KR20010012809A - 생체막을 통한 수송을 증진시키는 조성물 및 방법 - Google Patents

생체막을 통한 수송을 증진시키는 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

생체막을 통해 약물 및 거대분자를 수송하기 위한 방법 및 조성물을 개시한다. 하나의 구체예에서, 본 발명은 생체막을 통해 선택된 화합물의 수송을 증진시키는 방법으로서, 생체막이 수송 중합체에 공유적으로 부착된 생물학적 활성 작용제를 포함하는 콘쥬게이트와 접촉하는 것을 포함한다. 하나의 구체예에서, 중합체는 6 내지 25개의 서브유니트로 구성되고 서브유니트의 50%가 구아니디노 또는 아미디노 측쇄 부분을 포함한다. 중합체는 부착된 작용제에 비콘쥬게이트 형태의 작용제의 막통과 수송속도보다 더 빠른 생체막을 통한 막통과 수송속도를 제공하는 데 효과적이다. 수송증진 중합체는 바람직한 구체예에서, 서브유니트를 구성하는 아르기닌 잔기인 펩티드로 예시된다. 이러한 폴리아르기닌 펩티드는 모두 D-, 모두 L-, 또는 혼합 D- 및 L-아르기닌중 하나로 구성될 수 있고, 모두 추가의 아미노산을 포함할 수 있다. 생물학적 타겟의 콘쥬게이트가 통과하는 동안 중합체의 생물학적 안정성을 증진시키기 위해 보다 바람직하게, 적어도 하나, 바람직하게 모든 서브유니트가 D-아르기닌 잔기이다.

Description

생체막을 통한 수송을 증진시키는 조성물 및 방법{COMPOSITION AND METHOD FOR ENHANCING TRANSPORT ACROSS BIOLOGICAL MEMBRANES}
문헌
이 출원내에서 언급된 모든 문헌은 참고자료로서 여기에 삽입된다.
세포의 원형질막은 수많은 유용한 치료제의 통과를 저지하는 관문으로서 존재한다. 통상, 약물은 신체의 수상 부분과, 세포에 들어가기 위해서 약물이 통과해야 하는 지질막 둘다에 자유로이 용해되어야 한다. 매우 하전된 분자는 특히 막통과에 어려움을 겪는다. 펩티드 및 올리고뉴클레오티드와 같은 많은 치료적 거대분자는 특히 막통과 수송이 어렵다. 따라서, 생물공학이 수많은 잠재적으로 유용한 치료제를 가능하게 하였지만, 생체이용율의 고려가 자주 이들의 약제적 사용에 장애가 된다. 그러므로 약물, 및 특히 거대분자를 세포내로 수송하는 확실한 방법에 대한 요구가 있어 왔다.
지금까지, 생체막을 통해 분자를 수송시키기 위한 수많은 수송분자가 제안되어 왔다. Ryser 등(1979)은 특히 매우 고분자량이 바람직하면서, 세포막을 통해 다양한 분자의 수송을 증가시키기 위해 리신의 고분자량 중합체를 교시한다. 이 저자들은 오르니틴 및 아르기닌과 같은 다른 양성으로 하전된 잔기의 중합체를 생각하였지만, 그러한 중합체의 실효성은 보여주지 않았다.
Frankel 등(1991)은 선택된 분자들을 HIV의 태트(tat) 단백질에 콘쥬게이션시킴으로써 이들 분자들의 세포의 업테이크(uptake)를 증가시킬 수 있음을 보고하였다. 그러나, 태트 단백질의 사용은 바람직하지 못한 응집 및 불용성을 포함하여 몇가지 단점을 가진다.
Barsoum 등(1994) 및 Fawell 등(1994)은 태트 염기성 영역(서열 RKKRRQRRR을 가지는 잔기 49-57)을 포함하는 태트 단백질의 보다 짧은 단편을 사용하는 것을 제안하였다. Barsoum 등은 Ryser 등(상기)이 제안한 것과 반대로, 적당한 길이의 폴리아르기닌 중합체(MW 5000-15000달톤)가 β-갈락토시다제의 세포막을 통한 수송을 가능하게 하는 데 실패하였음을 지적하였다.
다른 연구들은 Antennapedia 호메오도메인으로부터 유도된 16개의 아미노산 펩티드-콜레스테롤 콘쥬게이트가 배양된 뉴런에 의해 신속히 내부화하는 것(Brugidou 등 1995)을 밝혔다. 그러나, 이 펩티드의 약간 짧은 개조물(15잔기)은 세포에 의해 효과적으로 흡수되지 않는다(Derossi 등, 1996).
본 발명은 인접하는, 매우 염기성이 서브유니트, 특히 구아니딜 또는 아미딘일 부분을 포함하는 서브유니트로 구성되는 몇몇 중합체를 작은 분자 또는 거대분자에 콘쥬게이션시킴으로써 부착된 분자의 생체막을 통한 수송을 현저하게 증진시키는 데 유효하다는 부분적으로 본 출원인의 발견에 기초한 것이다. 더욱이, 수송은 잔기 49-57로 구성되는 염기성 HIV 태트 펩티드에 의해 제공되는 수송속도보다 현저하게 빠른 속도로 일어한다.
발명의 개요
본 발명은 그 제 1 양태에서, 선택된 화합물의 생체막을 통한 수송을 증진시키는 방법을 포함한다. 이 방법에서, 생체막은 적어도 1개의 수송 중합체에 공유적으로 부착된 생물학적 활성 작용제를 포함하는 콘쥬게이트와 접촉한다. 이 콘쥬게이트는 비콘쥬게이트 형태의 생물학적 작용제의 막통과 수송속도보다 더 빠른 속도로 그 작용제의 생체막통과수송을 증진시키는 데 효과적이다.
하나의 구체예에서, 중합체는 적어도 50%가 구아니디노 또는 아미디노 측쇄 부분을 포함하는 6 내지 25개의 서브유니트로 구성되는 데 중합체는 적어도 6개, 보다 바람직하게 적어도 7개의 구아니디노 또는 아미디노 측쇄 부분을 포함한다. 다른 구체예에서, 중합체는 6 내지 20개, 7 내지 20개, 또는 7 내지 15개의 서브유니트로 구성된다. 보다 바람직하게, 중합체중 적어도 70%, 더욱 보다 바람직하게 90%의 서브유니트가 구아니디노 또는 아미디노 측쇄 부분을 포함한다. 바람직하게, 어떤 구아니디노 또는 아미디노 측쇄 부분도 1개 이상의 비구아니디노 또는 비아미디노 서브유니트에 의해 다른 그러한 부분으로부터 분리되지 않는다. 보다 구체적인 구체예에서, 중합체는 각각 구아니디노 또는 아미디노기를 포함하는 적어도 6개의 인접하는 서브유니트를 포함하고, 보다 바람직하게 적어도 6 또는 7개의 인접하는 구아니디노 측쇄 부분을 포함한다.
다른 구체예에서, 수송 중합체는 6 내지 25개의 인접하는 서브유니트, 7 내지 25개, 6 내지 20개, 또한 바람직하게 7 내지 20개의 인접하는 서브유니트를 포함하고, 그것의 각각은 구아니디노 또는 아미디노 측쇄 부분을 포함하고, 그 인접하는 서브유니트는 작용제가 부착하는 비아르기닌 잔기를 포함할 수 있는 것을 선택적인 조건으로 한다.
하나의 구체예에서, 각 인접하는 서브유니트는, 적어도 6개의 인접하는 아르기닌 잔기를 포함하는 중합체에 의해 예시되는 바와 같이 구아니디노부분을 포함한다.
바람직하게, 각 수송 중합체는 선형이다. 바람직한 구체예에서, 작용제는 수송 중합체의 말단에 부착한다.
또 다른 구체적 구체예에서, 콘쥬게이트는 단일 수송 중합체를 포함한다.
수송증진 중합체는 바람직한 구체예에서, 아르기닌 잔기가 서브유니트를 구성하는 펩티드로서 예시된다. 이러한 폴리아르기닌 펩티드는 모두, D-, 모두 L- 또는 혼합된 D- 및 L-아르기닌중 하나로 구성될 수 있고, 추가의 아미노산을 포함할 수 있다. 보다 바람직하게, 적어도 하나, 바람직하게 모든 서브유니트를 D-아르기닌잔기로 하여 콘쥬게이트를 생체 타켓에 운송하는 동안 중합체의 생물학적 안정성을 증진시킨다.
본 방법은 진핵생물의 세포막, 원핵생물의 세포막, 및 세포벽을 포함하는, 그러나 이에 국한하지는 않는, 모든 수많은 생체막을 통과하여 선택된 치료제의 수송을 증진시키는 데 사용할 수 있다. 원핵생물의 세포막의 예로서는 박테리아 막을 포함한다. 흥미있는 진핵생물의 세포막의 예로서는 수상세포, 표피세포, 내피세포, 케라틴세포, 근육세포, 진균세포, 박테리아세포, 식물세포 등의 막을 포함하나 이에 국한되지는 않는다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명의 수송 중합체는 실온(23℃) 또는 37℃에서 측정하였을 때, 실시예 6의 방법에 의해 태트(49-57) 펩티드에서 측정되는 친화성보다 적어도 10배, 바람직하게 적어도 100배 더 큰 명백한 친화성(Km)을 가진다.
생물학적 활성 작용제(치료제 포함)는 전형적으로 금속 킬레이트로서 송달되는 금속이온; 항암제(탁산(taxane)) 및 항균성 분자(예, 박테리아 또는 효모와 같은 진균에 대한) 등의 작은 유기분자; 및 핵산, 펩티드, 단백질 등의 거대분자; 및 그 것의 유사체를 포함하나 이에 국한되지는 않는다. 하나의 바람직한 구체예에서, 작용제는 안정성을 증가시키기 위해 선택적으로, 1개 이상의 2'-디옥시 뉴클레오타이드 서브유니트를 포함하는 리보자임 등의 핵산 또는 핵산 유사체이다. 대안적으로, 작용제는 펩티트 핵산(peptide nucleic acid, PNA)이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 작용제는 단백질 항원 등의 폴리펩티드이고, 생체막은 항원제시세포(APC)의 세포막이다. 또 다른 구체예에서, 작용제는 선택된 종양 항원에 대한 면역반응을 촉진시키거나 유도해내기 위해 선택된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 작용제는 탁산 또는 탁소이드 항암 화합물이다. 또 다른 구체예에서, 작용제는 비폴리펩티드 작용제, 바람직하게, 비폴리펩티드 치료제이다. 보다 일반적인 구체예에서, 작용제는 바람직하게 10kDa미만의 분자량을 가진다.
작용제는, 콘쥬게이트내에 구조적 유동성을 부여할 수 있고 작용제와 그것의 생체 타겟간의 상호작용을 촉진시킬 수 있는 연결부분에 의해 중합체에 연결될 수 있다. 하나의 구체예에서, 연결부분은, 예를 들면 에스테르, 아미드 또는 디술피드기 등의 효소에 의해 또는 용매가 매개되는 절단에 의해 절단가능한 링커기를 포함하는 절단가능한 링커이다. 또 다른 구체예에서, 절단가능한 링커는 광 절단가능기를 포함한다.
보다 구체적인 구체예에서, 절단가능한 링커는 생물학적 활성 작용제에서 먼 제 1 절단가능기와 그 작용제에 가까운 제 2 절단가능기를 포함하여, 제 1 절단가능기에서의 절단으로 친핵기를 포함하는 링커-작용제 콘쥬게이트를 생성하고, 상기 친핵 부분은 분자내에서 반응하여 제 2 절단가능기를 절단함으로써 링커 및 중합체로부터 작용제를 방출시킨다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 콘쥬게이트가 복수의 후보 작용제로부터 형성되는 경우, 선택된 생물학적 활성을 위해 복수의 콘쥬게이트를 스크린하는 데 사용될 수 있다. 콘쥬게이트는 세포에 업테이크될 때, 측정가능한 신호를 나타내는 세포와 접촉하고 그 때 신호의 크기는 선택된 생물학적 활성에 대한 콘쥬게이트의 효능의 지표가 된다. 이 방법은 특히 작용제 자체가 세포에 들어가 생물학적 활성을 증명할 수 없는 경우 또는 거의 불가능한 경우, 작용제의 활성을 시험하기 위해 유용하다. 하나의 구체예에서, 후보 작용제는 조합적 라이브러리에서 선택된다.
본 발명은 또한 상기 방법으로 스크리닝하기에 유용한 콘쥬게이트 라이브러리를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 생물학적으로 활성인 작용제를 생체막을 통과시켜 송달하기 위한 약제학적 조성물을 포함한다. 조성물은 상기한 바와 같이, 적어도 1개의 수송 중합체에 공유적으로 부착된 생물학적으로 활성인 작용제를 포함하는 콘쥬게이트와 약학적으로 허용되는 부형제로 이루어진다. 중합체는 비콘쥬게이트 형태의 작용제의 막통과 수송속도보다 더 빠른 막쿠과 수송속도를 작용제에 부여하는 데 효과적이다. 조성물은 그것을 사용하기 위한 지시와 함께 추가로 포장될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 약학적 조성물로 포유동물 환자, 특히 사람인 환자를 치료하는 치료방법을 포함한다.
본 발명은 이러한, 그리고 또 다른 목적과 양태는 본 발명의 하기 상세 명세서를 도면과 함께 읽을 때 보다 완전히 명백할 것이다.
본 발명은 유기화합물, 폴리펩티드, 올리고사카라이드, 핵산 및 금속이온과 같은 생물학적 활성 작용제의 생체막을 통한 수송을 증진시키는데 유효한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
도 1a 및 1b는 태트 염기성 펩티드(49-57, SEQ ID NO:1), 폴리-Lys(K9, SEQ ID NO:2) 및 폴리-Arg(각각 R4-R9 및 r4-r9, SEQ ID NO:3-8 및 12-17)을 포함하는 몇몇 폴리펩티드-형광 콘쥬게이트의 세포 업테이크를 펩티드 농도의 함수로서 플로팅한 것이고; 도 1c는 12.5μM의 농도의 콘쥬게이트에서 측정된 콘쥬게이트의 업테이크 수준의 히스토그램이다(실시예 2-3).
도 2a-2f는 형광에 콘쥬게이트된 6.25μM의 태트(49-57)(패널 A 및 D), 형광으로 표지된 7량체의 폴리-L-아르기닌(R7)(패널 B 및 E), 또는 형광으로 표지된 7량체의 폴리-D-아르기닌(r7)(패널 C 및 F)으로 37℃에서 10분간 인큐베이션한 후, 쥬르카트 세포에서 방출되는 형광(2a-2c) 및 투과된 빛(2d-2f)을 나타내는 공초점의 현미경(실시예 4)의 컴퓨터에서 생성된 이미지를 나타낸다.
도 3은 몇몇 폴리-Arg-형광 콘쥬게이트(각각 r9, R9, R15, R20, 및 R25, SEQ ID NO: 17 및 8-11)의 세포 업테이크를 콘쥬게이트 농도의 함수로서 나타낸다(실시예 5).
도 4는 0.5% 아지드나트륨이 존재하지 않을 때(4개의 왼쪽 막대)와 존재할 때(4개의 오른쪽 막대)의 형광-콘쥬게이트 태트(49-57) 및 폴리-Arg-형광 콘쥬게이트(각각 R9, R8, 및 R7)의 세포 업테이크의 히스토그램을 나타낸다(실시예 7).
