TWI427145B - 使用內含子之核醣核酸於生成類胚胎幹細胞 - Google Patents

Description

使用內含子之核醣核酸於生成類胚胎幹細胞

本發明關於一種用來培育、生成與篩選人類類胚胎幹細胞的方法，該項方法藉由一種能轉殖表現的內含子之微核醣核酸試劑。具體而言，本發明係關於一種用來生成非天然產生之內含子之方法與化合物。此內含子之化合物能經由反應而於人類細胞中生成小夾類先驅微核醣核酸(small hairpin-like precursor microRNA(miRNA))。因此將於細胞中誘發某些與分化發育相關基因之靜默效應，進而使該等細胞轉分化為類胚胎幹細胞似的分化多能性幹細胞。更具體來說，類夾先驅微核醣核酸(hairpin-like pre-miRNA)包含mir-302a、mir-302b、mir-302c、mir-302d或與上述核醣核酸同源或近似的衍生物或前驅物。

近來關於人類幹細胞的研究已顯示其可用來移植治療的潛力。然而，可用來複製人類幹細胞的來源卻受到限制，並且很難控制其純度與品質。於1998年，James Thomson等人(如US5,843,780、US6,200,806、US7,029,913及US7,220,584等專利)從人類胚胎中分離出第一株人類胚胎幹細胞(Thomsonet al .,(1998)Science 282： 1145-1147)。而H1與H9兩株典型的細胞株則由上述分離的幹細胞中衍生出來。兩年後，Gearhart等人(如US6,090,622、US6,245,566及US6,331,406等專利)也發展出從人類胚胎之後桑葚體(post-blastocyst)分離出最初的人 類胚胎幹細胞(hES-like primordial germ cells)。因為這些胚胎幹細胞的分離方法必須將原來的胚胎破壞，因此許多道德上、人文宗教上的疑慮逐漸提升，以至於爭論這些胚胎幹細胞用於臨床治療的正當性。

近年來，人們逐漸重視使用這些胚胎幹細胞的安全性疑慮。舉例來說，由於長期培養胚胎幹細胞需要一些由哺乳細胞(feeder)所釋放之未知因子來維持幹細胞的分化多能性(pluripotency)，因此這些胚胎幹細胞需要培養於小鼠或人類的纖維母細胞的哺乳細胞層中。Reubinoff等人之先前技術US6,875,607嘗試完成此方法，然而纖維母細胞的哺乳細胞具有全然不同的抗原特性，而可能汙染胚胎幹細胞並造成病人免疫上的排斥。此外，雖然已經有開發出一些不需要哺乳細胞的培養環境條件，但沒有一種條件能維持穩定、未分化的胚胎幹細胞持續一段時間。這是因為，被分離出來的人類胚胎幹細胞的純度通常不高。現今並無任何一株胚胎幹細胞在培養環境中能達到百分之百的高純度。即使是在最佳培養環境條件下，約有3~5%或更多的胚胎幹細胞傾向於分化成其他細胞型態並喪失其幹細胞的特性。畸胎瘤(teratoma)是胚胎幹細胞分化後常見的現象。畸胎瘤係一種衍生自人類胚細胞株(germ line cells)之腫瘤，其常包含多種癌化的細胞型態，這些型態相似於內胚層、中胚層及外胚層。因此，如何避免哺乳細胞汙染及增加幹細胞純度是現今幹細胞研究主要的兩項課題。

誘發型分化多能性幹細胞(Induced Pluripotent Stem)(iPS)細胞係由Takahashi及Yamanaka於2006年所公諸於世(Cell 126： 663-676)。藉由使用轉殖基因傳遞四種轉錄因子(Oct3/4 ,Sox2 ,c-Myc ,Klf4 )進入小鼠纖維母細胞中，成功地於體外(in vitro)轉分化體纖維母細胞(somatic fibroblast cells)成胚胎幹細胞。此外，Yu等人藉由相似的轉殖基因(Oct4、Sox2、Nanog 及LIN28 )方式，自人類纖維母細胞開發更新穎的iPS細胞(Yuet al .,(2007)Science 318： 1917-1920)。iPS的應用不只能解決道德與純度的問題亦可配合體細胞核轉移(somatic cell nuclear transfer(SCNT))提供一種對病患量身定做的治療方式(Meissneret al .,(2006)Nature 439： 212-215)。上述基於iPS細胞技術的體細胞核轉移治療技術已經在小鼠模式中證實能治療鐮刀型貧血症(Hannaet al .,(2007)Science 318： 1920-1923)。然而，iPS的應用仍有缺陷。這些缺陷在於iPS細胞生成方式；其一為使用反轉錄病毒的潛在危險；另一為使用具有致癌基因特性的轉錄因子(e.g.c-Myc )。而反轉錄病毒轉染方式是唯一一種可同時轉染四種全長的轉錄基因進入體細胞的方法，然而反轉錄病毒載體隨機插入細胞基因體的可能性可能會影響非標的基因並造成不可預期的結果，尤其當其中一個轉染基因是致癌基因的危險。

要精確地將四個全長轉錄因子傳遞至正確的位置是相當困難的一件事。然而，iPS技術需要精確地表現這四種轉錄因子 使其互相調控而激發多樣的訊息傳遞路徑而表現出眾多發育因子(developmental factor)。雖然詳細的機制仍不清楚，但Oct4-Sox2-c-Myc-Klf4 或Oct4-Sox2-Nanog-LIN28 之基因結合效應可產生阻擋細胞早期分化所需的發育因子訊息。儘管只有一個胚胎幹細胞標誌Oct4 ，其他用於生成iPS細胞的基因通常與發育路徑相關。這些基因通常表現於不同胚胎細胞時期或位置而導引細胞走向特定分化路徑。藉由錯置這些基因，因而使細胞分化的正常路徑被打亂，進而使這些細胞轉分化至類似胚胎幹細胞的狀態。這一套方法能達到目的但並不自然。在自然的受精卵中，母系物質(maternal materials)主要在調控幹細胞的維持與複製。這也是胚胎幹細胞在128的細胞時期之前全都是一樣的細胞具有一樣的分化多能性。母系物質產生於卵生成過程(oogenesis)時期，並存於成熟的卵子中以供早期胚胎發育。在小鼠的卵子中，核醣核酸占了母系物質很大的比例，約占整體基因物質中的45%(Stitzelet al .,(2007)Science 316： 407-408)。在卵子接合過程(maternal-zygotic transition)，母系物質很快速地降解，接合子的轉錄過程則開始進行如同兩細胞時期而產生胚胎發育的訊息(O’Farrellet al .,(2004)Curr.Biol. 14： R35-45)。能了解到，許多母系物質係結合子基因產物的抑制物，其在早期胚胎時期可抑制發育訊息並能維持分化多能性細胞態樣。因此，幹細胞維持及複製的秘密應該再於母系物質之中，而非在分化多能性細胞時期後顯現的發育訊息。

簡言之，為了生成並維持類人類胚胎幹細胞(human embryonic stem(hES)-like cells)如同具有母系物質，需要一種新穎的方式來轉殖傳遞分離的母系物質於人體幹細胞或體細胞中，而能維持幹細胞特性或轉分化體細胞成hES細胞。因此，仍然需要一種有效、簡單、安全的轉殖基因方法來傳遞母系物質，特別是母系核醣核酸(maternal RNAs)。

本發明係一種用來培育、生成與篩選人類類胚胎幹細胞的轉殖基因方法，藉由使用類小夾微核醣核酸(hairpin-like microRNA)之內含子表現方式，表現mir-302a、mir-302b、mir-302c、mir-302d及上述核醣核酸相互重組的先驅微核醣核酸(precursor microRNA)之同源衍生物(homologues)或組成物。微核醣核酸通常約長18到27的核苷酸，並能直接降解它們的標的訊息核醣核酸(mRNA)或抑制標的蛋白的轉譯過程。直接降解或抑制蛋白轉譯則是由微核醣核酸(miRNA)與標的物的互補程度(complementarity)。mir-302家族(mir-302s)於所有哺乳動物中序列一致性(conserved)很高，此家族由四個高度同源的微核醣核酸(>90%同源性)，分別是mir-302a、mir-302b、mir-302c、mir-302d所組成。mir-302家族表現時，係以基因群組方式存在於一長條核醣核酸轉錄分子(RNA transcript)中，並以mir-302b-mir-302c-mir-302a-mir-302d-mir-367從5端到3端 的形式連接(Suhet al .,(2004)Dev.Biol. 270： 488-498)。雖然mir-367也共同表現於mir-302家族基因群組中，然而mir-367實際上的表現程度卻小於mir-302家族。而mir-302家族被發現在小鼠卵細胞及人類胚胎幹細胞中表現量極高(Tanget al .,(2007)Genes Dev. 21： 644-648；Suhet al .,(2004)Dev.Biol .270： 488-498)。小鼠的卵細胞缺乏岱塞爾(Dicer)，岱塞爾係一種高度一致性的核醣核酸酶可供微核醣核酸生成，卵細胞限制於維持在減數分裂的分裂時期(division phase of meiosis I)，這現象指出微核醣核酸對於卵細胞生成的過程扮演重要的腳色(Murchisonet al .,(2007)Genes Dev .21 ：682-693)。也因此，mir-302家族非常有可能係維持幹細胞功能與重新複製的主要母系物質。

與先前iPS細胞技術藉由提升四種細胞轉錄因子基因的表現量相異，每一mir-302家族的成員接可調控超過445種細胞基因。此外，根據miRBase：：Sequences(http：//microrna.sanger.ac.uk/ )的資料庫，每一mir-302家族的成員共同的標的基因幾乎相同。許多mir-302的標的基因實質上為參與胚胎發育之細胞分化的發育訊息。因此，mir-302的功能很可能係阻斷或抑制發育訊息的大量產生而不是干擾特定訊息路徑。例如，類胰島素生長因子(insulin-like growth factors(IGF))對於神經元幹細胞及其先驅細胞係潛在發育訊息，此訊息係經由Ras/Raf/.mitogen-activated protein kinase MAPK路徑或經由 phosphatidylinosital 3-kinase(PI3K)/Akt訊息路徑。超過18種IGF受體(IGFR)與Ras/PI3K訊息路徑被發現係mir-302的標的基因。此現象亦顯示在哺乳卵細胞及胚胎幹細胞中有一嚴密的調控來阻止神經細胞分化。mir-302家族互補地與標的基因的轉錄分子之同源序列結合，進而經由核醣核酸干擾效應(RNA interference)抑制他們的蛋白轉譯。相似的mir-302家族抑制效應在許多不同細胞組織中被發現。據上述證據，mir-302家族很可能對於胚胎幹細胞的維持與自我複製扮演很重要的角色。藉由抑制細胞發育及分化的標的基因，mir-302家族可能可用來轉分化體細胞成胚胎幹細胞並維持該細胞的分化多能性與自我複製的胚胎幹細胞能力。

為了測試mir-302的胚胎幹細胞生成與維持功能，本發明使用一第二型轉錄系統之內含子之微核醣核酸表現系統(Pol-II-based intronic miRNA expression system)於不同人類體細胞中表現mir-302家族，供模擬原本內含子之微核醣核酸生成路徑(native intronic miRNA biogenesis pathway)，如圖1所示。內含子之微核醣核酸生成過程與細胞內第二型轉錄系統之先驅訊息轉錄因子及內含子剪接/切除之間的關係有關，通常發生於細胞核靠近基因體染色質附近的纖維(Linet al .(2004)Drug Design Reviews 1： 247-255；Ghoshet al .(2000)RNA6： 1325-1334)。在真核細胞中，具有蛋白轉譯能力的基因轉錄因子，如訊息核醣核酸係由第二型核醣核酸聚合酶(type-II RNA polymerases)所生成。通常基因轉錄過程生成先驅訊息核醣核酸(pre-mRNA)，其包含四個主要部分：五端非轉譯區域(5’-untranslated region(UTR))、含有蛋白轉譯密碼子之外顯子(protein-coding exon)、無蛋白轉譯能力之內含子(intron)及三端非轉譯區域(3’-UTR)。廣義來說，五端及三端非轉譯區域可視為特定內含子。內含子佔先驅訊息核醣核酸中無轉錄序列很大的一部分。每一內含子從30個鹼基到數千個鹼基都有，且必須在訊息核醣核酸成熟前切除。先驅訊息核醣核酸切除內含子的過程稱為核醣核酸剪接(RNA splicing)，通常經由細胞內剪接體(intracellular spliceosome)剪接。在核醣核酸剪接作用之後，些許由內含子衍生之核醣核酸片段被進一步處理而形成類微核醣核酸衍生分子(miRNA-like derivative molecules)，這些分子能有效地、個別地靜默抑制他們的標的基因。上述靜默抑制機制係經由類核醣核酸干擾機制(RNAi-like mechanism)，此時先驅訊息核醣核酸(pre-mRNA)之外顯子(exon)會接合再一起而形成成熟的訊息核醣核酸以供蛋白質生合成。

我們已經證實有效的微核醣核酸能由脊椎動物基因中的內含子生成，此生成機制與小干擾核醣核酸(siRNA)或基因間微核醣核酸(intergenic miRNA)生成機制不同(Linet al .(2003)Biochem Biophys Res Commun. 310： 754-760；Linet al .(2005)Gene 356： 32-38)。為了證實這個差異，圖2顯示了細胞內生合成過程與RNAi機制在小干擾核醣核酸(siRNA)、外顯子之微 核醣核酸(intergenic miRNA)與內含子之微核醣核酸(intronic miRNA)之間的比較。一般推測，siRNA係由兩條完整互補的核醣核酸所形成，其中這兩條核醣核酸係由同一DNA模板上相反位置之啟動子(promoter(P))所轉錄而成，在雜合(hybridized)之後被核醣核酸內切酶(RNaseIII endoribonucleases,Dicer(岱塞爾))切成約20到25鹼基對的雙股核醣核酸。不同於siRNA模式，intergenic miRNA(如lin-4及let-7)包含一長無編碼前驅核醣核酸轉錄分子(long non-coding precursor RNA transcript(pri-miRNA))，此分子係直接由第二型(Pol-II)或第三型(Pol-III)核醣核酸啟動子所轉錄而成，然而內含子之pri-miRNA只由第二型啟動子所轉錄而成，並將於核醣核酸剪接作用被剪接。在細胞核中，pri-miRNA進一步由多希亞(Drosha -like RNases)(用於形成intergenic miRNA)或剪接體及外體(exosomal component)(用於形成intronic miRNA)而形成類小夾彎折先驅物(hairpin-like stem-loop precursor)(又稱為內含子之微核醣核酸intronic miRNA)，之後再被運送至細胞質中以被miRNA相關之岱塞爾處理而為成熟微核醣核酸。接著，上述三種形式的核醣核酸最後被整合成核醣核酸誘導靜默複合體(RNA-induced silencing complex(RISC))，在此複合體中包含雙股的siRNA或單股的miRNA。岱塞爾與核醣核酸誘導靜默複合體用於生成siRNA與miRNA的路徑係不同的路徑(Tang,G.(2005)Trends Biochem Sci. 30： 106-114)。是故，miRNA的效 用，一般而言miRNA較siRNA為專一並較少不配對，這是因為miRNA只有單股有影響。換句話說，siRNA主要催化訊息核醣核酸的降解，而miRNA能誘發訊息核醣核酸的降解或抑制蛋白質生合成。因為內含子的miRNA路徑係被細胞內多重調控機制所控制，其中多重調控機制包含第二型轉錄機制、RNA splicing、外體解消(exosome digestion)及無義介導降解(nonsense-mediated decay(NMD)processing)，因此內含子微核醣核酸之基因靜默效應被認為係所有三種RNAi路徑中最有效、最專一、最安全的路徑(Linet al .(2008)Frontiers in Bioscience 13： 2216-2230)。

本發明揭露一種內含子用於基因調控的新功能及其相對應用方式。如圖3A與圖3B所示，基於內含子之核醣核酸剪接作用(intronic RNA splicing)與處理機制(processing mechanism)，本發明較佳實施例係一第二型基因重組轉錄表現系統，此系統包含至少一能經剪接的內含子，此內含子在本發明當中稱之為SpRNAi ，SpRNAi 具有抑制標的基因或抑制與SpRNAi 序列高度互補的基因的功能。SpRNAi 係與第二型轉錄系統所轉錄之先驅訊息核醣核酸(pre-mRNA)共同轉錄而形成，在核醣核酸剪接(RNA splicing)後SpRNAi 內含子即被釋放出來。從而，剪接後之SpRNAi 進一步被處理為成熟的基因靜默劑(例如小夾核醣核酸(small hairpin RNA(shRNA))及微核醣核酸(miRNA))，該些基因靜默劑能激發RNAi相關的基因靜默 效應。在內含子被剪接移除後，重組基因之外顯子轉錄分子經連接而形成一成熟的訊息核醣核酸分子，以供轉譯生合成一標誌蛋白(marker)或功能性蛋白。

如圖3A所示，SpRNAi 具體而言包含數個保存性高的核苷酸片段(consensus nucleotide elements)，其包含一五端剪接處(5'-splice site)、一分支點區(branch point motif,BrP)、一多嘧啶區(a poly-pyrimidine tract)以及一三端剪接處(3'-splice site)。此外，一類小夾核醣核酸(shRNA-like)之先驅微核醣核酸序列係插入SpRNAi 中，此先驅微核醣核酸序列插入並位於五端剪接處與分支點區之間。此部分的SpRNAi 內含子於核醣核酸剪接作用時(RNA splicing and processing)，能形成一套馬索(lariat)結構。此外，SpRNAi 之三端包含一多轉譯停止子區(multiple translational stop codon region(T codon))，以提升intronic RNA剪接作用(splicing)與無義介導降解過程的精確性。當此多轉譯停止子顯現於細胞質中之訊息核醣核酸，此多轉譯停止子能傳遞活化無義介導降解路徑之訊息，以供降解細胞中任何異常之核醣核酸結構。然而，插入SpRNAi 之具有高度二級結構的shRNA與先驅微核醣核酸(pre-miRNA)能個別地被保留至岱塞爾剪接而形成成熟之siRNA與miRNA。再加上，為了於細胞中表現，我們利用技術手段將SpRNAi 利用Drall 限制酶切位插入一紅色螢光蛋白(red fluorescent protein,RGFP )基因(來自Heteractis crispa 海葵的突變蛋白)，而形成一基因重組之含SpRNAi 的紅色螢光蛋白之SpRNAi-RGFP 基因，其中紅色螢光蛋白基因之第兩百零八個核苷酸位置被限制酶Drall 作用後會產生一AG-GN核苷酸之斷點，並於斷點兩端產生三個核苷酸突出之結構，SpRNAi 能藉由上述斷點所形成五端剪接處及三端剪接處嵌入。因為SpRNAi 之嵌入造成紅色螢光蛋白無法正常表現，不過等內含子剪接後，此紅色螢光蛋白就能恢復正常表現，因此我們可以利用紅色螢光蛋白在轉染細胞中的表現量來判定內含子之shRNA/miRNA所釋出的量。此時紅色螢光蛋白基因也能提供許多外顯子剪接促進子(exonic splicing enhancer,ESE)能提升核醣核酸的剪接作用(RNA splicing)之正確與效率。

