KR20220111322A - 표적 rna를 편집하기 위한 기능성 영역을 부가한 안티센스형 가이드 rna - Google Patents

표적 rna를 편집하기 위한 기능성 영역을 부가한 안티센스형 가이드 rna Download PDF

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KR20220111322A
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에이지 요시미
유카리 모리야
마리코 만다
다카야스 고토
다카토모 아라이
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아스텔라스세이야쿠 가부시키가이샤
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Abstract

과제: 표적 RNA를 ADAR에 의해 편집하기 위한 안티센스형 가이드 RNA의 제공.
해결 수단: 표적 RNA를 ADAR에 의해 편집하기 위한 안티센스형 가이드 RNA로서, 적어도 1개의 기능성 영역 및 해당 표적 RNA의 일부에 상보적이며 표적 RNA와 2본쇄를 형성할 수 있는 안티센스 영역을 포함하고, 적어도 1개의 해당 기능성 영역이 해당 안티센스 영역에 연결되어 있고, 해당 가이드 RNA가 ADAR 리크루트 염기 서열을 실질적으로 포함하지 않는, 가이드 RNA.
선택도: 없음

Description

표적 RNA를 편집하기 위한 기능성 영역을 부가한 안티센스형 가이드 RNA
본 발명은, ADAR을 유도하여 표적 RNA 편집을 행하기 위한 가이드 RNA, 특히, 기능성 영역을 부가한 안티센스형 가이드 RNA에 관한 것이다.
생체내에서는 일 염기 변이에 의한 RNA 편집 기구가 존재한다. 특히, 아데노신의 탈아미노화에 의해 아데노신을 이노신으로 변환하는 A로부터 I로의 RNA 편집은 가장 많이 관찰되고, 표적이 되는 RNA의 수는 400만에나 달한다. 2본쇄 RNA를 기질로 하여 아데노신으로부터 이노신으로의 변환을 행하는 효소로서, ADAR(adenosine deaminase acting on RNA)이 알려져 있다. ADAR에는 유전자가 상이한 3개의 서브타입(ADAR1, ADAR2, ADAR3)이 존재하고 있고, ADAR은, 그 N 말단에는 2본쇄 RNA 결합 도메인을, C 말단에는 데아미나아제 도메인을 갖는다. ADAR2는, 특히 중추 신경계에 있어서, 3-아미노-3-하이드록시-5-메틸-4-아이소옥사졸 프로피온산(AMPA)형 글루탐산 수용체를 구성하는 서브유닛인 GluR2를 높은 효율로 편집한다(Nature, 1996, Vol. 379, pp. 460-464). 아데노신으로부터 변환된 이노신은, 구아노신과 유사한 구조이므로, 번역의 단계에서는 구아노신으로 인식되기 때문에, 결과로서 코딩 영역에 아미노산의 변이를 도입하는 경우가 있다. 비코딩 영역의 ADAR의 기질로서는, 레트로트랜스포존(FEBS Letters, 2006, Vol. 580, pp. 2301-2305)이나 마이크로RNA(miRNA) 전구체도 보고되어 있고, ADAR이 생체내에서 다양한 기능을 담당하고 있을 가능성이 시사되어 있다(Annu. Rev. Biochem., 2010, Vol. 79, pp. 321-349).
인공적으로 변이를 도입한 ADAR의 개변체도 보고되어 있다. 예를 들면, ADAR에 변이를 도입하는 것에 의해, 아데노신뿐만 아니라 사이티딘도 인식할 수 있고, 사이티딘의 탈아미노화에 의해 사이티딘이 유리딘으로 변화하는 C로부터 U로의 RNA 편집도 행할 수 있는, ADAR의 개변체가 보고되어 있다(Science, 2019, Vol. 365, pp. 382-386).
근년, 야생형 ADAR과 인공 가이드 RNA를 이용한 RNA 편집으로서, GluR2 유래의 ADAR 리크루트 염기 서열(ADAR-recruiting base sequence)을 포함하는 표적 RNA를 편집하기 위한 가이드 RNA가 몇 가지 보고되어 있다(국제 공개 제2016/097212호, 국제 공개 제2017/050306호, 국제 공개 제2017/010556호, 국제 공개 제2019/111957호, Nucleic Acids Research, 2017, Vol. 45, pp. 2797-2808, Nature Methods, 2019, Vol. 16, pp. 239-242).
또한, 인공 합성 핵산인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 가이드 RNA로서 이용한 RNA 편집 기술로서, 편집 표적인 아데노신을 포함하는 mRNA에 상보적인 35염기 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용하여, mRNA와 불완전 헬릭스 구조의 2본쇄를 형성하여 ADAR을 리크루트함으로써, 표적 RNA를 편집하는 기술도 보고되어 있다(특허문헌 1 내지 3). 또, 100염기 이상의 인공 RNA를 이용하여 ADAR에 의한 표적 RNA의 편집을 유도할 수 있는 것도 보고되어 있다(비특허문헌 1). 게다가, ADAR1 데아미나아제 도메인-MS2 코트 단백질(MCP)의 융합 단백질과, 안티센스-MS2 RNA의 콘주게이트 시스템에 의한 표적 RNA의 편집도 보고되어 있다(비특허문헌 2).
이와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용한 RNA 편집에 대해서는 몇 가지 보고가 있다. 그러나, 표적 RNA 편집 가이드 RNA를 의약품으로서 사용하기 위해서는, 세포에서 일정한 편집 효율을 나타내는 것이 필요하지만, 편집 효율이 높은 RNA 편집 기술에 대해서는 충분히 검토되어 있지 않다.
한편, 핵내 저분자 RNA(snRNA: small nuclear RNA), 리보솜 RNA(rRNA: ribosomal RNA), 구아닌 사중쇄 구조나 스템-루프 구조 등의 고차 구조를 갖는 RNA 등의 각종 기능을 갖는 RNA 서열이 알려져 있고, 그 중 몇 개에 대해서는, 가이드 RNA 등의 RNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 부가하는 것도 보고되어 있다.
진핵생물에 있어서, snRNA는, 리보핵단백질(RNP)을 개재시켜 전구체 메신저 RNA(pre-mRNA)의 스플라이싱이나 프로세싱에 작용한다. 특히 5종류의 snRNP(U1, U2, U4, U5, U6)는 스플라이싱에 관련되는 스플라이소솜(spliceosome)을 구성하고 있고, snRNA는 진핵생물의 거의 모든 세포에서 대량으로 안정적으로 발현하고 있다(Biological Chemistry, 2018, Vol. 399, pp. 1265-1276).
U6 snRNA는, 모든 인간 세포에 있어서 안정적으로 대량으로 발현하고, 핵 내에서 리보핵단백질 U6 snRNP를 형성한다. U6 snRNP는 스플라이소솜을 구성하여, RNA 전구체에 있어서의 스플라이싱을 제어한다. U6 snRNA 유전자 상류의 전사 개시 엘리먼트는, 임의의 RNA(리보자임, 안티센스 리보핵산, RNA 앱타머 등)를 발현시키는 강력한 폴리머라아제 III(polIII)형 프로모터로서 알려져 있다(비특허문헌 3). 비특허문헌 3 내지 5에서는, U6을 코딩하는 서열로 만들어지는 저분자 RNA(small RNA) 발현 카세트(이하, 비특허문헌 3 내지 5에 기재된 U6을 코딩하는 서열을 포함하는 발현 카세트를 "U6 카세트"라고 칭한다)는, U6 서열의 고차 구조가 기능하여, 삽입한 RNA를 핵 내에 국재시키는 것이 보고되어 있다. U6 카세트는 small RNA를 안정적이고 강력하게 발현시키는 고안으로서, poly(U) 터미네이터 서열 직전에 인공 스템-루프 서열을 포함한다. RNA 서열 UNCG로 형성되는 테트라루프를 포함하는 인공 스템-루프 서열은, 열역학적으로 가장 안정된 스템-루프 구조를 취한다(Nucleic Acids Research, 1991, Vol. 19, pp. 5901-5905). 안정된 스템-루프 구조는 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성에 대한 내성을 나타내어, U6 카세트의 전사산물을 안정화시키는 것이 시사되어 있다(비특허문헌 3 내지 5).
U1 snRNA는 스플라이싱 도너 서열(엑손의 3'와 인트론의 5'의 정크션)에 상보적인 서열과 클로버 유사 구조를 취하는 서열로 이루어진다. U1 snRNA의 스플라이싱 도너 서열을 표적 유전자의 안티센스 서열로 치환한 키메라 U1 snRNA는, 엑손 스키핑을 유도할 수 있는 것이 알려져 있다(Mol. Ther., 2010, Vol. 18, pp. 1675-1682, Proc. Nat. Acad. Sci., 2002, Vol. 99, pp. 9456-9461). U1 snRNA 유전자 상류 400염기의 서열은 polII형 프로모터를 포함하고, 키메라 U1 snRNA의 전사에도 이용된다(Mol. Ther., 2004, Vol. 10, pp. 191-199).
U7 snRNA는 히스톤 pre-mRNA의 프로세싱을 담당한다. U7 snRNA는 히스톤 3의 pre-mRNA의 상보 서열, Sm 단백질 결합 사이트, 및 스템-루프 서열로 이루어진다. Sm 단백질 결합 사이트는 변이를 가함으로써, 본래의 Lsm 단백질이 아니라 스플라이소솜을 형성하는 D1, D2 단백질과의 결합능을 갖게 된다(Cell. Mol. Life Sci., 2004, Vol. 61, pp. 2560-2570). 표적 유전자의 안티센스 서열, 변이 Sm 단백질 결합 사이트, 및 스템-루프 서열로 구성되는 변이 키메라 U7 snRNA는, 엑손 스키핑을 유도할 수 있는 것이 보고되어 있다(Nat. Med., 2014, Vol. 20, pp. 992-1000). U7 snRNA 유전자 상류 270염기의 서열은 폴리머라아제 II(polII)형 프로모터를 포함하고, 변이 키메라 U7 snRNA의 전사에도 이용된다(Science, 2004, Vol. 306, pp. 1796-1799).
리보솜은 세포 내에서 단백질을 합성하는 세포 소기관이며, 2개의 서브유닛으로 구성된다. 진핵생물의 라지 서브유닛은 28S, 5.8S, 및 5S의 rRNA와 여러 가지 단백질로 이루어지고, 핵소체에서 집합한 후 세포질로 수송된다. 5S rRNA는, 5개의 헬릭스와 5개의 루프로 이루어지는 2차 구조를 취한다. 비특허문헌 5에서는, 5S rRNA 서열을 포함하는 안티센스 서열의 발현 카세트를 사용하여, 5S 유전자 상류의 polIII형 프로모터로부터 5S rRNA와 연결된 안티센스 서열을 전사하면, 세포질에 국재하는 것이 보고되어 있다(이하, 비특허문헌 5에 기재된 5S rRNA를 포함하는 발현 카세트를 "5S 카세트"라고 칭한다). 5S 카세트는 U6 카세트와 마찬가지로, 터미네이터 서열 직전에 인공 스템-루프 서열을 가진다.
구아닌 사중쇄(Gq: G-quadruplex) 구조는, 생체내의 환경에 있어서, 열역학적으로 안정적인 DNA 또는 RNA 고차 구조로서 알려져 있는, 구아닌을 포함하는 반복 서열이다. 고차 구조의 형성에는 1가 양이온을 필요로 한다. Gq는, 원래 텔로미어에 보이는 서열로서 보고되었다(Cell, 1989, Vol. 59, pp. 871-880). Gq의 기능으로서는, 전사 번역이나 에피게놈 제어 등이 알려져 있다(EMBO Reports, 2015, Vol. 16, pp. 910-922). Cas9의 가이드 RNA에 대해서는, 그 3' 말단에 Gq를 부가함으로써, 게놈 편집 효율이 향상되는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 6). 또한, 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 Gq를 부가함으로써, RNA 분해 효소에 의한 유전자 발현 억제의 효율을 상승시키는 것이 보고되어 있다(특허문헌 4).
small RNA에서 발견되는 핵산의 고차 구조인 스템-루프 구조는, 번역 조절 기능에 기여하는 것이 알려져 있다(Cell. Mol. Life Sci., 2006, Vol. 63, pp. 901-908). λ 파지 유래의 BoxB 서열은 스템-루프 구조를 취하고, λN 단백질과 강력한 어피니티를 나타낸다(Biol. Cell., 2008, Vol. 100, pp. 125-138, J. Am. Chem. Soc., 2002, Vol. 124, pp. 10966-10967). 이 성질을 이용하여, 가이드 RNA에 ADAR을 리크루트시키기 위해서, 가이드 RNA에 BoxB 서열을 부가하고, ADAR에 λN 단백질을 융합시키는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 7). 또한, 특허문헌 5에는, GluR2의 서열에 기초하여 설계된 가이드 RNA를 안정화시키기 위해서, 가이드 RNA의 3' 말단에 BoxB 서열을 부가할 수 있는 것이 기재되어 있지만, 비특허문헌 8에는, 가이드 RNA로의 BoxB 서열의 부가에 의한 안정화의 효과는 미소하였던 것이 기재되어 있다.
이와 같이, 각종 기능을 갖는 RNA 서열이 보고되어 있지만, 표적 RNA를 편집하는 가이드 RNA의 편집 활성에 기여하기 위해서 기능을 갖는 RNA 서열을 부가하는 것은 보고되어 있지 않다.
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Nat. Biotechnol., 2019, Vol. 37, pp. 1059-1069 Protein Eng. Des. Sel., 2018, Vol. 1, pp. 471-478 Gene Ther., 1997, Vol. 4, pp. 45-54 Nat. Biotechnol., 2002, Vol. 20, pp. 505-508 Mol. Ther., 2003, Vol. 7, pp. 237-247 Chem. Commun., 2018, Vol. 54, pp. 2377-2380 Nucleic Acids Research, 2016, Vol. 44, p. e157 Nucleic Acids Research, 2017, Vol. 45, pp. 2797-2808
표적 RNA를 ADAR에 의해 편집하기 위한 안티센스형 가이드 RNA 및 그것을 코딩하는 핵산을 제공한다.
본 발명자들은, ADAR을 유도하여 표적 RNA 편집을 행하기 위한 가이드 RNA에 대해 예의 검토한 결과, 적어도 1개의 기능성 영역이 연결된 안티센스 영역을 포함하고, ADAR 리크루트 염기 서열을 실질적으로 포함하지 않는, 가이드 RNA가 세포에서 높은 편집 효율을 나타내는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은, 이하의 [1] 내지 [23]에 관한 것이다.
[1] 표적 RNA를 ADAR에 의해 편집하기 위한 가이드 RNA로서, 적어도 1개의 기능성 영역 및 해당 표적 RNA의 일부에 상보적이며 표적 RNA와 2본쇄를 형성하는 안티센스 영역을 포함하고, 적어도 1개의 해당 기능성 영역이 해당 안티센스 영역에 연결되어 있고, 해당 가이드 RNA가 ADAR 리크루트 염기 서열을 실질적으로 포함하지 않는, 가이드 RNA.
[2] 적어도 1개의 기능성 영역이 안티센스 영역에 직접 결합되어 있거나 또는 안티센스 영역에 링커를 개재시켜 연결되어 있는, [1]에 기재된 가이드 RNA.
[3] 안티센스 영역이, 표적 RNA와 미스매치 염기쌍을 형성하는 염기를 갖는, [1] 또는 [2]에 기재된 가이드 RNA.
[4] 기능성 영역이, 가이드 RNA의 안정화, 가이드 RNA의 핵으로의 국재, 가이드 RNA의 세포질로의 국재, 표적 RNA와 안티센스 영역의 2본쇄 형성 촉진, 안티센스 영역에 의한 비특이적인 2본쇄 형성 저해, 및 표적 RNA와 안티센스 영역으로 형성되는 복합체의 안정화를 포함하는 기능 중 어느 1 이상의 기능을 갖는 염기 서열로 이루어지는 영역인, [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 가이드 RNA.
[5] 기능성 영역이, snRNA 서열로 이루어지는 영역, rRNA 서열로 이루어지는 영역, 구아닌 사중쇄 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역, 또는 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역, 혹은 그들의 어느 조합인, [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 기재된 가이드 RNA.
[6] 기능성 영역이, snRNA 서열로 이루어지는 영역 및 임의로 포함되는 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역인, [5]에 기재된 가이드 RNA.
[7] snRNA 서열로 이루어지는 영역이, U6 snRNA 서열로 이루어지는 영역, U1 snRNA 서열로 이루어지는 영역, 또는 U7 snRNA 서열로 이루어지는 영역인, [6]에 기재된 가이드 RNA.
[8] 기능성 영역이, rRNA 서열로 이루어지는 영역 및 임의로 포함되는 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역인, [5]에 기재된 가이드 RNA.
[9] rRNA 서열로 이루어지는 영역이 5S rRNA 서열로 이루어지는 영역인, [8]에 기재된 가이드 RNA.
[10] 기능성 영역이, 구아닌 사중쇄 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역, 또는 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역, 혹은 그들의 조합인, [5]에 기재된 가이드 RNA.
[11] 안티센스 영역, 구아닌 사중쇄 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역, 임의로 포함되는 추가적인 기능성 영역, 및 임의로 포함되는 링커로 이루어지고, 안티센스 영역, 구아닌 사중쇄 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역, 및 임의로 포함되는 추가적인 기능성 영역이 이 순서로 5'측으로부터 3'측에 연결되어 있는, [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 기재된 가이드 RNA.
[12] 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역, 안티센스 영역, 임의로 포함되는 추가적인 기능성 영역, 및 임의로 포함되는 링커로 이루어지고, 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역 및 안티센스 영역이 이 순서로 5'측으로부터 3'측에 연결되어 있는, [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 기재된 가이드 RNA.
[13] [1] 내지 [12] 중 어느 하나에 기재된 가이드 RNA 및 ADAR을 포함하는, 표적 RNA를 편집하는 시스템.
[14] [1] 내지 [12] 중 어느 하나에 기재된 가이드 RNA를 코딩하는 핵산.
[15] [1] 내지 [12] 중 어느 하나에 기재된 가이드 RNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터.
[16] ADAR을 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는, [15]에 기재된 발현 벡터.
[17] ADAR이 ADAR1 또는 ADAR2인, [16]에 기재된 발현 벡터.
[18] [15] 내지 [17] 중 어느 하나에 기재된 발현 벡터가 도입된 숙주 세포.
[19] [18]에 기재된 숙주 세포를 배양하는 공정을 포함하는, 발현 벡터를 제조하는 방법.
[20] [15] 내지 [17] 중 어느 하나에 기재된 발현 벡터 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 의약 조성물.
[21] [15]에 기재된 발현 벡터, ADAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 의약 조성물.
[22] [1] 내지 [12] 중 어느 하나에 기재된 가이드 RNA를 코딩하는 핵산을 세포, 바이러스 등에 도입하는 공정을 포함하는, 표적 RNA를 편집하는 방법.
[23] 표적 RNA를 ADAR에 의해 편집하기 위한 폴리뉴클레오타이드로서, 적어도 1개의 기능성 영역 및 해당 표적 RNA의 일부에 상보적이며 표적 RNA와 2본쇄를 형성하는 안티센스 영역을 포함하고, 적어도 1개의 해당 기능성 영역이 해당 안티센스 영역에 연결되어 있고, 해당 폴리뉴클레오타이드가 ADAR 리크루트 염기 서열을 실질적으로 포함하지 않는, 폴리뉴클레오타이드.
기능성 영역을 부가한 안티센스형 가이드 RNA는, 표적 RNA를 편집하기 위한 가이드 RNA로서 사용할 수 있다.
본 발명에 대해 이하에 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 명세서 중에서 사용되는 용어가 구체적으로 정의되어 있지 않은 경우, 당해 용어는, 당업자에게 일반적으로 받아들여지고 있는 의미로 사용된다.
<본 발명의 가이드 RNA>
본 발명은, 표적 RNA를 ADAR에 의해 편집하기 위한 가이드 RNA로서, 적어도 1개의 기능성 영역 및 해당 표적 RNA의 일부에 상보적이며 표적 RNA와 2본쇄를 형성하는 안티센스 영역을 포함하고, 적어도 1개의 해당 기능성 영역이 해당 안티센스 영역에 연결되어 있고, 해당 가이드 RNA가 ADAR 리크루트 염기 서열을 실질적으로 포함하지 않는, 가이드 RNA(이하, "본 발명의 가이드 RNA"라고도 칭한다)를 제공한다. 본 발명에 있어서, "표적 RNA를 ADAR에 의해 편집하기 위한 가이드 RNA"란, 해당 표적 RNA의 일부에 상보적이며 해당 표적 RNA와 2본쇄를 형성하는 영역을 갖고, ADAR을 표적 RNA에 유도하는 RNA 분자를 말한다.
1. 표적 RNA
본 발명에 있어서, "표적 RNA"란, 본 발명의 가이드 RNA에 의한 편집의 표적이 되는 RNA를 말한다. 해당 표적 RNA의 일부에는, 이노신으로 변환되는 아데노신 또는 유리딘으로 변환되는 사이티딘이 포함된다. 몇몇 태양에서는, 표적 RNA는, 아데노신을 포함하고, 해당 아데노신이 이노신으로 변환됨으로써 세포 기능 및/또는 유전자 발현이 제어될 수 있는, 임의의 RNA 서열이다. 다른 태양에서는, 표적 RNA는, 사이티딘을 포함하고, 해당 사이티딘이 유리딘으로 변환됨으로써 세포 기능 및/또는 유전자 발현이 제어될 수 있는, 임의의 RNA 서열이다. 여기에서, "세포 기능이 제어될 수 있는"이란, 표적 RNA를 갖는 세포에 있어서의 RNA의 기능, 번역, 단백질의 기능이 변화하는 것에 의해 해당 세포의 기능이 제어될 수 있는 것을 말한다. "유전자 발현이 제어될 수 있는"이란, 표적 RNA를 갖는 유전자의 발현이 제어될 수 있는 것을 말한다. 표적 RNA는, 엑손(exon), 인트론(intron), 엑손 중의 코딩 영역 또는 각종 비번역 영역(예를 들면, 레트로트랜스포존, 마이크로RNA(miRNA: microRNA), 전이 RNA(tRNA: transfer RNA), 리보솜 RNA(rRNA: ribosomal RNA) 등)을 포함하는 RNA 내에 존재할 수 있다. 표적 RNA는, 진핵 세포, 포유동물 세포, 바이러스, 원핵 세포, 박테리아, 파지 등에 포함되는 RNA 내에 존재할 수 있다.
