CZ406699A3 - Farmaceutický prostředek a způsob zvýšení transportu vybraných sloučenin přes biologickou membránu - Google Patents

Abstract

Toto řešení popisuje způsoby a prostředky pro transport léků a makromolekul přes biologické membrány. Vjednompřípadě řešení zahrnuje způsob zvýšení transportu vybraných sloučenin přes biologickoumembránu, kdeje biologická membrána v kontaktu s konjugátem obsahujícímbiologicky aktivní látku tak, žeje kovalentně navázán na transportní polymer. Vjednompřípadě obsahuje polymer od 6 do 25 podjednotek, ve kterýchje obsaženo alespoň 50 % guanidinových nebo amidinových skupin na postranním řetězci. Polymerje účinný při předávání připojeného činidla transportovaného přes biologickou membránu transmembránovou iychiostí, jenžje větší než rychlost transmembránového transportu činidla v nekonjugativní formě.

Description

FARMACEUTICKÝ PROSTŘEDEK A ZPŮSOB ZVÝŠENÍ TRANSPORTU VYBRANÝCH SLOUČENIN PŘES BIOLOGICKOU MEMBRÁNU

OBLAST TECHNIKY

Předkládaný vynález je zaměřený na způsoby a prostředky, které jsou účinné ke zvýšení transportu biologicky aktivních činidel, jako jsou organické sloučeniny, polypeptidy, oligosacharidy, nukleové kyseliny a ionty kovů přes biologické membrány.

DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY

Buněčná plazmatická membrána představuje bariéru pro průchod mnoha užitečných terapeutických činidel. Obecně musí být léky volně rozpustné ve vodných částech těla a v lipidových vrstvách, přes které musí projít, aby pronikly do buňky. Obzvláště velmi nabité molekuly přecházejí těžce přes membrány. Mnoho terapeutických makromolekul, jako jsou peptidy a oligonukleotidy, je rovněž neochotně transportováno přes membránu. A tak zatímco biotechnologie vyrobila velké množství cenově dostupných terapeutik, s ohledem na biologickou dostupnost se často brzdí jejich lékařské použití. Proto je zapotřebí spolehlivý způsob přenosu léčiv a hlavně makromolekul do buněk.

Až dosud byla navržena řada transportních molekul přenášejících molekuly přes biologické membrány. Ryser et al. (1979) přednáší použití vysoce molekulárních polymerů lysinu určených ke zvýšení transportu řady molekul přes buněčné membrány, především s velmi vysokými molekulárními hmotnostmi. Ačkoli autoři pozorovali polymery jiných pozitivně nabitých zbytků, např. ornithinu a argininu, činnost těchto polymerů nebyla prokázána.

Frankel et al. (1991) přednáší, že konjugace vybraných molekul na tat protein viru HIV může zvýšit buněčný příjem těchto molekul. Avšak použití tat proteinu mělo hlavní nevýhody zahrnující nepříznivé seskupování a nerozpustnost.

Barsoum et al. (1994) a Fawell et al. (1994) předpokládali použití kratších fragmentů tat proteinu skládající se z tat základní oblasti (zbytky 49 až 57 o sekvenci RKKRRQRRR). Barsoum et al. oznamovali, že průměrně dlouhé polyargininové polymery (M_w 5 000 až 15 000 Daltonů) neumožnily transport β-galaktosidu přes buněčné membrány (např. Barsoum na str. 3), na rozdíl od předpokladu Rysera et al. (supra).

Další studie ukazují, že 16 aminokyselinových peptid-cholesterolových konjugátů získaných z homeoboxu Arttennapedia je rychle internalizováno kultivovanými neurony (Brugidou et al.,

1995). Avšak nepatrně kratší forma tohoto peptidu (15 zbytků) není buňkami účinně přijímána (Derossi eíal._y 1996).

Předkládaný vynález je zčásti založen na žadatelově objevu, že konjugace určitých polymerů složených ze sousedících, velmi základních podjednotek, zejména podjednotek obsahujících guanidylové nebo amidinylové skupiny po malé molekuly nebo makromolekuly, je účinná k podstatnému zvýšení transportu připojených molekul přes biologické membrány. Avšak transport nastane rychlostí podstatně vyšší než je rychlost transportu základního HIV tat peptidu, jenž se skládá z 49 až 57 zbytků.

PODSTATA VYNALEZU

Z jednoho pohledu zahrnuje předkládaný vynález způsob zvýšení transportu vybrané sloučeniny přes biologickou membránu. Tímto způsobem je biologická membránu v kontaktu s konjugátem, jenž obsahuje biologicky aktivní látku tak, že je kovalentně vázán na alespoň jeden transportní polymer. Konjugát je účinný k podporování transportu přes biologickou membránu v rychlosti, jenž je větší než rychlost trans-membránového transportu biologického činidla v nekonjugativní formě.

V jednom případě polymer obsahuje od 6 do 25 podjednotek, alespoň 50 % z nich obsahuje guanidinovou nebo amidinovou skupinu na bočním řetězci, kde polymer obsahuje na bočním řetězci alespoň 6 a lépe alespoň 7 guanidinových nebo amidinových skupin. V jiném případě polymer obsahuje od 6 do 20, od 7 do 20 nebo od 7 do 15 podjednotek. Lépe alespoň 50 % těchto podjednotek v polymeru obsahuje na bočním řetězci guanidinovou nebo amidinovou skupinu a ještě lépe 90 %. Přednostně žádná guanidinová nebo amidinová skupina na postranním řetězci není oddělena od jiné takové skupiny více jak jednou neguanidinovou nebo neamidinovou podjednotkou. V mnohem specifičtějších případech obsahuje polymer alespoň 6 sousedících podjednotek, kde každá obsahuje buď guanidinovou nebo amidinovou skupinu a lépe alespoň 6 nebo 7 sousedících guanidinových skupin na bočním řetězci.

V jiném případě obsahuje transportní polymer od 6 do 25 sousedících podjednotek, od 7 do 25, od 6 do 20 nebo lépe od 7 do 20 sousedících podjednotek, kde každá z nich obsahuje guanidinovou nebo amidinovou skupinu na bočním řetězci a s volitelnou podmínkou, že jedna z sousedících podjednotek může obsahovat jiný než argininový zbytek, na které je činidlo připojeno.

V jednom případě obsahuje každá sousedící podjednotka guanidinovou skupinu, jak je doloženo příkladem polymeru obsahujícího alespoň 6 sousedících argininových zbytků. Lépe je každý ·· 0 ·· ·· • · · 0 · * · · • · · 0 · · · ·· 000 00 0 • 0 0 · 0 0 0 •0 ·00 00 0· transportní polymer lineární. V preferovaných případech je činidlo připojena na terminální konec transportního polymeru.

V jiných specifických případech konjugát obsahuje jediný transportní polymer.

Transport zvyšující polymery jsou například ve vhodných případech peptidy, ve kterých tvoří podjednotky argininové zbytky. Tyto polyargininové peptidy mohou být složeny buď všechny z D-, L- nebo směsí D- a L-argininů a mohou zahrnovat další aminokyseliny. Pro zvýšení biologické stability polymeru během přenosu konjugátu na jeho biologický cíl je lepší, když jsou alespoň jeden nebo přednostně všechny podjednotky zbytky D-argininu.

Způsob může být použit pro zvýšení transportu vybraných terapeutických činidel přes jakékoliv množství biologických membrán včetně eukaryotických buněčných membrán, prokaryotických buněčných membrán a buněčných stěn, ale není to limitující. Vzorovým příkladem prokaryotických buněčných membrán jsou bakteriální membrány. Vzorovým příkladem eukaryotických buněčných membrán jsou membrány dendritických buněk, epitelových buněk, endotelových buněk, keratinocytů, svalových buněk, buněk hub, bakteriálních buněk, rostlinných buněk apod., ale není to limitující.

Podle preferovaných případů vynálezu mají transportní polymery vynálezu zdánlivou afinitu (K_m), jenž je alespoň desetkrát větší a lépe alespoň 1 OO-krát větší než je afinita měřená pro tat (49 - 57) peptid podle příkladu 6, kde je měřena při pokojové teplotě (23 °C) nebo 37 °C. Biologicky aktivní látky (jenž obsahují terapeutika) zahrnují, ale není to limitující, ionty kovů, které jsou běžně dodávány jako kovové cheláty, malé organické molekuly, jako jsou protirakovinné (např. taxan) a antimikrobiální molekuly (např. proti bakteriím nebo houbám nebo kvasinkám) a makromolekuly, jako jsou nukleové kyseliny, peptidy, proteiny a jejich analogy. V jednom upřednostňovaném případě je činidlem nukleová kyselina nebo její analog, jako je ribozym, jenž volitelně obsahuje jednu nebo více 2'-deoxynukleotidových jednotek pro zvýšení stability. Jinak je činidlem peptidová nukleová kyselina (PNA). V jiných preferovaných případech je činidlem polypeptid, např. proteinový antigen a biologickou membránou je buněčná membrána antigen prezentující buňky (APC). V jiných případech je činidlo vybráno tak, aby podporovalo nebo vyvolávalo imunitní odpověď proti vybranému tumorovému antigenu.

V dalších preferovaných případech je činidlo taxan nebo taxoidová protinádorová sloučenina.

V dalších případech je činidlo nepolypeptidové činidlo, lépe nepolypeptidové terapeutikum.

V mnohem obecnějších případech má činidlo vhodně molekulovou hmotnost menší než 10 kDa. Činidlo může být připojeno k polymeru vazebnou skupinou, která může konjugátu udávat konformační flexibilitu a usnadňovat vazbu mezi činidlem a jeho biologickým cílem. V jednom případě je vazebná skupina štěpitelný spojovníkový článek, např. obsahující spojovníkovou • * skupinu, která je štěpitelná enzymem nebo pomocí rozpouštědla, jako je ester, amid nebo disulfidová skupina. V jiném případě obsahuje štěpitelný spojovníkový článek fotoštěpitelnou skupinu.

V mnohem specifičtějším případě obsahuje štěpitelný spojovník jednu štěpitelnou skupinu, která je vzdálená od biologicky aktivní látky a druhou štěpitelnou skupinu, jenž je v blízkosti činidla, takže štěpení první štěpitelné skupiny poskytuje konjugát spojovník-činidlo obsahující nukleofilní skupinu schopnou reagovat intramolekulárně za rozštěpení druhé štěpitelné skupiny, čímž se z uvedeného spojovníku a polymeru uvolní činidlo.

V jiném případě může být vynález použit pro sledování množství konjugátů pro vybranou biologickou aktivitu, kde uvedené konjugáty vznikly z mnoha ucházejících se činidel, Konjugáty jsou připojeny v kontaktním místě s buňkou, jenž vykazuje detektovatelný signál při příjmu konjugátu do buňky, takže velikost signálu je indikací účinnosti konjugátu vzhledem k vybrané biologické aktivitě. Tato metoda je částečně použitelná pro testování aktivit činidel, které jsou sami neschopné nebo slabě schopné uvést buňky do evidentní aktivity. V jednom případě jsou ucházející se činidla vybrány z kombinatorické knihovny.

Vynález rovněž zahrnuje knihovnu konjugátů, jenž je používána pro sledování výše uvedených způsobů.

V dalším ohledu vynález zahrnuje farmaceutický prostředek pro dodání biologicky aktivního činidla přes biologickou membránu. Prostředek obsahuje konjugát zahrnující biologicky aktivní činidlo kovalentně vázané na alespoň jeden transportní polymer, jak je popsáno výše a farmaceuticky přijatelnou pomocnou látku. Polymer je účinný k podporování transportu činidla přes biologickou membránu v rychlosti, jenž je větší než rychlost trans-membránového transportu biologického činidla v nekonjugované formě. Prostředek může být dodatečně zabalen s instrukcemi pro použití.

V jiném ohledu vynález obsahuje terapeutický způsob léčení savčích buněk, zejména lidských, farmaceutickým prostředkem popsaným výše.

Tyto a jiné objekty a rysy vynálezu budou mnohem více jasné, pokud bude následující detailní popis vynálezu čten v současně s doprovodnými obrázky.

Obrázky IA a 1B jsou obrázky buněčných příjmů určitých polypeptid-fluoresceinových konjugátů obsahujících tat základní peptid (49 - 57, SEQ ID NO: 1), poly-Lys (K9, SEQ ID NO:

2) a poly-Arg (R4 - R9 a r4 - r9, SEQ ID NO: 3 až 8 a 12 - 17, v tomto pořadí), jako funkci koncentrace peptidu, obr. IC je histogram příjmových hladin konjugátu měřených pro konjugáty o koncentraci 12,5 μΜ (příklady 2 až 3).

Obrázky 2A až 2F představují počítačově zpracovaný obraz z konfokálního mikroskopu (příklad 4) ukazující vysílanou fluorescenci (2A až 2C) a propouštěné světlo (2D až 2F) z buněk linie Jurkat po inkubaci při 37 °C po dobu 10 minut s 6,25 μΜ tat (49 - 57) konjugovaným na fluorescein (obrázky A a D) a 7-mer poly-L-argininu (R7) značeného fluoresceinem (obrázky B a E) nebo 7-mer poly-D-argininu (r7) značeného fluoresceinem (obrázky C a F).

Obrázek 3 ukazuje buněčný příjem určitých konjugátu poly-Arg-fluorescein (r9, R9, R15, R20 a R25, SEQ ID NO: 17 a 8 až 11, v tomto pořadí) jako funkcí koncentrace konjugátu (příklad 5). Obrázek 4 ukazuje histogram buněčného příjmu fluoresceinu konjugovaného na tat (49-57) a poly-Arg-fluoresceinových a poly-Arg-fluoresceinových konjugátů (r9, R8 a R7, jednotlivě) v nepřítomnosti (4 sloupce diagramu nalevo) a přítomnosti (4 sloupce grafu napravo) 0,5 % azidu sodného (příklad 7).

Obrázky 5A až 5C ukazují obrázky hladin příjmů vybraných polymerních konjugátů (K9, R9, r4, r5, r6, r7, r8 a r9) bakteriálními buňkami jako funkci koncentrace konjugátu, obr. 5A zahrnuje hladiny příjmů pozorované u R9 a r9 konjugátů jako funkci koncentrace konjugátu, pokud byly inkubovány s buňkami kmene E. coli HB101, obr. 5B zahrnuje velikosti příjmů pozorované u K9 a r4 až r9 konjugátů, pokud byly inkubovány s buňkami E. coli HB101, obr. 5C zahrnuje hladiny příjmů konjugátů r9 a K9, pokud byly inkubovány s buňkami Streptomyces bovis.

Obrázky 6A až 6E představují příklady konjugátů vynálezu, jenž obsahují štěpitelné spojovníkové skupiny. Obrázky 6F a 6G ukazují chemické struktury a běžně číslované základní atomy hlavního řetězce paclitaxelu a „TAXOTERE“. Obr. 6H představuje obecný chemický vzorec a číslování atomů v kruhu pro taxoidové sloučeniny.

A obr. 7 ukazuje inhibici sekrece gamma-interferonu (γ-IFN) myšími T buňkami jako funkci koncentrace konjugátu sense-PNA-r7 (SEQ ID NO: 18), anti-sense-PNA-r7 konjugátu (SEQ ID NO: 19) a nekonjugovaného anti-sense-PNA (SEQ ID NO: 20), kde PNA sekvence jsou založeny na sekvenci genu pro gamma-inerferon.

I. Definice

Termínem „biologická membrána“, jak je zde používán, se míní lipidové bariéry, jenž oddělují buňky nebo skupiny buněk od extracelulárního prostoru. Biologické membrány zahrnují, ale není to limitující, plazmatické membrány, buněčné membrány, intracelulární membrány organel, jak je mitochondriální, jaderná apod.

Termínem „trans-membránová koncentrace“ se míní koncentrace sloučeniny přítomné na té straně membrány, jenž je na druhé straně membrány, než na kterou byl konkrétní prostředek dodáván. Například, pokud je sloučenina přidávána do extracelulární tekutiny, množství později měřené sloučeniny uvnitř buňky je trans-membránová koncentrace sloučeniny.