如圖3B所示之另一實施例中，本發明提供一使用人造合成核醣核酸剪接與處理元件之遺傳工程方法產生一非天然基因，例如以人造之五端剪接處、分支點區、多嘧啶區以及三端剪接處而形成人造之SpRNAi (人造內含子)，此人造之SpRNAi 包含至少一嵌入之核醣核酸結構，此結構可係反意核醣核酸(antisense RNA)或shRNA或miRNA之結構。此外，可藉由去氧核醣核酸合成器(DNA synthesizer)以化學合成製造及連接這些元件。另一方面這些元件的連接方式亦可用限制酶來連接。此SpRNAi 內含子可直接轉染至細胞中或與整合細胞基因重組而被第二型轉錄聚合酶系統生合成基因轉錄分子(如pre-mRNA)。經過核醣核酸剪接(RNA splicing)與訊息核醣核酸 成熟作用後，SpRNAi 中所嵌入之微核醣核酸結構將經由細胞內剪接體及無義介導降解機制作用並釋出後，該些結構能經由高互補性而激化特定基因轉錄分子的靜默效應。此時，重組基因中的外顯子能連接以形成成熟之訊息核醣核酸，而表現出該基因之功能，例如報導基因轉譯或是以下幾種標誌蛋白：紅色螢光蛋白、綠色螢光蛋白(green fluorescent protein)、螢光素(luciferase)、乳糖基因調控組(lac-Z)以及它們之衍生物。報導/標誌蛋白之存在能有效定位shRNA/miRNA分子存在之位置，尤其在於辨認基因靜默/RNAi效果方面。

此外，藉由連接外顯子所形成之成熟訊息核醣核酸也可能有助於傳統基因治療去修補損害或遺失之基因，或提高特定基因表現。在其他方面，本發明提供一新穎化合物(SpRNAi )以誘發細胞經由intronic RNA splicing機制產生基因靜默分子，此靜默分子係經由反意基因介導(antisense-mediated)剔除或核醣核酸干擾效果(RNAi)來抑制特定基因功能。衍生自人造內含子SpRNAi 之基因靜默分子包含反意核醣核酸(antisense RNA)、核糖酵素(ribozyme)、短臨時核醣核酸(short temporary RNA,stRNA)、雙股核醣核酸、小干擾核醣核酸(small interfering RNA,siRNA)、微小無密碼子之核醣核酸(tiny non-coding RNA,tncRNA)、短小夾核醣核酸(short hairpin RNA,shRNA)、類小夾核醣核酸(hairpin-like RNA structure)、微核醣核酸(microRNA,miRNA)及與核醣核酸干擾(RNAi)有關之前/先驅 核醣核酸結構。使用這些內含子之核醣核酸(重組核苷酸)所衍生之基因靜默試劑有助於特定基因之靜默效應，這些特定基因自致病轉殖基因(pathogenic transgenes)、病毒基因(viral genes)、突變基因(mutant genes)、致癌基因(oncogenes)、與疾病相關小核醣核酸基因(disease-related small RNA genes)及任何具有或不具有蛋白轉譯相關之基因以及以上基因混合之基因選其一。

藉由經第二型轉錄聚合酶表現之含SpRNAi 的紅色螢光蛋白表現系統(SpRNAi-RGFP expression system)，我們已成功地於人類前列腺癌細胞(prostate cancer LNCaP)、人類子宮頸癌(human cervical cancer HeLa)以及大鼠神經幹細胞細胞(rat neuronal stem HCN-A94-2 cell)(Linet al .(2006a)Methods Mol Biol. 342： 295-312)產生具有基因靜默效果之成熟shRNA及miRNA。在斑馬魚(zebrafish)、雞以及小鼠(mouse)體內(Linet al .(2006b)Methods Mol Biol. 342： 321-334)亦有相同的效果。我們已於斑馬魚與許多不同人類細胞株中，針對綠色螢光蛋白與其他細胞基因轉錄分子的表現，測試過不同的先驅微核醣核酸結構，並得知較有效之基因靜默微核醣核酸係靠近介於五端剪接處與分支點區之間序列片段之五端。如圖3C所示，有一顯著之基因靜默效果發生於轉染針對綠色螢光蛋白之先驅微核醣核酸(anti-EGFP pre-miRNA)之組別(lane4 miR組)，然而於其他實驗組與對照組或控制組並無此效果被偵測到；這些實驗組 與對照組依序(由左到右)：1、控制組；2、針對愛滋病病毒蛋白(HIV-p24 )之先驅微核醣核酸的對照組；3、針對反意綠色螢光蛋白且無小夾結構(antisenseEGFP insert without the hairpin loop structure)之anti組；以及5、反轉先驅微核醣核酸序列之miR*組，該反轉先驅微核醣核酸序列之miR*組係完全互補於抗綠色螢光蛋白之先驅微核醣核酸(anti-EGFP pre-miRNA,miR*)。關於其他非標的基因，例如紅色螢光蛋白以及肌動蛋白(β -actin)並無靜默現象發生，表示SpRNAi 之微核醣核酸介導之核醣核酸干擾具有高度專一性。為了證實核醣核酸剪接RNA splicing於內含子之核醣核酸干擾(intronic RNAi)的效果，我們已測試三種不同的SpRNAi-RGFP 表現系統，如圖3D顯示(由左到右)：1.無內含子之紅色螢光蛋白載體組(SpRNAi-RGFP 表現系統無任何先驅微核醣核酸)；2.具有內含子之抗綠色螢光蛋白先驅微核醣核酸(intronic anti-EGFP pre-miRNA)之紅色螢光蛋白載體組(SpRNAi-RGFP expression system expressingRGFP with an intronic anti-EGFP pre-miRNA insert)；3.具有內含子之抗綠色螢光蛋白先驅微核醣核酸(五端剪接處缺陷)之紅色螢光蛋白載體組。由北方墨點法(Northern bolting)分析資料顯示，成熟之微核醣核酸(也就是內含子之微核醣核酸)只有在具有內含子之抗綠色螢光蛋白先驅微核醣核酸之紅色螢光蛋白載體組形成出來(lane2)，此SpRNAi-RGFP 表現系統與圖3C之lane4的SpRNAi-RGFP 表現系統相同，因 此證實需要靠細胞內剪接機制(cellular RNA splicing)來形成intronic miRNA。

基於上述觀察結果，我們進一步決定較佳之先驅微核醣核酸(pre-miRNA)結構以供藉由核醣核酸誘導靜默複合體(RNA-induced silencing complex(RISC))誘發最顯著之基因靜默效應(Linet.al .(2005)Gene 356： 32-38)。RISC複合體係一蛋白核醣核酸複合體(protein-RNA complex)，能導致特定基因轉錄分子降解或經由核醣核酸干擾機制抑制轉譯。對於RISC複合體之形成，雙股siRNA扮演重要之角色，此雙股siRNA在功能上是相異的，而且RISC複合體只傾向對其中一股進行反應。這種傾向係由每一股五端鹼基對之熱動力穩定所決定。基於siRNA之模式，推測miRNA及與其互補之miRNA*所形成之雙股核醣核酸對於RISC複合體之形成也很重要，假如此觀點為真，應無任何功能傾向性在pre-miRNA的彎折(stem-loop)結構中顯示。然而我們發現，在斑馬魚中，intronic pre-miRNA的stem-loop結構方向對於RISC複合體選股並形成miRNA有影響。

如圖4A所示，兩個具有不同內含子之微核醣核酸(intronic miRNA)之SpRNAi-RGFP 表現載體分別命名為miRNA*-stemloop-miRNA[1]及miRNA-stemloop-miRNA*[2](miRNA*係代表能與成熟miRNA序列互補之miRNA)。這兩組之先驅微核醣核酸具有相同的雙股彎折結構(stem-arm structure)，該彎折結構能對EGFP 基因第280到第302之核苷酸序列進行靜默效應。具體而言，miRNA與全長完整的成熟微核醣核酸序列相同，而miRNA*則與成熟微核醣核酸的序列互補。經微脂體(liposome)轉染這些SpRNAi-RGFP 載體(60ug each)進入兩周大的斑馬魚幼胚24小時後(Linet al .(2005)Gene 356： 32-38)，經由mirVana微核醣核酸分離管柱中之latex beads將具有靜默效應潛力之微核醣核酸(miRNA)沉澱下來。經序列比對之後，較有靜默效應之微核醣核酸(miR-EGFP(280-302))被揀選並辨識為miRNA-stemloop-miRNA*[2]，如圖4B所示的灰色陰影處。因為成熟的微核醣核酸(miRNA)只有於轉染miRNA-stemloop-miRNA*[2]之斑馬魚中被發現，因此推論RISC複合體傾向是與miRNA-stemloop-miRNA*[2]作用而非miRNA*-stemloop-miRNA[1]之先驅微核醣核酸。在此實驗，利用經由肌動蛋白啟動子表達之斑馬魚(Tg(actin-GAL4：UAS-gfp))來進行實驗，此斑馬魚會一直於各類細胞中表達綠色螢光蛋白。如圖4C所示，於此斑馬魚轉染SpRNAi-RGFP 載體後，將使綠色螢光蛋白基因靜默並表達可為指標蛋白之紅色螢光蛋白。觀察結果發現：胃腸部份的基因靜默效應較弱於其他組織，推測可能是此部位之核醣核酸酶(RNase)活性較強之故。圖4D中，西方墨點法(Western blotting)可偵測到miRNA*-stemloop-miRNA[1](1組)以及miRNA-stemloop-miRNA*[2](2組)之紅色螢光蛋白表現，然 而綠色螢光蛋白之基因靜默只有於轉染miRNA-stemloop-miRNA*[2](2組)之斑馬魚被發現，也應此呼應圖4C。因miRNA*-stemloop-miRNA[1]及miRNA-stemloop-miRNA*[2]之五端stem-arm結構的熱動力穩定力一致，因此我們推論內含子之先驅微核醣核酸(intronic pre-miRNA)之彎折結構(stem-loop)可能與RISC複合體形成成熟微核醣核酸(mature miRNA)的選股有關。岱塞爾於stem-arm的切位決定了成熟微核醣核酸的選股(Leeet al .(2003)Nature 425： 415-419)，是故內含子之先驅微核醣核酸的stem-loop可能決定了特殊切位的辨認。

因為上述先驅微核醣核酸之彎折(stem-loop)結構太大，對於SpRNAi-RGFP 載體之表現可能不佳，因此採用轉介核醣核酸(tRNA)之彎折(loop)(5’-(A/U)UCCAAGGGGG-3’)(SEQ.ID.NO.29)來取代原本較大的彎折結構，此較小的彎折(tRNA^met loop)被證明能加速微核醣核酸(miRNA)從核內運輸至核外，運輸途徑可經由Ran-GTP及Exportin-5等細胞核內外運輸機制(Linet al .(2005)Gene 356： 32-38)。最近，本發明使用一對改良之pre-mir-302彎折loop結構(如5’-GCTAAGCCAGGC-3’(SEQ.ID.NO.1)及5’-GCCTGGCTTAGC-3’(SEQ.ID.NO.2)，它們能提供同樣快速之先驅微核醣核酸運輸並且不干擾轉介核醣核酸之運輸。此改良之先驅微核醣核酸loop係藉由模仿mir-302s之彎折(short stem-loop)結構而設計，其能於胚胎幹細胞中高度表 達，但於分化細胞中表達程度較低。因此，用此改良之先驅微核醣核酸loop並不會干擾本身之微核醣核酸的運輸路徑。

關於先驅微核醣核酸之插入處，因為SpRNAi-RGFP 重組基因之內含子插入處的限制酶切位於五端及三端分別是PvuI 及MluI ，此前驅內含子之插入處(intronic insert)能被許多其他專一性基因之先驅微核醣核酸(pre-miRNA)切除而取代(例如，抗綠色螢光蛋白及mir-302之先驅微核醣核酸)。藉由改變先驅微核醣核酸插入處(pre-miRNA insert)而用於對抗或靜默不同基因轉錄分子，因此，此內含子之微核醣核酸產生系統能被應用於誘發標的基因in vitro 及in vivo 靜默效應的一種強大工具。為了確認係正確的插入處(insert)尺寸，具有pre-miRNA的SpRNAi-RGFP 表現載體(10ng)可藉由PCR技術並用引子(primer)(例如，5’-CTCGAGCATG GTGAGCGGCC TGCTGAA-3’(SEQ.ID.NO.23)及5’-TCTAGAAGTT GGCCTT-CTCG GGCAGGT-3’(SEQ.ID.NO.24))於94℃(1min.)、52℃(1min.)、及70℃(1min.)複製25個循環週期(cycles)後而大量複製(插入處)。最後PCR之終產物再經由2%洋菜膠(agarose gel)層析並利用gel extraction kit(Qiagen,CA)純化並序列確認。

本發明採用一經實驗論證設計的第二型聚合酶(Pol-II)之SpRNAi-RGFP 表現系統並利用此系統而發展出用於人類或小鼠細胞中表達mir-302基因家族。於較佳實施例中，本發明提供一使用非自然發生之內含子之方法及其化合物，此化合物能 被人類或小鼠細胞處理成類mir-302的核醣核酸分子，以供誘發細胞發育或分化相關基因的基因靜默效應。上述方法包含下列步驟：a)提供1)一種細胞，此細胞表現眾多，mir-302s所針對，發育或分化相關的基因；並提供2)一能表現的化合物(expression-competent composition)，此化合物包含一重組基因，該基因能於上述細胞中產生具有基因靜默效應之內含子之前驅核醣核酸轉錄分子(primary RNA transcript)，此分子能從內含子中生成類mir-302的核醣核酸分子(mir-302-like RNA molecule)，以供於細胞中經由RNA splicing與相關機制剔除(knock down)或抑制標的基因；b)步驟以上述化合物處理上述細胞，處理過程係在一定條件下，在此條件的細胞中標的基因的功能係被抑制。從而細胞被轉型為類胚胎幹細胞，此類細胞表現胚胎幹細胞標誌(如Oct3/4,SSEA3 及SSEA4 )。該細胞能於生物體外(in vitro )、體內(in vivo )、來自體內的體外試驗或間接體內(ex vivo )等情況下表現標的基因。廣義而言，內含子為基因中不具密碼子的序列(non-coding sequence)，其包含全長的內含子與五端非轉譯區域及三端非轉譯區域。在某些層面，本發明所設計的類mir-302核醣核酸分子包含mir-302a、mir-302b、mir-302c或mir-302d的第一段17個核苷酸(如5’-UAAGUGCUUC CAUGUUU-3’(SEQ.ID.NO.3))。所有mir-302家族的微核醣核酸皆擁有從五端數來相同的17個核苷酸。在其它實施例中，類mir-302的核醣核酸分子也能設計 在細胞基因中的內含子的區域內，而與之共同表現。一般而言，內含子插入處的技術包含類質體之轉殖基因轉染(plasmid-like transgene transfection)、同源基因合併交換(homologuous recombination)、轉位子傳遞(transposon delivery)、去氧核醣核酸接合(DNA ligation)、插入轉殖基因(transgene insertion)、跳躍基因嵌合(jumping gene integration)及反轉錄病毒感染(retroviral infection)或上述方法的混合方法。

在另一實施例中，本發明之重組基因表現一先驅訊息核醣核酸(pre-mRNA)。該重組基因係由外顯子(exon)與內含子(intron)所組成。外顯子於核醣核酸剪接後能被連接而形成一功能性訊息核醣核酸(mRNA)進而轉譯成蛋白，以供辨認內含子之核醣核酸的釋出，此時內含子被釋出細胞核進而被處理成具有一具有特定基因靜默功能之基因靜默效應物(gene silencing effector)，該基因靜默效應物可為反意核醣核酸(antisense RNA)、微核醣核酸(miRNA)、短小夾核醣核酸/小夾核醣核酸(shRNA)、siRNA、雙股核醣核酸以及以上核醣核酸之先驅物(例如，pre-miRNA與Piwi相關核醣核酸(Piwi-interacting RNA(piRNA)))。這些內含子之核醣核酸分子可包含一類髮夾之彎折結構(hairpin-like stem-loop structure)(約等同於類小夾核醣核酸)，此結構包含一序列，此序列係同源於5’-GCTAAG-CCAGGC-3’(SEQ.ID.NO.1)或是5’-GCCTGGCTTAGC-3’ (SEQ.ID.NO.2)，該序列能促進核醣核酸分子正確地從內含子被剪接也能促進該分子由細胞核運輸至細胞質中。而且這些內含子之核醣核酸分子的彎折結構(stem-arms)包含互補或同源於特定標的基因之序列。該內含子之核醣核酸分子同源或互補的序列大小約從15個鹼基對到1500鹼基對之間，較佳係18個到27個鹼基對左右。這些內含子之核醣核酸分子對於標的基因序列之互補或同源率約30%到100%之間，較佳為35%到49%之間。對於類小夾的內含子之核醣核酸(hairpin-like intronic RNA)，其互補或同源率約30%到100%之間；而對於線形內含子之核醣核酸(linear intronic RNA)則係90%到100%。

此外，非自然產生(人造的)內含子之五端包含一五端剪接處(5’-splice site or 5’clip)，其中該五端剪接處係一核苷酸序列並同源於5’-GTAAGAGK-3’(SEQ.ID.NO.4)或是GU(A/G)AGU序列(例如，5’-GTAAGAGGAT-3’(SEQ.ID.NO.30)、5’-GTAAGAGT-3’、5’-GTAGAGT-3’及5’-GTAAGT-3’)。此時，三端剪接處(3’-splice site or 3’clip)序列係同源於GWKSCYRCAG(SEQ.ID.NO.5)或CT(A/G)A(C/T)NG序列(例如，5’-GATATCCTGCAG-3’(SEQ.ID.NO.31)、5’-GGCTGCAG-3’、5’-CCACAG-3’)。此外，分支點區序列係位於五端與三端剪接處之間，該分支點區位於一核苷酸序列同源於5’-TACTWAY-3’(SEQ.ID.NO.6)(如，5’-TACTAAC-3’及5’-TACTTAT-3’)，該分支點區包 含一分支點，而該分支點係一腺核苷(adenosine,A)能形成一套馬索(lariat)結構之內含子核醣核酸，此套馬索(lariat)結構係由寡腺核苷合成酶(2’-5’-oligoadenylate synthetases)及剪接體協同作用產生。此外，多嘧啶區係位於分支點區與三端剪接處之間，其中多嘧啶區是一具有高密度的胸腺嘧啶(Thymine)與胞嘧啶(Cytosine)之核苷酸序列，多嘧啶區之核苷酸序列同源於5’-(TY)m(C/-)(T)nS(C/-)-3’(SEQ.ID.NO.7)與5’-(TC)nNCTAG(G/-)-3’(SEQ.ID.NO.8)。其中，”m”與”n”係指大於等於一的多重複序列，較佳m之序列數是一到三之間，而n之序列數是七到十二之間。”-“係指無任何核苷酸。一些連接核苷酸能用來連接上述內含子片段。基於37CFR1.822規定(台灣”核苷酸及胺基酸序列表記載格式”亦同)，W係指腺嘌呤(adenine(A))或胸腺嘧啶(thymine(T))/尿嘧啶(uracil(U))，K係指鳥嘌呤(guanine(G))或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)，S係指胞嘧啶(C)或鳥嘌呤(G)，Y係指胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)，R係指腺嘌呤(A)或鳥嘌呤(G)以及N係指腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)或其他。

