TW202317203A

TW202317203A - 用於抗病毒及抗癌疫苗之新穎ｍＲＮＡ組合物及產生方法

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Publication number: TW202317203A
Application number: TW111121694A
Authority: TW
Inventors: 希龍林; 沈家寧; 羿秀林; 陳守坤; 吳堂熙; 王梅榮
Original assignee: 美洛生物科技股份有限公司; 中央研究院
Priority date: 2021-06-12
Filing date: 2022-06-10
Publication date: 2023-05-01
Also published as: JP2023002469A; US20220396798A1

Abstract

本發明大體上係關於一種適用於研發且製造基於RNA之抗病毒及/或抗癌疫苗及藥物的新穎mRNA組合物及其產生方法。由此獲得之mRNA不僅用於製造預防性疫苗及/或藥物且亦用於製造治療性疫苗及/或藥物。本發明包括兩種類型之mRNA構築體，即分別為「5'-髮夾信使RNA (5hmRNA)」及「信使-髮夾-信使RNA (mhmRNA)」。簡言之，5hmRNA及mhmRNA兩者含有至少髮夾樣莖環RNA結構。該5hmRNA含有蛋白質/肽編碼mRNA之5'-UTR中之至少莖環RNA結構，而該mhmRNA含有在兩側上側接有兩個蛋白質/肽編碼mRNA序列之中間莖環結構。在mhmRNA中，第一個5'-mRNA較佳編碼RNA複製酶，諸如病毒RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)，以用於在經轉染細胞中擴增第二個3'-mRNA。在轉染至目標細胞中之後，5hmRNA及mhmRNA兩者可進一步轉譯成至少期望蛋白質/肽以用於誘發預先設計之期望生物效應或細胞功能，包括(但不限於)誘導特異性免疫反應、預防病毒感染、抑制病毒複製、抑制病毒組裝及/或抑制腫瘤/癌細胞生長以及引起癌細胞死亡。為產生高度結構化5hmRNA及mhmRNA，已研發出一種新穎PCR-IVT方法且與特別設計之RNA聚合酶-解旋酶混合物活性一起使用。

Description

用於抗病毒及抗癌疫苗之新穎mRNA組合物及產生方法

優先權 ：本發明主張2021年6月12日申請之標題為「Novel mRNA Composition and Production for Use in Anti-Viral and Anti-Cancer Vaccines」的美國臨時專利申請案第63/209,969號之優先權。本發明亦主張2021年6月15日申請之美國臨時專利申請案第63/210,988號、2021年6月22日申請之第63/213,258號及2021年7月16日申請之第63/222,666號之優先權，該等申請案均標題為「Novel mRNA Composition and Production Method for Use in Anti-Viral and Anti-Cancer Vaccines」。

本發明大體上係關於一種適用於研發且製造基於RNA之抗病毒及/或抗癌疫苗及藥物的新穎mRNA組合物及其產生方法。由此獲得之mRNA不僅用於產生預防性疫苗及/或藥物且亦用於產生治療性疫苗及/或藥物。本發明包括兩種類型之相關mRNA構築體，即分別為「5'-髮夾信使RNA (5hmRNA)」及「信使-髮夾-信使RNA (mhmRNA)」。簡言之，5hmRNA及mhmRNA兩者含有至少髮夾樣莖環結構(亦即完美地或不完美匹配之單個或多個髮夾RNA)。該5hmRNA含有蛋白質/肽編碼mRNA之5'-非轉譯區(5'-UTR)中之至少莖環RNA結構，而該mhmRNA含有在兩側上側接有兩個蛋白質/肽編碼mRNA序列之中間莖環RNA結構。在mhmRNA中，第一個5'-mRNA較佳編碼RNA複製酶，諸如病毒RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)，以用於在經轉染細胞中擴增第二個3'-mRNA。在轉染至目標細胞中之後，5hmRNA及mhmRNA兩者可進一步轉譯成至少期望蛋白質/肽以用於誘發預先設計之期望生物效應或細胞功能，包括(但不限於)誘導特異性免疫反應、預防病毒感染、抑制病毒複製、抑制病毒組裝及/或抑制腫瘤/癌細胞生長以及引起癌細胞死亡。為產生高度結構化5hmRNA及mhmRNA，已研發出一種新穎PCR-IVT方法且與特別設計之RNA聚合酶-解旋酶混合物活性一起使用。

聚合酶鏈反應 - 活體外轉錄 (PCR-IVT)方法已廣泛用於有義信使RNA (mRNA)及反義RNA (aRNA)產生持續二十年以上(圖1)。然而，IVT反應仍不適用於產生髮夾樣RNA，因為髮夾樣莖環結構為原核RNA聚合酶之內在轉錄終止之信號(McDowell等人, Science266:822-825, 1994)。因此，使用原核生物相關RNA聚合酶之先前PCR-IVT方法無法克服髮夾樣RNA產生之低效率問題。

PCR-IVT方法產生mRNA及/或RNA-DNA雜交體之組合用途首先由Lin等人報導(Lin之美國專利第7,662,791號、第8,080,652號、第8,372,969號及第8,609,831號)。如圖1中所示，Lin之方法首先使用PCR及/或反轉錄(RT)將特異性RNA啟動子引子併入所得PCR產物中以便產生用於IVT之啟動子驅動之DNA模板。接著，進行IVT反應以自DNA模板產生且擴增期望RNA分子(Lin等人, Methods Mol Biol.221:93-101, 2003)。接著，可進行選擇性之RT反應以產生RNA-DNA雜交體，其中DNA部分保護期望RNA (亦即mRNA)免於降解。在DNA保護下，RNA-DNA雜交體可經受進一步mRNA修飾，諸如將5'端帽及/或3'聚(A)尾添加至期望RNA/mRNA ((Lin SL, Methods Mol Biol.221:289-293, 2003)。此後，使用無RNA酶之DNA酶消化移除DNA部分，且經修改之RNA/mRNA可與遞送劑一起調配且接著轉染至目標細胞中以用於產生期望蛋白質/肽。替代地，期望RNA可轉染至細胞中以產生用於沉默特異性目標基因之piwi相互作用RNA (piRNA) (Lin之美國專利第8,372,969號及第8,609,831號)。然而，儘管Lin之方法已成功地用於產生mRNA及piRNA以用於誘發至少特異性生物及細胞效應，但此等mRNA及piRNA不為髮夾樣或含髮夾之RNA。因此，Lin之先前PCR-IVT方法並未揭示克服活體外髮夾樣RNA產生之低效率問題的有效方式。

傳統的mRNA產生方法很大程度上基於Lin之PCR-IVT概念及方法之部分或全部(Lin之美國專利第7,662,791號、第8,080,652號、第8,372,969號及第8,609,831號)。顯然，其為所屬技術領域中具有通常知識者容易預先考慮使用Lin之方法以活體外產生mRNA及/或mRNA-cDNA雜交序列之部分或全部。值得注意地，已使用Lin之概念及方法設計及研發一些商業半自動或全自動IVT裝置。然而，此等先前mRNA產生方法及裝置仍未提供克服髮夾樣RNA產生問題之任何有效解決方案。為解決此問題，由Lin等人研發出另一種在原核生物(亦即細菌)中使用質體驅動之RNA表現的方法(Lin之美國專利第9,637,747號及第9,783,811號)。此等原核生物產生之mRNA可含有多個髮夾樣莖環結構。在此方法中，將化學轉錄誘導劑添加至原核細胞培養基中以克服由髮夾RNA引起之內在轉錄終止之問題(McDowell等人, Science266:822-825, 1994)，從而引起髮夾樣RNA產量顯著增加。然而，此質體驅動之RNA表現方法需要原核細胞且限於原核生物中。

所屬技術領域中具有通常知識者預先考慮活體外產生髮夾樣或含髮夾之mRNA以用於疫苗/藥物產生為不合理的，因為廣泛已知髮夾樣RNA結構不僅阻礙mRNA轉錄且亦可干擾某些mRNA加工，諸如5'封端及修飾。在傳統概念中，髮夾樣結構在mRNA中之存在甚至可能阻礙蛋白質自mRNA轉譯。因此，高度結構化RNA產生之低效率問題極大地阻礙研發mRNA疫苗及藥物。

產生及使用5'端或含中間髮夾/莖環之mRNA構築體來設計且研發疫苗/藥物為本發明之關鍵新穎性中之一者。為此，先前PCR-IVT方法中無一者可克服髮夾樣RNA產生之低效率問題。因此，用於增加高度結構化RNA產生之效率的經改良PCR-IVT方法為高度受到期望的。