도 5a-5c는 선택된 중합체 콘쥬게이트(K9, R9, r4, r5, r6, r7, r8, 및 r9)의 박테리아 세포에 의한 업테이크를 콘쥬게이트 농도의 함수로서 플로팅한 것을 나타내고; 도 5a는 E. coli HB 101 세포와 배양할 때, R9 및 r9 콘쥬게이트에서 관찰되는 업테이크 수준을 콘쥬게이트 농도의 함수로서 비교하고; 도 5b는 E. coli HB 101 세포와 배양할 때, K9 및 r4 내지 r9 콘쥬게이트에서 관찰되는 업테이크 수준을 나타내고; 도 5c는 Strep. Bovis 세포와 인큐베이션할 때, r9 및 K9의 콘쥬게이트의 업테이크 수준을 비교한다.
도 6a-6e는 절단가능한 링커부분을 포함하는 본 발명의 실례의 콘쥬게이트를 나타내고; 도 6f 및 6g는 파클리탁셀 및 "TAXOTERE"의 화학구조와 구성 골격의 종래의 번호매기기를 나타내고; 도 6h는 탁소이드 화합물의 일반적인 화학구조와 고리원자의 번호매기기를 나타낸다.
도 7은 PNA 서열이 감마-인터페론의 유전자로부터의 서열에 기준으로 하는 경우, 쥐과의 T세포에 의한 감마-인터페론(γ-IFN)의 분비저해를 센스-PNA-r7 콘쥬게이트(SEQ ID NO:18), 안티센스 PNA-r7 콘쥬게이트(SEQ ID NO:19), 및 비콘쥬게이트 안티센스 PNA (SEQ ID NO:20)의 농도의 함수로서 나타낸다.
1. 정의
여기서 사용되는 용어 "생체막"은 세포들 또는 여러 군의 세포들을 세포외 공간으로부터 분리시키는 지질함유 관문을 나타낸다. 생체막은 원형질막, 세포벽 또는 미토콘드리아막, 핵막 등의 세포내소기관막을 포함하고, 이에 국한되지는 않는다.
용어 "막통과 농도"는 특정 조성물이 가해지는 막의 반대편 또는 "트랜스"인 막의 한 쪽에 존재하는 화합물의 농도를 가리킨다. 예를 들면, 화합물을 세포의 세포외액에 첨가할 때, 이후 세포내에서 측정되는 화합물의 양이 화합물의 막통과 농도이다.
"생물학적으로 활성 작용제" 또는 "생물학적으로 활성 기질"은 세포에 의해 업테이크된 후, 세포의 구조, 기능 또는 조성물에서 관찰할 수 있는 변화를 가져오는 작은 분자, 거대분자, 또는 금속이온 등의 화학적 기질을 가리킨다. 관찰할만한 변화는 1개 이상의 mRNAs 발현의 증가 또는 감소, 1개 이상의 단백질의 발현의 증가 또는 감소, 단백질 또는 다른 세포성분의 인산화, 효소의 저해 또는 활성화, 결합 쌍의 막간 결합의 저해 또는 활성화, 대사체의 합성속도의 증가 또는 감소, 세포 증식의 증가 또는 감소 등을 포함한다.
여기서 사용되는 용어 "거대분자"는 생물학적 또는 합성적 기원의 펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드로 예시되나 이에 국한되지 않는 큰 분자(MW 1000달톤 초과)를 가리킨다.
"작은 유기분자"는 1000달톤 이하의 분자량(MW)을 가지는 탄소함유 작용제를 가리킨다.
용어 "치료제", "치료적 조성물" 및 "치료적 물질"은 포유동물 종의 이익에 사용될 수 있는 어떤 조성물을 가리키나 이에 국한되지는 않는다. 이러한 작용제는 예를 들어, 이온, 작은 유기분자, 펩티드, 단백질 또는 폴리펩티드, 올리고뉴클레오티드, 및 올리고사카라이드 형태를 가질 수 있다.
용어 "비폴리펩티드 작용제" 및 "비폴리펩티드 치료제"는 수송증진 중합체를 포함하지 않는 수송 중합체 콘쥬게이트의 일부, 즉 폴리펩티드가 아닌 생물학적 활성 작용제를 가리킨다. 비폴리펩티드 작용제의 예는 폴리아르기닌 펩티드에 콘쥬게이션되어 생체막을 통한 증가된 송달을 위한 콘쥬게이트를 형성한 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
용어 "중합체"는 공유결합에 의해 결합된 2이상의 동일한 또는 상이한 서브유니트의 선형 사슬을 가리킨다. 펩티드는 펩티드 결합에 의해 결합된 동일한 또는 상이한 아미노산 서브유니트로 구성될 수 있는 중합체의 예이다.
여기서 사용되는 용어 "펩티드"는 펩티드 결합에 의해 결합된 D- 또는 L-아미노산 또는 D- 및 L-아미노산의 혼합물의 단일 사슬로 구성되는 화합물을 가리킨다. 일반적으로, 펩티드는 적어도 1개의 아미노산 잔기를 포함하고, 길이로 약 50개의 아미노산미만이다.
여기서 사용되는 용어 "단백질"은 펩티드 결합에 의해 결합된 선형으로 배열된 아미노산으로 구성되는 화합물을 가리키나 펩티드와는 반대로 잘 규정된 형태를 가진다. 단백질은 펩티드에 반대되는 것으로, 일반적으로, 50개 또는 그 이상의 아미노산으로 구성된다.
여기서 사용되는 용어 "폴리펩티드"는 1개 이상의 펩티드 결합을 포함하는 적어도 2개 이상의 아미노산 잔기의 중합체를 가리킨다. "폴리펩티드"는 폴리펩티드가 잘 규정된 형태를 가지거나 가지지 않거나에 상관없이 펩티드 및 단백질을 포함한다.
용어 "구아니딜", "구아니딘일" 및 "구아니디노"는 화학식 -HN=C(NH2)NH (프로톤화되지 않은 형태)를 가지는 부분을 가리키기 위해 상호교환적으로 사용된다. 예를 들면, 아르기닌은 구아니딜(구아니디노) 부분을 포함하고 또한 2-아미노-5-구아니디노발레산 또는 α-아미노-δ-구아니디노발레산으로 불려진다. "구아니딘윰"은 양성으로 하전된 콘쥬게이트 산 형태를 가리킨다.
"아미딘일" 및 "아미디노"는 화학식 -C(=NH)(NH2)를 가지는 부분을 가리킨다. "아미딘윰"은 양성으로 하전된 콘쥬게이트 산 형태를 가리킨다.
용어 "폴리아르기닌" 또는 "폴리-Arg"는 인접하는 아르기닌 잔기로 구성되는 중합체 서열을 가리키고; 폴리-L-아르기닌은 모두 L-아르기닌들을 가리키고; 폴리-D-아르기닌은 모두 D-아르기닌들을 가리킨다. 폴리-L-아르기닌은 또한 펩티드중 L-아르기닌의 수와 함께 대문자 "R"로 약기되고(예를 들어, R8는 8량체의 인접하는 L-아르기닌 잔기를 나타낸다); 폴리-D-아르기닌은 펩티드중 D-아르기닌의 수와 함께 소문자 "r"로 약기된다(r8은 8량체의 인접하는 D-아르기닌 잔기를 나타낸다).
아미노산 잔기는 여기서 그들의 생략되지 않은 명칭으로, 또는 표준의 단일 문자로 또는 3개의 문자표기법으로 나타낸다: A, Ala, 알라닌; C, Cys, 시스테인; D, Asp, 아스파트산; E, Glu, 글루탐산; F, Phe, 페닐알라닌; G, Gly, 글리신; H, His, 히스티딘; I, Ile, 이소류신; K, Lys, 리신; L, Leu, 류신; M, Met, 메티오닌; N, Asn, 아스파라진; P, Pro, 프롤린; Q, Gln, 글루타민; R, Arg, 아르기닌; S, Ser, 세린; T, Thr, 트레오닌; V, Val, 발린; W, Trp, 트립토판; X, Hyp, 히드록시프롤린; Y, Tyr, 티로신.
II. 중합체 부분의 구조
하나의 구체예에서, 본 발명에 따르는 수송 중합체는 상기 설명한 바와 같이, 6에서 25개 까지의 서브유니트의 짧은 길이의 중합체를 포함한다. 콘쥬게이트는 생체막을 통화하는 콘쥬게이트의 수송속도를 비콘쥬게이트 생물학적 작용제 단독의 수송속도와 비교하여 증가시키는 데 유용하다. 예가 되는 중합체 조성물은 펩티드이지만, 중합체는 하기 더 논의되는 바와 같이 비펩티드 골격 및/또는 서브유니트를 포함할 수 있다.
본 발명의 중요한 양태에서, 본 발명의 콘쥬게이트는 특히 작용제가 그것의 생물학적 효과를 발휘하기 위해서 막통과 수송이 필요하고, 표면의 수용체에 결합함으로써, 즉 작용제의 유입이 일어나지 않고 기본적으로 생물학적 효과를 발휘하지 않는 형태인 경우, 세포 또는 세포내소기관의 막을 통해 생물학적으로 활성인 작용제를 수송하는 데 유용하다. 게다가, 콘쥬게이트는, 특히 생물학적 활성 작용제의 생물학적 효과를 발휘하기 위해서 막통과 수송이 필요하고, 그들 자체로는(수송 중합체 또는 몇몇 다른 변형물과 콘쥬게이션하지 않고)의 세포내로 들어가서 생물학적 활성을 증명할 수 없거나, 단지 아주 조금 가능한 형태인 생물학적 활성 작용제를 수송하는 데 유용하다.
일반적인 것으로서, 콘쥬게이트에 사용되는 수송 중합체는 바람직하게 서브유니트의 선형 골격을 들 수 있다. 골격은 통상 탄소로 구성되는 대부분의 골격 사슬 원자와 함께, 통상 탄소, 질소, 산소, 황 및 인으로부터 선택되는 헤테로원자를 포함할 수 있다. 각 서브유니트는 말단 구아니디노 또는 아미디노기를 포함하는 측쇄 부분을 포함한다.
이웃하는 측쇄 부분 사이의 공간은 통상 서브유니트에서 서브유니트로 일관될 수 있지만, 본 발명에 사용되는 중합체는 또한 골격을 따라서 측쇄 부분사이에 다양한 공간을 포함할 수 있다.
측쇄 부분은 골격으로부터 멀어지면서 연장되어, 중앙의 구아니디노 또는 아미디노 탄소원자(NH2기가 부착됨)가 바람직하게 적어도 2개의 링커 사슬원자, 보다 바람직하게 2 내지 5개의 사슬원자를 포함하는 측쇄 링커에 의해 골격에 결합되고, 따라서 중앙의 탄소원자는 골격으로부터 제 3 내지 제 6 탄소원자만큼 떨어져 있다. 사슬원자는 산소, 황, 또는 질소 등의 1개 이상의 다른 원자로서 존재할 수 있지만, 바람직하게 메틸렌 탄소원자로서 제공된다. 바람직하게, 골격과 구아니디노 또는 아미디노기의 중앙의 탄소원자사이의 측쇄 링커는 아르기닌 측쇄로 예시되는 바와 같이 4개의 사슬원자길이이다.
본 발명의 수송 중합체 서열은 예를 들면 글리신, 알라닌 및 시스테인 등의, 상응하는 중합체함유 콘쥬게이트의 막수송속도에 크게 영향을 끼치지 않는 1개 이상의 비구아니디노/비아미디노 서브유니트 또는 아미노카프로산기 등의 링커에 의해 측면에 접할 수 있다. 또한, 모든 유리 아미노 말단기는 체내에서 유비퀴티네이션을 방지하기 위해서 아세틸 또는 벤질기 등의 보호기로 캡핑될 수 있다.
수송되는 작용제는 수많은 구체예에 따라서 수송 중합체에 결합될 수 있다. 하나의 바람직한 구체예에서, 작용제는 단일 수송 중합체에 결합되거나 결합을 통해 수송 중합체의 말단에 또는 적당한 결합기를 통해 중합체내의 내부 서브유니트에 결합된다.
제 2의 구체예에서, 작용제는 상기와 같은 동일한 방법으로, 1개 이상의 중합체에 부착한다. 이 구체예는 이웃 세포의 교차결합을 유도할 수 있으므로 다소 덜 바람직하다.
제 3의 구체예에서, 콘쥬게이트는 중합체의 각 말단에 부착된 2개의 작용제 부분을 포함한다. 이 구체예에서는, 작용제가 10kDa 미만의 분자량을 가지는 것이 바람직하다.
방금 언급한 제 1 및 제 3의 구체예에 관하여, 작용제는 일반적으로 구아니디노 또는 아미디노 측쇄중 어느 하나에 부착하지 않으므로 타겟 막과 자유롭게 상호작용할 수 있다.
본 발명의 콘쥬게이트는 간단한 합성공정으로 제조될 수 있다. 게다가, 콘쥬게이트 생성물은 통상 길이 및 조성물에서 실질적으로 균일하고, 따라서 효과에 있어서 이종의 혼합물보다 더 큰 일관성 및 재현성을 제공한다.
본 발명의 중요한 양태에 따라서, 본 발명자들은 단일 수송 중합체를 다양한 형태의 생물학적 활성 작용제중 어느 것에 부착하는 것은 콘쥬게이트 내에 큰 소수성 부분이 존재할 필요없이, 작용제의 생체막을 통한 업테이크 속도를 실질적으로 증가시키는 데 충분하다. 사실, 큰 소수성 부분의 부착은 그 소수성 부분이 지질 이중막에 부착하기 때문에 막통과 수송을 현저하게 방해하거나 저지할 수 있다. 따라서, 본 발명은 지질 및 지방산 부분 등과 같은 큰 소수성 부분을 포함하지 않는 콘쥬게이트를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 방법은 환자에서 혈액-뇌 관문을 통한 송달이 필요하기 않는 비중추신경계(non-CNS) 질환의 치료에 사용된다.
A. 중합체 구성성분
아미노산. 하나의 구체예에서, 수송 중합체는 D 또는 L 아미노산 잔기로 구성된다. 자연적으로 발생되는 L-아미노산 잔기를 수송 중합체에 사용하면, 그 분해 생성물이 세포 또는 생물에 상대적으로 무독성이 되기 때문에 이점을 가진다. 바람직한 아미노산 서브유니트은 아르기닌(α-아미노-δ-구아니디노발레산) 및 α-아미노-ε-아미디노헥사노산(등입체성 아미디노 유사체)이다. 아르기닌 내에 구아니딘윰기는 약 12.5의 pKa를 가진다.
보다 일반적으로, 각 중합체 서브유니트는 (i) 11보다 큰, 보다 바람직하게 12.5이상의 pKa를 가지는 매우 염기성인 측쇄 부분을 포함하고 (ii) 프로톤화된 상태로, 그 부분에 2중 특성을 부여하는 공명안정화 양성 하전을 공유하는 적어도 2개의 같은 자리 아미노기(NH2)를 포함한다.
α-아미노-β-구아니디노프로피온산, α-아미노-γ-구아니디노부티르산, 또는 α-아미노-ε-구아니디노카프로산 등의 다른 아미노산이 또한 사용될 수 있다(골격사슬과 중앙의 구아니딘윰 탄소사이에 2,3 또는 5 링커원자를 각각 포함함).
D-아미노산도 또한 수송 중합체에 사용될 수 있다. 오직 D-아미노산을 포함하는 조성물은 효소분해를 감소시키는 장점을 가진다. 그러나, 이들은 또한 대개 타겟 세포내에 그대로 남아있을 수 있다. 이러한 안정성은 중합체가 여전이 부착되었을 때, 작용제가 생물학적으로 활성이라면 일반적으로 문제되지 않는다. 콘쥬게이트 형태로 불활성인 작용제는, 작용부위에서 절단가능한 링커가 세포 및 세포내소기관내에서 작용제의 방출을 촉진하기 위해서, 콘쥬게이트내에 포함되어야 한다.
