CN114213526A - 一种利用E.coli无细胞蛋白表达系统重组表达人CD20的方法 - Google Patents

一种利用E.coli无细胞蛋白表达系统重组表达人CD20的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用E.coli无细胞蛋白表达系统重组表达人CD20的方法，该方法包括以下步骤：(1)扩增人CD20蛋白的编码DNA；(2)将步骤(1)获得的扩增产物加入到E.coli无细胞蛋白表达系统中进行人CD20蛋白的合成。本发明采用E.coli无细胞蛋白表达系统在细胞外重组表达人CD20蛋白，该人CD20包括全长人CD20及人CD20的同源蛋白(与全长人CD20的氨基酸序列相似度超过30％)，不仅大大缩短了人CD20的生产周期，降低了生产成本，提高了生产效率；而且蛋白表达过程可控性强，人CD20产量可达2mg/mL以上。

Description

一种利用E.coli无细胞蛋白表达系统重组表达人CD20的方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种利用E.coli无细胞蛋白表达系统重组表达人CD20的方法。
背景技术
人CD20是人B淋巴细胞表面特有的蛋白，具有4个跨膜区，表达于前B细胞阶段和成熟B细胞，B细胞分化为浆细胞后便不再表达。研究表明，95％以上的B细胞淋巴瘤均会高表达人CD20，而在正常的造血细胞及其它类型的造血干细胞中均无表达，因此人CD20可作为治疗B细胞淋巴瘤的理想靶点。人CD20还是离子通道蛋白，同时也参与细胞内的络氨酸激酶信号转化途径，与B细胞的活化、增殖、细胞周期信号传导有关。以人CD20为靶向，可以合成和筛选靶向药物，应用到自身免疫性疾病和癌症治疗中，因此快速且低成本的获得全长人CD20的意义重大。
人CD20可通过哺乳动物细胞重组蛋白表达方式方法制备，但全长人CD20很难采用成本更低的大肠杆菌细胞内表达方式获得。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种利用E.coli无细胞蛋白表达系统重组表达人CD20的方法，该方法成本低且产量高。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一种利用E.coli无细胞蛋白表达系统重组表达人CD20的方法，包括以下步骤：
(1)扩增人CD20蛋白的编码DNA；
(2)将步骤(1)获得的扩增产物加入到含有两性分子的E.coli无细胞蛋白表达系统中进行人CD20或其同源蛋白的合成。
本发明采用E.coli无细胞蛋白表达系统在细胞外重组表达人CD20蛋白，该人CD20包括全长人CD20(氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)及人CD20的同源蛋白(与全长人CD20的氨基酸序列相似度超过30％)，不仅大大缩短了人CD20的生产周期，降低了生产成本，提高了生产效率；而且蛋白表达过程可控性强，人CD20产量可达2mg/mL以上。
在上述的利用E.coli无细胞蛋白表达系统重组表达人CD20的方法中，所述的步骤(2)包括：
(a)将步骤(1)获得的扩增产物加入到E.coli无细胞蛋白表达系统中反应2h以上，所述的E.coli无细胞蛋白表达系统中添加有右旋糖苷；
(b)向E.coli无细胞蛋白表达系统中添加右旋糖酐酶，继续反应8-10h。
在反应前期，右旋糖苷加入到E.coli无细胞蛋白表达系统中后会形成大分子拥挤效应，大大提高蛋白表达量；而在反应后期，向E.coli无细胞蛋白表达系统中添加右旋糖酐酶则有利于降解右旋糖苷以获得葡萄糖，而在E.coli无细胞蛋白表达系统原有酶系的作用下，葡萄糖产生ATP为蛋白转录供能，从而进一步提高人CD20蛋白表达量。
在上述的利用E.coli无细胞蛋白表达系统重组表达人CD20的方法中，所述的E.coli无细胞蛋白表达系统包括外管和置于外管内的透析管，所述的外管内装有反应外液，所述的透析管内装有无细胞反应液；
所述的反应外液和无细胞反应液的体积比大于3：1；
所述的右旋糖苷和两性分子添加到无细胞反应液中，所述的右旋糖酐酶添加到反应外液中。
试验表明，在上述的反应外液和无细胞反应液的体积比下，人CD20蛋白表达量最高。将右旋糖苷添加到无细胞反应液中则便于将编码DNA束缚在无细胞反应液中(而不是在溶液中自由扩散)，将右旋糖酐酶添加到反应外液中则右旋糖酐酶可逐渐渗透至无细胞反应液中降解右旋糖苷。
在上述的利用E.coli无细胞蛋白表达系统重组表达人CD20的方法中，所述的右旋糖苷的重均分子量为20000～30000KDa，所述的右旋糖苷的添加量为1-10μg/60μL无细胞反应液；
