagcaag cctagcgcca acagcttcat cgaggacctg ctgttcaata aggtgaccct 3240

ggccgacgcc ggcttcatca agcagtacgg cgactgccta ggtgatattg cggcaagaga 3300

cctgatctgc gcccagaagt ttaacggttt gaacgtacta cctcctctgc tgaccgacga 3360

gatgatagca caatatacgt cggcattgct cgctggcacg atcacatcgg gctggacttt 3420

cggcgccgga gcagcgttgc aaatcccttt cgccatgcag atggcctaca gattcaatgg 3480

catcggcgtg acccagaatg tgctgtacga gaatcagaag ctgatcgcca atcagttcaa 3540

tagcgccatc ggcaagatcc aggacagcct gagcagcacc gccagcgccc tgggcaagct 3600

gcaggacgtg gtgaatcaga atgcccaggc cctgaatacc ctggtgaagc agctgagcag 3660

caatttcggc gccatcagta gtgtactcaa cgacatcctg agcagactgg acccaccaga 3720

ggccgaggtg caaattgatc gtcttattac tggcagactg cagagcctgc agacctacgt 3780

gacccagcag ctgatcagag ccgccgagat cagagccagc gccaatctgg ccgccaccaa 3840

gatgagcgag tgcgtgctgg gccagagcaa gagagtggac ttctgcggca agggctacca 3900

cctgatgagc ttccctcaga gcgctccaca tggcgtggtg ttcctgcacg tgacctacgt 3960

gcctgcccag gagaagaatt tcaccaccgc acccgcaatc tgccacgacg gcaaggccca 4020

cttccctaga gagggcgtgt tcgtgagcaa tggcacccac tggttcgtga cccagagaaa 4080

tttctacgag cctcagatca tcaccaccga caataccttc gtgagcggca attgcgacgt 4140

ggtgatcggg atagtcaata atactgtcta cgaccctctg cagcctgagc tggacagctt 4200

caaggaggag ctggacaagt acttcaagaa tcacaccagc cctgacgtgg acctcggtga 4260

tatttcggga atcaatgcca gcgtggtgaa tatccagaag gaaattgatc ggctcaacga 4320

agtggccaag aatctgaatg agagcctgat cgacctgcag gagctgggca agtacgagca 4380

gtacatcaag tggccttggt acatctggct gggcttcatc gccggcctga tcgccatcgt 4440

gatggtgacc atcatgctgt gctgcatgac ctcctgttgt tcctgtttga aagggtgttg 4500

ttcgtgtggg tcctgctgca agttcgacga ggacgacagc gagcctgtgc tgaagggcgt 4560

gaagctgcac tacacctaac tcgagactag tagccaacac cctgtctaaa aaacataaat 4620

ttctttaatc attttgcctc ttttctctgt gcttcaatta ataaaaaatg gaaagaacct 4680

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4740

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaggatcc 4800

tctagactgc aggagctcga tatcgaattc gtattctata gtgtcaccta aatccaattc 4860

actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg 4920

ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgatcg 4980

cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggcgc ctgatgcggt attttctcct 5040

tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat atggggcact ctcagtacaa tctgctctga 5100

tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc 5160

ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg 5220

tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct 5280

atttttatag gttaatgtca tgataataat ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg 5340

gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc 5400

gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag 5460

ccatattcaa cgggaaacgt cttgctctag gccgcgatta aattccaaca tggatgctga 5520

tttatatggg tataaatggg ctcgcgataa tgtcgggcaa tcaggtgcga caatctatcg 5580

attgtatggg aagcccgatg cgccagagtt gtttctgaaa catggcaaag gtagcgttgc 5640

caatgatgtt acagatgaga tggtcagact aaactggctg acggaattta tgcctcttcc 5700

gaccatcaag cattttatcc gtactcctga tgatgcatgg ttactcacca ctgcgatccc 5760

cgggaaaaca gcattccagg tattagaaga atatcctgat tcaggtgaaa atattgttga 5820

tgcgctggca gtgttcctgc gccggttgca ttcgattcct gtttgtaatt gtccttttaa 5880

cagcgatcgc gtatttcgtc tcgctcaggc gcaatcacga atgaataacg gtttggttga 5940

tgcgagtgat tttgatgacg agcgtaatgg ctggcctgtt gaacaagtct ggaaagaaat 6000

gcataaactt ttgccattct caccggattc agtcgtcact catggtgatt tctcacttga 6060

taaccttatt tttgacgagg ggaaattaat aggttgtatt gatgttggac gagtcggaat 6120

cgcagaccga taccaggatc ttgccatcct atggaactgc ctcggtgagt tttctccttc 6180

attacagaaa cggctttttc aaaaatatgg tattgataat cctgatatga ataaattgca 6240

gtttcatttg atgctcgatg agtttttcta actgtcagac caagtttact catatatact 6300

ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga 6360

taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt 6420

agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca 6480

aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct 6540

ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc ttctagtgta 6600

gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct 6660

aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc 6720

aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca 6780

gcccagct 6788

<210> 14

<211> 4130

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RBMRNA-Delta疫苗的mRNA序列

<400> 14

augagacaag cuugucccgc agucggcguc cagcggcucu gcuuguucgu gugugugucg 60

uugcaggccu uauucagauc uaccgguggu accgccacca uguucguguu ccuggugcug 120

cugccucugg ugagcagcca gugcgugaau cugagaacca gaacccagcu gccuccugcc 180

uacaccaaua gcuucaccag aggaguuuau uaucccgaua agguguucag aaguagugua 240

uuacauagua cccaggaccu guuccuaccu uucuucagua acgugaccug guuccacgcc 300

auccacguga gcggcaccaa uggcaccaag agauucgaca auccugugcu gccuuucaau 360

gacggcgugu acuucgccag caccgagaag agcaauauca ucagaggcug gaucuucggc 420

accaccuugg auuccaagac ucagagccug cugauuguaa acaacgcuac aaauguggug 480

aucaaggugu gcgaguucca guucugcaau gacccuuucc uggacguuua uuaucauaag 540

aacaacaaga gcuggaugga gagcggagua uauucgucgg cuaauaauug caccuucgag 600

uacgugagcc agccuuuccu gauggaccug gagggcaagc agggcaauuu caagaaucug 660

agagaguucg uguucaagaa uaucgacggc uacuucaaga ucuacagcaa gcacacaccc 720

auuaaucugg ugagagaccu gccucagggc uucagcgucc uggagccucu gguggaccug 780

ccuaucggca ucaauaucac cagauuccag acccugcugg cccugcacag aucauaucuu 840

acaccaggcg auucgucaag cgguuggacc gcuggagcug cggcauauua cgugggcuac 900

cugcagccua gaaccuuccu gcugaaguac aaugagaaug guacgauaac cgacgcaguu 960

gauugugccc uggacccucu gagcgagacc aagugcaccc ugaagagcuu caccguggag 1020

aagggcaucu accagaccag caauuucaga gugcagccua ccgagagcau cgugagauuc 1080

ccuaauauca ccaaucugug cccuuucggc gagguguuca augccaccag auucgccagc 1140

guguacgcau ggaaccgcaa gcggauaagc aauugcgugg ccgacuacag cgugcuguac 1200

aauagcgcca gcuucagcac cuucaaaugu uaugguguuu cgccaacaaa gcugaaugac 1260

cugugcuuca ccaaugugua cgccgacagc uucgugauca gaggcgacga ggugagacag 1320

aucgcgccag ggcagaccgg caagaucgcc gacuacaauu acaagcugcc ugacgacuuc 1380

