DE69818987T2

DE69818987T2 - Zusammensetzung und verfahren zur verzögerung des transports durch biologische membranen

Info

Publication number: DE69818987T2
Application number: DE69818987T
Authority: DE
Inventors: B. Jonathan ROTHBARD; A. Paul WENDER
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 1997-05-21
Filing date: 1998-05-21
Publication date: 2004-07-29
Anticipated expiration: 2018-05-22
Also published as: DE69818987D1; PL337033A1; CN1263473A; WO1998052614A3; GB2341390B; US6306993B1; JP2002502376A; KR20010012809A; EP0975370A2; US6495663B1; BR9809138A; AU734827B2; US20020131965A1; US20030162719A1; AU7593898A; GB2341390A; US20060111274A1; CA2291074A1; ES2210761T3; WO1998052614A2

Description

Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf Verfahren und Zusammensetzungen, die wirkungsvoll sind, um Transport von biologisch aktiven Mitteln, wie etwa organischen Verbindungen, Polypeptiden, Oligosacchariden, Nukleinsäuren und Metallionen, durch biologische Membranen zu erhöhen.
Literaturstellen

Barsoum et al., PCT Pub. Nr. WO 94/04686 (1994).
Bonifaci, N., et al., Aids 9: 995–1000.
Brugidou, J., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 214(2): 685–93 (1995).
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Giannis, A., et al., Advances Drug Res. 29: 1 (1997).
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Lam, K. S., et al., Chem. Rev. 97: 411 (1997).
Langston, S., DDT 2: 255 (1997).
Rivas, A., et al., J. Immunol. 154: 4423–33 (1995).
Ruegg, C., et al., J. Immunol. 154: 4434–43 (1995).
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Tavladoraki et al., Nature 366: 469 (1993).
Thompson, L. A., und Ellman, J. A., Chem. Rev. 96: 555 (1996).
Wong, S. S., Hrsg., Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press, Inc. Boca Raton, FL (1991).
Zuckermann, R. N., Chemtracts-Macromol. Chem. 4: 80 (1993).