本發明之原理依賴於使用新穎酶促PCR-IVT系統產生「5'-髮夾信使RNA (5hmRNA)」及/或「信使-髮夾-信使RNA (mhmRNA)」(圖2)及使用5hmRNA或mhmRNA或兩者來設計且研發醫藥及治療應用，諸如疫苗及/或藥物，其均適用於抗病毒及/或抗癌療法。為實現此目標，高效PCR-IVT方法為至關重要的，因為5hmRNA及mhmRNA兩者均為高度結構化mRNA且先前的PCR-IVT方法不能有效產生高度結構化RNA。顯然，可設想，高度結構化RNA產生之新穎方法不僅為有效5hmRNA/mhmRNA製造所需且亦為其成本降低所需，從而使得研發出更負擔得起及有效的mRNA疫苗/藥物以供公共使用。

傳統上，所屬技術領域中具有通常知識者預先考慮活體外產生髮夾樣或含髮夾之mRNA以用於疫苗/藥物產生為不合理的，因為廣泛已知髮夾RNA結構在5'-UTR中之存在不僅阻礙mRNA轉錄，且亦抑制蛋白質自mRNA轉譯。為解決此問題，本發明採用新穎IVT系統與RNA聚合酶與解旋酶活性之混合物。在IVT中添加解旋酶活性顯著地減少DNA模板及所得mRNA產物兩者之二級結構以供極更有效地產生高度結構化mRNA。因此，亦需要經改良緩衝系統來維持且增強IVT中混合RNA聚合酶及解旋酶活性之效率。有趣地，若干先前研究已報導解旋酶可參與原核轉錄終止；然而，本發明展示在IVT期間在mRNA產生中解旋酶之完全不同功能。替代地，吾等最近已發現某些病毒複製酶(諸如具有額外解旋酶活性之冠狀病毒RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp))亦可用於產生高度結構化mRNA。

若干先前研究已提出使用天然內部核糖體進入位點(IRES)進行mRNA疫苗研發(Schlake等人, RNA biology9:1319-1330, 2012；Ko等人, J. Micobiol. Biotechnol.29:127-140, 2019)。然而，因為此等天然IRES為高度結構化RNA模體，所得低產生速率嚴重阻礙其研發。為克服此問題，本文中本發明提供一種新穎PCR-IVT方法與一種新RNA聚合酶-解旋酶混合物活性，其不僅可用於顯著增加高度結構化mRNA產量且亦降低其生產成本。因此，現可藉由使用本發明來解決先前的含IRES之mRNA疫苗研發之低生產速率問題。

在藉由本發明產生的5hmRNA及mhmRNA之結構中，5'-髮夾樣莖環RNA結構之特殊設計不僅可刺激細胞內RNA加工酶以移除髮夾且接著在所有後續mRNA序列中添加5'端帽，且亦可同時產生至少小髮夾RNA (shRNA)，類似於siRNA及微小RNA前驅體(前體miRNA, pre-miRNA)，其可進一步用以使至少特定目標基因，諸如細胞、病毒及/或癌症相關基因沉默。亦已注意到RNA加工酶可能不能加工所有種類之5'-髮夾樣莖環RNA結構，但僅加工某些特別設計之結構。在進一步研究之後，吾等之研究表明一些特別設計之莖環RNA結構亦可充當人工內部核糖體進入位點(IRES)來起始且增強具有或不具有端帽結構的後續mRNA之轉譯。因此，在經處理及未經處理條件兩者下，此等特別設計之莖環RNA結構可促進由後續mRNA進行之蛋白質/肽合成。

在一個較佳實施例中(圖2)，5hmRNA主要由兩個部分組成：5'-莖環RNA及3'-mRNA。原則上，5'-莖環RNA含有至少完美或不完美匹配之單個或多個髮夾結構，較佳長度為約10至800個核苷酸，及位於莖環結構與後續3'-mRNA之起始密碼子之間的短間隔子序列，較佳長度相隔約1至500個核苷酸。當5'-莖環RNA中存在多個髮夾結構時，間隔子序列必須置放於每兩個髮夾RNA結構之間，較佳長度相隔約2至500個核苷酸。舉例而言，如SEQ.ID.NO.3至SEQ.ID.NO.15中所列出，髮夾結構及間隔子可分別具有相同或不同序列。此外，5'-莖環RNA可充當人工IRES模擬物來起始且增強3'-mRNA之轉譯。在另一方面，3'-mRNA不僅編碼至少一種期望蛋白質或肽，且亦在其3'端中含有5'-AAUAAA-3' (SEQ.ID.NO.1)或5'-AAUUAAA-3' (SEQ.ID.NO.2)序列。在mRNA轉譯之後，所得蛋白質/肽可至少產生所關注之生物功能或效應，包括(但不限於)誘導特異性免疫反應、預防病毒感染、抑制病毒組裝、抑制病毒複製及/或抑制腫瘤/癌細胞生長以及引起癌細胞死亡。

在另一較佳實施例中(圖2)，mhmRNA係藉由在5hmRNA之5'端中添加額外mRNA (5'-mRNA)序列形成。因此，莖環RNA現充當中間分隔物以分別將第一個5'-mRNA及下一個3'-mRNA至相同或不同蛋白質/肽之個別轉譯分隔開。此外，類似於5hmRNA，莖環RNA結構不僅刺激細胞內RNA加工酶以移除髮夾且在3'-mRNA中添加5'端帽，且亦可進一步產生至少shRNA及/或piRNA以供使至少所關注之特異性目標基因沉默。此等目標基因可包括多種疾病相關細胞及/或致病基因，諸如細胞、病毒及/或癌症相關基因。替代地，人工IRES樣5'-莖環RNA結構可置放於5'-mRNA或3'-mRNA或兩者之5'-UTR中，以用於分別起始且增強5'-mRNA及/或3'-mRNA之轉譯，從而引起多種期望蛋白質/肽產生。

在第三較佳實施例中，mhmRNA之第一個5'-mRNA編碼RNA複製酶，諸如病毒RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)，以用於擴增經轉染細胞中之下一個3'-mRNA。此種RNA複製酶/RdRp表現mhmRNA在經轉染細胞中為可自擴增的，因此亦稱為可自擴增mRNA (samRNA)。在轉染至目標細胞中之後，5hmRNA及mhmRNA兩者可經進一步加工且轉譯成至少期望蛋白質/肽以用於誘發預先設計的期望生物效應或功能，包括(但不限於)誘導特異性免疫反應、預防病毒感染、抑制病毒複製/組裝及/或抑制腫瘤/癌細胞生長以及引起癌細胞死亡。此外，所得mRNA可充當用於RdRp之模板以產生piRNA，從而至少產生特異性基因沉默效應，如吾等先前之美國專利第8,372,969號及第8,609,831號(Lin)中所描述。舉例而言，當所得mRNA編碼目標病毒基因時，由此獲得之piRNA將適用於研發疫苗以使病毒基因活性沉默且因此預防病毒感染。

5hmRNA及mhmRNA之莖環RNA結構可進一步含有如下所列的以下單個或多個髮夾樣序列中之至少一者： (1) 5'-GCUCCCUUCA ACUUUAACAU GGAAGUGCUU UCUGUGACUU UAAAAGUAAG UGCUUCCAUG UUUUAGUAGG AGU-3' (73-nt) (SEQ.ID.NO.3) (2) 5'-CCUUUGCUUU AACAUGGGGG UACCUGCUGU GUGAAACAAA AGUAAGUGCU UCCAUGUUUC AGUGGAGG-3' (68-nt) (SEQ.ID.NO.4) (3) 5'-CCACCACUUA AACGUGGAUG UACUUGCUUU GAAACUAAAG AAGUAAGUGC UUCCAUGUUU UGGUGAUGG-3' (69-nt) (SEQ.ID.NO.5) (4) 5'-CCUCUACUUU AACAUGGAGG CACUUGCUGU GACAUGACAA AAAUAAGUGC UUCCAUGUUU GAGUGUGG-3' (68-nt) (SEQ.ID.NO.6) (5) 5'-CUGUGUGGCU GUCACUCGGC UGCAUGCUUA GUGCACUCAC GCAG-3' (44-nt) (SEQ.ID.NO.7) (6) 5'-CUGUGUGGCU GUCACUCGGC UGCAUGCUUA GUGCACUCAC GCAGUAUAAU UAAUAACUAA UUACU-3' (65-nt) (SEQ.ID.NO.8) (7) 5'-GUCGUUGACA GGACACGAGU AACUCGUCUA UCUUCUGCAG GCUGCUUACG GUUUCGUCCG UGUUGCAGCC GAUCAUCAGC ACAUCUAGGU UUCGUCCGGG UGUGACCGAA AGGUAAGAUG GAGAGCCUUG UCCCUGGUUU CAACGAG-3' (147-nt) (SEQ.ID.NO.9) (8) 5'-AAUUAUAAAU UACCAGAUGA UUUUACAGGC UGCGUUAUAG CUUGGAAUUC UAACAAUCUU GAUUCUAAGG UUGGUGGUAA UUAUAAUU-3' (88-nt) (SEQ.ID.NO.10) (9) 5'-CACAAAUAUU ACCAGAUCCA UCAAAACCAA GCAAGAGGUC AUUUAUUGAA GAUCUACUUU UCAACAAAGU GACACUUGCA GAUGCUGGCU UCAUCAAACA AUAUGGUGAU UGCCUUGGUG AUAUUGCUG-3' (129-nt) (SEQ.ID.NO.11) (10) 5'-GCAAAAAUGU GAUCUUGCUU GUAAAUACAA UUUUGAGAGG UUAAUAAAUU ACAAGUAGUG CUAUUUUUGU AUUUAGGUUA GCUAUUUAGC UUUACGUUCC AGGAUGCCUA GUGGCAGCCC CACAAUAUCC AGGAAGCCCU CUCUGCGGUU UUUCAGAUUC GUUAGUCGAA AAACCUAAGA AAUUUAAUG-3' (189-nt) (SEQ.ID.NO.12) (11) 5'-CACUCCCCUG UGAGGACUAC UGUCUUCACG CAGAAAGCGU CUAGCCAUGG CGUUAGUAUG AGUGUCGUGC AGCCUCCAGG ACCCCCCCUC CCGGGAGAGC CAUAGUGGUC UGCGGAACCG GUGAGUACAC CGGAAUUGCC AGGACGACCG GGUCCUUUCU UGGAUCAACC CGCUCAAUGC CUGGAGAUUU GGGCGUGCCC CCGCGAGACU GCUAGCCGAG UAGUGUUGGG UCGCGAAAGG CCUUGUGGUA CUGCCUGAUG GGUGCUUGCG AGUGCCCCGG GAGGUCUCGU AGAC-3' (294-nt) (SEQ.ID.NO.13) (12) 5'-GGACACGAGU AACUCGUCUA UCUUCUGCAG GCUGCUUACG GUUUCGUCCG UGUUG-3' (55-nt) (SEQ.ID.NO.14) (13) 5'-CAGCCGAUCA UCAGCACAUC UAGGUUUUGU CCGGGUGUGA CCGAAAGGUA AG-3' (52-nt) (SEQ.ID.NO.15)