2. 안티센스 영역
본 발명의 가이드 RNA는, 안티센스 영역을 포함한다. 본 발명에 있어서, "안티센스 영역"이란, 표적 RNA의 일부에 상보적인 염기 서열을 갖고, 표적 RNA와 2본쇄를 형성하는 서열로 이루어지는 영역을 말한다. 안티센스 영역을 구성하는 염기 서열의 길이는, 몇몇 태양에서는, 10염기 내지 100염기, 10염기 내지 80염기, 10염기 내지 60염기, 10염기 내지 40염기이고, 몇몇 태양에서는, 15염기 내지 40염기이며, 몇몇 태양에서는, 10염기 내지 38염기, 몇몇 태양에서는, 15 내지 38염기, 몇몇 태양에서는, 18 내지 38염기이다. 몇몇 태양에서는, 안티센스 영역은, 표적 RNA와 미스매치 염기쌍을 형성하는 염기 또는 요동(wobble) 염기쌍을 형성하는 염기를 포함하고 있어도 된다. 몇몇 태양에서는, 안티센스 영역은, 표적 RNA와 미스매치 염기쌍을 형성하는 염기를 포함하고 있어도 된다.
본 명세서에 있어서 "미스매치 염기쌍"이란, G-A, C-A, U-C, A-A, G-G, C-C, U-U 염기쌍이다. 본 명세서에 있어서 "요동 염기쌍"이란, G-U, I-U, I-A, I-C 염기쌍이다. 안티센스 영역은, 몇몇 태양에서는, 해당 표적 RNA의 일부에 포함되는 아데노신 또는 사이티딘과 미스매치 염기쌍을 형성하는 염기를 갖고, 표적 RNA와 2본쇄를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역이다. 몇몇 태양에서는, 안티센스 영역은, 해당 표적 RNA의 일부에 포함되는 아데노신과 미스매치 염기쌍을 형성하는 염기를 갖고, 표적 RNA와 2본쇄를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역이다. 몇몇 태양에서는, 안티센스 영역은, 해당 표적 RNA의 일부에 포함되는 아데노신과 미스매치 염기쌍을 형성하는 염기인 사이티딘을 갖고, 표적 RNA와 2본쇄를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역이다.
안티센스 영역을 구성하는 염기 서열은, 표적 RNA의 서열, 염기 길이, 표적 RNA와 형성하는 미스매치 염기의 위치, 오프 타겟 효과 등을 고려하여, 당업자가 적절히 설계하는 것이 가능하다. 안티센스 영역을 구성하는 염기 서열은, ADAR에 의한 표적 RNA의 아데노신 또는 사이티딘으로의 편집 효율을 향상시키기 위해서, 해당 아데노신 또는 사이티딘과 미스매치 염기쌍 또는 요동 염기쌍을 형성하도록 설계할 수도 있다(RNA, 2001, Vol. 7, pp. 846-858, Nat. Biotechnol., 2019, Vol. 37, pp. 1059-1069).
본 명세서에 있어서 "ASR"이란, 안티센스 영역(antisense region)을 의미한다.
3. 기능성 영역
본 발명의 가이드 RNA는, 적어도 1개의 기능성 영역을 포함한다. 본 발명에 있어서, "기능성 영역"이란, 가이드 RNA의 안정화, 가이드 RNA의 핵으로의 국재, 가이드 RNA의 세포질로의 국재, 표적 RNA와 안티센스 영역의 2본쇄 형성 촉진, 안티센스 영역에 의한 비특이적인 2본쇄 형성 저해, 표적 RNA와 안티센스 영역으로 형성되는 복합체의 안정화 등을 포함하는 기능 중 어느 1 이상의 기능을 갖는 염기 서열로 이루어지는 영역을 말한다. 몇몇 태양에서는, 기능성 영역은, 가이드 RNA의 안정화, 가이드 RNA의 핵으로의 국재, 가이드 RNA의 세포질로의 국재, 표적 RNA와 안티센스 영역의 2본쇄 형성 촉진, 안티센스 영역에 의한 비특이적인 2본쇄 형성 저해, 및 표적 RNA와 안티센스 영역으로 형성되는 복합체의 안정화를 포함하는 기능 중 어느 1 이상의 기능을 갖는 염기 서열로 이루어지는 영역이다.
본 발명의 가이드 RNA는, 몇몇 태양에서는, 기능성 영역으로서, (a) 가이드 RNA의 안정화를 촉진하는 염기 서열로 이루어지는 영역, (b) 가이드 RNA의 핵으로의 국재를 촉진하는 염기 서열로 이루어지는 영역, (c) 가이드 RNA의 세포질로의 국재를 촉진하는 염기 서열로 이루어지는 영역, (d) 표적 RNA와 안티센스 영역의 2본쇄 형성을 촉진하는 염기 서열로 이루어지는 영역, (e) 안티센스 영역에 의한 비특이적인 2본쇄 형성을 저해하는 염기 서열로 이루어지는 영역, 또는 (f) 표적 RNA와 안티센스 영역으로 형성되는 복합체의 안정화를 촉진하는 염기 서열로 이루어지는 영역, 혹은 상기 (a) 내지 (f)에 기재된 기능 중 어느 2 이상의 기능을 갖는 염기 서열로 이루어지는 영역을 포함한다. 기능성 영역이 이들 중 1 이상의 기능을 갖는 것을 통틀어 "기능을 갖는"이라고 칭하는 경우가 있다. 또한, (a), (b), 및 (d)에 기재된 기능을 갖는 것을 통틀어 "snRNA 서열의 기능을 갖는"이라고 칭하는 경우가 있다. (a) 및 (c)에 기재된 기능을 갖는 것을 통틀어 "rRNA 서열의 기능을 갖는"이라고 칭하는 경우가 있다.
본 명세서에 있어서, "가이드 RNA의 안정화를 촉진하는"이란, RNA 분해 효소에 대한 내성을 부여하는 것을 말한다. 해당 기능은, 공지된 방법에 의해, RNA 분해 효소 존재하에서의 가이드 RNA의 잔존량, 세포로의 가이드 RNA를 코딩하는 핵산의 도입 후의 전사 저해하에서의 세포 내의 가이드 RNA의 잔존량 등을 측정하는 것에 의해 평가할 수 있다. 예를 들면, 실시예 10에 기재된 방법으로 평가할 수 있다. "가이드 RNA의 핵으로의 국재를 촉진하는"이란, 세포에 도입된 가이드 RNA의 핵으로의 이행 및 국재를 촉진하는 것을 말한다. 해당 기능은, 공지된 방법에 의해, 가이드 RNA의 세포내에서의 분포나 양을 검출하는 것에 의해 평가할 수 있다. 예를 들면, 인 사이츄 하이브리다이제이션(in situ hybridization)(Mol. Ther., 2003, Vol. 7, pp. 237-247)에 의해 확인할 수 있다. "가이드 RNA의 세포질로의 국재를 촉진하는"이란, 세포에 도입된 가이드 RNA가 세포질에 머무르는 것을 촉진하는 것을 말한다. 해당 기능은, 공지된 방법에 의해, 가이드 RNA의 세포내에서의 분포나 양을 검출하는 것에 의해 평가할 수 있다. 예를 들면, 인 사이츄 하이브리다이제이션(Mol. Ther., 2003, Vol. 7, pp. 237-247)에 의해 확인할 수 있다. "표적 RNA와 안티센스 영역의 2본쇄 형성을 촉진하는"이란, 표적 RNA와 안티센스 영역의 친화성을 향상시키는 것을 말한다. 해당 기능은, 공지된 방법에 의해, 어피니티 어세이에 의해 평가할 수 있다(BMC Botech., 2008, Vol. 8, article number 48). "안티센스 영역에 의한 비특이적인 2본쇄 형성을 저해하는"이란, 비특이적인 2본쇄 형성(이하, "오프 타겟 효과"라고도 칭한다)을 경감하는 것을 말한다. 해당 기능은, RNA 시퀀싱 등의 공지된 방법에 의해 평가할 수 있다(Nat. Biotechnol., 2019, Vol. 37, pp. 657-666). "표적 RNA와 안티센스 영역으로 형성되는 복합체의 안정화를 촉진하는"이란, 표적 RNA와 안티센스 영역으로 형성되는 2본쇄를 포함하는 복합체의 상태가 유지되는 것을 말한다. 해당 기능은, 공지된 방법에 의해, DNA/RNA 하이브리드쇄의 RNA를 분해하는 RNA 분해 효소 존재하에서, 표적 RNA와 안티센스 영역으로 형성되는 2본쇄의 잔존량을 측정하는 것에 의해 평가할 수 있다. 예를 들면, RNase H의 존재하에서의 표적 RNA와 DNA 서열로 이루어지는 가이드 RNA로 형성되는 2본쇄의 잔존량을 측정하는 것에 의해 평가할 수 있다(Antiviral Chemistry & Chemotherapy, 1996, Vol. 7, pp. 86-93).
몇몇 태양에서는, 가이드 RNA의 안정화를 촉진하는 염기 서열로 이루어지는 영역은, 열역학적으로 안정화되는 고차 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역이다. 열역학적으로 안정화되는 고차 구조는, 뉴클레아제 활성에 내성을 나타내는 구조이면 특별히 한정되지 않는다. 몇몇 태양에서는, 가이드 RNA의 안정화를 촉진하는 염기 서열로 이루어지는 영역은, 핵내 저분자 RNA(snRNA: small nuclear RNA) 서열로 이루어지는 영역, 리보솜 RNA(rRNA: ribosomal RNA) 서열로 이루어지는 영역, 이중쇄 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역, 삼중쇄 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역, 사중쇄 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역, 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역 등이다. 몇몇 태양에서는, 가이드 RNA의 안정화를 촉진하는 염기 서열로 이루어지는 영역은, snRNA 서열로 이루어지는 영역, 구아닌 사중쇄(Gq: G-quadruplex) 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역, 또는 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역이다.
몇몇 태양에서는, 가이드 RNA의 핵으로의 국재를 촉진하는 염기 서열로 이루어지는 영역은, 저분자 RNA(small RNA) 유래의 염기 서열로 이루어지는 영역이다. 몇몇 태양에서는, 가이드 RNA의 핵으로의 국재를 촉진하는 염기 서열로 이루어지는 영역은, snRNA 서열로 이루어지는 영역이다.
몇몇 태양에서는, 가이드 RNA의 세포질로의 국재를 촉진하는 염기 서열로 이루어지는 영역은, small RNA 유래의 염기 서열로 이루어지는 영역이다. 몇몇 태양에서는, 가이드 RNA의 세포질로의 국재를 촉진하는 염기 서열로 이루어지는 영역은, 가이드 RNA의 리보솜으로의 국재를 촉진하는 염기 서열로 이루어지는 영역이고, 몇몇 태양에서는, rRNA 서열로 이루어지는 영역이다. 몇몇 태양에서는, 가이드 RNA의 세포질로의 국재를 촉진하는 염기 서열로 이루어지는 영역은, 전이 RNA(tRNA: transfer RNA) 서열로 이루어지는 영역이다. 몇몇 태양에서는, 가이드 RNA의 세포질로의 국재를 촉진하는 염기 서열로 이루어지는 영역은, 시그널 인식 입자(signal recognition particle: SRP) 유래 RNA 서열인 7SL RNA 서열로 이루어지는 영역이다.
몇몇 태양에서는, 표적 RNA와 안티센스 영역의 2본쇄 형성을 촉진하는 염기 서열로 이루어지는 영역은, 열역학적 및 입체구조적으로 2본쇄 및 2본쇄를 포함하는 복합체의 형성을 촉진하는 염기 서열로 이루어지는 영역이다(Nat. Biotechnol., 2019, Vol. 37, pp. 657-666). 몇몇 태양에서는, 표적 RNA와 안티센스 영역의 2본쇄 형성을 촉진하는 염기 서열로 이루어지는 영역은, snRNA 서열로 이루어지는 영역, 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역, 또는 그들의 어느 조합이다. 몇몇 태양에서는, 표적 RNA와 안티센스 영역의 2본쇄 형성을 촉진하는 염기 서열로 이루어지는 영역은, U6 snRNA 서열로 이루어지는 영역, U1 snRNA 서열로 이루어지는 영역, U7 snRNA 서열로 이루어지는 영역, 또는 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역, 혹은 그들의 어느 조합이다.
몇몇 태양에서는, 안티센스 영역에 의한 비특이적인 2본쇄 형성을 저해하는 염기 서열로 이루어지는 영역은, 열역학적 및 입체구조적으로 오프 타겟 효과를 경감하는 염기 서열로 이루어지는 영역이다. 몇몇 태양에서는, 안티센스 영역에 의한 비특이적인 2본쇄 형성을 저해하는 염기 서열로 이루어지는 영역은, 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역이다(Chem. Commun., 2018, Vol. 54, pp. 2377-2380).
몇몇 태양에서는, 표적 RNA와 안티센스 영역으로 형성되는 복합체의 안정화를 촉진하는 염기 서열로 이루어지는 영역은, 열역학적 및 입체구조적으로 2본쇄 및 2본쇄를 포함하는 복합체가 안정화되어, 뉴클레아제 활성에 내성을 나타내는 염기 서열로 이루어지는 영역이다(Antiviral Chemistry & Chemotherapy, 1996, Vol. 7, pp. 86-93). 몇몇 태양에서는, 표적 RNA와 안티센스 영역으로 형성되는 복합체의 안정화를 촉진하는 염기 서열로 이루어지는 영역은, 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역이다.
본 발명의 가이드 RNA는, 몇몇 태양에서는, 기능성 영역으로서, snRNA 서열로 이루어지는 영역, rRNA 서열로 이루어지는 영역, 구아닌 사중쇄(Gq: G-quadruplex) 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역, 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역, SRP 유래 RNA 서열로 이루어지는 영역, 장쇄 비코딩 RNA(lncRNA: long non-coding RNA) 서열로 이루어지는 영역, tRNA 서열로 이루어지는 영역, 핵소체 저분자 RNA(snoRNA: small nucleolar RNA) 서열로 이루어지는 영역, 또는 miRNA 서열로 이루어지는 영역, 혹은 그들의 어느 조합을 포함한다. 본 발명의 가이드 RNA는, 몇몇 태양에서는, 기능성 영역으로서, snRNA 서열로 이루어지는 영역, rRNA 서열로 이루어지는 영역, Gq 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역, 또는 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역, 혹은 그들의 어느 조합을 포함한다.
본 발명의 가이드 RNA는, 몇몇 태양에서는, 기능성 영역으로서, snRNA 서열로 이루어지는 영역을 포함한다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 가이드 RNA는, 기능성 영역으로서, snRNA 서열로 이루어지는 영역 및 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역을 포함한다. snRNA 서열로 이루어지는 영역과 조합하여 이용할 수 있는 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역은, 몇몇 태양으로서는, 인공 스템-루프 서열로 이루어지는 영역이다. 인공 스템-루프 서열이란, 인공적으로 제작된 스템-루프 구조를 형성하는 서열이며, 예를 들면, U6 카세트 또는 5S 카세트에 포함되는 인공 스템-루프 서열(본 명세서 중, "STL 서열"이라고 칭한다)(Gene Ther., 1997, Vol. 4, pp. 45-54, Nat. Biotechnol., 2002, Vol. 20, pp. 505-508, Mol. Ther., 2003, Vol. 7, pp. 237-247)을 들 수 있다. snRNA 서열로 이루어지는 영역과 조합하여 이용할 수 있는 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역은, 몇몇 태양으로서는, STL 서열로 이루어지는 영역이다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 가이드 RNA는, 기능성 영역으로서, snRNA 서열로 이루어지는 영역 및 인공 스템-루프 서열로 이루어지는 영역을 포함한다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 가이드 RNA는, 기능성 영역으로서, snRNA 서열로 이루어지는 영역 및 STL 서열로 이루어지는 영역을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 snRNA 서열로 이루어지는 영역은, 당업자에게 주지된 snRNA의 염기 서열로 구성되는 영역이며, snRNA 서열의 기능을 갖는 한, 천연의 snRNA의 염기 서열에 있어서 부분적으로 개변을 포함해도 되고, 및/또는 snRNA 서열의 기능을 갖는 한, 천연의 snRNA의 염기 서열의 부분 서열이어도 된다. 예를 들면, 본 발명의 가이드 RNA는, 기능성 영역으로서, U1 snRNA 서열, U2 snRNA 서열, U4 snRNA 서열, U5 snRNA 서열, U6 snRNA 서열, U7 snRNA 서열, U11 snRNA 서열, U12 snRNA 서열, U4atac snRNA 서열, 또는 U6atac snRNA 서열로 이루어지는 영역, 혹은 그들의 어느 조합을 포함한다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 가이드 RNA는, 기능성 영역으로서, U1 snRNA 서열, U2 snRNA 서열, U4 snRNA 서열, U5 snRNA 서열, U6 snRNA 서열, 또는 U7 snRNA 서열로 이루어지는 영역, 혹은 그들의 어느 조합을 포함한다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 가이드 RNA는, 기능성 영역으로서, U6 snRNA 서열로 이루어지는 영역, U1 snRNA 서열로 이루어지는 영역, 또는 U7 snRNA 서열로 이루어지는 영역을 포함한다.
본 발명의 가이드 RNA는, 몇몇 태양에서는, 기능성 영역으로서, U6 snRNA 서열로 이루어지는 영역, U1 snRNA 서열로 이루어지는 영역, 또는 U7 snRNA 서열로 이루어지는 영역, 및 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역을 포함한다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 가이드 RNA는, 기능성 영역으로서, U6 snRNA 서열로 이루어지는 영역 및 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역을 포함한다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 가이드 RNA는, 기능성 영역으로서, U6 snRNA 서열로 이루어지는 영역 및 인공 스템-루프 서열로 이루어지는 영역을 포함한다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 가이드 RNA는, 기능성 영역으로서, U6 snRNA 서열로 이루어지는 영역 및 STL 서열로 이루어지는 영역을 포함한다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 가이드 RNA는, 기능성 영역으로서, U1 snRNA 서열로 이루어지는 영역 및 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역을 포함한다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 가이드 RNA는, 기능성 영역으로서, U1 snRNA 서열로 이루어지는 영역 및 인공 스템-루프 서열로 이루어지는 영역을 포함한다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 가이드 RNA는, 기능성 영역으로서, U1 snRNA 서열로 이루어지는 영역 및 STL 서열로 이루어지는 영역을 포함한다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 가이드 RNA는, 기능성 영역으로서, U7 snRNA 서열로 이루어지는 영역 및 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역을 포함한다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 가이드 RNA는, 기능성 영역으로서, U7 snRNA 서열로 이루어지는 영역 및 인공 스템-루프 서열로 이루어지는 영역을 포함한다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 가이드 RNA는, 기능성 영역으로서, U7 snRNA 서열로 이루어지는 영역 및 STL 서열로 이루어지는 영역을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 U6 snRNA 서열로 이루어지는 영역은, U6 snRNA의 염기 서열로 구성되는 영역이며, snRNA 서열의 기능을 갖는 한, 천연의 U6 snRNA의 염기 서열에 있어서 부분적으로 개변을 포함해도 되고, 및/또는 snRNA 서열의 기능을 갖는 한, 천연의 U6 snRNA의 부분 서열이어도 된다. 몇몇 태양에서는, 본 발명에서 사용되는 U6 snRNA 서열로 이루어지는 영역은, U6 snRNA의 염기 서열의 부분 서열로 이루어지는 영역이며, 몇몇 태양에서는, U6 snRNA의 염기 서열의 전사 개시점으로부터 27염기째까지의 염기 서열로 이루어지는 영역이다. 본 발명의 가이드 RNA에 있어서, U6 snRNA 서열로 이루어지는 영역은, snRNA 서열의 기능을 갖는 한, 인공 스템-루프 서열로 이루어지는 영역과 조합하여 사용해도 된다. U6 snRNA 서열로 이루어지는 영역과 인공 스템-루프 서열로 이루어지는 영역을 사용하는 경우, U6 snRNA 서열로 이루어지는 영역과 인공 스템-루프 서열로 이루어지는 영역 사이에 안티센스 영역을 삽입한다. 본 발명에서 사용되는 U6 snRNA 서열로 이루어지는 영역은, 몇몇 태양에서는, 서열번호 1로 나타나는 염기 서열, 또는 서열번호 1로 나타나는 염기 서열에 있어서 1 내지 3염기가 결실, 치환, 삽입 및/혹은 부가된 염기 서열로서, snRNA 서열의 기능을 갖는 염기 서열로 이루어지는 영역이다. 본 발명에서 사용되는 인공 스템-루프 서열로 이루어지는 영역은, 몇몇 태양에서는, STL 서열로 이루어지는 영역이며, 몇몇 태양에서는, 서열번호 2로 나타나는 염기 서열, 또는 서열번호 2로 나타나는 염기 서열에 있어서 1 내지 3염기가 결실, 치환, 삽입 및/혹은 부가된 염기 서열로서, 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역이다.
