JP5744375B2 - イントロンｒｎａ技術を用いる組み換え型核酸組成物及び同組み換え型核酸組成物を含む化粧品 - Google Patents

Description

本発明は、スキンケアのための化粧品の開発と生成のための手段に関する。具体的には、本発明は、非天然由来のイントロンを生成するための方法と組成物に関する。同非自然天然由来のイントロンの構成成分は、皮膚細胞によって短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）及び／又はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子となるようにプロセッシング可能であるために、細胞内の皮膚色素に関連する遺伝子及び／又は老化を引き起こす遺伝子に対し、特定の遺伝子サイレンシング効果を誘導することができる。こうして得られた遺伝子サイレンシング効果は、肌色の明るさと美白に役立つのみならず、皮膚内の不必要な老化遺伝子活性を抑制することにも効果的である。

本出願は、２００７年１０月３１日付け、Ｓｈｉ−Ｌｕｎｇ Ｌｉｎ及びＤａｖｉｄ Ｗｕらによる発明の名称が「イントロンＲＮＡ技術を用いる新規化粧品の設計及び製品」である米国仮特許出願に基づく優先権を主張する。本出願はまた、２００３年５月１５日に出願された米国特許出願第１０／４３９，２６２号「ＲＮＡスプライシング及びプロセシング誘導型遺伝子サイレンシング及びその応用」及び２００６年３月３１日に出願された米国特許出願第１１／２７８，１４３号「イントロンＲＮＡを用いる新規遺伝子導入法」の利益を主張し、これらの出願を参照として本明細書にて援用する。

色素沈着（即ち日焼け）及び老化の予防は健康肌を保持するための鍵ではあるが、皮膚色素及び老化過程の多くは個人の遺伝子活性と関連している。例えば、ヒアルロニダーゼ（Ｈｙａｌ）はしばしば、皮膚内の主要なアンチエージング細胞外マトリックスである皮下ヒアルロン酸（ＨＡ）を分解することにより肌のしわを引き起こすが、色素細胞性膜結合の糖タンパク質であるチロシナーゼ（Ｔｙｒ）は、肌及び髪内のメラニン（黒色素）生合成に対する重要な律速酵素である。そのため、良好なスキンケアはこれらの不必要な活性を抑止することによって実現できる。

現在のところ、しわ除去のためのヒアルロニダーゼ阻害剤に関する技術はない。明るい肌及び美白の肌を作るために、チロシナーゼ機能を阻害する多くの従来技術の試みではしばしば、ホルモンに由来する阻害性ペプチド、低分子化学薬品及び数種類の植物エキスを使用してきた。それらの植物エキスとしては、オリゴペプチド（例えば、ピネル（Ｐｉｎｅｌ）による特許文献１、ションロック（Ｓｃｈｏｎｒｏｃｋ）による特許文献２）、ヒドロキシテトロン酸誘導体（例えば、ペリコン（Ｐｅｒｒｉｃｏｎｅ）による特許文献３）、ベンゾイル化合物（例えば、キム（Ｋｉｍ）による特許文献４）、ヒドロキノン組成物（例えば、ウォッズマン（Ｗｏｒｔｚｍａｎ）による特許文献５及び６）、アルコールジオール及びトリオール類似物（例えば、ブラウンによる特許文献７）、コウジ酸誘導体（例えば、アンシラ（Ａｎｃｉｒａ）による特許文献８）、子嚢菌由来の酵素（例えば、マモネ（Ｍａｍｍｏｎｅ）による特許文献９）、及び植物エキス（例えば、ナガミネ（Ｎａｇａｍｉｎｅ）による特許文献１０、リー（Ｌｅｅ）による特許文献１１、ステック（Ｓｔｅｃｋ）による特許文献１２、ポウリ（Ｐａｕｌｙ）による特許文献１３、リベレッテ（Ｌｅｖｅｒｅｔｔ）による特許文献１４、１５及び１６、アルケッテ（Ａｒｑｕｅｔｔｅ）による特許文献１７、１８及び１９、チャウドゥリ（Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ）による特許文献２０及び２１）が含まれる。これらの物質及び方法はインビトロ（ｉｎ−ｖｉｔｒｏ）では良好に作用するが、ヒドロキノンとその誘導体のような僅かの物質のみが臨床試験（非特許文献１）において良好な色素沈着減少効果を誘導することができる。それにもかかわらず、反応性キノンへ誘導される全てのヒドロキノン誘導体は細胞毒性薬剤であると推定される。インビトロでの研究とインビボ（ｉｎ−ｖｉｖｏ）での研究との間のこれらの違いは、それらの安全性と有効性を実証するため革新的な戦略が必要とされることを示唆している。（本願におけるこれらの刊行物、その他全ての引用された刊行物及び特許は、本明細書において参照により援用される。）
最近のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術の進歩に伴い、新規な低分子ＲＮＡ薬剤は、二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ／ｓｉＲＮＡ）（非特許文献２及び非特許文献３）、及びドキシリボヌクレオチドＲＮＡ（ｄｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌａｔｅｄ−ＲＮＡ）干渉分子（例えば、Ｄ−ＲＮＡｉ）（非特許文献４）の使用を含む、標的とされた遺伝子抑制においてより強力な効果を有することが明らかになった。おそらく、これらの低分子ＲＮＡ薬剤はスキンケアのための新規な化粧品設計と製品の開発に利用され得るであろう。原則としては、ＲＮＡｉのメカニズムは、僅かのナノモルの用量で強力な効果を有し、特定の遺伝子機能の抑制が可能な転写後の遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）現象を引き出すが、この用量は、アンチセンスのオリゴヌクレオチドや低分子化学抑制剤（非特許文献５）を使用する従来の遺伝子欠損法よりも、より長い持続効果とより少ない毒性を備えることが証明された。これまでの多くの研究（非特許文献６、非特許文献３、非特許文献４及び非特許文献７）によれば、ｓｉＲＮＡ誘導性遺伝子サイレンシング効果は１週間持続する一方、Ｄ−ＲＮＡｉ効果は一回の治療後、更に１ヶ月までを維持可能である。ｓｉＲＮＡ／Ｄ−ＲＮＡｉ薬剤は、一連の細胞内配列特異的ｍＲＮＡの分解、及び／又は翻訳抑制過程を引き起こし、高度の相同性を示す全ての遺伝子転写産物、即ちコサプレッションに影響を与える。ＲＮａｓｅＩＩＩエンドリボヌクレアーゼ（Ｄｉｃｅｒ）及び／又はＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）による、異常なＲＮＡテンプレートへの酵素活性により低分子ＲＮＡ製品（２１−２５ヌクレオチド塩基）の生成から生じたコサプレッションが観察されている。このコサプレッションは通常、外来の導入遺伝子やウイルスゲノムからの誘導体である（非特許文献６、非特許文献３及び非特許文献４）。この確立されたＲＮＡｉメカニズムに基づき、合成ｓｉＲＮＡ及び／又はｄｓＲＮＡ薬剤を使用してチロシナーゼ機能を阻害しようとする先行技術としては、ベネッティ（Ｂｉｎｅｔｔｉ）による特許文献２２及びコリン−ジャンゴン（Ｃｏｌｌｉｎ−Ｄｊａｎｇｏｎｅ）による特許文献２３が挙げられる。

現行のＲＮＡｉ技術は、皮膚における不必要な遺伝子機能の抑制への新しい道を開いてくれるにも係わらず、これらの出願はいまだに、魚類、鳥類、哺乳類及びヒトを含む高等脊椎動物に対して持続的且つ安全的に作用することを立証していない。例えば、ほとんどのｓｉＲＮＡ薬剤は二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の形態に基づいたものである。この形態は、脊椎動物においてインターフェロンによって媒介された非特異的ＲＮＡ分解を引き起こすことが示されている（非特許文献８、非特許文献３、ロビンソン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）による特許文献２４及びラウ（Ｌａｕ）による特許文献２５）。こうしたインターフェロン媒介性の細胞毒性反応は、ｓｉＲＮＡ誘導性の遺伝子サイレンシング効果の標的特異性を低減し、多くの場合脊椎動物細胞における広範囲なＲＮＡ分解を生ずる（非特許文献８及び非特許文献３）。特に、哺乳類の細胞において、ｓｉＲＮＡ／ｄｓＲＮＡサイズが２５塩基対（ｂｐ）より長い場合、ＲＮＡｉ効果は妨げられることが明らかとなっている（非特許文献３）。サイズが２５ｂｐ未満のｓｉＲＮＡ又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）のトランスフェクションはこのような問題を完全に解消することができないだろう。それはスレッズ（Ｓｌｅｄｚ）他の非特許文献９及びリン（Ｌｉｎ）他の非特許文献１０に報告されているように、高用量のｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ（例えば、ヒトＴ細胞において＞２５０ ｎＭ）は、高用量の長鎖ｄｓＲＮＡに類似した強い細胞毒性効果を引き起こすことが可能だからである。この毒性はそれらが有する二本鎖ＲＮＡ形態によるものであり、同形態はインターフェロン媒介性の非特異的ＲＮＡ分解及び細胞性ＰＫＲ及び２−５Ａシステムのシグナル経路を介するプログラム細胞死を促進させる。インターフェロン誘導性２’，５’−オリゴアデニル酸合成酵素活性（２−５Ａ）システムの活性化が一本鎖ＲＮＡ（即ちｍＲＮＡ）の大きい切断へ誘導される場合にインターフェロン誘導性のプロテインキナーゼＰＫＲが細胞アポトーシスを誘発することは周知である（非特許文献８）。ＰＫＲ及び２−５Ａシステムのいずれも、二本鎖ＲＮＡの形態への高い親和性を有するｄｓＲＮＡ結合モチーフを含んでいる。更に、最も難しい問題は、高等脊椎動物における大量のＲＮａｓｅ活性により、インビボにてこれらの小さくかつ不安定なｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ構築物を送達することが不可能な点にある（非特許文献１１）。

ＲＮＡｉ効果は、外来の導入遺伝子又はウイルスゲノムに由来する転写テンプレートから、低分子ＲＮＡ製品（２１−２５ヌクレオチド塩基）の製造により自然に引き起こされるため（非特許文献６及び非特許文献４）、Ｐｏｌ−ＩＩＩによって媒介されたｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ表現ベクタの最近の利用は、インビボで比較的安定なＲＮＡｉの効果を提供する。（非特許文献１２）。このようなベクタに基づいたｓｉＲＮＡの試みを試した先行技術（非特許文献１３、非特許文献１４及び非特許文献１５）は、一定した遺伝子サイレンシング効果を維持することに成功した。彼らの戦略が目標とされた細胞又は組織集団に対するＲＮＡｉ効果への集中に失敗したのは、ユビキタスタイプのＩＩＩ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ−ＩＩＩ）プロモータを使用したためであった。Ｕ６及びＨ１のようなＰｏｌ−ＩＩＩプロモータはほとんど全てのタイプの細胞において活性化され、組織特異性遺伝子のターゲティングを不可能にする。しかも適切な集結部が存在しない短鎖ＲＮＡテンプレートにおいては多くの場合Ｐｏｌ−ＩＩＩ転写のリードスルー（ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）活性の漏れが起こるので、所望とされる２５ｂｐより長い高分子ＲＮＡ製品が合成され、予想外のインターフェロン細胞毒性を引き起こすことになる（非特許文献１６及び非特許文献１７）。このような問題はまた、Ｐｏｌ−ＩＩＩプロモータともう一つのベクタプロモータ（即ち、ＬＴＲとＣＭＶプロモータ）との間での競合的対立に起因し得る。その上、Ｐｏｌ−ＩＩＩ依存性ＲＮＡｉシステムから生成されたｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡの高濃度は、細胞性天然マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）経路を過度に飽和させ、そのためにｍｉＲＮＡの大規模な阻害と細胞死が引き起こされることが最近になって注目されてきた（非特許文献１８）。これらの不都合は健康管理においてＰｏｌ−ＩＩＩベースのＲＮＡｉベクタシステムの使用を妨げてしまう。
米国特許第７，２６８，１０８号 米国特許第６，８５２，６９９号 米国特許第７，０１９，０２９号 米国特許第６，８３８，４８１号 米国特許第６，９９８，１３０号 米国特許第７，０２５，９７７号 米国特許第７，２５０，１５７号 米国特許第６，７１０，０７６号 米国特許第６，５１４，５０６号 米国特許第７，１９２，６１７号 米国特許第７，１２５，５７２号 米国特許第６，５２１，２６７号 米国特許第７，１０５，１８４号 米国特許第６，９９４，８７４号 米国特許第７，０６０，３０４号 米国特許第７，２４７，３２１号 米国特許第７，０２５，９５７号 米国特許第７，０２９，７０９号 米国特許第７，０９７，８６６号 米国特許第６，６４９，１５０号 米国特許第６，９６９，５０９号 米国特許出願公開第２００５０１３７１５１号 米国特許出願公開第２００７０１３４１８８号 米国特許第４，２８９，８５０号 米国特許第６，１５９，７１４号 Ｓｏｌａｎｏ他、Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．、第１９巻、第５５０−５７１頁、２００６年 Ｆｉｒｅ他、Ｎａｔｕｒｅ、第３９１巻、第８０６−８１１頁、１９９８年 Ｅｌｂａｓｈｉｒ他、Ｎａｔｕｒｅ、第４１１巻、第４９４−４９８頁、２００１年 Ｌｉｎ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、第２８１巻、第６３９−６４４頁、２００１年 Ｌｉｎ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ、第１巻、第２４１−２４７頁、２００１年 Ｇｒａｎｔ，Ｓ．Ｒ．、Ｃｅｌｌ、第９６巻、第３０３−３０６頁、１９９９年、 Ｌｉｎ他、Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ Ｒｅｖｉｅｗｓ、第１巻、第２４７−２５５頁、２００４年ａ Ｓｔａｒｋ他、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第６７巻、第２２７−２６４頁、１９９８年 Ｓｌｅｄｚ他、Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、第５巻、第８３４−８３９頁、２００３年、 Ｌｉｎ他、Ｉｎｔｒｎ’ｌ Ｊ． Ｏｎｃｏｌ．、第２４巻、第８１−８８頁、２００４年ｂ Ｂｒａｎｔｌ Ｓ．、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、第１５７５巻、第１５−２５頁、２００２年 Ｔｕｓｃｈｌ他、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、第２０巻、第４４６−４４８頁、２００２年 Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ他、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、第２０巻、第４９７−５００頁、２００２年 Ｌｅｅ他、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、第２０巻、第５００−５０５頁、２００２年 Ｐａｕｌ他、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、第２０巻、第５０５−５０８頁、２００２年 Ｇｕｎｎｅｒｙ他、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．、第２８６巻、第７４５、７５７頁、１９９９年 Ｓｃｈｒａｍｍ他、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ、第１６巻、第２５９３−２６２０頁、２００２年 Ｇｒｉｍｍ他、Ｎａｔｕｒｅ、第４４１巻、第５３７−５４１頁、２００６年

皮膚のヘルスケアのための現行のＲＮＡｉ技術に関する送達の安定性、標的特異性及び安全性を改善するために、好ましい誘導及び維持の戦略が大いに期待されている。従って、効果的であり、安定かつ安全な遺伝子の調製法の必要性、及び新規なＲＮＡｉメカニズムを使用して皮膚における不必要な遺伝子機能を抑制するための薬剤組成物に対する必要性は今も存在している。

上述の目的を解決するために、請求項１に記載の発明は、ＲＮＡスプライシング／プロセッシングに関連した遺伝子サイレンシングを導入するための組み換え型核酸組成物であって、スキンケアのための化粧品を生成する方法に使用するための組み換え型核酸組成物において、同組み換え型核酸組成物は、（ａ）哺乳動物の皮膚細胞において、色素に関連する遺伝子及び老化を引き起こす遺伝子の少なくとも１つにおいて特定の遺伝子サイレンシング効果を誘導するマイクロＲＮＡ又はｓｈＲＮＡをコードするイントロン挿入物を含む少なくとも１つのイントロンであって、前記イントロンは、エキソンに隣接し且つ、細胞内ＲＮＡスプライシング及びプロセッシングの少なくとも一方を行う機構によって前記エキソンから切断され得るイントロンと、（ｂ）複数のエキソンであって、前記エキソンは所望の機能を備えた遺伝子を形成するよう連結されるエキソンと、を含み、イントロン挿入物は、配列番号８又は配列番号１０の配列を有するマイクロＲＮＡ又はｓｈＲＮＡをコードするものである、組み換え型核酸組成物を提供する。

請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の組み換え型核酸組成物が、（ａ）前記組み換え型核酸組成物のＲＮＡ転写物を発現するための発現可能なベクタを用いてライゲーションするために使用される少なくとも１つの多重制限／クローニング部位と、（ｂ）前記組み換え型核酸組成物の正確な大きさのＲＮＡ転写物を生成するために使用される複数の転写及び翻訳の少なくとも一方のための複数の終了部位と、を更に含むことを特徴とする。

請求項３に記載の発明は、請求項１に記載の組み換え型核酸組成物において、イントロンは、（ａ）供与スプライス部位及び受容のスプライス部位と、（ｂ）分枝点ドメインと、（ｃ）少なくとも１つのポリピリミジン領域と、をさらに含むことを特徴とする。

請求項４に記載の発明は、請求項１に記載の組み換え型核酸組成物において、色素に関連する遺伝子及び老化を引き起こす遺伝子のうちの少なくとも１つは、チロシナーゼ遺伝子、ヒアルロニダーゼ遺伝子、及びそれらの組み合わせからなる群より選択された少なくとも１つの遺伝子であることを特徴とする。

請求項５に記載の発明は、請求項１に記載の組み換え型核酸組成物において、イントロン挿入物は、配列番号１の配列を有する機能性ステムループ構造を含むヘアピン様核酸であることを特徴とする。

請求項６に記載の発明は、請求項３に記載の組み換え型核酸組成物において、分枝点は、配列番号５の配列を含む核酸配列内に位置するアデノシン（Ａ）ヌクレオチドであることを特徴とする。

請求項７に記載の発明は、請求項３に記載の組み換え型核酸組成物において、分枝点は、５’−ＴＡＣＴＡＡＣ−３’の配列を有する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドモチーフを含む核酸配列内に位置するアデノシン（Ａ）ヌクレオチドであることを特徴とする。

請求項８に記載の発明は、請求項３に記載の組み換え型核酸組成物において、ポリピリミジン領域は、配列番号６又は配列番号７の配列を含むＴ又はＣを高含量にて含む核酸配列であることを特徴とする。

請求項９に記載の発明は、請求項３に記載の組み換え型核酸組成物において、供与スプライス部位は、配列番号３の配列を含む核酸配列であることを特徴とする。

請求項１０に記載の発明は、請求項３に記載の組み換え型核酸組成物において、供与スプライス部位は、５’−ＧＴＡＡＧ−３’の配列を含む核酸配列であることを特徴とする。

請求項１１に記載の発明は、請求項３に記載の組み換え型核酸組成物において、受容スプライス部位は、配列番号４の配列を含む核酸配列であることを特徴とする。

請求項１２に記載の発明は、請求項３に記載の組み換え型核酸組成物において、受容スプライス部位は、５’−ＣＴＧＣＡＧ−３’の配列を含む核酸配列であることを特徴とする。
請求項１３に記載の発明は、美白の肌及び明るい肌とするための化粧品であって、同化粧品は、皮膚色素に関連する遺伝子及び老化を引き起こす遺伝子のうちの少なくとも一方に対して特定の遺伝子サイレンシング効果を誘導するための組み換え型核酸組成物を含み、同組み換え核酸組成物は、請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の組み換え核酸組成物である、化粧品、を提供する。