Hintergrund der Erfindung
Die Plasmamembranen von Zellen stellen eine Barriere für den Durchtritt bzw. die Passage vieler geeigneter therapeutischer Mittel dar. Im Allgemeinen muss ein Arzneimittel frei löslich sein, sowohl in den wässrigen Kompartimenten des Körpers als auch den Lipidschichten, durch welches es passieren muss, um in Zellen einzutreten. Hochgeladene Moleküle erfahren insbesondere Schwierigkeiten beim passieren von Membranen. Viele therapeutische Makromoleküle, wie etwa Peptide und Oligonukleotide, sind ebenfalls nicht besonders geeignet für Transmembrantransport. Wenngleich die Biotechnologie eine größere Anzahl potenziell wertvoller Therapeutika verfügbar gemacht hat, behindern Bioverfügbarkeitsbetrachtungen häufig ihre medizinische Anwendbarkeit. Es besteht daher ein Bedarf für verlässliche Mittel zum Transportieren von Arzneimitteln und insbesondere Makromolekülen in Zellen.
Bisher wurde eine Vielzahl von Transportmolekülen vorgeschlagen, um Moleküle durch biologische Membranen zu geleiten. Ryser et al. (1979) lehren die Verwendung von Lysinpolymeren mit hohem Molekulargewicht, zum Erhöhen des Transports verschiedener Moleküle durch Zellmembranen, wobei Moleküle mit sehr hohem Molekulargewicht bevorzugt sind. Wenngleich die Autoren Polymere anderer positiv geladener Gruppen, wie etwa Ornithin und Arginin, vorsahen, wurde die Wirksamkeit derartiger Polymere nicht gezeigt.
Frankel et al. (1991) berichteten, dass Konjugieren ausgewählter Moleküle an das tat-Protein von HIV die Zellaufnahme dieser Moleküle erhöhen kann. Jedoch hat die Verwendung des tat-Proteins gewisse Nachteile, einschließlich unvorteilhafter Aggregation und Unlöslichkeitseigenschaften.
Barsoum et al. (1994) und Fawell et al. (1994) schlugen die Verwendung kürzerer Fragmente des tat-Proteins vor, enthaltend die tat-basische Region (Reste 49–57 mit der Sequenz RKKRRQRRR). Barsoum et al. stellten fest, dass nicht übermäßig lange Polyargininpolymere (MG 5000–15.000 Dalton) nicht in der Lage waren, β-Galactosidase durch Zellmembranen zu transportieren (z. B. Barsoum auf Seite 3), im Gegensatz zu der Annahme von Ryser et al. (supra).
Andere Studien zeigten, dass ein 16-Aminosäurenpeptid-Cholesterol-Konjugat, das von der Antennapedia Homöodomäne stammt, rasch durch gezüchtete Neuronen aufgenommen wird (Brugidou et al., 1995). Jedoch werden etwas kürzere Versionen dieses Peptids (15 Gruppen) nicht effektiv durch Zellen aufgenommen (Derossi et al., 1996).
Die kanadische Patentanmeldung Nr. 2094658 beschreibt Trägerpeptide mit positiv geladenen D-Aminosäuren, z. B. Trägerpeptide, die aus 8 oder 9 D-Argininresten bestehen, zur intrazellulären Zuführung biochemischer Mittel.
Die vorliegende Erfindung basiert zum Teil auf der Entdeckung der Anmelden, dass Konjugation bestimmter Polymere, die zusammengesetzt sind aus benachbarten, hoch-basischen Untereinheiten, im Besonderen Untereinheiten, die Guanidyl- oder Amidinylgruppe enthalten, an kleine Moleküle oder Makromoleküle wirksam ist, um Transport des gebundenen Moleküls durch biologische Membranen wesentlich zu erhöhen. Darüber hinaus tritt der Transport mit einer Rate auf, die deutlich höher ist als die Transportrate, die durch ein basisches HIV-tat-Peptid bereitgestellt wird, das aus den Gruppen 49–57 besteht.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung umfasst unter einem Aspekt ein Verfahren zum Erhöhen des Transports eines biologisch wirksamen Mittels durch eine biologische Membran. In dem Verfahren wird eine biologische Membran in vitro in Kontakt gebracht mit einem Konjugat, das ein biologisch aktives Mittel enthält, das kovalent an einen polymeren Träger der Erfindung gebunden ist. Das Inkontaktbringen ist wirkungsvoll, um die Zuführung des Konjugats durch die biologische Membran im Vergleich zur Zuführung des biologisch aktiven Mittels in nicht konjugierter Form zu erhöhen.
In einer Hinsicht liefert die Erfindung ein Konjugat, bestehend aus einem biologisch aktiven Mittel, das kovalent an einen polymeren Träger gebunden ist, der ein Nicht-Peptidgrundgerüst aufweist, worin der polymere Träger (a) aus 6 bis 25 Untereinheiten besteht, von welchen mindestens 50% substituiert sind mit einer Seitenkettengruppe, die eine terminale Guanidino- oder Amidinogruppe umfasst, (b) mindestens sechs derartige Guanidino- oder Amidinoseitenkettengruppen enthält, und (c) wirkungsvoll die Menge biologisch aktives Mittel, die durch eine biologische Membran transportiert wird, relativ zur Menge des Mittels erhöht, die durch die biologische Membran in unkonjugierter Form transportiert werden kann.
In einer Ausführungsform besteht das Polymer aus 6 bis 25 Untereinheiten, wovon mindestens 50% eine Guanidino- oder Amidinoseitenkettengruppe enthalten, worin das Polymer mindestens 6 und bevorzugter mindestens 7 Guanidino- oder Amidinoseitenkettengruppen enthält. In einer anderen Ausführungsform besteht das Polymer aus 6 bis 20, 7 bis 20 oder 7 bis 15 Untereinheiten. Bevorzugter enthalten mindestens 70% der Untereinheiten in dem Polymer Guanidino- oder Amidinoseitenkettengruppen und noch bevorzugter mindestens 90%. Vorzugsweise ist keine Guanidino- oder Amidinoseitenkettengruppe getrennt von einer anderen derartigen Gruppe durch mehr als eine Nicht-Guanidino- oder Nicht-Amidinountereinheit. In einer spezifischeren Ausführungsform enthält das Polymer mindestens 6 benachbarte Untereinheiten, wobei jede entweder eine Guanidino- oder Amidinogruppe enthält und vorzugsweise mindestens 6 oder 7 benachbarte Guanidinoseitenkettengruppen.
In einer anderen Ausführungsform enthält das Transportpolymer von 6 bis 25 benachbarte Untereinheiten, von 7 bis 25, von 6 bis 20 oder vorzugsweise von 7 bis 20 benachbarte Untereinheiten, wobei jede hiervon eine Guanidino- oder Amidinoseitenkettengruppe enthält, und mit dem optionalen Vorbehalt, dass eine der benachbarten Untereinheiten eine Nicht-Arginingruppe enthalten kann, an welchen das Mittel gebunden ist.
In einer Ausführungsform enthält jede benachbarte Untereinheit eine Guanidinogruppe, wie beispielhaft dargestellt durch ein Polymer, das mindestens sechs benachbarte Arginingruppen enthält.
Vorzugsweise ist jedes Transportpolymer linear. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Mittel an ein terminales Ende des Transportpolymers gebunden.
In einer anderen spezifischen Ausführungsform enthält das Konjugat ein einzelnes Transportpolymer.
Das Verfahren kann verwendet werden, um Transport ausgewählter therapeutischer Mittel durch beliebige aus einer Vielzahl biologischer Membranen zu transportieren, einschließlich, ohne darauf begrenzt zu sein, eukaryontische Zellmembranen, prokaryontische Zellmembranen und Zellwände. Beispielhafte prokaryontische Zellmembranen umfassen Bakterienmembranen. Beispielhafte eukaryontische Zellmembranen, die von Interesse sind, umfassen, ohne darauf begrenzt zu sein, Membranen dendritischer Zellen, Epithelzellen, Endothelzellen, Keratinocyten, Muskelzellen, Pilzzellen, Bakterienzellen, Pflanzenzellen und dgl.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung hat das Transportpolymer der Erfindung eine scheinbare Affinität (Km), die mindestens um das 10-fache größer ist und vorzugsweise um mindestens das 100-fache größer ist als die Affinität, die für das tat (49 bis 57) – Peptid durch das Verfahren von Beispiel 6 gemessen wird, wenn bei Raumtemperatur (23°C) oder 37°C gemessen wird.
Biologisch aktive Mittel (welche therapeutische Mittel umfassen) umfassen, ohne darauf begrenzt zu sein, Metallionen, welche typischerweise als Metallchelate bereitgestellt werden; kleine organische Moleküle wie Antikrebsmittel (z. B. Taxan) und mikrobiologische Moleküle (z. B. gegen Bakterien oder Pilze, wie etwa Hefe); und Makromoleküle, wie etwa Nukleinsäuren, Peptide, Proteine und Analoga davon. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Mittel eine Nukleinsäure oder ein Nukleinsäureanaloges, wie etwa Ribozym, welches optional eine oder mehrere 2'-Deoxynukleotiduntereinheiten für verbesserte Stabilität enthält. Alternativ ist das Mittel eine Peptidnukleinsäure (PNA). In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das Mittel ein Polypeptid, wie etwa ein Proteinantigen, und die biologische Membran ist eine Zellmembran einer Antigenpräsentierenden Zelle (APC). In einer anderen Ausführungsform ist das Mittel ausgewählt, um eine Immunantwort gegen ein ausgewähltes Tumorantigen zu fördern oder hervorzurufen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das Mittel eine Taxan- oder taxoide Antikrebsverbindung. In einer anderen Ausführungsform ist das Mittel ein Nicht-Polypeptidmittel, vorzugsweise ein therapeutisches Nicht-Polypeptid- Mittel. In einer allgemeineren Ausführungsform hat das Mittel vorzugsweise ein Molekulargewicht von weniger als 10 kDa.
Das Mittel kann an das Polymer durch einen Linkerrest gebunden sein, welcher Konformationsflexibilität innerhalb des Konjugats verleihen und Wechselwirkungen zwischen dem Mittel und seinem biologischen Ziel erleichtern kann. In einer Ausführungsform ist die Linkergruppe ein spaltbarer Linker, z. B. enthaltend eine Linkergruppe, die durch ein Enzym oder eine Lösungsmittel vermittelte Spaltung spaltbar ist, wie etwa eine Ester-, Amid- oder Disulfidgruppe. In einer anderen Ausführungsform enthält der spaltbare Linker eine fotospaltbare Gruppe.
In einer spezifischeren Ausführungsform enthält der spaltbare Linker eine erste spaltbare Gruppe, die distal zum biologisch aktiven Mittel ist, und eine zweite spaltbare Gruppe, die proximal zu dem Mittel ist, sodass Spaltung der ersten spaltbaren Gruppe zu einem Linkermittelkonjugat führt, das eine nukleophile Gruppe enthält, die in der Lage ist, intramolekular zu reagieren, um die zweite spaltbare Gruppe, zu spalten, wobei das Mittel von dem Linker und dem Polymer freigesetzt wird.
In einer anderen Ausführungsform kann die Erfindung verwendet werden, um eine Vielzahl von Konjugaten auf ausgewählte biologische Aktivität zu screenen, worin die Konjugate aus einer Vielzahl von Kandidatenagentien gebildet sind. Die Konjugate werden in Kontakt gebracht mit einer Zelle, die ein nachweisbares Signal bei Aufnahme des Konjugats in die Zelle zeigt, sodass die Stärke des Signals kennzeichnend für die Wirksamkeit bzw. Effizienz des Konjugats in Bezug auf die ausgewählte biologische Aktivität ist. Dieses Verfahren ist besonders geeignet zum Testen der Aktivitäten von Mitteln, die selbst nicht in der Lage oder nur geringfügig in der Lage sind in Zellen einzutreten, um biologische Aktivität zu manifestieren. In einer Ausführungsform werden die Kandidatenagens ausgewählt aus einer kombinatorischen Bibliothek.
Die Erfindung umfasst auch eine Konjugatbibliothek, die geeignet ist zum Screenen in dem obigen Verfahren.
In einer anderen Hinsicht umfasst die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung zum Zuführen eines biologisch aktiven Mittels durch eine biologische Membran. Die Zusammensetzung umfasst ein Konjugat, das ein biologisch aktives Mittel enthält, das kovalent an mindestens ein Transportpolymer gebunden ist, wie oben beschrieben, und ein pharmazeutisch verträgliches Hilfsmittel. Das Polymer ist wirksam um dem Mittel eine Transmembrantransportrate zu verleihen, die größer als die Transmembrantransportrate des Mittels in nicht konjugierter Form ist. Die Zusammensetzung kann zusätzlich mit Instruktionen zu ihrer Verwendung verpackt sein.
In einer anderen Hinsicht umfasst die Erfindung eine Verwendung wie in Anspruch 30 definiert.
Diese und andere Gegenstände und Merkmale der Erfindung werden vollständiger ersichtlich, wenn die folgende detaillierte Beschreibung der Erfindung in Verbindung mit den anhängigen Zeichnungen gelesen wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1A und 1B sind Plots der zellulären Aufnahme bestimmter Polypeptid-Fluorescein-Konjugate, enthaltend tat-basisches Peptid (49–57, SEQ ID Nr: 1), Poly-Lys (K9, SEQ ID Nr: 2) und Poly-Arg (R4–R9 und r4–r9, SEQ ID Nr: 3–8 bzw. 12–17), als eine Funktion der Peptidkonzentration; 1C ist ein Histogramm der Aufnahmegrade der Konjugate, gemessen für Konjugate bei einer Konzentration von 12,5 μM (Beispiele 2–3);
Die 2A bis 2F zeigen Computer-generierte Bilder von konfokalen Mikrofotografien (Beispiel 4), welche emittierte Fluoreszenz (2A–2C) und transmittiertes Licht (2D–2F) von Jurkat-Zellen nach Inkubation bei 37°C für 10 Minuten mit 6,25 μM tat (49–57) konjugiert mit Fluorescein (Banden A und D), einem 7-mer von Poly-L-Arginin (R7), markiert mit Fluorescein (Banden B und E) oder einem 7-mer von Poly-D-Arginin (r7), markiert mit Fluorescein (Banden C und F) zeigen;
3 zeigt die Zellaufnahme bestimmter Poly-Arg-Fluorescein-Konjugate (r9, R9, R15, R20 und R25, SEQ ID Nr: 17 bzw. 8–11) als eine Funktion der Konjugatkonzentration (Beispiel 5);
4 zeigt ein Histogramm der zellulären Aufnahme von Fluorescein konjugiertem tat- (49–57) und Poly-Arg-Fluorescein-Konjugaten (R9, R8 bzw. R7) in der Abwesenheit (vier Balken auf der linken Seite) und beim Vorliegen (vier Balken auf der rechten Seite) von 0,5% Natriumazid (Beispiel 7);
Die 5A bis 5C zeigen Plots der Aufnahmegrade ausgewählter Polymerkonjugate (K9, R9, r4, r5, r6, r7, r8 und r9) durch Bakterienzellen als eine Funktion der Konjugatkonzentration; 5A vergleicht die Aufnahmegrade, die beobachtet werden für R9- und r9-Konjugate als eine Funktion der Konjugatkonzentration bei Inkubation mit E. Coli HB 101 Zellen; 5B zeigt die Aufnahmegrade, die beobachtet werden für K9- und r4- bis r9-Konjugate bei Inkubation mit E. Coli HB 101 Zellen; 5C vergleicht die Aufnahmegrade von Konjugaten von r9 und K9 bei Inkubation mit Strep. Bovis Zellen;
Die 6A bis 6E zeigen beispielhafte Konjugate der Erfindung, welche spaltbare Linkergruppen enthalten; 6F und 6B zeigen chemische Strukturen und herkömmliches Nummerieren von Konstituentengerundgerüstatomen für Paclitaxel und "TAXOTERE"; 6H zeigt eine allgemeine chemische Struktur und Ringatomnummerierung für taxoide Verbindungen; und
7 zeigt die Inhibierung der Sezernierung von Gamma-Interferon (γ-IFN) durch Maus-T-Zellen als eine Funktion der Konzentration eines Sense-PNA-r7-Konjugats (SEQ ID Nr: 18), Antisense-PNA-r7-Konjugat (SEQ ID Nr: 19) und nicht-konjugiertem Antisense PNA (SEQ ID Nr: 20), worin die PNA-Sequenzen auf einer Sequenz des Gens für Gamma-Interferon basieren.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
1. Definitionen
Der Ausdruck "biologische Membran" bedeutet, wie er hier verwendet wird, eine Lipid-enthaltende Barriere, die Zellen oder Gruppen von Zellen om extrazellulären Raum trennt. Biologische Membranen umfassen, ohne darauf begrenzt zu sein, Plasmamembranen, Zellwände, intrazelluläre Organellen Membranen, wie etwa die Mitochondrienmembran, Kernmembranen und dgl.
Der Ausdruck "Transmembrankonzentration" betrifft die Konzentration einer Verbindung, die auf der Seite einer Membran vorliegt, die gegenüberliegend oder "trans" zur Seite der Membran ist, zu welcher eine besondere Zusammensetzung hinzugegeben worden ist. Wenn z. B. eine Verbindung zu dem extrazellulären Fluid einer Zelle gegeben wird, ist die Menge der Verbindung, die nachfolgend innerhalb der Zelle gemessen wird, die Transmembrankonzentration der Verbindung.
"Biologisch aktives Mittel" oder "biologisch aktive Substanz" betrifft eine chemische Substanz, wie etwa ein kleines Molekül, Makromolekül oder Metallion, das eine beobachtbare Veränderung in der Struktur, Funktion oder Zusammensetzung einer Zellaufnahme durch die Zelle bewirkt. Beobachtbare Veränderungen umfassen erhöhte oder erniedrigte Expression einer oder mehrerer mRNAs, erhöhte oder erniedrigte Expression eines oder mehrerer Proteine, Phosphorylierung eines Proteins oder einer anderen Zellkomponente, Inhibierung oder Aktivierung eines Enzyms, Inhibierung oder Aktivierung der Bindung zwischen Komponenten eines Bindungspaares, eine erhöhte oder erniedrigte Syntheserate eines Metaboliten, erhöhte oder erniedrigte Zellproliferation und dgl.
Der Ausdruck "Makromolekül" bedeutet, wie er hier verwendet wird, große Moleküle (MG größer 1000 Dalton), wie beispielhaft dargestellt, ohne darauf begrenzt zu sein, durch Peptide, Proteine, Oligonukleotide und Polynukleotide biologischen oder synthetischen Ursprungs.
"Kleines organisches Molekül" betrifft ein Kohlenstoff-enthaltendes Mittel mit einem Molekulargewicht (MG) von kleiner oder gleich 1000 Dalton.
Der Ausdruck "therapeutisches Mittel", "therapeutische Zusammensetzung" und "therapeutische Substanz" betrifft, ohne darauf begrenzt zu sein, jede Zusammensetzung, die zum Vorteil einer Säugerspezies verwendet werden kann. Derartige Mittel können in der Form von Ionen, kleinen organischen Molekülen, Peptiden, Protein oder Polypeptiden, Oligonukleotiden und Oligosacchariden z. B. sein.
Die Ausdrücke therapeutisches "Nicht-Polypeptidmittel" und "Nicht-Polypeptidmittel" betreffen den Anteil eines Transportpolymerkonjugats, der nicht das transporterhöhende Polymer enthält und der ein biologisch aktives Mittel ist, das von einem Polypeptid verschieden ist. Ein Beispiel eines Nicht-Polypeptidmittels ist ein Antisense-Oligonukleotid, welches konjugiert sein kann an ein Polyargininpeptid, um ein Konjugat für verbesserte Zuführung durch biologische Membranen hindurch zu bilden.
Der Ausdruck "Polymer" betrifft eine lineare Kette von zwei oder mehr identischen oder nicht-identischen Untereinheiten, die durch kovalente Bindungen verknüpft sind. Ein Peptid ist ein Beispiel eines Polymers, das aus identischen oder nichtidentischen Aminosäureuntereinheiten aufgebaut sein kann, die durch Peptidbindungen miteinander verknüpft sind.
Der Ausdruck "Peptid", wie er hier verwendet wird, bedeutet eine Verbindung, die aus einer Einzelkette aus D- oder L-Aminosäuren oder einem Gemisch von D- und L-Aminosäuren besteht, die durch Peptidbindungen verbunden sind. Im Allgemeinen enthalten Peptide mindestens zwei Aminosäurereste und weisen weniger als 50 Aminosäuren in der Länge auf.
Der Ausdruck "Protein", wie er hier verwendet wird, bedeutet eine Verbindung, die aus linear angeordneten Aminosäuren besteht, die durch Peptidbindungen verknüpft sind, jedoch im Gegensatz zu Peptiden hat es eine gut definierte Konformation. Proteine bestehen im Gegensatz zu Peptiden im Allgemeinen aus Ketten von 50 oder mehr Aminosäuren.
"Polypeptid" bedeutet, wie hier verwendet, ein Polymer aus mindestens zwei Aminosäureresten und welches ein oder mehrere Peptidbindungen enthält. "Polypeptid" umfasst Peptide und Proteine, ungeachtet dessen, ob das Polypeptid eine gut definierte Konformation hat.
Die Ausdrücke "Guanidyl", "Guanidinyl" und "Guanidino" werden hier austauschbar verwendet, um eine Gruppe mit der Formel -HN=C(NH₂)NH (unprotonierte Form) zu bedeuten. Als ein Beispiel enthält Arginin eine Guanidyl(Guanidino)- Gruppe und wird ebenfalls als 2-Amino-S-Guanidinovaleriansäure oder α-Amino-δ-guanidinovaleriansäure bezeichnet. "Guanidinium" betrifft die positiv geladene Konjugatsäureform.
"Amidinyl" und "Amidino" bezeichnen eine Gruppe mit der Formel -C(=NH)(NH₂). "Amidinium" betrifft die positiv geladene Konjugatsäureform.
Der Ausdruck „Polyarginin" oder „Poly-Arg" betrifft eine Polymersequenz, bestehend aus benachbarten Arginingruppen; Poly-L-Arginin betrifft alle L-Arginine; Poly-D-Arginin betrifft alle D-Arginine. Poly-L-Arginin wird auch abgekürzt durch ein „R" am Anfang, gefolgt von der Anzahl von L-Argininen in dem Peptid (z. B. R8 bedeutet ein 8-mer benachbarter L-Arginingruppen); Poly-D-Arginin wird durch ein vorausgehendes „r", gefolgt von der Anzahl von D-Argininen in dem Peptid abgekürzt (r8 bedeutet ein 8-mer benachbarter D-Arginingruppen).
Aminosäuregruppen werden hier durch ihre vollständigen Namen oder durch Standard-ein-Buchstaben oder drei-Buchstaben-Bezeichnungen bezeichnet: A, Ala, Alanin; C, Cys, Cystein; D, Asp, Asparaginsäure; E, Glu, Glutaminsäure; F, Phe, Phenylalanin; G, Gly, Glycin; N, His, Histidin; I, Ile, Isoleucin; K, Lys, Lysin; L, Leu, Leucin; M, Met, Methionin; N, Asn, Asparagin; P, Pro, Prolin; Q, Gln, Glutamin; R, Arg, Arginin; S, Ser, Serin; T, Thr, Threonin; V, Val, Valin; W, Trp, Tryptophan; X, Hyp, Hydroxyprolin; Y, Tyr, Tyrosin.
II. Struktur der Polymergruppe
In einer Ausführungsform enthalten Transportpolymere gemäß der vorliegenden Erfindung Polymere mit kurzer Länge von 6 bis zu 25 Untereinheiten, wie oben beschrieben. Das Konjugat ist wirkungsvoll, um die Transportrate des Konjugats durch die biologische Membran relativ zur Transportrate des nicht-konjugierten biologischen Mittels alleine zu erhöhen. Wenngleich beispielhafte Polymerzusammensetzungen Peptide sind, enthalten Polymere der Erfindung Nicht-Peptidgrundgerüste, wie weiter unten definiert.
In einer wichtigen Hinsicht der Erfindung sind die Konjugate der Erfindung besonders geeignet zum Transportieren biologisch aktiver Mittel durch Zell- oder Organellenmembranen, wenn die Mittel des Typs sind, der Transmembrantransport erfordert, um ihre biologischen Wirkungen zu zeigen und welche ihre biologischen Wirkungen nicht primär durch Binden an einen Oberflächenrezeptor zeigen, d. h. sodass kein Eintritt des Mittels auftritt. Darüber hinaus sind die Konjugate besonders geeignet zum Transportieren biologisch aktiver Mittel des Typs, die Transmembrantransport erfordern, um ihre biologischen Wirkungen zu zeigen, und die an sich selbst (ohne Konjugation an ein Transportpolymer oder eine andere Modifikation) nicht in der Lage sind oder nur geringfügig in der Lage sind, in Zellen einzutreten, um biologische Aktivität zu manifestieren.
Als allgemeine Regel umfasst das Transportpolymer, das in dem Konjugat verwendet wird, vorzugsweise ein lineares Grundgerüst von Untereinheiten. Das Grundgerüst wird üblicherweise Heteroatome umfassen, ausgewählt aus Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel und Phosphor, wobei die Hauptmenge der Grundgerüstkettenatome im Allgemeinen aus Kohlenstoff besteht. Jede Untereinheit enthält einen Seitenkettenrest, der eine terminale Guanidino- oder Amidinogruppe umfasst.
Wenngleich der Abstand zwischen benachbarten Seitenkettengruppen im Allgemeinen von Untereinheit zu Untereinheit konsistent sein wird, können die Polymere, die in der Erfindung verwendet werden auch einen variablen Abstand zwischen Seitenkettengruppen entlang des Grundgerüsts aufweisen.
Die Seitenkettengruppen erstrecken sich vom Grundgerüst derart, dass das zentrale Guanidino- oder Amidinokohlenstoffatom (an welches die NH₂-Gruppen gebunden sind) mit dem Grundgerüst verknüpft ist durch einen Seitenkettenlinker, der vorzugsweise mindestens 2 Linkerkettenatome, bevorzugter von 2 bis 5 Kettenatome enthält, sodass das zentrale Kohlenstoffatom in Entfernung vom Grundgerüst das dritte bis sechste Kettenatom ist. Die Kettenatome werden vorzugsweise bereitgestellt als Methylenkohlenstoffatome, wenngleich ein oder mehrere andere Atome, wie etwa Sauerstoff, Schwefel oder Stickstoff, ebenfalls vorliegen können. Vorzugsweise ist der Seitenkettenlinker zwischen dem Grundgerüst und dem zentralen Kohlenstoffatom der Guanidino- oder Amidinogruppe vier Kettenatome lang, wie beispielsweise eine Argininseitenkette.
Die Transportpolymersequenz der Erfindung kann flankiert sein durch ein oder mehrere Nicht-Guanidino/Nicht-Amidino-Untereinheiten oder einen Linker, wie etwa eine Aminocapronsäuregruppe, welche die Rate des Membrantransports des entsprechenden Polymer-enthaltenden Konjugats nicht wesentlich nachteilig beeinflussen, wie etwa Glycin, Alanin und Cystein z. B. Ebenfalls kann jede freie Amino-terminale Gruppe mit einer Blockierungsgruppe gecappt sein, wie etwa einer Acetyl- oder Benzylgruppe, um Verallgegenwärtigung in vivo zu vermeiden.
Das zu transportierende Mittel kann an das Transportpolymer entsprechend einer Anzahl von Ausführungsformen gebunden sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Mittel an ein einzelnes Transportpolymer gebunden, entweder über eine Bindung an ein terminales Ende des Transportpolymers oder an eine interne Untereinheit innerhalb des Polymers über eine geeignete Verknüpfungsgruppe.
In einer zweiten Ausführungsform ist das Mittel an mehr als ein Polymer gebunden, auf dieselbe Art wie oben. Diese Ausführungsform ist etwas weniger bevorzugt, da sie zum Quervernetzen benachbarter Zellen führen kann.
In einer dritten Ausführungsform enthält das Konjugat zwei Mittelgruppen, die an jedes terminale Ende des Polymers gebunden sind. Für diese Ausführungsform ist es bevorzugt, dass das Mittel ein Molekulargewicht von weniger als 10 kDa aufweist.
Im Hinblick auf die ersten und dritten Ausführungsformen, die gerade genannt wurden, ist das Mittel im Allgemeinen nicht an eine der Guanidino- oder Amidinoseitenketten gebunden, sodass sie frei sind, um mit der Zielmembran zu Wechselwirken.
Die Konjugate der Erfindung können hergestellt werden durch einfache Syntheseschemata. Darüber hinaus sind die Konjugatprodukte üblicherweise im Wesentlichen homogen in Bezug auf Länge und Zusammensetzung, sodass sie eine größere Konsistenz und Reproduzierbarkeit in ihren Wirkungen bereitstellen als heterogene Gemische.
Gemäß einem wichtigen Aspekt der vorliegenden Erfindung wurde von den Anmeldern gefunden, dass die Bindung eines einzelnen Transportpolymers an eines aus einer Vielzahl von Typen biologisch aktiver Mittel ausreichend ist, um wesentlich die Aufnahmerate eines Mittels durch biologische Membranen zu erhöhen, selbst ohne das Erfordernis des Vorliegens einer großen hydrophoben Gruppe in dem Konjugat. Tatsächlich kann das Binden einer großen hydrophoben Gruppe wesentlich Kreuzmembrantransport erschweren oder verhindern, aufgrund von Adhäsion der hydrophoben Gruppe an die Lipiddoppelschicht. Demgemäß umfasst die vorliegende Erfindung Konjugate, die keine großen hydrophoben Gruppen enthalten, wie etwa Lipid- und Fettsäuremoleküle. In einer anderen Ausführungsform wird das Verfahren verwendet, um einen Nicht-Zentralnervensystemzustand (Nicht-ZNS-Zustand) in einem Individuum zu behandeln, das keine Zuführung durch die Blut-Hirn-Barriere erfordert.
A. Polymerkomponenten
Aminosäuren. In einer Ausführungsform besteht das Transportpolymer aus D- oder L-Aminosäuregruppen. Die Verwendung natürlich auftretender L-Aminosäurereste in den Transportpolymeren hat den Vorteil, dass Zerfalls-Produkte relativ nicht toxisch für die Zelle oder den Organismus sein sollten.
Im Allgemeineren ist es bevorzugt, dass jede Polymeruntereinheit eine hoch basische Seitenkettengruppe enthält, die in (i) einen pKa von größer als 11, bevorzugter 12,5 oder größer aufweist und (ii) in ihrem protonierten Zustand mindestens zwei geminale Aminogruppen (NH₂) enthält, die eine Resonanzstabilisierte positive Ladung teilen, welche dem Rest einen zweizähnigen Charakter geben.
D-Aminosäuren können auch in den Transportpolymeren verwendet werden. Zusammensetzungen, die ausschließlich D-Aminosäuren enthalten, haben den Vorteil, eines verringerten enzymatischen Abbaus. Jedoch können sie auch weitgehend intakt innerhalb der Zielzelle bleiben. Eine derartige Stabilität ist im Allgemeinen nicht problematisch falls das Mittel biologisch aktiv ist, wenn das Polymer immer noch gebunden ist. Für Mittel, die in Konjugatform inaktiv sind, sollte ein Linker innerhalb des Konjugats enthalten sein, der an der Wirkstelle spaltbar ist (z. B. durch Enyzm- oder Lösungsmittel-vermittelte Spaltung innerhalb einer Zelle), um Freisetzung des Mittels in Zellen oder Orgenellen zu fördern.
Andere Untereinheiten. Untereinheiten, die von Aminosäuren verschieden sind, können ebenfalls ausgewählt werden zur Verwendung bei der Bildung von Transportpolymeren. Derartige Untereinheiten können, ohne darauf begrenzt zu sein, Hydroxyaminosäuren, N-Methylaminosäuren, Aminoaldehyde und dgl. umfassen, welche zu Polymeren mit verringerten Peptidbindungen führen. Andere Untereinheitstypen können verwendet werden in Abhängigkeit von der Natur des ausgewählten Grundgerüsts, wie im nächsten Abschnitt diskutiert.
B. Grundgerüststyp
Eine Vielzahl von Grundgerüsttypen kann verwendet werden, um die Seitenkettenguanidino- und/oder Amidinogruppen anzuordnen und zu positionieren, wie etwa Alkylgrundgerüstgruppen, die verbunden sind durch Thioether- oder Sulfonylgruppen, Hydroxysäureester (äquivalent zum Ersatz von Amidbindungen durch Esterbindungen), Ersetzen des alpha-Kohlenstoffs durch Stickstoff, um ein Aza-analoges zu bilden, Alkylgrundgerüstgruppen, die durch Carbamatgruppen verbunden sind, Polyethylenimine (PEIs) und Aminoaldehyde, welche zu Polymeren führen, die aus sekundären Aminen aufgebaut sind.
Eine detaillierte Grundgerüstliste umfasst N-substituiertes Amid (CONR ersetzt CONH-Bindungen), Ester (CO₂), Ketomethylen (COCH₂) reduziert oder Methylenamino (CH₂NH), Thioamid (CSNH), Phosphinat (PO₂RCH₂), Phosphonamidat und Phosphonamidatester (PO₂RNH), Retropeptid (NHCO), trans-Alken (CR=CH), Fluoralken (CF=CH), Dimethylen (CH₂CH₂), Thioether (CH₂S), Hydroxyethylen (CH(OH)CH₂), Methylenoxy (CH₂O), Tetrazol (CN₄), Retrothioamid (NHCS), retroreduziertes (NHCH₂), Sulfonamido (SO₂NH), Methylensulfonamido (CHRSO₂NH), Retrosulfonamid (NHSO₂) und Peptoide (N-substituierte Glycine) und Grundgerüste mit Malonat- und/oder gem-Diaminoalkyluntereinheiten, z. B. in der Übersicht von Fletcher et al. (1998) dargestellt und detailliert ausgeführt durch darin zitierte Literaturstellen. Peptoidgrundgerüste (N-substituierte Glycine) können ebenfalls verwendet werden (z. B. Kessler, 1993; Zuckermann et al., 1992; und Simon et al., 1992). Viele der vorstehenden Substitutionen führen zu ungefähr isosteren Polymergrundgerüsten relativ zu Grundgerüsten, die aus α-Aminosäuren gebildet werden.
Studien, die zur Unterstützung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, verwendeten Polypeptide (z. B. Peptidgrundgerüste). Jedoch Nicht-Peptidgrundgerüste der Erfindung, wie etwa diejenigen, die oben beschrieben sind, können verbesserte biologische Stabilität bereitstellen (z. B. Resistenz gegenüber enzymatischem Abbau in vivo).
c. Synthese von polymeren Transportmolekülen
Polymere werden durch ein Verfahren nach dem Stand der Technik aufgebaut.
III. Bindung von Transportpolymeren an biologisch aktive Mittel
Transportpolymere der vorliegenden Erfindung können kovalent an biologisch aktive Mittel durch chemische Verfahren gebunden werden.
A. Chemische Verknüpfungen
Biologisch aktive Mittel, wie etwa kleine organische Moleküle und Makromoleküle, können an Transportpolymere der Erfindung über eine Vielzahl von Verfahren gebunden werden, die in der Technik bekannt sind (siehe z. B. Wong, 1991), entweder direkt (z. B. mit einem Carbodiimid) oder über eine verbindende Gruppe. Im Besonderen sind Carbamat-, Ester-, Thioether-, Disulfid- und Hydrazonbindungen im Allgemeinen leicht zu bilden und für die meisten Anwendungen geeignet. Ester- und Disulfidbindungen sind bevorzugt falls die Bindung gleich in dem Cytosol nach Transport der Substanz durch die Zellmembran abbaubar sein sollen.
Verschiedene funktionelle Gruppen (Hydroxyl, Amino, Halogen usw.) können verwendet werden, um das biologisch aktive Mittel an das Transportpolymer zu binden. Gruppen, von denen nicht bekannt sind, dass sie ein Teil einer aktiven Stelle des biologisch aktiven Mittels sind, sind bevorzugt, im Besonderen wenn das Polypeptid oder ein Teil davon auf der Substanz nach Zuführung verbleiben soll.
Polymere, wie etwa Peptide, die gemäß Beispiel 1 hergestellt sind, werden im Allgemeinen mit einer Amino-terminalen Schutzgruppe erzeugt, wie etwa FMOC. Für biologisch aktive Mittel, die die Bedingungen überstehen können, welche verwendet werden, um das Polypeptid von dem Syntheseharz abzuspalten und zum Entschützen der Seitenketten, kann das FMOC von dem N-Terminus des vollständigen Harz-gebundenen Polypeptids abgespalten werden, sodass das Mittel an das freie N-terminale Amin gebunden werden kann. In solchen Fällen wird das zu bindende Mittel typischerweise durch Verfahren aktiviert, die in der Technik allgemein dafür bekannt sind, dass sie eine aktive Ester- oder aktive Carbonatgruppe erzeugen, die wirkungsvoll ist, um eine Amid- bzw. Carbamatbindung mit der Polymeraminogruppe zu bilden. Natürlich kann auch eine andere Verknüpfungschemie verwendet werden.
Um dabei zu helfen Nebenreaktionen zu minimieren, können Guanidino- und Amidinogruppen blockiert werden unter Verwendung herkömmlicher Schutzgruppen, wie etwa Carbobenzyloxygruppen (CBZ), di-t-BOC, PMC, Pbf, N-NO₂ und dgl.
Kopplungsreaktionen werden durchgeführt durch bekannte Kopplungsverfahren in einer beliebigen Reihe von Lösungsmitteln, wie etwa N,N-Dimethylformamid (DMF), N-Methylpyrrolidinon, Dichlormethan, Wasser und dgl. Beispielhafte Kopplungsreagenzien umfassen O-Benzotriazolyloxytetramethyluroniumhexafluorphosphat (HATU), Dicyclohexylcarbodiimid, Brom-tris(pyrrolidino)phosphoniumbromid (PyBroP), usw. Andere Reagenzien können enthalten sein, wie etwa N,N-Dimethylaminopyridin (DMAP), 4-Pyrrolidinopyridin, N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxybenzotriazol und dgl.
Für biologisch aktive Mittel, die inaktiv sind bis das gebundene Transportpolymer freigesetzt wird, ist der Linker vorzugsweise ein leicht spaltbarer bzw. abspaltbarer Linker, was bedeutet, dass er für enzymatische oder Lösungsmittelvermittelte Spaltung in vivo zugänglich ist. Für diesen Zweck sind Linker, die Carbonsäureester- und Disulfidbindungen enthalten, bevorzugt, worin die ersteren Gruppen enzymatisch oder chemisch hydrolysiert werden und die letzteren durch Disulfidaustausch, z. B. in der Gegenwart von Glutathion, abgetrennt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der spaltbare Linker eine erste spaltbare Gruppe, die distal zu dem Mittel ist, und eine zweite spaltbare Gruppe, die proximal zu dem Mittel ist, sodass Spaltung der ersten spaltbaren Gruppe zu einem Linker-Mittel-Konjugat führt, das eine nukleophile Gruppe aufweist, welche in der Lage ist, zum intramolekularen Reagieren, um die zweite spaltbare Gruppe zu spalten, wobei das Mittel von dem Linker und dem Polymer freigesetzt wird. Diese Ausführungsform wird weiter veranschaulicht durch die verschiedenen kleinen Molekülkonjugate, die unten diskutiert werden.
IV. Erhöhter Transport biologisch aktiver Mittel durch biologische Membranen
A. Messen des Transports durch biologische Membranen
Modellsysteme zum Beurteilen der Fähigkeit von Polymeren der Erfindung zum Transport von Biomolekülen und anderen therapeutischen Substanzen durch biologischen Membranen umfassen Systeme, die die Fähigkeit des Polymers zum Transport eines kovalent gebundenen fluoreszenten Moleküls durch die Membran messen. Zum Beispiel kann Fluorescein (≈ 376 MG) als ein Modell für den Transport kleiner organischer Moleküle dienen (Beispiel 2). Für den Transport von Makromolekülen kann ein Transportpolymer mit einem großen Polypeptid vereinigt werden, wie etwa mit Ovalbumin (Molekulargewicht 45 kDa; z. B. Beispiel 14). Der Nachweis der Aufnahme von Makromolekülen kann erleichtert werden durch Binden eines fluoreszenten tag. Zelluläre Aufnahme kann auch durch konfokale Mikroskopie analysiert werden (Beispiel 4).
B. Erhöhter Transport durch biologische Membranen
In Versuchen, die mit Unterstützung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, wurden Transmembrantransport und begleitende zelluläre Aufnahme beurteilt durch Aufnahme eines Transportpeptids, das an Fluorescein gebunden ist, gemäß den Verfahren, die in den Beispielen 2 und 3 beschrieben sind. Kurz dargestellt bedeutet dies, dass Suspensionen von Zellen mit fluoreszenten Konjugaten inkubiert, suspendiert in Puffer für verschiedene Zeiten bei 37°C, 23 °C oder 3°C wurden. Nach Inkubation wurde die Reaktion gestoppt und die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und auf Fluoreszenz analysiert unter Verwendung von Fluoreszenz-aktivierter Zellsanalyse (FACS).
Unter den verwendeten Bedingungen war die zelluläre Aufnahme der Konjugate nicht befriedigend. Folglich konnten für die Peptide keine ED₅₀-Werte berechnet werden. Anstelle dessen werden Daten als Histogramme angegeben, um direkte Vergleiche der zellulären Aufnahme bei einzelnen Konjugatkonzentrationen zu erlauben.
Die 1A–1C zeigen Ergebnisse einer Studie, worin Polymere von L-Arginin (R; 1A) oder D-Arginin (r; 1B) im Längenbereich von 4 bis 9 Argininuntereinheiten auf ihre Fähigkeit zum Transport von Fluorescein in Jurkat-Zellen getestet wurden. Zum Vergleich wurde das Ausmaß des Transports für HIV-tat-Gruppen 49–57 ("49–57") und ein Nonamer von L-Lysin (K9) ebenfalls getestet. 1C zeigt ein Histogramm des Aufnahmegrads für die Konjugate bei einer Konzentration von 12,5 μM.
Wie in den Figuren gezeigt, traten Fluoreszenz-markierte Peptidpolymere, die aus 6 oder mehr Argininresten bestanden, in Zellen wirkungsvoller ein als die tat-Sequenz 49–57. Im Besonderen wurde die Aufnahme auf mindestens das zweifache des Aufnahmegrads von tat 49–57 verstärkt und war so hoch wie etwa das 6- bis 7-fache des Aufnahmegrads von tat 49–57. Die Aufnahme von Fluorescein alleine war vernachlässigbar. Ebenfalls zeigte das Lysinnonamer (K9) sehr geringe Aufnahme, wodurch angezeigt wurde, dass kurze Lysinpolymere als Transmembrantransportmittel im Gegensatz zu Guanidin-enthaltenden Polymeren mit vergleichbarer Länge ineffektiv sind.
Unter Bezugnahme auf 1B zeigten Homopolymere von D-Arginin sogar größere Transportaktivität als die L-Gegenstücke. Jedoch war die Größenordnung der Aufnahmegrade etwa die gleiche. Für die D-Homopolymere zeigten die Peptide mit 7 bis 9 Argininen ungefähr gleiche Aktivität. Das Hexamer (R6 oder r6) war etwas weniger wirkungsvoll, zeigte jedoch immer noch mindestens etwa 2- bis 3-fach höhere Transportaktivität als tat(49–57).
Die Fähigkeit des D- und L-Argininpolymers zum Erhöhen des Transmembrantransports wurde bestätigt durch konfokale Mikroskopie ( 2A–2F und Beispiel 4). Übereinstimmend mit den oben beschriebenen FACS-Daten, war das Cytosol von Zellen, die inkubiert waren mit entweder R9 ( 2B und 2E) oder r9 (2C und 2F) hell fluoreszierend, wodurch hohe Grade Konjugattransport in die Zellen angezeigt wird. Im Gegensatz hierzu zeigte tat(49– 57) bei der gleichen Konzentration nur schwache Färbung (2A und 2D). Die konfokalen Mikrografien heben auch den Punkt hervor, dass das D-Argininpolymer (2C) wirkungsvoller beim Eintritt in Zellen war als das Polymer, das aus L-Arginin aufgebaut war (2F).
Aus dem vorhergehenden ist ersichtlich, dass Transportpolymere der Erfindung deutlich irkungsvoller sind als HIV-tat-Peptid 47–59 beim Transportieren von Arzneimitteln durch die Plasmamebranen von Zellen. Darüber hinaus war das Poly-Lys-Nonamer ineffektiv als ein Transportmittel.
Zum Bestimmen, ob eine optimale Länge für benachbartes Guanidinium enthaltende Homopolymere vorlag, wurde ein Satz langer Argininhomopolymerkonjugate (R15, R20, R25 und R30) untersucht. Zum Untersuchen der Wirkung von wesentlich längeren Polymeren wurde auch ein Gemisch von L-Argininpolymeren mit einem mittleren Molekulargewicht von 12.000 Dalton (≈ 100 Aminosäuren) getestet (Beispiel 5). Jedoch musste zur Vermeidung von Präzipitationsproblemen der Serumgehalt in dem Assay zum Testen der Konjugate mit dem ≈ 12.000 MG-Polymermaterial verringert werden. Die Zellaufnahme wurde durch FACS wie oben analysiert und die mittlere Fluoreszenz lebender Zellen wurde gemessen. Die Cytotoxizität jedes Konjugats wurde ebenfalls gemessen.
Unter Bezugnahme auf 3 zeigte die Aufnahme von L-Argininhomopolymerkonjugaten mit 15 oder mehr Arginen Muster der zellulären Aufnahme, die deutlich verschieden waren von Polymeren, die neun Arginine oder mehr enthalten. Die Kurven der längeren Konjugate waren flacher, wobei sie diejenigen der R9- und r9-Konjugate kreuzten. Bei höheren Konzentrationen (> 3 μM) war die Aufnahme von R9 und r9 deutlich besser als für die längeren Polymere. Jedoch bei geringeren Konzentrationen zeigten Zellen, die mit den längeren Peptiden inkubiert waren, stärkere Fluoreszenz.
Basierend auf diesen Daten erscheint es, dass r9 und R9 in die Zellen mit höheren Raten eintreten als Polymere, die 15 oder mehr benachbarte Arginine enthalten. Jedoch die biologische Halbwertszeit von R9 (L-Peptid) war geringer als die für die längeren Konjugate, vermutlich aufgrund dessen, dass Proteolyse der längeren Peptide (aufgrund von Serumenzymen) Fragmente erzeugt, die Transportaktivität beibehalten. Im Gegensatz hierzu zeigte das D-Isomer (r9) keinen Hinweis auf proteolytischen Abbau, was übereinstimmend mit der hohen Spezifität von Serumproteasen für L-Peptide ist.
Daher scheint die Gesamttransporteffizienz eines Transportpolymers abhängig zu sein von einer Kombination von (i) der Rate der Transportmembranaufnahme (Polymer mit weniger als etwa 15 benachbarten Argininen sind besser) gegenüber der Zugänglichkeit für proteolytische Inaktivierung (längere Polymere sind besser). Demgemäß sind Polymere, die 7 bis 20 benachbarte Guanidiniumreste und vorzugsweise 7 bis 15 enthalten, bevorzugt.
Vor allem zeigte das Polyargininkonjugat mit hohem Molekulargewicht (12.000 MG) keine nachweisbare Aufnahme. Dieses Ergebnis ist übereinstimmend mit den Beobachtungen von Barsoum et al. (1994) und legt nahe, dass Argininpolymere Transporteigenschaften aufweisen, die deutlich verschieden von denjenigen sind, die durch Lysinpolymere gezeigt werden können. Darüber hinaus erwies sich das Polyargininkonjugat als stark toxisch (Beispiel 5). Im Allgemeinen erhöhte sich die Toxizität der Polymere mit der Länge, sodass nur das Konjugat mit einem MG von 12.000 hohe Toxizität bei allen getesteten Konzentrationen zeigte.
Wenn die zelluläre Aufnahme von Polymeren von D- und L-Arginin durch Michaelis-Menten-Kinetiken (Beispiel 6) analysiert wurde, war die Aufnahmerate durch Jurkat-Zellen so wirkungsvoll, dass präzise K_m-Werte nur erhalten werden konnten, wenn die Assays bei 3°C (auf Eis) durchgeführt wurden. Sowohl die maximale Transportrate (V_max) als auch die scheinbare Affinität der Peptide für den mutmaßlichen Rezeptor der Michaelis-Konstante (Km) wurden erhalten aus Lineweaver-Burk-Plots der beobachteten Fluoreszenz von Jurkat-Zellen nach Inkubation mit variierenden Konzentrationen von Nonameren von D- und L-Arginin für 30, 60, 120 und 240 Sekunden.
Kinetikanalysen zeigten auch, dass Arginin-reiche Polymere eine bessere Fähigkeit aufweisen zum Binden an und Durchtreten durch eine mutmaßliche zelluläre Transportstelle als z. B. das tat(49–57)-Peptid, da die K_m für Transport des nonameren Poly-L-Arginins (44 μM) wesentlich geringer war als die K_m des tat-Peptids (722 μM). Darüber hinaus zeigte das Nonamer von D-Arginin die kleinste K_m (7 μM) der in diesem Assay getesteten Polymere (Tabelle 1), d. h. eine ungefähr 100-fach höhere scheinbare Affinität. Entsprechend einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung hat das Transportpolymer der Erfindung eine scheinbare Affinität (K_m), die mindestens 10-mal größer ist und vorzugsweise mindestens 100-mal größer ist als die Affinität, die für tat durch das Verfahren von Beispiel 6 gemessen wird, wenn bei Raumtemperatur (23°C) oder 37°C gemessen wird.
Tabelle 1
Versuche, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, zeigten, dass Polymer-erleichterter Transport abhängig ist von der metabolen Integrität von Zellen. Die Zugabe einer toxischen Menge Natriumazid (0,5% Gew./V) zu Zellen führte zur Inhibierung der Aufnahme von Konjugaten um etwa 90% (Beispiel 7). Die in 4 gezeigten Ergebnisse zeigen (i) Natriumazidempfindlichkeit des Transmembrantransports, wodurch Energieabhängigkeit (zelluläre Aufnahme) nahegelegt wird, und (ii) die Überlegenheit von Polyguanidiniumpolymeren der Erfindung (R9, R8, R7) relativ zu HIV tat(49–57).
Ohne sich auf eine spezielle Theorie festzulegen, legen die Daten nahe, dass das Transportverfahren ein energieabhängiger Prozess ist, der durch spezifische Erkennung von Guanidinium- oder Amidinium-enthaltenden Polymeren durch ein Molekültransportmittel, das in zellulären Plasmamebranen vorliegt, vermittelt wird.