„Biologicky aktivním činidlem“ nebo „biologicky aktivní látkou“ se míní chemická látky, jako jsou malé molekuly, makromolekuly nebo ionty kovů, které způsobují pozorovatelné změny ve struktuře, funkci nebo složení buněk při příjmu buňkami. Pozorovatelné změny zahrnují zvýšení nebo snížení exprese jedné nebo více mRNA, zvýšení nebo snížení exprese jednoho nebo více proteinů, fosforylace proteinu nebo jiných buněčných složek, inhibice nebo aktivace enzymu, inhibice nebo aktivace vazby mezi členy vazebného páru, zvýšení nebo snížení rychlosti syntézy metabolitu, zvýšení nebo snížení buněční proliferace apod.

Termínem „makromolekula“, jak je zde použit, se míní například velké molekuly (o M_w větší než 1000 daltonů), ale není to limitující, peptidy, proteiny, oligonukleotidy a polynukleotidy biologického nebo syntetického původu.

„Malé organické molekuly“ jsou látky obsahující uhlík o molekulové hmotnosti (M_w) nižší nebo rovná 1000 daltonů.

Termínem „terapeutické činidlo“, „terapeutický prostředek“ a „terapeutická látka“ se míní, ale není to limitující, jakýkoliv prostředek který je použit tak, aby byl savčím druhům prospěšný. Taková činidla mohou být například ve formě iontů, malých organických molekul, peptidů, proteinů nebo polypeptidů, oligonukleotidů a oligosacharidů.

Termínem „nepolypeptidové činidlo“ a „nepolypeptidové terapeutické činidlo“ se míní úsek transportního polymerního konjugátu, jenž nezahrnuje polymer zvyšující transport a jenž je biologicky aktivní činidlo jiné než polypeptid. Příkladem nepolypeptidového činidla je oligonukleotid beze smyslu, který může být konjugován na poly-argininový peptid formou konjugátu, aby došlo ke zvýšení přenosu přes biologické membrány.

Termínem „polymer“ se míní lineární řetězec dvou nebo více shodných nebo neshodných podjednotek spojených kovalentními vazbami. Peptid je například takový polymer obsahující shodné nebo neshodné aminokyselinové podjednotky, jenž jsou spojeny peptidovými vazbami. Termínem „peptid“, jak je zde používán, se míní sloučenina tvořená jedním řetězcem D- nebo Laminokyselin nebo směsí D- a L-aminokyselin spojených peptidovými vazbami. Obecně peptidy obsahují alespoň dva aminokyselinové zbytky a jejich délka je menší než 50 aminokyselin. Termínem „protein“, jak je zde používán, se míní sloučenina skládající se z lineárních aminokyselin pospojovaných peptidovými vazbami, ale na rozdíl od peptidů mají velmi dobře definovanou konformaci. Proteiny se na rozdíl od peptidů skládají z řetězců o 50 nebo více aminokyselinách.

0 0 0 9 990 · «· ·

90 9 0 · 0 9 „Polypeptid“, jak je zde používáno, je polymer o alespoň dvou aminokyselinových zbytcích a obsahuje jednu nebo více peptidových vazeb. „Polypeptid“ zahrnuje peptidy a proteiny přesto, zda má polypeptid dobře popsanou konformaci.

Termíny „gunidyl“, „guanidinyl“ a „guanidino“ jsou používané zaměnitelně a týkají se skupin o vzorci -HN=C(NH2)NH (neprotonový tvar). Tak například arginin obsahuje guanidylovou (guanidinovou) skupinu a rovněž se vztahuje na 2-amino-5-guanidinovalerovou kyselinu nebo aamino-ó-guanidinovalerovou kyselinu. „Guanidium“ se vztahuje na pozitivně nabitý konjugát v kyselé formě.

„Amidinyl“ a „amidino“ se týká skupiny o vzorci -C(=NH)(NH2). „Amidinium“ se vztahuje na pozitivně nabitý konjugát v kyselé formě.

Termínem „poly-arginin“ nebo „póly-Arg“ se míní polymerní sekvence složená sousedících argininových zbytků, poly-L-arginin se týká všech L-argininů, poly-D-arginin všech D-argininů. Poly-L-arginnin se rovněž zkracuje velkým písmenem „R“, následuje počet L-argininů v peptidu (např. R8 představuje 8-mer sousedících L-argininových zbytků), poly-D-arginin je zkracován malým písmenem „r“, následuje počet D-argininů v peptidu (r8 představuje 8-mer sousedících D-argininových zbytků).

Aminokyselinové zbytky jsou zde představeny jejich celým názvem nebo standardními jedno písmenkovými nebo tří písmenkovými zápisy: A, Ala, alanin; C, Cys, cystein; D, Asp, kyselina asparagová; E, Glu, kyselina glutamová; F, Phe, phenylalanin; G, Gly, glycin; H, His, histidin; I, Ile, isoleucin; K, Lys, lysin; L, Leu, leucin; M, Met, methionin; A, Asn, asparagin; P, Pro, prolin; Q, Gin, glutamin; R, Arg, arginin; S, Ser, serin; T, Thr, threonin; V, Val, valin; W, Trp, tryptofan; X, Hyp, hydroxyprolin; Y, Tyr, tyrosin.

II. Struktura polymerních skupin

V jednom případě obsahují transportní polymery v souladu s předkládaným vynálezem krátké polymery od 6 do 25 podjednotek, jak je popsáno níže. Konjugát je účinný ke zvýšení transportní rychlost konjugátu přes biologickou membránu vzhledem k transportní rychlosti samotných nekonjugovaných biologických činidel. Ačkoliv uvedené polymerní prostředky jsou peptidy, mohou polymery obsahovat nepeptidový základní řetězec anebo podjednotky, jak je diskutováno níže,

V důležitém pohledu vynálezu jsou konjugáty tohoto vynálezu zvláště používány k přenosu biologicky aktivních látek přes buňky nebo membrány organel, pokud jde o činidla typu, jenž požadují trans-membránový transport, aby ukázaly svůj biologický účinek a aby nevykazovaly svůj biologický účinek především vazbou na povrchový receptor, tzn. že nedojde ke vstupu * 4 4 4 ♦ 4 4 4 4 · 4

Q 44 444 4 4 4 4

O 4 4444 4 4 4 4 · 4 • 4 4 4 4 «444

4444 444 44 444 44 «· činidla. Dále jsou konjugáty používány zejména k přenosu biologicky aktivních činidel takového typu, jenž požadují trans-membránový transport k vykazování svého biologického účinku a nejsou sami o sobě schopné (bez konjugace na transportní polymer nebo některé další modifikace) nebo jsou jen nepatrně schopné vniknout do buněk, aby projevily biologickou aktivitu.

Obecně transportní polymer používaný v konjugátu přednostně zahrnuje lineární základní řetězec podjednotek. V základním řetězci jsou různé atomy vybrané od uhlíku, dusíku, kyslíku, síry a fosforu, kde je většinou přítomen v základním řetězci uhlík. Každá podjednotka obsahuje na bočním řetězci skupinu, jenž zahrnuje koncovou guanidinovou nebo amidinovou skupinu. Ačkoliv místo mezi sousedícími skupinami bočního řetězce bude obvykle shodné od podjednotky k podjednotce, polymery používané ve vynálezu mohou rovněž zahrnovat variabilní prostor mezi skupinami bočního řetězce podél základního řetězce.

Skupiny bočního řetězce jsou daleko od základního řetězce, takže hlavní atom uhlíku guanidinové nebo amidinové skupiny (na který jsou připojeny NH2 skupiny) je navázán na základní řetězec spojovníkem postranního řetězce, jenž přednostně obsahuje alespoň dva spojovníkové atomy, lépe od dvou do pěti atomů, takže hlavní atom uhlíku je třetí až šestý atom řetězce vzdálený od základního řetězce. Atomy řetězce jsou přednostně poskytnuty jako methylenový uhlíkový atom, ačkoli jeden nebo více dalších atomů může být rovněž přítomno, např. kyslík, síra nebo dusík. Přednostně článek postranního řetězce mezi základním řetězcem a hlavním atomem uhlíku guanidinové nebo amidinové skupiny je řetězec o čtyřech atomech, jako je například argininový postranní řetězec.

Sekvence transportního polymeru vynálezu může být obklopena jedním nebo více neguanidinovými/neamidinovými podjednotkami nebo spojovníkem, např. aminokapronovou kyselinou, které významně neovlivňují rychlost membránového transportu odpovídajícího konjugátu, jenž obsahuje polymer, např. glycin, alanin a cystein. Rovněž jakékoliv volné aminokyselinové koncové skupiny mohou být zakončeny čepičkou s blokovací skupinou, jako je acetylová nebo benzylová skupina, aby zabránily všudypřítomnosti in vivo.

Aby bylo činidlo transportováno, může být navázáno na transportní polymer vzhledem k množství případů. V jednom upřednostňovaném případě je činidlo navázáno na jednoduchý transportní polymer, buď vazbou na terminální konec transportního polymeru nebo vhodnou vazebnou skupinou na vnitřní podjednotku polymeru.

Ve druhém případě je činidlo připojeno na více než jeden polymer stejným způsobem, jak je popsáno výše. Tento případ je poněkud méně preferován, protože může vést k zesítění sousedících buněk.

* »í · ·· 99

9 9 9 9 9 9 9 9 99 ·

999 9999

999 9 999 99 9

9 999 9999

9999 999 99 999 99 9·

Ve třetím případě obsahuje konjugát dvě skupiny činidel připojených na každý terminální konec polymeru. V tomto případě je upřednostňováno, aby činidlo mělo molekulovou hmotnost menší než 10 kDa.

Pokud jde o první a třetí případ, jenž byly právě zmíněny, není činidlo obecně navázáno najeden z jakéhokoli guanidinového nebo amidinového bočního řetězce, aby mohly volně působit na cílovou membránu.

Konjugáty vynálezu se mohou připravovat jednoduchým syntetickým způsobem. Kromě toho, jsou konjugátové produkty obvykle značně stejné v délce a složení, takže ve svém účinku poskytují větší důslednost a reproduktivnost než heterogenní směsi.

V souladu s důležitými ohledy předkládaného vynálezu bylo zjištěno navrhovatelem, že náklonnost jednoduchého transportního polymeru k jakémukoliv typu biologických aktivních činidel je postačující k tomu, aby se podstatně zvýšila rychlost příjmu činidla přes biologické membrány dokonce i bez požadování přítomnosti velkých hydrofobních skupin v konjugátu. Ve skutečnosti může připojení velkých hydrofobních skupin podstatně bránit nebo zamezit zkříženému membránovému transportu kvůli adhezi hydrofobních skupin na lipidovou dvojvrstvu. Podle toho obsahuje předkládaný vynález konjugáty, jenž neobsahují velké hydrofobní skupiny, např. lipidy a mastné kyseliny. V jiném případě je používán způsob, jenž v podstatě chrání necentrální nervové systémové (ne-CNS) podmínky, které nevyžadují dodání přes krevní mozkovou bariéru.

A, Složení polymerů

Aminokyseliny. V jednom případě je transportní polymer složen z D nebo L aminokyselinových zbytků. Použití přírodně se vyskytujících L-aminokyselin v transportních polymerech má výhodu vtom, že odbourávání produktů by bylo pro buňku nebo organismus relativně netoxické. Upřednostňovanými aminokyselinovými podjednotkami jsou arginin (a-amino-5-guanidinovalerová kyselina) a a-amino-e-amidinohexanová kyselina (izosterický amidinový analog). Guanidiová skupina v argininu má pKa přibližně 12,5.

Obecně jsou upřednostňované takové polymerové podjednotky obsahující velmi zásaditou skupinu vedlejšího řetězce, která (i) má pKa větší než 11, lépe 12,5 nebo větší a (ii) obsahuje ve svém protonovaném stavu alespoň dvě zdvojené aminokyseliny (NH2), jenž sdílí resonančněstabilizovaný kladný náboj, který dodává skupině ligandový charakter.

Mohou být použity i jiné aminokyseliny (obsahující mezi základním řetězcem a centrálním guanidinovým uhlíkem 2, 3, nebo 5 spojovníkových atomů), např. a-amino-P-guanidino10 • · · φ • · φ φ · · 4

Φ Φ Φ Φ

Φ Φ Φ Φ propionová kyselina, a-amino-y-guanidinobutyrová kyselina nebo a-amino-E-guanidinokapronová kyselina.

V transportních polymerech mohou být rovněž použity D-aminokyseliny. Prostředky obsahující výhradně D-aminokyseliny mají výhodu v tom, že snižují enzymatickou degradaci. Mohou však rovněž zůstat zvětší části v cílové buňce neporušené. Taková stabilita obyčejně není tak problematická, jestliže je činidlo biologicky aktivní, když je polymer stále navázaný. Pro činidla neaktivního v konjugátové formě by měl být v konjugátu obsažen spojovník, který je štěpitelný vmiste působení (např. enzymem nebo rozpouštědlem způsobující štěpení v buňce), aby podporoval uvolnění činidla z buněk nebo organel.

Jiné podjednotky. Podjednotky jiné než aminokyseliny mohou být vybrány pro použití ve vytvořených transportních polymerech. Takové podjednotky mohou obsahovat, ale není to limitující, hydroaminokyseliny, N-methylaminokyseliny aminoaldehydů apod., které jsou výsledkem v polymerech s redukovanými peptidovými vazbami. Jiné typy podjednotek mohou být použity v závislosti na původu vybraného základního řetězce, jak je projednáváno v dalších oddílech.

B, Typ základního řetězce

Různé typy základní skeletu mohou být použity pro uspořádání a umístění guanidinových anebo amidinových skupin postranního řetězce, jako jsou alkylové skelety spojené pomocí thioesterů nebo sulfonylových skupin, esterů hydroxykyselin, (ekvivalent k nahrazení amidových spojení pomocí esterových spojů), nahrazujících alfa-uhlík dusíkem za vzniku aza analogů, alkylové skelety spojené pomocí karbamátových skupin, polyethyleniminů (PEI) a aminoaldehydů, za vzniku polymerů složených ze sekundárních aminů.

Detailní seznam skeletů obsahuje N-substituované amidy, (CONR nahrazuje CONH vazby), estery (CO2), redukovaný ketomethylen (COCH2) nebo methylenaminovou skupinu (CH2NH), thioamid (CSNH), fosfornan (PO2RCH2), fosfoamidát a fosfoamidátester (PO₂RNH), retropeptid (NHCO), /rans-alken (CR=CH), fluoralkylen (CF=CH), dimethylen (CH2CH2), thioether (CH2S), hydroxyethylen (CH(OH)CH₂), sulfonamido (SO₂NH), methylensuífonamido (CJTRSO₂NH), retrosulfonamíd (NHSO₂), a peptoidy (N-substituované glyciny), a skelety s malonátovými, anebo gem-diaminoalkylovými podjednotkami, např. shrnuto Fletcher et al. (1998) a upřesněno pomocí reference zde citované. Peptidové skelety (N-substituované glyciny) mohou být také použity (např. Kessler, 1993, Zuckermann et al. 1992 a Simon et al., 1992). Hodně předcházejících substitucí má za následek přibližně izosterické polymerní skelety příbuzné ke skeletům vzniklých z alfa-aminokyselin.

9 <99 9 9 9

9999 9

Studie, provedené pro podporu předkládaného vynálezu využívají polypeptidy (např. peptidové skelety). Nicméně, jiné skelety, jako jsou skelety uvedené výše, mohou poskytnout zvýšenou biologickou stabilitu (například, odolnost proti enzymové degradaci in vivo).

C. Syntézy polymerních transportních molekul

Polymery jsou tvořeny pomocí v oboru známých metod. Ukázkové peptidové polymery mohou být produkované synteticky, přednostně použitím peptidového syntetizéru (Applied Biosystem Model 433) nebo mohou být syntetizované rekombinantně pomocí v oboru známých metod. Rekombinantní syntéza je obecně používaná, když je transportní polymer peptid, který fúzuje do polypeptidu nebo proteinu, o který je zájem.