為促進將5hmRNA或mhmRNA或兩者活體外、離體及/或活體內遞送至預期目標細胞中，5hmRNA及mhmRNA可與至少選自以下之遞送劑混合、結合、囊封及/或調配：甘胺醯甘油(glycylglycerins)、脂質體、奈米粒子、脂質奈米粒子、結合分子(conjugating molecules)、輸注化學品、基因槍物質、電穿孔粒子、轉位子及其組合。

使用5hmRNA及/或mhmRNA作為疫苗或藥物之優點包括(1)不需要活體外添加任何5'端帽且以便節省成本並減少污染，(2)產生經莖環RNA結構良好保護的更穩定mRNA產物，(3)在細胞內RNA加工酶移除莖環結構之後在經轉染細胞中形成100%封端之mRNA，(4)可進一步加工人工IRES樣模體/模擬物以供起始且增強由mRNA進行之蛋白質/肽合成，(5)形成具有經編碼複製酶/RdRp活性之可自擴增mRNA，(6)引起衍生自可自擴增mhmRA的蛋白質/肽產生之高產率，及(7)至少共表現適用於使至少所關注之特別目標基因，諸如病毒及/或癌症相關基因沉默的shRNA及/或piRNA。因此，可設想此等新穎5hmRNA及mhmRNA組合物適用於設計且研發新醫藥及治療應用，諸如疫苗及藥物，以用於抗病毒及/或抗癌療法。

A. 定義

為促進理解本發明，下文定義多個術語：

核酸：去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)之聚合物，單股或雙股。

核苷酸：由糖部分(戊醣)、磷酸鹽及含氮雜環鹼基組成的DNA或RNA之單體單元。鹼基係經由糖苷碳(戊醣之1'碳)連接至糖部分且鹼基與糖之組合為核苷。含有至少一個鍵結至戊糖之3'或5'位置之磷酸酯基的核苷為核苷酸。DNA及RNA由不同類型的分別稱作去氧核糖核苷酸及核糖核苷酸之核苷酸單元組成。

寡核苷酸：由兩個或更多個、較佳超過三個且通常超過十個DNA及/或RNA單體單元構成之分子。長於13個核苷酸單體之寡核苷酸亦稱作多核苷酸。確切大小將視多種因素而定，其又視寡核苷酸之最終功能或用途而定。寡核苷酸可以任何方式產生，包括化學合成、DNA複製、RNA轉錄、反轉錄或其組合。

核苷酸類似物：在結構上與腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)不同，但與核酸分子中之正常核苷酸之取代物充分類似之嘌呤或嘧啶核苷酸。

核酸組合物：核酸組合物係指單股或雙股分子結構之寡核苷酸或多核苷酸，諸如DNA或RNA序列，或混合DNA/RNA序列。

基因：其寡核苷酸或多核苷酸序列編碼RNA及/或多肽(蛋白質)之核酸組合物。基因可為RNA或DNA。基因可編碼非編碼RNA，諸如小髮夾RNA (shRNA)、微小RNA (miRNA)、rRNA、tRNA、snoRNA、snRNA及其RNA前驅體以及衍生物。替代地，基因可編碼蛋白質/肽合成必需的蛋白質編碼RNA，諸如信使RNA (mRNA)及其RNA前驅體以及衍生物。在一些情況下，基因可編碼亦含有至少微小RNA (microRNA)或shRNA序列之蛋白質編碼RNA。

初級 RNA 轉錄物：在無任何RNA加工或修飾之情況下直接自基因轉錄的RNA序列。

前驅體信使 RNA ( 前體 mRNA (pre-mRNA)) ：蛋白質編碼基因之初級RNA轉錄物，其藉由真核II型RNA聚合酶(Pol-II)機制於真核生物中經由稱為轉錄之細胞內機制來產生。前體mRNA序列含有5'-非轉譯區(UTR)、3'-UTR、外顯子及內含子。

內含子：編碼非蛋白質閱讀框架之基因轉錄物序列之一或多個部分，諸如框內內含子(in-frame intron)、5'-UTR及3'-UTR。

外顯子：編碼蛋白質閱讀框架之基因轉錄物序列(cDNA)之一或多個部分，諸如用於細胞基因、生長因子、胰島素、抗體及其類似物/同系物以及衍生物之cDNA。

信使 RNA (mRNA)：前體mRNA外顯子之組裝，其在藉由細胞內RNA剪接機制(例如，剪接體)移除內含子之後形成且充當用於肽/蛋白質合成之蛋白質編碼RNA。由mRNA編碼之肽/蛋白質包括(但不限於)酶、生長因子、胰島素、抗體及其類似物/同系物以及衍生物。

互補 DNA (cDNA)：含有與mRNA序列互補之序列且不含任何內含子序列的單股或雙股DNA。

有義鏈：與同源mRNA呈相同序列順序及組成之核酸分子。有義構形藉由「+」、「s」或「有義」符號指示。

反義鏈：與各別mRNA分子互補之核酸分子。反義構形以「-」符號或以DNA或RNA前面的「a」或「反義」指示，例如「aDNA」或「aRNA」。

鹼基對 (bp)：雙股DNA分子中腺嘌呤(A)與胸腺嘧啶(T)，或胞嘧啶(C)與鳥嘌呤(G)之配對關係。在RNA中，尿嘧啶(U)取代胸腺嘧啶。一般而言，配對關係經由氫鍵結實現。舉例而言，有義核苷酸序列「5'-A-T-C-G-U-3'」可與其反義序列「5'-A-C-G-A-T-3'」形成完全鹼基配對。

5' 端：在連續核苷酸之5'位處不具有核苷酸之末端，其中一個核苷酸之5'-羥基藉由磷酸二酯鍵接合至下一個核苷酸之3'-羥基。其他基團(諸如一或多個磷酸酯)可存在於該末端上。

3' 端：在連續核苷酸之3'位處不具有核苷酸之末端，其中一個核苷酸之5'-羥基藉由磷酸二酯鍵接合至下一個核苷酸之3'-羥基。其他基團(最常見為羥基)可存在於該末端上。

模板：由核酸聚合酶複製之核酸分子。視聚合酶而定，模板可為單股、雙股或部分雙股、RNA或DNA。合成之複本與模板或與雙股或部分雙股模板之至少一股互補。RNA及DNA兩者均以5'至3'方向合成。核酸雙螺旋之兩股始終對準以使得兩股之5'端在雙螺旋之相對端(且必然地，3'端亦為如此)。

核酸模板：雙股DNA分子、雙股RNA分子、雜交分子(諸如DNA-RNA或RNA-DNA雜交體)或單股DNA或RNA分子。

保守：若核苷酸序列與預先選擇序列之確切互補體係非隨機地雜交，則核苷酸序列相對於預先選擇(參考)序列保守。

同源或同源性：指示多核苷酸與基因或mRNA序列之間的相似性之術語。舉例而言，核酸序列可與特定基因或mRNA序列部分或完全同源。同源性可表示為藉由類似核苷酸之數目相比於核苷酸之總數目測定之百分比。