所述的两性分子包括表面活性剂，纳米盘，去垢剂和磷脂中的至少一种，所述的两性分子的添加量为0.1-2％。
在上述的利用E.coli无细胞蛋白表达系统重组表达人CD20的方法中，所述的右旋糖酐酶的添加量为2×10-5-4×10-5国际单位/μL反应外液。
在上述的利用E.coli无细胞蛋白表达系统重组表达人CD20的方法中，所述的反应外液中还添加有2-羟基-N,N,N-三甲基乙铵四氟硼酸盐，2-羟基-N,N,N-三甲基乙铵四氟硼酸盐的添加量为1-5μL/60μL反应外液。试验发现，2-羟基-N,N,N-三甲基乙铵四氟硼酸盐添加后无细胞反应系统中葡萄糖的含量显著提高，提示2-羟基-N,N,N-三甲基乙铵四氟硼酸盐可能起到催化剂作用，可促进右旋糖酐酶对右旋糖苷的降解。
在上述的利用E.coli无细胞蛋白表达系统重组表达人CD20的方法中，所述的无细胞反应液中添加有核糖体，核糖体在无细胞反应液中的终浓度为≥1nM。mRNA翻译为蛋白质的过程就是发生在核糖体内的，因此提高E.coli无细胞蛋白表达系统中核糖体的浓度有利于促进mRNA翻译为人CD20。
在上述的利用E.coli无细胞蛋白表达系统重组表达人CD20的方法中，步骤(a)中将扩增产物分次加入到无细胞反应液中，每次加入≥2μL，两次之间间隔≥1h，总添加量为≥5μL/60μL无细胞反应液；
所述的无细胞反应液中还添加有人CD20蛋白的mRNA，mRNA的的添加量为≥2μL/60μL无细胞反应液。
试验发现，与一次性将扩增产物添加到无细胞反应液中相比，分次添加扩增产物时获得的人CD20蛋白产量更高；而由于扩增产物是DNA序列，添加到无细胞反应液中后需要先转录成mRNA再翻译成蛋白质；额外添加人CD20蛋白的mRNA后可以提前启动蛋白翻译程序，进一步提高人CD20蛋白产量。
在上述的利用E.coli无细胞蛋白表达系统重组表达人CD20的方法的步骤(1)中，采用如下引物对扩增人CD20蛋白的编码DNA进行扩增：
上游引物：
5'-AATACGACTCACTATAGGGGAACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAAAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATATATAATGACAACACCCAGAAATTCAG-3'；
下游引物：
5'-AAAAAAAAAAAAAATTAAGGAGAGCTGTCATTTTCTATTGG-3'；
所述的E.coli无细胞蛋白表达系统中添加有T7 RNA聚合酶。
本发明在上游引物的5'端添加了T7启动子序列，在E.coli无细胞蛋白表达系统中添加T7 RNA聚合酶，也有利于提高人CD20蛋白的产量。
在上述的利用E.coli无细胞蛋白表达系统重组表达人CD20的方法的步骤(2)中，将E.coli无细胞蛋白表达系统置于20-37℃℃下进行人CD20蛋白的合成。实验发现，在30℃下反应可以获得较高的人CD20产量，提高反应温度对人CD20产量的增加无影响；同时30-40℃也是本发明选用的右旋糖酐酶的最适温度。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
(1)本发明采用E.coli无细胞蛋白表达系统在细胞外重组表达人CD20蛋白，该人CD20包括全长人CD20(氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)或截断人CD20(氨基酸序列如SEQID No.2所示)或人CD20的同源蛋白(与全长人CD20或截断人CD20的氨基酸序列相似度超过30％)，不仅大大缩短了人CD20的生产周期，降低了生产成本，提高了生产效率；而且蛋白表达过程可控性强，人CD20产量可达2mg/mL以上。
(2)本发明中，在反应前期，右旋糖苷加入到E.coli无细胞蛋白表达系统中后会形成大分子拥挤效应，大大提高蛋白表达量；而在反应后期，向E.coli无细胞蛋白表达系统中添加右旋糖酐酶则有利于降解右旋糖苷以获得葡萄糖，而在E.coli无细胞蛋白表达系统原有酶系的作用下，葡萄糖产生ATP为蛋白转录供能，从而进一步提高人CD20蛋白表达量。
(3)本发明中，反应外液中还添加有2-羟基-N,N,N-三甲基乙铵四氟硼酸盐，2-羟基-N,N,N-三甲基乙铵四氟硼酸盐添加后无细胞反应系统中葡萄糖的含量显著提高，提示2-羟基-N,N,N-三甲基乙铵四氟硼酸盐可能起到催化剂作用，可促进右旋糖酐酶对右旋糖苷的降解。
(4)本发明中，无细胞反应液中添加有核糖体，mRNA翻译为蛋白质的过程就是发生在核糖体内的，因此提高E.coli无细胞蛋白表达系统中核糖体的浓度有利于促进mRNA翻译为人CD20。
