FR2864830A1 - Procede de synthese sur support solide de composes peptidiques, notamment de composes peptidiques comportant un residu arginine - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un procédé de synthèse en phase solide sur une résine de composés de formule générale (I) suivante :dans laquelle Z représente notamment un atome d'hydrogène, ou un groupe fluorogénique ou chromogénique, m et p sont notamment égaux à 0, n représente un nombre entier de 1 à 5, R1 et R3 représentent notamment H, R2 représente notamment un enchaînement d'aminoacides naturels ou non, A représente N ou NH, sous réserve que lorsque A représente N, a représente une double liaison et b représente une simple liaison, et lorsque A représente NH, a représente une simple liaison et b représente une double liaison, et lorsque A représente N, B représente un groupe S-R4, dans lequel R4 représente notamment un groupe alkyle, et lorsque A représente NH, B représente notamment un atome de soufre.
Description
(I) a
B/b ''''''NH-(CHZ)p-RI PROCÉDÉ DE SYNTHÈSE SUR SUPPORT SOLIDE DE COMPOSÉS PEPTIDIQUES, NOTAMMENT DE COMPOSÉS PEPTIDIQUES COMPORTANT UN RÉSIDU ARGININE La présente invention concerne un procédé de synthèse sur support solide de composés peptidiques, notamment de composés peptidiques ou pseudopeptidiques comportant un résidu arginine ou un dérivé d'arginine, un résidu thiocitrulline ou S-alkyl-isothiocitrulline. La présente invention concerne également l'application de ce procédé à la préparation d'inhibiteurs de l'oxyde nitrique synthase (NOS) et à la synthèse de substrats fluorogéniques ou chromogéniques comportant une arginine en position C-terminale.
L'un des éléments clés de la synthèse en phase solide est le mode d'attachement au support solide du premier élément de la molécule en construction. Ceci est généralement assuré par des groupements chimiques bifonctionnels (ou "linkers") dont l'une des fonctions est liée de façon permanente au support solide et l'autre, à la molécule en construction, laquelle fonction fait alors office de groupement protecteur temporaire dont le clivage final libère la molécule synthétisée du support solide. De nombreux groupements "linkers" ont été décrits dans la littérature, permettant l'attachement de la molécule en construction par la plupart des fonctions chimiques. En synthèse peptidique sur support solide, la première brique de construction (un oc-amino acide) est généralement attachée au support solide par l'intermédiaire de sa fonction acarboxylique, soit sous la forme d'un ester (réaction avec la fonction alcool d'un "linker" approprié), soit sous la forme d'une liaison amide (réaction avec la fonction amine d'un autre type de "linker"). Cependant, il est parfois intéressant, en fonction de la nature du composé à synthétiser (par exemple, pour la synthèse de cyclopeptides "N-to-C" ou lorsque la fonction a-carboxylique C-terminale est bloquée par un groupement particulier, fluorophore, chromophore, etc...), d'accrocher le premier résidu par l'intermédiaire d'une fonction chimique présente sur sa chaîne latérale. La plupart des fonctions chimiques rencontrées dans les amino acides peuvent être greffées directement sur les résines disponibles sans recours à un "linker" supplémentaire. C'est bien sur le cas des fonctions (3- et y- carboxyliques des acides aspartique et glutamique qui peuvent être greffées de la même façon que la fonction a-carboxylique d'un a- amino acide. C'est aussi le cas des fonctions amine (lysine), alcool (sérine) et phénol (tyrosine). L'attachement de l'arginine par sa fonction guanidine a déjà été décrit mais nécessite cependant la préparation multi-étapes d'un "linker" supplémentaire, bifonctionnel, liant la fonction guanidine au "linker" déjà présent sur la résine, et l'attachement de l'arginine à ce second "linker". Les "linkers" répertoriés à ce jour sont tous de nature arène-sulfonyle et sont donc dérivés des groupements protecteurs de fonction guanidine habituellement utilisés (tosyle, Mtr, Pbf, par exemple). Un premier rapport par Zhong et al. (1997) décrit la préparation et l'utilisation d'un tel "linker". Cependant, l'attachement du groupement guanidine nécessite des conditions drastiques (4 N KOH à 75 C pendant 2 jours) qui sont incompatibles avec la présence de certains groupements chimiques (par exemple, protection Fmoc de la fonction a-amine, ester de la fonction a-carboxylique). D'autre part, le clivage final est réalisé à l'aide d'acide fluorhydrique (HF), ce qui limite l'utilisation d'une telle méthode en chimie combinatoire. Edwards et al. (2000) ont décrit un "linker" voisin basé sur le groupement protecteur Mtr sur lequel est greffée une fonction carboxylique permettant l'attachement à une résine (voir également Furlong et al., 2002). Le clivage final est effectué cette fois à l'aide d'un cocktail à base de TFA. Cependant, le principal désavantage de cette méthode est le faible rendement (20%) obtenu lors du greffage du groupement guanidine sur le "linker". Ceci est particulièrement défavorable au niveau coût si le dérivé d'arginine greffé a un prix de revient important (par exemple, s'il porte un groupement de type AMC). Enfin, Garcia et al. (2003) ont développé un "linker" dérivé de façon équivalente d'un groupement protecteur de type Pmc, clivable par le TFA, dont la synthèse est réalisée en six étapes. L'incorporation du dérivé d'arginine sur la résine modifiée par le "linker nécessite l'utilisation d'un large excès (5 équivalents).
Ainsi, les méthodes actuelles utilisées pour la synthèse sur support solide de dérivés comportant un résidu arginine comprend la synthèse multi-étapes d'un "linker" supplémentaire, par l'intermédiaire duquel la molécule synthétisée est fixée au niveau de sa chaîne latérale.
La présente invention a pour but de fournir un nouveau procédé sur support solide de synthèse de composés comportant un résidu arginine, qui évite la synthèse multi- étapes d'un "linker" supplémentaire.
La présente invention a pour but de fournir un nouveau procédé sur support solide de synthèse de composés comportant un résidu arginine en utilisant la fixation directe de dérivés isothiocyanate sur la fonction amine de résines commerciales, ce qui présente de nombreux avantages par rapport aux stratégies proposées à ce jour.
La présente invention concerne un procédé de synthèse en phase solide sur une résine de composés de formule générale (I) suivante: a B /b \NH-(CH2) p-RI dans laquelle: Z représente l'un des groupes suivants: É un atome d'hydrogène, É un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, un groupe arylalkyle comprenant de 6 à 30 atomes de carbone, un groupe arylallyle comprenant de 6 à 30 atomes de carbone, un groupe aryle comprenant de 6 à 30 atomes de carbone, un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, un groupe fluorogénique ou chromogénique, É un groupe COORa, CORa ou CSRa, Ra représentant un atome d'hydrogène, ou un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, un groupe arylalkyle comprenant de 6 à 30 atomes de carbone, un groupe arylallyle comprenant de 6 à 30 atomes de carbone, un groupe aryle comprenant de 6 à 30 atomes de carbone, (I) un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, un groupe fluorogénique ou chromogénique, un groupe acyle, Ra pouvant également représenter, lorsque Z représente un groupe CORa ou CSRa, un résidu d'amino acide ou un peptide, un groupe halogéno-alkyle, notamment perfluoroalkyle de 1 à 3 atomes de carbone, un groupe N(Rb)R, ou N(ORb)Rc, dans lequel Rb est un atome d'hydrogène, un groupe alkyle comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, linéaire ou ramifié, un groupe allyle, un groupe arylalkyle, arylallyle ou aryle comprenant de 6 à 30 atomes de carbone, un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, ou un groupe halogéno-alkyle tel que défini ci-dessus, et R, est un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, un;groupe allyle, un groupe arylalkyle, arylallyle ou aryle comprenant de 6 à 30 atomes de carbone, un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, É un groupe CH(ORe)Rd, Rd représentant un atome d'hydrogène, un groupe alkyle comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, un groupe arylalkyle, arylallyle ou aryle comprenant de 6 à 30 atomes de carbone, ou un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, ou un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, ou un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, ou un groupe halogéno-alkyle, notamment perfluoroalkyle de 1 à 3 atomes de carbone, ou un groupe acyle, Re représentant un atome d'hydrogène, un groupe alkyle comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, un groupe arylalkyle, arylallyle ou aryle comprenant de 6 à 30 atomes de carbone, un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, un groupe acyle, É un groupe N(Rg)Rf, Rf répondant à la définition donnée précédemment pour Rd, et Rg répondant à la définition donnée précédemment pour Re, É un groupe NHOH ou N(OR;)Rh, Rh et R; répondant à la définition donnée précédemment pour Re, É un groupe ORS, Ri répondant à la définition donnée précédemment pour Rej É un groupe SRk, Rk répondant à la définition donnée précédemment pour Re, É un groupe -NH-CO-N(RX)Ry ou -NH-CS-N(RX)Ry, RX et Ry, identiques ou différents, représentant H, un groupe alkyle de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe aryle ou alkylaryle comprenant de 5 à 30 atomes de carbone, 6 2864830 - m est égal à 0, ou représente un nombre entier de 1 à 4, - n représente un nombre entier de 1 à 5, - p est égal à 0, ou représente un nombre entier de 1 à 5, RI représente H, ou un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, de 1 à 5 atomes de carbone, - R3 représente H, ou un groupe alkyle de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, un groupe arylalkyle, arylallyle ou aryle comprenant de 5 à 30 atomes de carbone, un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, - R2 représente É un atome d'hydrogène, un groupe alkyle de 1 à 12 atomes de carbone, ou un groupe allyle, ou É un groupe aryle, arylalkyle, arylallyle comprenant de 5 à 30 atomes de 20 carbone, ou É un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, ou É un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, É un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, É un groupe acyle, ou É un aminoacide naturel ou non, ou É un enchaînement d'aminoacides naturels ou non de formule X-AAZ...-AAI, 30 z représentant le nombre d'aminoacides dans ledit enchaînement et étant un nombre entier de 2 à environ 40, X représentant soit un atome d'hydrogène, soit un groupement protecteur orthogonal des fonctions amines clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine, soit un groupe alkyle de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, soit un groupe aryle, arylalkyle ou arylallyle comprenant de 5 à 30 atomes de carbone, soit un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, soit un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, soit un groupe acyle, ou É un groupe R1-NHCO-, RI-NHCSou R1-NH-, RI répondant à la définition 1 o donnée précédemment pour Re, R2 et R3 pouvant former avec l'atome d'azote auquel ils sont liés une structure hétérocyclique, de nature aromatique ou non, A représente N ou NH, sous réserve que: lorsque A représente N, a représente une double liaison et b représente une simple liaison, et lorsque A représente NH, a représente une simple liaison et b représente une double liaison, lorsque A représente N, B représente un groupe S-R4, dans lequel R4 représente: É un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, ou un groupe arylalkyle, arylallyle ou aryle comprenant de 5 à 30 25 atomes de carbone, ou É un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, ou É un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, É un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant 30 de 5 à 12 atomes, É un groupe acyle, ou É un groupe R'4S, R'4 répondant à la définition donnée précédemment pour Re, lorsque A représente NH, B représente l'un des groupes suivants: É un atome de soufre, É un atome d'oxygène, É un groupe NR5, R5 représentant l'un des groupes suivants: un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, un groupe arylalkyle ou arylallyle comprenant de 6 à 30 atomes de carbone, un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, un groupe OR6, R6 répondant à la définition donnée précédemment pour Rc, un groupe NHR6 ou N(R'6)R6, R6 étant tel que défini ci-dessus et pouvant également être un groupe acyle, et R'6 répondant à la définition donnée précédemment pour R6, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend: * une étape de liaison d'un composé de formule générale (II) suivante:
S
dans laquelle: Z' représente: É un atome d'hydrogène, É un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, un groupe arylalkyle, arylallyle ou aryle comprenant de 6 15 20 25 30 à 30 atomes de carbone, un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, un groupe fluorogénique ou chromo génique, ou un groupe COOR'a, COR'a ou CSR'a, R'a représentant un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, un groupe arylalkyle, arylallyle ou aryle comprenant de 6 à 30 atomes de carbone, ou un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, un groupe fluorogénique ou chromogénique, un groupe acyle, R'a pouvant également représenter, lorsque Z' représente un groupe COR'a ou CSR'a, un résidu d'amino acide ou un peptide, un groupe halogéno-alkyle, notamment perfluoroalkyle de 1 à 3 atomes de carbone, un groupe N(R'b)R'c ou N(OR'b)R'c, dans lequel R'b est un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, un groupe arylalkyle, arylallyle ou aryle comprenant de 5 à 30 atomes de carbone, un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, ou un groupe halogéno-alkyle tel que défini ci-dessus, et R'b représente également un groupement protecteur des fonctions alcools clivable par le même réactif que celui utilisé pour le clivage final de la résine, ou un groupement protecteur orthogonal des fonctions alcools clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine, R'c répondant à la définition donnée précédemment pour Rc, et, lorsque Z' représente un groupe COOR'a, R'a peut également représenter un groupement protecteur des fonctions carboxyliques clivable par le même réactif que celui utilisé pour le clivage final de la résine, ou un groupement protecteur orthogonal des fonctions carboxyliques clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine, É un groupe CH(OR'e)R'd, R'd répondant à la définition donnée précédemment pour Rd, R'e représentant un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, un groupe arylalkyle, arylallyle ou aryle comprenant de 5 à 30 atomes de carbone, ou un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant de 3 à 7 atomes de carbone, ou un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, ou un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, ou un groupe acyle, ou un groupement protecteur des fonctions alcools clivable par le même réactif que celui utilisé pour le clivage final de la résine, ou un groupement protecteur orthogonal des fonctions alcools clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine, É un groupe N(R'g)R'f, R'f répondant à la définition donnée précédemment pour Rf, R'g représentant un atome d'hydrogène, ou 10 un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, un groupe arylalkyle, arylallyle ou aryle comprenant de 6 à 30 atomes de carbone, ou un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, ou un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, ou un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, ou un groupement protecteur des fonctions amines clivable par le même réactif que celui utilisé pour le clivage final de la résine, ou un groupement protecteur orthogonal des fonctions amines clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine, sous réserve que le groupe N(R'g)R'f soit différent de NH2, É un groupe N(OR';)R'h, R'h répondant à la définition donnée précédemment pour Rh et pouvant également représenter un groupement protecteur des fonctions amines clivable par le même réactif que celui utilisé pour le clivage final de la résine, ou un groupement protecteur orthogonal des fonctions amines clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine, et R'; répondant à la définition donnée précédemment pour R; et étant différent d'un atome d'hydrogène, et pouvant également représenter un groupement protecteur des fonctions alcools clivable par le même réactif que celui utilisé pour le clivage final de la résine, ou un groupement protecteur orthogonal des fonctions alcools clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine, É un groupe OR'j, R'i représentant 30. un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, un groupe arylalkyle, arylallyle ou aryle comprenant de 5 à 30 atomes de carbone, ou un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, ou un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, un groupe acyle, ou un groupement protecteur des fonctions alcools clivable par le même réactif que celui utilisé pour le clivage final de la résine, ou un groupement protecteur orthogonal des fonctions alcools clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine, É un groupe SR'k, R'k représentant un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, un groupe arylalkyle, arylallyle ou aryle comprenant de 5 à 30 atomes de carbone, ou un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, ou un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, un hétéro aryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, un groupe acyle, ou un groupement protecteur des fonctions thiols clivable par le même réactif que celui utilisé pour le clivage final de la résine, ou un groupement protecteur orthogonal des fonctions thiols clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine, un groupe -NH-CO-N(R'X)R'y ou -NH-CS-N(R'X)R'y, R'X et R'y, identiques ou différents, répondant à la définition donnée précédemment pour RX et Ry, R3, m et n sont tels que définis ci-dessus, R'2 représente É un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, un groupe arylalkyle, arylallyle ou aryle comprenant de 5 à 30 atomes de carbone, ou É un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, ou É un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, É un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant 10 de 5 à 12 atomes, É un groupe acyle, ou É un groupement protecteur des fonctions amines clivable par le même réactif que celui utilisé pour le clivage final de la résine, ou un groupement protecteur orthogonal des fonctions amines clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine, R'2 et R3 pouvant former avec l'atome d'azote auquel ils sont liés une structure hétérocyclique, de nature aromatique ou non, sur une résine porteuse de fonctions amines de formule NH-(CH2)p-RI, dans laquelle p et RI sont tels que définis ci-dessus, ce qui conduit à l'obtention d'une résine de formule (III) suivante: z' R3 (1) m R' N CH (CH2) \NH (III) S N/(CH2)P-Ri résine dans laquelle Z', R'2, R3, m, n, p et RI sont tels que définis ci-dessus, * le cas échéant, déprotection de la fonction amine par clivage de R'2, lorsque R'2 représente un groupement protecteur des fonctions amines clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine, et acylation de la fonction amine ainsi libérée par un dérivé carboxylique, ou synthèse peptidique selon les protocoles classiques en phase solide, ce qui conduit à l'obtention d'une résine de formule (III-1) suivante: Z' (ÎH2)m RZ N CH (cH2) (III-1)
N NH
SC.'N/(CHZ)p -RI résine correspondant à une résine de formule (III) susmentionnée dans laquelle R'2 est remplacé par R2 qui représente un aminoacide naturel ou non, ou un enchaînement d'aminoacides naturels ou non de formule X-AAZ...-AAI, tels que définis ci-dessus, * le cas échéant, lorsque Z' représente une fonction carboxylique, une fonction amine, une fonction alcool ou une fonction thiol, protégée par un groupement protecteur, respectivement des fonctions carboxyliques, amines, alcools et thiols, clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine, déprotection de la susdite fonction carboxylique, amine, alcool ou thiol par clivage dudit groupement protecteur, et réaction de cette fonction carboxylique, amine, alcool ou thiol déprotégée avec un réactif déterminé, ce qui conduit â l'obtention d'une résine de formule (III-2) suivante:
Z
(ÎH2)m N CH (CH2)
NH
S,CN(CH2)p-RI résine R'2 30 10 2864830 correspondant à une résine de formule (III) susmentionnée dans laquelle Z' est remplacé par Z, Z et R'2 étant tels que définis ci-dessus, * la résine de formule (III) obtenue précédemment étant ensuite: ** soit clivée à l'aide d'un réactif approprié, ce qui conduit à l'obtention de composés de formule (IV) suivante:
Z
Î3 1 (CH2) m RZ N CH (CH2)
NNH
S N / (CH2)p -R,
H
dans laquelle Z, R2, R3, m, n, p et RI sont tels que définis ci-dessus, ** soit traitée avec un halogénure d'alkyle, de préférence un iodure d'alkyle, de formule R4-Hal, dans laquelle Hal représente un atome d'halogène, et est de préférence un atome d'iode, et R4 est tel que défini ci-dessus, ce qui conduit à l'obtention d'une résine de formule (V) suivante: Z' CH2 I m
RN--
( CH2} \N R s j-,, N/(CH2)p-R1 résine dans laquelle Z', R2, R3, R4, m, n, p et RI sont tels que définis ci-dessus, 10 * la résine de formule (V) obtenue précédemment étant ensuite: ** soit clivée à l'aide d'un réactif approprié, ce qui conduit à l'obtention de composés de formule (VI) suivante:
Z
R (CH2) m RZ N CH (CH2) )\j R SN/(CH2)p-RI 4 H dans laquelle Z, R2, R3, R4, nj, n, p, et R1 sont tels que définis ci-dessus, ** soit, lorsque R4 représente un groupe méthyle, traitée par chauffage avec de l'acétate d'ammonium, ce qui conduit à l'obtention d'une résine de formule Z' R2 N CH (CH2)n \NH HN N/(CH2)p-RI résine dans laquelle Z', R2, R3, m, n, p et RI sont tels que définis ci-dessus, la résine de formule (VII) obtenue précédemment étant ensuite clivée à l'aide d'un réactif approprié, ce qui conduit à l'obtention de composés de formule (VIII) suivante:
Z (OH) I m
(VII) suivante: RZ N CH (VIII) (CH2) \NH HNN(CH2)p-RI
H (VII)
dans laquelle Z, R2, R3, m, n, p et RI sont tels que définis ci-dessus, ** soit, lorsque R4 représente un groupe méthyle, traitée par chauffage avec un composé de formule R'5-NH2, R'5 représentant: un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, un groupe arylalkyle ou arylallyle comprenant de 6 à 30 atomes de carbone, ou un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, ou un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, un groupe OR"6, dans lequel R"6 répond à la définition donnée précédemment pour R6 ou peut également représenter un groupement protecteur des fonctions alcools clivable par le même réactif que celui utilisé pour le clivage final de la résine, ou un groupe NH-R'"6 ou N(R'6) -R"'6, dans lequel R'6 est tel que défini ci-dessus et R'6 répond à la définition donnée précédemment pour R6 ou peut également représenter un groupement protecteur des fonctions amines clivable par le même réactif que celui utilisé pour le clivage final de la résine, ce qui conduit à l'obtention d'une résine de formule (IX) suivante: RZ N CH (CH2) \NH (CH2)P -RI R'S N i résine dans laquelle Z', R2, R3, m, n, p, R'5 et RI sont tels que définis ci-dessus, la résine de formule (IX) obtenue précédemment étant ensuite clivée à l'aide d'un réactif approprié, ce qui conduit à l'obtention de composés de formule (X) suivante: z (CH2) % n, RZ N i H (X) (CH2) NNH RS N N CH2)P-R1 H dans laquelle Z, R2, R3, m, n, p, R1 et R5 sont tels que définis ci-dessus.
