JP2019512498A - Ｐｄ−ｌ１発現低減用のオリゴヌクレオチド - Google Patents

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Abstract

本発明は、標的細胞内でＰＤ−Ｌ１の発現を低減させうるアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。オリゴヌクレオチドは、ＰＤ−Ｌ１のｍＲＮＡにハイブリダイズする。本発明は更に、オリゴヌクレオチドコンジュゲート及び医薬組成物、ならびにＨＢＶ、ＨＣＶ及びＨＤＶなどのウイルス性肝炎感染；マラリア、トキソプラズマ症、リーシュマニア症及びトリパノソーマ症などの寄生虫感染；肝臓癌又は肝臓における転移を、オリゴヌクレオチドを用いて治療する方法に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、プログラム死リガンド−１（ＰＤ−Ｌ１）に対して相補的であり且つ肝臓においてＰＤ−Ｌ１の発現を低減させる、オリゴヌクレオチド（オリゴマー）に関する。本発明はまた、肝臓感染症又は肝臓における癌に起因するＴ細胞の疲弊を緩和する方法に関する。関連する感染症としては、マラリア及びトキソプラズマ症（例えば、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium）、特に三日熱マラリア原虫（P. vivax）種、Ｐ．マラリア（P. malariae）種、及びＰ．ファルシパルム（P. falciparum）種）の原生動物により引き起こされるもの）等の、慢性ＨＢＶ、ＨＣＶ及びＨＤＶ及び寄生虫感染がある。
プログラム死−１（ＰＤ−１）受容体及びそのリガンドであるＰＤ−Ｌ１（又はＢ７−Ｈ１もしくはＣＤ２７４）からなる共刺激経路は、Ｔ細胞の疲弊に直接寄与し、結果として肝臓の慢性感染中にウイルス制御が欠如することが、公知となっている。ＰＤ−１経路はまた、この経路において破壊されたマウスが自己免疫疾患を発呈した際に、自己免疫に関与する。
ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用をブロックする抗体によって、Ｔ細胞応答、特にＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の応答が増強されることが明らかにされてきた（Barber et al 2006 Nature Vol 439 p682及びMaier et al 2007 J. Immunol.Vol 178 p 2714を参照のこと）。
国際公開第２００６／０４２２３７号パンフレットには、腫瘍におけるＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１）の発現を評価することによる癌の診断法が記載されていると共に、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の相互作用を妨害する薬剤を患者に送達することが示唆されている。妨害剤は、抗体、抗体断片、ｓｉＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドとすることができる。そのような妨害剤の具体例も存在しないし、また慢性肝臓感染症の記載も存在していない。
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ、ＲＮＡｉ又はｓｉＲＮＡ）分子を用いるＰＤ−Ｌ１のＲＮＡ干渉媒介性阻害はまた、例えば、国際公開第２００５／００７８５５号パンフレット、国際公開第２００７／０８４８６５号パンフレット、及び米国特許第８，５０７，６６３号明細書にも開示されている。これらはいずれも、肝臓への標的送達について記載されていない。
Dolina et al.2013 Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2 e72には、ｓｉＲＮＡ分子を標的化するＰＤ−Ｌ１を、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞にインビボで送達し、それによりＭＣＭＶ感染マウスにおけるＮＫ及びＣＤ８＋Ｔ細胞クリアランスを増強することが、記載されている。この論文が結論付けているところによれば、肝細胞に送達されたｓｉＲＮＡ分子を標的化するＰＤ−Ｌ１は、ＣＤ８＋Ｔ細胞エフェクター機能の増強に関して有効ではない。
ｓｉＲＮＡ手法が、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド手法とかなり異なるのは、生体内分布及び作用様式が全く異なるためである。Xu et al 2003 Biochem.Biophys.Res .Comm.Vol 306 page 712-717に記載されているように、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ中の標的部位に対する優先度が異なる。
国際公開第２０１６／１３８２７８号パンフレットには、５’末端に連結された２つ以上の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた、ＰＤ−Ｌ１を含む免疫チェックポイントの阻害について、記載されている。この出願は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）又は肝臓への標的送達に関しては、言及していない。
本発明は、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞及び肝臓の正弦波状内皮細胞（ＬＳＥＣｓ）などの非実質細胞における実質細胞（例えば、肝細胞）及び肝細胞の両方において、肝細胞内のＰＤ−Ｌ１のｍＲＮＡを非常に効率的に低減させる、新規なオリゴヌクレオチドならびにオリゴヌクレオチドコンジュゲートを同定するものである。オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ＰＤ−Ｌ１の低減又はサイレンシングによって、ＰＤ−１媒介性阻害を減らし、それによって疲弊したＴ細胞の免疫刺激を促進する。肝臓の慢性病原性感染におけるＴ細胞の疲弊を軽減することによって、肝臓の慢性病原性感染中の血中ウイルス抗原レベルの低下、及び免疫制御が回復される。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞はまた、本発明のオリゴヌクレオチド及びオオリゴヌクレオチドコンジュゲートによる活性化が可能であるとされている。
オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、肝細胞においてＰＤ−Ｌ１の局所的低減を確実に遂行し、それにより、ＰＤ−Ｌ１の全身枯渇に関連する肺炎、非ウイルス性肝炎及び大腸炎などの、自己免疫副作用リスクを低減する。
本発明は、ＰＤ−Ｌ１の発現を調節できる核酸を標的化するオリゴヌクレオチド又はコンジュゲート、ならびにＰＤ−Ｌ１の機能に関連する疾患を治療又は予防することに関する。オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、感染性因子に抗する免疫応答の疲弊した疾患を治療することを目的に、特に使用される場合がある。
したがって、第１の態様において、本発明は、ＰＤ−Ｌ１標的核酸に対する相補性が少なくとも９０％である長さ１０〜３０ヌクレオチドからなる連続ヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチドを提供するものである。オリゴヌクレオチドは、好ましくはギャップマーデザインを有する、アンチセンスオリゴヌクレオチドでありうる。オリゴヌクレオチドは、標的核酸の開裂によってＰＤ−Ｌ１の発現を阻害できるものであることが、好ましい。開裂は、ヌクレアーゼの補充によって達成されるのが、好ましい。
更なる態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのアシアロ糖タンパク質受容体標的化結合部分、例えば、少なくとも１つのＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分を含む結合部分に結合されている。結合部分及びオリゴヌクレオチドは、リンカー、特に生体開裂性リンカーを介して、一体的に連結される場合がある。
更なる態様において、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲート、ならびに医薬的に許容される希釈剤、担体、塩及び／又は補助剤を含む医薬組成物を提供するものである。
更なる態様において、本発明は、有効量の本発明のオリゴヌクレオチド又は組成物を前記細胞に投与することにより、ＰＤ−Ｌ１を発現する標的細胞におけるＰＤ−Ｌ１発現量を減少させるインビボ又はインビトロ方法を提供するものである。
更なる態様において、本発明は、ウイルスもしくは寄生虫に対する免疫回復に使用するための、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬組成物を提供するものである。
更なる態様において、本発明は、薬品として使用するための、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬組成物を提供するものである。
更なる態様において、本発明は、治療的もしくは予防的有効量の本発明のオリゴヌクレオチドを、疾患、障害又は機能障害、特にウイルス性肝炎感染もしくは寄生虫感染から選択される疾患に罹患しているか又は罹患しやすい被験者に投与することによって、疾患、障害もしくは機能不全を治療又は予防するために記載の方法を提供するものである。
更なる態様において、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬組成物は、ＨＢＶ、ＨＣＶ及びＨＤＶなどのウイルス性肝炎感染；あるいは、マラリア、トキソプラズマ症、リーシュマニア症及びトリパノソーマ症などの寄生虫感染；あるいは、肝臓癌もしくは肝臓の転移の治療又は予防に使用される。
オリゴヌクレオチドは、波線（Ａ−Ｄ）又は「オリゴヌクレオチド」（Ｅ−Ｈ）又はＴ2（Ｉ）として表され、アシアロ糖タンパク質受容体標的化結合部分は、３価Ｎ−アセチルガラクトサミン部分である例示的アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートを例証する。化合物Ａ〜Ｄは、ＰＥＧ３スペーサーに対する分子中のジ−リジンプラグと、３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分と、を含む。化合物Ａ及びＢにおいて、オリゴヌクレオチドは、リンカーなしで、アシアロ糖タンパク質受容体標的化結合部分に直接付着する。化合物Ｃ及びＤにおいて、オリゴヌクレオチドは、Ｃ６リンカーを介して、アシアロ糖タンパク質受容体標的化結合部分に直接付着する。化合物Ｅ−Ｉは、トレブラー分枝分子と、長さ・構造が可変のスペーサーと、３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分と、を含む。 オリゴヌクレオチドは、波線（Ａ−Ｄ）又は「オリゴヌクレオチド」（Ｅ−Ｈ）又はＴ2（Ｉ）として表され、アシアロ糖タンパク質受容体標的化結合部分は、３価Ｎ−アセチルガラクトサミン部分である例示的アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートを例証する。化合物Ａ〜Ｄは、ＰＥＧ３スペーサーに対する分子中のジ−リジンプラグと、３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分と、を含む。化合物Ａ及びＢにおいて、オリゴヌクレオチドは、リンカーなしで、アシアロ糖タンパク質受容体標的化結合部分に直接付着する。化合物Ｃ及びＤにおいて、オリゴヌクレオチドは、Ｃ６リンカーを介して、アシアロ糖タンパク質受容体標的化結合部分に直接付着する。化合物Ｅ−Ｉは、トレブラー分枝分子と、長さ・構造が可変のスペーサーと、３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分と、を含む。 オリゴヌクレオチドは、波線（Ａ−Ｄ）又は「オリゴヌクレオチド」（Ｅ−Ｈ）又はＴ2（Ｉ）として表され、アシアロ糖タンパク質受容体標的化結合部分は、３価Ｎ−アセチルガラクトサミン部分である例示的アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートを例証する。化合物Ａ〜Ｄは、ＰＥＧ３スペーサーに対する分子中のジ−リジンプラグと、３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分と、を含む。化合物Ａ及びＢにおいて、オリゴヌクレオチドは、リンカーなしで、アシアロ糖タンパク質受容体標的化結合部分に直接付着する。化合物Ｃ及びＤにおいて、オリゴヌクレオチドは、Ｃ６リンカーを介して、アシアロ糖タンパク質受容体標的化結合部分に直接付着する。化合物Ｅ−Ｉは、トレブラー分枝分子と、長さ・構造が可変のスペーサーと、３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分と、を含む。 オリゴヌクレオチドは、波線（Ａ−Ｄ）又は「オリゴヌクレオチド」（Ｅ−Ｈ）又はＴ2（Ｉ）として表され、アシアロ糖タンパク質受容体標的化結合部分は、３価Ｎ−アセチルガラクトサミン部分である例示的アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートを例証する。化合物Ａ〜Ｄは、ＰＥＧ３スペーサーに対する分子中のジ−リジンプラグと、３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分と、を含む。化合物Ａ及びＢにおいて、オリゴヌクレオチドは、リンカーなしで、アシアロ糖タンパク質受容体標的化結合部分に直接付着する。化合物Ｃ及びＤにおいて、オリゴヌクレオチドは、Ｃ６リンカーを介して、アシアロ糖タンパク質受容体標的化結合部分に直接付着する。化合物Ｅ−Ｉは、トレブラー分枝分子と、長さ・構造が可変のスペーサーと、３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分と、を含む。 実施例２で試験された化合物について、標的核酸上のそれらの位置に関して、ＥＣ５０（Ａ）及びＰＤ−Ｌ１ノックダウンを生理食塩水の％（Ｂ）として図示したグラフである。この細胞系統において、試験の対象となった化合物はＴＨＰ１（●）及びＫａｒｐａｓ（＊）である。 ３価ＧａｌＮＡｃ集落（ＧＮ２）の構造式である。ＧＮ２は、本発明における結合部分として有用である。波線は、母集団の（例えばＣ６アミノリンカーに対する、又は直接的にオリゴヌクレオチドに対する）結合部位を例証する。 ＣＭＰ ＩＤ番号７６６＿２の構造式である。 ＣＭＰ ＩＤ番号７６７＿２の構造式である。 ＣＭＰ ＩＤ番号７６８＿２の構造式である。 ＣＭＰ ＩＤ番号７６９＿２の構造式である。 ＣＭＰ ＩＤ番号７７０＿２の構造式である。 生理食塩水及び指示されたＣＭＰ ＩＤ番号で処置した後、ウェスタンブロットで、ポリ（ＩＣ）誘導動物由来の肝臓内でのＰＤ−Ｌ１タンパク質発現を検出した。各ブロットは、同じオリゴヌクレオチド、すなわちブロットＡの裸型オリゴヌクレオチドバージョン対ＧａｌＮＡｃ結合バージョン）ＣＭＰ ＩＤ番号７４４＿１及び７５５＿２、Ｂ）ＣＭＰ ＩＤ番号７４７＿１及び７５８＿２、Ｃ）ＣＭＰ ＩＤ番号７４８＿１及び７５９＿２、Ｄ）ＣＭＰ ＩＤ番号７５２＿１及び７６３＿２及びＥ）ＣＭＰ ＩＤ番号７５３＿１及び７６４＿２を示す。上位バンドはビンキュリン・ローディング対照であり、下位バンドはＰＤ−Ｌ１タンパク質である。各ブロット中での第１のレーンは、ポリ（ＩＣ）誘導を伴わない生理食塩水処置マウスを示す。これらのマウスは、ＰＤ−Ｌタンパク質をごく少量しか発現しない。 生理食塩水及び指示されたＣＭＰ ＩＤ番号で処置した後、ウェスタンブロットで、ポリ（ＩＣ）誘導動物由来の肝臓内でのＰＤ−Ｌ１タンパク質発現を検出した。各ブロットは、同じオリゴヌクレオチド、すなわちブロットＡの裸型オリゴヌクレオチドバージョン対ＧａｌＮＡｃ結合バージョン）ＣＭＰ ＩＤ番号７４４＿１及び７５５＿２、Ｂ）ＣＭＰ ＩＤ番号７４７＿１及び７５８＿２、Ｃ）ＣＭＰ ＩＤ番号７４８＿１及び７５９＿２、Ｄ）ＣＭＰ ＩＤ番号７５２＿１及び７６３＿２及びＥ）ＣＭＰ ＩＤ番号７５３＿１及び７６４＿２を示す。上位バンドはビンキュリン・ローディング対照であり、下位バンドはＰＤ−Ｌ１タンパク質である。各ブロット中での第１のレーンは、ポリ（ＩＣ）誘導を伴わない生理食塩水処置マウスを示す。これらのマウスは、ＰＤ−Ｌタンパク質をごく少量しか発現しない。 ● ビヒクル（第１０群及び第１群）、 ◆ ＤＮＡワクチン（第１１群及び第２群）、 〇 抗ＰＤ−Ｌ１抗体（第１２群）、 ▲ 裸型ＰＤ−Ｌ１アンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）＋ＤＮＡワクチン第７群）又は △ ＧａｌＮＡｃ結合型ＰＤ−Ｌ１ ＡＳＯ＋ＤＮＡワクチン（第８群）での処置後の肝臓における単核球の母集団、群毎の個々の動物を表すと共に、群毎の平均を垂直線で示してある（表１８を参照のこと）。ＤＮＡワクチン群と３つの処置群との間の統計的有意性が評価されており、存在する場合、群間に*で示されている（*＝Ｐ＜０．０５、***＝Ｐ＜０．００１及び****＝Ｐ＜０．０００１）。Ａ）は、 処置後の肝臓におけるＴ細胞の数を表す。Ｂ）はＣＤ４＋Ｔ細胞の画分を表す。Ｃ）は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の画分を表す。 ● ビヒクル（第１０群及び第１群）、 ◆ ＤＮＡワクチン（第１１群及び第２群）、 〇 抗ＰＤ−Ｌ１抗体（第１２群）、 ▲ 裸型ＰＤ−Ｌ１ ＡＳＯ＋ＤＮＡワクチン（第７群）又は △ ＧａｌＮＡｃ結合型ＰＤ−Ｌ１ ＡＳＯ＋ＤＮＡワクチン（第８群）を用いての処置後の肝臓におけるＰＤ−Ｌ１陽性細胞の調節、群毎の個々の動物を表すと共に、群毎の平均を垂直線で示してある（表１９を参照のこと）。ＤＮＡワクチン群と３つの処置群との間の統計的有意性が評価されており、存在する場合、群間に*で示されている（*＝Ｐ＜０．０５、及び****＝Ｐ＜０．０００１）。Ａ）は、処置後の肝臓においてＰＤ−Ｌ１を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを表す。Ｂ）は、処置後の肝臓内でＰＤ−Ｌ１を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージを表す。Ｃ）は、処置後の肝臓内でＰＤ−Ｌ１を発現するＢ細胞のパーセンテージを表す。 ● ビヒクル（第１０群及び第１群）、 ◆ ＤＮＡワクチン（第１１群及び第２群）、 〇 抗ＰＤ−Ｌ１抗体（第１２群）、 ▲ 裸型ＰＤ−Ｌ１ ＡＳＯ＋ＤＮＡワクチン第７群）又は △ ＧａｌＮＡｃ結合型ＰＤ−Ｌ１ ＡＳＯ＋ＤＮＡワクチン（第８群）を用いての処置後の肝臓内でのＨＢＶ抗原特異的ＣＤ８＋サイトカイン分泌細胞、群毎の個々の動物を表すと共に、群毎の平均を垂直線で示してある（表２０を参照のこと）。ＤＮＡワクチン群と３つの処置群との間の統計的有意性が評価されており、存在する場合、群間に*で示されている（*＝Ｐ＜０．０５）。Ａ）は、処置後のＨＢＶプレＳ２＋Ｓ抗原に対して特異的な肝臓におけるＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを表す。Ｂ）は処置後のＨＢＶコア抗原に対して特異的な肝臓におけるＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを表す。Ｃ）は処置後のＨＢＶプレＳ２＋Ｓ抗原に対して特異的な肝臓におけるＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを表す。 ＧａｌＮＡｃ結合型ＰＤ−Ｌ１アンチセンスＣＭＰ番号：７５９＿２（▼）で処置した後のＡＡＶ／ＨＢＶマウスにおけるＨＢＶ−ＤＮＡ、ＨＢｓ抗原及びＨＢｅ抗原と、ビヒクル（■）との比較。縦線は処置の終了を示す。
定義
オリゴヌクレオチド
本明細書において「オリゴヌクレオチド」という用語は概ね、２つ以上の共有結合したヌクレオシドを含む分子として当業者に遍く理解されているものとして定義されている。そのような共有結合したヌクレオシドはまた、核酸分子又はオリゴマーでありうる。オリゴヌクレオチドは通例、実験室で（固相化学合成により）作製され、続いて精製される。オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合、共有結合したヌクレオチドもしくはヌクレオシドの核酸塩基部分もしくはその修飾物の配列又は順序について説明する。本発明のオリゴヌクレオチドは人造、且つ化学的に合成されるものであり、精製又は単離されるのが一般的である。本発明のオリゴヌクレオチドは、１以上の修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドを含む場合がある。
アンチセンスオリゴヌクレオチド
本明細書において、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、標的核酸、特に標的核酸上の連続配列にハイブリダイズすることによって標的遺伝子の発現を調節できるオリゴヌクレオチドとして定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本質的に二本鎖ではなく、したがってｓｉＲＮＡではない。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖であるが、好ましい。
連続ヌクレオチド配列
「連続ヌクレオチド配列」という用語は、標的核酸に対して相補的なオリゴヌクレオチドの領域を指す。この用語は、本明細書中では「連続した核酸塩基配列」及び「オリゴヌクレオチド・モチーフ配列」という用語と同義に使用されている。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列を成している。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは隣接するヌクレオチド配列を含み、任意で、更なるヌクレオチド（例えば、連続ヌクレオチド配列に官能基を付着させるために使用可能なヌクレオチドリンカー領域）を含む場合がある。ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に対して相補的である場合もあれば、あるいは相補的でない場合もある。
ヌクレオチド
ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの構築ブロックであり、本発明の目的のためには、天然ヌクレオチド及び非天然ヌクレオチドの両方を含む。自然界において、ＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオチドのようなヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分、及び１つ以上のリン酸基（ヌクレオシドには存在しない）を含む。ヌクレオシド及びヌクレオチドはまた、同じ意味で「単位」又は「モノマー」と呼ばれる場合もある。
修飾ヌクレオシド
本明細書において「修飾ヌクレオシド」又は「ヌクレオシド修飾」という用語は、糖部分又は（ヌクレオ）塩基部分の１つ以上の修飾を導入することによって、同等のＤＮＡもしくはＲＮＡヌクレオシドと比べて修飾されたヌクレオシドを指す。好ましい実施形態において、修飾ヌクレオシドは、修飾糖部分を含む。修飾ヌクレオシドという用語は、本明細書において、用語「ヌクレオシド類似体」又は修飾「単位」又は修飾「モノマー」と同義に使用することもできる。
修飾ヌクレオシド間結合
「修飾ヌクレオシド間結合」という用語は、ホスホジエステル（ＰＯ）結合以外の結合として当業者に遍く理解されており、２つのヌクレオシドを一体的に共有結合させる結合として定義されている。修飾ヌクレオシド間結合を有するヌクレオチドはまた、「修飾ヌクレオチド」と呼ばれる。幾つかの実施形態において、修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合と比較してオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増加させる。天然起源のオリゴヌクレオチドの場合、ヌクレオシド間結合には、隣接するヌクレオシド同士の間にホスホジエステル結合を生じるリン酸基が含まれる。修飾ヌクレオシド間結合は、インビボでの使用のためにオリゴヌクレオチドを安定化するのに特に有用であり、本発明のオリゴヌクレオチド中のＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドの領域における、例えばギャップマーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内、ならびに修飾ヌクレオシドの領域内のヌクレアーゼを開裂から防護する役目を果たしうる。
実施形態において、オリゴヌクレオチドは、天然リン酸ジエステルから、例えばヌクレアーゼ攻撃に対する耐性が増強された結合へと修飾された１つ以上のヌクレオシド間結合を含む。ヌクレアーゼ耐性の定量方法には、オリゴヌクレオチドを血清中でインキュベートする方法、あるいはヌクレアーゼ耐性アッセイ（例えば、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤ））を使用する方法を挙げることができ、これらの方法は両方とも当該技術分野において周知である。オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増強できるヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合と呼ばれる。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列中のヌクレオシド間結合の少なくとも５０％（例えば、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列中のヌクレオシド間結合の少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、又は例えば少なくとも９０％）が修飾される。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列中の全てのヌクレオシド間結合が修飾される。幾つかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドを非ヌクレオチド官能基に連結するヌクレオシド（例えば結合）は、ホスホジエステルでありうることが、認識されるであろう。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列中の全てのヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合である。
修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート、ジホスホロチオエート及びボラノホスフェートを含む群から選択できる。幾つかの実施形態において、修飾ヌクレオシド間結合は、本発明のオリゴヌクレオチド、例えばホスホロチオエート、ジホスホロチオエート又はボラノホスフェートによるＲＮアーゼＨの補充と適合する。
幾つかの実施形態において、ヌクレオシド間結合は、硫黄（Ｓ）（例えば、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。
ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性、有益な薬物動態及び製造の容易さのために特に有用である。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列中のヌクレオシド間結合の少なくとも５０％はホスホロチオエート（例えば、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列中のヌクレオシド間結合の少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、又は例えば少なくとも９０％はホスホロチオエート）である。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列中の全てのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートである。
幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１つ以上の中性ヌクレオシド間結合、特にホスホトリエステル、メチルホスホネート、ＭＭＩ、アミド−３、ホルムアセタール又はチオホルムアセタールから選択されるヌクレオシド間結合を含む。
更なるヌクレオシド間結合は国際公開第２００９／１２４２３８号パンフレットに開示されている（本明細書において参照により援用されている）。或る実施形態において、ヌクレオシド間結合は、国際公開第２００７／０３１０９１号パンフレットに開示されているリンカーから選択される（本明細書において参照により援用されている）。特に、ヌクレオシド間結合は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）2−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）2−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）2−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）2−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）2−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）2−Ｓ−、−Ｏ−ＰＯ（ＲH）−Ｏ−、０−ＰＯ（ＯＣＨ3）−０−、−Ｏ−ＰＯ（ＮＲH）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ2ＣＨ2Ｓ−Ｒ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＢＨ3）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＮＨＲH）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）2−ＮＲH−、−ＮＲH−Ｐ（Ｏ）2−Ｏ−、−ＮＲH−ＣＯ−Ｏ−、−ＮＲH−ＣＯ−ＮＲH−から選択可能であり、且つ／あるいはヌクレオシド間リンカーは、−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＲH−、−ＮＲH−ＣＯ−ＣＨ2−、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＯ−ＮＲH−、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＲH−、−ＣＯ−ＮＲH−ＣＨ2−、−ＣＨ2−ＮＲHＣＯ−、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ−、−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−、−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ−、−ＣＨ2−ＳＯ2−ＣＨ2−、−ＣＨ2−ＣＯ−ＮＲH−、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＲH−ＣＯ−、−ＣＨ2−ＮＣＨ3−Ｏ−ＣＨ2−（式中、ＲHが水素及びＣ１−４−アルキルから選択される）からなる群から選択可能である。
ホスホチオエート結合のようなヌクレアーゼ耐性結合は、標的核酸との二本鎖形成の際にヌクレアーゼを補充する能力を有するオリゴヌクレオチド領域、例えばギャップマー用の領域Ｇ、又はヘッドマー及びテールマーの非修飾ヌクレオシド領域において特に有用であるが、ホスホロチオエート結合はまた、非ヌクレアーゼ補充領域及び／もしくはギャップマーのための領域Ｆ及びＦ’のような親和性増強領域において、又は頭部及び尾部の修飾されたヌクレオシド領域において有用であると思われる。
しかしながら、デザイン領域の各々は、ホスホロチオエート以外のヌクレオシド間結合、例えばロックド核酸（ＬＮＡ）などの修飾ヌクレオシドがヌクレアーゼ分解との結合を保護する領域において、ホスホジエステル結合などのヌクレオシド結合を含む場合がある。特に修飾されたヌクレオシド単位の間に（又は、通常は非ヌクレアーゼの補充領域に）、１つもしくは２つの結合のような、ホスホジエステル結合を含めることにより、オリゴヌクレオチドのバイオアベイラビリティ及び／又は生体分布を修飾することができる。これについては、本明細書において参照により援用されている国際公開第２００８／１１３８３２号パンフレットを参照のこと。
或る実施形態において、オリゴヌクレオチド内の全てのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合及び／又はボラノホスフェート結合である。オリゴヌクレオチド内の全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合であるのが、好ましい。
核酸塩基
核酸塩基という用語は、核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成するヌクレオシド及びヌクレオチド中に存在するプリン（例えば、アデニン及びグアニン）部分ならびにピリミジン（例えば、ウラシル、チミン及びシトシン）部分を包含される。本発明の文脈において、核酸塩基という用語はまた、天然起源の核酸塩基とは異なるが、核酸ハイブリダイゼーションの間に機能する修飾された核酸塩基を包含する。この文脈において、「核酸塩基」は、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン及びヒポキサンチンなどの天然起源の核酸塩基、ならびに天然に存在しない変異体の両方を指す。そのような変異体は、例えば、Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055、及びBergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1. 4. 1に記載されている。
幾つかの実施形態において、核酸塩基部分は、プリン又はピリミジンを、修飾プリン又はピリミジン（例えばイソシトシン、プソイドイソシトシン、５−メチルシトシン、５−チオゾロ−シトシン、５−プロピニル−シトシン、５−プロピニル−ウラシル、５−ブロモウラシル５−チアゾロ−ウラシル、２−チオ−ウラシル、２’−チオ−チミン、イノシン、ジアミノプリン、６−アミノプリン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、及び２−クロロ−６−アミノプリンのような置換プリン又は置換ピリミジン）に変更することによって修飾される。
核酸塩基部分は、それぞれの対応する核酸塩基の文字コード（例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ又はＵ）で表される場合があり、各英字は、任意で、同等の機能を有する修飾塩基を含んでいてもよい。例えば、例示的オリゴヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、及び５−メチルシトシンから選択される。任意で、ＬＮＡギャップマーとして、５−メチルシトシンＬＮＡヌクレオシドを使用できる。
修飾オリゴヌクレオチド
修飾オリゴヌクレオチドという用語は、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド及び／又は修飾ヌクレオシド間結合を含む、オリゴヌクレオチドを表す。キメラ「オリゴヌクレオチド」という用語は、修飾ヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドについて説明するため文献中に使用されている用語である。
相補性
「相補性」という用語は、ヌクレオシド／ヌクレオチドのワトソン−クリック塩基対形成能力を説明するものである。ワトソン−クリック塩基対は、グアニン（Ｇ）−シトシン（Ｃ）及びアデニン（Ａ）−チミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）である。オリゴヌクレオチドは、修飾された核酸塩基を有するヌクレオシドを含みうる。例えば、５−メチルシトシンは多くの場合、シトシンの代わりに使用されるので、相補性という用語には、非修飾核酸塩基と修飾核酸塩基との間のワトソン−クリック塩基対形成が包含されることが理解される（例えば、Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055及びBergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1. 4. 1を参照のこと）。