(5)本发明中，将扩增产物分次加入到无细胞反应液中，同时无细胞反应液中还添加有mRNA；与一次性将扩增产物添加到无细胞反应液中相比，分次添加扩增产物时获得的人CD20蛋白产量更高；而由于扩增产物是DNA序列，添加到无细胞反应液中后需要先转录成mRNA再翻译成蛋白质；额外添加人CD20蛋白的mRNA后可以提前启动蛋白翻译程序，进一步提高人CD20蛋白产量。
(6)本发明中，将E.coli无细胞蛋白表达系统置于30～40℃下进行人CD20蛋白的合成，在30℃下反应可以获得较高的人CD20产量，提高反应温度对人CD20产量的增加无影响；同时30-40℃也是本发明选用的右旋糖酐酶的最适温度。
附图说明
图1为E.coli无细胞蛋白表达系统中反应外液与无细胞反应液体积比对人CD20产量的影响；
其中，外液表示E.coli无细胞蛋白表达系统的反应外液，内液表示E.coli无细胞蛋白表达系统的无细胞反应液，M表示Marker蛋白质标准，下同；
图2为不同卵磷脂对人CD20产量的促溶效果比对；
图3为不同反应温度、PCR产物添加量和T7 RNA聚合酶对人CD20产量的影响；
其中，T7 pol表示T7 RNA聚合酶；
图4为PCR产物的添加方式对人CD20产量的影响；
图5为E.coli无细胞蛋白表达系统的无细胞反应液中核糖体浓度对人CD20产量的影响；
图6为E.coli无细胞蛋白表达系统的无细胞反应液中右旋糖苷的添加量对人CD20产量的影响；
图7为E.coli无细胞蛋白表达系统的反应外液中右旋糖酐酶对人CD20产量的影响；
图8为E.coli无细胞蛋白表达系统的反应外液中2-羟基-N,N,N-三甲基乙铵四氟硼酸盐的添加对人CD20产量的影响。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案做进一步详细说明。
实施例1
本实施例一种利用E.coli无细胞蛋白表达系统重组表达截断人CD20(氨基酸序列如SEQ ID No.2所示)的方法，包括以下步骤：
(1)扩增截断人CD20蛋白的编码DNA；
具体地，先根据GenBank获得截断人CD20编码DNA的核苷酸序列(如SEQ ID No.3所示)，使用Primer3 plus设计特异性引物，如下：
上游引物(如SEQ ID No.4所示)：5'-AATACGACTCACTATAGGGGAACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAAAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATAT ATATAATGACAACACCCAGAAATTCAG-3'；
下游引物(如SEQ ID No.5所示)：5'-AAAAAAAAAAAAAATTATTGGGTAGATGGGGAGTTTTTCTC-3'；
而后提取人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)总RNA，反转录得到cDNA，以此为模板，采用上述引物进行PCR扩增，PCR产物经验证正确后，置于4℃下保存备用；
(2)将步骤(1)获得的扩增产物加入到E.coli无细胞蛋白表达系统中进行CD20蛋白的合成；
本实施例中，E.coli无细胞蛋白表达系统包括外管和置于外管内的透析管，外管内装有反应外液(购自杭州谨澳生物科技有限公司)，透析管内装有无细胞反应液；其中，无细胞反应液由17.5μL反应内液(购自杭州谨澳生物科技有限公司)、10μL E.coli破碎液(购自杭州谨澳生物科技有限公司)、15μL PCR产物、10μL mRNA和7.5μL ddH2O组成，总体积60μL；
设置五个E.coli无细胞蛋白表达系统，各系统中透析管内的无细胞反应液的组成和体积均相同，但外管中依次设置为：无反应外液、10倍体积的反应外液(即反应外液的体积是无细胞反应液的10倍)、20倍体积的反应外液、40倍体积的反应外液和80倍体积的反应外液；将各E.coli无细胞蛋白表达系统置于30℃下恒温、静置孵育15h后取出，各取5μL的总蛋白跑SDS-PAGE，同时将总蛋白置于15000rpm，4℃下离心后获得的上清5μL也跑SDS-PAGE，结果见图1所示。
由图1可见，反应外液体积对透析式无细胞蛋白表达系统表达蛋白有一定的影响，即外液体积越多，表达的人CD20蛋白越多，且表达系统中无需添加卵磷脂，所表达的截断人CD20蛋白本身即为可溶蛋白。
实施例2
本实施例一种利用E.coli无细胞蛋白表达系统重组表达全长人CD20(氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)的方法，包括以下步骤：
(1)扩增全长人CD20蛋白的编码DNA；
