KR102580776B1 - Pd-l1 발현의 감소를 위한 올리고뉴클레오티드 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 표적 세포에서 PD-L1의 발현을 감소시킬 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 상기 올리고뉴클레오티드는 PD-L1 mRNA에 혼성화한다. 본 발명은 또한 올리고뉴클레오티드의 접합체, 및 약학 조성물, 및 상기 올리고뉴클레오티드를 사용하는, 바이러스성 간 감염, 예컨대 HBV, HCV 및 HDV; 기생충 감염, 예컨대 말라리아, 톡소플라즈마증, 리슈마니아증 및 트리파노소마증, 또는 간암 또는 간에서의 전이의 치료 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 프로그래밍(programming)된 사멸 리간드-1(PD-L1)에 상보적이고 간에서 PD-L1의 감소를 야기하는 올리고뉴클레오티드(올리고머)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 간의 감염 또는 간의 암에 의해 야기된 T-세포 배출을 완화시키는 방법에 관한 것이다. 관련된 감염은 만성 B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV) 및 D형 간염 바이러스(HDV), 및 기생충 감염, 예컨대 말라리아 및 톡소플라즈마증(예컨대, 플라스모듐(Plasmodium)의 원생동물, 특히 종 플라스모듐 비박스(Plasmodium vivax), 플라스모듐 말라리아에(Plasmodium Malariae) 및 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum)에 의해 야기됨)이다.
프로그래밍된 사멸-1(PD-1) 수용체 및 이의 리간드, PD-L1(또는 B7-H1 또는 CD274)로 이루어진 공자극성 경로는 간의 만성 감염 중에 바이러스 제어의 결핍을 야기하는 T-세포 배출에 직접 기여하는 것으로 공지되어 있다. PD-1 경로는 또한, 이러한 경로가 혼란한 마우스가 자가면역 질병을 발병하므로, 자가면역에서 중요한 역할을 한다.
PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용을 차단하는 항체가 T-세포 반응, 특히 CD8+ 세포독성 T-세포의 반응을 강화시킴이 밝혀졌다(문헌[Barber et al 2006 Nature Vol 439 p682] 및 문헌[Maier et al 2007 J. Immunol. Vol 178 p 2714] 참고).
국제 공개공보 제2006/042237호는 종양에서 PD-L1(B7-H1) 발현을 평가함으로써 암을 진단하는 방법을 기술하고, PD-1/PD-L1 상호작용을 간섭하는 제제를 환자에게 전달함을 시사한다. 간섭제는 항체, 항체 단편, siRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 이러한 간섭제에 대한 구체적인 예는 존재하지 않고, 만성 간 감염에 대한 어떠한 언급도 존재하지 않는다.
이중 가닥 RNA(dsRNA, RNAi 또는 siRNA) 분자를 사용하는 PD-L1의 RNA 간섭 매개된 억제는 또한, 예를 들어 국제 공개공보 제2005/007855호, 국제 공개공보 제2007/084865호 및 미국 특허공보 제8,507,663호에 개시되어 있다. 이들 중 어느 것도 간으로의 표적화된 전달을 기술하지 않는다.
문헌[Dolina et al. 2013 Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2 e72]은 MCMV 감염된 마우스에서 NK 및 CD8+ T-세포 청소(clearance)를 강화시키는 쿠퍼(Kupffer) 세포로의 PD-L1 표적화 siRNA 분자의 생체내 전달을 기술한다. 이러한 논문은 간세포로 전달된 PD-L1 표적화 siRNA 분자가 CD8+ T-세포 효과기 기능의 강화와 관련하여 효과적이지 않는 것으로 결론지어진다.
siRNA 접근은, 생체분포 및 작용 방식이 아주 상이하므로, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드 접근과 상당히 상이하다. 문헌[Xu et al 2003 Biochem. Biophys. Res .Comm. Vol 306 page 712-717]에 기술된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 siRNA는 mRNA 내의 표적 부위에 대한 상이한 선호도를 갖는다.
국제 공개공보 제2016/138278호는 5' 말단에서 연결된 2개 이상의 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하는, PD-L1을 비롯한 면역 체크포인트의 억제를 기술한다. 이러한 문헌은 HBV 또는 간으로의 표적화된 전달을 언급하지 않는다.
발명의 목적
본 발명은 간 세포(실질 세포(예컨대, 간세포) 및 비-실질 세포, 예컨대 쿠퍼 세포 및 간 정현 내피 세포(LSEC) 둘 다)에서 PD-L1 mRNA를 매우 효율적으로 감소시키는 신규한 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 접합체를 동정한다. PD-L1을 감소시키거나 침묵화시킴으로써, 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 접합체는 PD-1-매개된 억제를 감소시키고, 이에 의해 소실된 T-세포의 면역자극을 촉진한다. 간의 만성 병원성 감염에서 T-세포 배출의 완화는 간의 만성 병원성 감염 중에 혈액 내의 바이러스 항원의 감소된 수준 및 회복된 면역 조절을 야기할 것이다. 자연 살해(NK) 세포 및 자연 살해 T(NKT) 세포는 또한 본 발명의 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 접합체에 의해 활성될 수 있다.
올리고뉴클레오티드 접합체는 간 세포 내의 PD-L1의 국소적인 감소를 보장하고, 이에 따라 자가면역 부작용, 예컨대 PD-L1의 전신 고갈과 연관된 대장염, 비-바이러스성 간염 및 폐렴의 위험을 감소시킨다.
발명의 요약
본 발명은 PD-L1의 발현을 조절할 수 있는 핵산을 표적화하는 올리고뉴클레오티드 또는 접합체, 및 PD-L1의 작용화와 관련된 질병의 치료 또는 예방에 관한 것이다. 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 접합체는 특히 감염성 제제에 대한 면역 반응이 소실된 질병의 치료에 사용될 수 있다.
따라서, 제1 양상에서, 본 발명은 PD-L1 표적 핵산에 90% 이상 상보적인, 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이의 인접한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 올리고뉴클레오티드는, 바람직하게는 갭머(gapmer) 디자인을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산의 절단에 의해 PD-L1의 발현을 억제할 수 있다. 상기 절단은 바람직하게는 뉴클레아제 모집에 의해 달성된다.
추가 양상에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 아시알로당단백질 수용체 표적화 접합체 모이어티, 예컨대 하나 이상의 N-아세틸갈락토사민(GalNAc) 모이어티를 포함하는 접합체 모이어티에 접합된다. 접합 모이어티 및 올리고뉴클레오티드는 연결기, 특히 생체절단성 연결기에 의해 함께 연결될 수 있다.
추가 양상에서, 본 발명은 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 접합체, 및 약학적으로 허용되는 희석제, 담체, 염 및/또는 항원보강제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
추가 양상에서, 본 발명은 PD-L1을 발현하는 표적 세포에 올리고뉴클레오티드 또는 본 발명의 조성물을 효과량으로 투여함으로써, 상기 표적 세포에서 PD-L1 발현의 감소를 위한 생체내 또는 시험관내 방법을 위한 방법을 제공한다.
추가 양상에서, 본 발명은 바이러스 또는 기생충에 대한 면역성의 회복에 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 접합체 또는 약학 조성물을 제공한다.
추가 양상에서, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 접합체 또는 약학 조성물을 제공한다.
추가 양상에서, 본 발명은 치료 또는 예방 효과량의 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 질병, 질환 또는 기능장애, 특히 특히 바이러스성 간 감염 및 기생충 감염으로부터 선택되는 질병을 앓거나 이에 걸리기 쉬운 대상에게 투여함을 포함하는, 질병, 질환 또는 기능장애의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
추가 양상에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 접합체 또는 약학 조성물은 바이러스성 간 감염, 예컨대 HBV, HCV 및 HDV, 또는 기생충 감염, 예컨대 말라리아, 톡소플라즈마증, 리슈마니아증 및 트리파노소마증, 또는 간암 또는 간에서의 전이의 치료 또는 예방에 사용된다.
도 1은 올리고뉴클레오티드가 물결선(A 내지 D) 또는 "올리고뉴클레오티드"(E 내지 H) 또는 T2(I)로 표시되고 아시알로당단백질 수용체 표적화 접합체 모이어티가 3-가 N-아세틸갈락토사민 모이어티인, 예시적인 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체를 도시한다. 화합물 A 내지 D는 다이-리신 분지(brancher) 분자 PEG3 스페이서 및 3개의 말단 GalNAc 탄수화물 모이어티를 포함한다. 화합물 A 및 B에서, 올리고뉴클레오티드는 연결기 없이 아시알로당단백질 수용체 표적화 접합체 모이어티에 직접 부착된다. 화합물 C 및 D에서, 올리고뉴클레오티드는 C6 연결기를 통해 아시알로당단백질 수용체 표적화 접합체 모이어티에 직접 부착된다. 화합물 E 내지 I는 트레블러 분지 분자(trebler brancher molecule) 및 길이 및 구조가 변하는 스페이서 및 3개의 말단 GalNAc 탄수화물 모이어티를 포함한다.
도 2는 표적 핵산 상의 위치를 기준으로, 실시예 2에서 시험된 화합물에 대한 EC50(A) 및 PD-L1 녹다운(knock down)(염수의 %)(B)을 나타내는 그래프이다. 화합물이 시험된 세포주는 THP1(●) 및 카르파스(Karpas)(■)이다.
도 3은 3-가 GalNAc 클러스터(GN2)의 화학식을 도시한다. GN2는 본 발명에서 접합 모이어티로서 유용하다. 물결선은, 예컨대 C6 아미노 연결기로의 또는 직접적으로 올리고뉴클레오티드로의 클러스터의 접합 부위를 나타낸다.
도 4는 화합물 번호 766_2의 화학식을 도시한다.
도 5는 화합물 번호 767_2의 화학식을 도시한다.
도 6은 화합물 번호 768_2의 화학식을 도시한다.
도 7은 화합물 번호 769_2의 화학식을 도시한다.
도 8은 화합물 번호 770_2의 화학식을 도시한다.
도 9는 염수 및 표시된 화합물 번호를 사용하는 처리 후, 폴리(IC) 유도된 동물로부터 간에서의 PD-L1 단백질 발현을 검출하는 웨스턴 블롯을 도시한다. 각각의 블롯은 네이키드 올리고뉴클레오티드 대 동일한 올리고뉴클레오티드의 GalNAc 접합된 버젼을 나타낸다: 블롯 A) 화합물 번호 744_1 및 755_2, B) 화합물 번호 747_1 및 758_2, C) 화합물 번호 748_1 및 759_2, D) 화합물 번호 752_1 및 763_2, 및 E) 화합물 번호 753_1 및 764_2. 상부 밴드는 빈쿨린 로딩 대조군이고, 하부 밴드는 PD-L1 단백질이다. 각각의 블롯의 첫 번째 선은 폴리(IC) 유도 없이 염수 처리된 마우스를 나타낸다. 이러한 마우스는 매우 적은 PD-L 단백질을 발현한다.
도 10은 ● 비히클(군 10 및 1), ◆ DNA 백신(군 11 및 2), ○ 항-PD-L1 항체(군 12), ▲ 네이키드 PD-L1 ASO + DNA 백신(군 7) 또는 △ GalNAc 접합된 PD-L1 ASO + DNA 백신(군 8)을 사용하는 처리 후, 간의 단핵 세포 집단을 도시한다(각각의 군을 위하여, 개별 동물이 표시되고, 평균은 각각의 군에 대한 수직선에 의해 표시됨)(표 18 참조). DNA 백신 군과 3개의 처리 군 사이의 통계학성 유의성이 평가되었고, 존재하는 경우 군 사이에 *로 표시된다(* = P < 0.05, *** = P < 0.001 및 **** = P < 0.0001). A는 처리 후 간에서의 T-세포의 수를 나타낸다. B는 CD4+ T-세포의 분율을 나타내고, C는 CD8+ T-세포의 분율을 나타낸다.
도 11은 ● 비히클(군 10 및 1), ◆ DNA 백신(군 11 및 2), ○ 항-PD-L1 항체(군 12), ▲ 네이키드 PD-L1 ASO + DNA 백신(군 7) 또는 △ GalNAc 접합된 PD-L1 ASO + DNA 백신(군 8)을 사용하는 처리 후, 간의 PD-L1 양성 세포의 조절을 도시한다(각각의 군을 위하여, 개별 동물이 표시되고, 평균은 각각의 군에 대한 수직선에 의해 표시됨)(표 19 참조). DNA 백신 군과 3개의 처리 군 사이의 통계학성 유의성이 평가되었고, 존재하는 경우 군 사이에 *로 표시된다(* = P < 0.05 및 **** = P < 0.0001). A는 치료 후 간에서 PD-L1을 발현하는 CD8+ T-세포의 %를 나타낸다. B는 처리 후 간에서 PD-L1을 발현하는 CD4+ T-세포를 나타내고, C는 처리 후 간에서 PD-L1을 발현하는 B 세포를 나타낸다.
도 12는 ● 비히클(군 10 및 1), ◆ DNA 백신(군 11 및 2), ○ 항-PD-L1 항체(군 12), ▲ 네이키드 PD-L1 ASO + DNA 백신(군 7) 또는 △ GalNAc 접합된 PD-L1 ASO + DNA 백신(군 8)을 사용하는 처리 후, 간 내의 HBV 항원 특이적 CD8+ 사이토킨 분비 세포를 도시한다(각각의 군을 위하여, 개별 동물이 표시되고, 평균은 각각의 군에 대한 수직선에 의해 표시됨)(표 20 참조). DNA 백신 군과 3개의 처리 군 사이의 통계학성 유의성이 평가되었고, 존재하는 경우 군 사이에 *로 표시된다(* = P < 0.05). A는 치료 후 HBV PreS2+S 항원에 특이적인 간 내의 IFN-γ 분비 CD8+ T-세포의 %를 나타낸다. B는 치료 후 IHBV 코어 항원에 특이적인 간 내의 IFN-γ 분비 CD8+ T-세포의 %를 나타내고 C는 치료 후 HBV PreS2+S 항원에 특이적인 간 내의 IFN-γ 및 TNF-α 분비 CD8+ T-세포의 %를 나타낸다.
도 13은 비히클(■)과 비교되는, GalNAc 접합된 PD-L1 안티센스 화합물 번호 759_2(▼)에 의한 처리 후 AAV/HBV 마우스 내의 HBV-DNA, HBsAg 및 HBeAg를 도시한다. 수직선은 처리의 종료를 나타낸다.
도 2는 표적 핵산 상의 위치를 기준으로, 실시예 2에서 시험된 화합물에 대한 EC50(A) 및 PD-L1 녹다운(knock down)(염수의 %)(B)을 나타내는 그래프이다. 화합물이 시험된 세포주는 THP1(●) 및 카르파스(Karpas)(■)이다.
도 3은 3-가 GalNAc 클러스터(GN2)의 화학식을 도시한다. GN2는 본 발명에서 접합 모이어티로서 유용하다. 물결선은, 예컨대 C6 아미노 연결기로의 또는 직접적으로 올리고뉴클레오티드로의 클러스터의 접합 부위를 나타낸다.
도 4는 화합물 번호 766_2의 화학식을 도시한다.
도 5는 화합물 번호 767_2의 화학식을 도시한다.
도 6은 화합물 번호 768_2의 화학식을 도시한다.
도 7은 화합물 번호 769_2의 화학식을 도시한다.
도 8은 화합물 번호 770_2의 화학식을 도시한다.
도 9는 염수 및 표시된 화합물 번호를 사용하는 처리 후, 폴리(IC) 유도된 동물로부터 간에서의 PD-L1 단백질 발현을 검출하는 웨스턴 블롯을 도시한다. 각각의 블롯은 네이키드 올리고뉴클레오티드 대 동일한 올리고뉴클레오티드의 GalNAc 접합된 버젼을 나타낸다: 블롯 A) 화합물 번호 744_1 및 755_2, B) 화합물 번호 747_1 및 758_2, C) 화합물 번호 748_1 및 759_2, D) 화합물 번호 752_1 및 763_2, 및 E) 화합물 번호 753_1 및 764_2. 상부 밴드는 빈쿨린 로딩 대조군이고, 하부 밴드는 PD-L1 단백질이다. 각각의 블롯의 첫 번째 선은 폴리(IC) 유도 없이 염수 처리된 마우스를 나타낸다. 이러한 마우스는 매우 적은 PD-L 단백질을 발현한다.
도 10은 ● 비히클(군 10 및 1), ◆ DNA 백신(군 11 및 2), ○ 항-PD-L1 항체(군 12), ▲ 네이키드 PD-L1 ASO + DNA 백신(군 7) 또는 △ GalNAc 접합된 PD-L1 ASO + DNA 백신(군 8)을 사용하는 처리 후, 간의 단핵 세포 집단을 도시한다(각각의 군을 위하여, 개별 동물이 표시되고, 평균은 각각의 군에 대한 수직선에 의해 표시됨)(표 18 참조). DNA 백신 군과 3개의 처리 군 사이의 통계학성 유의성이 평가되었고, 존재하는 경우 군 사이에 *로 표시된다(* = P < 0.05, *** = P < 0.001 및 **** = P < 0.0001). A는 처리 후 간에서의 T-세포의 수를 나타낸다. B는 CD4+ T-세포의 분율을 나타내고, C는 CD8+ T-세포의 분율을 나타낸다.
도 11은 ● 비히클(군 10 및 1), ◆ DNA 백신(군 11 및 2), ○ 항-PD-L1 항체(군 12), ▲ 네이키드 PD-L1 ASO + DNA 백신(군 7) 또는 △ GalNAc 접합된 PD-L1 ASO + DNA 백신(군 8)을 사용하는 처리 후, 간의 PD-L1 양성 세포의 조절을 도시한다(각각의 군을 위하여, 개별 동물이 표시되고, 평균은 각각의 군에 대한 수직선에 의해 표시됨)(표 19 참조). DNA 백신 군과 3개의 처리 군 사이의 통계학성 유의성이 평가되었고, 존재하는 경우 군 사이에 *로 표시된다(* = P < 0.05 및 **** = P < 0.0001). A는 치료 후 간에서 PD-L1을 발현하는 CD8+ T-세포의 %를 나타낸다. B는 처리 후 간에서 PD-L1을 발현하는 CD4+ T-세포를 나타내고, C는 처리 후 간에서 PD-L1을 발현하는 B 세포를 나타낸다.
도 12는 ● 비히클(군 10 및 1), ◆ DNA 백신(군 11 및 2), ○ 항-PD-L1 항체(군 12), ▲ 네이키드 PD-L1 ASO + DNA 백신(군 7) 또는 △ GalNAc 접합된 PD-L1 ASO + DNA 백신(군 8)을 사용하는 처리 후, 간 내의 HBV 항원 특이적 CD8+ 사이토킨 분비 세포를 도시한다(각각의 군을 위하여, 개별 동물이 표시되고, 평균은 각각의 군에 대한 수직선에 의해 표시됨)(표 20 참조). DNA 백신 군과 3개의 처리 군 사이의 통계학성 유의성이 평가되었고, 존재하는 경우 군 사이에 *로 표시된다(* = P < 0.05). A는 치료 후 HBV PreS2+S 항원에 특이적인 간 내의 IFN-γ 분비 CD8+ T-세포의 %를 나타낸다. B는 치료 후 IHBV 코어 항원에 특이적인 간 내의 IFN-γ 분비 CD8+ T-세포의 %를 나타내고 C는 치료 후 HBV PreS2+S 항원에 특이적인 간 내의 IFN-γ 및 TNF-α 분비 CD8+ T-세포의 %를 나타낸다.
도 13은 비히클(■)과 비교되는, GalNAc 접합된 PD-L1 안티센스 화합물 번호 759_2(▼)에 의한 처리 후 AAV/HBV 마우스 내의 HBV-DNA, HBsAg 및 HBeAg를 도시한다. 수직선은 처리의 종료를 나타낸다.
정의
올리고뉴클레오티드
본원에 사용된 용어 "올리고뉴클레오티드"는 2개 이상의 공유 결합으로 연결된 뉴클레오시드를 포함하는 분자로서 당업자에게 일반적으로 이해되는 바와 같이 정의된다. 이러한 공유 결합된 뉴클레오시드는 또한 핵산 분자 또는 올리고머로서 지칭될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 고체-상 화학 합성 및 정제에 의해 실험실에서 통상적으로 제조된다. 올리고뉴클레오티드의 서열을 언급하는 경우, 공유 결합으로 연결된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 핵염기 모이어티 또는 이의 변형의 서열 또는 순서를 지칭한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 인공적이고, 화학적으로 합성되고, 전형적으로 정제되거나 단리된다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드
본원에 사용된 용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 표적 핵산, 특히 표적 핵산 상의 인접한 서열에 혼성화함으로써 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 올리고뉴클레오티드로서 정의된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 본질적으로 이중 가닥이 아니고, 이에 따라 siRNA가 아니다. 바람직하게는, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥이다.
인접한 뉴클레오티드 서열
용어 "인접한 뉴클레오티드 서열"은 표적 핵산에 상보적인 올리고뉴클레오티드의 영역을 지칭한다. 이러한 용어는 본원에서 용어 "인접한 핵염기 서열" 및 용어 "올리고뉴클레오티드 모티프 서열"과 상호교환적으로 사용된다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드는 인접한 뉴클레오티드 서열을 구성한다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 인접한 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 추가의 뉴클레오티드, 예를 들어 작용기를 인접한 뉴클레오티드 서열에 부착하는데 사용될 수 있는 뉴클레오티드 연결기 영역을 임의적으로 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 연결기 영역은 표적 핵산에 상보적이거나 상보적이지 않을 수 있다.
뉴클레오티드
뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드의 빌딩 블록이고, 본 발명의 목적을 위하여 천연 발생 및 비-천연 발생 뉴클레오티드를 둘 다 포함한다. 천연적으로, 뉴클레오티드, 예컨대 DNA 및 RNA 뉴클레오티드는 리보스 당 모이어티, 핵염기 모이어티 및 하나 이상의 포스페이트 기(뉴클레오시드에는 부재함)를 포함한다. 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 또한 "단위" 또는 "단량체"와 상호교환적으로 지칭될 수 있다.
변형된 뉴클레오시드
본원에 사용된 용어 "변형된 뉴클레오시드" 또는 "뉴클레오시드 변형"은 당 모이어티 또는 (핵)염기 모이어티의 하나 이상의 변형을 도입함으로써, 균등한 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드와 비교하여 변형된 뉴클레오시드를 지칭한다. 바람직한 양태에서, 변형된 뉴클레오시드는 변형된 당 모이어티를 포함한다. 용어 "변형된 뉴클레오시드"는 또한 본원에서 용어 "뉴클레오시드 유사체" 또는 변형된 "단위" 또는 변형된 "단량체"와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
변형된 뉴클레오시드간 연결기
용어 "변형된 뉴클레오시드간 연결기"는 2개의 뉴클레오시드를 함께 공유 결합으로 커플링시키는, 포스포다이에스터(PO) 이외의 연결기로서 당업자에게 일반적으로 이해되는 바와 같이 정의된다. 변형된 뉴클레오시드간 연결기를 갖는 뉴클레오티드는 또한 "변형된 뉴클레오티드"로 지칭된다. 일부 양태에서, 변형된 뉴클레오시드간 연결기는 포스포다이에스터 연결기와 비교하여, 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 내성을 증가시킨다. 천연 발생 올리고뉴클레오티드의 경우, 뉴클레오시드간 연결기는 인근 뉴클레오시드 사이에 포스포다이에스터 결합을 생산하는 포스페이트 기를 포함한다. 변형된 뉴클레오시드간 연결기는 생체내 사용을 위해 올리고뉴클레오티드를 안정화시키는데 특히 유용하고, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 중 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드의 영역에서, 예를 들어 변형된 뉴클레오시드의 영역뿐만 아니라 갭머 올리고뉴클레오티드의 갭 영역 내에서 뉴클레아제 절단에 대해 보호하는 역할을 할 수 있다.
한 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 천연 포스포다이에스터로부터, 예를 들어 뉴클레아제 공격에 대해 더욱 내성인 연결기로 변형된 하나 이상의 뉴클레오시드간 연결기를 포함한다. 뉴클레아제 내성은 혈청 중 올리고뉴클레오티드를 항온처리함으로써 또는 뉴클레아제 내성 검정(예컨대, 뱀 독액 포스포다이에스터라제(SVPD))(둘 다 당해 분야에 널리 공지됨)을 사용함으로써 측정될 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 내성을 강화시킬 수 있는 뉴클레오시드간 연결기는 뉴클레아제 내성 뉴클레오시드간 연결기로 지칭된다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접한 뉴클레오티드 서열 중 뉴클레오시드간 연결기의 50% 이상은 변형되고, 예컨대 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접한 뉴클레오티드 서열 중 뉴클레오시드간 연결기의 60% 이상, 예컨대 70% 이상, 예컨대 80% 이상, 또는, 예컨대 90% 이상은 변형된다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접한 뉴클레오티드 서열의 모든 뉴클레오시드간 연결기는 변형된다. 일부 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 비-뉴클레오티드 작용기, 예컨대 접합체에 연결하는 뉴클레오시드가 포스포다이에스터일 수 있음이 인정될 것이다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접한 뉴클레오티드 서열의 모든 뉴클레오시드간 연결기는 뉴클레아제 내성 뉴클레오시드간 연결기이다.
변형된 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트, 다이포스포로티오에이트 및 보라노포스페이트를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 양태에서, 변형된 뉴클레오시드간 연결기는 본 발명의 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 포스포로티오에이트, 다이포스포로티오에이트 또는 보라노포스페이트의 RNase H 모집과 상용성이다.
일부 양태에서, 뉴클레오시드간 연결기는 황(S)을 포함한다(예컨대, 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기).
포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기는 뉴클레아제 내성, 이로운 약동학 및 제조 용이성에 기인하여 특히 유용하다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접한 뉴클레오티드 서열 중 뉴클레오시드간 연결기의 50% 이상은 포스포로티오에이트이고, 예컨대 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접한 뉴클레오티드 서열 중 뉴클레오시드간 연결기의 60% 이상, 예컨대 70% 이상, 예컨대 80% 이상 또는 90% 이상은 포스포로티오에이트이다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접한 뉴클레오티드 서열의 모든 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트이다.
일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 중성 뉴클레오시드간 연결기, 특히 포스포트라이에스터, 메틸포스폰에이트, MMI, 아미드-3, 폼아세탈 및 티오폼아세탈로부터 선택되는 뉴클레오시드간 연결기를 포함한다.
추가의 뉴클레오시드간 연결기는 국제 공개공보 제2009/124238호(참고로서 본원에 혼입됨)에 개시되어 있다. 한 양태에서, 뉴클레오시드간 연결기는 국제 공개공보 제2007/031091호(참고로서 본원에 혼입됨)에 개시된 연결기로부터 선택된다. 특히, 뉴클레오시드간 연결기는 -O-P(O)2-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)2-O-, -O-P(O)2-S-, -O-P(O,S)-S-, -S-P(O)2-S-, -O-PO(RH)-O-, 0-PO(OCH3)-0-, -O-PO(NRH)-O-, -O-PO(OCH2CH2S-R)-O-, -O-PO(BH3)-O-, -O-PO(NHRH)-O-, -O-P(O)2-NRH-, -NRH-P(O)2-O-, -NRH-CO-O-, -NRH-CO-NRH-로부터 선택될 수 있고/거나 뉴클레오시드간 연결기는 O-CO-O-, -O-CO-NRH-, -NRH-CO-CH2-, -O-CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-, -CO-NRH-CH2-, -CH2-NRHCO-, -O-CH2-CH2-S-, -S-CH2-CH2-O-, -S-CH2-CH2-S-, -CH2-SO2-CH2-, -CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-CO-, -CH2-NCH3-O-CH2-(이때, RH는 수소 및 C1-4-알킬로부터 선택됨)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
뉴클레아제 내성 연결기, 예컨대 포스포티오에이트 연결기는 표적 핵산, 예컨대 갭머에 대한 영역 G, 또는 헤드머(headmer) 및 테일머의 비-변형된 뉴클레오시드 영역과 함께 듀플렉스(duplex)를 형성할 때 뉴클레아제를 모집할 수 있는 올리고뉴클레오티드 영역에 특히 유용하다. 그러나, 포스포로티에이트 연결기는 또한 비-뉴클레아제 모집 영역 및/또는 친화성 강화 영역, 예컨대 갭머에 대한 영역 F 및 F', 또는 헤드머 및 테일머의 변형된 뉴클레오시드 영역에 유용할 수 있다.
그러나, 각각의 디자인 영역은 특히 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 LNA가 뉴클레아제 분해에 대해 연결기를 보호하는 영역에서 포스포로티오에이트 이외의 뉴클레오시드간 연결기, 예컨대 포스포다이에스터 연결기를 포함할 수 있다. 특히 변형된 뉴클레오시드 단위(전형적으로 비-뉴클레아제 모집 영역에서) 사이 또는 이의 인근의 포스포다이에스터 연결기, 예컨대 1 또는 2개의 연결기를 포함하는 것은 올리고뉴클레오티드의 생체이용 효능 및/또는 생체분포를 변형시킬 수 있다(참고로서 본원에 혼입된 국제 공개공보 제2008/113832호 참고).
한 양태에서, 올리고뉴클레오티드 내의 모든 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트 및/또는 보라노포스페이트 연결기이다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드 내의 모든 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트 연결기이다.
핵염기
용어 "핵염기"는 핵산 혼성화에서 수소 결합을 형성하는 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드에 존재하는 퓨린(예컨대, 아데닌 및 구아닌) 및 피리미딘(예컨대, 우라실, 티민 및 사이토신) 모이어티를 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "핵염기"는 또한 천연 발생 핵염기와 상이할 수 있지만 핵산 혼성화 동안 작용성인 변형된 핵염기를 포함한다. 이러한 맥락에서, "핵염기"는 천연 발생 핵염기, 예컨대 아데닌, 구아닌, 사이토신, 티미딘, 우라실, 잔틴 및 하이포잔틴, 및 비-천연 발생 변이체를 둘 다 지칭한다. 이러한 변이체는, 예를 들어 문헌[Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055] 및 문헌[Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1]에 기술되어 있다.
일부 양태에서, 핵염기 모이어티는 퓨린 또는 피리미딘을 변형된 퓨린 또는 피리미딘, 예컨대 치환된 퓨린 또는 치환된 피리미딘, 예컨대 이소사이토신, 슈도이소사이토신, 5-메틸-사이토신, 5-티오졸로-사이토신, 5-프로핀일-사이토신, 5-프로핀일-우라실, 5-브로모-우라실, 5-티아졸로-우라실, 2-티오-우라실, 2'-티오-티민, 이노신, 다이아미노퓨린, 6-아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 2,6-다이아미노퓨린 및 2-클로로-6-아미노퓨린으로부터 선택되는 핵염기로 바꿈으로써 변형된다.
핵염기 모이어티는 각각의 상응하는 핵염기에 대한 문자 부호, 예컨대 A, T, G, C 또는 U로 표시될 수 있고, 이때 각각의 문자는 임의적으로 균등한 기능의 변형된 핵염기를 포함한다. 예를 들어, 예시적인 올리고뉴클레오티드에서, 핵염기 모이어티는 A, T, G, C 및 5-메틸-사이토신으로부터 선택된다. 임의적으로, LNA 갭머의 경우, 5-메틸-사이토신 LNA 뉴클레오시드가 사용될 수 있다.
변형된 올리고뉴클레오티드
용어 "변형된 올리고뉴클레오티드"는 하나 이상의 당-변형된 뉴클레오시드 및/또는 변형된 뉴클레오시드간 연결기를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 기술한다. 용어 "키메라" 올리고뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오시드를 갖는 올리고뉴클레오티드를 기술하기 위해 문헌에서 사용되는 용어이다.
상보성
용어 "상보성"은 뉴클레오시드/뉴클레오티드의 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기-대합을 위한 자격을 기술한다. 왓슨-크릭 염기 쌍은 구아닌(G)-사이토신(C) 및 아데닌(A)-티민(T)/우라실(U)이다. 올리고뉴클레오티드가 변형된 핵염기를 갖는 뉴클레오시드를 포함할 수 있고, 예를 들어 5-메틸 사이토신이 종종 사이토신 대신에 사용되고, 상기 용어 "상보성"은 비-변형된 및 변형된 핵염기 사이의 왓슨-크릭 염기 대합을 포괄함이 이해될 것이다(예를 들어, 문헌[Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055] 및 문헌[Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1] 참고).
본원에 사용된 용어 "% 상보성"은 소정 위치에서, 별개의 핵산 분자(예컨대, 표적 핵산)의 소정 위치의 인접한 뉴클레오티드 서열에 상보적인(즉, 왓슨-크릭 염기 쌍을 형성하는) 핵산 분자(예컨대, 올리고뉴클레오티드) 내의 인접한 뉴클레오티드 서열의 %인 뉴클레오티드의 수를 지칭한다. %는 2개의 서열 사이에 쌍을 형성하는 정렬된 염기의 수를 계수하고(표적 서열 5'-3' 및 올리고뉴클레오티드 서열 3'-5'로 정렬될 때), 올리고뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드의 총 수로 나누고, 100을 곱함으로써 계산된다. 이러한 비교에서, 정렬(염기 쌍을 형성)되지 않는 핵염기/뉴클레오티드는 미스매치(mismatch)로 지칭된다.
용어 "완전히 상보성"은 100% 상보성을 지칭한다.
하기 서열은 표적 핵산(서열번호 772)에 완전히 상보성인 올리고뉴클레오티드(서열번호 5)의 예이다.
5'gcagtagagccaatta3'(서열번호 772)
3'cgtcatctcggttaat5'(서열번호 5)
동일성
본원에 사용된 용어 "동일성"은 소정 위치에서, 별개 핵산 분자(예컨대, 표적 핵산)의 소정 위치에서 인접한 뉴클레오티드 서열과 동일한(즉, 상보성 뉴클레오시드와 왓슨-크릭 염기 쌍을 형성하는 이들의 능력의 면에서) 핵산 분자(예컨대, 올리고뉴클레오티드) 내의 인접한 뉴클레오티드 서열의 %인 뉴클레오티드의 수를 지칭한다. %는 갭을 비롯하여 2개의 서열 사이에 동일한 정렬된 염기의 수를 계수하고, 올리고뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드의 총 수로 나누고, 100을 곱함으로써 계산된다. % 동일성 = (매치 x 100)/정렬된 영역의 길이(갭을 포함함).
혼성화
본원에 사용된 용어 "혼성화하는" 또는 "혼성화하다"는 대향하는 가닥 상의 염기 쌍 사이에 수소 결합을 형성하고 이에 의해 듀플렉스를 형성하는 2개의 핵산 가닥(예컨대, 올리고뉴클레오티드 및 표적 핵산)으로 이해되어야 한다. 2개의 핵산 가닥 사이의 결합의 친화도는 혼성화의 강도이다. 이것은 종종 올리고뉴클레오티드의 절반이 표적 핵산과 듀플렉싱된 온도로서 정의되는 용융 온도(Tm)에 의하여 기술된다. 생리학적 조건 Tm은 친화도에 엄격히 비례하지는 않는다(문헌[Mergny and Lacroix, 2003, Oligonucleotides 13:515-537]). 표준 상태 깁스(Gibbs) 자유 에너지 ΔG°는 결합 친화도의 더욱 정확한 표현이고, ΔG°= -RTln(Kd)(이때, R은 기체 상수이고, T는 절대 온도임)에 의해 반응의 해리 상수(Kd)와 관련된다. 따라서, 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 사이의 반응의 매우 낮은 ΔG°는 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 사이의 강한 혼성화를 반영한다. ΔG°는 수성 농도가 1 M이고, pH가 7이고, 온도가 37℃인 반응과 연관된 에너지이다. 표적 핵산으로의 올리고뉴클레오티드의 혼성화는 자발적인 반응이고, 자발적인 반응의 경우, ΔG°는 0 미만이다. ΔG°는, 예를 들어, 문헌[Hansen et al., 1965, Chem. Comm. 36-38] 및 문헌[Holdgate et al., 2005, Drug Discov Today]에 기술된 등온 적정 열량계(ITC) 방법을 사용함으로써, 실험적으로 측정될 수 있다. 당업자는 시판 중인 장비가 ΔG° 측정에 이용가능함을 알 것이다. ΔG°는 또한 문헌[Sugimoto et al., 1995, Biochemistry 34:11211-11216] 및 문헌[McTigue et al., 2004, Biochemistry 43:5388-5405]에 기술된 대략적으로 유도된 열역학 파라미터를 사용하는 문헌[SantaLucia, 1998, Proc Natl Acad Sci USA. 95: 1460-1465]에 기술된 최근접 이웃 모델(nearest neighbor model)을 사용함으로써, 수치적으로 추정될 수 있다. 혼성화에 의해 의도된 핵산 표적을 조절할 가능성을 갖기 위하여, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드에 대해 -10 kcal 미만의 추정된 ΔG° 값을 갖는 표적 핵산에 혼성화한다. 일부 양태에서, 혼성화의 정도 또는 강도는 표준 상태 깁스 자유 에너지 ΔG°에 의해 측정된다. 올리고뉴클레오티드는 8 내지 30개의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드에 대해 -10 kcal 미만, 예컨대 -15 kcal 미만, 예컨대 -20 kcal 미만, 예컨대 -25 kcal 미만의 추정된 ΔG° 값을 갖는 표적 핵산에 혼성화할 수 있다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 -10 내지 -60 kcal, 예컨대 -12 내지 -40 kcal, 예컨대 -15 내지 -30 kcal 또는 -16 내지 -27 kcal, 예컨대 -18 내지 -25 kcal의 추정된 ΔG° 값을 갖는 표적 핵산에 혼성화한다.
표적 핵산
본 발명에 따라서, 표적 핵산은 포유동물 PD-L1을 코딩하고, 예를 들어 유전자, RNA, mRNA 및 미성숙 mRNA(pre-mRNA), 성숙 mRNA 또는 cDNA 서열일 수 있는 핵산이다. 따라서, 표적은 PD-L1 표적 핵산으로서 지칭될 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 포유동물 PD-L1의 표적 엑손 영역일 수 있거나, 예를 들어 PD-L1 미성숙 mRNA의 표적 인트론 영역일 수 있다(표 1 참고).
[표 1]
인간 PD-L1 엑손 및 인트론
적합하게는, 표적 핵산은 PD-L1 단백질, 특히 포유동물 PD-L1, 예컨대 인간 PD-L1을 코팅한다(예를 들어, 인간, 원숭이 및 마우스 PD-L1에 대한 RNA 및 미성숙 mRNA 서열에 대한 참고를 제공하는 표 2 및 3 참고). 본 발명의 맥락에서, 미성숙 mRNA는 또한 단백질을 코딩하는 핵산으로 간주된다.
일부 양태에서, 표적 핵산은 서열번호 1, 2 및 3 또는 이의 천연 발생 변이체(예컨대, 포유동물 PD-L1 단백질을 코딩하는 서열)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
연구 또는 진단에서 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 사용하는 경우, 표적 핵산은 cDNA, 또는 DNA 또는 RNA로부터 유도된 합성 핵산일 수 있다.
생체내 또는 시험관내 적용의 경우, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 PD-L1 표적 핵산을 발현하는 세포에서 PD-L1 표적 핵산의 발현을 억제할 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 핵염기의 인접한 서열은 전형적으로 1 또는 2개의 미스매치를 임의적으로 제외하고, 올리고뉴클레오티드를 임의적인 작용기, 예컨대 접합체, 또는 다른 비-상보성 종결 뉴클레오티드(예컨대, 영역 D' 또는 D")에 연결할 수 있는 뉴클레오티드 기반 연결기 영역을 임의적으로 제외하면서 올리고뉴클레오티드의 길이에 따라 측정된 바와 같이, PD-L1 표적 핵산에 상보성이다. 표적 핵산은, 일부 양태에서, RNA 또는 DNA, 예컨대 메신저 RNA, 예컨대 성숙 mRNA 또는 미성숙 mRNA일 수 있다. 일부 양태에서, 표적 핵산은 포유동물 PD-L1 단백질, 예컨대 인간 PD-L1, 예컨대 인간 PD-L1 미성숙 mRNA 서열, 예컨대 서열번호 1로 개시된 서열 또는 NCBI 참조 번호 NM_014143을 갖는 인간 mRNA 서열을 코딩하는 RNA 또는 DNA이다. 예시적인 표적 핵산에 대한 추가 정보는 표 2 및 3에 제공된다.
[표 2]
PD-L1 어크로스 종에 대한 게놈 및 어셈블리 정보
Fwd = 전방 가닥. 게놈 좌표는 미성숙 mRNA 서열(게놈 서열)을 제공한다. NCBI 기준은 mRNA 서열(cDNA 서열)이다.
*미국 국립 생물정보센터(The National Center for Biotechnology Information) 기준 서열 데이터베이스는 게놈, 전사체 및 단백질을 비롯한 포괄적이고 통합되고 중복되지 않고 주석이 잘 달린 기준 서열의 집합이다. 이는 웹사이트[www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq]에서 호스팅된다.
[표 3]
PD-L1 어크로스 종에 대한 서열 세부사항
표적 서열
본원에 사용된 용어 "표적 서열"은 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 상보적인 핵염기 서열을 포함하는 표적 핵산에 존재하는 뉴클레오티드의 서열을 지칭한다. 일부 양태에서, 표적 서열은 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 인접한 뉴클레오티드 서열에 상보적인 표적 핵산 상의 영역으로 이루어진다. 일부 양태에서, 표적 서열은 단일 올리고뉴클레오티드의 상보성 서열보다 길고, 예를 들어 다수의 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의해 표적화될 수 있는 표적 핵산의 바람직한 영역을 나타낼 수 있다.
표적 서열은 표적 핵산의 하위-서열일 수 있다.
일부 양태에서, 하위-서열은 a1 내지 a149로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열이다(표 4 참고). 일부 양태에서, 하위-서열은 인간 PD-L1 mRNA 엑손, 예컨대 e1, e2, e3, e4, e5, e6 및 e7로 이루어진 군으로부터 선택되는 PD-L1 인간 mRNA 엑손으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열이다(상기 표 1 참고).
일부 양태에서, 하위-서열은 인간 PD-L1 mRNA 인트론, 예컨대 i1, i2, i3, i4, i5 및 i6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 PD-L1 인간 mRNA 인트론으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열이다(상기 표 1 참고).
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산, 예컨대 표적 핵산의 하위-서열, 예컨대 본원에 기술된 표적 서열에 상보성이거나 이로 혼성화되는 인접한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
올리고뉴클레오티드는 표적 핵산 분자에 존재하는 표적 서열에 상보적이거나 이로 혼성화되는 8개 이상의 뉴클레오티드의 인접한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 인접한 뉴클레오티드 서열(및, 이에 따라 표적 서열)은 8개 이상의 인접한 뉴클레오티드, 예컨대 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 인접한 뉴클레오티드, 예컨대 12 내지 25개, 예컨대 14 내지 18개의 인접한 뉴클레오티드를 포함한다.
표적 세포
본원에 사용된 용어 "표적 세포"는 표적 핵산을 발현하는 세포를 지칭한다. 일부 양태에서, 표적 세포는 생체내 또는 시험관내일 수 있다. 일부 양태에서, 표적 세포는 포유동물 세포, 예컨대 설치류 세포, 예컨대 마우스 세포 또는 래트 세포, 또는 영장류 세포, 예컨대 원숭이 세포 또는 인간 세포이다.
바람직한 양태에서, 표적 세포는 PD-L1 mRNA, 예컨대 PD-L1 미성숙 mRNA 또는 PD-L1 성숙 mRNA를 발현한다. PD-L1 mRNA의 폴리 A 꼬리는 전형적으로 안티센스 올리고뉴클레오티드 표적화를 위해 분해된다.
천연 발생 변이체
용어 "천연 발생 변이체"는 표적 핵산과 동일한 유전자 자리로부터 유래하지만, 예를 들어, 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈의 다양성을 야기하는 유전자 코드의 퇴화에 기인하여, 또는 미성숙 mRNA의 대체적인 스플라이싱(splicing), 또는 다형태, 예컨대 단일 뉴클레오티드 다형태, 및 대립형질 변이체의 존재에 기인하여 상이할 수 있는 PD-L1 유전자 또는 전사체의 변이체를 지칭한다. 따라서, 올리고뉴클레오티드에 대한 충분한 상보성 서열의 존재에 근거하여, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산 및 이의 천연 발생 변이체를 표적화할 수 있다.
일부 양태에서, 천연 발생 변이체는 포유동물 PD-L1 표적 핵산, 예컨대 서열번호 1, 2 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 표적 핵산에 대해 95% 이상, 예컨대 98% 이상 또는 99% 이상의 상동성을 갖는다.
수많은 단일 뉴클레오티드 다형태는 PD-L1 유전자, 예를 들어 하기 표에 개시된 것들에서 공지되어 있다(인간 미성숙 mRNA 개시/기준 서열은 서열번호 2임).
발현의 조절
본원에 사용된 용어 "발현의 조절"은 올리고뉴클레오티드의 투여 전의 PD-L1의 양과 비교될 때 PD-L1의 양을 변화시키는 올리고뉴클레오티드 능력에 대한 전반적인 용어로서 이해되어야 한다. 발현의 대안적인 조절은 대조군 실험을 참고하여 결정될 수 있다. 대조군이 염수 조성물로 처리된 개체 또는 표적 세포, 또는 비-표적화 올리고뉴클레오티드(모의군)로 처리된 개체 또는 표적 세포임이 일반적으로 이해된다. 그러나, 이는 또한 관리 기준으로 처리된 개체일 수 있다.
조절의 하나의 유형은, 예컨대 mRNA의 분해 또는 전사의 봉쇄에 의해, PD-L1의 발현을 억제하거나, 하향조절하거나, 감소시키거나, 저해시키거나, 제거하거나, 중단시키거나, 차단시키거나, 예방하거나, 줄이거나, 저하시키거나, 회피하거나, 종결하는 올리고뉴클레오티드의 능력이다. 조절의 다른 유형은, 예컨대 슬라이스 부위의 수선 또는 슬라이싱의 방지, 또는 억제 기전의 제거 또는 봉쇄, 예컨대 마이크로RNA 억제에 의해, PD-L1의 발현을 회복하거나, 증가시키거나, 강화시키는 올리고뉴클레오티드의 능력이다.