本明細書において「％相補的である」という用語は、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）内の連続ヌクレオチド配列中のヌクレオチドの割合（パーセントで表された数）が、所与の位置で別個の核酸分子（例えば、標的核酸）の所与の位置で連続ヌクレオチド配列に対して相補的である（すなわちこの連続ヌクレオチド配列と共にワトソン−クリック塩基対を形成する）ことを指す。パーセンテージは、（標的配列５’−３’、及び３’−５’からのオリゴヌクレオチド配列と整列した場合）２つの配列間に対を形成するアラインメントされた塩基の数を数えることによって計算し、これをオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの総数で除算して、１００を乗算した値である。そのような比較において、アラインメントしない（塩基対を形成する）核酸塩基／ヌクレオチドは、ミスマッチと呼ばれる。
「完全に相補的である」という用語は、１００％の相補性を指す。
標的核酸（配列番号：７７２に対して完全に相補的なオリゴヌクレオチド（配列番号：５）の例を、以下に示す。
5’gcagtagagccaatta3’（配列番号：７７２）
3’cgtcatctcggttaat5’（配列番号：５）
同一性
本明細書において「同一性」という用語は、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）内の連続ヌクレオチド配列中のヌクレオチドの割合（パーセントで表された数）が、所与の位置で別個の核酸分子（例えば、標的核酸）の所与の位置で連続ヌクレオチド配列に対して同一であること（すなわち、相補的ヌクレオシドと共にワトソン−クリック塩基対を形成する能力）を指す。パーセンテージは、ギャップを含む２つの配列間で同一なアラインメントされた塩基の数を数えることによって計算し、これをオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの総数で除算して、１００を乗算した値である。同一性％＝（一致×１００）／アラインメントされた領域の長さ（ギャップあり）
ハイブリダイゼーション
本明細書において「ハイブリダイズ」又は「ハイブリダイズする」という用語は、反対側の鎖上の塩基対間に水素結合を形成し、それによって二本鎖を形成する２つの核酸鎖（例えば、オリゴヌクレオチド及び標的核酸）として理解される。２つの核酸鎖の間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強度であり、多くの場合、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二本鎖を成す温度として定義される融解温度（Ｔm）に関連して説明される。生理学的条件Ｔmは厳密に親和性に比例しない（Mergny及びLacroix, 2003, Oligonucleotides 13: 515-537）。標準状態のギブス自由エネルギーΔＧ°は、結合親和性のより正確な表現であり、ΔＧ°＝−ＲＴｌｎ（Ｋd）（式中、Ｒは気体定数であり、Ｔは絶対温度である）による反応の解離定数（Ｋd）に関連する。したがって、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の反応性が極めて低いΔＧ°は、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の強いハイブリダイゼーションを反映する。ΔＧ°は、水の濃度が１Ｍであり、ｐＨが７であり、温度が３７℃である反応に関連するエネルギーである。標的核酸へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは自発的反応であり、自発的な反応Δが誘発されるようにＧ°はゼロ未満とされる。ΔＧ°は、例えば、Hansen et al., 1965, Chem.Comm.36-38及びHoldgate et al., 2005, Drug Discov Todayに記載されている等温滴定熱量測定法（ＩＴＣ）で実験的に測定できる。当業者であれば、商業的機器がΔＧ°の測定に利用可能であることを知るであろう。ΔＧ°は、SantaLucia, 1998, Proc Natl Acad Sci USA. 95:1460-1465に記載されている最近傍点を使用して、Sugimoto et al., 1995, Biochemistry 34: 11211-11216及びMcTigue et al., 2004, Biochemistry 43: 5388-5405に記載されている適切に導出された熱力学的パラメータを使用して、数値的に推定できる。その意図された核酸標的をハイブリダイゼーションによって調節する可能性を有するために、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０〜３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに対して−１０ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。幾つかの実施形態において、ハイブリダイゼーションの程度又は強度は、標準状態のギブス自由エネルギーΔＧ°によって測定される。オリゴヌクレオチドは、８〜３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドの場合に、推定ΔＧ°値が、−１０ｋｃａｌ未満の範囲（例えば、−１５ｋｃａｌ未満、−２０ｋｃａｌ未満、例えば−２５ｋｃａｌ未満）の標的核酸にハイブリダイズする。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、−１０〜−６０ｋｃａｌ、例えば−１２〜−４０、例えば−１５〜−３０ｋｃａｌ又は−１６〜−２７ｋｃａｌ、例えば−１８〜−２５ｋｃａｌの推定ΔＧ°値を有する標的核酸にハイブリダイズする。
標的核酸
本発明によれば、標的核酸は、哺乳動物ＰＤ−Ｌ１をコードする核酸であり、例えば、遺伝子、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びプレｍＲＮＡ、成熟ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列でありうる。したがって、標的は、ＰＤ−Ｌ１標的核酸と呼ばれる場合がある。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、哺乳動物ＰＤ−Ｌ１の標的エキソン領域であってもよいし、又は例えば、ＰＤ−Ｌ１プレｍＲＮＡの標的イントロン領域であってもよい（表１を参照のこと）。
好適には、標的核酸は、ＰＤ−Ｌ１タンパク質、特に哺乳類ＰＤ−Ｌ１、例えば、ヒトＰＤ−Ｌ１をコードする（例えば、ヒト、サル及びマウスＰＤ−Ｌ１のｍＲＮＡ及びプレｍＲＮＡ配列について解説した表２及び表３を、参照のこと）。本発明の文脈において、プレｍＲＮＡはまた、タンパク質をコードする核酸と考えられる。
幾つかの実施形態において、標的核酸は、配列番号：１、２及び３又はその天然起源の変異体（例えば、哺乳類ＰＤ−Ｌ１タンパク質をコードする配列）からなる群から選択される。
研究又は診断において本発明のオリゴヌクレオチドを使用する場合、標的核酸は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ由来のｃＤＮＡ又は合成核酸であってもよい。
インビボ又はインビトロ用途では、本発明のオリゴヌクレオチドは典型的に、ＰＤ−Ｌ１標的核酸を発現する細胞におけるＰＤ−Ｌ１標的核酸の発現を阻害しうる。本発明のオリゴヌクレオチドの核酸塩基の連続配列は典型的に、任意で１つ又は２つのミスマッチを除く、且つ任意で、オリゴヌクレオチドを任意の官能基（例えばコンジュゲート）、又は他の非相補的末端ヌクレオチド（例えば、領域Ｄ’又はＤ”）に連結できる、ヌクレオチドベースのリンカー領域を除く、オリゴヌクレオチドの長さにわたって測定した場合、ＰＤ−Ｌ１標的核酸に対して相補的である。幾つかの実施形態において、標的核酸は、ＲＮＡ又はＤＮＡ（例えば、成熟ｍＲＮＡ又はプレｍＲＮＡのようなメッセンジャーＲＮＡ）でありうる。幾つかの実施形態において、標的核酸は、ヒトＰＤ−Ｌ１などの哺乳動物ＰＤ−Ｌ１タンパク質をコードするＲＮＡ又はＤＮＡであり、この哺乳動物ＰＤ−Ｌ１タンパク質は、ヒトＰＤ−Ｌ１プレｍＲＮＡ配列、例えば配列番号１として開示されるもの、又はＮＣＢＩリファレンス番号ＮＭ＿０１４１４３を有するヒトｍＲＮＡ配列である。例示的な標的核酸に関する詳細情報は、表２及び表３に示してある。
標的配列
本明細書において「標的配列」という用語は、本発明のオリゴヌクレオチドに相補的な核酸塩基配列を含む、標的核酸中に存在するヌクレオチドの配列を指す。幾つかの実施形態において、標的配列は、本発明のオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列に対して相補的な、標的核酸上の領域からなる。幾つかの実施形態において、標的配列は単一のオリゴヌクレオチドの相補的配列よりも長く、例えば、本発明の幾つかのオリゴヌクレオチドによって標的化できる標的核酸の好ましい領域を表しうる。
標的配列は、標的核酸のサブ配列でありうる。
幾つかの実施形態において、サブ配列はａ１〜ａ１４９からなる群から選択される配列である（表４を参照のこと）。幾つかの実施形態において、サブ配列は、ヒトＰＤ−Ｌ１のｍＲＮＡエキソンからなる群から選択される配列、例えば、ｅ１、ｅ２、ｅ３、ｅ４、ｅ５、ｅ６及びｅ７からなる群から選択されるＰＤ−Ｌ１ヒトｍＲＮＡエキソンである（上の表１を参照のこと）。
幾つかの実施形態において、サブ配列は、ヒトＰＤ−Ｌ１のｍＲＮＡイントロンからなる群から選択される配列、例えば、ｉ１、ｉ２、ｉ３、ｉ４、ｉ５及びｉ６からなる群から選択されるＰＤ−Ｌ１ヒトｍＲＮＡイントロンである（上の表１を参照のこと）。
本発明のオリゴヌクレオチドは、標的核酸に対して相補的であるか又はこの標的核酸にハイブリダイズする、連続ヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載の標的配列のような、標的核酸のサブ配列）を含む。
オリゴヌクレオチドは、標的核酸分子中に存在する標的配列に対して相補的であるか又はその標的配列にハイブリダイズする、少なくとも８ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む。連続ヌクレオチド配列（及び、ひいては標的配列）は、少なくとも８個の連続したヌクレオチド、例えば、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０連続ヌクレオチド（例えば、１２〜２５、１４〜１８連続ヌクレオチド等）からなる。
標的細胞
本明細書において「標的細胞」という用語は、標的核酸を発現する細胞を指す。幾つかの実施形態において、標的細胞はインビボ又はインビトロでありうる。幾つかの実施形態において、標的細胞は、げっ歯類細胞（例えば、マウス細胞もしくはラット細胞）、又は霊長類細胞（例えば、サル細胞もしくはヒト細胞）のような哺乳動物細胞である。
好ましい実施形態において、標的細胞は、ＰＤ−Ｌ１ｍＲＮＡ、例えばＰＤ−Ｌ１プレｍＲＮＡ又はＰＤ−Ｌ１成熟ｍＲＮＡを発現する。ＰＤ−Ｌ１のｍＲＮＡのポリＡ尾部は、典型的に、アンチセンスオリゴヌクレオチド標的化のために無視される。
天然起源の変異体
「天然起源の変異体」という用語は、ＰＤ−Ｌ１遺伝子の変異体、又は標的核酸と同じ遺伝子座に由来する転写物であって、但し、同じアミノ酸をコードする複数のコドンを引き起こす遺伝コードの縮重、又は代替スプライシングに起因するプレｍＲＮＡの存在、又はポリモルフィズムの存在（例えば、単一ヌクレオチドポリモルフィズム、及び対立遺伝子変異体）が原因で、異なる可能性があるものを指す。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドに対する充分な相補的配列の存在に基づいて、標的核酸及びその天然起源の変異体を標的化できる。
幾つかの実施形態において、天然起源の変異体は、哺乳類ＰＤ−Ｌ１標的核酸（例えば、配列番号１、２及び３からなる群から選択される標的核酸）に対して少なくとも９５％、例えば、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の相同性を有する。
多数の単一ヌクレオチド多型がＰＤ−Ｌ１遺伝子において公知であり、例えば、下の表に開示されている（ヒトプレｍＲＮＡ開始／参照配列は、配列番号２である）。
発現の調節
本明細書において「発現の調節」という用語は、オリゴヌクレオチドの投与前のＰＤ−Ｌ１の量と比較して、ＰＤ−Ｌ１の量を変化させるオリゴヌクレオチドの能力の包括的用語として理解すべきである。あるいは、発現の調節は、対照実験を参照して定量できる。対照は、非標的オリゴヌクレオチド（モック）で処理した生理食塩水組成物、個体もしくは標的細胞で処置した個体又は標的細胞であることが概ね理解されるが、また、ケア基準で処置される個体である場合もある。
１つのタイプの調節は、例えばｍＲＮＡの分解又は転写の妨害によって、オリゴヌクレオチドがＰＤ−Ｌ１の発現を阻害、下方制御、低減、抑制、除去、中断、ブロック、防止、軽減、低下、回避又は停止する能力である。別のタイプの調節は、オリゴヌクレオチドの、ＰＤ−Ｌ１の発現を回復、増加又は増強する能力である。スプライス部位の修復もしくはマイクロＲＮＡ抑制などの阻害機構のスプライシング、除去又は遮断の防止によって行うことができる。
高親和性修飾ヌクレオシド
高親和性修飾ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチド内に取り込まれた場合に、その相補的標的に対するオリゴヌクレオチドの、例えば融解温度（Ｔm）で測定された親和性を増強するように修飾されたヌクレオチドである。本発明の高親和性修飾ヌクレオシドは、修飾ヌクレオシド当たり好ましくは＋０．５〜＋１２℃、より好ましくは＋１．５〜＋１０℃、最も好ましくは＋３〜＋８℃の間の融解温度の上昇をもたらす。当該技術分野において多数の高親和性修飾ヌクレオシドが公知であり、例えば、多数の２’置換ヌクレオシド、ならびにロックド核酸（ＬＮＡ）が包含される(例えば、Freier & Altmann；Nucl.Acid Res., 1997, 25, 4429-4443及びUhlmann；Curr.Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213を参照のこと）。
糖修飾
本発明のオリゴマーは、修飾された糖部分、すなわちＤＮＡ及びＲＮＡに見出されるリボース糖部分と比較して、糖部分の修飾を有する１つ以上のヌクレオシドを含む場合がある。
主としてオリゴヌクレオチドの特定の特性、例えば親和性及び／又はヌクレアーゼ耐性を改善する目的で、リボース糖部分の修飾を伴う多数のヌクレオシドが作製されている。
そのような修飾には、例えば、典型的にはリボース環（ＬＮＡ）上のＣ２炭素とＣ４炭素との間のビラジカル架橋を有するヘキソース環（ＨＮＡ）又は二環式環、又は典型的にはＣ２炭素とＣ３炭素との間の結合を欠く非連結リボース環（例えば、ＵＮＡ）の置換によって、リボース環構造が修飾されたものが含まれる。他の糖修飾ヌクレオシドには、例えば、ビシクロヘキソース核酸（国際公開第２０１１／０１７５２１号パンフレット）又は三環核酸（国際公開第２０１３／１５４７９８号パンフレット）が含まれる。修飾ヌクレオシドはまた、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）又はモルホリノ核酸の場合、糖部分が非糖部分で置換されたヌクレオシドも含む。
糖修飾にはまた、リボース環上の置換基を、水素以外の基、又はＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオシド内に天然に存在する２’−ＯＨ基に変更することによって施される修飾も含まれる。置換基は、例えば、２’、３’、４’又は５’の位置に導入することができる。修飾糖部分を有するヌクレオシドにはまた、２’修飾ヌクレオシド、例えば２’置換ヌクレオシドも含まれる。実際、２’置換ヌクレオシドの開発にかなりの焦点が当てられてきており、２’置換ヌクレオシドの多くは、オリゴヌクレオチドに取り込まれたときに、ヌクレオシド耐性の増強及び親和性の増強などの有益な特性を呈することが見出されている。
２’修飾ヌクレオシド。
２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位（２’置換ヌクレオシド）にＨもしくは−ＯＨ以外の置換基を有するか、又は２’結合されたビラジドを含み、２’置換ヌクレオシド及びＬＮＡ（２’〜４’ビラジカル架橋）ヌクレオシドを含む。例えば、２’修飾糖は、結合親和性の増大、及び／又はオリゴヌクレオチドに対するヌクレアーゼ耐性の増加をもたらしうる。２’置換修飾ヌクレオシドの例は、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＲＮＡ、及び２’−Ｆ−ＡＮＡヌクレオシドである。更なる例については、例えば、Freier & Altmann；Nucl.Acid Res., 1997, 25, 4429-4443及びUhlmann；Curr.Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213、ならびにDeleavey及びDamha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937を参照のこと。以下は、幾つかの２’置換修飾ヌクレオシドの図である。
ロックド核酸ヌクレオシド（ＬＮＡ）。
ＬＮＡヌクレオシドは、Ｃ２’とＣ４’との間にリンカー基（ビラジカル又はブリッジと呼ばれる）を含む、修飾ヌクレオシドである。これらのヌクレオシドは、文献中では、架橋核酸又は二環式核酸（ＢＮＡ）とも呼ばれる。
幾つかの実施形態において、本発明のオリゴマーの修飾ヌクレオシド又はＬＮＡヌクレオシドは、式Ｉ又は式ＩＩの一般構造を有する。
式中、Ｗは−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒa）−、−Ｃ（ＲaＲb）−、例えば、幾つかの実施形態では−Ｏ−から選択され、Ｂは、核酸塩基又は修飾核酸塩基部分を表し、Ｚは、隣接ヌクレオシド、又は５’末端基へのヌクレオシド間結合を表し、Ｚ*は、隣接するヌクレオシド、又は３’末端基へのヌクレオシド間結合を表し、Ｘは、−Ｃ（ＲaＲb）−、−Ｃ（Ｒa）＝Ｃ（Ｒb）−、−Ｃ（Ｒa）＝Ｎ−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒa）2−、−Ｓ−、−ＳＯ2−、−Ｎ（Ｒa）−、及び＞Ｃ＝Ｚからなるリストから選択される基を表す。
幾つかの実施形態において、Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−、ＮＨ−、ＮＲaＲb、−ＣＨ2−、ＣＲaＲb、−Ｃ（＝ＣＨ2）−、及び−Ｃ（＝ＣＲaＲb）−からなる群から選択される。
幾つかの実施形態において、Ｘは、−Ｏ−である。
Ｙは、−Ｃ（ＲaＲb）−、−Ｃ（Ｒa）＝Ｃ（Ｒb）−、−Ｃ（Ｒa）＝Ｎ−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒa）2−、−Ｓ−、−ＳＯ2−、−Ｎ（Ｒa）−、及び＞Ｃ＝Ｚからなる群から選択される基を表す。
幾つかの実施形態において、Ｙは、−ＣＨ2−、−Ｃ（ＲaＲb）−、−ＣＨ2ＣＨ2−、−Ｃ（ＲaＲb）−Ｃ（ＲaＲb）−、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−、−Ｃ（ＲaＲb）Ｃ（ＲaＲb）Ｃ（ＲaＲb）−、−Ｃ（Ｒa）＝Ｃ（Ｒb）−、及び−Ｃ（Ｒa）＝Ｎ−からなる群から選択される。
幾つかの実施形態において、Ｙは、−ＣＨ2−、−ＣＨＲa−、−ＣＨＣＨ3−、ＣＲaＲb−
又は−Ｘ−Ｙ−からなる群から選択され、共に２価リンカー基（基質とも呼ばれる）を表し、−Ｃ（ＲaＲb）−、−Ｃ（Ｒa）＝Ｃ（Ｒb）−、−Ｃ（Ｒa）＝Ｎ−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒa）2−、−Ｓ−、−ＳＯ2−、−Ｎ（Ｒa）−、及び＞Ｃ＝Ｚからなる群から選択される１、２、３又は４基／原子からなる２価リンカー基を表す。
幾つかの実施形態において、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｘ−ＣＨ2−、−Ｘ−ＣＲaＲb−、−Ｘ−ＣＨＲa-、−Ｘ−Ｃ（ＨＣＨ3）-、−Ｏ−Ｙ−、−Ｏ−ＣＨ2−、−Ｓ−ＣＨ2−、−ＮＨ−ＣＨ2−、−Ｏ−ＣＨＣＨ3−、−ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ3ＣＨ3）−、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−、ＯＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−、−Ｏ−ＣＨ2ＯＣＨ2−、−Ｏ−ＮＣＨ2−、−Ｃ（＝ＣＨ２）−ＣＨ2−、−ＮＲa−ＣＨ2−、Ｎ−Ｏ−ＣＨ2、−Ｓ−ＣＲaＲb−及び−Ｓ−ＣＨＲa−からなる群から選択されるビラジカルを表す。
幾つかの実施形態において、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ2−又は−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ3）−を表し、式中、Ｚは−Ｏ−、−Ｓ−、及び−Ｎ（Ｒa）−から選択され、且つＲaはＲbを表す場合、各々が独立に、水素、任意で置換されたＣ1-6−アルキル、任意で置換されたＣ2-6−アルケニル、任意で置換されたＣ2-6−アルキニル、ヒドロキシ、任意で置換されたＣ1-6−アルコキシ、Ｃ2-6−アルケニルオキシ、Ｃ2-6−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ1-6−アルコキシカルボニル、Ｃ1-6−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシカルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ−カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ；モノ−及びジ（Ｃ1-6−アルキル）アミノ、カルバモイル；モノ−及びジ（Ｃ1-6−アルキル）−アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ1-6−アルキル−アミノカルボニル；モノ−及びジ（Ｃ1-6−アルキル）アミノ−Ｃ1-6−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ1-6−アルキルカルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ1-6−アルカノイルオキシ、スルホノ（sulphono）、Ｃ1-6−アルキルスルホノ（sulphono）オキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ1-6−アルキルチオ、ハロゲンから選択され、アリール及びヘテロアリールは任意で置換されていてもよく、２つのジェミナル置換基Ｒa及びＲbは一緒になって、置換されていてもよいメチレン（＝ＣＨ2）を示すことができ、ここで、全てのキラル中心について、不斉基はＲ又はＳ配向のいずれかに見出されうる。
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5及びＲ5*は独立に、水素、任意で置換されたＣ1-6−アルキル、任意に置換されたＣ2-6−アルケニル、任意で置換されたＣ2-6−アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ1-6−アルコキシ、Ｃ2-6−アルケニルオキシ、Ｃ2-6−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ1-6−アルコキシカルボニル、Ｃ1-6−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシカルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ−カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ；モノ−及びジ（Ｃ1-6−アルキル）アミノ、カルバモイル；モノ−及びジ（Ｃ1-6−アルキル）−アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ1-6−アルキル−アミノカルボニル；モノ−及びジ（Ｃ1-6−アルキル）アミノ−Ｃ1-6−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ1-6−アルキルカルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ1-6−アルカノイルオキシ、スルホノ（sulphono）、Ｃ1-6−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ1-6−アルキルチオ、ハロゲンからなる群から選択され、アリール及びヘテロアリールは任意で置換可能であり、且つ２つのジェミナル置換基が一緒になってオキソ、チオキソ、イミノ及び任意で置換されるメチレンを表しうる。
幾つかの実施形態において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5及びＲ5*が独立に、Ｃ1-6アルキル（例えば、メチル及び水素）から選択される。
幾つかの実施形態において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5及びＲ5*は全ていずれも水素である。
幾つかの実施形態において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3はいずれも水素であり、同様にＲ5及びＲ5*のいずれかは水素であり、且つＲ5及びＲ5*のうちの他方は水素以外（例えば、メチル等のＣ1-6アルキル）である。
幾つかの実施形態において、Ｒaは、水素又はメチルのいずれかである。幾つかの実施形態において、存在する場合、Ｒbは、水素又はメチルのいずれかである。
幾つかの実施形態において、Ｒa及びＲbの一方又は両方は、水素である。
幾つかの実施形態において、Ｒa及びＲbの一方は水素であり、他方は水素以外である。
幾つかの実施形態において、Ｒa及びＲbの一方はメチルであり、他方は水素である。
幾つかの実施形態において、Ｒa及びＲbは両方ともメチルである。
幾つかの実施形態において、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ2−であり、ＷはＯであり、且つＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5及びＲ5*は全ていずれも水素である。そのようなＬＮＡヌクレオシドは、いずれも本明細書において参照により援用されている国際公開第９９／０１４２２６号パンフレット、国際公開第００／６６６０４号パンフレット、国際公開第９８／０３９３５２号パンフレット、及び国際公開第２００４／０４６１６０号パンフレットに開示されており、β−Ｄ−オキシＬＮＡ及びα−Ｌ−オキシＬＮＡヌクレオシドと俗称されているものが挙げられる。
幾つかの実施形態において、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は−Ｓ−ＣＨ2−であり、ＷはＯであり、且つＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5及びＲ5*は全ていずれも水素である。そのようなチオＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第９９／０１４２２６号パンフレット、及び国際公開第２００４／０４６１６０号パンフレットに開示されている。これらの出願は、本明細書において参照により援用されている。
幾つかの実施形態において、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は−ＮＨ−ＣＨ2−であり、ＷはＯであり、且つＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5及びＲ5*は全ていずれも水素である。そのようなアミノＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第９９／０１４２２６号パンフレット、及び国際公開第２００４／０４６１６０号パンフレットに開示されている。これらの出願は、本明細書において参照により援用されている。
幾つかの実施形態において、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−又は−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−であり、ＷはＯであり、且つＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5及びＲ5*は全ていずれも水素である。そのようなＬＮＡヌクレオシドは、本明細書中で参照により援用されている国際公開第００／０４７５９９号パンフレット、及びMorita et al, Bioorganic & Med.Chem.Lett.12 73-76に開示されており、２’−Ｏ−４’Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）と俗称されているものを含む。
幾つかの実施形態において、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ2−であり、ＷはＯであり、且つＲ1、Ｒ2及びＲ3の全てならびにＲ5及びＲ5*のうちの一方は水素で、これらＲ5及びＲ5*のうちの他方は水素以外、例えばメチル等のＣ1-6アルキル）である。そのような５’置換ＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第２００７／１３４１８１号パンフレットに開示されている。この出願は、本明細書において参照により援用されている。
幾つかの実施形態において、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＲaＲb−であり、Ｒa及びＲbの一方又は両方は水素以外（例えばメチル）であり、ＷはＯであり、且つＲ1、Ｒ2及びＲ3の全てならびにＲ5及びＲ5*のうちの一方は水素で、これらＲ5及びＲ5*のうちの他方は水素以外（例えばメチル等のＣ1-6アルキル）である。そのようなビス修飾ＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第２０１０／０７７５７８号パンフレットに開示されている。この出願は、本明細書において参照により援用されている。
幾つかの実施形態において、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は、２価リンカー基−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ2ＯＣＨ3）−（２’Ｏ−メトキシエチル二環式核酸を表す（Seth at al., 2010, J. Org.Chem.Vol 75(5) pp. 1569-81）。幾つかの実施形態において、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は、２価リンカー基−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ2ＣＨ3）−（２’Ｏ−エチル二環式核酸を表す（Seth at al., 2010, J. Org.Chem.Vol 75(5) pp. 1569-81）。幾つかの実施形態において、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨＲa−であり、ＷはＯであり、且つＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5及びＲ5*は全ていずれも水素である。そのような６’置換ＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第１００３６６９８号パンフレット、及び国際公開第０７０９００７１号パンフレットに開示されている。これらの出願は両方とも本明細書において参照により援用されている。
幾つかの実施形態において、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ2ＯＣＨ3）−、ＷはＯであり、且つＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5及びＲ5*は全ていずれも水素である。そのようなＬＮＡヌクレオシドは、当該技術分野において環状ＭＯＥ（ｃＭＯＥ）としても公知であり、国際公開第０７０９００７１号パンフレットに開示されている。
幾つかの実施形態において、−Ｒ−又はＳ−のいずれかの構成内で、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は、２価リンカー基−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ3）−を表す。幾つかの実施形態において、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は共に、２価リンカー基−Ｏ−ＣＨ2-Ｏ−ＣＨ2を表す（Seth at al., 2010, J. Org.Chem）。幾つかの実施形態において、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ3）−、ＷはＯであり、且つＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5及びＲ5*は全ていずれも水素である。そのような６’メチルＬＮＡヌクレオシドは、当該分野においてｃＥＴヌクレオシドとしても知られており、国際公開第０７０９００７１号パンフレット（β−Ｄ）、及び国際公開第２０１０／０３６６９８号パンフレット（α−Ｌ）に開示されている（Ｓ）ｃＥＴ又は（Ｒ）ｃＥＴ立体異性体のいずれかでありうる。これらの出願は両方とも本明細書において参照により援用されている）。
幾つかの実施形態において、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＲaＲb−であり、Ｒa又はＲbはいずれも水素ではなく、ＷはＯであり、且つＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5及びＲ5*は全ていずれも水素である。幾つかの実施形態において、Ｒa及びＲbは両方ともメチルである。そのような６’二置換ＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第２００９００６４７８号パンフレットに開示されている。この出願は、本明細書において参照により援用されている。
幾つかの実施形態において、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は−Ｓ−ＣＨＲa−であり、ＷはＯであり、且つＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5及びＲ5*は全ていずれも水素である。そのような６’置換チオＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第１１１５６２０２号パンフレットに開示されており、この出願は、本明細書において参照により援用されている。幾つかの６’置換チオＬＮＡの実施形態において、Ｒaはメチルである。
幾つかの実施形態において、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は、−Ｃ（＝ＣＨ２）−Ｃ（ＲaＲb）−、例えば−Ｃ（＝ＣＨ2）−ＣＨ2−であるか、又は−Ｃ（＝ＣＨ2）−ＣＨ（ＣＨ3）−ＷはＯであり、且つＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5及びＲ5*は全ていずれも水素である。そのようなビニルカーボＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第０８１５４４０１号パンフレット、及び国際公開第０９０６７６４７号パンフレットに開示されており、これらの出願は両方とも本明細書において参照により援用されている。
幾つかの実施形態において、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は−Ｎ（−ＯＲa）−、ＷはＯであり、且つＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5及びＲ5*は全ていずれも水素である。幾つかの実施形態において、Ｒaは、メチル等のＣ1-6アルキルである。そのようなＬＮＡヌクレオシドは、Ｎ置換ＬＮＡとしても公知であり、本明細書において参照により援用されている国際公開第２００８／１５０７２９号パンフレットに開示されている。幾つかの実施形態において、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は、２価リンカー基−Ｏ−ＮＲa−ＣＨ3を一緒に指定する（Seth at al., 2010, J. Org.Chem）。幾つかの実施形態において、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は、−Ｎ（Ｒa）−、ＷはＯであり、且つＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5及びＲ5*は全ていずれも水素である。幾つかの実施形態において、Ｒaは、Ｃ1-6アルキル、例えばメチルである。