Par "hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes", on désigne un hétérocycle saturé ou insaturé, substitué ou non, de 3 à 8 atomes dans lequel un à trois atomes du cycle sont des hétéroatomes tels que N, O, ou S, les autres atomes étant C. L'hétérocycloalkyle peut représenter par exemple la pyrrolidine, la pipéridine, la morpholine, la pipérazine, le tétrahydropyranyle ou la thiomorpholine.
Par "hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes" un hétéroaryle, monocyclique ou bicyclique, substitué ou non, de 5 à 12 atomes contenant un à quatre hétéroatomes telsque N, O, S, le reste étant des atomes de carbone. Un tel hétéroacyle peut notamment correspondre à l'un des groupes suivants: pyridyle, pyrrolyle, imidazolyle, thiényle, furanyle, indolyle, quinolyle, pyrimidine, oxazole, oxadiazole, triazole, quinoline, isoquinoline ou thiazolyle.
L'expression "groupe fluorogénique" désigne un groupement fluorophore, c'est-à- dire un groupement chimique qui fluoresce (émet une lumière visible d'une longueur d'onde donnée, généralement verte) quand il est excité par une lumière UV ou visible d'une longueur d'onde donnée. Lorsque le fluorophore contient une fonction amine, il peut être attaché à un segment peptidique par lien amide entre cette fonction amine et le groupe carboxylique a du résidu C-terminal de ce segment peptidique. Le composé résultant peut être utilisé comme substrat fluorogénique d'une peptidase ou d'une protéase donnée. Ainsi attaché, le fluorophore présente habituellement des maxima d'absorption plus courts, et, s'il est encore fluorescent, un spectre d'émission à de plus courtes longueurs d'onde. L'action d'une peptidase ou d'une protéase libère le fluorophore, restaurant sa fluorescence. Comme exemples de groupements fluorogéniques, on peut citer: la 7-amino-4-méthylcoumarine (AMC), la 7-amino-4trifluorométhylcoumarine (AFC), la rhodamine 110, les dérivés de [3- et anaphtylamine.
L'expression "groupe chromogénique" désigne un groupement chromophore, c'est-à-dire un groupement chimique qui présente une forte absorbance dans la lumière visible ou la lumière UV à une longueur d'onde maximale (1max) donnée. Lorsque le chromophore contient une fonction amine, il peut être attaché à un segment peptidique par lien amide entre cette fonction amine et le groupe carboxylique a du résidu C- terminal de ce segment peptidique. Le composé résultant peut être utilisé comme substrat chromogénique d'une peptidase ou d'une protéase donnée. Ainsi attaché, le chromophore présente habituellement un spectre d'absorption différent de celui de la forme libre. L'action d'une peptidase ou d'une protéase libère le chromophore, restaurant son spectre d'absorption caractéristique. Comme exemples de groupements chromogéniques, on peut citer la para-nitroaniline (pNA) ou le para- nitrophénol.
Dans le cadre de la présente invention, l'expression "groupe acyle" correspond à un groupe de la forme RCO comprenant de 2 à 30 atomes de carbone, R représentant de préférence un groupe alkyle comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe aryle comprenant de 6 à 30 atomes de carbone, un groupe arylalkyle comprenant de 6 à 30 atomes de carbone ou un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone.
Selon un mode de réalisation avantageux de la présente invention, dans le composé de formule (I), lorsque Z représente un groupe N(Rg)Rf, Rf peut représenter un résidu d'acide ou un peptide et est alors fixé sur l'atome N;par l'intermédiaire de la fonction acyle de l'amino acide ou du peptide.
Selon un mode de réalisation avantageux de la présente invention, dans le composé de formule (I), lorsque Z représente un groupe N(OR;)Rh, Rh peut représenter un résidu d'acide ou un peptide et est alors fixé sur l'atome N par l'intermédiaire de la fonction acyle de l'amino acide ou du peptide.
Selon un mode de réalisation avantageux, lorsque R2 représente un enchaînement d'aminoacides tel que défini ci-dessus, X peut représenter un groupement protecteur orthogonal des fonctions amines clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine tel qu'un groupement Fmoc, benzyloxycarbonyle (Cbz ou Z), dans le cas d'une résine clivable par une solution concentrée de TFA.
Selon un mode de réalisation avantageux, R2 peut être lié à z pour former une structure cyclique: notamment, lorsque Z représente un groupe CORa, CO est lié par une liaison peptidique à la fonction amine de AAZ lorsque R2 représente un enchaînement d'aminoacides tel que défini ci-dessus.
Selon un mode de réalisation avantageux, lorsque, dans la formule (I), p est égal à 0, A représente N et B représente un groupe S-R4, alors RI et R4 peuvent être confondus et forment un lien carboné saturé ou insaturé, substitué ou non, composé de 2 à 4 atomes de carbone, entre S et NH, composant alors un hétérocycle de 5 à 7 atomes. Un tel composé répond à la formule (2') suivante: z R (CH) 2 m 1 I2
R-N-CH
SN /NH R4 Selon un mode de réalisation avantageux, lorsque, dans la formule (I), p représente 0, A représente NH et B représente N-R5i alors RI et R5 peuvent être confondus et forment un lien carboné saturé ou insaturé, substitué ou non, composé de 2 à 4 atomes de carbone, entre N et NH, composant alors un hétérocycle de 5 à 7 atomes. Un tel composé répond à la formule (3') suivante: (CH2)
NH
N NH R5 Selon un mode de réalisation avantageux, lorsque, dans la formule (I), p représente 0, A représente NH et B représente un groupe N-R5 dans lequel R5 représente un groupe O-R6, alors RI et R6 peuvent être confondus et forment un lien carboné saturé ou insaturé, substitué ou non, composé de 1 à 3 atomes de carbone, entre N-O et NH, (2') (3') 21 2864830 composant alors un hétérocycle de 5 à 7 atomes. Un tel composé répond à la formule (4') suivante: z (CH2)m
H
Ri N- i H (4') (CH2) \NH N''NH O-R6 Selon un mode de réalisation avantageux, lorsque, dans la formule (I), p représente 0, A représente NH et B représente un groupe N-R5 dans lequel R5 représente un groupe NH-R6, alors RI et R6 peuvent être confondus et forment un lien carboné saturé ou insaturé, substitué ou non, composé de 1 à 3 atomes de carbone, entre N-NH et NH, composant alors un hétérocycle de 5 à 7 atomes. Un tel composé répond à la formule (5') suivante: z
N NH 1 / N-R6
H (5') Les composés de formule (II) tels que mentionnés ci-dessus sont des dérivés isothiocyanates.
L'expression "groupement protecteur des fonctions alcools clivable par le même réactif que celui utilisé pour le clivage final de la résine" désigne par exemple un groupe tert-butyle ou trityle, dans le cas d'une résine clivable par une solution concentrée de TFA ou un groupe benzyle dans le cas d'une résine clivable par HF.
L'expression "groupement protecteur orthogonal des fonctions alcools clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine" désigne par exemple un groupe benzyle ou acétyle, dans le cas d'une résine clivable par une solution concentrée de TFA.
L'expression "groupement protecteur des fonctions carboxyliques clivable par le même réactif que celui utilisé pour le clivage final de la résine" désigne par exemple un 22 2864830 groupe tert-butyle, dans le cas d'une résine clivable par une solution concentrée de TFA, ou un groupe benzyle dans le cas d'une résine clivable par HF.
L'expression "groupement protecteur orthogonal des fonctions carboxyliques clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine" désigne par exemple un groupe allyle, méthyle, éthyle, fluorénylméthyle ou benzyle, dans le cas d'une résine clivable par une solution concentrée de TFA.
L'expression "groupement protecteur des fonctions amines clivable par le même réactif que celui utilisé pour le clivage final de la résine" désigne par exemple un groupe tert-butyloxycarbonyle (t-Boc) ou 4-méthyl- trityle (Mtt), dans le cas d'une résine clivable par une solution concentrée de TFA, ou un groupe benzyloxycarbonyle (Cbz = Z) ou 2chlorobenzyloxycarbonyle (2-Cl-Cbz = 2-Cl-Z), dans le cas d'une résine clivable par HF.
L'expression "groupement protecteur orthogonal des fonctions amines clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine" désigne par exemple un groupe fluorénylméthyloxycarbonyle (Fmoc), allyloxycarbonyle (alloc), 4- méthyl-trityle (Mtt), 1-(4,4-diméthyl-2,6-dioxocyclohex-l-ylidène)éthyle (Dde), trifluoroacétyle (Tfa) ou benzyloxycarbonyle (Cbz = Z), dans le cas d'une résine clivable par une solution concentrée de TFA.
L'expression "groupement protecteur des fonctions thiols clivable par le même réactif que celui utilisé pour le clivage final de la résine" désigne par exemple un groupe trityle ou tert-butyle, dans le cas d'une résine clivable par une solution concentrée de TFA, ou un groupe paraméthylbenzyle ou paraméthoxybenzyle, dans le cas d'une résine clivable par HF.
L'expression "groupement protecteur orthogonal des fonctions thiols clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine" désigne par exemple un groupe para-méthylbénzyle, paraméthoxybenzyle, tert-butyl-thio, trityle ou acétamidométhyle, dans le cas d'une résine clivable par une solution concentrée de TFA, ou un groupe trityle, tert-butyl-thio ou acétamidométhyle, dans le cas d'une résine clivable par HF.
Dans la résine de formule (II), R'2 est égal à R2 ou représente un groupement protecteur tel que défini ci-dessus, et Z' est égal à Z ou représente un groupe tel que défini ci-dessus comprenant un groupement protecteur soit des fonctions amines, alcools, thiols ou carboxyliques.
De même, dans la résine de formule (III), R'2 est égal à R2 ou représente un groupement protecteur des fonctions amines tel que défini ci-dessus, et Z' est égal à z ou représente un groupe tel que défini ci-dessus comprenant un groupement protecteur soit des fonctions amines, alcools, thiols ou carboxyliques.
Lorsque R'2 est égal à R2 et lorsque Z' est égal à z dans la résine de formule (III), l'étape pour obtenir le composé de formule (IV) correspond donc uniquement au clivage de la résine, soit par une solution concentrée de TFA, soit par HF.
Lorsque R'2 représente un groupe protecteur des fonctions amines clivable par le même réactif que celui utilisé pour le clivage final de la résine, l'étape d'obtention du w composé de formule (IV) correspond donc à la fois au clivage de la résine mais également à la déprotection de R'2 par le réactif utilisé, notamment l'acide trifluoroacétique (TFA) ou l'acide fluorhydrique (HF). La définition du substituant R'2 correspond donc alors à celle de R2.
Lorsque Z' représente un groupe comprenant un groupement protecteur des fonctions carboxyliques, amines, alcools ou thiols, clivable par le même réactif que celui utilisé pour le clivage final de la résine, l'étape d'obtention du composé de formule (IV) correspond donc à la fois au clivage de la résine mais également à la déprotection de Z' par le réactif utilisé, notamment l'acide trifluoroacétique (TFA) ou l'acide fluorhydrique (HF). La définition du substituant Z' correspond donc alors à celle de Z. Lorsque R'2 représente un groupement protecteur des fonctions amines clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine, une étape supplémentaire est nécessaire avant l'étape de clivage susmentionnée, cette étape supplémentaire correspondant à la déprotection de R'2. On obtient alors une résine de formule (III-1) qui correspond à une résine de formule (III) dans laquelle R'2 a été remplacé par R2.
Lorsque Z' représente un groupe comprenant un groupement protecteur des fonctions carboxyliques, amines, alcools ou thiols, clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine, une étape supplémentaire est nécessaire avant l'étape de clivage susmentionnée, cette étape supplémentaire correspondant à la déprotection de Z'. On obtient alors une résine de formule (III-2) qui correspond à une résine de formule (III) dans laquelle Z' a été remplacé par Z. Les composés de formule (IV) susmentionnés correspondent à des composés de formule (I), dans laquelle a est une liaison simple, b est une double liaison, A représente NH et B représente S. Ces composés sont des composés dérivés de thiourée.
Selon un mode de réalisation avantageux, les composés de formule (III) peuvent également être traités avec un composé R4-Hal afin d'obtenir la résine de formule (V) qui après clivage conduit à l'obtention de composés de formule (VI). Les composés de formule (VI) sont des composés de formule (I), dans laquelle a représente une double liaison, b représente une liaison simple, A représente N et B représente un groupe SR4, R4 étant tel que défini ci-dessus. Les composés de formule (VI) sont des dérivés de Salkyle-isothiourée.
Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention, dans la résine de formule (III), lorsque Z' = Z, R'2 R2, p = G et R1 = H, la résiné de formule (III) peut être traitée par un dihalogénure d'alkyle de formule R4Hal2, R4 étant un groupe linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, composé de 2 à 12 atomes de carbone, les deux halogénures étant espacés d'au moins 2 atomes de carbone, ce qui conduit à l'obtention d'une résine de formule (V) dans laquelle R1 et R4 sont confondus et forment un lien entre S et N, composant alors un hétérocycle de 5 à 7 atomes. Ce cas particulier correspond au schéma suivant: z z /1 / H2)m '3 ( H2 lm ( Rz N CH RZ N CH) (CH2) R4Ha12 - (CH2 NH \N C sue\)
S
IH R4 résine résine Selon un mode de réalisation avantageux, un composé de formule (V), dans laquelle R4 représente un groupe méthyle, peut également être traité par chauffage avec de l'acétate d'ammonium afin d'obtenir la résine de formule (VII) qui après clivage conduit à l'obtention d'un composé de formule (VIII). Les composés de formule (VIII) sont des composés de formule (I), dans laquelle a représente une liaison simple, b représente une double liaison, et A et B représentent NH. Les composés de formule (VIII) sont des dérivés de guanidine.
Lorsqu'un composé de formule (V), dans laquelle R4 représente un groupe méthyle, est chauffé avec un composé de formule R'5-NH2, on obtient un composé de 2864830 formule (IX), qui, après clivage, conduit à l'obtention d'un composé de formule (X). Les composés de formule (X) sont des composés de formule (I), dans laquelle a est une simple liaison, b est une double liaison, A représente NH et B représente N-R5. Les composés de formule (X) sont des dérivés de guanidine.
Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention, lorsque dans la résine de structure (V), R4 représente un groupe méthyle, Z' = Z, p = 0 et RI = H, la résine (V) peut être traitée par un halogénure d'alkylamine protégée de formule R7-NHR'5-Hal, dans lequel R'5 représente un groupe alkyle linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, composé de 2 à 12 atomes de carbone, l'halogénure et l'amine étant espacés d'au moins 2 atomes de carbone, et R7 représente un groupement protecteur des fonctions amines clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine, ce qui conduit à l'obtention d'une résine d'e formule (V) dans laquelle RI représente R7-NH-R'5; l'élimination du groupement protecteur R7 conduit à une résine de formule (V) dans laquelle Ri représente H2N-R'5; le traitement par chauffage de cette résine conduit à une résine de formule (IX) dans laquelle RI et R'5 sont confondus et forment un lien carboné saturé ou insaturé, substitué ou non, composé de 2 à 4 atomes de carbone, entre N et N, composant alors un hétérocycle de 5 à 7 atomes.
Ce cas particulier correspond au schéma suivant: z z (CH2)m ( H2)m RN CH R7NH-R'5-Hal RN CH i (CH2) (CH2) \N \N déprotection z z (CH2)m R-2---N CH (CH2) \NH N\/-'-/N résine R' s 25 30 R'S NH-R7 Me S i NH Me S N résine résine RN CH (CH2) N Me SNRs NHZ résine chauffage 26 2864830 Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention, lorsque dans la résine de structure (V), R4 représente un groupe méthyle, Z' = Z, p = 0 et RI = H, la résine (V) peut être traitée par un halogénure d'O-alkylhydroxylamine protégée de formule R7-NHO-R6- Hal, dans lequel R6 représente un groupe alkyle linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, composé de 2 à 12 atomes de carbone, l'halogénure et l'oxygène étant espacés d'au moins 1 atome de carbone, et R7 représente un groupement protecteur des fonctions amines clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine, ce qui conduit à l'obtention d'une résine de formule (V) dans laquelle RI représente R7-NHO-R6; l'élimination du groupement protecteur R7 conduit à une résine de formule (V) dans laquelle RI représente H2NO-R6; le traitement par chauffage de cette résine conduit à une résine de formule (IX) dans laquelle RI et R'5 sont confondus et forment un lien carboné saturé ou insaturé, substitué ou non, composé de 1 à 3 atomes de carbone, entre NO et N, composant alors un hétérocycle de 5 à 7 atomes. Ce cas particulier correspond au schéma suivant: R7NHO-R6-Hal
Z
R3 ( C 1 H2)m RZ N CH (CH2) Me SNH résine
Z
(CH2) RN--CH (CH2) R60NHR7 Me S résine m déprotection NN résine O R6 z (CH2). RZ N i H ( CH2) 7R60NH2 Me S N résine chauffage 27 2864830 Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention, lorsque dans la résine de structure (V), R4 représente un groupe méthyle, Z' = Z, p =0 et RI = H, la résine (V) peut être traitée par un halogénure d'N-alkylhydrazine protégée de formule R7-NHNH-R6-Hal, dans lequel R6 représente un groupe alkyle linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, composé de 2 à 12 atomes de carbone, l'halogénure et l'azote étant espacés d'au moins 1 atome de carbone, et R7 représente un groupement protecteur des fonctions amines clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine, ce qui conduit à l'obtention d'une résine de folmule (V) dans laquelle RI représente R7-NHNH-R6; l'élimination du groupement protecteur R7 conduit à une résine de formule (V) dans laquelle RI représente H2NNH-R6; le traitement par chauffage de cette résine conduit à une résine de formule (IX) dans laquelle RI et R'5 sont confondus et forment un lien carboné saturé ou insaturé, substitué ou non, composé de 1 à 3 atomes de carbone, entre N-NH et N, composant alors un hétérocycle de 5 à 7 atomes. Ce cas particulier correspond au schéma suivant:
Z Z ( HZ)
I m ( H2)m RZ N CH R, NHNH-R6 HaI RZ N i H (CH2) (CH2) \N \N j,,, ,R6NHNHR7 Me S NH Me S N résine résine déprotection R, Me NN résine N R6 H résine
Z Ri--N i H
chauffage (CH2) \N R6NHNH2 Me S N 28 2864830 La présente invention concerne plus particulièrement un procédé de synthèse en phase solide sur une résine de composés de formule générale (I) suivante: (I) a B--"-1-; -'''''''NH-(CH2)p -RI dans laquelle: Z représente l'un des groupes suivants: É un groupe COORa, CORa ou CSRa, Ra représentant un atome d'hydrogène, ou un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, un groupe arylalkyle comprenant de 6 à 30 atomes de carbone, un groupe arylallyle comprenant de 6 à 30 atomes de carbone, un groupe aryle comprenant de 6 à 30 atomes de carbone, un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éyentuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, un groupe fluorogénique ou chromogénique, un groupe acyle, Ra pouvant également représenter, lorsque Z représente un groupe CORa ou CSRa, un résidu d'amino acide ou un peptide, un groupe halogéno-alkyle, notamment perfluoroalkyle de 1 à 3 atomes de carbone, un groupe N(Rb)Rc ou N(ORb)Rc, dans lequel 10 15 25 29 2864830 Rb est un atome d'hydrogène, un groupe alkyle comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, linéaire ou ramifié, un groupe allyle, un groupe arylalkyle, arylallyle ou aryle comprenant de 6 à 30 atomes de carbone, un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, ou un groupe halogéno-alkyle tel que défini ci-dessus, et Re est un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, un groupe arylalkyle, arylallyle ou aryle comprenant de 6 à 30 atomes de carbone, un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, É un groupe N(Rg)Rf, Rf répondant à la définition donnée précédemment pour Rd, et Rg répondant à la définition donnée précédemment pour Re, É un groupe ORS, Rj répondant à la définition donnée précédemment pour Re, É un groupe SRk, Rk répondant à la définition donnée précédemment pour Re, É un groupe -NH-CO-N(RX)Ry ou -NH-CS-N(RX)Ry, R, et Ry, identiques ou différents, représentant H, un groupe alkyle de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe aryle ou alkylaryle comprenant de 5 à 30 atomes de carbone, m est égal à 0, ou représente un nombre entier de 1 à 4, n représente un nombre entier de 1 à 5, p est égal à 0, ou représente un nombre entier de 1 à 5, RI représente H, ou un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, de 1 à 5 atomes de 30 carbone, R3 représente H, ou un groupe alkyle de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, un groupe arylalkyle, arylallyle ou aryle comprenant de 5 à 30 atomes de 2864830 carbone, un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, R2 représente É un atome d'hydrogène, un groupe alkyle de 1 à 12 atomes de carbone, ou un groupe allyle, ou É un groupe aryle, arylalkyle, arylallyle comprenant de 5 à 30 atomes de 10 carbone, ou É un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, ou É un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, É un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, É un groupe acyle, ou É un aminoacide naturel ou non, ou É un enchaînement d'aminoacides naturels ou non de formule X-AAZ...