Andere Versuche in Zusammenhang mit der Erfindung haben gezeigt, dass die Konjugate der Erfindung effektiv sind zum Transport biologisch aktiver Mittel durch Membranen einer Vielzahl von Zelltypen, einschließlich humane T-Zellen (Jurkat), B-Zellen (Maus CH27), Lymphom-T-Zellen (Maus-EL4), Mastocytomzellen (Maus P388), mehrere Maus-T-Zell-Hybridome, neuronale Zellen (PC-12), Fibroblasten (Maus RT), Nierenzellen (Maus-HELA), Myeloblastome (Maus K562); und primäre Gewebezellen, einschließlich aller humaner Blutzellen (ausgenommen rote Blutzellen), wie etwa T- und B-Lymphozyten, Makrophagen, dendritische Zellen und Eiosinophile; Basophile, Mastzellen, endotheliale Zellen, Herzgewebezellen, Leberzellen, Milzzellen, Lymphknotenzellen und Keratinocyten.
Die Konjugate sind ebenfalls wirkungsvoll zum Durchqueren von sowohl gramnegativen als auch gram-positiven Bakterienzellen, wie in Beispiel 8 und in den 5A–5C offenbart. Im Allgemeinen erwiesen sich Polymere von D-Argininuntereinheiten dahingehend, dass sie sowohl in gram-positive als auch gram-negative Bakterien mit Raten eintraten, die deutlich schneller sind als die Transportraten, die für Polymere von L-Arginin beobachtet werden. Dies ist durch 5A dargestellt, welche viel höhere Aufnahmegrade für r9-Konjugat (D-Arginine) zeigt als für R9-Konjugat (L-Arginine), bei Inkubation mit E. coli HB 101 (prokariontisch) Zellen. Diese Beobachtung kann dem proteolytischen Abbau der L-Polymere durch Bakterienenzyme zuzuschreiben sein.
5B zeigt Aufnahmegrade für D-Argininkonjugate als eine Funktion der Länge (r4 bis r9) im Vergleich mit einem Poly-L-Lysinkonjugat (K9), bei Inkubation mit E. Coli HB 101-Zellen. Wie ersichtlich ist, zeigten die Polyargininkonjugate einen Trend, der ähnlich demjenigen ist, der in 2B mit eukaryontischen Zellen beobachtet wurde, sodass Polymere, die kürzer als r6 sind, geringe Aufnahmegrade zeigten, mit Aufnahmegraden, die als eine Funktion der Länge anstiegen.
Gram-positive Bakterien, wie beispielsweise durch Sfrep. bovis dargestellt, wurden ebenfalls wirkungsvoll mit Polymeren von Arginin, jedoch nicht Lysin, wie in 5C gezeigt, angefärbt.
Im Allgemeineren wurden maximale Aufnahmegrade durch die Bakterien bei 37 °C beobachtet. Jedoch wurde deutliches Färben beobachtet, wenn die Inkubation entweder bei Raumtemperatur oder bei 3°C durchgeführt wurde. Konfokale Mikroskopie zeigte, dass Vorbehandlung der Bakterien mit 0,5% Natriumazid den Transport durch die inneren Plasmamebranen von sowohl gram-positiven als auch gram-negativen Bakterien inhibierte, jedoch nicht den Transport durch die Zellwand (gram-positive Bakterien) in den periplasmatischen Raum.
Daher umfasst die Erfindung Konjugate, die antimikrobielle Mittel enthalten, wie etwa antimikrobielle und Antipilzmittel, zur Verwendung bei der Vorbeugung vor oder Inhibierung von mikrobieller Proliferation oder Infektion und zum Desinfizieren von Oberflächen, um die medizinische Sicherheit zu verbessern. Zusätzlich kann die Erfindung für den Transport in Pflanzenzellen, insbesondere in grünblättrige Pflanzen, verwendet werden.
Zusätzliche Studien im Zusammenhang mit der Erfindung zeigten, dass Translokation durch Bakterienmembranen sowohl Energie- als auch Temperaturabhängig ist, was übereinstimmend mit der Beobachtung ist, die früher für andere Zelltypen gemacht wurde.
V. Therapeutische Zusammensetzungen
A. Kleine organische Moleküle
Therapeutische Mittel aus kleinen organischen Molekülen können vorteilhaft an lineare polymere Zusammensetzungen, wie hier beschrieben, gebunden werden, um einen Transport durch biologische Membranen zu erleichtern oder zu erhöhen. Zum Beispiel kann die Zuführung von hochgeladenen Mitteln, wie etwa Levodopa (L-3,4-Dihydroxyphenylalanin; L-DOPA) vorteilhaft sein durch Binden an polymere Transportmoleküle, wie hier beschrieben. Peptoide- und peptidomimetische Mittel sind ebenfalls vorgesehen (z. B. Langston, 1997; Giannis et al., 1997). Ebenfalls ist die Erfindung vorteilhaft zum Zuführen kleiner organischer Moleküle, die geringe Löslichkeit in wässrigen Flüssigkeiten aufweisen, wie etwa Serum oder wässrige Salzlösungen. So können Verbindungen, deren therapeutische Wiksamkeiten durch ihre geringen Löslichkeiten begrenzt sind, in größeren Dosen gemäß der vorliegenden Erfindung verabreicht werden, und können wirkungsvoller auf einer molaren Basis in Konjugatform sein, relativ zur Nicht-Konjugatform aufgrund höherer Aufnahmegrade durch Zellen.
Da ein wesentlicher Teil der topologischen Oberfläche eines kleinen Moleküls häufig umfasst ist und daher erforderlich ist für biologische Aktivität, kann es notwendig sein, dass der kleine Molekülteil des Konjugats in besonderen Fällen von dem gebundenen Transportpolymer und der Linkergruppe (falls überhaupt vorliegend) für das kleine Molekülmittel getrennt werden muss, um biologische Wirkung nach Durchqueren der biologischen Zielmembran zu zeigen. Für solche Fälle umfasst das Konjugat vorzugsweise einen spaltbaren Linker zum Freisetzen von Arzneimitteln nach dem Durchtreten durch eine biologische Membran.
In einer Annäherung kann das Konjugat eine Disulfidbindung umfassen, wie in 6A dargestellt, welche ein Konjugat (1) zeigt, das ein Transportpolymer T enthält, welches an ein cytotoxisches Mittel, 6-Mercaptopurin, durch eine N-Acetyl-geschützte Cysteingruppe gebunden ist, die als ein Linker dient. So ist das cytotoxische Mittel durch eine Disulfidbindung an die 6-Mercaptogruppe gebunden und das Transportpolymer ist an die Cysteincarbonylgruppe über eine Amidbindung gebunden. Spaltung der Disulfidbindung durch Reduktion oder Disulfidaustausch führt zur Freisetzung des freien cytotoxischen Mittels.
Ein Verfahrne zum Synthetisieren eines Disulfid-enthaltenden Konjugats wird in Beispiel 9A bereitgestellt. Das Produkt enthält ein Heptamer von Arg-Resten, welches an 6-Mercaptopurin durch einen N-Acetyl-Cys-Ala-Ala-Linker gebunden ist, worin die Ala-Reste als ein zusätzlicher Spacer aufgenommen sind, um das Disulfid zugänglicher für Thiole und Reduktionsmittel zur Spaltung innerhalb einer Zelle zu machen. Der Linker in diesem Beispiel zeigt auch die Verwendung von Amidbindungen, welche enzymatisch innerhalb einer Zelle gespalten werden können.
In einer anderen Annäherung umfasst das Konjugat einen fotospaltbaren Linker, welcher bei Behandlung mit elektromagnetischer Strahlung gespalten wird. Eine beispielhafte Bindung ist in 6B dargestellt, welche ein Konjugat (II) zeigt, die ein Transportpolymer T enthält, das an 6-Mercaptopurin über eine meta-Nitrobenzoatlinkergruppe gebunden ist. Polymer T ist an die Ntrobenzoatgruppe durch eine Amidbindung zur Benzoatcarbonylgruppe gebunden und das cytotoxische Mittel ist über seine 6-Mercaptogruppe an die p-Methylengruppe gebunden. Die Verbindung kann gebildet werden durch Umsetzen von 6-Mercaptopurin mit p-Brommethyl-m-nitrobenzoesäure in der Gegenwart von NaOCH₃/Methanol unter Erhitzen, gefolgt durch Koppeln der Benzoatcarbonsäure an ein Transportpolymer wie etwa die Aminogruppe eines γ-Aminobuttersäurelinkers, der an das Polymer gebunden ist (Beispiel 9B). Fotoilluminierung des Konjugats bewirkt Freisetzung des 6-Mercaptopurins aufgrund der Nitrogruppe, die ortho zu dem Mercaptomethylrest ist. Dieser Ansatz findet Anwendung in Fototherapieverfahren, die in der Technik bekannt sind, insbesondere zum Lokalisieren von Arzneimittelaktivierung in einem ausgewählten Bereichs des Körpers.
Vorzugsweise enthält der spaltbare Linker erste und zweite spaltbare Gruppen, die zusammenwirken können, um das Polymer von dem biologisch wirksamen Mittel abzuspalten, wie durch die folgenden Ansätze veranschaulicht. Das heißt der spaltbare Linker enthält eine erste spaltbare Gruppe, die distal zu dem Mittel ist und eine zweite spaltbare Gruppe, die proximal zum Mittel ist, sodass die Spaltung der ersten spaltbaren Gruppe ein Linkermittel-Konjugat ergibt, das einen nukleophilen Rest enthält, der in der Lage ist zum intramolekularen Reagieren, um die zweite spaltbare Gruppe zu spalten, wobei das Mittel von dem Linker und dem Polymer freigesetzt wird.
6C zeigt ein Konjugat (III), das ein Transportpolymer T enthält, das mit dem Antikrebsmittel 5-Fluoruracil (5FU) verbunden ist. Hier wird die Bindung bereitgestellt durch eine modifizierte Lysylgruppe. Das Transportpolymer ist an die α-Aminogruppe gebunden und das 5-Fluoruracil ist über das α-Carbonyl gebunden. Die Lysyl-ε-Aminogruppe ist zu einem Carbamatester von o-Hydroxymethylnitrobenzol modifiziert worden, umfassend eine erste fotolabile spaltbare Gruppe in dem Konjugat. Fotoilluminierung trennt die Nitrobenzolgruppe von dem Konjugat, wobei ein Carbamat zurückbleibt, welches sich ebenfalls rasch zersetzt, um die freie ε-Gruppe, ein wirkungsvolles Nukleophil, zu ergeben. Intramolekulare Reaktion der ε-Aminogruppe mit der Amidbindung an die 5-Fluoruracilgruppe führt zur Zyklisierung unter Freisetzung der 5-Fluoruracilgruppe.
6D zeigt ein Konjugat (IV), enthaltend ein Transportpolymer T, das an den 2'-Sauerstoff des Antikrebsmittels, Paclitaxel, gebunden ist. Die Bindung wird bereitgestellt durch eine Linkergruppe, die umfasst (i) ein Stickstoffatom, das an das Transportpolymer gebunden ist, (ii) einen Phosphatmonoester, der para zu dem Stickstoffatom angeordnet ist und (iii) eine Carboxymethylgruppe, die meta zum Stickstoffatom ist, welche mit dem 2'-Sauerstoff von Paclitaxel durch eine Carboxylatesterbindung verbunden ist. Enzymatische Spaltung der Phosphatgruppe von dem Konjugat ergibt eine freie Phenolhydroxylgruppe. Diese nukleophile Gruppe reagiert dann intramolekular mit dem Carboxylatester, um freies Paclitaxel freizusetzen, zum Binden an sein biologisches Ziel. Beispiel 9C beschreibt ein Syntheseprotokoll zum Herstellen dieses Konjugattyps.
6E zeigt eine noch weitere Annäherung, worin ein Transportpolymer an ein biologisch aktives Mittel, z. B. Paclitaxel, durch eine Aminoalkylcarbonsäure gebunden wird. Vorzugsweise wird die Linkeraminogruppe an den Linkercarboxylkohlenstoff durch 3 bis 5 Kettenatome (n = 3 bis 5), vorzugsweise entweder 3 oder 4 Kettenatome, gebunden, welche vorzugsweise als Methylenkohlenstoffe bereitgestellt werden. Wie aus 6E ersichtlich, ist die Linkeraminogruppe an das Transportpolymer durch eine Amidbindung gebunden und ist an die Paclitaxelgruppe durch eine Esterbindung gebunden. Enzymatische Spaltung der Amidbindung setzt das Polymer frei und erzeugt eine freie nukleophile Aminogruppe. Die freie Aminogruppe kann dann intramolekular mit der Estergruppe reagieren, um den Linker von dem Paclitaxel freizusetzen.
6D und 6E sind veranschaulichend für einen anderen Aspekt der Erfindung, umfassend Taxan- und Taxoid-Antikrebskonjugate, welche verbesserte Transmembrantransportraten relativ zu entsprechenden nicht-konjugierten Formen aufweisen. Die Konjugate sind besonders geeignet zum Inhibieren von Wachstum von Krebszellen. Es wird angenommen, dass Taxane und Taxoide ihre Antikrebswirkungen durch Fördern der Polymerisation von Mikrotubuli (und Inhibierung von Depolymerisation) zu einem Ausmaß, das nachteilig für die Zellfunktion ist, wodurch Zellreplikation inhibiert wird und letztendlich Zelltod herbeigeführt wird, manifestieren.
Der Ausdruck "Taxan" betrifft Paclitaxel (6F, R' = Acetyl, R'' = Benzyl), ebenfalls bekannt unter der Marke "TAXOL") und natürlich auftretende synthetische oder biotechnisch entwickelte Analoga, die einen Grundgerüstkern aufweisen, der A-, B-, C- und D-Ringe von Paclitaxel enthält, wie in 6G dargestellt. 6F zeigt auch die Struktur von "TAXOTERETM" (R' = H, R'' = BOC), welches gewissermaßen löslicheres synthetisches Analoges von Paclitaxel ist, vertrieben von Rhone-Poulenc. "Taxoid" betrifft natürlich auftretendes, synthetisches oder biotechnisch entwickelte Analoga von Paclitaxel, die die Basis-A-, B- und C-Ringe von Paclitaxel enthalten, wie in 6A gezeigt. Wesentliche synthetische und biologische Information über die Synthese und Aktivität einer Vielzahl von Taxane- und Taxoid-Verbindungen ist erhältlich, wie in Suffness (1995) in einer Übersicht dargestellt, insbesondere in den Kapiteln 12 bis 14, als auch in der nachfolgenden Paclitaxel-Literatur. Darüber hinaus ist ein Wirt von Zelllinien erhältlich zum Vorhersagen von Antikrebsaktivitäten dieser Verbindung gegen bestimmte Krebstypen, wie z. B. in Suffness in den Kapiteln 8 und 13 beschrieben.
Das Transportpolymer ist konjugiert an die Taxan- oder Taxoidgruppe über eine geeignete Stelle der Bindung in dem Taxan oder Taxoid. Üblicherweise ist das Transportpolymer über ein C2'-Sauerstoff-, C7-Sauerstoffatom gebunden, unter Verwendung von Bindungsstrategien, wie oben beschrieben. Konjugation eines Transportpolymers über einen C7-Sauerstoff führt zu Taxan-Konjugaten, die Antikrebs- und Antitumoraktivität aufweisen, trotz Konjugation an dieser Position. Demgemäß kann der Linker spaltbar oder nicht spaltbar sein. Konjugation über den C2'-Sauerstoff verringert wesentlich die Antikrebsaktivität, sodass ein spaltbarer Linker zur Konjugation an diese Stelle bevorzugt ist. Andere Stellen zur Bindung können ebenfalls verwendet werden, wie etwa C10.
Es wird ersichtlich sein, dass die Taxan- und Taxoid-Konjugate der Erfindung verbesserte Wasserlöslichkeit relativ zu Taxol (≈ 0,25 μg/ml) und Taxotere (6–7 μg/ml) aufweisen. Daher sind keine großen Mengen Solubilisierungsmittel, wie etwa "CREMOPHOR EL" (polyoxyethyliertes Castoröl), Polysorbat 80 (Polyoxyethylensorbitanmonooleat, ebenfalls bekannt als "TWEEN 80") und Ethanol erforderlich, sodass Nebenwirkungen, die typischerweise mit diesen Solubilisierungsmitteln verbunden sind, wie etwa Anaphylaxe, Dyspnoe, Hypotension und Auswaschen (Flushing) verringert werden können.
B. Metalle
Metalle können in eukaryontische und prokaryontische Zellen transportiert werden unter Verwendung von Chelatisierungsmitteln, wie etwa Texaphyrin oder Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA), die konjugiert sind an eine Transportmembran der Erfindung, wie durch Beispiel 10 veranschaulicht. Diese Konjugate sind geeignet zum Zuführen von Metallionen für eine Bilddarstellung oder Therapie. Beispielhafte Metallionen umfassen Eu. Lu, Pr, Gd, Tc99m, Ga67, In111, Y90, Cu67 und Co57. Vorausgehende Membrantransportstudien mit Konjugatkandidaten können durchgeführt werden unter Verwendung von Assays auf Zellbasis, wie etwa in dem unten stehenden Beispielabschnitt beschrieben. Zum Beispiel kann unter Verwendung von Europiumionen die zelluläre Aufnahme durch zeitaufgelöste Fluoreszenzmessungen dargestellt werden. Für Metallionen, die cytotoxisch sind, kann die Aufnahme durch Cytotoxizität beobachtet werden.
C. Markomoleküle
Das verbesserte Transportverfahren der Erfindung ist besonders geeignet zum Erhöhen des Transports durch biologische Membranen für eine Vielzahl von Makromolekülen, einschließlich, ohne darauf begrenzt zu sein, Proteine, Nukleinsäuren, Polysaccharide und Analoga davon. Beispielhafte Nukleinsäuren umfassen Oligonukleotide und Polynukleotide, die aus DNA und RNA gebildet werden, und Analoga davon, welche ausgewählte Sequenzen aufweisen, die zur Hybridisierung an komplementäre Targets (z. B. Antisense-Sequenzen für einzel- und doppelsträngige Zielmoleküle) konstruiert sind, oder zum Exprimieren von Nukleinsäuretranskripten oder Proteinen, die durch die Sequenzen codiert sind. Analoga umfassen geladene und vorzugsweise ungeladene Grundgerüstanaloga, wie etwa Phosphonate (vorzugsweise Methylphosphonate), Phosphoramidate (N3' oder N5'), Thiophosphate, ungeladene Polymere auf Morpholinobasis und Proteinnukleinsäuren (PNAs). Derartige Moleküle können in einer Vielzahl therapeutischer Abläufe verwendet werden, einschließlich z. B. Enzymaustauschtherapie, Gentherapie und Antisense-Therapie.
Zum Beispiel sind Proteinnukleinsäuren (PNA)-Analoga von DNA, worin das Grundgerüst strukturell homomorph mit einem Deoxyribosegrundgerüst ist. Es besteht aus N-(2-Aminoethyl)glycineinheiten, an welche die Nukleobasen gebunden sind. PNAs, die alle vier natürlichen Nukleobasen aufweisen, hybridisieren an komplementäre Oligonukleotide unter Beachtung der Watson-Crick-Basenpaarungsregeln und sind eine tatsächliche DNA-Nachbildung in Bezug auf Basenpaarnachbildung (Egholm et al., 1993). Das Grundgerüst eines PNA wird eher durch Peptidbindungen gebildet als durch Phosphatester, wodurch es gut geeignet für Antisense-Anwendungen wird. Da das Grundgerüst ungeladen ist, zeigen PNA/DNA- oder PNA/RNA-Duplexe, die sich bilden, größere thermische Stabilität als normal. PNAs haben den zusätzlichen Vorteil, dass sie von Nukleasen oder Proteasen nicht erkannt werden. Zusätzlich können PNAs auf einem automatisierten Peptidsynthesizer synthetisiert werden, unter Verwendung von Standard t-Boc-Chemie. Die PNA wird dann an ein Transportpolymer der Erfindung gebunden.
Beispiele von Antisense-Oligonukleotiden, deren Transport in Zellen erhöht werden kann unter Verwendung der Verfahren der Erfindung, sind z. B. beschrieben im U.S. Patent 5,594,122. Derartige Oligonukleotide sind darauf ausgerichtet, den humanen Immunschwächevirus (HIV) zu behandeln. Konjugation eines Transportpolymers an ein Antisense-Oligonukleotid kann bewirkt werden z. B. durch Bilden einer Amidbindung zwischen dem Peptid und dem 5'-Terminus des Oligonukleotids durch einen Succinatlinker gemäß gut etablierter Verfahren. Die Verwendung von PNA-Konjugaten ist weiter in Beispiel 11 veranschaulicht.
7 zeigt Ergebnisse, die mit einem Konjugat der Erfindung erhalten werden, das eine PNA-Sequenz zum Inhibieren der Sezernierung von γ-Interteron (γ-IFN) durch T-Zellen enthält, wie in Beispiel 11 detailliert dargestellt. Wie ersichtlich ist, war das Antisense-PNA-Konjugat wirkungsvoll zum Blockieren der γ-IFN-Sezernierung, worin das Konjugat mit Gehalten von etwa 10 μM vorlag. Im Gegensatz hierzu wurde keine Inhibierung beobachtet mit dem Sense-PNA-Konjugat oder dem nicht konjugierten Antisense-PNA alleine.
Eine andere Klasse von Makromolekülen, die durch biologische Membranen transportiert werden können, wird beispielhaft dargestellt durch Proteine und im Besonderen Enzyme. Therapeutische Proteine umfassen, ohne darauf begrenzt zu sein, Austauschenzyme. Therapeutische Enzyme umfassen, ohne darauf begrenzt zu sein, Alglucerase zur Verwendung bei der Behandlung von lysosomaler Glucocerebrosidasemangelerkrankung (Gaucher's Krankheit), alpha-L-Iduronidase, zur Verwendung bei der Behandlung von Mucopolysaccharidose 1, alpha-N-Acetylglucosamidase, zur Verwendung bei der Behandlung des Sanfilippo B Syndroms, Lipase zur Verwendung bei der Behandlung von Pankreasinsuffizienz, Adenosideaminase, zur Verwendung bei der Behandlung des schweren kombinierten Immundefizienzsyndroms und Triosephosphatisomerase zur Verwendung bei der Behandlung neuromuskulärer Dysfunktion, die mit Triosephoshatisomerasemangel verbunden ist.
Zusätzlich und gemäß einem weiteren wichtigen Aspekt der Erfindung können Proteinantigene dem Cytosolkompartiment von Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) zugeführt werden, worin sie in Peptide abgebaut werden. Die Peptide werden dann in das endoplasmatische Reticulum transportiert, worin sie mit naszierenden HLA-Klasse-1-Molekülen assoziieren und sie werden auf der Zelloberfläche ersichtlich. Derartige "aktivierte" APCs können als Induktoren von Klasse-1-restringierten Antigen-spezifischen cytotoxischen T-Lymphozyten (CTLs) dienen, welche dann fortfahren Zellen zu erkennen und zu zerstören, die das besondere Antigen aufweisen. APCs, die in der Lage sind, diesen Prozess auszuführen, umfassen, ohne darauf begrenzt zu sein, bestimmte Makrophagen, B-Zellen und dendritische Zellen. In einer Ausführungsform ist das Proteinantigen ein Tumorantigen zum Hervorrufen oder Fördern einer Immunantwort gegen Tumorzellen.
Der Transport isolierter oder löslicher Proteine in das Cytosol von APC mit nachfolgender Aktivierung von CTL ist außergewöhnlich, da mit wenigen Ausnahmen die Injektion isolierter oder löslicher Proteine weder zu einer Aktivierung von APC noch Induktion von CTLs führt. Daher können Antigene, die an die transporterhöhenden Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung konjugiert sind, dazu dienen, eine zelluläre Immunantwort in vitro oder in vivo zu stimulieren.
Beispiel 14 liefert Details von Versuchen, die in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung durchgeführt worden sind, worin ein beispielhaftes Proteinantigen, Ovalbumin, APCs zugeführt wurde nach Konjugation an ein R7-Polymer. Nachfolgende Zugabe der APCs zu cytotoxischen T-Lymphozyten (CTLs) führte zu CD8 + Albumin-spezifischen cytotoxischen T-Zellen (stimulierte CTLs). Im Gegensatz hierzu konnten APCs, die unmodifiziertem Ovalbumin ausgesetzt waren, die CTLs nicht stimulieren.
In parallelen Versuchen wurden histokompatible dendritische Zellen (ein spezifischer Typ von APC) Ovalbumin-R7-Konjugaten ausgesetzt, dann in Mäuse injiziert. Nachfolgende Analyse von Blut dieser Mäuse zeigte das Vorliegen von Albumin-spezifischen CTLs. Kontrollmäusen wurden dendritische Zellen verabreicht, die unmodifiziertem Albumin ausgesetzt waren. Die Kontrollmäuse zeigten nicht die Albumin-spezifische CTL-Antwort. Diese Beispiele zeigen beispielhaft eine der spezifischen Anwendbarkeiten, die mit der Zuführung von Makromolekülen im Allgemeinen und Proteinen im Besonderen in Zellen verbunden sind.
In einer anderen Ausführungsform ist die Erfindung geeignet zum Zuführen immunspezifischer Antikörper oder Antikörperfragmente in das Cytosol, um mit nachteiligen biologischen Prozessen wechselzuwirken, wie etwa einer mikrobiellen Infektion. Jüngere Versuche haben gezeigt, dass intrazelluläre Antikörper effektive antivirale Mittel in Pflanzen- und Säugerzellen sein können (z. B. Tavladoraki et al., 1993; und Shaheen et al., 1996). Diese Verfahren verwendeten typischerweise einkettige variable Region-Fragmente (scFv), worin die schweren und leichten Ketten des Antikörpers als ein einzelnes Polypeptid synthetisiert werden. Die variablen schweren und leichten Ketten werden üblicherweise durch ein flexibles Linkerpeptid (z. B. 15 Aminosäuren) getrennt, um ein 28 kDa Molekül zu ergeben, das die Hochaffinitätsligandenbindungsstelle beibehält. Das prinzipielle Hindernis für eine weite Anwendung dieser Technologie ist die Effizienz der Aufnahme in infizierte Zellen gewesen. Jedoch durch Binden von Transportpolymeren an scFv-Fragmente kann das Ausmaß der zellulären Aufnahme erhöht werden, wobei es den immunspezifischen Fragmenten erlaubt wird, an wichtige mikrobiellen Komponenten zu binden und diese unwirksam zu machen, wie etwa HIV Rev, HIV reverse Transkriptase und Integrase-Proteine.
D. Peptide
Peptide, die durch die verbesserten Transportverfahren, die hier beschrieben sind, zugeführt werden sollen, umfassen, ohne dass sie darauf begrenzt werden sollen, Effektorpolypeptide, Rezeptorfragmente und dgl. Beispiele umfassen Peptide mit Phosphorylierungsstellen, die durch Protein-vermittelnde intrazelluläre Signale verwendet werden. Beispiele derartiger Proteine umfassen, ohne darauf begrenzt zu sein, Proteinkinase C, RAF-1, p21Ras, NF-κB, C-JUN und cytoplasmatische Schwänze von Membranrezeptoren, wie etwa IL-4-Rezeptor, CD28, CTLA-4, V7 und MHC-Klasse 1 und Klasse II-Antigene.
In Versuchen, die in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden (Beispiel 15) wurde ein 10-Aminosäuresegment der Cytoplasmaschwanzregion des Transmembranproteins V7 (ebenfalls bekannt als CD101) mit einer R7-Polymersequenz an seinem C-Terminus synthetisiert. Diese Schwanzregion ist dafür bekannt, dass sie physikalisch assoziiert mit und die Inaktivierung von RAF-1-Kinase vermittelt, ein kritisches Enzym in dem MAP-Kinaseweg der zellulären Aktivierung. Das V7-R7-Konjugat wurde zu T-Zellen gegeben, welche nachfolgend mit Detergens lysiert wurden. Die lösliche Fraktion wurde auf Immunpräzipitation durch Anti-V7-Antikörper aus Maus in Verbindung mit Ziegen-Anti-Maus IgG getestet.
In der Abwesenheit einer Peptidbehandlung kopräzipitierte RAF-1, eine Kinase, von der bekannt ist, dass sie mit V7 assoziiert und inaktiviert wird durch Assoziierung, mit V7. In Peptid-behandelten Zellen wurde RAF-1-Protein von dem V7-Immunokomplex eliminiert. Die gleiche Peptidbehandlung störte einen Komplex nicht, der aus RAF-1 und p21 Ras bestand, wodurch nichtspezifische Modifikation von RAF-1 durch die V7-Peptide ausgeschlossen wird. Diese Ergebnisse zeigten, dass ein Cytoplasmaschwanzregion-V7-Peptid bei Konjugation an ein membrantransporterhöhendes Peptid der vorliegenden Erfindung in eine Zielzelle eintritt und spezifisch mit einem physiologischen Effektormolekül, RAF-1, assoziiert. Eine derartige Assoziation kann verwendet werden, um intrazelluläre Prozesse abzubrechen.
In einem zweiten Satz von Untersuchungen wurde der V7-Teil des Konjugats in vitro phosphoryliert, unter Verwendung von Proteinkinase C. Anti-RAF-1-Präzipitate von T-Zellen, die phosphorylierten V7-Schwanzpeptiden ausgesetzt wurden, jedoch nicht dem unphosphoryliertem V7-Schwanzpeptid, zeigten potente Inhibierung der RAF-Kinaseaktivität. Diese Untersuchungen zeigen zwei Prinzipien. Erstens, dass die Transportpolymere der Erfindung den Transport eines hochgeladenen (phosphorylierten) Moleküls durch die Zellmembran bewirken können. Zweitens, während sowohl phosphorylierte als auch unphosphorylierte V7-Schwanzpeptide an RAF-1 binden können, modifizierte nur das phosphorylierte Peptid RAF-1-Kinaseaktivität.
VI. Screeningassawerfahren und Bibliothek
In einer anderen Ausführungsform kann die Erfindung verwendet werden, um ein oder mehrere Konjugate auf eine ausgewählte biologische Aktivität zu screenen, worin das bzw. die Konjugate gebildet wird bzw. gebildet werden aus einem oder mehreren Kandidatenagentien. Konjugate) wird (werden) in Kontakt gebracht mit einer Zelle, die ein nachweisbares Signal bei Aufnahme des Konjugats in die Zelle zeigt, sodass die Stärke des Signals kennzeichnend für die Effizienz des Konjugats in Bezug auf die ausgewählte biologische Aktivität ist.
Ein Vorteil dieser Ausführungsform ist, dass es besonders geeignet ist zum Testen der Aktivitäten von Mitteln, die selbst nicht in der Lage sind oder nur geringfügig in der Lage sind, in Zellen einzutreten, um biologische Aktivität zu manifestieren. Daher liefert die Erfindung einen besonders wirkungsvollen Weg zum Identifizieren aktiver Mittel, die ansonsten auf anderem Weg nicht zugänglich wären durch Screening-Programme im großen Maßstab, aufgrund des Fehlens eines wirkungsvollen und geeigneten Weges zum Transportieren des Mittels in die Zelle oder Organelle.
Vorzugsweise wird das mindestens eine Kandidatenagens bereitgestellt als eine Kombinationsbibliothek von Konjugaten, welche hergestellt werden unter Verwendung eines kombinatorischen synthetischen Verfahrens, das in der Technik bekannt ist. Zum Beispiel erkannten Thompson und Ellman (1996) mindestens fünf verschiedene allgemeine Ansätze zum Herstellen kombinatorischer Bibliotheken auf festen Trägern, nämlich (1) Synthese diskreter Verbindungen, (2) Splitsynthese (Split und Pool), (3) lösliche Bibliotheksdekonvolution, (4) Strukturbestimmung durch analytische Verfahren und (5) Decodierungsstrategien, worin die chemischen Zusammensetzungen aktiver Kandidaten bestimmt werden durch einzigartige Markierungen, nach positivem Testen auf biologische Aktivität in dem Assay. Synthese von Bibliotheken in Lösung umfasst mindestens (1) räumlich getrennte Synthesen und (2) Synthese von Pools (Thompson, supra). Darüber hinaus kann eine Beschreibung kombinatorischer Syntheseverfahren gefunden werden in Lam et al (1997), welche im Besonderen den Einkügelchen-eine-Verbindung-Ansatz beschreibt.
Diese Ansätze werden leicht angepasst, um Konjugate gemäß der vorliegenden Erfindung herzustellen, einschließlich geeigneter Schutzschemata, falls erforderlich. Zum Beispiel kann für eine Bibliothek, die auf einem oder mehreren festen Trägern aufgebaut ist, zuerst eine Transportgruppe an den (die) Träger gebunden werden, gefolgt durch kombinatorisches Aufbauen oder Anhängen von Kandidatenagentien, auf Polymere über geeignete reaktive Funktionalitäten. In einem alternativen Beispiel wird zuerst eine kombinatorische Bibliothek von Mitteln auf einem oder mehreren festen Trägern gebildet, gefolgt durch Hinzufügen eines Transportpolymers an jedes immobilisierte Kandidatenagens.
Ähnliche oder verschiedene Ansätze können verwendet werden für Lösungsphasensynthesen. Bibliotheken, die auf einem festen Träger gebildet werden, werden bevorzugt von dem Träger durch eine spaltbare Linkergruppe durch bekannte Verfahren (Thompson et al. Und Lam et al., supra) abgetrennt.
Der mindestens eine Konjugatkandidat kann mit einer Vielzahl von Assays auf Zellbasis getestet werden, die nachweisbare Signale im Verhältnis zu der irksamkeit des Konjugats ergeben. Herkömmlicherweise werden die Kandidaten mit Zellen in Platten mit mehrfachen Vertiefungen inkubiert und die biologischen Wirkungen werden über ein Signal gemessen (z. B. Fluoreszenz, Reflexion, Absorption oder Chemielumineszenz) das unter Verwendung eines Plattenlesegeräts quantifiziert werden kann. Alternativ können die Inkubationsgemische aus den Vertiefungen für ein weiteres Bearbeiten und/oder weitere Analyse entnommen werden. Die Strukturen aktiver und optional inaktiver Verbindungen, wenn nicht bereits bekannt, werden dann bestimmt und diese Information kann verwendet werden, um Leitverbindungen zu identifizieren und weitere Synthese- und Screeninganstrengungen zu konzentrieren.
Zum Beispiel wird der in Beispiel 11 detailliert dargestellte γ-Interferon-Sezernierungsassay leicht angepasst auf das Multivertiefungsformat, sodass aktive Sezernierungsinhibitoren durch Fluoreszenzdetektion auf Europiumbasis unter Verwendung eines Plattenlesegeräts nachgewiesen werden können. Antikrebsmittel können gescreent werden unter Verwendung etablierter Krebszelllinien (z. B. bereitgestellt durch die National Institutes of Health (NIH) und das National Cancer Institute (NCl)). Cytotoxische Wirkungen von Antikrebsmitteln können durch Trypanfarbstoffausschluss z. B. bestimmt werden.
Andere Beispiele umfassen Assays, die auf die Inhibierung der Zellsignalisierung ausgerichtet sind, wie etwa IL-4-Rezeptorinhibierung; Assays zum Blockieren zellulärer Proliferation und Genexpressionsassays. In einem typischen Genexpressionsassay wird ein Gen, das von Interesse ist, unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors angeordnet und wird abstromig von einem Gen gefolgt, zum Herstellen einer Reporterspezies, wie etwa β-Galactosidase oder Glühwürmchenluciferase. Eine Inhibitionswirkung kann basierend auf einer Abnahme des Reportersignals nachgewiesen werden.
Die Erfindung umfasst auch eine Konjugatbibliothek, welche geeignet ist zum Screenen in dem obigen Verfahren. Die Bibliothek umfasst eine Vielzahl von Kandidatenagentien für ein oder mehrere ausgewählte biologische Aktivitäten, von welchen jede konjugiert ist mit mindestens einem Transportpolymer gemäß der Erfindung. Vorzugsweise ist die Konjugatbibliothek eine kombinatorische Bibliothek. In einer anderen Ausführungsform umfasst die Erfindung eine regelmäßige Anordnung verschiedener Polymermittelkonjugate, die verteilt sind in einer mit Indices versehenen oder mit Indices versehbaren Vielzahl von Probenvertiefungen, zum Testen und Identifizieren aktiver Mittel, die von Interesse sind.
VI. Anwendbarkeit
Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung haben besondere Anwendbarkeit im Bereich der Human- und Veterinärtherapie. Im Allgemeinen werden verabreichte Dosen effektiv sein, um picomolare bis mikromolare Konzentrationen der therapeutischen Zusammensetzung der Effektorstelle zuzuführen. Geeignete Dosen und Konzentrationen werden von Faktoren abhängen, wie etwa der therapeutischen Zusammensetzung oder dem Arzneimittel, dem Ort der vorgesehenen Zuführung und dem Verabreichungsweg, welche alle empirisch gemäß im Stand der Technik allgemein bekannter Verfahren erhalten werden können. Eine weitere Anleitung kann erhalten werden aus Studien unter Verwendung experimenteller Tiermodelle zum Beurteilen der Dosis, wie im Stand der Technik bekannt.
Die Verabreichung der Verbindungen der Erfindung mit einem geeigneten pharmazeutischen Hilfsmittel, falls erforderlich, kann durch eine der anerkannten Arten der Verabreichung durchgeführt werden. Daher kann die Verabreichung z. B. intravenös, topikal, subkutan, transkutan, intramuskulär, oral, in ein Gelenk, parenteral, peritoneal, intranasal oder durch Inhalation erfolgen. Die Formulierungen können fest, halbfest, lyophilisiertes Pulver oder flüssige Dosisformen sein, wie etwa z. B. Tabletten, Pillen, Kapseln, Pulver, Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Suppositorien, Retentionseinlauf, Cremes, Salben, Lotionen, Aerosole oder dgl. vorzugsweise in Dosisformen, die geeignet für eine einfache Verabreichung von genauen Dosen sind.
Die Zusammensetzungen umfassen typischerweise einen herkömmlichen pharmazeutischen Träger oder ein Hilfsmittel und können zusätzlich andere medizinische Mittel, Träger, Hilfsmittel und dgl. enthalten. Vorzugsweise wird die Zusammensetzung etwa 5% bis 75% bezüglich des Gewichts einer Verbindung oder Verbindungen der Erfindung enthalten, wobei der Rest aus geeigneten pharmazeutischen Hilfsmitteln besteht. Geeignete Hilfsmittel können auf die spezielle Zusammensetzung und den Verabreichungsweg durch in der Technik allgemein bekannte Verfahren z. B zugeschnitten werden (Gennaro, 1990).
Zur oralen Verabreichung umfassen derartige Hilfsmittel pharmazeutische Qualitäten von Mannitol, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talk, Cellulose, Glucose, Gelatine, Sucrose, Magnesiumcarbonat und dgl. Die Zusammensetzung kann die Form einer Lösung, Suspension, Tablette, Pille, Kapsel, Pulver, Formulierung mit verzögerter Freisetzung und dgl. annehmen.
In einigen Ausführungsformen nehmen die pharmazeutischen Zusammensetzungen die Form einer Pille, Tablette oder Kapsel an und daher kann die Zusammensetzung zusammen mit dem biologisch aktiven Konjugat eines der folgenden enthalten: ein Verdünnungsmittel, wie etwa Lactose, Sucrose, Dicalciumphosphat und dgl.; ein Desintegrationsmittel, wie etwa Stärke oder Derivate davon; ein Gleitmittel, wie etwa Magnesiumstearat und dgl.; und ein Bindemittel, wie etwa Stärke, Gummiarabicum, Polyvinylpyrrolidon, Gelatine, Cellulose und Derivate davon.
Die aktiven Verbindungen der Formeln können in ein Zäpfchen gemischt werden, umfassend z. B. etwa 0,5% bis etwa 50% einer Verbindung der Erfindung, angeordnet in einem Polyethylenglykol (PEG)-Träger (z. B. PEG 1000 [96%] und PEG 4000 [4%]).
Flüssige Zussammensetzungen können hergestellt werden durch Lösen oder Dispergieren einer Verbindung (etwa 0,5% bis etwa 20%) und optional pharmazeutischer Hilfsmittel in einem Träger, wie etwa z. B. wässriger Salzlösung (z. B. 0,9% Gew.-%/V Natriumchlorid), wässrige Dextrose, Glycerol, Ethanol und dgl., um eine Lösung oder Suspension zu bilden, z. B. zur intravenösen Verabreichung. Die aktiven Verbindungen können auch zu einem Retentionseinlauf formuliert werden.
Falls es gewünscht ist, kann die zu verabreichende Zusammensetzung auch kleinere Mengen nichttoxischer Hilfssubstanzen enthalten, wie etwa Benetzungsoder Emulgiermittel, pH-Puffermittel, wie etwa z. B. Natriumacetat, Sorbitanmonolaurat oder Triethanolaminoleat.
Zur topischen Verabreichung wird die Zusammensetzung in einer geeigneten Form verabreicht, wie etwa als eine Lösung oder ein transdermales Pflaster. Zur Verabreichung durch Inhalation kann die Zusammensetzung als ein trockenes Pulver (z. B. Inhale Therapeutics) oder in flüssiger Form über einen Vernebler verabreicht werden.
Verfahren zum Herstellen derartiger Dosisformen sind bekannt und werden für den Fachmann in der Technik ersichtlich werden; siehe z. B. Remington's Pharmaceutical Sciences (1980). Die zu verabreichende Zusammensetzung wird in jedem Fall eine Menge des Proarzneimittels und/oder der aktiven Verbindungen) in einer pharmazeutisch wirksamen Menge zum Lindern des zu behandelnden Zustands enthalten, wenn sie gemäß den Lehren dieser Erfindung verabreicht wird.
Im Allgemeinen werden die Verbindungen der Erfindung in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht, d. h. in einer Dosis, die ausreichend ist, um eine Behandlung zu bewirken, welche in Abhängigkeit von dem Individuum und dem Zustand, der zu behandeln ist, variieren wird. Typischerweise ist eine therapeutisch wirksame Tagesdosis von 0,1 bis 100 mg/kg Körpergewicht Arzneimittel pro Tag. Die meisten Zustände reagieren bei einer Verabreichung von einer Gesamtdosis zwischen etwa 1 und etwa 30 mg/kg Körpergewicht pro Tag oder zwischen etwa 70 mg und 2100 mg pro Tag für eine Person mit 70 kg.
Die Stabilität des Konjugats kann weiterhin kontrolliert werden durch die Zusammensetzung und die Stereochemie des Grundgerüsts und der Seitenketten des Polymers. Für Polypeptidpolymere sind im Allgemeinen D-Isomere resistent gegenüber endogenen Proteasen und haben daher längere Halbwertszeiten im Serum und innerhalb von Zellen. D-Polypeptidpolymere sind daher geeignet wenn eine längere Wirkungsdauer gewünscht ist. L-Polypeptidpolymere haben kürzere Halbwertszeiten aufgrund ihrer Suszeptibilität für Proteasen und werden daher ausgewählt, um kürzere Wirkungseffekte zu vermitteln. Dies erlaubt es, dass Nebenwirkungen leichter verhindert werden durch Beenden der Therapie sobald Nebenwirkungen beobachtet werden. Polypeptide, die Gemische von D- und L-Resten umfassen, haben dazwischenliegende Stabilitäten. Homo-D-Polymere sind im Allgemeinen bevorzugt.
Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung veranschaulichen, jedoch nicht begrenzen.
Beispiel 1
Pegtidsynthese
Peptide wurden synthetisiert unter Verwendung von Festphasentechniken auf einem Applied Biosystems Peptid-Synthesizer unter Verwendung der FastMOCTM-Chemie und kommerziell erhältlicher Wang-Harze und Fmoc-geschützter Aminosäuren, entsprechend den in der Technik allgemein bekannten Verfahren (Bonifaci). Peptide wurden gereinigt unter Verwendung von C4- oder C18-Reversphase HPLC-Säulen und ihre Strukturen wurden unter Verwendung von Amiosäureanalyse und Massenspektrometrie bestätigt.
Beispiel 2
Fluoreszenzassays
Fluoreszente Peptide wurden synthetisiert durch Modifizieren des Aminoterminus des Peptids mit Aminocapronsäure, gefolgt durch Reaktion mit Fluoresceinisothiocyanat in der Gegenwart von (2-1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat/N-Hydroxybenzotriazol, gelöst in N-Methylpyrrolidon. Die Produkte wurden durch Gelfiltration gereinigt.
Suspensionszellen (10⁶/ml) wurden für verschiedene Zeiten inkubiert bei 37°C, 23°C oder 4°C, in einem Konzentrationsbereich von Peptiden oder Konjugaten in PBS bei einem pH-Wert von 7,2, enthaltend 2% fötales Kalbsserum (PBS/FCS) auf Platten mit 96 Vertiefungen. Nach einer 15-minütigen Inkubation wurden die Zellen durch Zentrifugieren pelletiert, dreimal mit PBS/FCS-enthaltendem 1%-igem Natriumazid gewaschen, inkubiert mit Trypsin/EDTA (Gibco) bei 37°C für fünf Minuten, dann noch zweimal mit PBS/FCS/NaN₃ gewaschen. Die pelletierten Zellen wurden in PBS, enthaltend 2% FCS und 0,1 % Propidiumjodid, resuspendiert und auf einem FACScan (Becton Dickenson, Mountain View, CA) analysiert. Zellen, die positiv für Propidiumjodid waren, wurden aus der Analyse ausgeschlossen. Zur Analyse von Polymeren von Arginin wurde die Spannung des Fotomultipliers um eine Größenordnung verringert, um eine genauere Messung zu erlauben.
Beispiel 3
tat-Basispeptid gegenüber Poly-Arg-Peptiden
Aufnahmegrade der folgenden Polypeptide wurden gemessen durch das Verfahren in Beispiel 2: (1) Ein Polypeptid, umfassend HIV-tat-Reste 49–57 (Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg = SEQ ID Nr: 1), (2) ein Nonamer von L-Lys-Resten (K9, SEQ ID Nr: 2) und (3) Homo-L oder Homo-Polypeptide, enthaltend vier bis neun Arg-Reste (SEQ ID Nr: 3–8 und 12–17). Ergebnisse sind in den 2A bis 2C gezeigt.
Beispiel 4
Konfokale Zellmikroskopie
Zellen, die inkubiert sind mit fluoreszenten Polyargininpeptiden wurden wie oben beschrieben für Bindungsassays hergestellt und bei der Cell Sciences Imaging Facility analysiert (Stanford University, Stanford, CA), unter Verwendung eines konfokalen Einstrahl-Laser-Scanningmikroskops, mit einer Anregungswellenlänge von 488 nm (Argon-Ionen-Laser) und einer Emissionsbandbreite von 510–550, unter Verwendung eines Banddurchgangsfilters. Konjugate (6,25 μM), enthaltend tat(49–57), R7 oder r7, gekoppelt an Fluorescein, wurden mit Jurkat-Zellen bei 37 °C für 10 Minuten inkubiert. Die 2A bis 2F zeigen Ergebnisse für emittierte Fluoreszenz (2A–2C) und transmittiertes Licht (2D–2F) für tat(49–57) (2A und 2C), R7 (2B und 2E) und r7 (2C und 2F).
Beispiel 5
Längenbereichsstudien
Die folgenden Homopolymere von Polyarginin wurden auf Fluoreszenz durch den Fluoreszenzassay in Beispiel 2 getestet, unter Inkubation bei 37°C für 15 Minuten vor dem Zellpelletieren: r9, R9, R15, R20, R25 und R30. Zusätzlich wurde auch ein Gemisch von L-Argininpolymeren mit einem mittleren Molekulargewicht von 12.000 Dalton (ungefähr 100 Aminosäuren) ebenfalls getestet (Sigma Chem. Co.) nachdem sie mit Fluoresceinisothiocyanat markiert und durch Gelfiltration („SEPHADEX" G-25) gereinigt wurden. Die Zellen wurden durch FACS analysiert und die mittlere Fluoreszenz der lebenden Zellen wurde gemessen. Die Cytotoxizität jedes Konjugats wurde ebenfalls gemessen durch Berechnen des Prozentanteils von Zellen, die mit Propidiumjodid färbten, was charakteristisch für Zelltod ist. Aufnahmeergebnisse für die r9-, R9-, R15-, R20- und R25-Konjugate sind in 3 gezeigt.
Das kommerziell erhältliche Polyarginin (12.000 MG) präzipitierte Proteine in Serum, am wahrscheinlichsten α1-Säuregylcoprotein. Daher wurde der Gehalt an fötalem Kälberserum um das 10-fache in dem Assay für Konjugate, die aus diesem Material hergestellt sind, verringert.
Die Poly-Arg-Zusammensetzung mit 12.000 MG war bei Konzentrationen von 800 nM bis 50 μM toxisch und ist aus 3 ausgenommen. Poly-L-Arg-Konjugate, die 20 Argininreste oder mehr enthalten, waren bei Konzentrationen von höher als 12 μM toxisch, sodass die Toxizität mit der Länge anstieg.
Beispiel 6
Kinetiken der Aufnahme
Zum Messen von Vmax und Km-Parametern der zellulären Aufnahme wurde das Assayverfahren von Beispiel 2 mit den folgenden Modifikationen verwendet. Peptide wurden mit Zellen für 0,5, 1, 2 und 4 Minuten bei 4°C dreifach in 50 μl PBS/FCS auf Platten mit 96 Vertiefungen inkubiert. Am Ende der Inkubation wurde die Reaktion durch Verdünnen der Proben in 5 ml PBS/FCS gequencht, es wurde zentrifugiert und einmal mit PBS/FCS, Trypsin/EDTA gewaschen und schließlich nochmals mit PBS/FCS und die Pellets wurden in PBS/FCS-enthaltendem Propidiumjodid zur Analyse auf einem FACScan aufgenommen. FACS-Daten wurden der Lineweaver-Burk-Gleichung für Michaelis-Menten-Kinetiken angepasst. Kinetikdaten für fluoreszente Konjugate von tat(49–57), R9 und r9 sind in Tabelle 1 gezeigt.
Beispiel 7
Metabolinhibitorwirkungen auf den Transport
Suspensionszellen (10⁶/ml) wurden für 30 Minuten mit 0,5% Natriumazid in PBSenthaltendem 2%-igem FCS inkubiert. Am Ende der Inkubation wurden fluoreszente Peptide (tat(49–57), R7, R8 oder R9) bis zu einer Endkonzentration von 12,5 μM zugegeben. Nach Inkubation für 30 Minuten wurden die Zellen wie in Beispiel 2 gewaschen, ausgenommen, dass alle Waschpuffer 0,1% Natriumazid enthielten. Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt.
Beispiel 8
Transport in Bakterienzellen
Gram-negative Bakterien (E. coli Stamm HB101) und gram-positive Bakterien (Strep. bovis) wurden in einem geeigneten Medium in logarithmischer Phase gezüchtet. Zellkulturen (4 × 10⁸ pro ml) wurden für 30 Minuten bei 37°C mit variierenden Konzentrationen fluoreszenter Konjugate inkubiert, die lineare Polymere von L-Arginin (R4 bis R9), D-Arginin (r4 bis r9) oder L-Lysin (K9) bei Konjugatkonzentration von 3 bis 50 μM enthielten. Die Zellen wurden gewaschen, in PBS-enthaltendem Propidiumjodid aufgenommen (um tote Zellen zu unterscheiden) und durch FACS und Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Ergebnisse sind in den 5A–5C wie oben diskutiert, gezeigt.
Beispiel 9
Konjugate mit beispielhaften spaltbaren Linkern
A. 6-Mercaptopurincysteindisulfidkonjugat