幾つかの実施形態において、Ｒ5及びＲ5*のうちの一方又は両方は水素であり、且つ置換時に、Ｒ5及びＲ5*のうちの他方は、Ｃ1-6アルキル、例えばメチルである。そのような実施形態において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3はいずれも水素であってよいし、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は、−Ｏ−ＣＨ２−又は−Ｏ−Ｃ（ＨＣＲa）−、例えば−Ｏ−Ｃ（ＨＣＨ３）−から選択可能である。
幾つかの実施形態において、ビラジカルは、−ＣＲaＲb−Ｏ−ＣＲaＲb−、例えばＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2−、ＷはＯであり、且つＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5及びＲ5*は全ていずれも水素である。幾つかの実施形態において、Ｒaは、Ｃ1-6アルキル、例えばメチルである。そのようなＬＮＡヌクレオシドは、立体構造的に制限されたヌクレオチド（ＣＲＮ）としても知られており、国際公開第２０１３０３６８６８号パンフレットに開示されている。この出願は、本明細書において参照により援用されている。
幾つかの実施形態において、ビラジカルは、−Ｏ−ＣＲaＲb−Ｏ−ＣＲaＲb−、例えばＯ−ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2−、ＷはＯであり、且つＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5及びＲ5*は全ていずれも水素である。幾つかの実施形態において、ＲaはＣ1-6アルキル、例えばメチルである。そのようなＬＮＡヌクレオシドは、ＣＯＣヌクレオチドとしても知られており、Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009 37(4), 1225-1238に開示されており、この出願は、本明細書において参照により援用されている。
指定されない限り、ＬＮＡヌクレオシドはβ−Ｄ又はα−Ｌ立体異性体でありうることが認識されるであろう。
ＬＮＡヌクレオシドの或る例は、スキーム１に図示されている。
実施例に例証されているように、本発明の幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチド中のＬＮＡヌクレオシドは、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオシドである。
ヌクレアーゼ媒介分解
ヌクレアーゼ媒介分解は、そのような配列と二本鎖を形成する場合、相補的なヌクレオチド配列の分解を媒介できるオリゴヌクレオチドを指す。
幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、本発明のオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ、特にエンドヌクレアーゼ、好ましくはエンドヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、例えばＲＮアーゼＨを補充する能力を有する標的核酸のヌクレアーゼ媒介性分解を介して機能できる。ヌクレアーゼ媒介機構は、典型的に少なくとも５もしくは６個のＤＮＡヌクレオシドの領域を含み、親和性を高めるヌクレオシド、例えばギャップマー、ヘッダー及びテールマーによって片側又は両側に隣接するオリゴヌクレオチドである。
ＲＮアーゼＨの活性及び補充
アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮアーゼＨ活性は、相補的ＲＮＡ分子と二本鎖を成す場合にＲＮアーゼＨを補充する能力を指す。国際公開第０１／２３６１３号パンフレットは、ＲＮアーゼＨを補充する能力を決定するために使用できるＲＮアーゼＨ活性を測定するためのインビトロの方法を提供するものである。オリゴヌクレオチドは典型的に、ＲＮアーゼＨを補充する能力を有すると考えられ、相補的な標的核酸配列が提供されているとき、初期速度をｐｍｏｌ／ｌ／ｍｉｎで測定した場合に、定量された初期速度の少なくとも５％、例えば少なくとも１０％又は２０％超の初期速度を有する（試験対象の修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するオリゴヌクレオチドで、但し、オリゴヌクレオチド中の全てのモノマー間のホスホロチオエート結合を有するＤＮＡモノマーのみを含有するものを使用し、且つ本明細書において参照により援用されている国際公開第０１／２３６１３号パンフレットの実施例９１〜９５に記載の方法論を使用した場合）。
ギャップマー
本明細書において「ギャップマー」という用語は、１つ以上の親和性を増強する修飾ヌクレオシド（側面又はウイング）を含む領域によって５’及び３’に隣接するＲＮアーゼＨ補充オリゴヌクレオチド（ギャップ）の領域を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。様々なギャップマーデザインが、本明細書に記載されており、ＲＮアーゼＨを補充する能力によって特徴付けられる。ヘッダー及びテールマーは、側面のうちの１つが欠けている、すなわちオリゴヌクレオチドの末端のうちの１つのみが親和性を増強する修飾ヌクレオシドを含む、ＲＮアーゼＨを補充する能力を有するオリゴヌクレオチドである。頭部の場合、３’側面は欠けている（すなわち、５’側面は親和性修飾ヌクレオシドを含む）、テールマーは５’側面が欠けている（すなわち、３’側面は親和性修飾ヌクレオシドを含む）。
ＬＮＡギャップマー
ＬＮＡギャップマーという用語は、親和性増強修飾ヌクレオシドのうちの少なくとも１つがＬＮＡヌクレオシドである、ギャップマー オリゴヌクレオチドを言う。
混合ウイングギャップマー
混合ウイングギャプマー又は混合側面ギャップマーという用語は、側面領域のうちの少なくとも１つが、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドと、少なくとも１つの非ＬＮＡ修飾ヌクレオシド（例えば、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＲＮＡ及び２’−Ｆ−ＡＮＡヌクレオシドのような、少なくとも１つの２’−置換修飾ヌクレオシド）と、を含んでなるＬＮＡギャプマーを指す。幾つかの実施形態において、混合ウイングギャップマーは、一方の側面にＬＮＡヌクレオシド（例えば、５’又は３’）のみを含み、他方の側面（それぞれ３’又は５’）に２’置換修飾ヌクレオシド及び任意でＬＮＡヌクレオシドを含む。
ギャップブレイカー
「ギャップブレイカー・オリゴヌクレオチド」という用語は、ギャップ領域が非ＲＮアーゼＨ補充ヌクレオシド（ギャップブレイカー・ヌクレオシド、Ｅ）で破壊された結果、ギャップ領域内に含まれる連続ＤＮＡヌクレオシド数が５未満となった場合でもＲＮアーゼＨの補充を維持する能力を有するギャップマーに関して使用される。非ＲＮアーゼＨ補充ヌクレオシドは、例えば、ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’との間の架橋がβ−Ｄ−オキシＬＮＡ又はＳｃＥＴヌクレオシドのようなβ立体配座にある、ＬＮＡのような３’末端立体構造のヌクレオシドである。ギャップブレイカー・オリゴヌクレオチドがＲＮアーゼＨを補充する能力は、典型的に、配列特異的、又は化合物特異的でさえある（Rukov et al.2015 Nucl.Acids Res.Vol. 43 pp. 8476-8487を参照）。本文献には、「ギャップブレイカー」オリゴヌクレオチドが開示されている。このギャップブレイカー・オリゴヌクレオチドは、幾つかの例において標的ＲＮＡのより特異的な開裂を提供するＲＮアーゼＨを補充するものである。
幾つかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ギャップブレイカー・オリゴヌクレオチドである。幾つかの実施形態において、ギャップブレイカー・オリゴヌクレオチドは、５’−側面（Ｆ）とギャップ（Ｇ）と３’−側面（Ｆ’）とを含み、非ＲＮアーゼＨ補充ヌクレオシド（ギャップブロッカーヌクレオシド、Ｅ）によってギャップが破壊され、ギャップ中に、少なくとも３又は４個の連続ＤＮＡヌクレオシドが含まれるようになる。幾つかの実施形態において、ギャップブレイカー・ヌクレオシド（Ｅ）がＬＮＡヌクレオシドであり、ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’との間の架橋がβ立体配座であり、ギャップ領域内に配置されていて、ギャップ・ブレーカーＬＮＡヌクレオシドが少なくとも３’（５’）及び３（３’）ＤＮＡヌクレオシド、又は少なくとも３（５’）及び４（３’）ＤＮＡヌクレオシド、又は少なくとも４（５’）及び３（３’）ＤＮＡヌクレオシド隣接した５’ならびに３’であり、且つオリゴヌクレオチドがＲＮアーゼＨを補充する能力を有する。
ギャップブレイカー・オリゴヌクレオチドは、次式で表すことができる。
Ｆ−Ｇ−Ｅ−Ｇ−Ｆ’；特にＦ1-7−Ｇ3-4−Ｅ1−Ｇ3-4−Ｆ’1-7
Ｄ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’、特にＤ’1-3−Ｆ1-7−Ｇ3-4−Ｅ1−Ｇ3-4−Ｆ’1-7
Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ”、特にＦ1-7−Ｇ3-4−Ｅ1−Ｇ3-4−Ｆ’1-7−Ｄ”1-3
Ｄ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ”、特にＤ’1-3−Ｆ1-7−Ｇ3-4−Ｅ1−Ｇ3-4-−Ｆ’1-7−Ｄ”1-3
領域Ｄ’及びＤ”は、「ギャップマーデザイン」の節に記載されている。
幾つかの実施形態において、ギャップブレイカー・ヌクレオシド（Ｅ）は、スキーム１に図示されているβ−Ｄ−オキシＬＮＡ又はＳｃＥＴ、又は別のβ−ＬＮＡヌクレオシドである。
コンジュゲート
本明細書において、コンジュゲートという用語は、非ヌクレオチド部分（結合部分又は領域Ｃ又は第３の領域）に共有結合しているオリオゴヌクレオチドを指し、オリゴヌクレオチドコンジュゲートとも呼ばれる。
本発明のオリゴヌクレオチドが１以上の非ヌクレオチド部分に結合されている場合、オリゴヌクレオチドの薬理を改善しうる。オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、細胞取り込み又は安定性に影響を与えることによって達成される。幾つかの実施形態において、結合部分はオリゴヌクレオチドを肝臓に対して標的化する。同時に、コンジュゲートは、非標的細胞型、組織又は器官（例えば、組織もしくは臓器）におけるオリゴヌクレオチドの活性を低下させるように機能し、対象外の細胞型、組織又は器官における標的活性又は活性を遮断する。本発明の一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、非コンジュゲートオリゴヌクレオチドと比較して、標的細胞におけるＰＤ−Ｌ１の阻害が改善されていることを示す。別の実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、非結合オリゴヌクレオチドと比較して、肝臓と、脾臓又は腎臓のような、他の器官との間の細胞分布が改善されている。すなわち、結合オリゴヌクレオチドは、脾臓又は腎臓によりも寧ろ肝臓に移行しがちである。別の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲートによって、結合オリゴヌクレオチドと比較した場合、結合オリゴヌクレオチドの肝臓への細胞の取り込みが改善されたことが明らかにされる。
国際公開第９３／０７８８３号パンフレット、及び国際公開第２０１３／０３３２３０号パンフレットは、好適な結合部分を提供するものであり、これらの出願は、本明細書において参照により援用されている。結合部分は、アシアロ糖タクパク質受容体（ＡＳＧＰｒ）に結合する能力を有するものが、更に好適とされる。特に、３価Ｎ−アセチルガラクトサミン結合部分は、ＡＳＧＰｒへの結合に適している。例えば、本明細書において参照により援用されている、国際公開第２０１４／０７６１９６号パンフレット、国際公開第２０１４／２０７２３２号パンフレット、及び国際公開第２０１４／１７９６２０号パンフレットを参照のこと。この結合部分は、本質的に、核酸から構成されていないアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートの一部である。
オリゴヌクレオチドコンジュゲート及びその合成についてはまた、Manoharan in Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T.Crooke, ed., Ch. 16, Marcel Dekker, Inc., 2001、及びManoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103による包括的総評もレポートされており、これらの文献は、その全容が本明細書において参照により援用されている。
或る実施形態において、非ヌクレオチド部分（結合部分）は、炭水化物、細胞表面受容体リガンド、薬物物質、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素（例えば細菌毒素）、ビタミン、ウイルスタンパク質（例えばカプシド）又はこれらの組み合わせからなる群から選択される。
リンカー
連鎖（linkage）又はリンカーは、１つの化学基又は関心のあるセグメントを１つ以上の共有結合を介して別の化学基又は関心対象のセグメントに連結する２つの原子間の結合である。結合部分は、オリゴヌクレオチドに直接又は連結部分（例えば、リンカーもしくはテザー）を介して結合させることができる。リンカーは、第３の領域、例えば結合部分（領域Ｃ）を、第１の領域、例えば標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列（領域Ａ）に共有結合するように機能する。
本発明の幾つかの実施形態において、本発明のコンジュゲート又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、任意で、標的核酸（第１の領域、すなわち領域Ａ）に相補的なオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列と結合部分（第３の領域、すなわち領域Ｃ）との間に位置するリンカー領域（第２の領域、すなわち領域Ｂ及び／もしくは領域Ｙ）を含む。
領域Ｂは、哺乳類の体内で通常遭遇するか又は遭遇するものに類似した条件下にて開裂可能な生理学的に易変的な結合を含むか又はそれからなる、生体開裂性リンカーを指す。生理学的に易変的なリンカーが化学的変換（例えば開裂）を受ける条件は、ｐＨ、温度、酸化的もしくは還元的条件又は薬剤等の化学的条件、及び哺乳類細胞内で見つかる塩濃度又は遭遇するものに類似の塩濃度を含む。哺乳類の細胞内状態にはまた、タンパク質分解酵素、加水分解酵素又はヌクレアーゼなどの哺乳動物細胞に通常存在する酵素活性の存在も含まれる。一実施形態において、生体開裂性リンカーは、Ｓ１ヌクレアーゼの開裂に感受性である。好ましい実施形態において、ヌクレアーゼ感受性リンカーは、１〜１０ヌクレオシド、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ヌクレオシド、より好ましくは２〜６ヌクレオシド、最も好ましくは少なくとも２連続ホスホジエステル結合、例えば少なくとも３又は４又は５連続ホスホジエステル結合、２〜４連結ヌクレオシドを含む。ヌクレオシドは、ＤＮＡ又はＲＮＡが好ましい。ホスホジエステル含有の生体開裂性リンカーは、本明細書中で参照により援用されている国際公開第２０１４／０７６１９５号パンフレットに詳述されている。
領域Ｙは、必ずしも生体開裂性ではないが、主に、結合部分（領域Ｃ又は第３領域）を、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列（領域Ａ又は第１領域）に共有結合させる機能を果たすリンカーをいう。領域Ｙのリンカーは、エチレングリコール、アミノ酸単位又はアミノアルキル基などの繰り返し単位の鎖構造又はオリゴマーを含みうる。本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、Ａ−Ｂ−Ｃ、Ａ−Ｂ−Ｙ−Ｃ、Ａ−Ｙ−Ｂ−Ｃ又はＡ−Ｙ−Ｃのように構成できる。幾つかの実施形態において、リンカー（領域Ｙ）は、アミノアルキル（例えば、Ｃ６−Ｃ１２アミノアルキル基等のＣ２−Ｃ３６アミノアルキル基）である。好ましい実施形態において、リンカー（領域Ｙ）は、Ｃ６アミノアルキル基である。
処置
本明細書において「処置」という用語は、既存の疾患（例えば、本明細書で言及する疾患もしくは障害）の治療、又は疾患の防止、すなわち予防を指す。したがって、幾つかの実施形態において本明細書中で言及される治療は予防的でありうることが認識されるであろう。
病原体に対する免疫応答の回復
免疫応答は、先天性及び適応性の免疫応答に分類される。自然免疫系は、即時的ではあるが非特異的な応答を提供するものである。適応免疫応答は、自然免疫応答によって活性化され、特定の病原体に対して高度に特異的である。抗原提示細胞の表面上に病原体由来抗原が提示されると、適応免疫応答の免疫細胞（すなわち、Ｔリンパ球及びＢリンパ球）が、抗原特異的受容体を介して活性化され、病原性特異的免疫応答、及び免疫記憶の発生につながる。ＨＢＶ及びＨＣＶのような慢性ウイルス感染症は、ウイルス特異的Ｔ細胞の非応答性を特徴とするＴ細胞枯渇と関連している。T細胞の疲弊は充分に研究され、総説については、例えばYi et al 2010 Immunology129, 474-481を参照のこと。慢性ウイルス感染はまた、先天性免疫細胞であるＮＫ細胞の機能低下に関連する。慢性感染のクリアランスのためには、ウイルス免疫応答の強化が重要である。Ｔ細胞及びＮＫ細胞媒介性の病原体に対する免疫応答の回復は、増殖、サイトカイン分泌及び細胞溶解性機能の測定によって評価できる（Dolina et al.2013 Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2 e72、及び本明細書中の実施例６）。
本発明は、動物、特にヒトに感染した病原体に対する免疫応答を回復させるための、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びそのコンジュゲート、ならびにこれらを含む医薬組成物の使用に関する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、肝臓に感染した病原体、特にＨＢＶのような慢性肝臓感染症に対して、特に有用である。コンジュゲートは、オリゴヌクレオチドの分布の標的化を可能にし、標的核酸の全身的ノックダウンを防止する。
本発明のオリゴヌクレオチド
本発明は、ＰＤ−Ｌ１の発現を調節できるオリゴヌクレオチドに関する。調節は、ＰＤ−Ｌ１をコードする標的核酸又はＰＤ−Ｌ１の調節に関与する標的核酸にハイブリダイズによって達成できる。標的核酸は、（例えば、配列番号：１、配列番号：２及び／又は配列番号：３からなる群から選択される配列）哺乳類ＰＤ−Ｌ１配列でありうる。標的核酸は、ＰＤ−Ｌ１の発現又は調節を支持する哺乳類の細胞から発現されたプレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ又は任意のＲＮＡ配列であってもよい。
本発明のオリゴヌクレオチドは、ＰＤ−Ｌ１を標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
本発明の一態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、結合部分、特にアシアロ糖タンパク質受容体標的化結合部分に結合されている。
幾つかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを阻害又は下方制御することによって標的の発現を調節できる。そのような調節によって、標的の正常発現レベルと比較して少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％標的の正常発現レベルを生ずることが好ましい。細胞もしくは生物体を感染性薬剤で抗原投与した場合、又は感染性薬剤で抗原投与をシミュレートする薬剤（例えば、ポリＩ：ＣもしくはＬＰＳ）で処置した場合、そのような調節によって、発現レベルと比較して少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％の発現の阻害を生ずることが好ましい。幾つかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドを、ＫＡＲＰＡＳ−２９９又はＴＨＰ１細胞を使用して、ＰＤ−Ｌ１のｍＲＮＡの発現レベルをインビボで少なくとも６０％又は７０％阻害できる可能性がある。幾つかの実施形態では、本発明の化合物を、ＫＡＲＰＡＳ−２９９又はＴＨＰ１細胞を使用して、ＰＤ−Ｌ１タンパク質の発現レベルをインビボで少なくとも５０％阻害できる可能性がある。好適には、実施例は、ＰＤ−Ｌ１ＲＮＡ（例えば、実施例１）を測定するために使用できるアッセイを提供する。標的の調節は、オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列と標的核酸との間のハイブリダイゼーションによって誘発される。幾つかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間のミスマッチを含む。ミスマッチに関係なく、標的核酸へのハイブリダイゼーションは、依然としてＰＤ−Ｌ１発現の所望の調節を示すのに充分でありうる。ミスマッチの結果として結合親和性が低減した場合、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチド数を増加させることによって、且つ／あるいは、標的（例えば、オリゴヌクレオチド配列内に存在する、ＬＮＡ等の２’修飾ヌクレオシド）に対する結合親和性を増強することによって、補償するのが有利な場合がある。
幾つかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、病原体特異的Ｔ細胞を回復させる機能を有する。幾つかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、未処置対照、又は標準ケアで処置された対照と比較した場合、病原体特異的Ｔ細胞を少なくとも４０％、５０％、６０％又は７０％増加させる機能を有する。一実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はコンジュゲートは、未処置対照、又は標準ケアで処置された対照と比較して、ＨＢＶ特異的Ｔ細胞を増加させる機能を有する。実施例は、ＨＢＶ特異的Ｔ細胞（例えば、Ｔ細胞増殖、サイトカイン分泌及び細胞溶解活性）を測定するために使用できるアッセイを提供するのが好適である。別の実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はコンジュゲートは、未処置対照、又は標準ケアで処置された対照と比較して、ＨＣＶ特異的Ｔ細胞を増加させる機能を有する。別の実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はコンジュゲートは、未処置対照、又は標準ケアで処置された対照と比較して、ＨＤＶ特異的Ｔ細胞を増加させることができる。
幾つかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは動物又はヒトのＨＢｓ抗原レベルを低減させることができる。幾つかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、処置前のレベルと比較して、ＨＢｓ抗原レベルを少なくとも４０％、５０％、６０％又は７０％、より好ましくは少なくとも８０％、９０％又は９５％低減させることができる。本発明のオリゴヌクレオチドを、ＨＢＶに感染した動物又はヒトにおけるＨＢｓ抗原の血清変換を達成できることが、最も好ましい。
本発明の態様は、ＰＤ−Ｌ１標的核酸に対する相補性が少なくとも９０％である長さ１０〜３０ヌクレオチドからなる連続ヌクレオチド配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも９０％相補的、例えば標的核酸の領域に少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、又は１００％に対して相補的な連続配列を含む。
好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド、又はこれらの連続ヌクレオチド配列は、標的核酸の領域に完全に対して相補的である（１００％相補的である）、あるいは幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間に１つ又は２つのミスマッチを含む場合がある。
幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号：１又は配列番号：２内に存在する標的核酸領域に対して、少なくとも９０％相補的、例えば完全に（すなわち１００％）相補的である、１０〜３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチド配列は、配列番号：１及び配列番号：２内に存在する対応する標的核酸領域に対して１００％相補的である。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチド配列は、配列番号：１及び配列番号：３内に存在する対応する標的核酸領域に対して１００％相補的である。
幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、対応する標的核酸領域に対して少なくとも９０％相補性、例えば１００％相補性を有する長さ１０〜３０ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含み、連続ヌクレオチド配列が、配列番号：１上の位置３７１−３０６８、５４６７−１２１０７及び１５３１７−１９５１１からなる群から選択される標的核酸のサブ配列に対して相補的である。更なる実施形態において、標的核酸のサブ配列は、配列番号：１上の位置３７１−５１０、８２２−１０９０、１９９２−３０６８、５４６７−５６０６、６４７０−１２１０７、１５３１７−１５７２０、１５３１７−１８０８３、１８８８１−１９４９４及び１８８１−１９４９４からなる群から選択される。好ましい実施形態において、標的核酸のサブ配列は、配列番号：１上の位置７３００−７３３３、８０２８−８０７２、９８１２−９８５９、１１７８７−１１８７３及び１５６９０−１５７３５からなる群から選択される。
幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、配列番号：１内に存在する対応する標的核酸領域に対して、少なくとも９０％相補的、例えば１００％相補的である、１０〜３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含み、標的核酸領域は、表４の領域ａ１〜ａ４４９からなる群から選択される。
幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、ａ７、ａ２６、ａ４３、ａ１１９、ａ１４２、ａ１５９、ａ１６０、ａ１６３、ａ１６９、ａ１７８、ａ１７９、ａ１８０、ａ１８９、ａ２０１、ａ２０２、ａ２０４、ａ２１４、ａ２２１、ａ２２４、ａ２２６、ａ２４３、ａ２５４、ａ２５８、２６９、ａ２７４、ａ３５０、ａ３６０、ａ３６４、ａ３６５、ａ３７０、ａ３７２、ａ３８１、ａ３８３、ａ３８６、ａ３８９、ａ４００、ａ４２７、ａ４３５及びａ４３８からなる群から選択される標的核酸の領域に対して相補的である。
好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、ａ１６０、ａ１８０、ａ２２１、ａ２６９及びａ３６０からなる群から選択される標的核酸領域の領域に対して相補的である。
幾つかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドが、８〜３５ヌクレオチド長、例えば９〜３０、例えば１０〜２２、例えば１１〜２０、例えば１２〜１８、例えば１３〜１７又は１４〜１６連続ヌクレオチド長を含むか又はそれからなる。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１６〜２０ヌクレオチド長を含むか又はそれからなる。本明細書で示される任意の範囲は、範囲の端点を含むことを理解すべきである。したがって、オリゴヌクレオチドが１０〜３０ヌクレオチドを含むと言える場合、１０ヌクレオチドと３０ヌクレオチドの両方が含まれる。
幾つかの実施形態において、連続ヌクレオチド配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０連続ヌクレオチド長を含むか又はそれからなる。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１６、１７、１８、１９又は２０ヌクレオチド長を含むか又はそれからなる。
幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、表５に記載の配列からなる群から選択される配列を含むか又はそれからなる。
幾つかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列が、配列番号：５〜７４３なる群から選択される配列に対して少なくとも９０％同一、好ましくは１００％同一の１０〜３０ヌクレオチド長を含むか又はそれからなる（表５に掲載のモチーフ配列を参照のこと）。
幾つかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列が、配列番号：５〜７４３及び７７１からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％同一、好ましくは１００％同一の１０〜３０ヌクレオチド長を含むか又はそれからなる。
幾つかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号：６、８、９、１３、４１、４２、５８、７７、９２、１１１、１２８、１５１、１６４、１６６、１６９、１７１、２２２、２３３、２４５、２４６、２５０、２５１、２５２、２５６、２７２、２７３、２８７、２９２、３０３、３１４、３１８、３２０、３２４、３３６、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４９、３５９、３６０、３７４、４０８、４０９、４１５、４１７、４２４、４２９、４３０、４５８、４６４、４６６、４７４、４９０、４９３、５１２、５１９、５１９、５２９、５３３、５３４、５４７、５６６、５６７、５７８、５８２、６０１、６１９、６２０、６３６、６３７、６３８、６４０、６４５、６５０、６５１、６５２、６５３、６５８、６５９、６６０、６６５、６７８、６７９、６８０、６８２、６８３、６８４、６８７、６９４、７０６、７１６、７２８、７３３、７３４、及び７３５からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％同一、好ましくは１００％同一の１０〜３０ヌクレオチド長を含むか又はそれからなる。
幾つかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号：２８７に対して少なくとも９０％同一、好ましくは１００％同一の１０〜３０ヌクレオチド長を含むか又はそれからなる。
幾つかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号：３４２に対して少なくとも９０％同一、好ましくは１００％同一の１０〜３０ヌクレオチド長を含むか又はそれからなる。
幾つかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号：６４０に対して少なくとも９０％同一、好ましくは１００％同一の１０〜３０ヌクレオチド長を含むか又はそれからなる。
幾つかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号：４６６に対して少なくとも９０％同一、好ましくは１００％同一の１０〜３０ヌクレオチド長を含むか又はそれからなる。
幾つかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号：５６６に対して少なくとも９０％同一、好ましくは１００％同一の１０〜３０ヌクレオチド長を含むか又はそれからなる。
オリゴヌクレオチドが（標的核酸に相補的な）連続ヌクレオチド配列よりも長い実施形態において、表５のモチーフ配列は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列部分を形成する。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの配列は、（例えば、生体開裂性リンカーが添加されていない場合）連続的なヌクレオチド配列と同等である。
連続した核酸塩基配列（モチーフ配列）は、例えばヌクレアーゼ耐性及び／又は標的核酸への結合親和性が増強するように修飾可能なことが理解される。修飾については、「定義」及び「オリゴヌクレオチドデザイン」の節に記載されている。表５には、各モチーフ配列の好ましいデザインが列挙されている。
オリゴヌクレオチドデザイン
オリゴヌクレオチドデザインとは、オリゴヌクレオチド配列中のヌクレオシド糖修飾のパターンを指す。本発明のオリゴヌクレオチドは、糖修飾ヌクレオシドを含み、また、ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドを含む場合がある。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、糖修飾ヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドを含む。本発明のオリゴヌクレオチドに修飾ヌクレオシドを取り込むことによって、標的核酸に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増強できる。その場合、修飾ヌクレオシドは、親和性増強修飾ヌクレオチドと呼ばれる場合があり、修飾ヌクレオシドは単位と呼ばれる場合がある。
実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１修飾ヌクレオシド、例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５又は少なくとも１６修飾ヌクレオシドを含む。或る実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１〜１０修飾ヌクレオシド、例えば２〜８修飾ヌクレオシド、例えば３〜７修飾ヌクレオシド、例えば４〜６修飾ヌクレオシド、例えば３、４、５、６又は７修飾ヌクレオシドを含む。
実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１以上の糖修飾ヌクレオシド、例えば２’糖修飾ヌクレオシドを含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’−フルオロ−ＡＮＡ及びＬＮＡヌクレオシドからなる群から独立に選択された、１以上の２’糖修飾ヌクレオシドを含むことが、好ましい。更により好ましいのは、１以上の修飾ヌクレオシドは、ロックド核酸（ＬＮＡ）である。
更なる実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含む。好ましい実施形態において、連続ヌクレオチド配列内の全てのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート又はボラノホスフェートヌクレオシド間結合である。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの連続配列中の全てのヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
幾つかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシド、例えば１、２、３、４、５、６、７、又は８のＬＮＡヌクレオシド、例えば２〜６のＬＮＡヌクレオシド、例えば３〜７のＬＮＡヌクレオシド、４〜６のＬＮＡヌクレオシド又は３、４、５、６又は７のＬＮＡヌクレオシドを含む。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチド中の修飾ヌクレオシドの少なくとも７５％は、ＬＮＡヌクレオシドであり、修飾ヌクレオシドの例えば８０％、例えば８５％、例えば９０％はＬＮＡヌクレオシドである。なお更に実施形態において、オリゴヌクレオチド中の全ての修飾ヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。更なる実施形態において、オリゴヌクレオチドは、β−Ｄもしくはα−Ｌ構成又はそれらの組み合わせのいずれかに、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ及び以下のＬＮＡヌクレオシド（チオ−ＬＮＡ、アミノ−ＬＮＡ、オキシ−ＬＮＡ、及び／又はＥＮＡのうちの１以上）の両方を含みうる。更なる実施形態において、全てのＬＮＡシトシン単位は５−メチル−シトシンである。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、５’末端に少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドを有し、且つヌクレオチド配列の３’末端に少なくとも２つのＬＮＡヌクレオシドを有する。