在本發明之另一實施例中，基因重組核苷酸可被重組併入表現載體以供基因轉染。表現載體選自DNA轉殖基因(DNA transgene)、質體(plasmids)、跳躍基因(jumping genes)、轉位子(transposons)、反轉位子(retrotransposons)、反轉錄病毒載體(retroviral vectors)、慢病毒載體(lentiviral vectors)、腺病毒載體 (adenoviral(AMV)vectors)、腺相關病毒載體(adeno-associated viral(AAV)vectors)、改性的病毒性肝炎(modified hepatitis-viral(HBV)vectors)、巨細胞病毒相關的病毒載體(cytomegalovirus(CMV)-associated viral vectors)。於轉染SpRNAi-RGFP 表現系統過程中，表現不同內含子之基因靜默效應物的該等載體能用於達到單一或複數個標的基因之靜默效應。在其他實施例中，複數個不同基因靜默效應物能自SpRNAi-RGFP 表現系統之內含子之小夾核醣核酸介子(intronic hairpin RNA insert)衍生，而使眾多基因靜默。此方法之優勢係藉由使用轉殖基因轉染或病毒感染而提供一穩定及相對長期之特定基因靜默效應。其中，本發明經由細胞內核醣核酸剪接及處理機制能產生核醣核酸干擾相關之基因靜默效應物(RNAi-related gene silencing effector)，該基因靜默效應物包含小干擾核醣核酸(small interfering RNA,siRNA)、微核醣核酸(microRNA(miRNA))及小夾核醣核酸(small hairpin RNA(shRNA))。並由細胞內特定基因核醣核酸啟動子(promoter)所控制，該些啟動子選自第二型核醣核酸聚合酶啟動子(Pol-II promoter)、第三型核醣核酸聚合酶啟動子(Pol-III promoter)及病毒啟動子。該病毒啟動子可為類第二型核醣核酸聚合酶啟動子(Pol-II-like RNA promoter)，其選自細胞巨大病毒(cytomegalovirus(CMV))、逆轉錄病毒長末端區域(retrovirus long-terminal region(LTR))、B型肝炎病毒(hepatitis B virus(HBV))、腺病毒(adenovirus (AMV))及腺相關病毒(adeno-associated virus(AAV))。例如，慢病毒(lentiviral LTR)啟動子能於每個細胞內提供超過5x10⁵ 單位的先驅訊息核醣核酸。此外，插入一對藥物敏感之抑制子(a drug-sensitive repressor)於這慢病毒啟動子之前端而供控制其基因靜默效應物的表現速率(expression rate)的方式係可行的方式之一。此抑制子能被化學藥物或抗生素抑制，這些化學藥物或抗生素選自G418、四環素(tetracycline)、新黴素(neomycin)、安比西林(ampicillin)、康黴素(kanamycin)及上述抗生素之衍生物。

本發明提供一於細胞內產生內含子之核醣核酸(intronic RNA)的新穎方法，以供產生成熟siRNA、miRNA及shRNA，這些RNA可誘發核醣核酸干擾基因靜默效應(RNAi-associated gene silencing effects)。其中，siRNA、miRNA及shRNA在細胞中，能藉由細胞機制的表現與處理本發明先驅miRNA/shRNA之內含子之介子，而產生單一或多重基因靜默效應物。例如，如之前所述，抗綠色螢光蛋白之先驅微核醣核酸(pre-miRNA)被異體表現於斑馬魚上，如同圖3A所示，而產生兩組不同長度的成熟微核醣核酸，如(mir-EGFP 282/300與mir-EGFP280-302)。這暗示著，單一SpRNAi 之介子(insert)能產生超過一種的基因靜默效應物(gene-silencing effectors)。正股(sense)或反意(antisense)的DNA構型能產生相同或相異的基因靜默效應物，以供與標的基因分子互補。在某些例子中， 內含子之基因靜默效應物能與一些標的基因轉錄分子(如mRNA)雜合，而形成雙股核醣核酸進而驅動核醣核酸干擾(RNAi)效應。因為內含子之基因靜默效應物係由表現載體持續產生，因此本發明能減輕小型核醣核酸被快速降解所造成之疑慮。

此外，本發明可供產生幹細胞。本發明潛在應用包含無哺乳細胞之人類胚胎幹細胞株之維持並避免上述細胞株進行細胞分化、於體外複製並培養分化之幹細胞株、純化同質性幹細胞群及利用上述幹細胞進行移植。本發明亦可為用來研究幹細胞功能及機制的用具或可供改變幹細胞性質以致於用於特定用途。於不同實施例中，本發明之類胚胎幹細胞可選自正常體細胞、癌化體細胞、哺乳類(如人類、猴子、大鼠及小鼠)之成熟幹細胞衍生而得。

為了清楚地描述本發明，文中採用以下特定用語。然而，本發明並非僅限於這些特定用語。其應理解為每個特定元素均包含所有技術上的均等物，其可由相似的手段達成相近的目的。

「核苷酸(Nucleotide)」一詞在此意指一單分子之去氧核醣核酸(deoxyribonucleotide)(DNA)或核醣核酸(ribonucleotide)(RNA)分子，這些分子包含五碳醣(pentose)、磷酸根(phosphate) 及鹼基(nitrogenous heterocyclic base)。此鹼基是經由醣苷鍵(glycosidic bond)與五碳醣聯接成一核苷(nucleoside)，此核苷以五碳醣三端與五端之位置與磷酸根連接而成微核苷酸。

「寡核苷酸(Oligonucleotide)」一詞在此意指一分子包含兩個以上的DNA或RNA，較佳係超過三個，而通常超過十個。而其精確的尺寸係取決於其最佳功能狀態。寡核苷酸係能以化學合成、DNA複製、反轉錄及以上方式混合之方式形成。

「核酸(Nucleic Acid)」一詞在此意指核苷酸(Nucleotide)之聚合體，可為單股或雙股。

「核苷酸相似物(Nucleotide Analog)」一詞在此意指一嘌呤(purine)或嘧啶(pyrimidine)核苷酸之結構與A、T、C、G或U不同但相似，而能在核苷酸中取代正常核苷酸。

「核酸化合物(Nucleic Acid Composition)」一詞在此意指一核酸化合物係關於一種多核苷酸(polynucleotide)如DNA或RNA，其以單股或雙股的形式存在。

「基因(Gene)」一詞在此意指一核酸之序列具有RNA或一多胜肽(蛋白質)之密碼子，此基因可為RNA或DNA。

「鹼基對(Base Pair(bp))」一詞在此意指於雙股DNA分子中A與T或C與G之配對。在RNA中，U取代T與A配對。一般來說鹼基對係以氫鍵(hydrogen bonding)所連接。

「先驅訊息核醣核酸(Precursor messenger RNA(pre-mRNA))」一詞在此意指在真核細胞中藉由第二型RNA聚合 酶(Pol-II)所產生之一基因之前驅RNA轉錄分子(primary ribo-nucleotide transcripts)，此過程為轉錄(transcription)，一先驅訊息核醣核酸序列包含五端非轉譯區域(5’-end untranslated region)、三端非轉譯區域(3’-end untranslated region)、外顯子(exon)及內含子(intron)。

「內含子(intron)」一詞在此意指一部分之基因轉錄分子所具有的非轉譯區域之片段如in-frame內含子、五端非轉譯區域及三端非轉譯區域。

「外顯子(exon)」一詞在此意指一部分之基因轉錄分子所具有蛋白轉譯區域之片段。

「訊息核醣核酸(mRNA)」一詞在此意指經由核內剪接機制除去內含子後所組成之先驅訊息核醣核酸之外顯子，而其具有蛋白轉譯密碼之mRNA。

「互補去氧核醣核酸(cDNA)」一詞在此意指一與mRNA序列互補之單股DNA，此cDNA無任何內含子序列。

「正股核酸(sense)」一詞在此意指一核酸分子之序列順序與同源的mRNA相同。此正股核酸構型係被標示為”+”、”s”或”sense”。

「反意核酸(antisense)」一詞在此意指一核酸分子之序列順序與mRNA互補。此反意核酸構型係被標示為”-”、”a”或”antisense”，例如”aDNA"或”aRNA”。

「五端(5’-end)」一詞在此意指一連續核苷酸於五碳醣之五 號碳之位置沒有以磷酸二酯鍵(phosphodiester bond)與下一個核苷酸之三號碳位置連接之端點謂之五端。有至少一個磷酸根顯示於端點。

「三端(3’-end)」一詞在此意指一連續核苷酸於五碳醣之三號碳之位置沒有以磷酸二酯鍵(phosphodiester bond)與下一個核苷酸之五號碳位置連接之端點謂之三端。端點通常為羥基。

「模板(Template)」一詞在此意指一能經核醣核酸聚合酶複製之核酸分子，根據不同的核醣核酸聚合酶，模板係可為單股、雙股、部分雙股。合成之複製核酸互補於模版，其中至少雙股中之一股互補或部分互補。RNA與DNA皆由五端到三端的方向合成。核酸的兩股通常結合(align)在一起以形成雙股。

「核酸模板(Nucleic Acid Template)」一詞在此意指一雙股DNA、雙股RNA、DNA-RNA雜合雙股或單股DNA或單股RNA。

「一致(Conserved)」一詞在此意指一核苷酸序列是與前驅序列一致。

「互補(Complemetary or complementarity or complementation)」一詞在此意指多核苷酸之間鹼基配對的方式，例如序列”AGT”係互補於序列”TCA”或”TCU”。互補可以係兩股DNA之間、DNA與RNA之間、兩股RNA之間。互補能是部分或完全。部分互補係只有某些核苷酸鹼基配對；然而完全互補則是全部核苷酸鹼基皆配對。而互補之程度對於兩 股雜合之效率重要影響。互補對於複製(amplification)反應很重要，在偵測核酸的接合(binding)也重要。互補率係關於一條單股核酸中非配對(mismatch)的鹼基與全部鹼基數量的比率，因此50%的互補率就是一半的鹼基非配對，一半的鹼基配對。即使是鹼基數量不同的雙股也能配對。在此情況下，互補發生於較長的一股的部分鹼基配對於較短的一股。

「同源(homologous or homology)」一詞在此意指一多核苷酸序列與一基因或mRNA之序列相似。如，一核酸序列可能部分或完全與一特定基因或mRNA之序列同源。同源可能也表示相似核苷酸數量與全部核苷酸數量的比率。

「互補鹼基(Complemetary base)」一詞在此意指當DNA或RNA形成雙股構型時，配對之核苷酸。

「互補核苷酸序列(Complemetary Nucleotide Sequence)」一詞在此意指一單股RNA或DNA之核苷酸序列足夠專一互補於另一股，其中係以氫鍵力量來形成互補。

「雜合(Hybirdize and Hybridization)」一詞在此意指核苷酸序列經由鹼基互補所形成雙股的情況。而雜合有時在引子(primer)對特定核酸序列(如模板)進行互補後可提供DNA聚合酶進行DNA複製初始步驟。有一非隨機且專一的交互作用在兩條互補多核苷酸之間。

「核醣核酸干擾(RNA interference(RNAi))」一詞在此意指在真核細胞中一經由RNA小片段(例如，微核醣核酸(miRNA) 及小干擾核醣核酸(siRNA))驅動之「後轉錄基因靜默機制」。這些RNA小片段可當成基因靜默效應物進而干擾與其互補之細胞內特定基因的表現(轉錄或轉譯)。

「微核醣核酸(MicroRNA(miRNA))」一詞在此意指一能與特定基因轉錄分子互補之單股核醣核酸(RNA)。miRNA通常係長約17到27個核苷酸之間，並能經由miRNA與mRNA之間的互補直接降解細胞中之訊息核醣核酸或抑制特定基因之蛋白轉譯。細胞本身miRNA能在所有真核細胞中發現，當成一防衛病毒感染之重要機制，並調控動植物生長發育基因的表現。

「先驅微核醣核酸(Pre-miRNA)」一詞在此意指一具有小夾結構之單股核醣核酸，此Pre-miRNA包含彎折結構區域(stem-arm and stem-loop region)用來與RNaseIII內切酶交互作用而產生一基因靜默效應物(gene silencing effector)(如miRNA)。此miRNAs能抑制與miRNA互補標的基因。Pre-miRNA的彎折結構區域能與雙股的特定基因轉錄分子形成完全或部分雜合，此時彎折結構區域與雙股的一端形成一圓形或一髮夾似的彎折結構。

「小干擾核醣核酸(small interfering RNA(siRNA))」一詞在此意指一短雙股核醣核酸，其長約18到25個鹼基配對之核苷酸，其能將與其完整互補的基因轉錄分子降解。

「小夾核醣核酸(small or short hairpin RNA(shRNA))」一詞 在此意指一具有一部分或完全互補之彎折結構序列之一單股核醣核酸，彎折結構序列經非配對核苷酸形成類髮夾結構。許多微核醣核酸(miRNA)係自shRNA先驅物所衍生，此shRNA先驅物又稱為先驅微核醣核酸(pre-miRNA)。

「載體(Vector)」一詞在此意指一具有能移動並於不同遺傳環境中表現的之重組核酸分子(如rDNA)。一般來說，此重組核酸分子係連接成一環型。此載體係能於細胞中自動複製，因此於其中的片段也會複製。一種較佳形式之載體為離合染色小體(episome)能於染色體外自我複製。較佳的載體能自動複製並表現所攜帶的遺傳物質。其中具有表現特定多胜肽之基因之載體為表現載體(expression vector)，具體來說，載體亦可經由反轉錄酶形成mRNA來重組cDNA。

「作用子(Cistron)」一詞在此意指一核苷酸序列具有胺基酸轉譯的密碼子，且其序列上及下端各有DNA表現控制區。

「啟動子(Promoter)」一詞在此意指一能經聚合酶辨認之核酸而能啟動轉錄反應。本發明中啟動子亦可為聚合酶接合處、促進子(Enhancer)與其它能啟動聚合酶反應的序列。

「抗體(Antibody)」一詞在此意指一具有與受體接合之一致性胺基酸序列之多胜肽或蛋白分子。

雖然本發明之實施例係由圖式所描述，必需指出的是，已揭露之實施例並未限制本發明之範圍。相反地，包含於申請專利範圍之精神及範圍之修改及均等設置均包含於本發明之範 圍內。本發明係關於一種新化合物及方法，該方法藉由內含子衍生之核醣核酸使真核細胞遺傳特性改變。這種遺傳特性改變是藉由一內含子之基因靜默機制而產生，重點在於此機制係藉由轉染一包含至少一能RNA splicing剪接之內含子(命名為SpRNAi )之重組基因進入目標細胞或有機組織中。SpRNAi 能攜帶內含子之核醣核酸之介子(intronic RNA insert)，經由細胞內核醣核酸之剪接與處理之機制而釋出該內含子之核醣核酸之介子，並經由RNAi/後轉錄基因靜默(post-transcriptional gene silencing(PTGS))靜默效應以互補方式抑制與內含子之核醣核酸之介子互補率高的基因轉錄分子。一般來說，如圖4及圖5所示，當重組基因利用化學方式或脂質體(liposome)轉染或病毒感染進入真核細胞後，該內含子之核醣核酸之介子(intronic RNA insert)經由第二型核醣核酸聚合酶系統轉錄，並由核醣核酸之剪接與處理之機制如剪接體(spliceosome)、外體(exosomes)與無義介導降解系統等作用後而釋出。在核醣核酸之剪接期間，內含子之核醣核酸(intronic RNA)形成一套馬索核醣核酸(lariat RNA)並進一步處理成基因靜默效應物(gene silencing effectors)，如短暫時核醣核酸(short-temporary RNA(stRNA))、反意核醣核酸(antisense RNA)、小干擾核醣核酸(siRNA)、小夾核醣核酸(shRNA)、微核醣核酸(miRNA)、Piwi交互作用核醣核酸(piRNA)及這些核醣核酸之先驅物與衍生物以及上述核醣核酸混合之核醣核酸選其一。之後，這些基因靜默效應物將 經由RISC複合體及核醣核酸基因靜默效應(RNAi-induced initiator of transcriptional silencing(RITS))而進行降解它們之標的基因轉錄分子或抑制標的基因之蛋白轉譯。

為了模擬細胞內先驅訊息核醣核酸(pre-mRNA)剪接及處理機制，我們使用細胞內剪接體、外體與NMD系統來催化內含子移除並處理SpRNAi-RGFP 表現系統。經由一連串細胞內剪接體組成物於SpRNAi 的snRNP辨識區域(如snRNPs U1,U2及U4/U6U5 tri-snRNP)組合後，SpRNAi 被釋出以進一步形成基因靜默效應物。將人造snRNP辨識區域併入SpRNAi 並將該SpRNAi 併入重組RGFP 表現系統之方法將分別於實施例一及二揭露。

設計、建構及評估能誘發內含子核醣核酸基因靜默效應之第二型轉錄聚合酶之紅色螢光蛋白(SpRNAi-RGFP )之表現系統

用於驅使細胞內核醣核酸剪接與作用導致基因靜默效應機制於體內(in vivo)已經被證實，本發明藉使用第二型轉錄聚合酶(Pol-II)之重組基因載體系統(稱為SpRNAi-RGFP )供表現內含子之基因靜默效應物(intronic gene silencing effectors)如圖3A與3B所示，此SpRNAi-RGFP 表現系統具有一人造的能剪接之內含子(SpRNAi )，這些基因靜默效應物如miRNA與類夾shRNA(hairpin-like shRNA)。將SpRNAi 利用基因工程方法及數條合成DNA連接(ligation)方式併入紅色螢光蛋白基因 (RGFP )，如實施例一及實施例二所揭露。SpRNAi 包含先驅miRNA或shRNA介子，這些介子經由核醣核酸之剪接與處理之機制而產生成熟的miRNA或shRNA基因靜默效應物。然而在其他實施例中，經由同樣之精神與原理，由第一型核醣核酸聚合酶系統(用於先驅核醣體核醣核酸ribosomal precursor RNA)也可以產生功能相同之基因靜默效應物(gene silencing effector)。此外能用來產生SpRNAi 之核醣核酸轉錄分子包含訊息核醣核酸(mRNA)、異質核核醣核酸(hnRNA)、核醣體核醣核酸(rRNA)、轉介核醣核酸tRNA、snoRNA、小胞核核醣核酸snRNA、先驅微核醣核酸(pre-miRNA)、病毒核醣核酸(viral RNA)以及上述核醣核酸之衍生物及先驅物。

如實施例1與2及圖3A所揭露，SpRNAi 被併入紅色螢光蛋白(red fluorescent protein,RGFP )基因(來自Heteractis crispa 的HcRed1突變的色彩蛋白)而形成一基因重組之含紅色螢光蛋白之SpRNAi (SpRNAi-RGFP )基因結構。因為SpRNAi 之嵌入造成紅色螢光蛋白無法正常表現，不過等內含子被剪接後，此紅色螢光蛋白就能恢復正常表現，我們可以利用紅色螢光波長570nm所偵測到之紅色螢光蛋白表現量來判定內含子之訊息核醣核酸(mRNA)的成熟。SpRNAi-RGFP 構建是基於先驅訊息核醣核酸之結構特性。SpRNAi (人造內含子)的主要單元包含數個snRNP辨識區域及連接件(linker)如五端剪接處、三端剪接處、分支點區(branch point motif(BrP))(用於辨識剪接體)、多 嘧啶區((PPT)用來與剪接體交互作用)以及連接件(linker)，以供連接每一單元及限制酶切位。如圖3B所示，本發明之具有靜默效應物之SpRNAi (人造內含子)從五端到三端包含五端剪接處、反意內含子之介子(anti intronic insert)(可經剪接或處理後而形成基因靜默效應物如類mir-302基因靜默效應物(mir-302-like gene silencing effector))、分支點區(BrP)、多嘧啶區(PPT)及三端剪接處(其可供剪接體組合)。此外，一些轉譯終止子(translational termination codons(T codon))係位於靠近SpRNAi 之三端剪接處之連接件序列。