accggcugcg ugaucgcgug gaacucuaac aaccuggacu cgaaaguugg aggcaauuac 1440

aauuaccgcu acagacuguu cagaaagagc aaucugaagc cuuucgagag agacaucagc 1500

accgagaucu accaggccgg cagcaagccg uguaauggcg uggagggcuu caauugcuac 1560

uucccucugc agagcuacgg cuuccagccu accaauggcg ugggcuacca gccuuacaga 1620

gugguggugc ugagcuucga gcugcugcac gcucccgcua ccgugugcgg cccuaagaag 1680

agcaccaauc uggugaagaa uaagugcgug aauuucaauu ucaauggucu aacuggaacg 1740

ggcgugcuga ccgagagcaa uaagaaguuu cuucccuuuc aacaauucgg cagagacauc 1800

gccgacacca cagaugcugu aagagacccu cagacccugg agauccugga caucacuccg 1860

uguagcuucg gcggcgugag cgugaucaca ccgggcacca auaccagcaa ucagguggcc 1920

gugcuguacc agggcgugaa uugcaccgag gugccugugg ccauccacgc cgaccagcug 1980

acucccacuu ggaggguaua uuccacggga agcaaugugu uccagaccag agccggcugc 2040

cugaucggcg ccgagcacgu gaauaauagc uacgagugcg acaucccuau cggcgccggc 2100

aucugcgcca gcuaccagac ccagaccaau agccgcggcg gcagcggcag cguggccagc 2160

cagagcauca ucgccuacac caugagccug ggcgccgaga auagcguggc cuacagcaau 2220

aauagcaucg ccaucccuac caauuucacc aucagcguga ccaccgaaau auuaccaguc 2280

uccaugacca agaccagcgu ggacugcacc auguacaucu gcggcgacag caccgagugc 2340

agcaaucugc ugcugcagua cggcagcuuc ugcacccagc ugaauagagc ccugaccggc 2400

aucgccgugg agcaggacaa gaauacccag gagguguucg cccaggugaa gcagaucuac 2460

aagacuccgc cgaucaagga cuucggcggc uucaauuuca gccaaauacu cccagaucca 2520

agcaagccua gcgccaacag cuucaucgag gaccugcugu ucaauaaggu gacccuggcc 2580

gacgccggcu ucaucaagca guacggcgac ugccuaggug auauugcggc aagagaccug 2640

aucugcgccc agaaguuuaa cgguuugaca guacuaccuc cucugcugac cgacgagaug 2700

auagcacaau auacgucggc auugcucgcu ggcacgauca caucgggcug gacuuucggc 2760

gccggagcag cguugcaaau cccuuucgcc augcagaugg ccuacagauu caauggcauc 2820

ggcgugaccc agaaugugcu guacgagaau cagaagcuga ucgccaauca guucaauagc 2880

gccaucggca agauccagga cagccugagc agcaccgcca gcgcccuggg caagcugcag 2940

aacgugguga aucagaaugc ccaggcccug aauacccugg ugaagcagcu gagcagcaau 3000

uucggcgcca ucaguagugu acucaacgac auccugagca gacuggaccc accagaggcc 3060

gaggugcaaa uugaucgucu uauuacuggc agacugcaga gccugcagac cuacgugacc 3120

cagcagcuga ucagagccgc cgagaucaga gccagcgcca aucuggccgc caccaagaug 3180

agcgagugcg ugcugggcca gagcaagaga guggacuucu gcggcaaggg cuaccaccug 3240

augagcuucc cucagagcgc uccacauggc gugguguucc ugcacgugac cuacgugccu 3300

gcccaggaga agaauuucac caccgcaccc gcaaucugcc acgacggcaa ggcccacuuc 3360

ccuagagagg gcguguucgu gagcaauggc acccacuggu ucgugaccca gagaaauuuc 3420

uacgagccuc agaucaucac caccgacaau accuucguga gcggcaauug cgacguggug 3480

aucgggauag ucaauaauac ugucuacgac ccucugcagc cugagcugga cagcuucaag 3540

gaggagcugg acaaguacuu caagaaucac accagcccug acguggaccu cggugauauu 3600

ucgggaauca augccagcgu ggugaauauc cagaaggaaa uugaucggcu caacgaagug 3660

gccaagaauc ugaaugagag ccugaucgac cugcaggagc ugggcaagua cgagcaguac 3720

aucaaguggc cuugguacau cuggcugggc uucaucgccg gccugaucgc caucgugaug 3780

gugaccauca ugcugugcug caugaccucc uguuguuccu guuugaaagg guguuguucg 3840

uguggguccu gcugcaaguu cgacgaggac gacagcgagc cugugcugaa gggcgugaag 3900

cugcacuaca ccuaacucga gacuaguagc caacacccug ucuaaaaaac auaaauuucu 3960

uuaaucauuu ugccucuuuu cucugugcuu caauuaauaa aaaauggaaa gaaccuaaaa 4020

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4080

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4130

Claims

1.重组SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)，所述S蛋白具有选自SEQ ID NO. 1-5中任一项所示的氨基酸序列。

