CN115960860A - 一种能够减少ivt副产物的t7-rna聚合酶突变体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种T7‑RNA聚合酶突变体，通过引入突变，提供了改良的T7‑RNA聚合酶突变体。T7‑RNA聚合酶结构简单、转录高效，广泛用于体外转录合成RNA，这是RNA相关研究的重要工具酶。本发明的T7‑RNA聚合酶突变体是将野生型T7‑RNA聚合酶的第240位天冬氨酸替换天冬酰胺，第762位天冬酰胺替换为色氨酸，同时突变这两个氨基酸位点，能够减少体外转录过程中产生的副产物。本发明的T7‑RNA聚合酶突变体不仅维持高效转录，还可以有效减少体外转录过程中寡核苷酸、中断RNA产物、3’末端延伸产物等副产物的产生，同时能够减少RNA药物生产过程中的纯化成本，为RNA的研究与应用提供一种有效的候选酶工具。

Description

一种能够减少IVT副产物的T7-RNA聚合酶突变体

技术领域

本发明属于核酸工具酶与核酸生物领域，特别是噬菌体T7-RNA聚合酶突变体及其应用。

背景技术

T7-RNA聚合酶是在噬菌体T7中发现的一个99kda（883个氨基酸）的单个亚基蛋白，主要参与转录活性，不需要任何其他辅助转录因子。T7-RNA聚合酶转录活性的特异性和稳定性来自于其启动子的特异性，该启动子是一个23个核苷酸的dsDNA序列。这种对启动子的特异性，包括启动子识别环以及T7-RNA聚合体中的N端结构域。T7-RNA聚合酶可以对含有双链T7启动子序列的ssDNA寡核苷酸模板进行转录。

RNA（核糖核酸）作为遗传信息传递的一类生物大分子，在真核生物、原核生物、部分病毒及类病毒中广泛存在，并具有许多不同的种类及功能。RNA相关研究的逐渐深入揭示出RNA在疾病治疗方面有着非常重要的应用价值。体外合成的siRNA和mRNA可以成为RNA靶向治疗的重要药物，很多大型制药公司都致力于开发RNA药物用于疾病治疗。此外，体外合成的mRNA由于具有在体内蛋白瞬时表达等优点当前已被作为一类全新的疫苗—mRNA疫苗被推广应用。

mRNA基于自身优势，理论上能够表达任何蛋白质，可以探索治疗几乎所有基于蛋白质的疾病。目前，mRNA技术在新冠疫苗的研发充分体现出其蛋白表达能力强，研发周期短的独特优势。除此之外，mRNA技术现已逐步推进至蛋白替代疗法，细胞治疗等领域，其未来产业化应用场景十分丰富。新冠疫情的助力以及技术更迭加速等情况，预计未来mRNA疫苗和药物市场规模也将达到万亿以上，在如此庞大的市场以及激烈竞争的环境下，mRNA在商业化进程中势必进一步加速。mRNA的生产中涵盖质粒纯化和mRNA制备工艺过程，由于生产工艺复杂，导致大规模商业化的产品不足以满足现有市场的需求。

IVT（体外转录）产物是一个混合物，不仅含有所需的目标mRNA产物，还含有一些杂质，包括酶、残留的NTPs和DNA模板，以及IVT过程中形成的异常mRNA产物。实验室级纯化方法是基于DNAse消化去除DNA，然后采用氯化锂沉淀。但是这些方法不能去除一些罕见的mRNA产物，如dsRNA和截断的RNA片段，而这些产品相关的杂质会降低翻译效率，并具有免疫原性，因而开发完备高效的工业级分离纯化工艺，及产品相关杂质表征方法建立也是工艺挑战之一。由于mRNA工业化纯化难度和成本较高，开发成熟的工业化纯化工艺固然重要，但如果能在转录过程中减少副产物的生成，不失为一种好的策略。如果可以从源头上减少杂质，就会在很大程度上降低下游纯化的难度，缩短生产周期。