幾つかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、２’−ＭＯＥ−ＲＮＡヌクレオシド（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の２’−ＭＯＥ−ＲＮＡヌクレオシド）である少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含む。幾つかの実施形態において、前記修飾ヌクレオシドのうちの少なくとも１つは、２’−フルオロ−ＤＮＡ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の２’−フルオロ−ＤＮＡヌクレオシドである。
幾つかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシド及び少なくとも１つの２’置換修飾ヌクレオシドを含む。
本発明の幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、２’糖修飾ヌクレオシド及びＤＮＡ単位の両方を含む。オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡ及びＤＮＡヌクレオシド（単位）の両方を含むのが好ましい。ＬＮＡ及びＤＮＡ単位の総計は、８〜３０（例えば、１０〜２５、好ましくは１２〜２２（例えば、１２〜１８、更により好ましくは１１〜１６であるのが、好ましい。本発明の幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列（例えば、連続ヌクレオチド配列）は少なくとも１つの又は２つのＬＮＡヌクレオシドからなり、残りのヌクレオシドはＤＮＡ単位である。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオシド、及び天然起源のヌクレオシド（ＲＮＡ又はＤＮＡ、最も好ましくはＤＮＡヌクレオシド）のみ、任意で、修飾ヌクレオシド間結合を有するもの（ホスホロチオエート等）を含む。
本発明の実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＲＮアーゼＨを補充する能力を有する。
本発明のオリゴヌクレオチドの構造デザインは、ギャプマー、ギャップブレイカー、ヘッドマー及びテールマーから選択できる。
ギャップマーデザイン
好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、本明細書中で単に「ギャップマー」とも呼ばれる、ギャップマーデザイン又は構造を有する。ギャップマー構造において、オリゴヌクレオチドは、５’側面、ギャップ及び３’−側面の、少なくとも３つの別個の構造領域、すなわち「'５−＞３’」配向のＦ−Ｇ−Ｆ’を含む。このデザインでは、フランキングＦ領域及びＦ’領域（ウイング領域とも呼ばれる）は、ＰＤ−Ｌ１標的核酸に対して相補的な修飾ヌクレオチドの連続ストレッチを含み、ギャップ領域Ｇはヌクレオチドの連続ストレッチを含むオリゴヌクレオチドが標的核酸と二本鎖を成す場合、ヌクレアーゼ、好ましくはＲＮアーゼのようなエンドヌクレアーゼ、例えばＲＮアーゼＨを補充する能力を有する。ヌクレアーゼ、特にＲＮアーゼＨを補充する能力を有するヌクレオシドは、ＤＮＡ、α−Ｌ−オキシ−ＬＮＡ、２’−フルオロ（Flouro）−ＡＮＡ及びＵＮＡからなる群から選択できる。領域Ｇの５’末端及び３’末端に隣接する領域Ｆ及びＦ’は、好ましくは非ヌクレアーゼ補充ヌクレオシド（３’末端構造を有するヌクレオシド）、より好ましくは１つ以上の親和性増強修飾ヌクレオシドを含む。幾つかの実施形態において、３’側面は、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシド、好ましくは少なくとも２つのＬＮＡヌクレオシドを含む。幾つかの実施形態において、５’側面は、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドを含む。幾つかの実施形態において、５’及び３’側面領域は両方とも、ＬＮＡヌクレオシドを含む。幾つかの実施形態において、側面領域中の全てのヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。他の実施形態では、隣接領域は、ＤＮＡヌクレオシド及び／又は非ＬＮＡ修飾ヌクレオシド（例えば、２’置換ヌクレオシド）のような、ＬＮＡヌクレオシド及び他のヌクレオシド（混合側面）の両方を含む場合がある。この場合、ギャップは、親和性増強修飾ヌクレオシド、好ましくはＬＮＡ（例えば、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ）を介して５’末端及び３’末端に隣接した少なくとも５つのＲＮアーゼＨ補充ヌクレオシド（２'エンド構造を有するヌクレオシド、好ましくはＤＮＡ）の連続配列として定義される。結果として、ギャップ領域に隣接する５’隣接領域、及び３’隣接領域のヌクレオシドは修飾ヌクレオシド、好ましくは非ヌクレアーゼ補充ヌクレオシドである。
領域Ｆ
領域Ｇの５’末端に付着された領域Ｆ（５’側面又は５’ウイング）は、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド、例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７修飾ヌクレオシドを含むか、含有するか又はそれらからなる。或る実施形態において、領域Ｆが、１〜７修飾ヌクレオシド、例えば２〜６修飾ヌクレオシド、例えば２〜５修飾ヌクレオシド、例えば２〜４修飾ヌクレオシド、例えば１〜３修飾ヌクレオシド、例えば１、２、３もしくは４修飾ヌクレオシドを含むか又はそれからなる。Ｆ領域は、その領域の５’末端及び３’末端に少なくとも修飾ヌクレオシドを有することによって、画定される。
幾つかの実施形態において、領域Ｆ内の修飾ヌクレオシドは３’末端構造を有する。
実施形態において、領域Ｆ内の修飾ヌクレオシドの１つ以上は、２’修飾ヌクレオシドである。一実施形態において、領域Ｆ内の全てのヌクレオシドは２’修飾ヌクレオシドである。
別の実施形態において、領域Ｆは、２’修飾ヌクレオシドに加えて、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含む。ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含む側面は、Ｆ領域の５’末端及び３’末端（Ｇ領域に隣接する）内に、２’修飾ヌクレオシドを有することを特徴とする。一実施形態において、領域Ｆは、ＤＮＡヌクレオシド（例えば、１〜３又は１〜２の連続ＤＮＡヌクレオシドのような、１〜３の連続ＤＮＡヌクレオシド）を含む。側面に位置するＤＮＡヌクレオシドは、ＲＮアーゼＨを当然補充できるものであるのが好ましい。幾つかの実施形態では、Ｆ領域の２’修飾ヌクレオシド、ならびにＤＮＡ及び／又はＲＮＡヌクレオシドは、１〜３個の２’修飾ヌクレオシド、ならびに１〜３個のＤＮＡと交互に存在し、及び／又はＲＮＡヌクレオシドである。そのような側面は、交互の側面と呼ばれる場合もある。交互の側面を有するオリゴヌクレオチド中の５’側の側面（領域Ｆ）の長さは、４〜１０ヌクレオシド、例えば４〜８、例えば４〜６ヌクレオシド、例えば４、５、６又は７修飾ヌクレオシドでありうる。幾つかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの５’側面のみが交互になっている。
交互ヌクレオシドを有する領域Ｆの具体例は、
２’1-3−Ｎ’1-4−２’1-3
２’1-2−Ｎ’1-2−２’1-2−Ｎ’1-2−２’1-2
である。
式中、２’は、修飾ヌクレオシド及びＮ’がＲＮＡ又はＤＮＡであることを表す。幾つかの実施形態において、交互側面内の全ての修飾ヌクレオシドはＬＮＡであり、Ｎ’はＤＮＡである。更なる実施形態において、領域Ｆ内の２’修飾ヌクレオシドのうちの１以上が、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、２’−フルオロ−ＤＮＡ単位、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、ＭＯＥ単位、ＬＮＡ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位及び２’−フルオロ−ＡＮＡ単位から選択される。
幾つかの実施形態において、Ｆ領域は、ＬＮＡ及び２’置換修飾ヌクレオシドの両方を含む。これらは、多くの場合、混合ウイング又は混合側面オリゴヌクレオチドと呼ばれる。
本発明の一実施形態において、領域Ｆ内の全ての修飾ヌクレオシドはＬＮＡヌクレオシドである。更なる実施形態において、領域Ｆ内の全てのヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。更なる実施形態において、領域Ｆ内のＬＮＡヌクレオシドが独立に、β−Ｄもしくはα−Ｌ構成又はそれらの組み合わせのいずれかに、オキシ−ＬＮＡ、チオ−ＬＮＡ、アミノ−ＬＮＡ、ｃＥＴ、及び／又はＥＮＡからなる群から選択される。好ましい実施形態において、領域Ｆは、連続配列の５’末端に少なくとも１つのβ−Ｄ−オキシＬＮＡ単位を含む。
領域Ｇ
領域Ｇ（ギャップ領域）は、前述のヌクレアーゼ、特にＲＮアーゼＨを補充する能力を有する少なくとも４、例えば、少なくとも５、例えば、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５又は少なくとも１６連続ヌクレオシドを含むか又はそれからなるのが、好ましい。更なる実施形態において、領域Ｇは、５〜１２、又は６〜１０又は７〜９（例えば、前述のヌクレアーゼを補充する能力を有する８連続ヌクレオチド単位）を含むか又はそれからなる。
或る実施形態において、ヌクレアーゼを補充する能力を有する領域Ｇのヌクレオシド単位は、ＤＮＡ、α−Ｌ−ＬＮＡ、Ｃ４’アルキル化ＤＮＡ（国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５０３４９号明細書及びVester et al., Bioorg. Med.Chem.Lett.18 (2008) 2296-2300。これら両文献は本明細書に中で参照により援用されている）、ならびに、ＡＮＡ及び２’Ｆ−ＡＮＡのようなアラビノース由来ヌクレオシドヌクレオシド（Mangos et al.2003 J. AM.CHEM.SOC.125, 654-661）、ＵＮＡ（アンロックド核酸）（出典：Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039。これらの文献は本明細書中で参照により援用されている）からなる群から選択される。ＵＮＡは、典型的には、リボースのＣ２とＣ３との間の結合が除去されてアンロックド「糖」部分を生じた、アンロックド核酸である。
なお更なる実施形態において、領域Ｇ内の少なくとも１つのヌクレオシド単位は、ＤＮＡヌクレオシド単位（例えば、１〜１８ＤＮＡ単位（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６又は１７ＤＮＡ単位、好ましくは２〜１７ＤＮＡ単位（例えば、３〜１６ＤＮＡ単位（例えば、４〜１５ＤＮＡ単位、例えば、５〜１４ＤＮＡ単位（例えば、６〜１３ＤＮＡ単位（例えば、７〜１２ＤＮＡ単位（例えば、８〜１１ＤＮＡ単位、より好ましくは単位８〜１７ＤＮＡ単位、又は９〜１６ＤＮＡ単位、１０〜１５ＤＮＡ単位又は１１〜１３ＤＮＡ単位（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５４、１６、１７ＤＮＡ単位である。幾つかの実施形態において、領域Ｇは１００％ＤＮＡ単位からなる。
更なる実施形態において、領域Ｇは、ＲＮアーゼＨ開裂を媒介できるＤＮＡと他のヌクレオシドとの混合物からなりうる。領域Ｇは、少なくとも５０％のＤＮＡ、より好ましくは６０％、７０％又は８０％のＤＮＡ、更により好ましくは９０％又は９５％のＤＮＡからなりうる。
なお更なる実施形態において、領域Ｇ中の少なくとも１つのヌクレオシド単位は、α−Ｌ−ＬＮＡヌクレオシド単位（例えば、少なくとも１つのα−Ｌ−ＬＮＡ（例えば、２、３、４、５、６、７、８又は９α−Ｌ−ＬＮＡである。更なる実施形態において、領域Ｇは、α−Ｌ−オキシ−ＬＮＡである少なくとも１つのα−Ｌ−ＬＮＡを含む。更なる実施形態において、領域Ｇは、ＤＮＡ及びα−Ｌ−ＬＮＡヌクレオシド単位の組み合わせを含む。
幾つかの実施形態において、領域Ｇ内のヌクレオシドは２’末端構造を有する。
幾つかの実施形態において、領域Ｇは、ＲＮアーゼＨを補充する能力を有するギャップブレイカー・オリゴヌクレオチドにつながる、ギャップブレイカー・ヌクレオシドを含みうる。
領域Ｆ’
領域Ｇの３’末端に付着された領域Ｆ’（３’側面又は３’ウイング）は、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド、例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７修飾ヌクレオシドを含むか、含有するか又はそれらからなる。或る実施形態において、領域Ｆ’は、１〜７修飾ヌクレオシド（例えば、２〜６修飾ヌクレオシド（例えば、２〜４修飾ヌクレオシド（例えば、１〜３修飾ヌクレオシド（例えば、１、２、３又は４修飾ヌクレオシドを含むか又はそれからなる。Ｆ’領域は、その領域の５’末端及び３’末端に少なくとも修飾ヌクレオシドを有することによって、画定される。
幾つかの実施形態において、領域Ｆ’内の修飾ヌクレオシドは３’末端構造を有する。
実施形態において、領域Ｆ’内の修飾ヌクレオシドのうちの１以上は、２’修飾ヌクレオシドである。一実施形態において、領域Ｆ’内の全てのヌクレオシドは２’修飾ヌクレオシドである。
実施形態において、領域Ｆ’内の修飾ヌクレオシドのうちの１以上は、２’修飾ヌクレオシドである。
一実施形態において、領域Ｆ’内の全てのヌクレオシドは２’修飾ヌクレオシドである。別の実施形態において、領域Ｆ’は、２’修飾ヌクレオシドに加えて、ＤＮＡ又はＲＮＡを含む。ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含む側面は、Ｆ’領域の５’末端（Ｇ領域に隣接する）及び３'末端内に、２’修飾ヌクレオシドを有することを特徴とする。一実施形態において、領域Ｆ’は、ＤＮＡヌクレオシド（例えば、１〜３又は１〜２の連続ＤＮＡヌクレオシドのような、１〜４の連続ＤＮＡヌクレオシド）を含む。側面に位置するＤＮＡヌクレオシドは、ＲＮアーゼＨを当然補充できるものであるのが好ましい。幾つかの実施形態において、Ｆ’領域の２’修飾ヌクレオシド、ならびにＤＮＡ及び／又はＲＮＡヌクレオシドは、１〜３の２’修飾ヌクレオシド及び１〜３のＤＮＡと交互に存在する及び／又はＲＮＡヌクレオシドであり、そのような側面は、交互の側面と呼ばれる場合がある。交互の側面を有するオリゴヌクレオチド中の３’側の側面（領域Ｆ’）の長さは、４〜１０ヌクレオシド（例えば、４〜８（例えば、４〜６ヌクレオシド（例えば、４、５、６又は７修飾ヌクレオシドでありうる。幾つかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの３’側面のみが交互になっている。
交互ヌクレオシドを有する領域Ｆ’の具体例は、
２’1-2−Ｎ’1-4−２’1-4
２’1-2−Ｎ’1-2−２’1-2−Ｎ’1-2−２’1-2
である。
式中、２’は、修飾ヌクレオシド及びＮ’がＲＮＡ又はＤＮＡであることを表す。幾つかの実施形態において、交互側面内の全ての修飾ヌクレオシドはＬＮＡであり、Ｎ’はＤＮＡである。更なる実施形態において、領域Ｆ’内の修飾ヌクレオシドは、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、２’−フルオロ−ＤＮＡ単位、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、ＭＯＥ単位、ＬＮＡ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位及び２’−フルオロ−ＡＮＡ単位から選択される。
幾つかの実施形態において、Ｆ’領域は、ＬＮＡ及び２’置換修飾ヌクレオシドの両方を含む。これらは、多くの場合、混合ウイング又は混合側面オリゴヌクレオチドと呼ばれる。
本発明の一実施形態において、全ての領域Ｆ’内の修飾ヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。更なる実施形態において、領域Ｆ’内の全ての修飾ヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。更なる実施形態において、領域Ｆ’内のＬＮＡヌクレオシドが独立に、β−Ｄもしくはα−Ｌ構成又はそれらの組み合わせのいずれかに、オキシ−ＬＮＡ、チオ−ＬＮＡ、アミノ−ＬＮＡ、ｃＥＴ、及び／又はＥＮＡからなる群から選択される。好ましい実施形態において、領域Ｆは、連続配列の３’末端に少なくとも２つのβ−Ｄ−オキシＬＮＡ単位を有する。
領域Ｄ’及びＤ”
領域Ｄ’及びＤ”は、領域Ｆの５’末端又は領域Ｆ’の３’末端にそれぞれ結合できる。領域Ｄ’又はＤ”は任意選択的である。
領域Ｄ’又はＤ”は、標的核酸に相補的であるか又は非相補的でありうる０〜５個、例えば１〜５個、例えば２〜４個、例えば０、１、２、３、４又は５個の追加ヌクレオチドを含みうる。これに関して、本発明のオリゴヌクレオチドは、幾つかの実施形態では、更なるヌクレオチドによって５’及び／又は３’末端に隣接する標的を調節できる連続ヌクレオチド配列を含みうる。そのような付加的なクレオチドは、ヌクレアーゼ感受性の生体開裂性リンカー（リンカーの定義を参照）として機能しうる。幾つかの実施形態において、更なる５’及び／又は３’末端ヌクレオシドは、ホスホジエステル結合と結合し、ＤＮＡ又はＲＮＡでありうる。別の実施形態において、追加の５’及び／又は３’末端ヌクレオシドは、例えば、ヌクレアーゼ安定性を高めるために、又は合成の容易さのために含まれうる修飾ヌクレオシドである。一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列の５’又は３’末端に、領域Ｄ’及び／又はＤ”を含む。更なる実施形態において、Ｄ’及び／又はＤ”領域は、標的核酸に対して相補的ではない１〜５ホスホジエステル連結ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドからなる。
本発明のギャップマー・オリゴヌクレオチドは、次式で表すことができる。
５’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−３’；特にＦ1-7−Ｇ4-12−Ｆ’1-7
５’−Ｄ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−３’、特にＤ’1-3−Ｆ1-7−Ｇ4-12−Ｆ’1-7
５’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ”−３’、特にＦ1-7−Ｇ4-12−Ｆ’1-7-Ｄ”1-3
５’−Ｄ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ’−３”、特にＤ’1-3−Ｆ1-7−Ｇ4-12−Ｆ’1-7-
Ｄ”1-3
領域Ｆ、Ｇ及びＦ’、Ｄ’及びＤ”内の好ましいヌクレオシドの数及び種類は、上述されている。本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、オリゴヌクレオチドの５’又は３’末端のいずれかに共有結合した領域Ｃ、特に上に示したギャップマー・オリゴヌクレオチドを有する。
一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、式５’−Ｄ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−３’又は５’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ”−３’のオリゴヌクレオチドを含み、領域Ｆ及びＦ’が独立に、１〜７修飾ヌクレオシドを含み、ＧはＲＮアーゼＨを補充する能力を有する６〜１６ヌクレオシド間の領域であり、且つ領域Ｄ’又はＤ”が１〜５ ホスホジエステルの連結ヌクレオシドを含む。領域Ｄ’又はＤ”は、結合部分への結合が企図されるオリゴヌクレオチドの末端に存在するのが好ましい。
交互側面を有するオリゴヌクレオチドの例は、次式で表すことができる。
２’1-3−Ｎ’1-4−２’1-3−Ｇ6-12−２’1-2−Ｎ’1-4−２’1-4
２’1-2−Ｎ’1-2−２’1-2−Ｎ’1-2−２’1-2−Ｇ6-12−２’1-2−Ｎ’1-2−
２’1-2−Ｎ’1-2−２’1-2
Ｆ−Ｇ6-12−２’1-2−Ｎ’1-4−２’1-4
Ｆ−Ｇ6-12−２’1-2−Ｎ’1-2−２’1-2−Ｎ’1-2−２’1-2
２’1-3−Ｎ’1-4−２’1-3−Ｇ6-12−Ｆ’
２’1-2−Ｎ’1-2−２’1-2−Ｎ1-2−２’1-2−Ｇ6-12−Ｆ’
側面は、Ｆ又はＦ’で示され、ＬＮＡヌクレオシドなどの２’修飾ヌクレオシドのみを含む。交互領域ならびに領域Ｆ、Ｇ及びＦ’、Ｄ’及びＤ”内の好ましいヌクレオシドの数及び種類は、上述されている。
幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２ヌクレオチド長からなるギャップマーであり、各Ｆ領域及びＦ’領域が、独立にＰＤ−Ｌ１標的核酸に対して相補的な１、２、３又は４修飾ヌクレオシド単位からなり、且つ領域Ｇが８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７ヌクレオシド単位からなり、ＰＤ−Ｌ１標的核酸と二本鎖を成す場合にヌクレアーゼを補充でき、領域Ｄ’は２つのホスホジエステル結合ＤＮＡからなる。
更なる実施形態において、オリゴヌクレオチドは、各Ｆ領域及びＦ’領域が独立に、２’−Ｏ−メトキシエチル−リボース糖（２’−ＭＯＥ）を含む３、４、５又は６修飾ヌクレオシド単位（例えば、ヌクレオシド単位、又は２’−フルオロデオキシリボース糖を含むヌクレオシド単位、及び／又はＬＮＡ単位からなり、ならびに領域Ｇが、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６又は１７ヌクレオシド単位（例えばＤＮＡ単位）、又は他のヌクレアーゼ補充ヌクレオシド（例えばα−Ｌ−ＬＮＡ）、又はＤＮＡとヌクレアーゼ補充ヌクレオシドとの混合物からなる、ギャップマーとされる。
更に具体的な実施形態において、オリゴヌクレオチドは、各Ｆ領域及びＦ’領域が、それぞれ２つのＬＮＡ単位からなり、且つ領域Ｇが１２、１３、１４ヌクレオシド単位、好ましくはＤＮＡ単位からなる、ギャップマーとされる。この性質の特異的ギャップマーデザインとしては、２−１２−２、２−１３−２及び２−１４−２が挙げられる。
更に具体的な実施形態において、オリゴヌクレオチドは、各Ｆ領域及びＦ’領域が、独立に３つのＬＮＡ単位からなり、且つ領域Ｇが８、９、１０、１１、１２、１３又は１４ヌクレオシド単位、好ましくはＤＮＡ単位からなる、ギャップマーとされる。この性質の特異的ギャップマーデザインとしては、３−８−３、３−９−３、３−１０−３、３−１１−３、３−１２−３、３−１３−３及び３−１４−３が挙げられる。
更に具体的な実施形態において、オリゴヌクレオチドは、各Ｆ領域及びＦ’領域がそれぞれ４つのＬＮＡ単位からなり、且つ領域Ｇが８、９、１０、１１又は１２ヌクレオシド単位、好ましくはＤＮＡ単位からなる、ギャップマーとされる。この性質の特異的ギャップマーデザインとしては、４−８−４、４−９−４、４−１０−４、４−１１−４及び４−１２−４が挙げられる。
この性質の特異的ギャップマーデザインとしては、６ヌクレオシドを含むギャップ、及び独立にウイング内の１〜４修飾ヌクレオシド、例えば１−６−１、１−６−２、２−６−１、１−６−３、３−６−１、１−６−４、４−６−１、２−６−２、２−６−３、３−６−２、２−６−４、４−６−２、３−６−３、３−６−４及び４−６−３ギャップマーからなる群から選択されるＦ−Ｇ−Ｆ’デザインが挙げられる。
この性質の特異的ギャップマーデザインとしては、７ヌクレオシドを含むギャップ、及び独立にウイング内の１〜４修飾ヌクレオシド、例えば１−７−１、２−７−１、１−７−２、１−７−３、３−７−１、１−７−４、４−７−１、２−７−２、２−７−３、３−７−２、２−７−４、４−７−２、３−７−３、３−７−４、４−７−３及び４−７−４ギャップマーからなる群から選択される、Ｆ−Ｇ−Ｆ’デザインが挙げられる。
この性質の特異的ギャップマーデザインとしては、８ヌクレオシドを有するギャップ、及びウイング内の独立に１〜４修飾ヌクレオシド、例えば１−８−１、１−８−２、１−８−３、３−８−１、１−８−４、４−８−１，２−８−１、２−８−２、２−８−３、３−８−２、２−８−４、４−８−２、３−８−３、３−８−４、４−８−３及び４−８−４ギャップマーからなる群から選択される、Ｆ−Ｇ−Ｆ’デザインが挙げられる。
この性質の特異的ギャップマーデザインとしては、９ヌクレオシドを含むギャップ、及び独立にウイング内の１〜４修飾ヌクレオシド、例えば１−９−１、２−９−１、１−９−２、１−９−３、３−９−１、１−９−４、４−９−１、２−９−２、２−９−３、３−９−２、２−９−４、４−９−２、３−９−３、３−９−４、４−９−３及び４−９−４ギャップマーからなる群から選択される、Ｆ−Ｇ−Ｆ’デザインが挙げられる。
この性質の特異的ギャップマーデザインとしては、１０ヌクレオシドを含むギャップ、例えば１−１０−１、２−１０−１、１−１０−２、１−１０−３、３−１０−１、１−１０−４、４−１０−１、２−１０−２、２−１０−３、３−１０−２、２−１０−４、４−１０−２、３−１０−３、３−１０−４、４−１０−３及び４−１０−４ギャップマーからなる群から選択されるＦ−Ｇ−Ｆ’デザインが挙げられる。
この性質の特異的ギャップマーデザインとしては、１１ヌクレオシドを含むギャップ、例えば１−１１−１、２−１１−１、１−１１−２、１−１１−３、３−１１−１、１−１１−４、４−１１−１、２−１１−２、２−１１−３、３−１１−２、２−１１−４、４−１１−２、３−１１−３、３−１１−４、４−１１−３及び４−１１−４ギャップマーからなる群から選択されるＦ−Ｇ−Ｆ’デザインが挙げられる。
この性質の特異的ギャップマーデザインとしては、１２ヌクレオシドを含むギャップ、例えば１−１２−１、２−１２−１、１−１２−２、１−１２−３、３−１２−１、１−１２−４、４−１２−１、２−１２−２、２−１２−３、３−１２−２、２−１２−４、４−１２−２、３−１２−３、３−１２−４、４−１２−３及び４−１２−４ギャップマーからなる群から選択されるＦ−Ｇ−Ｆ’デザインが挙げられる。
この性質の特異的ギャップマーデザインとしては、１３ヌクレオシドを含むギャップ、例えば１−１３−１、２−１３−１、１−１３−２、１−１３−３、３−１３−１、１−１３−４、４−１３−１、２−１３−２、２−１３−３、３−１３−２、２−１３−４、４−１３−２、３−１３−３、３−１３−４、４−１３−３及び４−１３−４ギャップマーからなる群から選択されるＦ−Ｇ−Ｆ’デザインが挙げられる。
この性質の特異的ギャップマーデザインとしては、１４ヌクレオシドを含むギャップ、例えば１−１４−１、２−１４−１、１−１４−２、１−１４−３、３−１４−１、１−１４−４、４−１４−１、２−１４−２、２−１４−３、３−１４−２、２−１４−４、４−１４−２、３−１４−３、３−１４−４、４−１４−３及び４−１４−４ギャップマーからなる群から選択されるＦ−Ｇ−Ｆ’デザインが挙げられる。
この性質の特異的ギャップマーデザインとしては、１５ヌクレオシドを含むギャップ、例えば１−１５−１、２−１５−１、１−１５−２、１−１５−３、３−１５−１、１−１５−４、４−１５−１、２−１５−２、２−１５−３、３−１５−２、２−１５−４、４−１５−２及び３−１５−３ギャップマーからなる群から選択される、Ｆ−Ｇ−Ｆ’デザインが挙げられる。
この性質の特異的ギャップマーデザインとしては、１６ヌクレオシドを含むギャップ、例えば１−１６−１、２−１６−１、１−１６−２、１−１６−３、３−１６−１、１−１６−４、４−１６−１、２−１６−２、２−１６−３、３−１６−２、２−１６−４、４−１６−２及び３−１６−３ギャップマーからなる群から選択される、Ｆ−Ｇ−Ｆ’デザインが挙げられる。
この性質の特異的ギャップマーデザインとしては、１７ヌクレオシドを含むギャップ、例えば１−１７−１、２−１７−１、１−１７−２、１−１７−３、３−１７−１、１−１７−４、４−１７−１、２−１７−２、２−１７−３及び３−１７−２ギャップマーからなる群から選択される、Ｆ−Ｇ−Ｆ’デザインが挙げられる。
全ての例において、Ｆ−Ｇ−Ｆ’デザインは、領域Ｄ’及び／又はＤ”を更に含み、領域Ｄ’及び／又はＤ”、１、２又は３ヌクレオシド単位（例えば、ＤＮＡ単位（例えば、２ホスホジエステル連結ＤＮＡ単位を有しうる。領域Ｆ及びＦ’のヌクレオシドは修飾ヌクレオシドであることが好ましく、領域Ｇのヌクレオチドは好ましくは未修飾ヌクレオシドである。
各デザインにおいて、好ましい修飾ヌクレオシドはＬＮＡである。
別の実施形態において、ギャップマー内のギャップ中の全てのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート及び／又はボラノホスフェート結合である。別の実施形態において、ギャップマー内の側面（Ｆ及びＦ’領域）中の全てのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート及び／又はボラノホスフェート結合である。別の好ましい実施形態において、ギャップマー中のＤ’及びＤ”領域における全てのヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。
本明細書中に開示されている特異的ギャップマーに関して、シトシン（Ｃ）部分が５−メチル−シトシンとして注釈されている場合、様々な実施形態において、オリゴヌクレオチド中に存在するＣの１つ以上が、非修飾Ｃ部分でありうる。
特定の実施形態において、ギャップマーは、参照により本明細書に援用されている国際公開第２００８／１１３８３２号パンフレットに記載のいわゆるショートマーである。
更なるギャップマーデザインは、国際公開第２００４／０４６１６０号パンフレット、国際公開第２００７／１４６５１１号パンフレットに開示されており、これらは、参照により援用されている。
本発明の或る実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＣＭＰ−ＩＤ番号：５＿１〜７４３＿１及び７７１＿１のオリゴヌクレオチド化合物からなる群から選択される。
本発明の或る実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＣＭＰ−ＩＤ番号６＿１、８＿１、９＿１、１３＿１、４１＿１、４２＿１、５８＿１、７７＿１、９２＿１、１１１＿１、１２８＿１、１５１＿１、１６４＿１、１６６＿１、１６９＿１、１７１＿１、２２２＿１、２３３＿１、２４５＿１、２４６＿１、２５０＿１、２５１＿１、２５２＿１、２５６＿１、２７２＿１、２７３＿１、２８７＿１、２９２＿１、３０３＿１、３１４＿１、３１８＿１、３２０＿１、３２４＿１、３３６＿１、３４２＿１、３４３＿１、３４４＿１、３４５＿１、３４６＿１、３４９＿１、３５９＿１、３６０＿１、３７４＿１、４０８＿１、４０９＿１、４１５＿１、４１７＿１、４２４＿１、４２９＿１、４３０＿１、４５８＿１、４６４＿１、４６６＿１、４７４＿１、４９０＿１、４９３＿１、５１２＿１、５１９＿１、５１９＿１、５２９＿１、５３３＿１、５３４＿１、５４７＿１、５６６＿１、５６７＿１、５７８＿１、５８２＿１、６０１＿１、６１９＿１、６２０＿１、６３６＿１、６３７＿１、６３８＿１、６４０＿１、６４５＿１、６５０＿１、６５１＿１、６５２＿１、６５３＿１、６５８＿１、６５９＿１、６６０＿１、６６５＿１、６７８＿１、６７９＿１、６８０＿１、６８２＿１、６８３＿１、６８４＿１、６８７＿１、６９４＿１、７０６＿１、７１６＿１、７２８＿１、７３３＿１、７３４＿１、及び７３５＿１であるオリゴヌクレオチド化合物からなる群から選択される。
本発明の好ましい一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＣＭＰ−ＩＤ番号：２８７＿１である。
本発明の別の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＣＭＰ−ＩＤ番号：３４２＿１である。
本発明の別の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＣＭＰ−ＩＤ番号：６４０＿１である。
本発明の別の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＣＭＰ−ＩＤ番号：４６６＿１である。
本発明の別の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＣＭＰ−ＩＤ番号：５６６＿１である。
本発明の更なる実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド・モチーフ及びオリゴヌクレオチド化合物の連続ヌクレオチド配列は、２〜４の付加的なホスホジエステルの連結ヌクレオシド５’末端に、連続ヌクレオチド配列（例えば、領域Ｄ’）を含む。一実施形態において、ヌクレオシドは、生体開裂性リンカー（「生体開裂性リンカー」の節を参照）としての役目を果たす。好ましい実施形態において、ｃａ（シチジン−アデノシン）ジヌクレオチドは、ホスホジエステル結合を介して連続ヌクレオチド配列（すなわち、表５に列挙されたモチーフ配列又はオリゴヌクレオチド化合物のいずれか１つ）の５’末端に連結される。好ましい実施形態において、二本鎖ヌクレオチドは、連続ヌクレオチドのリマインダが相補的である位置にて、標的配列に相補的ではない。
本発明の幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号：７６６、７６７、７６８、７６９及び７７０ヌクレオチドのモチーフ配列からなる群から選択される。
本発明の幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＣＭＰ−ＩＤ番号７６６＿１、７６７＿１、７６８＿１、７６９＿１及び７７０＿１のオリゴヌクレオチド化合物からなる群から選択される。
炭水化物結合部分
炭水化物結合部分は、ガラクトース、ラクトース、ｎ−アセチルガラクトサミン、マンノース及びマンノース−６−リン酸が挙げられるが、これらに限定されない。炭水化物コンジュゲートは、肝臓及び／もしくは筋肉のような或る範囲の組織における送達又は活性を増強するために使用できる。例えば、欧州特許第１４９５７６９号明細書、国際公開第９９／６５９２５号パンフレット、Yang et al., Bioconjug Chem (2009) 20(2): 213-21.Zatsepin & Oretskaya Chem Biodivers.(2004) 1(10): 1401-17を参照のこと。
幾つかの実施形態において、炭水化物結合部分は多価であり、例えば、２、３もしくは４個の同一又は非同一の炭水化物部分が、任意で、リンカー又はリンカーを介してオリゴヌクレオチドに共有結合可能である。幾つかの実施形態において、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドと炭水化物結合部分とを含む、コンジュゲートを提供するものである。
幾つかの実施形態において、結合部分は、マンノースもしくはマンノース−６−リン酸であるか又はそれらを含む。これは、筋肉細胞を標的化するうえで特に有用である（例えば、米国特許出願公開第２０１２／１２２８０１号明細書を参照のこと）。
アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰｒ）に結合できる結合部分は、肝臓内で肝細胞を標的化するうえで特に有用である。幾つかの実施形態において、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドとアシアロ糖タンパク質受容体標的化結合部分とを含む、オリゴヌクレオチドコンジュゲートを提供するものである。アシアロ糖タンパク質受容体標的化結合部分は、ガラクトースの親和性以上の親和性でアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＰＧｒ結合炭水化物部分）に結合できる１つ以上の炭水化物部分を含む。多数のガラクトース誘導体に関して、アシアロ糖タンパク質受容体に対する親和性が研究されてきた（例えば、Jobst, S.T.及びDrickamer, K. JB.C.1996, 271, 6686を参照）。つまり、これらの親和性は当該技術分野において典型的な方法を使用して容易に判別されている。