고친화도 변형된 뉴클레오시드
고친화도 변형된 뉴클레오시드는, 예를 들어 용융 온도(Tm)에 의해 측정되는 바와 같이 올리고뉴클레오티드 내로 혼입될 때, 상보성 표적에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화도를 강화시키는 변형된 뉴클레오티드이다. 본 발명의 고친화도 변형된 뉴클레오시드는 바람직하게는 변형된 뉴클레오시드 당 +0.5 내지 +12℃, 더욱 바람직하게는 +1.5 내지 +10℃, 가장 바람직하게는 +3 내지 +8℃의 용융 온도 증가를 야기한다. 수많은 고친화도 변형된 뉴클레오시드가 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 많은 2' 치환된 뉴클레오시드 및 잠금 핵산(LNA)을 포함한다(예컨대, 문헌[Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443] 및 문헌[Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213] 참고).
당 변형
본 발명의 올리고머는 변형된 당 모이어티, 즉 DNA 및 RNA에서 발견되는 리보스 당 모이어티와 비교되는 경우 당 모이어티의 변형을 갖는 하나 이상의 뉴클레오시드를 포함할 수 있다.
리보스 당 모이어티의 변형을 갖는 수많은 뉴클레오시드는 주로 올리고뉴클레오티드의 특정 특성, 예컨대 친화도 및/또는 뉴클레아제 내성을 개선할 목적으로 제조되었다.
이러한 변형은, 예컨대, 헥소스 고리(HNA), 리보스 고리 상의 C2와 C4 탄소 사이에 바이라디칼 가교를 전형적으로 갖는 이환형 고리(LNA), 또는 C2와 C3 탄소 사이에 결합이 전형적으로 결핍된 비연결된 리보스 고리(예컨대, UNA)에 의한 치환에 의해, 리보스 고리 구조가 변형된 것들을 포함한다. 다른 당 변형된 뉴클레오시드는, 예를 들어, 바이사이클로헥소스 핵산(국제 공개공보 제2011/017521호) 또는 삼환형 핵산(국제 공개공보 제2013/154798호)을 포함한다. 변형된 뉴클레오시드는 또한, 예를 들어 펩티드 핵산(PNA) 또는 모폴리노 핵산의 경우, 당 모이어티가 비-당 모이어티로 대체되는 뉴클레오시드를 포함한다.
당 변형은 또한 리보스 고리 상의 치환기를 수소 이외의 기, 또는 DNA 및 RNA 뉴클레오시드에서 천연 발견되는 2'-OH 기로 변경함으로써 제조된 변형을 포함한다. 치환기는, 예를 들어 2', 3', 4' 또는 5' 위치에서 도입될 수 있다. 변형된 당 모이어티를 갖는 뉴클레오시드는 또한 2' 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2' 치환된 뉴클레오시드를 포함한다. 실제로, 2' 치환된 뉴클레오시드를 개발하는데 많은 초점이 맞춰졌고, 올리고뉴클레오티드 내로 혼입될 때, 강화된 뉴클레오시드 내성 및 강화된 친화도를 갖는 수많은 2' 치환된 뉴클레오시드가 발견되었다.
2' 변형된 뉴클레오시드
2' 당 변형된 뉴클레오시드는 2' 위치에서 H 또는 -OH 이외의 치환기를 갖거나(2' 치환된 뉴클레오시드) 2' 연결된 바이라디칼을 포함하는 뉴클레오시드이고, 2' 치환된 뉴클레오시드 및 LNA(2'-4' 바이라디칼 가교된) 뉴클레오시드를 포함한다. 예를 들어, 2' 변형된 당은 강화된 결합 친화도 및/또는 증가된 뉴클레아제 내성을 올리고뉴클레오티드에 제공할 수 있다. 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드의 예는 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA(MOE), 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-RNA 및 2'-F-ANA 뉴클레오시드이다. 추가 예의 경우, 문헌[Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443], 문헌[Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213], 및 문헌[Deleavey and Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937]을 참고한다. 일부 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드가 하기 제시된다:
잠금 핵산(LNA) 뉴클레오시드
LNA 뉴클레오시드는 뉴클레오티드의 리보스 당 고리의 C2'와 C4' 사이에 연결기(바이라디칼 또는 가료로서 지칭됨)를 포함하는 변형된 뉴클레오시드이다. 이러한 뉴클레오시드는 또한 문헌에서 가교된 핵산 또는 이환형 핵산(BNA)으로 지칭된다.
일부 양태에서, 본 발명의 올리고머의 변형된 뉴클레오시드 또는 LNA 뉴클레오시드는 하기 화학식 I 또는 II의 일반적인 구조를 갖는다:
[화학식 I]
[화학식 II]
상기 식에서,
W는 -O-, -S-, -N(Ra)-, -C(RaRb)-로부터 선택되고, 예컨대, 일부 양태에서 -O-이고;
B는 핵염기 또는 변형된 핵염기 모이어티이고;
Z는 인근 뉴클레오시드, 또는 5'-말단 기로의 뉴클레오시드간 연결기이고;
Z*는 인근 뉴클레오시드 또는 3'-말단 기로의 뉴클레오시드간 연결기이고;
X는 -C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -O-, -Si(Ra)2-, -S-, -SO2-, -N(Ra)- 및 >C=Z로 이루어진 군으로부터 선택되는 기이고(일부 양태에서, X는 -O-, -S-, NH-, NRaRb, -CH2-, CRaRb, -C(=CH2)- 및 -C(=CRaRb)-로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, X는 -O-이다),
Y는 -C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -O-, -Si(Ra)2-, -S-, -SO2-, -N(Ra)- 및 >C=Z로 이루어진 군으로부터 선택되는 기이거나(일부 양태에서, Y는 -CH2-, -C(RaRb)-, -CH2CH2-, -C(RaRb)-C(RaRb)-, -CH2CH2CH2-, -C(RaRb)C(RaRb)C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)- 및 -C(Ra)=N-으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, Y는 -CH2-, -CHRa-, -CHCH3- 및 CRaRb-로 이루어진 군으로부터 선택된다),
-X-Y-는 함께 2가 연결기(또한 라디칼로 지칭됨)이거나, -C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -O-, -Si(Ra)2-, -S-, -SO2-, -N(Ra)- 및 >C=Z로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2, 3 또는 4개의 기/원자로 이루어진 2가 연결기이고(일부 양태에서, -X-Y-는 -X-CH2-, -X-CRaRb-, -X-CHRa-, -X-C(HCH3)-, -O-Y-, -O-CH2-, -S-CH2-, -NH-CH2-, -O-CHCH3-, -CH2-O-CH2, -O-CH(CH3CH3)-, -O-CH2-CH2-, OCH2-CH2-CH2-, -O-CH2OCH2-, -O-NCH2-, -C(=CH2)-CH2-, -NRa-CH2-, N-O-CH2, -S-CRaRb- 및 -S-CHRa-로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이라디칼이다. 일부 양태에서, -X-Y-는 -O-CH2- 또는 -O-CH(CH3)-이다. 이때 Z는 -O-, -S- 및 -N(Ra)-로부터 선택된다);
Ra, 및 존재하는 경우 Rb는 각각 수소, 임의적으로 치환된 C1-6-알킬, 임의적으로 치환된 C2-6-알켄일, 임의적으로 치환된 C2-6-알킨일, 하이드록시, 임의적으로 치환된 C1-6-알콕시, C2-6-알콕시알킬, C2-6-알켄일옥시, 카복시, C1-6-알콕시카보닐, C1-6-알킬카보닐, 폼일, 아릴, 아릴옥시-카보닐, 아릴옥시, 아릴카보닐, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시-카보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카보닐, 아미노, 모노- 및 다이(C1-6-알킬)아미노, 카바모일, 모노- 및 다이(C1-6-알킬)-아미노카보닐, 아미노-C1-6-알킬-아미노카보닐, 모노- 및 다이(C1-6-알킬)아미노-C1-6-알킬-아미노카보닐, C1-6-알킬-카보닐아미노, 카브아미도, C1-6-알카노일옥시, 설포노, C1-6-알킬설포닐옥시, 니트로, 아지도, 설파닐, C1-6-알킬티오, 할로겐으로부터 독립적으로 선택되고, 이때 아릴 및 헤테로아릴은 임의적으로 치환될 수 있고, 2개의 같은자리 치환기 Ra 및 Rb는 함께 임의적으로 치환된 메틸렌(=CH2)을 나타낼 수 있고, 모든 키랄 중심에 대하여, 비대칭 기는 R 또는 S 배향으로 발견될 수 있고;
R1, R2, R3, R5 및 R5*는 수소, 임의적으로 치환된 C1-6-알킬, 임의적으로 치환된 C2-6-알켄일, 임의적으로 치환된 C2-6-알킨일, 하이드록시, C1-6-알콕시, C2-6-알콕시알킬, C2-6-알켄일옥시, 카복시, C1-6-알콕시카보닐, C1-6-알킬카보닐, 폼일, 아릴, 아릴옥시-카보닐, 아릴옥시, 아릴카보닐, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시-카보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카보닐, 아미노, 모노- 및 다이(C1-6-알킬)아미노, 카바모일, 모노- 및 다이(C1-6-알킬)-아미노카보닐, 아미노-C1-6-알킬-아미노카보닐, 모노- 및 다이(C1-6-알킬)아미노-C1-6-알킬-아미노카보닐, C1-6-알킬-카보닐아미노, 카브아미도, C1-6-알카노일옥시, 설포노, C1-6-알킬설포닐옥시, 니트로, 아지도, 설파닐, C1-6-알킬티오 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, 이때 아릴 및 헤테로아릴은 임의적으로 치환될 수 있고, 2개의 같은자리 치환기는 함께 옥소, 티오옥소, 이미노 또는 임의적으로 치환된 메틸렌을 나타낼 수 있다.
일부 양태에서, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 C1-6 알킬, 예컨대 메틸 및 수소로부터 독립적으로 선택된다.
일부 양태에서, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다.
일부 양태에서 R1, R2 및 R3은 모두 수소이고, R5 또는 R5*는 또한 수소이고, R5 및 R5* 중 나머지 하나는 수소가 아니 것, 예컨대 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다.
일부 양태에서, Ra는 수소 또는 메틸이다. 일부 양태에서, 존재하는 경우, Rb는 수소 또는 메틸이다.
일부 양태에서, Ra 및 Rb 중 하나 또는 둘 다는 수소이다.
일부 양태에서, Ra 및 Rb 중 하나는 수소이고, 다른 하나는 수소가 아니다.
일부 양태에서, Ra 및 Rb 중 하나는 메틸이고, 다른 하나는 수소이다.
일부 양태에서, Ra 및 Rb는 둘 다 메틸이다.
일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -O-CH2-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 이러한 LNA 뉴클레오시드는 국제 공개공보 제99/014226호, 국제 공개공보 제00/66604호, 국제 공개공보 제98/039352호 및 국제 공개공보 제2004/046160호(모두 본원에 참고로서 혼입됨)에 개시되어 있고, 베타-D-옥시 LNA 및 알파-1-옥시 LNA 뉴클레오시드로서 공지된 것들을 포함한다.
일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -S-CH2-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 이러한 티오 LNA 뉴클레오시드는 국제 공개공보 제99/014226호 및 국제 공개공보 제2004/046160호(본원에 참고로서 혼입됨)에 개시되어 있다.
일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -NH-CH2-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 이러한 아미노 LNA 뉴클레오시드는 국제 공개공보 제99/014226호 및 국제 공개공보 제2004/046160호(본원에 참고로서 혼입됨)에 개시되어 있다.
일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -O-CH2-CH2- 또는 -O-CH2-CH2-CH2-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 이러한 LNA 뉴클레오시드는 국제 공개공보 제00/047599호 및 문헌[Morita et al, Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12 73-76](본원에 참고로서 혼입됨)에 개시되어 있고, 2'-O-4'C-에틸렌 가교 핵산(ENA)으로 통상적으로 공지된 것들을 포함한다.
일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -O-CH2-이고, W는 O이고, R1, R2 및 R3 모두 및 R5 및 R5* 중 하나는 수소이고, R5 및 R5* 중 다른 하나는 수소가 아닌 것, 예컨대 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다. 이러한 5' 치환된 LNA 뉴클레오시드는 국제 공개공보 제2007/134181호(본원에 참고로서 혼입됨)에 개시되어 있다.
일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -O-CRaRb-이고, 이때 Ra 및 Rb 중 하나 또는 둘 다는 수소가 아닌 것, 예컨대 메틸이고, W는 O이고, R1, R2 및 R3 모두 및 R5 및 R5* 중 하나는 수소이고, R5 및 R5* 중 다른 하나는 수소가 아닌 것, 예컨대 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다. 이러한 비스 변형된 LNA 뉴클레오시드는 국제 공개공보 제2010/077578호(본원에 참고로서 혼입됨)에 개시되어 있다.
일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 2가 연결기 -O-CH(CH2OCH3)-(2' O-메톡시에틸 이환형 핵산, 문헌[Seth at al., 2010, J. Org. Chem. Vol 75(5) pp. 1569-81])을 나타낸다. 일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 2가 연결기 -O-CH(CH2CH3)-(2'O-에틸 이환형 핵산, 문헌[Seth at al., 2010, J. Org. Chem. Vol 75(5) pp. 1569-81])을 나타낸다. 일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -O-CHRa-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 이러한 6' 치환된 LNA 뉴클레오시드는 국제 공개공보 제10/036698호 및 국제 공개공보 제07/090071호(둘 다 본원에 참고로서 혼입됨)에 개시되어 있다.
일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -O-CH(CH2OCH3)-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 이러한 LNA 뉴클레오시드는 또한 당해 분야에서 환형 MOE(cMOE)로 공지되어 있고, 국제 공개공보 제07/090071호에 개시되어 있다.
일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 2가 연결기 -O-CH(CH3)-을 나타낸다(R- 또는 S-배열). 일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 함께 2가 연결기 -O-CH2-O-CH2-를 나타낸다(문헌[Seth at al., 2010, J. Org. Chem]). 일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -O-CH(CH3)-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 이러한 6' 메틸 LNA 뉴클레오시드는 당해 분야에서 cET 뉴클레오시드로 공지되어 있고, 국제 공개공보 제07/090071호(베타-D) 및 국제 공개공보 제2010/036698호(알파-L)(둘 다 본원에 참고로서 혼입됨)에 개시된 바와 같이, (S)cET 또는 (R)cET 입체 이성질체일 수 있다.
일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -O-CRaRb-이고, 이때 Ra 및 Rb는 모두 수소가 아니고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 일부 양태에서, Ra 및 Rb는 둘 다 메틸이다. 이러한 6' 다이-치환된 LNA 뉴클레오시드는 국제 공개공보 제2009/006478호(본원에 참고로서 혼입됨)에 개시되어 있다.
일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -S-CHRa-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 이러한 6' 치환된 티오 LNA 뉴클레오시드는 국제 공개공보 제11/156202호(본원에 참고로서 혼입됨)에 개시되어 있다. 일부 6' 치환된 티오 LNA 양태에서, Ra는 메틸이다.
일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -C(=CH2)-C(RaRb)-, 예컨대 -C(=CH2)-CH2- 또는 -C(=CH2)-CH(CH3)-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 비닐 카보 LNA 뉴클레오시드는 국제 공개공보 제08/154401호 및 국제 공개공보 제09/067647호(둘 다 본원에 참고로서 혼입됨)에 개시되어 있다.
일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -N(-ORa)-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 일부 양태에서, Ra는 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다. 이러한 LNA 뉴클레오시드는 또한 N 치환된 LNA로 공지되어 있고, 국제 공개공보 제2008/150729호(본원에 참고로서 혼입됨)에 개시되어 있다. 일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 함께 2가 연결기 -O-NRa-CH3-을 나타낸다(문헌[Seth at al., 2010, J. Org. Chem]). 일부 양태에서, 바이라디칼 -X-Y-는 -N(Ra)-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 일부 양태에서, Ra는 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다.
일부 양태에서, R5 및 R5* 중 하나 또는 둘 다는 수소이고, 치환되는 경우, R5 및 R5* 중 다른 하나는 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다. 이러한 양태에서, R1, R2 및 R3은 모두 수소일 수 있고, 바이라디칼 -X-Y-는 -O-CH2- 및 -O-C(HCRa)-, 예컨대 -O-C(HCH3)-으로부터 선택될 수 있다.
일부 양태에서, 바이라디칼은 -CRaRb-O-CRaRb-, 예컨대 CH2-O-CH2-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 일부 양태에서, Ra는 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다. 이러한 LNA 뉴클레오시드는 또한 형태적으로 제한된 뉴클레오티드(CRN)로 공지되어 있고, 국제 공개공보 제2013/036868호(본원에 참고로서 혼입됨)에 개시되어 있다.
일부 양태에서, 바이라디칼은 -O-CRaRb-O-CRaRb-, 예컨대 O-CH2-O-CH2-이고, W는 O이고, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 일부 양태에서, Ra는 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다. 이러한 LNA 뉴클레오시드는 또한 COC 뉴클레오티드로 공지되어 있고, 문헌[Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009 37(4), 1225-1238](본원에 참고로서 혼입됨)에 개시되어 있다.
달리 지시되지 않는 한, LNA 뉴클레오시드가 베타-D 또는 알파-L 입체 이성질형일 수 있음이 인정될 것이다.
LNA 뉴클레오시드의 특정 예는 하기 도식 1에 지시된다.
[도식 1]
상기 예에 예시된 바와 같이, 본 발명의 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드 중 LNA 뉴클레오시드는 베타-D-옥시-LNA 뉴클레오시드이다.
뉴클레아제 매개된 분해
뉴클레아제 매개된 분해는 상보성 뉴클레오티드 서열과 듀플렉스를 형성할 때, 상보성 뉴클레오티드 서열의 분해를 매개할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.
일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산의 뉴클레아제 매개된 분해를 통해 작용할 수 있고, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제, 특히 엔도뉴클레아제, 바람직하게는 엔도리보뉴클레아제(RNase), 예컨대 RNase H를 모집할 수 있다. 뉴클레아제 매개된 기전을 통해 작동하는 올리고뉴클레오티드 디자인의 예는 전형적으로 5 또는 6개 이상의 DNA 뉴클레오시드의 영역을 포함하고 친화성 강화 뉴클레오시드, 예를 들어 갭머, 헤드머 및 테일머에 의해 한 측면 또는 양 측면 상에 접하는 올리고뉴클레오티드이다.
RNase H 활성 및 모집
안티센스 올리고뉴클레오티드의 RNase H 활성은 상보성 RNA 분자와의 듀플렉스에서 RNase H를 모집하는 이의 능력을 지칭한다. 국제 공개공보 제01/23613호는 RNase H를 모집하는 능력을 측정하는데 사용될 수 있는 RNase H 활성을 측정하기 위한 시험관내 방법을 제공한다. 전형적으로, 상보성 표적 핵산 서열과 함께 제공될 때, 시험되는 변형된 올리고뉴클레오티드와 동일한 염기 서열을 갖지만, 올리고뉴클레오티드 내의 모든 단량체 사이에 포스포로티오에이트 연결기를 갖는 DNA 단량체만을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 사용하고, 국제 공개공보 제01/23613호(본원에 참고에 의해 혼입됨)의 실시예 91 내지 95에 제공된 방법을 사용하여 측정된 초기 속도의 5% 이상, 예컨대 10% 이상 또는 20% 초과의 초기 속도(pmol/L/분으로 측정됨)를 갖는다면, 올리고뉴클레오티드는 RNase H를 모집할 수 있는 것으로 간주된다.
갭머
본원에 사용된 용어 "갭머"는 하나 이상의 친화성 강화 변형된 뉴클레오시드를 포함하는 영역에 의해 5' 및 3' 측면(플랭크 또는 윙)에 위치하는 RNase H 모집 올리고뉴클레오티드의 영역(갭)을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 다양한 갭머 디자인이 본원에 기술되어 있고, RNase H를 모집하는 이들의 능력에 의해 특징지어진다. 헤드머 및 테일머는 하나의 플랭크가 소실되는, 즉 올리고뉴클레오티드의 단부 중 1개만이 친화성 강화 변형된 뉴클레오시드를 포함하는 RNase H를 모집할 수 있는 올리고뉴클레오티드이다. 헤드머의 경우, 3' 플랭크가 소실되고(즉, 5' 플랭크는 친화성 강화 변형된 뉴클레오시드를 포함함), 테일머의 경우, 5' 플랭크가 소실된다(즉, 3' 플랭크는 친화성 강화 변형된 뉴클레오시드를 포함함).
LNA 갭머
용어 "LNA 갭머"는 하나 이상의 친화성 강화 변형된 뉴클레오시드가 LNA 뉴클레오시드인 갭머 올리고뉴클레오티드이다.
혼합된 윙 갭머
용어 "혼합된 윙 갭머" 또는 "혼합된 플랭크 갭머"는 하나 이상의 플랭크 영역이 하나 이상의 LNA 뉴클레오시드 및 하나 이상의 비-LNA 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 하나 이상의 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드, 예컨대, 예를 들어, 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA(MOE), 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-RNA 및 2'-F-ANA 뉴클레오시드를 포함하는 LNA 갭머를 지칭한다. 일부 양태에서, 혼합된 윙 갭머는 LNA 뉴클레오시드만을 포함하는 하나의 플랭크(예컨대, 5' 또는 3')를 갖고, 다른 플랭크(각각 3' 또는 5')는 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드 및 임의적으로 LNA 뉴클레오시드를 포함한다.
갭브레이커(Gapbreaker)
용어 "갭브레이커 올리고뉴클레오티드"는 갭 영역이 5개 미만의 연속적인 DNA 뉴클레오시드를 포함하도록, 갭 영역 비-RNase H 모집 뉴클레오시드(갭브레이커 뉴클레오시드, E)에 의해 파괴되더라고 RNAse H 모집을 유지할 수 있는 갭머에 관하여 사용된다. 비-RNase H 모집 뉴클레오시드는, 예를 들어 뉴클레오시드의 리보스 당 고리의 C2'와 C4' 사이의 가교가 베타 형태인 3' 엔도 형태, 예컨대 LNA의 3' 엔도 형태의 뉴클레오시드, 예컨대 베타-D-옥시 LNA 또는 ScET 뉴클레오시드이다. RNase H를 모집하는 갭브레이커 올리고뉴클레오티드의 능력은 전형적으로 서열이거나 심지어 화합물 특이적이다(일부 경우에, 표적 RNA의 더욱 특이적인 절단을 제공하는 RNase H를 모집하는 "갭브레이커" 올리고뉴클레오티드를 개시하는 문헌[Rukov et al. 2015 Nucl. Acids Res. Vol. 43 pp. 8476-8487] 참고).
일부 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 갭브레이커 올리고뉴클레오티드이다. 일부 양태에서, 갭브레이커 올리고뉴클레오티드는 5'-플랭크(F), 갭(G) 및 3'-플랭크(F')를 포함하고, 이때 갭은 갭이 3 또는 4개의 연속적인 DNA 뉴클레오시드를 함유하도록 비-RNase H 모집 뉴클레오시드(갭브레이커 뉴클레오시드, E)에 의해 분열된다. 일부 양태에서, 갭브레이커 뉴클레오시드(E)는 뉴클레오시드의 리보스 당 고리의 C2'와 C4' 사이의 가교가 베타 형태이고, 갭브레이커 LNA 뉴클레오시드가 적어도 3(5') 및 3(3') 또는 적어도 3(5') 및 4(3') 또는 적어도 4(5') 및 3(3') DNA 뉴클레오시드만큼 5' 및 3' 플랭크에 위치하도록 갭 영역 내에 위치하고, 올리고뉴클레오티드가 RNase H를 모집할 수 있는 LNA 뉴클레오시드이다.
갭브레이커 올리고뉴클레오티드는 하기 구조식으로 표시될 수 있다:
F-G-E-G-F', 특히 F1-7-G3-4-E1-G3-4-F'1-7
D'-F-G-F', 특히 D'1-3-F1-7-G3-4-E1-G3-4-F'1-7
F-G-F'-D", 특히 F1-7- G3-4-E1-G3-4-F'1-7-D"1-3
D'-F-G-F'-D", 특히 D'1-3-F1-7-G3-4-E1-G3-4-F'1-7-D"1-3
이때, 영역 D' 및 D"는 섹션 "갭머 디자인"에 기술된 바와 같다.
일부 양태에서, 갭브레이커 뉴클레오시드(E)는 베타-D-옥시 LNA 또는 ScET이거나 도식 1에 제시된 다른 베타-LNA 뉴클레오시드이다.
접합체
본원에 사용된 용어 "접합체"는 비-뉴클레오티드 모이어티(접합체 모이어티 또는 영역 C 또는 제3 영역)에 공유 결합으로 연결되는 올리고뉴클레오티드를 지칭하고, 올리고뉴클레오티드 접합체로도 지칭된다.
하나 이상의 비-뉴클레오티드 모이어티로의 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 접합은, 예컨대, 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포 분포, 세포 흡수 또는 안정성에 영향을 줌으로써, 올리고뉴클레오티드의 약리학을 개선할 수 있다. 일부 양태에서, 접합체 모이어티는 올리고뉴클레오티드를 간으로 표적화시킨다. 동시에, 접합체는 비-표적-세포 유형, 조직 또는 기관의 올리고뉴클레오티드의 활성, 예컨대 비-표적-세포 유형, 조직 또는 기관의 오프 표적(off target) 활성 또는 활성을 감소시키는 역할을 한다. 본 발명의 한 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 접합체는 비접합된 올리고뉴클레오티드와 비교하여, 표적 세포에서 PD-L1의 개선된 억제를 나타낸다. 다른 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 접합체는 비접합된 올리고뉴클레오티드와 비교될 때, 간과 다른 기관, 예컨대 비장 또는 신장 사이의 세포 분포를 개선하였다(즉, 더욱 접합된 올리고뉴클레오티드는 비장 또는 신장보다 간을 향함). 다른 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 접합체는 비접합된 올리고뉴클레오티드와 비교될 때, 접합체 올리고뉴클레오티드의 간으로의 개선된 세포 흡수를 나타낸다.
국제 공개공보 제93/07883호 및 국제 공개공보 제2013/033230호(본원에 참고로서 혼입됨)는 적합한 접합체 모이어티를 제공한다. 더욱 적합한 접합체 모이어티는 아시알로당단백질 수용체(ASGPr)로 결합할 수 있는 것이다. 특히, 3-가 N-아세틸갈락토사민 접합체 모이어티는 ASGPr로의 결합에 적합하다(예를 들어, 국제 공개공보 제2014/076196호, 국제 공개공보 제2014/207232호 및 국제 공개공보 제2014/179620호(본원에 참고에 의해 혼입됨) 참고). 접합체 모이어티는 본질적으로 핵산으로 구성되지 않는 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체의 부분이다.
올리고뉴클레오티드 접합체 및 합성은 또한 문헌[Manoharan in Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T. Crooke, ed., Ch. 16, Marcel Dekker, Inc., 2001] 및 문헌[Manoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103](이들은 각각 이의 전체 내용이 참고로서 본원에 혼입됨)에 의해 포괄적인 검토로서 보고되었다.
한 양태에서, 비-뉴클레오티드 모이어티(접합체 모이어티)는 탄수화물, 세포 표면 수용체 리간드, 약물 물질, 호르몬, 친유성 물질, 중합체, 단백질, 펩티드, 독소(예컨대, 세균성 독소), 비타민, 바이러스성 단백질(예컨대, 캡시드) 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
연결기
연결기 또는 연결자는 하나의 해당 화학적 기 또는 분절을 하나 이상의 공유 결합을 통해 다른 해당 화학적 기 또는 분절로 연결하는 2개의 원자 사이의 결합이다. 접합체 모이어티는 직접적으로 또는 연결 모이어티(예컨대, 연결기 또는 테더)를 통해 올리고뉴클레오티드에 부착될 수 있다. 연결기는 제3 영역, 예컨대 접합체 모이어티(영역 C)를 제1 영역, 예컨대 올리고뉴클레오티드 또는 표적 핵산에 상보적인 인접한 뉴클레오티드 서열(영역 A)에 공유 결합으로 결합시키는 역할을 한다.
본 발명의 일부 양태에서, 본 발명의 접합체 또는 올리고뉴클레오티드 접합체는 올리고뉴클레오티드 또는 표적 핵산에 상보적인 인접한 뉴클레오티드 서열(영역 A 또는 제1 영역)과 접합체 모이어티(영역 C 또는 제3 영역) 사이에 위치하는 연결기 영역(제2 영역 또는 영역 B 및/또는 영역 Y)을 임의적으로 포함할 수 있다.
영역 B는 포유동물 신체 내에서 통상적으로 만나거나 통상적으로 만나는 것과 유사한 조건 하에 절단성 생리학적으로 불안정한 결합을 포함하거나 이로 이루어진 생체절단성 연결기를 지칭한다. 생리학적으로 불안정한 연결기가 화학적 변형(예컨대, 절단)을 겪는 조건은 포유동물 세포에서 발견되거나 포유동물 세포에서 만나는 바와 유사한 pH, 온도, 산화 또는 환원 조건 또는 약품, 및 염 농도와 같은 화학적 조건을 포함한다. 포유동물 세포내 조건은 또한 포유동물 세포에 통상적으로 존재하는 효소적 활성, 예컨대 단백질 분해 효소 또는 가수분해 효소 또는 뉴클레아제로부터의 효소적 활성의 존재를 포함한다. 한 양태에서, 생체절단성 연결기는 S1 뉴클레아제 절단에 민감하다. 바람직한 양태에서, 뉴클레아제 민감성 연결기는 2개 이상의 연속적인 포스포다이에스터 연결기, 예컨대 3개 이상 또는 4 또는 5개의 연속적인 포스포다이에스터 연결기를 포함하는 1 내지 10개의 뉴클레오시드, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오시드, 더욱 바람직하게는 2 내지 6개의 뉴클레오시드, 가장 바람직하게는 2 내지 4개의 연결된 뉴클레오시드를 포함한다. 바람직하게는, 뉴클레오시드는 DNA 또는 RNA이다. 생체절단성 연결기를 함유하는 포스포다이에스터는 국제 공개공보 제2014/076195호(본원에 참고에 의해 혼입됨)에 더욱 상세히 기술되어 있다.
영역 Y는 필수적으로 생체절단성이지는 않지만, 주로 접합체 모이어티(영역 C 또는 제3 영역)를, 표적 핵산에 상보적인 올리고뉴클레오티드 또는 인접한 뉴클레오티드 서열(영역 A 또는 제1 영역)에 공유 결합으로 연결하는 역할을 한다. 영역 Y 연결기는 쇄 구조, 또는 에틸렌 글리콜, 아미노산 단위 또는 아미노 알킬 기와 같은 반복 단위의 올리고머를 포함할 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드 접합체는 하기 영역 요소로 구성될 수 있다: A-C, A-B-C, A-B-Y-C, A-Y-B-C 또는 A-Y-C. 일부 양태에서, 연결기(영역 Y)는 아미노 알킬, 예컨대 C2-C36 아미노 알킬 기, 예를 들어 C6-C12 아미노 알킬 기를 포함한다. 바람직한 양태에서, 연결기(영역 Y)는 C6 아미노 알킬 기이다.
치료
본원에 사용된 용어 "치료"는 존재하는 질병(예컨대, 본원에서 질병 또는 질환으로 지칭됨)의 치료, 및 질병의 방지, 즉 예방 둘 다를 지칭한다. 따라서, 본원에 언급된 치료는, 일부 양태에서, 예방적일 수 있다.
병원균에 대한 면역 반응의 회복
면역 반응은 내재 및 적응 면역 반응으로 분류된다. 내재 면역계는 즉각적이지만 비-특이적인 반응을 제공한다. 적응 면역 반응은 내재 면역 반응에 의해 활성화되고, 특정 병원균에 고도로 특이적이다. 항원-제시 세포의 표면 상의 병원균-유래 항원의 제시 시, 적응 면역 반응의 면역 세포(즉, T 및 B 림프구)는 이들의 항원-특이적 수용체를 통해 활성화되어 병원성-특이적 면역 반응 및 면역 기억의 발생을 야기한다. 만성 바이러스성 감염, 예컨대 HBV 및 HCV는 바이러스성-특이적 T-세포의 비반응성에 의해 특징지어지는 T-세포 배출과 연관된다. T-세포 배출은 잘 연구되었고, 검토를 위해, 예를 들어 문헌[Yi et al 2010 Immunology129, 474-481]을 참고한다. 만성 바이러스성 감염은 또한 내재 면역 세포인 NK 세포의 감소된 기능과 연관된다. 바이러스성 면역 반응의 강화는 만성 감염의 제거를 위해 중요하다. T-세포 및 NK 세포에 의해 매개된 병원균에 대한 면역 반응의 회복은 증식, 사이토킨 분비 및 세포용해 기능의 측정에 의해 평가될 수 있다(문헌[Dolina et al. 2013 Molecular Therapy-Nuclecic Acids, 2 e72] 및 본원의 실시예 6).
발명의 상세한 설명
본 발명은 동물, 특히 인간을 감염시킨 병원균에 대한 면역 반응을 회복하기 위한, 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 이의 접합체 및 이들을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체는 간을 감염시킨 병원균, 특히 만성 간 감염, 예컨대 HBV에 대해 특히 유용하다. 접합체는 올리고뉴클레오티드의 표적화된 분포를 가능하게 하고 표적 핵산의 시스템 녹다운(systemic knockdown)을 방지한다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드
본 발명은 PD-L1의 발현을 조절할 수 있는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 조절은 PD-L1을 코딩하거나 PD-L1의 조절과 관련된 표적 핵산으로 혼성화시킴으로써 달성될 수 있다. 표적 핵산은 포유동물 PD-L1 서열, 예컨대 서열번호 1, 서열번호 2 및/또는 서열번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열일 수 있다. 표적 핵산은 PD-L1의 발현 또는 조절을 지지하는 포유동물 세포로부터 발현된 미성숙 mRNA, mRNA 또는 임의의 RNA 서열일 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 PD-L1을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
본 발명의 한 양상에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 접합체 모이어티, 특히 아시알로당단백질 수용체 표적화 접합체 모이어티에 접합된다.
일부 양태에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적의 발현을 억제하거나 하향-조절함으로써 이를 조절할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 조절은 표적의 정상 발현 수준과 비교하여 20% 이상의 발현의 억제, 더욱 바람직하게는 표적의 정상 발현 수준과 비교하여 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상의 억제를 제공한다. 바람직하게는, 이러한 조절은 세포 또는 유기체가 감염성 제제에 의해 공격받거나 감염성 제제에 의한 공격을 자극하는 제제(예컨대, 폴리 I:C 또는 LPS)로 처리될 때의 발현 수준과 비교하여 20% 이상의 발현의 억제, 더욱 바람직하게는 세포 또는 유기체가 감염성 제제에 의해 공격받거나 감염성 제제에 의한 공격을 자극하는 제제(예컨대, 폴리 I:C 또는 LPS)로 처리될 때의 발현 수준과 비교하여 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상의 억제를 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 카르파스-299 또는 THP1 세포를 시험관내 사용하여 60 또는 70% 이상만큼 PD-L1 mRNA의 발현 수준을 억제할 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 화합물은 카르파스-299 또는 THP1 세포를 시험관내 사용하여 50% 이상만큼 PD-L1 단백질의 발현 수준을 억제할 수 있다. 적합하게는, 실시예는 PD-L1 RNA를 측정하는데 사용될 수 있는 검정을 제공한다(예컨대, 실시예 1). 표적 조절은 올리고뉴클레오티드 및 표적 핵산의 인접한 뉴클레오티드 서열 사이의 혼성화에 의해 유발될 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 사이의 미스매치를 포함한다. 미스매치에도 불구하고, 표적 핵산에 대한 혼성화는 PD-L1 발현의 목적 조절을 나타내기에 여전히 충분할 수 있다. 미스매치로부터 야기되는 감소된 결합 친화도는 올리고뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드의 증가된 수 및/또는 표적에 대한 결합 친화도를 증가시킬 수 있는 변형된 뉴클레오시드(예컨대, 올리고뉴클레오티드 서열 내에 존재하는 2' 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 LNA)의 증가된 수에 의해 유리하게 보충될 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 병원균-특이적 T-세포를 회복할 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 비처리된 대조군 또는 치료 기준으로 처리된 대조군과 비교될 때 40%, 50%, 60% 또는 70% 이상만큼 병원균-특이적 T-세포를 증가시킬 수 있다. 한 양태에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 접합체는 비처리된 대조군 또는 치료 기준으로 처리된 대조군과 비교될 때 HBV-특이적 T-세포를 증가시킬 수 있다. 적합하게는, 실시예는 HBV-특이적 T-세포를 측정하는데 사용할 수 있는 검정을 제공한다(예컨대, T-세포 증식, 사이토킨 분비 및 세포용해 활성). 다른 양태에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 접합체는 비처리된 대조군 또는 치료 기준으로 처리된 대조군과 비교될 때 HCV-특이적 T-세포를 증가시킬 수 있다. 다른 양태에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 접합체는 비처리된 대조군 또는 치료 기준으로 처리된 대조군과 비교될 때 HDV-특이적 T-세포를 증가시킬 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 동물 또는 인간에서 HBsAg 수준을 감소시킬 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 치료 전의 수준과 비교할 때 40%, 50%, 60% 또는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80%, 90% 또는 95% 이상만큼 HBsAg 수준을 감소시킬 수 있다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 HBV에 의해 감염된 동물 또는 인간에서 HBsAg의 혈청전환을 달성할 수 있다.
본 발명의 한 양상은 PD-L1 표적 핵산에 90% 이상 상보적인, 0 내지 30개의 뉴클레오티드 길이인 인접한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.
일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산의 영역과 90% 이상, 예컨대 91% 이상, 예컨대 92% 이상, 예컨대 93% 이상, 예컨대 94% 이상, 예컨대 95% 이상, 예컨대 96% 이상, 예컨대 97% 이상, 예컨대 98% 이상 또는 100% 상보적인 인접한 서열을 포함한다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접한 뉴클레오티드 서열은 표적 핵산의 영역에 완전히 상보적이거나(100% 상보성), 일부 양태에서 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 사이에 1 또는 2개의 미스매치를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 서열번호 2에 존재하는 표적 핵산 영역에 대해 90% 이상의 상보성, 예컨대 완전한(또는 100%) 상보성을 갖는, 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이의 인접한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드 서열은 서열번호 1 및 서열번호 2에 존재하는 상응하는 표적 핵산 영역에 대해 100% 상보적이다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드 서열은 서열번호 1 및 서열번호 2에 존재하는 상응하는 표적 핵산 영역에 대해 100% 상보적이다.
일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 접합체는 상응하는 표적 핵산 영역에 대한 90% 이상의 상보성, 예컨대 100%의 상보성을 갖는, 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이의 인접한 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 이때 인접한 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1의 위치 371 내지 3068, 5467 내지 12107 및 15317 내지 19511로 이루어진 군으로부터 선택되는 표적 핵산의 하위-서열에 상보적이다. 추가 양태에서, 표적 핵산의 하위-서열은 서열번호 1의 위치 371 내지 510, 822 내지 1090, 1992 내지 3068, 5467 내지 5606, 6470 내지 12107, 15317 내지 15720, 15317 내지 18083, 18881 내지 19494 및 1881 내지 19494로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 양태에서, 표적 핵산의 하위-서열은 서열번호 1의 위치 7300 내지 7333, 8028 내지 8072, 9812 내지 9859, 11787 내지 11873 및 15690 내지 15735로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 접합체는 서열번호 1에 존재하는 상응하는 표적 핵산 영역에 대한 90% 이상의 상보성, 예컨대 100% 상보성을 갖는, 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이의 인접한 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 표적 핵산 영역은 표 4의 영역 a1 내지 a449로 이루어진 군으로부터 선택된다.
[표 4]
본 발명의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 표적화될 수 있는 서열번호 1의 영역
일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 인접한 뉴클레오티드 서열은 표적 핵산의 영역에 상보적이고, 이때 표적 핵산 영역은 a7, a26, a43, a119, a142, a159, a160, a163, a169, a178, a179, a180, a189, a201, a202, a204, a214, a221, a224, a226, a243, a254, a258, 269, a274, a350, a360, a364, a365, a370, a372, a381, a383, a386, a389, a400, a427, a435 및 a438로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 인접한 뉴클레오티드 서열은 표적 핵산의 영역에 상보적이고, 이때 표적 핵산 영역은 a160, a180, a221, a269 및 a360으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 8 내지 35개의 뉴클레오티드 길이, 예컨대 9 내지 30개, 예컨대 10 내지 22개, 예컨대 11 내지 20개, 예컨대 12 내지 18개, 예컨대 13 내지 17개 또는 14 내지 16개 길이의 인접한 뉴클레오티드를 포함하거나 이들로 이루어진다. 바람직한 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 16 내지 20개 길이의 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어진다. 본원에 제공된 임의의 범위는 범위 종말점을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 올리고뉴클레오티드가 10 내지 30개의 뉴클레오티드를 포함하는 것으로 언급되면, 10개 및 30개의 뉴클레오티드가 둘 다 포함된다.
일부 양태에서, 인접한 뉴클레오티드 서열은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 길이의 인접한 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어진다. 바람직한 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 16, 17, 18, 19 또는 20개 길이의 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 인접한 뉴클레오티드 서열은 표 5에 열거된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접한 뉴클레오티드 서열은 서열번호 5 내지 743으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대한 90% 이상의 동일성, 바람직하게는 100% 동일성을 갖는 10 내지 30개 길이의 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어진다(표 5에 열거된 모티프 서열).
일부 양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접한 뉴클레오티드 서열은 서열번호 5 내지 743 및 771로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대한 90% 이상의 동일성, 바람직하게는 100% 동일성을 갖는 10 내지 30개 길이의 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접한 뉴클레오티드 서열은 서열번호 6, 8, 9, 13, 41, 42, 58, 77, 92, 111, 128, 151, 164, 166, 169, 171, 222, 233, 245, 246, 250, 251, 252, 256, 272, 273, 287, 292, 303, 314, 318, 320, 324, 336, 342, 343, 344, 345, 346, 349, 359, 360, 374, 408, 409, 415, 417, 424, 429, 430, 458, 464, 466, 474, 490, 493, 512, 519, 519, 529, 533, 534, 547, 566, 567, 578, 582, 601, 619, 620, 636, 637, 638, 640, 645, 650, 651, 652, 653, 658, 659, 660, 665, 678, 679, 680, 682, 683, 684, 687, 694, 706, 716, 728, 733, 734 및 735로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대한 90% 이상의 동일성, 바람직하게는 100% 동일성을 갖는 10 내지 30개 길이의 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접한 뉴클레오티드 서열은 서열번호 287에 대한 90% 이상의 동일성, 바람직하게는 100% 동일성을 갖는 10 내지 30개 길이의 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접한 뉴클레오티드 서열은 서열번호 342에 대한 90% 이상의 동일성, 바람직하게는 100% 동일성을 갖는 10 내지 30개 길이의 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접한 뉴클레오티드 서열은 서열번호 640에 대한 90% 이상의 동일성, 바람직하게는 100% 동일성을 갖는 10 내지 30개 길이의 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접한 뉴클레오티드 서열은 서열번호 466에 대한 90% 이상의 동일성, 바람직하게는 100% 동일성을 갖는 10 내지 30개 길이의 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 인접한 뉴클레오티드 서열은 서열번호 566에 대한 90% 이상의 동일성, 바람직하게는 100% 동일성을 갖는 10 내지 30개 길이의 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어진다.
올리고뉴클레오티드가 인접한 뉴클레오티드 서열(표적 핵산에 상보적임)보다 긴 양태에서, 표 5의 모티프 서열은 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 인접한 뉴클레오티드 서열 부분을 형성한다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드의 서열은 인접한 뉴클레오티드 서열과 동등하다(예컨대, 어떠한 생체절단성 연결기도 첨가되지 않은 경우).
인접한 핵염기 서열(모티프 서열)이 변형되어, 예를 들어 뉴클레아제 내성 및/또는 표적 핵산에 대한 친화도를 증가시킬 수 있음이 이해된다. 변형은 정의 및 "올리고뉴클레오티드 디자인" 섹션에 기술되어 있다. 표 5는 각각의 모티프 서열의 바람직한 디자인을 열거한다.
올리고뉴클레오티드 디자인
올리고뉴클레오티드 디자인은 올리고뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오시드 당 변형의 패턴을 지칭한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 당-변형된 뉴클레오시드를 포함하고, DNA 또는 RNA 뉴클레오시드를 또한 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 당-변형된 뉴클레오시드 및 DNA 뉴클레오시드를 포함한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드로의 변형된 뉴클레오시드의 혼입은 표적 핵산에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화도를 강화시킬 수 있다. 이러한 경우, 변형된 뉴클레오시드는 친화성 강화 변형된 뉴클레오티드로 언급될 수 있고, 변형된 뉴클레오시드는 또한 단위로 지칭될 수 있다.
한 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 1개 이상의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상 또는 16개 이상의 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 한 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 1 내지 10개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2 내지 8개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 3 내지 7개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 4 내지 6개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 3, 4, 5, 6 또는 7개의 변형된 뉴클레오시드를 포함한다.
한 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 당 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2' 당 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA, 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-DNA, 아라비노 핵산(ANA), 2'-플루오로-ANA 및 LNA 뉴클레오시드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 2' 당 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 더욱 더 바람직하게는, 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드는 잠금 핵산(LNA)이다.
추가 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드간 연결기를 포함한다. 바람직한 양태에서, 인접한 뉴클레오티드 서열 내의 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트 또는 보라노포스페이트 뉴클레오시드간 연결기이다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드의 인접한 서열 내의 모든 뉴클레오티드간 연결기는 포스포로티오에이트 연결기이다.