IVT 过程中 mRNA 的杂质存在着差异性，因此需要提高纯化技术的可选择性，以便工艺开发科学家可以根据分子的特点配制相应的培养基。目前mRNA主流纯化工艺都是采用 oligo dT柱子（ 只选择性地结合有polyA尾巴RNA），使用oligo dT纯化平台纯化mRNA的采用 TFF （切向流过滤）或 SEC （尺寸排阻色谱）来去除少量残留杂质，而其中部分杂质则较为复杂，找到一个通用的纯化平台比我们预想的更加困难。亲和层析Oligo (dT)与Poly(A)尾的杂交亲和有局限性，它无法区分ssRNA（单链RNA）和dsRNA（双链RNA），因为二者都带Poly(A)尾，但去除痕量的dsRNA是非常重要的，尤其是在疫苗生产领域。通过IVT与共转录加帽生产mRNA会有痕量的dsRNA，它会引发人体固有的免疫反应，降低疫苗的效力。 高盐浓度下可以抑制携带负电荷的柱子配体和RNA之间的相互排斥，促进氢键形成。将盐离子去除以后，恢复柱子配体-RNA之间的负电荷之间的排斥， 摧毁氢键，把RNA洗脱下来。但是，对于某些 mRNA 变体，发现存在非常强的双链 RNA 产品杂质，这需要采用精纯步骤才能分离，因此根据杂质进行层析配制将是获得最终工艺的理想做法。

T7-RNA聚合酶除了转录高效、延伸能力强等优点外，其作为体外RNA合成工具也存在一些不可忽略的缺点。它在合成RNA的过程中可能会产生许多的副产物，包括转录起始过程中产生的寡核苷酸、终止信号造成的中断RNA产物、RdRp活性造成的3’末端延伸产物等。体外合成的RNA产物的部分副产物会导致RNA药物在递送入脊椎动物体内后先天性免疫的激活，这也是当前RNA靶向疗法需解决的关键问题。虽然经过多步纯化能够达到药物使用的要求，但在大规模的生产合成中造成了生产成本的大量增加，纯化流程的增多也不利于RNA药物的稳定性。因而当前开发新的RNA合成工具酶使其维持高效转录并同时降低非特异性转录产物具有非常重要的应用价值。

现有技术中，中国申请专利CN107460177A提供了可利用化学修饰核苷酸的RNA聚合酶突变体，通过将构成野生型T7-RNA聚合酶的氨基酸序列中的632位的精氨酸被半胱氨酸取代的突变体，转录活力提高，并可以修饰2’三磷酸核苷。又例如中国授权专利CN102177236B提供了功能改善的RNA聚合酶突变体，通过将构成野生型T7-RNA聚合酶的氨基酸序列中的786位的谷氨酰胺、179位的赖氨酸以及685位的缬氨酸中的至少1个位置的氨基酸残基被其它氨基酸取代，提高了这种T7-RNA聚合酶突变体的热稳定性和/或比活性。但现有技术不能在维持高效转录的同时，降低IVT产生的副产物。IVT产生的副产物造成了后期纯化工作的复杂性，增加了RNA生产的时间成本和人力成本。

发明内容

要解决的技术问题：本发明的目的是，针对体外合成RNA的过程中产生许多副产物的问题，提供一种能够减少IVT副产物的T7-RNA聚合酶突变体。本发明提供了T7-RNA聚合酶的突变体，可用于体外RNA的生产，与现有的T7-RNA聚合酶存在明显差异，为RNA的研究与应用提供一种有效的候选酶工具。

技术方案：一种生产T7-RNA聚合酶突变体的方法，T7-RNA聚合酶突变体在SEQ IDNO:2所示的序列中进行氨基酸的改变，编码上述序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，具体包括下述步骤：

（a）用不同的氨基酸置换选自Asp240和Asn762的氨基酸，它们从野生型参照的N-端开始编号，且其中所述不同的氨基酸置换选自Asp240Asn和Asn762Trp；

（b）在表达系统中表达核酸分子，其具有编码步骤（a）的T7-RNA聚合酶突变体的核苷酸序列，并从所述表达系统分离表达的T7-RNA聚合酶突变体，由此生产T7-RNA聚合酶突变体。

将突变体基因插入到原核表达载体中，在大肠杆菌中进行蛋白表达，野生型酶作为对照，将纯化后的酶用于体外转录，对RNA产物跑胶验证转录效果。经筛选发现Asp240Asn和Asn762Trp双突变体具有明显的降低非目的转录产物的效果。令人意外的是，Asp240Asn和Asn762Trp双突变体能够基本消除中断RNA转录产物，从转录产物胶图看，条带非常明亮单一，基本看不到中断RNA的产生。而且目标产物浓度高于野生型酶，说明在相同的转录条件和转录时间下，双突变体能更高效的生产RNA。