Ν-methyl a hydroxyaminokyseliny mohou být substituované konvenčními aminokyselinami v pevné fázi peptidové syntézy. Nicméně, výroba polymerů s redukovanými peptidovými vazbami vyžaduje syntézu dimeru aminokyselin, které obsahují redukovanou peptidovou vazbu. Takové dimery jsou zabudované do polymerů pomocí standardní procedury syntézy v pevné fázi. Jiné syntetické postupy jsou dobře známé a mohou být nalezené, například, v Fletcher et al. (1998), Simon et al. (1992), a referencích zde citovaných.

III. Připojení transportních polymerů k biologicky aktivním látkám

Transportní polymery vynálezu mohou být připojené kovalentně k biologicky aktivním látkám pomocí chemických a rekombinantních metod.

A. Chemické vazby

Biologicky aktivní činidla, jako jsou malé organické molekuly a makromolekuly mohou být navázané k transportním polymerům vynálezu řadou v oboru známých metod (viz, například, Wong, 1991), buď přímo (např. pomocí karbodiimidu) nebo cestou vazebných skupin. Zvláště karbamátové, esterové, thioetherové, disulfídové a hydrazonové vazby jsou obecně výhodné pro snadnou tvorbu a také vhodné pro velmi mnoho použití. Esterové a disulfídové vazby jsou preferované v případě, že je potřeba aby vazba byla snadno degradovatelná v cytosolu, po transportu látky přes buněčnou membránu.

Různé funkční skupiny (hydroxyl, amino, halogen, atd.) mohou být použity pro připojení biologicky aktivního činidla k transportnímu polymeru. Skupiny, které nejsou známé jako část aktivního místa biologicky aktivního činidla jsou preferované, zejména jestliže polypeptid nebo jakákoliv jeho část zůstává připojená k substanci po jejím doručení.

• 4 4 44 4 «φ • 4 ·· · 4 44 4 · « ·· 4 4 4 4 4 4 4 * · 4·· 444·

4444 444 44 444 44 44

Polymery, jako jsou peptidy produkované podle příkladu 1, jsou obecně produkované s terminální chráněné aminoskupinou, jako je FMOC. Pro biologicky aktivní látky, které mohou odolat podmínkám použitých při štípání polypeptidu ze syntetických pryskyřic a nechránit postranní řetězce, FMOC může být štípána z N-konce kompletního pryskyřicově vázaného polypeptidu tak, že aktivní látka může být vázaná k volnému N-koncovému aminu. V takových případech, připojená aktivní látka je typicky aktivována pomocí metod známých v oboru produkcí aktivních esterů nebo aktivních karbonátových skupin účinných pro tvorbu amidové nebo karbamátové vazby s polymerní aminoskupinou. Ovšem i jiné vazebné chemické struktury mohou být zde použity.

Při minimalizaci postranních reakcí, guanidinové a amidinové skupiny mohou být blokované pomocí konvenčních protekčních skupin, jako jsou karbobenzyloxy skupiny (CBZ), di-ter.-BOC, PMC, Pbf, N-NO2 a podobně.

Párovací reakce jsou prováděné pomocí známých párovacích metod v jakékoliv matici rozpouštědel, jako je N, N-dimethylformamid (DMF), N-methyl pyrrolidinon, dichlormethan, voda a podobně. Ukázková párovací činidla obsahují O-benzotriazolyloxytetramethyluroniumhexafluorfostát (HATU), dicyklohexylkarbodiimid, brom-tri(pyrrolidino)fosfoniumbromid (PyBroP), atd. Jiné činidla mohou být také obsažena, jako je N,Ndimethylaminopyridin (DMAP), 4-pyrrolidinopyridin, N-hydroxysukcinimid, N-hydroxybenzotriazol, a podobně.

Pro biologicky účinné látky, které jsou neaktivní, pokud se neodstraní připojený transportní polymer, je upřednostňován snadno se štěpitelný spojovací článek, tzn. že snadno podléhá enzymatickému štěpení nebo štěpení provedené rozpouštědlem in vivo. Pro tento účel jsou preferované spojovací články, které obsahují esterové (estery karboxylových kyselin) nebo disulfidové vazby, kde dříve jmenované skupiny jsou hydrolyzované enzymaticky nebo chemicky a později jsou odděleny disulfidovou substitucí, např. za přítomnosti glutathionu.

V preferovaném případě obsahuje štěpitelný spojovací článek jednu štěpitelnou skupinu, která je vzdálená od biologicky aktivní látky a druhou štěpitelnou skupinu, která je v blízkosti biologicky aktivní látky, takže odštěpením první štěpitelné skupiny vznikne konjugát spojovacího článkuaktivní látka, který obsahuje nukleofilní část, která je schopna reagovat intramolekulárně za odštěpení druhé štěpitelné skupiny, čímž se z uvedeného spojovacího článku a polymeru uvolní biologicky aktivní látka. Tento případ je dále ilustrován řadou různých konjugátů malých molekul, jak je uvedeno níže.

··♦· ·♦·· ·*·· ·· ··· ···*

B. Fúzní polypeptidy

Transportní peptidové polymery vynálezu mohou být připojené k biologicky aktivním polypeptidovým činidlům pomocí rekombinantních prostředků, a to konstrukcí vektorů pro fúzí proteinů, které obsahují polypeptid o které je zájem a transportní polypeptid, a to pomocí metod v oboru dobře známých. Obecně je transportní peptidový komponent připojen na C-konec nebo N-konec peptidu, o který je zájem. Volitelně pomocí krátkého peptidového článku.

IV. Zvýšení transportu biologicky aktivních látek přes biologické membrány

A. Měření transportu přes biologické membrány.

Modelové systémy pro odhad schopnosti polymerů vynálezu přenášet biomolekuly a jiné terapeutické látky přes biologické membrány obsahuje systémy, které měří schopnost polymeru transportovat kovalentně připojené fluorescenční molekuly přes membránu. Například, fluorescein («376 MW) může sloužit jako model pro transport malých organických molekul (příklad 2). Pro transport makromolekul, transportní polymer může fúzovat do velkého polypeptidů, jako je ovalbumin (molekulová hmotnost 45 kDa, např. příklad 14). Detekovaní přijmu makromolekul může být usnadněno připojením fluorescenčního štítku. Buněčný příjem může být analyzován pomocí konfokálního mikroskopu (příklad 4).

B. Zvýšení transportu přes biologické membrány

V experimentech provedených na podporu předkládaného vynálezu byl trans-membránový přenos a průvodní buněčný příjem odhadován pomocí příjmu přenášeného peptidu spojeného s fluoresceinem, podle metod popsaných v příkladech 2 a 3. Stručně, suspenze buněk byly inkubována s fluoresceinovými konjugáty suspendovanými v pufru různou dobu při 37 °C, 23 °C, nebo při 3 °C. Po inkubaci se reakce zastaví a buňky jsou sebrány pomocí centrifugace » a analyzovány fluorescenčně pomocí tzv. fluorescenčně-aktivovaného buněčného dělení (FACS).

Za použitých podmínek nebyl příjem kunjugátu buňkami nasycen. Následkem toho nemohl být vypočítán a hodnota ED50 pro peptidy. Místo toho, data jsou prezentována jako histogramy dovolující přímé srovnání buněčného příjmu na jednotné koncentraci konjugátu.

Obr. 1A až IC ukazují výsledky ze studie, ve které polymery L-argininu (R, obr. 1A) nebo Dargininu (r, obr. 1B) v rozmezí délky od 4 do 9 argininových podjednotek byly testovány na schopnost transportovat fluorescein do buněk linie Jurkat. Pro srovnání byly také testovány

9 transportní hladiny pro HIV tat zbytky 49 - 57 („49 - 57“) a nonamer L-lysinu (K9). Obr. 1C ukazuje histogram hladiny příjmu pro konjugáty o koncentraci 12,5 μΜ.

Jak je vidět z obrázků, fluorescenčně značené peptidové polymery složené z 6 nebo více argininových zbytků vstupují do buněk účinněji než tat sekvence 49 - 57. Zejména byl zvýšen příjem alespoň dvakrát než je hladina příjmu tat 49 - 57 a přesně 6 až 7 krát větší příjem než tat 49 - 57. Příjem samotného fluoresceinu byl zanedbatelný. Tedy, nanomer lysinu (K9) vykazuje velmi nízký příjem, indikujíce tím, že krátké lysinové polymery jsou neúčinné jako transmembránové přenášeče, v protikladu k srovnatelně dlouhým polymerům obsahujícím guanidin. Pokud jde o obr. IB, homopolymery D-argininu ukazují dokonce větší transportní aktivitu než L-protějšky. Nicméně, řádově je úroveň příjmu stejná. Pro D-homopolymery, peptidy se 7 až 9 argininy vykazují přibližně stejnou aktivitu. Hexamer (R6 nebo r6) byl něco méně účinný, ale ještě stále vykazuje 2 až 3krát větší transportní účinnost než tat (49 - 57).

Schopnost D- a L-arginin polymerů zvýšit trans-membránový přenos byla potvrzena pomocí konfokálního mikroskopu (Obr. 2A až 2F a příklad 4). V souladu s FACS daty popsanými výše, cytosol buněk inkubovaných s R9 (Obr. 2B a 2E) nebo r9 (Obr. 2C a 2F) byl jasně fluorescenční , indikujíc vysokou hladinu konjugátů přenesených do buněk. V porovnání, tat (49 - 57) stejné koncentrace vykazoval jen slabé zbarvení (obr. 2A a 2D). Obrázky z konfokálního mikroskopu také zdůrazňují bod, kdy byl D-argininový polymer (obr. 2C) mnohem účinnější při vstupu do buněk než polymer složený z L-argininu (obr. 2F).

Z dříve zmíněných vývodů je zřejmé, že transportní polymery vynálezu jsou významně více účinné než HIV tat peptid 47-6-59 při transportu léčiv přes plasmatickou membránu buněk. Kromě toho poly-Lys nanomer byl jako přenašeč neúčinný.

Pro určení, zda-li to byla optimální délka sousedících guanidin obsahujících homopolymerů, byla zkoumána sada delších argininových homopolymerových konjugátů /R15, R20, R25 a R30). Pro zkoumání účinnosti podstatně delších polymerů byla také testována směs L-argininových polymerů s průměrnou molekulovou hmotností 12 000 daltonů (asi 100 aminokyselin) (příklad 5). Nicméně, pro zabránění srážecích problémů musela být redukována hladina sera při kvantitativním rozboru s testovacími konjugáty s polymery o molekulové hmotnosti okolo 12 000. Buněčný příjem byl analyzován pomocí FACS, jak je uvedeno výše a byl měřen aritmetický průměr fluorescence živých buněk. Byla také měřena cytotoxicita každého konjugátu.

Pokud jde o obr. 3, příjem L-argininového homopolymerového konjugátu s 15 nebo méně argininy ukazuje model buněčného příjmu zřetelně odlišný od polymerů, které obsahují devět argininů nebo méně. Křivky delších konjugátů byly plošší, protínající tyto od R9 a r9 konjugátů.

·» ♦ Μ · ·4 ·· • · ·· 9 9 99 9 9 9 9 _1Γ · · 9 9 9 9 9 9 9 li 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9999 999 99 999 99 99

Při vyšších koncentracích (>3 μΜ) příjem R9 a r9 by významně lepší než příjem delších polymerů. Nicméně při nižších koncentracích buňky inkubované s delšími polymery vykazují větší fluorescenci.

V závislosti na těchto datech se jeví, že r9 a R9 vstupuje do buněk ve větším podílu než polymery obsahující 15 nebo více sousedících argininů. Nicméně biologický poločas R9 (Lpeptid) byl kratší než pro delší konjugáty, pravděpodobně protože proteolysa delších peptidu (kvůli sérovým enzymům) produkuje fragmenty, které zadržují přenosovou účinnost. Naproti tomu D-isomer (r9) nevykazuje důkazy proteolytické degradace, v souladu s vysokou specifitou sérových proteáz pro L-polypeptidy.

Tedy, celková účinnost transportu transportního polymeru se zdá, že závisí na kombinaci (i) podílu trans-membránového příjmu (polymer s méně než 15 sousedícími argininovými jednotkami jsou lepší) proti citlivosti k proteolytické inaktivaci (delší polymery jsou lepší). Podle toho polymery obsahující 7 až 20 sousedících guanidinových zbytků, lépe 7 až 15, jsou preferované.

Význačně, polyargininové konjugáty o vysoké molekulové hmotnosti (12 000) nevykazují detekovatelný příjem buňkami. Tento výsledek je v souladu s pozorováním Barsouma et al. (1994), a předpokládá, že argininové polynmerymají transportní schopnosti, které jsou významně odlišné od těch, které mohou být vykázané od lysinových polymerů. Dále, 12 000 polyargininové konjugáty byly shledány vysoce toxickými (příklad 5). Obecně, toxicita polymerů roste s délkou, ačkoliv jenom 12 000 konjugáty vykazují vysokou toxicitu při všech testovaných koncentracích.

Když byl buněčný příjem polymerů D- a L-argininu analyzován Michaelis-Mentenovou kinetikou (příklad 6), rychlost příjmu buňkami linie Jurkat byla tak účinná, že přesné hodnoty K_m by mohly být získány, pouze když by bylo stanovení provedeno při 3 °C (na ledě). Obě maximální rychlosti transportu (V_max) a patrné afinity peptidů pro údajný receptor Michaelisovy konstanty (K_m) byly odvozeny z Lineweaver-Burkova grafu získaného fluorescencí buněk linie Jurkat po inkubaci s různými koncentracemi nonamerů D- a L-argininu 30, 60, 120 a 240 sekund.

Kinetická analýza rovněž ukazuje, že polymery bohaté na arginin vykazují lepší schopnost vazby na místa buněčného transportu a přecházet domnělá místa buněčného transportu, než například tat (49 - 57) peptid, jelikož K_m pro transport nonamerického poly-L-argininu (44 μΜ) byl značně nižší než I<_m tat peptidu (722 μΜ).

Avšak nonamer D-argininu vykazuje nižší K_m (7 μΜ) polymerů testovaných tímto stanovením (Tabulka 1), např. přibližně 100-krát věší zdánlivá afinita. Podle upřednostňovaného případu

9· • 9 •	• 99	99 • 9 • ·	• • 9 •	O • 9 • 9	99 • 9 • 9
9					9 9
9	•	• 9	•	9 9	9 9
9999	• 99	99	♦ ··	99	99

vynálezu má transportní polymer vynálezu zdánlivou afinitu (K_m) alespoň 10-krát větší a lépe alespoň ΙΟΟ-krát větší než je afinita měřená pro tat způsobem v příkladu 6 stanovená při pokojové teplotě (23 °C) nebo 37 °C.

	Tabulka 1
Km(pM)	Vmax (|JÍM/s)
H3N-RRRRRRRRR-COO'	44,43	0,35
H3N-rrrrrrrrr-COO'	7,21	0,39
tat 49 - 57	722	0,38

Pokusy provedené za podpory předkládaného vynálezu vykazují, že transport usnadněný polymerem závisí na metabolických vlastnostech buněk. Přidání toxického množství azidu sodného (0,5 % w/v) k buňkám vykazuje inhibici příjmu konjugátů okolo 90 % (příklad 7). Výsledek na obr. 4 ukazuje (i) citlivost azidu sodného na trans-membránový transport, svědčící o energetické závislosti (buněčný příjem) a (ii) převahu poly-guanidinových polymerů vynálezu (R9, R8, R7) vzhledem k HIV tat (49 - 57).

Bez přičítání jakékoliv konkrétní teorii se z dat předkládá, že transport je energeticky závislý proces zprostředkovaný tak, že molekulární transportér přítomný v plazmatických membránách buněk specificky rozpozná quanidinové a amidinové polymery.

Jiné pokusy podporované vynálezem ukazují, že konjugáty vynálezu jsou pro transport biologicky aktivní látky přes membrány různých typů buněk účinné, včetně lidských T buněk (linie Jurkat), B buněk (myší CH27), lymfomové T buňky (myší EL-1), mastocytomové buňky (myší P388), několik myších hybridomových T buněk, neuronové buňky (PC-12), fibroblasty (myší RT), ledvinové buňky (myší HELA), myeloblastomové (myší K562) a primárně tkáňové buňky zahrnující všechny lidské krevní buňky (kromě červených krvinek), např. T a B lymfocytů, makrofágů, dendritických buněk a eionosifilů, bazofilních granulocytů, žírných buněk, endotelových buněk, srdečních tkáňových buněk, jaterních buněk, buněk sleziny, buněk, mízních uzlin a keratinocytů.