遺伝子転写（例えば、ｍＲＮＡ）に基づいてタンパク質コーディングエキソンの集合に関する研究は文献において完全に記述され、当然のことながら、スプライスされたノンコーディングイントロンは完全に消化される運命にある（Ｎｏｔｔ他、ＲＮＡ、第９巻、第６０７−６１７頁、２００３年）。遺伝子のイントロンタンパク質は機能を持たない遺伝子老廃物であるか、またはその機能が未だに発見されていないか、というもの事実である。最近、この誤解はイントロンマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の観察によって修正された（Ｌｉｎ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．、第３１０巻、第７５４−７６０頁、２００３年；Ｙｉｎｇ他、Ｇｅｎｅ、第３４２巻、第２５−２８頁、２００４年；Ｙｉｎｇ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．、第３２６巻、第５１５−５２０頁、２００５年）。イントロンｍｉＲＮＡは、遺伝子イントロンに由来する新しいクラスの低分子の一本鎖調節性ＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）であり、それはコーディング遺伝子の前駆メッセンジャーＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）からスプライスアウトされ、更に短鎖ヘアピン様ｍｉＲＮＡに加工される。ｍｉＲＮＡは通常、１８−２７のヌクレオチド（ｎｔ）長を有しており、ｍｉＲＮＡとその標的との間における相補性に従い、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の標的を低下させるか、標的とされたｍＲＮＡのタンパク質翻訳を抑制することができる。この様にして、イントロンｍｉＲＮＡは機能的に前述のｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡに類似しているが、ＩＩ型ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ−ＩＩ）転写と生物発生のためのＲＮＡスプライシングに関する細胞内処理への要件は異なっている（非特許文献４）。また、イントロンは、細胞内のナンセンス変異依存性分解機構（ＮＭＤ）による認識のための複数の翻訳停止コドンを自然に含んでいるため（Ｚｈａｎｇ他、Ｎａｔｕｒｅ、第３７２巻、第８０９−８１２頁、１９９４年；Ｌｅｗｉｓ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第１００巻、第１８９−１９２頁、２００３年）、大部分の構築化されないイントロン配列は、細胞にとっては有毒である過度の蓄積を防ぐためにＲＮＡスプライシングの後に速やかに分解され得る。およそ１０％−３０％のスプライスされたイントロンは、ＮＭＤ消化後に保留され、そして更に、穏やかな半減期で細胞質に輸送されることが既に測定されており、天然由来のイントロンｍｉＲＮＡの細胞起源を示唆するものである（Ｃｌｅｍｅｎｔ他、ＲＮＡ、第５巻、第２０６−２２０頁、１９９９年）。

図１に示されるように、天然イントロンｍｉＲＮＡの生物発生は、ゲノムのペリクロマチン繊維に近い特定の核区域内において起こっている、発生期のＰｏｌ−ＩＩ媒介性ｐｒｅ−ｍＲＮＡ転写とイントロンスプライシング／除去との間における連結相互作用に依存している（非特許文献７及びＧｈｏｓｈ他、ＲＮＡ、第６巻、第１３２５−１３３４頁、２０００年）。真核生物においては、ｍＲＮＡのようなタンパク質コーディングの遺伝子転写はＩＩ型ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ−ＩＩ）によって発生する。ゲノム遺伝子の転写は、前駆メッセンジャーＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）を生成する。その前駆メッセンジャーＲＮＡは５’−非翻訳領域（ＵＴＲ）と、タンパク質コーディングエキソンと、ノンコーディングイントロンと３’−ＵＴＲとの四つの主要部分を含んでいる。概して言うと、５’−と３’−ＵＴＲはいずれもイントロン拡張の一種と見られている。イントロンはｐｒｅ−ｍＲＮＡにおいてノンコーディング配列の最大部分を占有している。各イントロンは最大３０キロ塩基までの範囲を含み、しかも、ｍＲＮＡ成熟の前にｐｒｅ−ｍＲＮＡ含有量からの除去が求められる。このｐｒｅ−ｍＲＮＡ切除とイントロン除去の過程はＲＮＡスプライシングと呼ばれ、細胞内のスプライセオソームによって実行される。ＲＮＡスプライシングの後、いくつかのイントロン由来のＲＮＡフラグメントは更に、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）由来分子を形成するように処理される。同分子は、ｐｒｅ−ｍＲＮＡのエキソンがタンパク質合成のための成熟ｍＲＮＡを形成するように合わせて結合される時に、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）様メカニズムを通してそれぞれの標的遺伝子を有効にサイレンシグさせる。

我々は既に、効果的な成熟ｍｉＲＮＡが脊椎動物遺伝子のイントロンから生成できることを立証した。その生物発生過程はｓｉＲＮＡ及び遺伝子間ｍｉＲＮＡの過程とは異なっている（Ｌｉｎ他、２００３年、前出、Ｌｉｎ他、Ｇｅｎｅ、第３５６巻、第３２−３８頁、２００５年）。それらの差異を立証するため、図２には、ｓｉＲＮＡ、遺伝子間の（エキソンの）ｍｉＲＮＡ及びイントロンｍｉＲＮＡにおける生来の生物発生及びＲＮＡｉメカニズムの比較が示されている。推定上、ｓｉＲＮＡは、一つのＤＮＡテンプレートからの逆位に置かれた二つのプロモータで転写された二つの完全相補ＲＮＡによって形成され、次いでハイブリダイズされ、更にＲＮａｓｅＩＩＩエンドリボヌクレアーゼ、即ちダイサー（Ｄｉｃｅｒ）によって２０−２５ｂｐの二本鎖体へと加工される。このｓｉＲＮＡモデルと異なって、遺伝子間のｍｉＲＮＡ、例えばｌｉｎ−４及びｌｅｔ−７の生物発生は、長いノンコーディング前駆ＲＮＡ転写又は一次転写（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）に係わっている。その転写はＰｏｌ−ＩＩ又はＰｏｌ−ＩＩＩ ＲＮＡプロモータから直接に転写されるものだが、一方イントロンｐｒｉ−ｍｉＲＮＡはＰｏｌ−ＩＩのみでその符号化遺伝子を用いて共同転写され、スプライスされたイントロンとしてＲＮＡスプライシングの後に放出される。細胞核において、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは更に、Ｄｒｏｓｈａ様ＲＮａｓｅｓ（遺伝子間のｍｉＲＮＡのためのもの）又はＮＭＤ機構（イントロンｍｉＲＮＡのためのもの）で切除され、ヘアピン様ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡと呼ばれたステムループ前駆体を形成する。その後、ｍｉＲＮＡ関連ダイサー（Ｄｉｃｅｒ＊）により成熟ｍｉＲＮＡに加工されるべく細胞質へ輸送される。その後、３つの低分子調節性ＲＮＡは全て、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）へ取り込まれる。ＲＩＳＣはｓｉＲＮＡの鎖又は一本鎖ｍｉＲＮＡのいずれかを含んでいる。ｓｉＲＮＡ経路及びｍｉＲＮＡ経路のためのダイサー及びＲＩＳＣは異なっていることが周知である（Ｔａｎｇ，Ｇ．、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ．、第３０巻、第１０６−１１４頁、２００５年）。結果として、ｍｉＲＮＡの効果は通常、ｓｉＲＮＡと比較してより特異的であり、かつ有害性は小さい。その理由は単一の鎖が係わっているためである。一方、ｓｉＲＮＡｓは最初にｍＲＮＡ分解を引き起こすが、ｍｉＲＮＡは標的遺伝子転写への配列相補性に依存してｍＲＮＡ分解又はタンパク質合成の抑制のいずれか、或いは、両方を誘導することができる。イントロンｍｉＲＮＡ経路は、Ｐｏｌ−ＩＩ転写、ＲＮＡスプライシング及びＮＭＤ処理を含む複数の細胞内調節システムによって良好に調整されるため、イントロンｍｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング効果は３つのＲＮＡｉ経路の中で、最も有効的であり、特異的かつ安全だと思われる（Ｌｉｎ他、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、第１３巻、第２２１６−２２３０頁、２００８年）。

本発明は、遺伝子規則とそれが関連した実用の観点においてイントロンの新しい機能を開示している。図３Ａ及び図３Ｂに示されるように、イントロンＲＮＡスプライシング及びプロセッシングのメカニズムに基づき、本発明の好ましい実施例は、少なくとも一つのスプライシング可能なイントロン、即ちＳｐＲＮＡｉ、を含むＰｏｌ−ＩＩ誘導型の組み換え遺伝子発現システムであり、イントロン配列に対して高相補性を有する不必要な遺伝子機能を阻害することができる。このＳｐＲＮＡｉは組み換え遺伝子の前駆ｍＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）と共に、Ｐｏｌ−ＩＩ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐ）によって共同転写され、ＲＮＡスプライシングによってｐｒｅ−ｍＲＮＡが切断される。その後、スプライシングされたＳｐＲＮＡｉは更に、ｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡのような成熟遺伝子サイレンシング薬剤にプロセッシングされ、ＲＮＡｉ関連の遺伝子サイレンシングを引き起こすことが可能となる。イントロン除去後、組み換え遺伝子転写物のエキソンはマーカ又は機能性タンパク質の翻訳合成のため、共に結合されて成熟ｍＲＮＡ分子を形成する。

図３Ａに示されるように、ＳｐＲＮＡｉイントロンの必須構成要素は５’スプライス部位、分枝点のモチーフ（ＢｒＰ）、ポリピリミジン領域（ＰＰＴ）及び３’スプライス部位によって構成されるいくつかのコンセンサスヌクレオチド要素を含んでいる。その上、ヘアピンｓｈＲＮＡ様ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列は、５’スプライス部位と分枝点のモチーフ（ＢｒＰ）との間に位置しているＳｐＲＮＡｉイントロンの内部に挿入されている。このイントロンの部分は通常、ＲＮＡスプライシング及びプロセッシング時にラリアット構造を形成する。本発明者らは、ヘリカーゼであるスプライセオソーム型Ｕ２及びＵ６ ｓｎＲＮＰの両方がｐｒｅ−ｍｉＲＮＡになるようラリアットＲＮＡフラグメントの巻き戻しと切除とに係わっていることを発見したが、詳細なプロセスは解明されていない。更に、ＳｐＲＮＡｉ構築物の３’−末端はイントロンＲＮＡスプライシングとＮＭＤ処理の正確性を向上するように複数の翻訳終止コドン領域（Ｔコドン）を含んでいる。細胞質型ｍＲＮＡに存在している場合、このＴコドンは細胞内の非構造型ＲＮＡの蓄積を低減するようにナンセンス変異依存性分解（ＮＭＤ）経路の活性に信号を送る。しかしながら、高度二次構造型ｓｈＲＮＡ及びｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの挿入は、成熟ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡをそれぞれを形成するように、更なるＤｉｃｅｒ切断のために保留される。その上に、細胞内発現のため、サンゴ礁のＨｅｔｅｒａｃｔｉｓ ｃｒｉｓｐａの変異色素タンパク質から単離された赤色蛍光タンパク質（ＲＧＦＰ）遺伝子のＤｒａＩＩ制限部位にＳｐＲＮＡｉ構築物を手動で組み込み、それにより組み換え型ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ遺伝子を形成した。制限酵素ＤｒａＩＩによる２０８番目のヌクレオチド部位におけるＲＧＦＰ切断は、それぞれの末端において３つの休止ヌクレオチドでＡＧ−ＧＮヌクレオチド切断を生成し、ＳｐＲＮＡｉ挿入後にそれぞれの末端は５’と３’のスプライス部位を形成する。このイントロン挿入が、イントロンスプライシングにより回復され得る機能型ＲＧＦＰタンパク質の構造を破壊するため、影響を受けた細胞の周囲で赤いＲＧＦＰの出現によりイントロンｓｈＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ及びＲＧＦＰ−ｍＲＮＡ成熟の放出が決定される。ＲＧＦＰ遺伝子はまた、複数のエキソンのスプライシング促進剤（ＥＳＥ）も提供し、ＲＮＡスプライシングの正確性と効果とを向上させる。

もう一つの好ましい実施例では（図３Ｂ）、本発明は合成ＲＮＡスプライシング及び、５’スプライス部位、分枝点のモチーフ（ＢｒＰ）、ポリピリミジン領域（ＰＰＴ）、及び３’−スプライス部位のような処理要素を使用するための遺伝子工学法を提供し、アンチセンスＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）及び／またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の製造のための、少なくとも一つの所望のＲＮＡ挿入物を含む人工のＳｐＲＮＡｉイントロンを形成する。ＤＮＡ合成装置はこれらの要素を化学的に製造したり、結合したりすることができる。代わりに、これらの要素の連結は、酵素の制限と連結によって実現できる。こうして得られたイントロンは、関係のある細胞へのトランスフェクションのために直接に使用できるか、或いは、Ｐｏｌ−ＩＩによる遺伝子転写（即ちｐｒｅ−ｍＲＮＡ）との共同発現のために細胞遺伝子への更なる取り込みができる。ＲＮＡスプライシング及びｍＲＮＡ成熟時において、所望のＲＮＡ挿入物は、細胞内スプライセオソームとＮＭＤメカニズムによって切除されて放出される。そして、所望の遺伝子機能の発現のため、組み換え遺伝子転写のエキソンが一緒に連結されて成熟ｍＲＮＡを形成する時、挿入ＲＮＡ配列へ、特定の遺伝子転写に対する所望の遺伝子サイレンシングの高相補性効果を引き起こす。ここで、所望の遺伝子機能とは、赤色／緑色蛍光タンパク質（ＲＧＦＰ／ＥＧＦＰ）、発光酵素、ｌａｃ−Ｚ及びそれらの誘導型類似体からなる群より選択されたレポータ又はマーカタンパク質の翻訳のようなものである。レポータ／マーカタンパク質の存在は、影響を受けた細胞内に挿入ｓｈＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ分子の生成物を配置するのに有用であり、所望の遺伝子サイレンシング／ＲＮＡｉ効果の識別を容易にする。

本発明によれば、エキソンの連結により形成された成熟ｍＲＮＡは、また、障害のある、或いは欠失した遺伝子機能の置き換え、又は特定の遺伝子発現の増加について従来の遺伝子治療においても有用である。別の態様において、本発明は、標的遺伝子機能の阻害に有用である、アンチセンス型遺伝子ノックアウト又はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）効果のいずれかを引き出すように、イントロンＲＮＡスプライシング及びプロセッシングのメカニズムによって遺伝子サイレンシング分子の細胞製造を誘導するための新規な組成物及び手段を提供する。こうして得られたイントロン由来の遺伝子サイレンシング分子は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、短い一時的なＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、非常に低分子のノンコーディングＲＮＡ（ｔｎｃＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及びＲＮＡｉ関連性前駆体ＲＮＡ構築物（ｐｒｉ−／ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）を含む。これらイントロンＲＮＡ由来の遺伝子サイレンシング薬剤の使用は、病原性導入遺伝子、ウイルス遺伝子、変異体遺伝子、発ガン遺伝子、疾病関連低分子ＲＮＡ遺伝子及びその他任意のタンパク質コーディング遺伝子並びにその他任意のノンコーディング遺伝子から構成される群より選択された不必要な遺伝子のターゲティングとサイレンシングにとって有力なツールとなる。

本発明のこのＰｏｌ−ＩＩ媒介型ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ発現系を利用することにより、本発明者らは、ヒトの前立腺ガンＬＮＣａＰ、ヒトの子宮頚ガンＨｅＬａ及びラットの神経幹ＨＣＮ−Ａ９４−２細胞において、（Ｌｉｎ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．、第３４２巻、第２９５−３１２頁、２００６年ａ）、及びゼブラフィッシュ、ニワトリ及びマウスのインビボにおいて（Ｌｉｎ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．、第３４２巻、第３２１−３３４頁、２００６年ｂ）、完全な遺伝子サイレンシングキャパシティを備えた成熟ｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ分子の生成に成功した。緑色ＥＧＦＰ並びにゼブラフィッシュ及び種々のヒト細胞系内の他の細胞遺伝子発現を標的とする異なるｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ挿入構築物を試験し、効果的な遺伝子サイレンシングｍｉＲＮＡｓは、５’スプライス部位と分枝点との間のイントロン配列の５’近傍性（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ）に由来することを確認した。図３Ｃに示されるように、強い遺伝子サイレンシング効果は、アンチＥＧＦＰ ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ挿入物（レーン４）のトランスフェクションにおいてのみ発生する一方、左から右へのレーン（１：ブランクのベクタ対照（Ｃｔｌ）、２：ＨＩＶ−ｐ２４を標的とするｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ挿入物（ｍｏｃｋ）、３：ヘアピンループ構造を備えていないアンチセンスＥＧＦＰ挿入物（ａｎｔｉ）、及び５：アンチＥＧＦＰ ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ＊）に対して完全に相補性を有する逆ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列、によって示された他の挿入物からは、効果はまったく検知されない。マーカＲＧＦＰとハウスキーピングβアクチンのような標的ではない遺伝子に対する効果は検知されておらず、このようなイントロンｍｉＲＮＡ媒介型ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は非常に標的特定性であることを示唆している。イントロンＲＮＡｉ効果におけるＲＮＡスプライシングの役割を更に確認するために、発明者らは、左から右へのレーン（１：任意のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ挿入物が存在しないでベクタイントロンフリーＲＧＦＰを発現するベクタ、２：イントロンアンチＥＧＦＰ ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ挿入物が存在した状態でベクタＲＧＦＰを発現するベクタ、３：２の構築物に類似するがＳｐＲＮＡｉイントロンにおける欠損５’スプライス部位を有するベクタ）により、図３Ｄで示されるような、３つの異なるＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ発現系も試験した。結果として、ノーザンブロット分析は、成熟ｍｉＲＮＡは、図３ＣのアンチＥＧＦＰ ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ挿入物を備えたＳｐＲＮＡｉベクタ構築物と同一のものであるベクタ２構築物のスプライスされたイントロンからのみ開放されたことを示し、ベクタ、イントロンｍｉＲＮＡ生物発生のために細胞ＲＮＡスプライシングが必要であることを示している。

上述のような理解の後に、本発明者らは、最大の遺伝子サイレンシング効果を誘導するためにｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ挿入物の最適な構造設計を決定し、強い構造バイアス（ｂｉａｓ）は、ＲＮＡｉエフェクタ、ＲＮＡ誘導型遺伝子サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）のアセンブリ時に、成熟ｍｉＲＮＡ鎖の細胞選択に存在することを確認した（Ｌｉｎ他、Ｇｅｎｅ、第３５６巻、第３２−３８頁、２００５年）。ＲＩＳＣはタンパク質ＲＮＡ複合体であり、ＲＮＡｉメカニズムにより標的遺伝子転写物の分解又は翻訳抑制のいずれかを誘導する。ｓｉＲＮＡ二本鎖体の形成は、ｓｉＲＮＡ関連ＲＩＳＣのアセンブリにおいて主要な役割を果たしている。ｓｉＲＮＡ二本鎖体の２つの鎖は機能的に非対称的になっている。しかしながら、ＲＩＳＣ複合体へのアセンブリはただ一つの鎖に対して優先的である。このような優先性は、鎖中の各５’末端塩基対の熱力学安定性によって決定される。このｓｉＲＮＡモデルに基づきｍｉＲＮＡの形成及びその相補的ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ＊）二本鎖体の形成は、ｍｉＲＮＡ関連ＲＩＳＣのアセンブリにおいて必要な工程と考えられた。これが事実であれば、機能バイアスはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのステムループ構造においてはまったく観察されないであろう。それにもかかわらず、本発明者らは、イントロンｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのステムループ定位が、ゼブラフィッシュ内のＲＩＳＣアセンブリのための成熟ｍｉＲＮＡに関する鎖の選択に関連していることを観察した。