다른 서브유니트. 아미노산이 아닌 서브유니트가 또한 수송 중합체를 형성하는 데 사용되기 위해서 선택될 수 있다. 이러한 서브유니트는 히드록시 아미노산, N-메틸-아미노산 아미노 알데히드 등을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 이 결과 중합체내에서 펩티드 결합이 줄어들게 된다. 다음 절에서 논의되는 바와 같이 선택된 골격의 성질에 의존하여, 다른 형태의 서브유니트가 사용될 수 있다.
B. 골격 형태
티오에테르 또는 술포닐기에 결합된 알킬 골격부분, 히드록시 산 에스테르(아미드 결합을 에스테르 결합으로 대체한 것에 상응함), 알파 탄소를 질소로 치환하여 아자 유사체를 형성한 것, 2차 아민으로 구성된 중합체를 초래하는 카르바메이트기, 폴리에틸렌이민(PEIs), 및 아미노 알데히드에 결합된 알킬 골격 등의 다양한 골격 형태가 측쇄 구아니디노 및/또는 아미디노를 배열하고 위치를 정하는 데 사용될 수 있다.
보다 상세한 골격 목록은 예를 들면, Fletcher 등(1998)에 의해 재고되는 바와 같이, 그리고 여기에 언급된 문헌에 의해 상세화되는 바와 같이, N-치환 아미드(CONR이 CONH를 대체함), 에스테르(CO2), 케토메틸렌(COCH2), 환원 또는 메틸렌아미노(CH2NH), 티오아미드(CSNH), 포스피네이트(PO2RCH2), 포스폰아미데이트 및 포스폰아미데이트 에스테르(PO2RNH), 레트로펩티드(NHCO), 트랜스-알켄(CR=CH), 플루오로알켄(CF=CH), 디메틸렌(CH2cH2), 티오에테르(CH2S), 히드록시에틸렌(CH(OH)CH2), 메틸렌옥시(CH2O), 테트라졸(CN4), 레트로티오아미드(NHCS), 레트로환원(NHCH2), 술포아미도(SO2NH), 메틸렌술포아미도(CHRSO2NH), 레트로술폰아미드(NHSO2), 및 펩토이드(N-치환 글리신) 및 말로네이트 및/또는 gem-디아미노알킬 서브유니트를 가진 골격을 포함한다. 펩토이드 골격(N-치환 글리신)을 또한 사용할 수 있다(예컨대, Kessler, 1993; Zuckermann 등., 1992; 및 Simon 등, 1992). 많은 앞서의 치환기는 α-아미노산으로부터 형성되는 골격에 비하여 대략 등입체성 중합체를 결과한다.
본 발명을 지지하여 수행된 연구는 폴리펩티드(예컨대, 펩티드 골격)를 사용하였다. 그러나, 상기한 것과 같이 다른 골격도 증가된 생물학적 안정성(예를 들면, 생체내에서 효소분해에 대한 저항성)을 제공할 수 있다.
C. 중합체 수송 분자의 합성
중합체는 당기술에 알려진 어떤 방법에 의해서도 구조될 수 있다. 예로서, 펩티드 중합체는 합성적으로, 바람직하게 펩티드 합성기(Applied Biosystems Model 433)를 사용하여 제조될 수 있고, 당기술에서 잘 알려진 방법에 의해 재조합적으로 합성될 수 있다. 재조합 합성은 일반적으로 수송 중합체가 흥미있는 폴리펩티드 또는 단백질에 축합된 펩티드일 때 사용된다.
N-메틸 및 히드록시-아미노산이 고체상 펩티드 합성에서 종래의 아미노산 대신 사용될 수 있다. 그러나, 감소된 펩티드 결합을 가지는 중합체의 제조는 감소된 펩티드결합을 포함하는 아미노산 2량체의 합성을 필요로 한다. 이러한 2량체는 표준 고체상 합성방법을 사용하여 중합체에 삽입될 수 있다. 다른 합성방법은 잘 알려져 있고, 예를 들면, Fletcher 등(1998), Simon 등(1992) 및 여기에 언급된 문헌에서 찾을 수 있다.
III. 수송 중합체의 생물학적 활성 작용제에의 부착
본 발명의 수송 중합체는 화학적 또는 재조합 방법에 의해 생물학적 활성 작용제에 공유적으로 부착될 수 있다.
A. 화학적 결합
작은 유기 분자 및 거대분자 등의 생물학적 활성 작용제는 당기술에 알려진 수많은 방법(예를 들어, Wong, 1991 참조)을 통하여, 직접(예, 카르보디이미드) 또는 링커 부분을 통해 수송 중합체에 결합될 수 있다. 특히, 카르바메이트, 에스테르, 티오에테르, 디술피드, 및 히드라존 결합이 일반적으로 형성되기 쉽고 대부분의 응용에 적당한다. 에스테르 및 디술피드 결합은 그 결합이 세포막을 통한 기질의 수송 후, 세포질에서 쉽게 분해된다면 바람직하다.
다양한 관능기(히드록실, 아미노, 할로겐 등)가 생물학적 활성 작용제를 수송 중합체에 부착시키는 데 사용될 수 있다. 생물학적 활성 작용제의 작용부위의 일부로 알려지지 않은 기가 바람직하고, 폴리펩티드 또는 그것의 어떤 일부가 송달 후, 물질에 부착된 채로 남아 있다면 특히 바람직하다.
실시예 1에 따라서 제조된 펩티드 등의 중합체는 일반적으로 FMOC 등의 아미노 말단 보호기로 제조된다. 폴리펩티드를 합성수지로부터 절단하고, 측쇄를 탈보호화하는 데 사용되는 조건에서 살아남을 수 있는 생물학적 활성 작용제를 위해서, FMOC는 완전한 수지-결합 폴리펩티드의 N-말단으로부터 절단되어 작용제가 유리 N-말단 아민에 결합될 수 있다. 이러한 경우, 부착된 작용제는 전형적으로 당기술에서 잘 알려진 방법에 의해 활성화되어 중합체 아미노기로 각각 아미드 또는 카르바메이트 결합을 형성하는 데 유효한 활성 에스테르 또는 활성 카르보네이트 부분을 생성할 수 있다. 물론, 다른 결합 화학이 또한 사용될 수 있다.
부반응을 최소화하기 위해서, 구아니디노 및 아미디노 부분을 카르보벤질옥시기(CBZ), 디-t-BOC, PMC, Pbf, N-NO2 등과 같은 종래의 보호기를 사용하여 차단할 수 있다.
결합반응은 N,N-디메틸 포름아미드(DMF), N-메틸 피롤리디논, 디클로로메탄, 물 등과 같은 일련의 용매로 공지된 결합반응에 의해 수행된다. 결합제의 예로서는 O-벤조트리아졸일옥시 테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트(HATU), 디시클로헥실 카르보디이미드, 브로모-트리스(피롤리디노) 포스포늄 브로마이드(PyBroP) 등을 들 수 있다. 다른 시약은 N,N-디메틸아미노 피리딘(DMAP), 4-피롤리디노 피리딘, N-히드록시 숙신이미드, N-히드록시 벤조트리아졸 등을 들 수 있다.
부착된 수송 중합체가 방출될 때까지 불활성인 생물학적 활성 작용제를 위해, 링커는 바람직하게 생체내에서 효소 또는 용매가 매개되는 절단에 감수성인 것을 의미하는 쉽게 절단가능한 링커이다. 이 목적으로, 효소적으로 또는 화학적으로 가수분해되는 카르복실산 에스테르 및 예컨대 글루타티온의 존재하에서 디술피드 교환에 의해 절단되는 디술피드 결합을 포함하는 링커가 바람직하다.
하나의 바람직한 구체예에서, 절단가능한 링커는 작용제에서 떨어진 제 1 절단가능기와 작용제에 가까운 제 2 절단가능기를 포함하여 제 1 절단가능기에서 절단으로 친핵 부분을 포함하는 링커-작용제 콘쥬게이트가 생성되고, 친핵 부분이 분자내에서 반응하여 제 2 절단가능기를 절단함으로써 링커와 중합체로부터 작용제를 방출시킨다. 이 구체예는 하기 논의되는 다양한 작은 분자 콘쥬게이트에 의해 더 예증된다.
B. 축합 폴리펩티드
본 발명의 수송 중합체는 당기술에 잘 알려진 방법에 따라서, 흥미있는 폴리펩티드 및 수송 중합체로 이루어지는 축합 단백질을 위한 벡터를 구조함으로써 재 조합 방법에 의해 생물학적 활성 폴리펩티드 작용제에 부착될 수 있다. 일반적으로, 수송 펩티드 중합체 구성성분은 선택적으로 짧은 펩티드 링커를 통해, 흥미있는 폴리펩티드의 C-말단 또는 N-말단에 부착될 것이다.
IV. 생물학적 활성 작용제의 생체막을 통한 증진된 수송
A. 생체막을 통한 수송의 측정
생분자 및 다른 치료적 물질을 생체막을 통과하여 수송하는 본 발명의 중합체의 능력을 평가하기 위한 모델계로는 공유적으로 부착된 형광물질을 막을 통해 수송하는 중합체의 능력을 측정하는 계를 들 수 있다. 예를 들면, 플루오레세인(376MW)은 작은 유기분자의 수송을 위한 모델로서 작용할 수 있다(실시예 2). 거대분자의 수송을 위해서, 수송 중합체는 오브알부민(분자량 45kDa; 예컨대 실시예 14) 등의 폴리펩티드에 축합될 수 있다. 거대분자의 업테이크의 측정은 형광 태그를 부착시킴으로써 용이하게 할 수 있다. 세포 업테이크는 또한 공초점의 현미경으로 분석될 수 있다(실시예 4).
B. 생체막을 통한 증진된 수송
본 발명을 지지하여 수행된 실험에서, 막통과 수송 및 동시에 일어나는 세포 업테이크는 실시예 2 및 3에 기재된 방법에 따라서, 플루오레세인에 결합된 수송 펩티드의 업테이크를 평가하였다. 간략히, 세포의 현탁액을 37℃, 23℃, 또는 3℃에서 다양한 시간동안 완충액에 현탁된 형광 콘쥬게이트와 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 후, 반응을 중지시키고 세포를 원심분리에 의해 수집하고 형광활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 형광을 분석하였다.
사용된 조건하에서, 콘쥬게이트의 세포 업테이크는 포화되지 않았다. 결과적으로, 펩티드의 ED50값을 계산할 수 없었다. 대신, 데이타를 단일 콘쥬게이트 농도에서 세포의 업테이크를 직접 비교할 수 있는 히스토그램으로 나타내었다.
도 1a-1c는 4 내지 9의 아르기닌 서브유니트의 길이 범위의 L-아르기닌(R; 도 1a) 또는 D-아르기닌(r; 도 1b)의 중합체의 플루오로세인을 주르카트(Jurkat) 세포로 수송하는 능력에 대해 시험한 연구 결과를 나타낸다. 비교를 위하여, HIV 태트 잔기 49-57("49-57") 및 L-리신의 9량체(K9)의 수송수준을 또한 시험하였다. 도 1c는 12.5μM의 농도에서 콘쥬게이트를 위한 업테이크 수준의 히스토그램을 나타낸다.
도면에서 볼 수 있듯이, 형광으로 표지된 펩티드 중합체는 태트 서열 49-57 보다 더 효과적으로 세포로 들어가는 6이상이 아르기닌으로 구성된다. 특히, 업테이크는 태트 49-57의 업테이크 수준의 적어도 약 2배로 증가되었고, 태트 49-57의 업테이크 수준의 약 6-7배만큼 증가되었다. 플루오레세인 단독의 업테이크는 무시할 만 하였다. 또한 리신 9량체(K9)는, 짧은 리신 중합체가 동등한 길이의 구아니딘윰포함 중합체에 비하여 막통과 수송체로서 효과적이지 못함을 나타내면서, 매우 작은 업테이크를 보였다.
도 1b에 관하여, D-아르기닌의 단일중합체는 L-형태보다 더 큰 수송활성을 나타냈다. 그러나, 업테이크 수준의 오더는 거의 비슷하였다. D-단일중합체의 경우, 7 내지 9개의 아르기닌을 가진 펩티트가 거의 동일한 활성을 나타내었다. 6량체(R6 또는 r6)는 다소 덜 효과적이고, 그러나 여전히 태트(49-57)보다 적어도 약 2 내지 3배 더 높은 수송 활성을 나타내었다.
막통과 수송을 증가시키는 D- 및 L-아르기닌 중합체의 능력은 공초점 현미경으로 확인하였다(도 2a-2f 및 실시예 4). 상기 FACS 데이타와 일관되게, R9(도 2b 및 2e) 또는 r9(도 2c 및 2f)와 인큐베이션된 세포의 세포질은 높은 수준의 세포내 콘쥬게이트 수송을 나타내면서 약간 형광이었다. 반대로, 동일한 농도의 태트(49-57)는 단지 약한 착색을 보였다(도 2a 및 2d). 공초점의 현미경사진은 또한 D-아르기닌 중합체(도 2c)가 L-아르기닌(도 2f)으로 구성되는 중합체보다 세포에 들어가는 데 더 효과적인 점을 강조한다.
상기에서, 본 발명의 수송 중합체는 세포의 원형질막을 통해 약물을 수송하는 데 HIV 태트 펩티드 47-59보다 훨씬 더 효과적임이 명백하다. 더욱이, 폴리-Lys 9량체는 수송체로서 유효하지 못하다.
인접하는 구아니딘윰-함유 단일중합체의 최적길이가 존재하는 지를 측정하기 위해, 1세트의 더 긴 아르기닌 단일중합체 콘쥬게이트(R15, R20, R25 및 R30)를 시험하였다. 실질적으로 더 긴 중합체의 효과를 시험하기 위해서, 평균 분자량12,000달톤(100개의 아미노산)을 가지는 L-아르기닌 중합체의 혼합물을 또한 시험하였다(실시예 5). 그러나 침전 문제를 피하기 위해, 시험중 혈청의 수준은12,000MW 중합체 물질을 가진 콘쥬게이트를 시험하기 위해 감소시켜야 했다. 상기와 같이 세포 업테이크를 FACS에 의해 분석하였고, 살아있는 세포의 평균 형광을 측정하였다. 각 콘쥬게이트의 세포독성을 또한 측정하였다.
도 3에 관하여, 15개 이상의 아르기닌을 가진 L-아르기닌 단일중합체의 업테이크는 9개 이하의 아르기닌을 포함하는 중합체와 명확하게 다른 세포 업테이크 패턴을 나타내었다. 더 긴 콘쥬게이트의 곡선은 R9 및 r9 콘쥬게이트의 곡선을 교차하면서 더 평평하게 나타났다. 높은 농도(＞3μM)에서의 R9 및 r9의 업테이크가 더 긴 중합체보다 현저하게 더 나았다. 그러나, 낮은 농도에서, 더 긴 펩티드와 인큐베이션한 세포는 더 큰 형광을 나타내었다.
이 데이타에 의거하여, r9 및 R9는 15개 이상의 인접 아르기닌을 포함하는 중합체보다 더 높은 속도로 세포에 들어가는 것을 나타낸다. 그러나, R9(L-펩티드)의 생물학적 반감기는 더 긴 콘쥬게이트보다 더 짧았는 데, 아마도 더 긴 펩티드의 단백질분해(혈청 효소로 인함)로 수송활성을 보유하는 단편이 생성되었기 때문이다. 그에 비하여, D-이성체(r9)는 혈청 프로테아제의 L-폴리펩티드에 대한 높은 특이성과 일관되게 단백질분해의 증거를 나타내지 않았다.