Konjugáty jsou rovněž účinné k prostupu obou gram-negativních a gram-pozitivních bakteriálních buněk, jak je popsáno v příkladu 8 a obr. 5A až 5C. Obecně byly polymery Dargininových podjednotek objeveny ke vstupu do gram-pozitivních a gram-negativních bakterií rychlostí značně rychlejší než je transportní rychlost zaznamenaná pro polymery L-argininu. To je ilustrováno na obr. 5A, který ukazuje mnohem vyšší hladiny příjmu r9 konjugátu (D-argininů) než R9 konjugátu (L-argininů), pokud byly inkubovány s buňkami E. coli HB101 (prokaryota). Toto pozorování se může přisuzovat proteolytické degradaci L-polymerů bakteriálními enzymy.

Π·· 9 · · · · · · • 9999 9 9 9 * 9 *

9 999 9999

9999 999 99 999 99 99

Obr. 5Β představuje hladiny příjmů D-argininových konjugátů jako funkce délky (r4 až r9) v porovnání s poyl-L-lysinovým konjugátem (K9), když byl inkubován s buňkami E. coli HB101. Jak může být zřejmé, polyargininové konjugáty ukazují tendenci podobnou té, jenž je pozorována s eukaryotickými buňkami na obr. 2B, to znamená, že polymery kratší než r6 vykazují nízkou hladinu příjmů, s hladinami příjmů se zvyšují jako funkce délky.

Gram-pozitivní bakterie, například Streptomyces bovis, byly rovněž hodně zabarvené argininovými polymery, ale ne lysinem, jak je ukázáno na obr. 5C.

Mnohem obecněji byly pozorovány maximální hladiny příjmů bakteriemi při 37 °C. Avšak významné zabarvení bylo pozorováno, pokud byla inkubace prováděna buď při pokojové teplotě nebo při 3 °C. Konfokální mikroskopie ukazuje, že předem ošetřené bakterie 0,5 % azidem sodným inhibují transport přes vnitřní plazmatickou membránu u obou gram-pozitivní ch a gramnegativních bakterií, ale neinhibují přenos přes buněčnou stěnu (u gram-pozitivních bakterií) do periplazmatického prostoru.

Tudíž vynález zahrnuje konjugáty, jenž obsahují antimikrobiální činidla, jako jsou antibakteriální a protihoubové sloučeniny pro použití k prevenci a inhibici mikrobiální proliferace nebo infekce a k dezinfekci povrchů pro zvýšení léčebné bezpečnosti. Kromě toho může být vynález použit k transportu do rostlinných buněk, zejména zelených listnatých rostlin. Další studie podporované vynálezem ukazují, že translokace přes bakteriální membrány je energeticky a teplotně závislá v souladu s pozorováním popsaným dříve pro jiný typ buněk.

V. Terapeutické prostředky

A. Malé organické molekuly

Malé organické molekuly terapeutických činidel mohou být výhodně připojeny na lineární polymerní prostředky, jak je zde popsáno, aby usnadnily nebo zvýšily transport přes biologické membrány. Například přenos vysoce nabitých činidel, jako je levodopa (L-3,4-dihydroxyfenylalanin, L-DOPA) může bát úspěšný vazbou na polymerní transportní molekuly, jak je zde popsáno. Peptoidy a peptidomimetické činidla jsou rovněž pozorovány (např. Langston, 1997, Giannis et al., 1997). Rovněž je vynález výhodný k přenosu malých organických molekul, které jsou slabě rozpustné ve vodných roztocích, jako je sérum a slaný roztok. Tudíž jsou sloučeniny, které jsou terapeuticky účinné, omezeny svou nízkou rozpustností, mohou být podávány ve větších dávkách podle předkládaného vynálezu a mohou být mnohem účinnější na molárním základě v konjugátové formě, vzhledem k nekonjugátové formě, následkem vyšší hladiny příjmu buňkami.

Jelikož je často vyžadována důležitá část topologického povrchu malé molekuly a tudíž je potřebná pro biologickou aktivitu, malé molekulové části konjugátu mohou být ve zvláštních případech potřebné k rozdělení konjugovaného transportního polymeru a spojovníkové skupiny (pokud nějaká je) na malé molekuly činidla, aby se po přechodu cílovou biologickou membránou projevila biologická aktivita. Pro takové případy obsahuje konjugát vhodně štěpitelný spojovník k odstranění volného léku po přenesení přes biologickou membránu.

V jednom přístupu může konjugát zahrnovat disulfidovou vazbu, jak je vidět na obr. 6A, který ukazuje konjugát (I) obsahující transportní polymer T navázaný na cytotoxické činidlo 6merkaptopurin N-acetylovou chráněnou skupinou cysteinu, jenž slouží jako spojovník. Tak je cytotoxické činidlo navázáno bisulfidovou vazbou na 6-merkaptonovou skupinu a transportní polymer je připojen na karbonylovou skupinu cysteinu přes amidový spojovník. Štěpení disulfidové vazby redukcí nebo disulfidovou substitucí vede k uvolnění volného cytotoxického činidla.

Způsob syntézy konjugátu obsahujícího disulfid je poskytnut v Příkladu 9A. Produkt obsahuje heptamer Arg zbytků, jenž je připojen na 6-merkaptopurin N-acetyl-Cys-Ala-Ala spojovníkem, kde jsou Ala zbytky obsaženy jako přídavný mezerník k poskytnutí disulfidu přístupnějšího k thiolům a redukční činidla pro štěpení uvnitř buněk. Spojovník v tomto případě také ilustruje použití amidových vazeb, které se mohou v buňce enzymaticky štěpit.

V jiném přístupu konjugát obsahuje foto štěpitelný spojovník, jenž je štěpen vystavením elektromagnetického záření. Ukázkové spojení je zobrazeno na obr. 6B, jenž ukazuje konjugát (II) obsahující transportní polymer T navázaný na 6-merkaptopurin wto-nitrobenzoátovou vazebnou skupinou. Polymer T je navázaný na nitrobenzoátovou skupinu amidovou vazbou na benzoát karbonylovou skupinu a cytotoxické činidlo je navázáno jeho 6-merkaptovou skupinou na /^-methylenovou skupinu. Sloučenina může být tvořena reakcí 6-merkaptopurinu spbromomethyl-w-nitrobenzoovou kyselinou v přítomnosti NaOCHs/methanol za tepla, následuje spojení benzoát karboxylové kyseliny s transportním polymerem, např. spojovníková aminoskupina γ-aminobutyrové kyseliny napojená na polymer (příklad 9B). Fotoiluminace konjugátu způsobuje odstranění 6-merkaptopurinu účinkem nitroskupiny, jenž je v poloze ortho na merkaptomethylové skupině. Tento přístup nachází použitelnost ve fototerapeutických metodách, jak jsou v oboru známy, zejména lokalizaci aktivace léčiv na vybranou oblast těla. Přednostně obsahuje štěpitelný spojovník první a druhou štěpitelnou skupinu, jenž může spolupracovat na štěpení polymeru od biologicky aktivního činidla , jak je ukázáno následujícími přístupy. A sice štěpitelný spojovník obsahuje první štěpitelnou skupinu vzdálenou od činidla a druhou štěpitelnou skupinu, jenž je v blízkosti činidla, takže štěpení první štěpitelné skupiny poskytuje konjugát spojovník-činidlo obsahující nukleofilní skupinu schopnou reagovat intramolekulárně za rozštěpení druhé štěpitelné skupiny, čímž se z uvedeného spojovníku a polymeru uvolní činidlo.

Obr. 6C zobrazuje konjugát (III) obsahující transportní polymer T navázaný na protirakovinné činidlo 5-fluoruracil (5FU). Zde je spojení poskytnuto modifikovaným lysylovým zbytkem. Transportní polymer je napojený na α-aminoskupinu a 5-fluoruracil je připojený a-karbonylem. Lysylová ε-aminoskupina byla modifikována na karbamát ester o-hydroxymethyl nitrobenzen, který obsahuje první fotolabilní štěpitelnou skupinu vkonjugátu. Fotoiluminace odštěpuje nitrobenzenovou skupinu od konjugátu, odštěpený karbamát který rovněž rychle rozkládá za vzniku volné ε-aminoskupiny jako účinného nukleofilu. Intramolekulární reakcí ε-aminoskupiny s amidovou vazbou na 5-fluoruracilu vede k cyklizaci za odstranění 5-fluoruracilové skupiny.

Obr. 6D ilustruje konjugát (IV) obsahující transportní polymer T navázaný na 2'-kyslík protirakovinového činidla paclitaxel. Spojení vzniklo vazebnou skupinou, jenž obsahuje (i) atom dusíku navázaný na transportní polymer, (ii) fosfátmonoester v poloze para k atomu dusíku a (iii) karboxymethylovou skupinu v poloze meta k atomu dusíku, jenž je připojený ke 2'-kyslíku paclitaxelu karboxylátesterovou vazbou. Enzymové štěpení fosfátové skupiny od konjugátu poskytuje volnou fenolhydroxylovou skupinu. Tato nukleofilní skupina poté reaguje intramolekulárně s karboxylátesterem za odstranění volného paclitaxelu vazbou na jeho biologický cíl. Příklad 9C popisuje syntézu přípravy tohoto typu konjugátu.

Obr. 6E představuje ještě jiný přístup, kde je transportní polymer navázán na biologicky aktivní činidlo, např. paclitaxel aminoalkyl karboxylovou kyselinou. Přednostně je spojovníková aminoskupina navázána na spojovníkový karboxylový uhlík od 3 do 5 atomový řetězec (n = 3 až 5), vhodně buď 3 nebo 4 atomový řetězec, které jsou přednostně poskytovány jako methylenové uhlíky. Jak je vidět na obr. 6E, je spojovníková aminokyselina připojena na transportní polymer amidovou vazbou a na paclitaxelovou skupinu esterovou vazbou. Enzymové štěpení amidové vazby uvolňuje polymer a poskytuje volnou nukleofilní aminoskupinu. Tato volná aminoskupina může poté intramolekulárně reagovat s esterovou skupinou za uvolnění spojovníku od paclitaxelu.

Obrázky 6D a 6E představují jiný pohled vynálezu obsahující taxanové a taxoidové protirakovinné konjugáty, jenž zvyšují trans-membránovou transportní rychlost vzhledem k odpovídajícím nekonjugátovým formám. Konjugáty jsou částečně používány k inhibici růstu rakovinných buněk. Věří se, že taxany a taxoidy projevují svůj protirakovinný účinek podpořením polymerizace mikrotubul (a inhibici depolymerizace) do té míry, až jsou škodlivé pro buněčné funkce, inhibují buněčnou replikaci a nakonec vedou k buněčné smrti.

• · · ·· · ·· · · • · · · · ··· · ·· · • · · ♦ · ···· • · · · · ·«···« • · ··· · · · · ···· ··· ·· ··· ·· ··

Výraz „taxan“ se týká paclitaxelu (Obr. 6F, R' = acetyl, R = benzyl), je rovněž znám pod obchodním názvem „TAXOL“ a nachází se v přírodní formě, syntetizovaný nebo jako biologicky vytvořené analogy se základním jádrem obsahujícím A, B, C a D kruhy paclitaxelu, jak je vidět na obr. 6G. Obr. 6F také ukazuje strukturu „TAXOTERE™“ (R' = H, R = BOC), který je poněkud rozpustnější syntetický analog paclitaxelu prodávaný Rhone-Poulenc. „Taxoid“ se týká přírodně se vyskytující, syntetizovaných a biologicky vytvořených analogů paclitaxelu, jenž obsahuje A, B a C kruhy paclitaxelu, jak je vidět na obr. 6H. Značné syntetické a biologické informace jsou dostupné o syntézách a aktivitách různých taxanových a taxoidových sloučenin, jak píše Suffness (1995), zejména v kapitolách 12 až 14, stejně jako v další paclitaxelové literatuře. Kromě toho jsou, k předpovědi protirakovinných aktivit těchto sloučenin proti určitých rakovinných typů, dostupné hostitelské buněčné linie, jak je popsáno např. v Suffness kapitola 8 až 13.

Transportní polymer je připojen na taxanovou nebo taxoidovou skupinu přes jakékoliv vhodné místo vazby na taxanu nebo taxoidu. Obyčejně je transportní polymer navázán C2'-kyslíkem, C7-kyslíkem s použitím vazby uvedené výše. Konjugace transportního polymeru přes C7-kyslík vede k taxanovým konjugátům, jenž mají navzdory konjugace v této poloze protirakovinou a protinádorovou aktivitu. Podle toho může být spojovník štěpitelný nebo neštěpitelný. Konjugace přes C2'-kyslík značně snižuje protirakovinnou aktivitu tak, že je štěpitelný spojovník pro konjugaci na tomto místě upřednostňován. Rovněž mohou být použita i jiná místa, např. CIO. Bude oceněno, že konjugáty taxonu a taxoidu vynálezu zvyšují rozpustnost ve vodě vzhledem ktaxolu o,25 μβ/ml) a taxoteru (6 až 7 μg/ml). Proto se nepožaduje velké množství rozpouštěcích činidel, jako je „CREMOPHOR EL“ (polyoxyethylenovaný ricinový olej), polysorbát 80, (polyoxyethylen sorbitan monooleát, také známý jako „TWEEN 80“) a ethanol, takže vedlejší účinek typicky spojené s těmito rozpouštěcími činidly, mohou být zmírněny např. anafylaxie, dýchavičnost, hypotenze a zrudnutí.

B. Kovy

Kovy mohou být přenášeny do eukaryotických a prokaryotických buněk prostřednictvím chelatačních činidel, např. texapyrin nebo diethylentriamin pentaoctová kyselina (DTPA), připojených na transportní membránu vynálezu, jak je ukázáno příkladem 10. Tyto konjugáty jsou prospěšné pro dodání kovových iontů k léčení. Ukázkovými ionty kovů jsou Eu, Lu, Pr, Gd, Tc99m, Ga67, Inlll, Y90, Cu67 a Co57. Předběžné studie membránového transportu s konjugáty mohou být ukázány s použitím stanovení založených na buňkách, jak je popsáno v příkladech níže. Například při použití iontů europia, může být zaznamenán buněčný příjem

0 0 0 0 0 00 00

000 0 000 0 00 0

000 0000 • 0000 00000 0 0 0 000 0000

0000 000 00 000 0 0 0« fluorescencí časového rozkladu. V případě kovových iontů, jenž jsou cytotoxické, může být zaznamenán příjem cytotoxicitou.

C. Makromolekuly

Způsob vynálezu zvyšující transport je výhodný zejména ke zvýšení transportu přes biologické membrány pro řadu makromolekul, ale není to limitující, jako jsou proteiny, nukleové kyseliny, polysacharidy a jejich analogy. Ukázkovým příkladem nukleových kyselin jsou oligonukleotidy a polynukleotidy tvořící DNA a RNA a jejich analogy, jenž mají vybrané sekvence navržené pro hybridizaci komplementárních cílů (např. sekvence beze smyslu pro jednořetězcové a dvouřetězcové cíle) nebo pro expresi transkriptů nukleových kyselin nebo proteinů kódovaných těmito sekvencemi. Analogy zahrnují nabité a lépe nenabité analogy základního řetězce, jako jsou fosfonáty, (lépe methylfosfonáty), fosforamidáty (N3' nebo N5'), thiofosfonáty, nenabité morfolinové polymery a protein nukleové kyseliny (PNA). Tyto molekuly mohou být použity v řadě léčebných režimů zahrnující například léčby nahrazením enzymu, genové léčby a antisense terapii.