본 발명에서 사용되는 U1 snRNA 서열로 이루어지는 영역은, U1 snRNA의 염기 서열로 구성되는 영역이며, snRNA 서열의 기능을 갖는 한, 천연의 U1 snRNA의 염기 서열에 있어서 부분적으로 개변을 포함해도 되고, 및/또는 snRNA 서열의 기능을 갖는 한, 천연의 U1 snRNA의 부분 서열이어도 된다. 본 발명의 가이드 RNA에 있어서, U1 snRNA 서열로 이루어지는 영역은, snRNA 서열의 기능을 갖는 한, 안티센스 영역을 U1 snRNA 서열에 연결하여 사용해도 되고, 또는 안티센스 영역을 U1 snRNA 서열에 삽입하여 사용해도 된다. 안티센스 영역을 U1 snRNA 서열에 삽입하는 경우는, U1 snRNA 서열을 임의의 2개의 영역으로 나누고, 그 사이에 안티센스 영역을 삽입한다. U1 snRNA 서열로의 안티센스 영역의 삽입은, U1 snRNA 서열의 일부를 안티센스 영역으로 치환하여 행해도 된다. 몇몇 태양에서는, U1 snRNA 서열의 염기 서열의 전사 개시점으로부터 3염기째 내지 10염기째까지의 염기 서열을 안티센스 영역으로 치환할 수 있다. U1 snRNA 서열로의 안티센스 영역의 삽입은, 몇몇 태양에서는, U1 snRNA 서열의 염기 서열의 전사 개시점으로부터 3염기째 내지 10염기째의 8염기가 결실된 염기 서열로 이루어지는 U1 snRNA 서열의 전사 개시점으로부터 3염기째에 안티센스 영역을 삽입할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 U1 snRNA 서열로 이루어지는 영역은, 몇몇 태양에서는, 서열번호 3으로 나타나는 염기 서열, 또는 서열번호 3으로 나타나는 염기 서열에 있어서 1 내지 20염기가 결실, 치환, 삽입 및/혹은 부가된 염기 서열로서, snRNA 서열의 기능을 갖는 염기 서열로 이루어지는 영역이다. 몇몇 태양에서는, 서열번호 3으로 나타나는 염기 서열에 있어서 전사 개시점으로부터 3염기째 내지 10염기째의 8염기가 결실된 염기 서열로서, snRNA 서열의 기능을 갖는 염기 서열로 이루어지는 영역이다.
본 발명에서 사용되는 U7 snRNA 서열로 이루어지는 영역은, U7 snRNA의 염기 서열로 구성되는 영역이며, snRNA 서열의 기능을 갖는 한, 천연의 snRNA의 염기 서열에 있어서 부분적으로 개변을 포함해도 되고, 및/또는 snRNA 서열의 기능을 갖는 한, 천연의 U7 snRNA의 부분 서열이어도 된다. 몇몇 태양에서는, 본 발명에서 사용되는 U7 snRNA 서열로 이루어지는 영역은, U7 snRNA의 염기 서열의 부분 서열로 이루어지는 영역이다. 몇몇 태양에서는, 본 발명에서 사용되는 U7 snRNA 서열로 이루어지는 영역은, U7 snRNA의 염기 서열의 부분 서열로 이루어지는 영역이며, 몇몇 태양에서는, Sm 단백질 결합 사이트(Sm OPT 서열) 및 U7 snRNA의 스템-루프 서열을 포함하는 U7 snRNA 서열로 이루어지는 영역이다. 본 발명의 가이드 RNA에 있어서, U7 snRNA 서열로 이루어지는 영역은, snRNA 서열의 기능을 갖는 한, 안티센스 영역을 U7 snRNA 서열에 연결하여 사용해도 되고, 또는 안티센스 영역을 U7 snRNA 서열에 삽입하여 사용해도 된다. 본 발명에서 사용되는 U7 snRNA 서열로 이루어지는 영역은, 서열번호 4로 나타나는 염기 서열, 또는 서열번호 4로 나타나는 염기 서열에 있어서 1 내지 10염기가 결실, 치환, 삽입 및/혹은 부가된 염기 서열로서, snRNA 서열의 기능을 갖는 염기 서열로 이루어지는 영역이다.
본 발명의 가이드 RNA는, 몇몇 태양에서는, 기능성 영역으로서, rRNA 서열로 이루어지는 영역을 포함한다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 가이드 RNA는, 기능성 영역으로서, rRNA 서열로 이루어지는 영역 및 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 rRNA 서열로 이루어지는 영역은, 당업자에게 주지된 rRNA의 염기 서열로 구성되는 영역이며, rRNA 서열의 기능을 갖는 한, 천연의 rRNA의 염기 서열에 있어서 부분적으로 개변을 포함해도 된다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 가이드 RNA는, 기능성 영역으로서, 진핵생물의 rRNA 서열로 이루어지는 영역을 포함한다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 가이드 RNA는, 기능성 영역으로서, 28S rRNA 서열, 18S rRNA 서열, 5.8S rRNA 서열, 5S rRNA 서열, 미토콘드리아 12S rRNA 서열, 또는 미토콘드리아 16S rRNA 서열로 이루어지는 영역, 혹은 그들의 어느 조합을 포함한다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 가이드 RNA는, 기능성 영역으로서, 5S rRNA 서열로 이루어지는 영역을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 5S rRNA 서열로 이루어지는 영역은, 5S rRNA의 염기 서열로 구성되는 영역이며, rRNA 서열의 기능을 갖는 한, 천연의 5S rRNA의 염기 서열에 있어서 부분적으로 개변을 포함해도 된다. 본 발명의 가이드 RNA에 있어서, 5S rRNA 서열로 이루어지는 영역은, rRNA 서열의 기능을 갖는 한, 인공 스템-루프 서열로 이루어지는 영역과 조합하여 사용해도 된다. 5S rRNA 서열로 이루어지는 영역과 인공 스템-루프 서열로 이루어지는 영역을 사용하는 경우, 5S rRNA 서열로 이루어지는 영역과 인공 스템-루프 서열로 이루어지는 영역 사이에 안티센스 영역을 삽입한다. 본 발명에서 사용되는 5S rRNA 서열로 이루어지는 영역은, 몇몇 태양에서는, 서열번호 5로 나타나는 염기 서열, 또는 서열번호 5로 나타나는 염기 서열에 있어서 1 내지 10염기가 결실, 치환, 삽입 및/혹은 부가된 염기 서열로서, rRNA 서열의 기능을 갖는 염기 서열로 이루어지는 영역이다. 본 발명에서 사용되는 인공 스템-루프 서열로 이루어지는 영역은, 몇몇 태양에서는, 서열번호 2로 나타나는 염기 서열, 또는 서열번호 2로 나타나는 염기 서열에 있어서 1 내지 3염기가 결실, 치환, 삽입 및/혹은 부가된 염기 서열로서, 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역이다.
몇몇 태양에서는, 본 발명의 가이드 RNA는, 기능성 영역으로서, 구아닌 사중쇄 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역, 또는 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역, 혹은 그들의 조합을 포함한다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 가이드 RNA는, 기능성 영역으로서, 구아닌 사중쇄 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역을 포함한다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 가이드 RNA는, 기능성 영역으로서, 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 구아닌 사중쇄 구조(Gq 구조)를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역은 Gq 서열을 포함한다. Gq 서열이란, 연속하는 구아닌 염기로 이루어지는 반복 단위를 4개 포함하는 서열이며, 4개의 구아닌 염기가 평면 상의 사중쇄(Gq) 구조를 형성하는 서열이다. 구아닌으로 이루어지는 반복 단위끼리의 사이에는, Gq 구조를 유지하는 한 구아닌 이외의 염기를 포함하고 있어도 된다. 몇몇 태양에서는, Gq 서열은, 1, 2, 3, 또는 4개의 연속하는 구아닌 염기로 이루어지는 반복 단위를 포함하고, 각각, 1, 2, 3, 또는 4층의 Gq를 형성한다. 몇몇 태양에서는, Gq 서열은, 3개의 연속하는 구아닌 염기로 이루어지는 반복 단위를 포함하고, 3층의 Gq를 형성한다. 이것을 "3층의 구아닌 사중쇄 구조"(이하, "3Gq"라고도 칭한다)라고 칭한다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 가이드 RNA는, 기능성 영역으로서, 3Gq를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역을 포함하고, 몇몇 태양에서는, 3Gq를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역은, 서열번호 6으로 나타나는 염기 서열, 또는 서열번호 6으로 나타나는 염기 서열에 있어서 1 내지 3염기가 결실, 치환, 삽입 및/혹은 부가된 염기 서열로서, Gq 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역이다.
스템-루프 구조는, 헤어핀 구조라고도 칭하며, 당해 기술 분야에 있어서 주지되어 있다. 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로서는, 앱타머 서열(Int. J. Biochem. Mol. Biol., 2013, Vol. 4, pp. 27-40, 국제 공개 제2016/143700호), BoxB 서열 유래의 서열, MS2 서열 유래의 서열, PP7 서열 유래의 서열(Integr. Biol., 2009, Vol. 1, pp. 499-505, Nucleic Acids Research, 2016, Vol. 44, pp. 9555-9564), 인공 스템-루프 서열(예를 들면, U6 카세트 또는 5S 카세트에 포함되는 인공 스템-루프 서열(STL 서열)(Gene Ther., 1997, Vol. 4, pp. 45-54, Nat. Biotechnol., 2002, Vol. 20, pp. 505-508, Mol. Ther., 2003, Vol. 7, pp. 237-247)) 등을 들 수 있다.
몇몇 태양에서는, 본 발명의 가이드 RNA는, 기능성 영역으로서, 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역을 포함하고, 해당 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역은, BoxB 서열 유래의 서열, 앱타머 서열, MS2 서열 유래의 서열, PP7 서열 유래의 서열, 또는 인공 스템-루프 서열(예를 들면, STL 서열)로 이루어지는 영역, 혹은 그들의 어느 조합이다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 가이드 RNA는, 기능성 영역으로서, BoxB 서열 유래의 서열로 이루어지는 영역을 포함한다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 가이드 RNA는, 기능성 영역으로서, STL 서열로 이루어지는 영역을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 BoxB 서열 유래의 서열로 이루어지는 영역은, 몇몇 태양에서는, 서열번호 7로 나타나는 염기 서열, 또는 서열번호 7로 나타나는 염기 서열에 있어서 1 내지 3염기가 결실, 치환, 삽입 및/혹은 부가된 염기 서열로서, 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어진다.
본 발명에서 사용되는 인공 스템-루프 서열로 이루어지는 영역은, 몇몇 태양에서는, U6 카세트 또는 5S 카세트에 포함되는 인공 스템-루프 서열(STL 서열)로 이루어지는 영역이며, 몇몇 태양에서는, 서열번호 2로 나타나는 염기 서열, 또는 서열번호 2로 나타나는 염기 서열에 있어서 1 내지 3염기가 결실, 치환, 삽입 및/혹은 부가된 염기 서열로서, 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역이다.
본 발명의 가이드 RNA는, 몇몇 태양에서는, 기능성 영역으로서, SRP 유래 RNA 서열로 이루어지는 영역을 포함하고, 몇몇 태양에서는, 해당 SRP 유래 RNA 서열로 이루어지는 영역이 7SL RNA 서열, 6S RNA 서열, 또는 4.5S RNA 서열로 이루어지는 영역이다.
본 발명의 가이드 RNA는, 몇몇 태양에서는, 동일한 기능성 영역을 적어도 2개 포함하고 있어도 되고, 다른 태양에서는, 상이한 2 이상의 기능성 영역을 적어도 1개씩 포함하고 있어도 된다.
4. 기능성 영역의 연결
본 발명의 가이드 RNA에 있어서, 기능성 영역은 안티센스 영역에 연결되어 있다. 본 명세서에 있어서 "연결"이란, 직접 결합하는 것 및 링커를 개재시켜 결합하는 것을 포함한다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 가이드 RNA에 있어서는, 적어도 1개의 기능성 영역이 안티센스 영역에 직접 결합되어 있다. 다른 태양에서는, 본 발명의 가이드 RNA는, 적어도 1개의 기능성 영역이 안티센스 영역에 링커를 개재시켜 연결되어 있다. 본 발명의 가이드 RNA에 있어서, 복수의 기능성 영역을 연결하여 이용하는 경우, 기능성 영역 간의 연결은, 직접 결합 또는 링커를 개재시킨 연결의 어느 것이어도 된다.
링커를 사용하는 경우, 몇몇 태양에서는, 링커의 길이는 1 내지 10염기이고, 몇몇 태양에서는 1 내지 6염기, 몇몇 태양에서는 1 내지 3염기, 몇몇 태양에서는 3 내지 6염기, 몇몇 태양에서는 3염기, 몇몇 태양에서는 6염기이다. 링커의 염기 서열은, 가이드 RNA를 구성하는 서열에 기초하여 당업자에 의해 적절히 설계 가능하다. 예를 들면, 본 발명에 있어서 사용되는 링커의 염기 서열은, 표적 RNA와 상보쇄를 형성하지 않도록 설계해도 된다. 몇몇 태양에서는, 링커는, 염기 서열 "UCU", 제한 효소 SalI 사이트 서열인 "GUCGAC", 또는 제한 효소 XbaI 사이트 서열인 "UCUAGA"로 이루어진다.
몇몇 태양으로서, 본 발명의 가이드 RNA가 기능성 영역으로서 BoxB 서열 유래의 서열로 이루어지는 영역을 포함하는 경우에는, BoxB 서열 유래의 서열로 이루어지는 영역과 안티센스 영역 사이, 및 BoxB 서열 유래의 서열로 이루어지는 영역과 다른 기능성 영역 사이에 링커를 개재시킨 연결을 이용할 수 있고, 몇몇 태양에서는, 해당 링커는 염기 서열 "UCU"이다. 몇몇 태양으로서, 본 발명의 가이드 RNA가 기능성 영역으로서 U6 snRNA 서열로 이루어지는 영역 및 임의로 포함되는 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역을 포함하는 경우, 또는 본 발명의 가이드 RNA가 기능성 영역으로서 5S rRNA 서열로 이루어지는 영역 및 임의로 포함되는 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역을 포함하는 경우에는, 링커를 개재시켜 기능성 영역에 안티센스 영역을 연결할 수 있고, 몇몇 태양에서는, 해당 링커는 염기 서열 "GUCGAC" 또는 "UCUAGA"이다.
5. 표적 RNA를 편집하기 위한 가이드 RNA
본 발명의 가이드 RNA는, ADAR 리크루트 염기 서열을 실질적으로 포함하지 않는 가이드 RNA이다. "ADAR 리크루트 염기 서열"이란, 동일 분자 내에서 스템-루프 구조를 형성하고, 해당 스템-루프 구조에 ADAR이 결합하여, 해당 ADAR이 표적 RNA에 리크루트될 수 있는 염기 서열이다. ADAR 리크루트 염기 서열의 예로서는, GluR2의 mRNA 전구체 등의 ADAR의 기질 유래의 스템-루프 구조에 기초하여 설계된 염기 서열(국제 공개 제2016/097212호, 국제 공개 제2017/050306호, 독일 특허 제102015012522호, 국제 공개 제2017/010556호, 국제 공개 제2019/111957호, Nucleic Acids Research, 2017, Vol. 45, pp. 2797-2808, Nature Methods, 2019, Vol. 16, pp. 239-242)을 들 수 있다. 본 발명에 있어서, ADAR 리크루트 염기 서열을 "실질적으로 포함하지 않는"이란, 가이드 RNA의 동일 분자 내에 ADAR 리크루트 염기 서열을 포함하지 않는 것을 말한다.
본 발명의 가이드 RNA는, 몇몇 태양에서는, 이하의 어느 가이드 RNA이다:
적어도 1개의 기능성 영역 및 해당 표적 RNA의 일부에 상보적이며 해당 표적 RNA와 2본쇄를 형성하는 안티센스 영역을 포함하고, 적어도 1개의 해당 기능성 영역이 해당 안티센스 영역에 직접 결합되어 있고, 해당 가이드 RNA가 ADAR 리크루트 염기 서열을 실질적으로 포함하지 않는, 가이드 RNA, 혹은
적어도 1개의 기능성 영역 및 해당 표적 RNA의 일부에 상보적이며 해당 표적 RNA와 2본쇄를 형성하는 안티센스 영역을 포함하고, 적어도 1개의 해당 기능성 영역이 해당 안티센스 영역에 링커를 개재시켜 연결되어 있고, 해당 가이드 RNA가 ADAR 리크루트 염기 서열을 실질적으로 포함하지 않는, 가이드 RNA.
본 발명의 가이드 RNA는, 몇몇 태양에서는, 이하의 가이드 RNA이다:
적어도 1개의 기능성 영역 및 해당 표적 RNA의 일부에 상보적이며 해당 표적 RNA와 2본쇄를 형성하는 안티센스 영역을 포함하고, 적어도 1개의 해당 기능성 영역이 해당 안티센스 영역에 연결되어 있고, 해당 가이드 RNA가 ADAR 리크루트 염기 서열을 실질적으로 포함하지 않는, 가이드 RNA로서, 해당 안티센스 영역은, 해당 표적 RNA와 미스매치 염기쌍을 형성하는 염기를 갖는, 가이드 RNA.
몇몇 태양에서는, 본 발명의 가이드 RNA는, 적어도 1개의 기능성 영역 및 해당 표적 RNA의 일부에 상보적이며 해당 표적 RNA와 2본쇄를 형성하는 안티센스 영역을 포함하고, 적어도 1개의 해당 기능성 영역이 해당 안티센스 영역에 연결되어 있고, 해당 가이드 RNA가 ADAR 리크루트 염기 서열을 실질적으로 포함하지 않는, 가이드 RNA로서, 해당 가이드 RNA가, 이하의 특징을 갖는다:
(1) 기능성 영역이, 가이드 RNA의 안정화, 가이드 RNA의 핵으로의 국재, 가이드 RNA의 세포질로의 국재, 표적 RNA와 안티센스 영역의 2본쇄 형성 촉진, 안티센스 영역에 의한 비특이적인 2본쇄 형성 저해, 및 표적 RNA와 안티센스 영역으로 형성되는 복합체의 안정화를 포함하는 기능 중 어느 1 이상의 기능을 갖는 염기 서열로 이루어지는 영역이다,
(2) 기능성 영역이, snRNA 서열로 이루어지는 영역, rRNA 서열로 이루어지는 영역, 구아닌 사중쇄 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역, 또는 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역, 혹은 그들의 어느 조합이다,
(3) 기능성 영역이, snRNA 서열로 이루어지는 영역 및 임의로 포함되는 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역이다,
(4) 기능성 영역이, U6 snRNA 서열로 이루어지는 영역, U1 snRNA 서열로 이루어지는 영역, 및 U7 snRNA 서열로 이루어지는 영역으로부터 선택되는 snRNA 서열로 이루어지는 영역, 및 임의로 포함되는 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역이다,
(5) 기능성 영역이, U6 snRNA 서열로 이루어지는 영역 및 인공 스템-루프 서열로 이루어지는 영역이다,
(6) 기능성 영역이, U6 snRNA 서열의 염기 서열의 부분 서열로서 snRNA 서열의 기능을 갖는 염기 서열로 이루어지는 영역 및 인공 스템-루프 서열로 이루어지는 영역이다,
(7) 기능성 영역이, U6 snRNA 서열의 염기 서열의 전사 개시점으로부터 27염기째까지의 부분 서열로서 snRNA 서열의 기능을 갖는 염기 서열로 이루어지는 영역 및 인공 스템-루프 서열로 이루어지는 영역이다,
(8) 기능성 영역이, 서열번호 1로 나타나는 염기 서열, 또는 서열번호 1로 나타나는 염기 서열에 있어서 1 내지 3염기가 결실, 치환, 삽입 및/혹은 부가된 염기 서열로서, snRNA 서열의 기능을 갖는 염기 서열로 이루어지는 영역, 및 서열번호 2로 나타나는 염기 서열, 또는 서열번호 2로 나타나는 염기 서열에 있어서 1 내지 3염기가 결실, 치환, 삽입 및/혹은 부가된 염기 서열로서, 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역이다,
(9) 기능성 영역이, U1 snRNA 서열로 이루어지는 영역이다,
(10) 기능성 영역이, 서열번호 3으로 나타나는 염기 서열, 또는 서열번호 3으로 나타나는 염기 서열에 있어서 1 내지 20염기가 결실, 치환, 삽입 및/혹은 부가된 염기 서열로서, snRNA 서열의 기능을 갖는 염기 서열로 이루어지는 영역이다,
(11) 기능성 영역이, 서열번호 3으로 나타나는 염기 서열에 있어서 전사 개시점으로부터 3염기째 내지 10염기째의 8염기가 결실된 염기 서열로서, snRNA 서열의 기능을 갖는 염기 서열로 이루어지는 영역이다,
(12) 기능성 영역이, U7 snRNA 서열로 이루어지는 영역이다,
(13) 기능성 영역이, Sm 단백질 결합 사이트(Sm OPT 서열) 및 U7 snRNA의 스템-루프 서열을 포함하는 U7 snRNA의 염기 서열의 부분 서열로서, snRNA 서열의 기능을 갖는 염기 서열로 이루어지는 영역이다,
(14) 기능성 영역이, 서열번호 4로 나타나는 염기 서열, 또는 서열번호 4로 나타나는 염기 서열에 있어서 1 내지 10염기가 결실, 치환, 삽입 및/혹은 부가된 염기 서열로서, snRNA 서열의 기능을 갖는 염기 서열로 이루어지는 영역이다,
(15) 기능성 영역이, rRNA 서열로 이루어지는 영역 및 임의로 포함되는 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역이다,
(16) 기능성 영역이, 5S rRNA 서열로 이루어지는 영역 및 임의로 포함되는 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역이다,
(17) 기능성 영역이, 서열번호 5로 나타나는 염기 서열, 또는 서열번호 5로 나타나는 염기 서열에 있어서 1 내지 10염기가 결실, 치환, 삽입 및/혹은 부가된 염기 서열로서, rRNA 서열의 기능을 갖는 염기 서열로 이루어지는 영역, 및 임의로 포함되는 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역이다,
(18) 기능성 영역이, 5S rRNA 서열로 이루어지는 영역 및 인공 스템-루프 서열로 이루어지는 영역이다,
(19) 기능성 영역이, 서열번호 5로 나타나는 염기 서열, 또는 서열번호 5로 나타나는 염기 서열에 있어서 1 내지 3염기가 결실, 치환, 삽입 및/혹은 부가된 염기 서열로서, rRNA 서열의 기능을 갖는 염기 서열로 이루어지는 영역, 및 서열번호 2로 나타나는 염기 서열, 또는 서열번호 2로 나타나는 염기 서열에 있어서 1 내지 3염기가 결실, 치환, 삽입 및/혹은 부가된 염기 서열로서, 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역이다,
(20) 기능성 영역이, 구아닌 사중쇄 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역 또는 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역, 혹은 그들의 조합이다,
(21) 기능성 영역이, 구아닌 사중쇄 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역이다,
(22) 기능성 영역이, 3층의 구아닌 사중쇄 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역이다,
(23) 기능성 영역이, 서열번호 6으로 나타나는 염기 서열, 또는 서열번호 6으로 나타나는 염기 서열에 있어서 1 내지 3염기가 결실, 치환, 삽입 및/혹은 부가된 염기 서열로서, 구아닌 사중쇄 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역이다,
(24) 기능성 영역이, 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역이다,
(25) 기능성 영역이, BoxB 서열 유래의 서열로 이루어지는 영역이다,
(26) 기능성 영역이, 서열번호 7로 나타나는 염기 서열, 또는 서열번호 7로 나타나는 염기 서열에 있어서 1 내지 3염기가 결실, 치환, 삽입 및/혹은 부가된 염기 서열로서, 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역이다,
(27) 기능성 영역이, 구아닌 사중쇄 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역 및 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역의 조합이다, 또는
(28) 기능성 영역이, 3층의 구아닌 사중쇄 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역 및 BoxB 서열 유래의 서열로 이루어지는 영역의 조합이다.