互補的或互補性或互補：關於與上述「鹼基對(bp)」規則有關的兩個多核苷酸(亦即mRNA及cDNA之序列)之間的匹配鹼基配對使用的術語。舉例而言，序列「5'-A-G-T-3'」不僅與序列「5'-A-C-T-3'」互補，且亦與「5'-A-C-U-3'」互補。互補可在兩條DNA股、DNA與RNA股之間或兩條RNA股之間。互補性可為「部分」或「完全」或「總體」。部分互補性或互補僅在核酸鹼基中之一些根據鹼基配對規則匹配時出現。完全或總體互補性或互補在鹼基在核酸股之間完全或完美匹配時出現。核酸股之間的互補程度對核酸股之間的雜交之效率及強度具有顯著影響。在擴增反應中，以及在視核酸之間的結合而定之偵測方法中，此尤其重要。百分比互補性或互補係指核酸之一股中相比於總鹼基之錯配鹼基的數目。因此，50%互補意謂一半鹼基錯配且一半匹配。即使核酸之兩股的鹼基數不同，兩股亦可互補。在此情況下，互補出現於對應於長股上與較短股上之鹼基配對之鹼基的較長股之部分與較短股之間。

互補鹼基：當DNA或RNA採用雙股組態時正常配對之核苷酸。

互補核苷酸序列：與另一單股上之核苷酸序列充分互補以藉由隨應氫鍵結在兩股之間特異性雜交的DNA或RNA之單股分子中之核苷酸序列。

雜交 (Hybridize/Hybridization)：在充分互補以經由鹼基配對形成複合物的核苷酸序列之間形成雙螺旋。當引子(或剪接模板)與目標(模板)「雜交」時，此類複合物(或雜交體)足夠穩定以提供DNA聚合酶起始DNA合成所需的引發功能。在可競爭性抑制的兩個互補聚核苷酸之間存在特異性，亦即非隨機相互作用。

轉錄後基因沉默：在mRNA降解或轉譯抑制層級上之靶向基因敲除或基因敲落效應，其通常藉由外來/病毒DNA或RNA轉殖基因或小抑制RNA觸發。

RNA 干擾 (RNAi)：真核生物中之轉錄後基因沉默機制，其可藉由小抑制RNA分子，諸如微小RNA (miRNA)、小髮夾RNA (shRNA)及小干擾RNA (siRNA)觸發。此等小RNA分子通常充當基因沉默子，干擾與小RNA具有完全或部分互補性的細胞內基因之表現。

基因沉默效應：在基因功能經抑制之後的細胞反應，由(但不限於)細胞週期衰減、G0/G1-檢查點阻滯、腫瘤抑制、抗致腫瘤性、癌細胞凋亡及其組合組成。

非編碼 RNA：無法用於經由細胞內轉譯機構合成肽或蛋白質之RNA轉錄物。非編碼RNA包括長及短調節RNA分子，諸如微小RNA (miRNA)、小髮夾RNA (shRNA)、小干擾RNA (siRNA)及雙股RNA (dsRNA)。此等調節RNA分子通常充當基因沉默子，干擾與非編碼RNA具有完全或部分互補性的細胞內基因之表現。

微小 RNA (miRNA)：能夠結合於與miRNA具有部分互補性之靶向基因轉錄物的單股RNA。miRNA長度通常為約17至27個寡核苷酸且視miRNA與其目標mRNA之間的互補性而定，能夠直接降解其細胞內mRNA目標或抑制其靶向mRNA之蛋白質轉譯。天然miRNA發現於幾乎所有真核生物中，充當針對病毒感染之防禦且允許在植物及動物發育期間調節基因表現。

前驅體微小 RNA ( 前體 miRNA(Pre-miRNA))：含有莖臂及莖環區之髮夾樣單股RNA，其用於與細胞內RNA酶III核糖核酸內切酶相互作用以產生能夠使與微小RNA序列互補之一或多個靶向基因沉默的一或多個微小RNA (miRNA)。前體miRNA之莖臂可形成完美(100%)或部分(錯配)雜交雙螺旋，而莖環連接莖臂雙螺旋之一端以形成圓形或髮夾環構形。然而，在本發明中，微小RNA之前驅體亦可包括初級miRNA (pri-miRNA)。

小干擾 RNA (siRNA)：大小為約18至27個完美鹼基配對之核糖核苷酸雙螺旋且能夠降解具有幾乎完美互補性之目標基因轉錄物的短雙股RNA。

小或短髮夾 RNA (shRNA)：含有一對部分或完全匹配之莖臂核苷酸序列之單股RNA，該等核苷酸序列由不匹配環或泡寡核苷酸劃分以形成髮夾樣結構。許多天然miRNA衍生自小髮夾樣RNA前驅體，亦即前驅體微小RNA (前體miRNA)。

載體：能夠在不同基因環境中移動及滯留之重組核酸組合物，諸如重組DNA (rDNA)。一般而言，另一核酸可操作地連接於其中。載體可能夠在細胞中自主複製，在此情況下，載體及連接之區段被複製。一種類型之較佳載體為游離基因體(episome)，亦即能夠進行染色體外複製之核酸分子。較佳載體為能夠自主複製及表現核酸之載體。能夠引導編碼一或多種多肽之基因及/或非編碼RNA之表現的載體在本文中稱為「表現載體」或「表現勝任載體」。尤其重要的載體允許使用反轉錄酶自所產生之mRNA選殖cDNA。載體可含有由以下組成之組分：病毒或II型RNA聚合酶(Pol-II或pol-2)啟動子或兩者、Kozak共有轉譯起始位點、聚腺苷酸化信號、複數個限制/選殖位點、pUC複製起點、用於在複製勝任原核細胞中表現至少抗生素抗性基因之SV40早期啟動子、用於在哺乳動物細胞中複製之視情況選用之SV40起點及/或四環素(tetracycline)反應性元件。載體之結構可為選自由以下組成之群的線形或圓形之單股或雙股DNA：質體、病毒載體、轉位子、反轉錄轉位子、DNA轉殖基因、跳躍基因及其組合。

啟動子：聚合酶分子識別，可能結合於，且起始RNA轉錄之核酸。出於本發明之目的，啟動子可為已知聚合酶結合位點、增強子及其類似物、可藉由所需聚合酶起始RNA轉錄物之合成的任何序列。

限制位點：用於限制酶裂解之DNA模體，包括但不限於 AatII、 AccI、 AflII/III、 AgeI、 ApaI/LI、 AseI、 Asp718I、 BamHI、 BbeI、 BclI/II、 BglII、 BsmI、 Bsp120I、 BspHI/LU11I/120I、 BsrI/BI/GI、 BssHII/SI、 BstBI/U1/XI、 ClaI、 Csp6I、 DpnI、 DraI/II、 EagI、 Ecl136II、 EcoRI/RII/47III/RV、 EheI、 FspI、 HaeIII、 HhaI、 HinPI、 HindIII、 HinfI、 HpaI/II、 KasI、 KpnI、 MaeII/III、 MfeI、 MluI、 MscI、 MseI、 NaeI、 NarI、 NcoI、 NdeI、 NgoMI、 NotI、 NruI、 NsiI、 PmlI、 Ppu10I、 PstI、 PvuI/II、 RsaI、 SacI/II、 SalI、 Sau3AI、 SmaI、 SnaBI、 SphI、 SspI、 StuI、 TaiI、 TaqI、 XbaI、 XhoI、 XmaI裂解位點。

順反子 (Cistron)：DNA分子中編碼胺基酸殘基序列且包括上游及下游DNA表現控制元件之核苷酸序列。

RNA 加工：引起RNA成熟、修飾及降解之細胞機制，包括RNA剪接、內含子切除、外泌體消化、無義介導之衰變(NMD)、RNA編輯、RNA加工、5'-封端、3'-poly(A)加尾及其組合。

基因遞送：選自由以下組成之群的基因工程改造方法：多聚核糖體轉染、脂質轉染、化學(奈米粒子)轉染、電穿孔、病毒感染、DNA重組、轉位子插入、跳躍基因插入、顯微注射、基因槍穿透及其組合。

基因工程改造：選自由以下組成之群的DNA重組方法：DNA限制及接合、同源重組、轉殖基因併入、轉位子插入、跳躍基因整合、反轉錄病毒感染及其組合。

腫瘤抑制：由(但不限於)以下組成之細胞抗腫瘤及抗癌機制：細胞週期衰減、G0/G1檢查點阻滯、腫瘤抑制、抗致腫瘤性、癌細胞凋亡及其組合。

目標細胞：選自由以下組成之群的單一或複數個人類細胞：體細胞、組織細胞、幹細胞、生殖系細胞、腫瘤細胞、癌細胞、病毒感染之細胞及其組合。

癌組織：衍生自由以下組成之群的贅生性組織：皮膚癌、前列腺癌、乳癌、肝癌、肺癌、腦腫瘤/腦癌、淋巴瘤、白血病及其組合。

抗體：具有編碼能夠結合預選配位體之受體之預選保守域結構的肽或蛋白質分子。

醫藥及 / 或治療應用：適用於以下的生物醫學利用率及/或設備：幹細胞產生、幹細胞研究及/或療法研發、癌症療法、疾病治療、傷口癒合及組織再生治療、藥物及/或食物供應之高產率生產及其組合。