V průběhu příkladu protein nukleové kyseliny (PNA) jsou analogy DNA, ve kterých je základní řetězec strukturálně blízký s deoxyribosovým základem. Skládá se z N-(2aminoethyl)glycinových jednotek, na které jsou navázány nukleové báze. PNA obsahující všechny čtyři původní nukleové báze hybridizují s komplementárními oligonukleotidy podle Watson-Crickova pravidla o párování bází a je opravdová DNA napodobenina ve významu rozpoznání párů bází (Egholm et al., 1993). Základ PNA je tvořen peptidovými vazbami radši než fosfátestery, vyhovující anti-sense aplikacím. Jelikož je základ nenabitý, PNA/DNA nebo PNA/RNA duplexy, vykazuje větší než obvyklou teplotní stabilitu. PNA mají další výhodu, že je nelze rozpoznat nukleázami ani proteázami. Kromě toho mohou být PNA syntetizovány automatickým peptidovým syntetizátorem používající standardní t-Boc chemie. PNA je poté snadno připojena na transportní polymer vynálezu.

Příklady oligonukleotidů beze smyslu, jenž mohou zvyšovat transport do buněk použitím způsobů vynálezu, jsou popsány například v U.S. Patent 5 594 122. Takové nukleotidy jsou směřované na léčení viru selhání imunity lidí (HIV). Konjugace transportního polymeru s oligonukleotidem beze smyslu může být účinná podle dobře zavedeného způsobu, například vznikem amidové vazby mezi peptidem a 5'-koncem oligonukleotidů přes sukcinátový spojovník. Použití PNA konjugátů je dále ukázáno v příkladě 11.

Obr. 7 ukazuje výsledky získané s konjugátem vynálezu obsahující PNA sekvenci pro inhibici sekrece gama interferonu (γ-IFN) T buňkami, jak je detailně vidět v příkladu 11. Může být patrno, že PNA konjugát beze smyslu byl účinný pro blokování sekrece γ-IFN, pokud byl přítomný konjugát v hladině přibližně 10 μΜ. Naproti tomu nebyla patrná inhibice sPNA konjugátem se smyslem nebo samotným nekonjugovaným PNA beze smyslu.

Jinou třídou makromolekul, jenž mohou být transportovány přes biologické membrány, jsou například proteiny a zejména enzymy. Terapeutické proteiny zahrnují, ale není to limitující, výměnu enzymů. Terapeutické enzymy zahrnují, ale není to limitující, alglucerasu používanou při léčení lysozomální glukocerebrosidasové nedostatečnosti (Gaucherova nemoc), a-Lidurinidasu používanou při léčení mukopolysacharidosy I, α-N-acetylglukosamidasu používanou při léčení sanfilippo B syndromu, lipasu používanou při léčení selhání činnosti slinivky břišní, adenosindeaminasu používanou při léčení vážného kombinovaného syndromu selhání imunity a triosafosfátizomerasu při léčení neuromuskulární disfunkce spojené s deficitem trisoafosfátizomerasy.

Kromě toho podle důležitého pohledu vynálezu mohou být proteinové antigeny dodány do cytosolové části antigen prezentujících buněk (APC), kde jsou degradovány na peptidy. Peptidy jsou poté transportovány do endoplazmatického retikula, kde se spojují se vznikající HLA třídou I molekul a projevují se na buněčném povrchu. Tyto „aktivované“ APC mohou sloužit jako induktory I. třídy omezené antigen-specifickými cytotoxickými T-lymfocyty (CTL), které poté postupují, aby poznaly a zničily buňky vystavující se konkrétnímu antigenu. APC, jenž jsou schopné provádět tento způsob, zahrnují, ale není to limitující, určité makrofágy, B buňky a dendritické buňky. V jednom případě je proteinový antigen nádorovým antigenem pro vyvolání nebo podpoření imunitní odpovědi proti nádorovým buňkám.

Transport izolovaných nebo rozpustných proteinů do cytosolu APC s následnou aktivací CTL je výjimečný, jelikož s malou výjimkou vnesení izolovaných nebo rozpustných proteinů nevede buď k aktivaci ABC nebo indukci CTL. Tudíž antigeny konjugované na prostředky předkládaného vynálezu zvyšující transport mohou sloužit ke stimulaci buněčné imunitní odpovědi in vitro nebo in vivo.

Příklad 14 poskytuje podrobnosti pokusů prováděných za podpory předkládaného vynálezu, ve kterých byl ukázkový proteinový antigen, ovalbumin, po konjugaci na R7 polymer dodán do APC. Následné přidání APC do cytotoxických T lymfocytů (CTL) vede k CD8+ cytotoxickým T buňkám specifických na albumin (stimulované CTL). Naproti tomu APC byly vystaveny účinku nemodifikovaného ovalbumínu zhoršující stimulaci CTL.

V paralelním pokuse byly histokompatibilní dendritické buňky (specifický typ APC) vystaveny účinku albumin-R7 konjugátů a poté byly vneseny do myší. Následná analýza krve těchto myší prokázala přítomnost CTL specifických na albumin. Kontrolní myši měly dendritické buňky • · · · 0 0 0 0 · ···· ··· *-* *·· ·· 00 vystavené účinku nemodifikovaného albuminu. Kontrolní myši nevykazovaly odpověď CTL specifického na albumin. Tyto pokusy jsou příkladem jedné ze specifických užitečností spojených obecně s přenosem makromolekul a zejména proteinů do buněk.

V jiném případě je vynález použitelný pro dodání imunospecifických protilátek nebo fragmentů protilátek do cytosolu k zasažení proti zhoubným biologickým procesům, jako je mikrobiální infekce. Poslední pokusy ukázaly, že intracelulární protilátky mohou být v rostlinných a savčích buňkách účinná protivirová činidla (např. Tavladoraki et al., 1993 a Shaheen et al., 1996). Tyto metody mohou běžně používat jednořetězcové variabilní úseky fragmentů (scFv), ve kterých jsou těžké a lehké řetězce protilátky syntetizovány jako jednoduchý polypeptid. Variabilní těžké a lehké řetězce jsou obvykle odděleny flexibilním spojovníkovým peptidem (např. 15 aminokyselin) na 28 kDa molekulu s vysokou afinitou vazebného místa ligandu. Hlavní překážkou pro široké uplatnění této technologie je schopnost příjmu do infikovaných buněk. Ale vazbou transportních polymerů na scFv fragmenty se může zvýšit stupeň buněčného příjmu umožňující, aby se imunospecifické fragmenty navázaly a oslabily důležité mikrobiální složky, jako je HIV Rev, HIV reverzní transkriptasa a integrasové proteiny,

D. Peptidy

Peptidy přenášené zvyšujícími transportními způsoby zde popsanými zahrnují, ale není to limitující, efektorové polypeptidy, receptorové fragmenty apod. Příklady obsahují peptidy s fosforylovanými místy používané proteiny zprostředkující intracelulární signál. Příklady takových proteinů zahrnují, ale není to limitující, proteinkinasu C, RAF-1, p21Ras, NF-κΒ, CJUN a cytoplazmatické konce membránových receptorů, jako jsou IL-4 receptor, CD28, CTLA4, V7 a MHC I. třídy a antigeny II. třídy.

Pokud je molekula zvyšující transport také peptid, syntézy může být dosaženo buď použitím automatického peptidového syntetizátoru nebo rekombinantními způsoby, při kterých je produkován polypeptid kódující fúzi peptidu, jak je uvedeno výše.

V pokusech provedených v podkladu předkládaného vynálezu (příklad 15) byl syntetizován 10aminokyselinový segment cytoplazmatické koncové oblasti transmembránového proteinu V7 (rovněž známého jako CD101) s R7 polymerem na jeho C-konci. Tato koncová oblast je známá pro fyzické připojování a zprostředkovává inaktivaci RAF-1 kinasy, kritického enzymu v MAPkinasové metabolické dráze buněčné aktivace. V7-R7 konjugát byl přidán k T-buňkám, které byly následně lyžovány detergentem. Rozpustná frakce byla testována na imunoprecipitaci antiV7 myší protilátkou ve spojení s kozí anti-myší IgG.

·» · · · · 44 · · • * · · ·»·· · « · ·

4 4 · 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 · · 4 4 4 • 4 4 4 4 4 4 4 4

4444 444 44 444 44 44

Pokud nedochází k peptidové úpravě, RAF-1, kinasa známá, že se připojuje a je inaktivována spojením sV7, se sráží spolu sV7. V buňkách ošetřených peptidem byl RAF-1 protein eliminován z V7 imunokomplexu. Ve stejném ošetření peptidem nebyl komplex, obsahující RAF-1 a p21 Ras zabraňující jakékoliv nespecifické modifikaci RAF-1 peptidu peptidy V7, rozrušen. Tyto výsledky ukazují, že cytoplazmatická koncová oblast V7 peptidu, pokud je konjugovaná na membránové peptidy, předkládaného vynálezu, zvyšující transport, vstupuje do cílové buňky a váže se specificky s fyziologickou efektorovou molekulou RAF-1. Toto spojení může být použito ke zničení intracelulárních procesů.

V druhé sadě pokusů byla V7 část konjugátu fosforylována in vitro proteinkinasou C. Anti-RAF1 precipitáty T buněk, které byly vystaveny účinku fosforylovaných V7 koncových peptidů, ale ne nefosforylovaného V7 koncového peptidu, ukazovaly silnou inhibici RAF-kinasové aktivity. Tyto studie ukazují dva principy. Zaprvé, transportní polymery vynálezu mohou účinně přenášet přes buněčnou membránu vysoce nabité (fosforylované) molekuly. Za druhé, zatímco mohou být oba fosforylované a nefosforylované V7 koncové peptidy vázány na RAF-1, pouze fosforylovaný peptid upravuje RAF-1 kinasovou aktivitu.

VI. Metoda zkoumání kvantitativního rozboru a knihovna

V jiném provedení, vynález může být použit ke zkoumání jednoho nebo více konjugátů a jeho vybrané biologické aktivity, kde konjugát(y) je vytvořen z jednoho nebo více kandidujících činidel. Konjugát(y) jsou spojené s buňkami, které vykazují detekovatelný signál po příjmu konjugátů do buněk, tak, že velikost signálu je odpovídající účinnosti konjugátu vzhledem k vybrané biologické aktivitě.

Jedna výhoda takového provedení je to, že je obzvláště užitečné pro testování aktivit činidel, které sami o sobě nejsou schopné, nebo je nepatrně, vstoupit do buněk a vykazovat biologickou aktivitu. Tedy, vynález poskytuje zvláště účinnou cestu identifikace aktivních činidel, které by nemusely jinak být dosažitelné pomocí široce zaměřených výzkumných programů, v důsledku toho, že postrádají účinnou a vhodnou cestu transportu činidla do buňky nebo organely.

Přednostně, jedno nebo více kandidujících činidel je poskytnuto jako kombinatorní knihovna konjugátů, které jsou připravené použitím jakékoliv z počtu kombinatorních syntetických metod známých v oboru. Například, Thompson a Ellman (1996) rozpoznali alespoň pět různých obecných přístupů pro přípravu kombinatorních knihoven na pevném nosiči, jmenovitě (1) syntézy oddělených látek, (2) štípací syntézy (rozštípnout a složit dohromady), (3) rozpustná knihovna dekomplikací, strukturální stanovení pomocí analytických metod a (5) a kódování strategií, pomocí kterých jsou určeny charakteristiky chemické směsi aktivních kandidátů pro

«9 9 99 ·9

999 9 99 9

9 9 9 9 9 9

99999 9

9 9 9 9 9 9

999 9· 99 testování positivní biologické aktivity v kvantitativním rozboru. Syntéza knihoven v roztoku obsahuje alespoň (1) prostorově oddělené syntézy a (2) syntézu dohromady (Thompson, supra). Další popis kombinatorních syntetických metod může být nalezeno u Lam et al. (1997), který zvláště popisuje kontakt „jedna-kapka-jedna-látka“.

Tyto přístupy jsou lehce adaptovatelné na přípravu konjugátů podle předkládaného vynálezu, obsahujíc vhodné ochranné schéma, je-li to nutné. Například, pro knihovny, které jsou konstruované pro jeden nebo více pevných nosičů, transportní peptidová skupina může být připojena k nosiči první, následující stavebním nebo připojeným kandidátovým činidlem kombinatorně na polymery přes vhodné reaktivní skupiny. V alternativní příkladě, kombinatorní knihovna činidel je prvně vytvořena na jednom nebo více pevných nosičích, následována přidáním transportního polymeru ke každému imobilizovanému ucházejícímu se činidlu. Podobné nebo různé přístupy mohou být použity pro fázové syntézy v roztoku. Knihovny vytvořené na pevném nosiči jsou přednostně oddělené z nosiče cestou štěpitelné spojovací skupiny pomoci známých metod (Thompson et al., a Lam et al., supra).

Jeden nebo více konjugovaných kandidátů může být testováno jakýmkoliv počtem buněčně založených kvantitativních rozborů, které vyvolají detekovatelný signál v závislosti na účinnosti konjugátu. Vhodně, kandidáti jsou inkubování s buňkami v mnohojamkových destičkách a biologické efekty jsou měřené pomocí signálu (např. fluorescence, odrazivost, absorpce nebo chemiluminiscence), který může být kvantitativně měřen čtecím zařízením z destiček. Alternativně, inkubační směs může být odstraněna z jamek pro další zpracování anebo analýzu. Struktura aktivních a volitelně neaktivních látek, jestliže nejsou již známé, je pak stanovena a tato informace může být použita pro identifikaci hlavních látek o pro zaměření další syntézy a výzkumného úsilí.

Například, kvantitativní rozbor γ-interferon sekretu popsaný v příkladu 11 je lehce adaptovatelný na mnohojamkový systém tak, že aktivní inhibitory sekretu mohou být detekované pomoci fluorescenční detekce založené na europiu pomocí čtecího zařízení destiček. Protirakovinné činidla mohou být zkoumané použitím založených linií rakovinných buněk (např. poskytované National Institutes of Health (NIH) a National Cancer Institute (NCI)). Cytotoxické účinky protirakovinných činidel mohou být stanovené pomocí vyloučení trypanového barviva, například.

Jiné příklady obsahují kvantitativní rozbor zaměřený na inhibici buněčné signalizace, jako inhibitor IL-4 receptorů, kvantitativní rozbor pro blokován buněčné proliferace a kvantitativní rozbor genové exprese. V typickém kvantitativním rozboru genové exprese je gen, o který je zájem, umístěn pod kontrolu vhodného promotoru a je následována po směru sekvence exprese

99 • 9 9 9

9 9 9 · 9 · « 9 9 · genu pro produkci reportérových druhů jako je β-galaktosidasy nebo luciferasy světlušek. Inhibiční účinek může být detekován na základě poklesu v reportérovém signálu.

Vynález také obsahuje konjugátovou knihovnu, která je užitečná pro zkoumání ve výše uvedených metodách. Knihovna obsahuje množství kandidátových činidel pro jednu nebo více vybraných biologických aktivit, každé z nich je konjugováno alespoň s jedním transportním polymerem podle vynálezu. Přednostně, knihovna konjugátů je kombinatorní knihovna. V jiném provedení vynález obsahuje pravidelnou řadu rozdílných konjugátů polymer-činidlo rozdělených do indexovaných vzorkových jamek, pro testování a identifikaci aktivních činidel, o které je zájem.

VI. Použitelnost

Prostředky a způsoby předkládaného vynálezu jsou zejména používány v oblasti lidských a veterinárních léčiv. Obecně podané dávky budou účinné k přenosu pikomolárnich až mikromolárních koncentrací terapeutického prostředku na efektorové místo. Vhodné dávky a koncentrace budou závislé na faktorech, jako jsou terapeutický prostředek nebo léčivo, místo určené k přenosu, způsob vedení, všechny které mohou být empiricky odvozeny podle způsobů v oboru dobře známých. Další rada může být získána ze studií používajících experimentální zvířecí modely pro vyhodnocení dávky, jak jsou známé v oboru.

Podání sloučenin vynálezu s vhodným farmaceutickým plnivem, je-li nezbytné, může být vedeno jakýmkoliv uznaným způsobem podání. Čili podání může být, například intravenózní, povrchové, subkutánní, transkutánní, intramuskulární, orální, perenterálně, peritonálně, intranasální nebo inhalací. Může být v pevném stavu, polopevném, jako lyofilizovaný prášek nebo kapalné formě, jako jsou například tablety, pilulky, kapsle, prášky, roztoky, suspenze, emulze, čípky, klystýr, krémy, masti, mléka, aerosoly apod., lépe v jednotkových dávkovačích formách vhodných pro podání přesných dávek.