일부 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 LNA 뉴클레오시드, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 LNA 뉴클레오시드, 예컨대 2 내지 6개의 LNA 뉴클레오시드, 예컨대 3 내지 7개의 LNA 뉴클레오시드, 4 내지 6개의 LNA 뉴클레오시드, 또는 3, 4, 5, 6 또는 7개의 LNA 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드 내의 75% 이상의 변형된 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이고, 예컨대 80%, 예컨대 85%, 예컨대 90%의 변형된 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 또 다른 양태에서, 올리고뉴클레오티드 내의 모든 변형된 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 추가 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 베타-D-옥시-LNA, 및 하기 LNA 뉴클레오시드 중 하나 이상을 모두 포함할 수 있다: 티오-LNA, 아미노-LNA, 옥시-LNA, 및/또는 베타-D 또는 알파-L 배열 또는 이들의 조합인 ENA. 추가 양태에서, 모든 LNA 사이토신 단위는 5-메틸-사이토신이다. 바람직한 양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 인접한 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 서열의 5' 말단의 1개 이상의 LNA 뉴클레오시드 및 3' 말단의 2개 이상의 LNA 뉴클레오시드를 갖는다.
일부 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 2'-MOE-RNA 뉴클레오시드인 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 2'-MOE-RNA 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드는 2'-플루오로 DNA, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 2'-플루오로-DNA 뉴클레오시드이다.
일부 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 LNA 뉴클레오시드 및 하나 이상의 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드를 포함한다.
본 발명의 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 2' 당 변형된 뉴클레오시드 및 DNA 단위를 둘 다 포함한다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드는 LNA 및 DNA 뉴클레오시드(단위)를 둘 다 포함한다. 바람직하게는, LNA 및 DNA 단위의 합한 총계는 8 내지 30, 예컨대 10 내지 25, 바람직하게는 12 내지 22, 예컨대 12 내지 18, 더욱 더 바람직하게는 11 내지 16이다. 본 발명의 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열, 예컨대 인접한 뉴클레오티드 서열은 1 또는 2개 이상의 LNA 뉴클레오시드로 이루어지고, 나머지 뉴클레오시드는 DNA 단위이다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 단지 LNA 뉴클레오시드 및 천연 발생 뉴클레오시드(예컨대, RNA 또는 DNA, 가장 바람직하게는 DNA 뉴클레오시드)를, 임의적으로 변형된 뉴클레오시드간 연결기, 예컨대 포스포로티오에이트와 함께 포함한다.
본 발명의 한 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 RNase H를 모집할 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드의 구조 디자인은 갭머, 갭브레이커, 헤드머 및 테일머로부터 선택될 수 있다.
갭머 디자인
바람직한 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 본원에서 단지 "갭머"로도 지칭되는 갭머 디자인 또는 구조를 갖는다. 갭머 구조에서, 올리고뉴클레오티드는 3개 이상의 별개의 구조 영역 5'-플랭크, 갭 및 3'-플랭크, F-G-F'를 '5 -> 3' 방향으로 포함한다. 이러한 디자인에서, 플랭킹 영역 F 및 F'(또한 윙 영역으로 지칭됨)는 PD-L1 표적 핵산에 상보적인 변형된 뉴클레오시드의 인접한 스트레치를 포함하는 한편, 갭 영역(G)은 뉴클레아제, 바람직하게는 엔도뉴클레아제, 예컨대 RNase, 예를 들어 RNase H를 모집할 수 있는 뉴클레오티드의 인접한 스트레치를 포함하고, 이때 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산과 듀플렉스로 존재한다. 뉴클레아제, 특히 RNase H를 모집할 수 있는 뉴클레오시드는 DNA, 알파-1-옥시-LNA, 2'-플루오로-ANA 및 UNA로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 영역 G의 5' 및 3' 말단을 플랭킹하는 영역 F 및 F'는, 바람직하게는 비-뉴클레아제 모집 뉴클레오시드(3' 엔도 구조를 갖는 뉴클레오시드), 더욱 바람직하게는 하나 이상의 친화성 강화 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 양태에서, 3' 플랭크는 하나 이상의 LNA 뉴클레오시드, 바람직하게는 2개 이상의 LNA 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 양태에서, 5' 플랭크는 하나 이상의 LNA 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 양태에서, 5' 및 3' 플랭킹 영역 둘 다는 LNA 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 양태에서, 플랭킹 영역 내의 모든 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 다른 양태에서, 플랭킹 영역은 LNA 뉴클레오시드 및 다른 뉴클레오시드를 둘 다(예컨대, DNA 뉴클레오시드 및/또는 비-LNA 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2' 치환된 뉴클레오시드) 포함할 수 있다(혼합된 플랭크). 이러한 경우, 갭은 친화성 강화 변형된 뉴클레오시드, 바람직하게는 LNA, 예컨대 베타-D-옥시-LNA에 의해 5' 및 3' 말단에서 플랭킹된 5개 이상의 RNase H 모집 뉴클레오시드(2' 엔도 구조를 갖는 뉴클레오시드, 바람직하게는 DNA)의 인접한 서열로 정의된다. 결과적으로, 갭 영역의 인근에 존재하는 5' 플랭킹 영역 및 3' 플랭킹 영역의 뉴클레오시드는 변형된 뉴클레오시드, 바람직하게는 비-뉴클레아제 모집 뉴클레오시드이다.
영역 F
영역 G의 5' 말단에 부착된 영역 F(5' 플랭크 또는 5' 윙)는 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상의 변형된 뉴클레오시드를 포함하거나 함유하거나 이로 이루어진다. 한 양태에서, 영역 F는 1 내지 7개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2 내지 6개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2 내지 5개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2 내지 4개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 1 내지 3개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 1, 2, 3 또는 4개의 변형된 뉴클레오시드를 포함하거나 이로 이루어진다. F 영역은 영역의 5' 말단 및 3' 말단에 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드를 가짐으로써 정의된다.
일부 양태에서, 영역 F의 변형된 뉴클레오시드는 3' 엔도 구조를 갖는다.
한 양태에서, 영역 F의 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드는 2' 변형된 뉴클레오시드이다. 한 양태에서, 영역 F의 모든 뉴클레오시드는 2' 변형된 뉴클레오시드이다.
다른 양태에서, 영역 F는 2' 변형된 뉴클레오시드 이외에 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. DNA 및/또는 RNA를 포함하는 플랭크는 F 영역의 5' 말단 및 3' 말단(G 영역의 인근임)에 2' 변형된 뉴클레오시드를 갖는 것으로 특징지어진다. 한 양태에서, 영역 F는 DNA 뉴클레오시드, 예컨대 1 내지 3개의 인접한 DNA 뉴클레오시드, 예컨대 1 내지 3개 또는 1 또는 2개의 인접한 DNA 뉴클레오시드를 포함한다. 플랭크의 DNA 뉴클레오시드는 바람직하게는 RNase H를 모집할 수 없어야 한다. 일부 양태에서, F 영역의 2' 변형된 뉴클레오시드 및 DNA 및/또는 RNA 뉴클레오시드는 1 내지 3개의 2' 변형된 뉴클레오시드 및 1 내지 3개의 DNA 및/또는 RNA 뉴클레오시드와 교호한다. 이러한 플랭크는 또한 교호하는 플랭크로 지칭될 수 있다. 교호하는 플랭크를 갖는 올리고뉴클레오티드 내의 5' 플랭크(영역 F)의 길이는 4 내지 10개의 뉴클레오시드, 예컨대 4 내지 8개, 예컨대 4 내지 6개 뉴클레오시드, 예컨대 4, 5, 6 또는 7개의 변형된 뉴클레오시드일 수 있다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드의 5' 플랭크만이 교호한다. 교호하는 뉴클레오시드를 갖는 영역 F의 특정 예는 다음과 같다:
2'1-3-N'1-4-2'1-3
2'1-2-N'1-2-2'1-2-N'1-2-2'1-2
이때, 2'는 변형된 뉴클레오시드를 나타내고, N'는 RNA 또는 DNA이다. 일부 양태에서, 교호하는 플랭크 내의 모든 변형된 뉴클레오시드는 LNA이고, N'는 DNA이다. 추가 양태에서, 영역 F 내의 하나 이상의 2' 변형된 뉴클레오시드는 2'-O-알킬-RNA 단위, 2'-O-메틸-RNA, 2'-아미노-DNA 단위, 2'-플루오로-DNA 단위, 2'-알콕시-RNA, MOE 단위, LNA 단위, 아라비노 핵산(ANA) 단위 및 2'-플루오로-ANA 단위로부터 선택된다.
일부 양태에서, F 영역은 LNA 및 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드를 둘 다 포함한다. 이들은 종종 혼합된 윙 또는 혼합된 플랭크 올리고뉴클레오티드로 지칭된다.
본 발명의 한 양태에서, 영역 F 내의 모든 변형된 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 추가 양태에서, 영역 F 내의 모든 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 추가 양태에서, 영역 F 내의 LNA 뉴클레오시드는 독립적으로 옥시-LNA, 티오-LNA, 아미노-LNA, cET 및/또는 ENA(베타-D 또는 알파-L 배열 또는 이들의 조합임)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 양태에서, 영역 F는 인접한 서열의 5' 말단에서 1개 이상의 베타-D-옥시 LNA 단위를 포함한다.
영역 G
영역 G(갭 영역)는 바람직하게는 상기 뉴클레아제, 특히 RNase H를 모집할 수 있는 4개 이상, 예컨대 5개 이상, 예컨대 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상 또는 16개 이상의 연속적인 뉴클레오시드를 포함하거나 모집하거나 이로 이루어진다. 추가 양태에서, 영역 G는 상기 뉴클레아제를 모집할 수 있는 5 내지 12개, 또는 6 내지 10개 또는 7 내지 9개, 예컨대 8개의 연속적인 뉴클레오티드 단위를 포함하거나 모집하거나 이로 이루어진다.
뉴클레아제를 모집할 수 있는 영역 G의 뉴클레오시드 단위는 한 양태에서 DNA, 알파-1-LNA, C4' 알킬화된 DNA(국제 특허출원 제PCT/EP2009/050349호 및 문헌[Vester et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296 - 2300], 둘 다 참고로서 본원에 혼입됨), 아라비노스 유래 뉴클레오시드, 예컨대 ANA 및 2'F-ANA(문헌[Mangos et al. 2003 J. AM. CHEM. SOC. 125, 654-661]), UNA(비잠금 핵산)(문헌[Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039]에 기술됨, 참고로서 본원에 혼입됨)로 이루어진 군으로부터 선택된다. UNA는, 전형적으로 리보스의 C2와 C3 사이의 결합이 제거되어 비잠금 "당" 잔사를 형성하는 비잠금 핵산이다.
또 다른 양태에서, 영역 G 내의 하나 이상의 뉴클레오시드 단위는 DNA 뉴클레오시드 단위, 예컨대 1 내지 18개의 DNA 단위, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17개의 DNA 단위, 바람직하게는 2 내지 17개의 DNA 단위, 예컨대 3 내지 16개의 DNA 단위, 예컨대 4 내지 15개의 DNA 단위, 예컨대 5 내지 14개의 DNA 단위, 예컨대 6 내지 13개의 DNA 단위, 예컨대 7 내지 12개의 DNA 단위, 예컨대 8 내지 11개의 DNA 단위, 더욱 바람직하게는 8 내지 17개의 DNA 단위, 또는 9 내지 16개의 DNA 단위, 10 내지 15개의 DNA 단위 또는 11 내지 13개의 DNA 단위, 예컨대 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17개의 DNA 단위이다. 일부 양태에서, 영역 G는 100% DNA 단위로 이루어진다.
추가 양태에서, 영역 G는 DNA, 및 RNase H 절단을 매개할 수 있는 다른 뉴클레오시드의 혼합물로 이루어질 수 있다. 영역 G는 50% 이상의 DNA, 더욱 바람직하게는 60%, 70% 또는 80%의 DNA, 더욱 더 바람직하게는 90% 또는 95%의 DNA로 이루어질 수 있다.
또 다른 양태에서, 영역 G 내의 하나 이상의 뉴클레오시드 단위는 알파-1-LNA 뉴클레오시드 단위, 예컨대 하나 이상의 알파-1-LNA, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 알파-1-LNA이다. 추가 양태에서, 영역 G는 하나 이상의 알파-1-LNA 또는 알파-1-옥시-LNA를 포함한다. 추가 양태에서, 영역 G는 DNA 및 알파-1-LNA 뉴클레오시드 단위의 조합을 포함한다.
일부 양태에서, 영역 G 내의 뉴클레오시드는 2' 엔도 구조를 갖는다.
일부 양태에서, 영역 G는 갭브레이커 뉴클레오시드를 포함하여, RNase H를 모집할 수 있는 갭브레이커 올리고뉴클레오티드를 야기할 수 있다.
영역 F'
영역 G의 3' 말단에 부착된 영역 F'(3' 플랭크 또는 3' 윙)는 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상의 변형된 뉴클레오시드를 포함하거나 함유하거나 이로 이루어진다. 한 양태에서, 영역 F'는 1 내지 7개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2 내지 6개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2 내지 4개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 1 내지 3개의 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 1, 2, 3 또는 4개의 변형된 뉴클레오시드를 포함하거나 이로 이루어진다. F' 영역은 영역의 5' 말단 및 3' 말단에 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드를 갖는 것에 의해 정의된다.
일부 양태에서, 영역 F' 내의 변형된 뉴클레오시드는 3' 엔도 구조를 갖는다.
한 양태에서, 영역 F' 내의 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드는 2' 변형된 뉴클레오시드이다. 한 양태에서, 영역 F' 내의 모든 뉴클레오시드는 2' 변형된 뉴클레오시드이다.
한 양태에서, 영역 F' 내의 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드는 2' 변형된 뉴클레오시드이다.
한 양태에서, 영역 F' 내의 모든 뉴클레오시드는 2' 변형된 뉴클레오시드이다. 다른 양태에서, 영역 F'는 2' 변형된 뉴클레오시드 이외에 DNA 또는 RNA를 포함한다. DNA 또는 RNA를 포함하는 플랭크는 F' 영역의 5' 말단(G 영역의 인근) 및 3' 말단 내의 2' 변형된 뉴클레오시드를 갖는 것에 의해 특징지어질 수 있다. 한 양태에서, 영역 F'는 DNA 뉴클레오시드, 예컨대 1 내지 4개의 인접한 DNA 뉴클레오시드, 예컨대 1 내지 3개 또는 1 또는 2개의 인접한 DNA 뉴클레오시드를 포함한다. 플랭크 내의 DNA 뉴클레오시드는 바람직하게는 RNase H를 모집할 수 없어야 한다. 일부 양태에서, F' 영역 내의 2' 변형된 뉴클레오시드 및 DNA 및/또는 RNA 뉴클레오시드는 1 내지 3개의 2' 변형된 뉴클레오시드 및 1 내지 3개의 DNA 및/또는 RNA 뉴클레오시드와 교호하고, 이러한 플랭크는 또한 교호하는 플랭크로 지칭될 수 있다. 교호하는 플랭크를 갖는 올리고뉴클레오티드 내의 3' 플랭크(영역 F')의 길이는 4 내지 10개의 뉴클레오시드, 예컨대 4 내지 8개, 예컨대 4 내지 6개 뉴클레오시드, 예컨대 4, 5, 6 또는 7개의 변형된 뉴클레오시드일 수 있다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드의 3' 플랭크만이 교호한다. 교호하는 뉴클레오시드를 갖는 영역 F'의 특정 예는 다음과 같다:
2'1-2-N'1-4-2'1-4
2'1-2-N'1-2-2'1-2-N'1-2-2'1-2
이때, 2'는 변형된 뉴클레오시드를 나타내고, N'는 RNA 또는 DNA이다. 일부 양태에서, 교호하는 플랭크 내의 모든 변형된 뉴클레오시드는 LNA이고, N'는 DNA이다. 추가 양태에서, 영역 F' 내의 변형된 뉴클레오시드는 2'-O-알킬-RNA 단위, 2'-O-메틸-RNA, 2'-아미노-DNA 단위, 2'-플루오로-DNA 단위, 2'-알콕시-RNA, MOE 단위, LNA 단위, 아라비노 핵산(ANA) 단위 및 2'-플루오로-ANA 단위로부터 선택된다.
일부 양태에서, F' 영역은 LNA 및 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드를 둘 다 포함한다. 이들은 종종 혼합된 윙 또는 혼합된 플랭크 올리고뉴클레오티드로 지칭된다.
본 발명의 한 양태에서, 영역 F' 내의 모든 변형된 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 추가 양태에서, 영역 F' 내의 모든 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 추가 양태에서, 영역 F' 내의 LNA 뉴클레오시드는 독립적으로 옥시-LNA, 티오-LNA, 아미노-LNA, cET 및/또는 ENA(베타-D 또는 알파-L 배열 또는 이들의 조합)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 양태에서, 영역 F'는 인접한 서열의 3' 말단에서 2개 이상의 베타-D-옥시 LNA 단위를 갖는다.
영역 D' 및 D"
영역 D' 및 D"는 각각 영역 F의 5' 말단 또는 영역 F'의 3' 말단에 부착될 수 있다. 영역 D' 또는 D"는 임의적이다.
영역 D' 또는 D"는 독립적으로 표적 핵산에 상보적이거나 비-상보적일 수 있는 0 내지 5개, 예컨대 1 내지 5개, 예컨대 2 내지 4개, 예컨대 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 추가적인 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 관점에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 일부 양태에서 추가적인 뉴클레오티드에 의해 5' 및/또는 3' 말단에서 플랭킹된 표적을 조절할 수 있는 인접한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 이러한 추가적인 뉴클레오티드는 생체절단성 연결기에 민감한 뉴클레아제로서 역할을 할 수 있다(연결기의 정의 참고). 일부 양태에서, 추가적인 5' 및/또는 3' 말단 뉴클레오시드는 포스포다이에스터 연결기와 연결되고, DNA 또는 RNA일 수 있다. 다른 양태에서, 추가적인 5' 및/또는 3' 말단 뉴클레오시드는, 예를 들어 뉴클레아제 안정성을 강화시키기 위해 또는 합성의 용이함을 위해 포함될 수 있는 변형된 뉴클레오시드이다. 한 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 인접한 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단에서 영역 D' 및/또는 D"를 포함한다. 추가 양태에서, D' 및/또는 D" 영역은 표적 핵산에 상보적이지 않은 1 내지 5개의 포스포다이에스터 연결된 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드로 구성된다.
본 발명의 갭머 올리고뉴클레오티드는 하기 구조식으로 표시될 수 있다:
5'-F-G-F'-3', 특히 F1-7-G4-12-F'1-7
5'-D'-F-G-F'-3', 특히 D'1-3-F1-7-G4-12-F'1-7
5'-F-G-F'-D"-3', 특히 F1-7-G4-12-F'1-7-D"1-3
5'-D'-F-G-F'-D'-3", 특히 D'1-3-F1-7-G4-12-F'1-7-D"1-3
영역 F, G 및 F', D' 및 D" 내의 바람직한 수 및 유형은 상기 기술되어 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드 접합체는 올리고뉴클레오티드, 특히 상기 제시된 갭머 올리고뉴클레오티드의 5' 또는 3' 말단에 공유 결합으로 부착된 영역 C를 갖는다.
한 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 접합체는 구조식 5'-D'-F-G-F'-3' 또는 5'-F-G-F'-D"-3'(이때, 영역 F 및 F'는 독립적으로 1 내지 7개의 변형된 뉴클레오시드를 포함하고, G는 RNase H를 모집할 수 있는 6 내지 16개의 뉴클레오시드의 영역이고, 영역 D' 또는 D"는 1 내지 5개의 포스포다이에스터 연결된 뉴클레오시드를 포함함)의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게는, 영역 D' 또는 D"는 접합체 모이어티로의 접합이 고려되는 올리고뉴클레오티드의 말단에 존재한다.
교호하는 플랭크를 갖는 올리고뉴클레오티드의 예는 하기 구조식에 의해 표시될 수 있다:
2'1-3-N'1-4-2'1-3-G6-12-2'1-2-N'1-4-2'1-4
2'1-2-N'1-2-2'1-2-N'1-2-2'1-2-G6-12-2'1-2-N'1-2-2'1-2-N'1-2-2'1-2
F-G6-12-2'1-2-N'1-4-2'1-4
F-G6-12-2'1-2-N'1-2-2'1-2-N'1-2-2'1-2
2'1-3-N'1-4-2'1-3-G6-12-F'
2'1-2-N'1-2-2'1-2-N1-2-2'1-2-G6-12-F'
이때, 플랭크는 F 또는 F'에 의해 표시되고, 단지 2' 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 LNA 뉴클레오시드를 함유한다. 교호하는 영역, 및 영역 F, G 및 F', D' 및 D" 내의 뉴클레오시드의 바람직한 수 및 유형은 상기 기술되어 있다.
일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22개 길이의 뉴클레오티드로 이루어진 갭머이고, 이때 각각의 영역 F 및 F'는 독립적으로 PD-L1 표적 핵산에 상보적인 1, 2, 3 또는 4개의 변형된 뉴클레오시드 단위로 이루어지고, 영역 G는 PD-L1 표적 핵산과의 듀플렉스일 때 뉴클레아제를 모집할 수 있는 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17개의 뉴클레오시드 단위로 이루어지고, 영역 D'는 2개의 포스포다이에스터 연결된 DNA로 이루어진다.
추가 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 각각의 영역 F 및 F'가 독립적으로 3, 4, 5 또는 6개의 변형된 뉴클레오시드 단위, 예컨대 2'-O-메톡시에틸-리보스 당을 함유하는 뉴클레오시드 단위(2'-MOE) 또는 2'-플루오로-데옥시리보스 당 및/또는 LNA 단위를 함유하는 뉴클레오시드 단위로 이루어지고, 영역 G가 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17개의 뉴클레오시드 단위, 예컨대 DNA 단위 또는 다른 뉴클레아제 모집 뉴클레오시드, 예컨대 알파-1-LNA 또는 DNA 및 뉴클레아제 모집 뉴클레오시드의 혼합물로 이루어진 갭머이다.
추가의 특이적 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 각각의 영역 F 및 F' 영역이 각각 2개의 LNA 단위로 이루어지고, 영역 G가 12, 13, 14개의 뉴클레오시드 단위, 바람직하게는 DNA 단위로 이루어진 갭머이다. 이러한 성질의 특이적 갭머 디자인은 2-12-2, 2-13-2 및 2-14-2를 포함한다.
추가의 특이적 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 각각의 영역 F 및 F'가 독립적으로 3개의 LNA 단위로 이루어지고, 영역 G가 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개의 뉴클레오시드 단위, 바람직하게는 DNA 단위로 이루어진 갭머이다. 이러한 성질의 특이적 갭머 디자인은 3-8-3, 3-9-3, 3-10-3, 3-11-3, 3-12-3, 3-13-3 및 3-14-3을 포함한다.
추가의 특이적 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 각각의 영역 F 및 F'가 각각 4개의 LNA 단위로 이루어지고, 영역 G가 8, 9, 10, 11 또는 12개의 뉴클레오시드 단위, 바람직하게는 DNA 단위로 이루어진 갭머이다. 이러한 성질의 특이적 갭머 디자인은 4-8-4, 4-9-4, 4-10-4, 4-11-4 및 4-12-4를 포함한다.
이러한 성질의 특이적 갭머 디자인은 윙 내에서 6개의 뉴클레오시드 및 독립적으로 1 내지 4개의 변형된 뉴클레오시드를 갖는 갭으로 이루어진 군으로부터 선택되는 F-G-F' 디자인, 예컨대 1-6-1, 1-6-2, 2-6-1, 1-6-3, 3-6-1, 1-6-4, 4-6-1, 2-6-2, 2-6-3, 3-6-2, 2-6-4, 4-6-2, 3-6-3, 3-6-4 및 4-6-3 갭머를 포함한다.
이러한 성질의 특이적 갭머 디자인은 윙 내에서 7개의 뉴클레오시드 및 독립적으로 1 내지 4개의 변형된 뉴클레오시드를 갖는 갭으로 이루어진 군으로부터 선택되는 F-G-F' 디자인, 예컨대 1-7-1, 2-7-1, 1-7-2, 1-7-3, 3-7-1, 1-7-4, 4-7-1, 2-7-2, 2-7-3, 3-7-2, 2-7-4, 4-7-2, 3-7-3, 3-7-4, 4-7-3 및 4-7-4 갭머를 포함한다.
이러한 성질의 특이적 갭머 디자인은 윙 내에서 8개의 뉴클레오시드 및 독립적으로 1 내지 4개의 변형된 뉴클레오시드를 갖는 갭으로 이루어진 군으로부터 선택되는 F-G-F' 디자인, 예컨대 1-8-1, 1-8-2, 1-8-3, 3-8-1, 1-8-4, 4-8-1, 2-8-1, 2-8-2, 2-8-3, 3-8-2, 2-8-4, 4-8-2, 3-8-3, 3-8-4, 4-8-3 및 4-8-4 갭머를 포함한다.
이러한 성질의 특이적 갭머 디자인은 윙 내에서 9개의 뉴클레오시드 및 독립적으로 1 내지 4개의 변형된 뉴클레오시드를 갖는 갭으로 이루어진 군으로부터 선택되는 F-G-F' 디자인, 예컨대 1-9-1, 2-9-1, 1-9-2, 1-9-3, 3-9-1, 1-9-4, 4-9-1, 2-9-2, 2-9-3, 3-9-2, 2-9-4, 4-9-2, 3-9-3, 3-9-4, 4-9-3 및 4-9-4 갭머를 포함한다.
이러한 성질의 특이적 갭머 디자인은 10개의 뉴클레오시드를 갖는 갭으로 이루어진 군으로부터 선택되는 F-G-F' 디자인, 예컨대 1-10-1, 2-10-1, 1-10-2, 1-10-3, 3-10-1, 1-10-4, 4-10-1, 2-10-2, 2-10-3, 3-10-2, 2-10-4, 4-10-2, 3-10-3, 3-10-4, 4-10-3 및 4-10-4 갭머를 포함한다.
이러한 성질의 특이적 갭머 디자인은 11개의 뉴클레오시드를 갖는 갭으로 이루어진 군으로부터 선택되는 F-G-F' 디자인, 예컨대 1-11-1, 2-11-1, 1-11-2, 1-11-3, 3-11-1, 1-11-4, 4-11-1, 2-11-2, 2-11-3, 3-11-2, 2-11-4, 4-11-2, 3-11-3, 3-11-4, 4-11-3 및 4-11-4 갭머를 포함한다.
이러한 성질의 특이적 갭머 디자인은 12개의 뉴클레오시드를 갖는 갭으로 이루어진 군으로부터 선택되는 F-G-F' 디자인, 예컨대 1-12-1, 2-12-1, 1-12-2, 1-12-3, 3-12-1, 1-12-4, 4-12-1, 2-12-2, 2-12-3, 3-12-2, 2-12-4, 4-12-2, 3-12-3, 3-12-4, 4-12-3 및 4-12-4 갭머를 포함한다.
이러한 성질의 특이적 갭머 디자인은 13개의 뉴클레오시드를 갖는 갭으로 이루어진 군으로부터 선택되는 F-G-F' 디자인, 예컨대 1-13-1, 2-13-1, 1-13-2, 1-13-3, 3-13-1, 1-13-4, 4-13-1, 2-13-2, 2-13-3, 3-13-2, 2-13-4, 4-13-2, 3-13-3, 3-13-4, 4-13-3 및 4-13-4 갭머를 포함한다.
이러한 성질의 특이적 갭머 디자인은 14개의 뉴클레오시드로 이루어진 군으로부터 선택되는 F-G-F' 디자인, 예컨대 1-14-1, 2-14-1, 1-14-2, 1-14-3, 3-14-1, 1-14-4, 4-14-1, 2-14-2, 2-14-3, 3-14-2, 2-14-4, 4-14-2, 3-14-3, 3-14-4, 4-14-3 및 4-14-4 갭머를 포함한다.
이러한 성질의 특이적 갭머 디자인은 15개의 뉴클레오시드를 갖는 갭으로 이루어진 군으로부터 선택되는 F-G-F' 디자인, 예컨대 1-15-1, 2-15-1, 1-15-2, 1-15-3, 3-15-1, 1-15-4, 4-15-1, 2-15-2, 2-15-3, 3-15-2, 2-15-4, 4-15-2 및 3-15-3 갭머를 포함한다.
이러한 성질의 특이적 갭머 디자인은 16개의 뉴클레오시드를 갖는 갭으로 이루어진 군으로부터 선택되는 F-G-F' 디자인, 예컨대 1-16-1, 2-16-1, 1-16-2, 1-16-3, 3-16-1, 1-16-4, 4-16-1, 2-16-2, 2-16-3, 3-16-2, 2-16-4, 4-16-2 및 3-16-3 갭머를 포함한다.
이러한 성질의 특이적 갭머 디자인은 17개의 뉴클레오시드를 갖는 갭으로 이루어진 군으로부터 선택되는 F-G-F' 디자인, 예컨대 1-17-1, 2-17-1, 1-17-2, 1-17-3, 3-17-1, 1-17-4, 4-17-1, 2-17-2, 2-17-3 및 3-17-2 갭머를 포함한다.
모든 경우에, F-G-F' 디자인은 1, 2 또는 3개의 뉴클레오시드 단위, 예컨대 DNA 단위, 예컨대 2 포스포다이에스터 연결된 DNA 단위를 가질 수 있는 영역 D' 및/또는 D"를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 영역 F 및 F' 내의 뉴클레오시드는 변형된 뉴클레오시드인 반면, 영역 G 내의 뉴클레오티드는 바람직하게는 비변형된 뉴클레오시드이다.
각각의 디자인에서, 바람직한 변형된 뉴클레오시드는 LNA이다.
다른 양태에서, 갭머 내의 갭 내의 모든 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트 및/또는 보라노포스페이트 연결기이다. 다른 양태에서, 갭머 내의 플랭크(F 및 F' 영역) 내의 모든 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트 및/또는 보라노포스페이트 연결기이다. 다른 바람직한 양태에서, 갭머 내의 D' 및 D" 영역 내의 모든 뉴클레오시드간 연결기는 포스포다이에스터 연결기이다.
본원에 개시된 특정 갭머의 경우, 사이토신(C) 잔사가 5-메틸-사이토신으로 주석이 달릴 때, 다양한 양태에서, 올리고뉴클레오티드에 존재하는 하나 이상의 Cs는 비변형된 C 잔사일 수 있다.
특정 양태에서, 갭머는 소위 국제 공개공보 제2008/113832호(참고로서 본원에 혼입됨)에 기술된 소위 쇼트머(shortmer)이다.
추가 갭머 디자인은 국제 공개공보 제2004/046160호, 국제 공개공보 제2007/146511호에 개시되어 있고 참고로서 혼입된다.
본 발명의 특정 양태의 경우, 올리고뉴클레오티드는 화합물 번호 5_1 내지 743_1 및 771_1을 갖는 올리고뉴클레오티드 화합물의 군으로부터 선택된다.
본 발명의 특정 양태의 경우, 올리고뉴클레오티드는 화합물 번호 6_1, 8_1, 9_1, 13_1, 41_1, 42_1, 58_1, 77_1, 92_1, 111_1, 128_1, 151_1, 164_1, 166_1, 169_1, 171_1, 222_1, 233_1, 245_1, 246_1, 250_1, 251_1, 252_1, 256_1, 272_1, 273_1, 287_1, 292_1, 303_1, 314_1, 318_1, 320_1, 324_1, 336_1, 342_1, 343_1, 344_1, 345_1, 346_1, 349_1, 359_1, 360_1, 374_1, 408_1, 409_1, 415_1, 417_1, 424_1, 429_1, 430_1, 458_1, 464_1, 466_1, 474_1, 490_1, 493_1, 512_1, 519_1, 519_1, 529_1, 533_1, 534_1, 547_1, 566_1, 567_1, 578_1, 582_1, 601_1, 619_1, 620_1, 636_1, 637_1, 638_1, 640_1, 645_1, 650_1, 651_1, 652_1, 653_1, 658_1, 659_1, 660_1, 665_1, 678_1, 679_1, 680_1, 682_1, 683_1, 684_1, 687_1, 694_1, 706_1, 716_1, 728_1, 733_1, 734_1 및 735_1을 갖는 올리고뉴클레오티드 화합물의 군으로부터 선택된다.
본 발명의 한 바람직한 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 화합물 번호 287_1이다.
본 발명의 다른 바람직한 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 화합물 번호 342_1이다.
본 발명의 다른 바람직한 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 화합물 번호 640_1이다.
본 발명의 다른 바람직한 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 화합물 번호 466_1이다.
본 발명의 다른 바람직한 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 화합물 번호 566_1이다.
본 발명의 추가 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 모티프 및 올리고뉴클레오티드 화합물의 인접한 뉴클레오티드 서열은 인접한 뉴클레오티드 서열(예컨대, 영역 D')의 5' 말단에 2 내지 4개의 추가적인 포스포다이에스터 연결된 뉴클레오시드를 포함한다. 한 양태에서, 뉴클레오시드는 생체절단성 연결기로서 역할을 한다(생체절단성 연결기에 대한 섹션 참고). 바람직한 양태에서, ca(시티딘-아데노신) 다이뉴클레오티드는 포스포다이에스터 연결기를 통해 인접한 뉴클레오티드 서열(즉, 표 5에 열거된 어느 한 모티프 서열 또는 올리고뉴클레오티드 화합물)의 5' 말단에 연결된다. 바람직한 양태에서, ca 다이뉴클레오티드는 인접한 뉴클레오티드의 나머지가 상보적인 위치에서 표적 서열에 상보적이지 않다.
본 발명의 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 인접한 뉴클레오티드 서열은 서열번호 766, 767, 768, 769 및 770을 갖는 뉴클레오티드 모티프 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 화합물 번호 766_1, 767_1, 768_1, 769_1 및 770_1을 갖는 올리고뉴클레오티드 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
탄수화물 접합체 모이어티
탄수화물 접합체 모이어티는 비제한적으로 갈락토스, 락토스, n-아세틸갈락토사민, 만노스 및 만노스-6-포스페이트를 포함한다. 탄수화물 접합체는 조직, 예컨대 간 및/또는 근육의 범위 내의 전달 또는 활성을 강화시키는데 사용될 수 있다(예를 들어, 유럽 특허공보 제1495769호, 국제 공개공보 제99/65925호, 문헌[Yang et al., Bioconjug Chem (2009) 20(2): 213-21] 및 문헌[Zatsepin & Oretskaya Chem Biodivers. (2004) 1(10): 1401-17] 참고).
일부 양태에서, 탄수화물 접합체 모이어티는 다가이고, 예컨대, 예를 들어 2, 3 또는 4개의 동일한 또는 비-동일한 탄수화물 모이어티는, 임의적으로 연결기를 통해 올리고뉴클레오티드에 공유 결합으로 결합될 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명은 본 발명의 올리고뉴클레오티드 및 탄수화물 접합체 모이어티를 포함하는 접합체를 제공한다.
일부 양태에서, 접합체 모이어티는 만노스 또는 만노스-6-포스페이트이거나 이를 포함할 수 있다. 이는 표적화 근육 세포를 표적화하는데 특히 유용하다(예를 들어, 미국 출원공개공보 제2012/122801호 참고).
아시알로당단백질 수용체(ASGPr)에 결합할 수 있는 접합체 모이어티는 간 내의 간세포를 표적화하는데 특히 유용하다. 일부 양태에서, 본 발명은 본 발명의 올리고뉴클레오티드 및 아시알로당단백질 수용체 표적화 접합체 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다. 아시알로당단백질 수용체 표적화 접합체 모이어티는 갈락토스의 친화도 이상의 친화도를 갖고 아시알로당단백질 수용체에 결합할 수 있는 하나 이상의 탄수화물 모이어티(ASPGr 결합 탄수화물 모이어티)를 포함한다. 아시알로당단백질 수용체에 대한 수많은 갈락토스 유도체의 친화도는 연구되어 있거나(예를 들어, 문헌[Jobst, S.T. and Drickamer, K. JB.C. 1996, 271, 6686] 참고), 당해 분야에 전형적인 방법을 사용하여 즉시 측정된다.
본 발명의 한 양상은 PD-L1 표적 핵산에 대해 90% 이상의 상보성을 갖고 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이의 인접한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드(영역 A); 및 b) a)의 올리고뉴클레오티드에 공유 결합으로 부착된 하나 이상의 아시알로당단백질 수용체 표적화 접합체 모이어티(영역 C)를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체이다. 올리고뉴클레오티드 또는 인접한 뉴클레오티드 서열은 섹션 "본 발명의 올리고뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드 디자인" 및 "갭머 디자인" 중 어느 하나에 기술될 수 있다.
일부 양태에서, 아시알로당단백질 수용체 표적화 접합체 모이어티는 갈락토스, 갈락토사민, N-폼일-갈락토사민, N-아세틸갈락토사민, N-프로피오닐-갈락토사민, N-n-부타노일-갈락토사민 및 N-이소부타노일갈락토사민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 ASPGr 결합 탄수화물 모이어티를 포함한다. 일부 양태에서, 아시알로당단백질 수용체 표적화 접합체 모이어티는 1-가, 2-가, 3-가 또는 4-가이다(즉, 아시알로당단백질 수용체에 결합할 수 있는 1, 2, 3 또는 4개의 말단 탄수화물 모이어티를 함유한다). 바람직하게는, 아시알로당단백질 수용체 표적화 접합체 모이어티는 2-가이고, 더욱 더 바람직하게는 3-가이다. 바람직한 양태에서, 아시알로당단백질 수용체 표적화 접합체 모이어티는 1 내지 3개의 N-아세틸갈락토사민(GalNAc) 모이어티(또한 GalNAc 접합체로 지칭됨)를 포함한다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드 접합체는 3-가 N-아세틸갈락토사민(GalNAc) 모이어티인 아시알로당단백질 수용체 표적화 접합체 모이어티를 포함한다. GalNAc 접합체는 포스포다이에스터, 메틸포스폰에이트 및 PNA 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 미국 특허공보 제5,994,517호 및 문헌[Hangeland et al., Bioconjug Chem. 1995 Nov-Dec;6(6):695-701], 문헌[Biessen et al 1999 Biochem J. 340, 783-792] 및 문헌[Maier et al 2003 Bioconjug Chem 14, 18-29]) 및 siRNAs(예컨대, 국제 공개공보 제2009/126933호, 국제 공개공보 제2012/089352호 및 국제 공개공보 제2012/083046호) 및 LNA 및 2'-MOE 변형된 뉴클레오시드(국제 공개공보 제2014/076196호, 국제 공개공보 제2014/207232호 및 국제 공개공보 제2014/179620호, 본원에 참고에 의해 혼입됨)와 함께 사용되었다.
아시알로당단백질 수용체 표적화 접합체 모이어티를 생산하기 위하여, ASPGr 결합 탄수화물 모이어티(바람직하게는 GalNAc)는 당류의 C-l 탄소를 통해 분지 분자에 부착된다. ASPGr 결합 탄수화물 모이어티는 바람직하게는 스페이서를 통해 분지 분자에 연결된다. 바람직한 스페이서는 가요성 친수성 스페이서이다(미국 특허공보 제5,885,968호; 문헌[Biessen et al. J. Med. Chern. 1995 Vol. 39 p. 1538-1546]). 바람직한 가요성 친수성 스페이서는 PEG 스페이서이다. 바람직한 PEG 스페이서는 PEG3 스페이서(3개의 에틸렌 단위)이다. 분지 분자는 2 또는 3개의 말단 ASPGr 결합 탄수화물 모이어티의 부착을 가능하게 하고 또한 올리고뉴클레오티드로의 분지점의 부착을 가능하게 하는 임의의 작은 분자일 수 있다. 예시적인 분지 분자는 다이-리신이다. 다이-리신 분자는 3개의 ASPGr 결합 탄수화물 모이어티를 부착할 수 있는 3개의 아민 기 및 다이-리신을 올리고뉴클레오티드에 부착할 수 있는 카복실 반응기를 함유한다. 대안적인 분지 분자는 글렌 리서치(Glen Research)에 의해 공급되는 더블러(doubler) 또는 트레블러(trebler)일 수 있다. 일부 양태에서, 분지는 1,3-비스-[5-(4,4'-다이메톡시트라이틸옥시)펜틸아미도]프로필-2-[(2-시아노에틸)-(N,N-다이이소프로필)] 포스포라미다이트(글렌 리서치 카탈로그 번호 10-1920-xx), 트리스-2,2,2-[3-(4,4'-다이메톡시트라이틸옥시)프로필옥시메틸]에틸-[(2-시아노에틸)-(N,N-다이이소프로필)]-포스포라미다이트(글렌 리서치 카탈로그 번호 10-1922-xx), 트리스-2,2,2-[3-(4,4'-다이메톡시트라이틸옥시)프로필옥시메틸]메틸렌옥시프로필-[(2-시아노에틸)-(N,N-다이이소프로필)]-포스포라미다이트 및 1-[5-(4,4'-다이메톡시-트라이틸옥시)펜틸아미도]-3-[5-플루오레노메톡시-카보닐-옥시-펜틸아미도]-프로필-2-[(2-시아노에틸)-(N,N-다이이소프로필)]-포스포라미다이트(글렌 리서치 카탈로그 번호 10-1925-xx)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 국제 공개공보 제2014/179620호 및 국제 출원번호 제PCT/EP2015/073331호는 다양한 GalNAc 접합체 모이어티의 생산을 기술한다(본원에 참고에 의해 혼입됨). 하나 이상의 연결기는 분지 분자와 올리고뉴클레오티드 사이에 삽입될 수 있다. 바람직한 양태에서, 연결기는 생체절단성 연결기이다. 연결기는 섹션 "연결기" 및 이의 하위섹션에 기술된 연결기로부터 선택될 수 있다.
아시알로당단백질 수용체 표적화 접합체 모이어티, 특히 GalNAc 접합체 모이어티는 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 올리고뉴클레오티드의 3'- 또는 5'-말단에 부착될 수 있다. 바람직한 양태에서, 아시알로당단백질 수용체 표적화 접합체 모이어티는 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 연결된다.
siRNA 전달에 관한 약동학 조절자는 국제 공개공보 제2012/083046호에 기술되어 있다(본원에 참고에 의해 혼입됨). 일부 양태에서, 탄수화물 접합체 모이어티는 16개의 이상의 탄소 원자를 갖는 소수성 기, 16 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 소수성 기, 팔미토일, 헥사데크-8-에노일, 올레일, (9E,12E)-옥타데카-9,12-다이에노일, 다이옥타노일 및 C16-C20 아실 및 콜레스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 약동학 조절자를 포함한다. 바람직한 양태에서, 탄수화물 접합체 모이어티를 함유하는 약동학 조절자는 GalNAc 접합체이다.
바람직한 탄수화물 접합체 모이어티는 1 내지 3개의 말단 ASPGr 결합 탄수화물 모이어티, 바람직하게는 N-아세틸갈락토사민 모이어티를 포함한다. 일부 양태에서, 탄수화물 접합체 모이어티는 스페이서를 통해 분지 분자에 연결된 3개의 ASPGr 결합 탄수화물 모이어티, 바람직하게는 N-아세틸갈락토사민 모이어티를 포함한다. 스페이서 분자는 8 내지 30개 원자의 길이일 수 있다. 바람직한 탄수화물 접합체 모이어티는 PEG 스페이서를 통해 다이-리신 분지 분자에 연결된 3개의 말단 GalNAc 모이어티를 포함한다. 바람직하게는, PEG 스페이서는 3PEG 스페이서이다. 적합한 아시알로당단백질 수용체 표적화 접합체 모이어티는 도 1에 제시된다. 바람직한 아시알로당단백질 수용체 표적화 접합체 모이어티는 도 3에 제시된다.
다른 GalNAc 접합체 모이어티는, 예를 들어, 부착된 GalNAc 모이어티를 갖는 작은 펩티드, 예컨대 Tyr-Glu-Glu-(아미노헥실 GalNAc)3(YEE(ahGalNAc)3; 간세포 상의 아시알로당단백질 수용체에 결합하는 글리코트라이펩티드, 예컨대, 문헌[Duff, et al., Methods Enzymol, 2000, 313, 297] 참고); 리신-기반 갈락토스 클러스터(예컨대, L3G4; 문헌[Biessen, et al., Cardovasc. Med., 1999, 214]); 및 콜란-기반 갈락토스 클러스터(예컨대, 아시알로당단백질 수용체에 대한 탄수화물 인식 모티프)를 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체는 화합물 번호 766_2, 767_2, 768_2, 769_2 및 770_2로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체는 도 4에 제시된 화합물에 상응하다.
다른 바람직한 양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체는 도 5에 제시된 화합물에 상응하다.
다른 바람직한 양태에서 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체는 도 6에 제시된 화합물에 상응하다.
다른 바람직한 양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체는 도 7에 제시된 화합물에 상응하다.
다른 바람직한 양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체는 도 8에 제시된 화합물에 상응하다.
연결기
생체절단성 연결기(영역 B)
접합체의 사용은 종종 강화된 약동학 또는 약동학적 동적 특성과 연관된다. 그러나, 접합체 모이어티의 존재는 목적 표적에 대한 올리고뉴클레오티드의 활성을, 예를 들어 혼성화 또는 뉴클레아제 모집(예컨대, RNAse H)을 방해하는 입체 장애를 통해 방해할 수 있다. 올리고뉴클레오티드(영역 A 또는 제1 영역)와 접합체 모이어티(영역 C 또는 제3 영역) 사이의 생리학적으로 불안정한 결합(생체절단성 연결기)의 사용은 접합체 모이어티의 존재에 기인한 개선된 특성을 가능하게 하는 반면, 표적 조직에서는 접합체 기가 올리고뉴클레오티드의 효과적인 활성을 방해하지 않도록 한다.