原核生物或原核細胞：單細胞生物體，其缺乏明確的膜結合核，且具有其基因物質呈DNA之連續股束之形式(諸如細菌)。

真核生物或真核生物細胞：單細胞或多細胞生物體，其細胞含有細胞核及包封於膜內之其他結構(胞器)，諸如酵母菌、植物及動物細胞。

轉錄誘導劑：可自原核細胞中誘導及/或增強真核pol-2或pol-2等效啟動子之真核RNA及/或基因轉錄的化學劑。舉例而言，轉錄誘導劑含有(但不限於)類似於3-嗎啉基丙烷-1-磺酸(MOPS)、乙醇及/或甘油之化學結構，以及其功能類似物，諸如甘露醇(mannitol)、2-(N-嗎啉基)乙磺酸(MES)及4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)或其混合物。

B. 組合物及應用

一種用於抗病毒及抗癌疫苗製造及研發的新穎mRNA組合物及其產生方法，其包含：至少5'-髮夾信使RNA (5hmRNA)及/或信使-髮夾-信使RNA (mhmRNA)或兩者，其中5hmRNA含有蛋白質/肽編碼mRNA之5'-UTR區中之至少莖環RNA結構且mhmRNA含有在其兩側上側接有兩個相同或不同mRNA序列之至少中間莖環RNA結構。

為克服髮夾樣RNA產生之低效率問題，使用新穎PCR-IVT方法與新的本發明RNA聚合酶-解旋酶混合物活性及經改良IVT緩衝系統產生5hmRNA及mhmRNA。此外，為促進將5hmRNA或mhmRNA或兩者遞送至目標細胞中，5hmRNA及mhmRNA可進一步與至少選自以下之遞送劑混合、結合、囊封及/或調配：甘胺醯甘油、脂質體、奈米粒子、脂質奈米粒子、結合分子、輸注化學品、基因槍物質、轉位子、電穿孔粒子及其組合。

在一個較佳實施例中，5hmRNA主要由兩個部分組成：5'-莖環RNA及3'-mRNA (圖2)。在結構上，5'-莖環RNA含有至少完美或不完美匹配之單個或多個髮夾結構，較佳長度為約10至800個核苷酸，及位於莖環結構與後續3'-mRNA之起始密碼子之間的短間隔子序列，較佳長度相隔約1至500個核苷酸。當5'-莖環RNA中存在多個髮夾樣結構時，間隔子序列必須置放於每兩個髮夾RNA結構之間，較佳長度相隔約2至500個核苷酸。髮夾結構及間隔子可分別具有相同或不同序列。此外，5'-莖環RNA可進一步充當人工IRES樣模擬物以用於起始且增強3'-mRNA之轉譯，從而引起期望蛋白質/肽產生。在另一方面，3'-mRNA不僅編碼至少一種期望蛋白質或肽，且亦在其3'端附近含有5'-AAUAAA-3' (SEQ.ID.NO.1)或5'-AAUUAAA-3' (SEQ.ID.NO.2)序列以用於誘導細胞內poly(A)加尾機制。

在另一較佳實施例中，mhmRNA係藉由在5hmRNA之5'端中添加額外mRNA (5'-mRNA)序列形成。因此，莖環RNA現充當中間分隔物以分別將第一個5'-mRNA及下一個3'-mRNA至相同或不同蛋白質/肽之個別轉譯分隔開。此外，類似於5hmRNA，莖環RNA結構不僅刺激細胞內RNA加工酶以在3'-mRNA中添加5'端帽，但亦可進一步產生至少shRNA及/或piRNA以供使至少所關注之目標基因沉默。此等特異性目標基因可包括多種疾病相關細胞及/或致病基因，諸如病毒及/或癌症相關基因。替代地，額外IRES樣5'-莖環RNA結構可置放於5'-mRNA或3'-mRNA或兩者之5'-UTR中，以用於分別起始且增強5'-mRNA及/或3'-mRNA之轉譯，從而引起多種期望蛋白質/肽產生。

在第三較佳實施例中(圖2)，mhmRNA之第一個5'-mRNA編碼RNA複製酶，諸如病毒RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)，以用於在經轉染細胞中擴增第二個3'-mRNA。此種RNA複製酶/RdRp表現mhmRNA在經轉染細胞中為可自擴增的。在轉染至目標細胞中之後，5hmRNA及mhmRNA兩者可經進一步處理且轉譯成至少期望蛋白質/肽以用於誘發預先設計的期望生物效應或功能，包括(但不限於)誘導特異性免疫反應、預防病毒感染、抑制病毒複製/組裝及/或抑制腫瘤/癌細胞生長以及引起癌細胞死亡。因此，可設想此類新穎5hmRNA及mhmRNA組合物極其適用於設計且研發新醫藥及/或治療應用，諸如疫苗及/或藥物，以用於抗病毒及/或抗癌療法。

5hmRNA及mhmRNA之莖環RNA結構可含有至少選自以下之序列：SEQ.ID.NO.3、SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.5、SEQ.ID.NO.6、…至SEQ.ID.NO.15，及/或其組合。

實例：

1. 人類細胞培養及活體外 RNA 轉染

對於培養角質細胞，自皮膚組織分離細胞且在適當抗生素之存在下在37℃下在5% CO ₂下在補充有人類角質細胞生長補充劑(HKGS, Invitrogen, Carlsbad, CA)之EpiLife無血清細胞培養基中培育。培養細胞係藉由使細胞暴露於胰蛋白酶/EDTA溶液持續1 min且用無酚紅DMEM培養基(Invitrogen)沖洗一次而以50%至60%匯合度傳代，且用HKGS補充劑在新鮮EpiLife培養基中以1:10稀釋度再塗鋪所剝離細胞。人類癌症及正常細胞株MCF7、HepG2、A549及BEAS-2B係取自美國菌種保存中心(ATCC，Rockville, MD)或吾等合作者且根據製造商之建議維護。對於RNA轉染，將0.5至500 µg之經分離mRNA (亦即5hmRNA或mhmRNA)溶解於0.5 ml新鮮EpiLife培養基中且與1至50 µl之In-VivoJetPEI轉染劑混合。在10至30 min培育之後，將混合物添加至含有50%至60%匯合度之經培育細胞的細胞培養物中。視細胞類型而定，每12至48小時更新培養基。可重複進行此轉染程序以增加轉染效率。轉染結果分別展示於圖6及圖9中。

2. 新穎 PCR-IVT 方案

遵循製造商之建議，藉由將約0.01 ng至10微克(µg)之經分離mRNA添加至20至50 µL RT反應(SuperScript III RT套組，ThermoFisher Scientific, MA, USA)中來進行期望mRNA之反轉錄(Reverse transcription；RT)。視mRNA量而定，RT反應混合物在1× RT緩衝液中含有mRNA、約0.01至20奈莫耳(nmole) RT引子、適當量之dNTP及反轉錄酶。接著，視期望mRNA之結構及長度而定，將RT反應在46至65℃下培育1至3小時(h)，以便製造用於下一PCR步驟的至少互補DNA (cDNA)模板。關於RT引子設計，作為實例但不限於此實例，吾等分別針對期望COVID-19病毒mRNA序列之RT使用5'-CAGTTCCAAT TGTGAAGATT CTC-3' (SEQ.ID.NO.16)，且針對另一種所關注之含抗癌微小RNA (miRNA)莖環之紅色螢光蛋白(RGFP)編碼mRNA (亦即RGFP編碼5hmRNA)之RT分別使用另一5'-CTTGATGACG TTCTCAGTGC-3' (SEQ.ID.NO.17) (圖3)。