Prostředky běžně zahrnují běžné farmaceutické nosiče nebo plnivo a mohou přídavně obsahovat další léčebná činidla, nosiče, pomocné látky apod. Přednostně prostředek bude obsahovat 5 % až 75 % hmotnosti sloučeniny nebo sloučenin vynálezu se zbytkem obsahující vhodné farmaceutické plnidla. Vhodná plnidla mohou být vyrobena pro konkrétní prostředek a způsoby podání metodami v oboru dobře známými, např. (Gennaro, 1990).

Pro orální podání tyto plnidla obsahují manitol, laktosu, škrob, stearát hořečnatý, sacharin sodný, celulosu, glukosu, želatinu, sacharosu, uhličitan hořečnatý apod. Prostředky mohou být ve formě roztoku, suspenze, tablety, pilulky, kapsle, prášku, pomalu se uvolňující formě apod.

* 4 ♦ 4 4 44 44 • · ·· 4 4 4 4

4· 4 4 4 4 4

4· · 4 «4 44 · • 4 444 4444

4444 444 44 444 44 44

Ve stejných případech jsou farmaceutické prostředky ve formě pilule, tablety nebo kapsle a tak prostředek může obsahovat spolu s biologicky aktivním konjugátem jakoukoliv následující látku: ředící roztok, např. laktosu, sacharosu, fosforečnan vápenatý a podobně, rozdělovači látku jako je škrob nebo jeho deriváty, zvlhčovadlo jako je stearát hořečnatý a podobně, a pojidlo jako je škrob, arabská guma, polyvinylpyrolidon, želatina, celulóza jejich deriváty.

Aktivní látky přípravků mohou být použity do čípků obsahujících, například, od 0,5%do 50% látky vynálezu, připravené v polyethylenglykolovém (PEG) nosiči (např. PEG 1000 (96%) a PEG 4000 (4%)). Kapalné přípravky mohou být připravené rozpouštěním nebo disperzi látky (od 0,5% do 20%) a volitelně farmaceutických pomocných látek v nosiči, jako je, například, solný roztok (např. 0,9% chlorid sodný), vodný roztok dextrózy, glycerol, ethanol a podobně, za vzniku roztoku nebo suspenze, např. pro intravenózní podáni. Aktivní látky mohou být obsažené také v klystýru.

Jestliže je žádoucí, přípravek pro podání může také obsahovat minoritní množství netoxických pomocných látek jako jsou smáčecí a emulgační činidla, pH pufrující látky, jako je například, acetát sodný, monolaureát sorbitanu nebo triethanolaminoleát.

Pro lokální použití je přípravek podáván v jakékoliv vhodné formě, jako je mléko nebo náplasti. Pro inhalační použití se přípravek užívá ve formě suchého prášku (např. Inhalační terapie) nebo v kapalné formě pomocí rozprašovače.

Metody pro přípravu takových forem dávek jsou známé nebo zřejmé pro odborníky v oboru, například, viz Remingtonů Pharmaceutical Sciences (1980). Přípravek pro podání bude, v jakémkoliv případě, obsahovat množství podpůrných nebo aktivních látek ve farmaceuticky účinném množství pro podporu formy léčení když je podán v souladu s vynálezem.

Obecně, látky vynálezu jsou podávané v terapeuticky účinném množství, tj. v dávkách dostatečných pro účinné léčení, které bude velmi záviset na jednotlivci a podmínkách léčení. Typicky, terapeuticky účinná denní dávka je od 0,1 do 100 mg/kg váhy těla. Nejvíce podmínek odpovídá podání celkové dávky mezi 1 až 30 mg/kg váhy těla a den, nebo mezi 70 mg až 2100 mg za den pro 70 kg osobu.

Stabilita konjugátu může být dále kontrolována pomocí složení a stereochemie základního řetězce a postranních řetězců polymeru. Pro polypeptidové polymery jsou D-isomery obecně odolnější k endogenním proteasám a tedy mají delší poločas rozpadu v séru v uvnitř buněk. D-polypeptidové polymery jsou tedy vhodné, když se požaduje delší trvání účinku. L-polypeptidové polymery mají kratší poločas rozpadu skrze jejich citlivost k proteasám a jsou tedy vybírané pro účinky kratšího trvání. To umožňuje lehčeji předejít vedlejším účinkům »

9 odstoupením od terapie jakmile jsou pozorovány vedlejší účinky. Polypeptidy obsahující směsi D- a L- zbytků mají střední stabilitu. Homo-D-polymery jsou obecně upřednostňované.

Následující příklady jsou zamýšlené jako ilustrace, ale nějako omezení předkládaného vynálezu

PŘÍKLADY PROVEDENÍ VYNÁLEZU

Příklad 1: Syntézy peptidů.

Peptidy byly syntetizovány použitím metod založených na pevné fázi na Applied Biosystems Peptide syntetizéru použitím FastMOC™ chemie a běžně dostupných Wang pryskyřic a Fmoc chráněných aminokyselin podle metod dobře známých v oboru (Bonifáci). Peptidy byly purifikovány použitím HPLC kolon s náplní C4 nebo Cl8 reverzní fáze a jejich struktury byly potvrzeny analýzou aminokyselin a hmotovou spektrometrií.

Příklad 2: Fluorescenční stanovení.

Fluorescenční peptidy byly syntetizovány modifikací amino-konce peptidu aminokapronovou kyselinou následnou reakcí fluorescein izothiokyanátu v přítomnosti (2-lH-benzotriazol-l-yΟΙ, 1,3,3-tetramethyl uronium hexafluorofosfát/N-hydroxybenzotriazol rozpuštěný vNmethylpyrolidonu. Produkty byly purifikovány gelovou filtrací.

Suspenze buněk (10⁶/ml) byla inkubována různou dobu při teplotě 37 °C, 23 °C nebo 4 °C s různou koncentrací peptidů nebo konjugátů v PBS pH 7,2 obsahující 2 % (PBS/FCS) na 96 miskách. Po 15 minutové inkubaci byly buňky stočeny centrifugací, třikrát promyty PBS/FCS obsahující 1 % azid sodný, inkubovány trypsin/EDTA (Gibco) při 37 °C 5 minut, poté dvakrát nebo vícekrát promyty PBS/FCS/NaN3. Zcentrifugované buňky byly resuspendovány v PBS obsahující 2 % FCS a 0,1 % propidium jodid a analyzován na FACScan (Becton Dickenson, Mountain View, CA). Buňky pozitivní na propidium jodid byly z analýzy vyloučeny. Pro analýzu argininových polymerů bylo napětí fotonásobiče sníženo na rozsah umožňující přesnější měření.

Příklad 3: Tat základní peptid proti póly-Arg peptidům.

Hladiny příjmu následujících polypeptidů byly měřeny metodou v příkladu 2: (1) polypeptid obsahující HIV tat zbytky 49-57 (Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg = SEQ ID NO: 1), (2) nonamer L-Lys zbytků (K9, SEQ ID NO: 2) a (3) homo-L nebo homo-polypeptidy obsahující ·· · «· « · · · · čtyři až devět Arg zbytků (SEQ ID NO: 3 až 8 a 12 až 17). Výsledky jsou zobrazeny na obrázcích 2A až 2C.

Přiklad 4: Konfokální buněčná mikroskopie.

Buňky inkubované s fluorescentními polyargininovými peptidy byly připraveny, jak je popsáno výše, pro stanovení vazeb a analyzovány na zařízení Cell Sciences Imaging Facility (Stanford Univerzity, Stanford, CA) s použitím snímacího jednoduchého paprskového laserového konfokálního mikroskopu s excitační vlnovou délkou 488 nm (argon-iontový laser) a emisní šířkou pásma v rozmezí 510 až 550 s použitím pásmového filtru. Konjugáty (6,25 μΜ) obsahující tat (49 - 57), R7 nebo r7 připojené na fluorescein byly inkubovány s buňkami linie Jurkat při 37 °C po dobu 10 minut. Obrázky 2A až 2F ukazují výsledky vysílané fluorescence (obr. 2A až 2C) a propouštěného světla (2D až 2F) pro tat (49 - 57) (obr. 2A a 2C), R7 (obr. 2B a 2E) a r7, (obr. 2C a 2F).

Příklad 5: Studie rozpětí délky.

Následující homopolymery polyargininu byly testovány fluorescenčním stanovením v příkladu 2, inkubací při 37 °C po dobu 15 minut před stočením buněk: r9, R9, R15, R20, R25 a R30. Kromě toho byla rovněž testována (Sigma Chem. Co.) směs L-argininových polymerů o průměrné molekulové hmotnosti 12 000 Da (přibližně 100 aminokyselin) po značení fluorescein isothiokyanátem a purifikována gelovou filtrací („SEPHADEX“ G-25). Buňky byly analyzovány FACS a byla měřena průměrná fluorescence živých buněk. Cytotoxicita každého konjugátu byla rovněž stanovena procentuálním zastoupením buněk, které jsou obarvené propidium jodidem, čímž je charakterizována buněčná smrt. Výsledky příjmů pro r9, R9, R15, R20 a R25 konjugáty jsou ukázány na obr. 3.

Komerčně dostupný polyarginin (M_w 12 000) je precipitován proteiny v séru, s největší pravděpodobností al-kyselým glykoproteinem. Proto byla hladina telecího fetálního séra při stanovení konjugátů připravených z tohoto materiálu 10-krát snížena.

Póly-Arg prostředek o M_w 12 000 byl toxický při koncentraci od 500 nM do 50 μΜ a není zahrnut v obr. 3. Póly-Arg konjugáty obsahující 20 argininových zbytků nebo více byly toxické při koncentraci větší než 12 μΜ, takže se toxicita zvyšuje s délkou.

Příklad 6: Kinetika příjmu.

Pro měření parametrů Vmax a Km buněčného příjmu byla použita stanovovací metoda příkladu 2 s následujícími modifikacemi. Peptidy byly inkubovány s buňkami po dobu 0,5, 1, 2 a 4 minut *· · ·* ♦ ·· 99 • · ·· 9 · ·· 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 • · ♦ · · ·«···· • 9 9 9 9 9 9 9 9

9999 999 9· 999 99 99 při 4 °C ve trojicích v 50 μΜ PBS/FCS v 96-ti jamkových destičkách. Na konci inkubace byla reakce ukončena rozpuštěním vzorku v 5 ml PBS/FCS, vzorek byl zcentrifugován a jednou promyt PBS/FCS, trypsin/EDTA a konečně znovu PBS/FCS a pelet v PBS/FCS obsahující propidium jodid dán na analýzu FACScan. FACS data byly dosazeny do Lineweaver-Burkové rovnice pro výpočet Michaelis-Mentenové kinetiky. Kinetická data pro fluorescentní konjugáty tat (49 - 57), R9 a r9 jsou zobrazeny v tabulce 1 výše.

Příklad 7: Účinky metabolických inhibitorů na transport

Suspenze buněk (10⁶/ml) byla inkubována po dobu 30 minut s 0,5 % azidem sodným vPBS obsahujícím 2 % FCS. Na konci inkubace byly přidány fluorescentní peptidy (tat (49 - 57), R7, R8 nebo R9) v konečné koncentraci 12,5 μΜ. Po 30-ti minutové inkubaci byly buňky promyty stejně jako v příkladu 2 až na to, že všechny promývací pufry obsahovaly 0,1 % azidu sodného. Výsledky jsou ukázány na obr. 5.

Příklad 8: Transport do bakteriálních buněk.

Gramnegativní bakterie (E. coli HB 101) a grampozitivní bakterie (Streptomyces bovis') rostly ve vhodných mediích do logaritmické fáze. Buněčné kultury (4x10 /ml) byly inkubovány po dobu 30 minut při 37 °C s různými koncentracemi fluorescentních konjugátů obsahující lineární polymery L-argininu (R4 až R9), D-argininu (r4 až r9) nebo L-lysinu (K9) o koncentraci konjugátu od 3 do 50 μΜ. Buňky byly promyty a přemístěny do PBS obsahující propidium jodid (do rozpoznání buněčné smrti) a analyzovány FACS a fluorescenčním mikroskopem. Výsledky jsou zobrazeny na obr. 5A až 5C a diskutovány výše.

Příklad 9; Konjugáty se vzorovými štěpitelnými spojovníky.

A. 3-Merkaptopurin cystein disulfidový konjugát

Al. Thiolová aktivace. N-acetyl-Cys(SH)-Ala-Ala-(Arg)7-CO2H (12,2 mg, 0,0083 mmol) byl rozpuštěn ve 3 ml 3:1 AcOFLFEO mícháním při okolní teplotě. Do tohoto roztoku byl přidán dithio-bis(5-nitropyridin) (DTNP) (12,9 mg, 0,0415 mmol, 5 eq.). Roztok byl míchán 24 hodin při okolní teplotě, po které měla směs světle žlutou barvu. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a zbytek byl rozpuštěn v 5 ml H2O a extrahován třikrát ethylacetátem do odstranění přebytečného DTNP. Vodná vrstva byla lyofílizována a produkt byl poté bez dalšího čištění použit.

A2. Připojení léčiva. N-acetyl-Cys(SH)-Ala-Ala-(Arg)7-CO2H (0,0083 mmol) byl rozpuštěn v 1 ml odplyněné H2O (pH 5) pod argonem při pokojové teplotě, míchán. Do směsi byl přidán

6-merkaptopurin (1,42 mg, 0,0083 mmol, 1 eq) v 0,5 ml DMF. Reakční směs byla míchaná 18 hodin pod inertní atmosférou při okolní teplotě. Po 18 hodinách se projevilo světle žluté zabarvení roztoku naznačující přítomnost volného 5-nitro-2-thiopyridinu. Rozpouštědlo bylo odstraněno pod sníženým tlakem a zbytek byl přečištěn metodou HPLC, jenž zajišťuje požadovaný produkt (I, Obr. 6A) v 50% celkové výtěžnosti.

B. Fotoštěpitelný taxolový konjugát

3-Nitro-4-brommethylbenzoová kyselina (100 mg, 0,384 mmol) je rozpuštěna v bezvodém methanolu (5 ml) pod atmosférou dusíku. Do tohoto roztoku je přidán methoxid sodný (88 μΐ, 25 % roztok v methanolu, 0,384 mmol, 1 eq) následované přidáním 6-merkaptopurinu (58,2 mg, 0,384 mmol, 1 eq). Směs je vařena pod zpětným chladičem a je míchaná po 3 hodiny. Reakce je poté ochlazena, filtrována a ukončena 6 N HCI. Reakční objem je poté snížen na jednu polovinu, k bodu, při kterém se produkt sráží a následně je odfiltrován. Zbytek je rozpuštěn v methanolu, filtrován (jestliže je to nezbytné) a koncentrován pod stlačeným tlakem do vzniku požadovaného sulfidu (II, obr. 6B) v 50% výtěžnosti jako žlutý pevný prášek.

C. Fosfátově-štěpitelný taxolový konjugát

Cl. Do suspenze kyseliny o-hydroxyfenyloctové (100 mg, 0,099 mmol) ve vodě (39 ml) při 0 °C byl pomalu odpipetován roztok kyseliny dusičné (12 ml 65% v 8 ml H2O). Roztok byl míchán další 1,5 hodiny při 0 °C. Směs byla poté vařena při okolní teplotě a míchána další 0,5 hodiny. Heterogenní směs byla vylita na ledu (10 g) a zfiltrována, až se odstranil nerozpustný or/Ao-nitro izomer. Načervenaiý roztok byl zakoncentrován pod sníženým tlakem a zahuštěný zbytek byl znovu rozpuštěn v 6N HCI zfiltrován přes celit. Rozpouštědlo bylo opět odstraněno za sníženého tlaku a byl získána požadovaná kyselina 2-hydroxy~4-nitrofenyloctová jako světlá, hnědočervená pevná látka (40 % výtěžek). Produkt (IV-a) byl použit v dalším kroku bez další purifikace.