本発明の一態様は、ａ）ＰＤ−Ｌ１標的核酸に対して少なくとも９０％の相補性を有する長さが１０〜３０ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド（領域Ａ）と；ｂ）ａ）においてオリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つのアシアロ糖タンパク質受容体標的化結合部分（領域Ｃ）と；を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートである。オリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、「本発明のオリゴヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチドデザイン」及び「ギャップマーデザイン」の節のいずれかに記載されているようにすることができる。
幾つかの実施形態において、アシアロ糖タンパク質受容体標的化結合部分は、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ−ホルミル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−プロピオニル−ガラクトサミン、Ｎ−ｎ−ブタノイル−ガラクトサミン及びＮ−イソブタノイルガラクトサミンからなる群から選択される少なくとも１つのＡＳＰＧｒ結合炭水化物部分を含む。幾つかの実施形態において、アシアロ糖タンパク質受容体標的化結合部分は、１価、２価、３価又は４価である（すなわち、アシアロ糖タンパク質受容体に結合できる１、２、３もしくは４個の末端炭水化物部分を含む）。アシアロ糖タンパク質受容体標的化結合部分は、２価、更により好ましくは３価である。好ましい実施形態において、アシアロ糖タンパク質受容体標的化結合部分は、１〜３個のＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分（ＧａｌＮＡｃコンジュゲートとも呼ばれる））を含む。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、３価Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分であるアシアロ糖タンパク質受容体標的化結合部分を含む。ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、ホスホジエステル， メチルホスホネート及びＰＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、米国特許第５，９９４５１７号明細書、及びHangeland et al., Bioconjug Chem.1995 Nov-Dec; 6(6): 695-701, Biessen et al 1999 Biochem J. 340, 783-792、及びMaier et al 2003 Bioconjug Chem 14, 18-29）、ｓｉＲＮＡ（例えば、国際公開第２００９／１２６９３３号パンフレット、国際公開第２０１２／０８９３５２号パンフレット、及び国際公開第２０１２／０８３０４６号パンフレット)、ならびにＬＮＡ及び２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドと併用されてきた（国際公開第２０１４／０７６１９６号パンフレット、国際公開第２０１４／２０７２３２号パンフレット、及び国際公開第２０１４／１７９６２０号パンフレット）。これらの文献は、本明細書中に参照により援用されている。
アシアロ糖タンパク質受容体標的化結合部分を生成するには、ＡＳＰＧｒ結合性炭水化物部分（好ましくは、ＧａｌＮＡｃ）は、糖類のＣ−１炭素を介して分岐分子に結合している。ＡＳＰＧｒ結合炭水化物部分は、スペーサーを介して分枝分子に連結されているのが好ましい。スペーサーとして好ましいのは、可撓性の親水性スペーサーである（U.S. Patent 5885968；Biessen et al.J. Med.Chern.1995 Vol. 39 p. 1538-1546）。好ましい可撓性の親水性スペーサーは、ＰＥＧスペーサーである。好ましいＰＥＧスペーサーは、ＰＥＧ３スペーサー（３つのエチレン単位）である。分枝分子は、２つ又は３つの末端のＡＳＰＧｒ結合炭水化物部分の結合を可能にし、更に分岐点のオリゴヌクレオチドへの結合を可能にする任意の小分子でありうる。典型的な分岐分子はジリジンである。ジリジン分子は、３つのＡＳＰＧｒ結合炭水化物部分が結合できる３つのアミン基と、ジリシンがオリゴヌクレオチドに結合できるカルボキシル反応基と、を含む。代替的な分枝分子は、Glen Researchによって供給されるもののようなダブラー又はトレブラーであってもよい。幾つかの実施形態において、ブランチャーは、１，３−ビス−［５−（４，４’−ペンチルアミド］プロピル−２−［（２−シアノエチル）−（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル）］ホスホラミダイト（Glen Researchカタログ番号：１０−１９２０−ｘｘ）、トリス−２，２，２−［３−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）プロピルオキシメチル］エチル−［（２−シアノエチル）−（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト（Glen Researchカタログ番号：１０−１９２２−ｘｘ）、トリス−２，２，２−［３−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）プロピルオキシメチル］メチレンオキシプロピル−［（２−シアノエチル）−（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト及び１−［５−（４，４’−ジメトキシ−トリチルオキシ）ペンチルアミド］−３−［５−フルオルメトキシカルボニルオキシ−ペンチルアミド］−プロピル−２−［（２−シアノエチル）−（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト（Glen Researchカタログ番号：１０−１９２５−ｘｘ）からなる群から選択できる。国際公開第２０１４／１７９６２０号パンフレット及び国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０７３３３１号明細書には、様々なＧａｌＮＡｃ結合部分の生成が記述されており、これらの文献は、本明細書中で参照により援用されている。分岐分子とオリゴヌクレオチドとの間には、１以上のリンカーが挿入される場合がある。好ましい実施形態において、リンカーは生体開裂性リンカーである。リンカーは、「リンカー」及びそのサブセクションに記載されているリンカーから選択できる。
アシアロ糖タンパク質受容体標的化結合部分、特にＧａｌＮＡｃ結合部分は、当該技術分野において公知の方法を用いてオリゴヌクレオチドの３’又は５’末端に付着させることができる。好ましい実施形態において、アシアロ糖タンパク質受容体標的化結合部分は、オリゴヌクレオチドの５’末端に連結されている。
ｓｉＲＮＡの送達に関連する薬物動態調節剤は、国際公開第２０１２／０８３０４６号パンフレットに記載されている（本明細書において参照により援用されている）。幾つかの実施形態において、炭水化物結合部分は、１６個以上の炭素原子を有する疎水性基、１６〜２０個の炭素原子を有する疎水性基、パルミトイル、ヘキサデク−８−エノイル、オレイル、（９Ｅ、１２Ｅ）−オクタデカ−９，１２ジエノイル、ジオクタノイル及びＣ１６−Ｃ２０アシル及びコレステロールからなる群から選択される薬物動態学的調節物質を含む。好ましい実施形態において、炭水化物結合部分を含有する薬物動態学的調節物質は、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートである。
炭水化物結合部分は、１〜３個の末端のＡＳＰＧｒ結合炭水化物部分、好ましくはＮ−アセチルガラクトサミン部分を含むのが好ましい。幾つかの実施形態において、炭水化物結合部分は、スペーサーを介して分枝分子に連結された３つのＡＳＰＧｒ結合炭水化物部分、好ましくはＮ−アセチルガラクトサミン部分を含む。スペーサー分子は、８〜３０原子の長さでありうる。好ましい炭水化物結合部分は、ＰＥＧスペーサーを介してジ−リジン分枝分子に連結された３つの末端ＧａｌＮＡｃ部分を含む。ＰＥＧスペーサーとして好ましいのは、３ＰＥＧスペーサーである。好適なアシアロ糖タンパク質受容体標的化結合部分を、図１に示す。好ましいアシアロ糖タンパク質受容体標的化結合部分を、図３に示す。
他のＧａｌＮＡｃ結合部分としては、例えば、Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−（アミノヘキシルＧａｌＮＡｃ）３（ＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３）のような結合したＧａｌＮＡｃ部分を有する小ペプチド；肝細胞上のアシアロ糖タクパク質受容体に結合する糖トリペプチド（例えば、Duff, et al., Methods Enzymol, 2000, 313, 297参照）；リジンベースのガラクトース集落（L3G4；Biessen, et al., Cardovasc.Med., 1999, 214)；及びコランベースのガラクトース集落（例えば、アシアロ糖タンパク質受容体の糖認識モチーフ）を挙げることができる。
本発明の幾つかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、以下のＣＰＭ ＩＤ番号：７６６＿２、７６７＿２、７６８＿２、７６９＿２及び７７０＿２からなる群から選択される。
好ましい実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、図４に図示されている化合物に対応している。
別の好ましい実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、図５に図示されている化合物に対応している。
別の好ましい実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、図６に図示されている化合物に対応している。
別の好ましい実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、図７に図示されている化合物に対応している。
別の好ましい実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、図８に図示されている化合物に対応している。
リンカー
生体開裂性リンカー（領域Ｂ）
コンジュゲートの使用は、多くの場合、薬物動態特性又は薬力学的動的特性の増強に関連する。しかし、結合部分が存在する場合は、例えば、ハイブリダイゼーション又はヌクレアーゼ補充（例えば、ＲＮアーゼＨ）を防止する立体障害を介して、意図された標的オリゴヌクレオチドの活性が妨げられる可能性がある。オリゴヌクレオチド（領域Ａ又は第１領域）と結合部分（領域Ｃ又は第３領域）との間に生理学的に易変的な結合（生体開裂性リンカー）を使用することにより結合部分の存在による特性の改善が可能となる一方、いったん標的組織において結合基がオリゴヌクレオチドの有効な活性を妨げないことが保証される。
易変的な結合を含む分子が適切な細胞内又は細胞外環境に到達すると、生理的に易変的な結合は自発的に生じる。例えば、分子が酸性化エンドソームに進入した際には、ｐＨ易変的な結合が開裂される場合がある。したがって、ｐＨ易変的な結合は、エンドソーム開裂可能な結合であると見なすことができる。酵素開裂可能な結合は、エンドソーム又はリソソーム又は細胞質に存在する酵素などの酵素に曝露されたときに開裂される場合がある。分子が細胞質の高還元性の環境に進入すると、ジスルフィド結合が開裂される場合がある。したがって、ジスルフィドを、細胞質の開裂可能な結合であると見なすことができる。本明細書において、ｐＨ易変的な結合は、酸性条件下（ｐＨ＜７）で選択的に破壊される易変的な結合である。細胞エンドソーム及びリソソームは７未満のｐＨを有するので、そのような結合は、エンドソーム的に易変的な結合とも呼ばれる場合がある。
標的化送達のための結合部分と会合した生体開裂性リンカーについては、標的組織（例えば、筋肉、肝臓、腎臓又は腫瘍）に見られる開裂速度が血清中に見られるものよりも大きいことが好ましい。Ｓ１ヌクレアーゼによる血清又は開裂に対する標的組織における開裂レベル（％）を定量するための好適な方法は、「材料と方法」の節に記載されている。幾つかの実施形態において、生体開裂性リンカー（生理学的に易変的なリンカー、又はヌクレアーゼ感受性リンカーもしくは領域Ｂとも呼ばれる）は、標準と比較して、少なくとも約２０％、例えば少なくとも約３０％、例えば少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約７０％、例えば少なくとも約７５％開裂されている。
幾つかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、３つの領域：ｉ）標的核酸に相補的な１０〜２５個の連続ヌクレオチドを含む第１の領域（領域Ａ）と、ｉｉ）生体開裂性リンカーを含む第２の領域（領域Ｂ）と、ｉｉｉ）アシアロ糖タンパク質受容体標的化結合部分のような結合部分を含む第３の領域（領域Ｃ）と、を含み、第３の領域は、第１領域に共有結合された第２領域に共有結合している。
本発明の一実施形態において、オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、連続ヌクレオチド配列（領域Ａ）及びアシアロ糖タンパク質受容体標的化結合部分（領域Ｃ）との間に、生体開裂性リンカー（領域Ｂ）を含む。
幾つかの実施形態において、生体開裂性リンカーは、標的核酸（領域Ａ）に相補的な隣接するヌクレオチドの５’末端及び／又は３’末端のいずれかに位置しうる。好ましい実施形態において、生体開裂性リンカーは、５’末端にある。
幾つかの実施形態において、開裂可能なリンカーは、例えば、標的細胞において発現されうるヌクレアーゼに感受性である。幾つかの実施形態において、生体開裂性リンカーは、２〜５個の連続ホスホジエステル結合で構成されている。リンカーは、ホスホジエステル結合ヌクレオシドの短い領域（例えば、リンカーの定義に詳述されているように１〜１０）であってもよい。幾つかの実施形態において、生体開裂性リンカー領域Ｂ中のヌクレオシドは、（任意で独立に）ヌクレアーゼの開裂を妨害しないＤＮＡ及びＲＮＡ又はその修飾物からなる群から選択される。ヌクレアーゼの開裂を妨げないＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオシドの修飾は、天然に存在しない核酸塩基でありうる。特定の糖修飾ヌクレオシドはまた、α−Ｌ−オキシ−ＬＮＡのようなヌクレアーゼの開裂を可能にしうる。幾つかの実施形態において、領域Ｂの全てのヌクレオシドは、２’−ＯＨリボース糖（ＲＮＡ）又は２’−Ｈ糖（すなわち、ＲＮＡ又はＤＮＡ）のいずれかを（任意で独立に）含む。好ましい実施形態において、領域Ｂの少なくとも２つの連続ヌクレオシドは、ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシド（少なくとも３もしくは４もしくは５連続ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオチドなど）である。更により好ましい実施形態において、領域Ｂのヌクレオシドは、領域Ｂが、１〜５又は１〜４の（例えば２、３、４連続ホスホジエステル連結ＤＮＡヌクレオシド）からなるＤＮＡヌクレオシドであることが、好ましい。好ましい実施形態において、領域Ｂは、ＲＮアーゼＨが補充されないほど短尺である。幾つかの実施形態において、領域Ｂは、３個以下もしくは４個以下の連続ホスホジエステル連結ＤＮＡ及び／又はＲＮＡヌクレオシド（例えばＤＮＡヌクレオシド）を含む。
領域Ｂがホスホジエステル結合ヌクレオシドで構成される場合、領域Ａ及びＢは一体的に領域Ｃに連結されたオリゴヌクレオチドを形成する場合がある。この文脈において、領域Ａは領域Ｂと区別することができ、領域Ａは少なくとも１つ、標的核酸（例えば、２’置換糖部分を有するＬＮＡ又はヌクレオシド）及び領域Ａに対する結合親和性が増強された２つの修飾ヌクレオシドは、それ自体で関連細胞系統における標的核酸の発現を調節できる。そのうえ、領域ＡがＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドを含む場合、これらヌクレオシドは、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合、例えばホスホロチオエートもしくはボラノホスフェートと連結される。他方、領域Ｂは、ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシド間のリン酸エステル結合を含む。幾つかの実施形態において、領域Ｂは、標的核酸と相補的ではないか、又は少なくとも５０％のミスマッチを含む。
幾つかの実施形態において、領域Ｂは、標的核酸配列に対して相補的でないか、又は領域Ａ内の標的核酸に相補的な連続ヌクレオチドに対して相補的でない。
幾つかの実施形態において、領域Ｂは、標的核酸配列と相補的である。この点で、領域Ａ及び領域Ｂは一緒になって、標的配列に対して相補的な単一の連続配列を形成しうる。
本発明の幾つかの態様において、第１の領域（領域Ａ）と第２の領域（領域Ｂ）との間のヌクレオシド間結合は、第２の領域の一部と見なして差し支えない。
幾つかの実施形態において、領域Ｂの塩基配列は、標的組織又は細胞又は亜細胞の区画に存在する主要なエンドヌクレアーゼの開裂酵素に基づいて、最適なエンドヌクレアーゼの開裂部位を提供するように選択される。この点に関して、標的組織及び非標的組織から細胞抽出物を単離することによって、領域Ｂで使用するためのエンドヌクレアーゼの開裂配列は、非標的細胞（例えば、腎臓）と比較した所望の標的細胞（例えば、肝臓／肝細胞）内での優先的な開裂活性に基づいて選択できる。これに関して、標的下方制御の化合物の効力は、所望の組織／細胞に対して最適化されうる。
幾つかの実施形態において、領域Ｂは、配列ＡＡ、ＡＴ、ＡＣ、ＡＧ、ＴＡ、ＴＴ、ＴＣ、ＴＧ、ＣＡ、ＣＴ、ＣＣ、ＣＧ、ＧＡ、ＧＴ、ＧＣ又はＧＧのジヌクレオチドを含み、Ｃは５−メチルシトシンである場合があり、且つ／あるいはＴはＵで置換可能であり、ヌクレオシド間結合はホスホジエステル結合が好ましい。幾つかの実施形態において、領域Ｂは、配列ＡＡＡ、ＡＡＴ、ＡＡＣ、ＡＡＧ、ＡＴＡ、ＡＴＴ、ＡＴＣ、ＡＴＧ、ＡＣＡ、ＡＣＴ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＡＧＡ、ＡＧＴ、ＡＧＣ、ＡＧＧ、ＴＡＡ、ＴＡＴ、ＴＡＣ、ＴＡＧ、ＴＴＡ、ＴＴＴ、ＴＴＣ、ＴＡＧ、ＴＣＡ、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＧ、ＴＧＡ、ＴＧＴ、ＴＧＣ、ＴＧＧ、ＣＡＡ、ＣＡＴ、ＣＡＣ、ＣＡＧ、ＣＴＡ、ＣＴＧ、ＣＴＣ、ＣＴＴ、ＣＣＡ、ＣＣＴ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＧＡ、ＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＧＡＡ、ＧＡＴ、ＧＡＣ、ＣＡＧ、ＧＴＡ、ＧＴＴ、ＧＴＣ、ＧＴＧ、ＧＣＡ、ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＧＡ、ＧＧＴ、ＧＧＣ、及びＧＧＧトリヌクレオチドを含み、Ｃは５−メチルシトシンである場合があり、且つ／あるいはＴはＵで置換可能であり、ヌクレオシド間結合はホスホジエステル結合であるのが好ましい。幾つかの実施形態において、領域Ｂは、配列ＡＡＡＸ、ＡＡＴＸ、ＡＡＣＸ、ＡＡＧＸ、ＡＴＡＸ、ＡＴＴＸ、ＡＴＣＸ、ＡＴＧＸ、ＡＣＡＸ、ＡＣＴＸ、ＡＣＣＸ、ＡＣＧＸ、ＡＧＡＸ、ＡＧＴＸ、ＡＧＣＸ、ＡＧＧＸ、ＴＡＡＸ、ＴＡＴＸ、ＴＡＣＸ、ＴＡＧＸ、ＴＴＡＸ、ＴＴＴＸ、ＴＴＣＸ、ＴＡＧＸ、ＴＣＡＸ、ＴＣＴＸ、ＴＣＣＸ、ＴＣＧＸ、ＴＧＡＸ、ＴＧＴＸ、ＴＧＣＸ、ＴＧＧＸ、ＣＡＡＸ、ＣＡＴＸ、ＣＡＣＸ、ＣＡＧＸ、ＣＴＡＸ、ＣＴＧＸ、ＣＴＣＸ、ＣＴＴＸ、ＣＣＡＸ、ＣＣＴＸ、ＣＣＣＸ、ＣＣＧＸ、ＣＧＡＸ、ＣＧＴＸ、ＣＧＣＸ、ＣＧＧＸ、ＧＡＡＸ、ＧＡＴＸ、ＧＡＣＸ、ＣＡＧＸ、ＧＴＡＸ、ＧＴＴＸ、ＧＴＣＸ、ＧＴＧＸ、ＧＣＡＸ、ＧＣＴＸ、ＧＣＣＸ、ＧＣＧＸ、ＧＧＡＸ、ＧＧＴＸ、ＧＧＣＸ、及びＧＧＧＸのトリヌクレオチドを含み、Ｘは、Ａ、Ｔ、Ｕ、Ｇ、Ｃ及びこれらの類縁体からなる群から選択可能であり、Ｃは５−メチルシトシンである場合があり、且つ／あるいはＴはＵで置換可能である。ヌクレオシド間結合はホスホジエステル結合であることが、好ましい。（天然起源の）核酸塩基Ａ、Ｔ、Ｕ、Ｇ、Ｃに言及する場合、これらは同等の天然核酸塩基（例えば、相補的ヌクレオシドとの塩基対）として機能する核酸塩基類似体で置換可能であることが認識される。
他のリンカー（領域Ｙ）
リンカーは、少なくとも２つの官能性基（一方はオリゴヌクレオチドに結合し、他方は結合部分に結合する）を有する場合がある。例示的なリンカー官能基は、オリゴヌクレオチド又は結合部分上の求核性基と反応するために求電子性である場合もあれば、あるいは求電子性基と反応するための求核性である場合もある。幾つかの実施形態において、リンカー官能基としては、ホスホロチオエート、ホスフェート、ホスファイト、不飽和（例えば、二重又は三重結合）などが挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの例示的なリンカー（領域Ｙ）としては、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（ＡＤＯ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、６−アミノヘキサン酸（ＡＨＥＸ又はＡＨＡ）、６−アミノヘキシルオキシ、４−アミノ酪酸、４−アミノシクロヘキシルカルボン酸、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミド−カプロン酸）（ＬＣＳＭＣＣ）、スクシンイミジルｍ−マレイミド−ベンゾイルエート（ＭＢＳ）、スクシンイミジルＮ−ｅ−マレイミド−カプロイル酸（ＥＭＣＳ）、スクシンイミジル６−（ベータ−マレイミド−プロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、スクシンイミジルＮ−（α−マレイミドアセテート）（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、β−アラニン（β−ＡＬＡ）、フェニルグリシン（ＰＨＧ）、４−アミノシクロヘキサン酸（ＡＣＨＣ）、β−（シクロプロピル）アラニン（β−ＣＹＰＲ）、アミノドデカン酸（ＡＤＣ）、アリレンジオール、ポリエチレングリコール、アミノ酸等が挙げられる。幾つかの実施形態において、リンカー（領域Ｙ）は、アミノアルキル、例えばＣ２−Ｃ３６アミノアルキル基、例えばＣ６−Ｃ１２アミノアルキル基を含む。好ましい実施形態において、リンカー（領域Ｙ）は、Ｃ６アミノアルキル基である。アミノアルキル基は、標準オリゴヌクレオチド合成の一部として、例えば保護されたアミノアルキルホスホルアミダイト等を使用して、オリゴヌクレオチド（領域Ａ又は領域Ａ−Ｂ）に添加できる。アミノアルキルとオリゴヌクレオチドとの間の連結基は、例えば、ホスホロチオエート又はホスホジエステル、又は本明細書中で言及される他のヌクレオシド連結基の１つでありうる。アミノアルキル基は、オリゴヌクレオチドの５’又は３’末端に共有結合している。市販のアミノアルキルリンカーは、例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端における連結のための、及びオリゴヌクレオチドの５’末端における連結のための３’−アミノ修飾試薬である５’−アミノ修飾酵素Ｃ６が利用可能である。これらの試薬は、Glen Research Corporation（Sterling, Va.）から入手可能である。これらの化合物又は類似のものは、フルオレセインをオリゴヌクレオチドの５’末端に連結することを目的に、Krieg, et al, Antisense Research and Development 1991, 1, 161によって利用された。多種多様な更なるリンカー基が当該技術分野において知られており、オリゴヌクレオチドへの結合部分の結合に有用でありうる。有用なリンカー基の多くに関する総説は、例えば、Antisense Research and Applications, S. T. Crooke and B. Lebleu, Eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1993, p. 303-350に見出される。アクリジンのような他の化合物は、ポリメチレン結合を介してオリゴヌクレオチドの３’末端リン酸基に結合している（Asseline, et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1984, 81, 3297）。上記の基は全ていずれも、単一のリンカー（領域Ｙ）として、又は１つ以上の更なるリンカー（領域Ｙ−Ｙ’又は領域Ｙ−ＢもしくはＢ−Ｙ）と組み合わせて使用できる。
リンカー、及びオリゴヌクレオチドのコンジュゲート調製時のリンカーの使用は、国際公開第９６／１１２０５号パンフレット、国際公開第９８／５２６１４号パンフレット、米国特許第４，９４８，８８２号明細書、同第５，５２５，４６５号明細書、同第５，５４１，３１３号明細書、同第５，５４５，７３０号明細書、同第５，５５２，５３８号明細書、同第５，５８０，７３１号明細書、同第５，４８６，６０３号明細書、同第５，６０８，０４６号明細書、同第４，５８７，０４４号明細書、同第４，６６７，０２５号明細書、同第５，２５４，４６９号明細書、同第５，２４５，０２２号明細書、同第５，１１２，９６３号明細書、同第５，３９１，７２３号明細書、同第５，５１０４７５号明細書、同第５，５１２，６６７号明細書、同第５，５７４，１４２号明細書、同第５，６８４，１４２号明細書、同第５，７７０，７１６号明細書、同第６，０９６，８７５号明細書、同第６，３３５，４３２号明細書及び同第６，３３５，４３７号明細書、ならびに国際公開第２０１２／０８３０４６号パンフレットにおける当該技術分野を通じて提供されており、これらの各出願はその全容が参照により援用されている。
製造方法
更なる態様において、本発明は本発明のオリゴヌクレオチドを製造する方法を提供するものであり、この製法は、ヌクレオチド単位を反応させ、それにより、そのオリゴヌクレオチド内に含有されている共有結合の連続ヌクレオチド単位を形成することを含む。この方法は、ホスホラミダイト化学を使用するものであることが、好ましい（例えば、Caruthers et al, 1987, Methods in Enzymology vol. 154, pages 287-313を参照)。更なる実施形態において、本方法は、連続ヌクレオチド配列を結合部分（リガンド）と反応させることを、更に含む。更なる態様では、本発明のオリゴヌクレオチドもしくは結合オリゴヌクレオチドを、医薬的に許容される希釈剤、溶媒、担体、塩及び／又は補助剤と混合することを含む、本発明の組成物の製造方法が提供されている。
医薬組成物
更なる態様において、本発明は、前述のオリゴヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドコンジュゲート、ならびに医薬的に許容される希釈剤、溶媒、担体、塩及び／又は補助剤のいずれかを含む、医薬組成物を提供するものである。医薬的に許容される希釈剤としては、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。医薬的に許容される塩としては、限定されるものではないが、ナトリウム塩及びカリウム塩が挙げられる。幾つかの実施形態において、医薬的に許容される希釈剤は、滅菌リン酸緩衝生理食塩水である。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、医薬的に許容される希釈剤中に５０〜３００μＭの濃度で使用される。
本発明において用いるのに好適な製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed., 1985に見出される。薬物送達方法の概略的な総説については、例えば、Langer（Science 249; 1527-1533, 1990）を参照のこと。国際公開第２００７／０３１０９１号パンフレットには、医薬的に許容される希釈剤、担体、及び補助剤の更なる好適且つ好ましい例が提供されている（本明細書において参照により援用されている）。好適な投薬量、製剤、投与経路、組成物、剤形、他の治療剤との併用、プロドラッグ製剤はまた、国際公開第２００７／０３１０９１号パンフレットに記載されている。
本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、医薬的に許容される活性物質、又は医薬組成物もしくは製剤の調製用の不活性物質と混合できる。医薬組成物の製剤用の組成物及び方法は、限定されないが、投与経路、疾患の程度、又は投与されるべき用量を含む多くの基準に依存する。
これらの組成物は、従来の滅菌技術で滅菌することも、あるいは滅菌濾過することもできる。結果として得られた水溶液は、そのまま使用するためにパッケージングしてもよく、又は凍結乾燥してもよく、凍結乾燥製剤を投与前に滅菌水性担体と組み合わせてもよい。調製物のｐＨは、典型的には３〜１１、より好ましくは５〜９又は６〜８、最も好ましくは７〜８（例えば、７〜７．５）である。固体形態で得られた組成物は、各々が錠剤又はカプセルの密封パッケージのような固定量の上記薬剤を含有する複数の単回投与単位でパッケージングできる。固体形態の組成物はまた、局所的に塗布可能なクリーム又は軟膏用に設計された絞り出しチューブ等の、柔軟量の容器中にパッケージングできる。
幾つかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、プロドラッグである。特に、オリゴヌクレオチドコンジュゲートに関して、プロドラッグが作用部分（例えば標的細胞）に送達されると、結合部分はオリゴヌクレオチドから開裂される。
用途
本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、例えば、診断薬、治療薬及び予防用の研究試薬として利用できる。
研究では、このようなオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートを用いて、細胞（例えば、インビトロ細胞培養物）及び実験動物におけるＰＤ−Ｌ１タンパク質の合成を特異的に調節し、それにより、治療介入の標的として標的の機能解析又はその有用性の評価を促進する。標的調節は典型的に、タンパク質を産生するｍＲＮＡを分解又は阻害し、それによりタンパク質形成を妨げるか、又はタンパク質を産生する遺伝子もしくはｍＲＮＡの調節物質を分解、又は阻害することによって達成される。
研究又は診断において本発明のオリゴヌクレオチドを使用する場合、標的核酸は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ由来のｃＤＮＡ又は合成核酸であってもよい。
本発明は、ＰＤ−Ｌ１を発現する標的細胞におけるＰＤ−Ｌ１の発現を調節するためのインビボ又はインビトロ方法であって、前記方法が、有効量の本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートを前記細胞に投与することを含む方法を提供するものである。
幾つかの実施形態において、標的細胞は、哺乳動物細胞、特にヒト細胞とされる。標的細胞は、インビトロ細胞培養物としてもよいし、あるいは哺乳動物の組織の一部を形成するインビボ細胞としてもよい。好ましい実施形態において、標的細胞は肝臓に存在する。肝細胞標的細胞は、実質細胞（例えば、肝細胞）、ならびにＫｕｐｆｆｅｒ細胞、ＬＳＥＣｓ、星状細胞（又はＩｔｏ細胞）、胆管細胞、及び肝臓関連白血球（Ｔ細胞及びＮＫ細胞を含む）等の非実質細胞から選択できる。幾つかの実施形態において、標的細胞は抗原提示細胞である。抗原提示細胞は、その表面上に、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ又はクラスＩＩと複合体化した外来抗原を提示する。幾つかの実施形態において、抗原提示細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ（すなわち、樹状細胞、マクロファージ及びＢ細胞などのプロフェッショナル抗原提示細胞）を発現する。
診断の際には、オリゴヌクレオチドを使用して、ノーザンブロッティング、インサイチュハイブリダイゼーション又は類似の技術により、細胞及び組織におけるＰＤ−Ｌ１発現を検出して定量できる。
本発明のオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドコンジュゲート、又はそれらの医薬組成物は、疾患もしくは障害を有する疑いのある動物又はヒトに投与することができ、その疾患もしくは障害は、ＰＤ−Ｌ１の発現を低減させることによって、特に肝臓標的細胞におけるＰＤ−Ｌ１の発現を低減させることによって、緩和又は処置できる。
本発明は、治療上もしくは予防上有効な量の本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、又は医薬組成物を、疾患に罹患しているかもしくは罹患しがちな被験者に投与することを含む、疾患の治療又は防止方法を提供する。
また、本発明は、薬品として使用するための、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、又は医薬組成物に関する。
本発明によるオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬組成物は、典型的に有効量で投与される。
本発明はまた、本明細書中で言及されている疾患又は障害を治療するための医薬品の製造に関して記載されている、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲートもしくは医薬組成物の使用を提供する。一実施形態において疾患は、ａ）ＨＢＶ、ＨＣＶ及びＨＤＶなどのウイルス性肝炎感染；ｂ）マラリア、トキソプラズマ症、リーシュマニア症及びトリパノソーマ症などの寄生虫感染；ならびにｃ）肝臓癌又は肝臓における転移である。
一実施形態において、本発明は、ウイルス感染症もしくは寄生虫感染症から選択される疾患又は障害の治療に使用するためのオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬組成物に関する。更なる実施形態において、疾患は、ａ）ＨＢＶ、ＨＣＶ及びＨＤＶなどのウイルス性肝炎感染；ｂ）マラリア、トキソプラズマ症、リーシュマニア症及びトリパノソーマ症などの寄生虫感染；ならびにｃ）肝臓癌又は肝臓における転移から選択される。
本明細書中で言及されている疾患又は障害は、免疫疲弊に関連する。特に疾患又は障害は、ウイルス特異的Ｔ細胞応答の疲弊と関連している。幾つかの実施形態において、疾患又は障害はＰＤ−Ｌ１発現の低減によって緩和又は処置できる。
本発明の方法は、免疫疲弊に関連する疾患に対する治療又は予防の目的に使用されるのが好ましい。
本発明の一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲートもしくは医薬組成物は、肝臓癌又は肝臓の転移に対する免疫応答の回復に使用される。
本発明の一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、又は医薬組成物は、病原体に対する免疫応答の回復に使用される。幾つかの実施形態において、病原体は肝臓に見出すことができる。病原体は、ウイルス又は寄生虫、特に、本明細書に記載されるものでありうる。好ましい実施形態において、病原体はＨＢＶである。
本発明は更に、本明細書中に記載のウイルスもしくは寄生虫感染に対する免疫回復用の薬品製造を目的とした、本明細書中に定義されているオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬組成物の使用に関する。
本発明のオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドコンジュゲート、又は医薬組成物は、ウイルス感染、特にPD-1経路に影響を与える肝臓におけるウイルス感染の治療に使用できる（例えば、Kapoor及びKottilil 2014 Future Virol Vol. 9 pp. 565-585、ならびにSalem及びEl-Badawy 2015 World J Hepatol Vol. 7 pp. 2449-2458を参照)。ウイルス性肝炎感染は、肝炎ウイルス、特にＨＢＶ、ＨＣＶ及びＨＤＶ、特にこれらの感染の慢性形態からなる群から選択できる。一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドコンジュゲート、又は医薬組成物はＨＢＶ、特に慢性ＨＢＶの治療を目的に使用される。慢性ＨＢＶ感染の指標は、高レベルのウイルス負荷（ＨＢＶ ＤＮＡ）であり、循環系において（ウイルス粒子を１００倍超過する）より高レベルの空ＨＢｓ抗原粒子である。
本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートはまた、ＨＩＶとの共感染症として発症するウイルス性肝炎感染の治療を目的に使用することもできる。本発明のオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬組成物で治療できる他のウイルス感染は、ｌｃｍｖ（リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス）、ならびに単感染としてのＨＩＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、及び他のヘルペスウイルスである。これらのウイルスは、肝栄養性ではないが、ＰＤＬ１下方制御に対する感受性がある可能性がある。