A.1 Thiolaktivierung. N-Acetyl-Cys(SH)-Ala-Ala-(Arg)-7-CO₂H (12,2 mg, 0,0083 mmol) wurde in 3 ml 3 : 1 AcOH : H₂O unter Rühren bei Raumtemperatur gelöst. Zu dieser Lösung wurde Dithio-bis-(5-nitropyridin) (DTNP) (12,9 mg, 0,0415 mmol, 5 Äg.) gegeben. Man ließ die Lösung für 24 h bei Umgebungstemperatur rühren, wonach das Gemisch eine hellgelbe Farbe annahm. Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde in 5 ml Wasser wieder gelöst und dreimal mit Ethylacetat extrahiert, um überschüssiges DTNP zu entfernen. Die wässrige Schicht wurde lyophilisiert und das Produkte wurde ohne weitere Reinigung verwendet.
A2. Binden von Arzneimittel N-Acetyl-Cys(SH)-Ala-Ala-(Arg)7-CO₂H (0,0083 mmol) wurde in 1 ml entgastem H₂O (pH-Wert = 5) unter Argon bei Raumtemperatur unter Rühren gelöst. 6-Mercaptopurin (1,42 mg, 0,0083 mmol, 1 Äg.) in 0,5 ml DMF wurde zu dem Gemisch gegeben. Man ließ die Reaktion für 18 h unter Inertatmosphäre bei Umgebungstemperatur rühren. Nach 18 h entwickelte sich eine hellgelbe Farbe, wodurch das Vorliegen von freiem 5-Nitro-2-thiopyridin angezeigt wird. Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck entfernt und der Rückstand wurde durch HPLC gereinigt, wodurch das gewünschte Produkt (I, 6A) in 50% Gesamtausbeute bereitgestellt wird.