优选的，所述T7-RNA聚合酶突变体在体外转录中的应用。

优选的，所述T7-RNA聚合酶突变体在编码RNA合成中的应用。

优选的，所述T7-RNA聚合酶突变体在非编码RNA合成中的应用。

优选的，所述的在非编码RNA合成中的应用，其特征在于，所述非编码RNA为microRNA、siRNA、piRNA、rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、SLRNA、SRPRNA、mRNA-like非编码RNA、不带polyA 尾巴的非编码RNA或寡核苷酸。

优选的，所述T7-RNA聚合酶突变体在基因编辑中的应用。

优选的，所述T7-RNA聚合酶突变体在RNA药物合成中的应用。

优选的，所述T7-RNA聚合酶突变体在体内蛋白质表达或无细胞蛋白表达体外翻译系统中的应用。

优选的，所述T7-RNA聚合酶突变体在生物学转录调控元件合成中的应用。

有益效果：

1、本发明的T7-RNA聚合酶突变体不仅能够维持高效转录，还可以有效减少体外转录过程中寡核苷酸、中断RNA产物、3’末端延伸产物等副产物的产生，为RNA的研究与应用提供一种有效的候选酶工具。

2、本发明的T7-RNA聚合酶突变体能够减少RNA药物生产过程中的纯化成本，快速的制备达到使用要求的RNA药物，为RNA药物的大规模生产提供了高效的工具酶。

附图说明

图1为T7-RNA聚合酶突变体与野生型T7-RNA聚合酶转录p19基因的RNA产物电泳图，其中，3、6为T7-RNA突变酶转录产物，1、2、4、5为商品化的T7-RNA聚合酶转录产物。

具体实施方式

本发明描述的实施例仅仅是本发明的部分实施例，并不是全部的实施例。在基于本发明内容所作出的其他实施内容，也属于本发明的保护范围之内。

实施例1

减少IVT副产物的T7-RNA聚合酶突变体的制备方法

T7-RNA聚合酶突变体的表达和纯化

通过分子克隆的方法构建了T7-RNA聚合酶突变体Asp240Asn和Asn762Trp，序列如SEQ ID NO:4所示，编码上述T7-RNA聚合酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。将含有突变体的原核表达载体pTrcHis转化至E.coli BL21表达菌株，挑菌扩大培养，将菌置于含100μg/ml氨苄的LB培养基中，37℃摇床培养3~4小时，OD₆₀₀值接近1.0，然后加入终浓度为0.3mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）于37℃诱导表达3h，随后于4℃、8000rpm离心15min收集菌体，在含有100mMNacl、40mMTris-Hcl（pH=7.5）、1mg/ml溶菌酶、0.5mM DTT的裂解液中重悬菌体，冰上静止1h。

将溶菌酶消化后的菌体进行超声破碎，超声前加入终浓度为100μg/ml的PMSF。超声条件：冰水浴，超声功率200W，工作3秒，间隔5秒，超声时间20min。超声后16000rpm/min高速离心30min，采用0.22μm的针头过滤器过滤上清液，过滤后的上清进行镍柱纯化。

首先利用超过10倍体积的平衡缓冲液（40mM Tris-Hcl（pH7.5），100mM Nacl，0.5mM DTT）平衡镍柱。将过滤后的上清加入平衡好的镍柱，待全部蛋白溶液通过镍柱后，缓慢加入5倍体积的含咪唑浓度为10mM的缓冲液进行洗杂，洗杂后加入100mM浓度的咪唑进行洗脱，收集洗脱液。

将洗脱溶液进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色1h，脱色后观察洗脱蛋白的浓度及纯度。将能够满足下一步实验要求的较为纯净的蛋白加入30kDa的超滤管置换缓冲液。置换缓冲液为40mM的Tris-Hcl（pH=7.9）、100mM的Nacl、1mM的DTT、0.1mM的EDTA和50%的甘油。将置换缓冲液之后的蛋白溶液于-20℃保存备用。

实施例2

转录模板的获取

 转录模板的获取是通过PCR方法扩增实验室已有载体，载体中含有T7启动子和P19 mRNA编码序列（见序列表SEQ ID NO.1），将纯化后的PCR产物作为转录模板，体外转录反应在含有40mMTris-Hcl（pH值=8.0），200nM RNA聚合酶，0.1μL RNA酶抑制剂，0.2μL焦磷酸酶，20ng/μL PCR模板，4mM ATP、GTP、CTP、UTP，12mM Mgcl₂，2mM亚精胺，2mM DTT的20μL体系中进行，37℃孵育2h后，添加1μL DNAaseⅠ于37℃消化模板30min。