따라서, 수송 중합체의 전체 수송 유효성은 막통과 업테이크 속도(약 15개 미만의 아르기닌을 가진 중합체가 더 나음) 대 단백질분해 불활성화(더 긴 중합체가더 나음)에 대한 감수성의 조합에 의존하는 것으로 나타난다. 따라서, 7 내지 20개, 바람직하게 7 내지 15개의 인접하는 구아니딘윰 잔기를 포함하는 중합체가 바람직하다.
특히, 고분자량의 폴리아르기닌 콘쥬게이트(12,000MW)는 탐지할 수 있는 업테이크를 나타내지 않는다. 이 결과는 Barsoum 등(1994)의 관찰과 일치하고, 아르기닌 중합체가 리신 중합체에 의해 나타날 수 있는 수송특성과 현저하게 다른 수송 특성을 가지는 것을 제안한다. 게다가, 12,000 폴리아르기닌 콘쥬게이트는 매우 독성인 것이 밝혀졌다(실시예 5). 단지, 12,000MW의 콘쥬게이트가 시험된 모든 농도에서 높은 독성을 나타내지만, 일반적으로 중합체의 독성은 길이에 비례하여 증가한다.
D- 및 L-아르기닌의 중합체의 세포 업테이크를 마이클리스-멘텐 동력학에 의해 분석하였을 때(실시예 6), 주르카트 세포에 의한 업테이크 속도는 매우 효율적이여서, 정확한 Km값은 단지 시험이 3℃(얼음상)에서 수행하였을 때 얻을 수 있었다. 수송의 최고 속도(Vmax), 및 마이클리스 상수(Km)의 추정상의 수용체에 대한 펩티드의 뚜렷한 친화성 둘다는 D- 및 L-아르기닌 9량체의 다양한 농도에서 30, 60, 120, 및 240초 동안 인큐베이션한 후, 주르카트 세포의 관찰된 형광을 Lineweaver-Burk 플로팅으로 유도하였다.
동역학적 분석은 또한 9량체의 폴리-L-아르기닌의 수송 Km(44μM)이 태트 펩티드의 Km(722μM)보다 실질적으로 더 낮았기 때문에 아르기닌이 풍부한 중합체가 예를 들어 태트(49-57) 펩티드보다 더 나은 결합력 및 추정상의 세포 수송위치를 통과하는 능력을 나타낸다는 것을 밝힌다. 더욱이, 9량체의 D-아르기닌은 이 시험(실시예 1)에서 시험된 중합체중 가장 낮은 Km(7μM), 즉, 대략 100배 더 큰 뚜렷한 친화성을 나타내었다. 본 발명의 바람직한 구체예에 따라서, 본 발명의 수송 중합체는 실온(23℃) 또는 37℃에서 측정하였을 때, 실시예 6의 방법에 의해 태트에서 측정된 친화성보다 적어도 10배 더 큰, 바람직하게 적어도 100배 더 큰 뚜렷한 활성(Km)을 가진다.
KM(μM) VMAX(μM/초)
H3N-RRRRRRRRR-COO- 44.43 0.35
H3N-rrrrrrrrr-COO- 7.21 0.39
태트 49-57 722 0.38
본 발명을 지지하여 수행된 시험은 중합체-촉진 수송이 세포의 대사적 완전성에 의존함을 나타내었다. 독성량의 아지드나트륨(0.5%w/v)을 세포에 첨가하면, 약 90%만큼 콘쥬게이트의 업테이크가 저지되었다(실시예 7). 도 4에 나타낸 결과는 (i) 에너지에 의존함(세포 업테이크)을 시사하면서 막통과 수송의 아지드나트륨 감수성과, (ii) HIV 태트(49-57)에 비하여 본 발명의 폴리구아니딘윰 중합체(R9, R8, R7)의 우월성을 나타낸다.
어떤 특정한 이론을 구하지 않고, 이 데이타는 수송과정이 구아니딘윰 또는 아미딘윰 함유 중합체가 세포 원형질막에 존재하는 분자 수송체에 의해 특이적으로 인지됨으로써 매개되는 에너지-의존성 과정임을 제안한다.
본 발명을 지지하는 다른 실험은 본 발명의 콘쥬게이트가 생물학적 활성 작용제를 T세포(주르카트), B-세포(쥐과의 CH27), 림프종 T세포(쥐과의 EL-4), 비만세포종(쥐과의 P388), 몇몇 쥐과의 T-세포 하이브리도마, 뉴런세포(PC-12), 섬유모세포(쥐과의 RT), 신장세포(쥐과의 HELA), 골수모구종(쥐과의 K562); T 및 B-임파구, 대식세포, 수상세포, 및 호산성 세포; 호염기성 세포, 비만세포, 내피세포, 심장조직세포, 간세포, 비장세포, 림프절 세포 등과 같은 모든 사람의 혈액세포(적혈구 제외) 및 케라틴세포를 포함하여 1차 조직세포를 포함하는 다양한 세포타입의 막을 통과하여 수송하는 데 유용함을 보여주었다.
콘쥬게이트는 또한 실시예 8 및 도 5a-5c에 개시되어 있는 바와 같이 그람 음성 및 그람 양성 박테리아세포 둘다를 통과하는 데 유효하다. 일반적으로, D-아르기닌 서브유니트의 중합체는 L-아르기닌의 중합체에서 발견되는 수송속도보다 현저하게 더 빠른 속도로 그람-양성 및 그람-음성 박테리아 둘다에 들어가는 것이 밝혀졌다. 이것은 E. coli HB 101(원핵생물) 세포와 인큐베이션되었을 때, R9 콘쥬게이트(L-아르기닌)보다 r9 콘쥬게이트(D-아르기닌)가 훨씬 더 높은 업테이크 수준을 나타내는 도 5에 의해 도시된다. 이 관찰결과는 L-중합체가 박테리아 효소에 의해 단백질분해적으로 분해되는 것에 기인할 것이다.
도 5b는 E. coli HB 101 세포와 인큐베이션되었을 때, 폴리-L-리신 콘쥬게이트(K9)에 비하여 길이의 함수(r4에서 r9)로서 D-아르기닌 콘쥬게이트의 업테이크 수준을 나타낸다. 도에서 알 수 있는 바와 같이, 폴리아르기닌 콘쥬게이트는 업테이크 수준이 길이의 함수로서 증가하는 것과 같이, r6보다 더 짧은 중합체가 낮은 업테이크 수준을 보여주는 것으로 진핵세포에서 관찰된 도 2b에서의 것과 유사한 경향을 나타내었다.
Strep. bovis에 의해 예시되는 바와 같이, 그람-양성 박테리아는 또한 도 5c에서 보여지는 바와 같이 리신이 아닌 아르기닌 중합체에 효율적으로 착색되었다.
보다 일반적으로, 박테리아에 의한 최대 업테이크 수준은 37℃에서 관찰되었다. 그러나, 현저한 착색은 인큐베이션이 실온 또는 3℃에서 수행되었을 때, 관찰되었다. 공초점의 현미경은 박테리아에 0.5% 아지드나트륨으로의 전처리가 세포벽(그람-양성 박테리아)에서 페리플라슴간극으로의 수송은 영향을 주지 않고, 그람-양성 및 그람-음성 박테리아의 내부 원형질막을 통과하는 수송을 저해하였음을 밝혔다.
따라서, 본 발명은 미생물의 생장 또는 감염을 예방하거나 저해하는 데 사용하기 위한, 그리고, 약제적 안전성을 향상시키기 위해 소독하는 표면을 위한 항박테리아 및 항진균 화합물 등의 항균제를 함유하는 콘쥬게이트를 포함한다. 게다가, 본 발명은 특히 녹색 잎이 많은 식물의 식물세포로의 수송에 사용될 수 있다.
본 발명을 지지하는 추가의 연구는 박테리아 막을 통한 이동이 다른 세포타입의 앞서 주목된 관찰과 일관되게 에너지 및 온도 둘다에 의존함을 밝혔다.
V. 치료적 조성물
A. 작은 유기분자
작은 유기분자 치료제는, 생체막을 통한 수송을 촉진시키기 위해 여기에 기재된 바와 같이 선형 중합체 조성물에 이롭게 부착될 수 있다. 예를 들면, 레보도파(L-3,4-디히도록시페닐알라닌; L-DOPA) 등의 매우 하전된 작용제의 송달은 여기 기재된 바와 같이 중합체 수송 분자에 결합시킴으로써 이로울 것이다. 펩토이드 및 펩티드유사 작용제가 또한 고려된다(예컨대, Langston, 1997; Giannis 등, 1997). 또한, 본 발명은 혈청 및 수성 염수 등의 수액에서 낮은 용해도를 가지는 작은 유기분자의 송달에 이점을 가진다. 따라서, 치료적 효율성이 그들의 낮은 용해도로 인하여 제한된 화합물은 본 발명에 따라서 더 높은 용량으로 투여될 수 있고, 콘쥬게이트 형태가 세포에 의한 높은 업테이크 수준으로 인하여 비콘쥬게이트 형태에 비하여 몰을 기준으로 보다 유효할 수 있다.
작은 분자의 위상적인 표면의 상당한 부분이 생물학적 활성에 자주 수반되고, 따라서 요구되기 때문에, 특별한 경우 콘쥬게이트의 작은 분자부분은 타겟 생체막을 통과한 후, 생물학적 활성을 발휘하기 위한 작은 분자의 작용제를 위해,부착된 수송 중합체 및 링커부분(존재한다면)에서 절단되는 것이 필요하다. 이러한 경우, 콘쥬게이트는 바람직하게 생체막을 통과한 후, 유리 약물을 방출하기 위한 절단가능한 링커를 포함한다.
하나의 접근방법에서, 콘쥬게이트는 링커로서 역할을 하는 N-아세틸-보호 시스테인기에 의해 세포독성 작용제, 즉 6-메르캅토푸린에 결합된 수송 중합체 T를 포함하는 콘쥬게이트(I)를 나타내는 도 6a에 도시된 바와 같이, 디술피드 결합을 포함할 수 있다. 따라서, 세포독성 작용제는 디술피드 결합에 의해 6-메르캅토기에 부착되고, 수송 중합체는 아미드 결합을 통해 시스테인카르보닐부분에 결합된다. 환원 또는 디술피드 교환에 의한 디술피드 결합의 절단은 유기 세포독성 작용제의 방출을 결과한다.
디술피드함유 콘쥬게이트를 합성하는 방법은 실시예 9A에 제공된다. 생성물은 N-아세틸-Cys-Ala-Ala 링커에 의해 6-메르캅토푸린에 결합된 7량체의 Arg 잔기를 포함한다. 여기서, Ala 잔기는 추가의 스페이서로서 디술피드를 세포내에서 절단하기 위해 티올 및 환원제에 보다 이용하기 쉽게 만들기 위해 포함된다. 이 실시예에서 링커는 또한 세포내에서 효소적으로 절단할 수 있는 아미드 결합의 사용을 도시한다.
또 다른 접근법에서, 콘쥬게이트는 전자기 조사에 노출되면 절단되는 광 절단성 링커를 포함한다. 예가 되는 결합은 메타-니트로벤조에이트 결합부분을 통해 6-메르캅토푸린에 결합된 수송 중합체 T를 포함하는 콘쥬게이트(II)를 보여주는 도 6b에 도시된다. 중합체 T는 벤조에이트 카르보닐기에 대한 아미드 결합에 의해 니트로벤조에이트부분에 결합되고, 세포독성 작용제는 그것의 6-메르캅토기를 통해 p-메틸렌기에 결합된다. 화합물은 6-메르캅토푸린을 NaOCH3/메탄올의 존재하에서 가열하면서 p-브로모메틸-m-니트로벤조산과 반응시키고, 이어서 γ-아미노부티르산 링커의 아미노기를 중합체에 부착시켜 카르복실산벤조에이트를 수송 중합체에 결합시킨다(실시예 9B). 콘쥬게이트에 광조명을 비추면 메르캅토메틸 부분의 오르토에 위치하는 니트로기에 의해 6-메르캅토푸린이 방출된다.이 접근법은 당기술에 공지되어 있는 바와 같이 광치료 방법, 특히 신체의 선택된 부분에서 약물을 국지적으로 활성화시키는 광치료방법에 사용될 수 있다.
바람직하게, 절단가능 링커는 이하 접근법으로 예증되는 바와 같이, 중합체를 생물학적 활성 작용제로부터 절단하는데 서로 협조할 수 있는 제 1 및 제 2 절단가능기를 포함한다. 즉, 절단가능 링커는 작용제에서 떨어진 제 1 절단가능기와 작용제에 가까운 제 2 절단가능기를 포함하고, 제 1 절단가능기의 절단은 제 2 절단가능기를 절단하기 위해 분자내에서 반응할 수 있는 친핵부분을 포함하는 링커-작용제 콘쥬게이트를 생성하고, 이로써 작용제는 링커와 중합체로부터 방출된다.
도 6c는 항암제, 5-플루오로우라실(5-FU)에 결합된 수송 중합체 T를 함유하는 콘쥬게이트(III)를 나타낸다. 여기서, 결합은 변형 리실기에 의해 제공된다. 수송 중합체는 α-아미노기에 결합되고, 5-플루오로우라실은 α-카르보닐을 통해 결합된다. 리실 ε-아미노기는 o-히드록시메틸 니트로벤젠의 카르바메이트 에스테르로 변형되었고, 이것은 콘쥬게이트내에 제 1, 광불안정 절단가능기를 이루었다. 광조명은 니트로벤젠부분을 콘쥬게이트로부터 절단하고 또한 카르바메이트는 급속히 분해되어 효과적인 친핵기인, 유리 ε-아미노기를 제공한다. 5-플루오로우라실기에 대한 아미드 결합과 ε-아미드기와의 분자내 반응은 환화를 유도하면서 5-플루오로우라실기를 방출시킨다.
도 6d는 항암제, 파클리탁셀의 2'-산소에 결합된 수송 중합체 T를 포함하는 콘쥬게이트(IV)를 도시한다. 이 결합은 (i) 수송 중합체에 부착된 질소원자, (ii) 질소원자의 파라위치의 인산 1에스테르 및 (iii) 카르복실레이트 에스테르 결합에 의해 파클리탁셀의 2-산소에 결합되는 질소원자의 메타위치의 카르복시메틸기를 포함하는 결합부분에 의해 제공된다. 콘쥬게이트로부터 인산기의 효소적 절단은 유리 페닐 히드록실기를 제공한다. 그런 다음 이 친핵기는 카르복실레이트 에스테르와 분자내에서 반응하여 그 생물학적 타겟에 결합하기 위한 유리 파클리탁셀을 유리한다. 실시예 9C에서 이 타입의 콘쥬게이트를 제조하는 합성 프로토콜을 설명한다.
도 6e는 수송 중합체가 예를 들어, 파클리탁셀 등의 생물학적 활성 작용제에 아미노알킬 카르복실산에 의해 결합된 또 다른 접근법을 도시한다. 바람직하게, 링커 아미노기는 바람직하게 메틸렌 탄소에 의해 제공되는 3 내지 5개의 사슬원자(n= 3 내지 5), 바람직하게 3 또는 4개의 사슬원자에 의해 링커 카르복실 탄소에 결합된다. 도 6e에서 볼 수 있는 바와 같이, 링커 아미노기는 아미드 결합에 의해 수송 중합체에 결합하고, 에스테르 결합에 의해 파클리탁셀부분에 결합한다. 아미드 결합의 효소적 절단은 중합체를 방츨시키고 유리 친핵 아미노기를 생성시킨다. 그런 다음 유리아미노기는 에스테르기와 분자내에서 반응하여 파클리탁셀로부터 링커를 방출시킬 수 있다.