-AAI, z représentant le nombre d'aminoacides dans ledit enchaînement et étant un nombre entier de 2 à environ 40, X représentant soit un atome d'hydrogène, soit un groupement protecteur orthogonal des fonctions amines clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine, soit un groupe alkyle de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, soit un groupe aryle, arylalkyle ou arylallyle comprenant de 5 à 30 atomes de carbone, soit un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, soit un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, soit un groupe acyle, ou 25 30 31 2864830 A représente N ou NH, sous réserve que: lorsque A représente N, a représente une double liaison et b représente une simple liaison, et lorsque A représente NH, a représente une simple liaison et b représente une double liaison, lorsque A représente N, B représente un groupe S-R4, dans lequel R4 représente: É un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, de 1 à 12 atomes de carbone, un 10 groupe allyle, ou un groupe arylalkyle, arylallyle ou aryle comprenant de 5 à 30 atomes de carbone, ou É un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, ou É un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, É un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, É un groupe acyle, ou É un groupe R'4S, R'4 répondant à la définition donnée précédemment pour Rc, lorsque A représente NH, B représente l'un des groupes suivants: É un atome de soufre, É un atome d'oxygène, É un groupe NR5, R5 représentant l'un des groupes srivants: un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, un groupe arylalkyle ou arylallyle comprenant de 6 à 30 atomes de carbone, un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de. 3 à 8 atomes, 30 32 2864830 un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, un groupe OR6, R6 répondant à la définition donnée précédemment pour Re, un groupe NHR6 ou N(R'6)R6, R6 étant tel que défini ci-dessus et pouvant également être un groupe acyle, et R'6 répondant à la définition donnée précédemment pour R6, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend: * une étape de liaison d'un composé de formule générale (II) suivante: z' ( H2) I m dans laquelle: Z' représente: É un groupe COOR'a, COR'a ou CSR'a, R'a représentant un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, un groupe arylalkyle, arylallyle ou aryle comprenant de 6 à 30 atomes de carbone, ou un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, un groupe fluorogénique ou chromogénique, un groupe acyle, 33 2864830 R'a pouvant également représenter, lorsque Z' représente un groupe COR'a ou CSR'a, un résidu d'amino acide ou un peptide, un groupe halogéno-alkyle, notamment perfluoroalkyle de 1 à 3 atomes 5 de carbone, un groupe N(R'g)R'c ou N(OR'b)R'c, dans lequel R'b est un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, un groupe arylalkyle, arylallyle ou aryle comprenant de 5 à 30 atomes de carbone, un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, ou un groupe halogéno-alkyle tel que défini ci-dessus, et R'b représente également un groupement protecteur des fonctions alcools clivable par le même réactif que celui utilisé pour le clivage final de la résine, ou un groupement protecteur orthogonal des fonctions alcools clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine, R'c répondant à la définition donnée précédemment pour Rc, et, lorsque Z' représente un groupe COOR'a, R'a peut également représenter un groupement protecteur des fonctions carboxyliques clivable par le même réactif que celui utilisé pour le clivage final de la résine, ou un groupement protecteur orthogonal des fonctions carboxyliques clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine, É un groupe N(R'g)R'f, R' f répondant à la définition donnée précédemment pour Rf, R'g représentant 30. un atome d'hydrogène, ou un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, un groupe arylalkyle, arylallyle ou aryle comprenant de 6 à 30 atomes de carbone, ou 34 2864830 un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, ou unhétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, ou un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, ou un groupement protecteur des fonctions amines clivable par le même réactif que celui utilisé pour le clivage final de la résine, ou un groupement protecteur orthogonal des fonctions amines clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine, sous réserve que le groupe N(R'g)R'f soit différent de NH2, É un groupe OR'i, R'j représentant un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, un groupe arylalkyle, arylallyle ou aryle comprenant de 5 à 30 atomes de carbone, ou un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, ou un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, un groupe acyle, ou un groupement protecteur des fonctions alcools clivable par le même réactif que celui utilisé pour le clivage final de la résine, ou un groupement protecteur orthogonal des fonctions alcools clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine, É un groupe SR'k, R'k représentant un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, un groupe arylalkyle, arylallyle ou aryle comprenant de 5 à 30 atomes de carbone, ou 10 2864830 un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, ou un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, un groupe acyle, ou un groupement protecteur des fonctions thiols clivable par le même réactif que celui utilisé pour le clivage final de la résine, ou un groupement protecteur orthogonal des fonctions thiols clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine, É un groupe -NH-CO-N(R'X)R'y ou -NH-CS-N(R',)R'y, R'X et R'y, identiques ou différents, répondant à la définition donnée précédemment pour RX et Ry, R3, m et n sont tels que définis ci-dessus, R'2 représente É un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, un groupe arylalkyle, arylallyle ou aryle comprenant de 5 20 à 30 atomes de carbone, ou É un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, ou É un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, É un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, É un groupe acyle, ou É un groupement protecteur des fonctions amines clivable par le même réactif que celui utilisé pour le clivage final de la résine, ou un groupement protecteur orthogonal des fonctions amines clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la réine, 10 36 2864830 sur une résine porteuse de fonctions amines de formule NH-(CH2) p-RI, dans laquelle p et RI sont tels que définis ci-dessus, ce qui conduit à l'obtention d'une résine de formule (III) suivante: Z' R' N CH (CH2)i.i \NH S,C,,NI,(CH2)p-R] résine dans laquelle Z', R'2, R3, m, n, p et RI sont tels que définis ci-dessus, * le cas échéant, déprotection de la fonction amine par clivage de R'2, lorsque R'2 représente un groupement protecteur des fonctions amines clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine, et acylation de la fonction amine ainsi libérée par un dérivé carboxylique, ou synthèse peptidique selon les protocoles classiques en phase solide, ce qui conduit à l'obtention d'une résine de formule (III-1) suivante: z' (i H2)m Ri N CH (CH2)
NNH
S j,,,.(C H2)p -RI résine correspondant à une résine de formule (III) susmentionnée dans laquelle R'2 est 30 remplacé par R2 qui représente un aminoacide naturel ou non, ou un enchaînement d'aminoacides naturels ou non de formule X-AAZ...-AAI, tels que définis ci-dessus, * le cas échéant, lorsque Z' représente une fonction carboxylique, une fonction amine, une fonction alcool ou une fonction thiol, protégée par un groupement 37 2864830 protecteur, respectivement des fonctions carboxyliques, amines, alcools et thiols, clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine, déprotection de la susdite fonction carboxylique, amine, alcool ou thiol par clivage dudit groupement protecteur, et réaction de cette fonction carboxylique, amine, alcool ou thiol déprotégée avec un réactif déterminé, ce qui conduit à l'obtention d'une résine de formule (III-2) suivante:
Z
( CH2) RR m R'2 N i CH (CH2) \NH S C.,, N j(CH2)p -RI résine correspondant à une résine de formule (III) susmentionnée dans laquelle Z' est remplacé par Z, Z et R'2 étant tels que définis ci-dessus, * la résine de formule (III) obtenue précédemment étant ensuite: ** soit clivée à l'aide d'un réactif approprié, ce qui conduit à l'obtention de composés de formule (IV) suivante:
Z
R ( H2)m R7--N CH i (CH2)n \NH s'N/(CH2)p-Ri
H
dans laquelle Z, R2, R3, m, n, p et RI sont tels que définis ci-dessus, ** soit traitée avec un halogénure d'alkyle, de préférence un iodure d'alkyle, de formule R4-Hal, dans laquelle Hal représente un atome d'halogène, et est de 25 10 préférence un atome d'iode, et R4 est tel que défini ci-dessus, ce qui conduit à l'obtention d'une résine de formule (V) suivante: Z' R (CH2) m Ri N CH (CH2) (CHz)p-R1 R4 SN/ dans laquelle Z', R2, R3, R4, m, n, p et RI sont tels que définis ci-dessus, * la résine de formule (V) obtenue précédemment étant ensuite: ** soit clivée à l'aide d'un réactif approprié, ce qui conduit à l'obtention de composés de formule (VI) suivante: Z (CH 2) pli 1 " RZ N i H (CH2) 20)\j ** soit, lorsque R4 représente un groupe méthyle, traitée par chauffage avec de l'acétate d'ammonium, ce qui conduit à l'obtention d'une résine de formule R2 N CH (CHz)
NNH
HN \N/(CH2)p -R1 résine résine CH p -R R4 S N z 1
H
dans laquelle Z, R2, R3, R4, m, n, p, et RI sont tels que définis cidessus, (VII) suivante: (VII) dans laquelle Z', R2, R3, m, n, p et RI sont tels que définis ci-dessus, la résine de formule (VII) obtenue précédemment étant ensuite clivée à l'aide d'un réactif approprié, ce qui conduit à l'obtention de composés de formule (VIII) suivante:
Z
R3 (CH2)m 1 R-2 N-OH (CH2) (VIII) \NH HN N,,(CH2)p-R1 H dans laquelle Z, R2, R3, m, n, p et RI sont tels que définis ci-dessus, 30 ** soit, lorsque R4 représente un groupe méthyle, traitée par chauffage avec 15 un composé de formule R'5-NH2, R'5 représentant: un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, un groupe arylalkyle ou arylallyle comprenant de 6 à 30 atomes de carbone, ou un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle 20 comprenant 3 à 7 atomes de carbone, ou un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, un groupe OR"6, dans lequel R"6 répond à la définition donnée précédemment pour R6 ou peut également représenter un groupement protecteur des fonctions alcools clivable par le même réactif que celui utilisé pour le clivage final de la résine, ou un groupe NH-R'6 ou N(R'6)R"'6, dans lequel R'6 est tel que défini ci-dessus et R'6 répond à la définition donnée précédemment pour R6 ou peut également représenter un groupement protecteur des fonctions amines clivable par le même réactif que celui utilisé pour le clivage final de la résine, 2864830 ce qui conduit à l'obtention d'une résine de formule (IX) suivante: z' R (CH2) m RZ N CH (CH2) \NH R S N N,.(CH2)p -R1 résine dans laquelle Z', R2, R3, m, n, p, R'5 et R1 sont tels que définis ci-dessus, la résine de formule (IX) obtenue précédemment étant ensuite clivée à l'aide' d'un réactif approprié, ce qui conduit à l'obtention de composés de formule (X) suivante: z (CH2) R2 N CH (CH2) (X) NNH RS N H/(CH2)p-R1 dans laquelle Z, R2, R3, m, n, p, R1 et R5 sont tels que définis ci-dessus.
La présente invention concerne plus particulièrement un procédé de synthèse en phase solide sur une résine de composés de formule générale (I) suivante: R7N CH (CH2)
N a
B /b \NH (CH2)p -RI
A (I) 20 25
41 2864830 dans laquelle: Z représente un groupe COORa, CORa ou CSRa, Ra représentant un atome d'hydrogène, ou Ra pouvant également représenter, lorsque Z représente un groupe CORa ou CSRa, un groupe NH2, m est égal à 0, ou représente un nombre entier de 1 à 4, - n représente un nombre entier de 1 à 5, p est égal à 0, ou représente un nombre entier de 1 à 5, RI représente H, ou un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, de 1 à 5 atomes de carbone, R3 représente H, ou un groupe alkyle de 1 à 12 atomes de carbone, - R2 représente É un atome d'hydrogène, ou É un aminoacide naturel ou non, ou É un enchaînement d'aminoacides naturels ou non de formule X-AAZ...-AA1, z représentant le nombre d'aminoacides dans ledit enchaînement et étant un nombre entier de 2 à environ 40, X représentant soit un atome d'hydrogène, soit un groupement protecteur orthogonal des fonctions amines clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine, soit un groupe alkyle de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, soit un groupe aryle, arylalkyle ou arylallyle comprenant de 5 à 30 atomes de carbone, soit un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, soit un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, soit un groupe acyle, ou A représente N ou NH, sous réserve que: lorsque A représente N, a représente une double liaison et b représente une simple liaison, et lorsque A représente NH, a représente une simple liaison et b représente une double liaison, 42 2864830 lorsque A représente N, B représente un groupe S-R4, dans lequel R4 représente un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, de 1 à 12 atomes de carbone, lorsque A représente NH, B représente l'un des groupes suivants: É un atome de soufre, É un atome d'oxygène, É un groupe NR5, R5 représentant l'un des groupes suivants: un atome d'hydrogène, ou un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend: * une étape de liaison d'un composé de formule générale (II) suivante: z' i3 (CH2)m R'-N-CH 2 (CH2) \N C S 20 dans laquelle: Z' représente: É un groupe COOR'a, COR'a ou CSR'a, R'a représentant, lorsque Z' représente un groupe COR'a ou CSR'a, un groupe NH2, et lorsque Z' représente un groupe COOR'a, R'a représentant un groupement protecteur des fonctions carboxyliques clivable par le même réactif que celui utilisé pour le clivage final de la résine, ou un groupement protecteur orthogonal des fonctions carboxyliques clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine, R3, m et n sont tels que définis ci-dessus, R'2 représente un groupement protecteur des fonctions amines clivable par le même réactif que celui utilisé pour le clivage final de la résine, ou un groupement protecteur orthogonal des fonctions amines clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine, 43 2864830 sur une résine porteuse de fonctions amines de formule NH-(CH2) p-R1, dans laquelle p et R1 sont tels que définis ci-dessus, ce qui conduit à l'obtention d'une résine de formule (III) suivante: z' ( HZ) I m R' N CH (CH2) \NH SN/(CH2)p-RI résine dans laquelle Z', R'2, R3, m, n, p et R1 sont tels que définis ci-dessus, * le cas échéant, déprotection de la fonction amine par clivage de R'2, lorsque R'2 représente un groupement protecteur des fonctions amines clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine, et acylation de la fonction amine ainsi libérée par un dérivé carboxylique, ou synthèse peptidique selon les protocoles classiques en phase solide, ce qui conduit à l'obtention d'une résine de formule (III-1) suivante: Z' (CH2) 13 1 m RZ N CH (CH2) (III-1) NH s, C N/(CH2)p -R1 résine correspondant à une résine de formule (III) susmentionnée dans laquelle R'2 est remplacé par R2 qui représente un aminoacide naturel ou non, ou un enchaînement 30 d'aminoacides naturels ou non de formule X-AAZ...-AA1, tels que définis ci-dessus, * le cas échéant, lorsque Z' représente une fonction carboxylique protégée par un groupement protecteur des fonctions carboxyliques, clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine, déprotection de la susdite fonction 10 carboxylique, par clivage dudit groupement protecteur, et réaction de cette fonction carboxylique déprotégée avec un réactif déterminé, ce qui conduit à l'obtention d'une résine de formule (III-2) suivante: z
NH
S j,N/(CH2)p-R1 (III-2) résine correspondant à une résine de formule (III) susmentionnée -dans laquelle Z' est 15 remplacé par Z, Z et R'2 étant tels que définis ci-dessus, * la lésine de formule (III) obtenue précédemment étant ensuite: ** soit clivée à l'aide d'un réactif approprié, ce qui conduit à l'obtention de composés de formule (IV) suivante:
Z
Rj (1 HZ)m R-2--N CH i (CH2)n
NNH
S N/(CH2)p-R1
H
dans laquelle Z, R2, R3, m, n, p et RI sont tels que définis ci-dessus, ** soit traitée avec un halogénure d'alkyle, de préférence un iodure d'alkyle, de formule R4-Hal, dans laquelle Hal représente un atome d'halogène, et est de préférence un atome d'iode, et R4 est tel que défini ci-dessus, ce qui conduit à l'obtention d'une résine de formule (V) suivante: z' (CH2) m RZ N CH (CH2) R S/\N/(CH2)p-R1 (V) résine dans laquelle Z', R2, R3, R4, m, n, p et RI sont tels que définis ci-dessus, * la résine de formule (V) obtenue précédemment étant ensuite: ** soit clivée à l'aide d'un réactif approprié, ce qui conduit à l'obtention de composés de formule (VI) suivante: z 1 (H2)m RZ N CH (CH2) R S N(CH2)p-R 4 H dans laquelle Z, R2, R3, R4, m, n, p, et RI sont tels que définis ci-dessus, ** soit, lorsque R4 représente un groupe méthyle, traitée par chauffage avec de l'acétate d'ammonium, ce qui conduit à l'obtention d'une résine de formule (VII) suivante: t' (CH2) m R-i N Î H (CH2) (VII) NNH \ HN N/(CH2)p-RI résine R5 N N % -(CH2)p-R1 dans laquelle Z', R2, R3, m, n, p et RI sont tels que définis ci-dessus, la résine de formule (VII) obtenue précédemment étant ensuite clivée à l'aide d'un réactif approprié, ce qui conduit à l'obtention de composés de formule (VIII) suivante: z (CH2) I m RS N CH (éH2) (VIII) \NH HN N/(CH2)p-Ri
H
dans laquelle Z, R2, R3, m, n, p et RI sont tels que définis ci-dessus, ** soit, lorsque R4 represente un groupe méthyle, traitée par chauffage avec un composé de formule R'5-NH2, R'5 représentant un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, ce qui conduit à l'obtention d'une résine de formule (IX) suivante: z' %\ /(CH2) -RI R'S N i P résine dans laquelle Z', R2, R3, m, n, p, R'5 et RI sont tels que définis ci-dessus, la résine de formule (IX) obtenue précédemment étant ensuite clivée à l'aide d'un réactif approprié, ce qui conduit à l'obtention de composés de formule (X) suivante: z (X) dans laquelle Z, R2, R3, m, n, p, R1 et R5 sont tels que définis ci-dessus.
La présente invention concerne également un procédé tel que défini cidessus, pour la synthèse en phase solide de dérivés thiourée répondant à la formule générale 5 suivante (IVa) : o
H
X AAZ ÉÉÉ AA1 Ra (IVa)
HN
S \NHR1 dans laquelle R1 et l'enchaînement X-AAZ...-AA1- sont tels que définis ci-dessus, et Ra, représente un groupe Ra ou ORa, Ra étant tel que défini ci-dessus, la formule (IVa) correspondant à la formule (IV), dans laquelle Z représente un 15 groupe CORa ou COORa, m = 0, R2 = X-AAZ.. .-AA1-, R3 = H, n = 3, A = NH, B =Set p=0, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend: * une étape de liaison d'un composé de formule générale (IIa) suivante: o
H
film c---NRia dans laquelle R'a représente un groupe R'a ou OR'a, R'a étant tel que défini ci- dessus, la formule (IIa) correspondant à la formule (II), dans laquelle Z' représente un groupe COR'a ou COOR'a, m = 0, R'2 = Fmoc, R3 = H et n = 3, sur une résine porteuse de fonctions amines NH2 ou NHR1, R1 étant tel que défini ci-dessus, 25 ce qui conduit à l'obtention d'une résine de formule (IIIa) suivante: o
H
frnoc R a dans laquelle RI et R' sont tels que définis précédemment, la formule (IIIa) correspondant à la formule (III), dans laquelle Z' représente un groupe COR'aouCOOR'a,m=0,R'2=Fmoc, R3=H,n=3,A=NH,B=Setp=0, * une étape de déprotection de la fonction amine NH-Fmoc par clivage du groupe Fmoc, notamment par le mélange pipéridine/DMF (20/80), et une étape de synthèse peptidique selon la stratégie Fmoc classique en phase solide, par une succession d'étapes d'addition/déprotection de résidus aminoacyles dont la fonction amine est protégée par un groupe Fmoc, et ce jusqu'à z résidus, et éventuellement déprotection du résidu AAz et introduction du groupe X, différent de H, sur la fonction amine ainsi libérée, X et z étant tels que définis ci-dessus, ce qui conduit à l'obtention d'une résine de formule (IIIb) suivante: o
H
X AAz... AAI Ria (IIIb) dans laquelle z, X, RI et R'a sont tels que définis ci-dessus, la formule (IIIb) correspondant à la formule (III), dans laquelle Z' représente un groupe COR'a ou COOR'a, m = 0, R3 = H, n = 3, A = NH, B = S, p= 0 et R'2 représente un aminoacide naturel ou non, ou un enchaînement d'aminoacides naturels ou non de formule X-AAz...-AA1-, 20 * le cas échéant, lorsque R'a, représente un groupe OR'a, une étape de déprotection de la fonction carboxylique par clivage de R'a, lorsque R'a représente un groupement protecteur de fonction carboxylique clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine, et réaction de cette fonction carboxylique avec un réactif déterminé, cette étape correspondant par exemple à la condensation de la fonction carboxylique déprotégée activée (l'activation de la fonction carboxylique peut être réalisée de différentes façons, par exemple à l'aide d'un réactif d& couplage peptidique comme l'HBTU, ou par formation de l'anhydride mixte avec le chloroformiate d'isobutyle) avec un dérivé porteur d'une fonction amine primaire ou secondaire tel qu'un résidu d'amino acide, une alkyle amine ou une aryle amine pour former un lien amide CONH, ou bien avec un dérivé porteur d'une fonction alcool pour former un lien ester, ce qui conduit à l'obtention d'une résine de formule (IIIc) suivante: o
H
X AAZ AAi Ra
HN
S ' NRI résine Ra, et R1 étant tels que définis ci-dessus, la formule (IIIc) correspondant à la formule (III), dans ?laquelle Z' représente un groupe CORa ou COORa, m = 0, R3 = H, n = 3, A = NH, B = S, p = 0 et R'2 représente un aminoacide naturel ou non, ou un enchaînement d'aminoacides naturels ou non de formule X-AAZ...-AAI-, * une étape finale de clivage de la résine obtenue précédemment à l'aide d'un réactif approprié, notamment une solution concentrée de TFA ou de HF, ce qui conduit 30 à l'obtention de composés de formule (IVa) définis ci- dessus.
