CN111944864A - 一种新型Cap2结构5′帽子类似物及其制备方法 - Google Patents

一种新型Cap2结构5′帽子类似物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种新型Cap2结构5'帽子类似物及其制备方法，属于基因工程技术领域，所述新型Cap2结构5'帽子类似物的分子式选自m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)p(2'OMeG)；m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)p(2'OMeG)等任一种。本发明提供的新型Cap2结构5'帽子类似物具有更高的合成效率、更高的加帽效率、更低的免疫原性和更高的蛋白翻译效率。

Description

一种新型Cap2结构5′帽子类似物及其制备方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种新型Cap2结构5′帽子类似物及其制备方法。
背景技术
翻译效率和免疫原性是mRNA药物行使功能的两大关键因素。自体免疫蛋白如RIG-I和IFIT识别异常加帽的mRNA，降低了外源mRNA在细胞内的活性和半衰期，使得mRNA药物在体内难以发挥作用。因此，优化mRNA帽结构对于提高mRNA的生物活性和降低免疫原性是至关重要的。
目前在体外合成带帽的mRNA有两种方法，第一种是mRNA转录后使用牛痘病毒加帽酶对其进行加帽，产生带Cap 0或Cap 1的RNA，这种加帽方法很高效，但是产量不稳定，价格也很昂贵。此外酶促加帽法不能产生Cap 2和m6Am的帽子。第二种方法是转录过程中加入过量的帽结构类似物来进行加帽。截至目前，最常用的帽结构类似物是ARCA，使用ARCA可产生具有免疫原性的Cap 0，但是加帽效率只有70％。该方法的产量也比较低，每毫升转录反应体系最多制备1.5mg RNA，转录产物具有很高的免疫原性。另一种叫做Cleancap的新型共转录加帽的方法也被广泛采用。Cleancap属于Cap 1，与ARCA使用二聚体(m7GpppG)启动T7转录不同，CleanCap使用三聚体(m7GpppAmG)启动T7转录。该方法的产量比较高，每毫升转录反应体系制备4mg加帽的RNA，加帽效率可达90％，其转录产物的免疫原性低于ARCA。
基于现有mRNA合成体系中的帽结构类似物的加帽率低，单位合成体积内mRNA产量低以及免疫原性高等缺点，从而研发了新型Cap2帽结构类似物，既弥补了以上应用上的缺点，又大大提升了蛋白翻译效率。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种新型Cap2结构5′帽子类似物及其制备方法，本发明提供的新型Cap2结构5′帽子类似物具有更高的合成效率、更高的加帽效率、更低的免疫原性和更高的蛋白翻译效率。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种新型Cap2结构5′帽子类似物，所述新型Cap2结构5′帽子类似物的分子式选自以下任一种；
m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA)p(2′OMeG)；
m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeG)p(2′OMeG)；
m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeC)p(2′OMeG)；
m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeU)p(2′OMeG)；
m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA)p(2′OMeA)；
m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeG)p(2′OMeA)；
m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeC)p(2′OMeA)；
m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeU)p(2′OMeA)；
m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA)p(2′OMeC)；
m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeG)p(2′OMeC)；
m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeC)p(2′OMeC)；
m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeU)p(2′OMeC)；
m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA)p(2′OMeU)；
m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeG)p(2′OMeU)；
m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeC)p(2′OMeU)；
m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeU)p(2′OMeU)；
3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA)p(2′OMeG)；
3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeG)p(2′OMeG)；
3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeC)p(2′OMeG)；
3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeU)p(2′OMeG)；
3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA)p(2′OMeA)；
3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeG)p(2′OMeA)；
3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeC)p(2′OMeA)；
3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeU)p(2′OMeA)；