B. Fotospaltbares Taxolkonjugat
3-Nitro-4-(brommethyl)benzoesäure (100 mg, 0,384 mmol) wird in wasserfreiem Methanol (5 ml) unter einer Stickstoffatmosphäre gelöst. Zu dieser Lösung wird Natriummethoxid (88 μl, 25% (Gew./Gew) in Methanol, 0,384 mmol, 1 Äq.) gegeben, gefolgt von der Zugabe von 6-Mercaptopurin (58,2 mg, 0,384 mmol, 1 Äq.). Das Gemisch wird auf Rückfluss erwärmt und man lässt für 3 h rühren. Das Reaktionsgemisch wird dann gekühlt, filtriert und durch Ansäuren mit 6N HCl gequencht. Das Reaktionsvolumen wird dann auf die Hälfte reduziert, bei welchem Punkt das Produkt präzipitiert und durch Filtration gesammelt wird. Der Rückstand wird in Methanol gelöst, filtriert (falls notwendig) und unter verringertem Druck konzentriert, um das gewünschte Sulfid (II, 6B) in 50 Ausbeute als einen gelben, pulverförmigen Feststoff bereitzustellen.
C. Phosphatspaltbares Taxolkonjugat

C1. Zu einer Suspension von o-Hydroxyphenylessigsäure (15,0 g, 0,099 mol) in H₂O (39 ml) wurde bei 0°C eine Lösung von Salpetersäure (12 ml 65%-ig in 8 ml H₂O) langsam mit einer Pipette zugegeben. Die Lösung wurde für zusätzliche 1,5 h bei 0°C gerührt. Das Gemisch wurde dann auf Umgebungstemperatur erwärmt und man ließ es für zusätzliche 0,5 h rühren. Die heterogene Lösung wurde über Eis (10 g) gegossen und filtriert, um das unlösliche ortho-Nitro-Isomer zu entfernen. Die rötliche Lösung wurde unter verringertem Druck konzentriert und der voluminöse Rückstand wurde in 6N HCl gelöst und durch Celit filtriert. Das Lösungsmittel wurde wieder unter verringertem Druck entfernt, um die gewünschte 2-Hydroxy-4-nitro-phenylessigsäure als einen hellen, braun-roten Feststoff (40% Ausbeute) bereitzustellen. Das Produkt (IV-a) wurde in dem nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet.
C2. Produkt IV-a (765 mg, 3,88 mmol) wurde in frisch destilliertem THF (5 ml) unter Argonatmosphäre gelöst. Die Lösung wurde bei 0°C gekühlt und Boran-THF (1,0 M in THF, 9,7 ml, 9,7 mmol, 2,5 Äq.) wurde tropfenweise über eine Spritze unter offensichtlicher Entwicklung von Wasserstoff zugegeben. Man ließ die Reaktion für zusätzliche 16 h rühren, langsam auf Raumtemperatur erwärmen. Die Reaktion wurde durch langsames Zugeben von 1 M HCl (unter heftiger Blasenentwicklung) und 10 ml Ethylacetat gequencht. Die Schichten wurden getrennt und die wässrige Schicht fünfmal mit Ethylacetat extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit Salzlauge gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand durch schnelle Säulenchromatografie (1 : 1 Hexan : Ethylacetat) gereinigt, um den gewünschten Nitroalkohol (IV-b) als einen leicht gelben Feststoff (85% Ausbeute) bereitzustellen.
C3. Nitroalkohol (IV-b) (150 mg, 0,819 mmol) wurde in trockenen DMF (5 ml), enthaltend Di-t-butyldicarbonat (190 mg, 1,05 Äq,) und 10% Pd-C (10 mg) gelöst. Das Gemisch wurde in einem Parr-Gerät angeordnet und fünfmal unter Druck gesetzt/gespült. Die Lösung wurde dann auf 47 psi unter Druck gesetzt und man ließ sie für 24 h schütteln. Die Reaktion wurde durch Filtration durch Celit gequencht und das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatografie (1 : 1 Hexan : Ethylacetat) gereinigt, um das geschützte Anilinprodukt (IV-c) als einen gelb-braunen kristallinen Feststoff in 70% Ausbeute bereitzustellen.
C4. TBDMS-CI (48 mg, 0,316 mmol) wurde in frisch destilliertem Dichlormethan (4 ml) unter einer Argonatmosphäre gelöst. Zu dieser Lösung wurde Imidazol (24 mg, 0,347 mmol, 1,1 Äq.) gegeben und es bildete sich unmittelbar ein weißes Präzipitat. Die Lösung wurde für 30 min bei Raumtemperatur gerührt, zu welchem Zeitpunkt Produkt IV-c (80 mg, 0,316 mmol, 1,0 Äq.) rasch als eine Lösung in Dichlormethan/THF (1,0 ml) zugegeben wurde. Man ließ das resultierende Gemisch für zusätzliche 18 h bei Raumtemperatur rühren. Die Reaktion wurde durch Zugabe von gesättigtem wässrigem Ammoniumchlorid gequencht. Die Schichten wurden abgetrennt und die wässrige Phase dreimal mit Ethylacetat extrahiert und die vereinigten organischen Schichten mit Salzlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Die organische Phase wurde konzentriert, um Silyletherphenolprodukt (IV-d) als ein leicht gelbes Öl (90% Ausbeute) bereitzustellen.
C5. Silyletherphenol IV-d (150 mg, 0,408 mmol) wurde in frisch destilliertem THF (7 ml) unter Argon gelöst und die Lösung auf 0°C gekühlt. n-BuLi (2,3 M in Hexan, 214 μl) wurde dann tropfenweise über eine Spritze zugegeben. Es wurde eine Farbänderung von leicht gelb nach tief rot unmittelbar festgestellt. Nach 5 min wurde Tetrabenzylpyrophosphat (242 mg, 0,45 mmol, 1,1 Äq.) schnell zu der gerührten Lösung unter Argon gegeben. Die Lösung wurde für zusätzliche 18 h unter Inertatmosphäre gerührt, langsam auf Raumtemperatur erwärmt, während welcher Zeit sich ein weißes Präzipitat bildete. Die Reaktion wurde durch Zugabe von gesättigtem wässrigem Ammoniumchlorid und 10 ml Ethylacetat gequencht. Die Schichten wurden getrennt und die wässrige Schicht wurde fünfmal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Salzlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde durch Verdampfen entfernt und der Rückstand durch schnelle Säulenchromatographie (1 : 1 Hexan : Ethylacetat) gereinigt, um den gewünschten Phosphatsilylether (IV-e) als ein leicht oranges Öl (90% Ausbeute) zu erhalten.
C6. Phosphatsilylether (IV-e) (10 mg, 0,0159 mmol) wurde in 2 ml trockenem Ethanol bei Raumtemperatur gelöst. Zu der gerührten Lösung wurden 20 μl konz. HCl (1% V : V Lösung) gegeben und man ließ das Gemisch rühren bis die TLC-Analyse anzeigte, dass die Reaktion vollständig war. Festes Natriumcarbonat wurde zugegeben, um die Reaktion zu quenchen und das Gemisch wurde rasch durch Silikagel filtriert und konzentriert, um rohes Alkoholdibenzylphosphatprodukt (IV-f) als ein leicht gelbes Öl (100% Ausbeute) zu ergeben.
C7. Alkohol IV-f (78 mg, 0,152 mmol) wurde in frisch destilliertem Dichlormethan (10 ml) unter einer Argonatmosphäre gelöst. Zu der Lösung wurde Dess-Martin Periodinan (90 mg, 0,213 mmol, 1,4 Äq.) gegeben. Man ließ die Lösung rühren und das Fortschreiten der Reaktion wurde durch TLC-Analyse beobachtet. Wenn TLC Vollständigkeit anzeigte, wurde die Reaktion durch Zugabe von 1 : 1 gesättigtes wässriges Natriumbicarbonat: gesättigtes wässriges Natriumthiosulfit gequencht. Man ließ das Zweiphasengemisch für 1 h bei Umgebungstemperatur rühren. Die Schichten wurden getrennt und die wässrige Phase wurde dreimal mit Ethylactat extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Salzlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck entfernt, um Aldehydprodukt (IV-g) als ein leicht braun-gelbes Öl (100% Ausbeute) bereitzustellen.
C8. Aldehyd IV-g (78 mg, 0,152 mmol) wurde in t-Butanol/Wasser (3,5 ml) unter Inertatmosphäre gelöst. Zu der schnell gerührten Lösung wurden 2-Methyl-2-buten (1,0 M in THF, 1,5 ml), Natriumphosphatmonobase (105 mg, 0,76 mmol, 5 Äq.) und Natriumchlorit (69 mg, 0,76 mmol, 5 Äq.) gegeben. Man ließ die Lösung für zusätzliche 8 Stunden bei Raumtemperatur rühren. Die Lösung wurde dann konzentriert und der Rückstand wurde angesäuert und mit Ethylacetat dreimal extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Lösung wurde wieder unter verringertem Druck konzentriert und der Rückstand wurde über Säulenchromatografie (2 : 1 Ethylacetat : Hexan) gereinigt, um das gewünschte Carbonsäurediphenylphosphat (IV-h) als ein leicht gelbes Öl (65% Ausbeute) zu ergeben.
C9. Säure IV-h (8,0 mg, 0,0152 mmol, 1,1 Äq.) wurde in frisch destilliertem Dichlormethan (2 ml) unter Argon bei Umgebungstemperatur gelöst. Zu diesem Gemisch wurde Paclitaxel (12 mg, 0,0138 mmol, 1 Äq.) gegeben, gefolgt von DMAP (2 mg, 0,0138 mmol, 1 Äq.) und DCC (3,2 mg, 0,0152, 1,1 Äq). Man ließ das Gemisch bei Raumtemperatur für zusätzliche 4 h rühren, während welcher Zeit sich ein leichtes Präzipitat bildete. Wenn TLC-Analyse zeigte, dass die Reaktion abgeschlossen war, wurde Lösungsmittel unter verringertem Druck entfernt und der Rückstand wurde durch schnelle Säulenchromatografie (1 : 1 Hexan : Ethylacetat) gereinigt, um Paclitaxel-C2'-Carboxylatester (IV-i) als einen weißen, kristallinen Feststoff (65% Ausbeute) zu ergeben.
C10. Ester IV-i (5,0 mg) wurde in reiner Ameisensäure (1,0 ml) unter einer Argonatmosphäre bei Raumtemperatur gelöst und man ließ für 30 min rühren. Wenn TLC anzeigte, dass die Reaktion abgeschlossen war, wurde die Lösung unter verringertem Druck konzentriert und der Rückstand wurde durch schnelle Filtration durch Silikagel gereinigt, um die gewünschte Anilin-Taxol-Verbindung (IV-j) in 50% Ausbeute als ein weißes Pulver zu ergeben.
C11. Zu einer Lösung von (Poly-di-CBZ)-geschütztem AcHN-RRRRRRR-CO₂H (1,2 Äq. 0,1 bis 1,0 M) in trockenem DMF wurde O-Benzotriazolyloxytetramethylurnoiumhexafluorphosphat (HATU, 1,0 Äq.) und eine katalytische Menge DMAP (0,2 Äq.) gegeben. Die Lösung wurde unter Inertatmosphäre für 5 min bei Umgebungstemperatur gerührt. Zu diesem Gemisch wurde dann Taxol-Anilin-Derivat (IV-j) als eine Lösung in trockenem DMF (minimales Volumen zum Lösen) gegeben. Die resultierende Lösung wurde für zusätzliche 5 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde abgeschlossen durch Konzentrieren des Reaktionsgemischs unter verringertem Druck. Das rohe Reaktionsgemisch wurde dann durch HLPC gereinigt, um das gewünschte Material bereitzustellen (IV, 6D).