聚合酶突变体与野生型T7-RNA聚合酶转录效率的比较

取1μL T7-RNA聚合酶突变体样品添加4μL DEPC水，然后添加5μL 2*RNA上样buffer混合后于80℃加热2min后置于冰上。配置1.5%的琼脂糖凝胶，190 V跑胶20min，进行EB检测，结果如图1所示。T7-RNA聚合酶Asp240Asn和Asn762Trp双突变体具有更高的目的RNA产量，也就是说具有更高的生产效率。

聚合酶突变体与野生型T7-RNA聚合酶转录产物特异性比较

四种野生型T7-RNA聚合酶为自由购买的T7-RNA聚合酶单酶，转录模板的获取和体外转录反应方法同实施例2。转录产物直接在1.5%的琼脂糖凝胶、190 V跑胶20min，进行EB检测，结果如图1所示。结果显示，突变体酶转录产物条带单一，胶图中几乎不可见非目标RNA产物，很大程度上降低了后期纯化的工作量，具有更高的产物特异性。

聚合酶突变体与野生型T7-RNA聚合酶对p19基因的转录过程中产生中断RNA的情况比较

因为被转录完全的目的RNA带有Poly（A+），所以经oligo(dT)纯化回收率的高低可判断目的RNA产物的占比。转录模板的获取和体外转录反应方法同实施例2，上样前RNA产物浓度调至一致。oligo(dT)纯化方法如下：

（1）色谱条件的建立

选用Monomix dT20色谱柱；检测波长为260nm；上样缓冲液为pH7.4的10mM Tris，1mM EDTA，5mM DTT混合液；柱体积V为1.09mL；流速为0.5mL/min；压力为1-3PSI；平衡液为pH7.4的10mM Tris，1mM EDTA，5mM DTT，1.6mM Nacl混合液，3CV；进样量为1mL。

（2）RNA样品处理：0.5ml mRNA样品加入0.5ml 2×上样缓冲液，65℃加热10min，冰浴10min。

（3）洗脱条件

平衡液清洗：4CV；洗脱：流动相为纯净水，室温，8CV；CIP：0.1M NaOH，室温，5CV。

（4）结果分析

野生型T7-RNA聚合酶转录产物经oligo(dT)纯化后回收率一般在65~70%，而T7-RNA聚合酶D240N和N762W双突变体转录产物的回收率可稳定在77%以上，双突变体转录产物经oligo(dT)纯化后回收率明显高于野生型，说明被完全转录的目的RNA产物占比明显高于野生型。 当利用野生型T7-RNA聚合酶转录时，出现非目的产物条带，包括提前中断的RNA产物，而利用Asp240Asn和Asn762Trp双突变体聚合酶进行转录时，条件单一明亮，非目的条带和提前中断的RNA产物在胶图中不可见，可忽略不计。这一结果也反映了Asp240Asn和Asn762Trp双突变体对比野生型酶，能够生产出更高产量和更高纯度的目的RNA。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (9)

1.一种生产T7-RNA聚合酶突变体的方法，其特征在于，包括下述步骤：

（a）用不同的氨基酸置换选自Asp240和Asn762的氨基酸，它们从野生型参照的N-端开始编号，且其中所述不同的氨基酸置换选自Asp240Asn和Asn762Trp；

（b）在表达系统中表达核酸分子，其具有编码步骤（a）的T7-RNA聚合酶突变体的核苷酸序列，并从所述表达系统分离表达的T7-RNA聚合酶突变体，由此生产T7-RNA聚合酶突变体。

2.权利要求1所述T7-RNA聚合酶突变体在体外转录中的应用。

3.权利要求1所述T7-RNA聚合酶突变体在编码RNA合成中的应用。

4.权利要求1所述T7-RNA聚合酶突变体在非编码RNA合成中的应用。

5.权利要求4所述的在非编码RNA合成中的应用，其特征在于，所述非编码RNA为microRNA、siRNA、piRNA、rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、SLRNA、SRPRNA、mRNA-like非编码RNA、不带polyA 尾巴的非编码RNA或寡核苷酸。

6.权利要求1所述T7-RNA聚合酶突变体在基因编辑中的应用。

7.权利要求1所述T7-RNA聚合酶突变体在RNA药物合成中的应用。

8.权利要求1所述T7-RNA聚合酶突变体在体内蛋白质表达或无细胞蛋白表达体外翻译系统中的应用。

9.权利要求1所述T7-RNA聚合酶突变体在生物学转录调控元件合成中的应用。

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