3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA)p(2′OMeC)；
3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeG)p(2′OMeC)；
3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeC)p(2′OMeC)；
3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeU)p(2′OMeC)；
3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA)p(2′OMeU)；
3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeG)p(2′OMeU)；
3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeC)p(2′OMeU)；
3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeU)p(2′OMeU)。
本发明还提供了上述技术方案所述的新型Cap2结构5′帽子类似物的制备方法，包括以下步骤：
1)将2′-O-Methyl-ATP、2′-O-Methyl-GTP、2′-O-Methyl-CTP和2′-O-Methyl-UTP分别溶解在无RNA酶的水中，再分别与磷酸水解酶、2×Reaction Buffer混合后进行孵育，得到2′-O-Methyl-ADP、2′-O-Methyl-GDP、2′-O-Methyl-CDP和2′-O-Methyl-UDP；
2)将所述步骤1)得到的2′-O-Methyl-ADP、2′-O-Methyl-GDP、2′-O-Methyl-CDP和2′-O-Methyl-UDP分别溶解在无RNA酶水中，再分别与7-Methylguanosine、7-Methyl-3′-O-Methylguanosine、鸟苷转移酶、2×Reaction Buffer混合后进行孵育，得到m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA/G/C/U)和3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA/G/C/U)；
3)将所述步骤2)得到的m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA/G/C/U)和3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA/G/C/U)分别溶解在无RNA酶水中，与T4RNALigase1混合后，再分别与2′-O-Methyl-ATP、2′-O-Methyl-GTP、2′-O-Methyl-CTP和2′-O-Methyl-UTP混合，再与2×T4 RNALigase Reaction Buffer混合后进行孵育，得到新型Cap2结构5′帽子类似物。
优选的，所述步骤1)2′-O-Methyl-ATP、2′-O-Methyl-GTP、2′-O-Methyl-CTP和2′-O-Methyl-UTP的摩尔与无RNA酶的水的体积比均为1～30mmol:14μL。
优选的，所述步骤1)无RNA酶的水与磷酸水解酶、2×Reaction Buffer的体积比为14:1:15。
优选的，所述磷酸水解酶的酶活为50000U；
所述2×Reaction Buffer的组分包括：50mM Tris-HCl、5mM KCl、1mM MgCl2、1mMDTT，pH值为8。
优选的，所述步骤1)～3)孵育的温度分别为37℃，所述孵育的时间分别为1h。
优选的，所述步骤2)无RNA酶水与7-Methylguanosine、7-Methyl-3′-O-Methylguanosine、鸟苷转移酶、2×Reaction Buffer的体积比为11:10:10:1:22。
优选的，所述步骤3)无RNA酶水与T4 RNA Ligase 1、2×T4 RNA LigaseReactionBuffer的体积比为11:1:22。
优选的，所述2×T4 RNA Ligase Reaction Buffer的组分包括：60mM Tris-HCl、20mM MgCl2、20mM DTT和2mMATP。
优选的，所述T4 RNALigase 1的酶活为10000U。
本发明的有益效果：
与现有帽结构类似物ARCA和Cleancap相比，本发明中的32种Cap2结构帽类似物具有更高的合成效率；
与现有帽结构类似物ARCA和Cleancap相比，本发明中的32种Cap2结构帽类似物具有更高的加帽效率；
与现有帽结构类似物ARCA和Cleancap相比，本发明中的32种Cap2结构帽类似物具有更低的免疫原性；
与现有帽结构类似物ARCA和Cleancap相比，本发明中的32种Cap2结构帽类似物具有更高的蛋白翻译效率。
附图说明
图1为本发明所提供的帽结构类似物的结构通式；
图2为本发明提供的32种新型Cap2帽结构类似物应用于mRNA合成有效增加mRNA的合成效率，在每毫升合成体系中，采用新型Cap2帽结构类似物的合成产物(4～6mg)明显高于ARCA(1.5mg)和Cleancap(3.8mg)；
图3为本发明提供的32种新型Cap2帽结构类似物应用于mRNA合成有效增加mRNA的加帽效率，在同等合成条件下，采用新型Cap2帽结构类似物的合成产物95％被加帽，高于ARCA的70％和Cleancap的90％；
图4为本发明提供的的32种新型Cap2帽结构类似物应用于mRNA合成有效降低免疫源性，采用新型Cap2帽结构类似物的合成产物在细胞内的免疫原性仅为采用ACRA结构的相同mRNA的9％-52％；
图5为本发明提供的新型Cap2帽结构类似物应用于mRNA合成有效提高蛋白翻译效率，编码荧光素酶(Luc)的mRNA分别采用ARCA、Cleancap和新型Cap2帽结构类似物进行加帽，对比三种mRNA在小鼠体内的表达强度,可以发现采用新型Cap2帽结构类似物的LucmRNA表达强度最高。
具体实施方式
本发明提供了一种新型Cap2结构5′帽子类似物，所述新型Cap2结构5′帽子类似物的分子式选自以下任一种；
m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA)p(2′OMeG)；
m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeG)p(2′OMeG)；
m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeC)p(2′OMeG)；
m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeU)p(2′OMeG)；