상기 (1) 내지 (28)의 어느 특징을 갖는 본 발명의 가이드 RNA에 있어서, 적어도 1개의 해당 기능성 영역은 해당 안티센스 영역에 직접 결합되어 있어도 되고 링커를 개재시켜 연결되어 있어도 된다.
몇몇 태양에서는, 본 발명의 가이드 RNA는, 적어도 1개의 기능성 영역 및 해당 표적 RNA의 일부에 상보적이며 해당 표적 RNA와 2본쇄를 형성하는 안티센스 영역을 포함하고, 적어도 1개의 해당 기능성 영역이 해당 안티센스 영역에 연결되어 있고, 해당 가이드 RNA가 ADAR 리크루트 염기 서열을 실질적으로 포함하지 않는, 가이드 RNA로서, 해당 가이드 RNA가, 이하의 특징을 갖는다:
(a-1) 가이드 RNA가, U6 snRNA 서열로 이루어지는 기능성 영역, 안티센스 영역, 임의로 포함되는 링커, 및 인공 스템-루프 서열로 이루어지는 영역으로 이루어지고, U6 snRNA 서열로 이루어지는 기능성 영역, 안티센스 영역, 및 인공 스템-루프 서열로 이루어지는 영역이 이 순서로 5'측으로부터 3'측에 연결되어 있다,
(a-2) 가이드 RNA가, U6 snRNA 서열의 염기 서열의 전사 개시점으로부터 27염기째까지의 부분 서열로서 snRNA 서열의 기능을 갖는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역, 안티센스 영역, 임의로 포함되는 링커, 및 인공 스템-루프 서열로 이루어지는 영역으로 이루어지고, U6 snRNA 서열의 염기 서열의 전사 개시점으로부터 27염기째까지의 부분 서열로서 snRNA 서열의 기능을 갖는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역, 안티센스 영역, 및 인공 스템-루프 서열로 이루어지는 영역이 이 순서로 5'측으로부터 3'측에 연결되어 있다,
(a-3) 가이드 RNA가, U1 snRNA 서열로 이루어지는 기능성 영역, 및 안티센스 영역으로 이루어지고, 안티센스 영역이 U1 snRNA 서열의 염기 서열에 삽입되어 있다,
(a-4) 가이드 RNA가, U1 snRNA 서열의 염기 서열의 전사 개시점으로부터 3염기째 내지 10염기째의 8염기가 결실된 염기 서열로서 snRNA 서열의 기능을 갖는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역, 및 안티센스 영역으로 이루어지고, 안티센스 영역이 U1 snRNA 서열의 염기 서열의 전사 개시점으로부터 3염기째에 삽입되어 있다,
(a-5) 가이드 RNA가, U7 snRNA 서열로 이루어지는 기능성 영역, 및 안티센스 영역으로 이루어지고, 안티센스 영역 및 U7 snRNA 서열로 이루어지는 기능성 영역이 이 순서로 5'측으로부터 3'측에 연결되어 있다,
(a-6) 가이드 RNA가, Sm 단백질 결합 사이트(Sm OPT 서열) 및 U7 snRNA의 스템-루프 서열을 포함하는 U7 snRNA 서열의 염기 서열의 부분 서열로서 snRNA 서열의 기능을 갖는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역, 및 안티센스 영역으로 이루어지고, 안티센스 영역 및 U7 snRNA 서열의 염기 서열의 부분 서열로 이루어지는 기능성 영역이 이 순서로 5'측으로부터 3'측에 연결되어 있다,
(a-7) 가이드 RNA가, 5S rRNA 서열로 이루어지는 기능성 영역, 안티센스 영역, 임의로 포함되는 링커, 및 인공 스템-루프 서열로 이루어지는 영역으로 이루어지고, 5S rRNA 서열로 이루어지는 기능성 영역, 안티센스 영역, 및 인공 스템-루프 서열로 이루어지는 영역이 이 순서로 5'측으로부터 3'측에 연결되어 있다,
(a-8) 가이드 RNA가, 안티센스 영역, 구아닌 사중쇄 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역, 및 임의로 포함되는 링커로 이루어지고, 안티센스 영역 및 구아닌 사중쇄 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역이 이 순서로 5'측으로부터 3'측에 연결되어 있다,
(a-9) 가이드 RNA가, 구아닌 사중쇄 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역, 안티센스 영역, 및 임의로 포함되는 링커로 이루어지고, 구아닌 사중쇄 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역 및 안티센스 영역이 이 순서로 5'측으로부터 3'측에 연결되어 있다,
(a-10) 가이드 RNA가, 안티센스 영역, 구아닌 사중쇄 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역, 추가적인 기능성 영역, 및 임의로 포함되는 링커로 이루어지고, 안티센스 영역, 구아닌 사중쇄 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역, 및 추가적인 기능성 영역이 이 순서로 5'측으로부터 3'측에 연결되어 있다,
(a-11) 가이드 RNA가, 안티센스 영역, 구아닌 사중쇄 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역, 추가적인 기능성 영역, 및 임의로 포함되는 링커로 이루어지고, 추가적인 기능성 영역, 안티센스 영역, 및 구아닌 사중쇄 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역이 이 순서로 5'측으로부터 3'측에 연결되어 있다,
(a-12) 가이드 RNA가, 안티센스 영역, 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역, 및 임의로 포함되는 링커로 이루어지고, 안티센스 영역 및 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역이 이 순서로 5'측으로부터 3'측에 연결되어 있다,
(a-13) 가이드 RNA가, 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역, 안티센스 영역, 및 임의로 포함되는 링커로 이루어지고, 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역 및 안티센스 영역이 이 순서로 5'측으로부터 3'측에 연결되어 있다,
(a-14) 가이드 RNA가, 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역, 안티센스 영역, 추가적인 기능성 영역, 및 임의로 포함되는 링커로 이루어지고, 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역, 안티센스 영역, 및 추가적인 기능성 영역이 이 순서로 5'측으로부터 3'측에 연결되어 있다,
(a-15) 가이드 RNA가, 구아닌 사중쇄 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역, 안티센스 영역, 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역, 및 임의로 포함되는 링커로 이루어지고, 구아닌 사중쇄 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역, 안티센스 영역, 및 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역이 이 순서로 5'측으로부터 3'측에 연결되어 있다,
(a-16) 가이드 RNA가, 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역, 안티센스 영역, 구아닌 사중쇄 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역, 및 임의로 포함되는 링커로 이루어지고, 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역, 안티센스 영역, 및 구아닌 사중쇄 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역이 이 순서로 5'측으로부터 3'측에 연결되어 있다,
(a-17) 가이드 RNA가, 안티센스 영역, 구아닌 사중쇄 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역, 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역, 및 임의로 포함되는 링커로 이루어지고, 안티센스 영역, 구아닌 사중쇄 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역, 및 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역이 이 순서로 5'측으로부터 3'측에 연결되어 있다, 또는
(a-18) 가이드 RNA가, 구아닌 사중쇄 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역, 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역, 안티센스 영역, 및 임의로 포함되는 링커로 이루어지고, 구아닌 사중쇄 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역, 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역, 및 안티센스 영역이 이 순서로 5'측으로부터 3'측에 연결되어 있다.
<본 발명에서 사용되는 ADAR>
본 발명에서 사용되는 ADAR에는, 천연으로 존재하는 ADAR, 및 데아미나아제 활성을 갖는 한, 그의 개변체도 포함된다. 데아미나아제 활성은, 당업자에게 공지된 방법에 의해, 기질의 탈아미노화를 검출함으로써 측정할 수 있다. 예를 들면, 데아미나아제 활성은, 아데노신의 이노신으로의 변환 또는 사이티딘의 유리딘으로의 변환을 검출함으로써 측정할 수 있다. 구체적으로는, 데아미나아제 활성은, 실시예 7 또는 8에 기재된 방법으로 측정할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 ADAR은, 몇몇 태양에서는, 진핵생물 유래 ADAR이고, 몇몇 태양에서는, 포유동물 유래의 ADAR이며, 또한 몇몇 태양에서는, 인간 ADAR이다. 본 발명에서 사용되는 ADAR은, 몇몇 태양에서는, ADAR1 또는 ADAR2이고, 몇몇 태양에서는, ADAR2이다. ADAR1에는, 2종의 스플라이싱 베리언트 ADAR1 p110 및 ADAR1 p150이 포함되고, 본 발명에서 사용되는 ADAR은, 몇몇 태양에서는, ADAR1 p110 또는 ADAR1 p150이다. 본 발명에서 사용되는 ADAR은, 몇몇 태양에서는, 인간 ADAR1 또는 인간 ADAR2이고, 몇몇 태양에서는, 인간 ADAR2이다. 본 발명에서 사용되는 ADAR은, 몇몇 태양에서는, 2본쇄 RNA 결합 영역(dsRBD: double-stranded-RNA binding domain)을 포함하고 데아미나아제 효소 활성을 갖는 폴리펩타이드이다(Trends in Biochemical Sciences, 2001, Vol. 26, pp. 376-384, RNA, 2001, Vol. 7, pp. 846-858). 본 발명에서 사용되는 ADAR은, 몇몇 태양에서는, 데아미나아제 도메인을 포함하고, 표적 RNA의 아데노신을 이노신으로 변환할 수 있는 폴리펩타이드이다. 본 발명에서 사용되는 ADAR은, 다른 태양에서는, 데아미나아제 도메인을 포함하고, 표적 RNA의 사이티딘을 유리딘으로 변환할 수 있는 폴리펩타이드이다. 본 발명에서 사용되는 ADAR은, 또 다른 태양에서는, 데아미나아제 도메인을 포함하고, 표적 RNA의 아데노신을 이노신으로 변환하는 것 및 사이티딘을 유리딘으로 변환하는 것이 가능한 폴리펩타이드이다. 본 발명에서 사용되는 ADAR은, 타 인자와의 융합 단백이어도 된다. 본 발명에서 사용되는 ADAR의 개변체에는, 아데노신 데아미나아제 활성을 갖는 개변체, 사이티딘 데아미나아제 활성을 갖는 개변체, 및 아데노신 및 사이티딘의 양쪽을 인식하고, 각각을 이노신 및 유리딘으로 변환하는 데아미나아제 활성을 갖는 개변체가 포함된다(Science, 2019, Vol. 365, pp. 382-386). 본 발명에서 사용되는 ADAR 및 ADAR의 개변체는, 타 인자와의 융합 단백이어도 된다.
본 발명에서 사용되는 ADAR은, 몇몇 태양에서는, 액세션 번호 [NP_001103.1], 액세션 번호 [NP_056648.1], 또는 액세션 번호 [NP_001102.3]으로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드, 혹은 이들 아미노산 서열 중 어느 것과 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열, 또는 이들 아미노산 서열 중 어느 것에 있어서 1 내지 10개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 아데노신 데아미나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드이다. 본 발명에서 사용되는 ADAR은, 몇몇 태양에서는, 서열번호 9로 나타나는 아미노산 서열(인간 ADAR2)로 이루어지는 폴리펩타이드, 혹은 해당 서열과 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열 또는 해당 서열에 있어서 1 내지 10개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 아데노신 데아미나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드이다. 본 발명에서 사용되는 ADAR은, 몇몇 태양에서는, 진핵 세포에 있어서 내재적으로 존재하는 ADAR이고, 몇몇 태양에서는, 진핵 세포에 외래적으로 도입된 ADAR이어도 된다. 진핵 세포로의 ADAR의 도입은, ADAR 폴리펩타이드를 직접 도입해도, ADAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 도입해도 된다.
본 명세서에 있어서, "동일성"이란, EMBOSS NEEDLE program(J. Mol. Biol., 1970, Vol. 48, pp. 443-453) 검색에 의해 디폴트로 준비되어 있는 파라미터를 이용하여 얻어진 값(Identity)을 의미한다. 상기의 파라미터는 이하와 같다.
Gap Open penalty = 10
Gap Extend penalty = 0.5
Matrix = EBLOSUM62
<본 발명의 표적 RNA를 편집하는 시스템>
본 발명은 또한, 본 발명의 가이드 RNA 및 ADAR을 포함하는 표적 RNA를 편집하는 시스템을 제공한다. 본 발명의 가이드 RNA 및 ADAR을 포함하는 표적 RNA 서열을 편집하는 시스템이란, 본 발명의 가이드 RNA 및 ADAR을 포함하는 표적 RNA 서열을 편집하기 위한 키트, 또는 본 발명의 가이드 RNA 및 ADAR을 이용하여 표적 RNA 서열을 편집하는 방법을 포함한다. 본 발명의 표적 RNA를 편집하는 시스템은, 몇몇 태양에서는, 적어도 1개의 기능성 영역 및 해당 표적 RNA의 일부에 상보적이며 표적 RNA와 2본쇄를 형성하는 안티센스 영역을 포함하고, 적어도 1개의 해당 기능성 영역이 해당 안티센스 영역에 연결되어 있고, 해당 가이드 RNA가 ADAR 리크루트 염기 서열을 실질적으로 포함하지 않는 가이드 RNA, 및 ADAR을 포함하는, 시스템이며, 몇몇 태양에서는, 적어도 1개의 기능성 영역 및 해당 표적 RNA의 일부에 상보적이며 표적 RNA와 2본쇄를 형성하는 안티센스 영역을 포함하고, 적어도 1개의 해당 기능성 영역이 해당 안티센스 영역에 연결되어 있고, 해당 가이드 RNA가 ADAR 리크루트 염기 서열을 실질적으로 포함하지 않는 가이드 RNA, 및 ADAR1 또는 ADAR2를 포함하는, 시스템이다.
본 발명의 표적 RNA를 편집하는 시스템은, 세포내에서도 세포외에서도 이용할 수 있다. 몇몇 태양에서는, 해당 시스템을 진핵 세포 내에서 이용할 수 있다. 몇몇 태양에서는, 해당 시스템을 원핵 세포 내, 박테리아 내, 파지 내, 바이러스 내 등에서 이용할 수 있다.
<본 발명의 가이드 RNA를 코딩하는 핵산>
본 발명은 또한, 본 발명의 가이드 RNA를 코딩하는 핵산(본 항에 있어서 "본 발명의 핵산"이라고도 칭한다)을 제공한다. 본 발명의 핵산은, 적어도 1개의 기능성 영역 및 해당 표적 RNA의 일부에 상보적이며 표적 RNA와 2본쇄를 형성하는 안티센스 영역을 포함하고, 적어도 1개의 해당 기능성 영역이 해당 안티센스 영역에 연결되어 있고, 해당 가이드 RNA가 ADAR 리크루트 염기 서열을 실질적으로 포함하지 않는, 가이드 RNA를 코딩하는 핵산이다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 핵산은, 적어도 1개의 기능성 영역 및 해당 표적 RNA의 일부에 상보적이며 표적 RNA와 2본쇄를 형성하는 안티센스 영역을 포함하고, 적어도 1개의 해당 기능성 영역이 해당 안티센스 영역에 연결되어 있고, 해당 가이드 RNA가 ADAR 리크루트 염기 서열을 실질적으로 포함하지 않는, 가이드 RNA를 코딩하는 핵산이며, 해당 기능성 영역을 코딩하는 핵산으로서, 이하에 나타내는 핵산을 포함한다;
(1) 이하의 "기능성 영역을 코딩하는 핵산"에 나타내는 서열번호로부터 선택되는 1개의 서열번호로 나타나는 염기 서열로 이루어지는 핵산,
(2) 이하의 "기능성 영역을 코딩하는 핵산"에 나타내는 서열번호 12로 나타나는 염기 서열에 있어서 1 내지 20염기가 결실, 치환, 삽입, 및/혹은 부가된 염기 서열로서, 해당 기능성 영역으로서의 기능을 갖는 염기 서열로 이루어지는 핵산,
(3) 이하의 "기능성 영역을 코딩하는 핵산"에 나타내는 서열번호 13 또는 서열번호 14로 나타나는 염기 서열에 있어서 1 내지 10염기가 결실, 치환, 삽입, 및/혹은 부가된 염기 서열로서, 해당 기능성 영역으로서의 기능을 갖는 염기 서열로 이루어지는 핵산,
(4) 이하의 "기능성 영역을 코딩하는 핵산"에 나타내는 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 15, 또는 서열번호 16으로 나타나는 염기 서열에 있어서 1 내지 3염기가 결실, 치환, 삽입, 및/혹은 부가된 염기 서열로서, 해당 기능성 영역으로서의 기능을 갖는 영역을 코딩하는 염기 서열로 이루어지는 핵산, 혹은
(5) (1) 내지 (3)에 포함되는 핵산 중 몇 개의 조합:
기능성 영역을 코딩하는 핵산
U6 snRNA를 코딩하는 핵산: 서열번호 10
STL을 코딩하는 핵산: 서열번호 11
U1 snRNA를 코딩하는 핵산: 서열번호 12
U7 snRNA를 코딩하는 핵산: 서열번호 13
5S rRNA를 코딩하는 핵산: 서열번호 14
3Gq를 코딩하는 핵산: 서열번호 15
BoxB를 코딩하는 핵산: 서열번호 16
본 발명의 핵산은, 다이옥시리보핵산이 연결된 구조를 갖고, 예를 들면, DNA이며, 몇몇 태양에서는, DNA이다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 핵산은, 발현 벡터에 통합된 핵산이다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 핵산은, 플라스미드 벡터에 통합된 핵산이다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 핵산은, 바이러스 벡터에 통합된 핵산이다.
본 발명의 핵산으로 코딩되는 가이드 RNA의 구체적 태양은, 상기 <본 발명의 가이드 RNA>의 항에 있어서 기재되는 본 발명의 가이드 RNA의 태양과 마찬가지이다. 구체적인 예를 이하에 나타낸다. 본 발명의 핵산은, 몇몇 태양에서는, 이하의 어느 가이드 RNA를 코딩하는 핵산이다:
적어도 1개의 기능성 영역 및 해당 표적 RNA의 일부에 상보적이며 해당 표적 RNA와 2본쇄를 형성하는 안티센스 영역을 포함하고, 적어도 1개의 해당 기능성 영역이 해당 안티센스 영역에 직접 결합되어 있고, 해당 가이드 RNA가 ADAR 리크루트 염기 서열을 실질적으로 포함하지 않는, 가이드 RNA,
적어도 1개의 기능성 영역 및 해당 표적 RNA의 일부에 상보적이며 해당 표적 RNA와 2본쇄를 형성하는 안티센스 영역을 포함하고, 적어도 1개의 해당 기능성 영역이 해당 안티센스 영역에 링커를 개재시켜 연결되어 있고, 해당 가이드 RNA가 ADAR 리크루트 염기 서열을 실질적으로 포함하지 않는, 가이드 RNA, 또는
적어도 1개의 기능성 영역 및 해당 표적 RNA의 일부에 상보적이며 해당 표적 RNA와 2본쇄를 형성하는 안티센스 영역을 포함하고, 적어도 1개의 해당 기능성 영역이 해당 안티센스 영역에 연결되어 있고, 해당 가이드 RNA가 ADAR 리크루트 염기 서열을 실질적으로 포함하지 않는, 가이드 RNA로서, 해당 안티센스 영역은, 표적 RNA와 미스매치 염기쌍을 형성하는 염기를 갖는, 가이드 RNA.
몇몇 태양에서는, 본 발명의 핵산은, 적어도 1개의 기능성 영역 및 해당 표적 RNA의 일부에 상보적이며 표적 RNA와 2본쇄를 형성하는 안티센스 영역을 포함하고, 적어도 1개의 해당 기능성 영역이 해당 안티센스 영역에 연결되어 있고, 해당 가이드 RNA가 ADAR 리크루트 염기 서열을 실질적으로 포함하지 않는, 가이드 RNA를 코딩하는 핵산으로서, 해당 가이드 RNA가, 이하의 특징을 갖는다:
(1) 기능성 영역이, 가이드 RNA의 안정화, 가이드 RNA의 핵으로의 국재, 가이드 RNA의 세포질로의 국재, 표적 RNA와 안티센스 영역의 2본쇄 형성 촉진, 안티센스 영역에 의한 비특이적인 2본쇄 형성 저해, 및 표적 RNA와 안티센스 영역으로 형성되는 복합체의 안정화를 포함하는 기능 중 어느 1 이상의 기능을 갖는 염기 서열로 이루어지는 영역이다,
(2) 기능성 영역이, snRNA 서열로 이루어지는 영역, rRNA 서열로 이루어지는 영역, 구아닌 사중쇄 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역, 또는 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역, 혹은 그들의 어느 조합이다,
(3) 기능성 영역이, snRNA 서열로 이루어지는 영역 및 임의로 포함되는 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역이다,
(4) 기능성 영역이, U6 snRNA 서열로 이루어지는 영역, U1 snRNA 서열로 이루어지는 영역, 및 U7 snRNA 서열로 이루어지는 영역으로부터 선택되는 snRNA 서열로 이루어지는 영역, 및 임의로 포함되는 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역이다,
(5) 기능성 영역이, rRNA 서열로 이루어지는 영역 및 임의로 포함되는 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역이다,
(6) 기능성 영역이, 5S rRNA 서열로 이루어지는 영역 및 임의로 포함되는 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역이다,
(7) 기능성 영역이, 구아닌 사중쇄 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역 또는 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역, 혹은 그들의 조합이다,
(8) 가이드 RNA가, 안티센스 영역, 구아닌 사중쇄 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역, 임의로 포함되는 추가적인 기능성 영역, 및 임의로 포함되는 링커로 이루어지고, 안티센스 영역, 구아닌 사중쇄 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역, 및 임의로 포함되는 추가적인 기능성 영역이 이 순서로 5'측으로부터 3'측에 연결되어 있다, 또는
(9) 가이드 RNA가, 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역, 안티센스 영역, 임의로 포함되는 추가적인 기능성 영역, 및 임의로 포함되는 링커로 이루어지고, 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역 및 안티센스 영역이 이 순서로 5'측으로부터 3'측에 연결되어 있다.