La présente invention concerne également un procédé tel que défini cidessus, pour la synthèse en phase solide de dérivés S-alkyle-isothiourée ' de formule générale (VIa) suivante: o
H
X AAZ... AA,I N\\Ra (VIa) N"-'- R4 S'NHRI dans laquelle X-AAZ...-AA1-, R1, R4 et Ra sont tels que définis ci-dessus, la formule (VIa) correspondant à la formule (VI), dans laquelle Z représente un groupe CORa (CORa ou COORa), m = 0, R2 = X-AAZ... -AA1-, R3 = H, n = 3, A = N, B=S-R4etp=0, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend: * une étape de traitement de la résine de formule (IIIc) telle que définie ci-dessus avec un halogénure d'alkyle, notamment un iodure d'alkyle, de formule R4-Hal, R4 étant tel que défini ci-dessus et Hal représentant un atome d'halogène, ce qui conduit à l'obtention d'une résine de formule (Va) suivante: o
H
X AAz... AAiN \/Ra N'--- (Va) résine dans laquelle Ra, X-AAZ...-AA1-, R1 et R4 sont tels que définis ci-dessus, la formule (Va) correspondant à la formule (V), dans laquelle Z représente un groupe CORa ouCOORa, m=0,R2=X-AAZ...-AA1-,R3=H,n 3,A=N,B=S-R4 etp=0, * une étape finale de clivage de la résine de formule (Va) obtenue précédemment à l'aide d'un réactif approprié, notamment une solution concentrée de TFA ou de HF, ce qui conduit à l'obtention de composés de formule (VIa) définis ci-dessus.
Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, lorsque R1 représente H, la résine de formule (IIIc) susmentionnée peut être traitée par un dihalogénure d' alkyle de formule R4(Hal)2, linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, composé de 2 à 12 atomes de carbone, les deux halogénures étant espacés d'au moins 2 atomes de carbone, ce qui conduit à l'obtention d'une résine dé formule (Va) dans laquelle R1 et R4 sont confondus et forment un lien entre S et N, composant alors un hétérocycle de 5 à 7 atomes.
La présente invention concerne également un procédé tel que défini cidessus, pour la synthèse en phase solide de dérivés de guanidine de formule générale (VIIIa) suivante: o
H
x AAZ ÉÉ AA1 R a (VIIIa) HN HN NHR1 dans laquelle Ra, X-AAZ...-AA1- et RI sont tels que définis ci-dessus, la formule (VIIIa) correspondant à la formule (VIII), dans laquelle Z représente un groupe CORa ou COORa, m = 0, R2 = X-AAZ...-AAI-, R3 = H, n = 3, A = NH, B=NHetp=O, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend: * une étape de traitement par chauffage de la résine de formule (Va) telle que 25 définie ci-dessus, dans laquelle R4 représente un groupe méthyle, avec de l'acétate d'ammonium, ce qui conduit à l'obtention d'une résine de formule (VIIa) suivante: 0 H X AAZ ÉÉÉ AA1 Ra
HN
HN N 1 R1
résine(VIIa) dans laquelle Ra, RI et X-AAZ...-AAI- sont tels que définis ci-dessus, la formule (VIIa) correspondant à la formule (VII), dans laquelle Z représente un groupe CORa ou COORa, m = 0, R2 = X-AAZ...-AAI-, R3 = H, n = 3, A = NH, B = NH etp=0, * une étape finale de clivage de la résine formule (VIIa) obtenue précédemment, à l'aide d'un réactif approprié, notamment une solution concentrée de TFA ou HF, ce qui conduit à l'obtention de composés de formule (VIIIa) tels que définis ci-dessus.
La présente invention concerne également un procédé tel que défini cidessus, 10 pour la synthèse en phase solide de dérivés de guanidine de formule générale (Xa) suivante: o
H
X AAZ ÉÉ AA1 N R a (Xa) R5N \NHR1 dans laquelle Ra, X-AAZ...-AAI-, R5 et RI sont tels que définis ci-dessus, la formule (Xa) correspondant à la formule (X) dans laquelle Z représente un groupe CORa ou COORa, m = 0, R2 = X-AAZ...-AAI-, R3 = H, n = 3, A = NH, B = NR5 etp=0 ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend: * une étape de traitement par chauffage de la résine de formule (Va) telle que définie ci-dessus dans laquelle R4 représente un groupe méthyle, avec un composé R'5-25 NH2, R'5 étant tel que défini ci-dessus, ce qui conduit à l'obtention d'une résine de formule (IXa) suivante: o
H
X AAZ... AA Ra HN (IXa) R'5N \NRJ résine dans laquelle Rte,, RI, R'5 et X-AAZ...-AAI- sont tels que définis ci-dessus, la formule (IXa) correspondant à la formule (IX) dans laquelle Z représente un groupe CORa ou COORa, m = 0, R2 = X-AAZ...-AA1-, R3 = H, n = 3, A = NH, B = NR'5etp=O, * une étape finale de clivage de la résine formule (IXa) obtenue précédemment, à l'aide d'un réactif approprié, notamment une solution concentrée de TFA ou HF, ce qui conduit à l'obtention de composés de formule (Xa) tels que définis ci-dessus.
La présente invention concerne également un procédé tel que défini cidessus, caractérisé en ce que les résines utilisées sont des résines: porteuses de fonctions amines NH2 telles que les résines suivantes: Rink amide AM PS (4-[(((2,4-diméthoxyphényl)Fmoc-aminométhyl) phénoxyacétamido)( Norleucine)aminométhylJ polystyrène) ; Rink amide BHA PS (4-[(((2, 4-diméthoxyphényl)Fmoc-aminométhyl)phénoxyacétamido) ( Norleucine)4-benzhydrylamine] polystyrène) ; Rink amide MBHA PS (4-[(((2, 4-diméthoxyphényl)Fmoc- aminométhyl)phénoxyacétamido) ( Norleucine) 4-méthyl-benzhydrylamineJ polystyrène) ; Rink amide acétamido PA (4-[(((2,4-diméthoxyphényl) Fmocaminométhyl)phénoxyacétamido)J polyamide) ; Rink amide NovaSyn TGR; Rink amide PEGA; Rink amide NovaGel; Sieber amide PS; Sieber amide NovaSyn TG; Bis-(2-amino-éthyle)-éther trityle; O-bis-(aminoéthyle) éthylène glycol trityle; 1,4-Bis-(aminométhyle)-benzène trityle; 1,3-bis-(aminométhyle)-benzène trityle; diaminoalkyle trityle, le groupe alkyle comprenant de 2 à 12 atomes de carbone; ( )-trans-1,2-diaminocyclohexane trityle; 4,4'diaminodicyclohexyleméthane trityle; N-1,3-Diaminopropan-2-ol trityle; hydroxylamine 2-chlorotrityle; cystéamine 2-chlorotrityle; BHA PS (4benzhydrylamine polystyrène) ; MBHA PS (4- méthylbenzhydrylamine polystyrène) ou porteuses de fonctions amines différentes de NH2 de formule NH-(CH2) p-RI, dans laquelle p et RI sont tels que définis ci-dessus, à savoir des résines telles qu'obtenues par amination réductrice entre un composé de formule R1-(CH2)p_1-CHO, p étant tel que défini ci-dessus, et des résines porteuses de 30 fonctions amines NH2 telles que mentionnées ci-dessus.
La présente invention concerne également l'application du procédé tel que défini ci-dessus, pour la synthèse en phase solide' de dérivés de peptides comportant une arginine en position C-terminale, à savoir de composés peptidiques de formule (VIIIa) telle que définie ci-dessus, dans laquelle R1, Ra et X-AAZ...-AA1- sont tels que définis ci-dessus.
La présente invention concerne également l'application susmentionnée, du procédé tel que défini ci-dessus, pour la synthèse en phase solide de dérivés de peptides comportant une arginine en position C-terminale, choisis parmi les composés peptidiques de formule (VIIIa) telle que définie ci-dessus, dans laquelle X-AAZ...-AA,-représente les enchaînements suivants: Ac-Val-Gly-Leu-, Ac-Ile-Glu-Gly, Ac-Phe-Val, Ac- Leu-Ser-Thr, Ac-Val-Pro, Ac-Ala-Lys, Ac-Val-Gly, Ac représentant un groupe acétyle.
La présente invention concerne également l'application du procédé tel que défini ci-dessus, pour la synthèse de substrats fluorogéniques ou chromogéniques comportant une arginine en position C-terminale, à savoir de composés peptidiques de formule (VIIIa) telle que définie ci-dessus, dans laquelle Ra, représente un groupe Ra, Ra représentant un groupe fluorophore ou chromophore, et X-AAZ...-AA1- est tel que défini ci-dessus.
La présente invention concerne également l'application susmentionnée, du procédé tel que défini ci-dessus, pour la synthèse de substrats fluorogéniques comportant une arginine en position C-terminale, à savoir de composés peptidiques de formule (VIIIa) tels que définis ci-dessus dans laquelle Ra représente: un groupement 7-amino-4-méthyl-coumarine de formule suivante: ou un groupement (3-naphtylamine de formule suivante: H ou un groupement a- naphtylamine de formule suivante: NH
N H ou un groupement 4-méthoxy-J3-naphtylamine de formule suivante:
H OMe
ou un groupement 7-amino-4-trifluorométhylcoumarine de formule suivante: CF3 ou un groupement Rhodamine 110 (forme bisamide) de formule suivante:
H H
H
La présente invention concerne également l'application susmentionnée, du procédé tel que défini ci-dessus, pour la synthèse de substrats chromogéniques 20 comportant une arginine en position C-terminale, à savoir de composés peptidiques de formule (VIIIa) tels que définis cidessus dans laquelle Ra représente: un groupement para-nitroaniline de formule suivante: ou un groupement para-nitrophénol de formule suivante: NO2 La présente invention concerne également l'application du procédé tel que défini ci- dessus, pour la préparation d'inhibiteurs de l'oxyde nitrique synthase (NOS), lesdits inhibiteurs étant choisis parmi les composés répondant à la formule (I) telle que définie ci-dessus, dans laquelle p est égal à 0 et R2 représente un atome d'hydrogène, à savoir parmi les composés répondant à la formule (I-bis) suivante: R3 N CH (CH2) NA (I-bis) a B b NHR1 dans laquelle a, b, m, n, A, B, Z, RI et R3 sont tels que définis ci- dessus, et notamment parmi les composés répondant à l'une des formules générales 10 suivantes: z z z R4S NHR, R5N NHR1 (2) (3) z H CH2 (IH2) H m R3 N CH R3 N CH (CH2) ( CH2) (4) \NH (5) NH NHR, i NHR, N OR6 NHR6 ainsi que les composés de formule (2) dans laquelle RI est confondu avec R4 pour former un cycle, lesdits composés répondant à la formule suivante: z (CH2)m
H
R7 -N CH (CH2) S /NH R4 20 25 30 (i CH, )m H (i H2)m H (i H2)m
H
R3 N CH R3 N CH R3 N CH \ (CH2\ (CH2\ NH i NH (CH2) (2') ainsi que les composés de formule (3) dans laquelle R1 est confondu avec R5 pour former un cycle, lesdits composés répondant à la formule suivante: z (3') N jNH R s ainsi que les composés de formule (4) et (5) dans lesquelles RI est confondu avec R6 pour former un cycle, lesdits composés répondant à la formule suivante: z z (I CH, H ( CH, ) H m R3 N CH R N CH (CH2) (CH,)
NH NH
(5') \
NNH NNH 1 / 1
O R6 N--R6 H R4, R5 et R6 étant tels que définis ci-dessus, et plus particulièrement parmi les composés de formules (1), (2), (3), (4), (5), (1'), (2'), (3'), (4') et (5') susmentionnées, dans lesquelles soit: m = 0 ou 1 et Z représente un groupe de formule CORa ou COORa, m = 0 ou 1 et Z représente un groupe de formule N(Rg)Rf, - m = 1 ou 2 et Z représente un groupe de formule ORS, m = 1 et Z représente un groupe de formule SRk.
La présente invention concerne également des composés de formule générale (IIa) suivante: 0
H
finocN R'a
II
S
dans laquelle R'a est tel que défini ci-dessus, (4') la formule (IIa) correspondant à la formule (II), dans laquelle Z représente un groupe COR'a ou COOR'a, m = 0, R'2 = Fmoc, R3 = H et n = 3, en tant qu'intetrnédiaires de synthèse des composés de formules (IVa), (VIa), et (VIIa) dans le cadre des procédés de synthèse ci-dessus.
La présente invention concerne également un composé tel que défini cidessus, de formule (IIa), dans laquelle Ria représente un groupement 7amino-4-méthyl-coumarine. Un tel composé répond à la formule suivante: 0 H fmoc
H
PARTIE EXPÉRIMENTALE L'utilisation de dérivés N-isothiocyanate de diamino acides, tels que la N8- isothiocyanato-ornithine ou la Ne-isothiocyanato-lysine, en synthèse en phase solide de peptides et pseudo-peptides est présentée. Ces dérivés, convenablement protégés, sont attachés sur un support solide de type résine "Rink amide" par réaction du groupement isothiocyanate avec la fonction amine de la résine. Cette réaction résulte dans la formation d'un groupement thiourée dont la fonction azotée distale est donc fournie par le "linker" du support solide et sera libérée lors du clivage final de la résine par l'acide trifluoroacétique (une approche analogue a été rapportée pour la synthèse en phase solide de 2-aminothiazoles [Kearney et al., 1998] et d'aryle-guanidines [Li et al., 2001]). Les dérivés protégés amino acides (a, mais aussi et homologues supérieurs) comportant ce groupement thiourée sur leur chaîne latérale sont donc attachés à la résine par l'intermédiaire de cette chaîne latérale. Ces dérivés comportent trois points de variabilité dont deux au niveau des fonctions amine et carboxylique de l'amino acide bloquées par des groupements protecteurs (orthogonaux l'un par rapport à l'autre et/ou au lien de la résine) ou autres groupements chimiques. La fonction amine, une fois déprotégée, peut être alkylée ou acylée. Elle peut être notamment le point de départ de synthèse d'un peptide ou d'un pseudo-peptide. Le groupement carboxylique, s'il est bloqué par un groupement protecteur, peut être déprotégé : i- en même temps que le clivage de la résine pour donner un acide carboxylique libre; ii- en cours de synthèse pour être modifié : amidation, estérification, homologation par la méthode d'Arndt- Eistert, etc..., et notamment, dans le cas d'un peptide ou pseudo-peptide, possibilité d'une cyclisation "N-to-C" par couplage en phase solide du groupement carboxylique libéré avec la fonction amine terminale (ou bien une fonction amine présente sur la chaîne latérale d'un résidu). Une exception est lorsque le groupement carboxylique du dérivé N- isothiocyanate de diamino acide a été modifié préalablement à l'attachement sur support solide: par amidation, estérification, et notamment par un groupement d'un intérêt biologique particulier (par exemple, un groupement fluorogénique tel que la 7-amino-4-méthyl- coumarine (AMC) ou chromogénique tel que la para-nitro-aniline (pNA), pour la synthèse de substrats de protéases) ; ou sous la forme d'un groupement précurseur de dérivés céto-activés (inhibiteurs de protéases à sérine). Le troisième point de variation se situe au niveau du groupement thiourée, entité intéressante par elle-même, mais aussi précurseur de dérivés S-alkyl-isothiourées et guanidines. Ainsi, par exemple, la N5- isothiocyanato-ornithine, après attachement à la résine, permet la synthèse de composés peptidiques ou non comportant la thiocitrulline (thiourée), un dérivé S-alkylé de la thiocitrulline (S-alkyl-isothiourée), une arginine (guanidine), ou un analogue d'arginine (guanidine di- ou tri-substituée). De même, le dérivé N5-isothiocyanato-lysine conduit à la synthèse de composés comportant une homothiocitrulline, ou un de ses dérivés S-alkylés, ou une homo-arginine substituée ou non sur sa fonction guanidine.
Le principal intérêt de la présente invention réside dans la possibilité offerte à la synthèse en phase solide dans des conditions compatibles avec la stratégie Fmoc (fluorénylméthyloxycarbonyle) de, peptides (et pseudo-peptides) comportant une arginine (ou dérivé d'arginine) liée au support solide par sa chaîne latérale, ceci sans la nécessité d'un bras chimique particulier entre la résine et le composé synthétisé, mais simplement par l'introduction directe d'un précurseur sur une résine de type "Rink amide" qui conduira à la fonction guanidine lors du clivage final. Secondairement, les composés intermédiaires de type thiocitrulline et S-alkyl-isothiocitrulline, également attachés à la résine par leur chaîne latérale, permettent la synthèse d'autres classes de molécules d'intérêt biologique. Enfin, la présence de trois points de variation offre de multiples possibilités en synthèse combinatoire.
Généralités concernant la synthèse en phase solide de peptides comportant une arginine à partir d'un dérivé d'ornithine dont la chaîne latérale est attachée à une résine par l'intermédiaire d'un lien thiourée.
La résine utilisée est une résine de type "Rink amide" (Rink et al., 1987) . Ceci implique que la synthèse de peptides est effectuée en utilisant la stratégie Fmoc.
Le dérivé isothiocyanate de l'ornithine est obtenu classiquement par réaction de la fonction S-amine de l'ornithine (protégée sur sa fonction a-aminé par un groupement Fmoc et dont la fonction a-carboxylique est bloquée par un groupement Z (voir ci- dessous)) avec CS2. Il est ensuite mis en présence de la fonction aniline libre de la résine Rink amide pour donner le dérivé protégé de thiocitrulline, attaché au support solide par le groupement thiourée de sa chaîne latérale. La synthèse du peptide désiré est réalisée après déprotection de la fonction a-amine de la thiocitrulline en milieu basique, et en suivant les protocoles classiques de la synthèse peptidique en phase solide. La fonction carboxylique terminale est éventuellement modifiée après déprotection (voir ci-dessous). La guanylation de la fonction thiourée est effectuée juste avant le clivage de la résine, en deux étapes. La thiourée réagit avec CH3I pour donner le dérivé S-méthyl- isothiourée qui est ensuite transformé en guanidine par action d'acétate d'ammonium dans le DMSO à 80 C. Le clivage final de la résine par le TFA en présence de "scavengers" libère le peptide-arginine.
Généralités concernant la synthèse de substrats fluorogéniques de protéases, 10 comportant un groupement 7-amino-4-méthyl-coumarine et une arginine comme résidu
PI
Le dérivé isothiocyanate de Fmoc-L-Orn-AMC, dont la synthèse n'a jamais été décrite, est préparé en trois étapes à partir de Fmoc-L-Orn(Boc)-OH. Celui-ci est couplé à l'AMC en présence de (Boc)2O. La fonction 8-amine est ensuite libérée de sa protection Boc, puis réagit avec CS2 pour donner le dérivé isothiocyanate. L'introduction sur une résine Rink amide MBHA et la suite de la synthèse se déroulent comme décrit précédemment. Après construction du peptide, la guanylation et le clivage finaux produisent le substrat désiré porteur du segment L-Arg-AMC. Le peptide construit à partir de la thiocitrulline fixée sur le support solide correspond à n'importe quelle séquence et est habituellement composé de 0 à 5 résidus. Son identité dépend de la protéase ciblée. Par exemple, le substrat de facteur Xa du système de la coagulation, Ac-Ile-Glu-Gly-Arg- AMC, a été synthétisé en suivant ce protocole avec un rendement de 31% après purification (voir Exemple 2).
Applications générales de la méthode décrite pour la synthèse en phase solide de peptides porteurs d'une arginine à partir d'une thiocitrulline supportée par sa chaîne latérale La fonction amine de la résine Rink amide peut subir au préalable une monoalkylation, introduisant ainsi une variabilité supplémentaire. Cette alkylation est réalisée par amination réductrice entre un aldéhyde ou une cétone et le lien aminé de la résine Rink amide (Brown et al., 1997).
L'introduction sur la résine Rink amide (substituée ou non) de dérivés d'acides aminés porteurs d'une fonction isothiocyanate sur leur chaîne latérale conduit à des composés thiourées (dérivés de thiocitrulline en partant d'orriithine), ou S-alkyl- isothiourées (dérivés de S-alkyl-isothiocitrulline en partant d'ornithine) , ou guanidines (dérivés d'arginine en partant d'omithine).
* Généralités concernant les dérivés comportant une thiocitrulline ou un dérivé de 5 thiocitrulline La thiocitrulline, l'homothiocitrulline et les dérivés S-alkyl-isothiocitrulline ont été décrits comme de puissants inhibiteurs de nitric oxide synthases (NOS) [Narayanan et al., 1994; Furfine et al., 1994; Narayanan et al., 1995]. Ces enzymes catalysent la conversion, dépendante du NADPH et de l'oxygène, de la L-arginine en Lcitrulline et oxyde nitrique (NO), et la conception d'inhibiteurs a reçu beaucoup d'attention. Il existe trois isoformes de NOS: la NOS endothéliale (eNOS) et la NOS neuronale (nNOS) qui sont exprimées de façon constitutive, et la NOS inductible (iNOS) qui est produite en réponse à des cytokines inflammatoires. Le NO produit par la nNOS joue un rôle dans la neurotransmission, tandis que le NO dérivé de la eNOS est un important vasodilatateur intervenant dans le contrôle de la pression sanguine normale et la perfusion des organes. L'expression inappropriée de iNOS dans le muscle lisse vasculaire et les cellules endothéliales génère NO en quantités qui sont fortement vasodilatatrices, causant une diminution marquée de la résistance vasculaire systémique et une hypotension potentiellement mortelle. L'inhibition de cette activité pourrait permettre de contrôler l'hypotension consécutive à un choc septique. L'inhibition de la nNOS pourrait être également utile pour contrôler la surproduction de NO neurotoxique par cette enzyme lors de la reperfusion de régions cérébrales ischémiques suite à une congestion cérébrale, ou lors de maladies neurodégénératives. Dans ce dernier cas, il est important que la eNOS ne soit pas également inhibée dans la mesure où cet effet résulterait en une vasoconstriction, réduisant alors la perfusion et donc l'oxygénation d'un tissu déjà ischémique. Il est donc important de rechercher des inhibiteurs puissants mais également sélectifs de l'une ou l'autre des isoformes de NOS. Ainsi, des inhibiteurs simples comme les S-méthyl- et S-éthyl-L-isothiocitrullines sont relativement sélectifs de la nNOS vis-à-vis des eNOS et iNOS, tandis que les mêmes dérivés sous la forme de dipeptides (avec un L-amino acide hydrophobe) sont plutôt sélectifs de la iNOS (Park et al., 2001). La modification au niveau du groupement thiourée ainsi qu'au niveau du squelette peptidique semble donc permettre de moduler l'activité inhibitrice vis-à-vis de l'une ou l'autre des isoformes de NOS. Différentes séries de composés ont d'ores et déjà été rapportées dans la littérature. Cependant, une méthode de synthèse de ces composés permettant une approche combinatoire, et notamment utilisant les avantages d'un support solide, n'a pas été encore décrite à ce jour. D'autre part, cet aspect concerne également les dérivés d'arginine, la Ncv-méthyl-L-arginine étant l'un des premiers inhibiteurs de NOS décrits. Une méthode permettant d'explorer l'ensemble de ces différentes possibilités de modification par une approche combinatoire représente un atout certain pour la découverte d'inhibiteurs puissants et sélectifs.