생리학적으로 불안정한 결합의 절단은 불안정한 결합을 함유하는 분자가 적절한 세포내 및/또는 세포외 환경에 도달할 때 자발적으로 발생한다. 예를 들어, pH 불안정한 결합은 분자가 산성화 엔도좀에 도입할 때 절단될 수 있다. 따라서, pH 불안정한 결합은 엔도좀 절단성 결합인 것으로 간주될 수 있다. 효소 절단성 결합은 엔도좀 또는 리소좀 또는 세포질에 존재하는 효소에 노출될 때 절단될 수 있다. 다이설파이드 결합은 분자가 세포 세포질의 더욱 환원적인 환경에 도입될 때 절단될 수 있다. 따라서, 다이설파이드는 세포질 절단성 결합으로 간주될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, pH-불안정한 결합은 산성 조건(pH 7 미만) 하에 선택적으로 파괴되는 불안정한 결합이다. 이러한 결합은 또한 세포 엔도좀 및 리소좀이 7 미만의 pH를 가지므로, 엔도좀 불안정한 결합으로 지칭될 수 있다.
표적화된 전달을 위해 접합체 모이어티에 연관된 생체절단성 연결기의 경우, 표적 조직(예를 들어 근육, 간, 신장 또는 종양)에서 보여지는 절단 속도는 혈청에서 발견되는 것보다 크다. 표적 조직 대 혈청의 절단 또는 S1 뉴클레아제에 의한 절단의 수준(%)을 측정하기 위한 적합한 방법은 "재료 및 방법" 섹션에 기술되어 있다. 일부 양태에서, 생체절단성 연결기(또한 생리학적으로 불안정한 연결기, 또는 뉴클레아제 민감성 연결기 또는 영역 B로 지칭됨)는, 본 발명의 접합체에서, 표준에 대해 비교될 때, 약 20% 이상, 예컨대 약 30% 이상, 예컨대 약 40% 이상, 예컨대 약 50% 이상, 예컨대 약 60% 이상, 예컨대 약 70% 이상, 예컨대 약 75% 이상 절단된다.
일부 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 접합체는 하기 3개의 영역을 포함한다: i) 표적 핵산에 상보적인 10 내지 25개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 제1 영역(영역 A); ii) 생체절단성 연결기를 포함하는 제2 영역(영역 B); 및 iii) 접합체 모이어티, 예컨대 아시알로당단백질 수용체 표적화 접합체 모이어티를 포함하는 제3 영역(영역 C)(이때, 제3 영역은 제1 영역에 공유 결합으로 연결된 제2 영역에 공유 결합으로 연결됨).
본 발명의 한 양태에서, 올리고뉴클레오티드 접합체는 인접한 뉴클레오티드 서열(영역 A)과 아시알로당단백질 수용체 표적화 접합체 모이어티(영역 C) 사이에 생체절단성 연결기(영역 B)를 포함한다.
일부 양태에서, 생체절단성 연결기는 표적 핵산에 상보적인 인접한 뉴클레오티드의 5'-말단 및/또는 3'-말단(영역 A)에 적합할 수 있다. 바람직한 양태에서, 생체절단성 연결기는 5'-말단에 존재한다.
일부 양태에서, 절단성 연결기는, 예를 들어 표적 세포에서 발현될 수 있는 뉴클레아제에 민감하다. 일부 양태에서, 생체절단성 연결기는 2 내지 5개의 연속적인 포스포다이에스터 연결기로 구성된다. 연결기는 짧은 영역(예컨대, 연결기의 정의에서 상술된 바와 같이 1 내지 10개) 포스포다이에스터 연결된 뉴클레오시드일 수 있다. 일부 양태에서, 생체절단성 연결기 영역 B 내의 뉴클레오시드는 (임의적으로 독립적으로) 뉴클레아제 절단을 방해하지 않는 DNA 및 RNA 또는 이들의 변형으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 뉴클레아제 절단을 방해하지 않는 DNA 및 RNA 뉴클레오시드의 변형은 비-천연 발생 핵염기일 수 있다. 특정 당-변형된 뉴클레오시드는 또한 알파-1-옥시-LNA와 같은 뉴클레아제 절단을 가능하게 할 수 있다. 일부 양태에서, 영역 B의 모든 뉴클레오시드는 (임의적으로 독립적으로) 2'-OH 리보스 당(RNA) 또는 2'-H 당(즉, RNA 또는 DNA)을 포함한다. 바람직한 양태에서, 영역 B의 2개 이상의 연속적인 뉴클레오시드는 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드(예컨대, 3, 4 또는 5개 이상의 연속적인 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드)이다. 더욱 더 바람직한 양태에서, 영역 B의 뉴클레오시드는 DNA 뉴클레오시드이고, 바람직하게는 영역 B는 1 내지 5개, 또는 1 내지 4개, 예컨대 2, 3, 4개의 연속적인 포스포다이에스터 연결된 DNA 뉴클레오시드로 이루어진다. 바람직한 양태에서, 영역 B는 작아서 RNAse H를 모집하지 않는다. 일부 양태에서, 영역 B는 3개 이하 또는 4개 이하의 연속적인 포스포다이에스터 연결된 DNA 및/또는 RNA 뉴클레오시드(예컨대, DNA 뉴클레오시드)를 포함한다.
영역 B가 포스포다이에스터 연결된 뉴클레오시드로 구성되는 경우, 영역 A 및 B는 영역 C에 연결된 올리고뉴클레오티드를 형성할 수 있다. 이러한 맥락에서, 영역 A는 영역 B로부터 분화될 수 있고, 이때 영역 A는 표적 핵산에 대한 증가된 결합 친화도를 갖는 하나 이상, 바람직하게는 2개 이상의 변형된 뉴클레오시드(예컨대, 2' 치환된 당 모이어티를 갖는 LNA 또는 뉴클레오시드)에 의해 개시되고, 영역 A는 스스로 관련 세포주에서 표적 핵산의 발현을 조절할 수 있다. 또한, 영역 A가 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드를 포함하는 경우, 이들은 뉴클레아제 내성 뉴클레오시드간 연결기, 예컨대 포스포로티오에이트 또는 보라노포스페이트와 연결된다. 한편, 영역 B는 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드 사이에 포스포다이에스터 연결기를 포함한다. 일부 양태에서, 영역 B는 표적 핵산에 상보적이지 않거나, 이에 대한 50% 이상의 미스매치를 포함한다.
일부 양태에서, 영역 B는 표적 핵산 서열, 또는 영역 A의 표적 핵산에 상보적인 인접한 뉴클레오티드에 상보적이지 않다.
일부 양태에서, 영역 B는 표적 핵산 서열에 상보적이다. 이에 관하여,영역 A 및 B는 함께 표적 서열에 상보적인 단일의 인접한 서열을 형성할 수 있다.
본 발명의 일부 양상에서, 제1 영역(영역 A)과 제2 영역(영역 B) 사이의 뉴클레오시드간 연결기는 제2 영역의 일부로 간주될 수 있다.
일부 양태에서, 영역 B 내의 염기의 서열은 표적 조직 또는 세포 또는 하위-세포 구획에 존재하는 우세한 엔도뉴클레아제 절단 효소에 근거하여, 최적 엔도뉴클레아제 절단 부위를 제공하도록 선택된다. 이에 관하여, 표적 조직 및 비-표적 조직으로부터 세포 추출물을 단리함으로써, 영역 B에 사용하기 위한 엔도뉴클레아제 절단 서열은 비-표적 세포(예컨대, 신장)와 비교되는 목적 표적 세포(예컨대, 간/간세포)의 바람직한 절단 활성에 근거하여 선택될 수 있다. 이에 관하여, 표적 하향-조절을 위한 화합물의 효능은 목적 조직/세포를 위해 최적화될 수 있다.
일부 양태에서, 영역 B는 서열 AA, AT, AC, AG, TA, TT, TC, TG, CA, CT, CC, CG, GA, GT, GC 또는 GG의 다이뉴클레오티드를 포함하고, 이때 C는 5-메틸사이토신일 수 있고/거나 T는 U로 대체될 수 있다. 바람직하게는, 뉴클레오시드간 연결기는 포스포다이에스터 연결기이다. 일부 양태에서, 영역 B는 서열 AAA, AAT, AAC, AAG, ATA, ATT, ATC, ATG, ACA, ACT, ACC, ACG, AGA, AGT, AGC, AGG, TAA, TAT, TAC, TAG, TTA, TTT, TTC, TAG, TCA, TCT, TCC, TCG, TGA, TGT, TGC, TGG, CAA, CAT, CAC, CAG, CTA, CTG, CTC, CTT, CCA, CCT, CCC, CCG, CGA, CGT, CGC, CGG, GAA, GAT, GAC, CAG, GTA, GTT, GTC, GTG, GCA, GCT, GCC, GCG, GGA, GGT, GGC 및 GGG의 트라이뉴클레오티드를 포함하고, 이때 C는 5-메틸사이토신일 수 있고/거나 T는 U로 대체될 수 있다. 바람직하게는, 뉴클레오시드간 연결기는 포스포다이에스터 연결기이다. 일부 양태에서, 영역 B는 서열 AAAX, AATX, AACX, AAGX, ATAX, ATTX, ATCX, ATGX, ACAX, ACTX, ACCX, ACGX, AGAX, AGTX, AGCX, AGGX, TAAX, TATX, TACX, TAGX, TTAX, TTTX, TTCX, TAGX, TCAX, TCTX, TCCX, TCGX, TGAX, TGTX, TGCX, TGGX, CAAX, CATX, CACX, CAGX, CTAX, CTGX, CTCX, CTTX, CCAX, CCTX, CCCX, CCGX, CGAX, CGTX, CGCX, CGGX, GAAX, GATX, GACX, CAGX, GTAX, GTTX, GTCX, GTGX, GCAX, GCTX, GCCX, GCGX, GGAX, GGTX, GGCX 및 GGGX의 트라이뉴클레오티드를 포함하고, 이때 X는 A, T, U, G, C 및 이들의 유사체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, C는 5-메틸사이토신일 수 있고/거나 T는 U로 대체될 수 있다. 바람직하게는, 뉴클레오시드간 연결기는 포스포다이에스터 연결기이다. (천연 발생) 핵염기 A, T, U, G, C를 지칭할 때, 이들이 균등한 천연 핵염기로서 작용하는 핵염기 유사체(예컨대, 상보성 뉴클레오시드와의 염기 쌍)로 치환될 수 있음이 인정될 것이다.
다른 연결기(영역 Y)
연결기는 2개 이상의 작용기(올리고뉴클레오티드에 부착하기 위한 하나 및 접합체 모이어티에 부착하기 위한 다른 하나)를 가질 수 있다. 예시적인 연결기 작용기는 올리고뉴클레오티드 또는 접합체 모이어티 상의 친핵성 기와의 반응을 위하 친전자성일 수 있거나, 친전자성 기와의 반응을 위해 친핵성일 수 있다. 일부 양태에서, 연결기 작용기는 아미노, 하이드록실, 카복실산, 티올, 포스포르아미데이트, 포스포로티오에이트, 포스페이트, 포스파이트, 불포화(예컨대, 이중 또는 삼중 결합) 등을 포함한다. 일부 예시적인 연결기(영역 Y)는 8-아미노-3,6-다이옥사옥탄산(ADO), 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC), 6-아미노헥산산(AHEX 또는 AHA), 6-아미노헥실옥시, 4-아미노부티르산, 4-아미노사이클로헥실카복실산, 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복시-(6-아미도-카프로에이트)(LCSMCC), 석신이미딜 m-말레이미도-벤조일레이트(MBS), 석신이미딜 N-e-말레이미도-카프로일레이트(EMCS), 석신이미딜 6-(베타-말레이미도-프로피온아미도)헥사노에이트(SMPH), 석신이미딜 N-(a-말레이미도 아세테이트)(AMAS), 석신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)부티레이트(SMPB), 베타-알라닌(베타-ALA), 페닐글리신(PHG), 4-아미노사이클로헥산산(ACHC), 베타-(사이클로프로필) 알라닌(베타-CYPR), 아미노 도데칸산(ADC), 알릴렌 다이올, 폴리에틸렌 글리콜, 아미노산 등을 포함한다. 일부 양태에서, 연결기(영역 Y)는 아미노 알킬, 예컨대 C2-C36 아미노 알킬 기, 예컨대, 예를 들어 C6-C12 아미노 알킬 기이다. 바람직한 양태에서, 연결기(영역 Y)는 C6 아미노 알킬 기이다. 아미노 알킬 기는, 예를 들어 (예컨대, 보호된) 아미노 알킬 포스포라미다이트를 사용하는 표준 올리고뉴클레오티드 합성의 일부로서 올리고뉴클레오티드(영역 A 또는 영역 A-B)에 첨가될 수 있다. 아미노 알킬과 올리고뉴클레오티드 사이의 연결기는, 예를 들어 포스포로티오에이트 또는 포스포다이에스터, 또는 본원에 언급된 다른 뉴클레오시드 연결기 중 하나일 수 있다. 아미노 알킬 기는 올리고뉴클레오티드의 5'- 또는 3'-말단에 공유 결합으로 연결된다. 시판 중인 아미노 알킬 연결기는, 예를 들어 올리고뉴클레오티드의 3'-말단에서의 연결기를 위한 3'-아미노-변형자 시약이고, 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에서의 연결기의 경우, 5'-아미노-변형자 C6이 이용가능하다. 이러한 시약은 글렌 리서치 코퍼레이션(미국 버지니아주 스털링 소재)로부터 이용가능하다. 이러한 화합물 또는 유사한 화합물은 플루오레세인을 올리고뉴클레오티드의 5'-말단으로 연결하기 위해 문헌[Krieg, et al, Antisense Research and Development 1991, 1, 161]에 의해 이용된다. 광범위한 추가 연결기가 당해 분야에 공지되어 있고, 올리고뉴클레오티드로의 접합체 모이어티의 부착에 유용할 수 있다. 많은 유용한 연결기의 검토는, 예를 들어, 문헌[Antisense Research and Applications, S. T. Crooke and B. Lebleu, Eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1993, p. 303-350]에서 발견될 수 있다. 아크리딘과 같은 다른 화합물은 폴리메틸렌 연결기를 통해 올리고뉴클레오티드의 3'-말단 포스페이트 기에 부착되었다(문헌[Asseline, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1984, 81, 3297]). 임의의 상기 기는 단일 연결기(영역 Y)로서 또는 하나 이상의 추가 연결기와의 조합(영역 Y-Y' 또는 영역 Y-B 또는 B-Y)으로 사용될 수 있다.
연결기 및 올리고뉴클레오티드의 접합체의 제조에서 이의 용도는 국제 공개공보 제96/11205호 및 국제 공개공보 제98/52614호 및 미국 특허공보 제4,948,882호; 제5,525,465호; 제5,541,313호; 제5,545,730호; 제5,552,538호; 제5,580,731호; 제5,486,603호; 제5,608,046호; 제4,587,044호; 제4,667,025호; 제5,254,469호; 제5,245,022호; 제5,112,963호; 제5,391,723호; 제5,510,475호; 제5,512,667호; 제5,574,142호; 제5,684,142호; 제5,770,716호; 제6,096,875호; 제6,335,432호; 및 제6,335,437호, 국제 공개공보 제2012/083046호(이들 각각은 이의 전체내용이 참고로서 혼입됨)와 같은 당해 분야 전반에 걸쳐 제공된다.
제조 방법
추가 양상에서, 본 발명은 뉴클레오티드 단위를 반응시키고, 이에 의해 올리고뉴클레오티드에 포함된 공유 결합으로 연결된 인접한 뉴클레오티드 단위를 형성하는 단계를 포함하는 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 제조 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 방법은 포스포라미다이트 화학을 사용한다(예를 들어, 문헌[Caruthers et al, 1987, Methods in Enzymology vol. 154, pages 287-313]). 추가 양태에서, 상기 방법은 인접한 뉴클레오티드 서열을 접합 모이어티(리간드)와 반응시키는 단계를 추가로 포함한다. 추가 양상에서, 상기 방법은 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 접합된 올리고뉴클레오티드와 약학적으로 허용되는 희석제, 용매, 담체, 염 및/또는 항원보강제를 혼합하는 단계를 포함하는 본 발명의 조성물의 제조를 위해 제공된다.
약학 조성물
추가 양상에서, 본 발명은 임의의 상기 올리고뉴클레오티드 및/또는 올리고뉴클레오티드 접합체 및 약학적으로 허용되는 희석제, 용매, 담체, 염 및/또는 항원보강제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 약학적으로 허용되는 희석제는 포스페이트-완충된 염수(PBS)를 포함하고, 약학적으로 허용되는 염은, 비제한적으로, 나트륨 및 칼륨 염을 포함한다. 일부 양태에서, 약학적으로 허용되는 희석제는 멸균 포스페이트 완충된 염수이다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 약학적으로 허용되는 희석제에 50 내지 300 μM 용액의 농도로 사용된다.
본 발명에 사용하는데 적합한 제형은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed., 1985]에서 발견된다. 약물 전달을 위한 방법은 간단한 검토를 위해, 예컨대 문헌[Langer, Science 249:1527-1533, 1990]을 참고한다. 국제 공개공보 제2007/031091호는 약학적으로 허용되는 희석제, 담체 및 항원보강제의 더욱 적합하고 바람직한 예를 제공한다(본원에 참고에 의해 혼입됨). 적합한 투여량, 제형, 투여 경로, 조성물, 투여 형태, 다른 치료제와의 조합, 전구약물 제형은 또한 국제 공개공보 제2007/031091호에 제공된다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 접합체는 약학 조성물 또는 제형의 제조를 위한 약학적으로 허용되는 활성 또는 불활성 물질과 혼합될 수 있다. 약학 조성물의 제형화를 위한 조성물 및 방법은, 비제한적으로 투여 경로, 질병의 정도 또는 투여되는 투여량을 비롯한 기준의 수에 따라 변한다.
이러한 조성물은 통상적인 멸균화 기술에 의해 멸균화될 수 있거나, 멸균 여과될 수 있다. 생산된 수용액은 그대로 사용하기 위해 포장되거나 동결건조될 수 있고, 동결건조된 제제는 투여 전에 멸균 수성 담체와 조합된다. 제제의 pH는 전형적으로 3 내지 11, 더욱 바람직하게는 5 내지 9 또는 6 내지 8, 가장 바람직하게는 7 내지 8, 예컨대 7 내지 7.5일 수 있다. 고체 형태의 생산된 조성물은, 예컨대 각각 정제 또는 캡슐의 밀봉된 포장 중에 고정된 양의 상기 약제를 함유하는 다수의 단일 투여량 단위로 포장될 수 있다. 고체 형태의 조성물은 또한 가요성 양을 위한 용기, 예컨대 국소 적용가능한 크림 또는 연고용으로 디자인된 압착가능한 튜브로 포장될 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 접합체는 전구약물이다. 특히, 올리고뉴클레오티드 접합체에 관하여, 접합체 모이어티는 전구약물이 작용 부위, 예컨대 표적 세포에 전달되면 올리고뉴클레오티드로 절단된다.
적용례
본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 접합체는, 예를 들어 진단, 치료 및 예방을 위한 연구 시약으로서 이용될 수 있다.
연구에서, 이러한 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 접합체는 세포(예컨대, 시험관내 세포 배양물) 및 실험 동물에서 PD-L1 단백질의 합성을 특이적으로 조절하는데 사용될 수 있고, 이에 의해 표적의 기능적 분석 또는 치료 중재를 위한 표적으로서의 유용성의 사정을 용이하게 한다. 전형적으로, 표적 조절은 단백질을 생산하는 mRNA를 분해시키거나 억제하고, 이에 의해 단백질 형성을 방지함으로써, 또는 단백질을 생산하는 유전자 또는 mRNA의 조절자를 분해시키거나 억제함으로써 달성된다.
연구 또는 진단에서 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 사용하는 경우, 표적 핵산은 cDNA, 또는 DNA 또는 RNA로부터 유래하는 합성 핵산일 수 있다.
본 발명은 PD-L1을 발현하는 표적 세포에서 PD-L1 발현을 조절하는 생체내 또는 시험관내 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 접합체를 상기 세포에 효과량으로 투여함을 포함한다.
일부 양태에서, 표적 세포는 포유동물 세포, 특히 인간 세포이다. 표적 세포는 포유동물 조직의 시험관내 세포 배양물 또는 생체내 세포 형성 부분일 수 있다. 바람직한 양태에서, 표적 세포는 간에 존재한다. 간 표적 세포는 실질 세포(예컨대, 간세포) 및 비-실질 세포, 예컨대 쿠퍼 세포, LSEC, 성상 세포(또는 Ito 세포), 담관세포 및 간-연관된 백혈구(예컨대, T-세포 및 NK 세포)로부터 선택될 수 있다. 일부 양태에서, 표적 세포는 항원-제시 세포이다. 항원-제시 세포는 이의 표면 상에서 주조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I 또는 클래스 II와 복합체화된 외래 항원을 나타낸다. 일부 양태에서, 항원-제시 세포는 MHC 클래스 II(즉, 전문 항원-제시 세포, 예컨대 수지상 세포, 대식세포 및 B 세포)를 발현한다.
진단에서, 올리고뉴클레오티드는 노턴 블로팅, 제자리 혼성화 또는 유사한 기술에 의해 세포 및 조직에서 PD-L1 발현을 검출하고 정량화시키는데 사용될 수 있다.
치료를 위해, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 접합체 또는 이의 약학 조성물은 PD-L1의 발현의 감소, 특히 간 표적-세포에서 PD-L1의 발현의 감소에 의해 완화되거나 치료될 수 있는 질병 또는 질환을 갖는 것으로 의심되는 동물 또는 인간에게 투여될 수 있다.
본 발명은 치료적 또는 예방적 효과량의 본 발명의 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 접합체 또는 약학 조성물을 질병을 앓거나 앓기 쉬운 대상에게 투여함을 포함하는, 질병의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 약제로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 접합체 또는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 접합체 또는 약학 조성물은 전형적으로 효과량으로 투여된다.
본 발명은 또한 본원에 언급된 질병 또는 질환의 치료용 약제의 제조에 기술된 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 접합체 또는 약학 조성물의 용도를 제공한다. 한 양태에서, 질병은 a) 바이러스성 간 감염, 예컨대 HBV, HCV 및 HDV; b) 기생충 감염, 예컨대 말라리아, 톡소플라즈마증, 리슈마니아증 및 트리파노소마증; 및 c) 간암 또는 간에서의 전이로부터 선택된다.
한 양태에서, 본 발명은 바이러스성 또는 기생충 감염으로부터 선택되는 질병 또는 질환의 치료에 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 접합체 또는 약학 조성물에 관한 것이다. 추가 양태에서, 질병은 a) 바이러스성 간 감염, 예컨대 HBV, HCV 및 HDV; b) 기생충 감염, 예컨대 말라리아, 톡소플라즈마증, 리슈마니아증 및 트리파노소마증; 및 c) 간암 또는 간에서의 전이로부터 선택된다.
본원에 언급된 질병 또는 질환은 면역 소실과 연관된다. 특히, 질병 또는 질환은 바이러스-특이적 T-세포 반응의 소실관 연관된다. 일부 양태에서, 질병 또는 질환은 PD-L1 발현의 감소에 의해 완화되거나 처리될 수 있다.
본 발명의 방법은 바람직하게는 면역 소실과 연관된 질병에 대한 치료 또는 예방에 사용된다.
본 발명의 한 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 접합체 또는 약학 조성물은 간암 또는 간에서의 전이에 대한 면역 반응의 회복에 사용된다.
본 발명의 한 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 접합체 또는 약학 조성물은 병원균에 대한 면역 반응의 회복에 사용된다. 일부 양태에서, 병원균은 간에서 발견될 수 있다. 병원균은 바이러스 또는 기생충, 특히 본원에 기술된 것들일 수 있다. 바람직한 양태에서, 병원균은 HBV이다.
본 발명은 또한 본원에 언급된 바이러스성 또는 기생충 감염의 회복용 약제의 제조를 위한, 본원에 정의된 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 접합체 또는 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 접합체 또는 약학 조성물은 바이러스성 감염, 특히 PD-1 경로가 영향을 받는 간에서의 바이러스성 감염의 치료에 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Kapoor and Kottilil 2014 Future Virol Vol. 9 pp. 565-585] 및 문헌[Salem and El-Badawy 2015 World J Hepatol Vol. 7 pp. 2449-2458] 참고). 바이러스성 간 감염은 간염 바이러스, 특히 HBV, HCV 및 HDV, 특히 이러한 감염의 만성 형태로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 한 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 접합체 또는 약학 조성물은 HBV, 특히 만성 HBV를 치료하는데 사용된다. 만성 HBV 감염의 지시자는 순환되는 높은 수준의 바이러스성 로드(load)(HBV DNA) 및 더욱 높은 수준의 빈 HBsAg 입자(100-배 초과의 과량의 비리온)이다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 접합체는 또한 HIV와의 동시감염으로 발생하는 바이러스성 간 감염을 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 접합체 또는 약학 조성물로 치료될 수 있는 다른 바이러스성 감염은 lcmv(림프구성 맥락수막염 바이러스), 및 단일 감염으로서 HIV, HSV-1 및 -2, 및 다른 헤르페스바이러스이다. 이러한 바이러스는 간천화성이 아니지만, 이들은 PD-L1 하향-조절에 민감할 수 있다.
일부 양태에서, 면역성 또는 면역 반응의 회복은 T-세포 및/또는 NK 세포 반응의 개선 및/또는 T-세포 소실의 완화와 관련되고, 특히 HBV-특이적 T-세포 반응, HCV-특이적 T-세포 반응 및/또는 HDV-특이적 T-세포 반응이 회복된다. T-세포 반응의 개선은, 예를 들어 간에서의 T-세포의 증가, 특히 대조군(예컨대, 치료 전의 수준 또는 비히클 처리된 대상에서의 수준)과 비교될 때 CD8+ 및/또는 CD4+ T-세포의 증가로서 평가될 수 있다. 추가 양태에서, 이것은 대조군과 비교될 때 회복되거나 증가되는 바이러스 특이적 CD8+ T-세포이고, 특히 HBV 특이적 CD8+ T-세포 또는 HCV 특이적 CD8+ T-세포 또는 HDV 특이적 CD8+ T-세포는 대조군과 비교될 때 회복되거나 증가된다. 바람직한 양태에서, HBV s 항원(HBsAg)에 특이적인 CD8+ T-세포 및/또는 HBV e 항원(HBeAg)에 특이적인 CD8+ T-세포 및/또는 HBV 코어 항원(HBcAg)에 특이적인 CD8+ T-세포는 대조군에 비해 본 발명의 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 접합체 또는 약학 조성물로 처리된 대상에서 증가된다. 바람직하게는, HBV 항원 특이적 CD8+ T-세포는 하나 이상의 사이토킨, 예컨대 인터페론-감마(IFN-γ) 또는 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)를 생산한다. 상기 CD8+ T-세포의 증가는 특히 간에서 관찰된다. 본원에 기술된 증가는 대조군과 비교될 때 통계학적으로 유의하여야 한다. 바람직하게는, 증가는 대조군과 비교될 때, 적어도 20%, 예컨대 25%, 예컨대 50%, 예컨대 75%이다. 다른 양태에서, 자연 살해(NK) 세포 및/또는 자연 살해 T(NKT) 세포는 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 접합체에 의해 활성화된다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 접합체 또는 약학 조성물은 치료 기생충 감염, 특히 PD-1 경로가 영향을 받는 기생충 감염의 치료에 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Bhadra et al. 2012 J Infect Dis vol 206 pp. 125-134]; 문헌[Bhadra et al. 2011 Proc Natl Acad Sci U S A Vol. 108 pp. 9196-9201]; 문헌[Esch et al. J Immunol vol 191 pp 5542-5550]; 문헌[Freeman and Sharpe 2012 Nat Immunol Vol 13 pp. 113-115]; 문헌[Gutierrez et al. 2011 Infect Immun Vol 79 pp. 1873-1881]; 문헌[Joshi et al. 2009 PLoS Pathog Vol 5 e1000431]; 문헌[Liang et al. 2006 Eur J Immunol Vol. 36 pp 58-64]; 문헌[Wykes et al. 2014 Front Microbiol Vol 5 pp 249] 참고). 기생충 감염은 말라리아, 톡소플라즈마증, 리슈마니아증 및 트리파노소마증으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 말라리아 감염은 플라스모듐(Plasmodium) 속, 특히 플라스모듐 비박스(Plasmodium vivax), 플라스모듐 말라리아에(Plasmodium Malariae) 및 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum) 종의 원생동물에 의해 유발된다. 톡소플라즈마증은 톡소플라즈마 곤디(Toxoplasma gondii)에 의해 유발된 기생충 질병이다. 리슈마니아증은 리슈마니아(Leishmania) 속의 원생동물 기생충에 의해 유발된 질병이다. 트리파노소마증은 트리파노소마(Trypanosoma) 속의 원생동물에 의해 유발된다. 샤카스병은 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi) 종에 의해 유발된 열대 형태이고, 수면병은 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei) 종에 의해 유발된다.
일부 양태에서, 면역성의 회복은 기생충-특이적 T-세포 및 NK 세포 반응, 특히 플라스모듐-특이적 T-세포 반응, 톡소플라즈마 곤디-특이적 T-세포 및 NK 세포 반응, 리슈마니아-특이적 T-세포 및 NK 세포 반응, 트리파노소마 크루지-특이적 T-세포 및 NK 세포 반응 또는 트리파노소마 브루세이-특이적 T-세포 및 NK 세포 반응의 회복과 관련된다. 추가 양태에서, 이것은 회복되는 기생충-특이적 CD8+ T-세포 및 NK 세포 반응이다.
투여
본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 약학 조성물은 국소(예컨대, 피부, 흡입, 안구 또는 귀) 또는 장(예컨대, 경구 또는 위장관) 또는 비경구(예컨대, 정맥내, 피하, 근육내, 대뇌내, 뇌실내 또는 척추강내) 투여될 수 있다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내 또는 근육내 주사 또는 주입, 척추강내 또는 두개골내, 예컨대 대뇌내 또는 뇌실내, 유리체내 투여를 비롯한 비경구 경로에 의해 투여된다. 한 양태에서, 활성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 접합체는 정맥내 투여된다. 다른 양태에서, 활성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 접합체는 피하 투여된다.
일부 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 접합체 또는 약학 조성물은 0.1 내지 15 mg/kg, 예컨대 0.1 내지 10 mg/kg, 예컨대 0.2 내지 10 mg/kg, 예컨대 0.25 내지 10 mg/kg, 예컨대 0.1 내지 5 mg/kg, 예컨대 0.2 내지 5 mg/kg, 예컨대 0.25 내지 5 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 투여는 1주에 1회, 2주에 1회, 3주에 1회 또는 1개월에 1회 수행될 수 있다.
병용 요법
일부 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 접합체 또는 약학 조성물은 다른 치료제와의 병용 치료에 사용하기 위한 것이다. 치료제는, 예를 들어 상기 질병 또는 질환을 위한 치료 표준일 수 있다.
만성 HBV 감염의 치료의 경우, 항바이러스성 약물 및 면역 시스템 조절자의 병용이 치료 표준으로서 추천된다. HBV에 효과적인 항바이러스성 약물은, 예를 들어 뉴클레오시(티)드 유사체이다. HBV의 치료법에 대해 승인된 5개의 뉴클레오시(티)드 유사체, 즉 라미부딘(에피비르(Epivir)), 아데포비르(헵세라(Hepsera)), 테노포비르(비리드(Viread)), 텔비부딘(타이제카(Tyzeka)), 엔테카비르(바라클루드(Baraclude))(이들은 바이러스성 복제(HBV DNA)를 억제하는데 효과적이지만, HBsAg 수준에 대한 효과가 없음)가 존재한다. 다른 항바이러스성 약물은 리바비린 및 HBV 항체 치료법(단클론성 또는 다클론성)을 포함한다. 면역 시스템 조절자는, 예를 들어 인터페론 알파-2a 및 PEG화된 인터페론 알파-2a(페가시스(Pegasys)) 또는 TLR7 작용제(예컨대, GS-9620) 또는 치료적 백신일 수 있다. IFN-α 치료는 바이러스성 로드를 감소시키는데 매우 알맞은 효과만을 나타내지만, 매우 비효율적임에도 불구하고 약간은 HBsAg 감소를 야기한다(48주 치료 후 10% 미만).
본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 접합체는 또한 HBV에 대해 효과적인 다른 항바이러스성 약물, 예컨대 국제 공개공보 제2012/145697호 및 국제 공개공보 제2014/179629호에 기술된 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 국제 공개공보 제2005/014806호, 국제 공개공보 제2012/024170호, 국제 공개공보 제2012/2055362호, 국제 공개공보 제2013/003520호 및 국제 공개공보 제2013/159109호에 기술된 siRNA 분자와 병용될 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 접합체가 다른 약제와의 병용 요법으로 투여될 때, 이들은 순차적으로 또는 동시에 또는 개별적으로 투여될 수 있다. 다르게는, 본 발명에 따른 약학 조성물은 본원에 기술된 약학적으로 허용되는 부형제와 결합된 본 발명의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 접합체, 및 당해 분야에 공지된 다른 치료제 또는 예방제의 조합으로 구성될 수 있다.
양태
본 발명의 하기 양태는 본원에 기술된 임의의 다른 양태와 조합으로 사용될 수 있다.
1. PD-L1의 발현을 감소시킬 수 있고 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이의 인접한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 안티센스 올리고뉴클레오티드.
2. 양태 1에 있어서, 인접한 뉴클레오티드 서열이 PD-L1 표적 핵산에 90% 이상 상보적인, 올리고뉴클레오티드.
3. 양태 1 또는 2에 있어서, 인접한 뉴클레오티드 서열이 서열번호 1, 서열번호 2 및/또는 서열번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 표적 핵산에 상보적인, 올리고뉴클레오티드.
4. 양태 1 내지 3 중 어느 한 양태에 있어서, 인접한 뉴클레오티드 서열이 서열번호 1의 위치 1 및 15720 내의 영역에 상보적인, 올리고뉴클레오티드.
5. 양태 1 내지 4 중 어느 한 양태에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 -10 kcal 미만의 ΔG°를 갖고, 서열번호 1, 서열번호 2 및/또는 서열번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 표적 핵산으로 혼성화될 수 있는, 올리고뉴클레오티드.
6. 양태 1 내지 5 중 어느 한 양태에 있어서, 인접한 뉴클레오티드 서열이 표적 핵산의 하위-서열에 상보적이고, 하위-서열이 서열번호 1의 위치 371 내지 3068, 5467 내지 12107, 15317 내지 15720, 15317 내지 18083, 15317 내지 19511 및 18881 내지 19494로 이루어진 군으로부터 선택되는, 올리고뉴클레오티드.
7. 양태 6에 있어서, 하위-서열이 서열번호 1의 위치 7300 내지 7333, 8028 내지 8072, 9812 내지 9859, 11787 내지 11873 및 15690 내지 15735로 이루어진 군으로부터 선택되는, 올리고뉴클레오티드.
8. 양태 2 내지 7 중 어느 한 양태에 있어서, 표적 핵산이 RNA인, 올리고뉴클레오티드.
9. 양태 8에 있어서, RNA가 mRNA인, 올리고뉴클레오티드.
10. 양태 9에 있어서, mRNA가 미성숙 mRNA 또는 성숙 mRNA인, 올리고뉴클레오티드.
11. 양태 1 내지 10 중 어느 한 양태에 있어서, 인접한 뉴클레오티드 서열이 14개 이상의 인접한 뉴클레오티드, 특히 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어진, 올리고뉴클레오티드.
12. 양태 1 내지 10 중 어느 한 양태에 있어서, 인접한 뉴클레오티드 서열이 16 내지 20개의 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어진, 올리고뉴클레오티드.
13. 양태 1 내지 10 중 어느 한 양태에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 14 내지 35개의 뉴클레오티드(길이)를 포함하거나 이로 이루어진, 올리고뉴클레오티드.
14. 양태 13에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 18 내지 22개의 뉴클레오티드(길이)를 포함하거나 이로 이루어진, 올리고뉴클레오티드.
15. 양태 1 내지 14 중 어느 한 양태에 있어서, 올리고뉴클레오티드 또는 인접한 뉴클레오티드 서열이 단일 가닥인, 올리고뉴클레오티드.
16. 양태 1 내지 15 중 어느 한 양태에 있어서, 인접한 뉴클레오티드 서열이 표적 핵산의 하위-서열에 상보적이고, 하위-서열이 A7, A26, A43, A119, A142, A159, A160, A163, A169, A178, A179, A180, A189, A201, A202, A204, A214, A221, A224, A226, A243, A254, A258, 269, A274, A350, A360, A364, A365, A370, A372, A381, A383, A386, A389, A400, A427, A435 및 A438로 이루어진 군으로부터 선택되는, 올리고뉴클레오티드.
17. 양태 16에 있어서, 하위-서열이 A221, A360, A180, A160 및 A269로 이루어진 군으로부터 선택되는, 올리고뉴클레오티드.
18. 양태 1 내지 17 중 어느 한 양태에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 siRNA가 아니고 자가-상보적이지 않은, 올리고뉴클레오티드.
19. 양태 1 내지 18 중 어느 한 양태에 있어서, 인접한 뉴클레오티드 서열이 서열번호 5 내지 743 및 771로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 올리고뉴클레오티드.
20. 양태 1 내지 19 중 어느 한 양태에 있어서, 인접한 뉴클레오티드 서열이 서열번호 6, 8, 9, 13, 41, 42, 58, 77, 92, 111, 128, 151, 164, 166, 169, 171, 222, 233, 245, 246, 250, 251, 252, 256, 272, 273, 287, 292, 303, 314, 318, 320, 324, 336, 342, 343, 344, 345, 346, 349, 359, 360, 374, 408, 409, 415, 417, 424, 429, 430, 458, 464, 466, 474, 490, 493, 512, 519, 519, 529, 533, 534, 547, 566, 567, 578, 582, 601, 619, 620, 636, 637, 638, 640, 645, 650, 651, 652, 653, 658, 659, 660, 665, 678, 679, 680, 682, 683, 684, 687, 694, 706, 716, 728, 733, 734 및 735로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 올리고뉴클레오티드.
21. 양태 1 내지 20 중 어느 한 양태에 있어서, 인접한 뉴클레오티드 서열이 서열번호 466, 640, 342, 287 및 566으로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 올리고뉴클레오티드.
22. 양태 1 내지 21 중 어느 한 양태에 있어서, 인접한 뉴클레오티드 서열이 상보적인 표적 핵산과 비교하여 0 내지 3개의 미스매치를 갖는, 올리고뉴클레오티드.
23. 양태 22에 있어서, 인접한 뉴클레오티드 서열이 표적 핵산과 비교되는 하나의 미스매치를 갖는, 올리고뉴클레오티드.
24. 양태 22에 있어서, 인접한 뉴클레오티드 서열이 표적 핵산과 비교되는 2개의 미스매치를 갖는, 올리고뉴클레오티드.
25. 양태 22에 있어서, 인접한 뉴클레오티드 서열이 표적 핵산 서열에 완전히 상보적인, 올리고뉴클레오티드.
26. 양태 1 내지 25 중 어느 한 양태에 있어서, 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드를 포함하는 올리고뉴클레오티드.
27. 양태 26에 있어서, 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드가 고-친화도 변형된 뉴클레오시드를 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
28. 양태 26 또는 27에 있어서, 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드가 2' 당 변형된 뉴클레오시드인, 올리고뉴클레오티드.
29. 양태 28에 있어서, 하나 이상의 2' 당 변형된 뉴클레오시드가 독립적으로 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA, 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-DNA, 2'-플루오로-ANA 및 LNA 뉴클레오시드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 올리고뉴클레오티드.
30. 양태 28에 있어서, 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드가 LNA 뉴클레오시드인, 올리고뉴클레오티드.
31. 양태 30에 있어서, 변형된 LNA 뉴클레오시드가 옥시-LNA인, 올리고뉴클레오티드.
32. 양태 31에 있어서, 변형된 뉴클레오시드가 베타-D-옥시-LNA인, 올리고뉴클레오티드.
33. 양태 30에 있어서, 변형된 뉴클레오시드가 티오-LNA인, 올리고뉴클레오티드.
34. 양태 30에 있어서, 변형된 뉴클레오시드가 아미노-LNA인, 올리고뉴클레오티드.
35. 양태 30에 있어서, 변형된 뉴클레오시드가 cET인, 올리고뉴클레오티드.
36. 양태 30에 있어서, 변형된 뉴클레오시드가 ENA인, 올리고뉴클레오티드.
37. 양태 30에 있어서, 변형된 뉴클레오시드가 베타-D-옥시-LNA, 알파-1-옥시-LNA, 베타-D-아미노-LNA, 알파-1-아미노-LNA, 베타-D-티오-LNA, 알파-1-티오-LNA, (S)cET, (R)cET 베타-D-ENA 및 알파-1-ENA로 이루어진 군으로부터 선택되는, 올리고뉴클레오티드.
38. 양태 30 내지 37 중 어느 한 양태에 있어서, 변형된 LNA 뉴클레오시드 이외에 하나 이상의 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드가 존재하는, 올리고뉴클레오티드.
39. 양태 38에 있어서, 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드가 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA(MOE), 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-DNA, 2'-플루오로-ANA로 이루어진 군으로부터 선택되는, 올리고뉴클레오티드.
40. 양태 1 내지 39 중 어느 한 양태에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드간 연결기를 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
41. 양태 40에 있어서, 변형된 뉴클레오시드간 연결기가 뉴클레아제 내성인, 올리고뉴클레오티드.
42. 양태 40 또는 41에 있어서, 인접한 뉴클레오티드 서열 내의 뉴클레오시드간 연결기의 50% 이상이 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기 또는 보라노포스페이트 뉴클레오시드간 연결기인, 올리고뉴클레오티드.
43. 양태 40 또는 41에 있어서, 인접한 뉴클레오티드 서열 내의 모든 뉴클레오시드간 연결기가 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기인, 올리고뉴클레오티드.
44. 양태 1 내지 43 중 어느 한 양태에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 RNase H를 모집할 수 있는, 올리고뉴클레오티드.
45. 양태 44에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 갭머인, 올리고뉴클레오티드.
46. 양태 44 또는 45에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 구조식 5'-F-G-F'-3'의 갭머이고, 이때 영역 F 및 F'가 독립적으로 1 내지 7개의 변형된 뉴클레오시드를 포함하거나 이로 이루어지고, G가 RNase H를 모집할 수 있는 6 내지 16개의 뉴클레오시드의 영역인, 올리고뉴클레오티드.
47. 양태 44 또는 45에 있어서, 갭머가 구조식 5'-D'-F-G-F'-3' 또는 5'-F-G-F'-D"-3'를 갖고, 이때 영역 F 및 F'가 독립적으로 1 내지 7개의 변형된 뉴클레오시드를 포함하고, G가 RNase H를 모집할 수 있는 6 내지 16개의 뉴클레오시드의 영역이고, 영역 D' 또는 D"가 1 내지 5개의 포스포다이에스터 연결된 뉴클레오시드를 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
48. 양태 47에 있어서, D' 또는 D"가 임의적인, 올리고뉴클레오티드.
49. 양태 47에 있어서, 영역 D'가 2개의 포스포다이에스터 연결된 뉴클레오시드로 이루어진, 올리고뉴클레오티드.
50. 양태 49에 있어서, 포스포다이에스터 연결된 뉴클레오시드가 ca(시티딘-아데노신)인, 올리고뉴클레오티드.
51. 양태 46 또는 47에 있어서, 변형된 뉴클레오시드가 독립적으로 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA, 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-DNA, 아라비노 핵산(ANA), 2'-플루오로-ANA 및 LNA 뉴클레오시드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 2' 당 변형된 뉴클레오시드인, 올리고뉴클레오티드.
52. 양태 46 내지 51 중 어느 한 양태에 있어서, 영역 F 및 F' 내의 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드가 LNA 뉴클레오시드인, 올리고뉴클레오티드.
53. 양태 52에 있어서, 영역 F 및 F' 내의 모든 변형된 뉴클레오시드가 LNA 뉴클레오시드인, 올리고뉴클레오티드.
54. 양태 53에 있어서, 영역 F 및 F'가 LNA 뉴클레오시드로 이루어진, 올리고뉴클레오티드.
55. 양태 52 내지 54 중 어느 한 양태에 있어서, 영역 F 및 F' 내의 변형된 뉴클레오시드가 옥시-LNA 뉴클레오시드인, 올리고뉴클레오티드.
56. 양태 52에 있어서, 하나 이상의 영역 F 또는 F'가 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA, 2'-아미노-DNA 및 2'-플루오로-DNA로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드를 추가로 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
57. 양태 46 내지 56 중 어느 한 양태에 있어서, 영역 G 내의 RNase H 모집 뉴클레오시드가 DNA, 알파-1-LNA, C4' 알킬화된 DNA, ANA, 2'F-ANA 및 UNA로부터 독립적으로 선택되는, 올리고뉴클레오티드.
58. 양태 57에 있어서, 영역 G 내의 뉴클레오시드가 DNA 및/또는 알파-1-LNA 뉴클레오시드인, 올리고뉴클레오티드.
59. 양태 57 또는 58에 있어서, 영역 G가 75% 이상의 DNA 뉴클레오시드로 이루어진, 올리고뉴클레오티드.
60. 양태 1 내지 59 중 어느 한 양태에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 화합물 번호 5_1 내지 743_1 및 771_1(표 5) 중 어느 하나로부터 선택되는, 올리고뉴클레오티드.
61. 양태 1 내지 60 중 어느 한 양태에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 화합물 번호 6_1, 8_1, 9_1, 13_1, 41_1, 42_1, 58_1, 77_1, 92_1, 111_1, 128_1, 151_1, 164_1, 166_1, 169_1, 171_1, 222_1, 233_1, 245_1, 246_1, 250_1, 251_1, 252_1, 256_1, 272_1, 273_1, 287_1, 292_1, 303_1, 314_1, 318_1, 320_1, 324_1, 336_1, 342_1, 343_1, 344_1, 345_1, 346_1, 349_1, 359_1, 360_1, 374_1, 408_1, 409_1, 415_1, 417_1, 424_1, 429_1, 430_1, 458_1, 464_1, 466_1, 474_1, 490_1, 493_1, 512_1, 519_1, 519_1, 529_1, 533_1, 534_1, 547_1, 566_1, 567_1, 578_1, 582_1, 601_1, 619_1, 620_1, 636_1, 637_1, 638_1, 640_1, 645_1, 650_1, 651_1, 652_1, 653_1, 658_1, 659_1, 660_1, 665_1, 678_1, 679_1, 680_1, 682_1, 683_1, 684_1, 687_1, 694_1, 706_1, 716_1, 728_1, 733_1, 734_1 및 735_1로 이루어진 군으로부터 선택되는, 올리고뉴클레오티드.