具体地，先根据GenBank获得全长人CD20编码DNA的核苷酸序列(如SEQ ID No.6所示)，使用Primer3 plus设计特异性引物，如下：
上游引物(如SEQ ID No.7所示)：
5'-AATACGACTCACTATAGGGGAACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAAAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATATATAATGACAACACCCAGAAATTCAG-3'；
下游引物(如SEQ ID No.8所示)：
5'-AAAAAAAAAAAAAATTAAGGAGAGCTGTCATTTTCTATTGG-3'；
而后提取人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)总RNA，反转录得到cDNA，以此为模板，采用上述引物进行PCR扩增，PCR产物经验证正确后，置于4℃下保存备用；
(2)将步骤(1)获得的扩增产物加入到E.coli无细胞蛋白表达系统中进行人CD20蛋白的合成；
本实施例中，E.coli无细胞蛋白表达系统包括外管和置于外管内的透析管，外管内装有480μL反应外液(购自杭州谨澳生物科技有限公司)，透析管内装有无细胞反应液；其中，无细胞反应液由17.5μL反应内液(购自杭州谨澳生物科技有限公司)、10μL E.coli破碎液(购自杭州谨澳生物科技有限公司)、15μL PCR产物、10μL mRNA、2.5μL卵磷脂和5μLddH2O组成，总体积60μL；
设置三个E.coli无细胞蛋白表达系统，各系统中采用的卵磷脂分别为S3、S4和S5；将各E.coli无细胞蛋白表达系统置于30℃下恒温、静置孵育15h后取出，各取5μL的总蛋白跑SDS-PAGE，同时将总蛋白置于15000rpm，4℃下离心后获得的上清5μL也跑SDS-PAGE，结果见图1所示。
由图2可见，S3卵磷脂对全长人CD20的促溶效果最好，因此选择S3卵磷脂作为促溶剂。
实施例3
本实施例一种利用E.coli无细胞蛋白表达系统重组表达全长人CD20(氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)的方法，与实施例2基本相同，不同之处在于：将E.coli无细胞蛋白表达系统置于37℃下反应；而后分别取总蛋白和上清蛋白跑SDS-PAGE，结果见图3。
由图3可见，与30℃下反应相比，在37℃下，S3卵磷脂的促溶作用并没有任何增强，二者的全长人CD20的产量相当；因此仍然选择在30℃下反应。
实施例4
本实施例一种利用E.coli无细胞蛋白表达系统重组表达全长人CD20(氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)的方法，与实施例2基本相同，不同之处在于：无细胞反应液中，PCR产物的添加量调整为20μL；反应后分别取总蛋白和上清蛋白跑SDS-PAGE，结果见图3。
由图3可见，增加PCR产物的用量后，人CD20的产量并没有显著提高；因此将PCR产物的添加量仍然定为15μL。
实施例5
本实施例一种利用E.coli无细胞蛋白表达系统重组表达全长人CD20(氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)的方法，与实施例2基本相同，不同之处在于：无细胞反应液中额外添加1μL的T7 RNA聚合酶(购自杭州谨澳生物科技有限公司)；反应后分别取总蛋白和上清蛋白跑SDS-PAGE，结果见图3。
由图3可见，增加T7 RNA聚合酶的用量后，人CD20的产量有所提高；因此将无细胞反应液的组成优化为：
由17.5μL反应内液、10μL E.coli破碎液、15μL PCR产物、10μL mRNA、2.5μL S3卵磷脂、1μL T7 RNA聚合酶和4μL ddH2O组成，总体积60μL。
实施例6
本实施例一种利用E.coli无细胞蛋白表达系统重组表达全长人CD20(氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)的方法，与实施例5基本相同，不同之处在于：将15μL PCR产物分次加入无细胞反应液中，每次添加2μL，两次之间间隔1小时；反应后分别取总蛋白和上清蛋白跑SDS-PAGE，结果见图4。
由图4可见，与一次性加入PCR产物相比，逐次加入PCR产物时获得的人CD20的产量更高。
实施例7