C2 Produkt IV-a (765 mg, 3,88 mmol) byl rozpuštěn v čerstvě destilovaném THF (5 ml) pod argonovou atmosférou. Roztok byl ochlazen na 0 °C a boran-THF (1 M v THF, 9,7 ml, 9,7 mmol, 2,5 eq) byl po kapkách přidáván injekční stříkačkou se zřejmým vývinem vodíku. Reakční směs byla míchána po dalších 16 hodin, slabě zahřívaná na pokojovou teplotu. Reakce byla ukončena pomalým přidáváním 1 M HCI (s divokým bubláním) a 10 ml ethylacetátu. Vrstvy byly odděleny a vodná fáze pětkrát extrahována ethylacetátem. Spojené organické vrstvy byly promyty solným roztokem a sušeny síranem hořečnatým. Rozpouštědlo bylo odpařeno ve vakuu a zbytek přečištěn rychlou kolonovou chromatografií (1:1 hexamethylacetát) do dosažení požadovaného nitroalkoholu (IV-b) jako světle žluté pevné látky (85 % výtěžnost).

• 9

9999

9

9 9 9 • 99

9 9 • 9 9

9« 999

99

9 9

9 ·

9 9 * 9 9 9

9· 99

C3. Nitrolakohol (IV-b) (150 mg, 0,819 mmol) byl rozpuštěn v suchém DMF (5 ml) obsahujícím di-terc. butyldikarbonát (190 mg/ 1,05 eq) a 10% Pd-C (10 mg). Směs byla dána do Parrovy aparatury a pětkrát stlačována/vyčištěna. Roztok byl poté stlačován do 47 psi a míchán 24 hodin. Reakce byla ukončena filtrací přes celit a rozpouštědlo bylo pod sníženým tlakem odstraněno. Zbytek byl purifikován kolonovou chromatografií (1:1 hexan:ethylacetát) do dosažení chráněného anilinového produktu (IV-c) jako světlehnědé pevné krystalické látky s výtěžkem 70 %.

C4. TBDMS-C1 (48 mg, 0,316 mmol) byl rozpuštěn v čerstvě destilovaném dichlormethanu (4 ml) pod atmosférou argonu. Do tohoto roztoku byl přidán imidazol (24 mg, 0,347 mmol, 1,1 eq) a okamžitě se vytvořila bílá sraženina. Roztok byl míchán 30 minut při pokojové teplotě, v tomto bodě byl přidán rychle produkt IV-c (80 mg, 0,316 mmol, 1,0 eq) jako roztok dichlormethanu/THF (1 ml). Výsledná směs byla míchána dalších 18 hodin při okolní teplotě. Reakce byla ukončena přidáním nasyceného vodného roztoku chloridu amonného. Vrstvy byly odděleny a vodná fáze byla třikrát extrahována ethylacetátem a spojené organické fáze promyty solným roztokem a sušeny síranem sodným. Organická fáze byla zakoncentrována do dosažení silyletherfenolového produktu (IV-d) jako světle žlutého oleje (90 % výtěžek).

C5. Silyletherfenol IV-d (150 mg, 0,408 mmol) byl rozpuštěn v čerstvě destilovaném THF (7 ml) pod argonem a roztok ochlazen na 0 °C. n-BuLi (2,3 M v hexanu, 214 μΐ) byl poté přidáván po kapkách stříkačkou. Změna barvy ze světle žluté na tmavě červenou byla okamžitě znatelná. Po pěti minutách byl rychle přidán tetrabenzylpyrofosfát (242 mg, 0,45 mmol, 1,1 eq) za stálého míchání roztoku pod argonem. Roztok byl míchán dalších 18 hodin pod inertní atmosférou, pomalu zahříván na pokojovou teplotu a během této doby vznikla bílá sraženina. Reakce byla ukončena přidáním nasyceného vodného roztoku chloridu amonného a 10 ml ethylacetátu. Vrstvy byly odděleny a vodná fáze byla pětkrát extrahována ethylacetátem. Spojené organické fáze byly promyty solným roztokem a sušeny síranem hořečnatým. Rozpouštědlo bylo odstraněno odpařením ve vakuu a zbytek přečištěn rychlou kolonovou chromatografií (1:1 hexan:ethylacetát) do dosažení požadovaného fosfát-silyletheru (IV-e) jako světle oranžového oleje (90 % výtěžnost).

C6. Fosfát-silylether (IV-e) (10 mg, 0,0159 mmol) byl rozpuštěn ve 2 ml suchého ethanolu při pokojové teplotě. Do míchaného roztoku bylo přidáno 20 μΐ koncentrované HCI (1 % v/v roztok) a směs byla míchána až do TLC analýzy, jenž ukazovala proběhnutí reakce. K ukončení reakce byl přidán pevný uhličitan draselný a směs byla rychle zfiltrována .přes silikagel a zakoncetrována do získání hrubého alkohol-dibenzyl fosfátu (IV-f) jako světle žlutého oleje (100 % výtěžnost).

44

4 4 4 4 4

4 4 4 4 • 4 4 4 4 4

4 4 4 4 «4« 44 44

C7. Alkohol IV-f (78 mg, 0,152 mmol) byl rozpuštěn v čerstvě destilovaném dichlormethanu (10 ml) pod atmosférou argonu. Roztok byl přidán do Dess-Martin periodinanu (90 mg, 0,213 mmol,

1,4 eq). Roztok byl poté míchán a průběh reakce byl sledován TLC analýzou. Jakmile TLC analýza ukazovala, že reakce proběhla, byla ukončena přidáním 1:1 nasyceného vodného roztoku bikarbonátu sodného : nasycenému vodnému roztoku thiosiřičitanu sodného. Dvoufázová směs byla míchána 1 hodinu při okolní teplotě. Fáze byly odděleny a vodná fáze třikrát extrahována ethylacetátem. Spojené organické fáze byly promyty solným roztokem a vysušeny síranem sodným. Rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku až do vzniku aldehydového produktu (IV-g) jako světle hnědého oleje (100 % výtěžnost).

C8. Aldehyd IV-g (78 mg, 0,152 mmol) byl rozpuštěn v roztoku terč. butanol/voda (3,5 ml) pod inertní atmosférou. Do rychle míchaného roztoku byl přidán 2-methyl-2-buten (1 M v THF, 1,5 ml), jednosytný fosfát sodný (105 mg, 0,76 mmol, 5 eq) a chlorid sodný (69 mg, 0,76 mmol, 5 eq). Roztok byl míchán dalších 8 hodin při pokojové teplotě. Roztok byl zakoncentrován a zbytky byly okyseleny a extrahovány třikrát ethylacetátem. Spojené organické fáze byly vysušeny síranem hořečnatým. Roztok byl opět zakoncetrován pod sníženým tlakem a zbytek byl přečištěn kolonovou chromatografií (2:1 ethylacetát:hexan) do dosažení požadovaného dibenzylfosfátu karboxylové kyseliny (IV-h) jako světle žlutého oleje (65 % výtěžnost).

C9. Kyselina IV-h (8 mg, 0,0152 mmol, 1,1 eq) byla rozpuštěna v čerstvě destilovaném dichlormethanu (2 ml) pod argonem při okolní teplotě. Do směsi byl přidán paclitaxel (12 mg, 0,0138 mmol, 1 eq) následovaný DMAP (2 mg, 0,0138 mmol, 1 eq) a DCC (3,2 mg, 0,0152 mmol, 1,1 eq). Směs byla míchána při pokojové teplotě další 4 hodiny, během které se tvořila světlá sraženina. Jakmile TLC analýza ukazovala, že reakce proběhla, rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku a zbytek byl přečištěn kolonovou chromatografií (1:1 ethylacetát .hexan) až do vzniku paclitaxel-C2'-karboxylátesteru (IV-i) jako bílé pevné krystalické látky (65 % výtěžnost).

CIO. Ester IV-i (5 mg) byl rozpuštěn v čisté kyselině mravenčí (1 ml) pod argonovou atmosférou při pokojové teplotě a míchán 30 minut. Jakmile TLC analýza ukazovala, že reakce proběhla, roztok byl zakoncentrován pod sníženým tlakem a zbytek byl přečištěn rychlou filtrací přes silikagel až do získání požadované sloučeniny anilin-taxol (IV-j) jako bílého prášku v 50% výtěžnosti.

Cil. Do roztoku (póly di-CBZ) chráněného AcHN-RRRRRRR-COOH (1,2 eq, 0,1 až 1 M) v suchém DMF byl přidán O-benzotriazolyloxytetramethyluroniumhexafluorofosfát (HATU, 1 eq) a katalytické množství DMAP (0,2 eq). Roztok byl míchán pod inertní atmosférou 5 minut při okolní teplotě. Do této směsi byl přidán Taxol-anilinový derivát (IV-j) jako roztok v suchém ·· ·· 99 • 9 9 9

9 9 9

9 9 · 9

9 9 9 ··

DMF (minimální objem k rozpuštění). Výsledný roztok byl míchán dalších 5 hodin při pokojové teplotě. Reakce byla zakončena zakoncentrováním reakční směsi pod sníženým tlakem. Surová reakční směs byla poté přečištěna HPLC až do získání požadovaného materiálu (IV, obr. 6D).

Příklad 10: Transport kovových iontů.

3,93 g DTPA je rozpuštěno ve 100 ml HEPES pufru a 1,25 ml atomového standardního roztoku chloridu europia (Sigma) rozpuštěného v 8 ml HEPES pufru je přidáno a mícháno 30 minut při pokojové teplotě. Chromatografické rozdělení a lyofilizace poskytne Eu-DTPA chelatační komplex. Tento komplex je poté konjugován na amino-konec polypeptidu pomocí peptidové chemie pevné fáze. Buněčný příjem europiových iontů může být zaznamenán pomocí časové analýzy fluorescence.

Příklad 11: Příjem PNA-peptidových konjugátu.

PNA peptidové konjugáty byly syntetizovány s použitím chemie pevných látek komerčně dostupných Fmoc činidel (PerSeptive Biosystems, Cambridge, MA) buď s Applied Biosystems 43 3 A peptidovým syntetizátorem nebo Millipore Expedite systémem syntéz nukleových kyselin. Polymery D nebo L-argininu byly připojeny na aminový nebo karboxylový konec PNA, jenž jsou obdobné 5' a 3' koncům nukleových kyselin. Konjugáty byly rovněž modifikovány tak, aby obsahovaly fluorescein nebo biotin přidáním mezičlánku kyseliny aminokapronové na N-konec konjugátu a poté připojením biotinu nebo fluoresceinu. PNA-peptidové konjugáty byly odděleny od pevné pryskyřice použitím 95 % TFA, 2,5 % triisopropylsilan a 2,5 % vodného fenolu. Pryskyřice byla odstraněna filtrací a zbylá kyselina byla odpařena. Produkt byl přečištěn metodou HPLC s kolonou sC18 reverzní fází a produkt byl lyofilizován. Požadované PNApolymerní byly identifikovány laserovou desorpční hmotovou spektroskopií.

A. Inhibice buněčné sekrece gama-IFN

1. PNA-peptidové konjugáty. Následující PNA-peptidové konjugáty se smyslem a beze smyslu byly připraveny na inhibování gama-IFN produkce, kde r = D-arginin a R = L-arginin:

Se smyslem:

NH₂-rrrrrrr-AACGCTACAC-COOH

Beze smyslu:

NH₂-rrrrrrr-GTGTAGCGTT-COOH (SEQ ID NO: 18) (SEQ ID NO: 19)

Fluorescentní beze smyslu: X-rrrrrrr-GTGTAGCGTT-COOH kde X = fluorescein-aminokaproát

Biotinylované beze smyslu: Z-rrrrrrr-GTGTAGCGTT-COOH kde Z = biotin-aminokaproát (X-SEQ ID NO: 19) (Z-SEQIDNO: 19)

2. Příjem T buňkami. Na ukázku, že PNA-polyargininové konjugáty vstupují do buněk účinně, byl fluorescentní konjugát beze smyslu uvedený výše (X-SEQ ID NO: 19) syntetizován spojením fluorescein isothiokyanátu na N-konec SEQ ID NO: 18 s použitím mezičlánku aminokapronové kyseliny.

Buněčný příjem byl stanoven inkubací lidské T buněčné linie Jurkat (5 x 10⁵ buněk/jamku), buď předem upravených 0,5 % azidem sodným 30 minut nebo fosfátem pufrovaným solí, s různým množství (100 nM až 50 μΜ) značeným fluoresceinem se smyslem a PNA-r7 konjugátem beze smyslu, stejně jako samotný PNA beze smyslu (bez r7 části). Množství PNA beze smyslu v buňkách byly analyzováno konfokálním mikroskopem a FACS. V obou případech byly fluorescentní signály přítomny pouze v buňkách, jenž nebyly vystaveny účinku azidu sodného a fluorescentní signál byl závislý na dávce fluorescentního konjugátu a na teplotě a době inkubace.

3. Gama-IFN stanovení. Množství gama interferonu vyloučeného myší T buněčnou linií (klon 11,3) bylo měřeno inkubací 10⁵ T buněk s různým množství antigenu (peptid obsahující zbytky 110 až 121 vorvaňového myglobinu) a histokompatibilních buněk sleziny z DBA/2 myši (H-2d, 5 x 10⁵), které se chovají jako antigen prezentující buňky (APC) v 96 jamkové destičkách. Po 24 hodinové inkubaci při 37 °C bylo přeneseno 100 μΐ supernatantu do mikrotitračních destiček s komerčně dostupnou anti-gama-IFN monoklonální protilátkou (Mab) (Pharmingen, San Diego, CA). Po jednohodinové inkubaci při pokojové teplotě byly destičky opláchnuty PBS pufrem obsahující 1 % telecí fetální sérum a 0,1 % Tween 20, po kterých byl přidán druhá biotinylovaná gama-IFN Mab. Po druhé hodině inkubace byly destičky opláchnuty stejně jako předtím a byl přidán europium (Eu)-streptavidin (Delphia-Pharmacia). Opět byl po hodinové inkubaci přidán kyselý pufr k uvolnění europia, který byl měřen časově rozloženou fluorometrií na Delphia destičkovém čtecím zařízení. Množství fluorescence bylo úměrné množství vzniklého gama-IFN a mohlo by být přesně vyčísleno s použitím známého množství gama-IFN na vytvořením kalibrační křivky.

• · ♦ · · ·· *· • ·« 9 9 9 9

9 · · · · • ······

9 9 9 9 9

999 99 99

4. Inhibice tvorby gama-IFN konjugáty. Schopnost PNA-polyargininových konjugátů inhibovat sekreci gama-IFN byla stanovena přidáním různé koncentrace výše uvedených gama-IFN konjugátů se suboptimálními dávkami peptidového antigenu (0,5 μΜ) do směsi klonu 11,3 T buněk a histokompatibilních buněk sleziny. Byly rovněž testovány PNA sekvence postrádající polyargininové skupiny a nekonjugovaný D-argininový heptamer.

Po 24 hodinách byly sebrány všechny vypěstované supernatanty a množství gama-IFN bylo měřeno použitím kvantitavního rozboru fluorescentní vazby popsané v části 3 výše. Ošetření buněk antisense PNA-r7 konjugátem vede k 70% redukci v IFN sekreci, kde ekvivalentní molární množství PNA-r7 se smyslem, PNA meze smyslu postrádající r7 nebo samotný r7 nevykazují inhibici (obr. 7).

Příklad 12: Transport velkého proteinového antigenu do APC.

Konjugát ovalbuminu připojený na poly-L-argininový heptamer vznikl reakcí polypeptidového polymeru obsahujícího cystein (Cys-Ala-Ala-Ala-Arg₇, SEQ ID NO: 21) s ovalbuminem (45 kDa) v přítomnosti sulfo-MBS, heterobifunkční látka způsobující zesítění (Pierce Chemical Co., Rockford, IL)

Molární poměr peptidu konjugovaného na ovalbumin byl vyčíslen analýzou aminokyselin. Konjugátový produkt byl označen 0V-R7. Konjugát byl přidán (konečná koncentrace ~ 10 μΜ) do B buněk, rovněž odkazované jako antigen prezentující buňky (APC), které byly izolovány podle standardních metod. APC byly inkubovány s OV-R7 a poté byly běžnými metodami přidány do připravených cytotoxických T-lymfocytů. Vystavení CTL účinku APC tak, že byly inkubovány s OV-R7 produkované CD8+ CTL specifický na albumin. Naproti tomu byly APC vystaveny účinku nemodifikovaného ovalbuminu zeslabeného stimulací CTL.