Beispiel 10
Transport von Metallionen
3,93 g DTPA werden in 100 ml HEPES-Puffer gelöst und 1,52 ml Europiumchloridatom-Standardlösung (Aldrich) gelöst in 8 ml HEPES-Puffer, werden zugegeben und für 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Chromatische Trennung und Lyophilisierung ergibt einen Eu-DTPA-Chelatkomplex. Dieser Komplex wird dann an den Aminoterminus eines Polypeptids durch Festphasenpeptidchemie konjugiert. Die zelluläre Europiumionenaufnahme kann durch zeitaufgelöste Fluoreszenz gezeigt werden.
Beispiel 11
Aufnahme von PNA-Peptidkonjugaten
PNA-Peptidkonjugate wurden synthetisiert unter Verwendung von Festphasenchemie mit kommerziell erhältlichen Fmoc-Reagenzien (PerSeptive Biosystems, Cambridge, MA), entweder auf einem Applied Biosystems 433A Peptidsynthesizer oder einem Millipore Expedite Nukleinsäuresynthesesystem. Polymere von D- oder L-Arginin wurden an den Amino- oder Carboxyltermini von PNAs gebunden, welche analog den 5'- bzw. 3'-Enden der Nukleinsäuren sind. Die Konjugate wurden auch modifiziert, um Fluorescein oder Biotin zu enthalten, durch Zugeben eines Aminocapronsäurespacers zu dem Aminoterminus des Konjugats und dann Binden von Biotin oder Fluorescein. Die PNA-Peptidkonjugate wurden von dem Festphaseharz gespalten, unter Verwendung von 95% TFA, 2,5% Triisopropylsilan und 2,5% wässrigem Phenol. Das Harz wurde durch Filtration entfernt und restliche Säure wurde durch Verdampfen entfernt. Das Produkt wurde durch HPLC unter Verwendung einer C18-Reversephasesäule gereinigt und das Produkt wurde lyophilisiert. Die gewünschten PNA-Polymerkonjugate wurden unter Verwendung von Laserdesorptionsmassenspektrometrie identifiziert.
A. Inhibierung zellulärer Sezernierung von Gamma-IFN