接著，遵循製造商之建議，藉由將約0.01 pg至10 µg之RT衍生之cDNA添加至50 µL PCR混合物(高保真PCR酶套組，ThermoFisher Scientific, MA, USA)來進行聚合酶鏈反應(PCR)。接著，視期望DNA及引子之結構及長度而定，使PCR混合物首先在94℃下在五至二十個(5至20個)變性循環中培育1 min，在30℃至55℃下退火30秒至1 min，且接著在72℃下擴展1至3 min。此後，視所得PCR產物之結構及長度而定，用一系列在94℃下變性1 min、在50℃至55℃下退火30秒且接著在72℃下擴展1至3 min的連續步驟進行另外十至二十個(10至20個) PCR循環。最後，所得PCR產物用作用於IVT之模板。為了作為實例(但不限於)此實例，吾等設計兩組用於擴增含病毒啟動子之DNA模板的PCR對引子，包括一對5'-GATATCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAGAG GTATGGTACT TGGTAGTT-3' (SEQ.ID.NO.18)及SEQ.ID.NO.16 (用於擴增約12.5k-核苷酸(nt) COVID-19 RdRp/解旋酶/S蛋白質編碼mhmRNA (結果展示於圖8中))及另一對引子5'-GATATCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAGAC TAGTGATGTT CTTGTTAACA ACT-3' (SEQ.ID.NO.19)及SEQ.ID.NO.16 (用於擴增約2.8k-nt COVID-19 S 2蛋白質編碼5hmRNA (結果展示於圖7中))。此外，吾等使用另一對PCR引子來擴增含抗癌miRNA-莖環之RGFP編碼DNA模板(亦即RGFP編碼5hmRNA)，包括含啟動子之正向引子5'-GATATCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAGAG GTATGGTACT TGGTAGTT-3' (SEQ.ID.NO.20)及SEQ.ID.NO.17 (結果展示於圖4及圖5中)。在原則設計上，所有經設計正向PCR引子至少編碼用於IVT之保守啟動子序列，諸如但不限於T7、T3及/或SP6啟動子序列，尤其5'-TCTAATACGA CTCACTATAG GGAGA-3' (SEQ.ID.NO.21)。另外，在正向啟動子-引子之3'端中可存在至少限制位點以用於在PCR產物中插入至少髮夾樣莖環結構或至少IRES樣莖環結構。

對於mRNA產生，由於已將啟動子-引子併入所得PCR產物中，因此可使用PCR產物作為模板進行經改良IVT反應以擴增期望mRNA序列。IVT反應混合物在1×轉錄緩衝液中含有0.01 ng至10 µgPCR產物、0.1至10 U解旋酶(Creative Enzymes, NY)、適當量之NTP及RNA聚合酶(亦即T7、T3、或SP6)。遵循製造商之建議，可根據所使用之RNA聚合酶調節1×轉錄緩衝液之含量。另外，1×轉錄緩衝液可進一步含有0.001至10 mM甜菜鹼(三甲基甘胺酸，TMG)、二甲亞碸(DMSO)及/或3-(N-嗎啉基)丙烷磺酸(MOPS)及/或其組合，其促進高度結構化RNA/DNA序列(諸如髮夾及IRES)之變性。接著，視所使用RNA聚合酶之穩定性及活性而定，將IVT反應物在37℃下培育1至6小時。在此經改良新穎IVT反應中，添加至少額外解旋酶以便促進RNA/DNA二級結構(諸如髮夾樣及IRES樣莖環結構)之解繞，以便克服活體外髮夾樣RNA產生之低效率問題。值得注意地，解旋酶可解繞DNA及RNA股兩者中之二級結構。

3. RNA 純化、北方墨點分析及 RNA 定序

遵循製造商之方案，期望mRNA (10 µg)經mirVana™ RNA分離套組(Ambion, Austin, TX)分離，且接著藉由使用15% TBE-脲聚丙烯醯胺凝膠(TBE-urea polyacrylamide gel)或3.5%低熔點瓊脂糖凝膠電泳進一步純化。對於北方墨點分析，將凝膠分餾之mRNA電轉染於尼龍膜(nylon membrane)上。用與mRNA之期望目標序列互補之標記[LNA]-DNA探針進行mRNA及其IVT模板(PCR產物)之偵測。探針係藉由高效液相層析(HPLC)進一步純化且在染料標記之核苷酸類似物或[ ³²P]-dATP (＞ 3000 Ci/mM，Amersham International, Arlington Heights, IL)之存在下用末端轉移酶(20單位)尾部標記20 min。為測定mRNA/miRNA序列，經設計之SEQ.ID.NO.21及SEQ.ID.NO.16或SEQ.ID.NO.17單獨用作引子，以分別用於自mRNA/miRNA序列之5'端及3'端進行RNA定序。

4. 蛋白質提取及西方墨點分析

遵循製造商之建議，細胞(10 ⁶)經補充有蛋白酶抑制劑、亮抑酶肽(Leupeptin)、TLCK、TAME及PMSF之CelLytic-M溶解/提取試劑(Sigma)裂解。裂解物在4℃下在12,000 rpm下離心20 min且回收上清液。使用經改良SOFTmax蛋白質分析套組在E-max微盤讀取器(Molecular Devices, CA)上量測蛋白質濃度。將各30 µg細胞裂解物在還原(+50 mM DTT)及非還原(無DTT)條件下添加至SDS-PAGE樣本緩衝液中，且煮沸3分鐘，隨後負載至6%至8%聚丙烯醯胺凝膠上。藉由SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)分離蛋白質，電轉染至硝化纖維素膜上且在室溫下在Odyssey阻斷試劑(Li-Cor Biosciences, Lincoln, NB)中培育2小時。接著，將一級抗體施加至試劑且在4℃下培育混合物。在過夜之後，將膜用TBS-T沖洗三次且接著在室溫下將山羊抗小鼠IgG結合二級抗體暴露於Alexa Fluor 680反應性染料(1:2,000；Invitrogen-Molecular Probes)持續1小時。在三次額外TBS-T沖洗之後，使用Li-Cor Odyssey紅外成像劑及Odyssey軟體v.10 (Li-Cor)進行免疫墨點之螢光掃描及影像分析。

5. 免疫染色分析

將細胞/組織樣本在4℃下在100%甲醇中固定30 min且接著在20℃下在4%多聚甲醛(在1×PBS中，pH 7.4)中固定10 min。此後，樣本在含有0.1%至0.25% Triton X-100之1×PBS中培育10 min且接著在1×PBS中洗滌三次，持續5 min。對於免疫染色，一級抗體包括(但不限於)抗DsRed/RGFP (Clontech, Palo Alto, CA)及抗COVID-19 S (Invitrogen)單株抗體。染料標記之山羊抗兔或馬抗小鼠抗體用作二級抗體(Invitrogen-Molecular Probes, Carlsbad, CA)。在具有Metamorph成像程序(Nikon)之螢光80i微觀定量系統(fluorescent 80i microscopic quantitation system)下以100×或200×放大率檢查且分析結果。陽性結果展示於圖6及圖9中。

6. 活體內轉染分析

遵循製造商之方案，將來自實例2及3之經分離mRNA或miRNA與適當量之遞送劑(諸如In-VivoJetPEI轉染劑)充分混合，且接著視應用之目的而定，注射至動物之血液靜脈或肌肉中。遞送劑用於混合、結合、囊封或調配期望5hmRNA或mhmRNA，以便不僅保護5hmRNA或mhmRNA免於降解，且亦促進將5hmRNA或mhmRNA活體外、離體及/或活體內遞送至所關注之特異性目標細胞中。

7. 統計分析

免疫染色、西方墨點法及北方墨點法之分析中任何超過75%之信號強度變化視為陽性結果，其轉而經分析且呈現為平均值±SE。藉由單向ANOVA進行資料之統計分析。當主效應顯著時，鄧尼特事後測試(Dunnett's post-hoc test)用於鑑別與對照顯著不同之組。為在兩個治療組之間進行成對比較，使用雙尾斯圖登t檢定(two-tailed student t test)。對於涉及超過兩個治療組之實驗，進行ANOVA，接著進行事後多重全距檢定(post-hoc multiple range test)。 p＜0.05之概率值視為顯著。自雙尾檢定測定所有 p值。