도 6d 및 6e는 상응하는 비콘쥬게이트 형태에 비하여 증가된 막통과 수송속도를 가지는 탁산 및 탁소이드 항암제 콘쥬게이트로 이루어지는 본 발명의 또 다른 양태를 예증한다. 콘쥬게이트는 암세포의 성장을 저해하는 데 특히 유용하다. 탁산 및 탁소이드는 세포기능에 해로운 마이크로튜블의 중합체화를 어느 정도 촉진시켜 (그리고 탈중합화를 저해함), 세포 복제를 저해하고, 궁극적으로 세포괴사를 유도하여 그들의 항암효과를 나타내는 것으로 생각된다.
용어 "탁산(taxane)"은 또한 상표명 "TAXOL"로 알려진 파클리탁셀(도 6e, R'=아세틸, R"=벤질)을 가르키는 것으로, 도 6g에 도시된 바와 같이 파클리탁셀의 A, B, C 및 D 고리를 포함하는 골격핵을 가지는 자연발생적, 합성적, 또는 생명공학적 유사체이다. 도 6f는 또한 Rhone-Poulenc.에 의해 판매되는 다소 보다 용해성인 파클리탁셀의 합성 유사체인 "TAXOTERE"(R'=H, R"=BOC)의 구조를 나타낸다. "탁소이드(Taxoid)"는 파클리탁셀의 자연발생적, 합성적 또는 생물공학적 유사체로서, 도 6h에 도시된 바와 같이 파클리탁셀의 기본 A, B 및 C고리를 포함한다. 다양한 탁산 및 탁소이드 화합물의 합성 및 활성에 관한 실질적인 합성 및 생물학적 정보는 Suffness(1995), 특히 12 내지 14장에 재고되는 바와 같이 이용가능하고 또한 이후의 파클리탁셀 문헌에서도 입수할 수 있다. 게다가, 세포계의 숙주는 예를 들면 Suffness의 8 및 13 장에 기재된 바와 같이, 이들 화합물의 몇몇 암타입에 대한 항암활성을 예상하기 위해 입수할 수 있다.
수송 중합체는 탁산 또는 탁소이드내 어떤 적당한 위치의 부착점을 통해 탁산 또는 탁소이드 부분에 콘쥬게이션된다. 편리하게, 수송 중합체는 상기와 같은 결합전략을 사용하여 C2'-산소원자, C7-산소원자를 통해 결합된다. C7-산소를 통한 수송 중합체의 콘쥬게이션은 그 위치에서의 콘쥬게이션에도 불구하고 항암 및 항종양 활성을 가지는 탁산 콘쥬게이트를 결과한다. 따라서, 링커는 절단가능하거나 또는 절단가능하지 않을 수 있다. C2'-산소를 통항 콘쥬게이션은 항암활성을 감소시키므로 이 위치에 콘쥬게이션하기 위해서는 절단가능한 링커가 바람직하다. C10 등의 다른 위치의 부착점도 또한 사용할 수 있다.
본 발명의 탁산 및 탁소이드 콘쥬게이트는 탁솔(0.25㎍/mL) 및 탁소테어(6-7㎍/mL)에 비하여 향상된 수용성을 가지는 것으로 평가될 것이다. 그러므로 다량의 "CREMOPHOR EL"(폴리옥시에틸화 피마자유), 폴리소르베이트 80("TWEEN 80"으로도 알려진 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트) 및 에탄올 등의 가용화제가 필요하기 않아 이들 가용화제와 연관된 전형적인 부작용, 과민증, 무호흡, 저혈압 및 홍조가 감소될 것이다.
B. 금속
금속은 실시예 10에서 도시된 바와 같이, 본 발명의 수송막에 콘쥬게이션 된, 텍사피린 또는 디에틸 트리아민 펜타아세트산(DTPA) 등의 킬레이트화제를 사용하여 진핵세포 및 원핵세포로 송달될 수 있다. 이들 콘쥬게이트는 이미지 또는 치료를 위해 금속이온을 송달하는 데 유용하다. 금속이온의 예로서는 Eu, Lu, Pr, Gd, Tc99m, Ga67, In111, Y90, Cu67, 및 Co57을 들 수 있다. 콘쥬게이트 후보물질을 사용한 예비적인 막-수송 연구는 하기 실시예 부분에서 기재된 바와 같이 세포단위의 실험을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 유러퓸 이온을 사용하여, 세포 업테이크는 시간-해상된 형광측정으로 모니터될 수 있다. 금속이온이 세포독성이라면 업테이크는 세포독성으로 모니터될 수 있다.
C. 거대분자
본 발명의 증가된 수송방법은 특히 단백질, 핵산, 폴리사카라이트, 및 그것의 유사체를 포함하나 이에 국한되지 않는 수많은 거대분자의 생체막을 통한 수송을 증진시키기에 적당하다. 핵산의 예로서는 상보적 타겟(예, 단일 또는 이중 가닥 타겟의 안티센스 서열)에 대한 하이브리드화 또는 핵산 전사물 또는 서열에 의해 암호화된 단백질을 발현하도록 설게된 선택된 서열을 가지는 DNA 및 RNA로 형성된 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드 및 그것의 유사체를 들 수 있다. 유사체는 포스포네이트(바람직하게 메틸포스포네이트), 포스포아미데이트(N'3 또는 N'5), 티오포스페이트, 하전되지 않은 모르폴리노계 중합체, 및 단백질 핵산(PNAs) 등과 같은 하전되거나, 바람직하게 하전되지 않은 골격 유사체를 포함한다. 이러한 분자는 예를 들면, 효소대체치료, 유전자치료, 및 안티센스치료를 포함하는 다양한 치료방법에 사용될 수 있다.
예로서, 단백질 핵산(PNA)는 디옥시리보스 골격을 가진 골격이 구조적으로 동형인 DNA의 유사체이다. 이것은 핵산염기가 부착되는 N-(2-아미노에틸)글리신 단위로 구성된다. 모든 4개의 자연적 핵산염기를 함유하는 PNAs는 왓슨-크릭 염기쌍 규칙을 따라서 상보적 올리고뉴클레오티드에 하이브리드되고, 염기쌍 인지에 관하여, 진정한 DNA 유사체이다(Egholm 등, 1993). PNA의 골격은 안티센스 응용에 매우 적합하게 포스페이트 에스테르 결합보다 펩티드 결합에 의해 형성된다. 골격이 하전되지 않기 때문에, 형성된 PNA/DNA 또는 PNA/RNA 이중가닥은 정상보다 더 큰 열안정성을 나타낸다. PNAs는 뉴클레아제 또는 프로테아제에 의해 인지되지 않는 추가의 이점을 가진다. 게다가, PNAs는 표준 t-BOC 화학을 사용하여 자동화 펩티드 합성장치상에서 합성될 수 있다. 그런 다음 PNA는 본 발명의 수송 중합체에 쉽게 결합된다.
본 발명의 방법을 사용하여 증가될 수 있는 세포로 수송되는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 예는 예를 들면 미국특허 5,594,122에 기재되어 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 사람의 면역결핍 바이러스(HIV)를 치료하는 것을 목적으로 한다. 수송 중합체와 안티센스 올리고뉴클레오티드의 콘쥬게이션은 예를 들면, 잘 확립된 방법에 따라, 숙시네이트 링커를 통하여 펩티드와 올리고뉴클레오티드의 5'-말단간에 아미드 결합을 형성시킴으로써 가능할 수 있다. PNA 콘쥬게이트의 사용은 실시예 11에서 더 예증된다.
도 7은 실시예 11에 상세화된 바와 같이, PNA 서열을 포함하는 본 발명의 콘쥬게이트로 T-세포에 의한 감마-인터페론(γ-IFN)의 분비 저해의 결과를 나타낸다. 알 수 있는 바와 같이, 안티센스 PNA 콘쥬게이트는 콘쥬게이트가 약 10μM의 수준으로 존재하였을 때 γ-IFN의 분비를 차단하는 데 유효하였다. 반대로, 센스-PNA 콘쥬게이트 또는 비콘쥬게이트 안티센스 PNA 단독으로 어떠한 저해도 나타내지 않았다.
생체막을 통해 수송될 수 있는 다른 종류의 거대분자는 단백질 및 특히, 효소로 예시된다. 치료적 단백질은 대체 효소를 포함하나 이에 국한되지는 않는다. 치료적 효소는 리소좀의 글로코세레브로시다제 결핍(고셔 병)에 사용되는 알글루세라제, 뮤코폴리사카라이드증 I의 치료에 사용되는 알파-L-이두로니다제, 산필립포 B 증후군을 치료하는 데 사용되는 알파-N-아세틸글루코스아미다제, 췌장기능부전에 사용되는 리파아제, 심한 병합 면역결핍 증후군을 치료하는 데 사용되는 디아미나제, 및 트리오스 포스페이트 이성질화효소 결핍과 연관된 신경근 기능부전을 치료하는 트리오스 포스페이트 이성질화효소를 포함한다.
게다가, 본 발명의 중요한 양태에 따라서, 단백질 항원은 이들이 펩티드로 분해되는 항원제시세포(APCs)의 세포질부분에 송달될 수 있다. 그런 다음 펩티드는 이들이 초기의 HLA 클래스 I 분자와 결합되는 소포체로 수송되고, 세포표면상에 드러내보인다. 이러한 "활성화" APCs는, 인지하여 특정 항원을 나타내는 세포를 파괴하는 항원-특이적 세포독성 T-임파구(CTLs)로 제한된 클래스 I의 유도체로서 작용할 수 있다. 이 과정을 수행할 수 있는 APCs는 몇몇 대식세포, B세포 및 수상세포를 포함하나 이에 국한되지는 않는다. 하나의 구체예에서, 단백질 항원은 종양세포에 대한 면역반응을 유도하거나 촉진하기 위한 종양 항원이다.
이후의 CTL의 활성화를 수반하는 단리된 또는 가용성 단백질의 APC 세포질로의 수송은 예외적이다. 왜냐하면, 몇몇 예외를 가지고, 단리된 또는 가용성 단백질의 주입은 APC의 활성화 또는 CTLs의 유도를 결과하지 않는다. 따라서, 본 발명의 수송을 증진시키는 조성물에 콘쥬게이션된 항원은 시험관내 또는 체내에서 세포 면역반응을 자극하는 역할을 할 수 있다.
실시예 14는 예로서 단백질 항원, 오브알부민을 R7 중합체에 콘쥬게이션한 후, APCs로 송달되는 점에서 본 발명을 지지하여 수행된 실험의 상세화를 제공한다. 이후에 APCs를 세포독성 T 임파구(CTLs)에 첨가하면 CD8+ 알부민-특이적 세포독성 T세포(자극된 CTLs)를 결과한다. 반대로, 미변형된 오브알부민에 노출되었던 APCs는 CTLs를 자극시키지 못하였다.
유사한 실험에서, 조직적합성 수상세포(APC의 특이적 타입)을 오브알부민-R7 콘쥬게이트에 노출시키고 쥐에 주입하였다. 이후에 이들 쥐로부터 혈액을 분석하여 알부민-특이적 CTLs가 존재함을 밝혔다. 콘트롤 마우스는 미변형된 알부민에 노출되었던 수상세포를 제공하였다. 콘트롤 마우스는 알부민-특이적 CTLs 반응을 나타내지 않았다. 이들 실험은 일반적인 거대분자, 특히 단백질을 세포내로 송달하는 것과 연관된 특이적 사용중 하나를 예시한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 미생물 감염 등의 해로운 생물학적 과정을 방해하기 위해 면역특이적 항체 또는 항체 단편을 세포질내로 송달하는 데 유용하다. 최근의 실험은 세포내 항체가 식물 및 포유동물 세포내에서 유효한 항바이러스 작용제임을 나타내었다(예컨대, Tavladoraki 등, 1993; 및 Shaheen 등, 1996). 이들 방법은 항체의 H쇄 및 L쇄가 단일 폴리펩티드로서 합성되는 점에서, 전형적으로 단일사슬 가변부위 단편(scFv)을 사용하였다. 가변 H쇄 및 L쇄는 유연성있는 링커 펩티드(예컨대, 15개의 아미노산)에 의해 항상 분리되어 리간드 결합위치에 높은 친화성을 보유하는 28kDa 분자를 제공한다. 이 기술을 널리 응용하는데 있어 주요한 장애는 감염된 세포로의 업테이크의 효율성이었다. 그러나 수송 중합체를 scFv 단편에 부착시킴으로써 세포의 업테이크 정도가 증가될 수 있고, 면역특이적 단편을 결합시킬 수 있고, HIV Rev, HIV 역전사효소 및 인테그라제 단백질 등의 중요한 미생물 구성성분을 손상시킬 수 있다.
D. 펩티드
여기에 기재된 증가된 수송 방법에 의해 송달되는 펩티드는 효과기 폴리펩티드, 수용체 단편 등을 포함하나 이에 국한되지는 않는다. 예로서는 단백질이 매개하는 세포내신호에 의해 사용되는 인산화 부위를 가지는 펩티드를 들 수 있다. 이러한 단백질의 예는 프로테인 카이나제 C, RAF-1, p21Ras, NF-κB, C-JUN 및 IL-4 수용제, CD28, CTLA-4, V7 및 MHC 클래스 I 및 클래스 II 항원 등의 막수용체의 세포질 말단을 포함하나 이에 국한되지는 않는다.
수송 증가 분자는 또한 펩티드일 때, 상기 언급한 바와 같이, 합성은 자동화 펩티드 합성장치를 사용하거나 또는 축합 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제조하는 재조합 방법에 의해 달성될 수 있다.
본 발명을 지지하여 수행된 실험(실시예 15)에서, 막통과 단백질 V7(또한 CD101로 알려짐)의 세포질 말단 영역의 10개의 아미노산 단편을 R7 중합체 서열로 그것의 C 말단에서 합성하였다. 이 말단 영역은 세포 활성화의 MAP 카이나제 경로에서 중요한 효소인 RAF-1 카이나제와 물질적으로 연관되어 있고 그것의 불활성화를 매개하는 것으로 알려져 있다. V7-R7 콘쥬게이트를 T-세포에 가하고 이어서 세제로 용해시켰다. 가용성 분획을 염소 항-마우스 IgG와 관련된 항 V7-쥐과의 항체에 의해 면역침전시켜 시험하였다.
펩티드 처치없이, 관련된 것으로 알려지고 V7과 결합하여 불활성화되는 카이나제, RAF-1는 V7과 같이 침전하였다. 펩티드를 처치한 세포에서, RAF-1 단백질을 V7 면역착체로부터 제거하였다. 동일한 펩티드 처치는 RAF-1의 V7 펩티드에 의한 보든 비특이적 변형을 제외하고, RAF-1 및 p21 Ras로 구성되는 착체를 파열시키지 않았다. 이들 결과는 세포질의 말단영역 V7 펩티드가 본 발명의 막수송을 증진시키는 펩티드에 콘쥬게이션되었을 때, 타겟 세포에 들어하고 특히 생리적인 효과기 분자, RAF-1에 결합된다. 이러한 결합은 세포내 과정을 손상시키는 데 사용될 수 있다.
제 2 세트의 연구에서, 콘쥬게이트의 V7 부분은 프로테인 카이나제 C를 사용하여 시험관 내에서 인산화된다. 비인산화 V7 말단 펩티드가 아닌 인산화 V7 말단 펩티드에 노출되었던 T 세포의 항-RAF-1 침전물은 RAF-카이나제 활성에 유효한 저해를 보였다. 이들 연구는 두가지 원리를 제시한다. 첫번째, 본 발명의 수송 중합체는 세포막을 통하여 매우 하전된(인산화된) 분자의 이동이 달성될 수 있다. 두번째, 두개의 인산화 및 비인산화 V7 말단 펩티드는 RAF-1에 결합할 수 있고 단지 인산화된 펩티드만이 RAF-1 카이나제 활성을 변형시켰다.