m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA)p(2′OMeA)；
m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeG)p(2′OMeA)；
m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeC)p(2′OMeA)；
m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeU)p(2′OMeA)；
m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA)p(2′OMeC)；
m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeG)p(2′OMeC)；
m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeC)p(2′OMeC)；
m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeU)p(2′OMeC)；
m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA)p(2′OMeU)；
m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeG)p(2′OMeU)；
m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeC)p(2′OMeU)；
m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeU)p(2′OMeU)；
3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA)p(2′OMeG)；
3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeG)p(2′OMeG)；
3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeC)p(2′OMeG)；
3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeU)p(2′OMeG)；
3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA)p(2′OMeA)；
3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeG)p(2′OMeA)；
3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeC)p(2′OMeA)；
3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeU)p(2′OMeA)；
3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA)p(2′OMeC)；
3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeG)p(2′OMeC)；
3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeC)p(2′OMeC)；
3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeU)p(2′OMeC)；
3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA)p(2′OMeU)；
3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeG)p(2′OMeU)；
3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeC)p(2′OMeU)；
3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeU)p(2′OMeU)。
在本发明中，所述新型Cap2结构5′帽子类似物共性是基于甲氧基修饰2′OMe，对A\G\C\U以及m7G核苷进行甲氧基修饰2′OMeA或2′OMeG或2′OMeC或2′OMeU和3′-O-Me-m7G。通过酶学反应形成新型Cap2结构的帽子。
本发明还提供了上述技术方案所述的新型Cap2结构5′帽子类似物的制备方法，包括以下步骤：
1)将2′-O-Methyl-ATP、2′-O-Methyl-GTP、2′-O-Methyl-CTP和2′-O-Methyl-UTP分别溶解在无RNA酶的水中，再分别与磷酸水解酶、2×Reaction Buffer混合后进行孵育，得到2′-O-Methyl-ADP、2′-O-Methyl-GDP、2′-O-Methyl-CDP和2′-O-Methyl-UDP；
2)将所述步骤1)得到的2′-O-Methyl-ADP、2′-O-Methyl-GDP、2′-O-Methyl-CDP和2′-O-Methyl-UDP分别溶解在无RNA酶水中，再分别与7-Methylguanosine、7-Methyl-3′-O-Methylguanosine、鸟苷转移酶、2×Reaction Buffer混合后进行孵育，得到m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA/G/C/U)和3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA/G/C/U)；
3)将所述步骤2)得到的m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA/G/C/U)和3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA/G/C/U)分别溶解在无RNA酶水中，与T4 RNA Ligase1混合后，再分别与2′-O-Methyl-ATP、2′-O-Methyl-GTP、2′-O-Methyl-CTP和2′-O-Methyl-UTP混合，再与2×T4 RNALigase Reaction Buffer混合后进行孵育，得到新型Cap2结构5′帽子类似物。