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序列表 (1)一般資訊： (iii)序列之數目：21 (2)關於SEQ ID NO:1之資訊： (i)序列特徵： (A)長度：6個鹼基對 (B)類型：核酸 (C)股型：單股 (D)拓撲構型：線性 (ii)分子類型：RNA (A)描述：/desc=「合成」 (iii)假設：否 (iv)反義：否 (xi)序列描述：SEQ ID NO:1： AAUAAA 6 (2)關於SEQ ID NO:2之資訊： (i)序列特徵： (A)長度：7個鹼基對 (B)類型：核酸 (C)股型：單股 (D)拓撲構型：線性 (ii)分子類型：RNA (A)描述：/desc=「合成」 (iii)假設：否 (iv)反義：否 (xi)序列描述：SEQ ID NO: 2： AAUUAAA 7 (2)關於SEQ ID NO: 3之資訊： (i)序列特徵： (A)長度：73個鹼基對 (B)類型：核酸 (C)股型：單股 (D)拓撲構型：髮夾 (ii)分子類型：RNA (A)描述：/desc=「合成」 (iii)假設：否 (iv)反義：否 (xi)序列描述：SEQ ID NO:3： GCUCCCUUCA ACUUUAACAU GGAAGUGCUU UCUGUGACUU UAAAAGUAAG UGCUUCCAUG UUUUAGUAGG AGU 73 (2)關於SEQ ID NO:4之資訊： (i)序列特徵： (A)長度：68個鹼基對 (B)類型：核酸 (C)股型：單股 (D)拓撲構型：髮夾 (ii)分子類型：RNA (A)描述：/desc=「合成」 (iii)假設：否 (iv)反義：否 (xi)序列描述：SEQ ID NO:4： CCUUUGCUUU AACAUGGGGG UACCUGCUGU GUGAAACAAA AGUAAGUGCU UCCAUGUUUC AGUGGAGG 68 (2)關於SEQ ID NO:5之資訊： (i)序列特徵： (A)長度：69個鹼基對 (B)類型：核酸 (C)股型：單股 (D)拓撲構型：髮夾 (ii)分子類型：RNA (A)描述：/desc=「合成」 (iii)假設：否 (iv)反義：否 (xi)序列描述：SEQ ID NO: 5： CCACCACUUA AACGUGGAUG UACUUGCUUU GAAACUAAAG AAGUAAGUGC UUCCAUGUUU UGGUGAUGG 69 (2)關於SEQ ID NO: 6之資訊： (i)序列特徵： (A)長度：68個鹼基對 (B)類型：核酸 (C)股型：單股 (D)拓撲構型：髮夾 (ii)分子類型：RNA (A)描述：/desc=「合成」 (iii)假設：否 (iv)反義：否 (xi)序列描述：SEQ ID NO: 6： CCUCUACUUU AACAUGGAGG CACUUGCUGU GACAUGACAA AAAUAAGUGC UUCCAUGUUU GAGUGUGG 68 (2)關於SEQ ID NO: 7之資訊： (i)序列特徵： (A)長度：44個鹼基對 (B)類型：核酸 (C)股型：單股 (D)拓撲構型：莖環 (ii)分子類型：RNA (A)描述：/desc=「合成」 (iii)假設：否 (iv)反義：否 (xi)序列描述：SEQ ID NO: 7： CUGUGUGGCU GUCACUCGGC UGCAUGCUUA GUGCACUCAC GCAG 44 (2)關於SEQ ID NO: 8之資訊： (i)序列特徵： (A)長度：65個鹼基對 (B)類型：核酸 (C)股型：單股 (D)拓撲構型：莖環 (ii)分子類型：RNA (A)描述：/desc=「合成」 (iii)假設：否 (iv)反義：否 (xi)序列描述：SEQ ID NO: 8： CUGUGUGGCU GUCACUCGGC UGCAUGCUUA GUGCACUCAC GCAGUAUAAU UAAUAACUAA UUACU 65 (2)關於SEQ ID NO: 9之資訊： (i)序列特徵： (A)長度：147個鹼基對 (B)類型：核酸 (C)股型：單股 (D)拓撲構型：莖環 (ii)分子類型：RNA (A)描述：/desc=「合成」 (iii)假設：否 (iv)反義：否 (xi)序列描述：SEQ ID NO: 9： GUCGUUGACA GGACACGAGU AACUCGUCUA UCUUCUGCAG GCUGCUUACG GUUUCGUCCG UGUUGCAGCC GAUCAUCAGC ACAUCUAGGU UUCGUCCGGG UGUGACCGAA AGGUAAGAUG GAGAGCCUUG UCCCUGGUUU CAACGAG 147 (2)關於SEQ ID NO: 10之資訊： (i)序列特徵： (A)長度：88個鹼基對 (B)類型：核酸 (C)股型：單股 (D)佈局：莖環 (ii)分子類型：RNA (A)描述：/desc=「合成」 (iii)假設：否 (iv)反義：否 (xi)序列描述：SEQ ID NO: 10： AAUUAUAAAU UACCAGAUGA UUUUACAGGC UGCGUUAUAG CUUGGAAUUC UAACAAUCUU GAUUCUAAGG UUGGUGGUAA UUAUAAUU 88 (2)關於SEQ ID NO: 11之資訊： (i)序列特徵： (A)長度：129個鹼基對 (B)類型：核酸 (C)股型：單股 (D)拓撲構型：多個莖環 (ii)分子類型：RNA (A)描述：/desc=「合成」 (iii)假設：否 (iv)反義：否 (xi)序列描述：SEQ ID NO: 11： CACAAAUAUU ACCAGAUCCA UCAAAACCAA GCAAGAGGUC AUUUAUUGAA GAUCUACUUU UCAACAAAGU GACACUUGCA GAUGCUGGCU UCAUCAAACA AUAUGGUGAU UGCCUUGGUG AUAUUGCUG 129 (2)關於SEQ ID NO: 12之資訊： (i)序列特徵： (A)長度：189個鹼基對 (B)類型：核酸 (C)股型：單股 (D)拓撲構型：多個莖環 (ii)分子類型：RNA (A)描述：/desc=「合成」 (iii)假設：否 (iv)反義：否 (xi)序列描述：SEQ ID NO: 12： GCAAAAAUGU GAUCUUGCUU GUAAAUACAA UUUUGAGAGG UUAAUAAAUU ACAAGUAGUG CUAUUUUUGU AUUUAGGUUA GCUAUUUAGC UUUACGUUCC AGGAUGCCUA GUGGCAGCCC CACAAUAUCC AGGAAGCCCU CUCUGCGGUU UUUCAGAUUC GUUAGUCGAA AAACCUAAGA AAUUUAAUG 189 (2)關於SEQ ID NO: 13之資訊： (i)序列特徵： (A)長度：294個鹼基對 (B)類型：核酸 (C)股型：單股 (D)拓撲構型：多個莖環 (ii)分子類型：RNA (A)描述：/desc=「合成」 (iii)假設：否 (iv)反義：否 (xi)序列描述：SEQ ID NO: 13： CACUCCCCUG UGAGGACUAC UGUCUUCACG CAGAAAGCGU CUAGCCAUGG CGUUAGUAUG AGUGUCGUGC AGCCUCCAGG ACCCCCCCUC CCGGGAGAGC CAUAGUGGUC UGCGGAACCG GUGAGUACAC CGGAAUUGCC AGGACGACCG GGUCCUUUCU UGGAUCAACC CGCUCAAUGC CUGGAGAUUU GGGCGUGCCC CCGCGAGACU GCUAGCCGAG UAGUGUUGGG UCGCGAAAGG CCUUGUGGUA CUGCCUGAUG GGUGCUUGCG AGUGCCCCGG GAGGUCUCGU AGAC 294 (2)關於SEQ ID NO: 14之資訊： (i)序列特徵： (A)長度：55個鹼基對 (B)類型：核酸 (C)股型：單股 (D)拓撲構型：莖環 (ii)分子類型：RNA (A)描述：/desc=「合成」 (iii)假設：否 (iv)反義：否 (xi)序列描述：SEQ ID NO: 14： GGACACGAGU AACUCGUCUA UCUUCUGCAG GCUGCUUACG GUUUCGUCCG UGUUG 55 (2)關於SEQ ID NO: 15之資訊： (i)序列特徵： (A)長度：52個鹼基對 (B)類型：核酸 (C)股型：單股 (D)拓撲構型：莖環 (ii)分子類型：RNA (A)描述：/desc=「合成」 (iii)假設：否 (iv)反義：否 (xi)序列描述：SEQ ID NO: 15： CAGCCGAUCA UCAGCACAUC UAGGUUUUGU CCGGGUGUGA CCGAAAGGUA AG 52 (2)關於SEQ ID NO: 16之資訊： (i)序列特徵： (A)長度：23個鹼基對 (B)類型：核酸 (C)股型：單股 (D)拓撲構型：線性 (ii)分子類型：DNA (A)描述：/desc=「合成」 (iii)假設：否 (iv)反義：是 (xi)序列描述：SEQ ID NO: 16： CAGTTCCAAT TGTGAAGATT CTC 23 (2)關於SEQ ID NO: 17之資訊： (i)序列特徵： (A)長度：20個鹼基對 (B)類型：核酸 (C)股型：單股 (D)拓撲構型：線性 (ii)分子類型：DNA (A)描述：/desc=「合成」 (iii)假設：否 (iv)反義：是 (xi)序列描述：SEQ ID NO: 17： CTTGATGACG TTCTCAGTGC 20 (2)關於SEQ ID NO: 18之資訊： (i)序列特徵： (A)長度：48個鹼基對 (B)類型：核酸 (C)股型：單股 (D)拓撲構型：線性 (ii)分子類型：DNA (A)描述：/desc=「合成」 (iii)假設：否 (iv)反義：否 (xi)序列描述：SEQ ID NO: 18： GATATCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAGAG GTATGGTACT TGGTAGTT 48 (2)關於SEQ ID NO: 19之資訊： (i)序列特徵： (A)長度：53個鹼基對 (B)類型：核酸 (C)股型：單股 (D)拓撲構型：線性 (ii)分子類型：DNA (A)描述：/desc=「合成」 (iii)假設：否 (iv)反義：否 (xi)序列描述：SEQ ID NO: 19： GATATCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAGAC TAGTGATGTT CTTGTTAACA ACT 53 (2)關於SEQ ID NO: 20之資訊： (i)序列特徵： (A)長度：48個鹼基對 (B)類型：核酸 (C)股型：單股 (D)拓撲構型：線性 (ii)分子類型：DNA (A)描述：/desc=「合成」 (iii)假設：否 (iv)反義：否 (xi)序列描述：SEQ ID NO: 20： GATATCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAGAG GTATGGTACT TGGTAGTT 48 (2)關於SEQ ID NO: 21之資訊： (i)序列特徵： (A)長度：25個鹼基對 (B)類型：核酸 (C)股型：單股 (D)拓撲構型：線性 (ii)分子類型：DNA (A)描述：/desc=「合成」 (iii)假設：否 (iv)反義：否 (xi)序列描述：SEQ ID NO: 21： TCTAATACGA CTCACTATAG GGAGA 25