62. 양태 1 내지 60 중 어느 한 양태에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 화합물 번호 287_1, 342_1, 466_1, 640_1, 566_1, 766_1, 767_1, 768_1, 769_1 및 770_1로 이루어진 군으로부터 선택되는, 올리고뉴클레오티드.
63. 양태 1 내지 62 중 어느 한 양태에 따른 올리고뉴클레오티드(영역 A); 및 상기 올리고뉴클레오티드에 공유 결합으로 부착되는 하나 이상의 접합체 모이어티(영역 C)를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체.
64. 양태 63에 있어서, 접합체 모이어티가 탄수화물, 세포 표면 수용체 리간드, 약물 물질, 호르몬, 친유성 물질, 중합체, 단백질, 펩티드, 독소, 비타민, 바이러스성 단백질 및 이들의 조합으로부터 선택되는, 올리고뉴클레오티드 접합체.
65. 양태 63 또는 64에 있어서, 접합체 모이어티가 탄수화물 함유 모이어티인, 올리고뉴클레오티드 접합체.
66. 양태 65에 있어서, 탄수화물 접합체 모이어티가 양태 1 내지 62 중 어느 한 양태에 따른 올리고뉴클레오티드에 공유 결합으로 부착된 하나 이상의 아시알로당단백질 수용체 표적화 모이어티를 포함하는, 올리고뉴클레오티드 접합체.
67. 양태 66에 있어서, 아시알로당단백질 수용체 표적화 접합체 모이어티가 갈락토스, 갈락토사민, N-폼일-갈락토사민, N-아세틸갈락토사민, N-프로피오닐-갈락토사민, N-n-부타노일-갈락토사민 및 N-이소부타노일갈락토사민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 탄수화물 모이어티를 포함하는, 올리고뉴클레오티드 접합체.
68. 양태 66 또는 67에 있어서, 아시알로당단백질 수용체 표적화 접합체 모이어티가 1-가, 2-가, 3-가 또는 4-가인, 올리고뉴클레오티드 접합체.
69. 양태 68에 있어서, 아시알로당단백질 수용체 표적화 접합체 모이어티가 2 내지 4개의 말단 GalNAc 모이어티, 각각의 GalNAc 모이어티를 분지 분자에 연결하는 PEG 스페이서로 이루어진, 올리고뉴클레오티드 접합체.
70. 양태 66 내지 69 중 어느 한 양태에 있어서, 아시알로당단백질 수용체 표적화 접합체 모이어티가 3-가 N-아세틸갈락토사민(GalNAc) 모이어티인, 올리고뉴클레오티드 접합체.
71. 양태 1 내지 70 중 어느 한 양태에 있어서, 접합체 모이어티가 도 1의 하나의 3-가 GalNAc 모이어티로부터 선택되는, 올리고뉴클레오티드 접합체.
72. 양태 71에 있어서, 접합체 모이어티가 도 3의 3-가 GalNAc 모이어티인, 올리고뉴클레오티드 접합체.
73. 양태 63 내지 72 중 어느 한 양태에 있어서, 연결기가 올리고뉴클레오티드 또는 인접한 올리고뉴클레오티드 서열과 접합체 모이어티 사이에 존재하는, 올리고뉴클레오티드 접합체.
74. 양태 73에 있어서, 연결기가 생리학적으로 불안정한 연결기(영역 B)인, 올리고뉴클레오티드 접합체.
75. 양태 74에 있어서, 생리학적으로 불안정한 연결기가 뉴클레아제 민감성 연결기인, 올리고뉴클레오티드 접합체.
76. 양태 74 또는 75에 있어서, 생리학적으로 불안정한 연결기가 2 내지 5개의 연속적인 포스포다이에스터 연결기로 이루어진, 올리고뉴클레오티드 접합체.
77. 양태 76에 있어서, 생리학적으로 불안정한 연결기가 양태 47 내지 50에 존재하는 영역 D' 또는 D"와 동등한, 올리고뉴클레오티드 접합체.
78. 양태 63 내지 77 중 어느 한 양태에 있어서, 올리고뉴클레오티드 접합체가 화합물 번호 766_2, 767_2, 768_2, 769_2 및 770_2로부터 선택되는, 올리고뉴클레오티드 접합체.
79. 양태 78에 있어서, 올리고뉴클레오티드 접합체가 도 4, 5, 6, 7 및 8에 표시된 올리고뉴클레오티드 접합체로부터 선택되는, 올리고뉴클레오티드 접합체.
80. 양태 63 내지 76 중 어느 한 양태에 있어서, 비접합된 올리고뉴클레오티드와 비교하여, 표적 세포 내의 PD-L1의 개선된 억제, 또는 간과 비장 사이의 개선된 세포 분포 또는 접합체 올리고뉴클레오티드의 간으로의 개선된 세포 흡수를 나타내는 올리고뉴클레오티드 접합체.
81. 양태 1 내지 62 중 어느 한 양태에 따른 올리고뉴클레오티드 또는 양태 63 내지 80 중 어느 한 양태에 따른 접합체 및 약학적으로 허용되는 희석제, 담체, 염 및/또는 항원보강제를 포함하는 약학 조성물.
82. 뉴클레오티드 단위를 반응시켜 올리고뉴클레오티드 내에 포함된 공유 결합으로 연결된 인접한 뉴클레오티드 단위를 형성하는, 양태 1 내지 62 중 어느 한 양태에 따른 올리고뉴클레오티드의 제조 방법.
83. 양태 82에 있어서, 인접한 뉴클레오티드 서열을 비-뉴클레오티드 접합 모이어티와 반응시킴을 추가로 포함하는, 제조 방법.
84. 올리고뉴클레오티드를 약학적으로 허용되는 희석제, 담체, 염 및/또는 항원보강제와 혼합함을 포함하는, 양태 81에 따른 약학 조성물의 제조 방법.
85. PD-L1을 발현하는 표적 세포에서 PD-L1 발현을 조절하는 생체내 또는 시험관내 방법으로서, 효과량의 양태 1 내지 62 중 어느 한 양태에 따른 올리고뉴클레오티드, 양태 63 내지 80 중 어느 한 양태에 따른 접합체 또는 양태 81에 따른 약학 조성물을 상기 세포에 투여함을 포함하는 방법.
86. 치료 또는 예방 효과량의 양태 1 내지 62 중 어느 한 양태에 따른 올리고뉴클레오티드, 양태 63 내지 80 중 어느 한 양태에 따른 접합체 또는 양태 81에 따른 약학 조성물을 질병을 앓고 있거나 질병에 걸리기 쉬운 대상에게 투여함을 포함하는, 질병의 치료 또는 예방 방법.
87. 치료 또는 예방 효과량의 양태 1 내지 62 중 어느 한 양태에 따른 올리고뉴클레오티드, 양태 63 내지 80 중 어느 한 양태에 따른 접합체 또는 양태 81에 따른 약학 조성물을 바이러스 또는 기생충에 감염된 대상에게 투여함을 포함하는, 바이러스 또는 기생충에 대한 면역성을 회복하는 방법.
88. 양태 87에 있어서, 면역성의 회복이, 대조군과 비교될 때, 하나 이상의 HBV 항원에 특이적인 CD8+ T-세포의 간에서의 증가인, 방법.
89. 대상에서 질병의 치료 또는 예방용 약제로서 사용하기 위한 양태 1 내지 62 중 어느 한 양태에 따른 올리고뉴클레오티드, 양태 63 내지 80 중 어느 한 양태에 따른 접합체 또는 양태 81에 따른 약학 조성물.
90. 대상에서 질병의 치료 또는 예방용 약제의 제조를 위한, 양태 1 내지 62 중 어느 한 양태에 따른 올리고뉴클레오티드 또는 양태 63 내지 80 중 어느 한 양태에 따른 접합체 중 올리고뉴클레오티드의 용도.
91. 바이러스 또는 기생충에 대한 면역성의 회복에 있어서, 양태 1 내지 62 중 어느 한 양태에 따른 올리고뉴클레오티드, 양태 63 내지 80 중 어느 한 양태에 따른 접합체 또는 양태 81에 따른 약학 조성물의 용도.
92. 양태 91에 있어서, 면역성의 회복이, 대조군과 비교될 때, 하나 이상의 HBV 항원에 특이적인 CD8+ T-세포의 간에서의 증가인, 용도.
93. 양태 92에 있어서, HBV 항원이 HBsAg인, 용도.
94. 양태 86 내지 93 중 어느 한 양태에 있어서, 질병이 PD-L1의 생체내 활성과 연관된, 방법, 올리고뉴클레오티드 또는 용도.
95. 양태 86 내지 93 중 어느 한 양태에 있어서, 질병이 항원-제시 세포에서 PD-L1의 증가된 발현과 연관된, 방법, 올리고뉴클레오티드 또는 용도.
96. 양태 95에 있어서, PD-L1이, 양태 1 내지 62 중 어느 한 양태에 따른 올리고뉴클레오티드, 양태 63 내지 80 중 어느 한 양태에 따른 접합체 또는 양태 81에 따른 약학 조성물에 의한 치료 부재 하의 또는 치료 전의 발현과 비교하여 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상만큼 감소하는, 방법, 올리고뉴클레오티드 또는 용도.
97. 양태 86 내지 95 중 어느 한 양태에 있어서, 질병이 바이러스성 간 감염 및 기생충 감염로부터 선택되는, 방법, 올리고뉴클레오티드 또는 용도.
98. 양태 97에 있어서, 바이러스성 감염이 HBV, HCV 또는 HDV인, 방법, 올리고뉴클레오티드 또는 용도.
99. 양태 86 내지 95 중 어느 한 양태에 있어서, 질병이 만성 HBV인, 방법, 올리고뉴클레오티드 또는 용도.
100. 양태 98에 있어서, 기생충 감염이 말라리아, 톡소플라즈마증, 리슈마니아증 또는 트리파노소마증인, 방법, 올리고뉴클레오티드 또는 용도.
101. 양태 86 내지 95 중 어느 한 양태에 있어서, 대상이 포유동물인, 방법, 올리고뉴클레오티드 또는 용도.
102. 양태 101애 있어서, 포유동물이 인간인, 방법, 올리고뉴클레오티드 또는 용도.
실시예
재료 및 방법
모티프 서열 및 올리고뉴클레오티드 화합물
[표 5]
인간 PD-L1 전사체(서열번호 1)를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드 모티프 서열(서열번호로 표시됨), 이들의 디자인, 및 모티프 서열을 기준으로 디자인된 특이적 안티센스 올리고뉴클레오티드 화합물(화합물 번호로 표시됨)의 목록.
모티프 서열은 올리고뉴클레오티드에 존재하는 핵염기의 인접한 서열을 나타낸다.
디자인은 갭머 디자인 F-G-F'를 나타내고, 이때 각각의 수는, 임의적으로 표적 핵산에 상보적인 인접한 서열의 필수적인 부분이 아닌 DNA 및 LNA의 추가 반복 영역을 선행하거나 후행하는, 연속적인 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2' 변형된 뉴클레오시드의 수(첫 번째 수 = 5' 플랭크), 이어서 DNA 뉴클레오시드의 수(두 번째 수 = 갭 영역), 이어서 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2' 변형된 뉴클레오시드의 수(세 번째 수 = 3' 플랭크).
올리고뉴클레오티드 화합물은 모티프 서열의 특정 디자인을 나타낸다. 대문자는 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드를 나타내고, 소문자는 DNA 뉴클레오시드를 나타내고, 모든 LNA C는 5-메틸 사이토신이고, 모든 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기이다.
[표 6]
마우스 PD-L1 전사체(서열번호 4)를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드, 이의 디자인, 및 모티프 서열을 기준으로 디자인된 특정 올리고뉴클레오티드 화합물(화합물 번호로 표시됨).
모티프 서열은 올리고뉴클레오티드에 존재하는 핵염기의 인접한 서열을 나타낸다.
디자인은 갭머 디자인 F-G-F'를 지칭하고, 이때 각각의 수는, 임의적으로 표적 핵산에 상보적인 인접한 서열의 필수적인 부분이 아닌 DNA 및 LNA의 추가 반복 영역을 선행하거나 후행하는 연속적인 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2' 변형된 뉴클레오시드의 수(첫 번째 수 = 5' 플랭크), 이어서 DNA 뉴클레오시드의 수(두 번째 수= 갭 영역), 이어서 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2' 변형된 뉴클레오시드의 수(세 번째 수=3' 플랭크)를 나타낸다.
올리고뉴클레오티드 화합물은 모티프 서열의 특정 디자인을 나타낸다. 대문자는 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드를 나타내고, 소문자는 DNA 뉴클레오시드를 나타내고, 모든 LNA C는 5-메틸 사이토신이고, 모든 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기를 나타낸다.
[표 7]
5' ca 생체절단성 연결기를 갖는 올리고뉴클레오티드 모티프 서열 및 안티센스 화합물
대문자는 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드를 나타내고, 소문자는 DNA 뉴클레오시드를 나타내고, 모든 LNA C는 5-메틸 사이토신이고, 아래첨자 o는 포스포다이에스터 뉴클레오시드간 연결기를 나타내고, 달리 지시되지 않는 한, 다른 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기이다.
[표 8]
GalNAc 접합된 안티센스 올리고뉴클레오티드 화합물.
GN2는 도 3에 제시된 3-가 GalNAc 클러스터를 나타내고, C6은 6개의 탄소를 갖는 아미노 알킬 기를 나타내고, 대문자는 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드를 나타내고, 소문자는 DNA 뉴클레오시드를 나타내고, 모든 LNA C는 5-메틸 사이토신이고, 아래첨자 o는 포스포다이에스터 뉴클레오시드 연결기를 나타내고, 달리 지시되지 않는 한, 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기이다. 일부 분자를 나타내는 화학 도면은 도 4 내지 8에 제시된다.
AAV/HBV 마우스 모델
파스퇴르 모델:
HLA-A2.1-/HLA-DR1-유전자이식 H-2 클래스 I-/클래스 II-녹아웃(본원에 hHLA-A2/DR1로 언급됨) 마우스를 생산하고, 인스티투트 파스퇴르(Institut Pasteur)에서 사육하였다. 이러한 마우스는 마우스 MHC 반응에 의한 어떠한 간섭 없이 인간 면역 기능 연구를 위한 생체내 실험 모델을 나타낸다(문헌[Pajot et al 2004 Eur J Immunol. 34(11):3060-9]).
아데노-연관된 바이러스(AAV) 벡터, 복제 경쟁적인 HBV DNA 게놈을 갖는 AAV 혈청형 2/8을 본 연구에 사용하였다. AAV-HBV 벡터(배치 GVPN #6163)를 멸균 포스페이트-완충된 염수(PBS)에서 희석하여 5 x 1011 vg/mL의 역가에 도달하였다. 100 μL의 이러한 희석 용액(투여량/마우스: 5 x 1010 vg)을 마우스의 꼬리 정맥에 정맥내(i.v.) 주사하였다. HBV DNA를 함유하는 완전한 바이러스성 입자를 HBV-담체 마우스의 혈액에서 검출하였다. HBcAg는 혈액 내의 HBV 순환 단백질 HBeAg 및 HBsAg와 함께 간에서 1년 이하 동안 검출되었다. 모든 AAV2/8-HBV-형질도입된 마우스에서, HBsAg, HBeAg 및 HBV DNA는 1년 이상 동안 혈청 내에서 지속되었다(문헌[Dion et al 2013 J Virol 87:5554-5563]).
상하이 모델:
이러한 모델에서, IHBV 게놈(AAV/HBV)을 갖는 재조합 아데노-연관된 바이러스(AAV)에 감염된 마우스는 30주 초과 동안 안정한 바이러스혈증 및 항원혈증을 유지한다(문헌[Dan Yang, et al. 2014 Cellular & Molecular Immunology 11, 71-78]).
수컷 C57BL/6 마우스(4 내지 6주령)(특정 병원균 부재)를 SLAC(Shanghai Laboratory Animal Center of Chinese Academy of Sciences; 중국 과학원의 상하이 실험 동물 센터)로부터 구입하였고, 동물 관리 시설에서 개별적으로 환기되는 우리에서 사육하였다. 우시(WuXi) IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee; 협회 동물 관리 및 사용 위원회, 우시 IACUC 프로토콜 번호 R20131126-마우스)에 의해 지시된 바와 같은 동물의 관리 및 사용을 위한 지침을 따랐다. 3일 동안 마우스가 새로운 환경에 익숙하게 하고, 실험 디자인에 따라 분류하였다.
재조합 AAV-HBV를 PBS(주사 당 200 μL)에서 희석하였다. 이러한 재조합 바이러스는 1.3 카피의 HBV 게놈(유전자형 D, 혈청형 ayw)을 갖는다.
0일 째에, 모든 마우스에 200 μL AAV-HBV를 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. AAV 주사 후 6, 13 및 20일 째에, 모든 마우스를 혈청 수집을 위해 하악하 채혈하였다(0.1 mL 혈액/마우스). 주사 후 22일 째에, 안정한 바이러스혈증을 갖는 마우스가 올리고뉴클레오티드 치료를 위해 준비되었다. 올리고뉴클레오티드는 비접합되거나 GalNAc 접합될 수 있다.
DNA 백신
플라스미드 DNA는 내독소-부재였고, 플라스미드-펙토리(Plasmid-Factory, 독일)에 의해 제조되었다. pCMV-S2.S ayw는 HBsAg(유전자형 D)의 preS2 및 S 도메인을 코딩하고, 이의 발현은 사이토메갈로바이러스 전초기 유전자 프로모터에 의해 조절된다(문헌[Michel et al 1995 Proc Natl Acad Sci U S A 92:5307-5311]). pCMV-HBc는 간염 코어(HBc) Ag를 갖는 HBV 캡시드를 코딩한다(문헌[Dion et al 2013 J Virol 87:5554-5563]).
DNA 백신에 의한 치료를 본원에 기술된 바와 같이 수행하였다. 백신접종 5일 전에, 심장독(CaTx, 라톡산(Latoxan) refL81-02, 50 μL/ 근육)을 마우스의 근육 내에 주사하였다. CaTx는 근육 섬유를 감극시켜 세포 퇴화를 유도하고, 주사 5일 후, 신규한 근육 섬유가 나타나고 형질감염에 대한 양호한 효능을 위해 DNA 백신을 수용할 것이다. 각각 1 mg/mL의 pCMV-S2.S ayw 및 pCMV코어를 동량으로 혼합하고, 각각의 마우스는 마취(100 μL의 12.5 mg/mL 케타민, 1.25 mg/mL 자일라진) 하에 문헌[Michel et al 1995 Proc Natl Acad Sci U S A 92:5307-5311]에 종래 기술된 바와 같이, 심장독-처리된 전경골근으로의 양측 근육내 주사에 의해 총 100 μg을 수용하였다.
항-PD-L1 항체
이것은 제넨테크(Genentech)에서 내부 생산된 마우스 항-마우스 PD-L1 IgG1 항체 클론 6E11이다. 이것은 아테졸리주맙을 크로스 블로킹(cross blocking)하고 로슈(Roche)에서 내부 생산된 아테졸리주맙의 유사한 시험관내 블로킹 활성을 갖는 대용 항체이다. 항체는 12.5 μg/g의 투여량으로 복강내(i.p.) 주사에 의해 투여된다.
올리고뉴클레오티드 합성
올리고뉴클레오티드 합성은 일반적으로 당해 분야에 공지되어 있다. 적용될 수 있는 프로토콜이 후술된다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 사용된 장치, 지지체 및 농도의 면에서 방법을 약간 바꿈으로써 생산될 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 올리고메이커(Oligomaker) 48에 대한 포스포라미다이트 접근법을 1 μmol 스케일로 사용하여 우리딘 유니버셜 지지체 상에서 합성된다. 합성의 종료시, 올리고뉴클레오티드는 60℃에서 5 내지 16시간 동안 수성 암모니아를 사용하여 고체 지지체로부터 절단된다. 올리고뉴클레오티드는 역상 HPLC(RP-HPLC) 또는 고체 상 추출에 의해 정제되고, UPLC에 의해 특징규명되고, 분자 질량은 또한 ESI-MS에 의해 확인된다.
올리고뉴클레오티드의 신장:
β-시아노에틸-포스포라미다이트(DNA-A(Bz), DNA-G(ibu), DNA-C(Bz), DNA-T, LNA-5-메틸-C(Bz), LNA-A(Bz), LNA-G(dmf) 또는 LNA-T)의 커플링은 활성화제로서 아세토니트릴 중 DCI(4,5-다이시아노이미다졸)(0.25 M) 및 아세토니트릴 중 5'-O-DMT-보호된 아미다이트(0.1 M)의 용액을 사용하여 수행된다. 최종 사이클을 위하여, 목적 변형을 갖는 포스포라미다이트, 예컨대 접합체 기를 부착하기 위한 C6 연결기 또는 접합체 기 자체가 사용될 수 있다. 포스포르티오에이트 연결기의 도입을 위한 티올화가 잔탄 하이드라이드(아세토니트릴/피리딘 9:1 중 0.01 M)를 사용함으로써 수행된다. 포스포르다이에스터 연결기는 THF/피리딘/물 7:2:1 중 0.02 M 요오드를 사용하여 도입될 수 있다. 나머지 시약은 올리고뉴클레오티드 합성에 전형적으로 사용되는 것들이다.
고체 상 합성 후 접합을 위하여, 시판 중인 C6 아미노 연결기 포스포라미다이트가 고체 상 합성의 마지막 사이클에 사용될 수 있고, 탈보호 및 고체 지지체로부터의 절단 후, 아미노연결되고 탈보호된 올리고뉴클레오티드가 단리된다. 접합체는 표준 합성 방법을 사용하는 작용기의 활성화에 의해 도입된다.
다르게는, 접합체 모이어티는, 국제 특허출원 제PCT/EP2015/073331호 또는 유럽 특허출원 제15194811.4호에 기술된 GalNAc- 또는 GalNAc-클러스터 포스포라미다이트를 사용함으로써, 고체 지지체 상에 고정하면서 올리고뉴클레오티드에 첨가될 수 있다.
RP-HPLC에 의한 정제:
조질 화합물을 페노메넥스 주피터(Phenomenex Jupiter) C18 10 μ 150 x 10 mm 컬럼 상에서 제조용 RP-HPLC에 의해 정제한다. 0.1 M 암모늄 아세테이트 pH 8 및 아세토니트릴을 완충액으로서 5 mL/분의 유량으로 사용한다. 수집된 분획을 동결건조하여 정제된 화합물을 전형적으로 백색 고체로서 수득한다.
약어:
DCI: 4,5-다이시아노이미다졸
DCM: 다이클로로메탄
DMF: 다이메틸포름아미드
DMT: 4,4'-다이메톡시트라이틸
THF: 테트라하이드로퓨란
Bz: 벤조일
Ibu: 이소부티릴
RP-HPLC: 역상 고성능 액체 크로마토그래피
T
m
검정
올리고뉴클레오티드 및 RNA 표적(포스페이트 연결된, PO) 듀플렉스를 500 mL RNase-부재 물 중에서 3 mM까지 희석하고, 500 mL 2x Tm-완충액(200 mM NaCl, 0.2 mM EDTA, 20 mM Na 포스페이트, pH 7.0)과 혼합한다. 용액을 3분 동안 95℃까지 가열하고, 이어서 30분 동안 실온에서 어닐링(annealing)하였다. 듀플렉스 용융 온도(Tm)를, 펠티어(Peltier) 온도 프로그래머 PTP6이 장착된 람다(Lambda) 40 UV/VIS 분광광도계 상에서 PE 템프랩(Templab) 소프트웨어(펄킨 엘머(Perkin Elmer))를 사용하여 측정하였다. 온도는 20℃에서 95℃까지 상승하고, 이어서 25℃까지 하락한다(260 nm에서 흡광도를 기록한다). 용융 및 어닐링 둘 다의 제1 미분계수 및 국소 최대치를 사용하여 듀플렉스 Tm을 평가하였다.
조직 특이적 시험관내 연결기 절단 검정
시험될 생체절단성 연결기(예컨대, DNA 포스포다이에스터 연결기(PO 연결기))를 갖는 FAM-표지된 올리고뉴클레오티드에 관련 조직(예컨대, 간 또는 신장) 및 혈청의 균질 현탁액을 사용하는 시험관내 절단을 수행하였다.
조직 및 혈청 샘플을 적합한 동물(예컨대, 마우스, 원숭이, 돼지 또는 래트)로부터 수집하고, 균질화 완충액(0,5% 이게팔(Igepal) CA-630, 25 mM 트리스(Tris) pH 8.0, 100 mM NaCl, pH 8.0(1 N NaOH로 조정됨) 중에서 균질화시킨다. 조직 균질 현탁액 및 혈청 올리고뉴클레오티드로 하여 200 μg/g 조직의 농도까지 스파이킹(spiking)한다. 샘플을 37℃에서 24시간 동안 항온처리하고, 이어서 샘플을 페놀-클로로폼으로 추출한다. 다이오넥스(Dionex) DNApac p-100 컬럼 및 10 mM로부터 1 M까지의 나트륨 퍼클로레이트(pH 7.5) 구배를 사용하는 다이오넥스 얼티메이트(Ultimate) 3000 상에서 AIE HPLC 분석을 상기 용액에 수행하였다. 615 nm에서의 형광 검출기 및 260 nm에서의 uv 검출기를 둘 다 사용하여 절단되거나 비-절단된 올리고뉴클레오티드의 함량을 표준에 대해 측정하였다.
S1 뉴클레아제 절단 검정
S1 뉴클레아제 민감성 연결기(예컨대, DNA 포스포다이에스터 연결기(PO 연결기))를 갖는 FAM-표지된 올리고뉴클레오티드에 S1 뉴클레아제 추출물 또는 혈청 중에서 시험관내 절단을 수행하였다.
100 μM의 올리고뉴클레오티드에 뉴클레아제 완충액 중 S1 뉴클레아제(100 μL 당 60 U)를 사용하여 20 및 120분 동안 시험관내 절단을 수행하였다. EDTA를 완충액 용액에 첨가함으로써, 효소적 활성화를 중단시킨다. 다이오넥스 얼티메이트 3000 상에서 다이오넥스 DNApac p-100 컬럼 및 10 mM로부터 1 M까지의 나트륨 퍼클로레이트(pH 7.5)의 구배를 사용하여 상기 용액에 AIE HPLC 분석을 수행하였다. 615 nm에서의 형광 검출기 및 260 nm에서의 uv 검출기를 둘 다 사용하여 절단되거나 비-절단된 올리고뉴클레오티드의 함량을 표준에 대해 측정하였다.
간 단핵 세포의 제조
AAV/HBV 마우스로부터 간 세포를 문헌[Tupin et al 2006 Methods Enzymol 417:185-201]에 기술된 방법에 따라(작은 변형을 가짐) 후술된 바와 같이 준비하였다. 마우스 안락사 후, G25 바늘을 갖는 주사기를 사용하여 간문맥을 통해 10 mL의 멸균 PBS를 간에 관류하였다. 기관이 엷어질 때, 기관을 행크 균형 염 용액(HBSS)(깁코(GIBCO: 등록상표) HBSS, 24020) + 5% 보체제거된 우태 혈청(FCS)에서 수확하였다. 수확된 간을 100 μm 세포-여과기(cell-strainer)(비디 팔콘(BD Falcon), 352360)에 천천히 통과시키고, 세포를 30 mL의 HBSS + 5 % FCS에 현탁하였다. 세포 현탁액을 50 g로 5분 동안 원심분리하였다. 이어서, 상청액을 289 g로 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후, 상청액을 폐기하고, 펠렛을 실온에서 15 mL의 35% 등장성 퍼콜(퍼콜) 용액(RPMI 1640(깁코, 31870)으로 희석된 지이 헬스케어(GE Healthcare) 퍼콜 #17-0891-01)에 재현탁하고, 15 mL 튜브에 옮겼다. 세포를 1,360 g로 실온에서 25분 동안 더욱 원심분리하였다. 상청액을 흡기에 의해 폐기하고, 단핵 세포를 함유하는 펠렛을 HBSS + 5% FCS로 2회 세척하였다.
세포를 완전 매질(10% FCS(하이클론(Hyclon), # SH30066, 로트 APG21570), 100 U/mL 페니실린 + 100 μg/mL 스트렙토마이신 + 0.3 mg/mL L-글루타민(깁코, 10378), 1X 비-필수 아미노산(깁코, 11140), 10 mM 헤페스(Hepes)(깁코, 15630), 1 mM 나트륨 피루베이트(깁코, 11360) 및 50 μM β-머캡토에탄올(LKB, 1830)이 보충된 α-최소 필수 매질(깁코, 22571))에서 배양하였다.
세포의 표면 표지
세포를 U-저부 96-웰 플레이트에 시딩하고, PBS FACS(1% 소 혈청 알부민 및 0.01% 나트륨 아자이드를 함유하는 PBS)로 세척하였다. 래트 항-마우스 CD16/CD32 항체 및 생존력 마커 LD 픽서블 옐로우(fixable yellow), 써모피셔, L34959를 함유하는 5 μL의 PBS FACS와 함께 세포를 4℃에서 어둠 하에 10분 동안 항온처리하였다. 이어서, 세포를 어둠에서 4℃에서 20분 동안 NK P46 BV421에 대한 단클론성 항체(Mab)(래트 Mab 항-마우스 NK P46, 바이오레전드(Biolegend), 137612) 및 F4/80(래트 Mab 항-마우스 F4/80 FITC, 비디 바이오레전드, 123108)을 함유하는 25 μL의 PBS FACS로 염색하고, 2개의 추가적인 표면 마커 PD1(래트 Mab 항-마우스 PD1 PE, 비디 바이오사이언시스(BD Biosciences), 551892) 및 PD-L1(래트 Mab 항-마우스 PD-L1 BV711, 바이오레전드, 124319)을 또한 첨가하였다.
세포내 사이토킨 염색(ICS) 검정
ICS 검정을 비장세포 및 간 단핵 세포 둘 다 상에서 수행하였다. 세포를 U-저부 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 세포를 갖는 플레이트를 음성 대조군으로 완전한 매질 단독에서, 또는 2 μg/mL의 농도로 표 9에 기술된 펩티드를 갖는 매질에서 37℃에서 밤새 항온처리하였다. 2 μg/mL의 브레펠딘(Brefeldin) A(시그마(Sigma), B6542)를 항온처리 1시간 후에 첨가하였다.
밤새 배양 후, 세포를 PBS FACS로 세척하고, 래트 항-마우스 CD16/CD32 항체 및 생존력 마커 LD 픽서블 옐로우, 써모피셔, L34959를 함유하는 5 μL의 PBS FACS와 함께 4℃에서 어둠에서 10분 동안 항온처리하였다. 이어서, Mab를 함유하는 25 μL의 PBS FACS로 세포를 4℃에서 어둠에서 20분 동안 염색하였다. 혼합물은 CD3에 대한 단클론성 항체(햄스터 Mab 항-마우스 CD3-PerCP, 비디 바이오사이언시스, 553067), CD8(래트 Mab 항-마우스 CD8-APC-H7, 비디 바이오사이언시스, 560182), CD4(래트 Mab 항-마우스 CD4-PE-Cy7, 비디 바이오사이언시스, 552775) 및 NK 세포(래트 Mab 항-마우스 NK P46 BV421, 바이오레전드, 137612)로 구성된다. 세포를 수차례 세척한 후에 고정하고, 사이토픽스/사이토펌(Cytofix/Cytoperm)으로 실온에서 어둠에서 20분 동안 투과시키고, 4℃의 펌/워쉬(Perm/Wash) 용액(비디 바이오사이언시스, 554714)으로 세척하였다.
IFNγ에 대한 항체(래트 Mab 항-마우스 IFNγ-APC, 클론 XMG1.2, 비디 바이오사이언시스, 554413) 및 종양 괴사 인자 알파(TNFα)(래트 Mab 항-마우스 TNFα-FITC, 클론 MP6-XT22; 1/250(비디 바이오사이언시스 554418))에 의한 세포내 사이토킨 염색을 4℃에서 어둠에서 30분 동안 수행하였다. MACSQuant 분석기를 사용하는 유동 세포분석에 의한 분석 전에, 세포를 펌/워쉬로 세척하고, 1% 폼알데하이드를 함유하는 PBS FACS에서 재현탁하였다.
살아있는 CD3+CD8+CD4- 및 세포 CD3+CD8-CD4+를 게이팅(gating)하고, 점 도표 상에 제시한다. 2개의 영역은 각각의 사이토킨에 대한 양성 세포를 위한 게이트로 정의된다. 이러한 게이트에서 발견되는 경우의 수를 모집단 내의 경우의 총 수로 나누어 반응하는 T-세포의 백분율을 산출한다. 각각의 마우스의 경우, 단독의 매질에서 수득되는 백분율은 배경으로서 간주되었고, 펩티드 자극에 의해 수득된 백분율에서 차감되었다.
가능성의 역치를 실험 배경에 따라 정의하였다(즉, 매질 단독 조건에서 각각의 군으로부터 수득된 염색된 세포의 평균 백분율 + 2의 표준 편차). 5개 이상의 경우에 나타낸 사이토킨의 백분율만이 양성으로서 간주되었다.
[표 9]
HBsAg(S2+S)의 HBV 코어 단백질 및 외피 도메인(Envelope domain)에 함유된 HLA-A2/DR1 제한된 에피토프.
실시예 1 - 시험관내 효능 시험
유전자 워크(gene walk)를 주로 16 내지 20량체 갭머를 사용하는 인간 PD-L1 전사체를 가로질러 수행하였다. 효능 시험을 인간 백혈병 단핵구 세포주 THP1 및 인간 비-호지킨 K 림프종 세포주(카르파스-299)에서 시험관내 실험으로 수행하였다.
세포주
THP1 및 카르파스(Karpas)-299 세포주를 인증된 세포 배양을 위한 유럽 콜렉션(European Collection of Authenticated Cell Cultures: ECACC)으로부터 원래 구입하였고, 5% CO2를 갖는 37℃의 가습된 인큐베이터에서 공급자에 의해 추천된 바와 같이 유지하였다.
올리고뉴클레오티드 효능
THP-1 세포(RPMI-글루타맥스(GLutamax) 중 3.104, 10% FBS, 1% 펜-스트렙(Pen-Strep)(써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))를 96-웰 환저 플레이트 내로 올리고뉴클레오티드(4 내지 5 μL)에 첨가하고, 100 μL/웰의 최종 부피로 6일 동안 배양하였다. 올리고뉴클레오티드를 하나의 단일 농도(20 μM) 및 25 내지 0.004 μM(물 중 1:3 희석)의 투여량-범위 농도에서 선별하였다. 제조사의 지시에 따라 MagNA 퓨어(Pure) 96 시스템(로슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics)) 상에서 MagNA 퓨어 96 세포 RNA 대용량 키트를 사용하여 전체 mRNA를 추출하였다. 유전자 발현 분석을 위하여, 표적화 내생 대조군으로서 사용된 인간 PD-L1 및 ACTB를 표적화하는 사전-디자인된 타크만(Taqman) 프라이머(써모 피셔 사이언티픽)를 갖는 콴트스튜디오(QuantStudio) 머신(어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems)) 상에서 타크만 RNA-to-ct 1-단계 키트(써모 피셔 사이언티픽)를 사용하여 RT-qPCR을 수행하였다. 2(-델타 델타 C(T)) 방법 및 대조군 샘플(비-처리된 세포)과 비교되는 %인 억제율을 사용하여 상대적인 PD-L1 mRNA 발현 수준을 계산하였다.
카르파스-299 세포를 RPMI 1640, 2 mM 글루타민 및 20% FBS(시그마)에서 배양하였다. PBS에 용해된 올리고뉴클레오티드 접합체의 첨가 전에 24시간 동안 항온처리된 96 웰 플레이트 중에서 세포를 10,000 세포/웰로 평판배양하였다. 올리고뉴클레오티드의 최종 농도는 100 μL/웰의 최종 부피에서 5 μM의 단일 투여량이거나, 100 μL 배양 부피에서 50 μM, 15.8 μM, 5.0 μM, 1.58 μM, 0.5 μM, 0.158 μM, 0.05 μM로부터 0.0158 μM까지의 범위의 투여 반응으로 첨가되었다. 올리고뉴클레오티드 화합물의 첨가 후 3일에 세포를 수확하였고, 제조사의 지시에 따라 퓨어링크 프로(PureLink Pro) 96 RNA 정제 키트(암바이온(Ambion))를 사용하여 RNA를 추출하였다. 제조사의 지시에 따라 M-MLT 역전사효소, 랜덤 10량체 레트로스크립트(RETROscript), RNase 억제제(암바이온) 및 100 mM dNTP 세트(인비트로겐(Invitrogen), PCR 등급)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 유전자 발현 분석을 위하여, PD-L1(어플라이드 바이오시스템스; Hs01125299_m1) 및 TBP(어플라이드 바이오시스템스; 4325803)를 위한 타크만 프라이머 검정으로 설정된 듀플렉스에서 타크만 패스트 어드밴스드 마스터 믹스(Taqman Fast Advanced Master Mix)(2X)(암바이온)를 사용하여 qPCR을 수행하였다. 상대적인 PD-L1 mRNA 발현 수준은 대조군 샘플(PBS-처리된 세포)의 %로서 표 10에 제시된다.
[표 10]
THP1 및 카르파스-299 세포주에서 항-PD-L1 화합물의 시험관내 효능(n=3 실험으로부터의 평균). PD-L1 mRNA 수준은 카르파스-299 세포 중 TBP 또는 THP1 세포 중 ACTB로 정규화되고, 대조군(PBS-처리된 세포)의 %로서 제시된다.
실시예 2 - 투여량 반응 곡선에서 시험관내 효능 시험
표 10으로부터의 올리고뉴클레오티드의 선택을 실시예 1에 기술된 시험관내 효능 검정에서 PBS 중 반-로그 연속 희석(50 μM, 15.8 μM, 5.0 μM, 1.58 μM, 0.5 μM, 0.158 μM, 0.05 μM로부터 0.0158 μM까지의 올리고뉴클레오티드)을 사용하여 카르파스-299 세포에서 시험하였다. IC50 및 최대 억제(% 잔류 PD-L1 발현)를 올리고뉴클레오티드에 대해 평가하였다.
EC50 계산을 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 6에서 수행하였다. IC50 및 최대 PD-L1 녹다운 수준은 대조군(PBS-처리된 세포)의 %로서 표 11에 제시된다.
[표 11]
염수의 %인 최대 억제 및 카르파스-299 세포주에서의 EC50.
실시예 1에 기술된 시험관내 효능 검정에서 25 μM로부터 0.004 μM까지의 1:3 연속물을 사용하여 표 6으로부터의 올리고뉴클레오티드의 선택을 THP-1 세포에서 시험하였다. IC50 및 최대 억제(% 잔류 PD-L1 발현)를 올리고뉴클레오티드에 대해 평가하였다.
EC50 계산을 그래프패드 프리즘 6에서 수행하였다. IC50 및 최대 PD-L1 녹다운 수준은 대조군(PBS-처리된 세포)의 %로서 표 12에 제시된다.
[표 12]
염수의 %인 최대 억제 및 THP1 세포주에서의 EC50.
표 7 및 8의 결과는 또한 서열번호 1의 PD-L1 미성숙 mRNA를 표적으로 하는 이들의 위치에 관하여 도 2에 도시된다.
이것으로부터, 거의 모든 화합물이 1 μM 미만의 EC50 값 및 대조군 세포(염수로 처리됨)에서 PD-L1 발현 수준의 25% 미만의 표적 녹다운을 가짐이 보여질 수 있다.
실시예 3 - 네이키드 및 GalNAc 접합된 PD-L1 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하는 폴리(I:C) 유도된 마우스에서 시험관내 효력 및 효능 및 생체내 PD-L1 감소.
표 6의 올리고뉴클레오티드 접합체를 사용하는 MCP-11 세포에서의 투여량-반응 연구에서 효능 및 효력 시험을 시험관내 실험으로 수행하였다. 동일한 올리고뉴클레오티드 및 GalNAc 접합된 버젼(표 8 화합물 번호 755_2 내지 765_2)을 PD-L1 mRNA 및 단백질 발현을 감소시키는 이들의 능력에 대해 폴리(I:C) 유도된 C57BL/6J 암컷 마우스에서 생체내 시험하였다.
시험관내 검정
10% 말 혈청, 2 mM L-글루타민, 0.025 mg/mL 젠타미신 및 1 mM 나트륨 피루베이트가 보충된 DMEM(시그마 카탈로그 번호 D0819)에 현탁된 MCP-11 세포(원래 ATCC로부터 구입함)를 8,000 세포/웰의 밀도로 96-웰 환저 플레이트 내의 올리고뉴클레오티드(10 μL)에 첨가하였고, 5% CO2를 갖는 37℃의 가습된 인큐베이터에서 200 μL/웰의 최종 부피로 3일 동안 배양하였다. 올리고뉴클레오티드는 투여량-범위 농도(50 μM, 15.8 μM, 5.0 μM, 1.58 μM, 0.5 μM, 0.158 μM, 0.05 μM 및 0.0158 μM)로 선별되었다.
제조사의 지시에 따라 퓨어링크 프로 96 RNA 정제 키트(암바이온)를 사용하여 전체 mRNA를 추출하였다. 제조사의 지시에 따라서 M-MLT 역전사효소, 랜덤 10량체 레트로스크립트, RNase 억제제(암바이온) 및 100 mM dNTP 세트(인비트로겐, PCR 등급)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 유전자 발현 분석을 위하여, PD-L1(써모 피셔 사이언티픽; FAM-MGB Mm00452054-m1) 및 Gusb(써모 피셔 사이언티픽; VIC-MGB-PL Mm01197698-m1)에 대한 타크만 프라이머 검정으로 설정된 듀플렉스에서 타크만 패스트 어드밴스드 마스터 믹스(2X)(암바이온)를 사용하여 qPCR을 수행하였다. 상대적인 PD-L1 mRNA 발현 수준은 PBS 대조군 샘플(PBS-처리된 세포)의 %에서 잔류 PD-L1 발현의 %로서 표 9에 제시된다. EC50 계산을 그래프패드 프리즘 6에서 수행하였다. EC50 및 최대 PD-L1 녹다운 수준은 대조군(PBS) 세포의 %로서 표 13에 제시된다.
생체내 검정
C57BL/6J 암컷 마우스(20 내지 23 g; 군 당 5 마리 마우스)에 마우스 PD-L1에 대한 5 mg/kg 비접합된 올리고뉴클레오티드 또는 마우스 PD-L1에 대한 2.8 mg/kg GalNAc-접합된 올리고뉴클레오티드를 s.c. 주사하였다. 3일 후, 마우스에 10 mg/kg 폴리(I:C)(LWM, 인비보겐)를 i.v. 주사하였다. 마우스를 폴리(I:C) 주사 후 5시간에 희생시켰고, 간 샘플을 RNA 추출 동안 RNAlater(써모 피셔 사이언티픽)에 위치시키거나 단백질 추출 동안 드라이 아이스에 냉동하였다.
전체 mRNA를 제조사의 지시에 따라 퓨어링크 프로 96 RNA 정제 키트(암바이온)를 사용하여 균질화된 간 샘플로부터 추출하였다. cDNA를, 제조사의 지시에 따라 M-MLT 역전사효소, 랜덤 10량체 레트로스크립트, RNase 억제제(암바이온) 및 100 mM dNTP 세트(인비트로겐, PCR 등급)를 사용하여 합성하였다. 유전자 발현 분석을 위해, PD-L1 mRNA(써모 피셔 사이언티픽; FAM-MGB Mm00452054-m1) 및 TBP(써모 피셔 사이언티픽; VIC-MGB-PL Mm00446971_m1)에 대한 타크만 프라이머 검정으로 설정된 듀플렉스에서 타크만(등록상표) 패스트 어드밴스드 마스터 믹스 타크만 패스트 어드밴스드 마스터 믹스(2X)(암바이온)를 사용하여 qPCR을 수행하였다. 상대적인 PD-L1 mRNA 발현 수준은 염수 및 폴리(I:C)가 주사된 마우스로부터의 대조군 샘플의 %로서 표 13에 제시된다.
1x 홀트(Halt) 프로테아제 억제제 칵테일(EDTA-부재)(써모 피셔 사이언티픽)과 혼합된 100 mg 조직 T-PER(등록상표) 조직 단백질 추출 시약(써모 피셔 사이언티픽)에 대해 2 mL로 간 샘플을 균질화시킴으로써 간 균질 현탁액을 제조하였다. 제조사의 지시에 따라 쿠마시 플러스(Coomassie Plus)(브래드포드(Bradford)) 검정 시약(써모 사이언티픽(Thermo Scientific))을 사용하여 간 균질 현탁액 중 단백질 농도를 측정하였다. 간 균질 현탁액(40 μg 단백질)을 1x MOPS 실행 완충액 중에서 4 내지 12% 비스-트리스 플러스 폴리아크릴아미드 겔(써모 피셔 사이언티픽) 상에서 분리하고, 제조사의 지시에 따라 아디블롯 드라이(iBLOT Dry) 블로팅 시스템(써모 피셔 사이언티픽)을 사용하여 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 각각의 블롯을 64 kDa 밴드에 수평적으로 2개의 부분으로 절단하였다. 5% 탈지유 및 0.05% 트윈(Tween)20을 함유하는 TBS 중에서 차단한 후, 5% 탈지유 및 0.05% 트윈20을 함유하는 TBS 중에서 1:10,000 희석된 토끼 단클론성 항-빈쿨린(압캠(Abcam) 카탈로그 번호 ab129002)(상부 막) 또는 1:1,000 희석된 염소 다클론성 항-mPD-L1(알앤디 시스템스(R&D Systems) 카탈로그 번호 AF1019)과 함께 막을 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 0.05% 트윈20을 함유하는 TBS에서 세척하였고, 5% 탈지유 및 0.05% 트윈20을 함유하는 TBS 중에서 1:3,000 희석된 HRP-접합된 돼지 항-토끼 IgG(다코(DAKO))(상부 막) 또는 1:2,000 희석된 HRP-접합된 토끼 항-염소 IgG(다코)에 실온에서 1시간 동안 노출시켰다. 막의 세척 후, ECL 실렉트(select)(아머샴(Amersham) 지이 헬스케어)를 사용하여 반응성을 검출하였다. 올리고뉴클레오티드로 처리된 각각의 마우스 군의 경우, 빈쿨린 밴드에 관한 PD-L1 밴드의 강도를 염수 및 폴리(I:C)(대조군)가 주사된 마우스의 PD-L1/빈쿨린 밴드 강도와 비교함으로써 평가하였다. 결과를 표 13에 제시하고, 네이키드 및 접합된 올리고뉴클레오티드의 쌍에 의한 웨스턴블롯을 도 9의 A 내지 E에 도시한다.