2.mRNA，所述mRNA编码权利要求1所述的S蛋白。

3.根据权利要求2所述的mRNA，其从5’到3’方向包含帽结构、5’-UTR、开放阅读框(ORF)、3’-UTR和polyA尾。

4.根据权利要求3所述的mRNA，其中所述5’-UTR包含衍生自17β-羟基类固醇脱氢酶4(HSD17B4)基因的5’-UTR或其同源物、片段或变体，和/或KOZAK序列；其中所述3’-UTR包含衍生自白蛋白(ALB)基因的3’-UTR或其同源物、片段或变体；和/或其中所述polyA尾的长度为100-150个核苷酸。

5.根据权利要求4所述的mRNA，其中所述5’-UTR包含如SEQ ID NO. 8和/或SEQ ID NO.9所示的序列；和/或其中所述3’-UTR包含如SEQ ID NO. 10所示的序列。

6.根据权利要求2所述的mRNA，其中所述mRNA的序列如SEQ ID NO. 12所示。

7.根据权利要求2-6中任一项所述的mRNA，其中所述mRNA中的一个或多个核苷酸各自独立替换为天然存在的核苷酸类似物或人工合成的核苷酸类似物，其中所述天然存在的核苷酸类似物选自假尿苷、2-硫尿苷、5-甲基尿苷、5-甲基胞苷和N6-甲基腺苷，和所述人工合成的核苷酸类似物选自N1-甲基假尿苷和5-乙炔基尿苷。

8.根据权利要求7所述的mRNA，其中所述mRNA中的一个或多个尿苷三磷酸各自独立替换为假尿苷三磷酸、1-甲基-假尿苷三磷酸或5-乙炔基尿苷三磷酸，和/或一个或多个胞苷三磷酸替换为5-甲基胞苷三磷酸。

9.DNA，其编码权利要求2-6中任一项所述的mRNA。

10.根据权利要求9所述的DNA，其中所述DNA的序列如SEQ ID NO. 11所示。

11.重组质粒，其包含权利要求9或10的DNA。

12.根据权利要求11所述的重组质粒，其中所述质粒为pT7TS质粒。

13.根据权利要求12所述的重组质粒，其还包含起始序列(Ori)、T7启动子、5’-UTR和3’-UTR。

14.根据权利要求13所述的重组质粒，其中所述起始序列为ColE1型起始序列；其中所述T7启动子的序列如SEQ ID NO. 7所示；其中所述5’-UTR包含衍生自HSD17B4的5’-UTR或其同源物、片段或变体，和/或KOZAK序列；和/或其中所述3’-UTR包含衍生自ALB的3’-UTR或其同源物、片段或变体。

15.根据权利要求14所述的重组质粒，其中所述起始序列为SEQ ID NO. 6所示的起始序列；其中所述5’-UTR包含如SEQ ID NO. 8和/或SEQ ID NO. 9所示的序列；和/或其中所述3’-UTR包含如SEQ ID NO. 10所示的序列。

16.根据权利要求11-15中任一项所述的重组质粒，其中所述重组质粒还包含polyA、抗性基因启动子和抗性基因。

17.根据权利要求16所述的重组质粒，其中所述polyA的长度为100-150个核苷酸；所述抗性基因启动子为氨苄青霉素抗性基因启动子；和/或所述抗性基因为硫酸卡那霉素抗性基因。

18.根据权利要求11所述的重组质粒，其中所述重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。

19.mRNA-载体颗粒，其包含权利要求2-8中任一项的mRNA和包封所述mRNA的载体材料。

20.组合物，其包含权利要求1所述的S蛋白、权利要求2-8中任一项所述的mRNA、权利要求11-18中任一项所述的重组质粒、或权利要求19所述的mRNA-载体颗粒。

21.根据权利要求1所述的S蛋白、权利要求2-8中任一项所述的mRNA、权利要求11-18中任一项所述的重组质粒、权利要求19所述的mRNA-载体颗粒、或权利要求20所述的组合物在制备用于在受试者中预防和/或治疗与SARS-CoV-2感染相关的疾病或病症的药物中的用途。

22.根据权利要求21所述的用途，其中所述疾病或病症为SARS-CoV-2 Lambda变异株感染引起的疾病或病症。