本实施例一种利用E.coli无细胞蛋白表达系统重组表达全长人CD20(氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)的方法，与实施例6基本相同，不同之处在于：分别向各E.coli无细胞蛋白表达系统的无细胞反应液中额外添加核糖体，使无细胞反应液中核糖体的终浓度依次为10nM、20nM和40nM；反应后分别取总蛋白的上清跑SDS-PAGE，结果见图5。
由图5可见，与未额外添加核糖体相比，添加核糖体后，表达细胞的人CD20产量显著提高。因此，将无细胞反应液的组成优化为：
由17.5μL反应内液、10μL E.coli破碎液、15μL PCR产物、10μL mRNA、2.5μL S3卵磷脂、1μL T7 RNA聚合酶、核糖体(终浓度20nM)和4μL ddH2O组成，总体积60μL；在此条件下，上清中人CD20的产量可达2mg/mL。
实施例8
本实施例一种利用E.coli无细胞蛋白表达系统重组表达全长人CD20(氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)的方法，与实施例7基本相同，不同之处在于：无细胞反应液中额外添加有右旋糖苷(重均分子量为20000KDa)。
设置五个平行试验组，各试验组中右旋糖苷的添加量依次为1μg、3μg、5μg、8μg和10μg；反应后分别取总蛋白的上清跑SDS-PAGE，结果见图6。
由图6可见，与未添加右旋糖苷时相比，添加右旋糖苷后，人CD20产量显著提高，其中右旋糖苷最优的添加量为8μg。这是因为右旋糖苷加入到无细胞反应液中后会形成大分子拥挤效应，从而大大提高蛋白表达量；上清中人CD20的产量可达2.5mg/mL。
实施例9
本实施例一种利用E.coli无细胞蛋白表达系统重组表达全长人CD20(氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)的方法，与实施例8基本相同，不同之处在于：步骤(2)包括：
(a)将步骤(1)获得的扩增产物加入到无细胞反应液中反应5h；
无细胞反应液中额外添加有8μg右旋糖苷(重均分子量为20000KDa)；
(b)向无细胞反应液中添加1.8×10-3国际单位的右旋糖酐酶(购买自杭州谨澳生物科技有限公司，适宜温度30-40℃)，继续反应10h；
同时设置对照组，对照组中，右旋糖酐酶从反应起始时即添加到反应外液中。
反应后分别取总蛋白的上清跑SDS-PAGE，结果见图7。
由图7可见，与未添加右旋糖酐酶相比，添加右旋糖酐酶后，人CD20产量显著提高；这是因为在反应后期添加右旋糖酐酶有利于降解右旋糖苷以获得葡萄糖，在E.coli无细胞蛋白表达系统原有酶系的作用下，葡萄糖产生ATP为蛋白转录供能，从而进一步提高人CD20蛋白表达量；上清中人CD20的产量可达3mg/mL。
与从反应起始时即添加右旋糖酐酶相比，在反应后期添加右旋糖酐酶时人CD20产量更高。可能是因为过早添加右旋糖酐酶不利于右旋糖苷发挥应有的大分子拥挤效应。
实施例10
本实施例一种利用E.coli无细胞蛋白表达系统重组表达全长人CD20(氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)的方法，与实施例9基本相同，不同之处在于：反应外液中添加有2-羟基-N,N,N-三甲基乙铵四氟硼酸盐，2-羟基-N,N,N-三甲基乙铵四氟硼酸盐(CAS：152218-75-2)的添加量依次设置为1μL、3μL和5μL；反应后分别取总蛋白的上清跑SDS-PAGE，结果见图8。
由图8可见，与未添加2-羟基-N,N,N-三甲基乙铵四氟硼酸盐时相比，添加2-羟基-N,N,N-三甲基乙铵四氟硼酸盐后，人CD20产量显著提高，上清中人CD20的产量可达3.4mg/mL；其中右旋糖苷最优的添加量为3μL。2-羟基-N,N,N-三甲基乙铵四氟硼酸盐可能起到催化剂作用，可促进右旋糖酐酶对右旋糖苷的降解，从而更快地产生ATP为蛋白翻译功能。
序列表
<110> 杭州迅耀生物科技有限公司
<120> 一种利用E.coli无细胞蛋白表达系统重组表达人CD20的方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 297
<212> PRT
<213> 人(human)
<400> 1
Met Thr Thr Pro Arg Asn Ser Val Asn Gly Thr Phe Pro Ala Glu Pro
1 5 10 15
Met Lys Gly Pro Ile Ala Met Gln Ser Gly Pro Lys Pro Leu Phe Arg
20 25 30
Arg Met Ser Ser Leu Val Gly Pro Thr Gln Ser Phe Phe Met Arg Glu
35 40 45
Ser Lys Thr Leu Gly Ala Val Gln Ile Met Asn Gly Leu Phe His Ile