[표 13]
마우스 PD-L1에 대한 올리고뉴클레오티드 접합체의 시험관내 및 생체내 효능.
+++: 대조군의 PD-L1/빈쿨린 밴드 강도와 유사함; ++: 대조군의 PD-L1/빈쿨린 밴드 강도보다 약함; +: 대조군의 PD-L1/빈쿨린 밴드 강도보다 훨씬 약함; nd = 측정되지 않음.
표 13의 데이터로부터, 올리고뉴클레오티드의 GalNAc 접합이 생체내 PD-L1 감소를 명백히 개선함을 알 수 있다. mRNA의 감소는 일반적으로 PD-L1 단백질의 감소와 관련된다. 화합물 번호 754_1을 제외하고는, 낮은 시험관내 EC50 값은 일반적으로 올리고뉴클레오티드가 GalNAc에 접합되는 경우 양호한 생체내 PD-L1 mRNA 감소를 반영한다.
실시예 4 - 폴리(I:C) 유도된 마우스로부터 분류된 간세포 및 비-실질 세포에서의 생체내 PK/PD
네이키드 및 GalNAc 접합된 올리고뉴클레오티드의 분포 및 PD-L1 mRNA 감소를 폴리(I:C) 유도된 마우스로부터 단리된 간세포 및 비-실질 세포에서 조사하였다.
C57BL/6J 암컷 마우스(군 당 n = 3)에 마우스 PD-L1 mRNA를 표적으로 하는 5 mg/kg 비접합된 올리고뉴클레오티드(748_1) 또는 7 mg/kg GalNAc-접합된 올리고뉴클레오티드(759_2)를 s.c. 주사하였다. 2일 후, 마우스에 15 mg/kg 폴리(I:C)(LWM, 인비보겐)를 i.p. 주사하였다. 폴리(I:C) 주사 후 18 내지 20시간에 마우스를 마취하였고, 5분 동안 15 mM 헤페스 및 0.38 mM EGTA를 함유하는 행크 균형 염 용액 및 이어서 12분 동안 콜라게나제 용액(0.17 mg/mL 콜라게나제 유형 2(워팅톤(Worthington) 4176), 0.03% BSA, 3.2 mM CaCl2 및 1.6 g/L NaHCO3을 함유하는 행크 균형 염 용액)을 사용하여 대정맥을 통해 1분 당 7 mL의 유량으로 간을 관류하였다. 관류 후, 간을 제거하고, 간 캡슐을 개봉하고, 간 현탁액을, 윌리암(William) E 매질을 사용하여 70 μm 세포-여과기를 통해 여과하였고, 세포 현탁액의 분획(혼합된 간 세포)을 추후 분석을 위해 제거하였다. 세포 현탁액의 나머지를 50 xg로 3분 동안 원심분리하였다. 상청액을 비-실질 세포의 추후 정제를 위해 수집하였다. 펠렛을 25 mL 윌리암 E 매질(1x 펜/스트렙(Pen/Strep), 2 mM L-글루타민 및 10% FBS(ATCC #30-2030)가 보충된 시그마 카탈로그 번호 W1878)에 재현탁하였고, 90% 퍼콜을 함유하는 25 mL 윌리암 E 매질과 혼합하였고, 간세포를 10분 동안 50 xg의 원심분리에 의해 침전시켰다. 윌리암 E 매질 중에서의 2회 세척에 이어서, 침전된 간세포를 윌리암 E 매질에 재현탁하였다. 비-실질 세포를 함유하는 상청액을 7분 동안 500 xg로 원심분리하고, 세포를 4 mL RPMI 매질에 재현탁하였고, 1,800 xg로 30분 동안 퍼콜의 2개의 층(25% 및 50% 퍼콜)을 통해 원심분리하였다. 2개의 퍼콜 층 사이의 비-실질 세포의 수집 후, 세포를 세척하고, RPMI 매질에 재현탁하였다.
전체 mRNA를, 제조사의 지시에 따라 퓨어링크 프로 96 RNA 정제 키트(암바이온)를 사용하여 정제된 간세포, 비-실질 세포 및 전체 간 현탁액(비-분별된 간 세포)으로부터 추출하였다. M-MLT 역전사효소, 랜덤 10량체 레트로스크립트, RNase 억제제(암바이온) 및 100 mM dNTP 세트(인비트로겐, PCR 등급)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 유전자 발현 분석을 위해, PD-L1(써모 피셔 사이언티픽; FAM-MGB Mm00452054-m1) 및 TBP(써모 피셔 사이언티픽; VIC-MGB-PL Mm00446971_m1)에 대한 타크만 프라이머 검정으로 설정된 듀플렉스에서 타크만 패스트 어드밴스드 마스터 믹스(2X)(암바이온)를 사용하여 qPCR을 수행하였다. 상대적인 PD-L1 mRNA 발현 수준을 염수 및 폴리(I:C)가 주사된 마우스로부터의 대조군 샘플의 %로서 표 10에 제시한다.
서열 5'-TACCGT-s-Bio-3'를 갖는 바이오티닐화된 캡쳐 프로브 및 서열 5'-DIG-C12-S1-CCTGTG-3'를 갖는 다이곡시제닌 접합된 검출 프로브를 사용하는 ELISA를 사용하여 올리고뉴클레오티드 함량 분석을 수행하였다. 상기 프로브는 포스포다이에스터 골격을 갖는 LNA만으로 이루어졌다. 간 샘플(약 50 mg)을, 1개의 5 mm 스테인레스 강 비드를 함유하는 2 mL 에펜도르프(Eppendorf) 튜브 중에서 1.4 mL MagNa 순수한 용해 완충액(로슈 카탈로그 번호 03604721001)에서 균질화시켰다. 균질한 용해물이 수득될 때까지, 샘플을 레취(Retsch) MM400 균질화기(메르크 유로랩(Merck Eurolab)) 상에서 균질화시켰다. 샘플을 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. 정의된 농도의 비접합된 안티센스 올리고뉴클레오티드 화합물(화합물 번호 748_1)을 비처리된 간으로 스파이킹하고, 이들을 샘플로서 가공함으로써, 표준을 생산하였다. 기대되는 샘플 올리고 함량(약 10배 이내)에 부합하도록 스파이크(Spike-in) 농도를 선택한다.
균질화된 샘플을 5 x SSCT 완충액(0.05%(v/v) 트윈-20을 함유하는 750 mM NaCl 및 75 mM 나트륨 시트레이트, pH 7.0) 중에서 최소 10배로 희석하였고, 캡쳐-검출 용액(5x SSCT 완충액 중 35 nM 캡쳐 프로브 및 35 nM 검출 프로브)을 사용하는 6회 2배 희석의 희석 시리즈를 수행하였고, 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. 각각의 웰에 100 μL를 갖는 96 웰 스트렙타비딘 코팅된 플레이트(눈크(Nunc) 카탈로그 번호 436014)에 샘플을 옮겼다. 플레이트를 천천히 교반하면서 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 2x SSCT 완충액으로 3회 세척하고, PBST(0.05%(v/v) 트윈-20을 함유하는 포스페이트 완충된 염수, pH 7.2, 새로이 제조됨)에 1:4,000으로 희석된 100 μL 항-DIG-AP Fab 단편(로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science), 카탈로그 번호 11 093 274 910)을 각각의 웰에 첨가하였고, 천천히 교반하면서 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 2x SSCT 완충액으로 3회 세척하고, 100 μL의 알칼리성 포스파타제(AP) 기질 용액(블루 포스(Blue Phos) 기질, KPL 제품 코드 50-88-00, 새로이 제조됨)을 첨가하였다. 색 강도를 천천히 교반하면서 30분 동안 항온처리한 후 615 nm에서 분광광도계로 측정하였다. 원 데이터를 판독기(Gen5 2.0 소프트웨어)로부터 엑셀 형식으로 보내고, 엑셀에서 추가로 분석하였다. 그래프패드 프리즘 6 소프트웨어를 사용하여 표준 곡선 및 로지스틱 4PL 회귀 모델을 생산하였다.
[표 14]
비접합된 및 GalNAc-접합된 올리고뉴클레오티드로 처리된 폴리(I:C) 마우스로부터의 전체 간 현탁액, 간세포 및 비-실질 세포에서의 PD-L1 발현 및 올리고 함량, n=3.
상기 결과는 네이키드(화합물 번호 748_1) 및 접합된(화합물 번호 759_2) 올리고뉴클레오티드가 전체 간 세포에서 PD-L1 mRNA를 동등하게 잘 감소시킴을 나타낸다. 단리된 간세포에서, 접합된 올리고뉴클레오티드의 효과는 네이키드 올리고뉴클레오티드의 효과보다 거의 5배 강하지만, 네이키드 올리고뉴클레오티드는 비-실질 세포에서 GalNAc-접합된 올리고뉴클레오티드보다 2배 강한 효과를 나타냈다. 간세포 및 비-실질 세포에서, PD-L1 mRNA 발현의 감소는 이러한 세포 유형에서 올리고뉴클레오티드 함량과 일부 정도까지 관련된다.
실시예 5 - 네이키드 및 GalNAc 접합된 PD-L1 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하는 AAV/HBV 마우스에서의 생체내 PD-L1 녹다운
본 연구에서, AAV/HBV 마우스를 네이키드로 처리하거나 GalNAc PD-L1 안티센스 올리고뉴클레오티드에 접합하고, PD-L1 mRNA 발현 및 HBV 유전자 발현을 간에서 평가하였다.
암컷 HLA-A2/DR1 마우스(5 내지 8주령)(군 당 5 마리의 동물)를 -1주에 비히클(염수), 네이키드 PD-L1 안티센스 올리고뉴클레오티드(5 mg/kg s.c.로 화합물 번호 752_1) 및 GalNAc PD-L1 안티센스 올리고뉴클레오티드(7 mg/kg s.c.로 화합물 번호 763_2)로 사전처리하였고, 이러한 투여량은 등몰 농도의 올리고뉴클레오티드에 상응한다. 마우스에 5 x 1010 vg AAV-HBV를 0주에 형질도입하였다(더욱 상세한 내용에 대하여 재료 및 방법 섹션의 AAV/HBV 마우스 모델의 기재내용을 참고함). AAV-HBV 형질 도입 후 W1부터 W4까지, 마우스는 1주 떨어져 제공된 PD-L1 올리고뉴클레오티드 또는 비히클(염수 용액)의 4회의 부가적인 s.c. 주사를 수용하였다.
혈액 샘플을 형질도입 전 1주 및 각각의 주사 후 1주에 채취하였다.
마지막 주사 후 1주에 마우스를 희생시키고, 이의 간을 PBS 관류에 따라서 제거하였다. 간을 더욱 작은 조각으로 절단하였고, 바로 냉동시켰다.
HBV 유전자 발현을 측정하기 위하여, 모든 핵산 키트 카탈로그 번호 965672에 대하여 키아앰프 원(QIAamp One)을 사용하여 키아젠 바이오로봇(Qiagen Biorobot)으로 DNA를 혈청으로부터 추출하였고, 혈청을 PBS에서 1:20 희석으로 희석하였고, 총 100 μL를 200 μL 완충액 AL에 용해시켰다. DNA를 키트로부터 100 μL로 용리하였다.
실시간 qPCR을 위하여 타크만 유전자 발현 마스터 믹스(카탈로그 번호 4369016, 어플라이드 바이오시스템스)를 1:1:0.5의 하기 프라이머 F3_코어, R3_코어, P3_코어(인터그레이티드 디엔에이 테크놀로지스(Integrated DNA Technologies), 모두 각각 100 μM로 재구성됨)를 첨가함으로써 제조된 프라이머 믹스와 함께 사용하였다:
정방향 (F3_코어): CTG TGC CTT GGG TGG CTT T(서열번호 784)
역방향 (R3_코어): AAG GAA AGA AGT CAG AAG GCA AAA(서열번호 785)
프로브 (P3_코어): 56-FAM-AGC TCC AAA/ZEN/TTC TTT ATA AGG GTC GAT GTC CAT G-3IABkFQ(서열번호 786)
HBV 플라스미드(유전자형 D, GTD)를 사용하는 표준 곡선을 1 x 109 카피/μL에서 개시하여 1 카피/μL로 하향되는 10배 희석을 사용하여 준비하였고, 반응 당 5 μL로 사용하였다.
각각의 반응을 위하여, 10 μL 유전자 발현 마스터 믹스, 4.5 μL 물, 0.5 μL 프라이머 믹스 및 5 μL 샘플 또는 표준을 첨가하였고, qPCR을 실행시켰다.
분석을 위하여, 표준 곡선을 사용하여 카피 수/mL/웰을 계산하였다. 결과는 표 15에 제시된다.
qPCR을 사용하여 PD-L1 mRNA 발현을 측정하였다.
세라믹 비드 및 1 mL의 트라이졸을 함유하는 2 mL 튜브(라이징 매트릭스(Lysing Matrix) D 튜브, 116913500, 엠피바이오(mpbio))에 첨가된 냉동된 간 조각으로부터 mRNA를 추출하였다.
프리셀리스 티슈 디스럽터(Precellys Tissue Disruptor)를 사용하여 간 조각을 균질화시켰다. 200 μL 클로로폼을 균질화물에 첨가하였고, 와동시켰고, 10,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리시켰다. RNA 함유 투명 상(약 500 μL)을 새로운 튜브에 옮겼고, 동일한 부피의 70% EtOH를 첨가하였다. 잘 혼합한 후, 용액을 RNeasy 스핀 컬럼 상으로 옮겼고, RNeasy 키트 매뉴얼 RNeasy 미니 카탈로그 번호 74104(퀴아젠)(RNA 분해 RNase-부재 DNase 세트, 카탈로그 번호 79254를 포함함)에 따라 RNA를 추가로 추출하였다. 50 μL H2O에서 용리하였다. 최종 RNA 농도를 측정하였고, 모든 샘플에 대해 100 ng/μL로 조정하였다.
제조사의 지시에 따라서 타크만 RNA-to-ct 1-단계 키트(카탈로그 번호 4392938, 써모 피셔)를 사용하여 7.5 μL RNA 상에서 qPCR을 수행하였다. 혼합된 프라이머는 함유된 PD-L1_1-3(프라이머 번호 Mm00452054_m1, Mm03048247_m1 및 Mm03048248_m1) 및 내인성 대조군(ATCB Mm00607939_s1, CANX Mm00500330_m1, YWHAZ Mm03950126_s1 및 GUSB Mm01197698_m1)을 사용하였다.
2^-ddct 방법을 사용하여 데이터를 분석하였다. 4개의 모든 내인성 대조군의 평균을 사용하여 dct 값을 계산하였다. PD-L1 발현은 내인성 대조군의 평균 및 염수의 %와 관련된다.
[표 15]
비접합된 및 GalNAc-접합된 올리고뉴클레오티드로 처리된 AAV/HBV 마우스에서의 PD-L1 mRNA 발현 및 HBV DNA, n=5.
이러한 결과로부터, 네이키드 및 GalNAc 접합된 올리고뉴클레오티드가 둘 다 AAV/HBV 마우스의 간에서 PD-L1 mRNA 발현을 감소시킬 수 있고, GalNAc 접합된 올리고뉴클레오티드가 약간 양호함을 알 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 둘 다 또한 혈청에서 HBV DNA의 약간의 감소를 야기하였다.
실시예 6 - AAV/HBV 마우스에서 T-세포 반응의 생체내 효과
본 연구에서, 파스퇴르로부터의 AAV/HBV 마우스를, PD-L1을 표적으로 하는 항체 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 네이키드이거나 GalNAc에 접합되었다. 치료 중에, 동물을 HBs 및 HBc 항원에 대한 DNA 백신으로 면역화시켜(재료 및 방법 섹션 참고) 항원 제시 세포에 의한 효율적인 T-세포 프라이밍을 보장하였다. 치료가 간 및 비장에서의 세포 집단 및 이러한 집단에 대한 PD-L1 발현에 영향을 주는 법, 및 HBV 특이적 T-세포 반응이 확인될 수 있는지 여부를 평가하였다.
치료 프로토콜:
암컷 HLA-A2/DR1 마우스를 하기 프로토콜에 따라 처리하였다. 연구를, 하기 표 16 및 17에 나타낸 바와 같이 투여 섭생법에 약간의 차이를 갖는 2개의 별개의 하위-연구로 수행하였다.
DNA 백신 및 항-PD-L1 항체를 재료 및 방법 섹션에 기술된 바와 같이 투여하였다. 사용된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 5 mg/kg의 화합물 번호 748_1(네이키드) 및 7 mg/kg의 화합물 번호 759_2(GalNAc 접합된)였고, 둘 다 피하 주사(s.c.)로서 투여되었다.
[표 16]
DNA 백신, 및 DNA 백신 + 항-PD-L1 항체에 의한 AAV/HBV 마우스 치료 프로토콜, 각각의 군 당 6 마리의 마우스.
이소타입 = 마우스 IgG 대조군 Ab, CaTx = 심장독, DNA = DNA 백신, Ab = 항-PD-L1 Ab, 및 * = 혈청 수집
[표 17]
DNA 백신 및 DNA 백신 + 네이키드 또는 접합된 PD-L1 올리고뉴클레오티드(ASO)에 의한 AAV/HBV 마우스 치료 프로토콜, 각각의 군 당 7 마리의 마우스.
DNA = DNA 백신, CaTx = 심장독, Ab = 항-PD-L1 Ab, ASO = 네이키드 PDL-1 올리고뉴클레오티드, GN-ASO = GalNAc-PDL-1 올리고뉴클레오티드, 및 * = 혈청 수집
희생 시, 각각의 군으로부터의 각각의 마우스의 혈액, 비장 및 간 단핵 세포를 수집하고, 적혈구를 고갈시켰다(용해 완충액, 비디 바이오사이언시스, 555899). 간 단핵 세포는 재료 및 방법 섹션에 기술된 바와 같은 특정 제법을 요구하였다.
세포 집단:
간에서, 세포계수를 사용하는 간 단핵 세포 상의 표면 표지(재료 및 방법 참고)에 의해 세포 집단을 분석하였다.
대조군(즉, 비히클 및 DNA-면역화된 군)과 비교하여 처리된 마우스의 비장 및 간에서의 NK 세포의 빈도에서 어떠한 유의한 변화도 나타나지 않았다. 표 18은, 네이키드 PD-L1 올리고뉴클레오티드(화합물 번호 748_1) 및 GalNAc 접합된 PD-L1 올리고뉴클레오티드(화합물 번호 759_2)로 처리된 군이 도 10A에 또한 제시된 각각의 대조군(즉, 비히클 및 DNA-면역화된 군)과 비교하여 T-세포에서의 유의한 증가를 가짐을 나타낸다. 이러한 증가는 CD4+ 및 CD8+ T-세포 집단(각각 표 18 및 도 10B 및 10C) 둘 다의 증가에 기인하였다.
[표 18]
백만의 세포에서 치료에 따른 간의 T-세포.
PD-L1 발현:
PD-L1 단백질의 발현을 희생 시 비장 및 간으로부터의 대식세포, B 및 T-세포 상에서 평가하였다. 표면 표지 항체 믹스(재료 및 방법 참고)에서 PD-L1 항체의 존재는 세포계수에 의한 PD-L1 발현 세포의 정량화를 가능하게 하였다.
비장에서, PD-L1을 발현하는 대식세포, B 세포 및 CD4+ T-세포의 %에서, 치료 사이에 어떠한 유의적인 차이도 관찰되지 않았다. PD-L1을 발현하는 CD8+ T-세포의 %는, 다른 치료(데이터는 제시되지 않음)와 비교될 때, 네이키드 PD-L1 올리고뉴클레오티드(화합물 번호 748_1) 및 GalNAc 접합된 PD-L1 올리고뉴클레오티드(화합물 번호 759_2)로 처리된 마우스에서 더욱 낮았다.
간에서, PD-L1은 주로 대조군(각각 조합된 2개의 비히클 및 DNA 백신접종 군, 도 11A)에서 32% 및 41%의 평균 빈도를 갖는 CD8+ T-세포 상에서 발현되었다. 네이키드 PD-L1 올리고뉴클레오티드 또는 GalNAc PD-L1 올리고뉴클레오티드에 의한 처리는 PD-L1을 발현하는 CD8+ T-세포의 빈도의 감소를 야기하였다(표 19 및 도 11A 참고). PD-L1을 발현하는 세포의 %의 유의한 차이는 또한, 이들 세포 유형이 CD8+ T-세포보다 PD-L1을 상당히 덜 발현하지만, ASO 치료 후 B 세포 및 CD4+ T-세포에 대해 나타났다(표 19 및 도 11B 및 11C 참고). 항-PD-L1 Ab에 의한 처리는 또한, 모든 세포 유형에서 PD-L1 발현의 명백한 감소를 야기하였다. 그러나, 이러한 감소가 치료에 사용된 항-PD-L1 항체에 의한 PD-L1 에피토프의 부분적인 봉쇄에 기인하여 표면 표지 항체 믹스 내의 PD-L1 검출 항체가 PD-L1에 결합하는 것을 방해하는 것이 가능하다. 따라서, 치료에 사용된 항-PD-L1 항체에 의한 PD-L1 하향 조절인 것으로 나타나는 것은 치료 항체와 검출 항체 사이의 에피토프 경쟁의 결과일 수 있다.
[표 19]
PD-L1 발현을 갖는 간 세포 집단의 %.
HBV 특이적 T-세포 반응:
전염증성 사이토킨을 생산하는 CD4+ 및 CD8+ T-세포 및 NK 세포를, IFNγ 및 TNFα 생산을 검출하는 세포내 사이토킨 염색 검정(재료 및 방법 섹션 참고)을 사용하여 검출하였다.
비장에서, 희생 시 어떠한 NK 세포도 검출가능하지 않았고, IFNγ 및 TNFα를 분비하는 소수의 CD4+ T-세포가 검출가능하였다(빈도 < 0.1%). 2개의 HBV 항원을 표적으로 하는 IFNγ-생산 CD8+ T-세포는 네이키드 PD-L1 올리고뉴클레오티드 또는 GalNAc PD-L1 올리고뉴클레오티드로 처리된 마우스 및 DNA 백신만을 수용하는 본 연구로부터의 마우스(데이터는 제시되지 않음)에서 검출되었다.
DNA-면역화된 HBV-담체 마우스의 간에서, 희생 시 어떠한 IFNγ-생산 NK 세포도 검출되지 않은 반면, 코어 또는 S2+S에 특이적인 IFNγ-분비 CD4+ T-세포는 소수의 DNA-면역화된 마우스의 간에서 낮은 빈도로 검출되었다(0.4% 미만, 데이터는 제시되지 않음). IFNγ를 생산하는 HBV S2+S-특이적 CD8+ T-세포는 다수의 DNA-면역화된 마우스에서 검출되었다. IFNγ-분비 CD8+ T-세포의 빈도는 DNA 백신 및 네이키드 PD-L1 올리고뉴클레오티드 또는 GalNAc PD-L1 올리고뉴클레오티드의 조합으로 처리된 마우스에서 증가한 반면, 항-PD-L1 항체에 의한 처리는 DNA 백신접종에 어떠한 명백한 추가적인 효과도 부가하지 않았다(도 12). 외피 및 코어 항원을 표적으로 하는 IFNγ-생산 CD8+ T-세포는 대부분의 DNA-면역화된 군(항-PD-L1 항체를 제외함)에서 검출되었다(도 12B). 대부분의 S2-S 특이적 T-세포는 IFNγ 및 TNFα를 둘 다 생산하였다(도 12C). 결과는 또한 표 20에 제시된다.
[표 20]
전체 IFNγ 또는 IFNγ + TNFα 세포 집단으로부터의 HBV 항원(S2-S 또는 코어) 특이적 CD8+ T-세포의 %.
실시예 7 - AAV/HBV 마우스의 혈청에서 HBV 항원 및 HBV DNA에 대한 생체내 효과
본 연구에서, 상하이로부터의 AAV/HBV 마우스(재료 및 방법 섹션 참고)를 GalNAc 접합된 PD-L1 안티센스 올리고뉴클레오티드 화합물 번호 759_2로 처리하였다.
치료가 비히클 처리된 동물과 비교하여 혈청내 HBe 및 HBs 항원 및 HBV DNA 수준에 영향을 주는 방법이 평가되었따.
치료 프로토콜:
재료 및 방법 섹션의 상하이 모델 하에 기술된 HBV 게놈(AAV/HBV)을 갖는 재조합 아데노-연관된 바이러스(AAV)로 감염된 수컷 C57BL/6 마우스를 본 연구에 사용하였다. 마우스(군 당 6 마리의 마우스)에 5 mg/kg의 안티센스 올리고뉴클레오티드 화합물 번호 759_2 또는 비히클(염수)(둘 다 피하 주사(s.c.)에 의해 투여됨)을 8주 동안 1주에 1회 주사하였다. 혈액 샘플을 치료 동안 매주 및 치료 후 6주에 수집하였다. HBV DNA, HBsAg 및 HBeAg 수준을 하기 기술된 혈청 샘플에서 측정하였다. 첫 번째 10주 동안의 결과를 표 21 및 도 13에 제시한다. 연구는 본원의 출원 시에 여전히 진행 중이었고, 이에 따라 남아있는 4주 동안의 데이터는 수득되지 않았다.
HBsAg 및 HBeAg 검출:
혈청 HBsAg 및 HBeAg 수준을 제조사의 프로토콜에 따라 HBsAg 화학발광 면역검정(CLIA) 및 HBeAg 클리아 키트(CLIA kit)(오토바이오 다이아그노스틱스 컴파니 리미티드, 중국 정저우 소재, 각각 카탈로그 번호 CL0310-2 및 CL0312-2)를 사용하여 감염된 AAV-HBV 마우스의 혈청에서 측정하였다. 간략하게, 50 mL의 혈청을 각각의 항체 코팅된 마이크로티터 플레이트로 옮겼고, 50 mL의 효소 접합체 시약을 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 진탕기 상에서 60분 동안 항온처리한 후, 모든 웰을 자동 세척기를 사용하여 세척 완충액으로 6회 세척하였다. 25 mL의 기질 A 및 이어서 25 mL의 기질 B를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 10분 동안 항온처리한 후, 엔비젼(Envision) 발광 판독기를 사용하여 발광을 측정하였다. HBsAg는 단위 IU/mL로 제공되고; 이때 1 ng HBsAg = 1.14 IU이다. HBeAg는 단위 NCU/mL 혈청으로 제공된다.
HBV DNA 추출 및 qPCR:
초기에, 마우스 혈청을 포스페이트-완충된 염수(PBS)로 10(1:10)의 인자만큼 희석하였다. MagNA 퓨어 96(로슈) 로봇을 사용하여 DNA를 추출하였다. 50 mL의 희석된 혈청을 200 μL MagNA 퓨어 96 외부 용해 완충액(로슈, 카탈로그 번호 06374913001)을 갖는 가공 카트리지에서 혼합하였고, 10분 동안 항온처리하였다. 이어서, "MagNA 퓨어 96 DNA 및 바이러스성 핵산 소용량 키트"(로슈, 카탈로그 번호 06543588001) 및 "바이러스성 NA 플라즈마 SV 외부 용해 2.0" 프로토콜을 사용하여 DNA를 추출하였다. DNA 용리 부피는 50 mL였다.
타크만 qPCR 머신(ViiA7, 라이프 테크놀로지스(life technologies))을 사용하여 추출된 HBV DNA의 정량화를 수행하였다. 각각의 DNA 샘플을 PCR에서 2회 시험하였다. 5 mL의 DNA 샘플을 384 웰 플레이트에 10 mL 타크만 유전자 발현 마스터 믹스(어플라이드 바이오시스템스, 카탈로그 번호 4369016), 0.5 mL 프라임타임(PrimeTime) XL qPCR 프라이머/프로브(IDT) 및 4.5 mL 증류수를 함유하는 15 mL의 PCR 마스터 믹스에 첨가하였고, 하기 설정을 사용하여 PCR을 수행하였다: UDG 항온처리(2분, 50℃), 효소 활성화(10분, 95℃) 및 PCR(변성을 위한 15초, 95℃ 및 어닐링 및 신장을 위한 1분, 60℃를 갖는 40회 사이클). DNA 카피 수를, ViiA7 소프트웨어에 의한 HBV 플라스미드 DNA 표준 곡선을 기준으로 Ct 값으로부터 계산하였다.
타크만 프라이머 및 프로브에 대한 서열(IDT):
정방향 코어 프라이머 (F3_코어): CTG TGC CTT GGG TGG CTT T(서열번호 784)
역방향 프라이머 (R3_코어): AAG GAA AGA AGT CAG AAG GCA AAA(서열번호 785)
타크만 프로브 (P3_코어): 56-FAM/AGC TCC AAA/ZEN/TTC TTT ATA AGG GTC GAT GTC CAT G/3IABkFQ 서열번호 786).
[표 21]
GalNAc 접합된 PD-L1 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 처리 후 AAV/HBV 마우스로부터의 혈청 내 HBV-DNA, HBsAg 및 HBeAg 수준.
본 연구로부터, GalNAc 접합된 PD-L1 안티센스 올리고뉴클레오티드 화합물 번호 759_2가 6주의 치료 후 혈청내 HBV-DNA, HBsAg 및 HBeAg 수준의 감소에 대한 상당한 효과 및 치료가 종료된 후 2주 이상 동안 지속되는 효과를 가짐을 알 수 있다.
실시예 8 - GalNAc 접합된 PD-L1 올리고뉴클레오티드를 사용하는 인간 1차 간세포에서의 시험관내 PD-L1 녹다운
게놈을 사용하여 1차 인간 간세포에서 PD-L1 전사체를 감소시키는 GalNAc 접합된 PD-L1 안티센스 올리고뉴클레오티드 화합물의 능력을 조사하였다.
세포 배양물
저온보존된 인간 간세포를 10% 우태 혈청, 페니실린(100 U/mL), 스트렙토마이신(0.1 mg/mL) 및 L-글루타민(0.292 mg/mL)이 보충된 WME에 약 5 x 106 세포/mL의 밀도로 현탁하고, 콜라겐-코팅된 24-웰 플레이트(벡톤 디킨슨 아게(Becton Dickinson AG), 스위스 알슈빌 소재)로 2 x 105 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 세포를 4시간 동안 사전-배양하여 세포 배양물 플레이트로의 부착을 가능하게 한 후, 100 μM의 최종 농도의 올리고뉴클레오티드에 의한 처리를 개시하였다. 사용된 올리고뉴클레오티드는 표 21 및 표 8에 제시되고, 비히클은 PBS였다. 시딩 매질을 315 μL의 혈청 부재 WME(페니실린(100 U/mL), 스트렙토마이신(0.1 mg/mL), L-글루타민(0.292 mg/mL)이 보충됨)로 대체하였고, PBS 중 35 μL의 1 mM 올리고뉴클레오티드 저장 용액을 세포 배양물에 첨가하였고, 세포 상에 24 또는 66시간 동안 방치하였다.
라이브러리 준비
전사체 발현 프로파일링을, 2 x 51 bp 페어링된 엔드 리드(paired end read) 및 견본 당 30 M의 최소 리드 깊이(Q 스퀘어드(squared) EA)를 갖는 시퀀싱 전량을 사용하는 일루미나(Illumina) 시퀀싱 플랫폼 상에서의 일루미나 가닥 mRNA 화학을 사용하여 수행하였다. 350 μL의 퀴아젠 RLT 완충액을 첨가함으로써 세포를 용해시키고, 무작위화 계획으로 기재하였다.
퀴아젠 RNeasy 미니 키트를 사용하여 mRNA를 정제하였다. mRNA를 정량화시키고, 아길런트 바이오애널라이저(Agilent Bioanalyzer)를 사용하여 완전성을 평가하였다. 단리된 RNA의 초기량 평가 시, 모든 샘플이 7.0 초과의 RIN 점수를 갖고 100 ng의 입력 품질 메트릭을 충족시킴을 관찰하였다.
시퀀싱 라이브러리를 100 ng의 전체 RNA로 시작하는 일루미나 TruSeq 가닥 mRNA 라이브러리 준비를 사용하여 모든 샘플에 대해 생성하였다. 최종 cDNA 라이브러리를 크기 분포에 대해 아길런트 바이오애널라이저(DNA 1000 키트)를 사용하여 분석하였고, qPCR(카파 라이브러리 콴트 키트(KAPA Library Quant Kit))에 의해 정량화시키고, 시퀀싱을 위한 준비에서 2 nM로 정규화시켰다. 표준 클러스터 생성 키트 v5를 사용하여 cDNA 라이브러리를 유동 세포 표면 및 cBot에 등온적으로 결합시켜 부착된 cDNA 구축물을 각각 약 1,000 카피의 클론성 클러스터까지 증폭시켰다. TruSeq SBS 키트를 사용하는 시퀀싱-바이-신테시스(sequencing-by-synthesis) 방법에 의해 DNA 서열을 측정하였다.
데이터 가공
길이 2 x 51 bp의 일루미나 페어링된-말단 시퀀싱 리드를, GSNAP 짧은 리드 정렬 프로그램(short read alignment program)을 사용하여 인간 기준 게놈 hg19 상에 매핑하였다. 삼툴스(SAMTOOLS) 프로그램을 사용하여 SAM-포맷 정렬을 분류된 정렬 BAM-포맷 파일로 전환하였다. hg19에 대한 상응하는 GTF 파일에 의해 특정된 NCBI RefSeq로부터의 엑손 주석에 근거하여 유전자 리드 수를 PD-L1에 대해 추정하였다. 각각의 샘플의 상이한 라이브러리 크기를 설명하는 정규화 단계를 DESeq2 R 패키지를 사용하여 적용하였다.
GalNAc 접합된 PD-L1 안티센스 올리고뉴클레오티드 화합물과의 항온처리 후 PD-L1 전사체의 감소를 표 22에 제시한다.
[표 22]
GalNAc 접합된 올리고뉴클레오티드와의 치료에 따른 인간 1차 간세포에서의 PD-L1 전사체 감소, n=4.
모든 5개의 GalNAc 접합된 안티센스 화합물은 비히클로 처리된 샘플과 비교될 때, 24 및 66시간 항온처리 후 유의한 PD-L1 전사체 감소를 나타냈다.
실시예 9 - HBV 감염된 ASGPR-HepaRG 세포에서 접합된 및 네이키드 PD-L1 안티센스 올리고뉴클레오티드의 EC50
2개의 네이키드 및 균등한 GalNAc 접합된 PD-L1 안티센스 올리고뉴클레오티드의 효력을 HBV 감염된 ASGPR-HepaRG 세포와 비교하였다.
세포주
HepaRG 세포(바이오프레딕 인터내셔널(Biopredic International), 프랑스 생-그레고리 소재)를 윌리암 E 매질(10% HepaRG 성장 보충제(바이오프레딕)가 보충됨)에서 배양하였다. 이러한 세포주로부터 인간 ASGPR1 및 ASGPR2를 안정적으로 과발현하는 HepaRG 세포주를, 렌티바이러스성 방법을 사용하여 생성하였다. 증식하는 HepaRG 세포를 CMV 프로모터 및 퓨로마이신 내성 유전자의 제어 하에 인간 ASGPR1 및 2를 코딩하는, 시리온 바이오텍(Sirion biotech)에 의해 주문 생산된 렌티바이러스(CLV-CMV-ASGPR1-T2a_ASGPR2-IRES-Puro)와 함께 MOI 300에서 형질도입하였다. 형질도입된 세포를 1 μg/mL 퓨로마이신과 함께 11일 동안 선택하였고, 이어서 이식유전자의 안정한 발현을 보장하기 위해 동일한 농도의 항생제에서 유지하였다. ASGPR1/2 과발현을 RT-qPCR에 의해 mRNA 수준에서(ASGPR1: 8,560배 대 비-형질도입된, ASGPR2: 2,389 배 대 비-형질도입된) 및 유동 세포분석 분석에 의해 단백질 수준에서 모두 확인하였다.
감염 전에 2주 이상 동안 1.8% DMSO를 사용하여 세포를 분화시켰다. HBV 유전자형 D를 HepG2.2.15 세포 배양물 상청액으로부터 유도하였고, PEG 침전을 사용하여 농축시켰다. HBV에 대한 시험 화합물의 활성을 평가하기 위하여, 96 웰 플레이트에서 분화된 ASGPR-HepaRG 세포를 20 내지 30의 MOI로 20시간 동안 HBV로 감염시킨 후, 세포를 PBS로 4회 세척하여 HBV 접종원을 제거하였다.
올리고뉴클레오티드 효력
하기 올리고뉴클레오티드를 25 μM로부터 0.4 nM(PBS 중 1:4 희석)까지의 연속적인 희석을 사용하여, 감염 후 7 및 10일에 HBV 감염된 ASGPR-HepaRG 세포에 첨가하였다. 세포를 감염 후 31일에 수확하였다:
제조사의 지시에 따라 MagNA 퓨어 96 시스템 상에서 MagNA 퓨어 96 세포 RNA 대용량 키트(로슈 다이아그노스틱스)를 사용하여 전체 mRNA를 추출하였다. 유전자 발현 분석을 위하여, RT-qPCR을 실시예 5에 기술된 바와 같이 수행하였다.
2^-ddct 방법을 사용하여 데이터를 분석하였다. 액틴B를 내인성 대조군으로서 사용하여 dct 값을 계산하였다. PD-L1 발현은 내인성 대조군 및 염수 비히클과 관련된다.
EC50 계산을 그래프패드 프리즘 6에서 수행하고, 표 23에 제시한다.
[표 23]
ASGPR-HepaRG HBV 감염된 세포에서의 EC50, n=4.
이러한 데이터는 PD-L1 안티센스 올리고뉴클레오티드의 GalNAc 접합이 EC50 값을 상당히 개선함을 명백히 나타낸다.
실시예 10 - 만성 HBV 환자로부터 유래하는 PBMC에서의 자극 T-세포 기능
네이키드 PD-L1 안티센스 화합물이 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 생체외 HBV 항원 자극 후에 만성적으로 감염된 HBV(CHB) 환자의 T-세포 기능을 증가시킬 수 있는지 여부를 조사하였다.
3명의 만성 HBV 감염된 환자로부터의 냉동된 PBMC를 해동하고, 100 μL 매질(RPMI1640 + 글루타맥스 + 8% 인간 혈청 + 25 mM 헤페스 + 1% 펜스트렙) 중 200,000 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 다음날, 세포를, 100 pg/mL IL-12 및 5 ng/mL IL-7을 함유하는 100 μL 매질 중 5 μM의 화합물 번호 466_1 또는 화합물 번호 640_1의 존재 또는 부재 하에 1 μM 펩믹스(PepMix) HBV 라지 외피 단백질 또는 1 μM 펩믹스 HBV 코어 단백질(표 9 참고)로 자극하였다(콘카나발린 자극을 단지 8일에 적용하였음). 4일 후, PD-L1 안티센스 올리고뉴클레오티드 처치를 50 IU IL-2를 함유하는 매질로 새롭게 하였다. 첫 번째 자극 후 8일에, 세포를 펩믹스 또는 5 μg/mL 콘카발린 A + PD-L1 안티센스 올리고뉴클레오티드로 24시간 동안 재자극하였다. 자극의 마지막 5시간 동안, 0.1 μL 브레펠딘 A, 0.1 μL 모넨신 및 3 μL 항-인간 CD-107(APC)을 첨가하였다.
24시간 후, 세포를 염색 완충액(PBS + 1% BSA + 0.09% 나트륨 아자이드 + EDTA)으로 세척하고, 표면 염색을 4℃에서 30분 동안 적용하였다[항-인간 CD3(BV 605), 항-인간 CD4(FITC), 항-인간 CD8(BV711), 항-인간 PD-L1(BV421), 항-인간 PD1(PerCP-Cy5.5) 및 라이브 앤 데드(Live and Dead) 염색(BV510)(비디 바이오사이언시스)]. 세포를 4℃에서 15분 동안 비디 고정 완충액에 고정하였다. 다음날 아침, 세포에 비디 펌/워쉬 완충액을 4℃에서 15분 동안 투과시키고, 세포내 염색을 4℃에서 30분 동안 수행하였다[항-인간 INFg(PE)]. 펌/워쉬 완충액에서 세척 후, 세포를 250 μL 염색 완충액에 용해시켰다.
FACS 측정을 비디 포테싸(BD Fortessa, 비디 바이오사이언시스) 상에서 수행하였다. 분석을 위하여, 전체 세포 집단을 먼저 살아있는 세포 상에서 염색하고(라이브 앤 데스(Live and Death) 염색, BV510), 이어서 CD3+(BV605) 세포 상에서 염색하였다. 이어서, CD3+ 세포를 CD107a+(APC) 대 IFNg+(PE)로서 도표화하였다.
결과는 표 24에 제시된다.
[표 24]
3명의 만성적으로 HBV 감염된 환자로부터 단리된 PBMC로부터의 CD3+ T-세포 상에서 PD-L1 ASO 치료의 효과.
이러한 데이터로부터, 항원 자극 자체가 CHB 환자(n=3)의 PBMC에서 T-세포 활성화(INFg 및/또는 CD107a를 발현하는 CD3+ 세포의 증가 %)를 유도할 수 있음을 알 수 있다. PD-L1 안티센스 올리고뉴클레오티드 CMP 466_1 또는 640_1의 첨가는 CD3+ T-세포 반응의 추가적인 증가를 야기하였다. 이러한 증가는 주로 HBV 외피 자극된 군에서 관찰되었다.