<본 발명에서 사용되는 ADAR을 코딩하는 핵산>
본 발명에서 사용되는 ADAR을 코딩하는 핵산은, 상기 <본 발명에서 사용되는 ADAR>에 기재된 ADAR을 코딩하는 핵산이다. 몇몇 태양에서는, 본 발명에서 사용되는 ADAR을 코딩하는 핵산은, 액세션 번호 [NP_001103.1], 액세션 번호 [NP_056648.1], 또는 액세션 번호 [NP_001102.3]으로 나타나는 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열로 이루어지는 핵산, 혹은 이들 중 적어도 1개의 서열과 동일성이 90% 이상인 염기 서열 또는 이들 중 적어도 1개의 서열에 있어서 1 내지 10염기가 결실, 치환, 삽입 및/혹은 부가된 염기 서열로 이루어지고, 아데노신 데아미나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산이다. 본 발명에서 사용되는 ADAR을 코딩하는 핵산은, 몇몇 태양에서는, 서열번호 8로 나타나는 염기 서열로 이루어지는 핵산, 혹은 해당 서열과 동일성이 90% 이상인 염기 서열, 또는 해당 서열에 있어서 1 내지 10염기가 결실, 치환, 삽입 및/혹은 부가된 염기 서열로 이루어지고, 아데노신 데아미나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산이다.
<본 발명의 가이드 RNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터>
본 발명은 또한, 본 발명의 가이드 RNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터("본 발명의 발현 벡터"라고도 칭한다)를 제공한다. 본 발명은 또한, 본 발명의 가이드 RNA를 코딩하는 핵산과 ADAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 본 발명의 가이드 RNA를 코딩하는 핵산 및 ADAR을 코딩하는 핵산은, 동일한 발현 벡터에 탑재되어 있어도, 상이한 발현 벡터에 탑재되어 있어도 된다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 발현 벡터는, 본 발명의 가이드 RNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터 및 ADAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터의 조합이다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 발현 벡터는, 본 발명의 가이드 RNA를 코딩하는 핵산 및 ADAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터이다.
1. 본 발명에서 사용되는 발현 벡터
본 발명에서 사용되는 발현 벡터로서는, 본 발명의 가이드 RNA를 코딩하는 핵산으로부터 본 발명의 가이드 RNA를 발현할 수 있는 발현 벡터, 및/또는 ADAR을 발현할 수 있는 발현 벡터이면, 특별히 제한되지 않는다. 몇몇 태양에 있어서, 본 발명에서 사용되는 발현 벡터는 인간 세포에 있어서 본 발명의 가이드 RNA를 발현시키기 위해서, 및/또는 ADAR을 발현시키기 위해서 이용할 수 있는 발현 벡터이다. 몇몇 태양에서는, 본 발명에서 사용되는 발현 벡터의 예로서는, 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터(예를 들면, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노 수반 바이러스 벡터) 등을 들 수 있다.
2. 프로모터
본 발명의 발현 벡터는, 본 발명의 가이드 RNA를 코딩하는 핵산 및/또는 ADAR을 코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하고 있어도 된다. 본 명세서에 있어서, "작동 가능하게 연결된"이란, 핵산으로 코딩된 폴리펩타이드 또는 RNA가 숙주 세포에 있어서 발현 가능하도록, 적어도 1개의 프로모터가 핵산에 연결되어 있는 것을 의미한다. 본 발명의 발현 벡터에 포함되는 프로모터로서는 특별히 한정되지 않지만, 본 발명의 가이드 RNA 또는 ADAR을 코딩하는 핵산을 발현시키는 데 적합한 RNA 폴리머라아제(예를 들면, RNA 폴리머라아제 II(polII), RNA 폴리머라아제 III(polIII))에 대응한 프로모터를 사용할 수 있다. 본 발명의 가이드 RNA를 발현시키기 위해서는, 몇몇 태양으로서는, polII 또는 polIII에 대응한 프로모터를 이용할 수 있고, 다른 태양으로서는, polIII에 대응한 프로모터를 이용할 수 있다. ADAR을 발현시키기 위해서는, 몇몇 태양으로서는, polII에 대응한 프로모터를 이용할 수 있다.
polII에 대응한 프로모터로서는, 예를 들면, CMV(cytomegalovirus) 유래 프로모터, SV40(simian virus 40) 프로모터, RSV(respiratory syncytial virus) 프로모터, EF1α(Elongation factor 1α) 프로모터, CAG 프로모터, U1 snRNA 프로모터, U7 snRNA 프로모터 등을 들 수 있다. polIII에 대응한 프로모터로서는, 예를 들면, 인간 U6 snRNA 프로모터(U6)(Nat. Biotechnol., 2002, vol. 20, pp. 497-500), 고감도 U6 프로모터(Nucleic Acids Research, 2003, vol. 31, p. e100), 인간 H1 프로모터, 5S rRNA 프로모터, 그 외에, 당업자에게 공지된 다른 바이러스 및 진핵 세포 프로모터를 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 발현 벡터는, 사용하는 프로모터나 숙주 세포 등에 따라서, 번역 개시 코돈, 번역 종지 코돈, polIII의 전사 개시점에 바람직한 퓨린 염기(G 또는 A), polyA 시그널, polIII을 위한 연속 T의 터미네이터 서열, 인핸서, 비번역 영역, 스플라이싱 접합부 등을 추가로 포함하고 있어도 된다.
<본 발명의 숙주 세포>
본 발명은 또한, 본 발명의 가이드 RNA를 코딩하는 핵산을 도입하는 것에 의해 형질전환된 숙주 세포("본 발명의 숙주 세포"라고도 칭한다)를 제공한다. 몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 숙주 세포는, 본 발명의 발현 벡터가 도입된 숙주 세포이다. 몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 숙주 세포는, 플라스미드 벡터인 본 발명의 발현 벡터가 도입된 숙주 세포이다. 몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 숙주 세포는, 바이러스 벡터인 본 발명의 발현 벡터를 제조하기 위한 플라스미드 벡터가 도입된 숙주 세포이다. 몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 숙주 세포는, 바이러스 벡터인 본 발명의 발현 벡터가 도입된 숙주 세포이다.
본 발명의 발현 벡터가 도입되는 숙주 세포로서는, 특별히 한정되지 않지만, 본 발명의 가이드 RNA를 코딩하는 핵산 또는 본 발명의 발현 벡터의 산생에 사용할 수 있는 세포인 한, 당해 분야에서 공지된 세포를 선택할 수 있다. 벡터의 복제에 사용할 수 있는 숙주 세포로서는, 예를 들면, 본 발명의 기술 분야에 있어서 통상 사용되는 천연 세포 또는 인공적으로 수립된 세포 등 여러 가지 세포를 들 수 있다. 벡터의 복제에 사용할 수 있는 숙주 세포로서는, 예를 들면, 동물 세포(예를 들면, CHO 세포, HEK 293 세포 등), 곤충 세포(예를 들면, Sf9 등), 세균(대장균 등), 효모(사카로마이세스속, 피키아속 등) 등을 들 수 있다. 몇몇 태양으로서, 대장균을 숙주 세포로서 사용할 수 있다. 형질전환은, 당업자에게 공지된 방법으로 실시할 수 있다(Green, M. R. and Sambrook, J., Molecular Cloning: A　Laboratory Manual, 4th Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012).
<본 발명의 가이드 RNA를 코딩하는 핵산 및 본 발명의 발현 벡터를 제조하는 방법>
본 발명의 가이드 RNA를 코딩하는 핵산(본 항에 있어서 "본 발명의 핵산"이라고도 칭한다)은, 본 명세서에 기재된 서열 또는 공적으로 이용 가능한 서열 정보에 기초하여, 당해 분야에서 공지된 표준적인 폴리뉴클레오타이드 합성법을 사용하여 합성할 수 있다. 또한, 어떤 본 발명의 핵산을 취득하면, 부위 특이적 변이 유발법(Current Protocols in Molecular Biology edition, 1987, John Wiley & Sons Section) 등의 당업자에게 공지된 방법을 사용하여, 소정의 부위에 변이를 도입하는 것에 의해, 다른 본 발명의 핵산을 제작하는 것도 가능하다.
본 발명의 핵산 및 본 발명의 발현 벡터를 제조하는 방법에는, 본 발명의 핵산 또는 본 발명의 핵산을 포함하는 발현 벡터가 도입된 숙주 세포를 배양하는 공정을 포함하는, 핵산을 제조하는 방법이 포함된다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 핵산을 제조하는 방법은, 본 발명의 핵산이 도입된 숙주 세포를 배양하여, 본 발명의 핵산을 복제하는 공정을 포함한다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 핵산을 제조하는 방법은, 본 발명의 핵산을 포함하는 발현 벡터가 도입된 숙주 세포를 배양하여, 본 발명의 발현 벡터를 복제하는 공정을 포함한다. 본 발명의 발현 벡터가 바이러스 벡터인 경우에는, 본 발명의 발현 벡터를 제조하는 방법은, 본 발명의 핵산을 포함하는 바이러스 벡터 플라스미드가 도입된 숙주 세포를 배양하고, 숙주 세포 내에서 제작된 바이러스 벡터를 정제하는 공정을 포함한다. 바이러스 벡터는 당업자에게 공지된 방법에 의해 제작할 수 있다.
본 발명의 핵산 및 본 발명의 발현 벡터를 제조하는 방법은, 숙주 세포의 배양액을 회수하여 라이세이트(용균액)를 얻는 공정을 포함해도 된다. 라이세이트는, 예를 들면, 회수한 배양액을 알칼리 용해법 또는 보일링법으로 처리함으로써 얻을 수 있다. 본 발명의 핵산을 제조하는 방법은, 라이세이트로부터 핵산 또는 발현 벡터를 정제하는 공정을 추가로 포함해도 된다. 라이세이트로부터의 핵산 또는 발현 벡터의 정제에는, 이온 교환 크로마토그래피 및/또는 소수 상호작용 크로마토그래피를 이용할 수 있다. 본 발명의 발현 벡터가 바이러스 벡터인 경우에는, 라이세이트로부터의 바이러스 벡터의 정제에는, 염화 세슘 밀도 구배 원심분리법, 수크로스 구배 원심분리법, 아이오딕사놀(iodixanol) 밀도 구배 원심분리법, 한외 여과법, 다이아필트레이션법, 어피니티 크로마토그래피법, 이온 교환 크로마토그래피법, 폴리에틸렌 글라이콜 침전법이나 황산 암모늄 침전법 등을 이용할 수도 있다.
<본 발명의 가이드 RNA를 제조하는 방법>
본 발명의 가이드 RNA는, 서열 정보에 기초하여, 당해 분야에서 공지된 표준적인 폴리뉴클레오타이드 합성법을 사용하여 합성할 수 있다. 또한, 본 발명의 어떤 가이드 RNA를 취득하면, 부위 특이적 변이 유발법(Current Protocols in Molecular Biology edition, 1987, John Wiley & Sons Section) 등의 당업자에게 공지된 방법을 사용하여, 소정의 부위에 변이를 도입하는 것에 의해, 표적 RNA로의 유도 기능 및 표적 RNA를 편집하는 기능을 유지한 본 발명의 가이드 RNA의 개변체를 제작하는 것도 가능하다. 본 발명의 가이드 RNA는, 수식된 핵산을 이용하여 제조할 수도 있다. 본 발명의 가이드 RNA는, 본 발명의 가이드 RNA를 코딩하는 핵산을 이용하여 제작할 수도 있다. 예를 들면, 본 발명의 가이드 RNA는, 본 발명의 가이드 RNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터로부터 본 발명의 가이드 RNA를 전사시키는 것에 의해 제작할 수 있다.
<본 발명의 폴리뉴클레오타이드>
본 발명은 또한, 표적 RNA를 ADAR에 의해 편집하기 위한 폴리뉴클레오타이드로서, 적어도 1개의 기능성 영역 및 해당 표적 RNA의 일부에 상보적이며 표적 RNA와 2본쇄를 형성하는 안티센스 영역을 포함하고, 적어도 1개의 해당 기능성 영역이 해당 안티센스 영역에 연결되어 있고, 해당 폴리뉴클레오타이드가 ADAR 리크루트 염기 서열을 실질적으로 포함하지 않는, 폴리뉴클레오타이드(이하, "본 발명의 폴리뉴클레오타이드"라고도 칭한다)를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 "폴리뉴클레오타이드"에는, 수식되어 있지 않은 뉴클레오타이드(DNA 또는 RNA) 및 수식된 뉴클레오타이드가 포함된다. 본 발명에서 사용되는 수식된 뉴클레오타이드의 예로서는, 리보스의 2'-OH기가 수식된 뉴클레오타이드, 뉴클레오사이드 간의 포스포다이에스터 결합이 수식된 뉴클레오타이드, 리보스가 변환된 뉴클레오타이드, 퓨린 잔기 또는 피리미딘 잔기가 수식된 뉴클레오타이드, 분자내 가교된 리보스를 포함하는 뉴클레오타이드 등이 포함된다. 리보스의 2'-OH기가 수식된 뉴클레오타이드의 예로서는, 2'-O-메틸리보스, 2'-플루오로리보스 등을 포함하는 뉴클레오타이드를 들 수 있다. 뉴클레오사이드 간의 포스포다이에스터 결합이 수식된 뉴클레오타이드의 예로서는, 포스포로싸이오에이트, 메틸포스포네이트 등을 포함하는 뉴클레오타이드, 또는 펩타이드 결합 핵산(PNA: Peptide nucleic acid)을 들 수 있다. 리보스가 변환된 뉴클레오타이드에는, 모폴리노 핵산(PMO: morpholino nucleic acid) 등이 포함된다. 퓨린 잔기 또는 피리미딘 잔기가 수식된 뉴클레오타이드에는, 5-메틸-데옥시사이티딘-인산(5-Me-dCMP), 2-아미노-데옥시아데노신-인산(2-amino-dAMP), 및 C5-수식 피리미딘을 포함하는 뉴클레오타이드가 포함된다. 분자내 가교된 리보스를 포함하는 뉴클레오타이드에는, 로크드 핵산(LNA: locked nucleic acid) 등이 포함된다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는, 사용하는 염기 서열 및 수식의 종류에 기초하여 당해 분야에서 공지된 방법에 의해 제작 가능하다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 구체적 태양은, 상기 <본 발명의 가이드 RNA> 및 <본 발명의 가이드 RNA를 코딩하는 핵산>의 항에 있어서 기재되는 본 발명의 가이드 RNA의 태양과 마찬가지이다. 구체적인 예를 이하에 나타낸다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는, 몇몇 태양에서는, 이하의 어느 폴리뉴클레오타이드이다:
적어도 1개의 기능성 영역 및 해당 표적 RNA의 일부에 상보적이며 해당 표적 RNA와 2본쇄를 형성하는 안티센스 영역을 포함하고, 적어도 1개의 해당 기능성 영역이 해당 안티센스 영역에 직접 결합되어 있고, 해당 폴리뉴클레오타이드가 ADAR 리크루트 염기 서열을 실질적으로 포함하지 않는, 폴리뉴클레오타이드,
적어도 1개의 기능성 영역 및 해당 표적 RNA의 일부에 상보적이며 해당 표적 RNA와 2본쇄를 형성하는 안티센스 영역을 포함하고, 적어도 1개의 해당 기능성 영역이 해당 안티센스 영역에 링커를 개재시켜 연결되어 있고, 해당 폴리뉴클레오타이드가 ADAR 리크루트 염기 서열을 실질적으로 포함하지 않는, 폴리뉴클레오타이드, 및
적어도 1개의 기능성 영역 및 해당 표적 RNA의 일부에 상보적이며 해당 표적 RNA와 2본쇄를 형성하는 안티센스 영역을 포함하고, 적어도 1개의 해당 기능성 영역이 해당 안티센스 영역에 연결되어 있고, 해당 폴리뉴클레오타이드가 ADAR 리크루트 염기 서열을 실질적으로 포함하지 않는, 폴리뉴클레오타이드로서, 해당 안티센스 영역은, 표적 RNA와 미스매치 염기쌍을 형성하는 염기를 갖는, 폴리뉴클레오타이드.
몇몇 태양에서는, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는, 적어도 1개의 기능성 영역 및 해당 표적 RNA의 일부에 상보적이며 해당 표적 RNA와 2본쇄를 형성하는 안티센스 영역을 포함하고, 적어도 1개의 해당 기능성 영역이 해당 안티센스 영역에 연결되어 있고, 해당 폴리뉴클레오타이드가 ADAR 리크루트 염기 서열을 실질적으로 포함하지 않는, 폴리뉴클레오타이드로서, 해당 폴리뉴클레오타이드가, 이하의 특징을 갖는다:
(1) 기능성 영역이, 가이드 RNA의 안정화, 가이드 RNA의 핵으로의 국재, 가이드 RNA의 세포질로의 국재, 표적 RNA와 안티센스 영역의 2본쇄 형성 촉진, 안티센스 영역에 의한 비특이적인 2본쇄 형성 저해, 및 표적 RNA와 안티센스 영역으로 형성되는 복합체의 안정화를 포함하는 기능 중 어느 1 이상의 기능을 갖는 염기 서열로 이루어지는 영역이다,
(2) 기능성 영역이, snRNA 서열로 이루어지는 영역, rRNA 서열로 이루어지는 영역, 구아닌 사중쇄 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역, 또는 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역, 혹은 그들의 어느 조합이다,
(3) 기능성 영역이, snRNA 서열로 이루어지는 영역 및 임의로 포함되는 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역이다,
(4) 기능성 영역이, U6 snRNA 서열로 이루어지는 영역, U1 snRNA 서열로 이루어지는 영역, 및 U7 snRNA 서열로 이루어지는 영역으로부터 선택되는 snRNA 서열로 이루어지는 영역, 및 임의로 포함되는 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역이다,
(5) 기능성 영역이, rRNA 서열로 이루어지는 영역 및 임의로 포함되는 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역이다,
(6) 기능성 영역이, 5S rRNA 서열로 이루어지는 영역 및 임의로 포함되는 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역이다,
(7) 기능성 영역이, 구아닌 사중쇄 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역 또는 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역, 혹은 그들의 조합이다,
(8) 가이드 RNA가, 안티센스 영역, 구아닌 사중쇄 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역, 임의로 포함되는 추가적인 기능성 영역, 및 임의로 포함되는 링커로 이루어지고, 안티센스 영역, 구아닌 사중쇄 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역, 및 임의로 포함되는 추가적인 기능성 영역이 이 순서로 5'측으로부터 3'측에 연결되어 있다, 또는
(9) 가이드 RNA가, 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역, 안티센스 영역, 임의로 포함되는 추가적인 기능성 영역, 및 임의로 포함되는 링커로 이루어지고, 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역 및 안티센스 영역이 이 순서로 5'측으로부터 3'측에 연결되어 있다.
<본 발명의 의약 조성물>
본 발명은 또한, 본 발명의 가이드 RNA, 본 발명의 가이드 RNA를 코딩하는 핵산(본 항에 있어서 "본 발명의 핵산"이라고도 칭한다), 본 발명의 발현 벡터, 또는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 의약 조성물("본 발명의 의약 조성물"이라고도 칭한다)을 제공한다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 의약 조성물은, 본 발명의 가이드 RNA 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 의약 조성물이다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 의약 조성물은, 본 발명의 가이드 RNA, ADAR, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 의약 조성물이다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 의약 조성물은, 본 발명의 핵산 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 의약 조성물이다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 의약 조성물은, 본 발명의 핵산, ADAR, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 의약 조성물이다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 의약 조성물은, 본 발명의 가이드 RNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 의약 조성물이다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 의약 조성물은, 본 발명의 가이드 RNA를 코딩하는 핵산 및 ADAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 의약 조성물이다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 의약 조성물은, 본 발명의 가이드 RNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터, ADAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 의약 조성물이다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 의약 조성물은, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 의약 조성물이다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 의약 조성물은, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, ADAR, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 의약 조성물이다.
몇몇 태양에서는, 본 발명의 의약 조성물은, 본 발명의 가이드 RNA를 코딩하는 핵산 및 인간 ADAR1 또는 인간 ADAR2를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 의약 조성물이다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 의약 조성물은, 본 발명의 가이드 RNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터, 인간 ADAR1 또는 인간 ADAR2를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 의약 조성물이다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 의약 조성물은, 본 발명의 가이드 RNA를 코딩하는 핵산 및 서열번호 9로 나타나는 아미노산 서열의 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열, 또는 해당 아미노산 서열과 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열로 이루어지고, 아데노신 데아미나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열로 이루어지는 핵산을 포함하는 발현 벡터, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 의약 조성물이다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 의약 조성물은, 본 발명의 가이드 RNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터, 서열번호 9로 나타나는 아미노산 서열의 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열, 또는 해당 아미노산 서열과 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열로 이루어지고, 아데노신 데아미나아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열로 이루어지는 핵산을 포함하는 발현 벡터, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 의약 조성물이다.
본 발명의 의약 조성물은, 당해 분야에 있어서 통상 이용되는 부형제, 즉, 약제용 부형제나 약제용 담체 등을 이용하여, 통상 사용되는 방법에 의해 조제할 수 있다. 이들 의약 조성물의 제형의 예로서는, 주사제, 점적용제 등의 비경구제를 들 수 있고, 정맥내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 근육내 투여 등에 의해 투여할 수 있다. 제제화에 있어서는, 약학적으로 허용되는 범위에서, 이들 제형에 따른 부형제, 담체, 첨가제 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 가이드 RNA, 본 발명의 핵산, 본 발명의 발현 벡터, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, ADAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터, 또는 ADAR의 투여량은, 표적 RNA가 존재하는 세포, 환자의 증상의 정도나 연령, 사용하는 제제의 제형 등에 맞추어 적절히 투여량을 조정할 수 있다. 예를 들면, 0.001mg/kg 내지 100mg/kg의 범위의 투여량으로 할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물로 예방 또는 치료할 수 있는 질환은, 몇몇 태양으로서, 유전성 질환이고, 몇몇 태양으로서, 표적 RNA 중의 1개 이상의 아데노신 또는 사이티딘 뉴클레오사이드의 편집이 유익한 변화를 가져오는 임의의 질환이며, 몇몇 태양으로서, 표적 RNA 중의 1개 이상의 아데노신 뉴클레오사이드의 이노신으로의 변환이 유익한 변화를 가져오는 임의의 질환이다. 본 발명의 의약 조성물은, 표적 RNA 중의 1개 이상의 아데노신 또는 사이티딘 뉴클레오사이드의 편집이 유익한 변화를 가져오는 임의의 질환의 예방 또는 치료제로서 이용할 수 있다. 몇몇 태양으로서, 본 발명의 의약 조성물은, 표적 RNA 중의 1개 이상의 아데노신 뉴클레오사이드의 이노신으로의 변환이 유익한 변화를 가져오는 임의의 질환의 예방 또는 치료제로서 이용할 수 있다.