図４Ａに示されるように、本発明者らは一対の対称ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ構築物、即ちｍｉＲＮＡ＊ステムループｍｉＲＮＡ［１］及びｍｉＲＮＡステムループｍｉＲＮＡ＊［２］をぞれぞれ含む、２つの異なるイントロンｍｉＲＮＡ挿入型ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ発現ベクタを構築した。２つのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡとも、同一の二本鎖ステムアーム構造を含んでいる。その構造はＥＧＦＰヌクレオチドの第２８０−３０２番の配列に対して誘導される。ここでの定義については、ｍｉＲＮＡは成熟マイクロＲＮＡの正確に完全な配列を意味しており、一方、ｍｉＲＮＡ＊は、成熟マイクロＲＮＡ配列に対して相補的な逆ヌクレオチド配列を意味している。これらのｍｉＲＮＡ発現ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰベクタ（それぞれ６０μｇ）を２週齢のゼブラフィッシュ稚魚へ２４時間リポソームトランスフェクションさせた後（Ｌｉｎ他、２００５年、前出）、本発明者らはｍｉＲＮＡ単離カラム（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を使用してゼブラフィッシュの低分子ＲＮＡを単離し、次いで、標的ＥＧＦＰ領域と一致する可能性のあるｍｉＲＮＡを全て、標的配列を含むラテックスビーズにより沈殿させた。シークエンシング後、１つの効果的なｍｉＲＮＡ同一物であるｍｉＲ−ＥＧＦＰ（２８０−３０２）が、図４Ａに示されるように、５’−ｍｉＲＮＡステムループｍｉＲＮＡ＊−３’構築物［２］のトランスフェクションにおいて活性であることを確認した（灰色で陰影付けられた配列）。成熟ｍｉＲＮＡは、［２］５’−ｍｉＲＮＡステムループｍｉＲＮＡ＊−３’構築物によってトランスフェクションされたゼブラフィッシュにおいてのみ検知されるので、ｍｉＲＮＡ関連ＲＩＳＣは［１］ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡよりはむしろ、構築物［２］と好ましくは相互作用をする必要があり、そのことはイントロンｍｉＲＮＡ−ＲＩＳＣアセンブリのための構造バイアスの存在を立証する。この実験において、本発明者らはアクチンプロモータ誘導性のＴｇ（ＵＡＳ：ｇｆｐ）種のゼブラフィッシュ、即ちＴｇ（アクチンＧＡＬ４：ＵＡＳ−ｇｆｐ）を使用しており、Ｔｇは殆どの細胞タイプの魚体内にて緑色蛍光ＥＧＦＰタンパク質を構成的に発現する。図４Ｂに示されるように、これらのゼブラフィッシュ内のＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰベクタのトランスフェクションは、標的ＥＧＦＰをサイレンシングさせ、赤色蛍光マーカタンパク質ＲＧＦＰを共に発現し、影響を受けた細胞内においてイントロンｍｉＲＮＡ生成の陽性指標として使用される。消化管内の遺伝子サイレンシング効果はおそらくこの領域内のＲＮａｓｅの高活性により他の組織より幾分低くなっている。更に、ウエスタンブロット分析（図４Ｃ）に基づけば、指標であるＲＧＦＰタンパク質発現は、５’−ｍｉＲＮＡ＊ステムループｍｉＲＮＡ−３’又は５’−ｍｉＲＮＡステムループｍｉＲＮＡ＊−３’ ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのいずれかでトランスフェクトされた魚の両方において検知される。一方、標的ＥＧＦＰ発現（緑色）の遺伝子サイレンシングは、５’−ｍｉＲＮＡステムループｍｉＲＮＡ＊−３’ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ構築物［２］でトランスフェクトされた魚においてのみ検知され、そのことは図４Ｂの結果を実証する。両方のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ構築物の５’末端ステムアームの耐熱性は同じであるので、本発明者らは、イントロンｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのステムループはＲＩＳＣアセンブリ時において、成熟ｍｉＲＮＡ配列の鎖の選択に関わっているとの結論に達した。ステムアームにおけるダイサーの切断部位は成熟ｍｉＲＮＡの鎖の選択を決定するものとして知られている（Ｌｅｅ他、Ｎａｔｕｒｅ、第４２５巻、第４１５−４１９頁、２００３年）と仮定した場合、イントロンｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのステムループは、特別な切断部位を識別するための決定要素として機能するであろう。

前述の設計において、天然のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡステムループ構造の多くはサイズが大きすぎて効率的な発現のためのＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ発現ベクタに適していないため、本発明者らは、天然のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡループに代えて、短いｔＲＮＡ^ｍｅｔループ（即ち、５’−（Ａ／Ｕ）ＵＣＣＡＡＧＧＧＧＧ−３’）（配列番号２６）を使用する必要がある。ｔＲＮＡ^ｍｅｔループは、同一のＲａｎ−ＧＴＰ及びＥｘｐｏｒｔｉｎ−５の輸送メカニズムを介して核から細胞質への設計されたｍｉＲＮＡｓの輸出を効率的に促進することが示されている（Ｌｉｎ他、２００５年、前出）。現在のところ、本発明は手動で改良されたｐｒｅ−ｍｉｒ−３０２ループ（即ち、５’−ＧＣＴＡＡＧＣＣＡＧＧＣ−３’（配列番号１）及び５’−ＧＣＣＴＧＧＣＴＴＡＧＣ−３’（配列番号２））の対を使用しており、それらは、ｔＲＮＡ輸送を干渉せずに、天然ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡと同様の核輸送効率を提供する。これらの新しいｐｒｅ−ｍｉＲＮＡループに関する設計は、ｍｉｒ−３０２ｓの短いステムループの模擬修正に基づいており、それは、他の分化組織細胞内ではなく、ＥＳ細胞において高度に発現される。このため、これらの人工ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡループの使用は、我々の体内の天然ｍｉＲＮＡ経路に干渉を与えないであろう。

ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ挿入については、組み換え型ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ遺伝子のイントロン挿入部位はその５’及び３’末端のそれぞれにおいてＰｖｕＩ及びＭｌｕＩの制限部位に隣接しているので、イントロン一次挿入物は、一致する付着末端を有する種々の遺伝子特異的ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ挿入物（例えば、抗ＥＧＦＰ及びアンチＴｙｒ ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）により簡単に除去されたり、置き換えられたりされる。異なる遺伝子転写物に誘導されるｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ挿入物を変更することにより、このイントロンｍｉＲＮＡ生成システムは、インビトロ及びインビボにおいて標的遺伝子サイレンシングを誘導するための、有力なツールとして機能を発揮することができる。正確な挿入サイズを確認するため、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ挿入ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ遺伝子（１０ｎｇ）は、９４℃、５２℃、そして、７０℃のそれぞれの温度で各一分間での２５サイクルの条件で、一対のオリゴヌクレオチドプライマー（即ち、５’−ＣＴＣＧＡＧＣＡＴＧ ＧＴＧＡＧＣＧＧＣＣ ＴＧＣＴＧＡＡ−３’（配列番号２１）及び５’−ＴＣＴＡＧＡＡＧＴＴ ＧＧＣＣＴＴＣＴＣＧ ＧＧＣＡＧＧＴ−３’（配列番号２２））を用いてポリメラーゼの連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅され得る。得られたＰＣＲ製品は２％のアガロースゲル上にて分画化され、そして、配列を確認するためのゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）を用いて抽出及び精製される。

本発明はＰｏｌ−ＩＩ媒介型ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ発現システムの原理検証設計を採用しており、スキンケア向けの新規化粧品の開発のために、その設計を使用している。一つの好ましい実施形態において、本発明は、非天然由来のイントロンとその構成成分を使用する方法を提供しており、その構成成分は、皮膚細胞によって短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）及び／又はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子にプロセッシングされ、皮膚色素関連遺伝子及び／又は細胞内の老化を引き起こす遺伝子に対する、特異的遺伝子サイレンシング効果を誘導するものである。同方法は、ａ）ｉ）標的遺伝子を発現する皮膚基質とｉｉ）イントロンエンコーディングＲＮＡ一次転写物を製造することが可能な組換え遺伝子を含む発現可能な組成物と、を提供する工程であって、同転写物が、次に細胞内ＲＮＡスプライシング及びプロセッシングメカニズムによりコード化されたイントロンから予め設計された遺伝子サイレンシング分子を生成可能であり、その後皮膚基質内で、標的遺伝子発現を破壊するか、又は標的遺伝子機能を抑制することが可能である工程と、ｂ）皮膚基質内の標的遺伝子機能が阻害されるような条件下にて同組成物で皮膚基質を治療する工程と、を含む。皮膚基質は、インビトロ、生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）又はインビボのいずれかにて標的遺伝子を発現することができる。一態様において、ＲＮＡスプライシング及びプロセッシングにて生成された遺伝子サイレンシング分子は、組み換え遺伝子のイントロン領域内に位置するヘアピン様ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ挿入物であり、チロシナーゼ（Ｔｙｒ）、ヒアルロニダーゼ（Ｈｙａｌ）、ヒアルロナンレセプターであるＣＤ４４及びＣＤ１６８、ＮＦカッパＢ、並びに他の色素関連及び／又は老化関連の遺伝子及び発ガン遺伝子から構成された群から選択された標的遺伝子をサイレンシングにする能力を有する。代わりに、このようなｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ挿入物は、皮膚において細胞遺伝子のイントロン領域へ、人工的に組み込むことができる。一般には、この種のイントロン挿入技術は、プラスミドのような導入遺伝子トランスフェクション、相同的組み換え、トランスポゾン送達、ジャンピング遺伝子組み込み及びレトロウイルス感染を含んでいる。

別の態様において、本発明の組み換え遺伝子は、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ構造を連想させる構造物を発現する。組み換え遺伝子は主に２つの部分：エキソンとイントロンから構成されている。エキソン部分はＲＮＡスプライシングの後に連結されて、イントロンＲＮＡ放出を識別するために、機能性ｍＲＮＡ及びタンパク質を形成する。一方、イントロン部分は組み換え遺伝子転写物からスプライスアウトされ、更に所望のイントロンＲＮＡ分子にプロセッシングされ、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ及びそれらの前駆体（即ち、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ及びｐｒｅ−ｐｉＲＮＡ）を含む遺伝子サイレンシングエフェクタとして機能する。これら所望のイントロンＲＮＡ分子は、５’−ＧＣＴＡＡＧＣＣＡＧ ＧＣ−３’（配列番号１）又は５’−ＧＣＣＴＧＧＣＴＴＡ ＧＣ−３’（配列番号２）と相同性の配列モチーフを含むヘアピン様ステムループ構造からなり、イントロンから所望のＲＮＡ分子を正確に切除するのみならず、細胞質への所望のＲＮＡ分子の核移動も促進する。また、これらのイントロン由来ＲＮＡ分子のステムアームは、標的遺伝子又は標的遺伝子遺伝子転写物のコード配列に対する相同性又は相補性或いはその両方を含んでいる。所望のＲＮＡ分子の相同的又は相補的な配列は、約１５〜１，５００ヌクレオチド塩基にサイズ化されており、最も好ましくは約１８〜２７ヌクレオチド塩基である。標的遺伝子配列に対する所望のイントロンＲＮＡ分子の相同性及び／又は相補性の割合は約３０〜１００％の範囲であるが、より好ましくは、所望のヘアピン様（ｈａｉｒｐｉｎ−ｌｉｋｅ）イントロンＲＮＡに対しては３５〜４９％であり、線形イントロンＲＮＡ分子に対しては９０〜１００％である。

加えて、非天然由来イントロンの５’末端は、５’−ＧＴＡＡＧＡＧＫ−３’（配列番号３）及びＧＵ（Ａ／Ｇ）ＡＧＵモチーフ（即ち、５’−ＧＴＡＡＧＡＧＧＡＴ−３’（配列番号２７）、５’−ＧＴＡＡＧＡＧＴ−３’、５’−ＧＴＡＧＡＧＴ−３’及び５’−ＧＴＡＡＧＴ−３’）のいずれかと相同性を有する供与スプライス部位を含む一方、その３’末端は、ＧＷＫＳＣＹＲＣＡＧ（配列番号４）又はＣＴ（Ａ／Ｇ）Ａ（Ｃ／Ｔ）ＮＧモチーフ（即ち、５’−ＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣ ＡＧ−３’（配列番号２８）、５’−ＧＧＣＴＧＣＡＧ−３’及び５’−ＣＣＡＣＡＧ−３’）のいずれかと相同性を有する受容スプライス部位である。その上、分枝点の配列は５’及び３’スプライス部位の間に位置しており、５’−ＴＡＣＴＡＡＣ−３’及び５’−ＴＡＣＴＴＡＴ−３’のような５’−ＴＡＣＴＷＡＹ−３’（配列番号５）モチーフとの相同体を含んでいる。分枝点配列のアデノシン“Ａ”ヌクレオチドは、殆ど全てのスプライセオソーム型イントロン内の細胞性（２’−５’）オリゴアデニル酸合成酵素及びスプライセオソームによって（２’−５’）連結型ラリアットイントロンＲＮＡの一部を形成する。更に、ポリピリミジン領域は、分枝点と３’スプライス部位との間に近接して位置しており、５’−（ＴＹ）ｍ（Ｃ／−）（Ｔ）ｎＳ（Ｃ／−）−３’（配列番号６）又は５’−（ＴＣ）ｎＮＣＴＡＧ（Ｇ／−）−３’（配列番号７）モチーフのいずれかと相同性を有するＴ又はＣを多く含むオリゴヌクレオチド配列を含んでいる。ここで、記号“ｍ”及び“ｎ”は、複数の繰り返しが１以上であることを示しており、最も好ましくは、ｍは１〜３に等しく、ｎは７〜１２に等しい。記号“−”は配列内の空白のヌクレオチドを意味している。これら全てのイントロン構成要素を連結するためのリンカーヌクレオチド配列も存在している。ヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列データに使用される符号と様式のための３７ＣＦＲ １．８２２ガイドラインに基づいて、符号Ｗはアデニン（Ａ）又はチミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）を意味し、符号Ｋはグアニン（Ｇ）又はチミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）を意味し、符号Ｓはシトシン（Ｃ）又はグアニン（Ｇ）を意味し、符号Ｙはシトシン（Ｃ）又はチミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）を意味し、符号Ｒはアデニン（Ａ）又はグアニン（Ｇ）を意味し、符号Ｎはアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）又はチミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）を意味する。

本発明のもう一つの好ましい実施形態では、組み換え遺伝子組成物は、遺伝子トランスフェクションのための発現可能なベクタにクローン化される。発現可能なベクタは、以下から成る群から選択されるものである：プラスミド、コスミド、ファージミド、イースト人工染色体、ジャンピング遺伝子、トランスポゾン、レトロトランスポゾン、レトロウイルスベクタ、レンチウイルスベクタ、ラムダベクタ、アデノウイルス（ＡＭＶ）ベクタ、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクタ、改良型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ベクタ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）関連ウイルスベクタ、そして、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、トマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）及びポプラモザイクウイルス（ＰｏｐＭＶ）のような植物関連モザイクウイルス。ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ遺伝子のトランスフェクション時、異なるイントロン遺伝子サイレンシングエフェクタを発現する複数のベクタは、一つの遺伝子又は複数の標的遺伝子に対する遺伝子サイレンシング効果を実現するために使用されることがある。代わりに、複数の遺伝子サイレンシングエフェクタは、複数の遺伝子サイレンシング効果を提供するためにＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ遺伝子のイントロンヘアピンＲＮＡ挿入物から生成され得る。この戦略の長所は、ベクタに基づく導入遺伝子トランスフェクション及びウイルス感染の使用による送達安定性にあり、特定の遺伝子サイレンシングに関する安定且つ比較的に長期の効果を提供する。一態様において、細胞ＲＮＡスプライシング及びプロセッシングメカニズムを利用した本発明は、細胞内において、遺伝子特異的ＲＮＡプロモータプロモータ（例えば、ＩＩ型ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ−ＩＩ）プロモータ及びウイルスプロモータ、又はそれら両方）の管理の下で、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及び／又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含むＲＮＡｉ関連の遺伝子サイレンシング分子を製造し得る。ウイルスプロモータは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レトロウイルス長鎖末端領域（ＬＴＲ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、アデノウイルス（ＡＭＶ）、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）及び植物関連のモザイクウイルスから単離されたＲＮＡプロモータ及びその誘導体を含み得る。例えば、レンチウイルスＬＴＲプロモータは、各細胞につき、最大５×１０^５コピーまでの成熟していないｍＲＮＡを提供するのに十分である。発現率を管理するために、レンチウイルスプロモータの前に薬剤感受性リプレッサーを挿入することは可能である。リプレッサーは、Ｇ４１８、テトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン及びそれらの誘導体などからなる群より選択された化学薬剤や抗生物質により阻害され得る。

本願にて発明されたスキンケアの利用に加え、本発明の潜在的な応用は、疾病関連の遺伝子の抑制による皮膚治療、ウイルス遺伝子に対して誘導される表皮の予防接種、微生物関連の病原体に関する外用治療、皮膚内の信号形質導入経路に関する研究、及びマイクロアレイ技術などと連携する遺伝子機能のハイスループットスクリーニングなどを含んでいる。本発明はまた、皮膚内遺伝子機能の研究、或いはスキンタイプの特徴を変更するための組成物及び方法を提供するためのツールとして利用され得る。スキンタイプは、正常な皮膚、病原性の皮膚、癌化した皮膚、ウイルス感染した皮膚、微生物感染した皮膚、生理的に疾患を有する皮膚、遺伝的に異変された動物又はヒトの皮膚からなる群より選択され得る。

本発明は、ＲＮＡスプライシング及びプロセッシングメカニズムによりインビボ及び細胞内のイントロンＲＮＡ分子を製造する新規な手法を提供し、好ましくは、ＲＮＡｉ／ＰＴＧＳ関連遺伝子サイレンシング効果が誘導できる成熟ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ分子を生成することである。所望のｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及び／又はｓｈＲＮＡ分子は、細胞メカニズムが本発明のイントロン前駆体ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ挿入物を如何に発現及び加工するかに応じて、単一単位又は複数単位において製造され得る。例えば、既に報告されたように、図３Ａに示されるように、ゼブラフィッシュ内の一つの抗ＥＧＦＰ ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ挿入型イントロンの異所性発現は確実に、ｍｉＲ−ＥＧＦＰ（２８２／３００）及びｍｉＲ−ＥＧＦＰ（２８０−３０２）のようなサイズの異なる２つの成熟マイクロＲＮＡを生成し、ＳｐＲＮＡｉイントロンの遺伝子サイレンシングＲＮＡ挿入物の１つが、１つ以上の遺伝子サイレンシングＲＮＡエフェクタを生成できることを示している。同じ、又は異なるスプライスされたＲＮＡエフェクタは、標的遺伝子転写物に対して相補性を有する、センス形態又はアンチセンス形態のいずれか、或いは、両方において生成され得る。特定の場合、スプライスされたＲＮＡ分子は、二次ＲＮＡｉ／ＰＴＧＳ効果を引き起こすための二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を形成するために標的遺伝子転写物（即ち、ｍＲＮＡ）とハイブリダイズされ得る。イントロンｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及び／又はｓｈＲＮＡは、本発明の発現可能なベクタによって常に形成され、それは、インビボにて適用するための迅速な低分子ＲＮＡの分解に対する関心を軽減させる。

代替的に、本発明は更に、皮膚細胞内の標的マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）遺伝子に対して誘導されるアンチセンスマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ＊）の製造に関する新規な手段を提供しており、結果的に、標的ｍｉＲＮＡ機能の抑制ができる。ｍｉＲＮＡは通常に、ＲＮＡｉ関連の遺伝子サイレンシングにおいて機能するため、ｍｉＲＮＡ＊はこの遺伝子サイレンシング効果を中和し、ｍｉＲＮＡ抑制型遺伝子の機能を回復し得る。完全に一致したｓｉＲＮＡと異なり、ｍｉＲＮＡ＊のｍｉＲＮＡへの結合は、ＲＮａｓｅ切断及び分解のためのミスマッチ塩基対領域を作製する。このようなミスマッチ塩基対領域は、ｍｉＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）のステムアーム領域の中央又はステムループ構造内のいずれかに位置していると好ましい。既に示されたように、ｓｉＲＮＡの中央にあるミスマッチ塩基対は、ｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング効果を阻害している（Ｈｏｌｅｎ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、第３０巻、第１７５７−１７６６頁、２００２年；Ｋｒｏｌ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７９頁、第４２２３０−４２２３９頁、２００４年）。多分、植物内のイントロン媒介型増強効果（ＩＭＥ）現象と同様に、シロイヌナズナ種及びタバコ種に関する以前の研究では、イントロン挿入物は、特定の遺伝子発現の増強とサイレンシングの両方のために、転写後の遺伝子変調において重要な役割を果たすことが示された（Ｒｏｓｅ Ａ．Ｂ．、ＲＮＡ、第８巻、第１４４４−１４５１頁、２００２年；Ｓｔｏｕｔｊｅｓｄｉｊｋ他、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、第１２９巻、第１７２３−１７３０頁、２００２年）。ＩＭＥメカニズムは、標的遺伝子に対して相補的であるｍｉＲＮＡを標的化することにより、２倍から１０倍以上、標的遺伝子発現を回復することができる。

以上本発明によれば、細胞内の皮膚色素に関連する遺伝子及び老化を引き起こす遺伝子の少なくとも一方に対し、特定の遺伝子サイレンシング効果を誘導することができる、組み換え型核酸組成物、同組成物を含む化粧品が提供される。

図１は天然イントロンマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の生物発生を表している。それは、連結されたエキソンがタンパク質合成のために成熟メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）となる時に、Ｐｏｌ−ＩＩによって前駆体メッセンジャーＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）と共に共同転写され、ＲＮＡスプライシングによってｐｒｅ−ｍＲＮＡが切除される論理である。アンチセンス又はヘアピン様の二次構造を有するスプライスされたイントロンｍｉＲＮＡは更に、ＲＮＡｉ関連の遺伝子サイレンシング効果を引き起こすことが可能な成熟ｍｉＲＮＡにプロセッシングされる。そのため、本発明者らは、天然イントロンｍｉＲＮＡ（図３Ａ及び３Ｂ）の生物発生を模擬して、少なくとも１つの前駆体マイクロＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）構造、いわゆるＳｐＲＮＡｉを含む人工イントロンを設計した。ＳｐＲＮＡｉは、Ｐｏｌ−ＩＩ又はウイルスＲＮＡプロモータ（Ｐ）のいずれかの制御に基づいてＩＩ型ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ−ＩＩ）で発現される細胞又は組み換え遺伝子へと取り込まれる。細胞内転写にて、このように製造された遺伝子転写物はＲＮＡスプライシング及びプロセッシング操作を受け、トランスフェクションされた細胞内の予め設計されたイントロンＲＮＡ分子を放出する。ある実施形態において、所望のＲＮＡ分子は遺伝子ノックダウンのためのアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブとしての提供可能なアンチセンスＲＮＡ構造物である。他の実施形態において、所望のＲＮＡ分子は低分子のアンチセンスＲＮＡフラグメント及び低分子のセンスＲＮＡフラグメントから構成され、ＲＮＡｉ誘導のための二本鎖ｓｉＲＮＡとして機能する。更に別の実施形態において、所望のＲＮＡ分子はＲＮＡｉ関連遺伝子サイレンシング効果を引き起こすことが可能なヘアピン様ＲＮＡ構築物である。