SEQUENCE LISTING
<110> F. Hoffmann-La Roche AG
<120> OLIGONUCLEOTIDES FOR REDUCTION OF PD-L1 EXPRESSION
<130> P33358-WO
<140> PCT/EP2017/055925
<141> 2017-03-14
<150> EP 16160149.7
<151> 2016-03-14
<160> 786
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20064
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 1
ggcgcaacgc tgagcagctg gcgcgtcccg cgcggcccca gttctgcgca gcttcccgag 60
gctccgcacc agccgcgctt ctgtccgcct gcaggtaggg agcgttgttc ctccgcgggt 120
gcccacggcc cagtatctct ggctagctcg ctgggcactt taggacggag ggtctctaca 180
ccctttcttt gggatggaga gaggagaagg gaaagggaac gcgatggtct agggggcagt 240
agagccaatt acctgttggg gttaataaga acaggcaatg catctggcct tcctccaggc 300
gcgattcagt tttgctctaa aaataattta tacctctaaa aataaataag ataggtagta 360
taggataggt agtcattctt atgcgactgt gtgttcagaa tatagctctg atgctaggct 420
ggaggtctgg acacgggtcc aagtccaccg ccagctgctt gctagtaaca tgacttgtgt 480
aagttatccc agctgcagca tctaagtaag tctcttcctg cgctaagcag gtccaggatc 540
cctgaacgga atttatttgc tctgtccatt ctgagaaccc aaaggagtcc taaaagagga 600
atggaggagc ctaagaataa aaatagtata ataaaacatt tcttagacac attgaccttg 660
gcctatgtca aagttcagtc tgggtttgtc ttataacaca aggagtaaaa gtaccattgt 720
tctacctctt tttttaatac ttgaaaaaaa tttactgtgg atgcttttct atgaattaaa 780
taaccttcta aaaaatgttt tcattgctgc attcgattag attgggtaac taaatgaaat 840
taattcctca ctgttgggta taaaggttat ttacagtggt tctgtcttag ccattcactg 900
aactcattgc atatatatct ctggaatatt gctgattgtt tccttcaagt aaacttagaa 960
gtgtaactac ttagtcaaag agcctgaata ttttaaaggc cttttgaaga aaactgaaaa 1020
tgctttccag aaaggatgta tcagttgaca atgacagtcg tcaacagtat ttaaggagaa 1080
ctatgatact ctgaagaaaa acttagcctt tctcagtaaa agtaggtagg cagaggccac 1140
atgacagcag ttagagtgtg gtcttcaagg aagtcacaga aatactgtgg ggaattgaaa 1200
ccccatgtgg aaaatgtaca agagtgtctc agtgtgactg agaaggaggt tgggcatggg 1260
gtttcatgga gtttaataaa gtttggtcac ttagtagagg tttaataaat caactgtctt 1320
aatctttgat cctacttaag aatttttttt ttgtttttgt agagatgggg ctcttgttat 1380
gttgcccagg ctgttctcga actcctagcc tcaggcgatc ctccctcctc aggctccaga 1440
agtcctggga ttactggcgg gagccaccat gcaggcctct tgctcctact tttgagaaag 1500
gaagtttaac cggttttttt tgtctttttt tttttttttt tgagacagag tctcactctg 1560
ttgcccatgc tggagtgcag tggtgcaatc tcagctcact gcctcccggg ttcaagtgat 1620
tctcctgcct cagcctcccg agtagctggg actacaggca cctgccacca cgcccagcta 1680
atttttgtat ttttagtaga aatggggttt caccatattg gccaggctga tctcgaactc 1740
ctgacctcag gtgatccgcc tgcctcggcc tcccaaagtg ctgggattac aggcatgagc 1800
cactgctcct ggctgcttaa ctttttctct atctcatcct cctacccatc ctacccttgg 1860
aagatagaga agtagtatta gttccatagt gttatactgg gcttccccca gggacaaacc 1920
cacttcccca acctgaatga gccatcactt cttccccagt ttacatttca ttgctcttta 1980
aatgtctcca ttcggatatg ggaattcaca tatggtcata attcttacct gaagaagatg 2040
tcagtcttct tctcttagac caactgccct gatatgaggt ttagaggtta aagaacatgt 2100
gtgtatttac atgatctttg tattctgcct tttcgtccct cactaatgac agctgcaccc 2160
caaggaaatg gagctgtgga agagagggtt tgataagaaa ttaagtaaat attggatcta 2220
atccatcacc ctccaggaag cctttattac tcctaaaaat ttcaaccaaa ttcattaaag 2280
gacaagaact ccaccagagt aggccataaa cattggcaaa attagttgta atccatgact 2340
agatttaatg tccctttgtt ttattcccat atggttataa tgctttgctt ggcattaggg 2400
gtattttaag ttttcttctg cctagtaagt gaatttgtgt ttataataca ataatcataa 2460
aatatcacat taatatttta taactgtaca gttataaaat attttataag taatatttat 2520
attttataag taatatttta taactgtaca gttaactctg gcccaaggaa aagatagtct 2580
gatagatgct gcagccccat tttagcaaat gtgacctcac aggcctgaat gccatcgcta 2640
ttccacatct acaggataga cggaaaggaa agaaataaaa aaataggtac ctaacactgg 2700
caagaggatg atgactcatg ttatttcact taaccttttt atcttttaac atgaaggact 2760
catacaggtt gataagaaac cagtgacata aacagaccaa aaaatgatca gatctttcaa 2820
attagcaaaa aaataatatt ttttaaacaa tgggtgaaaa tacagtgtaa cagtaccaat 2880
tatcaacatg tgttgagaac cagaaaaatg ttctttttct ttgatcagca acactatttg 2940
ggaaaatcta tcctcagggc ctagcctggg gccctggcac acagtaggca ctcaacgaat 3000
atttgctgaa cacacaaata cttatgatat tttaaaaaat tggcaacaat ctgataccta 3060
acaatagagg gattaaatat tatggaactg ttaaataaga tgcttatgaa taccatgcag 3120
taagatgggc aatatttatg ccataagctt taatgaaaca aatgggtatt aaatgtatga 3180
taaggttata aattactttt taaaagatta cagggaaaaa aattgaaaga tatacactga 3240
aatgtttttt gctcacagtg gtgacaaggt ttctcagcac tggcactgtt gacgttttag 3300
gctgtatgtc tttgctgtgg gaggctggcc tgtgcactgc agggtgtttg gcagcactct 3360
tggcctctgc ccctagatag caatagcagt cctccctcaa ccagcccaat tttgacaacc 3420
aaaaatgttt ccaggcatca ccagatgctc cctgggtgag agtgatgaaa tagtagggga 3480
ttttcccctt cttttcttat tttctgtaat tccattatat tactttaata ataaagaaaa 3540
aaacataaaa aataaacgaa tgttattatt ctacgtcagt ttggatgttt ggactccatt 3600
ttggggttct ttccattata tcacttggtc tgctaaacat tctacggttt ggtaaggtga 3660
agtgattcat gaaattttgg ttttattttt ttcctgatac taaaaataaa acattctttc 3720
acttggaaat ttggacacag aacaccaaaa aaaatccata atctcatctc tctttttctg 3780
tcttttcctt ccttttttcc ctttaaaaac aataaagagt gaaacctacc tgttctccct 3840
ctaatttaat tcctaaatat aatcactgtc aatatcttgg acatttcctg tgtctaaaca 3900
cacacacaca cttttttttt tcagcaaaag tggatttctg ctacatgtag tgttctgcaa 3960
cttactttct atgtgtttac aaaatcagta catgtacata tgctgaattc agtccttaat 4020
ggtattatat tttgtgaata taccaaaatt tgtttaacca cttagacaat ctaggatatt 4080
ctcagtttgc tgttatgagc aatgctcttc ctttacatat acagacatat atatatatat 4140
gtgtgtgtgt gtgtttttgt tttagtagga tagatttcta ggagagggtg aaaggtctta 4200
tgacatccgc atttacgatt gtaataggaa gtatcaaagt gccccctaaa gaaaaaaatc 4260
ctcccattag tgggtaagaa agcctatttg ttcatatctt cacaaacact aaatattaga 4320
aatatttaca attgtggtca agctcataag tgaaaatggt atttcatatc ttatattttt 4380
tattgtgaga ttgaacatct ttcatatgtt tacatgtcac ctgtatttct tattctctga 4440
actatatgtt atgacctttc actttttttc ctcatgggtt atgtgtagtt tgtatagttg 4500
tcttattgat tgttaggagc tatttatata ttaggaacat taatctcctg tcttatatat 4560
acgtggcatc gattagttga tcatttgtga gttcatgtct gtatacaaag attggagagg 4620
cactaagagg gaaaacttac ctctttctta tcaaagtttg taaatatatg tataacagaa 4680
gagggagaaa atattaataa atgcacagat tggctgaaat agagtataaa tcttttactc 4740
ccctacttca acataaactg caaaaggaga gtgacttttc tttcactctg acttccgtat 4800
tcctcatgct taaaatagtg cctagcacag aagaggtgct caatcagtgt ttgctaaacg 4860
aaataattag tcacatttca agcaggatga ctaaatgaag aatagaatct aggcagatac 4920
tctggaagag tggctgtgag tcattcatat cttagtatga attagtcaaa tccaactctc 4980
tccccttccc actccccact gttagtagaa gaatctgttt attgagagaa tagatttata 5040
atttagaata agtgagaggg gcagaagagg agattttgaa ggatggcacc tgaaggagga 5100
ctagcatggc tgagacagtg aagtggaagc cttgaatagc taaagggtaa gatgaaagta 5160
tttagctgta gggggaaaaa gcattgacag gttggaaaag taaaagtcag attctccttg 5220
ctctgaaatt ttgtacaggg caggttctac taggtatgtt acaatgcaga aaaaacatga 5280
aataattgag aggaatttgg tgcaatatta tcttcttggc ttcttttgag tgggcagatt 5340
tttttcacgg cctgtaacta taataaattt gaaacttctc atcttttagt aacttttttc 5400
acttaagttt atgtggctgt gggcaatgga atgaagatat tgaacttcca attccctgtt 5460
gggtttccac aattacaagt caatcatgac tggttattag aagactattt cagttagaac 5520
caccaagtcc catattgtca tattgtatgt ttaattatta agtgaagcag tcttcttttc 5580
gtgttttcca taattagggc attccagaaa gatgaggata tttgctgtct ttatattcat 5640
gacctactgg catttgctga acggtaagac accaaatcct tccattaggt tctatatttt 5700
aaatatttta accatgagtt taaaactaaa atgatcattt aaaatgcatg caattttctt 5760
atagagagaa cattctattc tttcttctac tttacacaat ggcaaagtct tctttctact 5820
ttacgcaatg ataaagttac ctgtgtcatt ttgtaaaaat atagagaata tagacaaatt 5880
gaaagacaca aaataatcta ttacccattt cccagggtta actactgaaa atatctgggg 5940
aaatggcctg tatgtataca tttatttgtt tgctttcaac aaggccaaga tcctttgatc 6000
tttcagtctt ggttgctctg tgacatgcct ttcctgatga ggatacttta aggaagaatt 6060
gtaagataca tggaaaatgt caggctaaca cagtactggc atcaccctgt gctctttcct 6120
gaactccata ccaatgtact tcttgccaga aaactgatca aaagtttagg gaagtaaaaa 6180
gagatgactg ttagaatcta ccattccctc tatgtaggaa gcaaataggt gtcctgtcaa 6240
aggacattct ggggatgtct acatgaaacc aagtctccct ggttgtaagg actccatctc 6300
catataatat ttatacagta atatatgttt ataaattgtg ggggcaactt gtttagctaa 6360
ttttattatt ctgctattgg gacactgtgt ctcagcatga gatatagtgt cccaaaacat 6420
atttcaagcc cattggataa aatatgtgtt tagcaagttc ttaaatataa tgataacata 6480
accgaccaga taaagtgatt tataaacgct gtgccaattt tgtaaatgtt tcgaggaatt 6540
ttcccttttc tgaagattgt ccttctttct ttttagcatt tactgtcacg gttcccaagg 6600
acctatatgt ggtagagtat ggtagcaata tgacaattga atgcaaattc ccagtagaaa 6660
aacaattaga cctggctgca ctaattgtct attgggaaat ggaggataag aacattattc 6720
aatttgtgca tggagaggaa gacctgaagg ttcagcatag tagctacaga cagagggccc 6780
ggctgttgaa ggaccagctc tccctgggaa atgctgcact tcagatcaca gatgtgaaat 6840
tgcaggatgc aggggtgtac cgctgcatga tcagctatgg tggtgccgac tacaagcgaa 6900
ttactgtgaa agtcaatggt aagaattatt atagatgaga ggcctgatct ttattgaaaa 6960
catattccaa gtgttgaaga cttttcattc ttgtaagtcc atacttattt tcaaacagaa 7020
cagcatagtc tgttcattca ttcattcaat tcatgaattc attcacataa ttatccaatt 7080
tcttgagcac ctatttgata gtcactggaa atccagagac aaacaacaca gagccatgtt 7140
ctacagtatg tacagttttc caaaaagaat ttctagtctt tactttttta ttacaaatgg 7200
aatacgtata cttgcaaata attcagatac tgtggaagag atcaaatgaa ttgcaaaagt 7260
gtccctcctc ccttcaccac tatctcccat ggcatgcaga gagagtaacc attatttgtg 7320
tgtccctcca gaaatttttt tattcaacta ctattttttt attttattag gtccgtcagt 7380
tttccttttt tgagcctctc tatatcaaat gcaaataaat atattcagaa caaaccccac 7440
tgtaaggttc acattaaaaa agacttgaag tcaccctatg aagacaaaaa ataatcacat 7500
taagtgtgaa agaacctatt cttccagtac aggataagcc atacttactg ggcatatatt 7560
catcttgaaa atctatactg atgttgtctt ggggaattga aaaggaacta ggagtgttag 7620
ttcctcggta ttgacccaca gttatgttat caggtcactt gagttcaaag ttttgtgttg 7680
gcactagcta agtaaaggaa aacacctctg ctttcattgt tgagtttcac agaattgaga 7740
gctgaaagga tcccaggcag gagcagctaa tccaaactcc cacaaagaac aaaaatcccc 7800
cagaggatct tctgttctta tatttcctgc aatggcgtcc ctgtcatatc ccacaatggc 7860
ctccctgcca tttggatatc ccttccatat cctgttgaaa ttactcccta atagtaagct 7920
gaaatctgcc cctctagttg tagtcttggg attatttcat ttacatgatg accttttaat 7980
atttgactag aattaaatca tctccccttg gtctttccat tcctgggcta actaccatca 8040
atctgagggc taacaataca agtagaaaaa gtatacattt gtcactgatc actgatcaat 8100
tattaatcaa tgatcactga taactataaa ctcaaaaaca aaatcatgtg gggattaaga 8160
gaaatgtatc agttttatgt tgtatttctg gtccctgata ctggctcagg taatgccact 8220
attgtcaaga agataccact tgtaaagtag atttaatttt cattatattt taccatatgc 8280
ttctccattc atgacatctc ttgagatgtt gtggtttata ctttcagttt ttctccagtc 8340
catccgcaaa tatcaggcat ctactgtgtt ccaagatatt aaagaaatca tcatgactta 8400
gcctcatcaa cagcattgct agatctggga tggaaaggaa gagtataatc ctggcagtca 8460
ggaagaaggc agcataaagt ataagtttct gcttccaaaa aaggtctctc atcagcctgt 8520
agggagtgtg tagggaaggg acagctgtcc ttgtagtagg gaagggtttt attcaggtcg 8580
tctgggctcc ataatatccc ttgtgtatct gcagtctcct ttgccatgga tcaacacaat 8640
aggaaatctt ccggcactga tggtttttcc aagggggagt tcttcctgga gcaaagcaaa 8700
tgaccaacca ggtttgagga cctgatttgt ttgacaattc cattttgtat tgtaaattac 8760
ttaattggca ttctactccc aatccatctt gtcatttgca tacagtggtt ttgggattga 8820
gttcagctat accaaaagtc tgaaccttct gcacttagaa caaggcaacc accaagcttc 8880
acttgcactg aggccgtgtc tccaatggaa atgaggcagc tggcttgcag gagcttccca 8940
actcagggaa gtagaactcc tgagtcacct ccatatgcaa atgatttcac agtaatgctg 9000
ttgaacttca cttcccatca cagcaaatgt gtggtaacat agcttcccca caggagttta 9060
ctcaccatgg tattttaaag gtgaaacatt tcaaaactga aatttgaaag aatttagttt 9120
tggattcact caattatcac tatcacttcg ggtgttattg cacctttctt gtttgtgagt 9180
ttaaatgcca gactctcagg ccactaactt tcaattaaaa gtgtttttct ttaatcgctg 9240
aacctaacag cagggaaaac gaaatgttca ttcagacttt cagaaccttc aatgagatta 9300
ggcagctgaa agatcaaagt gttgcatagt tgtcccgata aagctatttg gatcatatgg 9360
accaaatcga ctgctgtcat tccccaccaa ccccatctct ccccaaaatt cccagccctg 9420
tttaagtgtt ctctgtagca tttatctcta tctagtatat tgtgtagcat atcatatcat 9480
acttttctgt tttgtttatt gtctctctcc tcctagaata taaactccac aagcacaaag 9540
atttgggcct gttttataat attgttgcat ccccagggcc tgatatacag cagagtggtg 9600
gtacgaaaag agcacacaaa aaaatatttg ttgagtcaat gaatgaatga tttcctcaaa 9660
taggattagc ctaaaatttt ggaaacatga acagatttgg atatgtgaaa atttatttcc 9720
agactgttca tcaggaactg ttagcagctt ctaaagggta cactggagca gcagtagtaa 9780
aaggaggaag aggagcagct ctgctactgc tactatcgag tactactaca attagcactt 9840
gcttattctg tgtgttaggc cctgtactga acactctgtc taaattagtt catttcctcc 9900
tggaaatgac tctagggggt aagtgcttca tcatgtaaga tgagtatttt tcacattttg 9960
ttgtgtctga aatctgagtg tgtctttcaa tgatggaatc tttgattcca tgataagtgg 10020
tattattccc attttaagga tgaggaaact gaggtccaaa gaaattaagt aatttgccca 10080
aattcaccca gcctagaaaa tgataaagct agttctaaac ccaagcagat tagctctgaa 10140
gtctgggccc ttaataacca ctttttattg cctatatttg tacctctggt gtacgtatca 10200
agttatatgt tgacttcaaa actatcatga ccttttcttg gttttgattg tccaacatta 10260
gtatagtgtt ctgggtctgc aaaaattttg attactcatc tcatctgtaa aacattttga 10320
actcgtgtgt ttgtgcatgc acatttgtgt gtaattataa aaattttact ttctgttaat 10380
atataagttg tatcataaga aactgccgtt tttgaagagc aaaaaaaggt tgaatgttac 10440
cagttacatc tggttcaacc taatagacat ttgtacaaaa acagacattt taagaggttg 10500
aaataaaaat ttaataaaca atattttcag tttttactaa ttgtgatgct tcactatcat 10560
tagctaatat gtcaaggcat aatatacctt agggtgaact ttatcattaa caaaggtgga 10620
tggtgtcaat aatcttgagg tttgtgtttt tttatataac actgcgaggt ctaattaagt 10680
acttactgtt taccacctca tacagtggcc gataaaaagt gtcacttctg ctgtttcctc 10740
tgggttgtgc ttgaattatt agtattatct tcagtcctca gtttctttgt gggaaacttt 10800
ttaattagtt gtttaatttt gtaagatggt tagtttagtc aaaattagat aagagaattt 10860
gaaaatccgt agctacccca aagcaaccta cacataagaa ctattatttt tgtgttttga 10920
aatcataatt ttattgattt ccagtgtttc cactggtagt ggtttcattg atataggagt 10980
atcaaaacat cactcattat ttatttcagt ttcatttgat cctagccgtt ttgtattaac 11040
tctctgtgaa gaaattacct cacaaatcta ttgctgtcct tggtaaagga atggagaatt 11100
aaggctctag atcattagtg gttacactat agtattagaa gtaaaaaaaa gattatacca 11160
acaaaataag aacatgttaa tgtacttgta atgaataaac atgaataaag ctcttatgct 11220
atataggtgc actaaacaat ctactagaat tgtcagcaaa ctacgtatct taatcctgaa 11280
agggtcccaa accaatgatc taaaattgaa tcaaactttc ttccttgagc ataattactt 11340
aaatgattta ttaaaatagc cagcatttaa aagcttaaaa tgtaaatatc ataatgtggt 11400
atcctagata gcatcccaga acagaaaaag gatattaggg aaaaactgga ggaatggaat 11460
aaattatgca gtttagttat taataatgta ctaacgtcct tagttatgac gattgtacca 11520
tggtaatgta agatactaac aatagaggaa accgggtaag gagtatacag taactctata 11580
ctatctttgc aacttttttg taaatttaaa acttctaaaa taaagaacaa atttaaacat 11640
taaaaagtat caccaggaac atatatcact gtttacagat gaaatactat gtattttcat 11700
atctaatttc tgatcattga cttcaaatca gaaaagtgaa tgacacctca aaatcaggtt 11760
ttctgtttac tgaagtctaa gaaaagaaag cataccagct ggagagattc atgtttataa 11820
agacagattt ataacaacaa aaataaaata tccaagaata aatttaagaa gaagcacttt 11880
actgagaaac atatgaaaac ctgaacaaat ggagagggat attttgtatt tgaatagaaa 11940
gacttctggt ttaaagataa ttctctttaa attatttttt gtagaaattt aaggggtaca 12000
agagcagtgt tgtcacatgg atatattaca tagtggtgaa gtctggggtt ttagtgtaaa 12060
ttaatcttta cattttgttt gagcccaata aatgtaccaa catgattttt atagaaagat 12120
agtcattcct attaatccaa acttgtccca actttgaatt gaattgaggc agagctagca 12180
ggtgttcccc acggctgagg catctgaaca ttaagcatat ccctctgaga accagcctgc 12240
attgatactc tttctaatgt ggacagcatc aagctatgta cgtagttctg tgctcagcaa 12300
aagccctgac ttctttttgt ttatgtccta gccccataca acaaaatcaa ccaaagaatt 12360
ttggttgtgg atccagtcac ctctgaacat gaactgacat gtcaggctga gggctacccc 12420
aaggccgaag tcatctggac aagcagtgac catcaagtcc tgagtggtaa gaccaccacc 12480
accaattcca agagagagga gaagcttttc aatgtgacca gcacactgag aatcaacaca 12540
acaactaatg agattttcta ctgcactttt aggagattag atcctgagga aaaccataca 12600
gctgaattgg tcatcccagg taatattctg aatgtgtcca ttaaaatatg tctaacactg 12660
tcccctagca cctagcatga tgtctgccta tcatagtcat tcagtgattg ttgaataaat 12720
gaatgaatga ataacactat gtttacaaaa tatatcctaa ttcctcacct ccattcatcc 12780
aaaccatatt gttacttaat aaacattcag cagatattta tggaatatac cttttgttcc 12840
atgcattgta gtactcattg gatacacata gaataataag actcagttca cactcttcag 12900
gaaacagata aaaaactaag aaacaaacaa aaaacaggca atccaacacc atgtgggaaa 12960
tgctttcata gccgggaaac ctggggaata cctgagagga atactcaatt caggccttgt 13020
ttcaggaatc caaatcctgg cacatcagag ctgcttccct ctttccaggg tggcaggaaa 13080
taaatggaac atatttttct atcttatgcc aaacatgagg gaccctttct ccccggtgcc 13140
tctcccaagg tagtctacaa tatttcaact ctagcagtct gcttagtgca tagaacatga 13200
ggctgtgtgt ccctgggcaa attactagac ttctgtgtgc ttcactttcc ctgtaggatt 13260
ataatctact gagcaagctt attgtaaggg tcagattagc aacagtgtat gaaaatgatt 13320
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ggtagggtgg gagacagagt ctgatgagag gctcagaatg tgaaagaaag tgaggcgagt 13440
gagcatgata tttaatataa acacaaagat attctgagaa gagctgctca ctgccccctc 13500
ccccaataca tgttgatagg aaaatgccac gtacttcagc aaaaacaact gaaaaattag 13560
atagaaaagt caatcaatag gaaaagataa tccaggacgg tgttgtgaac agaaagaggg 13620
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caacttactt gttgggtggc ctacagtaac tcacctaact gcactgagtc tgtttcctca 13800
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ctgttgttgt gtctttaaag tttcacctgg gtagtcaaag atggatcatg ggtctcagtg 13980
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catctgtgta ccatgggacc ccctttcctc ctgcatggta ccccagacaa ggagcctagt 14100
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ctatattaaa gaatgcaaga ggggccagga gcggaggctc atgcctgtaa tctcagcact 14340
ttgggaggcc aaggtgggca gatcacttga ggtcaggagt ttgtgaccag cctggccaac 14400
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tgtaatccca gctactcggg agactgaggc acaagaattg cttgaacctg ggaggcggaa 14520
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cctcaaaaaa aaaaaaaaaa agcaagagga agtgaaataa tcaaggccgc catttaatag 14640
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ttcccatcaa aattttatct ttagtcagtt tgttttcgtt ttgttttgtt tttcagaact 15000
acctctggca catcctccaa atgaaaggac tcacttggta attctgggag ccatcttatt 15060
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atattcaaat aatttcctcc catttaagat gagtcagagt aaataattcc tccaatactt 15660
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ggaaagtagt gttaactgag agagtagaga taagctgttt ccaaaaatta tattcttaac 15840
aggactgaga tagccagaat ataaggatca agtttcaatg acagtaagat cctgagatgg 15900
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cctcatttta cagtagagaa aacagagggt caagaagata atgtaaagtg cccaagaaca 16800
cacagctgat cacaaaaatc aagcttgggg gccattagcc taaccacaga cccttactct 16860
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gttttccagg atatcatgta aggataattg ggtacaaata taacctgctg ctttctctca 17220
tttcaaattt atcatttatc atatcagcaa ctatgagtta tgttttttat tagatttctt 17280
gttacttttt ccccagacca cttcccatga aattaatata ctattatcac tctccagata 17340
cacatttgga ggagacgtaa tccagcattg gaacttctga tcttcaagca gggattctca 17400
acctgtggtt taggggttca tcggggctga gcgtgacaag aggaaggaat gggcccgtgg 17460
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gaggaggaga atgaagaaag atggagtcaa acagggagcc tggagggaga ccttgatact 17580
ttcaaatgcc tgaggggctc atcgacgcct gtgacaggga gaaaggatac ttctgaacaa 17640
ggagcctcca agcaaatcat ccattgctca tcctaggaag acgggttgag aatccctaat 17700
ttgagggtca gttcctgcag aagtgccctt tgcctccact caatgcctca atttgttttc 17760
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ttattttgag tctgtgaggt cttcttgtca tgtgagtgtg gttgtgaatg atttcttttg 17880
aagatatatt gtagtagatg ttacaatttt gtcgccaaac taaacttgct gcttaatgat 17940
ttgctcacat ctagtaaaac atggagtatt tgtaaggtgc ttggtctcct ctataactac 18000
aagtatacat tggaagcata aagatcaaac cgttggttgc ataggatgtc acctttattt 18060
aacccattaa tactctggtt gacctaatct tattctcaga cctcaagtgt ctgtgcagta 18120
tctgttccat ttaaatatca gctttacaat tatgtggtag cctacacaca taatctcatt 18180
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gaagcaaaca gattaagtaa cttgcccaaa ccagtaaata gcagacctca gactgccacc 18300
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aattccggca gtgtaccttg actgctagct accctgtgcc agaaaagcct cattcgttgt 19500
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tctactcagt ctattcctaa gtcctaactc ctccttgtgg tgttggattt gtaaggcact 19860
ttatcccttt tgtctcatgt ttcatcgtaa atggcatagg cagagatgat acctaattct 19920
gcatttgatt gtcacttttt gtacctgcat taatttaata aaatattctt atttattttg 19980
ttacttggta caccagcatg tccattttct tgtttatttt gtgtttaata aaatgttcag 20040
tttaacatcc cagtggagaa agtt 20064
<210> 2
<211> 20261
<212> DNA
<213> macaca fascicularis
<400> 2
gtaaaatcaa ggtgcgttca gatgttggct tgttgtaaat ttctgtttat attaataaca 60
taccaaatgt ggatttgttt taatcttcgg aactctttcc ggtgaaaacc tcatttacaa 120
gaaaactgga ctgacaggtt tcactttctg tttcatttct atacatagct ttattcctag 180
gacaccaaca ccactcgcta cccaaactga aagcttcccc gattccgccg aaggtcagga 240
aagtccaatg ccgggcaaac tggatttgct gccttgcgca gaggtgggcg ggaccccgcc 300
tccgggccgg gcgccaagtt gagcagctgg cacgcctcgc gaagccccag tcctgaagcc 360
ccagtcctgc gctgcttccc gaggctccgc accagccgcg cttctctctg cctgcaggta 420
gggagcgttg ttcctccgca ggtgcccacg gcccagcatc tctggctaac tcgctgggca 480
ccttaggacg gaggatctct acaccctttc tttgggatgg agagaggagg agggaaaggg 540
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atgcatctgg gcttcctcca ggcgcaattc agttttgctc taaaaataat ttatacctct 660
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gaatatagct ctgatgctag gctggaagtc tggacacggg tcctagtcca ccgtcagctg 780
cttgctagta atatgacttg tgtaagtcat cccagctgca gcagataagt aagtctcttc 840
ctgcgctaag cacgtccagg acccctgaac ggaatttatt tgctctgtcc attctgaaaa 900
cccaaaggag tcctaaaaga ggaatggagg agcctaagaa taaaaatagt ataataaaac 960
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ataaggagta aaagtaccat tgttctacct ctttttttaa tacttgaaaa aaaatttact 1080
gtagatgctt ttctattaat taaataacct tctaaaaaat gtttttagtg ctgcattcga 1140
ttaggttgga taactaaatg aaattaattc ctcactgttg ggtataaagg ttatttacag 1200
tggttctgtc ttagctattc actgaacatc attacataga tatctctgga atattgctga 1260
ttgtttccgt caataaactt agaagtgtaa ctacttagtc aaagagactg aatattttaa 1320
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tcacatgtgg tcataattct tacctgaaga agactgacgt cttcttctct tagaccaact 2340
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gggtttgatg agaaagtagg taaatattgg atctaatcca tcatcttcca ggaaacctcc 2520
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cataaacatt ggcaaaatta gttgtaatct atgactagat ttaatgtccc tttgttttat 2640
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tacagtgtaa cagtaccaaa tatcaacatg tgtcaagaac cagaaaaatg tttgttttct 3060
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cagtaggcac tgaacaaata tttgctgaac acacacatac ttatgatatt tttaaaattg 3180
gcaacaatcc aatacccaat aatagaggaa ttaaatatta tagaactgtt caataagatg 3240
cttacgaata tcatgcagta agatgggcaa tatttatatc ataagcttaa atgaaacaaa 3300
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tgaaagatat atactgaaat gctcacagtg gtgacaaggt tccccagcct tggcactatt 3420
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aaggaaaaaa cataaaaaat agatgaattt attattctac ctcagtttgg atgtttggac 3720
tccctttggg ggttctttcc attatatcac ttggtctgct aaacagtcta tggtttggca 3780
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tcattcgctt gaaaatttgg acacagaaca ccaaaaaaaa tccataatct catctctctt 3900
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cctccaattt aattcctaaa tataatcact gttaacatct tggacatttc ctgtgtctaa 4020
acacacatac tcactttttc ttttttttag caaaaagtgg atttctgcta catgtagtgt 4080
tccgcaactt cctacatgtt tacaaaatca gtacatttac atatgctgaa ttcagtcctt 4140
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ccagataagg tgatttttaa atgctgtgcc aactttataa atgttttgag gaattttccc 6660
ttttctgaag gttattcttc tttcttttta gcatttactg tcacggttcc caaggaccta 6720
tatgtggtag agtatggcag caatatgaca attgaatgca aattcccagt agaaaaacaa 6780
ttagacctga cttcactaat tgtctattgg gaaatggagg ataagaacat tattcaattt 6840
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<220>
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<223> n is a, c, g, or t
<400> 3
ctgaaagctt ccccgattcc gccgaaggtc aggaaagtcc aatgccgggc aaactggatt 60
tgctgccttg cgcagaggtg ggcgggaccc cgcctccggg ccgggcgcca agttgagcag 120
ctggcacgcc tcgcgaagcc ccagtcctga agccccagtc ctgcgctgct tcccgaggct 180
ccgcaccagc cgcgcttctc tctgcctgca ggtagggagc gttgttcctc cgcaggtgcc 240
cacggcccag catctctggc taactcgctg ggcaccttag gacggaggat ctctacaccc 300
tttctttggg atggagagag gaggagggaa agggaaggcg atggtctagg gggcagtaga 360
gccaattacc tgttggggtt aataagaaca ggcaatgcat ctgggcttcc tccagcgcaa 420
ttcagttttg ctctaaaaat aatttatacc tctaaaaata aataaggtgg gtagtatagg 480
ataggtagtc attcttatgc gaccgtgtgt tcagaatata gctctgatgc taggctggaa 540
gtctggacac gggtcctagt ccaccgtcag ctgcttgcta gtaatatgac ttgtgtaagt 600
catcccagct gcagcagata agtaagtctc ttcctgcgct aagcacgtcc aggacccctg 660
aacggaattt atttgctctg tccattctga aaacccaaag gagtcctaaa agaggaatgg 720
aggagcctaa gaataaaaat agtataataa aacatttctt agacaggttg accttggcct 780
atgtcaaagt tcagtctggg tttgtcttat aacataagga gtaaaagtac cattgttcta 840
cctctttttt taatacttga aaaaaaattt actgtagatg cttttctatt aattaaataa 900
ccttctaaaa aatgttttta gtgctgcatt cgattaggtt ggataactaa atgaaattaa 960
ttcctcactg ttgggtataa aggttattta cagtggttct gtcttagcta ttcactgaac 1020
atcattacat agatatctct ggaatattgc tgattgtttc cgtcaataaa cttagaagtg 1080
taactactta gtcaaagaga ctgaatattt taaaggcatt ttgaagaaaa ctgaaaatgc 1140
tttccagaaa ggatgtatca gttgacaatg atggttgtca acagtattta aggagaacta 1200
tgatactctg aagaaaaact tagcctttct cagtagaagc aggtaggcag aggccacatg 1260
acagcagtta gagtgtggtc ttcaaggaag tcacagaaat actgtgggga attgaaaccc 1320
caagtggaaa atgtacaaga gtgtctcagt gtgactgaga aggaggttgg gcttggggtt 1380
taacttaaga attttttctt ttcttttgtg gagatagggc ttttgttatg ttacccaggc 1440
tggtcttgaa ctcctagcct caggcgatcc tcccgcctca ggctgcagaa gtcctgggat 1500
tactggccgg agccaccatg caggcctctt gctcctactt ttgagaaagg aagcttaacc 1560
tttttttttt gtttgttttt gttttttgtt ttttttgtag acgagtctca ctctgttgcc 1620
caagctggag tgcagtggtg ccatctcagc tcacagcnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1680
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1740
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1800
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1860
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ngactttttc tctatctctt ccttctaccc atcctaccct 1920
tggaagatag agaagtaata tcagttccat cgtgttatac tgggcttccc ccagggacaa 1980
acccacttcc ccaacctgaa tgagccatca cttcttcccc agtttacatt tcattgctct 2040
ttgaatgtct ccgttcggat atgggaattc acatgtggtc ataattctta cctgaagaag 2100
actgacgtct tcttctctta gaccaactgc cctgatgtga ggtttagagg ttaaagaaca 2160
tgtgtgtatt tacatgatct ttgtattctg ccttttcgtc cctcactaat gacagctgaa 2220
ccccaaggaa atagagctgt ggaggagagg gtttgatgag aaagtaggta aatattggat 2280
ctaatccatc atcttccagg aaacctccat tacttctaaa aatttcaacc aaattcgtta 2340
aaggacaaga actccaccag agtagggcca taaacattgg caaaattagt tgtaatctat 2400
gactagattt aatgtccctt tgttttattc acatatggtt ataatgcttt gcttggaatt 2460
aggggtattt taagttttct tctgcctagt aagtgtattt gtgcttataa tacaataatt 2520
ataaaatatc acattaatat tttataactg tacagttaac tctggcccaa ggaaaagata 2580
gtccggtaga tgctgcagcc tgattttgta tctaaccctg gcaagaggat aatgactcat 2640
gttatttcac ttaccctttt tatcttttaa catgaagggc tcatataggt caataagaaa 2700
ccagtgatat aaacagacca aaaaatgatc agatctttca cnnnnanana aaaaaaatat 2760
ttttaaacaa tacccaactg ggtgaaaata caatgtaaca gtaccaaata tcaacatgtg 2820
tcaagaacca gaaaaatgtt tgttttcttt gatcagcaac actatttgag gaaatctatc 2880
ctcagggcct agcctggggc ctggcacaca gtaggcactg aacaaatatt tgctgaacac 2940
acacatactt atgatatttt taaaattggc aacaatccaa tacccaataa tagaggaatt 3000
aaatattata gaactgttca ataagatgct tacgaatatc atgcagtaag atgggcaata 3060
tttatatcat aagcttaaat gaaacaaatg ggtattaaag gtatggtaag gttataaatt 3120
actttttaag agattaaagg gaaaagactg aaagatatat actgaaatgc tcacagtggt 3180
gacaaggttc cccagccttg gcactattga cattttgggc tatgtctttg ctgtgggagg 3240
ctggcctgtg ctctgcagga ggtttggcag cactcttggt ttctacccct agatagcagt 3300
agcaaccctc cctcaaccag cccaattttg acaaccaaaa atgtttccag gcatcaccag 3360
attctccctg ggtgagagtg atgaaacagt aggtgatttt ccccttcttt tctcattttc 3420
tgtaattttg tcacattacg ttaataataa ggaaaaaaca taaaaaatag atgaatttat 3480
tattctacct cagtttggat gtttggactc cctttggggg ttctttccat tatatcactt 3540
ggtctgctaa acagtctatg gtttggcaag gtgaaatgat tcatgaaatt ttgtttttat 3600
tttttacctg atactaaaag taaaacattc attcgcttga aaatttggac acagaacacc 3660
aaaaaaaatc cataatctca tctctctttt tctgtctttt ccttcctttt ttccctttaa 3720
aaacaagagt gaaaacctac cggttctccc tccaatttaa ttcctaaata taatcactgt 3780
taacatcttg gacatttcct gtgtctaaac acacatactc actttttctt ttttttagca 3840
aaaagtggat ttctgctaca tgtagtgttc cgcaacttcc tacatgttta caaaatcagt 3900
acatttacat acgctgaatt cagtccttaa tggtattata ttttgtgaat ataacaaaat 3960
ttatttaacc acttagacaa tctaagatat tctcagtttg ctgttatgag caatgctctt 4020
cctttacata tacatatata tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtt 4080
ttagtaggat agatttctag gagagggcga aatgtcatat gacatccaca tttacaattg 4140
taataggaag tatcaaagtg ccccctaaaa aaaaaaattc ctcccattag tgtgtgagaa 4200
agcctatttg ttcatatctt cacaaacact aaatattaga aatatttaca attgtgttca 4260
agctaagaag tgaaaaatgg tatttcatat cttataattt ttgttgtgag attgaacata 4320
tttcctatgt ttacatgtca cctgtatttc ttattctctg aactatacgt tatgaccttt 4380
cacttatttt cctcatgggt tatgtgtagt ttgtgtagtt gtcttattga ttgttaggag 4440
ctatttatat attaggaaca ttaatctcct gtcttatatg tatgtggcat tgattagttg 4500
atcatttgtg agttcatgtc tgtatacaaa gattagagag gcagtaagag ggaaaactta 4560
cctctttctt atcaaagttt gtaaatatat gtataacaga agagagagaa aacattaata 4620
aatgctgaaa taaagtataa atttttactc cactacttca acataaacta caaaaggaga 4680
gtgacttttc tttcatgctg acttccatat tccccatgcc taaaatagtg cctagcacag 4740
aagaggtgct caatcagtgt ttgnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 4800
nnaaatgaag aatagaatct aggcagatac tctggaagag tgactgtgag tcattcatgg 4860
tcttggtatg aattagtcaa atccagcttt ctccccttcc cactccccac tgttagtaga 4920
ataatctgtt tattgagaga atagatttat aatttagaat aagaggggca gaagaggaga 4980
ttttgaagga tggcacctga aggaggacta gcatggctga gatagtgaag tggaagtctt 5040
ggaaagctaa agggtaagat gaaagtattt agccgtaggg ggaaaaagca ttgacaggtt 5100
ggaaatgtaa aagtcagatt ctccttgctt tgaaattttg tacagggcag gttctactag 5160
gtatgttaca atgcagaaaa aacatgaaat agttgagagg aatttggtga aatattatct 5220
tcctggcttc ttttgagtga gcagattttt ttcagggcct gtaactataa taaatttgaa 5280
acttctcatc ttttagtaac ttttttcact taagtttatg tggctgtggg caatggaatg 5340
aaggtattga acttcctatt ccctgctggg tttccacaat tacaagtcaa tcatgactgg 5400
ttattagaag actatttcaa ttagaaccac caagtcccat aatgtcatat tgtgtgttta 5460
attattaagt aaagcagtct tctttttgtg ttttccataa ttagcacatt ccagaaagat 5520
gaggatattt gctgtcttta tattcacgat ctactggcat ttgctgaatg gtaagacacc 5580
aaatccttcc attaggttct atattttaaa tattttaacc atgagtttaa aactaaaatg 5640
ataatttaaa atgcatgcaa ttttcttata gagagaatat tctcttcttt cttctacttt 5700
acacaatgac aaagtctttc ttctgcttta cacaatgata aagctccctg tgtcattgtg 5760
taaaaatata gagaatatag acaaattgaa agacacaaaa taatctatta cccatttccc 5820
agggttaact actgaaaata tctggggaaa tggcctgtat gtatatattt atttgtttgt 5880
tttcaacaag gccaggatct ttcaatcttt caatcttggt tgctctgtga catgcctttc 5940
ctgatgagaa tactctaagg aagaattgta ggatacatgg aaaatgtcag ggtaacacag 6000
tactggcacc accctgcggt cctttctgaa ctccatacca atgtacttct tgccagaaaa 6060
ctgatcaaaa gtttagggaa gtaaaaagag atgttagaat ctaccattcc ctctatgtag 6120
gaagcaaata ggtgtccagt caaaggacat tctggggatg tctacatgaa accaagtctc 6180
ctggttgtaa gtactccatc tccatataat atttctacag taatatatgt ttataaattg 6240
tgggggcaac ttgtttagct aattttatta ttctgttatt gggacactat gtctctgcat 6300
gagacatagt gtcccaaaac atatttcaag cccattggat aaaatatgta tttagcaagt 6360
tcttaaatat aatgataaca taactgacca gataaggtga tttttaaatg ctgtgccaac 6420
tttataaatg ttttgaggaa ttttcccttt tctgaaggtt attcttcttt ctttttagca 6480
tttactgtca cggttcccaa ggacctatat gtggtagagt atggcagcaa tatgacaatt 6540
gaatgcaaat tcccagtaga aaaacaatta gacctgactt cactaattgt ctattgggaa 6600
atggaggata agaacattat tcaatttgtg catggagagg aagacctgaa ggttcagcat 6660
agtaactaca gacagagggc ccagctgttg aaggaccagc tctccctggg aaatgctgca 6720
cttcggatca cagatgtgaa attgcaggat gcaggggttt accgctgcat gatcagctat 6780
ggtggtgccg actacaagcg gattaccgtg aaagtcaatg gtaagaatta ttatagatga 6840
gaggcctgat ctttatagaa aacatattct aagtgttgaa gacttttcat tcttataagt 6900
ccatacttat tttcaaacag aatagcatag tctcttcatt cattcattca gttcatgaat 6960
tcattcacgt aagtctccaa ttagcatttc ttgagcacct atatgatagt cattggaaat 7020
ccagagacaa cacagagcca tgttctacgg tatgtacagt tttccaaaaa taattcctag 7080
tctttacttt tttattataa atgtaataca tatacttgca aagaattcag atactatgga 7140
agagatcaaa tgaattgcaa aagtgtccct cctcccttca ccactatctc ccatgagata 7200
accaagagac actccaagag agtaaccatt atttgtgtgt ccctccagaa ccttttttat 7260
tcaactacca tttttttatt ttattaggtc tgtcagtttt ccttttttga gcctctctat 7320
atcaaatgct aataaatata ttcagatcaa accccactgt aaggttcata ttaaaaaaga 7380
cttgaagtct ccctatgaag acaaaaaata atcatattaa gtgtaaaaga acttattctt 7440
ccagtacagt ataaactata ctcactgggc atatattcat cttgaaaatc tatactgatg 7500
ttgtcttggg gaattgaaga ggaactagga gtgtcaattc ctgggaactg acccacagtt 7560
atgtcatcag gtcacttgag ttcgaagttt tgtgttagca ctagctaagt aaaggaaaac 7620
acctctgctt tcattgttga gtttcataga attgagagct gaaaggatcc caggcaggag 7680
cgactaatcc aaactcccac aaagaacaaa aatcccccag aggatcttct gttcatatat 7740
ttcctgcagt ggcatccctg tcatatccca caatggcatc cctgccattt ggactcccct 7800
tccatatcct gttgaaatta ctccctaata gtaagctgaa atctgcccct ctagttgtag 7860
ttttggaatt atttcatttc catgatgacc ttttaatatt tgactagaat taaatcatct 7920
ccccttggta tttccattcc tggactaact accatcaatc tgagggctaa caatacaagt 7980
agaaaaagtc tacacttgtc attgatcact gatcaatgat taatcaatga tcactgataa 8040
ttataaactc aaaaacaaaa tcatgtaggg attaagagaa atgtatcagt tttatgttgt 8100
atttctggtc cctgattctg gctcaaataa tgctactatt gtcaagaaga tatcacttgt 8160
aaagtagatt taattttcat tatattttac catgtgcttc tccattcacg gcatttcttg 8220
agatgttgtg gtttatactt tcagtttttc tccagtccat cagcaaatat caggcatcta 8280
ctgtgttcca agatattaaa gaaatcatca tgacttagcc tcatcaacag cattgctaga 8340
tctgggatgg aaaagaagag tataatcctg gcagtcagga agaaggctgc ataaagtata 8400
agtttctgct tccaaagaag atctctcatc agcctgtagg gagtgtatag ggaggggaca 8460
gctgtccttg tagtagcaaa gggttttatt caggtcatct gggctccata atatcccttg 8520
tgtatctgca gtctcctttg ccatggatca acacaatagg aaatcttccg gcactgatgg 8580
tttttccaag ggggagttct tcagggagca aagcaaatga ccaaccaggt ttgaggacct 8640
gatttgacaa ttccattttg tattttaaat tagttaattt gcattctagt cccaatccat 8700
cttgtcattt gcagacagtg gttttggggt tgagttgagc tataccaaaa gtctgaacct 8760
tctgcactta gaacnnnnaa ggcaaccacc aagcttcact tgcactgagg cagtgtctcc 8820
aatggaaacg aggtagctgg cttgcagaag ctttccaact cagggaagta gaactcctga 8880
gtcacctcca tatgcaaata atttcacagt actgctgttg aacttcactt cccatcacag 8940
caaatgtgtg gtaacatagc tttgccacag gagtttactn nnnnccatgg gattttaaag 9000
gtgaaacatt tcaaaactga aatttgaaag aatttagttt tggattcact caattatcat 9060
gatcactttg ggtgttattg cacctttcat gtttgtgagt ttaaatacca gactctcagg 9120
cctctaactt tcaattaaaa gtgtttttct ttaatcactg nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 9180
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 9240
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnctgtcat 9300
tccccaccaa ccccatcttt ccccaaaatt cccagccctg tttnnnnngt ttttctttaa 9360
tcactgaacc taatagtagg gaaaacgaaa tgttcattca gactttcagg accttcaatg 9420
agatgaggca gctgaaagat caaagtagtt gcatagttat cccagtaaag ctatttggat 9480
cgtatggacc agatcaactg ctgtcattcc ccaccaaccc catctttccc caaaattccc 9540
agccctgttt aagtgttctc tgtagcattt atctctatct agtatattgt gtagcatatc 9600
atatcatact tttctatttt gtttattgtc tctctcctcc tagaatataa actccacaag 9660
cacagagatt tgggtctgtt ttttaatatt gttgtatccc cagggcttga cgtaaagcag 9720
agtggtagta tgacaaaagc acacaaaaaa tatttgttga gtcaatgaat gaatgatttc 9780
ctcaaatagg attagcctaa aatttggaaa catgaacaga cttggatata tgaaaatttn 9840
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnttctaa agggtacact gaagcagcag 9900
tagtaaaagg aggaggagga gaagcagctc tgctactact attatcgagt actactannn 9960
nnnnnnnnnn nnnctacaac tatcgagtac tactacaatt agcacttgct tattctgtgt 10020
gttaggtcct gtactgaaca ttctgcctaa attagttcat ttcctcctgg aaatgactct 10080
gtggggtagg tgcttcatca tgtaagatga gtatttttca cacttcactg tctctgaaat 10140
ctgagtgtgt ctttcaatga tggaatcttt gatttcatga taagtggtat tattcccatt 10200
ttaaggatga ggaaactggg gtccaaagaa attaagtaat ttgcccaaat tcacctagcc 10260
tcgtaaatga taaagctagt tctaaatcca agcagattgg ctctgaagtc tgggccctta 10320
ataaccactt attgcctgta tttgcacctc tggtgtatgt atcaagttat atattggctt 10380
caaaactatc atgacctttt cttgattttg attgttcaat attagtatag tgttctnnnn 10440
nnnnnnnnnn nngggtctgc aaaaaatttt gattactcac ctcatctgta aaacatttta 10500
aacttgtgtg tctgtgcagg cacatttgtg tgtaattata aaaaatttac tatctattaa 10560
tatataggtt gtaccgtaag aaaaattgcc atttttgaag agncaaaaaa ggttgaatat 10620
taccagtttc atctggttca acctaataga catttgtaca aaaacagaca ttttaagagg 10680
atgaaataaa aatttaataa acaatatttt caatttttac taattgtgac gcttcactat 10740
tgttagctaa tatgtcaagg catgatatac cttagggtgg aatttatcat taacaaaggt 10800
ggatagtgtc aataatcttg aggtttgtgn ttttttatat aacactgtga ggtctaatta 10860
agtacttaat tgtttacaac ctcatacagt cgccaataat aagtgtcact tctgctgttt 10920
cctctgggtt gtgcttgaat tattagtatt atcttcaatc ctcagtttct ttgtggaaaa 10980
ctttttaann nnnnnnnnnn nnnnnnaaga tggttagttt agtcaaaatt agataagaga 11040
atctgaaaat ccataattac cccaaagcaa cccactcata agaactatta tttttgtgtt 11100
ttggnnnnnn nnnnnnnnnn nntttccagt gtttccactg gtagtggttt cattgatgta 11160
ggagtatcaa aacatcacta attatttatt tcagttttgt ttgatcctag ctgttttgtg 11220
ttaactttga agaaattaca tcacagatct attgttgtcc ttggtaaagg aatggagagt 11280
taaggctcta gatcattagt ggttatgctg tagtattagg agtaaaaaaa agattatatc 11340
aacaaaataa gaacatgtta atgtacttgt aatagataaa catgaataaa gctcttatgc 11400
tatatagatg cactgaacaa tctactagaa ttgtcagcaa acggtatctt aatcctnaaa 11460
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aagtgattta ttaaaatagc cagcatttaa aagcttaaaa tataagtatc ataatgtggt 11580
atcctagata gatcccagaa cagagaaagg atattaggga aaaactggag gaatggaata 11640
aattatgcag tttagttatt aataatgtac taatgtcctt agttatgacc attgtaccat 11700
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atctttgcaa tttttttgta aatttaaaac ttctaaaata aagaacaaat ttgaacatta 11820
aaaagtgtcg ccaggaacat gtatcactgt ttacagatga aacagtatgt atttttatat 11880
ctaatttctg atcattggct tcaaatcaga aaagtgaatg acacatcaag atcaggtttt 11940
ctgtttacta aataaagtct aagaaaacaa agcataccag ctggagagat tcatgtttat 12000
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cactatgtaa aaagtatagc actttactga gaaacatatg aaaacctgaa tacatggaga 12120
gaggtatttt atatttgaat agaaagattg ctggtttaaa gataattctc tttaaatttt 12180
ttttgttaga aatttaagag gtacaagagc agttttgtca cacggatata ttacatagtg 12240
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accaacatga tttttatagc aagatagtca ttcctattaa cccaaacttg tcccaacttt 12360
gaactgaact gaggcagagc tagcaggtgt tccccactgc tgaggcatct gaacattaag 12420
cgtatccctc tgagaaccag cctgcattga tcctctttct aatgtagaca gcatcaagct 12480
atatatctag ttctgtgctc agcaaaagcc ctgacttctt tttgcttatg tcctagctcc 12540
atacaacaaa atcaaccaaa gaattttggt tgtcgatcca gtcacctctg aacatgaact 12600
aacatgtcag gctgagggct accccaaggc cgaagtcatt tggacaagca gtgaccatca 12660
agtcctgagt ggtaagacca ccaccaccaa ttccaagaga gaggagaagc ttttaaatgt 12720
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<210> 4
<211> 20641
<212> DNA
<213> mus musculus
<400> 4
gcctcatgcc aggctgcact tgcacgtcgc gggccagtct cctcgcctgc aggtaaggga 60
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tcaccagtga aaaagcctag cactgtgtgt ttgatagtaa cttgagattc agtaccagat 6660
aatactcagc catgctttgc agtcagtacc atgatcttgc aaaggtgaaa tgccaggtgt 6720
ttgtttctta tcataaatgc aatatataat atattacata gatgtataga tataactgtg 6780
taacatgcaa taagatataa tatgcatata tttcatataa cataatgtat aatatataat 6840
gtataataat atatactaca atatatagtt atatgcatag ttatatattg catttatgat 6900
aaaaagcaaa cacctggcat ttcacttttg caagcttttt gaattacttg taaatatata 6960
tacatgcaaa catacataca cacacatgtt tttttacaag taatttgaat gtcatggaaa 7020
gaaatagaat cataaaaatg tccctcctcc ctaactacca tcttctaagc ataaatatac 7080
agtaactact atttgtacat ccctccatga ctttttgatt ggattactgt ttatatttaa 7140
tctatcaggc ttagcacatt ttctttcctt tgaatacctc catacaaaat tcaatgtgtg 7200
tttatatata tatgtatata tatagttata tcatatcata tatcatacaa agttttatat 7260
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caatatataa tgtatatgtg tgtgtgtgtg catatacctc tatatctatc tatctatcta 7380
tctatctatc tatctatcta tctatctatc tatagcttct actgtaaggg tcacttttta 7440
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ttcttccaca gagatggtac aggctacact cagcaggcat gcattcattt tcagggcctg 7560
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caccttgcta accacccctg ctttcactgt tgggttgcat agacctgaga gcttcactca 7740
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ggtctgcctg ctccttttcg gttttcataa taactttaaa actatttggc tagaatcaga 7980
tagtctcctt cgatcttttt actcctaaac tagtgtgaag ctcaatatta tacataggaa 8040
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ggaaaaatgt gtccattcga cagtttatta atgggtctgt gatggtgggt cgcttagagc 8160
ttatgaagat gccacttgcc ttatttcggt gcttggctct aacttccatt accttttact 8220
tacaattctt catttgtgac actcatgaaa ggagactcgg gatatggttg ttaatatctt 8280
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tctcatggct tgttaggagt aggtgactct ggtaaggagg aatttactct agattatgtg 8520
ctcagtgata tctctgatac caaagacaat cttttggagc gcacggcttc tccacggagg 8580
gacctgtgat gcggcaaagc tggtatccaa gcagtcttga aggcctgctt gactattttg 8640
ttttcttaca gaaatcacta cgtcgatatt ttactcccag ttcaccttgc catttgcatg 8700
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tacatacata tatttggcaa gatccgttct caaagacata catacataca tacatttggc 8940
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tataaaatta aaataggaac aggactgagg acatgcccag tgatgtacag gaccctggtt 9060
tcagtttcta gcaccatggt cgctggcatg caaaagcttt ccatgtcaag gaagtagaac 9120
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gtgtggtggt gaagcagccc tacagggagt tcactcgcca tggggtttta aaggtgaatt 9240
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ttggataatg ttctaccttc aaaggtttac agaagaccct caggcatcag gcttttaatt 9360
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caacaattaa ggattgccat ggtgcacccg atcccccagc tctgtttaaa ccttttctct 9540
gtcatctatg cctatctaag atgtctcagc atatcatgct tattgtctct ttccttctct 9600
tgaacacaag ctctaggggt aggggctttg gtcagtttta ttgttggacc tgttggcctt 9660
gacgtattat gaaggggcag tgtaataaga aaagaaaacc gtgtttgttg atggaatggt 9720
ttaaaaaaaa attagcttaa aatgtatgct atacgaacgg gcatgaatct gggagatttt 9780
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tgtgctcatg gtcctccaca tctgcctaac aacagcaggg gtagatgtta taattaacac 9900
tcacagaaca cctgatatgt gagaggttgt gccctgggct tcttgctcat atgaattcat 9960
ttcatcttta acataactct tcgggggagg cacttgccca tgaccatggc ttgttttctt 10020
tcctatcgac tatctttcaa atcggaatgt gtctttccct aggtgacatc tcagattcaa 10080
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catgtgtgtg attataaagg atatatctgg tgccaatagg tatagcttat attataagaa 10440
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attaacaaat ggagatggtc gcagtcatcc tgaagcttat tttagccaat gctttatcac 10680
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ttctcaatgt gaccagcagt ctgagggtca acgccacagc gaatgatgtt ttctactgta 13080
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a 20641
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<223> Oligonucleotide motif
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<223> Oligonucleotide motif
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<223> Oligonucleotide motif
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<223> Oligonucleotide motif
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 111
tgaattccca tatccga 17
<210> 112
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 112
agaattatga ccatat 16
<210> 113
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 113
aggtaagaat tatgacc 17
<210> 114
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 114
tcaggtaaga attatgac 18
<210> 115
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 115
cttcaggtaa gaattatg 18
<210> 116
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 116
tcttcaggta agaatta 17
<210> 117
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 117
cttcttcagg taagaat 17
<210> 118
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 118
tcttcttcag gtaagaa 17
<210> 119
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 119
tcttcttcag gtaaga 16
<210> 120
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 120
tggtctaaga gaagaag 17
<210> 121