VI. 스크리닝 시험방법 및 라이브러리
또 다른 구체예에서, 본 발명은 선택된 생물학적 활성을 위해 1이상의 콘쥬게이트를 스크리닝하는 데 사용될 수 있다. 여기서 콘쥬게이트는 1이상의 후보 작용제로부터 형성된다. 콘쥬게이트는 콘쥬게이트가 세포내로 업테이크되었을 때 감지할 수 있는 신호를 나타내는 세포와 접촉하는 데, 그 신호의 크기가 선택된 생물학적 활성에 관한 콘쥬게이트의 효능의 지표이다.
본 구체예의 하나의 이점은 특히, 그들 자체로는 세포에 들어가 생물학적 활성을 증명할 수 없는, 또는 거의 불가능한 작용제의 활성을 시험하는 데 유용하다는 것이다. 따라서, 본 발명은 작용제를 세포 또는 세포내소기관으로 수송하는 데 유효하고 편리한 방법이 없기 때문에, 다른 방법없이 대량의 스크리닝 프로그램을 통하여 이용할 수 없을 활성 작용제를 식별하는 특히 효율적인 방법을 제공한다.
바람직하게, 1이상의 후보 작용제는 당기술에서 공지된 수많은 조합적 합성 방법중 어느 것을 사용하여 제조된 콘쥬게이트의 조합적 라이브러리로서 제공된다. Thompson과 Ellman(1996)은 고체 지지체에서 조합적 라이브러리를 제조하기 위한 적어도 5개의 서로 다른 일반적인 접근법을 인식하였다. 그것은 즉, (1) 개별 화합물의 합성, (2) 분열합성(분열 및 풀), (3) 가용성 라이브러리 탈중첩, (4) 분석방법에 의한 구조적 결정, 및 (5) 시험후, 시험에서 생물학적 활성을 보이는 활성 후보물질의 화학적 조성물을 독특한 표지에 의해 식별되는 암호화 방법이다. 용액중에서 라이브러리의 합성은 적어도 (1) 공간적으로 분리된 합성 및 (2) 풀의 합성(Thompson, 상기)을 포함한다. 조합적 합성의 보다 상세한 설명은 특히 1-비드-1-화합물 접근법을 기재한 Lam 등(1997)에서 찾을 수 있다.
이들 접근법은 필요에 따라 적당한 보호 방법을 포함하는, 본 발명에 따르는 콘쥬게이트를 제조하기 위해 쉽게 변형될 수 있다. 예를 들면, 1개 이상의 고체 지지체상에서 구조된 라이브러리에서, 수송 중합체 부분은 지지체에 먼저 부착될 수 있고, 이어서 적당한 반응성 기능기를 통하여 중합체상에 조합적으로 후보물질을 구축하거나 덧붙일 수 있다. 다른 예에서, 작용제의 조합적 라이브러리는 먼저 1개 이상의 고체 지지체상에 형성된 다음, 수송 중합체를 각 고정화 후보 작용제에 부착시킬 수 있다. 유사하거나 다른 접근법이 용액상 합성에 사용될 수 있다. 고체 지지체상에서 형성된 라이브러리는 바람직하게 공지된 방법에 의해 절단가능한 링커기를 통해 지지체에서 절단된다(Thompson 등 및 Lam 등, 상기).
1개 이상의 콘쥬게이트 후보물질은 콘쥬게이트의 효능에 비례하여 감지할 수 있는 신호를 유도하는 수많은 세포수준의 시험중 어느 것으로 시험될 수 있다. 편리하게, 후보물질은 다중웰 플레이트에서 세포와 인큐베이션되고, 생물학적 효능은 플레이트 리더를 사용하여 정량화될 수 있는 신호(예컨대, 형광, 반사율, 흡수 또는 화학발광 등)를 통하여 측정된다. 대안적으로, 인큐베이션 혼합물을 이후의 공정 및/또는 분석을 위해 웰로부터 제거할 수 있다. 그런 다음, 활성이고 선택적으로 불활성인 화합물의 구조를, 이미 공지되지 않았지만, 측정할 수 있고, 이 정보는 유도 화합물을 식별하고 그 이상의 합성 및 스크리닝 작업에 집중하기 위해 사용될 수 있다.
예를 들면, 실시예 11에서 상세화된 γ-인터페론 분비실험은 다중웰 포랫으로 쉽게 변형될 수 있고, 따라서, 활성 분비 저해제는 플레이트 리더를 사용하여 유러퓸계 형광 측정에 의해 측정될 수 있다. 항암제는 확립된 암세포계를 사용하여 스크리닝될 수 있다(예컨대, 국립보건원(National Institutes of Health, NIH) 및 국립암기관(National Cancer Institute, NCI)에 의해 제공됨). 항암제의 세포독성 효과는 예를 들면, 트립판 염색 배제에 의해 측정될 수 있다.
다른 예는 IL-수용체 저해 등, 세포 신호전달 저해에 관한 실험; 세포 성장 차단 실험 및 유전자 발현실험을 포함한다. 전형적인 유전자 발현실험에서, 흥미있는 유전자를 적당한 프로모터의 조절하에 두고 β-갈락토시다제 또는 개똥벌래 루시페라제 등의 조고자 종을 생산하는 유전자를 아래방향에 둔다. 저해효과는 보고자 신호의 감소를 기준으로 검출할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 방법으로 스크리닝하는 데 유용한 콘쥬게이트 라이브러리를 포함한다. 라이브러리는 1이상의 선택된 생물학적 활성을 가지는 복수의 후보 작용제를 포함한다. 이들 후보 작용제 각각은 본 발명에 따라서 적어도 1개의 수송 중합체에 콘쥬게이션된다. 바람직하게, 콘쥬게이트 라이브러리는 조합적인 라이브러리이다. 다른 구체예에서, 본 발명은 흥미있는 활성 작용제를 시험하고 식별하기 위하여 색인된 또는 색인가능한 복수의 샘플 웰에 산재된 규칙적인 일련의 구별되는 중합체-작용제 콘쥬게이트를 포함한다.
VI. 사용
본 발명의 조성물 및 방법은 사람 및 수의학적 치료분야에서 특히 응용점을 가진다. 일반적으로, 투여용량은 피코몰 내지 마이크로몰 농도의 치료 조성물을 효과기 위치로 송달하기에 효과적일 것이다. 적절한 용량 및 농도는 치료적 조성물 또는 약물, 의도된 송달부위, 및 투여경로 등의 요인에 의존할 것이고, 이들 모두는 당기수에 널리 알려진 방법에 따라서 경험적으로 유도될 수 있다. 그 이상의 지시사항은 당기술에서 알려진 바와 같이 용량을 측정하는 실험동물모델을 사용한 연구로부터 얻어질 수 있다.
필요하다면 적당한 부형제와 함께 본 발명의 화합물의 투여는 투여의 어떤 허용된 방법을 통해 수행될 수 있다. 따라서, 투여는 예를 들어, 정맥, 국소, 피하, 피투, 근육, 경구, 관절내, 장관외, 복강, 경비 또는 흡입으로 가능하다. 제형은 정제, 환제, 캡슐, 파우더, 용액, 현탁액, 유제, 좌제, 정체관장, 크림, 연고, 로션, 에어로졸 등의 고체, 반고체, 동결건조된 파우더, 또는 액체 투여제형의 형태를 취할 수 있고, 바람직하게 정확한 용량으로 단일 투여하기에 적합한 단위투여형태를 취할 수 있다.
조성물은 전형적으로 종래의 약학적 담체 또는 부형제를 포함하고, 추가로 다른 약제적 작용제, 담체, 보조약 등을 더 포함할 수 있다. 바람직하게 조성물은 본 발명의 화합물의 약 5중량% 내지 75중량%가 되고 나머지는 적당한 약학적 부형제를 구성될 수 있다. 적절한 부형제는 당기술에 널리 알려진 방법에 의해 특정 조성물 및 투여경로에 맞출 수 있다(Gennaro, 1990).
경구 투여용으로, 이러한 부형제는 약학적 등급의 만니톨, 유당, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 사카린나트륨, 활석, 셀룰로오스, 글루코오스, 젤라틴, 수크로오스, 탄산마그네슘 등을 포함한다. 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환제, 파우더, 서방성 제형 등의 형태를 취할 수 있다.
몇몇 구체예에서, 약학적 조성물은 환제, 정제 또는 캡슐의 형태를 취하고, 따라서 그 조성물은 생물학적 활성 콘쥬게이트와 함께 다음의 모두를 포함할 수 있다: 유당, 수크로오스, 인산이칼슘 등의 희석제; 전분 또는 그것의 유도체 등의 붕괴제; 마그네슘 스테아레이트 등의 활택제; 및 전분, 아카시아검, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 셀룰로오스 및 그것의 유도체 등의 결합제.
제형중 활성 화합물은 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 담체(예를 들어, PEG 1000 [96%] 및 PEG 4000 [4%])에 배분된 약 0.5% 내지 약 50%의 본 발명의 화합물로 이루어지는 좌제로 제형화될 수 있다.
액체 조성물은 화합물(약 0.5% 내지 약 20%)과 예를들어, 수성 염수(예를 들어, 0.9% w/v 염화나트륨), 수성 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등과 같은 담체 중에서 선택적인 약학적 보조약를 용해시키거나 분산시킴으로써 제조되어 예를 들어, 정맥투여용의 용액 또는 현탁액을 형성할 수 있다. 활성 화합물은 또한 정체 관장으로 제형화될 수 있다.
원한다면, 투여되는 화합물은 또한 예를 들어, 아세트산나트륨, 소르비탄 모노라우레이트, 또는 트리에틸아민 올레이트 등의 습윤제 또는 유화제, pH 완충제 등과 같은 무독성 보조 물질을 소량으로 함유할 수 있다.
국소적 투여용으로, 조성물은 로션 또는 경피 패치 등의 어떤 적당한 포맷으로 투여된다. 흡입에 의한 수송용으로, 조성물은 분무기를 통해 건조 파우더(에를 들어, 흡입 치료제) 또는 액체 형태로 송달될 수 있다.
이러한 투여제형의 제조방법은 공지되어 있거나 또는 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences (1980)를 참조하라, 투여되는 조성물은 어떤 경우, 본 발명의 교시에 따라 투여되었을 때, 치료되는 증상의 경감을 위해 다량의 프로드럭 및/또는 약학적 유효량의 활성 화합물을 포함할 것이다.
일반적으로, 본 발명의 화합물은 개인 및 치료되는 증상에 의존하여 다양할 치료적 유효량, 즉 치료하기에 충분한 용량으로 투여될 것이다. 전형적으로, 치료적으로 유효한 1일 용량은 1일당 약물의 0.1 내지 100mg/kg체중이다. 대부분의 증상은 1일당 약 1 내지 약 30mg/kg체중사이의 총용량, 또는 70kg의 사람의 경우 1일당 약 70mg 내지 약 2100mg사이의 총용량의 투여에 반응한다.
콘쥬게이트의 안정성은 조성물 및 골격의 입체화학 및 중합체의 측쇄에 의해 더 조절될 것이다. 폴리펩티드 중합체의 경우, D-이성체는 일반적으로 내인성 프로테아제에 저항성이고, 따라서 혈청과 세포내에서 더 긴 반감기를 가진다. 그러므로 D-폴리펩티드 중합체는 더 긴 작용지속시간을 원하는 경우, 적절하다. L-폴리펩티드 중합체는 프로테아제에 대한 이들의 감수성으로 인하여 더 짧은 반감기를 가지고, 따라서 더 짧은 작용효과를 부여하기 위해 선택된다. 이것은 부작용이 관찰되자마자 치료를 중지함으로써 부작용을 보다 쉽게 막을 수 있다. D 및 L-잔기의 혼합물로 이루어지는 폴리펩티드는 중간의 안정성을 가진다. 단일-D-중합체가 일반적으로 바람직하다.
다음의 실시에는 본 발명을 제한하는 것이 아니라 예증하는 것으로 의도된다.
실시예 1
펩티드 합성
펩티드는 당기술에서 널리 알려진 방법에 따라소, FastMOC화학 및 시중에서 입수가능한 Wang 수지 및 Fmoc 보호 아미노산을 사용하여, Applied Biosystems Peptide 합성장치상에서 고체상 기술을 사용하여 합성하였다(Bonifaci). 펩티드는 C4 또는 C18 역상 HPLC 컬럼을 사용하여 정제하였고, 이들의 구조를 아미노산분석 및 질량분광계를 사용하여 확인하였다.
실시예 2
형광실험
형광 펩티드는 펩티드의 아미노 말단을 아미노카프로산으로 변형시키고, 이어서, 플루오레세인 이소티오시아네이트와 N-메틸 피롤리돈에 용해시킨 (2-1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸 유로니윰 헥사플루오로포스페이트/N-히드록시 벤조트리아졸의 존재하에서 반응시켰다. 그 생성물을 겔여과에 의해 정제하였다.
현탁 세포(106/mL)를 96웰 플레이트에서 2% 소태아 혈청을 함유하는 PBS pH 7.2중의 일정한 범위의 농도의 펩티드 또는 콘쥬게이트로 37℃, 23℃, 또는 4℃에서 다양한 시간동안 인큐베이션하였다. 15분의 인큐베이션 후, 세포를 원심분리로 펠릿화하고, 1% 아지드나트륨을 함유하는 PBS/FCS로 3회 세척하고, 트립신/EDTA(Gibco)과 37℃에서 5분동안 인큐베이션한 후, PBS/FCS/NaN3로 2회 더 세척하였다. 펠릿화된 세포는 2% FCS 및 0.1% 요오드화프로피듐을 포함하는 PBS에서 재현탁시켰고, FACScan(캘리포니아의 마운틴 뷰의 Becton Dickenson)상에서 분석하였다. 요오드화포스피듐에양성인세포를 분석물로부터 제거하였다. 아르기닌 중합체의 분석을 위하여, 광전배증관의 전합을 보다 정확한 측정이 가능한 크기의 오더로 감소시켰다.
실시예 3
태트 염기성 펩티드 대 폴리-Arg 펩티드
다음의 폴리펩티드의 업테이크 수준을 실시예 2에서의 방법에 따라 측정하였다:(1) HIV 태트 잔기 49-57로 이루어지는 폴리펩티드(Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg=SEQ ID NO:1), (2) L-Lys 잔기의 9량체(K9, SEQ ID NO:2), 및 (3) 4개 내지 9개의 Arg 잔기를 포함하는 호모-L 또는 호모-폴리펩티드(SEQ ID NO:3-8 및 12-17). 결과는 도 2a-2c에 나타낸다.
실시예 4
공초점 세포 현미경
형광 폴리아르기닌 펩티드와 인큐베이션한 세포를 결합실험을 위해 상기와 같이 제조하였고, 스캐닝, 단일 광선 레이저 공초점 현미경을 사용하여 Cell Sciences Imaging Facility(캘리포니아, 스탠포드, 스탠포드 유니버시티)에서, 488nm(아르곤 이온 레이저)의 여기파장 및 밴드-패스 필터를 사용한 510-550의 방사 밴드폭으로 분석하였다. 형광을 결합시킨 태트(49-57), R7, 또는 r7을 포함하는 콘쥬게이트(6.25μM)를 37℃에서 10분간 주르카트세포와 인큐베이션하였다. 도 2a-2f는 방사된 형광(도 2a-2c)과 태트(49-57)(도 2a 및 2c), R7(도 2b 및 2e) 및 r7(도 2c 및 2f)에 빛을 투과시킨다(2d-2f) 결과를 나타낸다.
