CN117999272A - 肽 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种侧链具有氟烷基的肽。本发明是2个以上的氨基酸通过肽键键合而成的肽，且构成该肽的氨基酸残基的至少1个侧链为下述通式(1)[式中，Z1为二、三或四价的除亚烷基以外的连接基团；Rf为至少由2个氟原子取代的C1－30烷基、－SF5、或者－SF4－CR101R102－CR103R104Cl(R101、R102、R103和R104各自独立地为氢原子、氟原子或氯原子，但R101、R102、R103和R104中的2个以上为氟原子)；n3为1、2或3，黑色圆点表示键合位点]。·—z1—Rfn3 (1)。
Description
技术领域
本发明涉及一种含有侧链导入有氟原子的氨基酸残基的肽。
本申请要求基于2021年9月22日在日本申请的日本特愿2021－154625号的优先权，并将其内容援引于此。
背景技术
抗体药物、肽药物、核酸药物等具有对靶分子的特异性高、副作用少的优点。但是，都存在难以到达存在于细胞内的靶分子的问题。为了解决该问题，研究了各种方法。其中，细胞膜透过性肽(Cell Penetrating Peptides:CPP)被视为很有希望。作为CPP，可举出来自HIV病毒TAT蛋白的肽(专利文献1)、多聚精氨酸序列的肽(专利文献2)作为代表性的例子。使其与药效肽键合能够将药效肽输送到细胞内(例如，专利文献3、非专利文献1)。
另一方面，报告了含氟氨基酸显示出特异性生理活性而受到关注。例如，报告了3,3,3－三氟丙氨酸及其衍生物作为吡哆醛酶的自杀式抑制剂(suicide inhibitor)而发挥作用(非专利文献2)。另外，报告了革兰氏阴性菌鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)和革兰氏阳性菌嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的丙氨酸消旋酶(Alanine Racemase)可被3,3,3－三氟丙氨酸灭活(非专利文献3)。含氟氨基酸和含有该含氟氨基酸的肽被期待作为生理活性物质应用于医药领域。
已知具有多氟结构的化合物在生物体内稳定且毒性低，在向细胞内摄取和从胞内体脱离的方面上优异(非专利文献4)。报告了能够利用该性质将使用将侧链氨基全氟酰基化后的赖氨酸作为构成氨基酸而得的肽树枝状聚合物用于基因递送(非专利文献5)。但是，由于为树枝状聚合物，因此无法如CPP那样形成与药效活性肽、核酸、作为抗体药物的蛋白质键合而得的杂交体。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利第6316003号说明书
专利文献2：美国专利第6306993号说明书
专利文献3：国际公开第2008/089491号
非专利文献
非专利文献1：Miyaji et.al.,Drug Metabolism and Disposition,2011,vol.39,p.1946-1953.
非专利文献2：Sakai et al.,Tetrahedron,1996,vol.52(1),p.233-244.
非专利文献3：Faraci and Walsh,Biochemistry,1989,vol.28(2),p.431-437.
非专利文献4：Zhang et al.,MRSCommunications,2018,vol.8,p.303-313.
非专利文献5：Cai et al.,ACSApplied Materials and Interfaces,2016,vol.8,p.5821-5832.
发明内容
专利文献1等中记载的CPP存在向细胞内的输送效率、生物体内的肽酶所致的分解等各种问题。
本发明的目的在于提供含有侧链导入有氟原子的氨基酸残基的肽及其制造方法。
本发明人等制造了一种含有侧链导入有氟原子的氨基酸残基的肽，结果发现该肽的细胞膜透过性优异，从而完成了本发明。
即，本发明如下。
[1]一种肽，是2个以上的氨基酸通过肽键键合而成的肽，
构成该肽的氨基酸残基的至少1个的侧链为下述通式(1)。
[式(1)中，Z1为二、三或四价的除亚烷基以外的连接基团；Rf为由至少2个氟原子取代的C1－30烷基(该C1－30烷基在碳原子为2以上的情况下可以在碳原子间具有1～5个醚键性氧原子)、－SF5、或者－SF4－CR101R102－CR103R104Cl(R101、R102、R103和R104各自独立地为氢原子、氟原子或氯原子，R101、R102、R103和R104中的2个以上为氟原子)；n3为1、2或3，黑色圆点表示键合位点]。
[2]根据上述[1]的肽，其中，上述Rf为下述通式(f－1)或(f－2)表示的基团。
[式中，RfP表示含有至少2个以上的氟原子的完全卤化C1－10烷基(该C1－10烷基在碳原子为2以上的情况下可以在碳原子间具有醚键性氧原子)，n1为0～10的整数，n2为0～9的整数，黑色圆点表示键合位点]。
[3]根据上述[1]或[2]的肽，其中，上述Z1为具有环基的连接基团。
[4]根据上述[3]的肽，其中，上述环基具有1,4－亚苯基或1,3,5取代苯基。
[5]根据上述[1]或[2]的肽，其中，上述Z1为不具有环基的连接基团。
[6]根据上述[1]或[2]的肽，其中，上述Z1为亚烷基、－O－、－S－、－NH－、－N(CH3)－、－N(C2H5)－、－N(C3H7)－、三价氮原子、－C(＝O)－、－S(＝O)2－、从环烷烃中除去2～4个氢原子所得的基团、从芳香环中除去2～4个氢原子所得的基团、从杂环中除去2～4个氢原子所得的基团、或者它们的组合(其中，不包括仅由亚烷基构成的基团)。
[7]根据上述[1]或[2]的肽，其中，上述Z1为－C(＝O)－、－C(＝O)－O－、－O－C(＝O)－、－NH－C(＝O)－O－、－O－C(＝O)－NH－、－C(＝O)－NH－、－NH－C(＝O)－、－S－S－、－S(＝O)2－NH－、－NH－S(＝O)2－、－S(＝O)2－NH－S(＝O)2－、－C(＝O)－NH－Ph－(－Ph－为1,4－亚苯基、1,3－亚苯基、1,5－亚苯基或1,3,5取代苯基)、或者它们中的任一基团与C1－6亚烷基的组合。
[8]根据上述[1]或[2]的肽，其中，上述Z1为下述通式(2)表示的连接基团。
[式中，Z2为二、三或四价的除亚烷基以外的连接基团；Rh为氢原子或C1－6烷基，黑色圆点表示键合位点]。
[9]根据上述[1]～[8]中的任一肽，其中，上述通式(1)表示的基团为侧链的氨基酸残基是在天然氨基酸的侧链上直接或间接地连接有1～3个上述Rf的氨基酸残基。
[10]根据上述[1]～[9]中的任一肽，其中，C末端或N末端可以由保护基保护。
[11]根据上述[1]或[2]的肽，其为下述通式(11)表示的三肽。
[式中，Z1、Rf和n3与上述相同；Rh为氢原子或C1－6烷基；R11和R12各自独立地为C1－6烷基或苄基；X为9－芴基甲氧基羰基或叔丁氧基羰基；Z为C1－6烷氧基、羟基或氨基]。
[12]根据上述[1]～[11]中的任一肽，其具有细胞膜透过性。
本发明的肽由于侧链导入了氟原子，因此细胞膜透过性优异。因此，该肽作为生理活性物质而期待应用于医药领域。
附图说明
图1是示出试验例1中在含有肽荧光缀合物1(Alexa－Ala－Asp(C8F17)－Phe－NH2)(PFCJ－1)、肽荧光缀合物4(Alexa－Ala－[(R)－RFAA(C8)]－Phe－OMe)(PFCJ－4)、肽荧光缀合物5(Alexa－Ala－[(S)－RFAA(C8)]－Phe－OMe)(PFCJ－5)或者荧光色素1(荧光物质Alexa Fluoro 647的二乙基酰胺体)(FD－1)的样品溶液中以37℃进行1小时处理后的HeLa细胞的流式细胞仪结果的图。
图2是示出试验例1中在含有肽荧光缀合物1(Alexa－Ala－Asp(C8F17)－Phe－NH2)(PFCJ－1)、肽荧光缀合物4(Alexa－Ala－[(R)－RFAA(C8)]－Phe－OMe)(PFCJ－4)、肽荧光缀合物5(Alexa－Ala－[(S)－RFAA(C8)]－Phe－OMe)(PFCJ－5)或者荧光色素1(FD－1)的样品溶液中以37℃进行1小时处理后的HeLa细胞的平均荧光强度(MFI)的测定结果的图。
图3是示出试验例2中在含有肽荧光缀合物1(Alexa－Ala－Asp(C8F17)－Phe－NH2)(PFCJ－1)、肽荧光缀合物2(Alexa－Ala－Asp(bis－C4F9)－Phe－NH2)(PFCJ－2)、荧光色素1(荧光物质Alexa Fluoro647的二乙基酰胺体)(FD1)或者细胞膜透过性肽Cys－TAT(47－57)的荧光缀合物(TAT－Alexa)的样品溶液中以37℃进行1小时处理后的HeLa细胞的流式细胞仪结果的图。
图4是示出试验例2中在含有肽荧光缀合物1(Alexa－Ala－Asp(C8F17)－Phe－NH2)(PFCJ－1)、肽荧光缀合物2(Alexa－Ala－Asp(bis－C4F9)－Phe－NH2)(PFCJ－2)、荧光色素1(荧光物质Alexa Fluoro647的二乙基酰胺体)(FD－1)或者细胞膜透过性肽Cys－TAT(47－57)的荧光缀合物(TAT－Alexa)的样品溶液中以37℃进行1小时处理后的HeLa细胞的平均荧光强度(MFI)的测定结果的图。
图5是示出试验例3中在FBS不存在下含有肽荧光缀合物1(Alexa－Ala－Asp(C8F17)－Phe－NH2)(PFCJ－1)、肽荧光缀合物3(Alexa－Ala－Asp(C12H25)－Phe－NH2)(PFCJ－3)或者荧光色素1(FD－1)的样品溶液中以37℃进行1小时处理后的HeLa细胞的平均荧光强度(MFI)的测定结果的图。
图6是示出试验例3中在FBS存在下含有肽荧光缀合物1(Alexa－Ala－Asp(C8F17)－Phe－NH2)(PFCJ－1)、肽荧光缀合物3(Alexa－Ala－Asp(C12H25)－Phe－NH2)(PFCJ－3)或者荧光色素1(FD－1)的样品溶液中以37℃进行1小时处理后的HeLa细胞的平均荧光强度(MFI)的测定结果的图。
图7是示出试验例4中在含有肽荧光缀合物1(Alexa－Ala－Asp(C8F17)－Phe－NH2)(PFCJ－1)、肽荧光缀合物2(Alexa－Ala－Asp(bis－C4F9)－Phe－NH2)(PFCJ－2)、肽荧光缀合物3(Alexa－Ala－Asp(C12H25)－Phe－NH2)(PFCJ－3)、肽荧光缀合物6(Alexa－Ala－Asp(C4F9)－Phe－NH2)(PFCJ－6)、肽荧光缀合物7(Alexa－Ala－Asp(C6F13)－Phe－NH2)(PFCJ－7)、肽荧光缀合物9(Alexa－Ala－Asp(SF4CF2CF2Cl)－Phe－NH2)(PFCJ－9)、肽荧光缀合物10(Alexa－Ala－Asp(tris－t－C4F9)－Phe－NH2)(PFCJ－10)或者荧光色素1(FD－1)的样品溶液中以37℃进行1小时处理后的HeLa细胞的流式细胞仪结果的图。
图8是示出试验例4中在含有肽荧光缀合物1(Alexa－Ala－Asp(C8F17)－Phe－NH2)(PFCJ－1)、肽荧光缀合物2(Alexa－Ala－Asp(bis－C4F9)－Phe－NH2)(PFCJ－2)、肽荧光缀合物3(Alexa－Ala－Asp(C12H25)－Phe－NH2)(PFCJ－3)、肽荧光缀合物6(Alexa－Ala－Asp(C4F9)－Phe－NH2)(PFCJ－6)、肽荧光缀合物7(Alexa－Ala－Asp(C6F13)－Phe－NH2)(PFCJ－7)、肽荧光缀合物9(Alexa－Ala－Asp(SF4CF2CF2Cl)－Phe－NH2)(PFCJ－9)、肽荧光缀合物10(Alexa－Ala－Asp(tris－t－C4F9)－Phe－NH2)(PFCJ－10)或者荧光色素1(FD－1)的样品溶液中以37℃进行1小时处理后的HeLa细胞的以荧光色素1为基准的各样品的相对荧光强度(RFI)的测定结果的图。
图9是示出试验例5中对肽荧光缀合物1(Alexa－Ala－Asp(C8F17)－Phe－NH2)(PFCJ－1)、肽荧光缀合物2(Alexa－Ala－Asp(bis－C4F9)－Phe－NH2)(PFCJ－2)、肽荧光缀合物3(Alexa－Ala－Asp(C12H25)－Phe－NH2)(PFCJ－3)、肽荧光缀合物6(Alexa－Ala－Asp(C4F9)－Phe－NH2)(PFCJ－6)、肽荧光缀合物7(Alexa－Ala－Asp(C6F13)－Phe－NH2)(PFCJ－7)、肽荧光缀合物9(Alexa－Ala－Asp(SF4CF2CF2Cl)－Phe－NH2)(PFCJ－9)和肽荧光缀合物10(Alexa－Ala－Asp(tris－t－C4F9)－Phe－NH2)(PFCJ－10)的平均粒径进行测定的结果的图。
图10是示出试验例6中在含有肽荧光缀合物1(Alexa－Ala－Asp(C8F17)－Phe－NH2)(PFCJ－1)、肽荧光缀合物8(Alexa－Ala－Asp(C10F21)－Phe－NH2)(PFCJ－8)、肽荧光缀合物11(Alexa－Ala－Asp(CH2CH2C8F17)－Phe－NH2)(PFCJ－11)或者荧光色素1(荧光物质Alexa Fluoro 647的二乙基酰胺体)(FD－1)的样品溶液中以37℃进行1小时处理后的HeLa细胞的流式细胞仪结果的图。
图11是示出试验例6中在含有肽荧光缀合物1(Alexa－Ala－Asp(C8F17)－Phe－NH2)(PFCJ－1)、肽荧光缀合物8(Alexa－Ala－Asp(C10F21)－Phe－NH2)(PFCJ－8)、肽荧光缀合物11(Alexa－Ala－Asp(CH2CH2C8F17)－Phe－NH2)(PFCJ－11)或者荧光色素1(FD－1)的样品溶液中以37℃进行1小时处理后的HeLa细胞的平均荧光强度(MFI)的测定结果的图。