幾つかの実施形態において、免疫もしくは免疫応答の回復は、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞応答の改善、ならびに／あるいはＴ細胞枯渇の緩和を含み、特に、ＨＢＶ特異的Ｔ細胞応答、ＨＣＶ特異的Ｔ細胞応答、ならびに／あるいはＨＤＶ特異的Ｔ細胞応答が回復する。Ｔ細胞応答の改善は、例えば、対照（処置前のレベル又はビヒクル処置済の被験者におけるレベル等）と比較して、肝臓内でのＴ細胞の増加（特に、ＣＤ８＋及び／もしくはＣＤ４＋Ｔ細胞の増加）として評価できる。更なる実施形態において、ウイルス特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、対照と比較して回復又は増加し、特に、ＨＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞又はＨＣＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞又はＨＤＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、対照と比較して回復又は増加する。好ましい実施形態において、ＨＢＶ ｓ抗原（ＨＢｓ抗原）に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞、及び／もしくはＨＢＶ ｅ抗原（ＨＢｅ抗原）に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞、及び／もしくはＨＢＶコア抗原（ＨＢｃＡｇ）に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞は、（ＩＦＮ−γ）又は腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬組成物を投与することを含む。ＨＢＶ抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）又は腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）のような、１つ以上のサイトカインを産生するのが、好ましい。上記のＣＤ８＋Ｔ細胞の増加は、特に肝臓において観察される。本明細書中に記載されている増加は、対照と比較して統計的に有意であるべきである。この増加は、対照と比較して、少なくとも２０％、例えば２５％、例えば５０％、例えば７５％であるのが、好ましい。別の実施形態において、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞 及び／又はナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞は、本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートによって活性化される。
本発明のオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドコンジュゲート、又は医薬組成物は、寄生虫感染症、特に、ＰＤ−１経路に影響を与える寄生虫感染症の治療に使用できる（例えば、Bhadra et al.2012 J Infect Dis vol 206 pp. 125-134；Bhadra et al.2011 Proc Natl Acad Sci U S A Vol. 108 pp. 9196-9201；Esch et al.J Immunol vol 191 pp 5542-5550；Freeman及びSharpe 2012 Nat Immunol Vol 13 pp. 113-115；Gutierrez et al.2011 Infect Immun Vol 79 pp. 1873-1881；Joshi et al.2009 PLoS Pathog Vol 5 e1000431；Liang et al.2006 Eur J Immunol Vol. 36 pp 58-64；Wykes et al.2014 Front Microbiol Vol 5 pp 249を参照のこと）。寄生虫感染症は、マラリア、トキソプラズマ症、リーシュマニア症及びトリパノソーマ症からなる群から選択できる。マラリア感染症は、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium）属、特に、三日熱マラリア原虫（P. vivax）、Ｐ．マラリア（P. malariae）及びＰ．ファルシパルム（P. falciparum）種の原虫によって引き起こされる。トキソプラズマは、トキソプラズマ（Toxoplasma gondii）によって引き起こされる寄生虫性疾患である。リーシュマニア症は、リーシュマニア（Leishmania）属の原生動物寄生虫によって引き起こされる疾患である。トリパノソーマ症は、トリパノソーマ（Trypanosoma）属の原生動物によって引き起こされる。熱帯地方のチャガ病は種クルーズトリパノソーマ（Trypanosoma cruzi）によって引き起こされ、且つ睡眠病は種ブルーストリパノソーマ（Trypanosoma brucei）によって引き起こされる。
幾つかの実施形態において、免疫の回復は、寄生虫特異的Ｔ細胞及びＮＫ細胞応答、特に、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium）特異的Ｔ細胞応答、トキソプラズマ（Toxoplasma gondii）特異的Ｔ細胞、及びＮＫ細胞応答、リーシュマニア（Leishmania）特異的Ｔ細胞、及びＮＫ細胞応答、クルーズトリパノソーマ（Trypanosoma cruzi）特異的Ｔ細胞、及びＮＫ細胞応答又はブルーストリパノソーマ（Trypanosoma brucei）特異的Ｔ細胞、及びＮＫ細胞応答の回復を伴う。更なる実施形態では、寄生虫特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞応答が、回復される。
投与
本発明のオリゴヌクレオチド又は医薬組成物は、局所的に（皮膚、吸入、眼もしくは耳）又は経腸（経口もしくは胃腸管など）又は非経口（静脈内、皮下、筋肉内、大脳内、脳室内もしくはクモ膜下腔内）投与できる。
好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド又は医薬組成物は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内もしくは筋肉内の注射又は注入、クモ膜下腔内もしくは頭蓋内、例えば、髄腔内もしくは頭蓋内の経路を含む非経口経路によって投与される。大脳内又は腔内、硝子体内投与が含まれる。一実施形態において、活性なオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、静脈内投与される。別の実施形態において、活性なオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、皮下投与される。
幾つかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬組成物は、０．１〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．２〜１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．２５〜１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１〜５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．２〜５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．２５〜５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。投与は、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、又は１か月に１回でありうる。
併用療法
幾つかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬組成物は、他の治療剤との併用治療の用途に使用される。治療剤は、例えば、上記の疾患又は障害に対する標準ケアとすることができる。
慢性ＨＢＶ感染症の治療には、抗ウイルス薬と免疫系調節物質の併用が推奨される。ＨＢＶに対して有効な抗ウイルス薬は、例えば、ヌクレオシド類似体である。処置のために認可された５つのヌクレオシドアナログがある。
ＨＢＶ、すなわちラミブジン（Epivir）、アデフォビル（Hepsera）、テノホビル（Viread）、テルビブジン（Tyzeka）、エンテカビル（Baraclude）は、ウイルス複製を抑制するのに効果的であるが、ＨＢｓ抗原レベルには効果がない。他の抗ウイルス薬には、リバビリン及びＨＢＶ抗体療法（モノクローナル又はポリクローナル）が含まれる。免疫系調節物質は、例えば、インターフェロンα−２ａ及びＰＥＧ化インターフェロンα−２ａ（Pegasys）又はＴＬＲ７アゴニスト（例えばGS-9620）もしくは治療用ワクチンでありうる。ＩＦＮ−α処置によるウイルス負荷の低減効果は極めて低いことが明らかにされているが、この処置の結果、極めて非効率ではあるが、ＨＢｓ抗原が多少（４８週間の処置後に１０％未満）低減する。
本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ＨＢＶ対して有効な他の抗ウイルス薬、例えば国際公開第２０１２／１４５６９７号パンフレット及び国際公開第２０１４／１７９６２９号パンフレットに記載されているアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は国際公開第２００５／０１４８０６号パンフレット、国際公開第２０１２／０２４１７０号パンフレット、国際公開第２０１２／２０５５３６２号、国際公開第２０１３／００３５２０号パンフレット及び国際公開第２０１３／１５９１０９号パンフレットに記載されているｓｉＲＮＡ分子と併用できる。
本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートが他の薬剤との併用療法で投与される場合、それらは逐次的にもしくは同時に個体に投与できる。あるいは、本発明の医薬組成物は、本明細書に記載されている医薬的に許容される賦形剤、及び当該分野において公知の別の治療剤又は予防剤と関連して、本発明のオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドコンジュゲートの組み合わせから構成できる。
本発明の以下の実施形態は、本明細書に記載されている他の実施形態と併用できる。
１． ＰＤ−Ｌ１の発現を低減できる１０〜３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
２． 連続ヌクレオチド配列がＰＤ−Ｌ１標的核酸に対して少なくとも９０％相補的である、実施形態１に記載のオリゴヌクレオチド。
３． 連続ヌクレオチド配列が、配列番号：１、配列番号：２及び／又は配列番号：３からなる群から選択される標的核酸に対して相補的である、実施形態１又は２に記載のオリゴヌクレオチド。
４． 連続ヌクレオチド配列が配列番号１上の位置１及び１５７２０内の領域に対して相補的である、実施形態１〜３に記載のオリゴヌクレオチド。
５． オリゴヌクレオチドが、配列番号：１、配列番号：２及び／又は配列番号：３からなる群から選択される標的核酸にハイブリダイズできる、ΔＧ°が１０ｋｃａｌ未満である、実施形態１〜４に記載のオリゴヌクレオチド。
６． 連続ヌクレオチド配列が標的核酸のサブ配列に対して相補的であり、サブ配列が、配列番号：１上の位置３７１−３０６８、５４６７−１２１０７、１５３１７−１５７２０、１５３１７−１８０８３、１５３１７−１９５１１及び１８８８１−１９４９４からなる群から選択される、実施形態１〜５に記載のオリゴヌクレオチド。
７． サブ配列は、配列番号：１上の位置７３００−７３３３、８０２８−８０７２、９８１２−９８５９、１１７８７−１１８７３及び１５６９０−１５７３５からなる群から選択される、実施形態６に記載のオリゴヌクレオチド。
８． 標的核酸がＲＮＡである、実施形態２〜７に記載のオリゴヌクレオチド。
９． ＲＮＡがｍＲＮＡである、実施形態８に記載のオリゴヌクレオチド。
１０． ｍＲＮＡが前駆体ｍＲＮＡ又は成熟ｍＲＮＡである、実施形態９に記載のオリゴヌクレオチド。
１１． 連続ヌクレオチド配列が少なくとも１４連続ヌクレオチド、特に１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４連続ヌクレオチドを含むか又はそれからなる、実施形態１から１０に記載のオリゴヌクレオチド。
１２． 連続ヌクレオチド配列が１６〜２０ヌクレオチドを含むか又はそれからなる、実施形態１から１０に記載のオリゴヌクレオチド。
１３． オリゴヌクレオチドが１４〜３５ヌクレオチド長を含むか又はそれからなる、実施形態１から１０に記載のオリゴヌクレオチド。
１４． オリゴヌクレオチドが１８〜２２ヌクレオチド長を含むか又はそれからなる、実施形態１３に記載のオリゴヌクレオチド。
１５． オリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列が一本鎖である、実施形態１から１４に記載のオリゴヌクレオチド。
１６． 連続ヌクレオチド配列が標的核酸のサブ配列に対して相補的であり、サブ配列がＡ７、Ａ２６、Ａ４３、Ａ１１９、Ａ１４２、Ａ１５９、Ａ１６０、Ａ１６３、Ａ１６９、Ａ１７８、Ａ１７９、Ａ１８０、Ａ１８９、Ａ２０１、Ａ２０２、Ａ２０４、Ａ２１４、Ａ２２１、Ａ２２４、Ａ２２６、Ａ２４３、Ａ２５４、Ａ２５８、２６９、Ａ２７４、Ａ３５０、Ａ３６０、Ａ３６４、Ａ３６５、Ａ３７０、Ａ３７２、Ａ３８１、Ａ３８３、Ａ３８６、Ａ３８９、Ａ４００、Ａ４２７、Ａ４３５及びＡ４３８からなる群から選択される、実施形態１から１５に記載のオリゴヌクレオチド。
１７． サブ配列がＡ２２１、Ａ３６０、Ａ１８０、Ａ１６０及びＡ２６９からなる群から選択される、実施形態１６に記載のオリゴヌクレオチド。
１８． オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡではなく、且つ自己相補的ではない、実施形態１から１７に記載のオリゴヌクレオチド。
１９． 連続ヌクレオチド配列が、配列番号：５〜７４３又は７７１から選択される配列を含むか又はそれからなる、実施形態１から１８に記載のオリゴヌクレオチド。
２０． 連続ヌクレオチド配列が、配列番号：６、８、９、１３、４１、４２、５８、７７、９２、１１１、１２８、１５１、１６４、１６６、１６９、１７１、２２２、２３３、２４５、２４６、２５０、２５１、２５２、２５６、２７２、２７３、２８７、２９２、３０３、３１４、３１８、３２０、３２４、３３６、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４９、３５９、３６０、３７４、４０８、４０９、４１５、４１７、４２４、４２９、４３０、４５８、４６４、４６６、４７４、４９０、４９３、５１２、５１９、５１９、５２９、５３３、５３４、５４７、５６６、５６７、５７８、５８２、６０１、６１９、６２０、６３６、６３７、６３８、６４０、６４５、６５０、６５１、６５２、６５３、６５８、６５９、６６０、６６５、６７８、６７９、６８０、６８２、６８３、６８４、６８７、６９４、７０６、７１６、７２８、７３３、７３４、及び７３５から選択される配列を含むか又はそれからなる、実施形態１から１９に記載のオリゴヌクレオチド。
２１． 連続ヌクレオチド配列が、配列番号：４６６、６４０、３４２、２８７及び５６６から選択される配列を含むか又はそれからなる、実施形態１から２０に記載のオリゴヌクレオチド。
２２． 連続ヌクレオチド配列が標的核酸と比較して０〜３個のミスマッチを有し、該連続ヌクレオチドが該標的核酸に対して相補的である、実施形態１から２１に記載のオリゴヌクレオチド。
２３． 連続ヌクレオチド配列が標的核酸と比較して１つのミスマッチを有する、実施形態２２に記載のオリゴヌクレオチド。
２４． 連続ヌクレオチド配列が、標的核酸と比較して２つのミスマッチを有する、実施形態２２に記載のオリゴヌクレオチド。
２５． 連続ヌクレオチド配列が、標的核酸配列に対して完全に補完的である、実施形態２２に記載のオリゴヌクレオチド。
２６． １以上の修飾ヌクレオシドを含む、実施形態１から２５に記載のオリゴヌクレオチド。
２７． １以上の修飾ヌクレオシドが高親和性修飾ヌクレオシドである、実施形態２６に記載のオリゴヌクレオチド。
２８． １以上の修飾ヌクレオシドが２’糖修飾ヌクレオシドである、実施形態２６又は２７に記載のオリゴヌクレオチド。
２９． １以上の２’糖修飾ヌクレオシドが独立に、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＤＮＡ、アラビノ核酸酸（ＡＮＡ）、２’−フルオロ−ＡＮＡ、及びＬＮＡヌクレオシドからなる群から選択される、実施形態２８に記載のオリゴヌクレオチド。
３０． １以上の修飾ヌクレオシドがＬＮＡヌクレオシドである、実施形態２８に記載のオリゴヌクレオチド。
３１． 修飾ＬＮＡヌクレオシドがオキシ−ＬＮＡである、実施形態３０に記載のオリゴヌクレオチド。
３２． 修飾ヌクレオシドがβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである、実施形態３１に記載のオリゴヌクレオチド。
３３． 修飾ヌクレオシドがチオＬＮＡである、実施形態３０に記載のオリゴヌクレオチド。
３４． 修飾ヌクレオシドがアミノ−ＬＮＡである、実施形態３０に記載のオリゴヌクレオチド。
３５． 修飾ヌクレオシドがｃＥＴである、実施形態３０に記載のオリゴヌクレオチド。
３６． 修飾ヌクレオシドがＥＮＡである、実施形態３０に記載のオリゴヌクレオチド。
３７． 修飾ＬＮＡヌクレオシドが、α−Ｌ−オキシ−ＬＮＡ、β−Ｄ−アミノ−ＬＮＡ、α−Ｌ−アミノ−ＬＮＡ、β−Ｄ−チオ−ＬＮＡ、α−Ｌ−アミノ−ＬＮＡ、チオ−ＬＮＡ、（Ｓ）ｃＥＴ、（Ｒ）ｃＥＴβ−Ｄ−ＥＮＡ及びα−Ｌ−ＥＮＡから選択される、実施形態３０に記載のオリゴヌクレオチド。
３８． 修飾ＬＮＡヌクレオシド以外に、少なくとも１つの２’置換修飾ヌクレオシドが存在する、実施形態３０から３７に記載のオリゴヌクレオチド。
３９． ２’置換修飾ヌクレオシドが２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＡＮＡからなる群から選択される、実施形態３８に記載のオリゴヌクレオチド。
４０． オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、実施形態１から３９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
４１． 修飾ヌクレオシド間結合がヌクレアーゼ耐性である、実施形態４０に記載のオリゴヌクレオチド。
４２． 連続ヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合の少なくとも５０％がホスホロチオエートヌクレオシド間結合又はボラノホスフェートヌクレオシド間結合である、実施形態４０又は４１に記載のオリゴヌクレオチド。
４３． 連続ヌクレオチド配列内の全てのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、実施形態４０又は４１に記載のオリゴヌクレオチド。
４４． オリゴヌクレオチドがＲＮアーゼＨを補充する能力を有する、実施形態１から４３に記載のオリゴヌクレオチド。
４５． オリゴヌクレオチドがギャップマーである、実施形態４４に記載のオリゴヌクレオチド。
４６． オリゴヌクレオチドが式５’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−３’のギャップマーであり、領域Ｆ及びＦ’が独立に１〜７修飾ヌクレオシドを含むか又はそれからなり、且つＧがＲＮアーゼＨを補充する能力を有する６〜１６ヌクレオシド間の領域であり、実施形態４４又は４５に記載のオリゴヌクレオチド。
４７． ギャップマーが、式５’−Ｄ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−３’又は５’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ”−３’を有し、領域Ｆ及びＦ’が独立に、１〜７修飾ヌクレオシドを含み、ＧがＲＮアーゼＨを補充する能力を有する６〜１６ヌクレオシド間の領域であり、且つ領域Ｄ’又はＤ”が１〜５ホスホジエステルの連結ヌクレオシドを含む、実施形態４４又は４５に記載のオリゴヌクレオチド。
４８． Ｄ’又はＤ”が任意選択的である、実施形態４７に記載のオリゴヌクレオチド。
４９． 領域Ｄ’が２つのホスホジエステルの連結ヌクレオシドからなる、実施形態４７に記載のオリゴヌクレオチド。
５０． ホスホジエステル連結ヌクレオシドがｃａ（シチジン−アデノシン）である、実施形態４９に記載のオリゴヌクレオチド。
５１． 修飾ヌクレオシドが２’糖修飾ヌクレオシドであり、独立に、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＤＮＡ、アラビノ核酸酸（ＡＮＡ）、２’−フルオロ−ＡＮＡ、及びＬＮＡヌクレオシドからなる群から選択される、実施形態４６又は４７に記載のオリゴヌクレオチド。
５２． Ｆ領域及びＦ’領域中の修飾ヌクレオシドのうちの１つ以上が、ＬＮＡヌクレオシドである、実施形態４６から５１に記載のオリゴヌクレオチド。
５３． Ｆ領域及びＦ’領域中の全ての修飾ヌクレオシドが、ＬＮＡヌクレオシドである、実施形態５２に記載のオリゴヌクレオチド。
５４． Ｆ領域及びＦ’領域がＬＮＡヌクレオシドからなる、実施形態５３に記載のオリゴヌクレオチド。
５５． Ｆ領域及びＦ’領域中の全ての修飾ヌクレオシドがオキシ−ＬＮＡヌクレオシドである、実施形態５２から５４に記載のオリゴヌクレオチド。
５６． 領域Ｆ又はＦ’のうちの少なくとも１つが、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ及び２’−フルオロ−ＤＮＡからなる群から独立に選択された少なくとも１つの２’置換修飾ヌクレオシドを更に含む、実施形態５２に記載のオリゴヌクレオチド。
５７． 領域Ｇ中のＲＮアーゼＨ補充ヌクレオシドが独立にＤＮＡ、α−Ｌ−ＬＮＡ、Ｃ４’アルキル化ＤＮＡ、ＡＮＡ及び２’Ｆ−ＡＮＡ及びＵＮＡから選択される、実施形態４６から５６に記載のオリゴヌクレオチド。
５８． 領域Ｇ中のヌクレオシドが、ＤＮＡ及び／又はα−Ｌ−ＬＮＡヌクレオシドである、実施形態５７に記載のオリゴヌクレオチド。
５９． 領域Ｇが少なくとも７５％ＤＮＡヌクレオシドからなる、実施形態５７又は５８に記載のオリゴヌクレオチド。
６０． オリゴヌクレオチドがＣＭＰ ＩＤ番号：５＿１〜７４３＿１及び７７１＿１（表５）のいずれか１つから選択される、実施形態１から５９に記載のオリゴヌクレオチド。
６１． オリゴヌクレオチドがＣＭＰ ＩＤ番号：６＿１、８＿１、９＿１、１３＿１、４１＿１、４２＿１、５８＿１、７７＿１、９２＿１、１１１＿１、１２８＿１、１５１＿１、１６４＿１、１６６＿１、１６９＿１、１７１＿１、２２２＿１、２３３＿１、２４５＿１、２４６＿１、２５０＿１、２５１＿１、２５２＿１、２５６＿１、２７２＿１、２７３＿１、２８７＿１、２９２＿１、３０３＿１、３１４＿１、３１８＿１、３２０＿１、３２４＿１、３３６＿１、３４２＿１、３４３＿１、３４４＿１、３４５＿１、３４６＿１、３４９＿１、３５９＿１、３６０＿１、３７４＿１、４０８＿１、４０９＿１、４１５＿１、４１７＿１、４２４＿１、４２９＿１、４３０＿１、４５８＿１、４６４＿１、４６６＿１、４７４＿１、４９０＿１、４９３＿１、５１２＿１、５１９＿１、５１９＿１、５２９＿１、５３３＿１、５３４＿１、５４７＿１、５６６＿１、５６７＿１、５７８＿１、５８２＿１、６０１＿１、６１９＿１、６２０＿１、６３６＿１、６３７＿１、６３８＿１、６４０＿１、６４５＿１、６５０＿１、６５１＿１、６５２＿１、６５３＿１、６５８＿１、６５９＿１、６６０＿１、６６５＿１、６７８＿１、６７９＿１、６８０＿１、６８２＿１、６８３＿１、６８４＿１、６８７＿１、６９４＿１、７０６＿１、７１６＿１、７２８＿１、７３３＿１、７３４＿１、及び７３５＿１からなる群から選択される、実施形態１から６０に記載のオリゴヌクレオチド。
６２． オリゴヌクレオチドがＣＭＰ ＩＤ番号：２８７＿１、３４２＿１、４６６＿１、６４０＿１、５６６＿１、７６６＿１、７６７＿１、７６８＿１、７６９＿１及び７７０＿１からなる群から選択される、実施形態１から６１に記載のオリゴヌクレオチド。
６３． ａ．請求項１から６２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド（領域Ａ）と；
ｂ．前記オリゴヌクレオチドに共有結合されている、少なくとも１つの結合部分（領域Ｃ）；
を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
６４． 結合部分が、炭水化物、細胞表面受容体リガンド、薬物物質、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素、ビタミン、ウイルスタンパク質又はこれらの組み合わせから選択される、実施形態６３に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
６５． 結合部分が、部分を含有する炭水化物である、実施形態６３又は６４に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
６６． 炭水化物結合部分が、少なくとも１つのアシアロ糖タンパク質受容体標的化部分を含み、請求項１から６２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドに共有結合されている、実施形態６５に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
６７． アシアロ糖タンパク質受容体標的化結合部分が、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ−ホルミル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−プロピオニル−ガラクトサミン、Ｎ−ｎ−ブタノイル−ガラクトサミン及びＮ−イソブタノイルガラクトサミンからなる群から選択される少なくとも１つの炭水化物部分を含む、実施形態６６に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
６８． アシアロ糖タンパク質受容体標的化結合部分が、１価、２価、３価又は４価である、実施形態６６又は６７に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
６９． アシアロ糖タンパク質受容体標的化結合部分が、２〜４個の末端ＧａｌＮＡｃ部分と各ＧａｌＮＡｃ部分を分岐分子に連結するＰＥＧスペーサーとからなる、実施形態６８に記載のオリゴマーコンジュゲート。
７０． アシアロ糖タンパク質受容体標的化結合部分が、３価Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分である、実施形態６６から６９に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
７１． 結合部分が、図１中の３価ＧａｌＮＡｃ部分のいずれか１つから選択される、実施形態６６から７０に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
７２． 結合部分が図３の３価ＧａｌＮＡｃ部分である、実施形態７１に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
７３． オリゴヌクレオチド又は連続オリゴヌクレオチド配列と結合部分との間にリンカーが存在する、実施形態６３から７２に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
７４． リンカーが、生理学的に易変的なリンカー（領域Ｂ）である、実施形態７３に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
７５． 生理学的に易変的なリンカーがヌクレアーゼ感受性リンカーである、実施形態７４に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
７６． 生理学的に易変的なリンカーが、２〜５個の連続するホスホジエステル結合で構成される、実施形態７４又は７５に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
７７． 生理学的に易変的なリンカーが、実施形態４７から５０中に存在する領域Ｄ’又はＤ”に等しい、実施形態７６に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
７８． オリゴヌクレオチドコンジュゲートがＣＭＰ ＩＤ番号：７６６＿２、７６７＿２、７６８＿２、７６９＿２及び７７０＿２から選択される、実施形態６３から７７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
７９． オリゴヌクレオチドコンジュゲートが図４、図５、図６、図７及び図８に表されるオリゴヌクレオチドコンジュゲートから選択される、実施形態７８に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
８０． 非結合オリゴヌクレオチドと比較して、標的細胞におけるＰＤ−Ｌ１の阻害の改善、又は肝臓と脾臓との間の細胞分布の改善、又はコンジュゲートオリゴヌクレオチドの肝臓への細胞への取り込みの改善を呈する、実施形態６３から７６に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
８１． 実施形態１から６２に記載のオリゴヌクレオチド、又は実施形態６３から８０に記載のコンジュゲート、ならびに医薬的に許容される希釈剤、担体、塩及び／又は補助剤を含む、医薬組成物。
８２． ヌクレオチド単位を反応させ、それにより、そのオリゴヌクレオチド内に含有されている共有結合の連続ヌクレオチド単位を形成することを含む、実施形態１から６２に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
８３． 連続ヌクレオチド配列を非ヌクレオチド結合部分と反応させることを、更に含む、実施形態８２に記載の方法。
８４． オリゴヌクレオチドを医薬的に許容される希釈剤、担体、塩及び／又は補助剤と混合することを含む、実施形態８１に記載の組成物の製造方法。
８５． ＰＤ−Ｌ１を発現する標的細胞内でのＰＤ−Ｌ１の発現を調節するためのインビボ又はインビトロ方法であって、前記方法が、有効量の実施形態１から６２に記載のオリゴヌクレオチド、又は実施形態６３から８０に記載のコンジュゲート、又は実施形態８１に記載の医薬組成物を前記細胞に投与することを含む、前記方法。
８６． 治療的もしくは予防的有効量の実施形態１から６２に記載のオリゴヌクレオチド、又は実施形態６３から８０に記載のコンジュゲート、又は実施形態８１に記載の医薬組成物を、疾患に罹患しているか又は罹患しやすい被験者に投与することを含む、疾患の治療又は防止方法。
８７． 治療的もしくは予防的有効量の実施形態６３から８０に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート、又は実施形態１から６２に記載のオリゴヌクレオチド、又は実施形態８１に記載の医薬組成物を、ウイルス又は寄生虫に感染した被験者に投与することを含む、ウイルスもしくは寄生虫に対する免疫回復法。
８８． 免疫性の回復が、対照と比較して、肝臓における１以上のＨＢＶ抗原に対して特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の増加である、実施形態８７に記載の方法。
８９. 被験者における疾患の治療又は防止用の薬品として使用するための、実施形態１から６２に記載のオリゴヌクレオチド、又は実施形態６３から８０に記載のコンジュゲート、又は実施形態８１に記載の医薬組成物。
９０． 被験者における疾患の治療又は防止用の薬品を調製するための、実施形態１から６２に記載のオリゴヌクレオチドの使用、又は実施形態６３から８０に記載のコンジュゲートの使用。
９１． ウイルスもしくは寄生虫に対する免疫性の回復に使用するための、実施形態１から６２に記載のオリゴヌクレオチド、又は実施形態６３から８０に記載のコンジュゲート、又は実施形態８１に記載の医薬組成物。
９２． 免疫性の回復が、対照と比較して、肝臓における１以上のＨＢＶ抗原に対して特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の増加である、実施形態９１に記載の使用。
９３． ＨＢＶ抗原がＨＢｓ抗原である、実施形態９２に記載の使用。
９４． 疾患がＰＤ−Ｌ１のインビボ活性に関連するものである、実施形態８６から９３に記載の方法、オリゴヌクレオチド又は使用。
９５． 疾患が、抗原提示細胞におけるＰＤ−Ｌ１の発現の増加と関連するものである、実施形態８６から９４に記載の方法、オリゴヌクレオチド又は使用。
９６． ＰＤ−Ｌ１が、実施形態１から６２に記載のオリゴヌクレオチド、又は実施形態６３から８０に記載のコンジュゲート、又は実施形態８１に記載の医薬組成物での治療を受けない場合の発現又はその処置前の発現と比較して少なくとも３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％低減される、実施形態９５に記載の方法、オリゴヌクレオチド又は使用。
９７． 疾患が、ウイルス性肝炎感染症又は寄生虫感染症から選択される、実施形態８６から９５に記載の方法、オリゴヌクレオチド又は使用。
９８． ウイルス感染がＨＢＶ、ＨＣＶ又はＨＤＶである、実施形態９８に記載の方法、オリゴヌクレオチド、又は使用。
９９． 疾患が慢性ＨＢＶである、実施形態８６から９５に記載の方法、オリゴヌクレオチド、又は使用。
１００． 寄生虫感染症が、マラリア、トキソプラズマ症、リーシュマニア症又はトリパノソーマ症である、実施形態９８に記載の方法、オリゴヌクレオチド、又は使用。
１０１． 被験者が哺乳動物である、実施形態８６から１００に記載の方法、オリゴヌクレオチド、又は使用。
１０２． 哺乳動物がヒトである、実施形態１０１に記載の方法、オリゴヌクレオチド、又は使用。
材料と方法
モチーフ配列及びオリゴヌクレオチド化合物
モチーフ配列は、オリゴヌクレオチド中に存在する核酸塩基の連続配列を表す。
デザインは、ギャップマーデザインＦ−Ｇ−Ｆ’を指す。各数字は連続した修飾ヌクレオシドの数を表す。２’修飾ヌクレオシド（第１の数＝５’側面）、続いてＤＮＡヌクレオシドの数（第２の数＝ギャップ領域）、続いて修飾ヌクレオシドの数（例えば、標的核酸に相補的である連続した配列の一部ではないＤＮＡ及びＬＮＡの更なる反復領域が先行するか又はその後に続く、２’修飾ヌクレオシド（第３の数＝３’側面）を含む。
オリゴヌクレオチド化合物は、モチーフ配列の特定の設計を表す。大文字はβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表す。全てのＬＮＡ Ｃは５−メチルシトシンであり、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
モチーフ配列は、オリゴヌクレオチド中に存在する核酸塩基の連続配列を表す。
デザインは、ギャップマーデザインＦ−Ｇ−Ｆ’を指す。各数字は連続した修飾ヌクレオシドの数を表す。２’修飾ヌクレオシド（第１の数＝５’側面）、続いてＤＮＡヌクレオシドの数（第２の数＝ギャップ領域）、続いて修飾ヌクレオシドの数（例えば、標的核酸に相補的である連続した配列の一部ではないＤＮＡ及びＬＮＡの更なる反復領域が先行するか又はその後に続く２’修飾ヌクレオシド（第３の数＝３’側面）を含む。
オリゴヌクレオチド化合物は、モチーフ配列の特定の設計を表す。大文字はβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表す。全てのＬＮＡ Ｃは５−メチルシトシンであり、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
大文字はβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表す。全てのＬＮＡ Ｃは５−メチルシトシンであり、添え字ｏはホスホジエステルヌクレオシド間結合を表し、別段の定めがない限り、他のヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
ＧＮ２は、図３に示す３価のＧａｌＮＡｃ集落を表し、Ｃ６は、６個の炭素を有するアミノアルキル基を表し、大文字はβ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表す。全てのＬＮＡ Ｃは５−メチルシトシンであり、添え字ｏはホスホジエステルヌクレオシド結合を表し、別段の定めがない限り、ヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。幾つかの分子を表す化学図面は、図４から図８に示す。
ＡＡＶ／ＨＢＶマウスモデル
パスツールモデル：