本发明将2′-O-Methyl-ATP、2′-O-Methyl-GTP、2′-O-Methyl-CTP和2′-O-Methyl-UTP分别溶解在无RNA酶的水中，再分别与磷酸水解酶、2×Reaction Buffer混合后进行孵育，得到2′-O-Methyl-ADP、2′-O-Methyl-GDP、2′-O-Methyl-CDP和2′-O-Methyl-UDP。在本发明中，所述2′-O-Methyl-ATP、2′-O-Methyl-GTP、2′-O-Methyl-CTP和2′-O-Methyl-UTP采用常规市售产品即可。
在本发明中，所述2′-O-Methyl-ATP、2′-O-Methyl-GTP、2′-O-Methyl-CTP和2′-O-Methyl-UTP的摩尔与无RNA酶的水的体积比优选均为1～30mmol:14μL，,更优选为10mmol:14μL。本发明对所述2′-O-Methyl-ATP、2′-O-Methyl-GTP、2′-O-Methyl-CTP和2′-O-Methyl-UTP的来源没有特殊限定，采用市售产品或者采用常规方法制备即可。在本发明中，所述无RNA酶的水与磷酸水解酶、2×Reaction Buffer的体积比优选为14:1:15。在本发明中，所述磷酸水解酶的酶活优选为50000U；所述2×Reaction Buffer的组分优选包括：50mMTris-HCl、5mM KCl、1mM MgCl2、1mM DTT，pH值为8。在本发明中，所述孵育的温度优选为37℃，所述孵育的时间优选为1h。在本发明中，所述2′-O-Methyl-ATP、2′-O-Methyl-GTP、2′-O-Methyl-CTP和2′-O-Methyl-UTP优选经过HPLC纯化后再溶解在无RNA酶水中。
本发明将得到的2′-O-Methyl-ADP、2′-O-Methyl-GDP、2′-O-Methyl-CDP和2′-O-Methyl-UDP分别溶解在无RNA酶水中，再分别与7-Methylguanosine、7-Methyl-3′-O-Methylguanosine、鸟苷转移酶、2×ReactionBuffer混合后进行孵育，得到m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA/G/C/U)和3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA/G/C/U)。
在本发明中，所述无RNA酶水与7-Methylguanosine、7-Methyl-3′-O-Methylguanosine、鸟苷转移酶、2×Reaction Buffer的体积比优选为11:10:10:1:22。在本发明中，所述鸟苷转移酶的酶活优选为50000U。在本发明中，所述2×Reaction Buffer的组分优选包括：50mM Tris-HCl、5mM KCl、1mM MgCl2、1mM DTT，pH值为8。本发明对所述7-Methylguanosine和7-Methyl-3′-O-Methylguanosine的来源没有特殊限定，采用常规市售或者采用常规制备方法制备即可。在本发明中，所述孵育的温度优选为37℃，所述孵育的时间优选为1h。
本发明将得到的m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA/G/C/U)和3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA/G/C/U)分别溶解在无RNA酶水中，与T4 RNA Ligase 1混合后，再分别与2′-O-Methyl-ATP、2′-O-Methyl-GTP、2′-O-Methyl-CTP和2′-O-Methyl-UTP混合，再与2×T4 RNA LigaseReaction Buffer混合后进行孵育，得到新型Cap2结构5′帽子类似物。
在本发明中，所述m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA/G/C/U)和3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA/G/C/U)优选进行HPLC纯化后再溶解在无RNA酶水中。
在本发明中，所述无RNA酶水与T4 RNA Ligase 1、2×T4 RNA Ligase ReactionBuffer的体积比优选为11:1:22。在本发明中，所述T4 RNA连接酶1的酶活优选为10000U。在本发明中，所述2×T4 RNA Ligase Reaction Buffer的组分优选包括：60mM Tris-HCl、20mM MgCl2、20mM DTT和2mM ATP。在本发明中，所述孵育的温度优选为37℃，所述孵育的时间优选为1h。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.将10mmol的2′-O-Methyl-ATP、2′-O-Methyl-GTP、2′-O-Methyl-CTP或者2′-O-Methyl-UTP分别溶解在无RNA酶的水中，总体积为14μl。加入1μl(50000U)磷酸水解酶和15μl 2×ReactionBuffer(50mM Tris-HCl；5mM KCl；1mM MgCl2；1mM DTT；pH 8)，37℃下孵育1h，得到2′-O-Methyl-ADP、2′-O-Methyl-GDP、2′-O-Methyl-CDP和2′-O-Methyl-UDP。
2.对以上所得2′-O-Methyl-ADP、2′-O-Methyl-GDP、2′-O-Methyl-CDP和2′-O-Methyl-UDP分别进行进行HPLC纯化并溶解在无RNA酶水中，总体积为11μl。
3.将10μl(10mmol)7-Methylguanosine、10μl(10mmol)7-Methyl-3′-O-Methylguanosine和1μl(50000U)鸟苷转移酶加入到步骤2得到的溶液中，加入22μl 2×ReactionBuffer(50mM Tris-HCl；5mM KCl；1mM MgCl2；1mM DTT；pH 8)，在37℃下孵育1h，得到m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA/G/C/U)或3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA/G/C/U)。
4.对步骤3所得的溶液进行HPLC纯化并溶解在无RNA酶水中备用，总体积为11μl。
5.将10μl(10mmol)的2′-O-Methyl-ATP、2′-O-Methyl-GTP、2′-O-Methyl-CTP或者2′-O-Methyl-UTP分别与1μl(10000U)T4 RNA连接酶1(ssRNA ligase NEB M0437M)加入到步骤4所得溶液中，加入22μl 2×T4RNA Ligase Reaction Buffer(60mM Tris-HCl(pH7.8at 25℃),20mM MgCl2,20mM DTT and 2mMATP)，在37℃下孵育1h，得到新型Cap2结构5′帽子类似物，分子式如下：