본 발명에는, 본 발명의 가이드 RNA, 본 발명의 핵산, 본 발명의 발현 벡터, 또는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 표적 RNA 중의 1개 이상의 아데노신 또는 사이티딘 뉴클레오사이드의 편집이 유익한 변화를 가져오는 임의의 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물이 포함된다. 또한, 본 발명에는, 본 발명의 가이드 RNA, 본 발명의 핵산, 본 발명의 발현 벡터, 또는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 예방 유효량 또는 치료 유효량을 투여하는 공정을 포함하는, 표적 RNA 중의 1개 이상의 아데노신 또는 사이티딘 뉴클레오사이드의 편집이 유익한 변화를 가져오는 임의의 질환을 예방 또는 치료하는 방법이 포함된다. 또한, 본 발명에는, 표적 RNA 중의 1개 이상의 아데노신 또는 사이티딘 뉴클레오사이드의 편집이 유익한 변화를 가져오는 임의의 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 본 발명의 가이드 RNA, 본 발명의 핵산, 본 발명의 발현 벡터, 또는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드가 포함된다. 또한, 본 발명에는, 표적 RNA 중의 1개 이상의 아데노신 또는 사이티딘 뉴클레오사이드의 편집이 유익한 변화를 가져오는 임의의 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물의 제조에 있어서의, 본 발명의 가이드 RNA, 본 발명의 핵산, 본 발명의 발현 벡터, 또는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 사용이 포함된다.
<본 발명의 표적 RNA를 편집하는 방법>
본 발명은 또한, 본 발명의 가이드 RNA를 이용한 표적 RNA를 편집하는 방법("본 발명의 편집 방법"이라고도 칭한다)을 제공한다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 편집 방법에서는, 본 발명의 가이드 RNA의 안티센스 영역이 표적 RNA와 2본쇄를 형성하고, 형성된 2본쇄 RNA에 ADAR이 리크루트되고, 리크루트된 ADAR이 표적 RNA 서열의 아데노신을 이노신으로 변환하는 방법을 포함한다. 여기에서, 이노신으로 변환되는 표적 RNA 상의 아데노신은, 안티센스 영역과 미스매치 염기쌍을 형성하고 있어도 된다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 편집 방법에서는, 본 발명의 가이드 RNA의 안티센스 영역이 표적 RNA와 2본쇄를 형성하고, 형성된 2본쇄 RNA에 ADAR이 리크루트되고, 리크루트된 ADAR이 표적 RNA 서열의 사이티딘을 유리딘으로 변환하는 방법을 포함한다. 여기에서, 유리딘으로 변환되는 표적 RNA 상의 사이티딘은, 안티센스 영역과 미스매치 염기쌍을 형성하고 있어도 된다.
본 발명의 편집 방법은, (i) 본 발명의 가이드 RNA, 본 발명의 가이드 RNA를 코딩하는 핵산, 본 발명의 발현 벡터, 또는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를, 표적 RNA를 갖는 세포, 바이러스 등에 도입하는 공정을 포함한다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 편집 방법은, (ii) ADAR, ADAR을 코딩하는 핵산, 또는 ADAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를, 해당 세포에 도입하는 공정을 추가로 포함한다. 공정(i) 및 (ii)는, 동시에 행해도 되고 따로따로 행해도 된다. 몇몇 태양에서는, 도입되는 표적 세포는, 진핵 세포 또는 원핵생물 등이고, 몇몇 태양에서는, 당해 세포는, 포유동물 세포, 박테리아 등이다. 몇몇 태양에서는, 도입되는 표적 바이러스에는, 파지를 포함한다. 몇몇 태양에서는, 표적 RNA의 아데노신이 이노신으로 변환되고, 다른 태양에서는, 표적 RNA의 사이티딘이 유리딘으로 변환된다. 또, 표적 RNA가 코딩 영역에 있는 경우는, 번역 시에 이노신을 구아노신으로 판독하는 공정을 포함하고 있어도 된다.
실시예
특별히 달리 언급이 없는 경우는, 이하의 실시예에 기재된 공정은, 공지된 방법에 따라 실시 가능하다. 또한, 시판되는 키트 또는 시약 등을 이용한 부분에 대해서는, 특별히 달리 언급이 없는 한 첨부된 프로토콜에 따라 실험을 행하였다.
실시예 1: 기능성 영역으로서 U6 snRNA 서열을 부가한 가이드 RNA 발현 플라스미드의 제작
pSUPER.neo 벡터(Oligoengine사, 카탈로그 번호 VEC-PBS-0004)의 H1 RNA polymerase III 프로모터(이하, H1 프로모터라고 칭한다)를, human U6 snRNA polymerase III(hU6) 프로모터 서열(서열번호 17)로 치환한 벡터를 구축하였다(이하, pSUPER.neo-U6 벡터라고 칭한다). hU6 프로모터 서열을 포함하는 단편은, hU6 프로모터를 갖는 pBAsi-hU6 Neo DNA(다카라 바이오사, 카탈로그 번호 3227)를 주형으로 하고, 5'측에 EcoRI 및 3'측에 BglII의 각 제한 효소 사이트를 부가하도록 하여, 표준적인 PCR법으로 증폭하였다. 반응에는, DNA 폴리머라아제 Gflex(다카라 바이오사, 카탈로그 번호 R060A)를 사용하였다. 얻어진 hU6 프로모터 단편을, 제한 효소 EcoRI 사이트(5'측) 및 BglII 사이트(3'측)를 사용하여 pSUPER.neo 벡터에 삽입하였다. 구축한 pSUPER.neo-U6 벡터로 E. coli DH5α Competent Cells(다카라 바이오사, 카탈로그 번호 9057, 이하, "DH5α 대장균주"라고 칭한다)를 형질전환하고, 액체 배양을 행하였다. 배양액을 원심하여 균체를 회수하고, NucleoBond(등록상표) Xtra Midi Plus EF(다카라 바이오사, 카탈로그 번호 U0422B)로 플라스미드 추출 정제를 행하여, 증폭된 pSUPER.neo-U6 벡터를 얻었다.
기능성 영역으로서 U6 snRNA 서열(이하, "U6"이라고 칭하는 경우가 있다)을 부가한 가이드 RNA 발현 플라스미드를 이하와 같이 구축하였다. pSUPER.neo-U6 벡터의 hU6 프로모터 하류에, 가이드 RNA U6-ASR-STL을 코딩하는 DNA 서열(서열번호 18)을, 제한 효소 BglII 사이트(5'측) 및 HindIII 사이트(3'측)를 사용하여 삽입하였다.
삽입하는 DNA 서열의 제작에 있어서는, 제한 효소 절단 말단을 형성하도록 합성한 포워드 올리고와 리버스 올리고(하기)를 어닐링하는 방법을 이용하였다.
포워드 올리고: 5'-GATCT-가이드 RNA를 코딩하는 DNA 서열-3'
리버스 올리고: 5'-AGCTT-가이드 RNA를 코딩하는 DNA 서열의 역상보 서열-3'
삽입한 DNA 서열에는, 5'측에 polIII의 전사 개시점에 바람직한 퓨린 염기(G 또는 A), 3'측에 polIII의 터미네이터 서열이 포함된다.
제작한 가이드 RNA 발현 플라스미드를 pSUPERneo_U6_gRNA라고 칭한다.
여기에서, ASR은, 실시예 4에서 사용되는 검출용 리포터 mRNA(Rluc-W104X)의 일부에 상보적인 24염기로 이루어지는 안티센스 염기 서열을 나타내고, 서열번호 18로 나타나는 DNA 서열 중, 37염기째로부터 60염기째까지의 서열로 코딩되는 RNA 서열로 이루어진다. U6은, 서열번호 1로 나타나는 RNA 서열로 이루어지고, U6을 코딩하는 핵산은 서열번호 10으로 나타나는 DNA 서열로 이루어진다. STL은, 서열번호 2로 나타나는 RNA 서열로 이루어지고, STL을 코딩하는 핵산은 서열번호 11로 나타나는 DNA 서열로 이루어진다.
가이드 RNA의 개요를 표 1에 나타낸다. 표 1에 있어서, "5'-"는 ASR의 5'측에 부가한 기능성 영역을, "-3'"는 ASR의 3'측에 부가한 기능성 영역을 나타낸다. "링커"는 ASR과 각 기능성 영역을 연결하는 서열을 나타낸다.
구축한 pSUPERneo_U6_gRNA 플라스미드를, DH5α 대장균주(다카라 바이오사, 카탈로그 번호 9057)를 이용하여 상기와 마찬가지로 하여 증식하였다.
실시예 2: 기능성 영역으로서 U1 snRNA 서열, U7 snRNA 서열, 또는 5S rRNA 서열을 부가한 가이드 RNA 발현 플라스미드의 제작
기능성 영역으로서 U1 snRNA 서열, U7 snRNA 서열, 또는 5S rRNA 서열(이하, 각각 "U1", "U7", "5S"라고 칭하는 경우가 있다)을 부가한 가이드 RNA 발현 플라스미드를 이하와 같이 제작하였다. pSUPER.neo 벡터의 H1 프로모터 상류에, 제한 효소 EcoRI 사이트(5'측) 및 HindIII 사이트(3'측)를 사용하여, 각각의 프로모터 서열 및 가이드 RNA를 코딩하는 DNA 서열을 삽입하였다. human U1 snRNA 프로모터 서열(서열번호 19), human U7 snRNA 프로모터 서열(서열번호 20), 또는 5S rRNA 프로모터 서열(서열번호 21) 직하에는, 하기의 가이드 RNA를 코딩하는 DNA 서열이 각각 연결되어 있다.
<가이드 RNA의 명칭 및 그것을 코딩하는 DNA 서열번호>
ASR-U1: 서열번호 22
ASR-U7: 서열번호 23
5S-ASR-STL: 서열번호 24
ASR-U1 및 5S-ASR-STL에는, 3'측에 폴리-T 서열이 포함된다.
U1은, 서열번호 3으로 나타나는 RNA 서열로 이루어지고, U1을 코딩하는 핵산은 서열번호 12로 나타나는 DNA 서열로 이루어진다. ASR-U1(서열번호 22)은, 서열번호 12 중 3염기째로부터 10염기째까지의 서열을 ASR로 치환한 염기 서열로 이루어진다.
U7은, 서열번호 4로 나타나는 RNA 서열로 이루어지고, U7을 코딩하는 핵산은 서열번호 13으로 나타나는 DNA 서열로 이루어진다.
5S는, 서열번호 5로 나타나는 RNA 서열로 이루어지고, 5S를 코딩하는 핵산은 서열번호 14로 나타나는 DNA 서열로 이루어진다.
각 가이드 RNA를 코딩하는 DNA 서열의 개요를 표 1에 나타낸다.
삽입하는 DNA 서열의 제작에 있어서는, DNA 합성(파스맥사)에 의해 제작하였다. 얻어진 플라스미드를 pSUPERneo_U1_gRNA, pSUPERneo_U7_gRNA, pSUPERneo_5S_gRNA라고 각각 칭한다.
구축한 플라스미드는 DH5α 대장균주(다카라 바이오사, 카탈로그 번호 9057)를 이용하여 실시예 1과 마찬가지의 방법으로 증식하였다.
실시예 3: 기능성 영역으로서 Gq 서열 및/또는 BoxB 서열 유래의 서열을 부가한 가이드 RNA 발현 플라스미드의 제작
기능성 영역으로서 Gq 서열(실시예 중에서는, 3Gq를 형성하는 서열을 Gq 서열이라고 칭하는 경우도 있다) 및/또는 BoxB 서열 유래의 서열을 부가한 가이드 RNA의 발현 플라스미드를 이하와 같이 제작하였다. pSUPER.neo 벡터의 H1 프로모터 하류에, 8종의 가이드 RNA를 코딩하는 DNA 서열(후술하는 <가이드 RNA의 명칭 및 그것을 코딩하는 DNA 서열번호>를 참조)을, 제한 효소 BglII 사이트(5'측) 및 HindIII 사이트(3'측)를 사용하여, 각각 삽입하였다.
<가이드 RNA의 명칭 및 그것을 코딩하는 DNA 서열번호>
ASR-Gq: 서열번호 25
Gq-ASR: 서열번호 26
ASR-BoxB: 서열번호 27
BoxB-ASR: 서열번호 28
Gq-ASR-BoxB: 서열번호 29
BoxB-ASR-Gq: 서열번호 30
ASR-Gq-BoxB: 서열번호 31
Gq-BoxB-ASR: 서열번호 32
삽입한 DNA 서열에는, 5'측에 polIII의 전사 개시점에 바람직한 퓨린 염기(G 또는 A), 3'측에 polIII의 터미네이터 서열이 포함된다.
Gq는, 서열번호 6으로 나타나는 RNA 서열로 이루어지고, Gq를 코딩하는 핵산은 서열번호 15로 나타나는 DNA 서열로 이루어진다. BoxB는, 서열번호 7로 나타나는 RNA 서열로 이루어지고, BoxB를 코딩하는 핵산은 서열번호 16으로 나타나는 DNA 서열로 이루어진다. 각 가이드 RNA의 개요를 표 1에 나타낸다.
삽입하는 DNA 서열은 실시예 1과 마찬가지의 방법을 이용하여 제작하였다. 얻어진 가이드 RNA 발현 플라스미드를 통틀어 pSUPERneo_H1_gRNA라고 칭한다.
구축한 플라스미드는 DH5α 대장균주(다카라 바이오사, 카탈로그 번호 9057)를 이용하여 실시예 1과 마찬가지의 방법으로 증식하였다.
한편, 비교 대조가 되는 가이드 RNA를, 기능성 영역을 포함하지 않고 ASR만을 코딩하는 DNA 서열(서열번호 33)을 이용하여, 상기와 마찬가지로 하여 제작하였다. 삽입한 DNA 서열에는, 5'측에 polIII의 전사 개시점에 바람직한 퓨린 염기(G 또는 A), 3'측에 polIII의 터미네이터 서열이 포함된다.
Figure pct00001
실시예 4: 세포내 표적 RNA의 편집 활성 검출용 리포터 발현 플라스미드의 제작
세포내 표적 RNA 편집 활성을 검출하기 위한 리포터 mRNA로서, 레닐라 루시페라아제(Renilla luciferase: Rluc) mRNA를 사용하였다. 세포내 표적 RNA 편집 활성 검출용 리포터 Rluc mRNA(Rluc-W104X)는, psiCHECK-2 벡터(프로메가사, 카탈로그 번호 C8021)에 탑재된 Rluc 유전자로 코딩되는 Rluc mRNA 서열에 기초하여 설계하였다. 구체적으로는, Rluc-W104X는, Rluc의 104번째의 아미노산인 Trp를 코딩하는 UGG의 311번째의 G가 A로 치환되어 있어, Trp 대신에 번역 종지 코돈(UAG)을 코딩하도록 설계하였다. Rluc-W104X 발현 플라스미드는, psiCHECK-2 벡터(프로메가사, 카탈로그 번호 C8021)를, 변이점 G311A를 포함하는 DNA 서열(서열번호 34)로, 제한 효소 DraIII 사이트(5'측) 및 AatII 사이트(3'측)를 사용하여 치환하여, 제작하였다. 얻어진 플라스미드를 psiCHECK-2_Rluc-W104X라고 칭한다. 구축한 psiCHECK-2_Rluc-W104X 벡터를 DH5α 대장균주(다카라 바이오사, 카탈로그 번호 9057)를 이용하여 실시예 1과 마찬가지의 방법으로 증식하였다.
실시예 5: ADAR2 발현 플라스미드의 제작
ADAR2 발현 플라스미드를, pAAV-CMV 벡터(다카라 바이오사, 카탈로그 번호 6230)의 CMV 유래 프로모터 하류의 제한 효소 EcoRI 사이트(5'측) 및 BamHI 사이트(3'측)에, ADAR2(서열번호 9)를 코딩하는 DNA 서열(서열번호 8)을, 제한 효소 EcoRI 사이트(5'측) 및 BglII 사이트(3'측)를 사용하여 삽입하여, 제작하였다. 얻어진 플라스미드를 pAAV-CMV-ADAR2라고 칭한다. 삽입한 DNA 서열에는 번역 개시 코돈 상류에 코작 서열(서열번호 8의 13염기째 내지 15염기째의 "ACC")을, ADAR2 유전자 하류에 종지 코돈을 배치하였다. 구축한 pAAV-CMV-ADAR2 플라스미드를 DH5α 대장균주(다카라 바이오사, 카탈로그 번호 9057)를 이용하여 실시예 1과 마찬가지의 방법으로 증식하였다.
실시예 6: 트랜스펙션
실험 1(표 2에 결과를 나타내는 루시페라아제 어세이 및 생어(Sanger) 시퀀싱에 의한 RNA 편집 효율의 검토를 위한 트랜스펙션)
인간 태아 신장 유래 세포주 HEK 293 세포를 5% 소 태아 혈청(FBS) 첨가 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM; Thermo Fisher Scientific사, 카탈로그 번호 10569-010)에 현탁하고, 96웰 플레이트에 2.0×104세포/100μL로 파종하고, 5% CO2 존재하 37℃에서 하룻밤 배양하였다.
실시예 4에서 제작한 세포내 표적 RNA 편집 활성 검출용 리포터 발현 플라스미드(psiCHECK-2_Rluc-W104X), 실시예 5에서 제작한 ADAR2 발현 플라스미드(pAAV-CMV-ADAR2), 실시예 1, 2, 또는 3에서 제작한 가이드 RNA 발현 플라스미드(pSUPERneo_U6_gRNA, pSUPERneo_U1_gRNA, pSUPERneo_U7_gRNA, pSUPERneo_5S_gRNA, 또는 pSUPERneo_H1_gRNA), 및 캐리어 플라스미드를, 각각 1:40:30:9의 중량비로 총량 100ng/웰이 되도록 혼합하였다. 캐리어 플라스미드로서 pHelper vector(다카라 바이오사, 카탈로그 번호 6230)를 사용하였다.
파종 후 하룻밤 배양한 HEK 293 세포에 LipofectamineTM 3000 Transfection Reagent(Thermo Fisher Scientific사, 카탈로그 번호 L3000015)로 트랜스펙션하였다. 비교 대조가 되는 가이드 RNA 발현 플라스미드도 마찬가지로 하여 트랜스펙션하였다.
트랜스펙션 후, 동일 조건에서 배양하고, 배양 3일 후의 세포를 실시예 7에 기재된 루시페라아제 어세이에 의한 RNA 편집 활성 및 실시예 8에 기재된 생어 시퀀싱에 의한 RNA 편집 효율의 검토에 제공하였다.
실험 2(표 3에 결과를 나타내는 루시페라아제 어세이 및 생어 시퀀싱에 의한 RNA 편집 효율의 검토를 위한 트랜스펙션)
세포내 표적 RNA 편집 활성 검출용 리포터 발현 플라스미드(psiCHECK-2_Rluc-W104X), ADAR2 발현 플라스미드(pAAV-CMV-ADAR2), 실시예 1 또는 3에서 제작한 가이드 RNA 발현 플라스미드(pSUPERneo_U6_gRNA 또는 pSUPERneo_H1_gRNA), 및 캐리어 플라스미드를, 각각 1:20:15:4의 중량비로 총량 100ng/웰이 되도록 혼합하고, 실험 1과 마찬가지의 방법을 이용하여 HEK 293 세포로의 트랜스펙션을 행하였다. 캐리어 플라스미드로서 pHelper vector(다카라 바이오사, 카탈로그 번호 6230)를 사용하였다.
실시예 7: 루시페라아제 어세이에 의한 RNA 편집 활성의 검출
실시예 6에서 트랜스펙션한 세포의 각 웰에 있어서, 트랜스펙션 효율을 보정하기 위한 반딧불이 루시페라아제 발광 강도(Fluc)와, 편집 활성을 평가하기 위한 레닐라 루시페라아제 발광 강도(Rluc)를, Dual-Glo(등록상표) Luciferase Assay System(프로메가사, 카탈로그 번호 E2940)과 EnVision(PerkinElmer사)을 이용하여 첨부 프로토콜에 따라 측정하였다.
표 2에 있어서, 실시예 6의 실험 1의 트랜스펙션 실험으로 얻어진 결과를 나타낸다.
표 2에는, 샘플 간의 트랜스펙션 효율을 보정하기 위해 Rluc/Fluc치를 산출하고, 비교 대조가 되는 ASR의 Rluc/Fluc치를 1로 한 경우의 각각의 가이드 RNA 샘플의 Rluc/Fluc치를 상대치로 나타내었다. 독립된 4시행의 산술 평균을 나타내었다.
Figure pct00002
"N.D."는 검출 한계 이하를 나타낸다.
표 3에 있어서, 실시예 6의 실험 2의 트랜스펙션 실험으로 얻어진 결과를 나타낸다.
표 3에는, 샘플 간의 트랜스펙션 효율을 보정하기 위해 Rluc/Fluc치를 산출하고, 3웰의 산술 평균치와 표준 편차치, 및 비교 대조가 되는 ASR의 Rluc/Fluc치를 1로 한 경우의 상대치로 나타낸 각각의 가이드 RNA 샘플의 Rluc/Fluc치를 나타내었다.
Figure pct00003
ADAR 단백질과 가이드 RNA에 의해 세포 내에서 표적 RNA의 A로부터 I로의 편집이 유도되면, 변이 도입한 번역 종지 코돈(UIG)은 mRNA로부터 번역될 때에 Trp가 되어, 레닐라 루시페라아제의 발광은 회복된다. 즉, Rluc치가 높을수록 RNA 편집 활성이 높은 것을 나타낸다.