以上の説明は、本発明の好ましい実施形態を例示のみの目的にて示すものであり、本発明を制限するものではない。種々の変更及び修正は当業者には自明であり、このような変更及び修正は、本発明の精神並びに範囲を逸脱するものではないとみなされ、更に特許請求の範囲内に含まれるものである。

本発明は、イントロン由来のＲＮＡを使用して皮膚細胞の遺伝子特性を変更するための新規な組成物及び方法を提供する。いかなる特定の論理にも拘束されることなく、関心となる細胞又は生物において、少なくとも１つのスプライシング可能なイントロン、いわゆるＳｐＲＮＡｉ、を含む組み換え遺伝子のトランスフェクションによって引き起こされた、新しく発見されたイントロン媒介型遺伝子サイレンシングメカニズムによってそのような遺伝子特性の変更が誘導される。ＳｐＲＮＡｉイントロンは更に、イントロンＲＮＡ挿入物を保持し、同イントロンＲＮＡ挿入物は、細胞内ＲＮＡスプライシング及びプロセッシング機構により放出され得、そして、イントロンＲＮＡ挿入物に対して非常に相補性が大きい標的遺伝子転写物に対するＲＮＡｉ／ＰＴＧＳ関連の遺伝子サイレンシング効果を引き起こす。一般的に、図４乃至７に示されるように、組み換え遺伝子は化学的に変換されたり、リポソームにてトランスフェクションされたり、又は皮膚細胞へのウイルス感染で導入されたりする場合に、イントロンＲＮＡ挿入物がＰｏｌ−ＩＩにより組み換え遺伝子とともに転写され、その後、スプライセオソーム及びナンセンス変異依存性分解（ＮＭＤ）システムのような、ＲＮＡスプライシング及びプロセッシング機構によって組み換え遺伝子転写物から放出される。ＲＮＡスプライシングの後、イントロンＲＮＡはラリアットＲＮＡを形成し、更に、低分子一時的ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ，、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）及び／又はそれらの前駆体ＲＮＡのような、低分子遺伝子サイレンシングエフェクタＲＮＡにプロセッシングされる。結果として、これらの遺伝子サイレンシングエフェクタＲＮＡは、機能アセンブリ及びＲＮＡ導入型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）及び／または転写サイレンシング（ＲＩＴＳ）のＲＮＡｉ誘導型イニシエーターの作用によって標的遺伝子転写物を減少するか、標的遺伝子転写物のタンパク質翻訳を抑制する。

天然のｐｒｅ−ｍＲＮＡスプライシング及びプロセッシングメカニズムを模擬して、本発明者らは、細胞内スプライセオソームとＮＭＤ機構とを使用して本発明者らが発明したＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ発現システムのイントロン除去及びプロセッシングに触媒作用を及ぼす。複数のＳｐＲＮＡｉイントロン（例えば、ｓｎＲＮＰ Ｕ１、Ｕ２及びＵ４／Ｕ６．Ｕ５ｔｒｉ−ｓｎＲＮＰのための結合部位）のｓｎＲＮＰ識別要素への細胞内スプライセオソーム構成要素の連続アセンブリによって、ＳｐＲＮＡｉイントロンは放出され、更に、低分子遺伝子サイレンシングエフェクタへとプロセッシングされる。本発明のＳｐＲＮＡｉイントロンへ合成ｓｎＲＮＰ識別要素を取り込み、次いでＳｐＲＮＡｉを組み換えＲＧＦＰ遺伝子へ取り込む方法は、実施例１−２においてそれぞれ記載されている。スプライセオソームイントロンについて、スプライセオソームｓｎＲＮＰｓのそれらの関連する識別部位へ連続的にアセンブリする様式は、全ての真核生物において種属特有の順序になっている（Ｌｅｗｉｎ Ｂ．、Ｇｅｎｅｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｐｒｅｓｓ、第６８８−６９０頁、２０００年）。種々の種の細胞内ＲＮＡスプライシング及びプロセッシングメカニズムが多種にわたるため、Ｌｅｗｉｎ Ｂ．はよく知られている事実、即ち、「スプライス部位は属の特有のものである。（中略）そして、スプライシングのための器官は組織特異的ではない（中略）」と述べた。これは、全てのスプライセオソームイントロンの一般的な特性といわれている。実際に、イントロンＲＮＡスプライシングプロセスの連続順序は次のように起こる：最初にＵ１ ｓｎＲＮＰを５’−イントロンスプライシング結合（５’−ドナースプライス部位）へ結合してからＵ２ ｓｎＲＮＰを分枝点モチーフへ結合し、そして、最後に、Ｕ１及びＵ２ ｓｎＲＮＰｓへＵ４／Ｕ６．Ｕ５ｔｒｉ−ｓｎＲＮＰを結合させる。それにより、５’スプライシング結合の正確な切断のための早期スプライシング複合体が形成される。５’スプライシングイントロン結合のスプライシング放出後、３’スプライシングイントロン結合（３’−受容スプライス部位）は続いてＵ５ ｓｎＲＮＰ及びいくつかの他のスプライシングタンパク質で形成された後期のスプライシング複合体によって切断される。しかしながら、真核生物のｔｒｉ−ｓｎＲＮＰ内においてＵ４／Ｕ６とＵ５ ｓｎＲＮＰとの構成要素を架橋するタンパク質／タンパク質相互作用及びＲＮＡ／タンパク質相互作用については殆ど知られていないし、Ｕ４／Ｕ６及びＵ５ ｓｎＲＮＰにおけるタンパク質の結合部位に関する知識は不明なところが未だに多い。

インビボでイントロンＲＮＡ媒介型遺伝子サイレンシング効果を誘導できる、Ｐｏｌ−ＩＩ媒介型人工組み換えＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ遺伝子発現システムに関する設計、構造および評価。

インビボにおいて所望の細胞内ＲＮＡスプライシング及び／又はプロセッシングを誘導する遺伝子サイレンシングメカニズムを誘発するための戦略は、本発明のＰｏｌ−ＩＩ転写型組み換え遺伝子ベクタ、いわゆるＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰを使用して既に試験した。同ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及びヘアピン様ｓｈＲＮＡのようなイントロン遺伝子サイレンシングＲＮＡエフェクタ（図３Ａ及びＢ）を発現するための人工のスプライシング可能なイントロン（ＳｐＲＮＡｉ）を含んでいる。ＳｐＲＮＡｉイントロンを赤色にシフトした蛍光タンパク質遺伝子（ＲＧＦＰ）に取り込むことは、実施例１−２にて示されるように、複数の合成ＤＮＡ配列の連続したライゲーションで遺伝的にプロセッシングされる。ＳｐＲＮＡｉイントロンは前駆体ｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ挿入物を含んでおり、スプライセオソーム及びＮＭＤシステム構成要素のような細胞内ＲＮＡスプライシング及びプロセッシング機構によって放出され得、その後、成熟ｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの遺伝子サイレンシングエフェクタの生成によってイントロンＲＮＡ媒介型遺伝子サイレンシング機構を誘引する。本発明者らは組み換え遺伝子転写物の細胞内ＲＮＡスプライシング及びプロセッシングによって標的遺伝子サイレンシングを誘導するモデルをここで示したが、同じ原理は、主としてＩ型ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ−Ｉ）によって転写されるリボソーム前駆体ＲＮＡ（ｐｒｅ−ｒＲＮＡ）のＲＮＡプロセッシングを介して機能するイントロン遺伝子サイレンシングＲＮＡ挿入物の設計と製造に適用できる。ＳｐＲＮＡｉイントロンの発現及びプロセッシングに使用できる他のＲＮＡ転写物は、ｈｎＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ及びそれらの前駆体と誘導体とを含む。

実施例１及び２並びに図３Ａに示されるように、ＳｐＲＮＡｉイントロンが合成され、かつイントロンフリーの赤色にシフトした蛍光タンパク質遺伝子（ＲＧＦＰ又はｒＧＦＰ）に組み込まれた。赤色にシフトした蛍光タンパク質遺伝子（ＲＧＦＰ又はｒＧＦＰ）は、Ｈｅｔｅｒａｃｔｉｓ ｃｒｉｓｐａのＨｃＲｅｄ１色素タンパク質から変異したものである。挿入されたＳｐＲＮＡｉイントロンは、ＲＧＦＰの機能的な蛍光タンパク質構造を分裂させたため、本発明者らは、成功裏にトランスフェクションされた細胞や器官において５７０ｎｍの波長における赤色の蛍光放出の再現により、イントロン除去及びＲＧＦＰ遺伝子転写物のｍＲＮＡ成熟を検出することができた。この組み換え型ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ遺伝子の構造は、前駆体メッセンジャーＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）内のスプライセオソームイントロンの天然構造に基づいたものであった。ＳｐＲＮＡｉイントロンの主要な構成要素は、末端部に正確な切断のための５’−供与スプライス部位（ＤＳ）及び３’−受容（ＡＳ）スプライス部位、スプライシング識別のための分枝点モチーフ（ＢｒＰ）、スプライセオソーム相互作用のためのポリピリミジン領域（ＰＰＴ）、所望のイントロン挿入のためにこれらの構成要素の各々といくつかの制限／クローニング部位とを連結するためのリンカーのような、複数のｓｎＲＮＰ識別部位及びリンカーを含んでいる。図３Ｂに示されるように、構造的に、５’から３’末端までに、本発明のＳｐＲＮＡｉイントロンは５’スプライス部位、抗（標的遺伝子）イントロン挿入物、分枝点モチーフ（ＢｒＰ）、ポリピリミジン領域（ＰＰＴ）、及び機能的なスプライセオソームアセンブリのための３’−受容（ＡＳ）スプライス部位を含んでいる。その上、いくつかの翻訳終了コドン（Ｔコドン）はＳｐＲＮＡｉイントロンの３’スプライス部位に近いリンカー配列において位置することがある。

一般的に、５’−供与スプライス部位は、５’−ＧＴＡＡＧＡＧＫ−３’（配列番号３）又は（５’−ＧＴＡＡＧＡＧＧＡＴ−３’（配列番号２７）、５’−ＧＴＡＡＧＡＧＴ−３’、５’−ＧＴＡＧＡＧＴ−３’及び５’−ＧＴＡＡＧＴ−３’のような）ＧＵ（Ａ／Ｇ）ＡＧＵモチーフのいずれかを含むか、又はいずれかと相同性を有するヌクレオチド配列であり、一方、３’−受容スプライス部位は、ＧＷＫＳＣＹＲＣＡＧ（配列番号４）又は（５’−ＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣ ＡＧ−３’（配列番号２８）、５’−ＧＧＣＴＧＣＡＧ−３’及び５’−ＣＣＡＣＡＧ−３’のような）ＣＴ（Ａ／Ｇ）Ａ（Ｃ／Ｔ）ＮＧモチーフのいずれかを含むか、又はいずれかと相同性を有するヌクレオチド配列である。その上、分枝点配列は５’スプライス部位と３’スプライス部位との間に位置しており、５’−ＴＡＣＴＡＡＣ−３’及び５’−ＴＡＣＴＴＡＴ−３’のような５’−ＴＡＣＴＷＡＹ−３’（配列番号５）モチーフとの相同性を有するものである。分枝点配列のアデノシン“Ａ”ヌクレオチドは、殆ど全てのスプライセオソームイントロン内の細胞性（２’−５’）−オリゴアデニル酸合成酵素及びスプライセオソームにより（２’−５’）連結型ラリアットイントロンＲＮＡの一部を形成している。更に、ポリピリミジン領域は、分枝点と３’スプライス部位との間に近接して位置しており、５’−（ＴＹ）ｍ（Ｃ／−）（Ｔ）ｎＳ（Ｃ／−）−３’（配列番号６）又は５’−（ＴＣ）ｎＮＣＴＡＧ（Ｇ／−）−３’（配列番号７）モチーフのいずれかと相同性を有するとともにＴ又はＣを多く含むオリゴヌクレオチド配列を含んでいる。符号「ｍ」及び「ｎ」は１以上の複数の反復を示しており、最も好ましくは、ｍは１〜３に等しく、かつｎ数字は７〜１２に等しい場合である。符号「−」は、配列内の空白ヌクレオチドを意味している。これら全てのイントロン構成要素を連結するために複数のリンカーヌクレオチド配列も存在している。ヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列データに使用される符号と様式のための３７ＣＦＲ １．８２２ガイドラインに基づいて、符号Ｗはアデニン（Ａ）又はチミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）を意味し、符号Ｋはグアニン（Ｇ）又はチミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）を意味し、符号Ｓはシトシン（Ｃ）又はグアニン（Ｇ）を意味し、符号Ｙはシトシン（Ｃ）又はチミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）を意味し、符号Ｒはアデニン（Ａ）又はグアニン（Ｇ）を意味し、符号Ｎはアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）又はチミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）を意味する。上記した全てのスプライセオソーム識別構成要素について、デオキシチミジン（Ｔ）ヌクレオチドはウリジン（Ｕ）で置き換え可能である。

スプライスされたＳｐＲＮＡｉ挿入物の機能を試験するために、種々のオリゴヌクレオチド薬剤を組み換え型ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ遺伝子構築物の抗（標的遺伝子）イントロン挿入部位にクローニングされ得る。抗（標的遺伝子）イントロン挿入部位は、複数の制限部位及びクローニング部位を含んでおり、それらは、ＡａｔＩＩ、ＡｃｃＩ、ＡｆｌＩＩ／ＩＩＩ、ＡｇｅＩ、ＡｐａＩ／ＬＩ、ＡｓｅＩ、Ａｓｐ７１８Ｉ、ＢａｍＨＩ、ＢｂｅＩ、ＢｃｌＩ／ＩＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｓｍＩ、Ｂｓｐ１２０Ｉ、ＢｓｐＨＩ／ＬＵ１１Ｉ／１２０Ｉ、ＢｓｒＩ／ＢＩ／ＧＩ、ＢｓｓＨＩＩ／ＳＩ、ＢｓｔＢＩ／Ｕ１／ＸＩ、ＣｌａＩ、Ｃｓｐ６Ｉ、ＤｐｎＩ、ＤｒａＩ／ＩＩ、ＥａｇＩ、Ｅｃｌ１３６ＩＩ、ＥｃｏＲＩ／ＲＩＩ／４７ＩＩＩ、ＥｈｅＩ、ＦｓｐＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎＰＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｉｎｆＩ、ＨｐａＩ／ＩＩ、ＫａｓＩ、ＫｐｎＩ、ＭａｅＩＩ／ＩＩＩ、ＭｆｅＩ、ＭｌｕＩ、ＭｓｃＩ、ＭｓｅＩ、ＮａｅＩ、ＮａｒＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＮｇｏＭＩ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＮｓｉＩ、ＰｍｌＩ、Ｐｐｕ１０Ｉ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩ／ＩＩ、ＲｓａＩ、ＳａｃＩ／ＩＩ、ＳａｌＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＳｍａＩ、ＳｎａＢＩ、ＳｐｈＩ、ＳｓｐＩ、ＳｔｕＩ、ＴａｉＩ、ＴａｑＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ、ＸｍａＩエンドヌクレアーゼ及びそれらの組み合わせからなる群より選択された制限酵素で識別されるものである。これらのイントロンオリゴヌクレオチド挿入物は、ラリアット形ＲＮＡ、短鎖の一時的なＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ干渉ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、リボザイム及びそれらの前駆体及び誘導体であって、それらのセンス形態又はアンチセンス形態若しくは両方、並びにそれらの組み合わせからなる群より選択された高度に構造的なＲＮＡをコードするＤＮＡテンプレートである。

関心のある細胞又は生物における遺伝子の送達及び活性化に好都合であるように、本発明の組み換え型ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ遺伝子は、プラスミド、コスミド、ファージミド、イースト人工染色体、トランスポゾン、ジャンピング遺伝子、ウイルスベクタ及びそれらの組み合わからなる群より選択された発現可能なベクタに好ましくはクローニングされ得る。こうして得られたベクタは、リポソームトランスフェクション、化学的トランスフェクション、化学形質変換、エレクトロポレーション、トランスポゾン組替え、ジャンピング遺伝子挿入、ウイルス感染、マイクロ注射、遺伝子銃浸透及びそれらの組み合わせからなる群より選択された高効率的な遺伝子送達法により細胞又は生物に導入される。その上、ベクタは、ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ遺伝子を発現するための少なくともひとつのウイルス又はＩＩ型ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ−ＩＩ）プロモータ、あるいは両方と、真核生物細胞において翻訳効率を上げるためのＫｏｚａｋ共通翻訳開始部位と、組み換え遺伝子転写物の３’末端をプロセッシングするためのＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ遺伝子の下流側にある複数のＳＶ４０ポリアデニル化信号と、原核細胞内の増殖のための複製ｐＵＣ起源と、ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ遺伝子をベクタに取り込むための少なくとも２つの制限／クローニング部位と、ＳＶ４０ Ｔ抗原を発現する哺乳類細胞内の複製のための選択的なＳＶ４０起源と、複製可能な原核細胞内の抗生物質耐性遺伝子を発現するための選択的なＳＶ４０初期プロモータと、を含んでいる。抗生物質耐性遺伝子の発現は、成功裏にトランスフェクションにされたクローン又は感染されたクローンを探すための選択的なマーカとして機能するために使用され、ペニシリンＧ、アンピシリン、ネオマイシン、ピューロマイシン（ｐａｒｏｍｙｃｉｎ）、カナマイシン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、スペクトロマイシン（ｓｐｅｃｔｒｏｍｙｃｉｎ）、フォフォマイシン（ｐｈｏｐｈｏｍｙｃｉｎ）、テトラサイクリン、リファピシン（ｒｉｆａｐｉｃｉｎ）、アムホテリシンＢ、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、セファロチン、チロシン及びそれらの組み合わせからなる群より選択された抗生物質に対して抵抗性を有する。

こうして得られたＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰベクタ構築物は、Ｔｇ（アクチン−ＧＡＬ４：ＵＳＡ−ｇｆｐ）種ゼブラフィッシュのその緑色ＥＧＦＰ遺伝子発現に対する標的をインビボにて試験した。実施例３及び図３Ｃに示されるように、ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰプラスミド構築物（レーン４）内の、抗ＥＧＦＰ ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ挿入物のリポソームトランスフェクションは、非常に強いＥＧＦＰ遺伝子サイレンシング効果（＞８０％遺伝子ノックダウン）を示す一方、左から右へのレーンによって示されたそれらの他の挿入物では効果が全く認められなかった。これらのレーンとは１：ブランクのベクタ対照（Ｃｔｌ）、２：ＨＩＶ−ｐ２４を標的とするｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ挿入物（ｍｏｃｋ）、３：ヘアピンループ構造を備えていないアンチセンスＥＧＦＰ挿入物（ａｎｔｉ）、及び５：アンチＥＧＦＰ ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ＊）に対して完全に相補性を有する逆ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列である。マーカＲＧＦＰとハウスキーピングβアクチンのような標的ではない遺伝子に対する効果は検知されておらず、このようなイントロンｍｉＲＮＡ媒介型ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は非常に標的特定性であることを示唆している。更に、低ストリンジェントなノーザンブロット分析（図３Ｄ）を使用することによって、本発明者らは、所望のＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ遺伝子転写物（中央のレーン２）からのみ効果的な低分子イントロンＲＮＡの生成及び放出を観察したが、イントロンを備えていないＲＧＦＰの天然の転写物（左のレーン１）又は機能的な５’スプライス部位を備えていない欠損ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ構築物の転写物からは観察できなかった。一方スプライスされたＲＧＦＰエクソンは、機能的な赤色蛍光タンパク質合成のための成熟ＲＮＡを形成するために共に結合された。