1、m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA)p(2′OMeG)；
2、m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeG)p(2′OMeG)；
3、m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeC)p(2′OMeG)；
4、m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeU)p(2′OMeG)；
5、m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA)p(2′OMeA)；
6、m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeG)p(2′OMeA)；
7、m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeC)p(2′OMeA)；
8、m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeU)p(2′OMeA)；
9、m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA)p(2′OMeC)；
10、m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeG)p(2′OMeC)；
11、m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeC)p(2′OMeC)；
12、m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeU)p(2′OMeC)；
13、m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA)p(2′OMeU)；
14、m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeG)p(2′OMeU)；
15、m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeC)p(2′OMeU)；
16、m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeU)p(2′OMeU)；
17、3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA)p(2′OMeG)；
18、3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeG)p(2′OMeG)；
19、3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeC)p(2′OMeG)；
20、3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeU)p(2′OMeG)；
21、3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA)p(2′OMeA)；
22、3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeG)p(2′OMeA)；
23、3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeC)p(2′OMeA)；
24、3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeU)p(2′OMeA)；
25、3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA)p(2′OMeC)；
26、3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeG)p(2′OMeC)；
27、3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeC)p(2′OMeC)；
28、3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeU)p(2′OMeC)；
29、3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA)p(2′OMeU)；
30、3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeG)p(2′OMeU)；
31、3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeC)p(2′OMeU)；
32、3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeU)p(2′OMeU)。
实施例2
实施例1制备的32种新型Cap2帽结构类似物应用于mRNA合成有效增加mRNA的合成效率(4-6mg/ml)。
实验方法：
1.合成mRNA前，先用NotI线性化质粒，4℃酶切过夜。
2.DNA模板抽提。
3.体外转录合成mRNA,分别使用ARCA、Cleancap和本发明中32种Cap2作为帽结构，反应体系如表1：
表1 反应体系
组分 用量
T7 10X Reaction Buffer 2ul
T7 ATP Solution(75mM) 2ul
T7 CTP Solution(75mM) 2ul
T7 GTP Solution(75mM) 2ul
T7 UTP Solution(75mM) 2ul
线性化质粒模板 <8ul
T7 Enzyme Mix 2ul
ARCA/Cleancap/Cap2 2ul
Nuclease-free水 至20ul
37℃反应6小时。TURBO DNase消化15分钟。
4.使用LiCl溶液对转录产物进行纯化，计算反应得率。
结果如表2、图2，使用ARCA帽结构时，每毫升转录反应体系最高可制备1.5mgmRNA，使用Cleancap时，每毫升转录反应体系最高可制备3.8mg mRNA，使用本发明中的cap2时，每毫升转录反应体系最高可制备至4～6mg mRNA。
表2 1ml mRNA合成反应体系所得的终产物质量(mg)
ARCA Cleancap 1 2 3 4 5 6 7
1.5 3.8 4.5 4.9 5.8 4.7 4.4 5.1 5.3
8 9 10 11 12 13 14 15 16
5.3 4.8 6.0 4.7 4.9 5.1 5.5 4.6 4.2