50 55 60
Ala Leu Gly Gly Leu Leu Met Ile Pro Ala Gly Ile Tyr Ala Pro Ile
65 70 75 80
Cys Val Thr Val Trp Tyr Pro Leu Trp Gly Gly Ile Met Tyr Ile Ile
85 90 95
Ser Gly Ser Leu Leu Ala Ala Thr Glu Lys Asn Ser Arg Lys Cys Leu
100 105 110
Val Lys Gly Lys Met Ile Met Asn Ser Leu Ser Leu Phe Ala Ala Ile
115 120 125
Ser Gly Met Ile Leu Ser Ile Met Asp Ile Leu Asn Ile Lys Ile Ser
130 135 140
His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro
145 150 155 160
Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn
165 170 175
Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Ser Leu Phe Leu Gly
180 185 190
Ile Leu Ser Val Met Leu Ile Phe Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val Ile
195 200 205
Ala Gly Ile Val Glu Asn Glu Trp Lys Arg Thr Cys Ser Arg Pro Lys
210 215 220
Ser Asn Ile Val Leu Leu Ser Ala Glu Glu Lys Lys Glu Gln Thr Ile
225 230 235 240
Glu Ile Lys Glu Glu Val Val Gly Leu Thr Glu Thr Ser Ser Gln Pro
245 250 255
Lys Asn Glu Glu Asp Ile Glu Ile Ile Pro Ile Gln Glu Glu Glu Glu
260 265 270
Glu Glu Thr Glu Thr Asn Phe Pro Glu Pro Pro Gln Asp Gln Glu Ser
275 280 285
Ser Pro Ile Glu Asn Asp Ser Ser Pro
290 295
<210> 2
<211> 181
<212> PRT
<213> 人(human)
<400> 2
Met Thr Thr Pro Arg Asn Ser Val Asn Gly Thr Phe Pro Ala Glu Pro
1 5 10 15
Met Lys Gly Pro Ile Ala Met Gln Ser Gly Pro Lys Pro Leu Phe Arg
20 25 30
Arg Met Ser Ser Leu Val Gly Pro Thr Gln Ser Phe Phe Met Arg Glu
35 40 45
Ser Lys Thr Leu Gly Ala Val Gln Ile Met Asn Gly Leu Phe His Ile
50 55 60
Ala Leu Gly Gly Leu Leu Met Ile Pro Ala Gly Ile Tyr Ala Pro Ile
65 70 75 80
Cys Val Thr Val Trp Tyr Pro Leu Trp Gly Gly Ile Met Tyr Ile Ile
85 90 95
Ser Gly Ser Leu Leu Ala Ala Thr Glu Lys Asn Ser Arg Lys Cys Leu
100 105 110
Val Lys Gly Lys Met Ile Met Asn Ser Leu Ser Leu Phe Ala Ala Ile
115 120 125
Ser Gly Met Ile Leu Ser Ile Met Asp Ile Leu Asn Ile Lys Ile Ser
130 135 140
His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro
145 150 155 160
Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn
165 170 175