インビボにおける効果的なイントロンマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）構築物に関する評価
前述の実験は、イントロンｍｉＲＮＡがインビボにおいて標的遺伝子発現をサイレンシングするための効果的な手段を提供するという事実を確立した。本発明者らは、イントロンｍｉＲＮＡ媒介型遺伝子サイレンシングに関する有効性を最初に評価し、ついで、最適な遺伝子サイレンシング効果を誘導可能なイントロンｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ挿入物のための最適な構造設計を決定した。これらの研究に基づき、本発明者らは、ＲＮＡｉ関連型遺伝子サイレンシングエフェクタの細胞内アセンブリのための成熟ｍｉＲＮＡの鎖、即ち、ＲＮＡ導入型遺伝子サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の選択において、強い構造的な優先性が存在していることを確認した。ＲＩＳＣはタンパク質ＲＮＡ複合体であり、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）又は転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）メカニズムにより標的遺伝子転写物の分解又は翻訳の抑制のいずれかを誘導する。

ゼブラフィッシュでは、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのステムループ構造は、周知のｓｉＲＮＡ関連のＲＩＳＣアセンブリとは異なって（Ｌｉｎ他、Ｇｅｎｅ、第３５６巻、第３２−３８頁、２００５年）、ＲＩＳＣアセンブリに対して成熟ｍｉＲＮＡ配列を決定することが観察された。ｓｉＲＮＡ二本鎖体形成は、ｓｉＲＮＡに関連したＲＩＳＣのアセンブリにおいて重要の役割を果たしている。ｓｉＲＮＡ二本鎖体の２つの鎖は機能的に非対称であるが、ＲＩＳＣ複合体へのアセンブリは一方の鎖のみに優先的である。このような優先性は、ｓｉＲＮＡ二本鎖体の鎖におけるそれぞれの５’末端塩基対の熱力学安定性によって決定される。このｓｉＲＮＡモデルに基づき、ｍｉＲＮＡ及びその相補的ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ＊）二本鎖体の形成は、ｍｉＲＮＡに関連したＲＩＳＣのアセンブリのための必須の工程であると考えられる。これが事実であれば、機能的なバイアス（ｂｉａｓ）はｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのステムループ構造からはまったく観察されないはずである。しかしながら、イントロンｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのステムループは、細胞内ＲＩＳＣアセンブリのための成熟ｍｉＲＮＡの鎖の選択と係わりがあることが観察された。

実験では、実施例１−２に記載されるような抗ＥＧＦＰ ｍｉＲＮＡ発現ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰベクタを構築し、２つの対称ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、即ちｍｉＲＮＡ＊ステムループｍｉＲＮＡ［１］及びｍｉＲＮＡステムループｍｉＲＮＡ＊［２］をＤＮＡ合成装置にて合成し、予め作製された組み換え型ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ遺伝子ベクタへそれぞれ挿入した。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ構築物はいずれも同じ二本鎖ステムアーム領域を含んでおり、同領域は、ＥＧＦＰヌクレオチド（ｎｔ）２８０−３０２配列に対して誘導されたものである。ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ遺伝子のイントロン挿入部位は、５’−及び３’末端のそれぞれにおいてＰｖｕＩ及びＭｌｕＩ制限／クローニング部位に隣接しているので、一次挿入物は付着性末端を有する種々の抗遺伝子挿入物（例えば、抗ＥＧＦＰ、抗Ｔｙｒ又は抗Ｈｙａｌ）により容易に除去され、かつ置換される。異なる遺伝子転写物に対して誘導されたＳｐＲＮＡｉ挿入物における変更を可能にすることにより、このイントロンｍｉＲＮＡ発現系は、インビボにおいてｍｉＲＮＡ関連の遺伝子応用の開発において価値のあるツールを提供する。

設計されたｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの構造的な優先性を決定するために、ｍｉｒＶａｎａ ｍｉＲＮＡ単離フィルタコラム（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）によりゼブラフィッシュの低分子ＲＮＡを単離し、標的配列を含むラテックスビーズにより標的ＥＧＦＰと相補的である全ての潜在的なｍｉＲＮＡ配列を沈殿させた。１つの完全長ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ−ＥＧＦＰ（２８０−３０２）は、図４Ａ（灰色で陰影付けられた配列）に示されるように、５’−ｍｉＲＮＡステムループｍｉＲＮＡ＊−３’構築物のトランスフェクションにおいて活性であることが確認された。この効果的な成熟ｍｉＲＮＡは、５’−ｍｉＲＮＡステムループｍｉＲＮＡ＊−３’構築物［２］でトランスフェクションされたゼブラフィッシュにおいてのみ検知されるので、ｍｉＲＮＡ関連ＲＩＳＣは、［１］ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ構造よりも望ましくは構築物［２］と相互作用する傾向があった。標的遺伝子サイレンシング及びｍｉＲＮＡ遺伝子発現との間の相関関係の視覚的表示のために（図４Ｂ）、Ｔｇ（アクチンＧＡＬ４：ＵＡＳ−ｇｆｐ）種のゼブラフィッシュを使用した。同ゼブラフィッシュは、ゼブラフィッシュの殆ど全ての細胞に存在する通常のβ−アクチンプロモータによって誘導される緑色蛍光ＥＧＦＰタンパク質を構造的に発現する一方、ゼブラフィッシュへの抗ＥＧＦＰ ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ遺伝子ベクタのトランスフェクションでは赤色蛍光タンパク質ＲＧＦＰを共に発現し、影響を受けた細胞におけるｍｉＲＮＡ生成のための陽性マーカ指標として提供される。ＦｕＧｅｎｅ陽イオンリポソーム型試薬（Ｒｏｃｈｅ，ＩＮ）により封入されたＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰベクタを魚（ゼブラフィッシュ）に適用後、試験された全てのベクタが、２４時間以内に２週齢のゼブラフィッシュ稚魚に完全に浸透されたことが確認され、鱗と骨を除いては、ベクタの完全に全身的な送達を提供することが明らかとなった。

マーカＲＧＦＰ（赤）は、全てのベクタでトランスフェクションされたゼブラフィッシュから検知されたがが、標的ＥＧＦＰ発現（緑色）のサイレンシングは、５’−ｍｉＲＮＡステムループｍｉＲＮＡ＊−３’［２］ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡによってトランスフェクションされた魚から観察された。図４Ｃに示されるように、ウエスタンブロット分析はこの遺伝子サイレンシングの結果を定量的に確認し、［２］のトランスフェクションされたゼブラフィッシュにおいては＞８５％ＲＧＦＰノックダウンを示した。しかしながら、消化管（ＧＩ）における遺伝子のサイレンシング効果は他の組織より低くなっており、それはこの領域でのＲＮａｓｅの高活性に起因していると考えられる。同じ５’末端の熱的安定性が両方の抗ＥＧＦＰ ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡステムアームに適用されるため、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのステムループ構造は機能性ＲＩＳＣアセンブリのための成熟ｍｉＲＮＡにおける鎖の選択に関与していることを提案する。ステムアーム内のダイサーの切断部位は成熟ｍｉＲＮＡの鎖の選択を決定付けることが周知であると仮定すると、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのステムループは特定の切断部位の認識のための決定要素として機能するのかもしれない。従って、種々の天然のｍｉＲＮＡ種における天然ステムループ構造の広範な不均質性に基づき、これらの実験において本発明者らは手動で改良されたｐｒｅ−ｍｉｒ−３０２ループ対を選択的に使用した。同ループ対は、例えば、５’−ＧＣＴＡＡＧＣＣＡＧＧＣ−３’（配列番号１）及び５’−ＧＣＣＴＧＧＣＴＴＡＧＣ−３’（配列番号２）であり、これらのものは、本発明のために最適なＲＩＳＣアセンブリ効果を提供するべく試験された。

マウス皮膚におけるイントロンマイクロＲＮＡ媒介型チロシナーゼ及びヒアルロニダーゼ遺伝子サイレンシング
以上の研究に基づき、マウス皮膚にある不必要な色素沈着関連型遺伝子Ｔｙｒ又は老化関連型遺伝子ＨｙａｌをサイレンシングするためのｍｉＲ−Ｔｙｒ又はｍｉＲ−Ｈｙａｌのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ挿入物のいずれかを用いて、最適なＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ遺伝子構築物を設計し、試験した。これらの手動に設計されたｍｉＲ−Ｔｙｒ ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲ−Ｈｙａｌｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、ヒト及びマウスの両方のＴｙ遺伝子及びＨｙａｌ遺伝子にある高度に保存される領域（＞９８％の相同性）をそれぞれ標的とする。ヒト及びマウスはいずれも、インビボにて皮膚でのこれらの最適なＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ遺伝子構築物に関する有効性及び安全性を試験するために有用な動物モデルを提供している。実際のところ、色素沈着遺伝子サイレンシングのためにヒトチロシナーゼ（Ｔｙｒ；２０８２ｂｐ）を標的とすることができる５４の天然のｍｉＲＮＡが存在しており、それらとしては、ｍｉｒ−１、ｍｉｒ−１５ａ、ｍｉｒ−１６、ｍｉｒ−３１、ｍｉｒ−１０１、ｍｉｒ−１２９、ｍｉｒ−１３７、ｍｉｒ−１４３、ｍｉｒ−１５４、ｍｉｒ−１９４、ｍｉｒ−１９５、ｍｉｒ−１９６ｂ、ｍｉｒ−２００ｂ、ｍｉｒ−２００ｃ、ｍｉｒ−２０６、ｍｉｒ−２０８、ｍｉｒ−２１４、ｍｉｒ−２２１、ｍｉｒ−２２２、ｍｉｒ−２９２−３ｐ、ｍｉｒ−２９９−３ｐ、ｍｉｒ−３２６、ｍｉｒ−３２８、ｍｉｒ−３８１、ｍｉｒ−４０９−５ｐ、ｍｉｒ−４３４−５ｐ、ｍｉｒ−４５０、ｍｉｒ−４５１、ｍｉｒ−４５２、ｍｉｒ−４６４、ｍｉｒ−４６６、ｍｉｒ−４８８、ｍｉｒ−４９０、ｍｉｒ−５０１、ｍｉｒ−５２２、ｍｉｒ−５５２、ｍｉｒ−５５３、ｍｉｒ−５７０、ｍｉｒ−５７１、ｍｉｒ−５８２、ｍｉｒ−６００、ｍｉｒ−６１９、ｍｉｒ−６２４、ｍｉｒ−６２５、ｍｉｒ−６３３、ｍｉｒ−６３４、ｍｉｒ−６９０、ｍｉｒ−６９７、ｍｉｒ−７０４、ｍｉｒ−７１４、ｍｉｒ−７５９、ｍｉｒ−７６１、ｍｉｒ−７６８−５ｐ及びｍｉｒ−８０４が含まれる。ｍｉＲＢａｓｅ：：配列プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ）のｍｉＲ標的検索データベースに従えば、これら全ての抗Ｔｙｒ ｍｉＲＮＡはＴｙｒ遺伝子転写物（ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ０００３７２）の最初の３００ヌクレオチドの領域に対して誘導される。その上、老化遺伝子サイレンシングのためのヒアルロニダーゼ（Ｈｙａｌ；２５１８ｂｐ、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ００７３１２）を標的とすることが可能な９つの天然のｍｉＲＮＡがあり、それらとしては、ｍｉｒ−１９７、ｍｉｒ−３４９、ｍｉｒ−４３４−５ｐ、ｍｉｒ−５４９、ｍｉｒ−６０５、ｍｉｒ−６１８、ｍｉｒ−６４７、ｍｉｒ−６８０、ｍｉｒ−７０２、ａｎｄ ｍｉｒ−７６３が含まれる。これら天然のｍｉＲＮＡのうちで、ｍｉｒ−４３４−５ｐは、ヒトのＴｙｒ遺伝子及びＨｙａｌ遺伝子の両方を標的とする唯一のものであり、且つＴｙｒ及びＨｙａｌ以外の標的遺伝子ではない遺伝子を最小に標的化する最も効率的なｍｉＲＮＡのひとつでもある。しかしながら、殆ど全ての天然のｍｉＲＮＡは、数個から５０個以上の標的を有し、それらはその他のものよりもより強力な幾つかの標的遺伝子と結合する傾向にあるので、これら天然のｍｉＲＮＡの使用は特異的ではなく、かつスキンケアの目的のためには十分に安全ではないであろう。

ｍｉＲＮＡの介在による皮膚の美白の実現可能性を試験するために、本発明のＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ発現システムを使用してマウス皮膚にある天然のｐｒｅ−ｍｉｒ−４３４−５ｐを発現させた。図５に示されるように、メラニン−ノックダウンしたマウス（Ｗ−９黒）の修復されたアルビノ（白）皮膚は、チロシナーゼ（Ｔｙｒ）に対して導入されたｐｒｅ−ｍｉｒ−４３４−５ｐ発現ベクタ（５０μｇ）の連続した皮膚内（ｉ．ｃ．）形質導入（４日間で合計２００μｇ）により作製された。Ｔｙｒ、Ｉ型膜タンパク質及び銅含有酵素は、肌と髪内のメラニン（黒色素）の生合成におけるチロシンヒドロキシル化に関する重要且つ律速段階を触媒する。最初のｉ．ｃ．注射後の約２週間から開始し、肌と髪のメラニンはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡトランスフェクションにおいてのみ、顕著に消失されたことが観察された。一方、ブランクの対照及びＰｏｌ−ＩＩＩ（Ｕ６）誘導型ｓｉＲＮＡトランスフェクションは同様の使用量ではこのような効果が現れなかった。ｐｒｅ−ｍｉｒ−４３４−５ｐトランスフェクションの毛包から単離されたｍＲＮＡを使用したノーザンブロット分析では、トランスフェクションの２日後にＴｙｒの発現が７６．１％±５．３％の減少を示す一方、ランダム遺伝子転写物の穏やかな非特異的分解がｓｉＲＮＡトランスフェクションされた皮膚から検出された（ハウスキーピング対照ＧＡＰＤＨ及び標的Ｔｙｒ ｍＲＮＡの両方の不鮮明なパターンを参照）。Ｇｒｉｍｍ他（２００６年）は、Ｐｏｌ−ＩＩＩ誘導性ＲＮＡｉシステムにより生成された高濃度のｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡが細胞マイクロＲＮＡ経路を過飽和し、全体的なｍｉＲＮＡの調節不全を引き起こすと報告している。この結果は、ｓｉＲＮＡ経路が皮膚組織内の天然のｍｉＲＮＡ経路とは相容できないことを示している。従って、ｍｉＲＮＡの使用は、スキンケアのためにより効率的であり、適合性があり、かつ安全な手法を提供できると考えられる。しかしながら、天然のｍｉｒ−４３４−５ｐはまた、細胞遺伝子サイレンシングのための他の５つの細胞遺伝子（ＴＲＰＳ１、ＰＩＴＸ１、ＬＣＯＲ、ＬＹＰＬＡ２及びＨｙａｌを含む）を標的にしているため、この天然のｐｒｅ−ｍｉｒ−４３４−５ｐトランスフェクションのオフターゲット効果は未だに決定されていない。

ｍｉＲＮＡ薬剤の標的特異性及び安全性を向上させるために、ｍｉｒ−４３４−５ｐの種配列を改めて設計してＴｙｒヌクレオチド３−２５（いわゆる、ｍｉＲ−Ｔｙｒ）又はＨｙａｌヌクレオチド４５９−４８２（いわゆる、ｍｉＲ−Ｈｙａｌ）のいずれかと結合する高度に適合した領域を形成した。Ｔｙｒ遺伝子サイレンシング（ｐｒｅ−ｍｉＲ−Ｔｙｒ）のためのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ挿入物配列は、５’−ＧＴＣＣＧＡＴＣＧＴ ＣＧＣＣＣＴＡＣＴＣ ＴＡＴＴＧＣＣＴＡＡ ＧＣＣＧＣＴＡＡＧＣ ＣＡＧＧＣＧＧＣＴＴ ＡＧＧＣＡＡＴＡＧＡ ＧＴＡＧＧＧＣＣＧＡ ＣＧＣＧＴＣＡＴ−３’（配列番号８）であり、これはスプライシングの後にヘアピン様ＲＮＡを形成し、更に、５’−ＧＣＣＣＴＡＣＴＣＴ ＡＴＴＧＣＣＴＡＡＧ ＣＣ−３’（配列番号９）を含むか、又はそれと相同性を有する成熟ｍｉＲ−ＴｙｒマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）配列にプロセッシングされる。代替的に、Ｈｙａｌ遺伝子サイレンシング（ｐｒｅ−ｍｉＲ−Ｈｙａｌ）のためのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ挿入物は、５’−ＧＴＣＣＧＡＴＣＧＴ ＣＡＧＣＴＡＧＡＣＡ ＧＴＣＡＧＧＧＴＴＴ ＧＡＡＧＣＴＡＡＧＣ ＣＡＧＧＣＴＴＣＡＡ ＡＣＣＣＴＧＡＣＴＧ ＴＣＴＡＧＣＴＣＧＡ ＣＧＣＧＴＣＡＴ−３’（配列番号１０）であり、スプライシングの後に異なる種類のヘアピン様ＲＮＡを形成し、更に５’−ＡＧＣＴＡＧＡＣＡＧ ＴＣＡＧＧＧＴＴＴＧ ＡＡ−３’（配列番号１１）を含むか、又はそれと相同性を有する成熟ｍｉＲ−Ｈｙａｌ ｍｉＲＮＡ配列にプロセッシングされる。ｐｒｅ−ｍｉＲ−Ｔｙｒ構築物及びｐｒｅ−ｍｉＲ−Ｈｙａｌ構築物のいずれも、同じｍｉｒ−４３４−５ｐ骨格及びｍｉｒ−３０２ステムループに基づいて再設計され、そのようにして得られた成熟ｍｉＲ−Ｔｙｒ及び成熟ｍｉＲ−Ｈｙａｌは互いに全く異なっている。図６に示されるように、マウス皮膚におけるｍｉＲ−Ｔｙｒ及びｍｉＲ−Ｈｙａｌのトランスフェクション発現は、標的とされたＴｙｒ遺伝子（９０％以上の減少）及びＨｙａｌ遺伝子（６７％以上の減少）を、交差によるオフターゲット効果を伴うことなくそれぞれに特異的に抑制した。成熟ｍｉＲ−ＴｙｒマイクロＲＮＡ及び成熟ｍｉＲ−ＨｙａｌマイクロＲＮＡの発現レベルは、ノーザンブロット分析により直接測定されるが、標的とされたＴｙｒ及びＨｙａｌの遺伝子製造物（タンパク質）のノックダウン率はウエスタンブロット分析によって決定される。

ヒト皮膚細胞内のｍｉＲ−Ｔｙｒ及びｍｉＲ−ＨｙａｌのマイクロＲＮＡ媒介型遺伝子サイレンシングに関する標的特異性及び安全性
本発明によって設計されたイントロンｍｉＲ−Ｔｙｒ及びｍｉＲ−Ｈｙａｌ ＲＮＡｉエフェクタに関する最適な遺伝子サイレンシング効果を理解した後、本発明者らは、スキンケアのための、ｍｉＲ−Ｔｙｒ ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲ−Ｈｙａｌ ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのいずれかを用いて、ヒト皮膚細胞内及び組織内のこれらのＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ遺伝子構築物に関する有効性、標的特異性及び安全性を継続して試験した。ヒト皮膚表面の細胞層にベクタが効率的にトランスフェクションされるために、１μｇ／ｍｌのＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰベクタ溶液を、１ｍｌのオートクレーブで処理されたｄｄＨ_２Ｏ中の１００μｇの精製したＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰベクタと、９９ｍｌの１００％のデオキシリボヌクレアーゼを含まないグリセリン（又はグリセロルと称される）と、を混合することにより調製した。デオキシリボヌクレアーゼを含まないグリセリンは、皮膚深部への送達及び細胞膜浸透の目的にて、ｍｉＲ−Ｔｙｒを封入するために使用した。これは皮膚に美白と明るさを与える製品に使われる主要成分のベースを形成する。この後、より多く他の化粧品成分が、最終的な化粧品の色、香り、効果及び／又は安定性を増加するために添加され得る。図７Ａに示されるように、上記したｍｉＲ−Ｔｙｒ（右側）を発現するこの主要成分ベースの２ｍｌで処理されたアジア系男性の腕の皮膚を、いかなるｍｉＲＮＡ挿入物も含まないブランクのＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰベクタ（グリセリン対照、左側）で処理された同皮膚の部分と比較した。ｍｉＲ−Ｔｙｒ処置により得られた皮膚の美白の結果（黒色素−メラニンの減少）は、同図にて示されるように、一日２回の処置後、３日間観察した。