图12是示出试验例7中在含有肽荧光缀合物1(Alexa－Ala－Asp(C8F17)－Phe－NH2)(PFCJ－1)、肽荧光缀合物12(Alexa－Ala－Asp(CH2CH2C6F13)－Phe－NH2)(PFCJ－12)或者荧光色素1(FD－1)的样品溶液中以37℃进行1小时处理后的HeLa细胞的平均荧光强度(MFI)的测定结果的图。
具体实施方式
本发明和本申请说明书中，“Cp1－p2”(p1和p2为满足p1＜p2的正整数)表示碳原子数为p1～p2的基团。
本发明和本申请说明书中，“C1－30烷基”为碳原子数1～30的烷基，可以为直链，也可以为支链。“C2－30烷基”为碳原子数2～30的烷基，可以为直链，也可以为支链。作为C1－30烷基的例子，可举出甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基、二十三烷基、二十四烷基、二十五烷基、二十六烷基、二十七烷基、二十八烷基、二十九烷基、三十烷基等。
本发明和本申请说明书中，“C1－10烷基”为碳原子数1～10的烷基，可以为直链，也可以为支链。“C2－10烷基”为碳原子数2～10的烷基，可以为直链，也可以为支链。作为C1－10烷基的例子，可举出甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等。
本发明和本申请说明书中，“C1－6烷基”为碳原子数1～6的烷基，可以为直链，也可以为支链。作为C1－6烷基的例子，可举出甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、己基等。
本发明和本申请说明书中，“C6－14芳基”为碳原子数6～14的芳香族烃基，特别优选C6－12芳基。作为C6－14芳基的例子，可举出苯基、萘基、蒽基、9－芴基等，特别优选苯基。
本发明和本申请说明书中，“可以取代的C6－14芳基”是C6－14芳基的碳原子所键合的氢原子的1或多个、优选1～3个被取代为其它官能团的基团。具有2个以上的取代基时，取代基彼此可以互为相同种类，也可以互为不同种类。作为该取代基，可举出硝基、卤素原子(氟原子、氯原子、溴原子或碘原子)、C1－6烷基、C1－6烷氧基、以及亚甲二氧基(－O－CH2－O－)等。作为“可以取代的C6－14芳基”的例子，可举出苯基、萘基、蒽基、4－硝基苯基、4－甲氧基苯基、2,4－二甲氧基苯基、3,4－二甲氧基苯基、4－甲基苯基、2,6－二甲基苯基、3－氯苯基、1,3－苯并二唑－5－基等。
本发明和本申请说明书中，“C6－14芳基－C1－6烷基”是C1－6烷基的碳原子所键合的1个氢原子被取代为C6－14芳基的基团。作为C6－14芳基－C1－6烷基中的C6－14芳基，可以例示苯基、萘基、蒽基、9－芴基等，特别优选苯基或9－芴基。作为C6－14芳基－C1－6烷基中的C1－6烷基，优选C1－4烷基。作为C6－14芳基－C1－6烷基的例子，可举出苄基、二苯基甲基、三苯基甲基、2－苯基乙基、9－蒽基甲基、9－芴基甲基等。
本发明和本申请说明书中，“卤素原子”是指氟原子、氯原子、溴原子或碘原子。“氟原子以外的卤素原子”是指氯原子、溴原子或碘原子。作为“氟原子以外的卤素原子”的例子，优选氯原子或溴原子，特别优选氯原子。
本发明和本申请说明书中，“C1－6烷氧基”是指碳原子数1～6的C1－6烷基的键合末端键合有氧原子的基团。C1－6烷氧基可以为直链，也可以为支链。作为C1－6烷氧基的例子，可举出甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基等。
本发明和本申请说明书中，“醚键性氧原子”是指将碳原子间连接的氧原子，不包含氧原子彼此串联连接的氧原子。碳原子数Nc(Nc为2以上的整数)的烷基可具有的醚键性氧原子最大为Nc－1个。
另外，以下，“化合物n”是指式(n)表示的化合物。
＜含氟肽＞
本发明的肽是由2个以上的氨基酸构成的肽，且是构成该肽的氨基酸残基的至少1个的侧链为下述通式(1)表示的基团的肽。通式(1)中，黑色圆点表示键合位点。应予说明，以下，有时将下述通式(1)表示的基团与α碳键合的氨基酸称为“含氟氨基酸”，有时将构成肽的氨基酸残基的至少1个的侧链为下述通式(1)表示的基团的肽称为“含氟肽”。
通式(1)中，Rf为至少由2个氟原子取代的C1－30烷基、－SF5、或者－SF4－CR101R102－CR103R104Cl。
Rf为至少由2个氟原子取代的C1－30烷基的情况下，该C1－30烷基在碳原子为2以上时(C2－30烷基时)可以在碳原子间具有1～5个醚键性氧原子。
Rf的键合于碳原子的1个以上的氢原子可以进一步由氟原子以外的卤素原子取代。这里，作为Rf的C1－30烷基，优选C1－20烷基，更优选C1－10烷基，进一步优选C2－10烷基，更进一步优选C2－8烷基。该C1－30烷基为C2－30烷基的情况下，可以在碳原子间具有1～5个醚键性氧原子。在Rf中，取代为氟原子的氢原子的个数只要为2个以上，就没有特别限定，例如，优选为3个以上，更优选为6个以上，进一步优选为7个以上。
作为Rf的例子，可举出三氟甲基、五氟乙基、七氟丙基、九氟丁基、全氟戊基、全氟己基、全氟庚基、全氟辛基、全氟壬基、全氟癸基、二氟甲基、1,1－二氟乙基、2,2－二氟乙基、1,1,2,2－四氟乙基、1,1,2,2,3,3－六氟丙基、1,1,2,3,3,3－六氟丙基、1,1,2,2,3,3－六氟己基、1,1,2,2,3,3－六氟辛基、1,1,2,2,3,3－六氟癸基、1,1,2,2,3,3－六氟十八烷基、1,1,2,2,3,3－六氟二十六烷基等。
Rf为碳原子数2的基团的情况下，作为Rf，相对于1,1,1－三氟乙基(CF3－CH2－)，优选如五氟乙基那样键合于碳原子的氢原子的至少4个以上被取代为氟原子的基团。另外，Rf为碳原子数3的基团的情况下，作为Rf，优选直链状基团，在为支链状基团的情况下，优选1,1,1,3,3,3－六氟丙烷－2－基((CF3)2－CH－)、(CF3)2－CF－基。Rf为碳原子数4的基团时，作为Rf，可以为直链状基团，也可以为支链状基团。为支链状基团的情况下，优选为键合于构成亚烷基部分的碳原子的氢原子被取代为氟原子的基团或者被完全氟化的基团。
作为Rf，优选下述通式(f－1)或(f－2)表示的基团。这里，RfP表示含有至少2个以上的氟原子的完全卤化C1－10烷基。RfP的C1－10烷基的氢原子全部被取代为卤素原子，这些卤素原子中的至少2个以上为氟原子的基团。RfP为碳原子数2以上时，即，为完全卤化C2－10烷基时，可以在碳原子间具有1～5个醚键性氧原子。在通式(f－2)中，2个RfP可以互为相同种类的基团，也可以是不同种类的基团。
下述通式(f－1)或(f－2)中，n1为0～10的整数，n2为0～9的整数。n1和n2为0时，均表示单键。即，n1为0时，通式(f－1)表示的基团为RfP－，n2为0时，通式(f－2)表示的基团为(RfP)2－CH－。
Rf为通式(f－1)表示的基团时，Rf优选RfP为三氟甲基、五氟乙基、七氟丙基、九氟丁基、全氟戊基、全氟己基、全氟庚基、全氟辛基、全氟壬基、或者全氟癸基且n1为0～4的整数的基团，更优选RfP为三氟甲基、五氟乙基、七氟丙基、九氟丁基、全氟戊基、全氟己基、全氟庚基、全氟辛基、全氟壬基、或者全氟癸基且n1为0～2的整数的基团，进一步优选RfP为三氟甲基、五氟乙基、七氟丙基、九氟丁基、全氟戊基、或者全氟己基且n1为0～2的整数的基团(其中，不包括n1为1、RfP为三氟甲基的基团)。
Rf为通式(f－2)表示的基团时，Rf优选RfP为三氟甲基、五氟乙基、七氟丙基、九氟丁基、全氟戊基、全氟己基、全氟庚基、全氟辛基、全氟壬基、或者全氟癸基且n2为0～4的整数的基团，更优选RfP为三氟甲基、五氟乙基、七氟丙基、九氟丁基、全氟戊基、全氟己基、全氟庚基、全氟辛基、全氟壬基、或者全氟癸基且n2为0～2的整数的基团，进一步优选RfP为三氟甲基、五氟乙基、七氟丙基、九氟丁基、全氟戊基、或者全氟己基且n2为0～2的整数的基团(其中，不包含n2为0或1、RfP为三氟甲基的基团)。
作为Rf的例子，可以为二氟甲基、1,1－二氟乙基、2,2－二氟乙基、1,1,2,2－四氟乙基、1,1,2,2,3,3－六氟丙基、1,1,2,3,3,3－六氟丙基等。
Rf为－SF4－CR101R102－CR103R104Cl表示的基团时，R101、R102、R103和R104各自独立地为氢原子、氟原子或氯原子。其中，R101、R102、R103和R104中的2个以上为氟原子。作为－SF4－CR101R102－CR103R104Cl表示的基团，具体而言，可举出－SF4－CF2－CF2Cl、－SF4－CF2－CFCl2、－SF4－CF2－CHF－Cl、－SF4－CF2－CCl3、－SF4－CF2－CHCl2、－SF4－CF2－CH2Cl、－SF4－CFCl－CFCl2、－SF4－CFCl－CHF－Cl、－SF4－CHF－CHF－Cl。
通式(1)中，Z1为二、三或四价的除亚烷基以外的连接基团，n3为1、2或3。作为Z1，只要是亚烷基以外的二～四价的基团，就没有特别限定。例如，Z1可举出亚烷基、氧原子(－O－)、硫原子(－S－)、－NH－、－N(CH3)－、－N(C2H5)－、－N(C3H7)－、三价氮原子、－C(＝O)－、－S(＝O)2－、从环烷烃中除去2～4个氢原子所得的基团、从芳香环中除去2～4个氢原子所得的基团、从杂环中除去2～4个氢原子所得的基团、或者它们的组合。作为芳基、杂芳基，可以使用上述举出的基团。其中，不包括仅由亚烷基构成的基团、与Rf的连接部分为亚烷基的基团。
Z1由亚烷基、氧原子(－O－)、硫原子(－S－)、－NH－、－N(CH3)－、－N(C2H5)－、－N(C3H7)－、－C(＝O)－、－S(＝O)2－、从环烷烃中除去2个氢原子所得的基团、从芳香环中除去2个氢原子所得的基团、从杂环中除去2个氢原子所得的基团、或者它们的组合构成的情况下，Z1为二价连接基团，通式(1)表示的基团为具有1个Rf基的基团。Z1具有三价氮原子的情况下，通过使2个Rf基直接或介由其它二价连接基团与该氮原子键合，能够使通式(1)表示的基团成为具有2个Rf基的基团。
作为Z1，可以是具有从环中除去氢原子所得的基团(环基)的连接基团，也可以是不具有环基的连接基团。Z1具有环基的情况下，可以使通式(1)表示的基团为具有2或3个Rf基的基团。作为该环基，可举出从环烷烃、芳香环、或者杂环中除去2～4个氢原子所得的基团。作为杂环，优选芳香环的1～3个碳原子被取代为选自氮原子、氧原子和硫原子中的1种以上原子的环。另外，该环基可以是从单环中除去氢原子所得的基团，也可以是从稠合环中除去氢原子所得的基团。作为通式(1)中的Z1所含有的环基，优选从环己烷、苯、咪唑或吲哚中除去2～4个氢原子所得的基团。例如，Z1为具有从苯中除去2～4个氢原子所得的环基的连接基团时，该环基为1,4－亚苯基、1,3－亚苯基、1,5－亚苯基、或者1,3,5取代苯基，优选1,4－亚苯基、或者1,3,5取代苯基。
具体而言，作为通式(1)中的Z1，可举出－C(＝O)－、－C(＝O)－O－、－O－C(＝O)－、－NH－C(＝O)－O－、－O－C(＝O)－NH－、－C(＝O)－NH－、－NH－C(＝O)－、－S－S－、－S(＝O)2－NH－、－NH－S(＝O)2－、－S(＝O)2－NH－S(＝O)2－、－C(＝O)－NH－Ph－(－Ph－为1,4－亚苯基、1,3－亚苯基、1,5－亚苯基、或者1,3,5取代苯基)。另外，也优选将它们中的任一基团与C1－6亚烷基组合而成的连接基团。作为通式(1)中的Z1，优选与Rf的连接部分为氧原子的基团。
作为通式(1)中的Z1，优选为下述通式(2)表示的连接基团。
通式(2)中，Z2为二、三或四价亚烷基以外的连接基团。作为Z2，只要是亚烷基以外的二～四价基团，就没有特别限定。例如，Z2可举出亚烷基、氧原子(－O－)、硫原子(－S－)、－NH－、－N(CH3)－、－N(C2H5)－、－N(C3H7)－、三价氮原子、－C(＝O)－、－S(＝O)2－、从环烷烃中除去2～4个氢原子所得的基团、从芳香环中除去2～4个氢原子所得的基团、从杂环中除去2～4个氢原子所得的基团、或者它们的组合。作为芳基、杂芳基，可以使用上述举出的基团。其中，不包括仅由亚烷基构成的基团、与Rf的连接部分为亚烷基的基团。
作为通式(2)中的Z2，具体而言，可以使用与Z1中举出的基团同样的基团。作为通式(2)中的Z2，优选为－C(＝O)－、－C(＝O)－O－、－O－C(＝O)－、－NH－C(＝O)－O－、－O－C(＝O)－NH－、－C(＝O)－NH－、－NH－C(＝O)－、－S－S－、－S(＝O)2－NH－、－NH－S(＝O)2－、－S(＝O)2－NH－S(＝O)2－、－C(＝O)－NH－Ph－(－Ph－为1,4－亚苯基、1,3－亚苯基、1,5－亚苯基、或者1,3,5取代苯基)。
通式(2)中，Rh为氢原子或C1－6烷基。Rh为C1－6烷基时，作为Rh，优选C1－3烷基，更优选甲基或乙基。
作为通式(1)表示的基团，例如，可举出Z1为通式(2)表示的基团且Rf为通式(f－1)或(f－2)表示的基团的基团。其中，优选通式(2)中的Z2为－C(＝O)－、－C(＝O)－O－、－O－C(＝O)－、－NH－C(＝O)－O－、－O－C(＝O)－NH－、－C(＝O)－NH－、－NH－C(＝O)－、－S－S－、－S(＝O)2－NH－、－NH－S(＝O)2－、－S(＝O)2－NH－S(＝O)2－、－C(＝O)－NH－Ph－(－Ph－为1,4－亚苯基、1,3－亚苯基、1,5－亚苯基、或者1,3,5取代苯基)、Rh为氢原子或C1－6烷基且Rf为通式(f－1)或(f－2)表示的基团的基团。