V jiném pokuse byly histokompatibilní dendritické buňky (specifický typ APC) vystaveny účinku albumin-R7 konjugátů a poté byly vneseny do myší. Následná analýza krve těchto myší prokázala přítomnost CTL specifických na albumin. Kontrolní myši měly dendritické buňky vystavené účinku nemodifikovaného albuminu. Kontrolní myši nevykazovaly odpověď CTL specifického na albumin.

Příklad 13: Zvýšený příjem V7-derivovaného peptidu.

Konjugát obsahující část C-koncové cytoplazmatické koncové oblasti V7 (leukocytový povrchový protein) o sekvenci KLSTLRSNT (SEQ ID NO: 22, Ruegg et al., 1995) byl syntetizovaný 7 argininovými zbytky připojenými na jeho C-konec podle standardních metod používaných peptidový syntetizér (Applied Biosystems Model 433). Konjugát byl přidáván ·· « · · »

···· · ·* ♦ · • · * · · • · ·» ·« ·· « · · · • · · ♦ • e · · · • · · · (konečná koncentrace ~ 10 μΜ) k T-buňkám, jenž byly izolovány standardními metodami a byl inkubován při 37 °C několik hodin přes noc. Buňky byly lyžovány s použitím detergentů (1 % Triton X-100). DNA byla odstraněna a rozpustná část (obsahující protein) byla vystavena účinku imunoprecipitaci anti-V7 myší monoklonální protilátkou v kombinaci skozí anti-myší IgG. RAF-1 je kinasa, která se spojuje s V7 a je inaktivována spojením s V7.

Pokud nedochází k peptidové úpravě, RAF-1 protein se sráží spolu s V7. V buňkách ošetřených peptidem byl RAF-1 protein eliminován z V7 imunokomplexu. Stejné peptidy nebyly schopné narušit komplex obsahující RAF-1 a p21 Ras vylučující nespecifické modifikace RAF-1 V7 peptidem.

Ve druhé studii byla V7 peptidová část V7-poly-argininového konjugátu fosforylována in vitro s použitím protein kinasy C. Anti-RAF-1 precipitáty T buněk, jenž byly vystaveny fosforylovaným V7 koncovým peptidům, ale ne nefosforylovánému V7 koncovému peptidu, představovaly silnou inhibici aktivity RAF-kinasy.

Zatímco vynález popisoval v referencích specifické metody a případy, bude oceněno, že řada modifikací a změn může vzniknout bez odchýlení se od podstaty vynálezu.

Reference:

Barsoum et al., PCT Pub. No. WO 94/04686 (1994).

Bonifáci, N., etal., Aids 9: 995 - 1000.

Brugidou, J., etal. Biochem. Biophys. Res. Comm. 214 (2): 685 - 93 (1995).

Derossi, D., et al., J. Biol. Chem., 269: 10444 - 50 (1995).

Egholm, M.O., et al., Nátuře 365: 566 - 568 (1993).

Ebrle and Nuninger, J. Org. Chem. 57: 2689 (1992).

Fawell, S., et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91: 664 - 668 (1994).

Fletcher, M.D., etal., Chem. Rev. 98: 763 (1998).

Gennaro, A.R., Ed., Remingtonů Pharmaceutical Sciences, 18^th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990).

Giannis A., et al., Advances Drug Res. 29: 1 (1997).

Kessler H., Angew. Chem. Int. Ed. Eng. 32: 543 (1993).

Lam, K.S., etal., Chem. Rev. 97: 411 (1997).

Langston, S., DDT 2: 255 (1997).

Rivas, A., et al., J. Immunol. 154: 4423 - 33 (1995).

Ruegg, C., etal., J. Immunol. 154: 4434-43 (1995).

Ryser, H.J.P., PCT Pub. No. WO 79/00515 (1979).

Simon etal., Proč. Nati. Acad. Sci. 89: 9367 (1992).

Suffness, M., Ed., Taxol: Sciences and Applications, CRC Press, New York, NY, pp. 237 - 239 (1995).

Shaheen et al., J. Virology 70: 3392 (1996).

Tavladoraki et al., Nátuře 266: 469 (1993).

Thompson, L.A., and Ellman, J.A., Chem. Rev. 96: 555 (1996).Wong, S.S., Ed. Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press, lne., Boča Raton, FL (1991)

Zuckermann, R.N., Chemtracts-Macromol. Chem. 4: 80 (1993).

Všechny reference citované v této přihlášce jsou zahrnuty v referencích.

Claims (55)

1. Konjugát vyznačující se tím, že obsahuje biologicky aktivní činidlo, jenž je kovalentně vázáno na nosič obsahující nepeptidový základní řetězec a obsahuje vhodné guanidinové nebo amidinové skupiny postranního řetězce, aby zvýšily přestup konjugátu přes biologickou membránu ve srovnání s přestupem biologicky aktivního činidla v nekonjugovaném stavu.

2. Konjugát podle nároku 1 vyznačující se tím, že nosič obsahuje od 5 do 25 guanidinových nebo amidinových skupin postranního řetězce.

3. Konjugát podle nároku 2 vyznačující se tím, že nosič obsahuje 6 až 20 sousedících guanidinových skupin postranního řetězce.

4. Konjugát podle nároku 1 vyznačující se tím, že nosič obsahuje alespoň 6 sousedících guanidinových anebo amidinových skupin postranního řetězce.

5. Konjugát podle nároku 1 vyznačující se tím, že nosič obsahuje od 5 do 25 podjednotek, kde každá z nich obsahuje postranní řetězec, z nichž alespoň 50 % postranních řetězců obsahuje guanidinové nebo amidinové skupiny.

6. Konjugát podle nároku 1 vyznačující se tím, že se rychlost přestupu konjugátu přes biologickou membránu zvětšuje.

7. Konjugát podle nároku 1 vyznačující se tím, že se množství konjugátu přes biologickou membránu zvětšuje.

8. Konjugát podle nároku 1 vyznačující se tím, že je přestup konjugátu přes biologickou membránu významně větší než biologicky aktivní látky připojené na základní HIV tat peptid obsahující zbytky 49 až 57.

9. Konjugát podle nároku 8 vyznačující se tím, že je přestup konjugátu přes biologickou membránu alespoň dvakrát větší než biologicky aktivní látky připojené na základní HIV tat peptid.

IfO 46JMĚUĚ&fótfSr • · · ♦♦·.„·

10. Konjugát podle nároku 9 vyznačující se tím, že transportní rychlost konjugátu přes biologickou membránu je alespoň šestkrát větší než transportní rychlost biologického činidla připojeného na základní HIV tat peptid.

11. Konjugát podle nároku 1 vyznačující se tím, že nepeptidový základní řetězec obsahuje atomy vybrané ze skupiny obsahující uhlík, kyslík, síru, fosfor a dusík.

12. Konjugát podle nároku 1 vyznačující se tím, že nepeptidový základní řetězec je vybrán ze skupiny obsahující alkylové skupiny připojené thioethery, sulfonylovými skupinami, karbamátovými skupinami, polyethylenimidiny nebo aminoaldehydy, estery hydroxykyseliny a aza analogy, ve kterých je uhlík v poloze alfa nahrazen dusíkem.

13. Konjugát podle nároku 12 vyznačující se tím, že nenpeptidový základní řetězec je vybrán ze skupiny obsahující N-substituované amidy, estery, ketomethylen, redukovaný nebo methylenamino, thioamid, fosfornan, fosfoamidát, fosfoamidový ester, retropeptidy, trcmsalken, fluoroalken, dimethylen, thioether, hydroxyethylen, methylenoxy, tetrazol, retrothioamid, sulfonamido, methylensulfonamido, retrosulfonamid a peptoid.

14. Konjugát podle nároku 12 vyznačující se tím, že nepeptidový základní řetězec obsahuje malonát anebo gew-diaminoalkylové podjednotky.

15. Konjugát podle nároku 1 vyznačující se tím, že jsou guanidinové anebo amidinové skupiny postranního řetězce připojeny na základní řetězec spojovníkem postranního řetězce, jenž obsahuje alespoň 2 atomy spojovníkového řetězce.

16. Konjugát podle nároku 15 vyznačující se tím, že spojovník postranního řetězce obsahuje od 2 do 5 atomů spojovníkového řetězce.

17. Konjugát podle nároku 15 vyznačující se tím, že spojovník postranního řetězce obsahuje atomy vybrané ze skupiny obsahující uhlík, kyslík, síru, fosfor a dusík.

18. Konjugát podle nároku 1 vyznačující se tím, že biologicky aktivní látky je malá organická molekula.

.ZMĚIJIĚW^T¹ » · ♦ · ·· ·<

v**'

19. Konjugát podle nároku 1 vyznačující se tím, že biologicky aktivní látky je připojen k alespoň dvěma nosičům.

20. Konjugát podle nároku 1 vyznačující se tím, že alespoň dvě biologicky aktivní látky jsou připojeny na nosič.

21. Způsob zvýšení transportu vybrané sloučeniny přes biologickou membránu vyznačující se tím, že obsahuje: místo kontaktu biologické membrány s konjugátem podle nároku 1, čímž je uvedené kontaktní místo účinné pro zvýšení přenosu konjugátu přes biologickou membránu v porovnání s přenosem biologicky aktivního činidla v nekonjugované formě.

22. Způsob podle nároku 21 vyznačující se tím, že biologická membrána je eukaryotická buněčná membrána.

23. Způsob podle nároku 21 vyznačující se tím, že biologická membrána je prokaryotická buněčná membrána.

24. Způsob podle nároku 21 vyznačující se tím, že spojování je provedeno in vitro.

25. Způsob podle nároku 21 vyznačující se tím, že nosič obsahuje od 6 do 25 guanidinových nebo amidinových skupin postranního řetězce a obsahuje alespoň 6 sousedících guanidinových anebo amidinových skupin postranního řetězce.

26. Způsob podle nároku 21 vyznačující se tím, že nosič obsahuje mezi 7 a 20 sousedícími guanidinovými skupinami postranního řetězce.

27. Způsob podle nároku 21 vyznačující se tím, že rychlost trans-membránového transportu konjugátu je významně větší než rychlost trans-membránového transportu biologického činidla připojeného na základní HIV tat peptid obsahující zbytky 49 až 57.

28. Způsob podle nároku 27 vyznačující se tím, že transportní rychlost konjugátu je alespoň dvakrát větší než transportní rychlost biologického činidla připojeného na základní HIV tat peptid.

«?MěNÉNÝ_:tisr

29. Způsob podle nároku 28 vyznačující se tím, že transportní rychlost konjugátu je alespoň šestkrát větší než transportní rychlost biologického činidla připojeného na základní HIV tat peptid.

30. Konjugát vyznačující se tím, že obsahuje biologicky aktivní činidlo, jenž je kovalentně vázáno štěpitelným spojovníkem na nosič obsahující vhodné guanidinové nebo amidinové skupiny postranního řetězce, aby zvýšily přestup konjugátu přes biologickou membránu ve srovnání s přestupem biologicky aktivního činidla v nekonjugovaném stavu, kde je spojovník štěpitelný in vivo.

31. Konjugát podle nároku 30 vyznačující se tím, že nosič obsahuje od 6 do 25 guanidinových nebo amidinových skupin postranního řetězce.

32. Konjugát podle nároku 30 vyznačující se tím, že nosič obsahuje alespoň 6 sousedících guanidinových nebo amidinových skupin postranního řetězce.

33. Konjugát podle nároku 31 vyznačující se tím, že nosič obsahuje mezi 7 a 20 sousedícími guanidinovými nebo amidinovými skupinami postranního řetězce.

34. Konjugát podle nároku 30 vyznačující se tím, že nosič obsahuje D-argininové a L-argininové zbytky.

35. Konjugát podle nároku 30 vyznačující se tím, že štěpitelný spojovník je enzymaticky štěpitelný.

36. Konjugát podle nároku 30 vyznačující se tím, že Štěpitelný spojovník je chemicky štěpitelný.

37. Konjugát podle nároku 30 vyznačující se tím, že štěpitelný spojovník je fotoštěpitelný.

38. Konjugát podle nároku 30 vyznačující se tím, že štěpitelný spojovník obsahuje ester.

39. Konjugát podle nároku 30 vyznačující se tím, že štěpitelný spojovník obsahuje disulfidovou vazbu.

ýj 49jZMSNÉK&USF

40. Konjugát podle nároku 30 vyznačující se tím, že štěpitelný spojovník obsahuje jednu štěpitelnou skupinu, která je vzdálená od činidla a druhou štěpitelnou skupinu, jenž je v blízkosti činidla, takže štěpení první štěpitelné skupiny poskytuje konjugát spojovníkčinidlo obsahující nukleofilní skupinu schopnou reagovat intramolekulárně za rozštěpení druhé štěpitelné skupiny, čímž se z uvedeného spojovníku a nosiče uvolní činidlo.

41. Konjugát podle nároku 30 vyznačující se tím, že přestup konjugátu přes biologickou membránu je významně větší než biologicky aktivního činidla připojeného na základní HIV tat peptid obsahující zbytky 49 až 57.

42. Konjugát podle nároku 41 vyznačující se tím, že přestup konjugátu přes biologickou membránu je alespoň dvakrát větší než biologicky aktivního činidla připojeného na základní HIV tat peptid.

43. Konjugát podle nároku 42 vyznačující se tím, že přestup konjugátu je alespoň šestkrát větší než přestup biologicky aktivního činidla připojeného na základní HIV tat peptid.

44. Způsob zvýšení transportu vybrané sloučeniny přes biologickou membránu vyznačuiící se tím, že obsahuje: místo kontaktu biologické membrány s konjugátem podle nároku 30, čímž je uvedené kontaktní místo účinné pro zvýšení přenosu konjugátu přes biologickou membránu v porovnání s přenosem biologicky aktivního činidla v nekonjugované formě.

45. Způsob podle nároku 44 vyznačující se tím, že štěpitelný spojovník je štěpen za uvolnění volné biologicky aktivní látky po prostoupením biologickou membránu.

46. Způsob podle nároku 45 vyznačující se tím, že je štěpitelný spojovník enzymaticky štěpitelný spojovník a volná biologicky aktivní látka je uvolněna vazbou konjugátu s enzymem, jenž štěpí spojovník.

47. Způsob podle nároku 45 vyznačující se tím, že štěpitelný spojovník je foto štěpitelný spojovník a volná biologicky aktivní látka je uvolněna vazbou konjugátu se světlem.

48. Způsob podle nároku 45 vyznačující se tím, že je štěpitelný spojovník chemicky štěpitelný.

-50.ŽMENENYtIST «> 9 9 9 9 9 9 • » · 9 9 9 9 ·· ··* 99 99

49. Způsob podle nároku 48 vyznačující se tím, že štěpitelný spojovník obsahuje disulfidovou vazbu a štěpení spojovníku je účinné redukcí nebo disulfidovou substitucí.

50. Způsob podle nároku 45 vyznačující se tím, že nosič obsahuje od 6 do 25 guanidinových nebo amidinových skupin postranního řetězce.

51. Způsob podle nároku 45 vyznačující se tím, že nosič obsahuje alespoň 6 sousedících guanidinových nebo amidinových skupin postranního řetězce.

52. Způsob podle nároku 45 vyznačující se tím, že nosič obsahuje mezi 7 a 20 sousedícími guanidinovými nebo amidinovými skupinami postranního řetězce.

53. Způsob podle nároku 45 vyznačující se tím, že přestup konjugátu přes biologickou membránu je významně větší než transportní rychlost biologicky aktivního činidla připojeného na základní HIV tat peptid obsahující zbytky 49 až 57.

54. Způsob podle nároku 53 vyznačující se tím, že přestup konjugátu přes biologickou membránu je alespoň dvakrát větší než transportní rychlost biologicky aktivního činidla připojeného na základní HIV tat peptid.

55. Způsob podle nároku 54 vyznačující se tím, že přestup konjugátu přes biologickou membránu je alespoň šestkrát větší než transportní rychlost biologicky aktivního činidla připojeného na základní HIV tat peptid.