Ser Pro Ser Thr Gln
180
<210> 3
<211> 543
<212> DNA
<213> 人(human)
<400> 3
atgacaacac ccagaaattc agtaaatggg actttcccgg cagagccaat gaaaggccct 60
attgctatgc aatctggtcc aaaaccactc ttcaggagga tgtcttcact ggtgggcccc 120
acgcaaagct tcttcatgag ggaatctaag actttggggg ctgtccagat tatgaatggg 180
ctcttccaca ttgccctggg gggtcttctg atgatcccag cagggatcta tgcacccatc 240
tgtgtgactg tgtggtaccc tctctgggga ggcattatgt atattatttc cggatcactc 300
ctggcagcaa cggagaaaaa ctccaggaag tgtttggtca aaggaaaaat gataatgaat 360
tcattgagcc tctttgctgc catttctgga atgattcttt caatcatgga catacttaat 420
attaaaattt cccatttttt aaaaatggag agtctgaatt ttattagagc tcacacacca 480
tatattaaca tatacaactg tgaaccagct aatccctctg agaaaaactc cccatctacc 540
caa 543
<210> 4
<211> 104
<212> DNA
<213> 人工合成序列(Unknown)
<400> 4
aatacgactc actatagggg aaccacaacg gtttccctct agaaataaaa ttttgtttaa 60
ctttaagaag gagatatata taatgacaac acccagaaat tcag 104
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工合成序列(Unknown)
<400> 5
aaaaaaaaaa aaaattattg ggtagatggg gagtttttct c 41
<210> 6
<211> 894
<212> DNA
<213> 人(human)
<400> 6
atgacaacac ccagaaattc agtaaatggg actttcccgg cagagccaat gaaaggccct 60
attgctatgc aatctggtcc aaaaccactc ttcaggagga tgtcttcact ggtgggcccc 120
acgcaaagct tcttcatgag ggaatctaag actttggggg ctgtccagat tatgaatggg 180
ctcttccaca ttgccctggg gggtcttctg atgatcccag cagggatcta tgcacccatc 240
tgtgtgactg tgtggtaccc tctctgggga ggcattatgt atattatttc cggatcactc 300
ctggcagcaa cggagaaaaa ctccaggaag tgtttggtca aaggaaaaat gataatgaat 360
tcattgagcc tctttgctgc catttctgga atgattcttt caatcatgga catacttaat 420
attaaaattt cccatttttt aaaaatggag agtctgaatt ttattagagc tcacacacca 480
tatattaaca tatacaactg tgaaccagct aatccctctg agaaaaactc cccatctacc 540
caatactgtt acagcataca atctctgttc ttgggcattt tgtcagtgat gctgatcttt 600
gccttcttcc aggaacttgt aatagctggc atcgttgaga atgaatggaa aagaacgtgc 660
tccagaccca aatctaacat agttctcctg tcagcagaag aaaaaaaaga acagactatt 720
gaaataaaag aagaagtggt tgggctaact gaaacatctt cccaaccaaa gaatgaagaa 780
gacattgaaa ttattccaat ccaagaagag gaagaagaag aaacagagac gaactttcca 840