特定言之，僅出於說明目的且非限制目的來參照圖式，其中說明：

圖1描繪PCR-IVT方法之逐步程序。對於mRNA產生，此PCR-IVT方法之部分或全部程序可用於所需mRNA產物之單次或多次循環擴增。

圖2描繪5hmRNA及mhmRNA之設計結構。

圖3描繪經設計紅色螢光RGFP編碼5hmRNA之實例結構。如所示，此RGFP編碼5hmRNA之莖環RNA結構含有位於經編碼RGFP mRNA之5'-UTR中的SEQ.ID.NO.14/15、SEQ.ID.NO.3、SEQ.ID.NO.4及SEQ.ID.NO.5序列之組合。本文中，僅充當實例而非限制本發明，可理解的是，莖環RNA結構可經任何髮夾樣RNA、shRNA、前體miRNA及/或IRES樣RNA結構置換以用於活體外、離體以及活體內誘發期望生物效應或細胞功能。同樣地，經編碼RGFP mRNA視期望蛋白質/肽功能而定亦可由任何其他期望蛋白質/肽編碼mRNA置換以至少活體外、離體以及活體內誘發期望生物及/或細胞效應。

圖4展示藉由本發明PCR-IVT方法與新穎解旋酶活性製得的所得併入啟動子之PCR產物及其衍生之5hmRNA。在增加PCR產物之起始量之後，經擴增5hmRNA分子基於劑量依賴性按比例增加。因此，可達到30至2000倍之最佳產生速率增加，從而產生每1 mL IVT反應最大高達0.6至0.9 mg mRNA產量(0.6至0.9 mg/mL mRNA)。

圖5展示在活體外由Drosha樣RNA酶III酶活性(Ambion RNA酶III，ThermoFisher Scientific, MA, USA)加工之後，PCR IVT製得之5hmRNA (亦即RGFP編碼5hmRNA)序列之髮夾樣/IRES樣莖環RNA結構。如此實例中所示，經Drosha加工之髮夾樣RNA結構含有經設計IRES樣莖環RNA以及miR-302b、miR-302c及miR-302a之前驅體。已知miR-302a、b及c為腫瘤抑制劑微小RNA，其適用於抗癌療法。

圖6展示藉由本發明PCR-IVT製得之5hmRNA (來自圖3)轉染之A549細胞中的所得RGFP蛋白質(紅色螢光顏色)產生，指示期望蛋白質/肽可成功地在經轉染細胞中由5hmRNA產生，以便遞送經設計生物及/或細胞效應。可設想，經編碼RGFP mRNA可經5hmRNA及mhmRNA中之任何其他蛋白質/肽編碼mRNA序列置換，以便遞送不同所關注之生物效應或細胞功能。

圖7展示抗病毒(COVID-19) 5hmRNA之北方墨點分析(Northern blot analysis)結果。

圖8展示抗病毒mhmRNA之北方墨點分析結果。

圖9展示在經抗病毒5hmRNA (來自圖7)轉染之後在BEAS-2B細胞中產生的冠狀病毒(例如，COVID-19) S 2蛋白質之免疫染色結果，指示將抗病毒5hmRNA遞送至BEAS-2B肺上皮細胞株中可誘導冠狀病毒S 2蛋白質之細胞內產生，此適用於活體內觸發抗病毒免疫反應。

Claims

一種用於抗病毒及抗癌疫苗製造及研發的新穎mRNA組合物及其產生方法，其包含：至少5'-髮夾信使RNA (5hmRNA)及/或信使-髮夾-信使RNA (mhmRNA)或兩者，其中該5hmRNA含有期望mRNA之5'-UTR區中之至少莖環RNA結構且該mhmRNA含有在其兩側上側接有兩個相同或不同所關注mRNA序列之至少莖環RNA結構，且其中該5hmRNA及該mhmRNA使用新穎聚合酶鏈反應(PCR)-活體外轉錄(IVT)反應與至少額外的解旋酶活性及經改良緩衝系統產生。
如請求項1所述之組合物及方法，其中該5hmRNA主要由兩個部分組成：5'-莖環RNA及3'-mRNA。
如請求項2所述之組合物及方法，其中該5'-莖環RNA含有至少完美或不完美匹配之單個或多個髮夾結構，較佳長度為約10至800個核苷酸，及位於該莖環結構與後續3'-mRNA之起始密碼子之間的短序列，較佳長度相隔約1至500個核苷酸。
如請求項3所述之組合物及方法，其中該5'-莖環RNA中之該多個髮夾結構在每兩個髮夾RNA結構之間進一步含有間隔子序列，較佳長度相隔約2至500個核苷酸。
如請求項2所述之組合物及方法，其中該3'-mRNA不僅編碼至少一種期望蛋白質或肽，且亦在其3'端中含有SEQ.ID.NO.1或SEQ.ID.NO.2。
如請求項2所述之組合物及方法，其中該5'-莖環RNA結構可進一步用作人工內部核糖體進入位點(IRES)模擬物來起始且增強該3'-mRNA之轉譯。
如請求項1所述之組合物及方法，其中該mhmRNA係藉由在5hmRNA之5'端中添加額外mRNA (5'-mRNA)序列形成，其中該mhmRNA之該莖環RNA結構充當中間分隔物以分別將第一個5'-mRNA及下一個3'-mRNA至相同或不同蛋白質/肽之個別轉譯分隔開。
如請求項7所述之組合物及方法，其中該莖環RNA結構進一步用作人工內部核糖體進入位點(IRES)模擬物來起始且增強該3'-mRNA之轉譯。
如請求項7所述之組合物及方法，其中該mhmRNA之該第一個5'-mRNA編碼RNA複製酶，諸如病毒RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)，以用於在經轉染細胞中擴增第二個3'-mRNA序列，從而在該等經轉染細胞中產生mRNA自擴增機制。
如請求項1所述之組合物及方法，其中5hmRNA及mhmRNA之該莖環RNA結構可含有至少選自以下之序列：SEQ.ID.NO.3、SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.5、SEQ.ID.NO.6、SEQ.ID.NO.7、SEQ.ID.NO.8、SEQ.ID.NO.9、SEQ.ID.NO.10、SEQ.ID.NO.11、SEQ.ID.NO.12、SEQ.ID.NO.13、SEQ.ID.NO.14、SEQ.ID.NO.15及其組合。
如請求項1所述之組合物及方法，其中在轉染至目標細胞中之後，5hmRNA及mhmRNA兩者可進一步轉譯成至少期望蛋白質/肽以用於誘發預先設計之期望生物效應或細胞功能，包括(但不限於)誘導特異性免疫反應、預防病毒感染、抑制病毒複製/組裝及/或抑制腫瘤/癌細胞生長以及引起癌細胞死亡。
如請求項1所述之組合物及方法，其中該5hmRNA及該mhmRNA可進一步在經轉染細胞中加工以產生適用於使至少特異性目標基因沉默之至少shRNA及/或piRNA。
如請求項12所述之組合物及方法，其中該特異性目標基因包括多種疾病相關之細胞及致病基因，諸如病毒及/或癌症相關基因。
如請求項1所述之組合物及方法，其中該解旋酶活性可解繞DNA及RNA兩者之二級結構。
如請求項1所述之組合物及方法，其中該5hmRNA及該mhmRNA之設計適用於研發新醫藥及治療應用，諸如疫苗及/或藥物，以用於抗病毒及/或抗癌療法。
如請求項1所述之組合物及方法，其中該5hmRNA或該mhmRNA或兩者用作抗病毒疫苗之成分。
如請求項1所述之組合物及方法，其中該5hmRNA或該mhmRNA或兩者用作抗癌藥物之成分。
如請求項1所述之組合物及方法，其中該5hmRNA或該mhmRNA或兩者進一步與至少遞送劑混合以用於活體外、離體及/或活體內細胞轉染。
如請求項18所述之組合物及方法，其中該遞送劑包括甘胺醯甘油(glycylglycerins)、脂質體、奈米粒子、脂質奈米粒子、結合分子、輸注化學品、基因槍物質、電穿孔粒子、轉位子及其組合。
如請求項1所述之組合物及方法，其中該經改良緩衝系統含有1×轉錄緩衝液與額外0.001至10 mM甜菜鹼(三甲基甘胺酸，TMG)、二甲亞碸(DMSO)及/或3-(N-嗎啉基)丙烷磺酸(MOPS)及/或其組合。