실시예 5
길이의 범위 연구
다음의 폴리아르기닌의 단일중합체는 37℃에서 15분간 인큐베이션하고, 세포 펠릿화하여 실시예 2에서의 형광시험으로 실험하였다: r9, R9, R15, R20, R25, 및 R30. 게다가, 12,000달톤(대략 100개의 아미노산)의 평균분자량을 가지는 L-아르기닌 중합체의 혼합물을 플루오레세인 이소티오시아네이트로 표지하고 겔 여과에 의해 정제한 후("SEPHADEX" G-25), 또한 실험하였다(Sigma Chem. Co.). 세포를 FACS로 분석하였고, 살아있는 세포의 평균형광을 측정하였다. 각 콘쥬게이트의 세포독성은 세포 괴사의 특성인 요오드화프로피듐으로 착색된 세포의 백분율을 계산함으로써 측정하였다. r9, R9, R15, R20, 및 R25의 업테이크 결과는 도 3에 나타낸다.
시중에서 입수가능한 폴리아르기닌(12,000MW)은 대부분 α-1-산 글리코프로테인인 혈청중의 단백질을 침전시켰다. 그러므로, 소태아 혈청의 수준을 이 재료로부터 제조된 콘쥬게이트의 경우 시험에서 10배로 감소시켰다.
12,000MW의 폴리-Arg 조성물은 800nM 내지 50μM의 농도에서 독성이었고, 도 3에서는 제외되었다. 20개 이상의 아르기닌 잔기를 포함하는 폴리-L-Arg 콘쥬게이트는 12μM초과의 농도에서 독성이었고, 독성은 길이에 비례하여 증가하였다.
실시예 6
업테이크의 동력학
세포 업테이크의 Vmax 및 Km 파라메터를 측정하기 위하여, 실시예 2의 시험방법을 이하와 같이 변형시켜 사용하였다. 펩티드를 96웰 플레이트내에서 PBS/FCS 50μL중에 4℃에서 0.5, 1, 2, 및 4분동안 세포와 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 끝나면, PBS/FCS 5mL중에 샘플을 희석시켜 반응을 중지시키고, 원심분리하고, PBS/FCS, 트립신/EDTA로 한번 세척하고, 최종적으로 PBS/FCS로 다시 세척하여 FACScan상에서 분석을 위해 요오드화프로피듐을 포함하는 PBS/FCS중에 펠릿을 흡수시켰다. FACS 데이타는 마이클리스-멘텐 동력학에서 Lineweaver-Burk식에 맞추었다. 태트(49-57), R9 및 r9의 형광 콘쥬게이트의 동력학 데이타는 상기 표 1에 나타낸다.
실시예 7
수송에 대한 대사 억제제 효과
현탁세포(106/mL)를 2% FCS를 포함하는 PBS중 0.5% 아지드나트륨으로 30분간인큐베이션하였다. 인큐베이션이 끝날 때, 형광 펩티드(태트(49-57), R7, R8, 또는 R9)를 가하여 12.5μM의 최종부피로 하였다. 30분동안 인큐베이션한 후, 세포를 모든 세척 완충액이 0.1% 아지드나트륨을 포함하는 것을 제외하고, 실시예 2에서와 같이 세척하였다. 그 결과를 도 5에 나타낸다.
실시예 8
박테리아 세포로의 수송
그람-음성 박테리아(E. coli 균주 HB101) 및 그람-양성 박테리아(Strep. bovis)를 대수상으로 적절한 배지에서 성장시켰다. 세포 배양물(mL당 4x108)을 3 내지 50μM의 콘쥬게이트 농도에서 L-아르기닌(R4에서 R9), D-아르기닌(r4에서 r9), 또는 L-리신(K9)의 선형 중합체를 포함하는 형광 콘쥬게이트의 다양한 농도에서 37℃에서 30분동안 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고, PBS-함유 요오드화프로피듐(괴사 세포를 구별하기 위해)에 흡수시키고 FACS와 형광 현미경으로 분석하였다. 결과는 상기 논의된 바와 같이 도 5a-5c에 나타낸다.
실시예 9
예로서의 절단가능 링커와의 콘쥬게이트
A. 6-메르캅토푸린 시스테인 디술피드 콘쥬게이트
A1. 티올 활성화. N-아세틸-Cys(SH)-Ala-Ala-(Arg)7-CO2H(12.2mg, 0.0083mmol)를 대기온도에서 교반하면서 3:1 AcOH:H2O 3mL에 용해시켰다. 이 용액에 디티오-비스(5-니트로피리딘)(DTNP)(12.9mg, 0.0415mmol, 5eq)을 가했다. 이 용액을 대기온도에서 24시간동안 교반시킨 후, 혼합물을 밝은 황색을 나타냈다. 용매를 진공에서 제거하였고, 그 잔여물을 H20 5mL에 용해시키고, 에틸아세테이트로 3회 추출하여 과량의 DTNP를 제거하였다. 수상을 동결건조시키고, 그 생성물을 더 이상의 정제없이 사용하였다.
A2. 약물의 부착
N-아세틸-Cys(SH)-Ala-Ala-(Arg)7-CO2H(0.0083mmol)를 실온의 아르곤하에서 교반하면서 가스를 제거한 H2O(pH=5) 1mL에 용해시켰다. DMF 0.5mL중의 6-메르캅토푸린(1.42mg, 0.0083mmol, 1eq)을 혼합물에 가하였다. 반응을 불활성 대기하, 대기온도에서 18시간 교반하였다. 18시간 후, 유리 5-니트로-2-티오피리딘의 존재를 나타내면서, 밝은 황색으로 변했다. 용매를 감압하에서 제거하고, 그 잔여물을 HPLC로 정제하여, 원하는 생성물을 50%의 전체 수율로 얻었다(I. 도 6a).
B. 광절단가능한 탁솔 콘쥬게이트
3-니트루-4-(브로모메틸)벤조산(100mg, 0.384mmol)을 질소분위기하에서 무수메탄올(5mL)에 용해시킨다. 이 용액에 메탄올(0.384mmol, 1eq)중 메톡시드나트륨(88μL, 25%(w/w)을 가하고, 이어서 6-메르캅토푸린(58.2mg, 0.384mmol, 1eq)을 가한다. 그 혼합물을 환류온도로 가열하고, 3시간동안 교반하였다. 그런 다음 반응혼합물을 냉각시키고, 여과하고, 6N HCl을 가하여 산성화시켜 중지시킨다. 그런 다음, 반응물의 부피를 생성물의 침전이 생길 대까지 반으로 감소시키고, 여과에 의해 수거한다. 그 잔여물을 메탈올에 재용해시키고, 여과하고(필요하다면) 감압하에서 농축시켜 원하는 술피드(II, 도 6b)를 50%의 수율로 황색 파우더 고체로 얻는다.
C. 포스페이트-절단가능 탁솔 콘쥬게이트
C1. H20(39mL)중 o-히드록시 페닐아세트산(15.0g, 0.099mol)의 현탁물에 0℃에서 질산(8mL H2O중 65%의 12mL)의 용액을 천천히 피펫을 통해 가하였다. 용액을 추가의 1.5시간동안 0℃에서 교반시켰다. 그런 다음, 혼합물을 대기온도로 가열하였고, 추가의 0.5시간동안 교반시켰다. 이질의 혼합물을 얼음(10g)에 붓고, 여과하여 불용성 오르토-니트로 이성체를 제거하였다. 그 적색의 용액을 감압하에서 농축시키고, 탁한 잔여물을 6N HCl에서 재용해시키고 셀라이트를 통해 여과시켰다. 용매를 다시 감압하에서 제거하여 원하는 2-히드록시-4-니트로-페닐아세트산을 밝은 적갈색의 고체로서 얻었다(40% 수율). 생성물(IV-a)을 더 이상의 정제없이 다음 단계에서 사용하였다.
C2. 생성물 IV-a(765mg, 3.88mmol)을 새롭게 증류한 THF(5mL)에 아르곤 분위기하에서 용해시켰다. 용액을 0℃까지 냉각시키고, 보란-THF(THF중 1.0M, 9.7mL, 9.7mmol, 2.5eq)를 수소의 방출이 뚜렷하게, 시린지를 통해 적하하였다. 반응물을 추가의 16시간동안 교반시키고, 실온까지 천천히 가열시켰다. 반응물을 1M HCl(격렬한 거품발생)와 에틸아세테이트 10mL를 천천히 가해 중지시켰다. 그 층을 분리하고, 수상을 에틸아세테이트로 5회 추출하였다. 합한 유기층을 함수로 세척하였고, 황산마그네슘에서 건조시켰다. 그 용매를 진공하에서 증발시키고, 그 잔여물을 신속한 컬럼 크로마토그래피(헥산:에틸아세테이트 1:1)로 정제하여 원하는 니트로-알코올(IV-6)을 밝은 황색고체로서 얻었다(85% 수율).
C3. 니트로-알코올(IV-b)(150mg, 0.819mmol)을 디-t-부틸디카보네이트(190mg, 1.05eq) 및 10% Pd-C(10mg)을 포함하는 건조 DMF(5mL)에 용해시켰다. 혼합물을 Parr장치에 넣고, 일정한 기압을 유지하다가 그 기압을 제거하는 과정을 5회 실시하였다, 그런 다음, 용액을 47psi로 기압을 유지하고, 24시간동안 진탕하였다. 반응을 셀라이트를 통과시켜 여과함으로써 중지시키고, 용매를 감압하에서 제거하였다. 그 잔여물을 컬럼크로마토그래피(1:1 헥산:에틸아세테이트)로 정제하고, 보호된 아닐린 생성물(IV-c)을 황갈색 결정질 고체로 70% 수율로 얻었다.
C4. TBDMS-Cl(48mg, 0.316mmol)을 새롭게 증류시킨 디클로로메탄(4mL)에 아르곤 분위기하에서 용해시켰다. 이 용액에 이미다졸(24mg, 0.347mmol, 1.1eq)을 가하고, 즉시 백색 침전히 생성되었다. 이 용액을 30분간 실온에서 교반하였고, 그 때, 생성물 IV-c(80mg, 0.316mmol, 1.0eq)을 디클로로메탄/THF(1.0mL)의 용액으로 급히 가하였다. 그 결과의 혼합물을 대기온도에서 추가의 18시간동안 교반하였다. 반응을 포화 수성 염화암모늄을 가하여 중지시켰다. 층을 분리하고, 수상을 에틸아세테이트로 3회 추출하였고, 합한 유기상을 함수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시켰다. 유기상을 농축시켜 밝은 황색 오일의 형태로 실릴 에테르-페놀 생성물(IV-d)을 얻었다(90% 수율).
C5. 실릴 에테르-페놀 IV-d(150mg, 0.408mmol)을 아르곤하에서 새롭게 증류시킨 THF(7mL)에 용해시키고, 용액을 0℃로 냉각시켰다. 그런 다음, n-BuLi(헥산중 2.3M, 214μM)을 시린지를 통해 적가하였다. 밝은 황색에서 짙은 적색으로의 색깔변화가 즉시 나타났다. 5분후, 테트라벤질 피로포스페이트(242mg, 0.45mmol, 1.1eq)를 아르곤하에서 교반중인 용액에 급속히 가하였다. 용액을 추가의 18시간동안 불활성 대기하에서 교반하였고, 실온으로 천천히 가열시키는 중 백색 침전이 형성되었다. 반응을 포화 염화암모늄과 에틸아세테이트 10mL를 가해 중지시켰다. 층을 분리하고, 수상을 에틸아세테이트로 5회 추출하였다. 합한 유기상을 함수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 증발시켜 제거하고, 그 잔여물을 신속한 컬럼크로마토그래피(헥산:에틸아세테이트 1:1)로 정제하고, 밝은 오렌지색 오일로서 원하는 포스페이트-실릴 에테르(IV-e)을 얻었다(90% 수율).
C6. 포스페이트-실릴 에테르(IV-e)(10mg, 0.0159mmol)을 실온에서 건조 에탄올 2mL에 용해시켰다. 교반중인 용액에 농 HCl(1% v:v 용액) 20μL를 가하였고, 그 혼합물에 TLC 분석에 의해 반응이 완결된 것이 나타날 때까지 교반시켰다. 고체 낱산칼륨을 가해 반응을 중지시키고, 혼합물을 실리카겔을 통해 재빨리 여과하고, 농축하여 미정제 알코올-디벤질 포스페이트 생성물(IV-f)를 밝은 황색오일로서 얻었다(100% 수율).
C7. 알코올 IV-f(78mg, 0.152mmol)을 새롭게 증류시킨 디클로로메탄(10mL)에 아르곤 분위기하에서 용해시켰다. 그 용액에 Dess-Martin 페리오디난(90mg, 0.213mmol, 1.4eq)을 가하였다. 그 용액을 교반하였고, 반응의 진행을 TLC분석으로 모니터하였다. 일단, TLC가 반응이 완결되었음을 나타내었을 때, 반응을 1:1 포화 수성 중탄산나트륨:포화 수성 이황화나트륨으로 중지시켰다. 2염기 혼합물을 대기온도에서 1시간동안 교반하였다. 층을 분리하고, 수상을 에틸아세테이트로 3회 추출하였다. 합한 유기상을 함수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압하에서 제거하여 알데히드 생성물(IV-g)를 밝은 황갈색 오일로서 얻었다(100% 수율).
C8. 알데히드 IV-g(78mg, 0.152mmol)을 불활성 분위기하에서, t-부탄올/물(3.5mL)에 용해시켰다. 급속히 교반중인 용액에 2-메틸-2-부텐(THF중 1.0M, 1.5mL), 인산1염기나트륨(105mg, 0.76mmol, 5eq) 및 염화나트륨(69mg, 0.76mmol, 5eq)을 가하였다. 그 용액을 실온에서 8시간동안 추가로 교반시켰다. 용액을 농축시키고, 그 잔여물을 산성화하고, 에틸아세테이트로 3회 추출하였다. 합한 유기상을 황산마그네슘에서 건조시켰다. 용액을 다시 감압하에서 농축시키고, 그 잔여물을 컬럼크로마토그래피(2:1 에틸아세테이트:헥산)으로 정제하여 원하는 카르복실산-디벤질포스페이트(IV-h)를 밝은 황색 오일의 형태로 얻었다(65% 수율).
C9. 산 IV-h(8.0mg, 0.0152mmol, 1.1eq)를 새롭게 증류시킨 디클로로메탄(2mL)에 아르곤 분위기하, 대기온도에서 용해시켰다. 그 용액에 파클리탁셀(12mg, 0.0138mmol, 1eq)을 가하고, 이어서, DMAP(2mg, 0.0138mmol, 1eq) 및 DCC(3.2mg, 0.0152, 1.1eq)을 가하였다. 그 혼합물을 실온에서 추가로 4시간동안 교반시키는 중 밝은 침전물이 형성되었다. 일단, TLC가 반응이 완결되었음을 나타내었을 때, 용매를 감압하에서 제거하고, 그 잔여물을 신속한 컬럼크로마토그래피(헥산:에틸아세테이트 1:1)으로 정제하여 원하는 파클리탁셀-C2'-카르복실레이트 에스테르(IV-i)를 백색 결정질 고체의 형태로 얻었다(65% 수율).