作为本发明的含氟肽，优选侧链为上述通式(1)表示的基团(－Z1－(Rf)n3)的氨基酸残基是在天然氨基酸的侧链直接或间接地连接有1～3个Rf基的氨基酸残基的肽。作为本发明的含氟肽，具体而言，优选具有至少1个如下氨基酸残基的肽，所述氨基酸残基为将精氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酰胺残基、或者赖氨酸残基的侧链的氨基的1个或2个氢原子由－Rf或－Z3－(Rf)n4(Z3为二、三或四价除亚烷基以外的连接基团。其中，不包含与Rf的连接部分为亚烷基的基团。另外，n4为2、3或4)取代的氨基酸残基；将精氨酸残基的侧链的亚氨基的氢原子由－Rf或－Z3－(Rf)n4取代的氨基酸残基；将天冬氨酸残基或谷氨酸残基的侧链的羧基的氢原子由－Rf或－Z3－(Rf)n4取代的氨基酸残基；将半胱氨酸残基或蛋氨酸残基的侧链的硫醇基的氢原子由－Rf或－Z3－(Rf)n4取代的氨基酸残基；将丝氨酸残基、苏氨酸残基或色氨酸残基的侧链的羟基的氢原子由－Rf或－Z3－(Rf)n4取代的氨基酸残基；将酪氨酸残基或苯基丙氨酸残基的侧链的苯环的1个～3个氢原子由－Rf或－Z3－(Rf)n4取代的氨基酸残基；将组氨酸残基的侧链的咪唑环的1个～3个氢原子由－Rf或－Z3－(Rf)n4取代的氨基酸残基；将色氨酸残基的侧链的吲哚环的1个～3个氢原子由－Rf或－Z3－(Rf)n4取代的氨基酸残基。
作为Z3，只要是亚烷基以外的二～四价基团，就没有特别限定。例如，Z3可举出亚烷基、氧原子(－O－)、硫原子(－S－)、－NH－、－N(CH3)－、－N(C2H5)－、－N(C3H7)－、三价氮原子、－C(＝O)－、－S(＝O)2－、从环烷烃中除去2～4个氢原子所得的基团、从芳香环中除去2～4个氢原子所得的基团、从杂环中除去2～4个氢原子所得的基团、或者它们的组合。作为芳基、杂芳基，可以使用上述举出的基团。其中，不包含仅由亚烷基构成的基团、与Rf的连接部分为亚烷基的基团。具体而言，作为Z3，可以使用与Z1、Z2同样的连接基团。
天然氨基酸的侧链的氨基、亚氨基、羧基、羟基、硫醇基、苯环、咪唑环、吲哚环等的氢原子向－Rf或－Z3－(Rf)n4的取代可以通过酯反应等一般的合成反应来进行。
作为本发明的含氟肽，可举出含有至少1个侧链为－Z1－(Rf)n3的氨基酸残基的肽。只要构成该肽的氨基酸残基中的至少1个的侧链为－Z1－(Rf)n3即可，也可以全部氨基酸残基的侧链为－Z1－(Rf)n3。一分子的肽中侧链为－Z1－(Rf)n3的氨基酸残基有2个以上时，此等多个－Z1－(Rf)n3可以互为相同种类，也可以为不同种类。另外，肽中的侧链为－Z1－(Rf)n3的氨基酸残基可以在N末端，也可以在C末端，也可以为末端以外。
本发明的含氟肽只要是由2个以上的氨基酸构成的肽即可，也优选由3个以上的氨基酸构成的肽。作为本发明的含氟肽，优选为由2～40个氨基酸构成的肽，更优选为由3～20个氨基酸构成的肽。
本发明的含氟肽的氨基酸序列没有特别限定。例如，与极性侧链相比疏水性(非极性)侧链的比例越高的肽，细胞膜透过性越良好。因此，本发明的含氟肽也可以为含有较多具有疏水性侧链的氨基酸残基的氨基酸序列。另一方面，将本发明的含氟肽与疏水性物质连接使用的情况下，该含氟肽通过成为含有较多具有极性侧链的氨基酸残基的氨基酸序列而能够得到整个分子的疏水性与亲水性的平衡，更能够提高细胞膜透过性。
本发明的含氟肽的N末端可以由氨基的保护基保护。作为N末端的保护基，只要是氨基的保护基，就没有特别限定，例如，可以使用肽合成中采用的氨基的保护基。作为氨基的保护基，可举出叔丁氧基羰基(Boc)基、9－芴基甲氧基羰基(Fmoc)基、苄氧基羰基(Cbz)基、烯丙氧基羰基(Alloc)基、2,2,2－三氯乙氧基羰基(Troc)基等氨基甲酸酯系保护基。从能够在稳定的条件下脱保护的方面出发，优选为叔丁氧基羰基(Boc)或9－芴基甲氧基羰基(Fmoc)。
本发明的含氟肽的C末端可以由保护基保护。作为C末端的保护基，只要是羧基的保护基，就没有特别限定，例如，可以使用肽合成中采用的羧基的保护基。作为羧基的保护基，具体而言，为选自下述通式(p－1)表示的基团、2－(9,10－二氧代)蒽基甲基、苄氧基甲基和苯甲酰甲基中的保护基。通式(p－1)中，R3为可以取代的C6－14芳基，R4和R5各自独立地为氢原子或可以取代的C6－14芳基。另外，黑色圆点表示键合位点。
作为羧基的保护基，可举出苄基、二苯基甲基、三苯基甲基、4－硝基苄基、4－甲氧基苄基、2,4－二甲氧基苄基、3,4－二甲氧基苄基、4－甲基苄基、2,6－二甲基苄基、3－氯苄基、9－蒽基甲基、胡椒基、2－(9,10－二氧代)蒽基甲基、苄氧基甲基、苯甲酰甲基等。从能够在稳定的条件下脱保护的方面出发，C末端的羧基的保护基优选为苄基、三苯基甲基，更优选为苄基。
作为本发明的含氟肽中的侧链不为－Z1－(Rf)n3的氨基酸残基，没有特别限定，可以为α－氨基酸的氨基酸残基，也可以为β－氨基酸的氨基酸残基，也可以为γ－氨基酸的氨基酸残基，也可以为δ－氨基酸的氨基酸残基。另外，也可以为L－氨基酸的氨基酸残基，还可以为D－氨基酸的氨基酸残基。作为本发明的含氟肽中含有的侧链不为－Z1－(Rf)n3的氨基酸残基，优选为构成蛋白质的氨基酸或其D型体、以及它们的侧链经修饰的修饰氨基酸的氨基酸残基。
作为构成蛋白质的氨基酸，可举出甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、脯氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸等。另外，作为构成蛋白质的氨基酸经修饰的修饰氨基酸，例如，可举出赖氨酸、精氨酸、组氨酸的侧链的氨基的氢原子被取代为上述举出的氨基的保护基、Pbf(N-ω-(2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基))基的氨基酸；天冬氨酸、谷氨酸的侧链的羧基的氢原子被取代为上述举出的羧基的保护基、叔丁基的烷基的氨基酸；半胱氨酸的硫醇基的氢原子被取代为苄基的氨基酸。
作为本发明的含氟肽，例如，可举出下述通式(11)表示的三肽。通式(11)中，Rf和n3与上述通式(1)中的Rf和n3相同，Z2和Rh与上述通式(2)中的Z2和Rh相同。
通式(11)中，R11和R12各自独立地为C1－6烷基或苄基。作为通式(11)的三肽，R11和R12优选各自独立地为甲基或苄基，特别优选R11为甲基且R12为苄基。
通式(11)中，X为9－芴基甲氧基羰基(Fmoc)或叔丁氧基羰基(Boc)。
通式(11)中，Z为C1－6烷氧基、羟基或氨基。Z为C1－6烷氧基时，作为Z，特别优选甲氧基。
本发明的含氟肽除了使用至少侧链为－Z1－(Rf)n3的氨基酸作为原料氨基酸以外，可以利用一般的肽合成法来进行。例如，可以通过肽固相合成法来进行。含氟肽可以通过将侧链为－Z1－(Rf)n3的氨基酸作为原料使用肽自动合成仪而容易地合成。作为含氟氨基酸，优选侧链为－Z1－(Rf)n3的氨基酸。
使保护了氨基的氨基酸依次与将C末端键合于固相上的氨基酸缩合，使肽从固相上脱离，由此可以制造肽。氨基酸原料优选使用氨基由Boc基或Fmoc基保护的原料。氨基酸原料的侧链官能团优选使用由保护基保护的官能团。作为侧链官能团的保护基，可举出Boc基、三苯基甲基、苄基、2,2,5,7,8－五甲基色满－6－磺酰基(Pmc)基等。
作为形成肽键的缩合剂，例如，可举出N,N－二环己基碳二亚胺(DCC)、1－乙基－3－(3’－二甲基氨基丙基)碳二亚胺(WSC)、苯并三唑－1－基氧基－三(二甲基氨基)磷六氟磷酸盐(BOP)、苯并三唑－1－基氧基三吡咯烷基磷/>六氟磷酸盐(pyBOP)、2－(1H－苯并三唑－1－基)－1,1,3,3－四甲基脲/>六氟磷酸盐(HBTU)、2－(1H－苯并三唑－1－基)－1,1,3,3－四甲基脲/>四氟硼酸盐、1－氰基－2－乙氧基－2－氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基吗啉基碳/>六氟磷酸盐(COMU)等。另外，也可以使N－羟基苯并三唑(HOBt)、(羟基亚氨基)氰基乙酸乙酯(oxyma)和上述缩合剂以优选比例混合使用。
肽键的形成可以使用将羧基末端活化的方法，作为其活化剂，例如，可举出N－羟基琥珀酰亚胺、对硝基苯基酯、五氟苯基酯等。作为形成肽键时使用的碱，例如，可举出三乙基胺、二异丙基乙基胺(DIPEA)等。作为肽键形成反应中使用的溶剂，例如，可举出氯仿、二氯甲烷(DCM)、二氯乙烷(DCE)、乙腈(MeCN)、N,N－二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)等。
作为肽或氨基酸的氨基末端氨基的保护基的Boc基和Fmoc基分别可以通过三氟乙酸(TFA)或哌啶而除去。肽的氨基酸残基的侧链官能团的保护基例如可以通过TFA、氟化氢(HF)、三氟甲磺酸等而除去。
另外，肽固相合成法中，作为使肽或氨基酸残基的侧链官能团带有保护基的肽从肽固相合成树脂上脱离的方法，例如，可以使用TFA。肽从肽固相树脂上的脱离和氨基酸残基的侧链官能团的保护基的脱离也可以分别在同一反应体系内同时进行。或者，也可以分别独立进行。作为肽固相合成用肽固相合成树脂，例如，可以使用4－羟基甲基－3－甲氧基苯氧基丁酸－二苯甲胺－聚苯乙烯树脂、对苄氧基苄基醇－聚苯乙烯树脂、肟树脂等通常市售的树脂。
目标肽或其中间体可以通过例如离子色谱、凝胶过滤色谱、反相色谱、正相色谱、重结晶、萃取、分离结晶等各种方法来进行分离、纯化。另外，由此得到的肽可以通过常规方法而转化为各自的盐。
所制造的含氟肽的氨基或羧基的保护基也可以根据需要进行脱保护。脱保护可以根据保护基的种类按照常规方法进行。
氟烷基、－SF5、－SF4－CR101R102－CR103R104Cl由于含有很多氟原子，因此本发明的含氟肽的细胞膜透过性优异。另外，由于结构与天然肽大不相同，因此不易被肽酶分解。利用这些性质，本发明的含氟肽可期待作为生理活性物质应用于医药领域。例如，本发明的含氟肽有望作为将药效成分向靶细胞递送的DDS载体加以利用。通过对因摄取到生物体内的靶细胞内而显示出某种生理活性的功能性成分以不损害其功能的方式附加本发明的含氟肽，能够改善该功能性成分向靶细胞的摄取效率。该功能性成分可以为肽，也可以为蛋白质，还可以为低分子化合物。另外，通过将构成显示出生理活性的功能性肽的氨基酸残基中的一部分的侧链在不损害该功能性肽的功能的范围取代为－Z1－(Rf)n3，能够改善该功能性肽的细胞膜透过性、在细胞内的滞留时间。
为了具有细胞膜透过性而连接CPP－活性肽(药效部分)时也能够使用自动合成装置进行合成，在成本上占据优势，具有实用性。
如国际公开第2021/002407号说明书所记载的非天然氨基酸需要进行立体选择性反应或光学拆分，合成各种含氟氨基酸衍生物非常麻烦。此外，如由这样的非天然氨基酸衍生的国际公开第2021/002408号说明书中记载的肽的合成也非常麻烦。
与此相对，本发明的肽可以由天然氨基酸衍生，即便不进行光学拆分，也能够合成立体构型确定的氨基酸。另外，通过另行准备含氟单元与天然氨基酸反应也能够合成，能够由同一制造工艺来合成各种含氟氨基酸，在成本上也具有优点。
实施例
以下，根据实施例对本发明进行说明，但本发明并不限定于这些实施例。
实施例、比较例的分析中使用的NMR装置为日本电子制JNM－ECZ400S(400MHz)，1HNMR中将四甲基硅烷设为0PPM，19FNMR中将C6F6设为－162PPM的基准值。
本申请说明书中，使用以下简称。
Bn：苄基
Boc：叔丁氧基羰基
All：烯丙基
Phth:邻苯二甲酰基
Et2O：乙醚
Fmoc：9－芴基甲氧基羰基
THF：四氢呋喃
TMS：三甲基甲硅烷
C4F9：1,1,2,2,3,3,4,4,4－九氟丁基
C6F13：1,1,2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,6－十三氟己基
C8F17：1,1,2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8－十七氟辛基
COMU：1－氰基－2－乙氧基－2－氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基吗啉碳六氟磷酸盐(CASRN：1075198-30-9)
oxyma：(羟基亚氨基)氰基乙酸乙酯(CASRN：3849-21-6)
DIPEA：二异丙基乙基胺
[制造例1]
含有RF(C8)基的氨基酸(Fmoc－Asp(C8F17)－OH：2b)的合成
4－(全氟辛基)苯胺(化合物(1))按照Org.Lett.，2019,21,6481中记载的方法进行合成。
另外，在干燥的容量25mL的双口茄形瓶中，将化合物(1)150mg(0.3mmol)、Fmoc－Asp－OAll 130mg(0.33mmol，1.1等量)溶解于二氯甲烷6mL，加入COMU 141mg(0.33mmol，1.1等量)、oxyma 47mg(0.33mmol，1.1等量)和DIPEA85.3mg(0.66mmol，2.2等量)，在室温下搅拌18小时。然后，将反应混合物用HCl(1N)进行淬灭，用二氯甲烷萃取3次。将合并的有机相减压浓缩后，用乙酸乙酯稀释，用HCl(1N)、饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水进行清洗。将清洗后的有机相用硫酸钠干燥、过滤后，进行减压浓缩而得到化合物(2a)的粗产物。将粗产物溶解于丙酮后，使用己烷进行再沉淀纯化，由此得到纯化合物(2a)(Fmoc－Asp(C8F17)－OAll)的白色固体(173mg，0.19mmol)。(收率64.9％)
化合物(2a)：
1H NMR(400MHz，DMSO－D6)δ＝7.87－7.77(m，5H)，7.65－7.57(m，4H)，7.37－7.22(m，4H)，5.82(m，1H)，5.26(d，J＝17.1Hz，1H)，5.12(d，J＝17.1Hz，1H)，4.54(m，3H)，4.29－4.18(m，3H)，2.94－2.54(m，2H).