Généralités concernant les substrats de protéases De nombreuses protéases, pour la plupart de la famille des protéases à sérine et présentant un très fort intérêt en chimie médicinale, possèdent une spécificité de type trypsique, c'est-à-dire qu'elles coupent une liaison peptidique du côté Cterminal d'un amino acide basique (principalement une arginine, résidu désigné P1 d'après la nomenclature de Schechter et Berger [Schechter et al., 1967]). C'est le cas notamment de certaines protéases de la cascade de la coagulation (thrombine, facteurs Xa, IXa, VIIa,...) ou du système du complément (Clr, Cls,...), dont l'inhibition représente une approche thérapeutique importante face à certaines maladies thrombotiques ou inflammatoires, respectivement. L'évaluation de l'activité inhibitrice de composés nécessite un test simple, sensible et rapide. La plupart des tests décrits utilisent des substrats fluorogéniques ou chromo géniques dont la digestion par les protéases libère un fluorophore ou un chromophore mesuré par spectrofluorimétrie ou spectroscopie UV, respectivement. Ces substrats sont constitués d'un squelette peptidique rappelant le plus souvent le site protéique de clivage naturel par ces protéases, et d'un fluorophore ou d'un chromophore attaché sur le côté C-terminal du résidu Pl. La 7- amino-4-méthyl- coumarine (AMC) est l'un des fluorophores les plus utilisés [Zimmerman et al., 1976; Kanaoka et al., 1977]. Elle est attachée au squelette peptidique par l'intermédiaire d'un lien amide formé entre sa fonction amine et la fonction a-carboxlique du résidu P1. L'hydrolyse de cette liaison par une protéase libère l'AMC. Cette libération s'accompagne d'un changement important du spectre d'émission de fluorescence, permettant une quantification. Le haut rendement quantique rend le test très sensible et applicable à la détection de traces de protéases. De nombreux substrats porteurs d'un groupement AMC ont été décrits et certains sont commerciaux. La synthèse de ces substrats suit essentiellement une méthodologie classique en solution et une stratégie de synthèse peptidique utilisant le groupement Boc ou le groupement Z comme protection de la fonction a-amino des amino acides. La première étape est le couplage de l'AMC sur le dérivé protégé du résidu Pl. Elle est suivie d'une série de cycles de déprotectioncouplage correspondant à l'ajout pas à pas des amino acides du C-terminus vers le N-terminus de la séquence peptidique désirée. Enfin, en fonction de la nature des résidus constituant le segment peptidique, une dernière étape consistant en l'élimination de groupements protecteurs présents sur les chaînes latérales d' amino acides est éventuellement réalisée. Ces synthèses sont longues et de rendement limité. Ceci peut être amélioré en suivant une approche mixte de synthèse en phase solide/solution. Il s'agit de réaliser la condensation en solution de deux fragments, ui segment peptidique synthétisé sur support solide et le segment P1-AMC ou l'AMC seul. Cependant, une limitation importante de cette méthode est le fort risque de racémisation au niveau du résidu C-terminal du segment peptidique au cours du couplage, ce qui va beaucoup influencer la sensibilité du substrat vis-à-vis de la protéase. La synthèse totale en phase solide représente la voie la plus intéressante, mais elle nécessite la synthèse d'un dérivé de l'AMC contenant un groupement fonctionnel permettant l'attachement du fluorophore sur un support solide [Kanaoka et al., 1984; Besson et al., 1992; Harris et al., 2000].
Une dernière possibilité est de synthétiser puis d'attacher sur un support solide le segment protégé Pl-AMC par la chaîne latérale du résidu Pl si celle-ci contient un groupement fonctionnel adéquat. L'attachement sur un support de Arg-AMC par la fonction guanidine de l'amino acide a déjà été décrit [Edwards et al., 2000; Furlong et al., 2002], mais comme indiqué précédemment, il nécessite la synthèse multi-étapes d'un "linker" supplémentaire. La présente invention permet d'éviter la préparation d'un tel "linker" et utilise la fixation directe d'un dérivé isothiocyanate sur la fonction amine de résines commerciales.
EXEMPLES
La méthode, objet de la présente invention, et certaines applications sont décrites ci-dessous.
Exemple 1: Synthèse du peptide Ac-Val-Gly-Leu-Arg-NH2 et de dérivés monosubstitués sur la fonction guanidine de l'arginine.
1- Synthèse de Fmoc-L-Orn(N8-CS)-NH2.
1-1. Fmoc-L-Orn(N(5-Boc)-NH2. A une solution du dérivé protégé FmocLOrn(N&Boc)-OH (2,0 g; 4,4 mmol) dans le DME (10 mL), sont ajoutés à 10 C sous agitation de la N-méthyl morpholine (0,48 ml; 4,4 mmol) et du chloroformiate d'isobutyle (0,60 ml; 4,4 mmol). Après 10 minutes, une solution d'ammoniaque à 28% dans l'eau (1,3 mL) est ajoutée au mélange. Au bout de 8 minutes, de l'acétate d'éthyle (50 ml) est ajouté, et la phase organique est lavée 3 fois avec KHSO4 1 M, H2O, NaHCO3 saturé et NaCl saturé, puis séchée (MgSO4) et concentrée sous vide pour donner une poudre blanche (1,98 g; 99%).
Formule brute C25H31N305, M = 453,5; m/z (ES+) 454,3 (M+H+) ; 476,3 (M+Na+ ) ; 398,1 (M-tBu+H+) ; 907,5 (2M+H+) ; Pf 200-202 C Rf= 0,5 (acétate d'éthyle) HPLC (conditions A = gradient 0 à 100% MeCN en 12 minutes, colonne Symmetry Shield 4,6 x 50 mm) tR = 7,45 min; RMN 1H (CDC13) 8 7,78 (d; J = 7,5 Hz; 2H) ; 7,65 (d; J = 7,2 Hz; 2H) ; 7,40 (t; J = 7,4 Hz; 2H) ; 7,30 (t; J = 7,5 Hz; 2H) ; 6,60 (s, 1H) ; 5,75 (s, 1H) ; 5,50 (s, 1H) ; 4,80-4,65 (m, 1H) ; 4,52-4,35 (m, 2H) ; 4,20 (t; J = 6,8' Hz; 1H) ; 3,50-3,35 (m, 25 2H) ; 1,80-1,60 (m, 4H) ; 1,42 (s, 9H).
Ce composé répond à la formule suivante: o o Il H
NNH
NH-Boc 1-2. Fmoc-L-Orn-NH2. Le produit précédent (0,9 g; 1,98 mM) est traité par 10 mL d'un mélange TFA/DCM (50/50) 'pendant 30 minutes à température ambiante. Après évaporation sous vide des solvants, le résidu liquide est repris par un mélange éther/hexane. Le composé désiré précipite sous la forme d'une poudre blanche qui est récupérée par filtration (0,93 g; 100%).
Formule brute: C20H23N303, M = 353,0; Pf 122 124 C HPLC (conditions A) tR = 5,17 min; RMN IH (DMSO-d6) 6 7,92 (d; J = 7,5 Hz; 2H) ; 7,72 (d; J = 7, 2 Hz; 2H) ; 7,40 (t; J = 7,8 H z; 2H) ; 7,35 (t; J = 7,4 Hz; 2H) ; 7,1 (s, 1H) 4,32-4, 20 (m, 1 H) ; 4,18-4,12 (m, 2H) ; 3,95 (t; J = 5,,0 Hz; 1H) ; 3,40-3,30 (q; J = 7,0 Hz; 2H) ; 1,75- 1,50 (m, 4H).
Ce composé répond à la formule suivante: NH2 1-3. Fmoc-L-Orn(N&CS)-NH2. A une solution du composé précédent (2,65 g; 5, 66 mmol) dans le THF (25 mL), sont ajoutés à 0 C de la TIRA (2,79 mL; 19, 8 mmol) et du disulfure de carbone (3,0 mL; 49,5 mmol). Après 45 minutes d'agitation à 0 C, 6,75 mL de H202 (59,4 mmol) sont ajoutés goutte à goutte à 0 C. Le mélange est ensuite dilué avec 60 mL d'éther, puis la phase organique est lavée avec KHSO4 1 M (2 fois), H20 (1 fois), NaCl saturé (1 fois), séchée sur MgSO4 et concentrée à sec. Le résidu est recristallisé à l'aide d'un mélange AcOEt/hexane (5/5) pour donner une poudre blanche (1,83 g, 82%).
Rf= 0,58 (AcOEt/hexane, 5/5) Pf = 110-112 C RMN 1H (CDC13) S 7,75 (d; J = 7,4 Hz; 2H) ; 7,58 (d; J,= 7,4 Hz; 2H) ; 7,40 (t; J = 7,4 Hz; 2H) ; 7,30 (t; J = 7,3 Hz; 2H) ; 6,10 (s, 1H) ; 5,65 (s, 1H) ; 5,55 (d; J = 7,6 Hz; 1H) ; 4,55-4,35 (m, 2H) ; 4,20 (t; J = 6,5 Hz; 1H) ; 3,68-3,45 (m, 2H) ; 2,10-1,65 (m, 4H).
Ce composé répond à la formule suivante:
O O H
N'-..../'---NH2 N=C=S Il s'agit donc d'un composé répondant à la formule (IIa) dans laquelle R'a représente un groupe NH2.
2- Synthèse de Ac-Val-Gly-Leu-Arg-NH2.
2-1. Attachement du dérivé Fmoc-L-Orn(N&CS)-NH2 sur une résine Rink amide MBHA: formation du lien thiourée (Fmoc-L-Tci(Nco-Rink)-NH2). La résine Rink amide MBHA (2,1 g; substitution 0,7 mmol/g) dont la fonction amine est protégée par un groupement Fmoc, est introduite dans un réacteur de synthèse manuelle, puis mouillée et lavée par du DMF. La protection Fmoc est éliminée à l'aide d'une solution de 20% de pipéridine dans le DMF (15 mL, 5 min, puis 15 mL, 15 min). Après élimination par filtration de la solution de déprotection et lavages par le DMF, la résine est rincée plusieurs fois par du THF. A la résine est ajoutée une solution de Fmoc-LOrn(N.CS)-NH2 (1,8 g; 3,1 éq) et de TEA (0,64 mL; 3,1 éq) dans le THF (25 mL). La suspension est agitée pendant 1,5 h à 60 C et une nuit à température ambiante. Après élimination de la phase liquide par filtration, la résine est lavée par du DCM (1 fois) et du DMF (3 fois). L'achèvement de l'attachement est vérifié par l'obtention d'un test au TNBS négatif.
2-2. Construction du peptide Ac-Val-Gly-Leu-Tci(Nc -Rink)-NH2. La synthèse du peptide suit les protocoles classiques de synthèse peptidique en phase solide et comprend une suite de cycles déprotection/couplage réalisés dans l'ordre des résidus du peptide désiré, du C-terminal vers le N-terminal. La déprotection du groupement protecteur Fmoc est réalisée comme décrit précédemment, c'est-à-dire à l'aide d'une solution pipéridine/DMF (20/80) en deux temps (5 min et 15 min). Les couplages sont réalisés de la façon suivante: après déprotection, la résine est lavée avec du DMF, puis est ajoutée une solution du dérivé protégé Fmoc- amino acide (3 'éq.), HBTU (3 éq), HOBt (3 éq) et DIEA (3,1 éq) dans le DMF (15-20 mL). Après 2-3 h d'agitation, la phase liquide est éliminée par filtration et la résine est lavée par DMF, MeOH, DCM, DMF. L'achèvement du couplage est évalué par un test au TNBS. S'il est positif, un second couplage est effectué. Après construction du peptide et élimination du groupement Fmoc, la fonction amine du résidu valine N- terminal est acétylée à l'aide d'une solution d'acide acétique (4 éq), HBTU (4 éq), HOBt (4 éq) et DIEA (4,1 éq) dans le DMF (15 mL). Après 2 h d'agitation, la résine est traitée comme après un couplage.
Le composé ainsi obtenu répond à la formule suivante: HNN s
O
c'est-à-dire Ac-Val-Gly-Leu-HN
O H O H rl
O H O j
Ce composé est un composé répondant à la formule (IIIb), dans laquelle R'a = NH2, z = 3, AA1 = Leu, AA2 = Gly, AA3 = Val, X = Ac et R1 H. 2-3. S-méthylation de la thiocitrulline: Ac-Val-Gly-Leu-SMeltc(Nw-Rink)- NH2. Le dérivé précédent, toujours fixé sur la résine, est traité par une solution de CH3I 0,2M dans le DMF (0,25 mL de CH3I dans 20 mL de DMF) pendant 1 heure à température ambiante. Cette opération est renouvelée deux fois. La résine est ensuite lavée par du DMF (3 fois) et du DCM (3 fois), puis séchée sous vide. Après clivage d'un échantillon de résine (voir conditions ci-après), l'analyse par HPLC en phase inverse et par spectrométrie de masse du peptide brut obtenu montre que la S-méthylation du groupement thiourée est complète dans ces conditions.
Le composé ainsi obtenu répond à la formule suivante: (D HN,.S-Me Ac-ValGly-Leu-HN Ce composé correspond donc à un composé de formule (Va), dans laquelle 10 R'a=NH2,z=3,AA1=Leu, AA2=Gly, AA3=Val, X=Ac,R1=HetR4=Me.
2-4. Guanylation de la S-méthyl-isothiocitrulline: Ac-Vil-Gly-Leu-Arg(NcoRink)-NH2. La résine précédente (0,13 g; 0,09 mmol) est transférée dans un tube, puis mouillée avec du DMSO. Une solution d'acétate d'ammonium 2 M dans le DMSO (1,54 g dans 10 mL de DMSO) est ensuite ajoutée et le tube est scellé. La suspension est agitée pendant 12 h à 80 C. Après refroidissement, la résine est transférée à nouveau dans un réacteur pour synthèse manuelle, lavée par du DCM (3 fois), du DMF (3 fois), du DCM (2 fois), et séchée sous vide.
On obtient alors un composé de formule suivante: Ac-Val-Gly-Leu-HN
O
Ce composé correspond donc à un composé de formule (VIIa), dans laquelle R'a = NH2, z = 3, AA1 = Leu, AA2 = Gly, AA3 = Val, X = Ac et R1= H. 2-5. Clivage de la résine. La résine précédente (0,13 g) est traitée par un mélange de TFA/TIS/H20 (95/2,5/2,5) (1,3 mL). Après 1,5 h d'agitation à température ambiante, la résine est éliminée par filtration, puis le filtrat est concentré sous vide. Le résidu est repris par de l'éther diéthylique. Le peptide brut précipite, est récupéré par filtration, puis est solubilisé dans un mélange H20/MeCN/TFA (50/50/0,1) et lyophilisé (17 mg, 39% ; pureté, 85%).
Formule brute C21H40N805, M = 484,46; m/z (ES+) 485,4 (M+H+) HPLC (conditions B = gradient de 0% à 100% de CH3CN en 3 min, colonne C18 5 Chromolith SpeedRod 4,6 x 50 mm) tR = 0,78 min. Le composé final obtenu repond à la formule suivante: HN vNK2
O H
Il ^.-'N
N H
O
Il s'agit donc d'un composé de formule (VIIIa) dans laquelle Ra, = NH2, z = 3, 15 AA1 = Leu, AA2 = Gly, AA3 = Val, X = Ac et R1= H. 3- Synthèse de Ac-Val-Gly-Leu-Arg(Nc Me)-NH2.
La résine Ac-Val-Gly-Leu-SMeltc(Nco-Rink)-NH2 (0,5 g; 0,35 mmol) est traitée comme décrit ci-dessus (paragraphe 2-4). Le dérivé guanidine Nméthylé est formé par réaction avec 20 mL d'une solution de chlorhydrate de méthylamine 2 M (2,7 g) et de NMM 2 M (4,4 mL) dans le DMSO. Après agitation pendant 12 h à 80 C dans un tube scellé et refroidissement, la résine est lavée avec du DCM (3 fois), du DMF (3 fois), du DCM (2 fois), puis séchée et clivée par 5 mL d'une solution de TFAITIS/H2O (95/2,5/2,5) comme décrit précédemment (paragraphe 2-5.) (62 mg, 36% ; pureté, 98%).
Formule brute C22H42N805, M = 498,63; m/z (ES+) 499,3 (M+H+) HPLC (conditions B) tR = 1,39 min. Le composé ainsi obtenu répond à la formule suivante:
NH
o Ac-V al-Gly-Leu-HN NHz
H
N--- --'NHZ c'est-à-dire H o o
NH HN HN\N CH3 H Ce composé répond donc à la formule (VIIIa) dans laquelle Ra, =
NH2, z = 3, AA1 = Leu, AA2 = Gly, AA3 = Val, X = Ac et RI = Me.
4- Synthèse de Ac-Val-Gly-Leu-Arg(Ncv-Et)-NH2.
La résine Ac-Val-Gly-Leu-SMeltc(Ncv-Rink)-NH2 (0,5 g, 0,35 mmol) est traitée comme décrit ci-dessus (paragraphe 2-4). Le dérivé N-éthyl guanidine est formé par réaction avec 20 mL d'une solution de chlorhydrate d'éthylamine 2,5 M (4,07 g) et de NMM 2,5 M (5,5 mL) dans le DMSO. Après agitation pendant 17 h à 80 C dans un tube scellé et refroidissement, la résine est lavée avec du DCM (3 fois), du DMF (3 fois) , du DCM (2 fois), puis séchée et clivée par 5 mL d'une solution de TFA/TIS/H20 (95/2,5/2,5) comme décrit précédemment (paragraphe 2-5)(103 mg, 58% ; pureté, 83%).
Formule brute C23H44N805, M = 512,66; m/z (ES+) 513,4 (M+H+) HPLC (conditions B) tR = 1,45 min. Le composé ainsi obtenu répond à la formule suivante: o o H Ac-Val-Gly-Leu-HN NH N\/NHZ E 2 o o c'est-à-dire
NH
HN\H j CH, zNH HN N H CH3 z Ce composé répond donc à la formule (VIIIa) dans laquelle Ra = NH2, z = 3, AA1 = Leu, @A2 = Gly, AA3 = Val, X = Ac et RI = Et.
5- Synthèse de Ac-Val-Gly-Leu-Arg(Nrv-OH)-NH2.
La résine Ac-Val-Gly-Leu-SMeltc(Ncv-Rink)-NH2 (0,28 g, 0,196 mmol) est traitée comme décrit ci-dessus (paragraphe 2-4). Le dérivé N-hydroxy guanidine est formé par réaction avec 20 mL d'une solution de chlorhydrate d'hydroxylamine 2,5 M (3,47 g) et de NMM 2,5 M (5,5 mL) dans le DMSO. Après agitation pendant 17 h à 80 C dans un tube scellé et refroidissement, la résine est lavée avec du DCM (3 fois), du DMF (3 fois), du DCM (2 fois), puis séchée et clivée par 3 mL d'une solution de TFA/TIS/H20 (95/2,5/2,5) comme décrit précédemment (paragraphe 2-5)(35 mg, 36% ; pureté, 80%).
Formule brute C21H40N806, M = 500,60; m/z (ES+) 502,3 (M+H+) HPLC (conditions B) tR = 1,39 min. Le composé ainsi obtenu répond à la formule suivante: o o H NN ,,,./ NH2 Ac Val-Gly Leu HNN ,,,./ NH2 z c'est-à-dire o o
NH
HN \NH OH
NH HNNH-OH
Ce composé répond donc à la formule (VIIIa) dans laquelle Ra, = NH2, z = 3, 20 AA 1= Leu, AA2 = Gly, AA3 = Val, X = Ac et R1= OH.
Exemple 2: Synthèse de substrats fluorogéniques comportant l'AMC comme 25 fluorophore et l'arginine comme résidu P1.
1- Synthèse de Fmoc-L-Orn(N6-CS)-AMC.
1-1. Fmoc-L-Orn(NS-Boc)-AMC. A une solution du dérivé protégé Fmoc-LOm(NSBoc)-OH (5,29 g; 11,6 mmol), de pyridine (0,9 mL) et de (Boc)20 (3,12 g, 14,3 mmol) dans le dioxane (45 mL), est ajoutée l'AMC (2,51 g; 14,3 mmol). Après 24 heures d'agitation à température ambiante, le gel obtenu est dilué dans 200 mL d'acétate d'éthyle. La phase organique est lavée par NaHCO3 saturé (3 fois), KHSO4 1M (3 fois), et NaCl saturé (1 fois). Elle est ensuite séchée sur MgSO4 et concentrée à sec. Le produit obtenu est purifié sur colonne de gel de silice en utilisant le mélange AcOEtlhexane (5/5) puis AcOEt 100 % comme éluants.