パスツール研究所（Institut Pasteur）で、ＨＬＡ−Ａ２．１−／ＨＬＡ−ＤＲ１−トランスジェニックＨ−２クラスＩ−／クラスＩＩ−ノックアウトマウス（本明細書中ではＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１マウスと呼ばれる）を作成し、飼育した。これらのマウスは、マウスＭＨＣ応答に何ら干渉することのない、ヒト免疫機能試験用のインビボ実験モデルである（Pajot et al 2004 Eur J Immunol.34(11): 3060-9）。
これらの研究では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、複製能ＨＢＶ ＤＮＡゲノムを保有するＡＡＶ血清型２／８を使用した。ＡＡＶ−ＨＢＶベクター（バッチGVPN＃６１６３）を、５×１０11ｖｇ／ｍＬの力価に達するように滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した。この希釈溶液１００μＬ（用量／マウス：５×１０10ｖｇ）を、マウスの尾静脈に静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。ＨＢＶ−キャリアマウスの血液中に、ＨＢＶ ＤＮＡを含有する完全なウイルス粒子が検出された。血中ＨＢＶ循環タンパク質ＨＢｅ抗原及びＨＢｓ抗原と共に、肝臓においてＨＢｃ抗原が最大１年間検出された。全てのＡＡＶ２／８−ＨＢＶ形質導入マウスにおいて、血清中のＨＢｓ抗原、ＨＢｅ抗原、及びＨＢＶ ＤＮＡが少なくとも１年間持続した（Dion et al 2013 J Virol 87: 5554-5563）。
上海モデル：
このモデルでは、ＨＢＶゲノム（ＡＡＶ／ＨＢＶ）を保有する組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）で感染したマウスは、３０週間を超えて安定なウイルス血症及び抗原血症を維持する（Dan Yang, et al. 2014 Cellular & Molecular Immunology 11, 71-78）。
特異的な病原体を含まない雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（４〜６週齢）を、ＳＬＡＣ（Shanghai Laboratory Animal Center of Chinese Academy of Sciences）から購入し、動物飼育施設の個別換気ケージに収容した。WuXi IACUC（所内動物実験委員会、WUXI IACUCプロトコール番号R20131126-Mouse）に指示されている動物の飼育・利用に関するガイドラインを遵守した。マウスを３日間新しい環境に順応させ、実験的デザインに従って分類した。
組み換えＡＡＶ−ＨＢＶを、ＰＢＳ（注射当たり２００μＬ）で希釈した。この組み換えウイルスは、ＨＢＶゲノム（遺伝子型Ｄ、血清型ａｙｗ）の１〜３コピーを保有する。
０日目に、全てのマウスの尾静脈に、２００μＬのＡＡＶ−ＨＢＶを注射した。ＡＡＶ注射後の６日目、１３日目及び２０日目に、全てのマウスを顎下で採血し（０．１ｍｌ血液／マウス）、血清を採取した。注射後２２日目に、ウイルス血症が安定なマウスにおけるオリゴヌクレオリゴヌクレオチド処置の準備が整った。オリゴヌクレオチドは、非結合型又はＧａｌＮＡｃ結合型とすることができる。
ＤＮＡワクチン
プラスミドＤＮＡは、エンドトキシン不含で、Plasmid-Factory（Germany）で製造された。ｐＣＭＶ−Ｓ２．Ｓは、ＨＢｓ抗原（遺伝子型Ｄ）のプレＳ２ドメイン及びＳドメインをコードし、その発現はサイトメガロウイルス即時初期遺伝子プロモーターによって制御される（Michel et al 1995 Proc Natl Acad Sci U S A 92: 5307-5311）。ｐＣＭＶ−ＨＢｃは、肝炎コア（ＨＢｃ）抗原を保有するＨＢＶキャプシドをコードする(Dion et al 2013 J Virol 87: 5554-5563)。
ここに記載されているように、ＤＮＡワクチンでの治療を行った。ワクチン接種の５日前に、カルジオトキシン（ＣａＴｘ、Latoxan refL８１−０２、５０μｌ／筋肉）を、マウスの筋肉に注射した。ＣａＴｘは、筋肉線維を脱分極させて細胞変性を誘導し、注射後５日目には新しい筋繊維が現われ、ＤＮＡワクチンの投与によって、トランスフェクション効果を改善するものである。pCMV-S2.S ayw及びpCMVCoreをそれぞれ１ｍｇ／ｍｌで等量で混合し、以前にMichel et al 1995 Proc Natl Acad Sci U S A 92：5307-5311に記載されているように、麻酔（１００μＬの１２．５ｍｇ／ｍＬケタミン、１．２５ｍｇ／ｍＬキシラジン）下、カルジオトキシン処理した前脛骨筋への両側筋肉注射によって合計１００μｇを各マウスに投与した。
抗ＰＤ−Ｌ１抗体
これは、Genetech社で内部的に産生されたマウス抗マウスＰＤ−Ｌ１ ＩｇＧ１抗体クローン６Ｅ１１であり、Atezolizumabをブロックし、同様のインビトロでのブロッキング活性を有する代理抗体であり、ロッシュ（Roche）で内部的に産生されるアテゾリズマブである。抗体は、１２．５μｇ／ｇの用量で腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって投与された。
オリゴヌクレオチド合成
オリゴヌクレオチド合成は、当該技術分野において概ね公知である。以下は適用可能なプロトコールである。本発明のオリゴヌクレオチドは、使用される器具、支持体及び濃度の点で僅かに変化する方法によって製造されたものであってもよい。
Oligomaker 48上でホスホルアミダイト法を使用して、ウリジンユニバーサル支持体上で、１μｍｏｌスケールでオリゴヌクレオチドを合成する。合成終了時に、オリゴヌクレオチドを、水性アンモニアを使用して６０℃で５〜１６時間、固体支持体から開裂させる。オリゴヌクレオチドは、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）又は固相抽出によって精製され、ＵＰＬＣによって特徴付けられ、分子量はＥＳＩ−ＭＳによって更に確認される。
オリゴヌクレオチドの伸張：
５’−Ｏ−ＤＭＴ保護アミダイトのアセトニトリル溶液（０．１Ｍ）、及びＤＣＩ（４，５−ジシアノイミダゾール）のアセトニトリル溶液（０．２５Ｍ）を活性化剤として使用して、β−シアノエチル−ホスホラミダイト（ＤＮＡ−Ａ（Ｂｚ）、ＤＮＡ−Ｇ（ｉｂｕ）、ＤＮＡ−Ｃ（Ｂｚ）、ＤＮＡ−Ｔ、ＬＮＡ−５−メチル−Ｃ（Ｂｚ）、ＬＮＡ−Ａ（Ｂｚ）、ＬＮＡ−Ｇ（ｄｍｆ）、又はＬＮＡ−Ｔ）のカップリングを行った。最終サイクル用に、所望の修飾を有するホスホラミダイトを使用できる。結合基を結合させるためのＣ６リンカー、又は結合基である。ホスホロチオエート結合の導入のためのチオール化は、水素化キサンタン（アセトニトリル／ピリジン９：１中０．０１Ｍ）を使用して実施する。フォスフォジエステル結合は、ＴＨＦ／ピリジン／水（７：２：１）中の０．０２Ｍヨウ素を使用して導入できる。残りの試薬は、オリゴヌクレオチドの合成に典型的に使用される試薬である。
固相合成後の結合に備えて、市販のＣ６アミノリンカーホスホルアミダイトを固相合成の最後のサイクルで使用して、脱保護及び固体支持体からの開裂の後、アミノ結合脱保護オリゴヌクレオチドを単離させることができる。標準的な合成方法を使用することで、官能基の活性化を介してコンジュゲートが導入される。
あるいは、国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０７３３３１号明細書又は欧州特許出願公開第１５１９４８１１．４号明細書に記載されているように、ＧａｌＮＡｃ−もしくはＧａｌＮＡｃ集落のホスホラミダイトを用いることにより、結合部分を依然として固体支持体上に存在させながら、オリゴヌクレオチドに添加させることが可能である。
ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製：
粗化合物を、Phenomenex Jupiter C18の１０μ１５０×１０ｍｍカラムでの分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製する。０．１Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ８及びアセトニトリルを、５ｍＬ／分の流速で緩衝液として使用する。収集した画分を凍結乾燥して、典型的には白色固体として精製化合物を得る。
略語：
ＤＣＩ：４，５−ジシアノイミダゾール
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＴ：４，４’−ジメトキシトリチル
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
Ｂｚ：ベンゾイル
Ｉｂｕ：イソブチリル
ＲＰ−ＨＰＬＣ：逆相高速液体クロマトグラフィー
Ｔmアッセイ
オリゴヌクレオチド及びＲＮＡ標的（リン酸結合、PO）二本鎖を、５００ｍｌのＲＮアーゼ不含水中で３ｍＭに希釈し、５００ｍｌの２×Ｔm緩衝液（２００ｍＭのＮａＣｌ、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と混合する。溶液を９５℃で３分間加熱し、次いで室温で３０分間アニールさせる。PE Templabソフトウェア（Perkin Elmer）を用いたPeltier温度プログラマーPTP6を備えたLambda 40 ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計で、二本鎖融解温度（Ｔm）を測定する。温度を２０℃から９５℃まで上昇させ、次いで２５℃まで下げ、２６０ｎｍで吸収を記録する。一次導関数、ならびに融解及びアニーリングの両方の極大値を使用して、二本鎖Ｔmを評価する。
組織特異的インビボリンカー開裂アッセイ
試験される生体開裂性リンカー（例えば、ＤＮＡホスホジエステルリンカー（ＰＯリンカー））を有するＦＡＭ標識オリゴヌクレオチドは、関連する組織（例えば、肝臓又は腎臓）及び血清のホモジネートを使用してインビトロで開裂される。
組織及び血清試料を好適な動物（例えば、マウス、サル、ブタ又はラット）から収集し、ホモジナイゼーション緩衝液（０．５％のIgepal CA-630、２５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０（１規定のＮａＯＨで調整）。組織ホモジェネート及び血清を２００μｇ／ｇ組織の濃度までオリゴヌクレオチドでスパイクした。試料を３７℃で２４時間インキュベートし、その後、試料をフェノール−クロロホルムで抽出する。Dionex DNApac p-100カラム及び１０ｍＭ〜１Ｍの過塩素酸ナトリウム（ｐＨ７．５）の勾配を用い、Dionex Ultimate 3000で、この溶液のＡＩＥ ＨＰＬＣ分析を行う。蛍光検出器（６１５ｎｍ）及びＵＶ検出器（２６０ｎｍ）の両方を使用して、標準物質に対する開裂及び非開裂オリゴヌクレオチドの含量を定量する。
Ｓ１ヌクレアーゼ感受性アッセイ
Ｓ１ヌクレアーゼ感受性リンカー（例えば、ＤＮＡリン酸ジエステルリンカー（ＰＯリンカー））を用いたＦＡＭ標識オリゴヌクレオチドを、Ｓ１ヌクレアーゼ抽出物又は血清中でインビトロ開裂させる。
ヌクレアーゼ緩衝液（６０Ｕ／１００μＬ）中のＳ１ヌクレアーゼで、１００μＭのオリゴヌクレオチドに対してインビトロ開裂を２０分間及び１２０分間行う。緩衝液にＥＤＴＡを加えることによって酵素活性を中断させる。Dionex DNApac p-100カラム及び１０ｍＭ〜１Ｍの過塩素酸ナトリウム（ｐＨ７．５）の勾配を用い、Dionex Ultimate 3000で、この溶液のＡＩＥ ＨＰＬＣ分析を行う。蛍光検出器（６１５ｎｍ）及びＵＶ検出器（２６０ｎｍ）の両方を使用して、標準物質に対する開裂及び非開裂オリゴヌクレオチドの含量を定量する。
肝臓単核細胞の調製
Tupin et al 2006 Methods Enzymol 417: 185-201に記載されている方法に若干の修正を加えて、ＡＡＶ／ＨＢＶマウス由来の肝細胞を調製した。安楽死させた後のマウスの肝臓に、Ｇ２５ニードル付きのシリンジを使用して、門脈経由で滅菌ＰＢＳ１０ｍｌを灌流させた。臓器が蒼白のときは、その臓器を、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）（GIBCO（登録商標）HBSS、24020）＋５％の胎児牛胎仔血清（ＦＣＳ）で採取した。採取された肝臓を１００μｍ細胞ストレーナー（BD Falcon、352360）に通してゆっくりと加圧し、３０ｍｌのＨＢＳＳ＋５％ＦＣＳ中に細胞を懸濁させた。細胞懸濁液を５分間５０ｇで遠心分離させた後、上清を４℃にて１０分間２８９ｇで遠心分離させた。遠心分離後、上清を捨て、ペレットを３５％等張パーコール溶液（GE Healthcare Percoll#17-0891-01、RPMI 1640（GIBCO, 31870）に希釈）中で室温にて１５ｍｌ単位で再懸濁させ、１５ｍｌチューブに移した。細胞を更に室温にて２５分間１３６０ｇで遠心分離させた。上清を吸引により捨て、単核細胞を含有するペレットを、ＨＢＳＳ＋５％ＦＣＳで２回洗浄した。
１０％のＦＣＳ（Hyclone, ＃SH30066、ロットAPG21570）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン＋１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン＋０．３ｍｇ／ｍＬのＬ−グルタミン（Gibco, 10378）、１×非必須アミノ酸（Gibco, 11140）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Gibco, 15630）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Gibco, 11360）及び５０μＭのβ−メルカプトエタノール（LKB, 1830））を補給したα最小必須培地（Gibco, 22571）からなる完全培地中で、細胞を培養した。
細胞の表面標識
細胞をＵ底９６ウェルプレート中に播種し、ＰＢＳ ＦＡＣＳ（１％ウシ血清アルブミンと０．０１％アジ化ナトリウムとを含有するＰＢＳ）で洗浄した。ラット抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２抗体と生存マーカーＬＤフィクサブルイエロー（Thermofisher, L34959）とを含有する５μＬのＰＢＳ ＦＡＣＳで、４℃の暗所で細胞を１０分間インキュベートした。次いで、ＮＫ Ｐ４６ ＢＶ４２１（ラットＭａｂ抗マウスＮＫ Ｐ４６、Biolegend、137612）及びＦ４／８０（ラットＭａｂ抗マウスＦ４／８０ ＦＩＴＣ、BD Biolegend, 123108）に対するモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を含有する２５μＬのＰＢＳ ＦＡＣＳで４℃の暗所にて細胞を２０分間染色し、また、２つの補足的面マーカー：ＰＤＬ１（ラットＭａｂ抗マウスＰＤ１ ＰＥ、BD Biosciences, 551892）及びＰＤＬ１（ラットＭａｂ抗マウスＰＤＬ１ ＢＶ７１１、Biolegend, 124319）を添加した。
細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイ
脾細胞及び肝臓単核細胞の両方でＩＣＳアッセイを実施した。細胞をＵ底９６ウェルプレートに播種した。細胞を入れたプレートを、陰性対照としての完全培地単独で、又は表９に記載のペプチドとの併用のいずれかで、３７℃にて２μｇ／ｍｌの濃度で一晩インキュベートした。インキュベーションの１時間後に、２μｇ／ｍＬのブレフェルジンＡ（Sigma, B6542）を添加した。
一晩培養した後の細胞をＰＢＳ ＦＡＣＳで洗浄し、ラット抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２抗体と生存マーカーＬＤ定着性黄色（Thermofisher, L34959）とを含有する５μＬのＰＢＳ ＦＡＣＳと共に、４℃の暗所で１０分間インキュベートした。次いで、４℃の暗所にて、Ｍａｂを含有するＰＢＳ ＦＡＣＳ２５μＬで細胞を２０分間染色した。この混合物は、ＣＤ３（ハムスターＭａｂ抗マウスＣＤ３−ＰｅｒＣＰ、BD Biosciences, 553067）、ＣＤ８（ラットＭａｂ抗マウスＣＤ８−ＡＰＣ−Ｈ７、BD Biosciences, 560182）、ＣＤ４マウスＣＤ４−ＰＥ−Ｃｙ７、BD Biosciences, 552775）及びＮＫ細胞（Ｒａｔ Ｍａｂ抗マウスＮＫ Ｐ４６ ＢＶ４２１、Biolegend, 137612）に対するモノクローナル抗体で構成されていた。細胞を数回の洗浄後に固定し、室温の暗所にてＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍで２０分間透過化処置してから、４℃にてＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ溶液（BD Biosciences, 554714）で洗浄した。
４℃の暗所で、ＩＦＮγ（ラットＭａｂ抗マウスＩＦＮγ−ＡＰＣ、クローンＸＭＧ１．２、BD Biosciences、554413）及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）（ラットＭａｂ抗マウスＴＮＦα−ＦＩＴＣ、クローンＭＰ６−ＸＴ２２；１／２５０（BD Biosciences 554418）に対する抗体で、細胞内サイトカインを３０分間染色した。MACSQuant Analyzerを使用してフローサイトメトリーで分析するに先立ち、細胞をＰｅｒｍ／Ｗａｓｈで洗浄し、１％ホルムアルデヒド含有のＰＢＳ ＦＡＣＳ中に再懸濁させた。
生存細胞ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ４−及びＣＤ３＋ＣＤ８−ＣＤ４＋をゲートし、ドットプロット上に提示した。各サイトカインの陽性細胞に対して２つの領域をゲートするように定義した。これらゲート内の事象の検出数を親の母集団内の事象総数で除算して、Ｔ細胞の応答率を算出した。各マウスについて、培地単独で得られたパーセンテージをバックグラウンドと見なし、これをペプチド刺激で得られたパーセンテージから減算した。
実験のバックグラウンド（すなわち、培地単独状態と２つの標準偏差における、群毎に得られた染色細胞の平均パーセンテージ）に従って、陽性の閾値を定義した。少なくとも５つの事象を表すサイトカインのパーセンテージのみを、陽性と見なした。
実施例１：インビトロ有効性の試験
主として１６〜２０ｍｅｒのギャプマーを使用して、ヒトＰＤ−Ｌ１転写産物全体に対して遺伝子ウォーク（gene walk）を実施した。有効性試験は、ヒト白血病単球細胞系統ＴＨＰ１及びヒト非ホジキンリンパ腫細胞系統（ＫＡＲＰＡＳ−２９９）における、インビトロ実験で行った。
細胞系統
ＴＨＰ１及びＫａｒｐａｓ−２９９細胞系統は、当初ECACC（European Collection of Authenticated Cell Cultures）から購入し、加湿インキュベーター内で、供給者が推奨するように３７℃にて５％ＣＯ2で維持した。
オリゴヌクレオチドの効果
ＴＨＰ−１細胞（RPMI-GLutamax中３．１０４、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（Thermo Fisher Scientific）をオリゴヌクレオチド（４〜５μｌ）に添加し、これを９６ウェル丸底プレートに入れ、最終容量１００μｌ／ウェルで６日間培養した。オリゴヌクレオチドを、単一濃度（２０μＭ）にて、及び２５μＭ〜０．００４μＭ（１：３希釈の水溶液）の用量範囲濃度にて、スクリーニングした。MagNA Pure 96 Cellular RNA Large Volume Kit（MagNA Pure 96 System（Roche Diagnostics））をメーカーの指示に従って使用して、総ｍＲＮＡを抽出した。遺伝子発現解析用に、内因性対照として使用されるヒトＰＤＬ１及びＡＣＴＢを標的化する予備設計済のTaqmanプライマー（Thermo Fisher Scientific）を用い、QuantStudioマシン（Applied Biosystems）で、TaqMan RNA-to-ct1-Stepキット（Thermo Fisher Scientific）を使用してＲＴ−ｑＰＣＲを行った。相対的なＰＤ−Ｌ１のｍＲＮＡ発現レベルは、２ΔΔＣ（Ｔ）（2(-Delta Delta C(T))）法及び対照試料（非処置細胞）と比較した割合（％）としての阻害パーセンテージを使用して計算された。
Ｋａｒｐａｓ−２９９細胞を、RPMI 1640、２ｍＭグルタミン及び２０％ＦＢＳ（Sigma）中で培養した。この細胞を９６ウェルプレートに１００００細胞／ウェルで播種し、２４時間インキュベートした後、ＰＢＳ中に溶解させたオリゴヌクレオチドを添加した。オリゴヌクレオチドの最終濃度は、単回用量５μＭ、最終培養容量にて１００μｌ／ウェル、あるいは、１００μＬ培養容量中、５０μＭ、１５．８μＭ、５．０μＭ、１．５８μＭ、０．５μＭ、０．１５８μＭ、０．０５μＭ、０．０１５８μＭの範囲用量反応で添加した。オリゴヌクレオチド化合物を添加した後の３日目に細胞を採取し、PureLink Pro 96 RNA Purificationキット（Ambion）をメーカーの指示に従って使用して、ＲＮＡを抽出した。Ｍ−ＭＬＴ逆転写酵素、RETROscript、ＲＮアーゼ阻害剤（Ambion）及び１００ｍＭのｄＮＴＰセット（Invitrogen, PCR Grade）を使用してｃＤＮＡを合成した。遺伝子発現解析用に、ＰＤ−Ｌ１（Applied Biosystems; Hs01125299_m1）及びＴＢＰ（Applied Biosystems; 4325803）用のTaqManプライマーアッセイを用いたデュプレックスセットアップで、TaqMan Fast Advanced Master Mix（2X）（Ambion）を使用してｑＰＣＲを行った。相対的なＰＤ−Ｌ１のｍＲＮＡ発現レベルを対照試料（ＰＢＳ中で処置された細胞）の％として、表１０に示す。
実施例２ − 用量応答曲線におけるインビトロ有効性の試験
表１０から選択されたオリゴヌクレオチドを、ＫＡＲＰＡＳ-２９９細胞にて、半対数（half-log）連続希釈ＰＢＳ溶液（５０μＭ、１５．８μＭ、５．０μＭ、１．５８μＭ、０．５μＭ、０．１５８μＭ、μＭ、０．０５μＭ、０．０１５８μＭのオリゴヌクレオチド）を用いて試験し、実施例１に記載のインビトロ有効性アッセイにおいて評価した。ＩＣ５０及び最大の阻害（残渣％ＰＤ−Ｌ１発現量）オリゴヌクレオチドについて評価した。
GraphPad Prism6で、ＥＣ５０の計算を行った。表１１に、ＩＣ５０及び最大ＰＤ−Ｌ１ノックダウンレベルを、対照（ＰＢＳ）処置済細胞の％として示す。
表６から選択されたオリゴヌクレオチドを、実施例１に記載のインビトロ有効性アッセイにおいて、水２５μＭ〜０．００４μＭでの１：３連続希釈を用い、ＴＨＰ−１細胞における試験を行った。ＩＣ５０及び最大の阻害（残存ＰＤ−Ｌ１発現率）をオリゴヌクレオチドについて評価した。
GraphPad Prism6で、ＥＣ５０の計算を行った。ＩＣ５０及び最大ＰＤ−Ｌ１ノックダウンレベルは、対照（ＰＢＳ）の処置済み細胞の％として表１２に示してある。
表７及び表８の結果はまた、配列番号：１のＰＤ−Ｌ１プレｍＲＮＡを標的化するそれらの位置に関しても図２に示してある。
このことから、ほとんど全ての化合物では、ＥＣ５０値が１μＭ未満であり、且つ標的ノックダウンが対照細胞（生理食塩水で処置されたもの）においてＰＤ−Ｌ１発現レベルの２５％を下回っていることが分かる。
実施例３ − 裸型の、及びＧａｌＮＡｃ結合型のＰＤ−Ｌ１アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用した、ポリ（Ｉ：Ｃ）誘導マウスにおける、インビトロ効力及び有効性ならびにインビボＰＤ−Ｌ１低減
有効性及び効能試験は、表６のオリゴヌクレオチドを使用して、ＭＣＰ−１１細胞における用量応答研究におけるインビトロ実験で行った。同じオリゴヌクレオチド、ならびにＧａｌＮＡｃ結合型バージョン（表８のＣＭＰ ＩＤ番号７５５＿２〜７６５＿２）が、ポリ（Ｉ：Ｃ）誘発Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウスにおけるＰＤ−Ｌ１のｍＲＮＡ及びタンパク質の発現を低減させる能力を、インビボで試験した。
インビトロアッセイ
１０％ウマ血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．０２５ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン及び１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを補給したＤＭＥＭ（Sigmaカタログ番号Ｄ０８１９）中に懸濁させたＭＣＰ−１１細胞（当初ATCCから購入）を、９６ウェル丸底プレート中のオリゴヌクレオチド（１０μｌ）に８０００細胞／ウェルの密度で加えて、５％ＣＯ2を含む３７℃の加湿インキュベーター内で２００μｌ／ウェルの最終容量で３日間培養した。オリゴヌクレオチドを用量範囲濃度（５０μＭ、１５．８μＭ、５．０μＭ、１．５８μＭ、０．５μＭ、０．１５８μＭ、０．０５μＭ及び０．０１５８μＭ）でスクリーニングした。
PureLink Pro 96 RNA精製キット（Ambion）をメーカーの指示に従って使用して、総ｍＲＮＡを抽出し、Ｍ−ＭＬＴ逆転写酵素、ランダムデカマーＲＥＴＲＯｓｃｒｉｐｔ、ＲＮアーゼ阻害剤（Ambion）及び１００ｍＭ ｄＮＴＰセット（Invitrogen, PCR Grade）をメーカーの指示に従って使用して、ｃＤＮＡを合成した。遺伝子発現解析用に、ＰＤ−Ｌ１（Thermo Fisher Scientific; FAM−MGB Mm00452054-m１）及びGusb（Thermo Fisher Scientific; VIC−MGB−PL Mm01197698-m1）のTaqManプライマーアッセイを用いたデュプレックスセットアップで、TaqMan Fast Advanced Master Mix（2X）（Ambion）を使用してｑＰＣＲを行った。表９に、相対的ＰＤ−Ｌ１のｍＲＮＡ発現レベルを、ＰＢＳ対照試料の％（ＰＢＳ処置済細胞）中の残渣ＰＤ−Ｌ１発現量の％として示す。GraphPad Prism６で、ＥＣ５０の計算を行った。表１３に、ＥＣ５０及び最大ＰＤ−Ｌ１ノックダウンレベルを、対照（ＰＢＳ）細胞の％として示す。
インビボアッセイ
マウスＰＤ−Ｌ１に対する５ｍｇ／ｋｇの非結合オリゴヌクレオチド、又はマウスＰＤ−Ｌ１に対する２．８ｍｇ／ｋｇのＧａｌＮＡｃ結合型オリゴヌクレオチドを、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウス（２０〜２３ｇ；１群当たり５匹のマウス）に皮下注射した。３日後、１０ｍｇ／ｋｇポリ（Ｉ：Ｃ）（LWM、Invivogen）を、マウスに静脈内注射した。ポリ（Ｉ：Ｃ）注射後５時間目にマウスを屠殺し、肝臓試料をＲＮＡ抽出用のRNAlater（Thermo Fisher Scientific）に入れるか、又はタンパク質抽出に備えてドライアイスで凍結させた。
PureLink Pro 96 RNA Purificationキット（Ambion）をメーカーの指示に従って使用して、ホモジナイズされた肝臓試験から総ｍＲＮＡを抽出した。Ｍ−ＭＬＴ逆転写酵素、ランダムデカマーRETROscript、ＲＮアーゼ阻害剤（Ambion）及び１００ｍＭのｄＮＴＰセット（Invitrogen, PCR Grade）をメーカーの指示に従って使用して、ｃＤＮＡを合成した。遺伝子発現解析用に、ＰＤ−Ｌ１のｍＲＮＡ（Thermo Fisher Scientific；FAM-MGB Mm00452054-m1）及びTBP（Thermo Fisher Scientific；VIC-MGB-PL Mm00446971_m1)用のTaqManプライマーアッセイを用いたデュプレックスセットアップで、TaqMan（登録商標）Fast Advanced Master Mix TaqMan Fast Advanced Master Mix（2X）（Ambion）を使用してｑＰＣＲを行った。表１３に、ＰＤ−Ｌ１のｍＲＮＡの相対的な発現レベルを、生理食塩水及びポリ（Ｉ：Ｃ）を注射されたマウス由来の対照試料の％として示す。
１×停止プロテアーゼインヒビターカクテル、ＥＤＴＡ不含（Thermo Fisher Scientific）と混合した１００ｍｇの組織T-PER（登録商標）組織タンパク質抽出試薬（Thermo Fisher Scientific）当たり２ｍｌの肝臓試料をホモジナイズして、肝臓ホモジネートを調製した。クーマシープラス（Bradford）アッセイ試薬（Thermo Scientific）をメーカーの指示に従って使用して、肝臓ホモジネート中のタンパク質濃度を測定した。iBLOT乾式ブロッティングシステム（Thermo Fisher Scientific）をメーカーの指示に従って使用して、１×ＭＯＰＳ泳動緩衝液中、４〜１２％のBis-Tris Plusポリアクリルアミドゲル（Thermo Fisher Scientific）上で、肝臓ホモジネート（タンパク質４０μｇ）を分離させ、これをニトロセルロース膜に移した。各ブロットを、６４ｋＤａのバンドにて水平に２つの部分に切断した。膜を５％スキムミルクと０．０５％のＴｗｅｅｎ２０とを含有するＴＢＳ中でブロッキングした後、１：１００００希釈したウサギモノクローナル抗ビンキュリン（Abcamカタログ番号ａｂ１２９００２）（上側の膜）、又は５％スキムミルクと０．０５％のＴｗｅｅｎ２０とを含有するＴＢＳ中で１：１０００に希釈したヤギポリクローナル抗ｍＰＤ−Ｌ１（R&D Systemsカタログ番号ＡＦ１０１９）（下側の膜）と共に、４℃で一晩インキュベートした。膜を０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＴＢＳ中で洗浄してから、１：３０００に希釈されたＨＲＰ結合ブタ抗ウサギＩｇＧ（DAKO）、又は５％スキムミルクと０．０５％のＴｗｅｅｎ２０とを含有するＴＢＳ中で１：２０００に希釈されたＨＲＰ結合ウサギ抗ヤギＩｇＧ（DAKO）に、室温で１時間曝露させた。膜を洗浄した後、ECL Select（Amersham GE Healthcare）を使用して反応性を検出した。オリゴヌクレオチドで処置された群毎に、ビンキュリンバンドに対するＰＤ−Ｌ１バンドの強度を、生理食塩水及びポリ（Ｉ：Ｃ）（対照）を注射されたマウスのＰＤ−Ｌ１／ビンキュリンバンド強度と比較して評価した。結果を表１３に示し、裸型オリゴヌクレオチド及び結合オリゴヌクレオチドの対を使用したウェスタンブロットを図９Ａ〜図９Ｅに示す。
表１３のデータから分かるように、オリゴヌクレオチドのＧａｌＮＡｃ結合によってインビボＰＤ−Ｌ１の低減が改善されることが明らかである。ｍＲＮＡの低減は概ね、ＰＤ−Ｌ１タンパク質の低減と相関する。ＣＭＰ ＩＤ番号：７５４＿１を除き、インビトロでのＥＣ５０値が低いことは、いったんオリゴヌクレオチドがＧａｌＮＡｃに結合された後に、インビボＰＤ−Ｌ１ｍＲＮＡの低減が良好であることが概ね反映されている。
実施例４−ポリ（Ｉ：Ｃ）誘導マウス由来の選別された肝細胞及び非実質細胞におけるインビボＰＫ／ＰＤ
ポリ（Ｉ：Ｃ）誘導マウスから単離された肝細胞及び非実質細胞における、裸型オリゴヌクレオチド及びＧａｌＮＡｃ結合型オリゴヌクレオチドの分布、及びＰＤ−Ｌ１ｍＲＮＡの低減を調べた。
マウスＰＤ−Ｌ１のｍＲＮＡを標的化する５ｍｇ／ｋｇの非結合オリゴヌクレオチド（７４８＿１）又は７ｍｇ／ｋｇのＧａｌＮＡｃ結合型オリゴヌクレオチド（７５９＿２）を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウスに皮下注射した（１群当たりｎ＝３）。２日後、１５ｍｇ／ｋｇポリ（Ｉ：Ｃ）（LWM、InvivoGen）を、マウスに腹腔内注射した。マウスをポリ（Ｉ：Ｃ）注射後１８〜２０時間麻酔し、肝臓を１５ｍＭのＨｅｐｅｓと０．３８ｍＭのＥＧＴＡを含有するハンクス平衡塩類溶液を使用して、毎分７ｍｌの流速で５分間灌流させた。続いて、０．１７ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ２型（Worthington 4176）、０．０３％ＢＳＡ、３．２ｍＭのＣａＣｌ2及び１．６ｇ／ｌのＮａＨＣＯ3を含むコラゲナーゼ溶液（ハンクス平衡塩類溶液）で１２分間洗浄した。灌流後、肝臓を摘出し、肝臓嚢を開き、ウィリアムスＥ培地を使用して肝臓懸濁液を７０μｍの細胞濾過器で濾過し、以後の分析に備えて細胞懸濁液（＝混合肝細胞）のアリコートを摘出した。残りの細胞懸濁液を、５０×ｇで３分間遠心分離した。後で非実質細胞を精製するため、上清を回収した。ペレットを２５ｍｌのウィリアムＥ培地（Sigmaカタログ番号Ｗ１８７８：１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、２ｍＭのＬ−グルタミン及び１０％ＦＢＳ（ＡＴＣＣ＃３０−２０３０）を補給したもの）中に再懸濁させ、９０％パーコールと肝細胞とを含有する２５ｍｌのウィリアムＥ培地と混合し、５０×ｇで１０分間遠心分離して肝細胞を沈殿させた。ウィリアムＥ培地で２回洗浄した後、沈殿した肝細胞をウィリアムＥ培地中に再懸濁させた。非実体細胞を含有する上清を５００×ｇで７分間遠心分離し、細胞をＲＰＭＩ培地４ｍｌ中に再懸濁させて、２つのパーコール層（２５％及び５０％パーコール）に通して３０分間１８００×ｇで遠心分離した。２つのパーコール層間の非実体細胞が回収された後、細胞を洗浄し、ＲＰＭＩ培地中に再懸濁した。
PureLink Pro 96 RNA Purificationキット（Ambion）をメーカーの指示に従って使用して、精製肝細胞、非実質細胞、及び総肝臓懸濁液（非分画肝細胞）から総ｍＲＮＡを抽出した。Ｍ−ＭＬＴリバーストランスクリプターゼ、ランダムデカマーRETROscript、ＲＮアーゼ阻害剤（Ambion）、及び１００ｍＭのｄＮＴＰセット（Invitrogen, PCR Grade）を、メーカーの指示に従って使用して、ｃＤＮＡを合成した。遺伝子発現解析用に、ＰＤ−Ｌ１（Thermo Fisher Scientific; FAM-MGB Mm00452054-m1）及びＴＢＰ（Thermo Fisher Scientific; VIC-MGB-PL Mm00446971_m1）のTaqManプライマーアッセイを用いたデュプレックスセットアップで、TaqMan Fast Advanced Master Mix（2X）（Ambion）を使用してｑＰＣＲを行った。表１０に、ＰＤ−Ｌ１のｍＲＮＡの相対的な発現レベルを、生理食塩水及びポリ（Ｉ：Ｃ）を注射されたマウス由来の対照試料の％として示す。
配列５’−ＴＡＣＣＧＴ−ｓ−Ｂｉｏ−３’を有するビオチン化捕捉プローブ、及び配列５’−ＤＩＧ−Ｃ１２−Ｓ１−ＣＣＴＧＴＧ−３’を有するジゴキシゲニン結合検出プローブを用いたＥＬＩＳＡを使用して、オリゴヌクレオチド内容物の分析を行った。プローブは、ホスホジエステル骨格を有するＬＮＡのみからなっていた。５ｍｍ径ステンレススチールビーズ１個を含む２ｍＬエッペンドルフチューブ中のＭａｇＮａ純粋溶解緩衝液（Rocheカタログ番号０３６０４７２１００１）１．４ｍＬ中で、肝臓試料（約５０ｍｇ）をホモジナイズした。均一な溶解物が得られるまで、Retsch MM400ホモジナイザー（Merck Eurolab）で試料をホモジナイズした。試料を室温で３０分間インキュベートした。規定濃度の非結合アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物（ＣＭＰ ＩＤ番号７４８＿１）を未処置の肝臓試料中にスパイクし、これらを試料として処置することにより、標準物質（Standards）を生成した。スパイクイン濃度を、予期される試料オリゴ含量（約１０倍以内）に一致するように選択する。
ホモジナイズした試料を５×ＳＳＣＴ緩衝液（７５０ｍＭのＮａＣｌ、及び７５ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ７．０）含有）中で最小１０倍に希釈し、捕捉−検出溶液（３５ｎＭ捕捉プローブ及び５×ＳＳＣＴ緩衝液中３５ｎＭ検出プローブ）を使用して、段階希釈で６×２倍希釈を行い、室温で３０分間インキュベートした。試料を９６ウェルのストレプトアビジン被覆プレート（Nuncカタログ番号４３６０１４）にウェル当たり１００μＬで移した。プレートを穏やかに撹拌しながら室温で１時間インキュベートした。２×ＳＳＣＴ緩衝液で３回洗浄し、新たに作製された０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ７．２）を含有するＰＢＳＴ（リン酸緩衝生理食塩水）で１：４０００に希釈された抗ＤＩＧ−ＡＰ Ｆａｂフラグメント（Roche Applied Science、カタログ番号１１０９３２７４９１０）１００μＬを各ウェルに加えて、穏やかに撹拌しながら室温で１時間インキュベートした。２×ＳＳＣＴ緩衝液で３回洗浄し、１００μＬのアルカリホスファターゼ（ＡＰ）基質溶液（ブルーフォス（Blue Phos）基質、KPL製品コード５０−８８−００、新たに調製されたもの）を添加する。穏やかに撹拌しながら３０分間インキュベートした後、色の強度を６１５ｎｍで分光光度的に測定した。未加工データを、リーダー（Gen5 2.0ソフトウェア）からエクセル形式にエクスポートし、Excelで更に分析した。GraphPad Prism 6ソフトウェア及びロジスティック４ＰＬ回帰モデルを使用して、検量線を生成した。