19F NMR(376MHz，DMSO－D6)δ＝－80.0(s，3F)，－108.8(s，2F)，－121.0(s，2F)，－121.6(s，6F)，－122.3(s，2F)，－125.7(s，2F).
在0℃下向化合物(2a)(173mg，0.2mmol)的THF(2mL)溶液中加入三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(10mol％)和膦(phosphine)(20mol％)进行搅拌，进一步添加苯基硅烷(2当量)后升温到室温搅拌2小时。然后，将反应混合物用HCl(1N)(10mL)淬灭，用二氯甲烷萃取2次。减压浓缩有机相，将得到的粗产物用硅胶柱层析(氯仿:甲醇＝8:1(容量比))进行纯化，得到Fmoc－Asp(C8F17)－OH(化合物(2b))的黄色固体(139mg，0.16mmol，收率82％)。
化合物(2b)：
1H NMR(500MHz，DMSO－D6)δ＝10.37(s，1H)，7.85－7.21(m，12H)，4.44(brs，1H)，4.52－4.22(m，3H)，2.90－2.68(m，2H).
19F NMR(376MHz，DMSO－D6)δ＝－80.06(s，3F)，－108.83(s，2F)，－122.36～－120.96(m，10F)，－125.41(s，2F).
[制造例2]
含有RF(C8)基的氨基酸(Fmoc－Asp(bis－C8F17)－OAll：4)的合成
首先，根据Tetrahedron.，2002，vol.58(20)，p.3977中记载的方法来合成3,5－双(全氟辛基)苯胺(化合物(3))。
接着，使用化合物(3)(930mg，0.1mmol)来代替4－(全氟辛基)苯胺，按照与制造例1同样的顺序得到Fmoc－Asp(bis－C8F17)－OAll(化合物(4))的粗产物。将该粗产物用硅胶层析(乙酸乙酯/己烷＝1/4(容量比))纯化，得到纯化合物(4)(940mg，0.07mmol，收率72％)
化合物(4)：
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝7.76(d，J＝7.3Hz，2H)，7.59(m，3H)，7.35(dt，J＝34.8，7.5Hz，6H)，5.94－5.82(m，3H)，5.35－5.23(m，3H)，4.43－4.21(m，3H)，2.98(dd，J＝74.3，17.2Hz，2H).
19F NMR(376MHz，CDCl3)δ＝－80.44(s，6F)，－110.83(s，4F)，－122.52～－121.03(m，20F)，－125.97(s，4F).
[制造例3]
含有RF(C4)基的氨基酸(Fmoc－Asp(bis－C4F9)－OH：6b)的合成
首先，按照Tetrahedron.，2002，vol.58(20)，p.3977中记载的方法使用C4F9I代替C8F17I来合成3,5－双(全氟丁基)苯胺(化合物(5))。
接着，使用化合物(5)(1.1g，2mmol)代替4－(全氟辛基)苯胺，按照与制造例1同样的顺序得到Fmoc－Asp(bis－C4F9)－OAll(化合物(6a))的粗产物。将该粗产物利用硅胶层析(乙酸乙酯/己烷＝1/10(容量比))进行纯化，由此得到纯化合物(6a)(370mg，0.39mmol，收率19.5％)。
化合物(6a)：
1H NMR(400MHz，ACETONE－D6)δ＝9.92(s，1H)，7.82－7.61(m，6H)，7.30(dt，J＝42.2，7.4Hz，4H)，6.90(d，J＝8.2Hz，1H)，5.88(dq，J＝22.8，5.3Hz，1H)，5.32－5.11(m，2H)，4.75(dd，J＝14.4，6.2Hz，1H)，4.62(d，J＝6.9Hz，2H)，4.37－4.21(m，3H)，3.11(d，J＝6.4Hz，2H).
19F NMR(376MHz，ACETONE－D6)δ＝－81.81(s，6F)，－111.45(s，4)，－123.15(s，4F)，－126.09(s，4F).
接着，利用与制造例1同样的方法进行化合物(6a)(180mg，0.2mmol)的脱烯丙基化，得到Fmoc－Asp(bis－C4F9)－OH(化合物(6b))(91g，0.11mmol，收率53％)。
化合物(6b)：
1H NMR(400MHz，ACETONE－D6)δ＝9.81(1H)，7.89－6.91(m，12H)，4.71(s，1H)，4.31－4.25(m，3H)，3.11－2.88(m，2H).
19F NMR(376MHz，ACETONE－D6)δ＝－81.75(s，6F)，－111.45(s，4F)，－123.12(s，4F)，－126.07(s，4F).
[制造例4]
含有SF5基的氨基酸(Fmoc－Asp(SF5)－OH：8b)的合成
使用4－五氟硫基苯胺(化合物(7))(438mg，2mmol)来代替4－(全氟辛基)苯胺，按照与制造例1同样的顺序得到Fmoc－Asp(SF5)－OAll(化合物(8a))(882mg，1.48mmol，收率74％)。该产物不进行纯化而供于下一步的脱保护。
化合物(8a)：
1H NMR(400MHz，ACETONE－D6)δ＝9.75(s，1H)，7.84－7.23(m，12H)，5.94－5.84(m，1H)，5.33－5.12(m，2H)，4.84－4.72(m，3H)，4.35－4.31(m，3H)，3.41－3.22(m，2H).
19F NMR(376MHz，ACETONE－D6)δ＝88.14－86.65(m，5F).
接着，利用与制造例1同样的方法进行化合物(8a)(120mg，0.2mmol)的脱烯丙基化，得到Fmoc－Asp(SF5)－OH(化合物(8b))的(0.10mmol，55mg，收率49％)。
化合物(8b)
1H NMR(400MHz，ACETONE－D6)δ＝9.74(s，1H)，7.78－6.90(m，12H)，4.73(s，1H)，4.35－4.20(m，3H)，2.95－2.81(m，4H).
19F NMR(376MHz，ACETONE－D6)δ＝86.7－85.1(m，5F).
[制造例5]
含有支链RF(C4)基的氨基酸(Fmoc－Asp(tris－t－C4F9)－OH：10b)的合成
首先，根据Dalton Trans.，2012，vol.41，p.8368和NewJ.Chem.，2017，vol.41，p.7729的Electronic Supplementary Information中记载的方法按照上述反应式来合成化合物(9)。
接着，使用具有多个支链Rf基的化合物(化合物(9))(400mg，0.47mmol)来代替4－(全氟辛基)苯胺，按照与制造例1同样的顺序得到Fmoc－Asp(tris－t－C4F9)－OAll(化合物(10a))的粗产物。将该粗产物利用硅胶层析(乙酸乙酯/己烷＝1/10(容量比))进行纯化，由此得到纯化合物(10a)(300mg，0.24mmol，收率52％)。
化合物(10a)
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ＝7.75(d，J＝6.9Hz，2H)，7.60－7.28(m，8H)，7.21(d，J＝8.6Hz，2H)，6.09(d，J＝8.0Hz，1H)，5.92－5.86(m，1H)，5.34－5.21(m，2H)，4.70(d，J＝5.2Hz，3H)，4.44(dd，J＝10.3，7.4Hz，2H)，4.36(s，6H)，4.23(t，J＝7.2Hz，1H)，3.07(dd，J＝16.5，12.0Hz，2H).
19F NMR(471MHz，CDCl3)δ＝－70.12(s，27F).
接着，利用与制造例1同样的方法进行化合物(10a)(248mg，0.2mmol)的脱烯丙基化，由此得到Fmoc－Asp(tris－t－C4F9)－OH(化合物(10b))(108mg，0.091mmol，收率45％)。
化合物(10b)：
1H NMR(400MHz，ACETONE－D6)δ＝7.74－7.60(m，8H)，7.36－7.24(m，4H)4.61(s，6H)，4.34－4.16(m，4H)，2.92－2.81(m，2H).
19F NMR(376MHz，ACETONE－D6)δ＝－70.82(s，27F).
[制造例6]
含有十二烷基的氨基酸(Fmoc－Asp(C12F25)－OH：12b)的合成
使用4－十二烷基苯胺(化合物(11))(78mg，0.3mmol)来代替4－(全氟辛基)苯胺，按照与制造例1同样的顺序得到Fmoc－Asp(C12H25)－OAll(化合物(12a))的粗产物。将该粗产物利用硅胶层析(乙酸乙酯/己烷＝1/10(容量比))进行纯化，由此得到纯化合物(12a)(172mg，0.27mmol，收率90％)。
化合物(12a)：
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ＝7.74(d，J＝7.4Hz，2H)，7.59－7.57(m，2H)，7.38－7.26(m，6H)，7.11(d，J＝8.6Hz，2H)，5.93－5.85(m，1H)，5.34－5.21(m，2H)，4.80－4.72(m，2H)，4.69(s，1H)，4.22(t，J＝7.2Hz，3H)，3.04(dd，J＝116.7，15.9Hz，2H)，1.28－1.24(m，25H).
接着，利用与实施例1同样的方法进行Fmoc－Asp(C12H25)－OAll化合物(12a)(135mg，0.211mmol)的脱烯丙基化，将得到的粗产物利用硅胶柱层析(乙酸乙酯:己烷＝1:10(容量比))进行纯化，由此得到Fmoc－Asp(C12H25)－OH(化合物(12b))(71mg，0.119mmol，收率56％)。
化合物(12b)
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ＝7.74－7.49(m，6H)，7.13－6.94(m，6H)，4.55(s，1H)，4.37－4.20(m，3H)，3.09－2.89(m，2H)，1.28－1.21(m，25H).
[制造例7]
含有RF基的氨基酸(Fmoc－Asp(C4F9)－OH：14b，Fmoc－Asp(C6F13)－OH：16b，Fmoc－Asp(CH2CH2C6F13)－OH：18b，Fmoc－Asp(SF4CF2CF2Cl)－OH：20b)的合成
使用4－(全氟丁基)苯胺(化合物(13))(731mg，4.1mmol)代替4－(全氟辛基)苯胺，按照与制造例1同样的顺序得到Fmoc－Asp(C4F9)－OAll(化合物(14a))的粗产物。将该粗产物利用硅胶层析(乙酸乙酯/己烷＝1/10(容量比))进行纯化，由此得到纯化合物(14a)(1072mg，2.5mmol，收率61％)。
化合物(14a)：
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝7.75(d，J＝7.4Hz，2H)，7.62(d，J＝7.4Hz，2H)，7.60－7.50(m，4H)，7.45－7.30(m，4H)，5.97－5.73(m，1H)，5.28(m，2H)，4.77－4.57(m，3H)，4.52－4.29(m，2H)，4.22(t，J＝6.5Hz，1H)，3.17－2.95(m，2H).
19F NMR(376MHz，CDCl3)δ＝－80.86(s，3F)，－110.46(s，2F)，－122.65(s，2F)，－125.49(s，2F).