次に、皮膚細胞の一次培養物を、個人の同意（全ての治療はこの同意に基づいたものである）を得た上で試験されたドナーからのトリプシン分離性（ｔｒｙｐｓｉｎ−ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ）皮膚の移植片によって得た。皮膚一次培養物におけるベクタトランスフェクションは、実施例３及び６（合計６０μｇ）に記載されるように実施された。図７Ｂに示されるように、標的チロシナーゼタンパク質とその基質メラニンの損失に関するウエスタンブロット分析は、生物統計的に有意である（ｐ＞０．００１）。皮膚におけるチロシナーゼタンパク質とその基質メラニンの減少量は、ｍｉＲ−Ｔｙｒ発現ベクタの処置された濃度に比例しており、ｍｉＲ−Ｔｙｒ処置の増加と標的チロシナーゼタンパク質及び基質メラニンの損失との間における正の相関関係を示している。いかなるｍｉＲＮＡ挿入物をも含まないブランクのＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰベクタ（グリセリン）及び抗ＥＧＦＰ ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ挿入物（ｍｉＲ−ｇｆｐ）を発現するＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰベクタのようなベクタでのその他の処置では何の効果も発見されていない。１μｇ／ｍｌのｍｉＲ−Ｔｙｒ発現ベクタトランスフェクションの濃度にて、最大のＴｙｒ遺伝子サイレンシング率は、チロシナーゼに対しては約５５％−６０％であり、メラニンに対しては３０％−４５％である一方、非標的ハウスキーピング対照βアクチンの発現はｍｉＲ−Ｔｙｒ処置による影響を受けておらず、このことは、この人工マイクロＲＮＡ分子の高い標的特異性を示すものである。図７Ｃは更に、皮膚メラニンレベルは皮膚細胞一次培養物の明視野（ＢＦ）の写真（上のパネル）に示されるように、明らかに減少する一方、メラニン（細胞核の周りの黒い点）はｍｉＲ−Ｔｙｒ処置のない正常な皮膚細胞（即ち、ブランクとグリセリのみ）では非常に発現されていること、を示している。ｍｉＲ−Ｔｙｒ処置後の皮膚細胞は、メラニンの蓄積は抑えられていることを示しており、インビボにおける有効な皮膚美白効果を立証している。皮膚メラニンのこの減少に関しては、免疫細胞化学（ＩＣＣ）染色分析（図７Ｃの下方パネル）にて確認されているように、標的チロシナーゼ発現がｍｉＲ−Ｔｙｒ処置後の皮膚細胞において同時に低減されている。従って、図７Ａ乃至図７Ｃの全体結果に基づいて、設計されたｍｉＲ−ＴｙｒマイクロＲＮＡは、インビボにおけるヒトの皮膚において、チロシナーゼ発現を抑制させて、メラニンの生成を成功裏に阻止するために使用され得る。

ヒト皮膚においてｍｉＲ−Ｔｙｒの遺伝子サイレンシングの有効性が確立された後、本発明者らは、上述のｍｉＲ−Ｔｙｒでトランスフェクションされた皮膚細胞一次培養物と、処置されていない皮膚細胞の一次培養物における３２，６６８以上のヒト遺伝子発現の変化を評価するために遺伝子マイクロアレイ分析（ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｕ１３３Ａ＆Ｂアレイ，Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用した。そして天然のｍｉｒ−４３４の使用と比較して、遥かに多くの標的特異性を有し、かつ標的遺伝子以外の遺伝子に対してはより少ない遺伝子サイレンシング効果を示した。試験された各細胞培養物からの全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して単離した。図８Ａ（左側）に示されるように、処置されていない（ｍｉＲ−）皮膚細胞一次培養物及びｍｉＲ−Ｔｙｒでトランスフェクションされた（ｍｉＲ＋）皮膚細胞一次培養物でのマイクロアレイ分析結果は、標的チロシナーゼ（Ｔｙｒ）及びそれに関連したＴＲＰ１遺伝子を含む２つのみの遺伝子が１．５倍（＞遺伝子発現の５０％の変化）よりも多く変化を受けたこと（図８Ｂ）を示し、ｍｉＲ−Ｔｙｒ媒介型遺伝子サイレンシング効果は標的Ｔｙｒに対して非常に特異的であることを示している。その上、細胞毒性やインターフェロン媒介型ＰＫＲ／２−５Ａ経路に関連した遺伝子が影響を受けることはなく、このことは、スキンケア処置に対してこの遺伝子サイレンシング効果は安全であることを示唆している（図８Ｂ）。本発明者らは又、ノーザンブロット分析を使用してこれらのマイクロアレイ確認型遺伝子の遺伝子発現レベルを比較及び評価し（図８Ｃ）、図８Ａ及び図８Ｂと同様の結果であることを確認した。天然のｍｉｒ−４３４−５ｐトランスフェクション（図８Ａ、右側）の結果を用いて行った更なる比較では、相関関係係数（ＣＣ）の比率は、ｍｉＲ−Ｔｙｒでトランスフェクションされた（ｍｉＲ＋）細胞においては３２，６６８の遺伝子発現のうちの９９．８％という高い比率が変更しないままであることを示すが、７７．６％のＣＣという低い比率がｍｉｒ−４３４−５ｐでトランスフェクションされた細胞において発見された。このことは、わずか６５のみの細胞遺伝子の発現パターンが設計されたｍｉＲ−Ｔｙｒトランスフェクションで変更されることを意味している。これに対し、７，３１７個以上の遺伝子が天然のｍｉｒ−４３４−５ｐでのトランスフェクションで変更されている。それらのミスマッチステムアームにより殆どすべての天然のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は複数の細胞遺伝子を標的にしていることが周知であるため、本発明者らの発明は、これらｍｉＲＮＡの標的特異性の遺伝子サイレンシング応用における安全な使用において、これらステムアーム領域の再設計が必要であることを示す。

従って、本発明のイントロンヘアピン様マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）／ｓｈＲＮＡ発現ベクタの使用は、インビボにおいてスキンケア特に、色素沈着の治療と老化予防のための強力な新しい戦略を提供する。同様の処置において、Ｐｏｌ−ＩＩで転写されたイントロンｍｉＲＮＡは検知され得る細胞毒性を全く引き起こさないが、Ｐｏｌ−ＩＩＩ誘導性ｓｉＲＮＡは以前に報告されたような非特異的なｍＲＮＡ分解を誘導した（Ｓｌｅｄｚ他、前出；Ｌｉｎ他、２００４ｂ年、前出）。これは、イントロンｍｉＲＮＡが、二本鎖ｓｉＲＮＡの潜在的細胞毒性の影響を全く受けることなく、インビボで効果的且つ標的特異性であるという事実を強調している。このようなイントロンｍｉＲＮＡ媒介型遺伝子サイレンシング経路は、Ｐｏｌ−ＩＩ転写、ＲＮＡスプライシング及びＮＭＤプロセッシングを含む複数の細胞内調整系でよく協調されているため、イントロンｍｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング効果は、既に知られている３つのＲＮＡｉ経路の全てにおいて、最も効率的であり、特異的であり、かつ安全であると考えられる。再設計されたイントロンｍｉＲＮＡの使用は、スキンケアの用途において比較的に長期的、効果的、特異的かつ安全な遺伝子操作アプローチを提供し、従来のｓｉＲＮＡ方法で示されたように、非特異的な遺伝子、即ちオフターゲット遺伝子に対するサイレンシング細胞毒性を阻止することができる。

Ａ．定義
本発明について理解しやすくするため、いくつかの用語は次のように定義される：
ヌクレオチド：糖部分（ペントース）、リン酸及び窒素系複素環式塩基から構成されたＤＮＡやＲＮＡの単量体の単位である。その塩基は、グリコシド炭素（ペントースの１’の炭素）を介して糖部分に連結されており、塩基及び糖の組み合わせがヌクレオシドである。ペントースの３’又は５’位に結合された少なくとも一つのリン酸基を含むヌクレオシドがヌクレオチドである。

オリゴヌクレオチド：２つ以上の、好ましくは３つ以上の、そして通常は１０個以上のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドからなる分子である。正確な大きさは種々の要素に依存するが、それらはまたオリゴヌクレオチドの最終的な機能又は使用に依存する。オリゴヌクレオチドは、任意の方法で生成されるが、同方法は化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写、あるいはそれらの組み合わせを含んでいる。

核酸：ヌクレオチドのポリマーであり、一本鎖又は二本鎖のいずれでも良い。
ヌクレオチド類似体：Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ又はＵとは構造的に異なっているプリンやピリミジンヌクレオチドであるが、核酸分子内の通常のヌクレオチドのための代替物に十分に類似している。

遺伝子：そのヌクレオチド配列がＲＮＡ及び／又はポリペプチド（タンパク質）をコードする核酸である。遺伝子はＲＮＡ又はＤＮＡのいずれでも良い。
塩基対（ｂｐ）：二本鎖ＤＮＡ分子においてアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）、又はシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）の対関係である。ＲＮＡではウラシル（Ｕ）がチミンに代わっている。一般に、その対関係は水素結合によりなされている。

前駆体メッセンジャーＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）：遺伝子のリボヌクレオチド一次転写物であり、転写と称される細胞内メカニズムにより真核細胞内のＩＩ型ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ−ＩＩ）機構により生成される。ｐｒｅ−ｍＲＮＡ配列は５’末端非翻訳領域、３’末端非翻訳領域、エキソン及びイントロンを含んでいる。

イントロン：非タンパク質読み取り枠をコード化する遺伝子転写配列の一部又は複数の部分である。
エキソン：タンパク質読み取り枠をコード化する遺伝子転写配列の一部又は複数の部分である。

メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）：ｐｒｅ−ｍＲＮＡエキソンのアセンブリであり、細胞内スプライセオソーム機構によるイントロン除去の後に形成され、タンパク質合成のためのタンパク質コーディングＲＮＡとして使用される。

ｃＤＮＡ：一本鎖ＤＮＡであり、ｍＲＮＡ配列に対して相補的であり、イントロン配列をまったく含んでいない。
センス：相同性ｍＲＮＡと同じ配列順序及び組成である核酸分子である。このセンスの形態は「＋」、「ｓ」又は「ｓｅｎｓｅ」の符号で示される。

アンチセンス：各ｍＲＮＡ分子に相補的な核酸分子である。アンチセンスの形態は、「−」の符号、或いは、ＤＮＡ又はＲＮＡの前に「ａ」又は「ａｎｔｉｓｅｎｓｅ」をつけて示され、例えば、「ａＤＮＡ」又は「ａＲＮＡ」である。

５’末端：１つのヌクレオチドの５’−水酸基がホスホジエステル結合で次のヌクレオチドの３’−水酸基に結合された連続したヌクレオチドの５’位においてヌクレオチドが欠けている末端である。１つ以上のリン酸塩のような他の官能基が末端に存在し得る。

３’末端：１つのヌクレオチドの５’−水酸基がホスホジエステル結合で次のヌクレオチドの３’−水酸基に結合された連続したヌクレオチドの３’位においてヌクレオチドが欠けている末端である。末端に他の官能基、多くの場合は水酸基が存在し得る。

テンプレート：核酸ポリメラーゼでコピーされる核酸分子である。テンプレートは、ポリメラーゼに依存して、一本鎖、二本鎖、或いは、部分的に二本鎖のいずれでもよい。合成されたコピーは、テンプレート、或いは、二本鎖又は部分的な二本鎖のテンプレートの少なくとも一方の鎖と相補的である。ＲＮＡ及びＤＮＡのいずれも、５’から３’の方向に合成される。核酸二本鎖体の２本の鎖は２本の鎖の５’末端が二本鎖体の反対側の末端となるように常に整列されている（そして、必要に応じ、３’末端も同様である）。

核酸テンプレート：ＤＮＡ−ＲＮＡ又はＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド、或いは、一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ分子のような、二本鎖ＤＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ分子、ハイブリッド分子である。

保存：予め選択された配列の正確な相補物と非ランダムにハイブリダイズされる場合、ヌクレオチド配列は予め選択された（参照された）配列に対して保存される。
「相補的」、「相補性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ）」、又は「相補性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）」：塩基対の規則により関連付けられたポリヌクレオチド（即ち、ヌクレオチドの配列）を参照して使用される。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に対し相補的であり、又、「Ｔ−Ｃ−Ｕ」に対しても相補的になっている。相補性は、２つのＤＮＡの鎖の間、ＤＮＡとＲＮＡの鎖の間、或いは、２つのＲＮＡの鎖の間のいずれにもあり得る。相補性は「一部」又は「完全」或いは「総計」のいずれでも良い。一部の相補性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ）又は相補性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）は、いくつかの核酸塩基が塩基対ルールに従って対称になる時のみ、起きる。完全又は総計の相補性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ）又は相補性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）は、塩基が核酸の鎖の間において完全に対称であるとき起きる。核酸の鎖の間の相補性の程度は、核酸の鎖の間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に対して明らかな効果がある。これは増幅反応において特に重要である。また、核酸間の結合に従う検出法においても同じく重要である。相補性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ）又は相補性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）の百分率は、核酸の１つの鎖の合計塩基に対するミスマッチ塩基の数を参照する。従って、５０％の相補性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）は、塩基の半分はミスマッチであり、塩基の半分は一致していることを意味している。２つの鎖の塩基数が違っている場合でも２つの鎖は相補性となり得る。この状況では、相補性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）は、短いほうの鎖の塩基と対をなす対応する長い方の鎖の塩基との間でも起こる。

「相同の」又は「相同性」：遺伝子やｍＲＮＡ配列との類似性を有するポリヌクレオチド配列を意味する。核酸配列は例えば、特定の遺伝子またはｍＲＮＡ配列に対して部分的に又は完全に相同性を有し得る。相同性は、ヌクレオチドの総数に対して類似するヌクレオチドの数により決定された百分率で表すことができる。

相補性塩基：ＤＮＡやＲＮＡが二本鎖構成を取り入れる時、通常に対になっているヌクレオチドである。
相補性ヌクレオチド配列：ＤＮＡ又はＲＮＡの一本鎖分子におけるヌクレオチドの配列であり、２つの鎖の間で引き続く水素結合により特異的にハイブリダイズするもう１つの一本鎖と十分に相補性である配列である。

「ハイブリダイズする」及び「ハイブリダイゼーション」：塩基対を介して複合体を成形するのに十分に相補性を有するヌクレオチド配列の間に二本鎖体を形成すること。プライマー（或いは、スプライステンプレート）が標的（テンプレート）と「ハイブリダイズ」する場合、このような複合体（或いは、混成物）は十分に安定であり、ＤＮＡ合成を開始するために、ＤＮＡポリメラーゼにより必要とされるプライミング機能を提供する。競合的に阻害される二つの相補的ポリヌクレオチドの間には、特異的な、即ち、非ランダム的な相互作用が存在する。

ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）：真核生物における転写後の遺伝子サイレンシング機構であり、マイクロＲＮＡ及び低分子干渉ＲＮＡのような低分子ＲＮＡ分子により引き起こされる。これらの低分子ＲＮＡ分子は通常、遺伝子サイレンサーとして機能し、低分子ＲＮＡに対して完全な相補物又は部分的な相補物のいずれかを含む細胞内遺伝子の発現を干渉する。

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）：ｍｉＲＮＡに対して部分的な相補物を有する標的遺伝子転写物に連結可能な一本鎖ＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは通常、約１７−２７個のオリゴヌクレオチド長であり、ｍｉＲＮＡとその標的ｍＲＮＡとの間の相補性に従い、細胞内ｍＲＮＡ標的物を直接分解するか、又は標的ｍＲＮＡのタンパク質翻訳を直接抑制するかのいずれかを行うことができる。天然ｍｉＲＮＡは、殆ど全ての真核生物から見出され、ウイルス感染からの防御として機能し、植物及び動物の発達時に遺伝子発現の調整を可能にする。

Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ：マイクロＲＮＡ配列に対して相補性を有する一つ又は複数の標的遺伝子をサイレンシングすることができる１つ又は複数のマイクロＲＮＡを生成するために細胞内ＲＮａｓｅＩＩＩエンドリボヌクレアーゼと相互作用をするためのヘアピン様一本鎖ＲＮＡであって、ステムアーム及びステムループ領域を含んでいる。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのステムアームは、完全な（１００％）又は部分的な（ミスマッチを含む）ハイブリダイズされた二本鎖体の形態のいずれかを形成する一方、ステムループはサイクル又はヘアピンループ形態を形成するべくステムアーム二本鎖体の一方の端部に連結されている。

低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）：約１８−２５の完全な塩基対のリボヌクレオチド二本鎖体にサイズ化され、かつ殆ど完全に相補性である標的遺伝子転写物を分解することができる短い二本鎖ＲＮＡ。

低分子、又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）：ヘアピン様構造を形成するために、一致していないループオリゴヌクレオチドで分割された一対の部分的に一致した、又は完全に一致したステムアームヌクレオチド配列を含む一本鎖ＲＮＡ。多くの天然ｍｉＲＮＡはヘアピン様ＲＮＡ前駆体、いわゆる前駆体マイクロＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）から由来する。

ベクタ：異なる遺伝子環境にて移動及び滞在ができる組み換え型ＤＮＡ（ｒＤＮＡ）のような組み換え型核酸分子。一般的に、もう１つの核酸は有効に連結されている。ベクタは細胞内での自己複製ができ、その場合に、ベクタ及び取り付けられたセグメントは複製される。一種の好ましいベクタはエピソーム、即ち、染色体外の複製が可能な核酸分子である。好ましいベクタは、自己複製及び／または、それらが連結している核酸の発現が可能なものである。一つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を誘導することができるベクタは本明細書では、「発現ベクタ」と称される。特に重要なベクタは、逆転写酵素を使用して生成されたｍＲＮＡからｃＤＮＡのクローニングを可能にする。

シストロン：アミノ酸残基の配列をコードするＤＮＡ分子ヌクレオチドの配列であり、上流及び下流ＤＮＡ発現制御要素を含んでいる。
プロモータ：ポリメラーゼ分子が識別し、恐らく結合し、そして合成を開始する核酸。本発明の目的のために、プロモータは、既知のポリメラーゼ結合部位、エンハンサー等、所望のポリメラーゼで合成を開始することができる任意の配列であり得る。

抗体：予め選択されたリガンドを結合することが可能なレセプタをコードする予め選択された保存ドメイン構造を有するペプチド又はタンパク質分子。
Ｂ．組成物
ＲＮＡスプライシング及び／またはプロセッシングに関連した遺伝子サイレンシングを導入するための組み換え型核酸組成物はａ）少なくとも１つのイントロンであって、複数のエキソンと隣接して並び、かつ細胞内ＲＮＡスプライシング及び／またはプロセッシング機構によってエキソンから切断され得るイントロンと、ｂ）所望の機能を備える遺伝子を形成するよう連結され得る複数のエキソンと、を含む。

以上の組み換え型核酸組成物は更にａ）少なくとも１つの制限／クローニング部位であって、皮膚細胞内の組み換え型核酸組成物のＲＮＡ一次転写物を発現するための発現可能なベクタに同組み換え型核酸組成物を取り込むために使用される制限／クローニング部位と、ｂ）複数の転写及び翻訳終了部位であって、組み換え型核酸組成物の正確な大きさのＲＮＡ転写物を生成するために使用される転写及び翻訳終了部位と、を含む。

上記した組み換え型核酸組成物のイントロンは更に、ａ）標的遺伝子に対して相補的であるか、又は相同性を有する遺伝子サイレンシングエフェクタ挿入物と、ｂ）５’供与スプライス部位と、ｃ）３’受容スプライス部位と、ｄ）スプライセオソーム型識別のための分枝点モチーフと、ｅ）スプライセオソーム相互作用のためのポリピリミジン領域と、ｆ）以上の構成要素を連結するための複数のリンカーと、を含む。