17 18 19 20 21 22 23 24 25
4.7 4.1 4.4 4.6 4.8 4.6 4.5 4.7 4.1
26 27 28 29 30 31 32
4.6 4.7 4.8 5.3 5.3 4.5 4.3
实施例3
实施例1制备的32种新型Cap2帽结构类似物应用于mRNA合成有效增加加帽效率(95-98％)。
实验方法：
将实施例1中的得到的不同帽结构的mRNA分子进行酶切，可在液相色谱质谱分析实验中对加帽和未加帽的mRNA分子比例进行测定。
Beads预处理：
1、使用磁铁浓缩beads，吸去上清存储液，加入等体积的0.1M NaOH+0.05M NaCl；
2、吸去上清，用等体积0.1M NaCl重悬beads，保持浓度不变；
3、mRNA与剪切标签退火，配置以下反应体系。
表2 反应体系
10x RNase H reaction buffer 12ul
RNase H probe 500pmol
mRNA 100pmol
total 120ul
梯度退火：95℃5min
65℃2min
55℃2min
22℃hold
4、剪切标签与beads结合
Beads经过15000g 5min离心，去上清，加入120ul退火后的mRNA和标签，室温孵育30min，期间轻轻震荡，确保充分结合；
5、RNase H剪切
加入10ul RNase H，37℃孵育3h。用磁石沉淀beads，弃上清。
加入100ul washing buffer，充分混匀，磁石沉淀2min，弃上清。重复3次。
DI water洗3次，
6、RppH消化
10units RppH in nebuffer 2室温消化1小时
7、DI water洗3次。
8、洗脱
吸去DI water，加入100ul预热至80℃的75％乙醇，温育3min，磁石沉淀3min，取上清，蒸发离心45min，至体积为10ul，重悬至50ul100M EDTA/1％MeOH，待LC-MS分析。
9、LC-MS分析不同帽结构类似物合成的mRNA加帽率。
结果如表3和图3所示，使用ARCA帽结构时，转录产物加帽率最高为70％，使用Cleancap时，转录产物加帽率最高为90％，，使用本发明中的cap2时，转录产物加帽率最高可达95％。
表3 使用不同帽结构时mRNA加帽率
Figure BDA0002641863970000131
实施例4
实施例1制备的32种新型Cap2帽结构类似物应用于mRNA合成有效降低免疫源性。
实验方法：采用RNA免疫共沉淀的方法，将胞内免疫蛋白TLR3、TLR7、TLR8和RIG-1与其结合的RNA一起进行免疫沉淀，最后对这些mRNA进行实时定量PCR鉴定，其相对丰度与其免疫原性呈正比关系。
实验方法：
1.细胞收集
培养人PBMC细胞至106个/孔，使用Lipofectamine 2000将5μg ARCA、Cleancap和Cap 2帽结构的mRNA转染细胞。24h后通过胰蛋白酶消化收集细胞并在PBS中重悬细胞，离心，收集细胞。
2.细胞固定和裂解
在细胞中加入固定液，15min加入甘氨酸终止固定，离心收集细胞。加入裂解液重悬细胞，冰孵育30min，4℃，2400g离心10min，收集上清。
3.RNA免疫沉淀
将TLR3、TLR7、TLR8和RIG-1的抗体(2～10μg)加入上清液中(6～10mg)，4℃轻柔搅动孵育2h。加入protein A/G磁珠(40μL)，4℃轻柔搅动孵育1h。
4.洗去未结合的物质
2500rpm离心30s沉淀磁珠，移去上清液，在500uL RIP缓冲液中重悬磁珠。RIP缓冲液中重复清洗共三次，随后在PBS中清洗一次。
5.对免疫沉淀后RBP上结合的RNA进行纯化
在TRIzol RNA提取试剂(1mL)中重悬磁珠，分离共沉淀的RNA。使用不含核酸酶的水(20μL)洗脱RNA。
6.将RNA逆转录(RT)为cDNA，并根据mRNA序列设计引物进行定量PCR分析，mRNA免疫原性与磁珠沉淀的mRNA拷贝数成正比。
结果如表4和图4，本发明中的Cap2帽结构mRNA免疫原性明显低于ARCA和Cleancap帽结构的mRNA免疫原性。
表4使用不同帽结构时mRNA的胞内免疫原性，所有结果为相对于ARCA的相对值；
表4 实验结果
ARCA Cleancap 1 2 3 4 5 6 7
1 0.76 0.40 0.37 0.28 0.48 0.52 0.38 0.24
8 9 10 11 12 13 14 15 16
0.31 0.4 0.18 0.31 0.19 0.23 0.35 0.34 0.48
17 18 19 20 21 22 23 24 25
0.44 0.31 0.26 0.51 0.15 0.29 0.41 0.48 0.29
26 27 28 29 30 31 32
0.49 0.09 0.52 0.27 0.31 0.4 0.3
实施例5
实施例1制备的新型Cap2帽结构类似物应用于mRNA合成有效蛋白翻译效率。
实验方法：将等量编码荧光素酶luciferase的mRNA皮内注射于小鼠背部，24小时后尾静脉注射荧光素酶底物，发光强度与有效目的蛋白翻译率成比。
实验结果如图5，本法明中的新型Cap2帽结构类似物应用于mRNA合成有效蛋白翻译效率明显高于ARCA和Cleancap帽结构的蛋白翻译效率。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种新型Cap2结构5'帽子类似物，其特征在于，所述新型Cap2结构5'帽子类似物的分子式选自以下任一种；
m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)p(2'OMeG)；
m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)p(2'OMeG)；
m7G(5')ppp(5')(2'OMeC)p(2'OMeG)；
m7G(5')ppp(5')(2'OMeU)p(2'OMeG)；
m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)p(2'OMeA)；
m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)p(2'OMeA)；
m7G(5')ppp(5')(2'OMeC)p(2'OMeA)；
m7G(5')ppp(5')(2'OMeU)p(2'OMeA)；
m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)p(2'OMeC)；
m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)p(2'OMeC)；
m7G(5')ppp(5')(2'OMeC)p(2'OMeC)；
m7G(5')ppp(5')(2'OMeU)p(2'OMeC)；