另外，使用4－(全氟己基)苯胺(化合物(15))(411mg，1.0mmol)代替4－(全氟辛基)苯胺，按照与制造例1同样的顺序得到Fmoc－Asp(C6F13)－OAll(化合物(16a))的粗产物。将该粗产物利用硅胶层析(乙酸乙酯/己烷＝1/10(容量比))进行纯化，由此得到纯化合物(16a)(575mg，0.73mmol，收率73％)。
化合物(16a)：
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝7.77(d，J＝8.3Hz，2H)，7.59(d，J＝7.1Hz，2H)，7.36(dt，J＝34.3，8.1Hz，8H)，5.90(m，J＝10.6，4.9Hz，1H)，5.79(d，J＝7.2Hz，1H)，5.31(m，2H)，4.74(m，3H)，4.41(s，2H)，4.23(t，J＝7.0Hz，1H)，3.43－3.20(m，2H).
19F NMR(376MHz，CDCl3)δ＝－80.6(s，3F)，－110.3(s，2F)，－125.9～－121.7(m，8F).
另外，使用4－(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8－十三氟辛基)苯胺(化合物(17))(500mg，1.14mmol)代替4－(全氟辛基)苯胺，按照与制造例1同样的顺序得到Fmoc－Asp(CH2CH2C6F13)－OAll(化合物(18a))的粗产物。将该粗产物利用重结晶(丙酮/环己烷＝1/10)进行纯化，由此得到纯化合物(18a)(745mg，0.91mmol，收率80％)。
化合物(18a)：
1H NMR(500MHz，ACETONE－D6)δ＝9.31(s，1H)，7.85(d，J＝7.4Hz，2H)，7.69(d，J＝7.4Hz，2H)，7.61(d，J＝8.0Hz，2H)，7.39(t，J＝7.4Hz，2H)，7.31－7.27(m，4H)，6.91(d，J＝8.6Hz，1H)，5.92(qd，J＝11.0，5.3Hz，1H)，5.36－5.32(m，1H)，5.17(dd，J＝10.9，1.1Hz，1H)，4.74－4.70(m，1H)，4.64－4.63(m，2H)，4.37－4.23(m，3H)，3.05－2.90(m，3H)，2.58－2.47(m，2H).
19F NMR(471MHz，ACETONE－D6)δ＝－80.70(t，J＝10.1Hz，3F)，－113.58～－114.27(m，2F)，－121.49(s，2F)，－122.46(s，2F)，－123.02(s，2F)，－125.80(td，J＝15.0，7.1Hz，2F).
应予说明，4－(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8－十三氟辛基)苯胺(化合物(17))是以4－硝基苯重氮四氟硼酸盐为原料按照Eur.J.Org.Chem.2001，p.1121－1128的方法由Heck反应衍生为偶联物后通过氢化而合成的。
化合物(17)：
1H NMR(500MHz，ACETONE-D6)δ＝7.06－6.93(m,2H)，6.69－6.56(m，2H)，2.82－2.74(m，2H)，2.53－2.32(m，2H).
19F NMR(471MHz，ACETONE-D6)δ－81.61(s，3F)，－114.91(s，2F)，－122.40(s，2F)，－123.37(s，2F)，－124.00(s，2F)，－126.71(s，2F).
另外，使用4－[(3－氯－1,1,2,2,3,3－六氟－丙基)－四氟－1,6－硫基]苯胺(化合物(19))(350mg，0.89mmol)代替4－(全氟辛基)苯胺，按照与制造例1同样的顺序得到Fmoc－Asp(SF4CF2CF2Cl)－OAll(化合物(20a))的粗产物。将该粗产物利用硅胶层析(乙酸乙酯/己烷＝1/10(容量比))进行纯化，由此得到纯化合物(20a)(321mg，0.45mmol，收率51％)。
化合物(20a)：
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝7.77(d，J＝8.3Hz，2H)，7.59(d，J＝7.1Hz，2H)，7.36(dt，J＝34.3，8.1Hz，8H)，5.90(m，J＝10.6，4.9Hz，1H)，5.79(d，J＝7.2Hz，1H)，5.31(m，2H)，4.74(m，3H)，4.41(s，2H)，4.23(t，J＝7.0Hz，1H)，3.43－3.20(m，2H).
19F NMR(376MHz，CDCl3)δ＝－80.6(s，3F)，－110.3(s，2F)，－125.9～－121.7(m，8F).
应予说明，4－[(3－氯－1,1,2,2,3,3－六氟－丙基)－四氟－1,6－硫基]苯胺(化合物(19))如下合成。
氮气氛下，将使4－(氯四氟－λ6－硫基)硝基苯(0.20mmol)和2,2’－偶氮双－2－甲基丁腈、2,2’－偶氮双－2,4－二甲基戊腈(ADVN)(10mol％)溶解于DCE(0.1M)的溶液在微波西林瓶(10mL)中搅拌后，冷却到0℃。接着，将四氟乙烯(TFE)通过鼓泡填充到该溶液(1.0个大气压)中。在油浴上以40℃搅拌72小时后，通过过滤除去不溶性固体，减压下蒸发滤液。将得到的粗产物利用快速硅胶柱层析(正己烷/EtOAc＝9/1(容量比))进行纯化，由此以无色晶体的形式得到4－(2－氯四氟乙基四氟－λ6－硫基)硝基苯(0.040g，收率55％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝8.33(d，J＝8.7Hz，2H)，8.00(d，J＝9.2Hz，2H).
13C NMR(100MHz，CDCl3)δ＝159.4(quint，J C－F＝21.9Hz)，149.2，127.7(quint，JC－F＝4.8Hz)，124.2，122.1(tt，J C－F＝303.4，35.6Hz)，121.3(ttquint，J C－F＝312.1，37.6，36.6Hz).
19F NMR(376MHz，CDCl3)δ＝48.0(m，4F)，－68.1(t，J＝10.7Hz，2F)，－90.7(m，2F).
在使4－(2－氯四氟乙基四氟－λ6－硫基)硝基苯(0.98mmol)溶解于乙醇(20mL)的溶液中加入铁(11当量)和饱和氯化铵水溶液(5mL)，在油浴上以80℃搅拌2小时。然后，通过硅藻土过滤除去不溶性固体，减压下蒸发滤液。使得到的粗产物溶解于乙酸乙酯并用水进行清洗，将水层用乙酸乙酯进行2次萃取后，将合并的有机萃取物利用硫酸钠进行干燥，减压下蒸发溶剂。将得到的粗产物通过快速硅胶柱层析(正己烷/EtOAc＝4/1(容量比))进行纯化，由此以浅黄色液体的形式得到所期望的化合物(19)(0.311g，收率95％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝7.55(d，J＝8.7Hz，2H)，6.58(d，J＝9.1Hz，2H)，3.97(br，2H)
19F NMR(376MHz，CDCl3)δ＝49.5(m，4F)，－67.9(t，J＝10.8Hz，2F)，－90.7(m，2F).
另外，使用4－(全氟癸基)苯胺(化合物(15))(611mg，1.0mmol)代替4－(全氟辛基)苯胺，按照与制造例1同样的顺序得到Fmoc－Asp(C10F21)－OAll(化合物(21))的粗产物。将该粗产物通过硅胶层析(乙酸乙酯/己烷＝1/10(容量比))进行纯化，由此得到纯化合物(21)(810mg，0.82mmol，收率82％)。
化合物(21)：
1H NMR(400MHz，ACETONE－D6)δ7.90－7.23(m，12H)，5.93－5.84(m，1H)，5.31(dd，J＝17.2，1.6Hz，1H)，5.13(d，J＝10.5Hz，1H)，4.73(t，J＝6.0Hz，1H)，4.61(d，J＝5.0Hz，2H)，4.36－4.19(m，3H)，3.11－3.05(m，2H).
19F NMR(376MHz，ACETONE－D6)δ－81.6(s，3F)，－110.2(t，J＝14.4Hz，2F)，－121.6－－123.1(m，14F)，－126.6(s，2F).
接着，利用与制造例1同样的方法进行化合物(14a)(1000mg，1.45mmol)的脱烯丙基化，得到Fmoc－Asp(C4F9)－OH(化合物(14b))(432mg，0.67mmol，收率46％)。
化合物(14b)：
1H NMR(400MHz，ACETONE－D6)δ＝9.8(s，1H)，8.0－7.8(m，2H)，7.6(m，2H)，7.3(dt，J＝42.4，7.1Hz，8H)，6.8(d，J＝8.2Hz，1H)，4.7－4.6(m，1H)，4.5－4.0(m，3H)，3.0－2.7(m，2H).
19F NMR(376MHz，ACETONE－D6)δ＝－81.8(s，3F)，－110.4(d，J＝9.5Hz，2F)，－123.2(s，2F)，－126.1(s，2F).
此外，利用与制造例1同样的方法进行化合物(16a)(1.8g，2.28mmol)的脱烯丙基化，得到Fmoc－Asp(C6F13)－OH(化合物(16b))(965mg，1.28mmol，收率56％)。
化合物(16b)：
1H NMR(400MHz，ACETONE－D6)δ＝10.0(s，1H)，8.0－7.8(m，4H)，7.3(d，J＝41.7，8H)，6.9(m，1H)，4.6(d，J＝7.0Hz，1H)，4.29－4.20(m，J＝27.4，6.7Hz，3H)，3.0－2.7(m，2H).
19F NMR(376MHz，ACETONE－D6)δ＝－81.6(s，3F)，－110.2(d，2F)，－121.9(s，2F)，－122.4(s，2F)，－123.3(s，2F)，－126.7(s，2F).
此外，利用与制造例1同样的方法进行化合物(18a)(654mg，0.80mmol)的脱烯丙基化，得到Fmoc－Asp(CH2CH2C6F13)－OH(化合物(18b))(597mg，0.77mmol，收率96％)。
化合物(18b)：
1H NMR(400MHz，ACETONE－D6)δ＝10.0(s，1H)，8.0－7.8(m，4H)，7.3(d，J＝41.7，8H)，6.9(m，1H)，4.6(d，J＝7.0Hz，1H)，4.29－4.20(m，J＝27.4，6.7Hz，3H).
19F NMR(376MHz，ACETONE－D6)δ＝－81.6(s，3F)，－110.2(d，2F)，－121.9(s，2F)，－122.4(s，2F)，－123.3(s，2F)，－126.7(s，2F).
此外，利用与制造例1同样的方法进行化合物(20a)(310mg，0.16mmol)的脱烯丙基化，得到Fmoc－Asp(SF4CF2CF2Cl)－OH(化合物(20b))(74.4mg，0.16mmol，收率32％)。
化合物(20b)：
1H NMR(400MHz，ACETONE－D6)δ＝10.0(s，1H)，8.0－7.8(m，4H)，7.3(d，J＝41.7，8H)，6.9(m，1H)，4.6(d，J＝7.0Hz，1H)，4.29－4.20(m，J＝27.4，6.7Hz，3H).
19F NMR(376MHz，ACETONE－D6)δ＝－81.6(s，3F)，－110.2(d，2F)，－121.9(s，2F)，－122.4(s，2F)，－123.3(s，2F)，－126.7(s，2F).
[制造例8]
含有RF基的氨基酸(Fmoc－Asp(CH2CH2C8F17)－OH：24b)的合成
使用3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,10,10,10－十七氟－1－癸胺(化合物(23))(3.79mg，8.08mmol)代替4－(全氟辛基)苯胺，按照与制造例1同样的顺序得到Fmoc－Asp(CH2CH2C8F17)－OAll(化合物(24a))的粗产物。将该粗产物利用硅胶层析(乙酸乙酯/己烷＝1/10(容量比))进行纯化，由此得到纯化合物(24a)(4.89mg，5.81mmol，收率72％)。
化合物(24a)：
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝7.75(d，J＝7.4Hz，2H)，7.62(d，J＝7.4Hz，2H)，7.60－7.50(m，4H)，7.45－7.30(m，4H)，5.97－5.73(m，1H)，5.28(m，2H)，4.77－4.57(m，3H)，4.52－4.29(m，2H)，4.22(t，J＝6.5Hz，1H)，3.17－2.95(m，2H).
19F NMR(376MHz，CDCl3)δ＝－80.86(s，3F)，－110.46(s，2F)，－122.65(s，2F)，－125.49(s，2F).
接着，利用与制造例1同样的方法进行化合物(24a)(2.61mg，3.11mmol)的脱烯丙基化，得到Fmoc－Asp(CH2CH2C8F17)－OH(化合物(24b))(1.33g，1.67mmol，收率54％)。
化合物(24b)：
1H NMR(400MHz，ACETONE－D6)δ＝7.83(d，J＝7.8Hz，2H)，7.68(d，J＝7.3Hz，2H)，7.38(t，J＝7.3Hz，2H)，7.31－7.27(m，2H)，6.73(d，J＝8.2Hz，1H)，4.56(dd，J＝14.4，5.7Hz，1H)，434－4.20(m，3H)，3.52(t，J＝6.4Hz，2H)，2.48(td，J＝19.4，7.2Hz，2H).
19F NMR(376MHz，ACETONE－D6)δ＝－81.5(t，J＝10.1Hz，3F)，－114.5(t，J＝17.3Hz，2F)，－122.1～－124.0(m，10F)，－126.6(s，2F).
[实施例1]
三肽H－Ala－Asp(C8F17)－Phe－NH2的合成
向固相合成用管中加入RINK酰胺树脂(39mg，0.025μmol)和DMF(2mL)，在室温下搅拌30分钟使树脂溶胀。接着，向该管中加入20％哌啶/DMF溶液(2mL)搅拌3分钟后，用DMF(2mL)清洗3次。再次加入20％哌啶/DMF溶液(2mL)搅拌12分钟，由此进行Fmoc基的脱保护。接着，加入Fmoc－Phe－OH(39mg，0.10mmol，4.0当量)、COMU(43mg，0.10mmol，4.0当量)、oxyma(14mg，0.10mmol，4.0当量)和DIPEA(26mg，0.20mmol，8.0当量)在室温下搅拌2小时，进行氨基酸的缩合反应。接下来，将反应物用DMF(2mL)清洗3次后，利用与上述同样的方法进行Fmoc的脱保护。对制造例1中合成的Fmoc－Asp(C8F17)－OH(84mg，0.10mmol，4.0当量)和Fmoc－Ala－OH(31mg，0.10mmol，4.0当量)进行同样的操作。作为后续处理，加入切割用切割液(TFA:三异丙基硅烷:水＝95:2.5:2.5(容量比))(2mL)在室温下搅拌2小时，由此进行从树脂上的切割，得到含有H－Ala－Asp(C8F17)－Phe－NH2的粗产物。将该粗产物进行真空干燥后，利用反相色谱(乙腈/水/TFA＝75:25:0.1～99:1:0.1(容量比))进行纯化，得到H－Ala－Asp(C8F17)－Phe－NH2(5mg，5μmol，收率20％)。
H－Ala－Asp(C8F17)－Phe－NH2：
1H NMR(500MHz，DMSO－D6)δ＝7.43－7.36(m，5H)，7.20－7.13(m，4H)，5.27(t，J＝7.2Hz，1H)，4.46(t，J＝7.4Hz，1H)，4.32(t，J＝7.2Hz，1H)，3.03－2.90(m，2H)，2.81－2.59(m，2H)，1.08(s，3H).