1. PNA-Peptidkonjugate. Die folgenden Sense- und Antisense-PNA-Peptidkonjugate wurden hergestellt zum Inhibieren der gamma-IFN-Produktion, worin r = D-Arginin und R = L-Arginin: Sense:
Antisense:
fluoreszentes Antisense:
worin X = Fluorescein-Aminocaproat biotinyliertes Antisense:
worin Z = Biotin-Aminocaproat
2. Aufnahme durch T-Zellen. Um zu zeigen, dass PNA-Polyargininkonjugate wirkungsvoll in Zellen eintreten, wurde das obige fluorezente Antisense-Konjugat (X-SEQ ID N: 19) synthetisiert durch Konjugieren von Fluoresceinisothiocyanat an den Aminoterminus von SEQ ID Nr: 18, unter Verwendung eines Aminocapronsäurespacers. Zelluläre Aufnahme wurde untersucht durch Inkubieren der Jurkat-Human-T-Zelllinie (5 × 10⁵ Zellen/Vertiefung), entweder vorbehandelt für 30 Minuten mit 0,5 Natriumazid oder Phosphat-gepufferter Salzlösung, mit variierenden Mengen (100 nM bis 50 μm) des Fluorescein-markierten Sense- und Antisens-PNA-r7-Konjugats, als auch dem Antisense-PNA alleine (ohne r7-Segment). Die Menge Antisense-PNA, die in die Zellen eintritt, wurde analysiert durch konfokale Mikroskopie und FACS. In beiden Fällen lagen nur in Zellen Fluoreszenzsignale vor, die nicht Azid ausgesetzt waren und das Fluoreszenzsignal war abhängig von der Dosis des fluoreszierenden Konjugats und von der Temperatur und Dauer der Inkubation.
3. Gamma-IFN-Assay. Die Menge gamma-Interferon, die durch eine Maus-T-Zelllinie (Klon 11.3) sezeneriert wird, wurde durch Inkubieren von 10⁵ T-Zellen mit variierenden Mengen Antigen (Peptid, bestehend aus den Gruppen 110–121 von Walsperma-Myoglobin) und histokompatiblen Milzzellen von DBA/2-Mäusen (H-2d, 5 × 10⁵), welche als Antigen-präsentierende Zellen (APCs) wirken, in Platten mit 96 Vertiefungen. Nach Inkubation für 24 Stunden bei 37°C wurden 100 μl der Überstände in Mikrotiterplatten übergeführt, die mit kommerziell erhältlichen Anti-Gamma-IFN monoklonalen Antikörpern (Mab) (Pharmingen, San Diego, CA) beschichtet waren. Nach Inkubation für eine Stunde bei Raumtemperatur wurden die Platten mit PBS, enthaltend 1% fötales Kalbsserum und 0,1% Tween 20, gewaschen, wonach ein zweiter, biotinylierter gamma-IFN-Mab zugegeben wurde. Nach einer zweiten Stunde Inkubation wurden die Platten wie zuvor gewaschen und Europium (Eu)-Streptavidin (Delphia-Pharmacia) wurde zugegeben. Wieder nach einer Stunde Inkubation wurde ein saurer Puffer zugegeben, um Eu freizusetzen, das durch zeitaufgelöste Fluorometrie auf einem Delphia-Plattenlesegerät gemessen wurde. Die Fluoreszenzmenge war proportional der Menge von Gamma-IFN, die erzeugt worden ist und konnte genau quantifiziert werden durch Verwendung bekannter Mengen Gamma-IFN, zum Entwickeln einer Standardkurve.
4. Inhibierung der gamma-IFN-Produktion durch Konjugate. Die Fähigkeit von PNA-Polyargininkonjugaten zum Inhibieren der Sezernierung von gamma-IFN wurde untersucht durch Zugeben verschiedener Konzentrationen der obigen gamma-IFN-Konjugate mit suboptimalen Dosen von Peptidantigen (0,5 μm) zu einem Gemisch von Klon 11.3 T-Zellen und histokompatiblen Milzzellen. PNA-Sequenzen, denen Polyarginingruppen fehlen und nicht konjugiertes D-Argininheptamer wurden ebenfalls getestet.