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 121
gttggtctaa gagaag 16
<210> 122
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 122
agttggtcta agagaa 16
<210> 123
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 123
cagttggtct aagagaa 17
<210> 124
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 124
gcagttggtc taagagaa 18
<210> 125
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 125
cagttggtct aagaga 16
<210> 126
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 126
gcagttggtc taagaga 17
<210> 127
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 127
gcagttggtc taagag 16
<210> 128
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 128
ctcatatcag ggcagt 16
<210> 129
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 129
cacacatgtt ctttaac 17
<210> 130
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 130
taaatacaca catgttct 18
<210> 131
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 131
gtaaatacac acatgttc 18
<210> 132
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 132
tgtaaataca cacatgtt 18
<210> 133
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 133
gatcatgtaa atacacac 18
<210> 134
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 134
agatcatgta aatacaca 18
<210> 135
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 135
caaagatcat gtaaatacac 20
<210> 136
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 136
acaaagatca tgtaaataca 20
<210> 137
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 137
gaatacaaag atcatgta 18
<210> 138
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 138
agaatacaaa gatcatgt 18
<210> 139
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 139
cagaatacaa agatcatg 18
<210> 140
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 140
gcagaataca aagatca 17
<210> 141
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 141
aggcagaata caaagat 17
<210> 142
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 142
aaggcagaat acaaaga 17
<210> 143
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 143
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<210> 144
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 144
cattagtgag ggacga 16
<210> 145
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 145
gagggtgatg gattag 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 146
ttaggagtaa taaagg 16
<210> 147
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 147
ttaatgaatt tggttg 16
<210> 148
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 148
ctttaatgaa tttggt 16
<210> 149
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 149
catggattac aactaa 16
<210> 150
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 150
tcatggatta caacta 16
<210> 151
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 151
gtcatggatt acaact 16
<210> 152
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 152
cattaaatct agtcat 16
<210> 153
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 153
gacattaaat ctagtca 17
<210> 154
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 154
agggacatta aatcta 16
<210> 155
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 155
caaagcatta taacca 16
<210> 156
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 156
acttactagg cagaag 16
<210> 157
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 157
cagagttaac tgtaca 16
<210> 158
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 158
ccagagttaa ctgtac 16
<210> 159
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 159
gccagagtta actgta 16
<210> 160
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 160
tgggccagag ttaact 16
<210> 161
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 161
cagcatctat cagact 16
<210> 162
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 162
tgaaataaca tgagtcat 18
<210> 163
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 163
gtgaaataac atgagtc 17
<210> 164
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 164
tctgtttatg tcactg 16
<210> 165
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 165
gtctgtttat gtcact 16
<210> 166
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 166
tggtctgttt atgtca 16
<210> 167
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 167
ttggtctgtt tatgtc 16
<210> 168
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 168
tcacccattg tttaaa 16
<210> 169
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 169
ttcagcaaat attcgt 16
<210> 170
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 170
gtgtgttcag caaatat 17
<210> 171
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 171
tctattgtta ggtatc 16
<210> 172
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 172
attgcccatc ttactg 16
<210> 173
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 173
tattgcccat cttact 16
<210> 174
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 174
aaatattgcc catctt 16
<210> 175
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 175
ataaccttat cataca 16
<210> 176
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 176
tataacctta tcatac 16
<210> 177
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 177
ttataacctt atcata 16
<210> 178
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 178
tttataacct tatcat 16
<210> 179
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 179
actgctattg ctatct 16
<210> 180
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 180
aggactgcta ttgcta 16
<210> 181
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 181
gaggactgct attgct 16
<210> 182
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 182
acgtagaata ataaca 16
<210> 183
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 183
ccaagtgata taatgg 16
<210> 184
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 184
ttagcagacc aagtga 16
<210> 185
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 185
gtttagcaga ccaagt 16
<210> 186
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 186
tgacagtgat tatatt 16
<210> 187
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 187
tgtccaagat attgac 16
<210> 188
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 188
gaatatccta gattgt 16
<210> 189
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 189
caaactgaga atatcc 16
<210> 190
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 190
gcaaactgag aatatc 16
<210> 191
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 191
tcctattaca atcgta 16
<210> 192
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 192
ttcctattac aatcgt 16
<210> 193
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 193
actaatggga ggattt 16
<210> 194
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 194
tagttcagag aataag 16
<210> 195
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 195
taacatatag ttcaga 16
<210> 196
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 196
ataacatata gttcag 16
<210> 197
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 197
cataacatat agttca 16
<210> 198
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 198
tcataacata tagttc 16
<210> 199
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 199
tagctcctaa caatca 16
<210> 200
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 200
ctccaatctt tgtata 16
<210> 201
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 201
tctccaatct ttgtat 16
<210> 202
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 202
tctatttcag ccaatc 16
<210> 203
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 203
cggaagtcag agtgaa 16
<210> 204
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 204
ttaagcatga ggaata 16
<210> 205
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 205
tgattgagca cctctt 16
<210> 206
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 206
gactaattat ttcgtt 16
<210> 207
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 207
tgactaatta tttcgt 16
<210> 208
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 208
gtgactaatt atttcg 16
<210> 209
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 209
ctgcttgaaa tgtgac 16
<210> 210
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 210
cctgcttgaa atgtga 16
<210> 211
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 211
atcctgcttg aaatgt 16
<210> 212
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 212
attataaatc tattct 16
<210> 213
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 213
gctaaatact ttcatc 16
<210> 214
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 214
cattgtaaca taccta 16
<210> 215
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 215
gcattgtaac atacct 16
<210> 216
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 216
taatattgca ccaaat 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 217
gataatattg caccaa 16
<210> 218
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 218
agataatatt gcacca 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 219
gccaagaaga taatat 16
<210> 220
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 220
cacagccaca taaact 16
<210> 221
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 221
ttgtaattgt ggaaac 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 222
tgacttgtaa ttgtgg 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 223
tctaactgaa atagtc 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 224
gtggttctaa ctgaaa 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 225
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 226
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 227
tatgacaata tgggac 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 228
atatgacaat atggga 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 229
cttcacttaa taatta 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 230
ctgcttcact taataa 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 231
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 232
gaatgcccta attatg 16
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 233
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 234
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 235
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 236
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Oligonucleotide motif
<400> 237
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 242
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 243
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 244
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Oligonucleotide motif
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Oligonucleotide motif
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cactttatct ggtcgg 16
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<213> Artificial Sequence
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<223> Oligonucleotide motif
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Oligonucleotide motif
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<213> Artificial Sequence
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<223> Oligonucleotide motif
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Oligonucleotide motif
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
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<213> Artificial Sequence
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<223> Oligonucleotide motif
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 255
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Oligonucleotide motif
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Oligonucleotide motif
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 262
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 264
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<210> 265
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 265
cttgtagtcg gcaccac 17
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 266
cttgtagtcg gcacca 16
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 267
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
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<210> 272
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 272
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
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gcaattcatt tgatct 16
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
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atagtggtga agggaggag 19
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<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 278
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 283
atagtggtga agggag 16
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<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 285
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 286
catgggagat agtggt 16
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 287
acaaataatg gttactct 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
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acacacaaat aatggtta 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
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gagggacaca caaataat 18
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 292
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 294
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 295
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 296
tactggaaga ataggt 16
<210> 297
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 297
tggcttatcc tgtact 16
<210> 298
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 298
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 299
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 300
gtatggctta tcctgt 16
<210> 301
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 301
atgaatatat gcccagt 17
<210> 302
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 302
gatgaatata tgccca 16
<210> 303
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 303
caagatgaat atatgcc 17
<210> 304
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 304
gacaacatca gtataga 17
<210> 305
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 305
caagacaaca tcagta 16
<210> 306
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 306
cactcctagt tccttt 16
<210> 307
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 307
aacactccta gttcct 16
<210> 308
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 308
taacactcct agttcc 16
<210> 309
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 309
ctaacactcc tagttc 16
<210> 310
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 310
tgataacata actgtg 16
<210> 311
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 311
ctgataacat aactgt 16
<210> 312
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 312
tttgaactca agtgac 16
<210> 313
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 313
tcctttactt agctag 16
<210> 314
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 314
gagtttggat tagctg 16
<210> 315
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 315
tgggatatga caggga 16
<210> 316
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 316
tgtgggatat gacagg 16
<210> 317
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 317
atatggaagg gatatc 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 318
acaggatatg gaaggg 16
<210> 319
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 319
atttcaacag gatatgg 17
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<223> Oligonucleotide motif
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<223> Oligonucleotide motif
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Oligonucleotide motif
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<223> Oligonucleotide motif
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<223> Oligonucleotide motif
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<213> Artificial Sequence
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<223> Oligonucleotide motif
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<213> Artificial Sequence
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<223> Oligonucleotide motif
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Oligonucleotide motif
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Oligonucleotide motif
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Oligonucleotide motif
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gagaagtgtg agaagc 16
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<213> Artificial Sequence
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<223> Oligonucleotide motif
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Oligonucleotide motif
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
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caaggcataa taagat 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
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ccaaggcata ataaga 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Oligonucleotide motif
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<213> Artificial Sequence
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atgatccaat tctcac 16
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Oligonucleotide motif
<400> 618
cgcttcatct tcaccc 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Oligonucleotide motif
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Oligonucleotide motif
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gtatgacact gcatct 16
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 621
tgtatgacac tgcatc 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
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ttctcttctg taagtc 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Oligonucleotide motif
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<223> Oligonucleotide motif
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<213> Artificial Sequence
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<223> Oligonucleotide motif
<400> 633
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<213> Artificial Sequence
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<223> Oligonucleotide motif
<400> 634
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<213> Artificial Sequence
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<223> Oligonucleotide motif
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<213> Artificial Sequence
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<223> Oligonucleotide motif
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<213> Artificial Sequence
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<223> Oligonucleotide motif
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<213> Artificial Sequence
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<223> Oligonucleotide motif
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<213> Artificial Sequence
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<223> Oligonucleotide motif
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<223> Oligonucleotide motif
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<223> Oligonucleotide motif
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<223> Oligonucleotide motif
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<223> Oligonucleotide motif
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<213> Artificial Sequence
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<223> Oligonucleotide motif
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<213> Artificial Sequence
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<223> Oligonucleotide motif
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<223> Oligonucleotide motif
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Oligonucleotide motif
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 720
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Oligonucleotide motif
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<223> Oligonucleotide motif
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<223> Oligonucleotide motif
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<220>
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<223> Oligonucleotide motif
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
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<212> DNA
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<220>
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<210> 737
<211> 16
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 737
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 738
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<220>
<223> Oligonucleotide motif
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<400> 740
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 741
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<220>
<223> Oligonucleotide motif
<400> 742
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<223> Oligonucleotide motif
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<223> Oligonucleotide motif
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<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide motif
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<223> Oligonucleotide motif
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catgatatac aatgctac 18
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<223> Oligonucleotide motif
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catcgttggg taaattta 18
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<220>
<223> Oligonucleotide motif
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<211> 18
<212> DNA
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<220>
<223> Oligonucleotide motif
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> artificial
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> HBV epitope
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> HBV epitope
<400> 775
Thr Thr Phe His Gln Thr Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu
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<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> HBV epitope
<400> 776
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1 5 10 15
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> HBV epitope
<400> 777
Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile
1 5
<210> 778
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> HBV epitope
<400> 778
Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys Leu Gly Gln
1 5 10 15
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> HBV epitope
<400> 779
Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> HBV epitope
<400> 780
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<213> Artificial
<220>
<223> HBV epitope
<400> 781
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1 5 10 15
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20
<210> 782
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> HBV epitope
<400> 782
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<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> HBV epitope
<400> 783
Ser Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu
1 5 10
<210> 784
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 784
ctgtgccttg ggtggcttt 19
<210> 785
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 785
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 786
ttctttataa gggtcgatgt ccatg 25
Claims (47)
- 화학식 CTAattgtagtagtaCTC의 안티센스 올리고뉴클레오티드로서,
상기 화학식에서, 대문자는 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오시드를 나타내고, 소문자는 DNA 뉴클레오시드를 나타내며, 모든 LNA C는 5-메틸 시토신이고, 모든 뉴클레오시드간 연결기는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기인, 안티센스 올리고뉴클레오티드. - 제1항의 올리고뉴클레오티드, 및
상기 올리고뉴클레오티드에 공유 결합으로 부착된 접합체 모이어티
를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체. - 제2항에 있어서,
올리고뉴클레오티드와 접합체 모이어티 사이에 연결기가 존재하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체. - 제2항에 있어서,
접합체 모이어티가 아시알로당단백질 수용체 표적화 모이어티인, 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체. - 제4항에 있어서,
아시알로당단백질 수용체 표적화 모이어티가 3가 N-아세틸갈락토사민(GalNAc) 모이어티인, 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체. - 제3항에 있어서,
연결기가 생리학적으로 불안정한 연결기인, 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체. - 제6항에 있어서,
생리학적으로 불안정한 연결기가 뉴클레아제 민감성 연결기인, 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체. - 제6항에 있어서,
생리학적으로 불안정한 연결기가 시티딘-아데노신 다이뉴클레오티드를 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체. - 제2항에 있어서,
올리고뉴클레오티드와 접합체 모이어티 사이에 연결기가 존재하고; 추가로 접합체 모이어티는, 3가 N-아세틸갈락토사민(GalNAc) 모이어티인 아시알로당단백질 수용체 표적화 모이어티이고;
연결기는 생리학적으로 불안정한 연결기이고; 추가로 생리학적으로 불안정한 연결기는 시티딘-아데노신 다이뉴클레오티드를 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체, 및
약학적으로 허용되는 희석제, 용매, 담체, 염 및 항원보강제(adjuvant)로부터 선택되는 하나 이상
을 포함하는, 바이러스 또는 기생충에 대한 면역 반응의 회복에 사용하기 위한 약학 조성물. - 제10항에 있어서,
약학적으로 허용되는 희석제가 멸균 포스페이트-완충된 염수인, 약학 조성물. - 제10항에 있어서,
약학적으로 허용되는 염이 나트륨인, 약학 조성물. - 제10항에 있어서,
약학적으로 허용되는 염이 칼륨인, 약학 조성물. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체, 또는
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체, 및 약학적으로 허용되는 희석제, 용매, 담체, 염 및 항원보강제로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 약학 조성물
의 효과량을 PD-L1을 발현하는 표적 세포에 투여함을 포함하는, 상기 표적 세포에서 PD-L1 발현을 조절하기 위한 시험관내 방법. - 제1항에 있어서,
바이러스에 대한 면역 반응의 회복에 사용하기 위한, 안티센스 올리고뉴클레오티드. - 제2항에 있어서,
바이러스에 대한 면역 반응의 회복에 사용하기 위한, 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체. - 제10항에 있어서,
바이러스에 대한 면역 반응의 회복에 사용하기 위한, 약학 조성물. - 제15항에 있어서,
바이러스가 HBV인, 안티센스 올리고뉴클레오티드. - 제16항에 있어서,
바이러스가 HBV인, 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체. - 제17항에 있어서,
바이러스가 HBV인, 약학 조성물. - 제1항에 있어서,
기생충에 대한 면역 반응의 회복에 사용하기 위한, 안티센스 올리고뉴클레오티드. - 제2항에 있어서,
기생충에 대한 면역 반응의 회복에 사용하기 위한, 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체. - 제10항에 있어서,
기생충에 대한 면역 반응의 회복에 사용하기 위한, 약학 조성물. - 제15항, 제18항 및 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
면역 반응의 회복이, 대조군과 비교될 때 하나 이상의 HBV 항원에 특이적인 CD8+ T-세포의 간에서의 증가인, 안티센스 올리고뉴클레오티드. - 제16항, 제19항 및 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
면역 반응의 회복이, 대조군과 비교될 때 하나 이상의 HBV 항원에 특이적인 CD8+ T-세포의 간에서의 증가인, 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체. - 제17항에 있어서,
면역 반응의 회복이, 대조군과 비교될 때 하나 이상의 HBV 항원에 특이적인 CD8+ T-세포의 간에서의 증가인, 약학 조성물. - 제1항에 있어서,
약제로서 사용하기 위한, 안티센스 올리고뉴클레오티드. - 제2항에 있어서,
약제로서 사용하기 위한, 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체. - 제10항에 있어서,
약제로서 사용하기 위한, 약학 조성물. - 제1항에 있어서,
HBV 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 안티센스 올리고뉴클레오티드. - 제2항에 있어서,
HBV 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체. - 제10항에 있어서,
HBV 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 약학 조성물. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체의 약학적으로 허용되는 염.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체의 약학적으로 허용되는 나트륨 염.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체의 약학적으로 허용되는 칼륨 염.
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JP5645840B2 (ja) | 2008-12-02 | 2014-12-24 | 株式会社Wave Life Sciences Japan | リン原子修飾核酸の合成方法 |
MX342945B (es) | 2009-07-06 | 2016-10-18 | Ontorii Inc * | Profármacos de ácido nucleico novedosos y métodos de uso de los mismos. |
WO2012039448A1 (ja) | 2010-09-24 | 2012-03-29 | 株式会社キラルジェン | 不斉補助基 |
DK2734208T3 (en) | 2011-07-19 | 2017-06-19 | Wave Life Sciences Ltd | PROCEDURES FOR SYNTHESIS OF FUNCTIONALIZED NUCLEIC ACIDS |
ES2862073T3 (es) | 2012-07-13 | 2021-10-06 | Wave Life Sciences Ltd | Grupo auxiliar asimétrico |
DK2872147T3 (da) | 2012-07-13 | 2023-02-20 | Wave Life Sciences Ltd | Fremgangsmåde til fremstilling af kirale oligonukleotider |
WO2015108048A1 (ja) | 2014-01-15 | 2015-07-23 | 株式会社新日本科学 | 抗腫瘍作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗腫瘍剤 |
US10144933B2 (en) | 2014-01-15 | 2018-12-04 | Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. | Chiral nucleic acid adjuvant having immunity induction activity, and immunity induction activator |
AU2015207773B2 (en) | 2014-01-16 | 2021-06-17 | Wave Life Sciences Ltd. | Chiral design |
KR20180033537A (ko) | 2015-07-21 | 2018-04-03 | 더 칠드런스 메디칼 센터 코포레이션 | Pd-l1 발현 조혈 줄기 세포 및 용도 |
JP6748219B2 (ja) | 2016-03-14 | 2020-08-26 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | Pd−l1発現低減用のオリゴヌクレオチド |
US20220354888A1 (en) * | 2016-08-03 | 2022-11-10 | Aalborg Universitet | ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES (ASOs) DESIGNED TO INHIBIT IMMUNE CHECKPOINT PROTEINS |
CA3039055A1 (en) | 2016-10-07 | 2018-04-12 | Secarna Pharmaceuticals Gmbh & Co. Kg | Novel approach for treating cancer |
WO2019060708A1 (en) | 2017-09-22 | 2019-03-28 | The Children's Medical Center Corporation | TREATMENT OF TYPE 1 DIABETES AND AUTOIMMUNE DISEASES OR DISORDERS |
IL272566B1 (en) * | 2017-10-16 | 2024-03-01 | Hoffmann La Roche | Nucleic acid molecule to reduce papd5 and papd7 mRNA to treat hepatitis b infection |
KR20200140240A (ko) * | 2018-01-12 | 2020-12-15 | 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 | 알파-시누클레인을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 그의 용도 |
WO2020007772A1 (en) * | 2018-07-02 | 2020-01-09 | Roche Innovation Center Copenhagen A/S | Antisense oligonucleotides targeting gbp-1 |
WO2020011653A1 (en) * | 2018-07-09 | 2020-01-16 | Roche Innovation Center Copenhagen A/S | Antisense oligonucleotides targeting kynu |
WO2020081585A1 (en) * | 2018-10-15 | 2020-04-23 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | The long non-coding rna inca1 and homo sapiens heterogeneous nuclear ribonucleoprotein h1 (hnrnph1) as therapeutic targets for immunotherapy |
EP3934695A1 (en) * | 2019-03-05 | 2022-01-12 | F. Hoffmann-La Roche AG | Intracellular targeting of molecules |
AU2020254929A1 (en) | 2019-04-02 | 2021-11-11 | Proqr Therapeutics Ii B.V. | Antisense oligonucleotides for immunotherapy |
US20220220485A1 (en) | 2019-05-03 | 2022-07-14 | Secarna Pharmaceuticals Gmbh & Co. Kg | PD-L1 antisense oligonucleotides for use in tumor treatment |
WO2021122735A1 (en) * | 2019-12-19 | 2021-06-24 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Use of sept9 inhibitors for treating hepatitis b virus infection |
WO2021122910A1 (en) * | 2019-12-19 | 2021-06-24 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Use of sbds inhibitors for treating hepatitis b virus infection |
CN114829603A (zh) * | 2019-12-20 | 2022-07-29 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于抑制scn9a表达的增强寡核苷酸 |
WO2021173812A1 (en) * | 2020-02-28 | 2021-09-02 | Aligos Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for targeting pd-l1 |
JP2023536999A (ja) | 2020-08-05 | 2023-08-30 | エフ. ホフマン-ラ ロシュ アーゲー | B型肝炎患者のオリゴヌクレオチド処置 |
WO2023011597A1 (en) * | 2021-08-04 | 2023-02-09 | Hepagene Therapeutics (HK) Limited | Ligand conjugates for delivery of therapeutically active agents |
CN113789324B (zh) * | 2021-08-17 | 2023-08-25 | 广东省大湾区华南理工大学聚集诱导发光高等研究院 | 一种aie探针及其制备方法与在荧光定量pcr方法中的应用 |
CA3234478A1 (en) | 2021-11-11 | 2023-05-19 | Souphalone LUANGSAY | Pharmaceutical combinations for treatment of hbv |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011127180A1 (en) | 2010-04-06 | 2011-10-13 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of cd274/pd-l1 gene |
WO2014118272A1 (en) | 2013-01-30 | 2014-08-07 | Santaris Pharma A/S | Antimir-122 oligonucleotide carbohydrate conjugates |
WO2014118267A1 (en) | 2013-01-30 | 2014-08-07 | Santaris Pharma A/S | Lna oligonucleotide carbohydrate conjugates |
Family Cites Families (95)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5927900A (ja) | 1982-08-09 | 1984-02-14 | Wakunaga Seiyaku Kk | 固定化オリゴヌクレオチド |
US4948882A (en) | 1983-02-22 | 1990-08-14 | Syngene, Inc. | Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis |
US4587044A (en) | 1983-09-01 | 1986-05-06 | The Johns Hopkins University | Linkage of proteins to nucleic acids |
US5430136A (en) | 1984-10-16 | 1995-07-04 | Chiron Corporation | Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites |
US5525465A (en) | 1987-10-28 | 1996-06-11 | Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine | Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same |
DE3738460A1 (de) | 1987-11-12 | 1989-05-24 | Max Planck Gesellschaft | Modifizierte oligonukleotide |
US5391723A (en) | 1989-05-31 | 1995-02-21 | Neorx Corporation | Oligonucleotide conjugates |
US5254469A (en) | 1989-09-12 | 1993-10-19 | Eastman Kodak Company | Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures |
US5486603A (en) | 1990-01-08 | 1996-01-23 | Gilead Sciences, Inc. | Oligonucleotide having enhanced binding affinity |
US5608046A (en) | 1990-07-27 | 1997-03-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds |
US5245022A (en) | 1990-08-03 | 1993-09-14 | Sterling Drug, Inc. | Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides |
US5512667A (en) | 1990-08-28 | 1996-04-30 | Reed; Michael W. | Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides |
DE69132510T2 (de) | 1990-11-08 | 2001-05-03 | Hybridon Inc | Verbindung von mehrfachreportergruppen auf synthetischen oligonukleotiden |
RU2123528C1 (ru) * | 1990-11-08 | 1998-12-20 | Чирон Корпорейшн | Способ получения белков hcv, пригодных для использования в вакцине или иммуноанализе, асиалогликопротеин (варианты), композиция для использования в вакцине или в иммуноанализе (варианты), способ очистки асиалогликопротеина и способ понижения содержания или элиминации hcv |
ATE239484T1 (de) | 1991-10-24 | 2003-05-15 | Isis Pharmaceuticals Inc | Derivatisierte oligonukleotide mit verbessertem aufnahmevermögen |
NL9201440A (nl) | 1992-08-11 | 1994-03-01 | Univ Leiden | Triantennaire clusterglycosiden, hun bereiding en toepassing. |
US5574142A (en) | 1992-12-15 | 1996-11-12 | Microprobe Corporation | Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery |
US5580731A (en) | 1994-08-25 | 1996-12-03 | Chiron Corporation | N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith |
WO1996011205A1 (en) | 1994-10-06 | 1996-04-18 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Peptide nucleic acid conjugates |
US5684142A (en) | 1995-06-07 | 1997-11-04 | Oncor, Inc. | Modified nucleotides for nucleic acid labeling |
TW520293B (en) | 1995-11-22 | 2003-02-11 | Univ Johns Hopkins Med | Delivery system to enhance cellular uptake of biomolecules |
JP3756313B2 (ja) | 1997-03-07 | 2006-03-15 | 武 今西 | 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体 |
US5770716A (en) | 1997-04-10 | 1998-06-23 | The Perkin-Elmer Corporation | Substituted propargylethoxyamido nucleosides, oligonucleotides and methods for using same |
CN1263473A (zh) | 1997-05-21 | 2000-08-16 | 利兰·斯坦福青年大学托管委员会 | 增加跨生物膜转运的组合物和方法 |
CA2303299C (en) | 1997-09-12 | 2016-02-23 | Exiqon A/S | Oligonucleotide analogues |
US6096875A (en) | 1998-05-29 | 2000-08-01 | The Perlein-Elmer Corporation | Nucleotide compounds including a rigid linker |
US6300319B1 (en) | 1998-06-16 | 2001-10-09 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Targeted oligonucleotide conjugates |
US6335432B1 (en) | 1998-08-07 | 2002-01-01 | Bio-Red Laboratories, Inc. | Structural analogs of amine bases and nucleosides |
US6335437B1 (en) | 1998-09-07 | 2002-01-01 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for the preparation of conjugated oligomers |
NZ513402A (en) | 1999-02-12 | 2003-06-30 | Sankyo Co | Novel nucleosides and oligonucleotide analogues |
CA2372085C (en) | 1999-05-04 | 2009-10-27 | Exiqon A/S | L-ribo-lna analogues |
US6617442B1 (en) | 1999-09-30 | 2003-09-09 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Human Rnase H1 and oligonucleotide compositions thereof |
US20060276422A1 (en) | 2001-05-18 | 2006-12-07 | Nassim Usman | RNA interference mediated inhibition of B7-H1 gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
WO2005007855A2 (en) | 2003-07-14 | 2005-01-27 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF B7-H1 GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA) |
US20040142325A1 (en) | 2001-09-14 | 2004-07-22 | Liat Mintz | Methods and systems for annotating biomolecular sequences |
EP3287144A1 (en) * | 2002-07-03 | 2018-02-28 | ONO Pharmaceutical Co., Ltd. | Immunopotentiating compositions |
US7687617B2 (en) | 2002-11-18 | 2010-03-30 | Santaris Pharma A/S | Oligonucleotides with alternating segments of locked and non-locked nucleotides |
JP4980716B2 (ja) | 2003-06-12 | 2012-07-18 | アルナイラム ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド | 遺伝子サイレンシングに有用な保存されたhbv及びhcv配列 |
ATE387217T1 (de) | 2003-07-11 | 2008-03-15 | Lbr Medbiotech B V | Mannose-6-phosphat rezeptor vermittelter gentransfer zu muskelzellen |
PT1810026T (pt) * | 2004-10-06 | 2018-06-11 | Mayo Found Medical Education & Res | B7-h1 e pd-1 no tratamento do carcinona de células renais |
CN101084438B (zh) * | 2004-10-06 | 2013-12-25 | 梅约医学教育与研究基金会 | B7-h1和癌症的诊断、预后和治疗方法 |
US20120122801A1 (en) | 2005-01-05 | 2012-05-17 | Prosensa B.V. | Mannose-6-phosphate receptor mediated gene transfer into muscle cells |
PL1907000T5 (pl) * | 2005-06-08 | 2020-11-16 | Dana-Farber Cancer Institute | Metody i kompozycje do leczenia infekcji przetrwałych |
WO2007031091A2 (en) | 2005-09-15 | 2007-03-22 | Santaris Pharma A/S | Rna antagonist compounds for the modulation of p21 ras expression |
JP5342881B2 (ja) | 2006-01-27 | 2013-11-13 | アイシス ファーマシューティカルズ, インコーポレーテッド | 6−修飾された二環式核酸類似体 |
DK2015758T3 (da) | 2006-05-05 | 2014-06-23 | Isis Pharmaceuticals Inc | Forbindelser og fremgangsmåder til modulering af ekspression af apob |
US7666854B2 (en) | 2006-05-11 | 2010-02-23 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Bis-modified bicyclic nucleic acid analogs |
US7547684B2 (en) | 2006-05-11 | 2009-06-16 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 5′-modified bicyclic nucleic acid analogs |
NZ600281A (en) * | 2006-12-27 | 2013-03-28 | Harvard College | Compositions and methods for the treatment of infections and tumors |
DK2149605T3 (da) | 2007-03-22 | 2013-09-30 | Santaris Pharma As | Korte RNA antagonist forbindelser til modulering af det ønskede mRNA |
US8278425B2 (en) | 2007-05-30 | 2012-10-02 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs |
WO2008154401A2 (en) | 2007-06-08 | 2008-12-18 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Carbocyclic bicyclic nucleic acid analogs |
AU2008272918B2 (en) | 2007-07-05 | 2012-09-13 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 6-disubstituted bicyclic nucleic acid analogs |
US8546556B2 (en) | 2007-11-21 | 2013-10-01 | Isis Pharmaceuticals, Inc | Carbocyclic alpha-L-bicyclic nucleic acid analogs |
WO2009090182A1 (en) | 2008-01-14 | 2009-07-23 | Santaris Pharma A/S | C4'-substituted - dna nucleotide gapmer oligonucleotides |
DK2285819T3 (da) | 2008-04-04 | 2013-12-02 | Isis Pharmaceuticals Inc | Oligomere forbindelser omfattende neutralt bundne, terminale bicykliske nukleosider |
US8575123B2 (en) | 2008-04-11 | 2013-11-05 | Tekmira Pharmaceuticals Corporation | Site-specific delivery of nucleic acids by combining targeting ligands with endosomolytic components |
DK2356129T3 (da) | 2008-09-24 | 2013-05-13 | Isis Pharmaceuticals Inc | Substituerede alpha-L-bicykliske nukleosider |
WO2010063011A2 (en) * | 2008-11-28 | 2010-06-03 | Emory University | Methods for the treatment of infections and tumors |
CN114835812A (zh) * | 2008-12-09 | 2022-08-02 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 抗-pd-l1抗体及它们用于增强t细胞功能的用途 |
US9181525B2 (en) * | 2009-03-06 | 2015-11-10 | Mie University | Method for enhancing a function of a T cell |
CN106237345A (zh) * | 2009-05-06 | 2016-12-21 | 库尔纳公司 | 通过针对脂质转运和代谢基因的天然反义转录物的抑制治疗脂质转运和代谢基因相关疾病 |
US8791085B2 (en) * | 2009-05-28 | 2014-07-29 | Curna, Inc. | Treatment of antiviral gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to an antiviral gene |
WO2011017521A2 (en) | 2009-08-06 | 2011-02-10 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Bicyclic cyclohexose nucleic acid analogs |
EP2571989A4 (en) * | 2010-05-18 | 2014-08-13 | Univ Mcgill | METHOD FOR REDUCING THE EXPRESSION OF SPICY GLIOMES FROM DOWN REGULATED KIDNEY CELL CARCINOMES |
US8846637B2 (en) | 2010-06-08 | 2014-09-30 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Substituted 2′-amino and 2′-thio-bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom |
HUE044815T2 (hu) | 2010-08-17 | 2019-11-28 | Sirna Therapeutics Inc | Hepatitisz B vírus (HBV) génexpressziójának RNS-interferencia közvetített gátlása, rövid interferáló nukleinsav (SINS) alkalmazásával |
DK3124610T3 (da) | 2010-10-28 | 2019-06-11 | Benitec Biopharma Ltd | Hbv-behandling |
CN103492568B (zh) | 2010-12-17 | 2017-04-12 | 箭头研究公司 | 用于siRNA的半乳糖簇‑药代动力学调节剂靶向部分 |
CA3131967A1 (en) | 2010-12-29 | 2012-07-05 | F. Hoffman-La Roche Ag | Small molecule conjugates for intracellular delivery of nucleic acids |
JP6042871B2 (ja) | 2011-04-21 | 2016-12-14 | アイオーニス ファーマシューティカルズ, インコーポレーテッドIonis Pharmaceuticals,Inc. | B型肝炎ウイルス(hbv)発現の調節 |
CA3064103C (en) | 2011-06-30 | 2023-03-07 | Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting gene expression of hepatitis b virus |
DK2734208T3 (en) | 2011-07-19 | 2017-06-19 | Wave Life Sciences Ltd | PROCEDURES FOR SYNTHESIS OF FUNCTIONALIZED NUCLEIC ACIDS |
US10023861B2 (en) | 2011-08-29 | 2018-07-17 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Oligomer-conjugate complexes and their use |
EP2753631A1 (en) | 2011-09-07 | 2014-07-16 | Marina Biotech, Inc. | Synthesis and uses of nucleic acid compounds with conformationally restricted monomers |
WO2013049307A2 (en) | 2011-09-30 | 2013-04-04 | University Of Miami | Enhanced immune memory development by aptamer targeted mtor inhibition of t cells |
HRP20220924T1 (hr) * | 2011-10-17 | 2022-10-28 | Io Biotech Aps | Imunoterapija zasnovana na pd-l1 |
EP2850092B1 (en) | 2012-04-09 | 2017-03-01 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Tricyclic nucleic acid analogs |
WO2013159109A1 (en) | 2012-04-20 | 2013-10-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of hepatitis b virus (hbv) expression |
JP2015523853A (ja) * | 2012-05-16 | 2015-08-20 | ラナ セラピューティクス インコーポレイテッド | Atp2a2発現を調節するための組成物及び方法 |
EP2850183A4 (en) | 2012-05-16 | 2016-02-10 | Rana Therapeutics Inc | COMPOSITIONS AND METHOD FOR MODULATING GENE EXPRESSION |
ES2862073T3 (es) | 2012-07-13 | 2021-10-06 | Wave Life Sciences Ltd | Grupo auxiliar asimétrico |
US10077443B2 (en) * | 2012-11-15 | 2018-09-18 | Roche Innovation Center Copenhagen A/S | Oligonucleotide conjugates |
CN104813168B (zh) | 2012-11-30 | 2017-10-20 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 需要pd‑l1抑制剂综合疗法的患者的鉴定 |
CA2921514C (en) | 2013-05-01 | 2023-10-24 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for modulating apolipoprotein c-iii expression |
CN112263682A (zh) | 2013-06-27 | 2021-01-26 | 罗氏创新中心哥本哈根有限公司 | 靶向pcsk9的反义寡聚体和缀合物 |
EP3102697A1 (en) * | 2014-02-03 | 2016-12-14 | Myriad Genetics, Inc. | Method for predicting the response to an anti-her2 containing therapy and/or chemotherapy in patients with breast cancer |
US20170216403A1 (en) | 2014-08-12 | 2017-08-03 | Massachusetts Institute Of Technology | Synergistic tumor treatment with il-2, a therapeutic antibody, and an immune checkpoint blocker |
EP3204397A1 (en) | 2014-10-10 | 2017-08-16 | F. Hoffmann-La Roche AG | Galnac phosphoramidites, nucleic acid conjugates thereof and their use |
US9828601B2 (en) | 2015-02-27 | 2017-11-28 | Idera Pharmaceuticals, Inc. | Compositions for inhibiting checkpoint gene expression and uses thereof |
GB201507926D0 (en) | 2015-05-08 | 2015-06-24 | Proqr Therapeutics N V | Improved treatments using oligonucleotides |
WO2017055423A1 (en) * | 2015-10-02 | 2017-04-06 | Roche Innovation Center Copenhagen A/S | Oligonucleotide conjugation process |
AU2016357980B2 (en) | 2015-11-16 | 2020-06-25 | F. Hoffmann-La Roche Ag | GalNAc cluster phosphoramidite |
WO2017100587A1 (en) | 2015-12-09 | 2017-06-15 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Polynucleotide agents targeting programmed cell death 1 ligand 1 (pd-l1) and methods of use thereof |
JP6748219B2 (ja) | 2016-03-14 | 2020-08-26 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | Pd−l1発現低減用のオリゴヌクレオチド |
-
2017
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