19F NMR(376MHz，DMSO－D6)δ＝－80.1(s，3F)，－108.8(s，2F)，－122.4～－121.0(m，9F)，－125.7(s，2F).
使ThermoFisher Scientific公司制的荧光物质Alexa Fluor(注册商标)647与所合成的具有十七氟辛基的三肽(H－Ala－Asp(C8F17)－Phe－NH2)的N末端键合。
向容量1.5mL的黑色管中加入溶解于干燥DMSO(20μL)的Alexa Fluor 647－NHS酯(0.2mg)、溶解于干燥DMSO(200μL)的H－Ala－Asp(C8F17)－Phe－NH2(4.0当量)和溶解于干燥DMSO(10μL)的DIPEA(3.0当量)。将该混合物在室温下持续搅拌过夜后，利用反相色谱(乙腈/水/TFA＝25:75:0.1～99:1:0.1)纯化，进行冷冻干燥，以蓝色固体的形式得到荧光缀合物1(利用荧光计进行计算，收率为33％)。应予说明，荧光使用Nano Drop(注册商标)分光光度计ND－1000在发光波长＝650nm处进行测定。
MALDI－TOF MS[M+4H]+：m/z计算值C66H71F17N7O17S4 1+1684.3512，实验值1684.5611
[实施例2]
三肽H－Ala－Asp(bis－C4F9)－Phe－NH2的合成
进行缩合的氨基酸使用制造例3中合成的Fmoc－Asp(bis－C4F9)－OH来代替Fmoc－Asp(C8F17)－OH，利用与实施例1同样的方法合成三肽，得到H－Ala－Asp(bis－C4F9)－Phe－NH2(13mg，15μmol，收率63％)。
H－Ala－Asp(bis－C4F9)－Phe－NH2：
LRMS(LC－MS)[M+H]+：m/z计算值C30H26F18N5O4 +862.17，实验值862.20
对于H－Ala－Asp(bis－C4F9)－Phe－NH2，利用与实施例1同样的方法进行与Alexa Fluor 647的键合，以蓝色固体的形式得到H－Ala－Asp(bis－C4F9)－Phe－NH2的荧光缀合物2(利用荧光计进行计算，收率为32％色素基准)。
MALDI－TOF MS[M+3H]： m/z 计算值 C66H69F18N7O17S41701.3345，实验值1701.8410
[实施例3]
三肽H－Ala－Asp(SF5)－Phe－NH2的合成
进行缩合的氨基酸使用制造例4中合成的Fmoc－Asp(SF5)－OH代替Fmoc－Asp(C8F17)－OH，利用与实施例1同样的方法合成三肽，得到H－Ala－Asp(SF5)－Phe－NH2(9.6mg，17μmol，收率70％)。
H－Ala－Asp(SF5)－Phe－NH2
LRMS(LC－MS)[M+H] +：m/z 计算值 C22H27F5N5O4S+ 552.17，实验值 552.23
[实施例4]
三肽H－Ala－Asp(tris－t－C4F5)－Phe－NH2的合成
进行缩合的氨基酸使用制造例5中合成的Fmoc－Asp(tris－t－C4F5)－OH代替Fmoc－Asp(C8F17)－OH，利用与实施例1同样的方法合成三肽，得到H－Ala－Asp(tris－t－C4F9)－Phe－NH2(10mg，5μmol，收率34％)。
H－Ala－Asp(tris－t－C4F9)－Phe－NH2：
LRMS(LC－MS)[M+H] +：m/z 计算值 C38H33F27N5O7 + 1184.19，实验值 1184.86
[实施例5]
三肽H－Ala－Asp(C4F9)－Phe－NH2、H－Ala－Asp(C6F13)－Phe－NH2、H－Ala－Asp(C10F21)－Phe－NH2、H－Ala－Asp(SF4CF2CF2Cl)－Phe－NH2的合成
进行缩合的氨基酸使用制造例7中合成的Fmoc－Asp(C4F9)－OH代替Fmoc－Asp(C8F17)－OH，利用与实施例1同样的方法合成三肽，得到H－Ala－Asp(C4F9)－Phe－NH2(2mg，3.1μmol，收率12％)。
H－Ala－Asp(C4F9)－Phe－NH2：
LRMS(LC－MS)[M+H] +：m/z 计算值 C26H33F9N5O4 + 644.19，实验值 644.16
另外，进行缩合的氨基酸使用制造例7中合成的Fmoc－Asp(C6F13)－OH代替Fmoc－Asp(C8F17)－OH，利用与实施例1同样的方法合成三肽，得到H－Ala－Asp(C6F13)－Phe－NH2(2.1mg，2.8μmol，收率11％)。
H－Ala－Asp(C6F13)－Phe－NH2：
LRMS(LC－MS)[M+H] +：m/z 计算值 C38H27F13N5O4 + 744.18，实验值 744.16
另外，进行缩合的氨基酸使用制造例7中合成的Fmoc－Asp(CH2CH2C6F13)－OH代替Fmoc－Asp(C8F17)－OH，利用与实施例1同样的方法合成三肽，得到H－Ala－Asp(CH2CH2C6F13)－Phe－NH2(5mg，6.4μmol，收率25％)。
H－Ala－Asp(CH2CH2C6F13)－Phe－NH2：
LRMS(LC－MS)[M+H] +：m/z 计算值 C30H31F13N5O4 + 772.72，实验值 772.36
另外，进行缩合的氨基酸使用Fmoc－Asp(C10F21)－OH代替Fmoc－Asp(C8F17)－OH，利用与实施例1同样的方法合成三肽，得到H－Ala－Asp(C10F21)－Phe－NH2(1.8mg，1.9μmol，收率8％)。应予说明，Fmoc－Asp(C10F21)－OH是将制造例7中合成的化合物(22a)利用与制造例1同样的方法进行脱烯丙基化反应而得到的。得到的产物不进行纯化而用于三肽合成。
H－Ala－Asp(C10F21)－Phe－NH2：
LRMS(LC－MS)[M+H] +：m/z 计算值 C38H27F13N5O4 + 943.16，实验值 943.27
另外，进行缩合的氨基酸使用制造例7中合成的Fmoc－Asp(SF4CF2CF2Cl)－OH代替Fmoc－Asp(C8F17)－OH，利用与实施例1同样的方法合成三肽，得到H－Ala－Asp(SF4CF2CF2Cl)－Phe－NH2(1.8mg，2.7μmol，收率11％)。
H－Ala－Asp(SF4CF2CF2Cl)－Phe－NH2：
LRMS(LC－MS)[M+H] +：m/z 计算值 C24H27ClF8N5O4S+ 668.13，实验值 668.14
对于H－Ala－Asp(C4F9)－Phe－NH2，利用与实施例1同样的方法进行与AlexaFluor 647的键合，以蓝色固体的形式得到H－Ala－Asp(C4F9)－Phe－NH2的荧光缀合物6(利用荧光计进行计算，收率为54％色素基准)。
MALDI－TOF MS[M+3H]： m/z 计算值 C66H69F18N7O17S41701.3345，实验值1701.8410
对于H－Ala－Asp(C6F13)－Phe－NH2，利用与实施例1同样的方法进行与AlexaFluor 647的键合，以蓝色固体的形式得到H－Ala－Asp(C6F13)－Phe－NH2的荧光缀合物7(利用荧光计进行计算，收率为50％色素基准)。
MALDI－TOF MS[M+3H]： m/z 计算值 C64H67F13N7O17S41583.3503，实验值1583.7450
对于H－Ala－Asp(CH2CH2C6F13)－Phe－NH2，利用与实施例1同样的方法进行与Alexa Fluor 647的键合，以蓝色固体的形式得到H－Ala－Asp(CH2CH2C6F13)－Phe－NH2的荧光缀合物12(利用荧光计进行计算，收率为96％色素基准)。
MALDI－TOF MS[M+4H]+：m/z计算值C66H75F13N7O17S4 +1612.3889，实验值1612.8993
另外，对于H－Ala－Asp(C10F21)－Phe－NH2，利用与实施例1同样的方法进行与Alexa Fluor 647的键合，以蓝色固体的形式得到H－Ala－Asp(C10F21)－Phe－NH2的荧光缀合物8(利用荧光计进行计算，收率为72％色素基准)。
MALDI－TOF MS[M+4H]：m/z 计算值 C68H71F21N7O17S4 1784.32，实验值 1784.56
另外，对于H－Ala－Asp(SF4CF2CF2Cl)－Phe－NH2，利用与实施例1同样的方法进行与Alexa Fluor 647的键合，以蓝色固体的形式得到H－Ala－Asp(SF4CF2CF2Cl)－Phe－NH2的荧光缀合物9(利用荧光计进行计算，收率为42％色素基准)。
MALDI－TOF MS[M+3H]：m/z计算值C60H71ClF8N7O17S5 +1508.3065，实验值1508.476
另外，对于H－Ala－Asp(tris－t－C4F9)－Phe－NH2，利用与实施例1同样的方法进行与Alexa Fluor 647的键合，以蓝色固体的形式得到H－Ala－Asp(tris－t－C4F9)－Phe－NH2的荧光缀合物10(利用荧光计进行计算，收率为89％色素基准)。
MALDI－TOF MS[M+3H]：m/z计算值C60H71ClF8N7O17S5 +1508.3065，实验值1508.476
[实施例6]
三肽H－Ala－Asp(CH2CH2C8F17)－Phe－NH2的合成
进行缩合的氨基酸使用制造例8中合成的Fmoc－Asp(CH2CH2C8F17)－OH代替Fmoc－Asp(C8F17)－OH，利用与实施例1同样的方法合成三肽，得到H－Ala－Asp(CH2CH2C8F17)－Phe－NH2(5mg，6.27μmol，收率25％)。
H－Ala－Asp(CH2CH2C8F17)－Phe－NH2：
LCMS(LC－MS)[M+H] +：m/z 计算值 C32H26F18N5O4 + 871.20，实验值 871.35
对于H－Ala－Asp(CH2CH2C8F17)－Phe－NH2，利用与实施例1同样的方法进行与Alexa Fluor 647的键合，以蓝色固体的形式得到H－Ala－Asp(CH2CH2C8F17)－Phe－NH2的荧光缀合物11(利用荧光计进行计算，收率为80％色素基准)。
MALDI－TOF MS[M+3H]：m/z 计算值 C66H69F18N7O17S4 1708.35，实验值 1708.82
[实施例7]
四肽H－Cys－Ala－Asp(C8F17)－Phe－NH2，H－Cys－Ala－Asp(C6F13)－Phe－NH2的合成
进行缩合的氨基酸使用Fmoc－Asp(C8F17)－OH，利用与实施例1同样的方法合成四肽，得到H－Cys－Ala－Asp(C8F17)－Phe－NH2(16mg，17μmol，收率22％)。
H－Cys－Ala－Asp(C8F17)－Phe－NH2：
LRMS(LC－MS)[M+H] +：m/z 计算值 C33H32F17N6O5S+ 947.69，实验值 947.54
另外，进行缩合的氨基酸使用制造例7中合成的Fmoc－Asp(C6F13)－OH代替Fmoc－Asp(C8F17)－OH，利用与实施例1同样的方法合成四肽，得到H－Cys－Ala－Asp(C6F13)－Phe－NH2(12mg，15μmol，收率57％)。
H－Cys－Ala－Asp(C6F13)－Phe－NH2：
LRMS(LC－MS)[M+H] +：m/z 计算值 C31H32F13N6O5S+ 847.67，实验值 847.54
[比较例1]
三肽H－Ala－Asp(C12H25)－Phe－NH2的合成
进行缩合的氨基酸使用制造例6中合成的不含氟原子的Fmoc－Asp(C12H25)－OH代替Fmoc－Asp(C8F17)－OH，利用与实施例1同样的方法合成三肽，得到H－Ala－Asp(C12H25)－Phe－NH2(7.1mg，11μmol，收率48％)。
H－Ala－Asp(C12H25)－Phe－NH2：
1H－NMR(500MHz，DMSO－D6)δ9.86(s，1H)，7.04(m，4H)，4.52(m，1H)，4.34(m，1H)，4.09(m，1H)，2.89－3.05(m，2H)，2.65－2.81(m，2H)，1.23―1.98(m，28H).