표 2로부터, 안티센스 영역에 snRNA 또는 5S rRNA가 연결된 가이드 RNA, 안티센스 영역 3'측에 Gq만이 연결된 가이드 RNA, 안티센스 영역 5'측에 BoxB만이 연결된 가이드 RNA, 안티센스 영역 3'측에 Gq 및 BoxB가 연결된 가이드 RNA는, Rluc/Fluc치의 상대치가 비교 대조가 되는 안티센스 영역으로 이루어지는 가이드 RNA(ASR)에 대해서 2.0 이상을 나타내었다.
표 3으로부터, 안티센스 영역 5'측에 Gq 및 3'측에 BoxB가 연결된 가이드 RNA를 제외한 모든 가이드 RNA는, 비교 대조가 되는 ASR보다도 높은 Rluc/Fluc치를 나타내었다. 특히, 안티센스 영역에 U6이 연결된 가이드 RNA, 안티센스 영역 3'측에 Gq만이 연결된 가이드 RNA, 안티센스 영역 5'측에 BoxB만이 연결된 가이드 RNA, 안티센스 영역 3'측에 Gq 및 BoxB가 연결된 가이드 RNA는, Rluc/Fluc치의 상대치가 비교 대조가 되는 ASR에 대해서 5.0 이상을 나타내었다.
실시예 8: 생어 시퀀싱에 의한 RNA 편집 효율의 검토
실시예 6에서 트랜스펙션한 세포를 회수하고, 회수한 세포로부터 QIAshredder(QIAGEN사, 카탈로그 번호 79656), RNeasy Mini Kit(QIAGEN사, 카탈로그 번호 74106), RNase-free DNase Set(QIAGEN사, 카탈로그 번호 79254)를 이용하여 첨부 프로토콜에 따라 총RNA를 추출, 정제하였다. 정제한 RNA에 대해, Recombinant DNase I(RNase-free)(다카라 바이오사, 카탈로그 번호 2270A)를 이용하여 첨부 프로토콜에 따라 재차 DNA 소화 처리를 행하였다. 얻어진 RNA에 대해, SuperScript(등록상표) VILOTM cDNA Synthesis kit(Thermo Fisher Scientific사, 카탈로그 번호 11754-250)를 이용하여 첨부 프로토콜에 따라 역전사 반응을 행하여, cDNA를 얻었다. cDNA를 주형으로 하고, 편집점을 포함하는 단편을 증폭하는 하기 프라이머와 PrimeSTAR(등록상표) GXL DNA Polymerase(다카라 바이오사, 카탈로그 번호 R050A)를 이용하여 첨부 프로토콜에 따라 PCR 반응을 행하였다.
<표 2의 실험에서 사용한 프라이머>
포워드 프라이머: ATGGCTTCCAAGGTGTACGACC(서열번호 35)
리버스 프라이머: TTACTGCTCGTTCTTCAGCACG(서열번호 36)
<표 3의 실험에서 사용한 프라이머>
포워드 프라이머: CTCGCTGCAAGCAAATGAAC(서열번호 37)
리버스 프라이머: TCGTCCCAGGACTCGATCAC(서열번호 38)
PCR 증식 단편은 ExoSAP-ITTM Express PCR Product Cleanup Reagents(Thermofisher Scientific사, 카탈로그 번호 75001.200.UL)를 이용하여 첨부 프로토콜에 따라 정제하여, PCR 증식에 이용한 포워드 프라이머와 함께 3730 xl(엑스엘) DNA Analyzer(Applied Biosystems사)에 의한 생어 시퀀싱 반응에 제공하였다.
표 2에 있어서, 실시예 6의 실험 1의 트랜스펙션 실험으로 얻어진 결과를 나타낸다.
생어 시퀀싱 반응으로 얻어진 파형 데이터 파일(확장자: .ab1)에, QSVanalyzer(Bioinformatics, 2009, Vol. 25, p3244-3250)에 의해 해석을 가하고, 구아닌(G)의 시그널 강도의 비(G/(G＋A)×100)를 RNA 편집 효율(%)로 하였다. "N.D."는 검출 한계 이하를 나타낸다. 대표예의 결과를 나타낸다.
표 3에 있어서, 실시예 6의 실험 2의 트랜스펙션 실험으로 얻어진 결과를 나타낸다.
표 3에서는, 얻어진 파형 데이터 파일(확장자: .ab1)에, QSVanalyzer에 의해 해석을 가하였다. 미편집 Rluc-W104X의 G의 시그널 강도를 0, 또한 A의 시그널 강도를 1, 야생형 Rluc의 G의 시그널 강도를 1, 또한 A의 시그널 강도를 0으로 보정했을 때의, G의 보정한 시그널 강도의 비(G/(G＋A)×100)를 RNA 편집 효율(%)로 하였다. 대표예의 결과를 나타낸다.
표 2로부터, 비교 대조가 되는 ASR이 유도하는 RNA 편집 효율은 검출 한계 이하였다. 동일 조건에 있어서, 안티센스 영역에 snRNA 또는 5S rRNA가 연결된 가이드 RNA, 안티센스 영역 3'측에 Gq만이 연결된 가이드 RNA, 안티센스 영역 5'측에 BoxB만이 연결된 가이드 RNA, 안티센스 영역 3'측에 Gq 및 BoxB가 연결된 가이드 RNA는, 23% 이상의 RNA 편집 효율을 나타내었다.
표 3에 기재된 기능성 영역이 연결된 안티센스 영역을 포함하는 본 발명의 가이드 RNA는, 비교 대조가 되는 ASR보다도 높은 RNA 편집 효율을 나타내었다. 특히, 안티센스 영역에 U6이 연결된 가이드 RNA, 안티센스 영역 3'측에 Gq만이 연결된 가이드 RNA, 안티센스 영역 5'측에 BoxB만이 연결된 가이드 RNA, 안티센스 영역 3'측에 Gq 및 BoxB가 연결된 가이드 RNA는, 47% 이상의 RNA 편집 효율을 나타내었다.
실시예 9: 반딧불이 루시페라아제(Fluc) mRNA를 표적으로 한 RNA 편집 효율의 검토
본 발명의 가이드 RNA가 상이한 표적 RNA에 대해서도 높은 RNA 편집 효율을 나타내는지를 확인하였다.
psiCHECK-2 벡터(프로메가사, 카탈로그 번호 C8021)에 탑재되어 있는 반딧불이 루시페라아제(Fluc)의 코딩 영역 내 167번째의 A를 편집 표적으로 한 가이드 RNA 발현 플라스미드를, 실시예 1 및 3과 마찬가지로 하여 제작하였다. 제작에 사용한 가이드 RNA를 코딩하는 DNA 서열은 하기와 같다.
<가이드 RNA의 명칭 및 그것을 코딩하는 DNA 서열번호>
U6-ASRf-STL: 서열번호 39
ASRf-Gq: 서열번호 40
Gq-ASRf: 서열번호 41
ASRf-BoxB: 서열번호 42
BoxB-ASRf: 서열번호 43
Gq-ASRf-BoxB: 서열번호 44
BoxB-ASRf-Gq: 서열번호 45
ASRf-Gq-BoxB: 서열번호 46
Gq-BoxB-ASRf: 서열번호 47
DNA 서열에는, 5'측에 polIII의 전사 개시점에 바람직한 퓨린 염기(G 또는 A), 3'측에 polIII의 터미네이터 서열이 포함된다.
얻어진 플라스미드를, 통틀어 pSUPERneo_gRNAf라고 칭한다.
ASRf는, 편집 표적인 A를 포함하는 Fluc 리포터 mRNA에 상보적인 24염기로 이루어지는 안티센스 염기 서열을 나타내고, 서열번호 40으로 나타나는 DNA 서열의 3염기째로부터 26염기째까지의 서열로 코딩되는 RNA 염기 서열로 이루어진다.
한편, 비교 대조가 되는 가이드 RNA 발현 플라스미드도 마찬가지로 하여, 기능성 영역을 포함하지 않고 ASRf만을 코딩하는 DNA 서열(서열번호 48)을 이용하여 제작하였다.
실시예 6의 실험 1과 마찬가지로 하여, Fluc 리포터 발현 플라스미드(psiCHECK-2(프로메가사, C8021), 실시예 5에서 제작한 ADAR2 발현 플라스미드(pAAV-CMV-ADAR2), 상기의 가이드 RNA 발현 플라스미드(pSUPERneo_gRNAf), 및 캐리어 플라스미드를, 각각 1:80:100:19의 중량비로 총량 100ng/웰이 되도록 혼합하고 HEK 293 세포에 LipofectamineTM 3000 Transfection Reagent(Thermo Fisher Scientific사, 카탈로그 번호 L3000015)를 이용하여 트랜스펙션하였다. 비교 대조가 되는 가이드 RNA 발현 플라스미드도 마찬가지로 하여 트랜스펙션하였다. 캐리어 플라스미드로서 pHelper vector(다카라 바이오사, 카탈로그 번호 6230)를 사용하였다.
실시예 8(표 2의 경우)과 마찬가지로 하여 PCR 반응을 행하고, 시퀀스 프라이머를 이용하여 생어 시퀀싱 반응을 행하였다. Fluc 리포터 mRNA를 표적으로 한 RNA 편집 효율을, 생어 시퀀싱 반응의 파형 데이터 파일로부터 표 2와 마찬가지로 산출하였다. 본 시험의 PCR 반응 및 생어 시퀀싱 반응에 이용한 프라이머를 하기에 나타내었다.
포워드 프라이머 Fluc: ACCCGCTTAAAAGCTTGGC(서열번호 49)
리버스 프라이머 Fluc: CCACGGTAGGCTGAGAAATG(서열번호 50)
시퀀스 프라이머: CATGCTGTTCAGCAGCTCGC(서열번호 51)
독립된 3시행의 산술 평균을 표 4에 나타낸다.
Figure pct00004
안티센스 영역에 U6이 연결된 가이드 RNA, 안티센스 영역 5'측 또는 3'측에 Gq만이 연결된 가이드 RNA, 안티센스 영역 3'측에 BoxB만이 연결된 가이드 RNA, 안티센스 영역 5'측에 BoxB 및 3'측에 Gq가 연결된 가이드 RNA, 안티센스 영역 3'측에 Gq 및 BoxB가 연결된 가이드 RNA에서, 비교 대조가 되는 ASRf보다도 높은 RNA 편집 효율을 나타내었다. 특히, 안티센스 영역에 U6이 연결된 가이드 RNA, 안티센스 영역 3'측에 Gq만이 연결된 가이드 RNA, 안티센스 영역 5'측에 BoxB 및 3'측에 Gq가 연결된 가이드 RNA는 17% 이상의 RNA 편집 효율을 나타내었다.
실시예 10: 가이드 RNA의 세포내에서의 안정성의 검토
가이드 RNA의 세포내에서의 안정성은, 전사 저해 후의 가이드 RNA의 잔존량의 비교에 의해 평가할 수 있다. 가이드 RNA의 세포로의 도입 후에 목적으로 하는 가이드 RNA의 잔존량이 많을수록 안정성이 높은 것을 의미한다.
HEK 293 세포를 5% FBS 첨가 DMEM에서 배양하고, 24웰 플레이트에 1×105세포/0.5mL로 파종하고, 5% CO2 존재하 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 다음날, 실시예 4에서 제작한 세포내 표적 RNA 편집 활성 검출용 리포터 발현 플라스미드(psiCHECK-2_Rluc-W104X), 실시예 5에서 제작한 ADAR2 발현 플라스미드(pAAV-CMV-ADAR2), 실시예 1 또는 3에서 제작한 가이드 RNA 발현 플라스미드(pSUPERneo_H1_gRNA 또는 pSUPERneo_U6_gRNA), 및 캐리어 플라스미드를, 각각 1:40:30:9의 중량비로 총량 400ng/웰이 되도록 혼합하였다. 캐리어 플라스미드로서 pHelper vector(다카라 바이오사, 카탈로그 번호 6230)를 사용하였다. LipofectamineTM 3000 Transfection Reagent(Thermo Fisher Scientific사, 카탈로그 번호 L3000015)를 이용하여 HEK 293 세포에 트랜스펙션하였다.
트랜스펙션 24시간 후에 일부 웰의 세포를 회수하고, 액티노마이신 D 첨가 전의 상태를 0시간으로 하였다. 동시에, 회수하지 않았던 웰은 액티노마이신 D(와코 준야쿠사, 카탈로그 번호 010-21263)를 5μg/mL로 첨가한 DMEM로 치환하였다. 액티노마이신 D는 2본쇄 DNA에 결합하여 RNA 폴리머라아제에 의한 전사를 저해하는 것이 알려져 있다. 액티노마이신 D 첨가 후 4시간 및 6시간에 있어서 세포를 회수하고, 회수한 세포로부터 miRNeasy Mini Kit(QIAGEN사, 카탈로그 번호 217004) 및 RNase-free DNase Set(QIAGEN사, 카탈로그 번호 79254)를 이용하여 첨부 프로토콜에 따라 가이드 RNA를 포함하는 총RNA를 추출, 정제하였다. 얻어진 RNA에 대해, Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit(다카라 바이오사, 카탈로그 번호 638315)를 이용하여 첨부 프로토콜에 따라 small RNA에 폴리A 부가를 행한 후, 역전사 반응을 행하여 cDNA를 얻었다. cDNA를 주형으로 하고, PrimeSTAR(등록상표) GXL DNA Polymerase(다카라 바이오사, 카탈로그 번호 R050A)를 이용하여 2종류의 터치다운 PCR 반응을 행하였다. 세포에 내재성으로 발현하는 U6 snRNA의 PCR 반응에는, Mir-X miRNA qRT-PCR TB Green(등록상표) Kit(다카라 바이오사, 카탈로그 번호 638314)에 첨부된 U6 Forward Primer 및 U6 Reverse Primer를 이용하였다. 세포 내재성 U6 snRNA양은 샘플 간의 가이드 RNA양의 보정에 이용하였다. 가이드 RNA의 PCR 반응에는 ASR과 상동인 서열(서열번호 52)의 프라이머 및 상기 키트에 첨부된 mRQ 3' Primer를 이용하였다. 터치다운 PCR의 반응 조건은, 94℃, 1분의 사이클 전 열변성 스테이지, 98℃, 10초의 열변성, 65℃, 15초의 어닐링, 및 68℃, 30초의 신장 반응을 포함하는 증폭 스테이지, 및 72℃, 3분의 신장 반응 스테이지로 구성된다. 이 중, 증폭 스테이지의 1사이클째 내지 5사이클째는, 사이클의 경과마다 어닐링 온도가 1℃씩 저하되는 터치다운 방식이며, 6사이클째 이후의 어닐링 온도는 60℃에서 유지된다. 세포 내재성 U6 snRNA의 PCR의 증식 스테이지는 전체 23사이클, 가이드 RNA의 PCR의 증식 스테이지는 전체 20사이클로 실시하였다.
각각의 PCR 산물은 2% 아가로스 겔을 이용하여 전기영동하고, 영동 결과를 ChemiDocTM Touch Imaging System(Bio-Rad사)으로 촬영하였다. PCR 밴드는 Image Lab 6.1 Software for Windows(BIO RAD사)로 정량하였다.
표 5에서는, 가이드 RNA를 주형으로 한 PCR 밴드의 시그널 강도를 세포 내재성 U6 snRNA를 주형으로 한 PCR 밴드의 시그널 강도로 보정한 값(가이드 RNA/U6치)을 산출하였다. 가이드 RNA의 잔존량으로서, 액티노마이신 D 첨가 전의 값을 1로 하여 액티노마이신 D 첨가 후 4시간 및 6시간에 있어서의 가이드 RNA/U6치의 상대치를 나타내었다. 독립된 3시행의 산술 평균을 나타내었다.
Figure pct00005
액티노마이신 D 첨가 후의 가이드 RNA의 잔존량이 많을수록, 세포내에서의 당해 가이드 RNA의 안정성이 높은 것을 의미하고 있다.
표 5에 나타낸 본 발명의 가이드 RNA는, 비교 대조가 되는 ASR에 비해, 액티노마이신 D 첨가 후 4시간 및 6시간에 있어서 높은 가이드 RNA의 잔존량을 나타내어, 안정성이 높은 것이 확인되었다.
본 발명의 가이드 RNA는, 표적 RNA 편집에 유용하고, 본 발명의 가이드 RNA, 본 발명의 가이드 RNA를 코딩하는 핵산, 본 발명의 발현 벡터, 또는 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 의약 조성물은, 유전성 질환을 비롯하여 표적 RNA를 편집하는 것에 의해 예방 또는 치료할 수 있는 여러 가지 질환에 사용할 수 있는 점에서 유용하다.