一般來說，五端剪接處可微核苷酸序列，該序列包含或同源於5’-GTAAGAGK-3’(SEQ.ID.NO.4)或是GU(A/G)AGU序列(例如，5’-GTAAGAGGAT-3’(SEQ.ID.NO.30)、5’-GTAAGAGT-3’、5’-GTAGAGT-3’及5’-GTAAGT-3’)。三端剪接處序列可包含或同源於GWKSCYRCAG(SEQ.ID.NO.5)或CT(A/G)A(C/T)NG序列(例如，5’-GATATCCTGCAG-3’(SEQ.ID.NO.31)、5’-GGCTGCAG-3’及5’-CCACAG-3’)。此外，分支點序列係位於五端與三端剪接處之間，該分支點區序列包含或同源於5’-TACTWAY-3’(SEQ.ID.NO.6)(例如，5’-TACTAAC-3’及5’-TACTTAT-3’)。該分支點區序列之分支點核苷酸係一腺核苷(adenosine,A)，其能形成一套馬索(lariat)內含子核醣核酸結構(2’-5’方式連接)，其藉由2’-5’寡腺核酸合成酶(2’-5’-oligoadenylate synthetases)及剪接體在大部分的剪接內 含子中形成。此外，多嘧啶區位於分支點區與三端剪接處之間，其中多嘧啶區具有許多胸腺嘧啶(Thymine)與胞嘧啶(Cytosine)之核苷酸序列，多嘧啶區之核苷酸序列同源於5’-(TY)m(C/-)(T)nS(C/-)-3’(SEQ.ID.NO.7)與5’-(TC)nNCTAG(G/-)-3’(SEQ.ID.NO.8)。”m”與”n”係指大於等於一之多重複序列，較佳m之序列數是一到三之間而n之序列數是七到十二之間。”-“係指無任何核苷酸。全部內含子之單元是藉由一些連接件(linker)核苷酸來連接，基於使用符號及公式以供表達核苷酸與胺基酸序列之37CFR1.822規定，W係指腺嘌呤(adenine(A))或胸腺嘧啶(thymine(T))/尿嘧啶(uracil(U))，K係指鳥嘌呤(guanine(G))或胸腺嘧啶/尿嘧啶，S係指胞嘧啶(C)或鳥嘌呤，Y係指胞嘧啶或胸腺嘧啶/尿嘧啶，R係指腺嘌呤或鳥嘌呤以及N係指腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤或胸腺嘧啶/尿嘧啶。對於上述剪接體辨識單元(spliceomomal recognition components)，去氧胸腺核苷酸(deoxythymidine)可由尿核酸(uridine)取代。

為了確定剪接後之SpRNAi 之介子(insert)之功能。許多寡核苷酸序列經由基因工程方式併入重組SpRNAi-RGFP 之內含子介子區域。這些反意內含子介子區域包含數種限制酶切位，其中這些限制酶係選自AatII、AccI、AflII/III、AgeI、ApaI/LI、AseI、Asp718I、BamHI、BbeI、BclI/II、BglII、BsmI、Bsp120I、BspHI/LU11I/120I、BsrI/BI/GI、BssHII/SI、BstBI/U1/XI、ClaI、Csp6I、DpnI、DraI/II、EagI、Ecl136II、EcoRI/RII/47III、EheI、 FspI、HaeIII、HhaI、HinPI、HindIII、HinfI、HpaI/II、KasI、KpnI、MaeII/III、MfeI、MluI、MscI、MseI、NaeI、NarI、NcoI、NdeI、NgoMI、NotI、NruI、NsiI、PmlI、Ppu10I、PstI、PvuI/II、RsaI、SacI/II、SalI、Sau3AI、SmaI、SnaBI、SphI、SspI、StuI、TaiI、TaqI、XbaI、XhoI、XmaI 以及以上限制酶混合之限制酶。其中這些內含子之寡核苷酸介子(intronic oligonucleotide insert)是DNA模板，此模板可供轉錄成具有相當多的二級結構之轉錄分子，上述分子選自套馬索核醣核酸、短暫時(short-temporary)核醣核酸(stRNA)、反意核醣核酸(antisense RNA)、小干擾核醣核酸(siRNA)、小夾核醣核酸(shRNA)、微核醣核酸(miRNA)、Piwi交互作用核醣核酸(piRNA)、核糖酵素(ribozyme)及這些核醣核酸之先驅物或衍生物，其可為正股或反意的形式或具有兩種形式，以及上述核醣核酸之混合物。

為了基因傳送之方便以誘發特定細胞活化，本發明之較佳之基因重組結構SpRNAi-RGFP 被併入表現載體，該載體可選自DNA轉殖基因(DNA transgene)、質體(plasmid)、轉位子(transposon)、反轉位子(retrotransposon)、跳躍基因(jumping)、病毒載體及上述載體之混合載體。該載體藉由基因轉染方法進入特定細胞或組織，這些基因轉染方法選自脂質體轉染法(liposomal transfection)、化學轉染法(chemical transfection)、電穿孔法(electroporation)、轉位子DNA重組法(transposon-mediated DNA recombination)、跳躍基因併入法 (jumping gene insertion)、病毒感染法(viral infection)、微注射法(micro-injection)、基因槍法(gene-gun penetration)以及以上方法混合之方法。此載體進一步包含至少一病毒或第二型核醣核酸聚合酶(Pol-II)或第三型核醣核酸聚合酶(Pol-III)之啟動子以表現SpRNAi-RGFP 。再者，上述載體可包含Kozak轉譯起始處(Kozak consensus translation initiation site)以增加在真核細胞中之轉譯效率、多重SV40之多腺苷酸化作用信號(polyadenylation signals)於SpRNAi-RGFP 之下游區域以供重組基因轉錄分子三端的進一步處理、pUC複製起始子(origin of replication)以中於原核細胞中大量複製、至少兩個限制酶切位用於併合SpRNAi-RGFP 入載體、選擇性(可有或可不有)之SV40複製起始子用於在哺乳細胞中表達SV40 T抗原、及選擇性(可有或可不有)之早期啟動子(early promotor)用於在能複製的原核細胞中具有表現至少一抗生素的抗藥性。抗生素抗藥性基因的表現可用來篩選是否順利轉染或感染標的細胞的指標。上述抗生素抗藥性基因可對抗選自青黴素G(penicillin G)、安比西林(ampicillin)、新黴素(neomycin)、巴龍黴素(paromycin)、康黴素(kanamycin)、鏈黴素(streptomycin)、紅黴素(erythromycin)、斯派克黴素(spectromycin)、霍火黴素(phophomycin)、四環素(tetracycline)、利福黴素(rifapicin)、兩性黴素B(amphotericin B)、健他黴素(gentamycin)、氯黴素(chloramphenicol)、頭孢黴素(cephalothin)、泰黴素(tylosin)以 及以上抗生素混合之抗生素。

SpRNAi-RGFP 載體已經於(Tg(actin-GAL4：UAS-gfp))株之斑馬魚體內測試過，證實可抑制綠色螢光蛋白基因表現。如實施例三及六與圖3C所示，抗綠色螢光蛋白(anti-EGFP )之先驅微核醣核酸介子之SpRNAi-RGFP 質體，此質體經由脂質體轉染後(第四列(lane 4))顯示出很顯著之綠色螢光蛋白的基因靜默效應(約大於80%之蛋白被抑制)，然而於其他實驗組與對照組中並無任何靜默效應被偵測到；這些實驗組與對照組依序(由左到右)為1、控制組(blank vector control,Ctl)；2、針對愛滋病病毒蛋白p-24 (HIV-p24 )之先驅微核醣核酸(pre-miRNA)的對照組。3、針對反意綠色螢光蛋白且無小夾結構介子(antisenseEGFP insert without the hairpin loop structure)之anti組以及5、反轉先驅微核醣核酸序列之miR*組，其中反轉先驅微核醣核酸序列完全互補於抗綠色螢光蛋白之先驅微核醣核酸(anti-EGFP pre-miRNA,miR*)。對於非專一基因，如紅色螢光蛋白及肌動蛋白(actin)，發現並無靜默效應發生，表示內含子之微核醣核酸介入之核醣核酸干擾效應(intronic miRNA-mediated RNA interference(RNAi))具有高度專一性。此外，如圖3D所示，藉由北方墨點法(Northern bolting)分析，顯示有效用之內含子之核醣核酸(intronic RNA)只在具有內含子之抗綠色螢光蛋白先驅微核醣核酸之紅色螢光蛋白載體組(SpRNAi-RGFP )生成出來(中間第二列)，在不具有內含子之紅 色螢光蛋白組(intron-freeRGFP )(左邊第一列)或缺乏五端剪接處之SpRNAi-RGFP 組中並無此現象發生。此時紅色螢光蛋白之外顯子可被連接起來形成成熟核醣核酸以進行表現具有功能的紅色螢光蛋白。

有效的內含子之微核醣核酸(miRNA)結構的最佳化

先前實驗建立內含子之微核醣核酸(intronic miRNA)能提供一種化合物與方法，其可於體內(in vivo )產生基因靜默效應。為了進一步評估內含子之微核醣核酸之基因靜默效應之效率以及決定較佳的內含子之微核醣核酸之結構，以供產生最佳的基因靜默效應。根據研究，在細胞內的核醣核酸靜默(RNAi)相關基因靜默效應機制(如RISC)對於成熟的微核醣核酸的特定一股具有結構上的偏好。RISC為蛋白-核醣核酸複合體，此複合體經由RNAi機制對於標的基因轉錄分子的降解或標的基因的轉譯抑制或PTGS機制皆有影響。

選擇以斑馬魚做為實驗材料，在實驗中發現先驅微核醣核酸之彎折結構(stem-loop)決定了RISC複合體與成熟微核醣核酸序列之組合，此組合與習知的siRNA-RISC組合之複合體不同(Linet.al .(2005)Gene 356： 32-38)。siRNA雙股的形成於siRNA-RISC複合體中扮演重要之角色，siRNA的雙股功能並不相同，只有一股會與RISC複合體組合。此偏好現象是由於siRNA雙股五端之鹼基對之動態熱穩定性(thermodynamic stability of each 5’-end base-pairing)所決定。基於siRNA模式， miRNA及其互補之miRNA(又稱miRNA*)兩者之間的雙股形成被認為係組成miRNA-RISC複合體關鍵性之一步。假如此模式係正確的話，將無偏好特定一股之現象出現在先驅微核醣核酸的彎折結構上。然而，實驗發現intronic pre-miRNA之彎折結構對於miRNA-RISC複合體的組成選股上具有影響。

如實施例一與二揭露方式，利用建構完成之anti-EGFP miRNA之SpRNAi-RGFP 載體以及miRNA*-stemloop-miRNA[1]以及miRNA-stemloop-miRNA*[2](miRNA*代表係與成熟微核醣核酸序列互補之微核醣核酸)這兩個不同之先驅微核醣核酸，經DNA合成器合成後，個別併入預先準備好之SpRNAi-RGFP 載體中。這兩組的先驅微核醣核酸包含相同之雙股彎折結構(double-strandstem-arm region)，該彎折結構能對EGFP 基因第280到第302之核苷酸序列進行靜默效應。因為SpRNAi-RGFP 載體中經由五端及三端的PvuI 及MluI 限制酶切位將內含子之介子併入。上述介子能輕易被許多其他抗不同基因的介子(例如，anti-EGFP ，mir-302先驅微核醣核酸)所取代。藉由此可將SpRNAi 介子取代成其他抗不同基因轉錄分子的介子的方式，此內含子之微核醣核酸表現系統能提供一於體內之發育微核醣核酸遺傳應用之重要工具。

為了決定先驅微核醣核酸結構上的偏好性，先經由mirVana微核醣核酸分離管柱(Ambion,Austin,TX)分離後，再藉由latex beads將具有斑馬魚中具有靜默效應潛力之微核醣核酸沉澱下 來。其中一全長微核醣核酸，miR-EGFP(280-302)，在miRNA-stemloop-miRNA*[2]結構中，被證實具有靜默效應，如圖4A及圖4B(灰色陰影序列)所示。因為此有效之成熟微核醣核酸只有在斑馬魚轉染miRNA-stemloop-miRNA*[2]中，被發現有效，因此推測miRNA-RISC複合體對於miRNA-stemloop-miRNA*[2]而非[1]有結構上之偏好性。如圖4C所示，利用經由肌動蛋白(beta-actin)啟動子表達之斑馬魚(Tg(actin-GAL4：UAS-gfp))來進行實驗以展現視覺上標的基因靜默效應與miRNA表現之關係，此斑馬魚會一直於各類細胞中表達綠色螢光蛋白。於此斑馬魚轉染抗EGFP SpRNAi-RGFP 載體並表達一可當為指標蛋白之紅色螢光蛋白，可利用指標蛋白當成微核醣核酸在細胞中生成的指標。上述載體利用FuGene cationic liposomal reagent(Roche,In)轉染SpRNAi-RGFP 載體進入斑馬魚胚胎後，發現所有載體能在轉染24小時後完全進入斑馬魚胚胎中，除了骨骼及魚鱗部分以外。

該紅色螢光蛋白之指標蛋白係在被轉染之斑馬魚中被偵測到，然而綠色螢光蛋白(EGFP)之靜默效應只在被轉染miRNA-stemloop-miRNA*[2]之先驅微核醣核酸之斑馬魚組別(miR組)中被觀察到。如圖4D所示，西方墨點分析法定量性地確認基因靜默效應，在[2]結構所轉染之斑馬魚有大於百分之八十五的基因抑制。然而基因抑制效應於腸道(GI)係較其他組織要低，此一現象可能與腸道中較高RNase活性有關。因 為[1]與[2]之五端之熱穩定度為相同，因此推測此先驅微核醣核酸之彎折結構係與RISC複合體組合成熟微核醣核酸的選股有關。而岱塞爾(Dicer)於彎折結構(stem-loop)的切位已知可決定成熟微核醣核酸的選股，因而先驅微核醣核酸之彎折結構可能扮演決定辨識特殊切位的角色。因此基於不同微核醣核酸之彎折結構之多樣性，本發明利用一組改良之pre-mir-302彎折(如5’-GCTAAGCCAGGC-3’(SEQ.ID.NO.1)及5’-GCCTGGCTTAGC-3’(SEQ.ID.NO.2))與RISC複合體最佳化地組合以發揮本發明之效用。

Mir-302之SpRNAi-RGFP 於人類初胚表皮細胞(hpESC)、人類前列腺癌細胞PC3與人類初胚黑色素瘤細胞Colo細胞之轉染作用

基於上述實驗，將設計好的mir-302a-mir-302b-mir-302c-mir-302d之先驅微核醣核酸介子或重新設計的mir-302先驅微核醣核酸介子(如類小夾序列，其包含5’-UAAGUGCUUC CAUGUUUUAG UGU-3’(SEQ.ID.NO.9))併入所設計之SpRNAi-RGFP 載體中，以供於hpESC、PC3及Colo細胞中，靜默發育及分化的相關基因。mir-302a、mir-302b、mir-302c及mir-302d的成熟序列分別為5’-UAAGUGCUUC CAUGUUUUGG UGA-3’(SEQ.ID.NO.10)、5’-UAAGUGCUUC CAUGUUUUAG UAG-3’(SEQ.ID.NO.11)、5’-UAAGUGCUUC CAUGUUUCAG UGG-3’ (SEQ.ID.NO.12)及5’-UAAGUGCUUC CAUGUUUGAG UGU-3’(SEQ.ID.NO.13)。這些類mir-302基因靜默效應物之同源物在前端共十七個核苷酸(100%同源)中分享一致的五端區域，這十七個核苷酸與5’-UAAGUGCUUC CAUGUUU-3’(SEQ.ID.NO.3)的序列相同。在這些mir-302同源序列中，胸腺嘧啶(T)能用來取代尿嘧啶(U)。

在這些實驗中，mir-302a-mir-302b-mir-302c-mir-302d之先驅微核醣核酸經轉染入hpESC及PC3細胞，而重新設計的mir-302同源序列(SEQ.ID.NO.9)則轉染入Colo細胞中。在mir-302轉染後，所有的細胞株的型態(morphology(下部圖面))則改變，從紡錘狀或變形蟲狀改變置較圓胖的外型，顯示這些細胞可能喪失移動(migration)的能力且其細胞增生速率很低，此時如同幹細胞成長速率(圖5A至圖5C)。流式細胞儀(上部圖面)的細胞DNA含量(DNA content)(Y軸)對應不同細胞周期(X軸)所顯示有絲分裂的細胞群減少超過67%，證實這些mir-302轉染細胞之細胞增生速率變慢，而上述細胞群係由DNA含量所決定。第一峰(左)與第二峰(右)分別顯示為G0/G1與有絲分裂M期的細胞群占整體細胞群的相對數量。在mir-302轉染後，有絲分裂的細胞群在hpESC細胞中從36.1%降低至10.9%；在PC3細胞中從38.4%降低至12.6%；在Colo細胞中從36.5%降低至11.5%。然而，當轉染無SpRNAi-RGFP 載體或含有mir-gfp先驅微核醣核酸介子之載體時，細胞形態 或細胞增生皆無明顯地改變。上述mir-gfp先驅微核醣核酸係設計為抑制螢火蟲的綠色螢光蛋白，其與人類或小鼠的基因序列並無任何同源一致性。基於上述發現，mir-302同源物的基因轉殖表現能將人類初胚細胞及癌化細胞轉型為更類似胚胎幹細胞的型態及增生速率，如同先前iPS細胞所發現的改變(Okitaet al .,(2007)Nature 448： 313-317；Werniget al .,(2007)Nature 448： 318-324)。

胚樣體(embryoid body)形成、胚胎幹細胞指標蛋白表現、基因體DNA去甲基化及mir-302轉殖表現於Colo(Colo+mir-302)及PC3(PC3+mir-302)細胞中所造成之細胞移動等作用評估

為了證實mir-302轉染細胞的類胚胎幹細胞性質，本發明使用胚樣體形成、胚胎幹細胞指標蛋白表現、基因體去甲基化及細胞移動現象的減少來進行評估。mir-302轉染細胞有著很高的細胞叢聚性(high density cell culture confluence(>80%-90%))並傾向於形成上述胚樣體之緊密的細胞叢(colonies)如同原生人類胚胎幹細胞所衍生的胚樣體(如圖6A)。然而，若無適當的賀爾蒙或生長因子導引，這些胚樣體於再次培養時將相互分散並分化成類神經元細胞(如右下圖)。為了證實胚胎幹細胞及胚樣體細胞的遺傳特性，進一步評估這些胚胎幹細胞的指標蛋白表現。如圖6B所示，mir-302轉染之Colo細胞(Colo+mir-302)顯著地表現出一系列胚胎幹細 胞標準的指標蛋白，如Oct3/4、SSEA-3、SSEA-4及Sox2等，然而並無上述胚胎幹細胞的指標蛋白在一般的Colo細胞中或轉染空載體的Colo細胞(colo cells transfected with an emptySpRNAi-RGFP vector)中、轉染mir-gfp微核醣核酸載體的Colo細胞(Colo+mir-gfp)或轉染mir-434-5p微核醣核酸載體的Colo細胞(Colo+mir-434-5p)等細胞中並無被偵測到的跡象。mir-434-5p的序列並不與mir-302同源。因為Colo細胞係已分化的人類黑色素瘤細胞株，因此結果顯示mir-302-SpRNAi-RGFP 載體的轉染能使Colo細胞再度導向胚胎幹細胞的狀態，此一狀態與真正的胚胎幹細胞相似。