对于H－Ala－Asp(C12H25)－Phe－NH2，利用与实施例1同样的方法进行与AlexaFluor 647的键合，以蓝色固体的形式得到H－Ala－Asp(C12H25)－Phe－NH2的荧光缀合物3(利用荧光计进行计算，收率为23％色素基准)。
MALDI－TOF MS[M+4H]+：m/z 计算值 C70H96N7O17S4 + 1434，5740，实验值1434.1390
[比较例2]
合成具有十七氟辛基的二肽(Boc－RFAA(C8)－Phe－OMe)。
在干燥的容量300mL的三口茄形瓶中对2－((叔丁氧基羰基)氨基)－3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,10,10,10－十七氟十二烷酸(994.4mg，1.68mmol)、DCM(99mL)、苯丙氨酸甲酯盐酸盐(1.84mmol)和oxyma(1.84mmol)进行混合搅拌。将反应混合物冷却到0℃，加入COMU(1.84mmol)和DIPEA(3.69mmol)，在室温下搅拌20.5小时。然后，将该反应混合物用HCl(1N)淬灭，用DCM萃取3次。将合并的有机相减压浓缩后，用乙酸乙酯稀释，用HCl(1N)、饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水进行清洗。将清洗后的有机相用硫酸钠干燥、过滤后，进行减压浓缩而得到Boc－RFAA(C8)－Phe－OMe的粗产物。将该粗产物利用硅胶层析(乙酸乙酯/己烷＝1/4(容量比))进行纯化，得到Boc－[(R)－RFAA(C8)]－Phe－OMe(非对映异构体A)(383.3mg，0.508mmol)、和Boc－[(S)－RFAA(C8)]－Phe－OMe(非对映异构体B)(417.1mg，0.553mmol)的合计807.3mg(1.07mmol，收率63.8％)。
这里，使用非对映异构体B的晶体，通过X射线结构分析将所含有的RFAA(C8)的立体构型确定为(S)型。X射线结构分析使用Rigaku制VariMax DualSaturn。
Boc－[(R)－RFAA(C8)]－Phe－OMe(非对映异构体A)：
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ＝7.30－7.25(m，3H)，7.07－7.05(m，2H)，6.40(d，1H)，5.46(m，1H)，5.00－4.87(m，2H)，3.77(s，3H)，3.20－3.11(m，2H)，1.47(s，9H).
19F NMR(470MHz，CDCl3)δ＝－80.86(t，3F)，－114.89(d，J＝281Hz，1F)，－119.11(d，J＝279Hz，1F)，－120.40～－123.10(m，10F)，－126.23(m，2F).
Boc－RFAA(C8)－Phe－OMe
Boc－[(S)－RFAA(C8)]－Phe－OMe(非对映异构体B)：
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ＝7.28－7.26(m，3H)，7.10－7.04(m，2H)，6.35(d，1H)，5.48(m，1H)，5.00－4.87(m，2H)，3.74(s，3H)，3.15－3.13(m，2H)，1.47(s，9H).
19F NMR(470MHz，CDCl3)－80.86(t，3F)，－114.21(d，J＝275Hz，1F)，－118.78(d，J＝279Hz，1F)，－120.35～－123.00(m，10F)，－126.23(m，2F).
对所合成的肽的N末端侧的保护基进行脱保护，得到H－RFAA(C8)－Phe－OMe。
向容量50mL的双口烧瓶中放入搅拌子，加入Boc－[(R)－RFAA(C8)]－Phe－OMe(非对映异构体A)(0.508mmol)和DCM(17mL)。该将反应混合物冷却到0℃后，添加TFA(3.4mL)，升温到室温。搅拌1.5小时后，添加碳酸氢钠水溶液而结束反应。将水相用DCM萃取，减压馏去合并的有机相，得到脱保护体H－[(R)－RFAA(C8)]－Phe－OMe的粗产物。将该粗产物利用硅胶层析(乙酸乙酯/己烷＝2/5(容量比))进行纯化，由此得到H－[(R)－RFAA(C8)]－Phe－OMe(非对映异构体A)(0.393mmol，收率67.7％)。
H－[(R)－RFAA(C8)]－Phe－OMe(非对映异构体A)
1H NMR(500MHz，ACETONE－D6)δ＝7.95(br，1H)，7.30－7.22(m，5H)，4.82－4.77(m，1H)，4.40－4.25(m，1H)，3.67(s，3H)，3.20－3.07(m，2H).
19F NMR(470MHz，ACETONE－D6)δ＝－80.86(t，3F)，－115.00(d，J＝277Hz，1F)，－117.20(d，J＝275Hz，1F)，－120.00～－122.70(m，10F)，－125.95(s，2F).
对Boc－[(S)－RFAA(C8)]－Phe－OMe(非对映异构体B)(98.7μmol)利用同样的方法进行脱保护，得到H－[(S)－RFAA(C8)]－Phe－OMe(非对映异构体B)(60.1μmol，收率60.8％)。
H－[(S)－RFAA(C8)]－Phe－OMe(非对映异构体B)：
1H NMR(500MHz，ACETONE－D6)δ＝7.31－7.19(m，5H)，4.82－4.79(m，1H)，4.70－4.64(m，1H)，3.72(s，3H)，3.22－3.06(m，2H).
19F NMR(470MHz，ACETONE－D6)δ＝－80.86(t，3F)，－114.76(d，J＝267Hz，1F)，－117.31(d，J＝275Hz，1F)，－120.00～－122.70(m，10F)，－125.94(s，2F).
接下来，合成具有十七氟辛基的三肽(Boc－Ala－RFAA(C8)－Phe－OMe)。
在容量25mL的双口圆底烧瓶内使二肽(H－[(R)－RFAA(C8)]－Phe－OMe)(0.24mmol)、Boc－Ala－OH(1.2当量)和oxyma(1.2当量)溶解于DCM(3.4mL)，并进行搅拌。将反应混合物冷却到0℃，加入COMU(1.2当量)和DIPEA(1.2当量)，达到室温并搅拌24小时。然后，将反应混合物用HCl(1N)淬灭，用DCM萃取3次。将合并的有机相减压浓缩后，用乙酸乙酯稀释，用HCl(1N)、饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水清洗。将清洗后的有机相用硫酸钠干燥、过滤后，进行减压浓缩而得到Boc－Ala－[(R)－RFAA(C8)]－Phe－OMe的粗产物。将粗产物溶解于DCM后，用己烷再沉淀，进行过滤，由此得到纯Boc－Ala－[(R)－RFAA(C8)]－Phe－OMe(0.20mmol，收率85.4％)。
Boc－Ala－[(R)－RFAA(C8)]－Phe－OMe(非对映异构体A)：
1H NMR(500MHz，ACETONE－D6)δ＝8.29(br，1H)，7.72(br，1H)，7.28－7.17(m，5H)，6.38(br，1H)，5.67－5.60(m，1H)，4.80－4.76(m，1H)，4.23－4.18(m，1H)，3.67(s，3H)，3.20－3.00(m，2H)，1.43(s，9H)1.30(t，3H).
19F NMR(470MHz，ACETONE－D6)δ＝－80.86(t，3F)，－114.57(d，J＝282Hz，1F)，－119.31(d，J＝281Hz，1F)，－120.00～－122.70(m，10F)，－125.96(m，2F).
对H－[(S)－RFAA(C8)]－Phe－OMe(非对映异构体B)(46.1μmol)利用同样的方法进行与Boc－Ala－OH的缩合，得到Boc－Ala－[(S)－RFAA(C8)]－Phe－OMe(非对映异构体B)(45.7μmol，收率99％)。
Boc－Ala－[(S)－RFAA(C8)]－Phe－OMe(非对映异构体B)：
1H NMR(500MHz，ACETONE－D6)δ＝8.33(br，1H)，7.85(br，1H)，7.30－7.22(m，5H)，6.30(br，1H)，5.63－5.53(m，1H)，4.72－4.67(m，1H)，4.32－4.25(m，1H)，3.66(s，3H)，3.18－3.02(m，2H)，1.40(s，9H)1.32(d，3H).
19F NMR(470MHz，ACETONE－D6)δ＝－80.86(t，3F)，－114.50(d，J＝287Hz，1F)，－118.77(d，J＝277Hz，1F)，－120.75～－122.53(m，10F)，－125.93(m，2F).
对所合成的肽的N末端侧的保护基进行脱保护，得到H－Ala－[(R)－RFAA(C8)]－Phe－OMe。
向容量20mL的双口烧瓶中放入搅拌子，另一方面加入Boc－Ala－[(R)－RFAA(C8)]－Phe－OMe(非对映异构体A)(0.194mmol)和DCM(5mL)。该将反应混合物冷却到0℃后，添加TFA(1mL)，升温到室温，搅拌2小时。然后，添加碳酸氢钠水溶液结束反应。将该反应混合物的水相用DCM萃取，减压馏去合并的有机相，得到脱保护体H－Ala－[(R)－RFAA(C8)]－Phe－OMe的粗产物。将该粗产物利用硅胶层析(氯仿/甲醇＝15/1(容量比))进行纯化，得到H－Ala－[(R)－RFAA(C8)]－Phe－OMe(非对映异构体A)(0.147mmol，收率75.6％)。
H－Ala－[(R)－RFAA(C8)]－Phe－OMe(非对映异构体A)：
1H NMR(500MHz，ACETONE－D6)δ＝8.30，8.20(m，NH)，7.28－7.19(m，5H)，6.38(br，1H)，5.68－5.53(m，1H)，4.79－4.76(m，1H)，3.97－3.47(m，1H)，3.67(s，3H)，1.26，1.17(s，3H).
19F NMR(470MHz，ACETONE－D6)δ＝－80.86(t，3F)，－114.50(d，J＝282Hz，1F)，－119.48(d，J＝281Hz，1F)，－120.40～－122.65(m，10F)，－125.92(m，2F).
对Boc－Ala－[(S)－RFAA(C8)]－Phe－OMe(非对映异构体B)(45.7μmol)利用同样的方法进行脱保护，得到H－Ala－[(S)－RFAA(C8)]－Phe－OMe(非对映异构体B)(21.1μmol，收率46.2％)。
H－Ala－[(S)－RFAA(C8)]－Phe－OMe(非对映异构体B)：
1H NMR(500MHz，ACETONE－D6)δ＝8.38，8.21(m，NH)，7.31－7.21(m，5H)，5.59－5.54(m，1H)，4.76－4.72(m，1H)，4.06－3.97(m，1H)，3.67(s，3H)，3.20－3.04(m，2H)，1.19，1.17(s，3H).
19F NMR(470MHz，ACETONE－D6)δ＝－80.86(t，3F)，－114.82(d，J＝282Hz，1F)，－118.68(d，J＝284Hz，1F)，－120.80～－122.70(m，10F)，－125.98(m，2F).
使荧光物质Alexa Fluor 647与所合成的脱保护后的三肽(H－Ala－[(R)－RFAA(C8)]－Phe－OMe)的N末端键合。
向容量1.5mL的黑色管中加入溶解于干燥DMSO(175μL)的Alexa Fluor 647－NHS酯(1.75mg)、溶解于干燥DMSO(50μL)的H－Ala－RFAA(C8)－Phe－OMe(3.0当量)、溶解于干燥DMSO(71μL)的DIPEA(3.0当量)和干燥DMSO 124μL。将混合物在室温下持续搅拌过夜。将该混合物利用反相色谱(乙腈/水/TFA＝25:75:0.1～99:1:0.1)纯化，进行冷冻干燥以蓝色固体的形式得到荧光缀合物4(利用荧光计进行计算，收率为52.0％)。应予说明，荧光使用Nano Drop(注册商标)分光光度计ND－1000在发光波长＝650nm处进行测定。
MALDI－TOF MS
[M+2]－：m/z计算值C59H63F17N5O17S4－1564.2825，实验值1564.3501
对H－Ala－[(S)－RFAA(C8)]－Phe－OMe(非对映异构体B)(1.241μmol)利用同样的方法进行与Alexa Fluor TM 647的键合，以蓝色固体的形式得到H－Ala－[(S)－RFAA(C8)]－Phe－OMe(非对映异构体B)的荧光缀合物5(利用荧光计进行计算，收率为54.3％色素基准)。
MALDI－TOF MS
[M+4]+：m/z计算值C59H65F17N5O17S4+1566.3935，实验值1566.3679
[试验例1]
肽荧光缀合物1、4、5和荧光色素1的比较
对实施例1中合成的肽荧光缀合物1(Alexa－Ala－Asp(C8F17)－Phe－NH2)、比较例2中合成的肽荧光缀合物4(Alexa－Ala－[(R)－RFAA(C8)]－Phe－OMe)和肽荧光缀合物5(Alexa－Ala－[(S)－RFAA(C8)]－Phe－OMe)以及荧光物质Alexa Fluor 647的二乙基酰胺体(荧光色素1)调查向细胞内的摄取效率。
(样品溶液的制备)
将合成的肽荧光缀合物1、4、5和荧光色素1的DMSO溶液使用DMEM低葡萄糖培养液稀释为浓度1.5μM，并调整成所含有的DMSO浓度为0.15％，将由此得到的溶液作为细胞膜透过性试验用样品溶液。
(细胞膜透过性的评价)
HeLa细胞在肽处理的24小时前接种于96孔细胞培养板(0.5×105细胞/孔)。