Solide jaune pâle (5,84 g; 83%).
Formule brute C35H37N307, M = 611; m/z (ES+) 612,44 (M+H+) ; 634,09 (M+Na+ ) ; 556,12 (M-tBu+H+) ; 512,38 (M-Boc+H+) Pf 160-162 C Rf= 0,22 (AcOEt/hexane 5/5) HPLC (conditions B) tR = 3,58 min RMN 1H (CDC13) S 7, 80 (d; J = 7,4 Hz; 2H) ; 7,70 (s, 1H) ; 7,62 (d; J = 7,2 Hz; 2H) ; 7,60-7, 50 (m, 2H) ; 7,40 (t; J = 7,2 Hz; 2H) ; 7,32 (t; J = 7,3 Hz; 2H) ; 6,20 (s, 1H) ; 5,78 (d, 1H) ; 4,70 (m, 1H) ; 4,40 (m, 2H) ; 4,20 (t; J = 6,8 Hz; 1H) ; 3,60-3,00 (m, 2H) ; 2,40 (s, 3H) ; 1,90-1,55 (m, 4H) ; 1,49 (s, 9H).
Ce composé répond à la formule suivante: 1-2. Fmoc-L-Orn-AMC. Le composé précédent (5,8 g; 9,5 mmol) est traité par 56 mL d'un mélange TFAIDCM (50/50) pendant 35 minutes à température ambiante. Après évaporation sous vide des solvants, le résidu liquide est repris par de l'éther diéthylique. Le composé désiré précipite sous la forme d'une poudre jaune hygroscopique qui est récupérée par filtration (6,42 g; 100%).
Formule brute C30H29N305, M = 511; m/z (ES+) (M+H+) = 512,1 HPLC (conditions B) tR = 2,61 min. Ce composé répond à la formule suivante: 1-3. Fmoc-L-Orn(N8-CS)-AMC. A une solution du composé précédent (6,38 g; 10,2 mmol) dans le THF (50 mL), sont ajoutés à 0 C de la TEA (5,03 mL; 35, 7 mmol) et du disulfure de carbone (5,4 mL; 89,4 mmol). Après 45 minutes d'agitation à 0 C, 12,2 mL de H202 (107,2 mmol) sont ajoutés goutte à goutte à 0 C. Le mélange est ensuite dilué avec 100 mL d'éther diéthylique, puis la phase organique est lavée avec KHSO4 1M (2 fois), H2O (1 fois), NaCl saturé (1 fois), séchée sur MgSO4 et concentrée sous vide. Le résidu est recristallisé à l'aide d'un mélange AcOEt/hexane (5/5) pour donner une poudre blanche (5,59 g; 98,8%).
Pf 156-158 C Rf= 0,26 (AcOEt/hexane, 5/5) Le composé obtenu répond à la formule suivante: H CH3 N=C=S Ce composé correspond à un composé de formule (IIa) dans laquelle Ra, = AMC.
1-4. Attachement du dérivé Fmoc-L-Orn(NS-CS)-AMC sur une résine Rink amide MBHA: formation du lien thiourée (Fmoc-L-Tci(Nco-Rink)-AMC). La résine Rink amide MBHA (4,78 g; substitution 0,7 mmol/g) dont la fonction amine est protégée par un groupement Fmoc, est introduite dans un réacteur de synthèse manuelle, puis mouillée et lavée par du DMF. La protection Fmoc est éliminée à l'aide d'une solution de 20% de pipéridine dans le DMF (25 mL, 5 min, puis 25 mL, 15 min). Après élimination par filtration de la solution de déprotection et lavages par le DMF, la résine est rincée plusieurs fois par du THF. A la résine est ajoutée une solution de Fmoc-LOrn(N6-CS)-AMC (5,56 g, 3 éq) et de TEA (1,46 mL, 3,1 éq) dans le THF (75 mL). La suspension est agitée pendant 80 min à 62 C et une nuit à température ambiante. Après élimination de la phase liquide par filtration, la résine est lavée par du DCM (1 fois) et du DMF (3 fois) . L'achèvement de. l'attachement est vérifié par l'obtention d'un test au TNBS négatif.
2- Synthèse de Ac-Ile-Glu-Gly-Arg-AMC: substrat du facteur Xa.
2-1. Ac-Ile-Glu(OtBu)-Gly-Tci(Nco-Rink)-AMC. Une portion de la résine Fmoc-L-Tci(Nw-Rink)-AMC (0,79 g) est traitée deux fois par un mélange pipéridine/DMF (20/80) pendant 5 et 15 minutes pour éliminer la protection Fmoc. La synthèse du peptide est ensuite réalisée en suivant les protocoles classiques de synthèse peptidique en phase solide. Elle comprend une suite de cycles déprotection/couplage réalisés dans l'ordre des résidus du peptide désiré, du C-terminal vers le N-terminal. La déprotection du groupement protecteur Fmoc est réalisée comme décrit précédemment. Les couplages sont réalisés de la façon suivante: après déprotection, la résine est lavée avec du DMF, puis est ajoutée une solution du dérivé protégé Fmoc-amino acide (Fmoc-Gly-OH: 0,52 g; Fmoc-Glu(OtBu)-OH: 0,75 g; Fmoc-Ile-OH: 0,62 g; 3,2 éq), HBTU (0,66 g, 3,2 éq), HOBt (0,27 g, 3,2 éq) et DlEA (0,31 mL, 3,2 éq) dans le DMF (15-20 mL). Après 2-3 h d'agitation, la phase liquide est éliminée par filtration et la résine est lavée par DMF, MeOH, DCM, DMF. L' achèvement du couplage est évalué par un test au TNBS. S'il est positif, un second couplage est effectué. Après construction du peptide et élimination du groupement Fmoc, la fonction amine du résidu isoleucine N-terminal est acétylée à l'aide d'une solution d'acide acétique (0,14 g; 4 éq), HBTU (0,88 g; 4 éq), HOBt (0,35 g; 4 éq) et DIEA (0,43 mL; 4,1 éq) dans le DMF (15 mL). Après 2 heures d'agitation, la résine est traitée comme après un couplage.
Le composé ainsi obtenu répond à la formule suivante: Ac-Ile-Glu(OtBu)GIy-HN
O
2-2. Ac-Ile-Glu(OtBu)-GIy-SMeltc(Nro-Rink)-AMC. Le dérivé précédent, toujours fixé sur la résine, est traité par une solution de CH3I 0,2M dans le DMF (0,25 mL de CH3I dans 20 mL de DMF) pendant 1 heure à température ambiante. Cette opération est renouvelée deux fois. La résine est ensuite lavée par du DMF (3 fois) et du DCM (3 fois), puis séchée sous vide.
Le composé ainsi obtenu répond à la formule suivante: Ac-Ile-Glu(OtBu)GIy-HN O 25 2-3. Ac-Ile-Glu-Gly-Arg-AMC. La résine précédente est transférée dans un tube, puis mouillée avec du DMSO. Une solution d'acétate d'ammonium 2 M dans le DMSO (1,54 g dans 10 mL de DMSO) est ensuite ajoutée et le tube est scellé. La suspension est agitée pendant 12 h à 80 C. Après refroidissement, la résine est transférée à nouveau dans un réacteur pour synthèse manuelle, lavée par du DCM (3 fois), du DMF (3 fois), du DCM (2 fois), et séchée sous vide. La déprotection du peptide et le clivage de la résine sont effectués par traitement pendant 2 h avec 8 mL d'un mélange TFA/TIS/H20 (95/2,5/2,5), pour donner 231 mg de composé brut. La purification par HPLC préparative en phase inverse (colonne C18) donne 115 mg (31%) de substrat (pureté > 96%).
Formule brute C31H44N809; M = 672,0; m/z (ES+) (M+H+) = 673,2; ([M+2H+]/2) = 337,2 HPLC (conditions B) tR = 1,79 min. HN \NH2 Ce composé final correspond à un composé de formule (VIIIa) dans laquelle Ra, _ AMC, z = 3, AA1 = Gly, AA2 = Glu, AA3 = Ile, X = Ac et R1 = H. 3- Synthèse de Ac-Phe-Val-Arg-AMC: substrat de la thrombine.
3-1. Ac-Phe-Val-Tci(Na -Rink)-AMC. La synthèse est réalisée comme décrit 20 au paragraphe 2-1 à partir de 0,79 g de la résine Fmoc-L-Tci(Nw-Rink)AMC (voir paragraphe 1-4) en utilisant les dérivés d'amino acides suivants: Fmoc-Val-OH (0,60 g, 3,2 éq), Fmoc-Phe-OH (0,68 g, 3,2 éq).
3-2. Ac-Phe-Val-SMeltc(Nrv-Rink)-AMC. La méthylation du groupement 25 thiourée du composé précédent est réalisée comme décrit au paragraphe 2-2, à l'aide d'une solution de CH3I 0,2 M dans le DMF (0,25 mL de CH3I dans 20 mL DMF).
3-3. Ac-Phe-Val-Arg-AMC. La guanylation du composé précédent et le clivage de la résine sont réalisés comme décrit au paragraphe 2-3, pour donner 227 mg de produit brut. La purification par HPLC préparative en phase inverse sur colonne C18 donne 105 mg (31%) de substrat (pureté > 96%).
Formule brute C32H41N706; M = 619,0; m/z (ES+) (M+H+) = 620,4 HPLC (conditions B) tR = 2,08 min. c'est-à-dire O OH NH Ac-Ile-Glu-Gly-Arg-HN Le composé final ainsi obtenu répond à la formule suivante: H CH3 Le composé final obtenu répond à la formule suivante:
C H
N o o c'est-à-dire CH3
H A
NH
HN NHZ
et correspond à un composé de formule (VIIIa) dans laquelle Ra, = AMC, z = 2, AA1 = Val, AA2 = Phe, X = Ac et R1 = H. 4- Synthèse de Ac-Leu-Ser-Thr-Arg-AMC: substrat de la protéine C activée.
4-1. Ac-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Tci(Nci -Rink)-AMC. La synthèse est réalisée comme décrit au paragraphe 2-1 à partir de 0,79 g de la résine Frnoc-L-Tci(Na -Rink)-AMC (voir paragraphe 1-4) en utilisant les dérivés d'amino acides suivants: Fmoc-Thr(tBu)-OH (0,67 g; 3,2 éq), Fmoc-Ser(tBu)OH (0,68 g; 3,2 éq), Fmoc-Leu-OH (0,63 g, 3,2 éq).
4-2. Ac-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-SMeltc(Nco-Rink)-AMC. La méthylation du groupement thiourée du composé précédent est réalisée comme décrit au paragraphe 2-2, à l'aide d'une solution de CH3I 0,2 M dans le DMF (0,25 mL de CH3I dans 20 mL DMF).
4-3. Ac-Leu-Ser-Thr-Arg-AMC. La guanylation du composé précédent et le clivage de la résine sont réalisés comme décrit au paragraphe 2-3, pour donner 265 mg de produit brut. La purification par HPLC préparative en phase inverse sur une colonne C 18 donne 130 mg (35%) de substrat (pureté > 96%).
Formule brute C31H46N8O9; M = 674,0; m/z (ES+) (M+H+) = 675,5 HPLC (conditions B) tR = 1,84 min. Le composé final obtenu répond à la formule suivante: et correspond à un composé de formule (VIIIa) dans laquelle Rc,, = AMC, z = 3, AA1 = Thr, AA2 = Ser, AA3 = Leu, X = Ac et RI = H. 5Synthèse de Ac-Val-Pro-Arg-AMC: substrat de la thrombine.
5-1. Ac-Val-Pro-Tci(Nw-Rink)-AMC. La synthèse est réalisée comme décrit au paragraphe 2-1 à partir de 0,79 g de la résine Fmoc-L-Tci(Nco-Rink)- AMC (voir paragraphe 1-4) en utilisant les dérivés d'amino acides suivants: Fmoc-Pro-OH (0,59 g; 3,2 éq), Fmoc-Val-OH (0,6 g; 3,2 éq).
5-2. Ac-Val-Pro-SMeltc(Nco-Rink)-AMC. La méthylation du groupement thiourée du composé précédent est réalisée comme décrit au paragraphe 2-2, à l'aide d'une solution de CH3I 0,2 M dans le DMF (0,25 mL de CH3I dans 20 mL DMF).
5-3. Ac-Val-Pro-Arg-AMC. La guanylation du composé précédent et le clivage de la résine sont réalisés comme décrit au paragraphe 2-3, pour donner 145 mg de produit brut. La purification par HPLC préparative en phase inverse sur une colonne C 18 donne 50 mg (16%) de substrat (pureté > 96%).
Formule brute C28H39N706; M = 569,0; m/z (ES+) (M+H+) = 570,3 HPLC (conditions B) tR = 1,83 min. Le composé final obtenu répond à la formule suivante: Hg CH3 z
NH
et correspond à un composé de formule (VIIIa) dans laquelle Ra = AMC, z = 2, AA1 = Pro, AA2 = Val, X = Ac et R1 = H. 6- Synthèse de Ac-Ala-Lys-Arg-AMC: substrat de la protéase à sérine IRC.
6-1. Ac-Ala-Lys(Ne-Boc)-Tci(Nco-Rink)-AMC. La synthèse est réalisée comme décrit au paragraphe 2-1 à partir de 0,79 g de la résine Fmoc-L-Tci(NoRink)-AMC (voir paragraphe 1-4) en utilisant les dérivés d'amino acides suivants: Fmoc-Lys(Boc)-OH (0,83 g; 3,2 éq), Fmoc-Ala-OH (0,55 g; 3,2 éq).
6-2. Ac-Ala-Lys(Ne Boc)-SMeltc(NarRink)-AMC. La méthylation du groupement thiourée du composé précédent est réalisée comme décrit au paragraphe 2-2, à l'aide d'une solution de CH3I 0,2 M dans le DMF (0,25 mL de CH3I dans 20 mL DMF).
6-3. Ac-Ala-Lys-Arg-AMC. La guanylation du composé précédent et le clivage 25 de la résine sont réalisés comme décrit au paragraphe 2-3, pour donner 231 mg de produit brut. La purification par HPLC préparative en phase inverse sur une colonne C18 donne 95 mg (30%) de substrat (pureté > 96%).
Formule brute C27H40N8O6 M = 572,0; m/z (ES+) (M+H+) = 573,3; ([M+2H+]/2) = 287,3 HPLC (conditions B) tR = 1,46 min. Le composé final obtenu répond à la formule suivante: NH2 HN \NH2 et correspond à un composé de formule (VIIIa) dans laquelle Ra = AMC, z = 2, AA1 = Lys, AA2 = Ala, X = Ac et R1 = H. 7- Synthèse de Ac-Val-Gly-Arg-AMC: substrat "trypsin-like".
7-1. Ac-Val-Gly-Tci(Nw-Rink)-AMC. La synthèse est réalisée comme décrit au paragraphe 2-1 à partir de 0,79 g de la résine Fmoc-L-Tci(Nco-Rink)- AMC (voir paragraphe 1-4) en utilisant les dérivés d'amino acides suivants: Frnoc-Gly-OH (0,53 g, 3,2 éq), Fmoc-Val-OH (0,60 g; 3,2 éq).
7-2. Ac-Val-GIy-SMeItc(Nco-Rink)-AMC. La méthylation du groupement thiourée du composé précédent est réalisée comme décrit au paragraphe 2-2, à l'aide d'une solution de CH3I 0,2 M dans le DMF (0,25 mL de CH3I dans 20 mL DMF).
7-3. Ac-Val-Gly-Arg-AMC. La guanylation du composé précédent et le clivage de la résine sont réalisés comme décrit au paragraphe 2-3, pour donner 195 mg de produit brut. La purification par HPLC préparative en phase inverse sur une colonne C18 donne 88 mg (27%) de substrat (pureté > 96%).
Formule brute C25H35N706; M = 529,0; m/z (ES+) (M+H+) = 530,3 HPLC (conditions B) tR = 1,75 min. O =
NH
Le composé final obtenu répond à la formule suivante: et correspond à un composé de formule (VIIIa) dans laquelle Ra = AMC, z = 2, AA1 = Gly, AA2 = Val, X = Ac et R1= H. 8- Synthèse de Ac-Val-Gly-Leu-Arg-AMC: substrat de la gp76 de Plasmodium falciparum.
8-1. Ac-Val-Gly-Leu-Tci(Na)-Rink)-AMC. La synthèse est réalisée comme décrit au paragraphe 2-1 à partir de 0,53 g de la résine Fmoc-L-Tci(NcoRink)-AMC (voir paragraphe 1-4) en utilisant les dérivés d'amino acides suivants: Fmoc-Leu-OH (0,4 g; 3 éq), Fmoc-Gly-OH (0,33 g; 3 éq), Fmoc-Val-OH (0,38 g; 3 éq). Les quantités de réactifs utilisés pour les couplages sont: HBTU (0,42 g; 3 éq), HOBt (0,17 g; 3 éq) ; DIEA (0,2 mL; 3,1 éq). L'acétylation de la fonction amine N-terminale est réalisée à l'aide de 4 éq d'acide acétique (0,09 g), 4 éq de HBTU (0,56 g), 4 éq de HOBt (0,23 g) et 4,1 éq de DIEA (0,26 mL).
8-2. Ac-Val-Gly-Leu-SMeltc(Nw-Rink)-AMC. La méthylation du groupement thiourée du composé précédent est réalisée comme décrit au paragraphe 2-2, à l'aide d'une solution de CH3I 0,2 M dans le DMF (0,25 mL de CH3I dans 20 mL DMF).
8-3. Ac-Val-Gly-Leu-Arg-AMC. La guanylation du composé précédent et le clivage de la résine sont réalisés comme décrit au paragraphe 2-3 (conditions de clivage: 6 mL du mélange TFAITIS/H2O (95/2,5/2,5)), pour donner 82 mg de produit brut. La purification par HPLC préparative en phase inverse sur une colonne C18 donne 52 mg (22%) de substrat (pureté > 96%).
Formule brute C31H46N807;M = 642,0; m/z (ES+) (M+H+) = 643,5 HPLC (conditions B) tR = 2,0 min. Le composé final obtenu répond à la formule suivante HN \NH2 et correspond à un composé de formule (VIIIa) dans laquelle Ra, = AMC, z = 3, AA1 = Leu, AA2 = Gly, AA3 = Val, X = Ac et R1 = H. Exemple 3: Synthèse de Fmoc-Tci-NH2 1,8 g de résine Rink amide MBHA (substitution 0,7 mmol/g), dont la fonction amino est protégée par un groupement Fmoc, est introduite dans un réacteur de synthèse manuelle, puis mouillée et lavée par du DMF. La protection Fmoc est éliminée à l'aide d'une solution de 20% de pipéridine dans le DMF (15 mL, 5 min puis 15 mL, 15 min).
Après élimination par filtration de la solution de déprotection et lavages par le DMF, la résine est rincée plusieurs fois par du THF. A la résine est ajoutée une solution de Fmoc-L-Orn(N8-CS)-NH2 (1,5 g, 3,8 mmol, 3 éq) (voir Example 1 , paragraphe 1) et de TEA (0,55 mL, 3,1 éq) dans le THF (25 mL). La suspension est agitée pendant 80 min à 62 C et une nuit à température ambiante. Après élimination de la phase liquide par filtration, la résine est lavée par du DCM (1 fois), du DMF (3 fois) et du DCM (3 fois), et séchée. Une portion de la résine obtenue FmocTci(NarRink)-NH2 (0,55 g) est clivée à l'aide de 5,5 mL du mélange TFA/TIS/H20 (95/2,5/2,5) pour donner 110 mg (69%) de Fmoc-Tci-NH2 (pureté > 95%). 15
Formule brute C21H23N4O3S, M = 412; m/z (ES+) (M+H+) = 413,1 HPLC (conditions B) tR = 2,34 min RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) S 7,90 (d; J= 7,5 Hz; 2H) ; 7,70 (d; J= 7,2 Hz; 2H) ; 7,40 (t; J = 6,7 Hz; 2H) ; 7,25 (t; J = 7,0 Hz; 2H) ; 7,00 (s, 1H) ; 6,85 (s, 1H) ; 5 4,38-4,15; 4,18-4,10 (m, 2H) ; 4,00-3,80 (m, 1H) ; 3,42- 3,22 (q; J = 7,3 Hz; 2H) ; 1,75-1,50 (m, 4H).
Le composé obtenu répond à la formule suivante: Exemple 4: Synthèse de Fmoc-SMeltc-NH2.
0,35 g de la résine Fmoc-Tci(Nco-Rink)-NH2 est traité par une solution de CH3I 0,2 M dans le DMF (0,375 mL de CH3I dans 30 mL de DMF) pendant 1 h à température ambiante. Cette opération est renouvelée deux fois. Après lavages par le DMF et le DCM, la résine est séchée et clivée comme décrit précédemment pour donner 60 mg (58%) de Fmoc-SMeltc-NH2 (pureté > 95%).
Formule brute C22H25N4O3S; M = 426,5; m/z (ES+)(M+.,H+) = 427,5 25 HPLC (conditions B) tR = 2,25 min RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 6 9,10 (s, 2H) ; 7, 90 (d; J 7,5 Hz; 2H) ; 7,70 (t; J= 6,6 Hz; 2H) ; 7,50 (t; J= 7,3 Hz; 2H) ; 7,32 (t; J= 7,4 Hz; 2H) ; 7,10 (s, 1H) ; 4,35-4,25 (m, 1H) ; 4,23-4,15 (m, 2H) ; 3,90 (t; J = 5,1 Hz; 1H) ; 3,35-3,25 (m, 2H) ; 2,58 (s, 3H) ; 1, 75-1,42 (m, 4H). 0 0 Il H N-NH2
N NH2 H s Exemple 5: Synthèse du dérivé semicarbazone d'un inhibiteur de protéase de type aldéhydique: Ac-Val-Gly-Leu-homoArgininal dont la fonction aldéhyde est protégée sous la forme d'un groupement semicarbazone.