５’−供与スプライス部位は、５’−ＧＴＡＡＧＡＧＫ−３’（配列番号３）又は（５’−ＧＴＡＡＧＡＧＧＡＴ−３’（配列番号２７）、５’−ＧＴＡＡＧＡＧＴ−３’、５’−ＧＴＡＧＡＧＴ−３’及び５’−ＧＴＡＡＧＴ−３’のような）ＧＵ（Ａ／Ｇ）ＡＧＵモチーフのいずれかを含むか、又はいずれかと相同性を有するヌクレオチド配列であり、一方、３’−受容スプライス部位は、ＧＷＫＳＣＹＲＣＡＧ（配列番号４）又は（５’−ＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣ ＡＧ−３’（配列番号２８）、５’−ＧＧＣＴＧＣＡＧ−３’及び５’−ＣＣＡＣＡＧ−３’のような）ＣＴ（Ａ／Ｇ）Ａ（Ｃ／Ｔ）ＮＧモチーフのいずれかを含むか、又はいずれかと相同性を有するヌクレオチド配列である。その上、分枝点配列は５’スプライス部位と３’スプライス部位との間に位置しており、５’−ＴＡＣＴＡＡＣ−３’及び５’−ＴＡＣＴＴＡＴ−３’のような５’−ＴＡＣＴＷＡＹ−３’（配列番号５）モチーフとの相同性を有するものである。分枝点配列のアデノシン“Ａ”ヌクレオチドは、殆ど全てのスプライセオソームイントロン内の細胞性（２’−５’）−オリゴアデニル酸合成酵素及びスプライセオソームにより（２’−５’）連結型ラリアットイントロンＲＮＡの一部を形成している。更に、ポリピリミジン領域は、分枝点と３’スプライス部位との間に近接して位置しており、５’−（ＴＹ）ｍ（Ｃ／−）（Ｔ）ｎＳ（Ｃ／−）−３’（配列番号６）又は５’−（ＴＣ）ｎＮＣＴＡＧ（Ｇ／−）−３’（配列番号７）モチーフのいずれかと相同性を有するとともにＴ又はＣを多く含むオリゴヌクレオチド配列を含んでいる。符号「ｍ」及び「ｎ」は１以上の複数の反復を示しており、最も好ましくは、ｍは１〜３に等しく、かつｎ数字は７〜１２に等しい場合である。符号「−」は、配列内の空白ヌクレオチドを意味している。これら全てのイントロン構成要素を連結するために複数のリンカーヌクレオチド配列も存在している。ヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列データに使用される符号と様式のための３７ＣＦＲ １．８２２ガイドラインに基づいて、符号Ｗはアデニン（Ａ）又はチミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）を意味し、符号Ｋはグアニン（Ｇ）又はチミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）を意味し、符号Ｓはシトシン（Ｃ）又はグアニン（Ｇ）を意味し、符号Ｙはシトシン（Ｃ）又はチミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）を意味し、符号Ｒはアデニン（Ａ）又はグアニン（Ｇ）を意味し、符号Ｎはアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）又はチミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）を意味する。上記した全てのスプライセオソーム識別構成要素について、デオキシチミジン（Ｔ）ヌクレオチドはウリジン（Ｕ）で置き換え可能である。

Ｃ．方法
ヒト皮膚細胞内のＲＮＡスプライシング及びプロセッシングに関連した遺伝子サイレンシング効果を導入するためのインビボでの方法は、ａ）エキソンに隣接する遺伝子サイレンシングエフェクタをコード化するスプライセオソーム型イントロンを含む組み換え型核酸組成物を構築する工程であって、同イントロンがヘアピン様ＲＮＡ構造をコード化し、ＲＮＡ媒介型遺伝子サイレンシングを誘導するためにエキソンから切断され得ることを含む、工程と、ｂ）組み換え型核酸組成物を発現可能なベクタにクローニングする工程と、ｃ）同ベクタをインビボにて複数の皮膚細胞に導入する工程であって、同皮膚細胞は、組み換え型核酸組成物の複数のＲＮＡ一次転写物を生成し、かつ同皮膚細胞はＲＮＡ一次転写物からイントロンをスプライスして、遺伝子サイレンシングエフェクタに対して相同性を有するか、又は相補的な配列を含む遺伝子に対して遺伝子サイレンシング効果を提供することと、エキソンがタンパク質をコード化するために共に連結され得ることと、を含む工程と、からなる。

実施例
以下の実施例は、特定の好ましい実施形態及び本発明の態様を例示するものであるが、本発明の範囲を制限するものではない。

以下の実験において、以下の略語が使用されている：Ｍ（モルの）、ｍＭ（ミリモル）、μｍ（マイクロモル）、ｍｏｌ（モル）、ｐｍｏｌ（ピコモル）、ｇｍ（グラム）、ｍｇ（ミリグラム）、μｇ（マイクログラム）、ｎｇ（ナノグラム）、Ｌ（リットル）、ｍｌ（ミリリットル）、μｌ（マイクロリットル）、℃（摂氏温度）、ｃＤＮＡ（コピー又は相補的ＤＮＡ）、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）、ｓｓＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）、ｄｓＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）、ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド三リン酸）、ＲＮＡ（リボ核酸）、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸）、ＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水）、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（トリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩）及びＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）。

ＳｐＲＮＡｉ含有組み換え遺伝子（ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ）の構築
センス挿入物、アンチセンス挿入物又はヘアピン−ＥＧＦＰ挿入物を含む三種の異なるＳｐＲＮＡｉイントロンの生成に使用された合成核酸配列は以下のものを含む：Ｎ１センス、５’−ｐＧＴＡＡＧＡＧＧＡＴ ＣＣＧＡＴＣＧＣＡＧ ＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡ ＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡ ＧＡ−３’（配列番号１２）、Ｎ１アンチセンス、５’−ｐＣＧＣＧＴＣＴＴＧＡ ＡＧＡＡＧＡＴＧＧＴ ＧＣＧＣＴＣＣＴＧＣ ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣ ＴＣＴＴＡＣ−３’（配列番号１３）、Ｎ２センス、５’−ｐＧＴＡＡＧＡＧＧＡＴ ＣＣＧＡＴＣＧＣＴＴ ＧＡＡＧＡＡＧＡＴＧ ＧＴＧＣＧＣＴＣＣＴ ＧＡ−３’（配列番号１４）、Ｎ２アンチセンス、５’−ｐＣＧＣＧＴＣＡＧＧＡ ＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣ ＴＴＣＴＴＣＡＡＧＣ ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣ ＴＣＴＴＡＣ−３’（配列番号１５）、Ｎ３センス、５’−ｐＧＴＡＡＧＡＧＧＡＴ ＣＣＧＡＴＣＧＣＡＧ ＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡ ＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡ ＧＴＴＡＡＣＴＴＧＡ ＡＧＡＡＧＡＴＧＧＴ ＧＣＧＣＴＣＣＴＧＡ−３’（配列番号１６）、Ｎ３アンチセンス、５’−ｐＣＧＣＧＴＣＡＧＧＡ ＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣ ＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴ ＴＡＡＣＴＴＧＡＡＧ ＡＡＧＡＴＧＧＴＧＣ ＧＣＴＣＣＴＧＣＧＡ ＴＣＧＧＡＴＣＣＴＣ ＴＴＡＣ−３’（配列番号１７）、Ｎ４センス、５’−ｐＣＧＣＧＴＴＡＣＴＡ ＡＣＴＧＧＴＡＣＣＴ ＣＴＴＣＴＴＴＴＴＴ ＴＴＴＴＴＧＡＴＡＴ ＣＣＴＧＣＡＧ−３’（配列番号１８）、Ｎ４アンチセンス、５’−ｐＧＴＣＣＴＧＣＡＧＧ ＡＴＡＴＣＡＡＡＡＡ ＡＡＡＡＡＧＡＡＧＡ ＧＧＴＡＣＣＡＧＴＴ ＡＧＴＡＡ−３’（配列番号１９）。それに加え、２つのエキソンフラグメントは、赤色蛍光ＲＧＦＰ遺伝子（配列番号２０）の２０８個目のヌクレオチド（ｎｔ）部位でのＤｒａＩＩ制限酵素切断によって生成され、そして、５’フラグメントは更にＴ４ ＤＮＡポリメラーゼによって終端が平滑化された。ＲＧＦＰは赤色にシフトした新規な蛍光変異色素タンパク質遺伝子を意味し、それはＨｅｔｅｒａｃｔｉｓ ｃｒｉｓｐａ．（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）からのＨｃＲｅｄ１色素タンパク質の６９個目のアミノ酸（ａ．ａ．）部位に更なるアスパラギン酸塩を挿入することによって生成され、５７０ｎｍの波長にて、会合の少ないほぼ２倍の強い近赤外蛍光放射を示す。又、ＸｈｏＩとＸｂａＩ制限酵素によりｐＨｃＲｅｄ１−Ｎ１／１プラスミド（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）を切断し、２％のアガロースゲル電気泳動により単離された完全長の７６９−ｂｐ ＲＧＦＰ遺伝子フラグメント及び３，９３４−ｂｐのブランクプラスミドをそれぞれ精製した。

Ｎ１センスをＮ１アンチセンスへの、Ｎ２センスをＮ２アンチセンスへの、Ｎ３センスをＮ３アンチセンスへの、そして、Ｎ４センスをＮ４アンチセンスへのハイブリダイゼーションは、センス配列及びアンチセンス配列が１：１の各相補混合物を、９４℃で２分間加熱し、次に１ｘＰＣＲ緩衝液（例えば、２５℃にてｐＨ９．２の５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１６ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、１．７５ｍＭ ＭｇＣｌ_２）に７０℃で１０分間の加熱をすることによりそれぞれ実施した。続いて、Ｎ１、Ｎ２又はＮ３混成物のいずれかをＮ４混成物と順次ライゲーションし、Ｎ１−Ｎ４混成物、Ｎ２−Ｎ４混成物又はＮ３−Ｎ４混成物（いずれも、１：１）の混合物のそれぞれを５０℃から１時間わたって１０℃まで徐々に冷却し、Ｔ４リガーゼと相対的な緩衝液（Ｒｏｃｈｅ，ＩＮ）とを同混合物に１２℃にて１２時間の間混合し、適切な末端を備えたエキソンに挿入するためのイントロンを得た。ＲＧＦＰエキソンフラグメントを反応物（１：１：１）に加えた後、Ｔ４リガーゼ及び緩衝液は更に１２℃にて１２時間の間、ライゲーションを繰り返すために同様に調整された。正確なサイズの組み換え型ＲＧＦＰ遺伝子をクローニングするために、１０ｎｇのライゲーションされたヌクレオチド配列を、ＲＧＦＰに特異的なプライマー対である５’−ＣＴＣＧＡＧＣＡＴＧ ＧＴＧＡＧＣＧＧＣＣ ＴＧＣＴＧＡＡ−３’（配列番号２１）及び５’−ＴＣＴＡＧＡＡＧＴＴ ＧＧＣＣＴＴＣＴＣＧ ＧＧＣＡＧＧＴ−３’（配列番号２２）を用いて、９４℃で１分間、５２℃で１分間、そして６８℃で２分間を３０サイクル実施して、ＰＣＲ増幅を行った。結果として得られたＰＣＲ生成物は、２％のアガロースゲル上で分画化され、そして、〜９００−ｂｐヌクレオチド配列がゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）で抽出かつ精製された。この〜９００ｂｐ ＳｐＲＮＡｉ含有ＲＧＦＰ遺伝子の構成は更にシークエンシングによって確認された。

組み換え遺伝子は、５’末端及び３’末端のそれぞれに、ＸｈｏＩ及びＸｂａＩ制限部位を所有するので、ＸｈｏＩ及びＸｂａＩクローニング部位への付着末端を有するベクタに容易にクローニングされ得る。ベクタは、プラスミド、コスミド、ファージミド、イースト人工染色体、ジャンピング遺伝子、トランスポゾン及びウイルスベクタからなる群より選択された皮膚親和性で、発現可能な生物又はや下位有機体でなければならない。その上、イントロン内の挿入物はまた、その５’末端及び３’−末端のそれぞれにおいて、ＰｖｕＩ制限部位及びＭｌｕＩ制限部位と隣接して並んでいるので、その挿入物を、ＰｖｕＩクローニング部位及びＭｌｕＩクローニング部位への付着末端を有する別の異なる挿入配列を用いて除去及び置換が可能である。挿入される配列は、蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、発光酵素遺伝子、ｌａｃ−Ｚ遺伝子、ウイルス遺伝子、細菌遺伝子、植物遺伝子、動物遺伝子及びヒト遺伝子からなる群より選択された遺伝子標的に対して高い相補性を有するヘアピン様遺伝子サイレンシングエフェクタであることが好ましい。遺伝子サイレンシングエフェクタ挿入物とその標的遺伝子との間の相補率及び／または相同率は約３０％−１００％の範囲にあるが、ヘアピンｓｈＲＮＡ挿入物に対しては３５％−４９％、センス−ｓｔＲＮＡ及びアンチセンス−ｓｉＲＮＡ挿入物の両方に対しては９０％−１００％の範囲にあることがより好ましい。

ＳｐＲＮＡｉ含有遺伝子の発現可能なベクタへのクローニング
組み換え型ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ遺伝子はその５’末端及び３’−末端のそれぞれにＸｈｏＩ及びＸｂａＩ制限部位を有するので、ＸｈｏＩ及びＸｂａＩクローニング部位への付着末端を有するベクタにて容易にクローニングされ得る。本発明者らは、ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ遺伝子を直線化された３，９３４−ｂｐのブランクのｐＨｃＲｅｄ１−Ｎ１／１プラスミドと１：１６（ｗ／ｗ）の割合にて混合し、得られた混合物を５０分間にわたり６５℃から１５℃まで冷却し、次にライゲーションを実施するために、１２℃にて１２時間の間、Ｔ４リガーゼ及び相対緩衝液を加えた。これによりＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ発現ベクタが形成され、同ベクタは５０μｇ／ｍｌカナマイシン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含むＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α ＬＢ培養物中において増殖され得る。陽性クローンは、９４℃で１分間、次いで６８℃で２分間を３０サイクルで、ＲＧＦＰ特異的プライマー対（配列番号２１及び配列番号２２）を用いたＰＣＲ、及び引き続くシークエンシングにて確認した。ウイルスベクタへのクローニングについては、ＸｈｏＩ／ＸｂａＩ−直線化ｐＬＮＣＸ２レトウイルスのベクタ（ＢＤ）を代わりに使用することを除いては、同様なライゲーション工程にて実施され得る。ＳｐＲＮＡｉイントロン内の挿入物は、その５’末端及び３’末端のそれぞれにてＰｖｕＩ及びＭｌｕＩ制限部位と隣接して並んでいるので、抗ＥＧＦＰ ｓｈＲＮＡ挿入物を除去して、ＰｖｕＩ及びＭｌｕＩクローニング部位への付着末端を有するｍｉＲ−Ｔｙｒ又はｍｉＲ−Ｈｙａｌ挿入配列で置き換えることができる。

ｍｉＲ−Ｔｙｒ挿入物又はｍｉＲ−Ｈｙａｌ挿入物のいずれかを含む種々のＳｐＲＮＡｉイントロンの生成に使用される合成核酸配列は、以下の通りである：ｍｉＲ−Ｔｙｒセンス、５’−ＧＴＣＣＧＡＴＣＧＴ ＣＧＣＣＣＴＡＣＴＣ ＴＡＴＴＧＣＣＴＡＡ ＧＣＣＧＣＴＡＡＧＣ ＣＡＧＧＣＧＧＣＴＴ ＡＧＧＣＡＡＴＡＧＡ ＧＴＡＧＧＧＣＣＧＡ ＣＧＣＧＴＣＡＴ−３’（配列番号８）、ｍｉＲ−Ｔｙｒアンチセンス、５’−ＡＴＧＡＣＧＣＧＴＣ ＧＧＣＣＣＴＡＣＴＣ ＴＡＴＴＧＣＣＴＡＡ ＧＣＣＧＣＣＴＧＧＣ ＴＴＡＧＣＧＧＣＴＴ ＡＧＧＣＡＡＴＡＧＡ ＧＴＡＧＧＧＣＧＡＣ ＧＡＴＣＧＧＡＣ−３’（配列番号２３）、及びｍｉＲ−Ｈｙａｌセンス、５’−ＧＴＣＣＧＡＴＣＧＴ ＣＡＧＣＴＡＧＡＣＡ ＧＴＣＡＧＧＧＴＴＴ ＧＡＡＧＣＴＡＡＧＣ ＣＡＧＧＣＴＴＣＡＡ ＡＣＣＣＴＧＡＣＴＧ ＴＣＴＡＧＣＴＣＧＡ ＣＧＣＧＴＣＡＴ−３’（配列番号１０）、ｍｉＲ−Ｈｙａｌアンチセンス、５’−ＡＴＧＡＣＧＣＧＴＣ ＧＡＧＣＴＡＧＡＣＡ ＧＴＣＡＧＧＧＴＴＴ ＧＡＡＧＣＣＴＧＧＣ ＴＴＡＧＣＴＴＣＡＡ ＡＣＣＣＴＧＡＣＴＧ ＴＣＴＡＧＣＴＧＡＣ ＧＡＴＣＧＧＡＣ−３’（配列番号２４）。これらの挿入物は、ｍｉＲ−ＴｙｒセンスのｍｉＲ−Ｔｙｒアンチセンスへのハイブリダイゼーション及びｍｉＲ−ＨｙａｌセンスのｍｉＲ−Ｈｙａｌアンチセンスへのハイブリダイゼーションのそれぞれにて形成した。こうして得られたこれらのｍｉＲ−Ｔｙｒ−発現ベクタ及びｍｉＲ−Ｈｙａｌ発現ベクタは、５０μｇ／ｍｌカナマイシン（ｐＨｃＲｅｄ１−Ｎ１／１プラスミドベースのベクタに対して）又は１００μｇ／ｍｌアンピシリン（ｐＬＮＣＸ２ウイルスベクタに対して）のいずれかを含むＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α ＬＢ培養物において増殖され得る。増殖されたＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰベクタは、Ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ又はＭａｘｉ−ｐｒｅｐプラスミド抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ， ＣＡ）を製造業者の指示に従って使用することにより、単離及び精製され得る。ｐＬＮＣＸ２ベクタに関しては、伝染性があって複製不能なウイルスを製造するために、パッケージング細胞株ＰＴ６７（ＢＤ）を使用してもよい。トランスフェクションされたＰＴ６７細胞は、３７℃かつ５％ＣＯ_２の条件を用いて、４ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン硫酸塩及び５０μｇ／ｍｌのネオマイシン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，ＭＯ）を含む１０％胎児ウシ血清で補充された１ｘＤＭＥＭ培地において培養された。ＰＴ６７細胞で生成されたウイルスの力価は、トランスフェクションの前では、少なくとも１０^６ｃｆｕ／ｍｌであると決定された。

インビボでのベクタトランスフェクション
細胞培養、稚魚及びマウス皮膚へのベクタトランスフェクションについて、最初に、抗ＥＧＦＰ、ｍｉＲ−Ｔｙｒ挿入物又はｍｉＲ−Ｈｙａｌ ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ挿入物のいずれかを含むＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ発現プラスミドベクタとＦｕＧｅｎｅ試薬（Ｒｏｃｈｅ，ＩＮ）とを製造業者の指示に従って混合した。そして、その混合物を、細胞培養物（即ち、ヒト皮膚の一次培養物）、稚魚又はマウス皮膚のそれぞれに直接適用した。ＨＩＶ ｇａｇ−ｐ２４遺伝子に対して挿入物を含まないＲＧＦＰ遺伝子及びｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ挿入物を備えたＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ遺伝子を含むベクタを陰性の対照として使用した。組織又は細胞の形態及び蛍光画像を最初のトランスフェクション後の、０時間、２４時間、４８時間、及び７２時間の時点にて撮影した。インビボでのヒト皮膚へのトランスフェクションについては、予め作製されたＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰベクタ溶液は、１ｍｌ中のオートクレーブ処理されたｄｄＨ_２Ｏに抗ＥＧＦＰ、ｍｉＲ−Ｔｙｒ又はｍｉＲ−Ｈｙａｌのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ挿入物のいずれかを含んだ、又は含まない所定量（即ち、１−１０００μｇ）の精製したＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰベクタを、デオキシリボヌクレアーゼを完全に含まないグリセリン（又はグリセロール）と混合することにより形成した。ついでこの溶液を皮膚に直接適用し、３分間軽くマッサージした。