C10. 에스테르 IV-i(5.0mg)을 순수한 포름산(1.0mL)에 실온의 아르곤분위기하에서 용해시키고, 30분동안 교반시켰다. 일단, TLC가 반응이 완결되었음을 나타내었을 때, 용액를 감압하에서 농축시키고, 그 잔여물을 실리카겔을 통해 신속히 여과시켜 정제함으로써 원하는 아닐린-탁솔 화합물(IV-j)를 백색 파우더의 형태로 50%의 수율로 얻었다.
C11. 건조 DMF중 (폴리-디-CBZ)-보호된 AcHN-RRRRRRRRR-CO2H(1.2eq, 0.1 내지 1.0M)용액에 O-벤조트리아졸일옥시 테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트(HATU, 1.0eq) 및 DMAP의 촉매량(0.2eq)를 가하였다. 이용액을 불활성 대기하에서 5분동안 대기온도에서 가열하였다. 그런 다음, 이 용액에 탁솔-아닐린 유도체(IV-j)를 건조 DMF중 용액으로서 가하였다(용해시키기 위한 최소량). 그 결과의 용액을 실온에서 추가의 5시간동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하에서 농축시킴으로써 반응을 완결시켰다. 그런 다음, 미정제 반응 혼합물을 HPLC로 정제하여 원하는 물질(IV, 도 6d)를 얻었다.
실시예 10
금속이온의 수송
DTPA 3.93g을 HEPES 완충액 100ml에 용해시키고, HEPES 완충액 8ml중에 용해시킨 염화유러퓸 원자표준용액(Aldrich) 1.52ml에 가하고, 실온에서 30분동안 교반하였다. 크로마토그래피로 분리하고, 동결건조시켜 Eu-DTPA 킬레이트 착체를 얻었다. 그런 다음, 이 착체를 고체상 펩티드 화학에 의해 폴리펩티드의 아미노 말단에 콘쥬게이션시킨다. 유러퓸 이온의 세포 업테이크는 시간-해상 형광으로 모니터할 수 있다.
실시예 11
PNA-펩티드 콘쥬게이트의 업테이크
PNA 펩티드 콘쥬게이트를 시중에서 입수가능한 Fmoc 시약(메사추세스, 캠브리지, PerSeptive Biosystems)으로 고체상 화학을 사용하여 Applied Biosystems 433A 펩티드 합성장치 또는 Millipore Expedite 핵산 합성 시스템상에서 합성하였다. D 또는 L-아르기닌의 중합체를 핵산의 5' 및 3'말단과 각각 유사한 PNAs의 아미노 또는 카르복실 말단에 부착시켰다. 콘쥬게이트는 또한 콘쥬게이트의 아미노 말단에 아미노카프로산 스페이서를 첨가하고, 비오틴 또는 플루오레세인을 부착시킴으로써 플루오레세인 또는 비오틴을 포함하도록 변형되었다. PNA-펩티드 콘쥬게이트는 95% TFA, 2.5% 트리이소프로필 실란 및 2.5% 수성 페놀을 사용하여 고체상 수지로부터 절단하였다. 그 수지를 여과하여 제거하고, 잔여 산을 증발시켜 제거하였다. 생성물을 C-18 역상 컬럼을 사용하여 HPLC로 정제하고, 생성물을 동결건조하였다. 원하는 PNA-중합체 콘쥬게이트를 레이저 탈착 분광법을 사용하여 확인하였다.
A. 감마-IFN의 세포분비의 억제
1. PNA-펩티드 콘쥬게이트 다음의 센스 및 안티센스 PNA-펩티드 콘쥬게이트를 감마-IFN 생성을 저해하기 위해 제조하였다. 여기서, r= D-아르기닌, 및 R= L-아르기닌:
센스: NH2-rrrrrrr-AACGCTACAC-COOH (SEQ ID NO:18)
안티센스 : NH2-rrrrrrr-GTGTAGCGTT-COOH (SEQ ID NO:19)
형광 안티센스: X-rrrrrrr-GTGTAGCGTT-COOH (X-SEQ ID NO:19)
여기서, X = 플루오레세인-아미노카프로에이트
비오틴화 안티센스: Z-rrrrrrr-GTGTAGCGTT-COOH (Z-SEQ ID NO:19)
여기서, Z = 비오틴-아미노카프로에이트
2. T 세포에 의한 업테이크. PNA-폴리아르기닌 콘쥬게이트가 세포에 효과적으로 들어가는 지를 보이기 위해서, 상기 형광 안티센스 콘쥬게이트(X-SEQ ID NO:19)를 플루오레세인 이소티오시아네이트를 SEQ ID NO:18의 아미노 말단에 아미노카프로산 스페이서를 사용하여 콘쥬게이션시킴으로서 합성하였다.
0.5% 아지드나트륨 또는 인산완충화 염수로 30분 동안 전처리한 주르카트 사람의 T 세포계(5 x 105세포/웰)를 안티센스 PNA 단독(r7 단편 없이)은 물론 플루오레세인-표지된 센스 및 안티센스 PNA-r7 콘쥬게이트의 다양한 양(100nM에서 50μM)으로 인큐베이션함으로써 세포의 업테이크를 시험하였다. 세포로 들어간 안티센스 PNA의 양을 공초점 현미경 및 FACS로 분석하였다. 두 경우에, 형광신호는 아지드에 노출되지 않은 세포내에만 존재하고, 형광 신호는 형광 콘쥬게이트의 양과 온도, 인큐베이션의 지속시간에 의존하였다.
3. 감마-IFN 시험. 쥐과의 T 세포계(클론 11.3)에서 분비되는 감마 인터페론의 양을 96웰 플레이트에서 105T 세포를 다양한 양의 항원(고래의 정충 미오글로빈의 잔기 110-121로 구성되는 펩티드)과 항원제시세포(APCs)로서 작용하는 DBA/2 마우스로부터 조직적합성 비장세포(H-2d, 5 x 105)와 인큐베이션함으로써 측정하였다. 37℃에서 24시간동안 인큐베이션한 후, 상층액 100μL을 시중에서 입수할 수 있는 항-감마-IFN 단일클론항체(Mab)(캘리포니아, 산 디아고, Pharmingen)로 코팅된 마이크로타이터 플레이트에 옮겼다. 실온에서 1시간동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 1% 소태아 혈청과, 0.1% Tween 20을 함유하는 PBS로 세척한 후, 제 2의 비오틴화 감마-IFN Mab를 가하였다. 2-3시간동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 이전과 같이 세척하고, 유러퓸(Eu)-스트렙타비딘(Delphia-Pharmacia)를 가하였다. 다시, 1시간동안 인큐베이션한 후, 산성의 완충액을 가하여 Eu를 유리시키고, Delphia 플레이트 리더상에서 시간-해상 형광측정기로 측정하였다. 형광의 양은 생성된 감마-IFN의 양에 비례하였고, 기지의 감마-IFN을 사용하여 정확하게 정량화하여 스탠다드 곡선을 만들 수 있다.
4. 콘쥬게이트에 의해 감마-IFN 생성 저해. 감마-IFN의 분비를 저해하는 PNA-폴리아르기닌 콘쥬게이트의 능력은 다양한 농도의 상기 감마-IFN 콘쥬게이트를 펩티드 항원(0.5μM)의 최적에 버금가는 농도로 클론 11.3 T 세포 및 조직적합성 비장세포의 혼합물에 가함으로써 시험하였다. 폴리아르기닌 부분이 없는 PNA 서열 및 비-콘쥬게이션된 D-아르기닌 7량체를 또한 시험하였다.
24시간 후, 배양된 상층액의 분액을 취하고, 감마-IFN의 양을 상기 3절에 기재된 형광 결합시험을 사용하여 측정하였다. 안티센스 PNA-r7 콘쥬게이트로 세포를 처리하여 IFN 분비물에서 70% 이상의 감소를 가져온 반면, 센스 PNA-r7의 동등몰량, r7이 없는 안티센스 PNA, 또는 r7단독은 어떤 저해도 나타내지 않았다(도 7).
실시예 12
큰 단백질 항원의 APCs로의 수송
폴리-L-아르기닌 7량체에 결합된 오브알부민의 콘쥬게이트는 시스테인-함유 폴리펩티드 중합체(Cys-Ala-Ala-Ala-Arg7, SEQ ID NO:21)를 술포-MBS, 이종2기능 크로스링커(일리노이, 락포드의 Pierce Chemical Co.,)의 존재하에서, 오브알부민(45kDa)과 반응시킴으로써 생성시켰다. 오브알부민에 콘쥬게이션된 몰비율을 아미노산분석으로 정량화하였다. 콘쥬게이트 생성물을 OV-R7로 나타냈다. 콘쥬게이트를 항원제시세포(APCs)에 또한 속하는 B세포에 가하고(최종 농도=10μM), 표준방법에 따라서 분리하였다. APCs를 OV-R7과 인큐베이션한 다음, 표준방법으로 분리한 세포독성 T-임파구의 제조물에 가하였다. CTLs를, OV-R7과 인큐베이션한 APCs에 노출시켜 CD8+ 알부민-특이적 CTLs를 생성하였다. 반대로, 미변형된 오브알부민에 노출되었던 APCs는 CTLs를 자극시키지 못했다.
또 다른 실험에서, 조직접합성 수상세포(APC의 특이적 타입)을 알부민-R7-콘쥬게이트에 노출시킨 다음, 마우스에 주사하였다. 이들 마우스로부터의 이후의 혈액분석은 알부민-특이적 CTLs의 존재를 밝혔다. 콘트롤 마우스는 알부민-특이적 CTL 반응을 나타내지 않았다.
실시예 13
V7-유도 펩티드의 증가된 업테이크
서열 KLSTLRSNT(SEQ ID NO:22; Ruegg et al., 1995)를 가지는 V7(백혈구 표면 단백질)의 C-말단 세포질 말단영역의 일부로 구성되는 콘쥬게이트를 펩티드 합성장치(Applied Biosystems Model 433)을 사용하여 표준방법에 따라서 C-말단에 부착한 7-아르기닌 잔기와 합성하였다. 콘쥬게이트를 표준방법에 의해 분리시킨 T-세포에 가하고(최종 농도10μM), 몇시간에서 하루밤동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 세포를 세제를 사용하여 용해시켰다(1% Triton X-100). DNA를 제거하고, 가용성(단백질함유) 분획을 염소 항마우스 IgG와 조합하여 항-V7 쥐과의 단일클론항체로 면역침전시켰다. RAF-1은 카이나제와 관련되고, V7과 결합하여 불활성화된다.
펩티드의 처치없이, RAF-1 단백질은 V7과 함께 공-침전하였다. 펩티드를 처리한 세포에서, RAF-1 단백질을 V7 면역착체로부터 제거시켰다. 동일한 펩티드는 V7 펩티드에 의한 RAF-1의 비-특이적 변형을 제외하고, RAF-1과 p21 Ras로 이루어지는 착체를 파열할 수 없었다.
제 2의 실험에서, V7-폴리-아르기닌 콘쥬게이트의 V7 펩티드부분을 시험관내에서 프로테인 카이나제 C를 사용하여 인산화하였다. 비인산화 V7 말단 펩티드가 아닌, 인산화 V7 말단 펩티드에 노출되었던 T 세포의 항-RAF-1-침전물은 RAF-카이나제 활성에 강력한 저해를 나타내었다.
본 발명이 구체적 방법과 구체예에 관련하여 설명되어지는 동안, 다양한 변형과 변화가 본 발명의 사상에서 벗어나지 않고 만들어질 수 있음이 인식될 것이다.

Claims (31)

  1. 선택된 화합물의 생체막을 통한 수송을 증진시키는 방법에 있어서,
    생체막을 수송 중합체에 공유적으로 부착된 생물학적으로 활성 작용제를 포함하는 콘쥬게이트와 접촉시키는 것으로 이루어지고,
    상기 중합체는 6 내지 25개의 서브유니트로 구성되고, 상기 중합체의 적어도 50%가 구아니디노 또는 아미디노 측쇄 부분을 포함하고, 중합체는 적어도 6개의 인접하는 구아니디노 및/또는 아미디노 측쇄 부분을 포함하며,
    그럼으로써, 상기 접촉이 상기 생체막을 통한 상기 콘쥬게이트의 수송을 비콘쥬게이트 형태의 생물학적 작용제의 막통과 수송속도보다 더 빠른 속도로 촉진시키는 데 효과적인 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 중합체내의 서브유니트의 적어도 70%가 구아니디오 측쇄 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 어떤 구아니디노 또는 아미디노 측쇄 부분도 1개 이상의 비구아니디노 또는 비아미디노 서브유니트에 의해 다른 그러한 부분으로부터 분리되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체가 7에서 20개까지의 서브유니트로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항에 있어서, 각 서브유니트가 구아니디노기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체가 적어도 6개의 인접하는 아르기닌 잔기들을 포함하는 펩티드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 중합체가 7에서 20개의 펩티드 서브유니트로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, 모든 상기 서브유니트가 아르기닌 잔기들인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 6 항 내지 제 8 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 아르기닌 잔기중 적어도 하나가 D-배향을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 모든 상기 아르기닌 잔기들이 D-배향을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘쥬게이트가 적어도 2개의 그러한 수송 중합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체막이 진핵생물의 세포막인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 11 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체막이 원핵생물의 세포막인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제가 핵산 또는 핵산 유사체인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 13 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제가 펩티드 핵산인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 13 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제가 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 단백질 항원이고, 상기 생체막이 항원제시세포의 세포막인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1 항 내지 제 13 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제가 종양 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 1 항 내지 제 13 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제가 탁산 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 1 항 내지 제 13 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제가 금속이온인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 1 항 내지 제 13 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제가 항균성 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체가 절단가능한 링커에 의해 상기 작용제에 콘쥬게이션되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 절단가능한 링커가 에스테르기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 22 항에 있어서, 상기 절단가능한 링커가 디술피드기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 22 항에 있어서, 상기 절단가능한 링커가 작용제에서 먼 제 1 절단가능기와 작용제에 가까운 제 2 절단가능기를 포함하고, 제 1 절단가능기의 절단으로 제 2 절단가능기를 절단하기 위해 분자내에서 반응시킬 수 있는 친핵부분을 포함하는 링커-작용제 콘쥬게이트를 생성하고, 그럼으로써 상기 링커와 중합체로부터 작용제를 방출시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 제 1 기는 아미드기이고, 상기 제 2 기는 에스테르기이며, 아미드기의 절단으로 에스테르기를 절단하기 위해 분자내에서 반응하는 유리 아미노기를 생성시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 25 항에 있어서, 상기 제 1 기가 인산에스테르기이고, 상기 제 2 기가 카르복실레이트 에스테르기이어서, 인산에스테르기의 절단으로 카르복실레이트 에스테르기를 절단하기 위해 분자내에서 반응하는 유리 히드록실기를 생성시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 1 항 내지 제 27 항중 어느 한 항에 있어서, 복수의 콘쥬게이트를 선택된 생물학적 활성에 대해 스크리닝하는 데 사용하기 위해, 상기 콘쥬게이트를 복수의 후보 작용제로부터 제조하고, 상기 접촉은 각 콘쥬게이트를 콘쥬게이트가 세포내로 업테이크되었을 때 감지할 수 있는 신호를 나타내는 세포와 접촉시키는 것을 포함하고, 그럼으로써 신호의 크기는 선택된 생물학적 활성에 대한 콘쥬게이트의 효능을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 후보 작용제가 조합적 라이브러리에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 1 항 내지 제 29 항에 따르는 콘쥬게이트, 및
    약학적으로 허용되는 부형제로 이루어지는, 생물학적 활성 작용제를 생체막을 통해 송달하기 위한 조성물.
  31. 제 29 항에 따르는 콘쥬게이트의 조합적 라이브러리.
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