Oct3/4(或稱Oct-3或Oct-4)係POU轉錄因子的一種，其於分化全能胚胎幹細胞及生殖細胞表現的量很高(Scholeret al .,(1989)EMBO J .8： 2543-2550；Rosneret al .,(1990)Nature 345： 686-692)。Oct3/4的表現量對於維持幹細胞自我更新及分化多能性扮演重要的角色。Oct3/4的抑制調控導致胚胎幹細胞的分化進入不同的發育過程。SSEA蛋白包含SSEA-1、3及4起初係由單株抗體所辨識，此單株抗體能辨識在鼠科胚胎細胞初期著床階段表面及畸形癌細胞表面之乳糖醣脂體，但卻無法在上述細胞分化後的衍生細胞被抗體辨識(Solteret al .,(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75： 5565-5569)。未分化之初期胚胎幹細胞、人類胚胎癌細胞(hEC)及胚胎幹細胞皆表現出SSEA-3及SSEA-4但並無SSEA-1(Thomsonet al .,(1998)Science 282： 1145-1147)。在卵子生成過程中SSEA-3及SSEA-4係生成於卵子、受精卵及早期分裂的胚胎細胞之細胞膜表面(Shevinskyet al .,(1982)Cell 30： 697-705)。Sox2在維持分化全能性上扮演核心轉錄分子，但此功能並非專一於胚胎幹細胞中(Boyeret al .,(2005)Cell 122： 947-956)。因此，基於對於胚胎幹細胞指標蛋白的知識，經mir-302轉染之Colo細胞具有表現所有上述胚胎幹細胞指標蛋白及胚胎幹細胞的特性。

此外，分化多能性幹細胞具有另一獨特性質的後修飾改變，如基因體去甲基化(Hochedlingeret al .,(2006)Nature 441： 1061-1067)。為了轉分化已經分化的體細胞進入胚胎幹細胞階段，許多胚胎基因需要經由再激化以至於抑制發育及分化相關訊號或基因。DNA甲基化對於調控上述基因的表現或不表現扮演重要的角色。因為上游啟動子區域的甲基化通常干擾眾多轉錄分子對於基因表現的組合，去甲基化過程必須啟動以供重新活化胚胎基因，如Oct3/4、SSEA-3、SSEA-4及Sox2。為了評估Colo+mir-302細胞及Colo細胞的甲基化程度，首先運用(DNA isolation kit,Roche,IN)分離上述細胞的基因體。並用切位為CCGG的限制酶HpaII將分離之基因體作用，HpaII對於CpG甲基化具有敏感性，並只切沒有甲基化的CCGG處，但無法切有甲基化的CCGG處。如圖6C所示，切解作用後之基因體片段，類胚胎幹細胞Colo+mir-302細胞的片段較一般Colo細胞的片段要小，暗示轉染mir-302的Colo細胞確實有 較高程度的去甲基化發生。此外，Colo細胞及Colo+mir-302細胞的基因體之原始尺寸大小幾乎相同，故可證實上述結論。

圖6D進一步顯示Oct3/4基因啟動子區域甲基化形態上的改變，尤其係在hpESC、PC3及Colo細胞與轉染mir-302的上述細胞之間改變很明顯。為了證實這些區域的甲基化，本實驗利用重亞硫酸鹽(bisulfite)來分離基因體DNA(CpGenome DNA modification kit,Chemicon,CA)，重亞硫酸鹽可將未甲基化的胞嘧啶轉變為尿嘧啶，之後利用兩條前向引子(primer)5’-GTTGTTTTGT TTTGGTTTTG GATAT-3’(SEQ.ID.NO.36)及5’-ATTGTTTTGT TTTGGTTTTG GATTTA-3’(SEQ.ID.NO.37)以及一條反向引子(reverse primer)5’-GTAGAAGTGC CTCTGCCTTC C-3’(SEQ.ID.NO.38)及聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction(PCR))(long template PCR extension kit,Roche,IN)分離Oct3/4之五端上游啟動子區域。細胞基因體(100ng)先與引子(共150pmole)及1xPCR緩衝液混合，加熱至94℃至四分鐘後立即放置冰上冷卻。而後，經25個PCR循環，其條件如下：92℃、1分鐘；55℃、1分鐘；以及70℃、5分鐘。而後，藉PCR純化套組(Qiagen,CA)收集PCR反應產物，此PCR產物與切ACGT序列的多重限制酶，這些限制酶包含AclI (AACGTT)、BmgBI (CACGTC)、PmlI (CACGTG)、SnaBI (TACGTA)及HpyCH4IV (ACGT)，每種5單位(5U each)均勻混合。因為在此區域中無甲基化的ACGT處可經由重亞 硫酸鹽(bisulfite)反應轉化為AUGT處，而AUGT處無法被上述限制酶切動。如圖6D所示，至少四種甲基化的ACGT處，在轉染mir-302的hpESC、PC3及Colo細胞中，被轉化成去甲基化的ACGT處。經mir-302轉染所造成Oct3/4 基因啟動子區域的去甲基化可能係由mir-302轉染細胞如Colo+mir-302中，Oct3/4基因表現的再度活化所造成。

除此之外，細胞移動的抑制通常在mir-302所轉染的癌化細胞中被觀察到。一般而言，胚胎幹細胞傾向於停留於一處並形成原位胚樣體(embryoid bodyin situ )，這可能可以解釋為何PC3及Colo細胞在mir-302轉染之後會喪失移動能力。如圖6E所示，當PC3細胞置於PC3+mir-302細胞旁時，我們能清楚觀察到癌化的PC3細胞沿著PC3+mir-302細胞之一邊快速移動約30秒。黑色箭頭指示PC3細胞移動的方向。此實驗結果暗示一種mir-302轉染於癌細胞中的潛在治療應用，這不單可以使癌細胞轉化成有用的幹細胞亦可降低癌細胞轉移的可能性，更有優勢的是，因為mir-302轉染的癌細胞仍然可與病人的免疫系統相容，如上所述的類胚胎幹細胞的分化多能性細胞能被用來移植治療而無任何免疫排斥的反應。

利用miRNA基因晶片分析辨識轉殖基因mir-302表現

為了證實在轉染細胞中轉殖mir-302基因的表現量，我們使用miRNA基因晶片分析(miRNA microarray analysis)。在約70%的匯流，從每株細胞中經mir Vana^TM miRNA分離套組 (Ambion,Inc.,Austin,TX)所分離的小核醣核酸。所分離的小核醣核酸經純化並定量後使用1%甲醛-洋菜膠電泳法及光譜儀分析(spectrophotometer measurement)(Bio-Rad,Hercules,CA)以及送至LC Sciences(San Diego,CA)以供進一步miRNA生物晶片分析。在Cy3及Cy5的強度圖片中，訊號的強度增加由第1級至第65535級，其相對應的色彩改變由藍轉綠到黃至紅。在Cy5/Cy3的圖片比率來看，當Cy3強度高於Cy5時，顏色為綠色，當Cy3與Cy5的強度相同時，顏色為黃色，以及當Cy5強度較Cy3高時，顏色為紅色。如圖7A所示，Cy3為細胞沒有任何處理(如Colo)，而Cy5為細胞有經mir-302轉染(如Colo+mir-302)。在Cy5/Cy3的圖片比率(最右)，在SpRNAi-RGFP -mir-302轉染後，全部的mir-302家族(白圈)都高度表現。因為mir-302家族基因及重新設計的mir-302試劑有約91%的同源性，這顯示重新設計的mir-302試劑能當成mir-302成員，並代替mir-302的原本功能。圖7B顯示在Colo+mir-302細胞中，不同的表現量之miRNA的條列。

基於如圖7A所示的結果，我們也可以發現mir-302表現量的增加能增加前驅mir-302的表現以及其他微核醣核酸，例如mir-92,mir-93,mir-200c,mir-367,mir-371,mir-372,mir-373,mir-374以及全部的mir-520家族成員。經由miRBase：：Sequence program(http：//microrna.sanger.ac.uk/ )及這些mir的標的基因分析證實mir-302家族可針對超過400種標的基因，這暗示這 些微核醣核酸可能對於維持幹細胞的分化多能性及再生性扮演重要的角色。他們的標的基因包含但不限於RAB/RAS相關的致癌基因成員、ECT相關的致癌基因、多種型態腺癌基因(pleiomorphic adenoma genes)、E2F轉錄分子、Cyclin D結合類Myb轉錄分子(cyclin D binding Myb-like transcription factors)、HMG-box轉錄分子、Sp3轉錄因子、類CP2轉錄因子(CP2-like proteins transcription factor)、NFkB活化蛋白基因、cyclin相伴激酶(cyclin-dpendent kinases(CDK))、MAPK相關激酶、SNF相關激酶、肌凝蛋白支鏈激酶(myosin light chain kinases)、TNF-alpha誘發蛋白基因(TNF-alpha-induce protein genes)、DAZ-相關蛋白基因(DAZ-associated protein genes)、LIM相關homeobox基因(LIM-associated homeobox genes)、DEAD/H box蛋白基因(DEAD/H box protein genes)、forkhead box蛋白基因(forkhead box protein genes)、BMP調控子(BMP regulator)、Rho/Rac鳥嘌呤核苷酸交換因子(Rho/Rac guanine nucleotide exchange factor)、IGF受體(IGF receptor)、endothelin受體(endothelin receptor)、左右決定因子(left-right determination factors)、細胞週期素(cyclins)、p53誘發核蛋白基因(p53-inducible nuclear protein gens)、類RB1(RB-like 1)、RB接合蛋白基因(RB binding protein genes)、Max接合蛋白基因(Max-binding protein genes)、c-MIR細胞免疫辨識模組(c-MIR cellular modulator of immune recognition)、Bcl2-like細 胞凋亡處進子(Bcl2-like apoptosis facilitator)、連接蛋白(protocadherins)、結合蛋白(integrin β4/β8)、抑制子(inhibin)、錒克力(ankyrins)、SENP1、NUFIP2、FGF9/19、SMAD2、CXCR4、EIF2C、PCAF、MECP2、組織蛋白乙醯轉化酶MYST3(histone acetyltransferase MYST3)、細胞核蛋白RNP H3(nuclear RNP H3)以及許多核受體及因子。這些所有基因皆與胚胎發育及癌化生成相關。

利用基因晶片分析辨識胚胎幹細胞標誌表現

在共同表現胚胎幹細胞標誌蛋白與轉殖mir-302基因的相關性已經被證實，我們利用基因晶片分析來搜尋在細胞內mir-302轉染前及後，基因體範圍內的基因表現改變在mir-302轉染細胞及其他人類胚胎幹細胞之間。Affymetrix基因晶片(GeneChip U133A&B arrays,Santa Clara,CA)被用來評估在Colo+mir-302及其他人類胚胎幹細胞之間超過32668個人類基因表現型態，如HuEC8及H9。從每個測試細胞株所分離的全部核醣核酸經RNeasy spin column(Qiagen,Valencia,CA)收集。為了認實背景的不同標的，我們重覆生物晶片測試並使用相同Colo+mir302樣本及選出兩百個基因，這些基因在其中一邊有顯現出來。如圖8A所示，這些選擇基因(白點)的表現量改變全都小於Colo+mir-302的一倍，顯示這些背景值的雜訊係相當小的。基於這些預先選擇的基因並用一倍的改變量當成篩選標準(threshold)，我們能計算在兩組比較基因的相對係數 (correlation coefficiency(CC))。32668個人類基因表現型態在相比較的樣本之間的相對係數比率具有相似的比例。在如此的相對係數比率，如圖8A所示的結果證實Colo+mir-302細胞之基因表現型態與hES HuEC8及H9細胞之間具有88%及86%的相似性，然而只有53%的相對係數係顯示於Colo與Colo+mir-302細胞之間。這證實SpRNAi-RGFP 相關的mir-302轉染改變至少15354個細胞基因的表現形態，這些可能與癌化Colo細胞轉化成類胚胎幹細胞Colo+mir-302細胞相關。

許多在Colo與Colo+mir-302細胞之間主要不同表現程度的基因列表顯示於圖8B。如H9及HuEC8細胞，Colo+mir-302細胞表現胚胎幹細胞及生殖細胞的細胞標誌蛋白(如SSEA-3,SSEA-4,Utf1,Oct4,Sox2,Pulimio-2 及Nanog )表現量很高。然而，Klf4並不表現於Colo+mir-302細胞中，顯示與iPS細胞有些許不同(如圖6B所示)。此外，許多癌症標誌(cancer marker)、發育訊號(developmental signal)及細胞增長因子(cell proliferating facotr)被發現顯著地在mir-302轉染細胞中受到抑制，如同未分化細胞(undifferentiated round cell)的型態及如圖5所示之較慢的細胞複製的現象被觀察到。縱上所述，這些發現指出mir-302轉染的方法能遺傳地轉化已分化的Colo細胞株而成具有類胚胎幹細胞的Colo+mir-302細胞株，而與分化多能性的H9及HuEC8幹細胞相似。

利用各種荷爾蒙及生長因子導引細胞分化

就定義上來說，分化多能性幹細胞能分化成許多細胞型態，這些形態與從胚胎外胚層、中胚層及內胚層衍生的組織細胞相似。舉例來說，在無哺乳細胞的條件下(feeder-free)利用活體外(in vitrto )的赫爾蒙及生長因子進行處理，本發明已經可成功的導引Colo+mir-302細胞的分化成三種不同細胞形態如圖9A到9C所示。首先，在無哺乳細胞的條件下，用雄激素(androgen)與雙水化睪固酮(dihydrotestosterone(DHT 50ng/ml))處理Colo+mir-302細胞六小時後，移植上述細胞(約10⁵ 個細胞)入六周大雌性免疫喪失(immunocompromised)SCID米黃色小鼠的子宮中，一周之後生成一類精原細胞的孢囊在移植處(圖9A中間)。接著，運用轉形生長因子β 1(transforming growth factorβ 1(TGF-β 1 100ng/ml))處理12小時後，移植處理後的細胞進入六周大雌性免疫喪失(immunocompromised)SCID米黃色小鼠的子宮中，這些細胞分化成類纖維母細胞的型態並開始分泌膠原蛋白，在一周內，這些細胞占據了子宮大部分的區域(圖9B)。最後，用骨轉形蛋白4(bone morphogenetic protein 4(BMP4 100ng/ml))處理Colo+mir-302細胞12小時後，再用異種皮移植(xenograft)方式將處理後的細胞移植到六周大免疫喪失SCID米黃色小鼠的肝臟中，上述細胞會分化成類軟骨細胞，其周圍有些許鈣化沉澱(圖9C)。藉由用無胸腺淋巴小鼠(thymic nude mice)當成一種體內模擬移殖治療的環境。這些實驗證實本發明之mir-302之轉染方法可產生新穎的胚胎幹細胞 株，這些細胞株可在無哺乳細胞的體外環境中，經導引並生成不同組織細胞形態。因此，本發明不只能轉化或轉形以分化的體細胞而成類胚胎幹細胞的分化多能性細胞，而且亦可在無哺乳細胞的培養環境下維持幹細胞的分化多能性及自我複製的能力。

因此，本發明藉由利用內含子的mir-302表現載體提供一種新穎的幹細胞生成方法，具體來說，由初胚體細胞株及癌細胞株所衍生的生成方法。因為內含子之微核醣核酸相關基因靜默路徑與許多細胞內的調控機制協調反應，這些機制包含基因轉錄因子、核醣核酸剪接(RNA splicing)、外體解消及無義介導降解。內含子的微核醣核酸之基因靜默效應被認為最有效、最專一、最安全於所有三種已知的RNAi路徑。基於全部的優勢，本發明之內含子的mir-302試劑的使用提供一種簡單、有效及安全的基因使用方法，其不只可供轉化體細胞成類胚胎幹細胞的分化多能性細胞，亦可在無哺乳細胞的培養條件下維持胚胎幹細胞的分化多能性，因此可避免如同先前的iPS幹細胞方法將四種巨大轉錄因子基因以令人厭煩的反轉錄病毒轉染入單一細胞。如圖10所示，基於mir-302所誘發生成之胚胎幹細胞(mir-302-induced embryonic stem cell)，這暗示SSEA-1在mir-302誘發的細胞(Colo+mir-302)細胞中有一定程度的表現；然而在Klf4則無此表現。

本發明之化合物： 一種可供誘發內含子之核醣核酸相關的基因靜默效應之重組核醣核酸化合物包含：a)至少一內含子，其中該內含子由複數個外顯子包圍，這些外顯子能藉由細胞內RNA splicing將外顯子切除並由處理機制接著作用；以及b)複數個外顯子，其中該外顯子能連接成一基因而具有特定功能。

上述的重組核醣核酸化合物，進一步包含a)至少一限制酶切位，其中該限制酶切位可用於併合該重組核醣核酸化合物於一表現載體中，以供表現該重組核醣核酸化合物的前驅核醣核酸轉錄分子於哺乳細胞中；以及b)複數個轉錄及轉譯終止處(transcription and translation termination sites)，其中該轉錄及轉譯終止處可被用來製造該重組核醣核酸化合物的核醣核酸轉錄分子的正確尺寸。

上述重組核醣核酸化合物的內含子進一步包含：a)一基因靜默效應物的介子，其互補或同源於至少一標的基因；b)一五端剪接處；c)一三端剪接處；d)一可供剪接體辨識的分支點區域； e)一可供剪接體接合的多嘧啶區；f)複數個可供連接主要元件的連接件。

基因靜默效應物之介子包含一核苷酸序列，其同源於5’-UAAGUGCUUC CAUGUUU-3’(SEQ.ID.NO.3)，該五端剪接處係一核苷酸序列並同源於5’-GTAAGAGK-3’(SEQ.ID.NO.4)或是GU(A/G)AG U序列(例如，5’-GTAAGAGGAT-3’(SEQ.ID.NO.30)、5’-GTA AGAGT-3’、5’-GTAGAGT-3’及5’-GTAAGT-3’)。此時，三端剪接處(3’-splice site or 3’clip)序列係同源於GWKSCYRCAG(SEQ.ID.NO.5)或CT(A/G)A(C/T)NG序列(例如，5’-GATATCC TGCAG-3’(SEQ.ID.NO.31)、5’-GGCTGCAG-3’、5’-CCACAG-3’)。此外，分支點區序列係位於五端與三端剪接處之間，該分支點區位於一核苷酸序列同源於5’-TACTWAY-3’(SEQ.ID.NO.6)(如，5’-TACTAAC-3’及5’-TACTTAT-3’)。此外，多嘧啶區係位於分支點區與三端剪接處之間，其中多嘧啶區是一具有高密度的胸腺嘧啶(Thymine)與胞嘧啶(Cytosine)之核苷酸序列，多嘧啶區之核苷酸序列同源於5’-(TY)m(C/-)(T)nS(C/-)-3’(SEQ.ID.NO.7)與5’-(TC)nNCTAG(G/-)-3’(SEQ.ID.NO.8)。其中，”m”與”n”係指大於等於一的多重複序列，較佳m之序列數是一到三之間，而n之序列數是七到十二之間。”-“係指無任何核苷酸。一些連接核苷酸能用來連接上述內含子片段。基於37CFR1.822規 定(台灣”核苷酸及胺基酸序列表記載格式”亦同)，W係指腺嘌呤(adenine(A))或胸腺嘧啶(thymine(T))/尿嘧啶(uracil(U))，K係指鳥嘌呤(guanine(G))或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)，S係指胞嘧啶(C)或鳥嘌呤(G)，Y係指胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)，R係指腺嘌呤(A)或鳥嘌呤(G)以及N係指腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)或其他。對於上述所有剪接體辨識元件中，deoxythymidine(T)核苷酸係可用尿嘧啶(U)來取代。