1- Synthèse du dérivé semicarbazone de Boc-L-Lys(NE CS)-H.
1-1. Boc-L-Lys(Ne-Z)-N(OMe)Me. A une solution du chlorhydrate de N,Odiméthylhydroxylamine (0,565 g; 5,79 mmol) et de DIEA (2,75 mL; 15,8 mmol) dans le DCM (28 mL), sont ajoutés 2,33 g (5,26 mmol) de BOP et 2 g (5,26 mmol) de Boc-L-Lys(Ns-Z)-OH. La réaction est suivie par CCM (AcOEt/hexane, 7/3). A la fin de la réaction, le milieu réactionnel est concentré sous vide, puis le résidu est dissous dans l'éther. La phase organique est lavée avec KHSO4 1 M (3 fois), NaHCO3 saturé (3 fois), NaCl saturé (1 fois), est séchée sur MgSO4, puis évaporée sous vide pour donner une huile jaune (1,75 g, 79%).
Formule brute: C21H33N306; M = 423,5; m/z (ES+) 424,0 (M+H)+; 446,2 (M+Na)+; 368,0 (M-tBu+H)+; 324,2 (M-Boc+H)+; 847,5 (2M+Hj+; 869,6 (2M+Na)+ ; Rf= 0,6 (AcOEt/hexane, 7/3).
Le produit obtenu est le suivant: Boc-NH 20 1-2. Dérivé semicarbazone de Boc-L-Lys(Ne-Z)-H. A une solution du composé précédent (1,74 g; 4,11 mmol) dans le THF anhydre (27 mL)refroidie à 0 C, est ajouté du LiAlH4 (0,195 g; 5,14 mmol) en petites portions sur une durée de 20 min, puis le mélange est agité pendant 25 min à 0 C. La réaction est suivie par CCM (AcOEt/hexane, 7/3). L'excès de LiALH4 est ensuite neutralisé par l'addition de KHSO4 1 M. Le THF est évaporé, puis la phase aqueuse est extraite avec de l'éther diéthylique (30 mL, puis 2 fois 25 mL). Les phases organiques sont réunies et lavées avec KHSO4 1 M (3 fois), NaHCO3 saturé (3 fois), NaCl saturé (1 fois), séchées sur Na2SO4 et évaporées sous vide pour donner Boc-L-Lys(Ne-Z)-H sous la forme d'un solide blanc (1,04 g; 70%) qui est utilisé tel que pour l'étape suivante.
Formule brute C19H28N205; M=364,4.
Le dérivé aldéhyde obtenu (1,04 g, 2,86 mmol) est dissous dans l'éthanol absolu (15 mL), puis est ajoutée une solution de semicarbazide (0,32 g; 2, 86 mmol) et d'acétate de sodium (0,22 g; 2,86 mmol) dans l'eau (7 mL). Le mélange est chauffé à reflux pendant 25 min, puis laissé agiter 10 h à température ambiante. 25 mL d'eau sont alors ajoutés sous agitation et une extraction est réalisée avec AcOEt (3 fois 25 mL). Les phases organiques sont réunies, séchées sur MgSO4, et concentrées sous vide pour donner une huile incolore. Le produit obtenu est purifié à l'aide d'une colonne de gel de silice en utilisant le mélange AcOEt/MeOH (7/3) comme éluant. (0,680 g; 56%). Formule brute C20H31N505; M=421,5; m/z (ES+) 422, 2 (M+H)+; 439,3 (M+Na)+; 366,3 (M-tBu+H)+; 843,5 (2M+H)+; 865,2 (2M+Na)+; Rf= 0,48 (AcOEt/MeOH, 7/3) ; HPLC (conditions C) tR = 2,5 min. Le produit obtenu est le suivant: Boc-HNN N I I NH2 H
NE-Z
1-3. Dérivé semicarbazone de Boc-L-Lys-H. A une solution du composé précédent (1,90 g; 4,52 mmol) dans le méthanol (50 mL) sont ajoutés 20 pL d'acide acétique glacial et 200 mg de Pd/C 10%. La suspension est agitée à température ambiante sous courant d'hydrogène. Après 2 h, le mélange réactionnel est filtré sur célite et le solvant est évaporé sous vide. Le résidu est trituré dans un mélange éther/hexane pour donner une poudre blanchâtre qui est récoltée par filtration et séchée (1,43 g, 68%). Formule brute C12H25N503; M = 287,3; m/z (ES+) 288,2 (M+H)+ ; HPLC (conditions C) tR = 1,3 min. Le produit obtenu est le suivant:
H O
H O
Boc-HNN N II NH2 H NH2 1-4. Dérivé semicarbazone de Boc-L-Lys(Ns-CS)-H. A une solution du composé précédent (1,43 g; 5,0 mmol) dans le THF (25 mL), sont ajoutés à 0 C du TEA (1,54 mL; 11,0 mmol) et du CS2 (1,57 mL; 26,0 mmol). Après 45 min d'agitation à 0 C, 12,2 mL (107,2 mmol) de H202 sont ajoutés goutte à goutte à 0 C. Le mélange est ensuite dilué avec de l'éther (50 mL), puis la phase organique est lavée avec KHSO4 1 M (2 fois), IH20 (1 fois), NaCl saturé (1 fois), séchée sur MgSO4 et concentrée sous vide pour donner un produit pâteux jaune (1,21 g; 73%). Rf= 0,18 (AcOEt).
Le produit obtenu est le suivant: N=C=S 2- Synthèse du dérivé semicarbazone de Ac-Val-Gly-Leu-homoArgininal.
2-1. Attachement du dérivé semicarbazone de Boc-L-Lys(Ne-CS)-H sur une résine Rink amide MBHA: formation du lien thiourée (Boc-L-homoTci(NcoRink)-H). La résine Rink amide MBHA (1,7 g, substitution 0,7 mmol/g) dont la fonction amine est protégée par un groupement Fmoc, est introduite dans un réacteur de synthèse manuelle, puis mouillée et lavée par du DMF. La protection Fmoc est éliminée à l'aide d'une solution de 20% de pipéridine dans le DMF (15 mL, 5 min, puis 15 mL, 15 min). Après élimination par filtration de la solution de déprotection et lavages par le DMF, la résine est rincée plusieurs fois par du THF. A la résine est ajoutée une solution du dérivé semicarbazone de Boc-L-Lys(Ne-CS)-H (1,21 g; 3 éq) et de TEA (0,49 mL; 3,1 éq) dans le THF (50 mL). La suspension est agitée pendant 1 h 20 min à 62 C et une nuit à température ambiante. Après élimination de la phase liquide par filtration, la résine est lavée par du DCM (1 fois) et du DMF (3 fois). L'achèvement de l'attachement est vérifié par l'obtention d'un test au TNBS négatif.
H O
Boc-HN_N_H NH2 H o Le produit obtenu est le suivant: Boc-HNN/N_N I I H2
H
2-2. Dérivé semicarbazone de H-L-homoTci(Nco-Rink)-H. Le clivage du groupement Boc suit le protocole décrit par Zhang et al. (1998). La résine est traitée par une solution de TMSOTf (3,9 mL, 1 M final) et 2,6lutidine (3,5 rnL, 1,5 M final) dans le DCM (20 mL) (2 fois 30 min). La résine est ensuite lavée avec DCM (5 fois 1 min), MeOH, (3 fois 5 min), DMF (5 fois 1 min).
Le produit obtenu est le suivant: H H2NN--=N N II NH2 s
HN HN s
2-3. Dérivé semicarbazone de Ac-Val-Gly-Leu-L-homo T ci(Nco-Rink)-H. La synthèse du peptide suit les protocoles classiques de synthèse pepttdique en phase solide et comprend une suite de cycles déprotection/couplage réalisés dans l'ordre des résidus du peptide désiré, du C-terminal vers le N-terminal. La déprotection du groupement protecteur Fmoc est réalisée comme décrit précédemment, c'est-à-dire à l'aide d'une solution pipéridine/DMF (20/80) en deux temps (5 min et 15 min). Les couplages sont réalisés de la façon suivante: après déprotection, la résine est lavée avec du DMF, puis est ajoutée une solution du dérivé protégé Fmoc- amino acide (3 éq.), HBTU (3 éq), HOBt (3 éq) et DIEA (3,1 éq) dans le DMF (15-20 mL). Après 2-3 h d'agitation, la phase liquide est éliminée par filtration et la résine est lavée par DMF, MeOH, DCM, DMF. L'achèvement du couplage est évalué par un test au TNBS. S'il est positif, un second couplage est effectué. Après construction du peptide et élimination du groupement Fmoc, la fonction amine du résidu valine N- terminal est acétylée à l'aide d'une solution d'acide acétique (0,14 g; 4 éq), HBTU (0,88 g; 4 éq), HOBt (0,36 g; 4 éq) et DIEA (0,43 mL; 4,1 éq) dans le DMF (15 mL). Après 2 heures d'agitation, la résine est traitée comme après un couplage.
Le produit obtenu est le suivant: NH2 H 0 Ac vai-Gly-Leu-HN/I N N H s l:
O
2-4. Dérivé semicarbazone du peptide Ac-Val-Gly-Leu-L-homoTci-H. Un 15 échantillon de la résine précédente (0,2 g) a été clivé pour suivre le bon déroulement de la réaction. Le clivage est effectué en présence de TFA/H2O (9/1) (2 mL) pendant 1 heure, pour donner après traitement 35 mg (45%) de composé brut.' Formule brute C23H43N9O5S; M = 557,7; m/z (ES+) 558,5 (M+H)+ HPLC (conditions C) tR = 1,55 min. H o Le produit obtenu est le suivant: Ac Val-G1-Leu HN/ N H 11 NH2 2-5. Ac-Val-Gly-Leu-L-homoTci-H. A une solution du composé précédent (30 mg; 0,054 mmol) dans le MeOH (1 mL) sont ajoutés 108 L de HC1 0,5 N et 10 L de formaline. Après 4 h d'agitation à 0 C, le solvant est évaporé sous vide. Une coévaporation avec l'éther permet d'obtenir un solide jaune (19 mg, 71%).
Formule brute C22H40N6O5S; M = 500,6; m/z (ES+) 501,4 (M+H)+; 519,4 (M+ H2O+H)+; 483,4 (M-H2O+H)+ HPLC (conditions C) tR = 1,75 min. Le produit obtenu est le suivant: Ac-Val-Gly-Leu-HN o s Ce composé correspond à un composé de formule (IV), dans laquelle Z = CHO, m = 0, n = 4, p = 0, R1 = H, R2 = X-AAZ...-AA1 avec z = 3, AA1 = Leu, AA2 = Gly, AA3 = Val et X = Ac et R3 = H. 2-6. Dérivé semicarbazone de Ac-Val-Gly-Leu-homoArgininal. Le dérivé semicarbazone de Ac-Val-Gly-Leu-L-homoTci(NrrRinlc)-H (voir paragraphe 2- 3) est traité par une solution de CH3I 0,2 M dans le DMF(0,25 mL de CH3I dans 20 mL de DMF) pendant 1 heure à température ambiante. Cette opération est renouvelée deux fois. La résine est ensuite lavée par du DMF (3 fois) et du DCM (3 fois), puis séchée sous vide.
La résine est alors transférée dans un tube, puis mouillée avec du DMSO. Une solution d'acétate d'ammonium 2 M dans le DMSO (1,54 g dans 10 mL de DMSO) est ensuite ajoutée et le tube est scellé. La suspension est agitée pendant 12 h à 80 C. Après refroidissement, la résine est transférée à nouveau dans un réacteur pour synthèse manuelle, lavée par du DCM (3 fois) , du DMF (3 fois), du DCM (2 fois), et séchée sous vide.
La résine est clivée à l'aide d'un mélange de TFA/TIS/H2O (95/2,5/2,5). Après 1,5 h d'agitation à température ambiante, la résine est éliminée par filtration, puis le filtrat est concentré sous vide. Le résidu est repris par de l'éther di,thylique. Le peptide brut précipite, est récupéré par filtration, puis est solubilisé dans un mélange H2O/MeCN/TFA (50/50/0,1) et lyophilisé (35 mg, 42%).
Formule brute C23H44N10O5 M = 540,6; m/z (ES+) 541,4 (M+H)+; 484,4 (forme aldéhyde + H)+ HPLC (conditions C) tR = 1,41 min.
H O
Ac-Val-Gly-Leu-H ZN N N II NH a H HN NH H 2-7 Ac-Val-Gly-Leu-homoArgininal. A une solution du composé précédent (30 mg; 0,055 mmol) dans le MeOH (1 mL) sont ajoutés 110 L de HC1 0,5 N et 10 L de formaline. Après 4 heures d'agitation à 0 C, le solvant est évaporé sous vide. Une coévaporation à l'éther permet d'obtenir un solide jaunâtre (21 mg, 79%).
Formule brute C22H41N705 M = 483,5; m/z (ES+) 484,4 (M+H)+ HPLC (conditions C) tR = 1,65 min. Le produit obtenu est le suivant: o Le produit obtenu est le suivant: Ac-Val-Gly-Leu-HN N ''H
NH
Ce composé correspond à un composé de formule (VIII), dans laquelle Z = CHO, m = 0, n = 4, p = 0, RI = H, R2 = X-AAZ...-AA1 avec z = 3, AA1 = Leu, AA2 = Gly, AA3=ValetX=Ac,etR3=H.
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Claims (14)
1. Procédé de synthèse en phase solide sur une résine de composés de formule générale (I) suivante: Z 1 (H2) 1 m RZ N CH (CH2) (1) A a B NH(cl-12), -RI dans laquelle: Z représente l'un des groupes suivants: É un atome d'hydrogène, É un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, un groupe arylalkyle comprenant de 6 à 30 atomes de carbone, un groupe arylallyle comprenant de 6 à 30 atomes de carbone, un groupe aryle comprenant de 6 à 30 atomes de carbone, un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, un groupe fluorogénique ou chromogénique, É un groupe COORa, CORa ou CSRa, Ra représentant un atome d'hydrogène, ou 30. un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, un groupe arylalkyle cômprenant de 6 à 30 atomes de carbone, un groupe arylallyle comprenante de 6 à 30 atomes de carbone, un groupe aryle comprenant de 6 à 30 atomes de carbone, un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, un groupe fluorogénique ou chromogénique, un groupe acyle, Ra pouvant également représenter, lorsque Z représenté un groupe CORa ou CSRa, un résidu d'amino acide ou un peptide, un groupe halogéno-alkyle, notamment perfluoroalkyle de 1 à 3 atomes de carbone, un groupe N(Rb)Rc ou N(ORb)Rc, dans lequel Rb est un atome d'hydrogène, un groupe alkyle comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, linéaire ou ramifié, un groupe allyle, un groupe arylaikyle, arylallyle ou aryle comprenant de 6 à 30 atomes de carbone, un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, ou un groupe halogéno-alkyle tel que défini ci-dessus, et Rc est un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, un groupe arylalkyle, arylallyle ou aryle comprenant de 6 à 30 atomes de carbone, un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, É un groupe CH(ORe)Rd, Rd représentant un atome d'hydrogène, un groupe alkyle comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, un groupe arylalkyle, arylallyle ou aryle comprenant de 6 à 30 atomes de carbone, ou un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, ou un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, ou un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, ou un groupe halogéno-alkyle, notamment perfluoroalkyle de 1 à 3 atomes de carbone, ou un groupe acyle, Re représentant un atome d'hydrogène, un groupe alkyle comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, un groupe arylalkyle, arylallyle ou aryle comprenant de 6 à 30 atomes de carbone, un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, un groupe acyle, É un groupe N(Rg)Rf, Rf répondant à la définition donnéè précédemment pour Rd, et Rg répondant à la définition donnée précédemment pour Re, É un groupe NHOH ou N(OR;)Rh, Rh et R; répondant à la définition donnée précédemment pour Re, É un groupe ORS, Ri répondant à la définition donnée précédemment pour Re, É un groupe SRk, Rk répondant à la définition donnée précédemment pour Re, É un groupe -NH-CO-N(Rx)Ry ou -NH-CS-N(Rx)Ry, Rx et Ry, identiques ou différents, représentant H, un groupe alkyle de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe aryle ou alkylaryle comprenant de 5 à 30 atomes de carbone, m est égal à 0, ou représente un nombre entier de 1 à 4, n représente un nombre entier de 1 à 5, p est égal à 0, ou représente un nombre entier de 1 à 5, RI représente H, ou un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, de 1 à 5 atomes de carbone, R3 représente H, ou un groupe alkyle de 1 à 12 atomes dé carbone, un groupe allyle, un groupe arylalkyle, arylallyle ou aryle comprenant de 5 à 30 atomes de carbone, un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, R2 représente É un atome d'hydrogène, un groupe alkyle de 1 à 12 atomes de carbone, ou un groupe allyle, ou É un groupe aryle, arylalkyle, arylallyle comprenant de 5 à 30 atomes de carbone, ou É un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, ou É un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, É un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, É un groupe acyle, ou É un aminoacide naturel ou non, ou É un enchaînement d'aminoacides naturels ou non de formule X-AAZ...-AA1, z représentant le nombre d'aminoacides dans ledit enchaînement et étant un nombre entier de 2 à environ 40, X représentant soit un atome d'hydrogène, soit un groupement protecteur orthogonal des fonctions amines clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine, soit un groupe alkyle de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, soit un groupe aryle, arylalkyle ou arylallyle comprenant de 5 à 30 atomes de carbone, soit un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, soit un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, soit un groupe acyle, ou É un groupe R1-NHCO-, R1-NHCS- ou R1-NH-, R répondant à la définition donnée précédemment pour Re, R2 et R3 pouvant former avec l'atome d'azote auquel ils sont liés une structure hétérocyclique, de nature aromatique ou non, A représente N ou NH, sous réserve que: lorsque A représente N, a représente une double liaison et b représente une simple 15 liaison, et lorsque A représente NH, a représente une simple liaison et b représente une double liaison, - lorsque A représente N, B représente un groupe S-R4, dans lequel R4 20 représente: É un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, ou un groupe arylalkyle, arylallyle ou aryle comprenant de 5 à 30 atomes de carbone, ou É un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 25 3 à 7 atomes de carbone, ou É un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, É un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, É un groupe acyle, ou É un groupe R'4S, R'4 répondant à la définition donnée précédemment pour Re, 10 15 20 25 lorsque A représente NH, B représente l'un des groupes suivants: É un atome de soufre, É un atome d'oxygène, É un groupe NR5, R5 représentant l'un des groupes suivants: un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, un groupe arylalkyle ou arylallyle comprenant de 6 à 30 atomes de carbone, un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, un groupe OR6, R6 répondant à la définition donnée précédemment pour Rc, un groupe NHR6 ou N(R'6)R6, R6 étant tel que défini ci-dessus et pouvant également être un groupe' acyle, et R'6 répondant à la définition donnée précédemment pour R6, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend: * une étape de liaison d'un composé de formule générale (II) suivante: R' N----CH dans laquelle: Z' représente: É un atome d'hydrogène, É un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, un groupe arylalkyle, arylallyle ou aryle comprenant de 6 2864830 à 30 atomes de carbone, un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, un groupe fluorogénique ou chromogénique, ou É un groupe COOR'a, COR'a ou CSR'a, R'a représentant un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 12 atomes de 10 carbone, un groupe allyle, un groupe arylalkyle, arylallyle ou aryle comprenant de 6 à 30 atomes de carbone, ou un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, un groupe fluorogénique ou chromogénique, un groupe acyle, R'a pouvant également représenter, lorsque Z' représente un groupe COR'a ou CSR'a, un résidu d'amino acide ou un peptide, un groupe halogéno- alkyle, notamment perfluoroalkyle de 1 à 3 atomes de carbone, un groupe N(R'b)R'c ou N(OR'b)R'c, dans lequel R'b est un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, un groupe arylalkyle, arylallyle ou aryle comprenant de 5 à 30 atomes de carbone, un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, ou un groupe halogéno-alkyle tel que défini ci-dessus, et 20 25 30 R'b représente également un groupement protecteur des fonctions alcools clivable par le même réactif que celui utilisé pour le clivage final de la résine, ou un groupement protecteur orthogonal des fonctions alcools clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine, R', répondant à la définition donnée précédemment pour Rc, et, lorsque Z' représente un groupe COOR'a, R'a peut également représenter un groupement protecteur des fonctions carboxyliques clivable par le même réactif que celui utilisé pour le clivage final de la résine, ou un groupement protecteur orthogonal des fonctions carboxyliques clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine, É un groupe CH(OR'e)R'd, R'd répondant à la définition donnée précédemment pour Rd, R'e représentant un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, un groupe arylalkyle, arylallyle ou aryle comprenant de 5 à 30 atomes de carbone, ou un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant de 3 à 7 atomes de carbone, ou un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, ou un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, ou un groupe acyle, ou un groupement protecteur des fonctions alcools clivable par le même réactif que celui utilisé pour le clivage final de la résine, ou un groupement protecteur orthogonal des fonctions alcools clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine, É un groupe N(R'g)R'f, R'f répondant à la définition donnée précédemment pour Rf, R'g représentant un atome d'hydrogène, ou 10 102 2864830 un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, un groupe arylalkyle, arylallyle ou aryle comprenant de 6 à 30 atomes de carbone, ou un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, ou un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, ou un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, ou un groupement protecteur des fonctions amines clivable par le même réactif que celui utilisé pour le clivage final de la résine, ou un groupement protecteur orthogonal des fonctions amines clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine, sous réserve que le groupe N(R'g)R'f soit différent de NE2, É un groupe N(OR';)R'h, R'h répondant à la définition donnée précédemment pour Rh et pouvant également représenter un groupement protecteur des fonctions amines clivable par le même réactif que celui utilisé pour le clivage final de la résine, ou un groupement protecteur orthogonal des fonctions amines clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine, et R'; répondant à la définition donnée précédemment pour R, et étant différent d'un atome d'hydrogène, et pouvant également représenter un groupement protecteur des fonctions alcools clivable par le même réactif que celui utilisé pour le clivage final de la résine, ou un groupement protecteur orthogonal des fonctions alcools clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine, É un groupe OR'j, R'i représentant 30. un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, un groupe arylalkyle, arylallyle ou aryle comprenant de 5 à 30 atomes de carbone, ou un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, ou un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, 5. un groupe acyle, ou un groupement protecteur des fonctions alcools clivable par le même réactif que celui utilisé pour le clivage final de la résine, ou un groupement protecteur orthogonal des fonctions alcools clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine, É un groupe SR'k, R'k représentant un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, un groupe arylalkyle, arylallyle ou aryle comprenant de 5 à 30 atomes de carbone, ou un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, ou un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, un groupe acyle, ou un groupement protecteur des fonctions thiols clivable par le même réactif que celui utilisé pour le clivage final de la résine, ou un groupement protecteur orthogonal des fonctions thiols clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine, É un groupe -NH-CO-N(R'X)R'y ou -NH-CS-N(R',)R'y, R', et R'y, identiques ou différents, répondant à la définition donnée précédemment pour RX et Ry, R3, m et n sont tels que définis ci-dessus, R'2 représente É un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, un groupe arylalkyle, arylallyle ou aryle comprenant de 5 à 30 atomes de carbone, ou 20 25 25 104 2864830 É un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle comprenant 3 à 7 atomes de carbone, ou É un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, É un hétéroaryle, mono- ou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, É un groupe acyle, ou É un groupement protecteur des fonctions amines clivable par le même réactif que celui utilisé pour le clivage final de la résine, ou un groupement protecteur orthogonal des fonctions amines clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine, R'2 et R3 pouvant former avec l'atome d'azote auquel ils sont liés une structure hétérocyclique, de nature aromatique ou non, sur une résine porteuse de fonctions amines de formule NH-(CH2)p-RI, dans 15 laquelle p et RI sont tels que définis ci-dessus, ce qui conduit à l'obtention d'une résine de formule (III) suivante: z' R' N CH (CH2)