在37℃下将24小时前培养的HeLa细胞的培养基更换为肽荧光缀合物1、4、5和荧光色素1的样品溶液，对在37℃下培养1小时后的细胞膜透过性进行评价。各规定时间的培养后，用PBS(磷酸生理食盐水)进行3次细胞表面的清洗，用Trypsin－EDTA0.05％(Gibco公司制)剥离细胞进行回收。将回收的细胞利用流式细胞仪(guava easyCyte(商标)8)测定检测导入于肽荧光缀合物的荧光色素(Alexa Fluor 647)的红色2荧光(661/15nm)而进行分析。将样品溶液中以37℃培养1小时的细胞的基于流式细胞仪的分析结果示于图1。纵轴为细胞数(count)，横轴为各细胞的荧光强度。另外，将对各样品的平均荧光强度(MFI)进行比较的结果示于图2。应予说明，各图中，将肽荧光缀合物标记为PFCJ，将荧光色素标记为FD。
如图1所示，对于在37℃下1小时孵育后的细胞的Alexa Fluor 647的荧光强度，在用侧链具有氟烷基的肽荧光缀合物1、4和5处理过的细胞中，均比用荧光色素1处理过的细胞高。如图2所示，细胞的Alexa Fluor647的荧光强度的平均值与用荧光色素1处理过的细胞相比，在用肽主链的α碳直接键合有氟烷基的肽荧光缀合物4和肽荧光缀合物5处理过的细胞中为几倍左右，与此相对，用天冬氨酸的侧链的羧基介由肽键和亚苯基导入了氟烷基的肽荧光缀合物1处理过的细胞中为几十倍～几百倍。根据这些结果，可知侧链具有氟烷基的肽与市售的细胞膜透过性肽、荧光色素相比，向细胞内的摄取效率较高，细胞膜透过性优异，特别是，与肽主链的α碳键合的侧链本身为氟烷基的肽相比，在α碳介由连接基团连接有氟烷基的肽的细胞膜透过性优异。
[试验例2]
肽荧光缀合物1、2、TAT－Alexa、荧光色素1的比较
对实施例1中合成的肽荧光缀合物1(Alexa－Ala－Asp(C8F17)－Phe－NH2)、实施例2中合成的肽荧光缀合物2(Alexa－Ala－Asp(bis－C4F9)－Phe－NH2)、荧光物质AlexaFluor 647的二乙基酰胺体(荧光色素1)、以及在市售的细胞膜透过性肽ANASpec公司制Cys－TAT(47－57)(H－Cys－Tyr－Gly－Arg－Lys－Lys－Arg－Arg－Gln－Arg－Arg－Arg－NH2)的末端Cys附加有荧光物质Alexa Fluor 647C2 Maleimide的物质(TAT－Alexa)调查向细胞内的摄取效率。
使用与试验例1同样制备的肽荧光缀合物1、2、TAT－Alexa、荧光色素1的样品溶液，按照与试验例1同样的顺序利用流式细胞仪测定红色2荧光(661/15nm)而进行分析。
将在样品溶液中以37℃培养1小时的细胞的基于流式细胞仪的分析结果示于图3。另外，将对各样品的平均荧光强度(MFI)进行比较的结果示于图4。各图中，将肽荧光缀合物标记为PFCJ，将荧光色素标记为FD。
如图3所示，对于在37℃下孵育1小时后的细胞的Alexa Fluor 647的荧光强度，在用侧链介由连接基团连接有氟烷基的肽荧光缀合物1、2处理过的细胞中，均比用荧光色素1、TAT－Alexa处理过的细胞高。如图4所示，可知细胞的Alexa Fluor 647的荧光强度的平均值与用荧光色素1处理过的细胞相比，用TAT－Alexa处理过的细胞约为2倍左右，与此相对，用肽荧光缀合物1和2处理过的细胞高达几十倍～几百倍。根据这些结果，可知侧链介由连接基团连接有氟烷基的肽与市售的细胞膜透过性肽、荧光色素相比，向细胞内的摄取效率较高，细胞膜透过性优异。
[试验例3]
肽荧光缀合物1、3、荧光色素1的比较(在不存在血清下、存在血清下的比较)
对实施例1中合成的侧链含有氟原子的肽荧光缀合物1(Alexa－Ala－Asp(C8F17)－Phe－NH2)、比较例1中合成的侧链不含有氟原子的肽荧光缀合物3(Alexa－Ala－Asp(C12H25)－Phe－NH2)和荧光色素1调查向细胞内的摄取效率。
这里，作为更接近生物体内的条件，也制备了放入胎牛血清(FBS)的样品而进行实施。
(不存在FBS下的细胞膜透过试验)
使用与试验例1同样制备的肽荧光缀合物1、肽荧光缀合物3、荧光色素1的样品溶液，按照与试验例1同样的顺序利用流式细胞仪测定红色2荧光(661/15nm)进行分析。
将对于在样品溶液中以37℃培养1小时的细胞的基于流式细胞仪的分析结果比较各样品的平均荧光强度(MFI)的结果示于图5。各图中，将肽荧光缀合物标记为PFCJ，将荧光色素标记为FD。
(加入了FBS的样品溶液的制备)
使用含有FBS10％的DMEM低葡萄糖培养液(含有10％FBS和1％青霉素－链霉素溶液的DMEM低葡萄糖培养基)将合成的肽荧光缀合物1、肽荧光缀合物3和荧光色素1的DMSO溶液稀释为浓度1.5μM，将由此得到的溶液作为FBS存在下的细胞膜透过性试验用样品溶液。
(FBS存在下的细胞膜透过试验)
使用与试验例1同样制备的肽荧光缀合物1、肽荧光缀合物3、荧光色素1的样品溶液，并在样品溶液中放入FBS，除此以外，按照与试验例1同样的顺序利用流式细胞仪测定红色2荧光(661/15nm)进行分析。
将对于在放入FBS的样品溶液中以37℃培养1小时的细胞的基于流式细胞仪的分析结果比较各样品的平均荧光强度(MFI)的结果示于图6。各图中，将肽荧光缀合物标记为PFCJ，将荧光色素标记为FD。
如图5所示，在37℃下孵育1小时后的细胞的Alexa Fluor 647的平均荧光强度(MFI)在使用不存在FBS下的细胞的试验中，与用侧链含有氟原子的肽荧光缀合物1处理过的细胞相比，用侧链不含有氟原子的肽荧光缀合物3处理过的细胞较高。与此相对，在使用存在FBS下的细胞的试验中，如图6所示，侧链含有氟原子的肽荧光缀合物1的MFI值较高。
根据这些结果，可知本发明的含氟肽在更接近生物体内的条件下显示出较高的细胞膜透过性。
[试验例4]
肽荧光缀合物1～3、6、7、9、10和荧光色素1的比较
对实施例1中合成的肽荧光缀合物1(Alexa－Ala－Asp(C8F17)－Phe－NH2)、实施例2中合成的肽荧光缀合物2(Alexa－Ala－Asp(bis－C4F9)－Phe－NH2)、实施例5中合成的肽荧光缀合物6(Alexa－Ala－Asp(C4F9)－Phe－NH2)、实施例5中合成的肽荧光缀合物9(Alexa－Ala－Asp(SF4CF2CF2Cl)－Phe－NH2)、实施例5中合成的肽荧光缀合物7(Alexa－Ala－Asp(C6F13)－Phe－NH2)、实施例5中合成的肽荧光缀合物10(Alexa－Ala－Asp(tris－t－C4F9)－Phe－NH2)、比较例1中合成的侧链不含有氟原子的肽荧光缀合物3(Alexa－Ala－Asp(C12H25)－Phe－NH2)、荧光物质Alexa Fluor 647的二乙基酰胺体(荧光色素1)调查向细胞内的摄取效率。
使用与试验例1同样制备的肽荧光缀合物1～3、6、7、9、10、荧光色素1的样品溶液，按照与试验例1同样的顺序利用流式细胞仪测定红色2荧光(661/15nm)进行分析。
将在样品溶液中以37℃培养1小时的细胞的基于流式细胞仪的分析结果示于图7。另外，将对以荧光色素1为基准的各样品的相对荧光强度(RFI)进行比较的结果示于图8。各图中，将肽荧光缀合物标记为PFCJ，将荧光色素标记为FD。
如图7和8所示，在用肽荧光缀合物处理过的细胞中，与用荧光色素1处理过的细胞相比，细胞的Alexa Fluor 647的荧光强度的平均值较高。另外，可知导入至肽中的氟烷基的链长越长，荧光强度的平均值越高，存在细胞膜透过性越高的趋势。
[试验例5]
肽荧光缀合物1～3、6、7、9和10的粒径的比较
使用与试验例4同样制备的肽荧光缀合物1～3、6、7、9和10的样品溶液，利用动态光散射法测定粒径。
在纯水中调整成肽缀合物为1.5μM，向石英皿中放入12μL肽缀合物，使用动态光散射装置DLS(Zeta sizerμV 60mW 830nm laser)测定37℃下的粒径，求出粒度分布。将各肽荧光缀合物的平均粒径(个数基准分布的平均直径)的分析结果示于图9。各图中，将肽荧光缀合物标记为PFCJ，将荧光色素标记为FD。
将图8和图9进行比较时，可知导入至肽中的氟烷基的链长越长，存在平均粒径越小的趋势。特别是细胞膜透过性优异的肽荧光缀合物1的平均粒径为6nm左右，非常小。虽然氟烷基的链长影响平均粒径的理由尚不明确，但推测链长越长，氟烷基彼此的凝聚力越强，因该凝聚力而使肽荧光缀合物整体的粒径变小。
[试验例6]
肽荧光缀合物1、8、11和荧光色素1的比较
对实施例1中合成的肽荧光缀合物1(Alexa－Ala－Asp(C8F17)－Phe－NH2)、实施例5中合成的肽荧光缀合物8(Alexa－Ala－Asp(C10F21)－Phe－NH2)、实施例6中合成的肽荧光缀合物11(Alexa－Ala－Asp(CH2CH2C8F17)－Phe－NH2)和荧光物质Alexa Fluor 647的二乙基酰胺体(荧光色素1)调查向细胞内的摄取效率。
使用与试验例1同样制备的肽荧光缀合物1、8、11和荧光色素1的样品溶液，按照与试验例1同样的顺序利用流式细胞仪测定红色2荧光(661/15nm)进行分析。
将在样品溶液中以37℃培养1小时的细胞的基于流式细胞仪的分析结果示于图10。另外，将对各样品的平均荧光强度(MFI)进行比较的结果示于图11。各图中，将肽荧光缀合物标记为PFCJ，将荧光色素标记为FD。
如图10和11所示，在用肽荧光缀合物处理过的细胞中，与用荧光色素1处理过的细胞相比，细胞的Alexa Fluor 647的荧光强度的平均值较高。另外，可知导入至肽中的氟烷基的链长越长，荧光强度的平均值越高，存在细胞膜透过性越高的趋势。
[试验例7]
肽荧光缀合物1、12、和荧光色素1的比较
对于实施例1中合成的肽荧光缀合物1(Alexa－Ala－Asp(C8F17)－Phe－NH2)、实施例5中合成的肽荧光缀合物12(Alexa－Ala－Asp(CH2CH2C6F13)－Phe－NH2)、和荧光物质Alexa Fluor 647的二乙基酰胺体(荧光色素1)，调查向细胞内的摄取效率。
使用与试验例1同样制备的肽荧光缀合物1、12、或荧光色素1的样品溶液，按照与试验例1同样的顺序利用流式细胞仪测定红色2荧光(661/15nm)进行分析。
将对各样品的平均荧光强度(MFI)进行比较的结果示于图12。各图中，将肽荧光缀合物标记为PFCJ，将荧光色素标记为FD。
如图12所示，对于在37℃下孵育1小时后的细胞的Alexa Fluor 647的荧光强度，在用侧链介由连接基团连接有氟烷基的肽荧光缀合物1或12处理过的细胞中，均比用荧光色素1处理过的细胞高。具体而言，可知用肽荧光缀合物12处理过的细胞的Alexa Fluor647的荧光强度的平均值与用荧光色素1处理过的细胞相比高14倍左右。根据这些结果，可知侧链介由连接基团连接有氟烷基的肽与荧光色素相比，向细胞内的摄取效率较高，细胞膜透过性优异。
产业上的可利用性
本发明提供一种具有侧链含有氟原子的氨基酸残基的肽。本发明的含氟肽由于细胞膜透过性优异，因此可期待例如作为将药效成分向靶细胞导入的载体等生理活性物质应用于医药领域。
Claims (12)
1.一种肽，是2个以上的氨基酸通过肽键键合而成的肽，
构成该肽的氨基酸残基的至少1个的侧链为下述通式(1)，
式(1)中，Z1为二、三或四价的除亚烷基以外的连接基团；Rf为由至少2个氟原子取代的C1－30烷基、－SF5、或者－SF4－CR101R102－CR103R104Cl，其中，该C1－30烷基在碳原子为2个以上的情况下可以在碳原子间具有1～5个醚键性氧原子，R101、R102、R103和R104各自独立地为氢原子、氟原子或氯原子，R101、R102、R103和R104中的2个以上为氟原子；n3为1、2或3，黑色圆点表示键合位点。
2.根据权利要求1所述的肽，其中，所述Rf为下述通式(f－1)或(f－2)表示的基团，
式(f－1)和(f－2)中，RfP表示含有至少2个以上的氟原子的完全卤化C1－10烷基，其中，该C1－10烷基在碳原子为2个以上的情况下可以在碳原子间具有醚键性氧原子，n1为0～10的整数，n2为0～9的整数，黑色圆点表示键合位点。
3.根据权利要求1或2所述的肽，其中，所述Z1为具有环基的连接基团。
4.根据权利要求3所述的肽，其中，所述环基具有1,4－亚苯基或1,3,5取代苯基。
5.根据权利要求1或2所述的肽，其中，所述Z1为不具有环基的连接基团。
6.根据权利要求1或2所述的肽，其中，所述Z1为亚烷基、－O－、－S－、－NH－、－N(CH3)－、－N(C2H5)－、－N(C3H7)－、三价氮原子、－C(＝O)－、－S(＝O)2－、亚环烷基、二价～四价的芳基、二价～四价的杂芳基、或者它们的组合，其中，不包括仅由亚烷基构成的基团。
7.根据权利要求1或2所述的肽，其中，所述Z1为－C(＝O)－、－C(＝O)－O－、－O－C(＝O)－、－NH－C(＝O)－O－、－O－C(＝O)－NH－、－C(＝O)－NH－、－NH－C(＝O)－、－S－S－、－S(＝O)2－NH－、－NH－S(＝O)2－、－S(＝O)2－NH－S(＝O)2－、－C(＝O)－NH－Ph－、或者它们中的任一基团与C1－6亚烷基的组合，其中，－Ph－为1,4－亚苯基、1,3－亚苯基、1,5－亚苯基、或者1,3,5取代苯基。
8.根据权利要求1或2所述的肽，其中，所述Z1为下述通式(2)表示的连接基团，
式(2)中，Z2为二、三或四价的除亚烷基以外的连接基团；Rh为氢原子或C1－6烷基，黑色圆点表示键合位点。
9.根据权利要求1或2所述的肽，其中，所述通式(1)表示的基团为侧链的氨基酸残基是在天然氨基酸的侧链上直接或间接地连接有1～3个所述Rf的氨基酸残基。
10.根据权利要求1或2所述的肽，其中，C末端或N末端可以由保护基保护。
11.根据权利要求1或2所述的肽，其为下述通式(11)表示的三肽，
式(11)中，Rf和n3与所述通式(1)中的Rf和n3相同；Z2为二、三或四价的除亚烷基以外的连接基团；Rh为氢原子或C1－6烷基；R11和R12各自独立地为C1－6烷基或苄基；X为9－芴基甲氧基羰基或叔丁氧基羰基；Z为C1－6烷氧基、羟基或氨基。
12.根据权利要求1或2所述的肽，其具有细胞膜透过性。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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