gaacctcccc aagatcagga atcctcacca atagaaaatg acagctctcc ttaa 894
<210> 7
<211> 104
<212> DNA
<213> 人工合成序列(Unknown)
<400> 7
aatacgactc actatagggg aaccacaacg gtttccctct agaaataaaa ttttgtttaa 60
ctttaagaag gagatatata taatgacaac acccagaaat tcag 104
<210> 8
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工合成序列(Unknown)
<400> 8
aaaaaaaaaa aaaattaagg agagctgtca ttttctattg g 41

Claims (10)

1.一种利用E.coli无细胞蛋白表达系统重组表达人CD20的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)扩增人CD20蛋白的编码DNA；
(2)将步骤(1)获得的扩增产物加入到含有两性分子的E.coli无细胞蛋白表达系统中进行人CD20或其同源蛋白的合成。
2.如权利要求1所述的利用E.coli无细胞蛋白表达系统重组表达人CD20的方法，其特征在于，所述的步骤(2)包括：
(a)将步骤(1)获得的扩增产物加入到E.coli无细胞蛋白表达系统中反应2小时以上，所述的E.coli无细胞蛋白表达系统中添加有右旋糖苷；
(b)向E.coli无细胞蛋白表达系统中添加右旋糖酐酶，继续反应8-10h。
3.如权利要求2所述的利用E.coli无细胞蛋白表达系统重组表达人CD20的方法，其特征在于，所述的E.coli无细胞蛋白表达系统包括外管和置于外管内的透析管，所述的外管内装有反应外液，所述的透析管内装有无细胞反应液；
所述的反应外液和无细胞反应液的体积比大于3：1；
所述的右旋糖苷和两性分子添加到无细胞反应液中，所述的右旋糖酐酶添加到反应外液中。
4.如权利要求3所述的利用E.coli无细胞蛋白表达系统重组表达人CD20的方法，其特征在于，所述的右旋糖苷的重均分子量为20000～30000KDa，所述的右旋糖苷的添加量为1-10μg/60μL无细胞反应液；
所述的两性分子包括表面活性剂，纳米盘，去垢剂和磷脂中的至少一种，所述的两性分子的添加量为0.1-2％。
5.如权利要求3所述的利用E.coli无细胞蛋白表达系统重组表达人CD20的方法，其特征在于，所述的右旋糖酐酶的添加量为2×10-5-4×10-5国际单位/μL反应外液。
6.如权利要求3所述的利用E.coli无细胞蛋白表达系统重组表达人CD20的方法，其特征在于，所述的反应外液中还添加有2-羟基-N,N,N-三甲基乙铵四氟硼酸盐，2-羟基-N,N,N-三甲基乙铵四氟硼酸盐的添加量为1-5μL/60μL反应外液。
7.如权利要求3所述的利用E.coli无细胞蛋白表达系统重组表达人CD20的方法，其特征在于，所述的无细胞反应液中添加有核糖体，核糖体在无细胞反应液中的终浓度为≥1nM。
8.如权利要求3所述的利用E.coli无细胞蛋白表达系统重组表达人CD20的方法，其特征在于，步骤(a)中将扩增产物分次加入到无细胞反应液中，每次加入≥2μL，两次之间间隔≥1h，总添加量为≥5μL/60μL无细胞反应液；
所述的无细胞反应液中还添加有人CD20蛋白的mRNA，mRNA的的添加量为≥2μL/60μL无细胞反应液。
9.如权利要求1-8中任意一项所述的利用E.coli无细胞蛋白表达系统重组表达人CD20的方法，其特征在于，步骤(1)中，采用如下引物对扩增人CD20蛋白的编码DNA进行扩增：
上游引物：
5'-AATACGACTCACTATAGGGGAACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAAAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATATATAATGACAACACCCAGAAATTCAG-3'；
下游引物：
5'-AAAAAAAAAAAAAATTAAGGAGAGCTGTCATTTTCTATTGG-3'；
所述的E.coli无细胞蛋白表达系统中添加有T7 RNA聚合酶。
10.如权利要求1-8中任意一项所述的利用E.coli无细胞蛋白表达系统重组表达人CD20的方法，其特征在于，步骤(2)中，将E.coli无细胞蛋白表达系统置于20～37℃下进行人CD20蛋白的合成。
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