NH
SC.., ..-(CH2)p -RI résine dans laquelle Z', R'2, R3, m, n, p et RI sont tels que définis ci-dessus, * le cas échéant, déprotection de la fonction amine par clivage de R'2, lorsque R'2 représente un groupement protecteur des fonctions amines clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine, et acylation de la fonction amine ainsi libérée par un dérivé carboxylique, ou synthèse peptidique selon les protocoles classiques en phase solide, ce qui conduit à l'obtention d'une résine de formule (III-1) suivante: z' S j N(CH2)p-Ri résine correspondant à une résine de formule (III) susmentionnée dans laquelle R'2 est remplacé par R2 qui représente un aminoacide naturel ou non, ou un enchaînement d'aminoacides naturels ou non de formule X-AA2...-AAI, tels que définis ci-dessus, * le cas échéant, lorsque Z' représente une fonction carboxylique, une fonction amine, une fonction alcool ou une fonction thiol, protégée par un groupement protecteur, respectivement des fonctions carboxyliques, amines, alcools et thiols, clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine, déprotection de la susdite fonction carboxylique, amine, alcool ou thiol par clivage dudit groupement protecteur, et réaction de cette fonction carboxylique, amine, alcool ou thiol déprotégée avec un réactif déterminé, ce qui conduit à l'obtention d'une résine de formule (III-2) suivante: z (CH2)m N CH (CH2) \NH (III-2) S j N/(CH2)P-RI résine correspondant à une résine de formule (III) susmentionnée dans laquelle Z' est remplacé par Z, Z et R'2 étant tels que définis ci-dessus, R'2 25 * la résine de formule (III) obtenue précédemment étant ensuite: ** soit clivée à l'aide d'un réactif approprié, ce qui conduit à l'obtention de composés de formule (IV) suivante: z (H2) ( m Rz N CH ( CH2) \NH (IV) N/(CHZ)p-R1
H
dans laquelle Z, R2, R3, m, n, p et R1 sont tels que définis ci-dessus, ** soit traitée avec un halogénure d'alkyle, de préférence un iodure d'alkyle, de formule R4-Hal, dans laquelle Hal représente un atome d'halogène, et est de préférence un atome d'iode, et R4 est tel que défini ci-dessus, ce qui conduit à l'obtention d'une résine de formule (V) suivante: z' ( CH2) R m R-2 N CH (CH2) \N R S jN(CH2)p-R1 dans laquelle Z', R2, R3, R4, m, n, p et R1 sont tels que définis ci-dessus, * la résine de formule (V) obtenue précédemment étant ensuite: ** soit clivée à l'aide d'un réactif approprié, ce qui conduit à l'obtention de composés de formule (VI) suivante: z R3 (H2)m Ri N--CH (CH2)
N R S N 4 H (V)
résine
N
(CH2)p-R, z' CH2 R7 N CH (CH2) \NH N N/(CH2 -RI H résine dans laquelle Z', R2, R3, m, n, p et RI sont tels que définis ci-dessus, la résine de foiniule (VII) obtenue précédemment étant ensuite clivée à l'aide d'un réactif approprié, ce qui conduit à l'obtention de composés de formule (VIII) suivante: z (CH2) 1 m R-2 N CH (CH2) (VIII)
NNH
HN N /(CH2)p -RI
H
dans laquelle Z, R2, R3, m, n, p et RI sont tels que définis ci-dessus, * * soit, lorsque R4 représente un groupe méthyle, traitée par chauffage avec 25 un composé de formule R'5-NH2, R'5 représentant: un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe allyle, un groupe arylalkyle ou arylallyle comprenant de 6 à 30 atomes de carbone, ou un groupe cycloalkyle, saturé ou insaturé, constitué d'un cycle 30 comprenant 3 à 7 atomes de carbone, ou un hétérocycloalkyle, éventuellement substitué, comprenant de 3 à 8 atomes, dans laquelle Z, R2, R3, R4, m, n, p, et RI sont tels que définis ci-dessus, ** soit, lorsque R4 représente un groupe méthyle, traité:É par chauffage avec de l'acétate d'ammonium, ce qui conduit à l'obtention d'une résine de formule (VII) suivante: (VII) R'SN N (CH2)P-RI résine 108 2864830 un hétéroaryle, monoou bicyclique, éventuellement substitué, comprenant de 5 à 12 atomes, un groupe OR"6, dans lequel R"6 répond à la définition donnée précédemment pour R6 ou peut également représenter un groupement protecteur des fonctions alcools clivable par le même réactif que celui utilisé pour le clivage final de la résine, ou un groupe NH- R"'6 ou N(R'6)-R"'6, dans lequel R'6 est tel que défini ci-dessus et R"'6 répond à la définition donnée précédemment pour R6 ou peut également représenter un groupement protecteur des fonctions amines clivable par le même réactif que celui utilisé pour le clivage final de la résine, ce qui conduit à l'obtention d'une résine de formule (IX) suivante: z' (C 1 HZ)m RZ N i H (CH2) \NH dans laquelle Z', R2, R3, m, n, p, R'5 et RI sont tels que définis ci-dessus, la résine de formule (IX) obtenue précédemment étant ensuite clivée à l'aide d'un réactif approprié, ce qui conduit à l'obtention de composés de formule (X) suivante: z (X)
R
RS N N(CH2)P H dans laquelle Z, R2, R3, m, n, p, R1 et R5 sont tels que définis ci-dessus,
2. Procédé selon la revendication 1, pour la synthèse en phase solide de dérivés thiourée répondant à la formule générale suivante (IVa) : o
H
X AAZ... AA1 Ra (IVa)
HN
S \NHR1 dans laquelle R1 et l'enchaînement X-AAZ...-AA1- sont tels que définis dans la revendication 1, et Ra, représente un groupe Ra ou ORa, Ra étant tel que défini dans la revendication 1, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend: * une étape de liaison d'un composé de formule générale (IIa) suivante: o
H
fine cRa
N Il
S
dans laquelle R' représente un groupe R'a ou OR'a, R'a étant tel que défini dans la revendication 1, sur une résine porteuse de fonctions amines NH2 ou NHR1, R1 étant tel que défini ci-dessus, ce qui conduit à l'obtention d'une résine de formule (IIIa) suivante: o
H
finoc'-N'',v'--'''-R' a dans laquelle R1 et R'a sont tels que définis précédemment, 20 * une étape de déprotection de la fonction amine NH-Fnoc par clivage du groupe Fmoc, notamment par le mélange pipéridine/DMF (20/x'0), et une étape de synthèse peptidique selon la stratégie Fmoc classique en phase solide, par une succession d'étapes d'addition/déprotection de résidus aminoacyl.es dont la fonction amine est protégée par un groupe Fmoc, et ce jusqu'à z résidus, et éventuellement déprotection du résidu AAz et introduction du groupe X, différent de H, sur la fonction amine ainsi libérée, X et z étant tels que définis dans la revendication 1, ce qui conduit à l'obtention d'une résine de formule (IIIb) suivante: o
H
X AAZ É É É AAI Râ
HN
(IIIb) dans laquelle z, X, RI et R'a sont tels que définis ci-dessus, * le cas échéant, lorsque R'a représente un groupe OR'a, une étape de déprotection de la fonction carboxylique par clivage de R'a, lorsque R'a représente un groupement protecteur de fonction carboxylique clivable par un réactif différent de celui utilisé pour le clivage final de la résine, et réaction de cette fonction carboxylique avec un réactif déterminé, ce qui conduit à l'obtention d'une résine de formule (IIIc) suivante: o
H
N\/\ X AAZ... AAi Ra
HN
Ra, et RI étant tels que définis ci-dessus, * une étape finale de clivage de la résine obtenue précédemment à l'aide d'un réactif approprié, ce qui conduit à l'obtention de composés de formule (IVa) définis ci-dessus.
3. Procédé selon la revendication 1, pour la synthèse en phase solide de dérivés S-alkyle-isothiourée de formule générale (VIa) suivante: o
H
X AAZ... AAI Ra (Via) N RS NHR1 dans laquelle X-AAZ...-AAI-, RI et R4 sont tels que définis dans la revendication 1, et Ra est tel que défini dans la revendication 2, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend: * une étape de traitement de la résine de formule (IIIc) selon la revendication 2 avec un halogénure d'alkyle, notamment un iodure d'alkyle, de formule R4-Hal, R4 étant tel que défmi dans la revendication 1 et Hal représentant un atome d'halogène, ce qui conduit à l'obtention d'une résine de formule (Va) suivante: o
H
X AAZ... Ra (Va) dans laquelle Ra est tel que défini dans la revendication 2, X-AAZ...-AA1-, RI et R4 sont tels que définis dans la revendication 1, * une étape finale de clivage de la résine de formule (Va) obtenue précédemment à l'aide d'un réactif approprié, ce qui conduit à l'obtention de composés de formule (VIa) définis ci-dessus.
s
4. Procédé selon la revendication 1, pour la synthèse en phase solide de dérivés de guanidine de formule générale (VIIIa) suivante: o
H
}{ ApZ... AA1 R a (VIIIa) dans laquelle Ra est tel que défini dans la revendication 2, X-AAZ...-AAI- et RI 15 sont tels que définis dans la revendication 1, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend: * une étape de traitement par chauffage de la résine de formule (Va) selon la revendication 3 dans laquelle R4 représente un groupe méthyle, avec de l'acétate d'ammonium, ce qui conduit à l'obtention d'une résine de formule (VIIa) suivante: o
H
X AAZ... -AA1 Roc (VIIa) dans laquelle Ra est tel que défini dans la revendication 2, R1 et X-AAZ...-AA1-30 sont tels que définis dans la revendication 1, * une étape finale de clivage de la résine formule (VIIa) obtenue précédemment, à l'aide d'un réactif approprié, ce qui conduit à l'obtention de composés de formule (VIIIa) tels que définis ci-dessus. 10
5. Procédé selon la revendication 1 de synthèse en phase solide de dérivés de guanidine de formule générale (Xa) suivante: o H X AAz... moi R a
HN
RSN NHR, dans laquelle Ra est tel que défini dans la revendication 2, XAAZ...-AAI-, R5 et RI sont tels que définis dans la revendication 1, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend: * une étape de traitement par chauffage de la résine de formule (Va) selon la revendication 3 dans laquelle R4 représente un groupe méthyle, avec un composé R'5-NH2, R'5 étant tel que défini dans la revendication 1, ce qui conduit à l'obtention d'une résine de formule (IXa) suivante: o H X AAZ (Xa) (IXa) dans laquelle Ra est tel que défini dans la revendication 2, RI, R'5 et -AAI- sont tels que définis dans la revendication 1, * une étape finale de clivage de la résine formule (IXa) obtenue précédemment, à l'aide d'un réactif approprié, ce qui conduit à l'obtention de composés de formule (Xa) tels que définis ci-dessus.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les résines utilisées sont des résines: porteuses de fonctions amines NH2 telles que les résines suivantes: Rink amide AM PS (4-[(((2,4-diméthoxyphényl)Fmoc-aminométhyl) phénoxyacétamido)( Norleucine)aminométhylJ polystyrène) ; Rink amide BHA PS (4-[(((2,4-diméthoxyphényl)Fmoc-am inométhyl)p hénoxyacétamido)(d Norleucine)4-benzhydrylamineJ polystyrène) ; Rink amide MBHA PS (4-[(((2, 4-dirréthoxyphényl)Fmoc- am inométhyl)phénoxyacétamido) ( Norleucine) 4-méthyl-benzhydrylamineJ polystyrène) ; Rink amide acétamido PA(4-[(((2,4-diméthoxyphényl)Fmoc- aminométhyl)phénoxyacétamido)J polyamide) ; Rink amide NovaSyn TGR; Rink amide PEGA; Rink amide NovaGelTm; Sieber amide PS; Sieber amide NovaSyn TG; Bis-(2-amino-éthyle)-éther trityle; O-bis-(aminoéthyle)éthylène glycol trityle; 1,4-Bis-(aminométhyle)-benzène trityle; 1,3-bis- (aminométhyle)-benzène trityle; diaminoalkyle trityle, le groupe alkyle comprenant de 2 à 12 "atomes de carbone; ( )-trans-1,2-diaminocyclohexane trityle; 4,4'diaminodicyclohexyleméthane trityle; N-1,3-Diaminopropan-2-ol trityle; hydroxylamine 2-chlorotrityle; cystéamine 2- chlorotrityle; BHA PS (4-benzhydrylamine polystyrène) MBHA PS (4- méthylbenzhydrylamine polystyrène) ou porteuses de fonctions amines différentes de NH2 de formule NH-(CH2) p 20 R1, dans laquelle p et RI sont tels que définis dans la revendication 1, à savoir des résines telles qu'obtenues par amination réductrice entre un composé de formule RI-(CH2)p_1-CHO, p étant tel que défini dans la revendication 1, et des résines porteuses de fonctions amines NH2 telles que mentionnées ci-dessus.
7. Application du procédé selon l'une des revendications 1 à 6, pour la synthèse en phase solide de dérivés de peptides comportant une arginine en position C-terminale, à savoir de composés peptidiques de formule (VIIIa) selon la revendication 4, dans laquelle R1, Ra et X-AAZ...-AAI- sont tels que définis dans la revendication L
8. Application selon la revendication 7, du procédé selon l'une des revendications 1 à 6, pour la synthèse en phase solide de dérivés de peptides comportant une arginine en position C-terminale, choisis parmi les composés peptidiques de 2864830 formule (VIIIa) selon la revendication 4, dans laquelle X-AAZ... ÉAA1- représente les enchaînements suivants: Ac-Val-Gly-Leu-, Ac-Ile-Glu-Gly, Ac-Phe-Val, Ac- Leu-Ser-Thr, Ac-Val-Pro, Ac-Ala-Lys, Ac-Val-Gly, Ac représentant un groupe acétyle.
9. Application du procédé selon l'une des revendications 1 à 8, pour la synthèse de substrats fluorogéniques ou chromogéniques comportant une arginine en position C-terminale, à savoir de composés peptidiques de formule (VIIIa) selon la revendication 4, dans laquelle Ra représente un groupe Ra, Ra représentant un groupe fluorophore ou chromophore, et X-AAZ.
-AA1- est tel que défini dans l'une des revendications 1 à 8...CLMF:
10. Application selon la revendication 9, du procédé selon l'une des revendications 1 à 8 pour la synthèse de substrats fluorogéniques comportant une arginine en position C-terminale, à savoir de composés peptidiques de formule (VIIIa) tels que définis dans la revendication 9 dans laquelle Ra représente un groupement 7-amino-4-méthyl-coumarine de formule suivante:
H
ou un groupement (3-naphtylamine de formule suivan te: H ou un groupement a-naphtylamine de formule suivante: NH 116 2864830 ou un groupement 4-méthoxy-(3Énaphtylamine de formule suivante:
H OMe
- ou un groupement 7-amino-4-trifluorométhylcoumarine de formule suivante: CF3
H
ou un groupement Rhodamine 110 (forme bisamide) de formule suivante:
H H
11. Application selon la revendication 9, du procédé selon l'une des revendications 1 à 8, pour la synthèse de substrats chromo géniques comportant une arginine en position C-terminale, à savoir de composés peptidiques de formule (VIIIa) tels que définis dans la revendication 9 dans laquelle Ra représente: un groupement para-nitroaniline de formule suivante ou un groupement para-nitrophénol de formule suivante: NO2 NO2
12. Application du procédé selon l'une des revendications 1 à 8, pour la préparation d'inhibiteurs de l'oxyde nitrique synthase (NOS), lesdits inhibiteurs étant 10 choisis parmi les composés répondant à la formule (I) selon la revendication 1, dans laquelle p est égal à 0 et R2 représente un atome d'hydrogène, à savoir parmi les composés répondant à la formule (I-bis) suivante: z 1 (CH2) m H jI (I-bis) a B b NHR dans laquelle a, b, m, n, A, B, Z, R1 et R3 sont tels que définis dans la revendication 1, et notamment parmi les composés répondant à l'une des formules générales 15 suivantes: z z z (CH2) m (CH2)m (CH2).
H H H R3 N CH R3 N CH R N CH (CH2) (CH2) (CH2)
NH NH
S\NHRI R4SNHRi RSN\NHR1 R3 N CH (CH2) NA (3) R3 N CH (CH2) (CH2) (4) NH (5) \NH (C 1 H2) m
H z
NHR1 OR6 N NHR NHR6 ainsi que les composés de formule (2) dans laquelle R1 est confondu avec R4 pour former un cycle, lesdits composés répondant à la formule suivante: z (CH2)m
H
ainsi que les composés de formule (3) dans laquelle R1 est confondu avec R5 pour former un cycle, lesdits composés répondant à la formule suivante: z (CH2)m
H
R3 -N--CH (CH2) (3')
NH
N\ NH R5 ainsi que les composés de formule (4) et (5) dans lesquelles R1 est confondu avec R6 pour former un cycle, lesdits composés répondant à la formule suivante: z z (CH2)m (CH2).
H
R-N-CH R-N-CH
(CH2\ (CH2) (4') NH (5') NH
NNH N NH
0-R6 N--R6 H R4, R5 et R6 étant tels que définis dans la revendication 1, et plus particulièrement parmi les composés de formules (1), (2), (3), (4) , (5), (1'), (2'), (3'), (4') et (5') susmentionnées, dans lesquelles soit: m = 0 ou 1 et Z représente un groupe de formule CORa ou COORa, m = 0 ou 1 et Z représente un groupe de formule N(Rg)Rf, (2') m = 1 ou 2 et Z représente un groupe de formule OR, m = 1 et Z représente un groupe de formule SRk.
13. Composés de formule générale (IIa) suivante: 5 o
H N
finoc R' a dans laquelle R'a est tel que défini dans la revendication 2, en tant qu'intermédiaires de synthèse des composés de formules (IVa), (Vla), et (VIla) dans le cadre des procédés de synthèse selon l'une des revendications 2 à 7.
14. Composé selon la revendication 12, de formule (IIa) dans laquelle Rra représente un groupement 7-amino-4-méthyl-coumarine.
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| WO1999015498A1 (fr) * | 1997-09-23 | 1999-04-01 | Astrazeneca Ab | Nouveaux antagonistes de npy |
-
2004
- 2004-01-06 FR FR0400046A patent/FR2864830B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
2005
- 2005-01-04 WO PCT/FR2005/000007 patent/WO2005068488A1/fr active Application Filing
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999015498A1 (fr) * | 1997-09-23 | 1999-04-01 | Astrazeneca Ab | Nouveaux antagonistes de npy |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS, vol. 10, no. 20, 2000, GBOXFORD, pages 2291 - 2294, XP004224203 * |
| TETRAHEDRON LETTERS., vol. 44, no. 28, 7 July 2003 (2003-07-07), NLELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS, AMSTERDAM., pages 5319 - 5321, XP004430975 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10087221B2 (en) | 2013-03-21 | 2018-10-02 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Synthesis of hydantoin containing peptide products |
| US10450343B2 (en) | 2013-03-21 | 2019-10-22 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Synthesis of cyclic imide containing peptide products |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2005068488A1 (fr) | 2005-07-28 |
| FR2864830B1 (fr) | 2006-03-10 |
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