本發明之方法：一種在哺乳細胞中用於誘發內含子mir-302相關的基因靜默效應之轉殖基因方法，其包含下列步驟：a)建構一重組核醣核酸化合物，其包含具有mir-302相關基因靜默效應物之至少一內含子，該基因靜默效應物由外顯子環繞，其中內含子能經切除後而與外顯子分離，以供進一步mir-302基因靜默效應；b)將該重組核醣核酸化合物併入一表現載體中；以及c)轉殖該載體進入複數個哺乳細胞中，其中該細胞產生許多上述核醣核酸化合物的前驅核醣核酸轉錄分子，其中細胞的剪接體將內含子經剪接作用後從前驅核醣核酸轉錄分子中分離出來，以至於提供mir-302相關的基因靜默效應，其係針對與mir-302基因靜默效應物序列同源或互補的序列基因。

本發明已由上述相關實施例加以描述，然而上述實施例僅為實施本發明之範例。必需指出的是，已揭露之實施例並未限制本發明之範圍。相反地，包含於申請專利範圍之精神及範圍之修改及均等設置均包含於本發明之範圍內。

以下實驗設計為舉例說明，但並不限制本發明之範圍。對所有熟習本領域之人士來說，可於不脫離本發明的精神和範圍內，對此做合理的變化。

實施例一 建構包含SpRNAi 之重組基因(SpRNAi-RGFP )

用於產生三種不同SpRNAi 內含子之合成核酸序列，該序列包含正股、反意或小夾EGFP 介子(hairpin-EGFP insert)，如下所示：N1-正股(sense),5’-GTAAGAGGAT CCGATCGCAG GAGCGCACCA TCTTCTTCAA GA-3’(SEQ.ID.NO.14)；N1-反意，5’-CGCGTCTTGA AGAAGATGGT GCGCTCCTGC GATCGGATCC TCTTAC-3’(SEQ.ID.NO.15)；N2-正股，5’-GTAAGAGGAT CCGATCGCTT GAAGAAGATG GTGCGCTCCT GA-3’(SEQ.ID.NO.16)；N2-反意，5’-CGCGTCAGGA GCGCACCATC TTCTTCAAGC GATCGGATCC TCTTAC-3’(SEQ.ID.NO.17)；N3-正股，5’-GTAAGAGGAT CCGATCGCAG GAGCGCACCA TCTTCTTCAA GTTAACTTGA AGAAGATGGT GCGCTCCTGA-3’(SEQ.ID.NO.18)；N3-反意(antisense), 5’-CGCGTCAGGA GCGCACCATC TTCTTCAAGT TAACTTGAAG AAGATGGTGC GCTCCTGCGA TCGGATCCTC TTAC-3’(SEQ.ID.NO.19)；N4-正股(sense),5’-CGCGTTACTA ACTGGTACCT CTTCTTTTTT TTTTTGATAT CCTGCAG-3’(SEQ.ID.NO.20)；N4-反意，5’-GTCCTGCAGG ATATCAAAAA AAAAAGAAGA GGTACCAGTT AGTAA-3’(SEQ.ID.NO.21)。從SEQ.ID.NO.14到SEQ.ID.NO.21的所有序列在該等序列的五端皆有磷酸化。此外，兩外顯子片段係經由DraII 限制酶切紅色螢光RGFP 基因(SEQ.ID.NO.22)之第208個核苷酸處所產生，且該片段之五端進一步經T4 DNA聚合酶作用而生成平整端(blunt end)。此處所指的RGFP 為在第69個胺基酸處嵌入一額外的天門冬胺酸(aspartate)之新穎的紅光色偏(red-shifted)的螢光蛋白基因，該螢光蛋白(HcRed1)係由海葵Heteractis crispa (BD Biosciences,CA)所衍生而來。修飾後的紅色螢光蛋白具有較少的變性以及幾乎兩倍遠紅外線螢光強度之紅色螢光570nm波長射線。本發明利用pHcRed1-N1/1 載體(BD Biosciences,CA)與XhoI 及XbaI 限制酶切開並用2%洋菜膠(agarose gel)電泳純化全長769鹼基對(bp)之RGFP 基因片段與3934bp之無RGFP 之空載體並純化之(gel extraction kit,Qiagen,CA)。

將N1-正股與N1-反意、N2-正股與N2-反意、N3-正股與 N3-反意及N4-正股與N4-反意序列(1：1)的雜合，個別加熱每個互補序列到94℃(2分鐘)，於1xPCR緩衝液(如50mM Tris-HCl,pH 9.2 at 25℃,16mM(NH₄ )₂ SO₄ ,1.75mM MgCl₂ )加熱70℃(10分鐘)。接著立刻個別逐漸冷卻(一小時期間從50℃到10℃)N1+N4、N2+N4、N3+N4(1：1)之雜合混合而實施N1、N2、N3雜合到N4連續性連接(sequential ligation)。之後用T4DNA接合酶(ligase)及相對應之緩衝液中在12℃再作用12小時使其接合，而獲得SpRNAi 內含子以供插入RGFP 外顯子之DraII 切位處。在RGFP 外顯子片段被加入反應(1：1：1)後，T4 DNA接合酶及相對應之緩衝液經相對應調整再一次進行連接反應12小時(12℃)。為了建構正確大小尺寸的重組SpRNAi 接入RGFP 基因(recombinantSpRNAi -insertedRGFP gene)，10ng之接合核苷酸(ligated nucleotide)序列經PCR技術及一對RGFP 特定引子(primers)5’-CTCGAGCATG GTGAGCGGCC TGCTGAA-3’(SEQ.ID.NO.23)與5’-TCTAGAAGTT GGCCTTCTCG GGCAGGT-3’(SEQ.ID.NO.24)在PCR條件於94℃(1分鐘)、52℃(1分鐘)、68℃(2分鐘)而進行30次重覆反應。而後，利用2%洋菜膠(agarose gel)分離出PCR之產物，約900bp大小之核苷酸序列經Gel Extraction kit(Qiagen,CA)所純化出來。此900bp大小之SpRNAi -insertedRGFP gene，可供進一步用序列比對(sequencing)確認之。較佳而言，在缺乏內含子介子的情況下，SpRNAi 內含子的正股序列為 5'-GTAAGTGGTC CGATCGTCGC GACGCGTCAT TACTAACTAT CAATATCTTA ATCCTGTCCC TTTTTTTTCC ACAGTAGGAC CTTCGTGCA-3'(SEQ.ID.NO.25)，而SpRNAi 內含子的反意序列為5'-TGCACGAAGG TCCTACTGTG GAAAAAAAAG GGACAGGATT AAGATATTGA TAGTTAGTAA TGACGCGTCG CGACGATCGG ACCACTTAC-3'(SEQ.ID.NO.26)。

在另一實施例中，重組SpRNAi-RGFP 轉殖基因能經併SpRNAi (由SEQ.ID.NO.25及SEQ.ID.NO.26雜合)入RGFP 外顯子的DraII 之限制酶切位。而之後的實驗流程如前所述。用於測試重新設計的mir-302先驅miRNA介子之SpRNAi-RGFP 轉殖基因建構載體係由這種方式形成。

因為重組SpRNAi-RGFP 基因分別在五端及三端具有XhoI 與XbaI 限制酶切位，其能輕易地經由XhoI 與XbaI 限制酶切位併入載體中。此載體必須為有機組織(organism)或次有機組織(suborganism)，該些組織選自DNA轉殖基因、質體(plasmids)、跳躍基因(jumping genes)、轉位子(transposons)及病毒載體(retroviral vectors)。此外，因為位於內含子之該介子分別在五端及三端經PvuI 及MluI 限制酶切位併入內含子，因此本發明也能利用同樣的限制酶切位將其他不同介子接入載體以替換之。該介子(inserted sequence or insert)較佳為類小夾 之基因靜默效應物(hairpin-like gene silencing effector)，該基因靜默效應物具有能標定(target)特定基因的高度互補性序列，這些特定基因選自綠色螢光蛋白(GFP )基因、螢光素基因(luciferase genes)、乳糖控制組(lac-Z)基因、病毒基因、細菌基因、植物基因、動物及人類基因等序列以進行靜默。這些靜默效應物介子(insert)與其標的基因序列之互補或同源率約30%到100%之間，對hairpin-shRNA介子(insert)較佳為35%到49%，對正股-RNA與反意-RNA介子而言，較佳之序列互補率範圍為90%到100%。

實施例二 建構包含SpRNAi 之重組基因(SpRNAi-RGFP )進入表現載體(Expression-competent Vector)

因為重組SpRNAi-RGFP 基因分別於五端及三端具有XhoI 與XbaI 的限制酶切位，其能利用該等切位將重組基因接入載體。本發明將SpRNAi-RGFP 重組基因與3934bp之pHcRed-N1/1 載體以1：16(w/w)混合，並從65℃降溫到15℃超過50分鐘，之後加入T4接合酶及其緩衝液混合12℃(12小時)以進行接合。所形成的SpRNAi-RGFP 表現載體能利用E.coli DH5α LB(50ug/ml康黴素(kanamycin)(Sigma Chemical,St.Louis,Mo))進行大量複製。並利用PCR技術及其RGFP 特定引子(SEQ.ID.NO.23)及(SEQ.ID.NO.24)於94℃(1分鐘)、68℃(2分鐘)並進行30次循環反應而序列比對以確認為具有特定 重組基因的菌株(positive clone)。為了將重組基因併入病毒載體，相同的接合程序也能實施於XhoI/XbaI -linearizedpLNCX2 反轉錄病毒載體(BD)以外的載體。因為介子分別於五端及三端經PvuI 及MluI 限制酶切位連接於SpRNAi 內，因此本發明能利用該等切位去除或以重新設計的mir-302介子取代anti-EGFP shRNA介子。該重新設計的mir-302介子序列包含同源的5’-UAAGUGCUUC CAUGUUU-3’(SEQ.ID.NO.3)區域，如相似於5’-UAAGUGCUUC CAUGUUUUAG UGU-3’(SEQ.ID.NO.9)、5’-UAAGUGCUUC CAUGUUUUGG UGA-3’(SEQ.ID.NO.10)、5’-UAAGUGCUUC CAUGUUUUAG UAG-3’(SEQ.ID.NO.11)、5’-UAAGUGCUUC CAUGUUUCAG UGG-3’(SEQ.ID.NO.12)或5’-UAAGUGCUUC CAUGUUUGAG UGU-3’(SEQ.ID.NO.13)。

合成核酸序列可用來產生許多不同SpRNAi 內含子包含mir-302家族先驅微核醣核酸叢聚(mir-302 familial pre-miRNA cluster)或重新設計的mir-302介子，示例如下：mir-302a-正股，5’-GTCCGATCGT CCCACCACTT AAACGTGGAT GTACTTGCTT TGAAACTAAA GAAGTAAGTG CTTCCATGTT TTGGTGATGG ATCTCGAGCT C-3’(SEQ.ID.NO.39)；mir-302a-反意，5’-GAGCTCGAGA TCCATCACCA AAACATGGAA GCACTTACTT CTTTAGTTTC AAAGCAAGTA CATCCACGTT TAAGTGGTGG GACGATCGGA C-3’(SEQ.ID.NO.40)；mir-302b-正股，5’-ATCTCGAGCT CGCTCCCTTC AACTTTAACA TGGAAGTGCT TTCTGTGACT TTGAAAGTAA GTGCTTCCAT GTTTTAGTAG GAGTCGCTAG CGCTA-3’(SEQ.ID.NO.41)；mir-302b-反意，5’-TAGCGCTAGC GACTCCTACT AAAACATGGA AGCACTTACT TTCAAAGTCA CAGAAAGCAC TTCCATGTTA AAGTTGAAGG GAGCGAGCTC GAGAT-3’(SEQ.ID.NO.42)；mir-302c-正股，5’-CGCTAGCGCT ACCTTTGCTT TAACATGGAG GTACCTGCTG TGTGAAACAG AAGTAAGTCG TTCATGTTTC AGTGGAGGCG TCTAGACAT-3’(SEQ.ID.NO.43)；mir-302c-反意，5’-ATGTCTAGAC GCCTCCACTG AAACATGAAC GACTTACTTC TGTTTCACAC AGCAGGTACC TCCATGTTAA AGCAAAGGTA GCGCTAGCG-3’(SEQ.ID.NO.44)；mir-302d-正股，5’-CGTCTAGACA TAACACTCAA ACATGGAAGC ACTTAGCTAA GCCAGGCTAA GTGCTTCCAT GTTTGAGTGT TCGACGCGTC AT-3’(SEQ.ID.NO.45)；mir-302d-反意，5’-ATGACGCGTC GAACACTCAA ACATGGAAGC ACTTAGCCTG GCTTAGCTAA GTGCTTCCAT GTTTGAGTGT TATGTCTAGA CG-3’(SEQ.ID.NO.46)；and miR-302s-正股，5’-GTCCGATCGT CATAAGTGCT TCCATGTTTT AGTGTGCTAA GCCAGGCACA CTAAAACATG GAAGCACTTA TCGACGCGTC AT-3’(SEQ.ID.NO.27)；mir-302s-反意，5’-ATGACGCGTC GATAAGTGCT TCCATGTTTT AGTGTGCCTG GCTTAGCACA CTAAAACATG GAAGCACTTA TGACGATCGG AC-3’(SEQ.ID.NO.28)。

Mir-302家族先驅微核醣核酸叢聚可分別經mir-302a-正股與mir-302a-反意雜合、mir-302b-正股與mir-302b-反意雜合、mir-302c-正股與mir-302c-反意雜合及mir-302d-正股與mir-302d-反意雜合而形成。接著，mir-302a、mir-302b、mir-302c及mir-302d分別經PvuI /XhoI ,XhoI /NheI ,NheI /XbaI 及XbaI /MluI 等限制酶切開並經洋菜膠萃取過濾管柱(gel extraction filter column)(Qiagen,CA)於35微升之高壓滅菌二次水(autoclaved ddH₂ O)萃取之。立刻接著，所收集的雜合經T4 DNA接合酶(Roche,20U)互相接合而形成mir-302家族微核醣核酸介子叢聚，此外這些雜合核醣核酸可進一步經由PvuI /MluI 等限制酶切位併入SpRNAi-RGFP 表現載體。包含mir-302家族微核醣核酸介子叢聚之SpRNAi-RGFP 重組基因被併入反轉錄病毒pLNCX2 載體，此載體具有pVSV-G 表面抗原，此抗原可供轉殖性感染hpESC與PC3細胞。為了形成人工重新設計的mir-302先驅微核醣核酸介子，本發明雜合 (SEQ.ID.NO.27)與(SEQ.ID.NO.28)兩條合成序列，而後以PvuI /MluI 等限制酶切開並以T4 DNA接合酶(20U)將此雜合序列接合於表現SpRNAi-RGFP 的pHcRed1 載體。此重組基因包含一重新設計的mir-302先驅微核醣核酸，其可供於Colo細胞的轉殖性DNA重組。成功轉染的細胞可經分離及24小時後收集以供繼代培養，並利用抗RGFP的單株抗體及細胞流式儀(Clontech,Palo Alto,CA)來收集上述細胞。

mir-302先驅微核醣核酸叢聚及mir-302表現載體如上述方式形成後可於E.coli DH5α LB(50微克/毫升康黴素)進行pHcRed1-N1/1 質體載體的大量複製或(100微克/毫升安比西林)進行pLNCX2 反轉錄載體的大量複製。大量複製的SpRNAi-RGFP 表現載體經mini-prep或maxi-prep plasmid extraction kit(Qiagen,CA)分離及純化，詳細流程詳見使用說明。對於pLNCX2 反轉錄載體而言，本發明可利用包裝細胞株(packaging cell line)GP2-293(Qiagen,CA)以供製造具有感染但卻無法複製的病毒。經感染之GP2-293細胞於1x DMEM(碳吸附的10%胎牛血清(FBS)、4mM L-麩醯胺酸、1mM丙酮酸鈉、100微克/毫升硫酸鏈絲菌素、50微克/毫升新黴素(Sigma Chemical,MO))培養液中於37℃及5%的二氧化碳中培養。經GP2-293細胞產生的病毒數量在轉染之前測定至少為10⁶ cfu/毫升。

實施例三in vitro 轉殖性轉染

對以反轉錄病毒載體轉染入hpESC及PC3細胞株而言，、斑馬魚幼苗及老鼠皮膚，首先將具有anti-EGFP mir-gfp 或mir-302家族叢聚先驅微核醣核酸介子之SpRNAi-RGFP pLNCX2 反轉錄表現載體於pVSV-G共同轉染的GP2-293細胞(Clontech,CA)。在培養於37℃、5%的二氧化碳36個小時後，GP2-293細胞的培養液(每10毫升)經由過濾(0.25微米的孔徑)並直接個別地傳送於hpESC及PC3細胞培養液中。因為該培養液中含有很高的該反轉錄病毒載體劑量，因此全部的測試細胞皆轉殖性地經載體所感染並於24小時內開始表現內含子的介子及RGFP。為了轉殖性傳遞重新設計的人造mir-302先驅微核醣核酸進入Colo細胞中，本發明首先混合預先準備好的SpRNAi-RGFP 轉殖基因(每細胞培養皿中60微克(μg)溶於10毫升中)，該轉殖基因包含實施例二的預先設計之mir-302先驅微核醣核酸介子，與FuGene試劑(Roche,IN)混合而依使用手冊操作。接著，混合物用於Colo細胞培養24小時。因為轉殖基因也包含類轉位子序列，其同源於特定不具有密碼子的人類基因體區域，而後經由細胞流式儀及抗RGFP的單株抗體(Clontech,CA)收集成功轉殖性轉染的細胞，以供繼代培養。

實施例四 北方墨點法分析(Northern Blot Analysis)

RNA(20μg全部RNA或2ug poly[A⁺ ]RNA)經由1%甲醛- 洋菜膠(formaldehyde-agarose gels)電泳分離後利用毛細現象將RNA吸附於尼龍膜上(Schleicher & Schuell,Keene,NH)。能互補於連接RGFP 之5端外顯子與先前設計之先驅微核醣核酸介子(pre-miRNA insert)之間之75bp連接序列(junction sequence)之合成探針(probe)經Prime-It II kit(Stratagene,La Jolla,CA)所標定(labeled)，並藉由隨機引子延長(random primer extension)技術，使用[³² P]-dATP(>3000Ci/mM,Amersham International,Arlington Heights,IL)及所純化之10bp-cutoff Micro Bio-Spin chromatography columns(Bio-Rad,Hercules,CA)來標定序列。序列的雜合係藉由混合50%去離子甲醯胺(deionized formamide)(pH 7.0,5x Denhardt’s solution,0.5% SDS,4 x SSPE and 250mg/mL denatured salmon sperm DNA fragments(18hr,42℃))而實施。尼龍膜於2x SSC,0.1% SDS(15min,25℃)的條件下洗滌兩次並以0.2 x SSC,0.1% SDS(45min,37℃)的條件洗滌一次後，進行(自動)放射攝影術(autoradiography)。

實施例五 十二烷基磺酸鈉聚丙醯胺膠體電泳(SDS-PAGE)及西方墨點法分析(Western Blot Analysis)