서열번호 1 내지 7: 합성 RNA
서열번호 10 내지 52: 합성 DNA
SEQUENCE LISTING <110> Astellas Pharma Inc. <120> A target RNA-editing antisense-type guide RNA to which a functional sequence is added <130> A20028A00 <150> JP2019-222437 <151> 2019-12-09 <160> 52 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic RNA <400> 1 gugcucgcuu cggcagcaca uauacua 27 <210> 2 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic RNA <400> 2 gcggacuucg guccgcuuuu 20 <210> 3 <211> 216 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic RNA <400> 3 auacuuaccu ggcaggggag auaccaugau cacgaaggug guuuucccag ggcgaggcuu 60 auccauugca cuccggaugu gcugaccccu gcgauuuccc caaauguggg aaacucgacu 120 gcauaauuug ugguaguggg ggacugcguu cgcgcuuucc ccugacuuuc uggaguuuca 180 aaaguagacu guacgcuaag ggucauaucu uuuuuu 216 <210> 4 <211> 149 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic RNA <400> 4 aauuuuugga gcagguuuuc ugacuucggu cggaaaaccc cucccaauuu cacuggucua 60 caaugaaagc aaaacaguuc ucuuccccgc uccccggugu gugagagggg cuuugauccu 120 ucucugguuu ccuaggaaac gcguaugug 149 <210> 5 <211> 118 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic RNA <400> 5 gucuacggcc auaccacccu gaacgcgccc gaucucgucu gaucucggaa gcuaagcagg 60 gucgggccug guuaguacuu ggaugggaga ccgccuggga auaccgggug cuguaggc 118 <210> 6 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic RNA <400> 6 ggguuugggu uuggguuugg guuu 24 <210> 7 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic RNA <400> 7 agagggcccu gaagagggcc cuuu 24 <210> 8 <211> 2127 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (16)..(2118) <400> 8 gaattcgccg ccacc atg gat ata gaa gat gaa gaa aac atg agt tcc agc 51 Met Asp Ile Glu Asp Glu Glu Asn Met Ser Ser Ser 1 5 10 agc act gat gtg aag gaa aac cgc aat ctg gac aac gtg tcc ccc aag 99 Ser Thr Asp Val Lys Glu Asn Arg Asn Leu Asp Asn Val Ser Pro Lys 15 20 25 gat ggc agc aca cct ggg cct ggc gag ggc tct cag ctc tcc aat ggg 147 Asp Gly Ser Thr Pro Gly Pro Gly Glu Gly Ser Gln Leu Ser 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Phe Val Met Ser Val Val 255 260 265 gtg gat ggt cag ttc ttt gaa ggc tcg ggg aga aac aag aag ctt gcc 867 Val Asp Gly Gln Phe Phe Glu Gly Ser Gly Arg Asn Lys Lys Leu Ala 270 275 280 aag gcc cgg gct gcg cag tct gcc ctg gcc gcc att ttt aac ttg cac 915 Lys Ala Arg Ala Ala Gln Ser Ala Leu Ala Ala Ile Phe Asn Leu His 285 290 295 300 ttg gat cag acg cca tct cgc cag cct att ccc agt gag ggt ctt cag 963 Leu Asp Gln Thr Pro Ser Arg Gln Pro Ile Pro Ser Glu Gly Leu Gln 305 310 315 ctg cat tta ccg cag gtt tta gct gac gct gtc tca cgc ctg gtc ctg 1011 Leu His Leu Pro Gln Val Leu Ala Asp Ala Val Ser Arg Leu Val Leu 320 325 330 ggt aag ttt ggt gac ctg acc gac aac ttc tcc tcc cct cac gct cgc 1059 Gly Lys Phe Gly Asp Leu Thr Asp Asn Phe Ser Ser Pro His Ala Arg 335 340 345 aga aaa gtg ctg gct gga gtc gtc atg aca aca ggc aca gat gtt aaa 1107 Arg Lys Val Leu Ala Gly Val Val Met Thr Thr Gly Thr Asp Val Lys 350 355 360 gat gcc aag gtg ata agt gtt tct aca gga aca aaa tgt att aat ggt 1155 Asp Ala Lys Val Ile Ser Val Ser Thr Gly Thr Lys Cys Ile Asn Gly 365 370 375 380 gaa tac atg agt gat cgt ggc ctt gca tta aat gac tgc cat gca gaa 1203 Glu Tyr Met Ser Asp Arg Gly Leu Ala Leu Asn Asp Cys His Ala Glu 385 390 395 ata ata tct cgg aga tcc ttg ctc aga ttt ctt tat aca caa ctt gag 1251 Ile Ile Ser Arg Arg Ser Leu Leu Arg Phe Leu Tyr Thr Gln Leu Glu 400 405 410 ctt tac tta aat aac aaa gat gat caa aaa aga tcc atc ttt cag aaa 1299 Leu Tyr Leu Asn Asn Lys Asp Asp Gln Lys Arg Ser Ile Phe Gln Lys 415 420 425 tca gag cga ggg ggg ttt agg ctg aag gag aat gtc cag ttt cat ctg 1347 Ser Glu Arg Gly Gly Phe Arg Leu Lys Glu Asn Val Gln Phe His Leu 430 435 440 tac atc agc acc tct ccc tgt gga gat gcc aga atc ttc tca cca cat 1395 Tyr Ile Ser Thr Ser Pro Cys Gly Asp Ala Arg Ile Phe Ser Pro His 445 450 455 460 gag cca atc ctg gaa gaa cca gca gat aga cac cca aat cgt aaa gca 1443 Glu Pro Ile Leu Glu Glu Pro Ala Asp Arg His Pro Asn Arg Lys Ala 465 470 475 aga gga cag cta cgg acc aaa ata gag tct ggt gag ggg acg att cca 1491 Arg Gly Gln Leu Arg Thr Lys Ile Glu Ser Gly Glu Gly Thr Ile Pro 480 485 490 gtg cgc tcc aat gcg agc atc caa acg tgg gac ggg gtg ctg caa ggg 1539 Val Arg Ser Asn Ala Ser Ile Gln Thr Trp Asp Gly Val Leu Gln Gly 495 500 505 gag cgg ctg ctc acc atg tcc tgc agt gac aag att gca cgc tgg aac 1587 Glu Arg Leu Leu Thr Met Ser Cys Ser Asp Lys Ile Ala Arg Trp Asn 510 515 520 gtg gtg ggc atc cag gga tcc ctg ctc agc att ttc gtg gag ccc att 1635 Val Val Gly Ile Gln Gly Ser Leu Leu Ser Ile Phe Val Glu Pro Ile 525 530 535 540 tac ttc tcg agc atc atc ctg ggc agc ctt tac cac ggg gac cac ctt 1683 Tyr Phe Ser Ser Ile Ile Leu Gly Ser Leu Tyr His Gly Asp His Leu 545 550 555 tcc agg gcc atg tac cag cgg atc tcc aac ata gag gac ctg cca cct 1731 Ser Arg Ala Met Tyr Gln Arg Ile Ser Asn Ile Glu Asp Leu Pro Pro 560 565 570 ctc tac acc ctc aac aag cct ttg ctc agt ggc atc agc aat gca gaa 1779 Leu Tyr Thr Leu Asn Lys Pro Leu Leu Ser Gly Ile Ser Asn Ala Glu 575 580 585 gca cgg cag cca ggg aag gcc ccc aac ttc agt gtc aac tgg acg gta 1827 Ala Arg Gln Pro Gly Lys Ala Pro Asn Phe Ser Val Asn Trp Thr Val 590 595 600 ggc gac tcc gct att gag gtc atc aac gcc acg act ggg aag gat gag 1875 Gly Asp Ser Ala Ile Glu Val Ile Asn Ala Thr Thr Gly Lys Asp Glu 605 610 615 620 ctg ggc cgc gcg tcc cgc ctg tgt aag cac gcg ttg tac tgt cgc tgg 1923 Leu Gly Arg Ala Ser Arg Leu Cys Lys His Ala Leu Tyr Cys Arg Trp 625 630 635 atg cgt gtg cac ggc aag gtt ccc tcc cac tta cta cgc tcc aag att 1971 Met Arg Val His Gly Lys Val Pro Ser His Leu Leu Arg Ser Lys Ile 640 645 650 acc aag ccc aac gtg tac cat gag tcc aag ctg gcg gca aag gag tac 2019 Thr Lys Pro Asn Val Tyr His Glu Ser Lys Leu Ala Ala Lys Glu Tyr 655 660 665 cag gcc gcc aag gcg cgt ctg ttc aca gcc ttc atc aag gcg ggg ctg 2067 Gln Ala Ala Lys Ala Arg Leu Phe Thr Ala Phe Ile Lys Ala Gly Leu 670 675 680 ggg gcc tgg gtg gag aag ccc acc gag cag gac cag ttc tca ctc acg 2115 Gly Ala Trp Val Glu Lys Pro Thr Glu Gln Asp Gln Phe Ser Leu Thr 685 690 695 700 ccc tgaagatcc 2127 Pro <210> 9 <211> 701 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Asp Ile Glu Asp Glu Glu Asn Met Ser Ser Ser Ser Thr Asp Val 1 5 10 15 Lys Glu Asn Arg Asn Leu Asp Asn Val Ser Pro Lys Asp Gly Ser Thr 20 25 30 Pro Gly Pro Gly Glu Gly Ser Gln Leu Ser Asn Gly Gly Gly Gly Gly 35 40 45 Pro Gly Arg Lys Arg Pro Leu Glu Glu Gly Ser Asn Gly His Ser Lys 50 55 60 Tyr Arg Leu Lys Lys Arg Arg Lys Thr Pro Gly Pro Val Leu Pro Lys 65 70 75 80 Asn Ala Leu Met Gln Leu Asn Glu Ile Lys Pro Gly Leu Gln Tyr Thr 85 90 95 Leu Leu Ser Gln Thr Gly Pro Val His Ala Pro Leu Phe Val Met Ser 100 105 110 Val Glu Val Asn Gly Gln Val Phe Glu Gly Ser Gly Pro Thr Lys Lys 115 120 125 Lys Ala Lys Leu His Ala Ala Glu Lys Ala Leu Arg Ser Phe Val Gln 130 135 140 Phe Pro Asn Ala Ser Glu Ala His Leu Ala Met Gly Arg Thr Leu Ser 145 150 155 160 Val Asn Thr Asp Phe Thr Ser Asp Gln Ala Asp Phe Pro Asp Thr Leu 165 170 175 Phe Asn Gly Phe Glu Thr Pro Asp Lys Ala Glu Pro Pro Phe Tyr Val 180 185 190 Gly Ser Asn Gly Asp Asp Ser Phe Ser Ser Ser Gly Asp Leu Ser Leu 195 200 205 Ser Ala Ser Pro Val Pro Ala Ser Leu Ala Gln Pro Pro Leu Pro Val 210 215 220 Leu Pro Pro Phe Pro Pro Pro Ser Gly Lys Asn Pro Val Met Ile Leu 225 230 235 240 Asn Glu Leu Arg Pro Gly Leu Lys Tyr Asp Phe Leu Ser Glu Ser Gly 245 250 255 Glu Ser His Ala Lys Ser Phe Val Met Ser Val Val Val Asp Gly Gln 260 265 270 Phe Phe Glu Gly Ser Gly Arg Asn Lys Lys Leu Ala Lys Ala Arg Ala 275 280 285 Ala Gln Ser Ala Leu Ala Ala Ile Phe Asn Leu His Leu Asp Gln Thr 290 295 300 Pro Ser Arg Gln Pro Ile Pro Ser Glu Gly Leu Gln Leu His Leu Pro 305 310 315 320 Gln Val Leu Ala Asp Ala Val Ser Arg Leu Val Leu Gly Lys Phe Gly 325 330 335 Asp Leu Thr Asp Asn Phe Ser Ser Pro His Ala Arg Arg Lys Val Leu 340 345 350 Ala Gly Val Val Met Thr Thr Gly Thr Asp Val Lys Asp Ala Lys Val 355 360 365 Ile Ser Val Ser Thr Gly Thr Lys Cys Ile Asn Gly Glu Tyr Met Ser 370 375 380 Asp Arg Gly Leu Ala Leu Asn Asp Cys His Ala Glu Ile Ile Ser Arg 385 390 395 400 Arg Ser Leu Leu Arg Phe Leu Tyr Thr Gln Leu Glu Leu Tyr Leu Asn 405 410 415 Asn Lys Asp Asp Gln Lys Arg Ser Ile Phe Gln Lys Ser Glu Arg Gly 420 425 430 Gly Phe Arg Leu Lys Glu Asn Val Gln Phe His Leu Tyr Ile Ser Thr 435 440 445 Ser Pro Cys Gly Asp Ala Arg Ile Phe Ser Pro His Glu Pro Ile Leu 450 455 460 Glu Glu Pro Ala Asp Arg His Pro Asn Arg Lys Ala Arg Gly Gln Leu 465 470 475 480 Arg Thr Lys Ile Glu Ser Gly Glu Gly Thr Ile Pro Val Arg Ser Asn 485 490 495 Ala Ser Ile Gln Thr Trp Asp Gly Val Leu Gln Gly Glu Arg Leu Leu 500 505 510 Thr Met Ser Cys Ser Asp Lys Ile Ala Arg Trp Asn Val Val Gly Ile 515 520 525 Gln Gly Ser Leu Leu Ser Ile Phe Val Glu Pro Ile Tyr Phe Ser Ser 530 535 540 Ile Ile Leu Gly Ser Leu Tyr His Gly Asp His Leu Ser Arg Ala Met 545 550 555 560 Tyr Gln Arg Ile Ser Asn Ile Glu Asp Leu Pro Pro Leu Tyr Thr Leu 565 570 575 Asn Lys Pro Leu Leu Ser Gly Ile Ser Asn Ala Glu Ala Arg Gln Pro 580 585 590 Gly Lys Ala Pro Asn Phe Ser Val Asn Trp Thr Val Gly Asp Ser Ala 595 600 605 Ile Glu Val Ile Asn Ala Thr Thr Gly Lys Asp Glu Leu Gly Arg Ala 610 615 620 Ser Arg Leu Cys Lys His Ala Leu Tyr Cys Arg Trp Met Arg Val His 625 630 635 640 Gly Lys Val Pro Ser His Leu Leu Arg Ser Lys Ile Thr Lys Pro Asn 645 650 655 Val Tyr His Glu Ser Lys Leu Ala Ala Lys Glu Tyr Gln Ala Ala Lys 660 665 670 Ala Arg Leu Phe Thr Ala Phe Ile Lys Ala Gly Leu Gly Ala Trp Val 675 680 685 Glu Lys Pro Thr Glu Gln Asp Gln Phe Ser Leu Thr Pro 690 695 700 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 10 gtgctcgctt cggcagcaca tatacta 27 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 11 gcggacttcg gtccgctttt 20 <210> 12 <211> 216 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 12 atacttacct ggcaggggag ataccatgat cacgaaggtg gttttcccag ggcgaggctt 60 atccattgca ctccggatgt gctgacccct gcgatttccc caaatgtggg aaactcgact 120 gcataatttg tggtagtggg ggactgcgtt cgcgctttcc cctgactttc tggagtttca 180 aaagtagact gtacgctaag ggtcatatct tttttt 216 <210> 13 <211> 149 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 13 aatttttgga gcaggttttc tgacttcggt cggaaaaccc ctcccaattt cactggtcta 60 caatgaaagc aaaacagttc tcttccccgc tccccggtgt gtgagagggg ctttgatcct 120 tctctggttt cctaggaaac gcgtatgtg 149 <210> 14 <211> 118 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 14 gtctacggcc ataccaccct gaacgcgccc gatctcgtct gatctcggaa gctaagcagg 60 gtcgggcctg gttagtactt ggatgggaga ccgcctggga ataccgggtg ctgtaggc 118 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 15 gggtttgggt ttgggtttgg gttt 24 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 16 agagggccct gaagagggcc cttt 24 <210> 17 <211> 241 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 17 gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60 ataattagaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120 aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180 atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240 c 241 <210> 18 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artifitial DNA <400> 18 ggggtgctcg cttcggcagc acatatacta gtcgacgaag gttcagcagc tcgaaccaag 60 tctagagcgg acttcggtcc gctttttttt tt 92 <210> 19 <211> 400 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artifitial DNA <400> 19 acacaggcta aggaccagct tctttgggag agaacagacg caggggcggg agggaaaaag 60 ggagaggcag acgtcacttc cccttggcgg ctctggcagc agattggtcg gttgagtggc 120 agaaaggcag acggggactg ggcaaggcac tgtcggtgac atcacggaca gggcgacttc 180 tatgtagatg aggcagcgca gaggctgctg cttcgccact tgctgcttca ccacgaagga 240 gttcccgtgc cctgggagcg ggttcaggac cgctgatcgg aagtgagaat cccagctgtg 300 tgtcagggct ggaaagggct cgggagtgcg cggggcaagt gaccgtgtgt gtaaagagtg 360 aggcgtatga ggctgtgtcg gggcagaggc ccaagatctc 400 <210> 20 <211> 270 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artifitial DNA <400> 20 gtttcaggat cctaacaaca taggagctgt gattggctgt tttcagccaa tcagcactga 60 ctcatttgca tagcctttac aagcggtcac aaactcaaga aacgagcggt tttaatagtc 120 ttttagaata ttgtttatcg aaccgaataa ggaactgtgc tttgtgattc acatatcagt 180 ggaggggtgt ggaaatggca ccttgatctc accctcatcg aaagtggagt tgatgtcctt 240 ccctggctcg ctacagacgc acttccgcaa 270 <210> 21 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artifitial DNA <400> 21 ccccgggctg gcggtgtcgg ctgcaatccg gcgggcacgg ccgggccggg ctgggctctt 60 ggggcagcca ggcgcctcct tcagc 85 <210> 22 <211> 233 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artifitial DNA <400> 22 atgaaggttc agcagctcga accaagggca ggggagatac catgatcacg aaggtggttt 60 tcccagggcg aggcttatcc attgcactcc ggatgtgctg acccctgcga tttccccaaa 120 tgtgggaaac tcgactgcat aatttgtggt agtgggggac tgcgttcgcg ctttcccctg 180 actttctgga gtttcaaaag tagactgtac gctaagggtc atatcttttt ttt 233 <210> 23 <211> 173 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artifitial DNA <400> 23 gaaggttcag cagctcgaac caagaatttt tggagcaggt tttctgactt cggtcggaaa 60 acccctccca atttcactgg tctacaatga aagcaaaaca gttctcttcc ccgctccccg 120 gtgtgtgaga ggggctttga tccttctctg gtttcctagg aaacgcgtat gtg 173 <210> 24 <211> 176 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 24 gtctacggcc ataccaccct gaacgcgccc gatctcgtct gatctcggaa gctaagcagg 60 gtcgggcctg gttagtactt ggatgggaga ccgcctggga ataccgggtg ctgtaggcgt 120 cgacgaaggt tcagcagctc gaaccaagtc tagagcggac ttcggtccgc tttttt 176 <210> 25 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 25 ggggaaggtt cagcagctcg aaccaagggg tttgggtttg ggtttgggtt ttttttt 57 <210> 26 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 26 ggggggtttg ggtttgggtt tgggtttgaa ggttcagcag ctcgaaccaa gtttttt 57 <210> 27 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 27 ggggaaggtt cagcagctcg aaccaagtct agagggccct gaagagggcc cttttttttt 60 <210> 28 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 28 gggagagggc cctgaagagg gcccttttct gaaggttcag cagctcgaac caagtttttt 60 <210> 29 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 29 ggggggtttg ggtttgggtt tgggtttgaa ggttcagcag ctcgaaccaa gtctagaggg 60 ccctgaagag ggcccttttt ttttt 85 <210> 30 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 30 gggagagggc cctgaagagg gcccttttct gaaggttcag cagctcgaac caaggggttt 60 gggtttgggt ttgggttttt ttttt 85 <210> 31 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 31 ggggaaggtt cagcagctcg aaccaagggg tttgggtttg ggtttgggtt ttctagaggg 60 ccctgaagag ggcccttttt tttt 84 <210> 32 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 32 ggggtttggg tttgggtttg ggtttagagg gccctgaaga gggccctttt ctgaaggttc 60 agcagctcga accaagtttt tt 82 <210> 33 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 33 ggggaaggtt cagcagctcg aaccaagttt ttt 33 <210> 34 <211> 516 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 34 cacgtcgtgc ctcacatcga gcccgtggct agatgcatca tccctgatct gatcggaatg 60 ggtaagtccg gcaagagcgg gaatggctca tatcgcctcc tggatcacta caagtacctc 120 accgcttagt tcgagctgct gaaccttcca aagaaaatca tctttgtggg ccacgactgg 180 ggggcttgtc tggcctttca ctactcctac gagcaccaag acaagatcaa ggccatcgtc 240 catgctgaga gtgtcgtgga cgtgatcgag tcctgggacg agtggcctga catcgaggag 300 gatatcgccc tgatcaagag cgaagagggc gagaaaatgg tgcttgagaa taacttcttc 360 gtcgagacca tgctcccaag caagatcatg cggaaactgg agcctgagga gttcgctgcc 420 tacctggagc cattcaagga gaagggcgag gttagacggc ctaccctctc ctggcctcgc 480 gagatccctc tcgttaaggg aggcaagccc gacgtc 516 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 35 atggcttcca aggtgtacga cc 22 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 36 ttactgctcg ttcttcagca cg 22 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 37 ctcgctgcaa gcaaatgaac 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 38 tcgtcccagg actcgatcac 20 <210> 39 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 39 ggggtgctcg cttcggcagc acatatacta gtcgacggcg cacagacatc tcgaagcact 60 tctagagcgg acttcggtcc gctttttttt tt 92 <210> 40 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 40 ggggcgcaca gacatctcga agcactgggt ttgggtttgg gtttgggttt tttttt 56 <210> 41 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 41 ggggtttggg tttgggtttg ggtttggcgc acagacatct cgaagcactt ttttt 55 <210> 42 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 42 ggggcgcaca gacatctcga agcacttcta gagggccctg aagagggccc ttttttttt 59 <210> 43 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 43 gggagagggc cctgaagagg gcccttttct ggcgcacaga catctcgaag cacttttttt 60 <210> 44 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 44 ggggtttggg tttgggtttg ggtttggcgc acagacatct cgaagcactt ctagagggcc 60 ctgaagaggg cccttttttt ttt 83 <210> 45 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 45 gggagagggc cctgaagagg gcccttttct ggcgcacaga catctcgaag cactgggttt 60 gggtttgggt ttgggttttt ttttt 85 <210> 46 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 46 ggggcgcaca gacatctcga agcactgggt ttgggtttgg gtttgggttt tctagagggc 60 cctgaagagg gccctttttt ttt 83 <210> 47 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 47 ggggtttggg tttgggtttg ggtttagagg gccctgaaga gggccctttt ctggcgcaca 60 gacatctcga agcacttttt tt 82 <210> 48 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 48 ggggcgcaca gacatctcga agcacttttt tt 32 <210> 49 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 49 acccgcttaa aagcttggc 19 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 50 ccacggtagg ctgagaaatg 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 51 catgctgttc agcagctcgc 20 <210> 52 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 52 gaaggttcag cagctcgaac caag 24

Claims (23)

  1. 표적 RNA를 ADAR에 의해 편집하기 위한 가이드 RNA로서, 적어도 1개의 기능성 영역 및 해당 표적 RNA의 일부에 상보적이며 표적 RNA와 2본쇄를 형성할 수 있는 안티센스 영역을 포함하고, 적어도 1개의 해당 기능성 영역이 해당 안티센스 영역에 연결되어 있고, 해당 가이드 RNA가 ADAR 리크루트 염기 서열을 실질적으로 포함하지 않는, 가이드 RNA.
  2. 제 1 항에 있어서,
    적어도 1개의 기능성 영역이 안티센스 영역에 직접 결합되어 있거나 또는 안티센스 영역에 링커를 개재시켜 연결되어 있는, 가이드 RNA.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    안티센스 영역이, 표적 RNA와 미스매치 염기쌍을 형성하는 염기를 갖는, 가이드 RNA.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    기능성 영역이, 가이드 RNA의 안정화, 가이드 RNA의 핵으로의 국재, 가이드 RNA의 세포질로의 국재, 표적 RNA와 안티센스 영역의 2본쇄 형성 촉진, 안티센스 영역에 의한 비특이적인 2본쇄 형성 저해, 및 표적 RNA와 안티센스 영역으로 형성되는 복합체의 안정화를 포함하는 기능 중 어느 1 이상의 기능을 갖는 염기 서열을 포함하는 영역인, 가이드 RNA.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    기능성 영역이, snRNA 서열로 이루어지는 영역, rRNA 서열로 이루어지는 영역, 구아닌 사중쇄 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역, 또는 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역, 혹은 그들의 어느 조합인, 가이드 RNA.
  6. 제 5 항에 있어서,
    기능성 영역이, snRNA 서열로 이루어지는 영역 및 임의로 포함되는 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역인, 가이드 RNA.
  7. 제 6 항에 있어서,
    snRNA 서열로 이루어지는 영역이, U6 snRNA 서열로 이루어지는 영역, U1 snRNA 서열로 이루어지는 영역, 또는 U7 snRNA 서열로 이루어지는 영역인, 가이드 RNA.
  8. 제 5 항에 있어서,
    기능성 영역이, rRNA 서열로 이루어지는 영역 및 임의로 포함되는 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역인, 가이드 RNA.
  9. 제 8 항에 있어서,
    rRNA 서열로 이루어지는 영역이 5S rRNA 서열로 이루어지는 영역인, 가이드 RNA.
  10. 제 5 항에 있어서,
    기능성 영역이, 구아닌 사중쇄 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역, 또는 스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 영역, 혹은 그들의 조합인, 가이드 RNA.
  11. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    안티센스 영역, 구아닌 사중쇄 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역, 임의로 포함되는 추가적인 기능성 영역, 및 임의로 포함되는 링커를 포함하고,
    안티센스 영역, 구아닌 사중쇄 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역, 및 임의로 포함되는 추가적인 기능성 영역이 이 순서로 5'측으로부터 3'측에 연결되어 있는, 가이드 RNA.
  12. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역, 안티센스 영역, 임의로 포함되는 추가적인 기능성 영역, 및 임의로 포함되는 링커를 포함하고,
    스템-루프 구조를 형성하는 염기 서열로 이루어지는 기능성 영역 및 안티센스 영역이 이 순서로 5'측으로부터 3'측에 연결되어 있는, 가이드 RNA.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 가이드 RNA 및 ADAR을 포함하는, 표적 RNA를 편집하는 시스템.
  14. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 가이드 RNA를 코딩하는 핵산.
  15. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 가이드 RNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  16. 제 15 항에 있어서,
    ADAR을 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는, 발현 벡터.
  17. 제 16 항에 있어서,
    ADAR이 ADAR1 또는 ADAR2인, 발현 벡터.
  18. 제 15 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 기재된 발현 벡터가 도입된 숙주 세포.
  19. 제 18 항에 기재된 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 발현 벡터를 제조하는 방법.
  20. 제 15 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 기재된 발현 벡터 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 의약 조성물.
  21. 제 15 항에 기재된 발현 벡터, ADAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 의약 조성물.
  22. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 가이드 RNA를 코딩하는 핵산을 세포, 바이러스 등에 도입하는 것을 포함하는, 표적 RNA를 편집하는 방법.
  23. 표적 RNA를 ADAR에 의해 편집하기 위한 폴리뉴클레오타이드로서, 적어도 1개의 기능성 영역 및 해당 표적 RNA의 일부에 상보적이며 표적 RNA와 2본쇄를 형성할 수 있는 안티센스 영역을 포함하고, 적어도 1개의 해당 기능성 영역이 해당 안티센스 영역에 연결되어 있고, 해당 폴리뉴클레오타이드가 ADAR 리크루트 염기 서열을 실질적으로 포함하지 않는, 폴리뉴클레오타이드.
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