m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)p(2'OMeU)；
m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)p(2'OMeU)；
m7G(5')ppp(5')(2'OMeC)p(2'OMeU)；
m7G(5')ppp(5')(2'OMeU)p(2'OMeU)；
3′-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)p(2'OMeG)；
3′-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)p(2'OMeG)；
3′-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeC)p(2'OMeG)；
3′-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeU)p(2'OMeG)；
3′-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)p(2'OMeA)；
3′-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)p(2'OMeA)；
3′-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeC)p(2'OMeA)；
3′-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeU)p(2'OMeA)；
3′-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)p(2'OMeC)；
3′-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)p(2'OMeC)；
3′-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeC)p(2'OMeC)；
3′-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeU)p(2'OMeC)；
3′-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)p(2'OMeU)；
3′-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)p(2'OMeU)；
3′-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeC)p(2'OMeU)；
3′-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeU)p(2'OMeU)。
2.权利要求1所述的新型Cap2结构5'帽子类似物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将2'-O-Methyl-ATP、2'-O-Methyl-GTP、2'-O-Methyl-CTP和2'-O-Methyl-UTP分别溶解在无RNA酶的水中，再分别与磷酸水解酶、2×Reaction Buffer混合后进行孵育，得到2'-O-Methyl-ADP、2'-O-Methyl-GDP、2'-O-Methyl-CDP和2'-O-Methyl-UDP；
2)将所述步骤1)得到的2'-O-Methyl-ADP、2'-O-Methyl-GDP、2'-O-Methyl-CDP和2'-O-Methyl-UDP分别溶解在无RNA酶水中，再分别与7-Methylguanosine、7-Methyl-3'-O-Methylguanosine、鸟苷转移酶、2×Reaction Buffer混合后进行孵育，得到m7G(5')ppp(5')(2'OMeA/G/C/U)和3′-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeA/G/C/U)；
3)将所述步骤2)得到的m7G(5')ppp(5')(2'OMeA/G/C/U)和3′-O-Me-m7G(5')ppp(5')(2'OMeA/G/C/U)分别溶解在无RNA酶水中，与T4 RNA Ligase1混合后，再分别与2'-O-Methyl-ATP、2'-O-Methyl-GTP、2'-O-Methyl-CTP和2'-O-Methyl-UTP混合，再与2×T4 RNALigase Reaction Buffer混合后进行孵育，得到新型Cap2结构5'帽子类似物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)2'-O-Methyl-ATP、2'-O-Methyl-GTP、2'-O-Methyl-CTP和2'-O-Methyl-UTP的摩尔与无RNA酶的水的体积比均为1～30mmol:14μL。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)无RNA酶的水与磷酸水解酶、2×Reaction Buffer的体积比为14:1:15。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述磷酸水解酶的酶活为50000U；
所述2×Reaction Buffer的组分包括：50mM Tris-HCl、5mM KCl、1mM MgCl2、1mM DTT，pH值为8。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)～3)孵育的温度分别为37℃，所述孵育的时间分别为1h。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)无RNA酶水与7-Methylguanosine、7-Methyl-3'-O-Methylguanosine、鸟苷转移酶、2×ReactionBuffer的体积比为11:10:10:1:22。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)无RNA酶水与T4 RNALigase 1、2×T4 RNA Ligase Reaction Buffer的体积比为11:1:22。
9.根据权利要求2或8所述的制备方法，其特征在于，所述2×T4RNA Ligase ReactionBuffer的组分包括：60mM Tris-HCl、20mM MgCl2、20mM DTT和2mMATP。
10.根据权利要求2或8所述的制备方法，其特征在于，所述T4 RNA Ligase 1的酶活为10000U。
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