結果から明らかなように、裸型（ＣＭＰ ＩＤ番号：７４８＿１）及び結合（ＣＭＰ ＩＤ番号：７５９＿２）オリゴヌクレオチドは、総肝細胞内でＰＤ−Ｌ１ｍＲＮＡを同様に良好に低減させる。単離された肝細胞において、結合オリゴヌクレオチドの効果は裸型オリゴヌクレオチドの効果よりも約５倍強力で、裸型オリゴヌクレオチドは非実質細胞のＧａｌＮＡｃ結合オリゴヌクレオチドよりも２倍強力な効果を呈した。肝細胞及び非実質細胞において、ＰＤ−Ｌ１のｍＲＮＡ発現の低下は、これらの細胞型におけるオリゴヌクレオチド含量と或る程度相関する。
実施例５ − 裸型ＰＤ−Ｌ１アンチセンスオリゴヌクレオチド及びＧａｌＮＡｃ結合ＰＤ−Ｌ１アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用した、ＡＡＶ／ＨＢＶマウスにおける、インビボＰＤ−Ｌ１ノックダウン
本研究では、ＡＡＶ／ＨＢＶマウスを裸型又はＧａｌＮＡｃ結合型ＰＤ−Ｌ１アンチセンスオリゴヌクレオチドで処置し、肝臓におけるＰＤ−Ｌ１のｍＲＮＡ発現量及びＨＢＶ遺伝子発現を評価した。
第１週目に、５〜８週齢の雌ＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１マウス（１群当たり動物５匹）を、ビヒクル（生理食塩水）、裸型ＰＤ−Ｌ１アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＣＭＰ ＩＤ番号７５２＿１（５ｍｇ／ｋｇ ｓｃ））、及びＧａｌＮＡｃ（５ｍｇ／ｋｇ ｓｃ）ＰＤ−Ｌ１アンチセンスオリゴヌクレオチド（７ｍｇ／ｋｇ皮下でのＣＭＰ ＩＤ番号７６３＿２）で予備処置した。これらの用量はオリゴヌクレオチドの等モル濃度に対応する。マウスを０週目に５×１０10ｖｇのＡＡＶ−ＨＢＶにより形質導入した。詳細については、「材料と方法」の節のＡＡＶ／ＨＢＶマウスモデルの説明を参照のこと。ＡＡＶ−ＨＢＶ形質導入後の第１週目から第４週目まで１週間間隔で、ＰＤ−Ｌ１オリゴヌクレオチド又はビヒクル（生理食塩水）を更に４回皮下注射でマウスに投与した。
形質導入の１週間前及び各注射の１週間後に血液試料を採取した。
最後の注射の２週間後にマウスを屠殺し、その肝臓をＰＢＳ灌流後に除去した。肝臓をより小さな断片に切断して、直接凍結した。
ＨＢＶ遺伝子の発現を測定するに際して、QIAamp One-For-All Nucleic Acidキット、カタログ番号９６５６７２を使用してQiagen Biorobotで血清からＤＮＡを抽出し、血清をＰＢＳ中で１：２０希釈にて希釈して、合計１００μｌを２００μｌの緩衝液ＡＬ中に溶出させてから、本キットからＤＮＡを１００μｌ単位で溶出させた。
リアルタイムｑＰＣＲ用に、TaqMan Gene Expression Master Mix（カタログ番号４３６９０１６、Applied Biosystems）を、以下のプライマーF3_core、R3_core、P3_core（Integrated DNA Technologies）それぞれ１００μＭを１：１：０．５で加えたプライマー混合物と共に使用した。
フォワード（F3_core）：ＣＴＧ ＴＧＣ ＣＴＴ ＧＧＧ ＴＧＧ ＣＴＴ Ｔ（配列番号：７８４）
リバース（R3_core）：ＡＡＧ ＧＡＡ ＡＧＡ ＡＧＴ ＣＡＧ ＡＡＧ ＧＣＡ ＡＡＡ（配列番号：７８５）
プローブ（P3_core）：５６−ＦＡＭ−ＡＧＣ ＴＣＣ ＡＡＡ／ＺＥＮ／ＴＴＣ ＴＴＴ ＡＴＡ ＡＧＧ ＧＴＣ ＧＡＴ ＧＴＣ ＣＡＴ Ｇ−３ＩＡＢｋＦＱ（配列番号：７８６）
ＨＢＶプラスミド（遺伝子型Ｄ、GTD）を用いた検量線を、初回の１×１０9コピー／μｌから１コピー／μｌまで、１０倍希釈を用いて調製して、１反応当たり５μｌで使用した。
反応毎に、１０μｌの遺伝子発現マスターミックス、４．５μｌの水、０．５μｌのプライマーミックス、及び５μｌの試料又は標準液を加えて、ｑＰＣＲを行った。
分析用に、検量線を使用して、コピー数／ｍｌ／ウェルを計算した。結果を表１５に示す。
ＰＤ−Ｌ１のｍＲＮＡ発現量をｑＰＣＲで測定した。
凍結した肝臓片からｍＲＮＡを抽出し、これをセラミックビーズ（Lysing Matrix D tubes、１１６９１３５００、mpbio）とＴｒｉｚｏｌ １ｍｌとを含有する２ｍｌチューブに加えた。
プリセリーズ（Precellys）製の組織破砕装置（Tissue Disruptor）を使用して肝臓片をホモジナイズした。２００μｌのクロロホルムをホモジネートに添加し、ボルテックスして、４℃にて１００００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。清澄な相（約５００μｌ）を含有するＲＮＡを新しいチューブに移し、同じ容量の７０％ＥｔＯＨを添加した。よく混合した後、溶液をRNeasyスピンカラムに移し、RNeasy KitのマニュアルRNeasy Mini Kit、カタログ番号７４１０４、Qiagen(ＲＮＡ消化ＲＮアーゼ不含ＤＮアーゼセット、カタログ番号７９２５４を含む）に従って、ＲＮＡを更に抽出した。５０μｌのＨ2Ｏ中での溶出最終ＲＮＡ濃度を測定し、全ての試料について１００ｎｇ／μｌに調整した。
Taqman RNA-to-ct 1-step Kit（カタログ番号４３９２９３８、Thermo Fisher）をメーカーの指示に従って使用して、７．５μｌのＲＮＡに対してｑＰＣＰを行った。混合して使用されたｆｐｒｉｍｅｒは、ＰＤ−Ｌ１＿１−３（プライマー番号Ｍｍ００４５２０５４＿ｍ１、Ｍｍ０３０４８２４７＿ｍ１及びＭｍ０３０４８２４８＿ｍ１）、ならびに内因性対照（ＡＴＣＢ Ｍｍ００６０７９３９＿ｓ１、ＣＡＮＸ Ｍｍ００５００３３０＿ｍ１、ＹＷＨＡＺ Ｍｍ０３９５０１２６＿ｓ１及びＧＵＳＢ Ｍｍ０１１９７６９８＿ｍ１）が含有されていた。
２＾−ｄｄｃｔ法を使用して、データを分析した。４つの内在性対照全ての平均を用い、ｄｃｔ値を計算した。内因性対照の平均に対するＰＤ−Ｌ１発現量、及び生理食塩水（％）
これらの結果から、裸型及びＧａｌＮＡｃ結合型オリゴヌクレオチドは両方とも、ＡＡＶ／ＨＢＶマウスの肝臓におけるＰＤ−Ｌ１のｍＲＮＡの発現量を低減させることができ、ＧａｌＮＡｃ結合オリゴヌクレオチドの方が幾分良好であることが分かる。また、両方のオリゴヌクレオチドによって、血清中のＨＢＶ ＤＮＡが若干低減された。
実施例６ − ＡＡＶ／ＨＢＶマウスにおけるＴ細胞応答に対するインビボ効果
本研究では、パスツール（Pasteur）から入手されたＡＡＶ／ＨＢＶマウスを、ＰＤ−Ｌ１を標的化する抗体又はアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置した。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、裸型又はＧａｌＮＡｃ結合型のいずれかであった。処置中に、抗原提示細胞による効率的なＴ細胞プライミングを確実にするために、ＨＢｓ抗原及びＨＢｃ抗原に抗するＤＮＡワクチンで動物を免疫した（「材料と方法」の節を参照のこと）。この処置が肝臓内及び脾臓内の細胞母集団ならびにこれらの母集団におけるＰＤ−Ｌ１発現に対してどのように影響するか、またＨＢＶ特異的Ｔ細胞応答を同定できるかどうかを評価した。
処置プロトコール：
雌のＨＬＡ−Ａ２／ＤＲ１マウスを以下のプロトコールに従って処置した。本研究は、下の表１６及び表１７に示すような投与レジメンにおいて若干異なる２つの別個のサブ研究で実施された。
「材料と方法」の節に記載されているように、ＤＮＡワクチン及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与した。使用されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、皮下注射（ｓ．ｃ．）として投与された場合に、５ｍｇ／ｋｇのＣＭＰ ＩＤ番号７４８＿１（裸型）、及び７ｍｇ／ｋｇのＣＭＰ ＩＤ番号：７５９＿２（ＧａｌＮＡｃ結合型）であった。
屠殺時に各群からの各マウスの脾臓及び肝臓の単核細胞を採取し、赤血球細胞を枯渇させた（Lysing Buffer, BD biosciences, 555899）。「材料と方法」の節に記載されているように、肝単核細胞に特定の調製物が必要とされた。
細胞母集団：
サイトメトリーを使用して肝臓単核細胞（「材料と方法」を参照）の表面標識によって、肝臓における細胞集団を分析した。
対照群（すなわちビヒクル群及びＤＮＡ免疫群）と比較して、処置マウスの脾臓及び肝臓におけるＮＫ細胞の頻度には、有意な変化が全く認められなかった。表１８に示すように、肝臓において、裸型ＰＤ−Ｌ１オリゴヌクレオチド（ＣＭＰ ＩＤ番号：７４８＿１）及びＧａｌＮＡｃ結合型ＰＤ−Ｌ１オリゴヌクレオチド（ＣＭＰ ＩＤ番号：７５９＿２）で処置された群は、いずれかの対照群（すなわち、ビヒクル及びＤＮＡで免疫化された群）と比較してＴ細胞数が有意に増加した。これは、図１０Ａにも同様に示されている。この増加は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞母集団の両方の増加に起因するものであった（それぞれ表１８、図１０Ｂ及び図１０Ｃ）。
ＰＤ−Ｌ１発現量：
屠殺の時点での、脾臓及び肝臓由来のマクロファージ、Ｂ細胞及びＴ細胞におけるＰＤ−Ｌ１タンパク質の発現を評価した。表面標識抗体混合物中にＰＤ−Ｌ１抗体を存在させることによって（「材料と方法」を参照）、サイトメトリーを用い、ＰＤ−Ｌ１発現細胞の定量が可能となった。
脾臓における、マクロファージ内、Ｂ細胞内及びＣＤ４＋Ｔ細胞内でのＰＤ−Ｌ１発現率（％）に処置間の有意差は観察されなかった。ＰＤ−Ｌ１を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞の％は、他の処置と比較して、裸型ＰＤ−Ｌ１オリゴヌクレオチド（ＣＭＰ ＩＤ番号７４８＿１）及びＧａｌＮＡｃ結合型ＰＤ−Ｌ１オリゴヌクレオチド（ＣＭＰ ＩＤ番号７５９＿２）で処置したマウスでは低かった（データ非公開）。
肝臓において、ＰＤ−Ｌ１は主としてＣＤ８＋Ｔ細胞上で発現した。対照群（それぞれビヒクル接種群及びＤＮＡワクチン接種群の２つを組み合わせた図１１Ａ）では、平均頻度が３２％及び４１％であった。裸型ＰＤ−Ｌ１オリゴヌクレオチド又はＧａｌＮＡｃ ＰＤ−Ｌ１オリゴヌクレオチドでの治療によって、ＰＤ−Ｌ１を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度が減少した（表１９及び図１１Ａを参照）。これらの細胞型は、ＣＤ８＋Ｔ細胞よりもＰＤ−Ｌ１の発現率が有意に少ないが、ＡＳＯ処置後のＢ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞ではまた、ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞の割合（％）における有意な差が認められた（表１９、図１１Ｂ及び図１１Ｃを参照）。また、全ての細胞型において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体での処置によるＰＤ−Ｌ１の発現低減は明らかであった。しかしながら、この低減は、治療に使用される抗ＰＤ−Ｌ１抗体を介してＰＤ−Ｌ１エピトープが部分的に遮断されたことに起因するものであり、その結果、表面標識抗体混合物中のＰＤ−Ｌ１検出抗体がＰＤ−Ｌ１に結合するのが妨げられることになる。したがって、処置に使用された抗ＰＤ−Ｌ１抗体を介したＰＤ−Ｌ１下方制御のようなものと見られるのは、処置抗体と検出抗体との間でエピトープの競合が発生した結果でありうる。
ＨＢＶ特異的Ｔ細胞応答：
ＩＦＮγ及びＴＮＦα産生を検出する細胞内サイトカイン染色アッセイ（「材料と方法」の節を参照）を使用して、炎症性サイトカインを産生するＮＫ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、及びＣＤ８＋Ｔ細胞を検出した。
屠殺時に、脾臓内でＮＫ細胞、ＩＦＮγ−及びＴＮＦα分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞は検出されなかった（頻度＜０．１％）。裸型ＰＤ−Ｌ１オリゴヌクレオチド又はＧａｌＮＡｃ ＰＤ−Ｌ１オリゴヌクレオチド、ならびにＤＮＡワクチンのみを受けた本研究のマウス（データ非公開）で処置したマウスにおいて、２つのＨＢＶ抗原を標的化するＩＦＮγ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞が検出された。
屠殺時に、ＤＮＡ免疫化ＨＢＶキャリアマウスの肝臓内では、ＩＦＮγ産生ＮＫ細胞は検出されなかった一方、幾つかのＤＮＡ免疫化マウスの肝臓内は、ＩＦＮγ分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞がコア（Core）又はＳ２＋Ｓに特異的であった（＜０．４％、データ非公開）。大部分のＤＮＡ免疫マウスにおいて、ＩＦＮγを産生するＨＢＶ Ｓ２＋Ｓ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が検出された。ＤＮＡワクチンと裸型ＰＤ−Ｌ１オリゴヌクレオチド又はＧａｌＮＡｃ ＰＤ−Ｌ１オリゴヌクレオチドとの組み合わせで処置したマウスにおいては、ＩＦＮγ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度が増加したのに対して、抗ＰＤ−Ｌ１抗体で処置した場合には、ＤＮＡワクチン接種に対する明白な付加的効果が認められなかった（図１２）。エンベロープ及びコア抗原を標的化するＩＦＮγ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞が、ほとんどのＤＮＡ免疫化群（抗ＰＤ−Ｌ１抗体を除く）で検出された（図１２Ｂ）。ほとんどのＳ２−Ｓ特異的Ｔ細胞では、ＩＦＮγ及びＴＮＦαの両方が産生された（図１２Ｃ）。また、結果を表２０に示す。
実施例７−ＡＡＶ／ＨＢＶマウス血清中のＨＢＶ抗原及びＨＢＶ ＤＮＡに対するインビボ効果
本研究では、上海から入手されたＡＡＶ／ＨＢＶマウス（「材料と方法」の節を参照）を、ＧａｌＮＡｃ結合型ＰＤ−Ｌ１アンチセンスオリゴヌクレオチドＣＭＰ ＩＤ番号７５９＿２で処置した。
血清中のＨＢｅ及びＨＢｓ抗原ならびにＨＢＶ ＤＮＡレベルに対して処置が与えた影響を、ビヒクル処置動物と比較して評価した。
処置プロトコール：
「材料と方法」の節で上海モデルに記載されているように、本研究では、ＨＢＶゲノムを保有する組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（ＡＡＶ／ＨＢＶ）を感染させた雄のＣ５７ＢＬ／６マウスを使用した。５ｍｇ／ｋｇ又は媒体（生理食塩水）のアンチセンスオリゴヌクレオチドＣＭＰ ＩＤ番号：７５９＿２の両方を、８週間にわたって週１回マウス（１群当たりマウス６匹）に注射した。この注射は、皮下注射（ｓ．ｃ．）として投与された。処置中は毎週、処置後６週間に血液試料を採取した。以下に記載するように、ＨＢＶ ＤＮＡ、ＨＢｓ抗原及びＨＢｅ抗原レベルを血清試験で測定した。最初の１０週間分の結果を、表２１及び図１３に示す。出願の時点で依然として調査が進行中であったので、残りの４週間分のデータは得られていない。
ＨＢｓ抗原及びＨＢｅ抗原の検出：
ＨＢｓ抗原・化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）及びＨＢｅ抗原ＣＬＩＡキット（それぞれAutobio diagnostics Co. Ltd., Zhengzhou, China、カタログ番号ＣＬ０３１０−２及びＣＬ０３１２−２）を使用して、製造業者のプロトコールに従い、感染ＡＡＶ−ＨＢＶマウス血清中の血清ＨＢｓ抗原及びＨＢｅ抗原レベルを測定した。概略説明すると、５０μｌの血清をそれぞれの抗体被覆マイクロタイタープレートに移し、５０μｌの酵素結合試薬を加えた。プレートを室温にて振盪機上で６０分間インキュベートした後、自動洗浄機を使用して全てのウェルを洗浄緩衝液で６回洗浄した。２５μｌの基質Ａ、次いで２５μｌの基質Ｂを、各ウェルに加えた。プレートを室温で１０分間インキュベートした後、Envisionルミネセンスリーダーを使用して発光を測定した。１ｎｇのＨＢｓ抗原＝１．１４ＩＵとした場合、ＨＢｓ抗原は単位ＩＵ／ｍｌで与えられる。ＨＢｅ抗原は、単位ＮＣＵ／ｍｌ血清で与えられる。
ＨＢＶ ＤＮＡの抽出及びｑＰＣＲ：
最初に、マウス血清をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１０倍（１：１０）に希釈した。MagNA Pure 96（Roche）ロボットを使用して、ＤＮＡを抽出した。希釈された血清５０μｌを処置カートリッジ中で２００μｌのMagNA Pure 96外部溶解緩衝液（Roche、カタログ番号０６３７４９１３００１）と混合し、１０分間インキュベートした。次いで、「MagNA Pure 96 DNA and Viral Nucleic Acid Small Volume Kit」（Roche、カタログ番号０６５４３５８８００１）及び「Viral NA Plasma SV external lysis 2.0」プロトコールを使用して、ＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ溶出容量は５０μｌであった。
抽出されたＨＢＶ ＤＮＡの定量は、Taqman qPCRマシン（ViiA7、life technologies）を使用して行った。各ＤＮＡ試料をＰＣＲで二重に試験した。３８４ウェルプレート中TaqMan Gene Expression Master Mix（Applied Biosystems、カタログ番号４３６９０１６）１０μｌと、PrimeTime XL qPCR Primer/Probe（IDT）０．５μｌと、蒸留水４．５μｌとを含有するＰＣＲマスターミックス１５μｌに、ＤＮＡ試料５μｌを加えて、ＰＣＲを行った。その際に使用した設定は以下のとおり：ＵＤＧインキュベーション（２分、５０℃）、酵素活性化（１０分、９５℃）及びＰＣＲ４０サイクル分（９５℃にて１５秒間変性；ならびに６０℃にて１分間アニーリング及び伸長）。ＤＮＡコピー数は、ViiA7ソフトウェアによるＨＢＶプラスミドＤＮＡ検定線に基づいて、Ｃt値から計算した。
TaqManプライマーの配列及びプローブ（IDT）：
フォワードコアプライマー（F3_core）：ＣＴＧ ＴＧＣ ＣＴＴ ＧＧＧ ＴＧＧ ＣＴＴ Ｔ（配列番号：７８４）
リバースプライマー（R3_core）：ＡＡＧ ＧＡＡ ＡＧＡ ＡＧＴ ＣＡＧ ＡＡＧ ＧＣＡ ＡＡＡ（配列番号：７８５）
Taqmanプローブ（P3_core）：５６−ＦＡＭ／ＡＧＣ ＴＣＣ ＡＡＡ ／ＺＥＮ／ＴＴＣ ＴＴＴ ＡＴＡ ＡＧＧ ＧＴＣ ＧＡＴ ＧＴＣ ＣＡＴ Ｇ／３ＩＡＢｋＦＱ（配列番号：７８６）。
本研究から分かるように、ＧａｌＮＡｃ結合型ＰＤ−Ｌ１アンチセンスオリゴヌクレオチドＣＭＰ番号７５９＿２が、６週間の処置後のＨＢＶ−ＤＮＡ、ＨＢｓ抗原及びＨＢｅ抗原レベルの低下に対する有意な効果と、処置後少なくとも２週間にわたって持続する効果と、を有する。
実施例８ − ＧａｌＮＡｃ結合型ＰＤ−Ｌ１オリゴヌクレオチドを使用した、ヒト初代肝細胞におけるインビボＰＤ−Ｌ１ノックダウン
初代ヒト肝細胞におけるＰＤ−Ｌ１転写産物を減少させるＧａｌＮＡｃ結合型ＰＤ−Ｌ１アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物の能力を、ゲノミクスを用いて調べた。
細胞培養
凍結保存されたヒト肝細胞を、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）及びＬ−グルタミン（０．２９２ｍｇ／ｍｌ）を補給したＷＭＥ中で５×１０6細胞／ｍｌに希釈し、２×１０5細胞／ウェルの密度でコラーゲン被覆２４ウェルプレート（Becton Dickinson AG、Allschwil、Switzerland）中に播種した。細胞を４時間前培養し、細胞培養プレートに付着させてから、最終濃度１００μＭのオリゴヌクレオチドでの処置を開始した。使用されたオリゴヌクレオチドは、表２１及び表８に示すとおりであり、ビヒクルはＰＢＳとされた。播種培地を、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）及びＬ−グルタミン（０．２９２ｍｇ／ｍｌを補給した３１５μｌの無血清ＷＭＥで置き換えて、１ｍＭのＰＢＳ中のオリゴヌクレオチドストック溶液３５μｌを細胞培養物に添加し、これを細胞上に２４時間又は６６時間放置した。
ライブラリの調製
Stranded mRNAケミストリーを使用し、２×５１ｂｐ対末端リード及び３０Ｍ／試料（Q squared EA）の配列決定ストラテジーを用いて、転写物発現プロファイリングを行った。ウェル中にQiagen RLT緩衝液３５０μｌを添加して、細胞を溶解させ、無作為化スキームで受託した。
QiagenRNeasy Mini Kitを使用して、ｍＲＮＡを精製した。ｍＲＮＡを定量し、Agilent Bioanalyzerを使用して完全性を評価した。単離されたＲＮＡを初期品質評価した際、全ての試料がＲＩＮスコア＞７．０で、１００ｎｇの入力品質メトリックを満たしていることが観察された。
１００ｎｇの全ＲＮＡから開始して、Illumina TruSeq Stranded mRNA Library Preparationを使用して、全ての試料について配列決定ライブラリを作成した。最終のｃＤＮＡライブラリをサイズ分布及びAgilent Bioanalyzer（ＤＮＡ１０００キット）を用いて分析し、ｑＰＣＲ（KAPA Library Quant Kit）で定量し、配列決定の準備に際して２ｎＭに標準化した。Standard Cluster Generation Kit v5を使用して、ｃＤＮＡライブラリをフローセル表面に結合させ、ｃＢｏｔを等温的に付着させて、付着されたｃＤＮＡ構築物をそれぞれ約１０００コピーのクローン集落まで増幅した。TruSeq SBSキットを用いた合成による配列決定技術によって、ＤＮＡ配列を決定した。
データ処理
GSNAPショートリードアライメントプログラムを使用して、長さ２×５１ｂｐのIlluminaペアエンド・シーケンシング・リード（paired-end sequencing reads）を、ヒト参照ゲノムｈｇ１９上にマッピングした。SAMTOOLSプログラムを使用して、ＳＡＭフォーマットアライメントを、ソートアライメントＢＡＭフォーマットファイルに変換した。ｈｇ１９に対応するＧＴＦファイルで指定されたNCBI RefSeqからのエキソンアノテーションに基づいて、ＰＤ−Ｌ１の遺伝子読み取りカウントを推定した。各試料の異なるライブラリサイズを考慮した正規化工程が、DESeq2Rパッケージを使用して適用された。
ＧａｌＮＡｃ結合型ＰＤ−Ｌ１アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物とのインキュベーション後のＰＤ−Ｌ１転写物の減少を、表２２に示す。
ビヒクルで処理した試料と比較して、５つのＧａｌＮＡｃ結合型アンチセンス化合物は全て２４時間及び６６時間のインキュベーション後に有意なＰＤ−Ｌ１転写物の減少を示した。
実施例９ − ＨＢＶ感染ＡＳＧＰＲ−ＨｅｐａＲＧ細胞における結合及び裸型ＰＤ−Ｌ１アンチセンスオリゴヌクレオチドのＥＣ５０
ＨＢＶに感染したＡＳＧＰＲ−ＨｅｐａＲＧ細胞における２つの裸型ＰＤ−Ｌ１アンチセンスオリゴヌクレオチド及び同等のＧａｌＮＡｃ結合型ＰＤ−Ｌ１アンチセンスオリゴヌクレオチドの効力を比較した。
細胞系統
ＨｅｐａＲＧ細胞（Biopredic International, Saint-Gregoire, France）を、ウィリアムＥ培地（１０％ＨｅｐａＲＧ増殖サプリメント（Biopredic）を添加したもの）で培養した。レンチウイルス法を使用して、この細胞系統から、ヒトＡＳＧＰＲ１及びＡＳＧＰＲ２を安定に過剰発現するＨｅｐａＲＧ細胞系統を生成した。ＣＭＶプロモーター及びピューロマイシン耐性遺伝子の制御下でヒトＡＳＧＰＲ１及び２をコードするSirion biotech（CLV−CMV-ASGPR1-T2a_ASGPR2-IRES-Puro）が必要に応じて産生したレンチウイルスを、増殖用ＨｅｐａＲＧ細胞に、感染多重度（MOI）を３００として形質導入した。形質導入細胞を１μｇ／ｍｌピューロマイシンで１１日間選択し、次いで、確実に導入遺伝子が安定して発現するように、同濃度の抗生物質中で維持した。ＡＳＧＰＲ１／２過剰発現を、ＲＴ−ｑＰＣＲ（ＡＳＧＰＲ１：非形質導入対８５６０倍、ＡＳＧＰＲ２：非形質導入対２３８９倍）によるｍＲＮＡレベル及びフローサイトメトリー分析によるタンパク質レベルの両方で確認した。
感染前の少なくとも２週間、１．８％ＤＭＳＯを使用して細胞を分化させた。ＨｅｐＧ２．２．１５細胞培養上清からＨＢＶ遺伝子型Ｄを取り出し、ＰＥＧ沈殿を用いて濃縮した。試験化合物のＨＢＶに対する活性を評価するため、９６ウェルプレート中の分化したＡＳＧＰＲ−ＨｅｐａＲＧ細胞の感染多重度（MOI）を２０〜３０としてＨＢＶを２０時間にわたって感染させ、その後、細胞をＰＢＳで４回洗浄して、ＨＢＶ接種物を除去した。
オリゴヌクレオチドの有効性
以下のオリゴヌクレオチド
を、２５μＭから０．４ｎＭ（１：４希釈ＰＢＳ溶液）の連続希釈を使用して、感染後７日目及び１０日目にＨＢＶ感染ＡＳＧＰＲ−ＨｅｐａＲＧ細胞に添加した。感染後１３日目に、細胞を収穫した。
MagNA Pure 96 Cellular RNA Large Volume Kit（MagNA Pure 96 System（Roche Diagnostics））をメーカーの指示に従って使用して、総ｍＲＮＡを抽出した。実施例５に記載されているように、遺伝子発現分析用のＲＴ−ｑＰＣＲを行った。
２＾−ｄｄｃｔ法を使用して、データを分析した。アクチンＢを内因性対照として使用して、ｄｃｔ値を計算した。ＰＤ−Ｌ１発現量は、内因性対照及び生理食塩水ビヒクルに関連する。
GraphPad Prism6でＥＣ５０の計算を行った。これを、表２３に示す。
これらのデータから明らかに分かるように、ＰＤ−Ｌ１アンチセンスオリゴヌクレオチドのＧａｌＮＡｃ結合型は、ＥＣ５０値を有意に改善する。
実施例１０−慢性ＨＢＶ患者由来のＰＢＭＣにおける刺激Ｔ細胞機能
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のエクスビボでのＨＢＶ抗原刺激後に、裸型ＰＤ−Ｌ１アンチセンス化合物が、慢性的に感染したＨＢＶ（ＣＨＢ）患者のＴ細胞機能を増強させうるかどうかを調べた。
慢性ＨＢＶ感染患者３例から採取されたＰＢＭＣ凍結物を解凍し、１００μｌの培地（ＲＰＭＩ１６４０＋ＧｌｕｔａＭａｘ＋８％ヒト血清＋２５ｍＭのＨｅｐｅｓ＋１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ）中２００，０００細胞／ウェルの密度で播種した。翌日、１００pｇ／ｍｌのＩＬ−１２と５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７とを含有する１００μｌの培地中に、５μＭのＣＭＰ ＩＤ番号：４６６＿１又はＣＭＰ ＩＤ番号：６４０＿１を含めた又は含めない、１μＭのＰｅｐＭｉｘＨＢＶラージエンベロープタンパク質又は１μＭのＰｅｐＭｉｘＨＢＶコアタンパク質で、細胞を刺激した（表９参照）。８日目にのみ、コンカナバリン刺激を適用した。４日後に、ＰＤ−Ｌ１アンチセンスオリゴヌクレオチド処置を、５０ＩＵのＩＬ−２を含有する培地で更新した。最初の刺激後８日目に、ＰｅｐＭｉｘ又は５μｇ／ｍｌのコンカナバリンＡ＋ＰＤ−Ｌ１アンチセンスオリゴヌクレオチドで、細胞を２４時間再刺激した。ここ５時間にわたって刺激が得られるように、０．１μｌのブレフェルジンＡ（Brefeldin A）、０．１μｌのモネンシン（Monensin）、及び３μｌの抗ヒトＣＤ−１０７（APC）を添加した。
２４時間後、細胞を染色緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．０９％アジ化ナトリウム＋ＥＤＴＡ）で洗浄し、表面染色［抗ヒトＣＤ３（BV605）、抗ヒトＣＤ４（FITC）抗ヒトＣＤ８（BV711）、抗ヒトＰＤＬ１（BV421）、抗ヒトＰＤ１（PerCP-Cy5.5）、ならびに、生存及び死滅染色（BV510）（BD Biosciences）］を４℃で３０分間適用した。細胞を４℃のＢＤ固定緩衝液中で１５分間固定した。翌朝、４℃で細胞をBD Perm/Wash Bufferで１５分間透過処理し、４℃で細胞内染色［抗ヒトＩＮＦ（PE）］を３０分間行った。Perm/Wash Bufferで洗浄後、細胞を２５０μｌの染色緩衝液中に溶解した。
BD Fortessa（BD Biosciences）で、FACS測定を行った。分析用、全細胞母集団を、最初に生細胞（生存及び死亡染色、BV510）で、次いでＣＤ３＋（BV605）細胞でゲーティングした。続いて、ＣＤ３＋細胞をＣＤ１０７ａ＋（APC）対ＩＦＮ＋（PE）としてグラフ化した。
結果を表２４に示す。
これらのデータから分かるように、ＣＨＢ患者のＰＢＭＣにおいて、抗原刺激はそれ自体で、Ｔ細胞活性化（ＩＮＦ及び／又はＣＤ１０７ａを発現するＣＤ３＋細胞％の増加）を誘導できる（ｎ＝３）。ＰＤ−Ｌ１アンチセンスオリゴヌクレオチドＣＭＰ ４６６＿１又は６４０＿１を添加すると、ＣＤ３＋Ｔ細胞応答が更に増加した。この増加が主に観察されたのは、ＨＢＶエンベロープ刺激群であった。

Claims (24)

  1. ａ．ＰＤ−Ｌ１標的核酸に対して少なくとも９０％の相補性を有する１０〜３０ヌクレオチド長さの連続ヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチド（領域Ａ）と；
    ｂ．（ａ）のオリゴヌクレオチドに共有結合された少なくとも１つの、アシアロ糖タンパク質受容体標的化結合部分（領域Ｃ）と；
    を含んでなる、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  2. 前記連続ヌクレオチド配列が、配列番号：１、配列番号：２及び／又は配列番号：３からなる群から選択される標的核酸に対して相補的である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  3. 前記連続ヌクレオチド配列が標的核酸のサブ配列に対して相補的であり、前記サブ配列が、配列番号：１上の３７１−３０６８位、５４６７−１２１０７位及び１５３１７−１９５１１位からなる群から選択される、請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  4. 前記連続ヌクレオチド配列が標的核酸のサブ配列に対して相補的であり、前記サブ配列がＡ２２１、Ａ３６０、Ａ１８０、Ａ１６０及びＡ２６９からなる群から選択される、請求項１から３に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  5. 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号：４６６、６４０、３４２、２８７及び５６６から選択される配列を含む、請求項１から４に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  6. 前記連続ヌクレオチド配列が１以上の修飾ヌクレオシド（例えば、１以上の２’糖修飾ヌクレオシドを含む、請求項１から５に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  7. 前記１以上の２’糖修飾ヌクレオシドが独立に、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＤＮＡ、アラビノ核酸酸（ＡＮＡ）、２’−フルオロ−ＡＮＡ、及びＬＮＡヌクレオシドからなる群から選択される、請求項６に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  8. 前記全ての修飾ヌクレオシドがＬＮＡヌクレオシドである、請求項６又は７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  9. 前記連続ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合（例えば、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合）を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  10. 前記オリゴヌクレオチドがギャップマーである、請求項１から９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  11. 前記ギャップマーが式５’−Ｄ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−３’又は５’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ”−３’を有し、領域Ｆ及びＦ’が独立に、１〜７修飾ヌクレオシドを含み、ＧがＲＮアーゼＨを補充する能力を有する６〜１６ヌクレオシド間の領域であり、及び領域Ｄ’又はＤ”は任意であり、且つ０〜５ホスホジエステルの連結ヌクレオシドを含む、請求項１０に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  12. 前記アシアロ糖タンパク質受容体標的化結合部分が、ガラクトース、ガラクトースアミン、Ｎ−ホルミル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−プロピオニル−ガラクトサミン、Ｎ−ｎ−ブタノイル−ガラクトサミン及びＮ−イソブタノイルガラクトサミンからなる群から選択される少なくとも１つの炭水化物部分を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  13. 前記アシアロ糖タンパク質受容体標的化結合部分が１価、２価、３価又は４価である、請求項１から１２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  14. 前記アシアロ糖タンパク質受容体標的化結合部分が、３価Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分である、請求項１から１３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  15. 前記アシアロ糖タンパク質受容体標的化結合部分が、図３の前記３価ＧａｌＮＡｃ部分である、請求項１から１４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  16. 前記オリゴヌクレオチドコンジュゲートがＣＭＰ ＩＤ番号：７６６＿２、７６７＿２、７６８＿２、７６９＿２及び７７０＿２から選択される、請求項１から１５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  17. オリゴヌクレオチド又は請求項１から１１のいずれか一項に記載の連続ヌクレオチド配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
  18. 請求項１から１６に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート、又は請求項１７に記載のオリゴヌクレオチド、ならびに医薬的に許容される希釈剤、溶媒、担体、塩及び／又は補助剤を含む、医薬組成物。
  19. ＰＤ−Ｌ１を発現する標的細胞におけるＰＤ−Ｌ１の発現を調節するためのインビボ又はインビトロ方法であって、前記方法が、有効量の請求項１から１６に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート、又は請求項１７に記載のオリゴヌクレオチドを前記細胞に投与することを含む、方法。
  20. ウイルスもしくは寄生虫に対する免疫応答の回復に使用するための、請求項１から１６に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート、又は請求項１７に記載のオリゴヌクレオチド、又は請求項１８に記載の医薬組成物。
  21. 前記免疫応答の回復が、対照と比較して、肝臓における１以上のＨＢＶ抗原に対して特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の増加である、請求項２０に記載の使用。
  22. 薬品として使用するための、請求項１から１６に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート、又は請求項１７に記載のオリゴヌクレオチド、又は請求項１８に記載の医薬組成物。
  23. ＨＢＶ、ＨＣＶ及びＨＤＶなどのウイルス性肝炎感染；マラリア、トキソプラズマ症、リーシュマニア症及びトリパノソーマ症などの寄生虫感染；又は肝臓癌もしくは肝臓の転移の治療又は予防に使用するための、請求項１から１６に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート、又は請求項１７に記載のオリゴヌクレオチド、又は請求項１８に記載の医薬組成物。
  24. ＨＢＶ、ＨＣＶ及びＨＤＶなどのウイルス性肝炎感染；マラリア、トキソプラズマ症、リーシュマニア症及びトリパノソーマ症などの寄生虫感染；又は肝臓癌もしくは肝臓の転移の治療又は予防用の薬品を調製するための、請求項１から１６に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲートの使用、又は請求項１７に記載のオリゴヌクレオチド、又は請求項１８に記載の医薬組成物。
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