ノーザンブロット分析
ＲＮＡ（２０μｇの全ＲＮＡ又は２μｇのポリ［Ａ^＋］ＲＮＡ）は１％のホルムアルデヒドアガロースゲル上にて分画化され、かつナイロン膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）に移された。ＲＧＦＰ ５’−エキソンと、抗ＥＧＦＰ ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ挿入物又はｍｉＲ−Ｔｙｒ（配列番号９）との間に隣接する７５塩基対の接合配列か、又は、ｍｉＲ−Ｈｙａｌ（配列番号１０）のいずれかに対して相補性を有する合成プローブを［^３２Ｐ］−ｄＡＴＰ（＞３０００Ｃｉ／ｍＭ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）の存在下にてランダムプライマー伸長法によって、Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔ ＩＩキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いてラベルし、１０ｂｐ−カットオフのマイクロバイオスピンクロマトグラフィカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で精製した。５０％の新鮮な脱イオンホルムアミド（ｐＨ７．０）、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、０．５％ＳＤＳ、４ｘＳＳＰＥ及び２５０ｍｇ／ｍＬの変性したサケ精液ＤＮＡフラグメント（１８時間、４２℃）の混合物中にてハイブリダイゼーションを実施した。オートラジオグラフィーを実施する前に、２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ（１５分間２５℃）にて２回、０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ（４５分間３７℃）にて１回、膜を順次洗浄した。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析
標的タンパク質の免疫ブロット法については、成長培地から除去後の単離された細胞を氷冷したＰＢＳにて洗浄し、プロテアーゼ抑制剤、ロイペプチン、ＴＬＣＫ、ＴＡＭＥ及びＰＭＳＦを補充されたＣｅｌＬｙｔｉｃ−Ｍ溶解／抽出試薬（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）を製造業者の指示に従って使用し、処理した。細胞は室温の振盪器上にて１５分間培養され、マイクロチューブ内に播種され、５分間、１２，０００ｘｇで遠心分離して、細胞の残屑をペレット化した。タンパク質含有の細胞溶解物を回収し、使用時まで−７０℃にて保存した。タンパク質の決定は、Ｅ−ｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）にてＳＯＦＴｍａｘソフトウエアパッケージを用いて測定した。３０μｇの各細胞溶解物を５０ｍＭ ＤＴＴと共に（還元される）、又は５０ｍＭ ＤＴＴを使用しないで（還元されない）ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液に加え、８％のポリアクリルアミドゲル上に装填される前に３分間沸騰し、一方、対照のレーンには２〜３μｌの分子量マーカ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を装填した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、標準プロトコル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄ ＥＤ）に従って実施した。タンパク質分画物をニトロセルロース膜上にエレクトロブロットし、オデッセイブロッキング試薬（Ｌｉ−Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＢ）を用いて１〜２時間、室温中においてブロックした。ついで、ＥＧＦＰ（１：５，０００；ＪＬ−８，ＢＤ）、ＲＧＦＰ（１：１０，０００；ＢＤ）、Ｔｙｒ（１：２，０００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｔｚ）又はＨｙａｌ（１：２，０００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｔｚ）のいずれかに対して誘導される一次抗体を使用して、タンパク質発現を一晩中４℃で評価した。タンパク質ブロットは、ＴＢＳ−Ｔを用いて３回洗浄し、二次抗体である、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０反応性染料を含むヤギ抗マウスＩｇＧコンジュゲート（１：２，０００、分子ブローブ）に、１時間、室温にてさらした。更にＴＢＳ−Ｔで３回洗浄後、Ｌｉ−Ｃｏｒオデッセイ赤外線撮像装置及びオデッセイソフトウエアｖ．１０（Ｌｉ−Ｃｏｒ）を用いてスキャニング及び画像分析を行った。

ゼブラフィッシュのイントロンＲＮＡ媒介型遺伝子サイレンシング
Ｔｇ（アクチンＧＡＬ４：ＵＡＳ−ｇｆｐ）種のゼブラフィッシュ稚魚は、トランスフェクション時、１０ ｍｌの０．２ｘ無血清ＲＰＭＩ １６４０培地を用いて魚用容器にて飼育した。トランスフェクションプレミックス（ｐｒｅ−ｍｉｘ）は、１ｍｌの１ｘ無血清ＲＰＭＩ１６４０培地に、６０μｌのＦｕＧｅｎｅリポソームトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を静かに溶解することにより調製した。実施例１及び２にて記載されているように、抗ＥＧＦＰ ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ挿入物を含む、又は含まないＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰベクタ（２０μｇ）をプレミックス溶液とともに混合し、氷上にて３０分間静置し、容器内のＴｇ（アクチンＧＡＬ４：ＵＡＳ−ｇｆｐ）魚に直接適用した。合計３つの用量を１２時間の間隔（合計６０μｇ）で与えた。サンプルは、最初のトランスフェクションの６０時間後に採取した。

インビボでのマウス皮膚のイントロンｍｉｒ−４３４−５ｐ及びｍｉＲ−Ｔｙｒ媒介型遺伝子サイレンシング
メラニンノックダウンマウス（Ｗ−９黒系の）のパッチドアルビノ（白）皮は、４日間（合計２００μｇ）にわたり天然のｍｉｒ−４３４−５ｐ ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ挿入物を含む単離されたＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ遺伝子発現ベクタの連続的な皮膚内注射（ｉ．ｃ．）により、或いは、６日間にわたり、一日２回（合計２４０μｇ）、設計されたｍｉＲ−Ｔｙｒ ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ挿入物を含むリポソーム封入ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ遺伝子発現ベクタの皮膚への直接導入により、作製した。天然のｍｉｒ−４３４−５ｐ ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ挿入物を含むＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ遺伝子 発現ベクタの生成に関しては、イントロン挿入に対して合成ｍｉｒ−４３４−５ｐ ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ（即ち、５’−ＧＴＣＣＧＡＴＣＧＴ ＣＵＣＧＡＣＵＣＵＧ ＧＧＵＵＵＧＡＡＣＣ ＡＡＡＧＣＵＣＧＡＣ ＵＣＡＵＧＧＵＵＵＧ ＡＡＣＣＡＵＵＡＣＵ ＵＡＡＵＵＣＧＵＧＧ ＵＵＵＧＡＡＣＣＡＵ ＣＡＣＵＣＧＡＣＵＣ ＣＵＧＧＵＵＣＧＡＡ ＣＣＡＵＣＣＧＡＣＧ ＣＧＴＣＡＴ−３’（配列番号２５））を使用することを除いては、実施例２に記載の手順に従った。標的組織へ効率的に送達するために、その構築物を、実施例３及び６に記載された同様のプロトコルに従って、ＦｕＧｅｎｅリポソーム型トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ，ＩＮ）と混合した。

ヒト皮膚におけるイントロンｍｉＲ−Ｔｙｒ媒介型遺伝子サイレンシング
ヒトの複数細胞層へ効率的にベクタをトランスフェクションするために、１μｇ／ｍｌ ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰベクタ溶液を、オートクレーブで処理された１ｍｌのｄｄＨ_２Ｏ中の１００μｇの精製したＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰベクタとデオキシリボヌクレアーゼを全く含まないグリセリン９９ｍｌ（グリセロールとも称される）とを混合することにより作製した。デオキシリボヌクレアーゼを全く含まないグリセリンは皮膚深部への送達及び細胞膜浸透を目的として、ｍｉＲ−Ｔｙｒを封入するために使用した。これにより、本発明による皮膚を美白にするとともに明るくするための主要成分のベースが形成された。次に、発明者の腕の一方（左腕）において、その右側の部分には設計されたｍｉＲ−Ｔｙｒを発現するこの主要成分のベース溶液の２ｍｌが直接適用され、比較としてその左側の部分には、ｍｉＲＮＡ挿入物を含まないブランクのＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰベクタの別の２ｍｌが直接塗布された。ｍｉＲ−Ｔｙｒ処置による皮膚美白の効果は（黒色素メラニンの減少）は一日に２回の処置後３日間観察した。

免疫細胞化学染色（ＩＣＣ）法
免疫化学染色キットはＩｍｇｅｎｅｘ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手して、製造業者の指示に従って使用した。標本を、最初にＰＢＳにて３回洗浄し、ツェラー溶液（１０ｍＭＴｒｉｓ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５％胎児の子牛血清、１％ＢＳＡ及び０．５％トゥイーン２０，ｐＨ７．４）で３０分間培養した。次に、それらの標本を、４℃の加湿室で一次抗体（ツェラー溶液で希釈されている）とともに一晩培養した。その後、それらの標本をＴＢＳＴで３回水洗し、ビオチン化ヤギ抗ウサギ抗体又はウマ抗マウス抗体を二次抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）として使用して２時間培養した。その後、標本を一度ＴＢＳＴで洗浄し、また、ストレプタビジン−ＨＲＰを三次抗体として更に２時間使用した。続いて、それらの標本をＰＢＴで１回洗浄し、結合抗体をＤＡＢ基質で検出した。陽性の結果は、全範囲のスキャニングを用いた１００倍の顕微鏡下で観察され、１００倍及び４００倍の倍率（倒立顕微鏡ＴＥ２０００定量システム）で記録された。

マイクロアレイ分析
マイクロアレイハイブリダイゼーションのための標識化されたプローブを調製するために、抽出された全ＲＮＡ（２μｇ）を、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｃｈｏｉｃｅシステムキット（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して、修飾されたオリゴ（ｄＴ）_２４−Ｔ７プロモータプライマー（例えば、５’−ＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡ ＴＴＧＴＡＡＴＡＣＧ ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ ＧＧＧＡＧＧＣＧＧ−（ｄＴ）_２４−３’）（配列番号３３）を用いて、製造業者のプロトコルに従って、二本鎖ｃＤＮＡへと変換した。二本鎖ｃＤＮＡを、フェノール／クロロホルム抽出にて精製し、エタノールで沈殿させ、ピロ炭酸ジエチル（ＤＥＰＣ）処理されたｄｄＨ_２Ｏの０．５μｇ／μｌの濃縮液で再懸濁した。フェーズロックゲル（５’Ｐｒｉｍｅ→３’Ｐｒｉｍｅ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）を全ての有機抽出において使用し、回収率を増大した。インビトロでの転写はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼと、１μｇのｃＤＮＡ、７．５ｍＭのラベル化されていないＡＴＰ及びＧＴＰと、５ｍＭのラベルされていないＵＴＰ及びＣＴＰと、２ｍＭのビオチンでラベルされたＣＴＰ及びＴＰ（ビオチン−１１−ＣＴＰ、ビオチン−１６−ＵＴＰ、Ｅｎｚｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）と、を用いて実施した。反応は３７℃にて４時間実施し、ｃＲＮＡをＲＮｅａｓｙスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）にて精製した。サンプルは、サイズ範囲を確認するために１％のアガロースゲル上にて分離され、ついで、μｇ単位のｃＲＮＡを、４０ｍＭのトリスアセテート、ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＫＯＡｃ／３０ｍＭ ＭｇＯＡｃにおいて９４℃にて３５分間を加熱することにより、５０塩基の平均サイズにランダムにフラグメント化した。

合計３２，６６８の遺伝子を含む１組の４つのオリゴヌクレオチドマイクロアレイ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｕ１３３Ａ＆Ｂ ａｒｒａｙｓ，Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）をハイブリダイゼーションのために使用した。ハイブリダイゼーションは、４０℃にて１６時間、一定に混合しながら２００μｌのＡＦＦＹ緩衝液（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）において完了した。ハイブリダイゼーション後、アレイは２００μｌの６ｘＳＳＰＥ−Ｔ緩衝液（１×０．２５Ｍの塩化ナトリウム／１５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．６／１ｍＭ ＥＤＴＡ／０．００５％のトリトン）を用いて３回洗浄し、その後２００μｌの６ｘＳＳＰＥ−Ｔを用いて１時間、５０℃にて水洗した。アレイは、０．５ＸＳＳＰＥ−Ｔで２回洗浄し、０．５ｘＳＳＰＥ−Ｔを用いて５０℃にて１５分間、水洗した。染色は、６ｘＳＳＰＥ−Ｔ（ｐＨ７．６）中の２μｇ／ｍｌのストレプトアビジン−フィコエリトリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）及び１ｍｇ／ｍｌのアセチル化のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を用いて実施した。アレイは、共焦点スキャナ（Ｍｏｋｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用して７．５μｍで読み取られ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｕｉｔｅバージョン４．０のソフトウエアにより分析された。サンプルは、完全にマッチしたプローブとミスマッチプローブとの間の平均の差異の合計を使用することにより正規化された。２倍より大きく誘導された差分信号が収集された。

統計分析
結果を平均±ＳＥとして示した。データの統計分析は、一元配置分散分析（Ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）で行われた。主たる効果が有意である場合、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較（ｐｏｓｔ−ｈｏｃ）検定を使用して、対象から有意に異なる群を識別した。２つの治療群の間を一対ごとに比較するために、両側（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ）スチューデントＴ検定を使用した。２つ以上の治療群を含む実験については、ＡＮＯＶＡは多重比較の多重範囲検定に従って実施した。ｐ＜０．０５の確立値は有意であると考えた。全てのｐ値は両側試験にて決定した。

本明細書に記載された実施例及び実施形態は例示のみの目的にてなされたものであり、種々の修正又は変更が当業者に示唆され、それらの修正又は変更も添付された特許請求の範囲に記載されているように本発明の精神及び範囲内に包含されるものであることが理解される。本明細書において引用された全ての刊行物及び特許は、その全体が参照の目的にて援用される。

天然イントロンマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）生物発生の細胞内メカニズムを示す。 ｓｉＲＮＡ、エキソン型（遺伝子間の）マイクロＲＮＡ及びイントロンマイクロＲＮＡ経路の間の異なる生物発生メカニズムを示す。 Ａ乃至Ｄは、発現可能なベクタ組成物（Ａ）（配列番号２９）におけるＳｐＲＮＡｉ取り込み型組み換え遺伝子（ＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ）構築物に関する好ましい実施形態、及び、天然イントロンｍｉＲＮＡの生物発生を模擬し、人工マイクロＲＮＡを生成するこの組成物を使用する戦略（Ｂ）を示す。魚の緑色ＥＧＦＰに対して誘導されたＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ発現組成物のインビボ試験は、ウエスタンブロット分析（Ｃ）にて決定されるように、特に、標的ＥＧＦＰ遺伝子発現において８５％以上の抑制（ｋｎｏｃｋ ｄｏｗｎ）効果を示した。イントロン由来抗ＥＧＦＰマイクロＲＮＡ及びそのスプライスされた前駆体は、ノーザンブロット分析後、１％のホルムアルデヒドアガロースゲル電気泳動の上で観察された（Ｄ）。 Ａ乃至Ｃは、効果的なマイクロＲＮＡ生物発生及びゼブラフィッシュの標的とされる緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）発現の得られる遺伝子スプライシングのためのＳｐＲＮＡｉ−ＲＧＦＰ構築物内のイントロンＲＮＡ挿入物に関する異なる設計を示し、［１］５’−ｍｉＲＮＡ＊ステムループｍｉＲＮＡ−３’構築物（配列番号３０）のトランスフェクション及び［２］５’−ｍｉＲＮＡステムループｍｉＲＮＡ＊−３’ヘアピンＲＮＡ構築物（配列番号３１、配列番号３２）のトランスフェクション間のＲＩＳＣアセンブリにおける非対称優先性の選択を立証する（Ａ）。インビボでの遺伝子サイレンシングは、［１］の構築物ではなく、［２］のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ構築物のトランスフェクションにおいてのみ観察された。ＥＧＦＰ及びＲＧＦＰの色の組み合わせは（深いオレンジ色にて示されるように）緑色よりも赤く表示しているので、標的ＥＧＦＰ（緑色）の発現レベルは、ベクタの指標であるＲＧＦＰ（赤）が全てのベクタトランスフェクションにおいて均等的に存在している場合、［２］のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡトランスフェクションにおいて明らかに低減されている（Ｂ）。ＥＧＦＰタンパク質レベルのウエスタンブロット分析は、［２］のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡトランスフェクションに関する特異的サイレンシングの結果を確認している（Ｃ）。検知可能な遺伝子サイレンシングは、リポソームのみ（Ｌｉｐｏ）、挿入物なしのブランクのベクタ（Ｖｃｔｒ）及びｓｉＲＮＡ（ｓｉＲ）のような他の処置ではまったく検知されていない。 本発明により発現された天然ｍｉｒ−４３４のマウスの皮膚脱色におけるチロシナーゼ（Ｔｙｒ）遺伝子サイレンシング効果を示し、本発明を用いてインビボにて局所皮膚遺伝子変調が実施可能であることを示す。 本発明により発現された改良型人工抗Ｔｙｒ ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−Ｔｙｒ）挿入物のマウス皮膚における使用の結果を示し、標的とされるチロシナーゼ（Ｔｙｒ）に対し、より特異的であり、かつオフターゲット遺伝子に対してはより影響の少ない遺伝子サイレンシング効果を示している。 Ａ乃至Ｃは、図６の方法とは同様であるが、本発明により発現された改良型人工抗Ｔｙｒ ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−Ｔｙｒ）挿入物のヒトの腕の皮膚（Ａ）及び初代皮膚細胞培養物（Ｂ及びＣ）における使用の結果を示し、チロシナーゼ（Ｔｙｒ）発現において５０％以上のノックダウン率を示す。 Ａ乃至Ｃは、上記した人工抗Ｔｙｒ ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡでトランスフェクションされた初代皮膚細胞培養物中の変更された遺伝子発現の遺伝子マイクロアレイ分析（アフィメトリクスヒトＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｕ１３３Ａ＆Ｂ，ＣＡ）の結果を示し、ｍｉｒ−４３４のような天然マイクロＲＮＡの使用に比べ、遥かに標的特異性が高く、かつオフターゲット遺伝子に対してはより影響の少ない遺伝子サイレンシング効果を示している。

Claims (13)

1. ＲＮＡスプライシング／プロセッシングに関連した遺伝子サイレンシングを導入するための組み換え型核酸組成物であって、スキンケアのための化粧品を生成する方法に使用するための組み換え型核酸組成物において、前記組み換え型核酸組成物は、
   （ａ）哺乳動物の皮膚細胞において、色素に関連する遺伝子及び老化を引き起こす遺伝子の少なくとも１つにおいて特定の遺伝子サイレンシング効果を誘導するマイクロＲＮＡ又はｓｈＲＮＡをコードするイントロン挿入物を含む少なくとも１つのイントロンであって、前記イントロンは、エキソンに隣接し且つ、細胞内ＲＮＡスプライシング及びプロセッシングの少なくとも一方を行う機構によって前記エキソンから切断され得るイントロンと、
   （ｂ）複数のエキソンであって、前記エキソンは所望の機能を備えた遺伝子を形成するよう連結されるエキソンと、を含み、
   前記イントロン挿入物は、配列番号８又は配列番号１０の配列を有するマイクロＲＮＡ又はｓｈＲＮＡをコードするものである、組み換え型核酸組成物。
2. 請求項１に記載の組み換え型核酸組成物は、
   （ａ）前記組み換え型核酸組成物のＲＮＡ転写物を発現するための発現可能なベクタを用いてライゲーションするために使用される少なくとも１つの多重制限／クローニング部位と、
   （ｂ）前記組み換え型核酸組成物の正確な大きさのＲＮＡ転写物を生成するために使用される複数の転写及び翻訳の少なくとも一方のための複数の終了部位と、を更に含む、組み換え型核酸組成物。
3. 前記イントロンは、
   （ａ） 供与スプライス部位及び受容スプライス部位と、
   （ｂ） 分枝点ドメインと、
   （ｃ） 少なくとも１つのポリピリミジン領域と、をさらに含む、請求項１に記載の組み換え型核酸組成物。
4. 前記色素に関連する遺伝子及び老化を引き起こす遺伝子のうちの少なくとも１つは、チロシナーゼ遺伝子、ヒアルロニダーゼ遺伝子、及びそれらの組み合わせからなる群より選択された少なくとも１つの遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の組み換え型核酸組成物。
5. 前記イントロン挿入物は、配列番号１の配列を有する機能性ステムループ構造を含むヘアピン様核酸であることを特徴とする請求項１に記載の組み換え型核酸組成物。
6. 前記分枝点は、配列番号５の配列を含む核酸配列内に位置するアデノシン（Ａ）ヌクレオチドであることを特徴とする請求項３に記載の組み換え型核酸組成物。
7. 前記分枝点は、５’−ＴＡＣＴＡＡＣ−３’の配列を有する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドモチーフを含む核酸配列内に位置するアデノシン（Ａ）ヌクレオチドであることを特徴とする請求項３に記載の組み換え型核酸組成物。
8. 前記ポリピリミジン領域は、配列番号６又は配列番号７の配列を含むＴ又はＣを高含量にて含む核酸配列であることを特徴とする請求項３に記載の組み換え型核酸組成物。
9. 前記供与スプライス部位は、配列番号３の配列を含む核酸配列であることを特徴とする請求項３に記載の組み換え型核酸組成物。
10. 前記供与スプライス部位は、５’−ＧＴＡＡＧ−３’の配列を含む核酸配列であることを特徴とする請求項３に記載の組み換え型核酸組成物。
11. 前記受容スプライス部位は、配列番号４の配列を含む核酸配列であることを特徴とする請求項３に記載の組み換え型核酸組成物。
12. 前記受容スプライス部位は、５’−ＣＴＧＣＡＧ−３’の配列を含む核酸配列であることを特徴とする請求項３に記載の組み換え型核酸組成物。
13. 美白の肌及び明るい肌とするための化粧品であって、前記化粧品は、皮膚色素に関連する遺伝子及び老化を引き起こす遺伝子のうちの少なくとも一方に対して特定の遺伝子サイレンシング効果を誘導するための組み換え型核酸組成物を含み、
    前記組み換え核酸組成物は、請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の組み換え核酸組成物である、化粧品。

Images