Nach 24 Stunden wurden Aliquote der gezüchteten Überstände entnommen und die Menge Gamma-IFN wurde gemessen unter Verwendung des in Abschnitt 3 oben beschriebenen Fluoreszenzbindungsassays. Behandlung der Zellen mit dem Antisense-PNA-r7-Konjugat führte zu einer über 70%-igen Verringerung der IFN-Sezernierung, während äquivalente molare Mengen des Sense PNA-r7-Antisense-PNA, dem r7 fehlt, oder r7 alleine keine Inhibierung zeigten (7).
Beispiel 12
Transport von Großem Proteinantigen in APCs
Ein Konjugat von Ovalbumin, gekoppelt an ein Poly-L-Argininheptamer, wurde gebildet durch Umsetzen eines Cystein-enthaltenden Polypeptidpolymers (Cys-Ala-Ala-Ala-Arg₇, SEQ ID Nr: 21) mit Ovalbumin (45 kDa) in der Gegenwart von Sulfo-MBS, einem heterobifunktionellen Quervernetzer (Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Das molare Verhältnis von Peptid, das an Ovalbumin konjugiert ist, wurde durch Aminosäureanalyse quantifiziert. Das Konjugatprodukt wurde als OV-R7 bezeichnet. Das Konjugat wurde zu B-Zellen gegeben (Endkonzentration 10 μM), welche ebenfalls als Antigen-präsentierende Zellen (APCs) bezeichnet werden, welche gemäß Standardverfahren isoliert wurden. Die APCs wurden mit OV-R7 inkubiert und dann wurden sie zu einer Präparation von cytotoxischen T-Lymphozyten, isoliert durch Standardverfahren, gegeben. Behandeln von CTLs mit APCs, die inkubiert worden sind mit OV-R7, erzeugte CD8+-Albuminspezifische CTLs. Im Gegensatz hierzu konnten APCs, die mit unmodifiziertem Ovalbumin behandelt worden sind, die CTLs nicht stimulieren.
In einem anderen Versuch wurden histokompatible dendritische Zellen (ein spezifischer Typ von APC) Albumin-R7-Konjugaten ausgesetzt und wurden dann in Mäuse injiziert. Nachfolgende Analyse von Blut dieser Mäuse zeigte das Vorliegen Albumin-spezifischer CTLs. Kontrollmäuse erhielten dendritische Zellen, die unmodifiziertem Albumin ausgesetzt waren. Die Kontrollmäuse zeigten nicht die Albumin-spezifische CTL-Antwort.
Beispiel 13
Verstärkte Aufnahme von Peptid, das von V7 stammt
Ein Konjugat, bestehend aus einem Teil der C-terminalen cytoplasmatischen Schwanzregion von V7 (ein Leukozytenoberflächenprotein) mit der Sequenz KLSTLRSNT (SEQ ID Nr: 22; Ruegg et al., 1995) wurde synthetisiert, wobei 7 Argininreste an seinen C-Terminus gemäß Standardverfahren gebunden wurden, unter Verwendung eines Peptidsynthesizers (Applied Biosystems Modell 433). Das Konjugat wurde zu (Endkonzentration ≈ 10 μM) zu T-Zellen gegeben, welche durch Standardverfahren isoliert worden waren und es wurde bei 37°C für mehrere Stunden über Nacht inkubiert. Zellen wurden unter Verwendung von Detergens (1% Triton X-100) lysiert. DNA wurde entfernt und die lösliche (Protein-enthaltende) Fraktion wurde einer Immunpräzipitation mit Anti-V7-Mausmonoklonalem Antikörper in Kombination mit Ziegen-Anti-Maus-IgG unterzogen. RAF-1 ist eine Kinase, die assoziiert mit und inaktiviert ist durch Assoziation mit V7.
Bei Fehlen einer Peptidbehandlung copräzipitierte RAF-1-Protein mit V7. In Peptid-behandelten Zellen wurde RAF-1-Protein von dem V7-Immunokomplex eliminiert. Die gleichen Peptide waren nicht in der Lage, einen Komplex, der aus RAF-1 und p21 Ras bestand, zu zerstören, wodurch nichtspezifische Modifikation von RAF-1 durch das V7-Peptid ausgeschlossen wird.
In einer zweiten Studie wurde der V7-Peptidteil des V7-Poly-Arginin-Konjugats in vitro phosphoryliert unter Verwendung von Protein-Kinase-C. Anti-RAF-1-Präzipitate von T-Zellen, die den phosphorylierten V7-Schwanzpeptiden ausgesetzt waren, jedoch nicht dem unphosphorylierten V7-Schwanzpeptid, zeigten potente Inhibierung der RAF-Kinaseaktivität.
Wenngleich die Erfindung unter Bezugnahme auf spezifische Verfahren und Ausführungsformen beschrieben worden ist, wird ersichtlich sein, dass verschiedene Modifikationen und Veränderungen gemacht werden können.

Claims

Konjugat, umfassend ein biologisch aktives Mittel, das kovalent an einen polymeren Träger gebunden ist, der ein Nicht-Peptidgrundgerüst aufweist, worin der polymere Träger (a) aus 6 bis 25 Untereinheiten besteht, von welchen mindestens 50% mit einer Seitenkettengruppe substituiert sind, die eine terminale Guanidino- oder Amidinogruppe enthält, (b) mindestens sechs derartige Guanidino- oder Amidino-Seitenkettengruppen enthält und (c) wirksam ist, um die Menge biologisch aktives Mittel, die durch eine biologische Membran transportiert wird, relativ zur Menge des Mittels, die durch die biologische Membran in unkonjugierter Form transportiert werden kann, zu erhöhen.
Konjugat nach Anspruch 1, worin der polymere Träger wirkungsvoll ist, um die Menge des biologisch aktiven Mittels, die durch eine biologische Membran transportiert wird, um mindestens das zweifache, optional mindestens das sechsfache, relativ zur Menge des Mittels, die durch die biologische Membran transportiert werden kann, wenn das Mittel an ein basisches HIV tat-Peptid konjugiert ist, das aus den Resten 49–57 besteht, zu erhöhen.
Konjugat nach Anspruch 1, worin der polymere Träger ebenfalls wirkungsvoll ist, um die Rate mit welcher das biologisch aktive Mittel durch eine biologische Membran transportiert wird, relativ zur Rate, mit welcher das biologische Mittel in unkonjugierter Form durch die biologische Membran transportiert werden kann, zu erhöhen.
Konjugat nach Anspruch 3, worin der polymere Träger wirkungsvoll ist, um die Rate, mit welcher das biologisch aktive Mittel durch eine biologische Membran transportiert wird, um mindestens das zweifache, optional mindestens das sechsfache, relativ zur Rate, mit welcher das Mittel durch die biologische Membran transportiert werden kann, wenn das Mittel an ein basisches HIV tat-Peptid konjugiert ist, das aus den Resten 49–57 besteht, zu erhöhen.
Konjugat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das biologisch aktive Mittel kovalent durch einen spaltbaren Linker an den Träger gebunden ist und worin der Linker in vivo spaltbar ist.
Konjugat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der polymere Träger aus 6 bis 25 benachbarten Untereinheiten besteht, von welchen jede eine Seitenkettengruppe enthält, die eine terminale Guanidino- oder Amidinogruppe umfasst.
Konjugat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Nicht-Peptidgrundgerüst ein peptoides Grundgerüst ist und die Untereinheiten N– substituierte Glycin-Untereinheiten sind.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin das Nicht-Peptid-Grundgerüst aus Alkylgruppen besteht, die durch Carbamat-Bindungen verbunden sind.
Verfahren nach einem, der Ansprüche 1 bis 3, worin das Nicht-Peptid-Grundgerüst ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Alkyleneinheiten, die verbunden sind durch Thioether, Sulfonylgruppen, Carbamatgruppen, Polyethylenimine oder Aminoaldehyde, Hydroxysäureester und Aza-Analoge, worin ein alpha-Kohlenstoff durch Stickstoff ersetzt ist, gegebenenfalls worin das Nicht-Petid-Grundgerüst Peptoid-, Malonat- und/oder gem-Diaminoalkyl-Untereinheiten umfasst.
Konjugat nach Anspruch 1, worin das Nicht-Peptidgrundgerüst aus Bindungen besteht, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus N-substituierten Amid-, Ester-, Ketomethylen-, Methylenamino-, Thioamid-, Phosphinat-, Phosphonamidat-, Phosphonamidatester-, Retropeptid-, trans-Alken-, Fluoralken-, Dimethylen-, Thioether-, Hydroxyethylen-, Methylenoxy-, Tetrazol-, Retrothiamid-, Sulfonamido-, Methylensulfonamido- und Retrosulfonamidobindungen.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin jede terminale Guanidino- oder Amidinogrupppe an das Grundgerüst durch eine Seitenkette gebunden ist, die mindestens etwa 2 Kettenatome umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Kohlenstoff, Sauerstoff, Schwefel, Phosphor und Stickstoff und Kombinationen davon.
Konjugat nach Anspruch 11, worin der Seitenketten-Linker 2 bis 5 Atome enthält.
Konjugat nach Anspruch 11, worin die Seitenkette die Struktur-(CH₂)_n-aufweist, worin n eine ganze Zahl im Bereich von 2 bis einschließlich 5 ist.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 13, worin das biologisch aktive Mittel ein kleines organisches Molekül ist.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 14, weiterhin umfassend einen zusätzlichen polymeren Träger, der kovalent an das biologisch aktive Mittel konjugiert ist, worin der zusätzliche polymere Träger ein Nicht-Peptidgrundgerüst aufweist, das aus 6 bis 25 Untereinheiten besteht, von welchen mindestens 50% mit einer Seitenkettengruppe substituiert sind, die eine terminale Guanidino- oder Amidinogruppe enthält und mindestens sechs derartige Guanidino- oder Amidino-Seitenkettengruppen enthält.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 15, weiterhin umfassend ein zusätzliches biologisch aktives Mittel, das kovalent mit dem Träger konjugiert ist.
Konjugat nach einem der Ansprüche 5 bis 16, worin der spaltbare Linker enzymatisch spaltbar, chemisch spaltbar oder photochemisch spaltbar ist.
Konjugat nach einem der Ansprüche 5 bis 17, worin der spaltbare Linker eine Carbamat-, Ester-, Thioether-, Disulfid- oder Hydrazonbindung umfasst.
Konjugat nach Anspruch 18, worin der spaltbare Linker eine Esterbindung oder eine Disulfidbindung umfasst.
Konjugat nach einem der Ansprüche 5 bis 19, worin der spaltbare Linker eine erste spaltbare Gruppe, die distal zum biologisch aktiven Mittel ist, und eine zweite spaltbare Gruppe, die proximal zum biologisch aktiven Mittel ist, enthält, wobei die Spaltung der ersten spaltbaren Gruppe ein Linker-biologisch aktives Mittel-Konjugat ergibt, das eine nucleophile Gruppe enthält, die intramolekular reagiert, um die zweite spaltbare Gruppe abzuspalten, wobei das biologisch aktive Mittel von dem Linker und dem Träger freigesetzt wird.
Verfahren zum Erhöhen des Transports eines biologisch aktiven Mittels durch eine biologische Membran, wobei das Verfahren umfasst: in vitro In-Kontakt-bringen der biologischen Membran mit einem Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 20; wobei das In-Kontakt-bringen wirksam ist, um die Zuführung des Konjugats durch die biologische Membran im Vergleich zur Zuführung des biologisch aktiven Mittels durch die Membran in nichtkonjugierter Form zu erhöhen.
Verfahren nach Anspruch 21, worin das biologisch aktive Mittel kovalent an den Träger durch einen spaltbaren Linker gebunden ist, worin der Linker in vivo spaltbar ist.
Verfahren nach Anspruch 21 oder Anspruch 22, worin die biologische Membran eine eukariotische Zellmembran ist.
Verfahren nach Anspruch 21 oder Anspruch 22, worin die biologische Membran eine prokariotische Zellmembran ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 24, worin der spaltbare Linker abgespalten wird, um freies biologisch aktives Mittel nach dem Durchgang durch die biologische Membran freizusetzen.
Verfahren nach Anspruch 25, worin der spaltbare Linker ein enzymatisch spaltbarer Linker ist und das freie biologisch aktive Mittel freigesetzt wird durch In-Kontakt-bringen des Konjugats mit einem Enzym, das den Linker spaltet.
Verfahren nach Anspruch 25, worin der spaltbare Linker ein photospaltbarer spaltbarer Linker ist und das freie biologisch aktive Mittel freigesetzt wird durch In-Kontakt-bringen des Konjugats mit Licht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 25, worin der spaltbare Linker ein chemisch spaltbarer Linker ist.
Verfahren nach Anspruch 28, worin der spaltbare Linker eine Disulfidbindung umfasst und die Spaltung des Linkers durch Reduktion oder Disulfidaustausch bewirkt wird.
Verwendung eines polymeren Trägers, der ein Nicht-Peptidgrundgerüst aufweist, zur Herstellung eines Medikaments zur Erhöhung der Menge eines biologisch aktiven Mittels, die durch eine biologische Membran transportiert wird, relativ zur Menge des Mittels, die durch die biologische Membran in unkonjugierter Form transportiert werden kann, worin das biologisch aktive Mittel kovalent an den polymeren Träger gebunden ist und der polymere Träger (a) aus 6 bis 25 Untereinheiten besteht, von welchen mindestens 50% mit einer Seitenkettengruppe substituiert sind, die eine Guanidino- oder Amidinogruppe enthält und (b) mindestens sechs derartige Guanidino- oder Amidino-Seitenkettengruppen enthält.
Verwendung nach Anspruch 30, worin das biologisch aktive Mittel kovalent an den Träger durch einen spaltbaren Linker gebunden ist und worin der Linker in vivo spaltbar ist.
Verwendung nach Anspruch 30 oder 31, worin der polymere Träger aus 6 bis 25 benachbarten Untereinheiten besteht, von welchen jede eine Seitenkettengruppe enthält, die eine terminale Guanidino- oder Amidinogruppe umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 30 bis 32, worin das Nicht-Peptidgrundgerüst ein peptoides Grundgerüst ist und die Untereinheiten N-substituierte Glycin-Untereinheiten sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 30 bis 32, worin das Nicht-Peptid-Grundgerüst aus Alkylengruppen besteht, die durch Carbamat-Bindungen verknüpft sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 30 bis 34, worin jede terminale Guanidino- oder Amidinogruppe an das Grundgerüst durch eine Seitenkette gebunden ist, die mindestens etwa 2 Kettenatome umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Kohlenstoff, Sauerstoff, Schwefel, Phosphor und Stickstoff und Kombinationen davon.
Verwendung nach Anspruch 35, worin der Seitenkettenlinker 2 bis 5 Kettenatome enthält.
Verwendung nach Anspruch 35, worin die Seitenkette die Struktur -(CH₂)_n-aufweist, worin n eine ganze Zahl im Bereich von 2 bis einschließlich 5 ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 30 bis 37, worin der spaltbare Linker eine Carbamat-, Ester-, Thioether-, Disulfid- oder Hydrazonbindung umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 30 bis 37, worin der spaltbare Linker eine erste spaltbare Gruppe, die distal zum biologisch aktiven Mittel ist, und eine zweite spaltbare Gruppe, die proximal zum biologisch aktiven Mittel ist, enthält, wobei die Spaltung der ersten spaltbaren Gruppe ein Linker-biologisch aktives Mittel-Konjugat ergibt, das eine nucleophile Gruppe enthält, die intramolekular reagiert, um die zweite spaltbare Gruppe abzuspalten, wobei das biologisch aktive Mittel von dem Linker und dem Träger freigesetzt wird.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 20, worin das biologisch aktive Mittel (a) eine Nucleinsäure; (b) ein Oligonucleotid; (c) ein Polynucleotid; (d) ein Peptid, z. B. ein Effektor-Polypeptid oder ein Rezeptorfragment, wie etwa RAF-1; (e) ein Protein, z. B. ein Enzym, ein Antigen, ein Antikörper oder ein Antikörperfragment; (f) eine Proteinnucleinsäure; (g) ein Polysaccharid; (h) ein antimikrobielles Mittel; oder (i) ein Antikrebsmittel ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verabreichung eines biologisch aktiven Mittels, dessen Wirksamkeit in nichtkonjugierter Form durch seine Wasserlöslichkeit begrenzt ist, wobei die Zusammensetzung aus dem biologisch aktiven Mittel und kovalent daran gebunden, einem polymeren Träger, der ein Nicht-Peptidgrundgerüst aufweist, besteht, worin der polymere Träger (a) aus 6 bis 25 Untereinheiten besteht, von welchen mindestens 50% mit einer Seitenkettengruppe substituiert sind, die eine terminale Guanidino- oder Amidinogruppe enthält, (b) mindestens sechs derartige Guanidino- oder Amidino-Seitenkettengruppen enthält und (c) wirksam ist, um die Menge biologisches Mittel, die durch eine biologische Membran transportiert wird, relativ zur Menge des Mittels, die durch die biologische Membran in unkonjugierter Form transportiert werden kann, zu erhöhen.