對特定蛋白之免疫轉印法(immunoblotting)，於培養液經去除後之分離細胞經過冰的食鹽磷酸緩衝液(phosphate buffered saline(PBS))潤拭，並用CelLytic-M細胞溶解萃取劑(lysis/extraction reagent)(Sigma,MO)並依據使用說明補充蛋白 酶抑制劑(protease inhibitors)如Leupeptin、TLCK、TAME及PMSF。之後細胞至於室溫中以搖晃器(shaker)搖晃15分鐘後將細胞刮入試管中後，用12000xg之轉速離心5分鐘將細胞殘渣沉澱，並將具有蛋白質之細胞萃取液收集並儲存在-70℃以待使用。並利用SOFmax software package在E-max microplate測定器(reader)(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)將蛋白定量。每30μg之細胞萃取液被加入SDS-PAGE樣品緩衝液(sample buffer)(有還原或未還原50mM DTT)並將上述樣本煮沸3分鐘，再將樣本注入8%聚丙醯胺膠(polyacrylamide gels)，同時將2~3μl蛋白標示(protein marker)(Bio-Rad)注入其中。而SDS-polyacrylamide gel電泳(electrophoresis)是依據標準程序來實施(Molecular Cloning,3rd ED)。蛋白層析後經由電轉漬(electroblotting)法將蛋白質吸附在硝化纖維膜(nitrocellulose membrane)而用Odyssey blocking reagent(Li-Cor Biosciences,Lincoln,NB)在室溫作用1~2小時。本發明利用抗體(primary antibody)直接對特定蛋白(EGFP(1：5,000；JL-8,BD),RGFP(1：10,000；BD),Oct3/4(1：500；Santa Crutz),SSEA-3(1：500；Santa Crutz),SSEA-4(1：500；Santa Crutz),Sox2(1：1000；Santa Crutz),Klf4(1：200；Santa Crutz))標定，於4℃作用整晚，以供評估蛋白表現量。接著用TBS-T緩衝液洗三次，並再以抗體(secondary antibody)作用此nitrocellulose membrane(goat anti-mouse IgG conjugate with Alexa Fluor 680 reactive dye (1：2,000；Molecular Probes))，室溫作用一小時後再用TBS-T緩衝液洗三次後進行呈像並用Li-Cor Odyssey Infrared Imager及Odyssey Softeare v.10(Li-Cor)紀錄影像。

實施例六 斑馬魚中內含子之核醣核酸基因靜默效應(Intronic RNA-mediated Gene Silencing)

將此株Tg(actin -GAL4：UAS-gfp)斑馬魚幼魚養在具有10ml 0.2x無血清(serum-free)RPMI 1640培養液之容器中以待轉染。藉由輕巧地溶解60μl FuGene liposomal transfection reagent(Roche Biochemicals,Indianapolis,IN)於1ml 1x無血清(serum-free)RPMI 1640培養液中而準備轉染預先劑(transfection pre-mix)。如實施例一與二所述之具有與不具有anti-EGFP 先驅微核醣核酸介子之SpRNAi-RGFP 載體(20μg)與上述轉染預先劑混合並置於冰上30分鐘後直接導入斑馬魚幼魚之容器中以進行轉染。所有三個劑量(全部60μg)經12小時間隔島入，並待第一次轉染60小時後收集樣本並觀察。

實施例七 細胞流式儀分析(Flow Cytometry Assay)

細胞經胰蛋白酶作用後、離心收集並用1ml PBS(預冷的70%甲醇)重新混勻，並置於-20℃ 1小時。之後細胞經離心收集並以1ml PBS洗一次。細胞再一次經離心收集並以1ml的PBS(1mg/ml濃度的碘化丙啶(propidium iodide)及0.5mg/ml 核酸水解酶)重新混勻並置於37℃，30分鐘。約有15,000個細胞經BD FACSCalibur(San Jose,CA)分析。細胞偶具現象(Cell doublet)經由暫止區寬度與暫止域相對值(plotting pulse width versus pulse area)並以單一細胞設定閘門口徑。收集的資料經Flowjo軟體及Watson Pragmatic演算法(algorithm)分析之。

實施例八 去氧核醣核酸甲基化試驗DNA Methylation Assay

本發明首先經DNA isolation kit(Roche,IN)分離細胞的基因體。基因體DNA樣本經培養試驗細胞於10mM Tris-HCl(pH 8.0),10mM EDTA,and 0.2mg/ml蛋白酶K(proteinase K)55℃ 3小時後經乙醇沉澱而準備。之後分離的基因體經由CCGG切位之限制酶HpaII(10U)個別地於37℃作用4小時。之後最終的DNA片段經由1%之洋菜膠電泳所分離。為了決定Oct3/4 啟動子區域的甲基化區域，本發明用重亞硫酸鹽(CpGenome DNA modification kit,Chemicon,CA)處理分離的基因體DNA。接著經PCR技術(long template PCR extension kit,Roche,IN)與兩條向前引子(forward primer)5’-GAGGAGTTGA GGGTACTGTG-3’(SEQ.ID.NO.47)及5’-GAGGAGCTGA GGGCACTGTG-3’(SEQ.ID.NO.48)與一相反引子(reverse primer)5’-GTAGAAGTGC CTCTGCCTTC C-3’(SEQ.ID.NO. 49)來分離Oct3/4 五端上游啟動子區域。細胞基因體(100奈克(ng))首先經引子(全部150pmole)混合於1x PCR緩衝液，並加熱至94℃ 4分鐘後直接置於冰上。之後進行25個循環的PCR反應，反應條件如下92℃ 1分鐘；55℃ 1分鐘；以及70℃ 5分鐘。最終的PCR產物經由PCR purification kit(Qiagen,CA)所收集並以等量的ACGT切位之限制酶(5U each)混合進行反應，限制酶包含AclI (AACGTT),BmgBI (CACGTC),PmlI (CACGTG),SnaBI (TACGTA)及HpyCH4IV (ACGT)。最終DNA片段經由3%洋菜膠電泳分離之。

實施例九 微核醣核酸生物晶片分析(MicroRNA Microarray Analysis)

人類PC3及Colo細胞株經美國型態培養收集機構(American Type Culture Collection(ATCC,Rockville,MD))獲得且hpESC細胞經由胰蛋白酶從發明人的手臂由皮膚分離而得。在70%相關性(confluency)之下，小核醣核酸經mir Vana^TM miRNA isolation kit(Ambion,Inc.,Austin,TX)從每株細胞株中分離，如其使用者說明進行實驗。小核醣核酸的純度及品質經由1%甲醛洋菜膠電泳及光譜分析儀(Bio-Rad,Hercules,CA)來評估，之後送至LC Sciences(San Diego,CA)以供微核醣核酸生物晶片分析。每一生物晶片經由一標定Cy3或Cy5之單一樣本或個別標定Cy3或Cy5的樣本方式雜合。消除背景並 標準化(normalization)。對於雙樣本分析(dual sample assay)，p -value計算後，顯現出表現差異超過3倍之轉錄分子。

實施例十 基因生物晶片分析

為了準備經標定之探針(probe)以用來與生物晶片上的基因雜合，將萃取出來之全部核醣核酸(2μg)轉變成雙股cDNA，並使用Superscript Choice system kit(Gibco/BRL,Gaithersburg,MD)及修飾後之oligh(dT)₂₄ -T7啟動子引子(promoter primer)如5'-GGCCAGTGAA TTGTAATACG ACTCACTATA GGGAGGCGG-(dT)₂₄ -3'(SEQ.ID.NO.50)，接續步驟如同其使用者說明步驟。將雙股cDNAs用酚/氯仿(phenol/chloroform)萃取出來後，利用乙醇將之沉澱並再回溶至0.5μg/μl焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate (DEPC))-treated ddH₂ O。而Phase-Lock Gel(5'Prime→3'Prime,Inc.,Boulder,CO)可被用來增加萃取率。而in vitro 轉錄可用T7核醣核酸聚合酶與1μg of cDNA,7.5mM unlabeled ATP and GTP,5mM unlabeled UTP和CTP及2mM biotin-labeled CTP及UTP(biotin-11-CTP,biotin-16-UTP,Enzo Diagnostics)共同於37℃反應4小時產生cRNA，接著cRNA利用RNeasy spin columns(Qiagen,CA)純化。樣品經1%之洋菜膠來證實其尺寸大小，接著於40mM Tris-acetate,pH 8.0,100mM KOAc/30mM MgOAc緩衝液中藉加熱到94℃35分鐘而使cRNA隨機分裂成約50個核苷酸的大 小。

利用四個核苷酸一組之生物晶片(GeneChip U133A&B arrays,Affymetrix,Santa Clara,CA)及U133 plus 2人類基因體之生物晶片(Affymetrix,Santa Clara,CA)，其中總共包含32668個基因可供進行雜合，雜合反應係於200μl之AFFY緩衝液(Affymetrix)於40℃中16小時連續攪動下完成。在雜合反應完成後，生物晶片用200μl之6x SSPE-T緩衝液(1x 0.25M氯化鈉/15mM磷酸鈉，pH 7.6/1mM EDTA/0.005% Triton)潤拭3次並接著用200μl之6x SSPE-T緩衝液於50℃洗一小時。接著用0.5X SSPE-T潤拭兩次及0.5x SSPE-T於50℃沖洗15分鐘。之後用2μg/ml streptavidin-phycoerythrin(Molecular Probes)及1mg/ml acetylated BSA(Sigma)於6x SSPE-T(pH 7.6)緩衝液中進行染色後，將生物晶片置入confocal scanner(Molecular Dynamics)以7.5μm進行判讀並以Affymetrix Microarray Suite version 4.0軟體進行分析。藉由完美配對(perfectly matched)探針與非配對(mismatched)探針之全部的平均差將樣本標準化(normalize)後，收集訊號差異大於兩倍之訊號。

實施例十一 細胞分化測試(Cell Differentiation Assay)

本發明所有的細胞株皆培養於無酚紅(phenol red-free)之DMEM培養液(10%炭吸附的胎牛血清(10% charcoal-stripped fetal bovine serum(FBS)))，在70%相關性(confluency)之下，不 同的賀爾蒙(hormones)及生長因子被各別地添加入細胞培養液中，如50ng/ml DHT、100ng/ml TGF-β1及/或100ng/ml BMP4。經過6到12個小時培養，經處理後的細胞在胰蛋白酶作用下以4份(aliquot)的200μl 1x PBS溶液收集後，立刻殖入6周大無胸腺免疫喪失之SCID米黃色小鼠之頸部皮膚、尾部靜脈、子宮及肝臟中體內。

實施例十二 統計分析

生物晶片結果係被呈現為平均值±SE。這些樣本資料之統計分析藉由one-way ANOVA方式計算。當具有統計上顯著差異時，Dunnett’s post-hoc test被用來辨認與標準具有差異之樣本組。為了在兩組之間進行比對，two-tailed sudentt test係被使用。為了比對超過兩組，ANOVA比對後再由post-hoc multiple range test來進行比對。或然率值p <0.05被認定為具有統計上的意義，所有p 值是藉由two-tailed test來決定。

本發明或申請案檔案包含至少一圖式為彩色。本發明或專利申請案與彩色圖式經請求而提交給相關單位並繳交相關規費。圖1顯示細胞內內含子之微核醣核酸(intronic mircoRNA,miRNA)生成機制。上述內含子之微核醣核酸與先驅訊息核醣核酸共同轉錄並經RNA splicing作用，以形成外顯子而連接為訊息核醣核酸，以供生合成蛋白質。經剪接後的內含子之微核 醣核酸被進一步處理成為成熟之微核醣核酸，以供產生RNAi相關基因靜默效應。因此，我們設計一人造內含子包含至少一先驅微核醣核酸結構(或稱SpRNAi )，以供模擬細胞本身內含子之微核醣核酸之生合成過程(圖3A及圖3B)。SpRNAi 經併入細胞或重組基因中，經第二型聚合酶啟動子或病毒啟動子調控，而由第二型聚合酶系統表現。在細胞內轉錄生成後，經RNA splicing處理後而釋放預先設計之內含子之核醣核酸分子。在其它實施例中，預先設計之內含子之核醣核酸分子可為反意核醣核酸結構，上述反意結構可供基因剔除作用。在其它實施例中，預先設計之內含子之核醣核酸分子可包含部分反意及正股核醣核酸片段以供形成雙股的siRNA並產生RNAi機制。在其它實施例中，預先設計之內含子之核醣核酸分子可為類小夾核醣核酸結構，以供產生RNAi相關基因靜默效應。

圖1顯示細胞內內含子之微核醣核酸(intronic mircoRNA,miRNA)生成機制。

圖2顯示siRNA、外顯子之微核醣核酸(exonic(intergenic)microRNA)及內含子之微核醣核酸(intronic microRNA)路徑機制。

圖3A到3D顯示本發明較佳實施例之SpRNAi-RGFP 重組基因結構化合物(圖3A)(SEQ.ID.NO.32)及其原理(圖3B)以產生一模仿內含子之微核醣核酸(intronic miRNA)之人造微核醣核酸。SpRNAi-RGFP 表現載體於細胞內之測試顯示，直接於 斑馬魚中抑制綠色螢光蛋白有超過85%基因抑制(knockdown)效應，並由西方墨點法證實，如圖3C。而具有能靜默綠色螢光蛋白之內含子之微核醣核酸(intronic miRNA)及其剪接先驅物能經由1%formaldhyde瓊膠電泳並於北方墨點法後被觀察到(圖3D)。

圖4A到4C顯示本發明之SpRNAi-RGFP 結構之不同設計的內含子之核醣核酸介子(intronic RNA insert)的效用評價。有效率的miRNA生合成，及於兩周大之斑馬魚幼魚中有效率地產生綠色螢光蛋白靜默效應，證實了核醣核酸誘導靜默複合體在5’-miRNA*-stemloop-miRNA-3’[1 ]與5’-miRNA-stemloop-miRNA*-3’[2 ]兩種小夾核醣核酸之間，有不對稱之偏好傾向(圖4A)。綠色螢光蛋白之基因靜默只在轉染先驅微核醣核酸結構[2 ]中發現，而不是在轉染結構[1 ]中被發現，而證實其偏好。因綠色螢光蛋白與紅色螢光蛋白的顏色重疊後會呈現紅色大於綠色如圖所顯現之深橘色，因此綠色螢光蛋白的量是遠低於紅色螢光蛋白於先驅微核醣核酸結構[2 ]轉染組，此時載體之指標紅色螢光蛋白則是平均表現地(圖4B)(SEQ.ID.NO.33-35)。用西方墨點法分析綠色螢光蛋白之量，證實在轉染先驅微核醣核酸結構組[2 ]中具有明顯的基因靜默效應(圖4C)。在其他實驗組例如脂質體組(Liposome only(Lipo))、無任何介子之空載體組(Vctr)以及siRNA(siR)組皆無基因靜默效應出現。

圖5A到5C顯示在mir-302-like核醣核酸分子經過轉染表現於人類上皮細胞(hpESC)、人類前列腺癌細胞株(PC3)及人類初始黑色素瘤細胞株(Colo)，導致細胞型態及細胞增生的改變。在mir-302轉染後，表現mir-302的細胞個別稱為hpESC+mir-302、PC3+mir-302及Colo+mir-302，在mir-gfp轉染後(mir-gfp為靜默綠色螢光蛋白的序列)，表現mir-gfp的細胞個別稱為hpESC+mir-gfp、PC3+mir-gfp及Colo+mir-gfp。

圖6A到6E顯示Colo及PC3細胞株轉染mir-302之胚胎幹細胞特性。這些特性包含形成胚樣體(embryoid body)，如圖6A所示。Oct3/4、SSEA-3及SSEA-4等蛋白之西方墨點法分析，如圖6B。基因體的去甲基化分析，如圖6C。CpG去甲基化分析，如圖6D。及細胞位移，如圖6E。

圖7A到7B顯示微核醣核酸生物晶片分析，證實mir-302家族全部高度表現於Colo+mir-302細胞中。

圖8A到8B顯示在Colo+mir-302細胞中基因晶片的分析結果(Affymetrix human GeneChip U133A & B,CA)，結果顯示，與人類胚胎幹細胞HuEC8及H9細胞的基因表現狀態相比，有許多胚胎幹細胞的標誌(marker)基因有顯著地上升，而癌症及發育基因的表現則有顯著地下降。

圖9A到9C顯示具有紅色螢光蛋白之Colo+mir-302細胞能分化為許多細胞型態，例如，原始軟骨細胞、纖維母細胞及生殖細胞。在處理過不同發育訊號物質(如，不同的賀爾蒙及/ 或生長因子)後，證實其分化多能性相似於那些胚胎幹細胞。

圖10為生物晶片(Affymetrix U133 plus 2 human genome genechips)的資料，其顯示SSEA-1係表現在Colo+mir-302細胞，然而Klf4基因則不表現。此外，許多標準人類胚胎幹細胞標誌細高度表達於Colo+mir-302細胞而非原本的Colo細胞，例如，Oct4、Sox2、Nanog、Utf1、Rex1、SALL2及SALL4，此結果呼應圖8B的實驗結果。

<110> LIN,Shi-Lung,et al.林希龍等人

<120> 使用內含子之核醣核酸於生成類胚胎幹細胞/Generation of Human Embryonic Stem-Like Cells Using Intronic RNA

<130> 5199-0138PUS1

<140> 098114452

<141> 2009-04-30

<160> 50

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 12

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 1

<210> 2

<211> 12

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 2

<210> 3

<211> 17

<212> RNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 3

<210> 4

<211> 8

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 4

<210> 5

<211> 10

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 5

<210> 6

<211> 7

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 6

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 7

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> n is a,c,g,or t

<400> 8

<210> 9

<211> 23

<212> RNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 9

<210> 10

<211> 23

<212> RNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 10

<210> 11

<211> 23

<212> RNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 11

<210> 12

<211> 23

<212> RNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 12

<210> 13

<211> 23

<212> RNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 13

<210> 14

<211> 42

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 14

<210> 15

<211> 46

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 15

<210> 16

<211> 42

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 16

<210> 17

<211> 46

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 17

<210> 18

<211> 70

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 18

<210> 19

<211> 74

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 19

<210> 20

<211> 47

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 20

<210> 21

<211> 45

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 21

<210> 22

<211> 689

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 藉由從海葵(Heteractis crispa )衍生來之HcRed1彩色蛋白質基因(chromoprotein gene)於第69個胺基酸插入天門冬胺酸(aspartate(Asp))而生成之突變紅色螢光蛋白基因

<400> 22

<210> 23

<211> 27

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 23

<210> 24

<211> 27

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 24

<210> 25

<211> 89

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 25

<210> 26

<211> 89

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 26

<210> 27

<211> 82

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 27

<210> 28

<211> 82

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 28

<210> 29

<211> 11

<212> RNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 29

<210> 30

<211> 10

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 30

<210> 31

<211> 12

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 31

<210> 32

<211> 65

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 32

<210> 33

<211> 53

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 33

<210> 34

<211> 54

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 34

<210> 35

<211> 53

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 35

<210> 36

<211> 25

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 36

<210> 37

<211> 26

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 37

<210> 38

<211> 21

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 38

<210> 39

<211> 91

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 39

<210> 40

<211> 91

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 40

<210> 41

<211> 95

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 41

<210> 42

<211> 95

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 42

<210> 43

<211> 89

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 43

<210> 44

<211> 89

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 44

<210> 45

<211> 82

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 45

<210> 46

<211> 82

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 46

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 47

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 48

<210> 49

<211> 21

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 49

<210> 50

<211> 63

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 化學合成寡核苷酸

<400> 50

Claims (62)

1. 一種生成哺乳類類幹細胞的方法，包含以下步驟：a.建構一基因重組核酸化合物(recombinant nucleic acid composition)，該基因重組核酸化合物包含至少一具有一類mir-302之基因靜默效應物(mir-302-like gene-silencing effector)之一內含子(intron)，該內含子與至少一外顯子(exon)連接，其中該內含子經切除後與該外顯子分離以供誘發一mir-302介導之基因靜默效應(RNA-mediated gene silencing)；b.裁接(cloning)該基因重組核酸化合物至一表現載體；以及c.轉染該表現載體進入複數個哺乳類細胞中，其中該等哺乳類細胞產生複數個該基因重組核酸化合物之前驅核醣核酸轉錄分子(primary RNA transcript)，該內含子並分離於該前驅核醣核酸轉錄分子；其中包含該內含子之類mir-302之基因靜默效應物誘發的該mir-302介導之基因靜默效應引致基因體的去甲基化以及Oct3/4 基因表現的活化，因而造成該等哺乳類細胞轉化(reprogram)成複數個類幹細胞之分化多能性細胞(stem cell-like pluripotent cells)；其中該些類幹細胞之分化多能性細胞的基因表現型態與幹細胞之基因表現型態具有超過53%的相似性。
2. 如請求項1所述之生成哺乳類類幹細胞的方法，其中該哺乳 類細胞包含人類細胞。
3. 如請求項1所述之生成哺乳類類幹細胞的方法，其中該哺乳類細胞包含體細胞(somatic cell)。
4. 如請求項1所述之生成哺乳類類幹細胞的方法，其中該哺乳類細胞包含癌化細胞(cancerous cell)。
5. 如請求項1所述之生成哺乳類類幹細胞的方法，其中該內含子之該類mir-302之基因靜默效應物包含一合成DNA序列。
6. 如請求項1所述之生成哺乳類類幹細胞的方法，進一步包含一合成該內含子或該外顯子以及兩者之部分核酸序列的步驟。
7. 如請求項1所述之生成哺乳類類幹細胞的方法，其中該基因重組核酸化合物包含一基因重組的細胞內基因(recombinant cellular gene)。
8. 如請求項1所述之生成哺乳類類幹細胞的方法，其中該基因重組核酸化合物包含一基因重組的基因(recombinant gene)，其衍生於選自綠色螢光蛋白基因(GFP gene)、病毒基因、哺乳類基因、跳躍基因、轉位子及以上基因之混合基因。
9. 如請求項1所述之生成哺乳類類幹細胞的方法，其中該內含子經由一遺傳工程方法所建構，該遺傳工程方法選自DNA限制酶處理及連接(DNA restriction and ligation)、同源基因重組(homologuous recombination)、轉殖基因併入(transgene incorportation)、轉位子插入(transposon insertion)、跳躍基因整併(jumping gene integration)、反轉錄病毒感染(retroviral infection) 以及上述方法混合之方法。
10. 如請求項1所述之生成哺乳類類幹細胞的方法，其中該內含子包含一核酸序列，該核酸序列包含一內含子介子(intronic insert)，該介子包含該類mir-302之基因靜默效應物、一分支點區、一多嘧啶區、一五端剪接處(donor splice site)及一三端剪接處(acceptor splice site)。
11. 如請求項10所述之生成哺乳類類幹細胞的方法，其中該內含子介子包含一類小夾(hairpin-like)核酸序列，該序列包含一同源於SEQ.ID.NO.1或SEQ.ID.NO.2的彎折結構(stem loop structure)。
12. 如請求項10所述之生成哺乳類類幹細胞的方法，其中該內含子介子包含一核酸序列，該序列包含一同源或互補或兩者皆是的方式於SEQ.ID.NO.3。
13. 如請求項10所述之生成哺乳類類幹細胞的方法，其中該內含子介子包含一類小夾先驅微核醣核酸(hairpin-like precursor microRNA(pre-miRNA))序列，該序列包含一核酸序列選自SEQ.ID.NO.9、SEQ.ID.NO.10、SEQ.ID.NO.11、SEQ.ID.NO.12及SEQ.ID.NO.13。
14. 如請求項10所述之生成哺乳類類幹細胞的方法，其中該內含子介子經由至少一限制酶切位併入於該內含子，該限制酶切位選自AatII、AccI、AflII/III、AgeI、ApaI/LI、AseI、Asp718I、BamHI、BbeI、BclI/II、BglII、BsmI、Bsp120I、BspHI/LU11I/120I、 BsrI/BI/GI、BssHII/SI、BstBI/U1/XI、ClaI、Csp6I、DpnI、DraI/II、EagI、Ecl136II、EcoRI/RII/47III、EheI、FspI、HaeIII、HhaI、HinPI、HindIII、HinfI、HpaI/II、KasI、KpnI、MaeII/III、MfeI、MluI、MscI、MseI、NaeI、NarI、NcoI、NdeI、NgoMI、NotI、NruI、NsiI、PmlI、Ppu10I、PstI、PvuI/II、RsaI、SacI/II、SalI、Sau3AI、SmaI、SnaBI、SphI、SspI、StuI、TaiI、TaqI、XbaI、XhoI、XmaI 及上述切位混合之切位。
15. 如請求項10所述之生成哺乳類類幹細胞的方法，其中該分支點區包含一分支點，而該分支點係一腺核苷(adenosine,A)並位於一核酸序列，該核酸序列包含或同源於SEQ.ID.NO.6。
16. 如請求項10所述之生成哺乳類類幹細胞的方法，其中該分支點區包含一分支點，而該分支點係一腺核苷(adenosine,A)並位於一核酸序列，該核酸序列包含至少一同源於5’-TACTAAC-3’之寡核苷酸區(oligonucleotide motif)。
17. 如請求項10所述之生成哺乳類類幹細胞的方法，其中該多嘧啶區包含一具有高密度的胸腺嘧啶(Thymine)與胞嘧啶(Cytosine)之核酸序列，該核酸序列包含或同源於SEQ.ID.NO.7或SEQ.ID.NO.8。
18. 如請求項10所述之生成哺乳類類幹細胞的方法，其中該五端剪接處包含一核酸序列，該核酸序列包含或同源於SEQ.ID.NO.4。
19. 如請求項10所述之生成哺乳類類幹細胞的方法，其中該五 端剪接處包含一核酸序列，該核酸序列包含或同源於5’-GTAAG-3’。
20. 如請求項10所述之生成哺乳類類幹細胞的方法，其中該三端剪接處包含一核酸序列，該核酸序列包含或同源於SEQ.ID.NO.5。
21. 如請求項10所述之生成哺乳類類幹細胞的方法，其中該三端剪接處包含一核酸序列，該核酸序列包含或同源於5’-CTGCAG-3’。
22. 如請求項1所述之生成哺乳類類幹細胞的方法，其中該類mir-302之基因靜默效應物包含一核酸序列，該核酸序列包含同源或互補或兩者皆是的方式於SEQ.ID.NO.3。
23. 如請求項1所述之生成哺乳類類幹細胞的方法，其中該類mir-302之基因靜默效應物包含一核酸序列，該核酸序列包含SEQ.ID.NO.10、SEQ.ID.NO.11、SEQ.ID.NO.12及/或SEQ.ID.NO.13。
24. 如請求項1所述之生成哺乳類類幹細胞的方法，其中該類mir-302之基因靜默效應物包含一核酸序列，該核酸序列包含SEQ.ID.NO.9。
25. 如請求項1所述之生成哺乳類類幹細胞的方法，其中該表現載體選自DNA轉殖基因(DNA transgene)、質體(plasmid)、轉位子(transposon)、反轉位子(retrotransposon)、跳躍基因、病毒載體及上述載體混合之載體。
26. 如請求項1所述之生成哺乳類類幹細胞的方法，其中該表現載體包含一病毒啟動子或一第二型RNA聚合酶(Pol-II)啟動子或兩者、一Kozak轉譯起始處、多腺苷酸化作用信號及複數個限制酶切位。
27. 如請求項26所述之生成哺乳類類幹細胞的方法，其中該等限制酶切位包含一可供內切酶作用之寡核苷酸切位，該切位選自AatII、AccI、AflII/III、AgeI、ApaI/LI、AseI、Asp718I、BamHI、BbeI、BclI/II、BglII、BsmI、Bsp120I、BspHI/LU11I/120I、BsrI/BI/GI、BssHII/SI、BstBI/U1/XI、ClaI、Csp6I、DpnI、DraI/II、EagI、Ecl136II、EcoRI/RII/47III、EheI、FspI、HaeIII、HhaI、HinPI、HindIII、HinfI、HpaI/II、KasI、KpnI、MaeII/III、MfeI、MluI、MscI、MseI、NaeI、NarI、NcoI、NdeI、NgoMI、NotI、NruI、NsiI、PmlI、Ppu10I、PstI、PvuI/II、RsaI、SacI/II、SalI、Sau3AI、SmaI、SnaBI、SphI、SspI、StuI、TaiI、TaqI、XbaI、XhoI、XmaI 及上述切位混合之切位。。
28. 如請求項26所述之生成哺乳類類幹細胞的方法，其中該載體進一步包含一pUC複製起始子(origin of replication)、一於原核細胞具有表現至少一抗抗生素基因(antibiotic resistance gene)之一SV40初期(early)啟動子以及一於該哺乳類細胞之任意的(optional)SV40複製起始子(origin for replication)。
29. 如請求項28所述之生成哺乳類類幹細胞的方法，其中該抗抗生素基因可對抗選自青黴素G(penicillin G)、安比西林 (ampicillin)、新黴素(neomycin)、巴龍黴素(paromycin)、康黴素(kanamycin)、鏈黴素(streptomycin)、紅黴素(erythromycin)、斯派克黴素(spectromycin)、霍火黴素(phophomycin)、四環素(tetracycline)、利福黴素(rifapicin)、兩性黴素B(amphotericin B)、健他黴素(gentamycin)、氯黴素(chloramphenicol)、頭孢黴素(cephalothin)、泰黴素(tylosin)、G418及上述抗生素混合之抗生素。
30. 如請求項1所述之生成哺乳類類幹細胞的方法，其中該表現載體經一基因轉染方法送入該哺乳類細胞，該基因轉染方法選自脂質體轉染法(liposomal transfection)、化學轉染法(chemical transfection)、轉殖基因DNA重組法、病毒感染法(viral infection)、轉位子傳遞法(transposon insertion)、跳躍基因轉染法(jumping gene transfection)、微注射法(micro-injection)、電穿孔法(electroporation)、基因槍法(gene-gun penetration)及上述方法混合之方法。
31. 如請求項1所述之生成哺乳類類幹細胞的方法，其中該基因重組核酸化合物之該前驅核醣核酸轉錄分子(primary RNA transcript)係經由一轉錄機制而產生，該轉錄機制選自第二型核醣核酸聚合酶轉錄機制、第三型核醣核酸聚合酶轉錄機制、第一型核醣核酸聚合酶轉錄機制及病毒核醣核酸聚合酶轉錄機制。
32. 如請求項1所述之生成哺乳類類幹細胞的方法，其中該基因 重組核酸化合物之該前驅核醣核酸轉錄分子包含一核醣核苷酸序列，該核醣核苷酸序列選自訊息核醣核酸(mRNA)、異質核核醣核酸(hnRNA)、核醣體核醣核酸(rRNA)、轉介核醣核酸(tRNA)、(snoRNA)、小胞核核醣核酸(snRNA)、先驅微核醣核酸(pre-microRNA)、病毒核醣核酸(viral RNA)及上述核醣核酸之衍生物及先驅物(precursors)。
33. 如請求項1所述之生成哺乳類類幹細胞的方法，其中該類mir-302之基因靜默效應物係經一內含子切除機制(intron excision mechanism)從該內含子中釋出，該內含子切除機制選自核醣核酸剪接系統(RNA splicing)、外體解消(exosome digestion)及無義介導降解(NMD processing)系統。
34. 如請求項1所述之生成哺乳類類幹細胞的方法，其中該mir-302介導之基因靜默效應係由細胞內後轉錄基因靜默(intracellular posttranscriptional gene silencing)、轉譯抑制(translational suppression)、核醣核酸干擾(RNA interference)及/或無義介導降解等機制導致。
35. 如請求項1所述之生成哺乳類類幹細胞的方法，其中該類幹細胞之分化多能性細胞表現mir-302微核醣核酸。
36. 如請求項1所述之生成哺乳類類幹細胞的方法，其中該類幹細胞之分化多能性細胞表現胚胎幹細胞指標蛋白(marker)Oct3/4、SSEA-3 及SSEA-4 。
37. 如請求項1所述之生成哺乳類類幹細胞的方法，其中該類幹 細胞之分化多能性細胞培養於無哺乳細胞(feeder-free)的培養環境。
38. 如請求項1所述之生成哺乳類類幹細胞的方法，其中該類幹細胞之分化多能性細胞培養於DMEM(10%炭吸附小牛血清(FBS))的培養環境。
39. 如請求項1所述之生成哺乳類類幹細胞的方法，其中該類幹細胞之分化多能性細胞能分化為類生殖細胞(germ line-like cell)。
40. 如請求項1所述之生成哺乳類類幹細胞的方法，其中該類幹細胞之分化多能性細胞能分化為類精原細胞(spermatogonia-like cell)。
41. 如請求項1所述之生成哺乳類類幹細胞的方法，其中該類幹細胞之分化多能性細胞能分化為類纖維母細胞(fibroblast-like cell)。
42. 如請求項1所述之生成哺乳類類幹細胞的方法，其中該類幹細胞之分化多能性細胞能分化為類軟骨細胞(chodrocyte-like cell)。
43. 如請求項1所述之生成哺乳類類幹細胞的方法，其中該類幹細胞之分化多能性細胞能分化為類胚樣體細胞群(embryoid body-like colony)。
44. 如請求項1所述之生成哺乳類類幹細胞的方法，其中該類mir-302之基因靜默效應物同源於mir-93、mir-367、mir-371、 mir-372、mir-373及mir-520及特定標定基因。
45. 如請求項1所述之生成哺乳類類幹細胞的方法，其中該類幹細胞之分化多能性細胞經利用mir-302微核醣核酸作為篩選標的而選擇性地分離。
46. 一種用於生成哺乳類類幹細胞之基因重組核酸化合物，包含：至少一內含子，包含一類mir-302之基因靜默效應物，用以於哺乳類細胞中藉由誘發一mir-302介導之基因靜默效應，引致基因體的去甲基化與Oct3/4 基因表現的活化，以及造成該哺乳類細胞轉化成類幹細胞之分化多能性細胞；該類幹細胞之分化多能性細胞的基因表現型態與幹細胞之基因表現型態具有超過53%的相似性；其中該內含子與至少一外顯子連接，該內含子經切除後與該外顯子分離以供誘發一mir-302介導之基因靜默效應，該等外顯子相互連接而具有蛋白質表達功能。
47. 如請求項46所述之基因重組核酸化合物，其中該內含子包含：(a)一具有該類mir-302之基因靜默效應物之內含子介子；(b)一五端剪接處及一三端剪接處；(c)一分支點區；以及(d)至少一多嘧啶區。
48. 如請求項47所述之基因重組核酸化合物，其中該內含子介 子包含一類小夾核酸序列(hairpin-like nucleic acid sequence)，該序列包含一同源於SEQ.ID.NO.1或SEQ.ID.NO.2的彎折結構。
49. 如請求項47所述之基因重組核酸化合物，其中該內含子介子包含一核酸序列，該序列包含一同源或互補或兩者皆是的方式於SEQ.ID.NO.3。
50. 如請求項47所述之基因重組核酸化合物，其中該內含子介子包含一類小夾先驅微核醣核酸(hairpin-like precursor microRNA(pre-miRNA))序列，該序列包含一核酸序列選自SEQ.ID.NO.9、SEQ.ID.NO.10、SEQ.ID.NO.11、SEQ.ID.NO.12及SEQ.ID.NO.13。
51. 如請求項47所述之基因重組核酸化合物，其中該內含子介子經由至少一限制酶切位併入於該內含子，該限制酶切位選自AatII、AccI、AflII/III、AgeI、ApaI/LI、AseI、Asp718I、BamHI、BbeI、BclI/II、BglII、BsmI、Bsp120I、BspHI/LU11I/120I、BsrI/BI/GI、BssHII/SI、BstBI/U1/XI、ClaI、Csp6I、DpnI、DraI/II、EagI、Ecl136II、EcoRI/RII/47III、EheI、FspI、HaeIII、HhaI、HinPI、HindIII、HinfI、HpaI/II、KasI、KpnI、MaeII/III、MfeI、MluI、MscI、MseI、NaeI、NarI、NcoI、NdeI、NgoMI、NotI、NruI、NsiI、PmlI、Ppu10I、PstI、PvuI/II、RsaI、SacI/II、SalI、Sau3AI、SmaI、SnaBI、SphI、SspI、StuI、TaiI、TaqI、XbaI、XhoI、XmaI 及上述切位混合之切位。
52. 如請求項47所述之基因重組核酸化合物，，其中該分支點 區包含一分支點，而該分支點係一腺核苷(adenosine,A)並位於一核酸序列，該核酸序列包含或同源於SEQ.ID.NO.6。
53. 如請求項47所述之基因重組核酸化合物，其中該分支點區包含一分支點，而該分支點係一腺核苷(adenosine,A)並位於一核酸序列，該核酸序列包含至少一同源於5’-TACTAAC-3’之寡核苷酸區(oligonucleotide motif)。
54. 如請求項47所述之基因重組核酸化合物，其中該多嘧啶區包含一具有高密度的胸腺嘧啶(Thymine)與胞嘧啶(Cytosine)之核酸序列，該核酸序列包含或同源於SEQ.ID.NO.7或SEQ.ID.NO.8。
55. 如請求項47所述之基因重組核酸化合物，其中該五端剪接處包含一核酸序列，該核酸序列包含或同源於SEQ.ID.NO.4。
56. 如請求項47所述之基因重組核酸化合物，其中該五端剪接處包含一核酸序列，該核酸序列包含或同源於5’-GTAAG-3’。
57. 如請求項47所述之基因重組核酸化合物，其中該三端剪接處包含一核酸序列，該核酸序列包含或同源於SEQ.ID.NO.5。
58. 如請求項47所述之基因重組核酸化合物，其中該三端剪接處包含一核酸序列，該核酸序列包含或同源於5’-CTGCAG-3’。
59. 如請求項46所述之基因重組核酸化合物，其中該類mir-302之基因靜默效應物包含一核酸序列，該核酸序列包含同源或互補或兩者皆是的方式於SEQ.ID.NO.3。
60. 如請求項46所述之基因重組核酸化合物，其中該類mir-302之基因靜默效應物包含一核酸序列，該核酸序列包含 SEQ.ID.NO.10、SEQ.ID.NO.11、SEQ.ID.NO.12及/或SEQ.ID.NO.13。
61. 如請求項46所述之基因重組核酸化合物，其中該類mir-302之基因靜默效應物包含一核酸序列，該核酸序列包含SEQ.ID.NO.9。
62. 一種生成哺乳類類幹細胞的方法，包含以下步驟：a.建構一基因重組核酸化合物，該基因重組核酸化合物包含至少一具有一微型核醣核酸之基因靜默效應物之一內含子，該內含子與至少一外顯子連接，其中該內含子經切除後與該外顯子分離以供誘發一該微型核醣核酸介導之基因靜默效應；b.裁接該基因重組核酸化合物至一表現載體；以及c.轉染該表現載體進入複數個哺乳類細胞中，其中該等哺乳類細胞產生複數個該基因重組核酸化合物之前驅核醣核酸轉錄分子，該內含子並分離於該前驅核醣核酸轉錄分子；其中包含該微型核醣核酸之基因靜默效應物誘發的該微型核醣核酸介導之基因靜默效應引致基因體的去甲基化以及Oct3/4 基因表現的活化，因而造成該等哺乳類細胞轉化成複數個類幹細胞之分化多能性細胞；其中該些類幹細胞之分化多能性細胞的基因表現型態與幹細胞之基因表現型態具有超過53%的相似性。