CN1263473A - 增加跨生物膜转运的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了使药物和大分子跨越生物膜转运的方法和组合物。在一个实施方案中,本发明包括增强选定化合物跨越生物膜转运的方法,其中使生物膜与含有共价连接于转运聚合物的生物活性剂接触。在一个实施方案里,聚合物由6—25个亚单位构成,它们的至少50%含胍基或脒基侧链部分。该聚合物能有效地促进所连接的活性剂以大于非偶联形式活性剂的跨膜转运速率通过生物膜作跨膜转运。

Description

增加跨生物膜转运的组合物和方法
发明领域
本发明涉及能有效地增加生物活性剂，如有机化合物、多肽、低聚肽、核酸和金属离子跨生物膜转运的方法和组合物。
参考文献
Barsoum等，PCT公开号94/04686(1994)。
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Zuckermann，R.N.，Chemtracts-Macromol.Chem.4：80(1993)。
本申请里的所有文献都纳入本文供参考。
发明背景
细胞质膜对许多有用的治疗剂的通过形成一道屏障。一般来说，药物必须在机体的水性分隔空间里和必须通过的脂质层里都自由地溶解方能进入细胞。带有高电荷的分子特别难以通过膜。许多治疗用的大分子，如肽和寡核苷酸也特别难以跨膜转运。这样，虽然生物技术能得到更多数量的有潜在价值的治疗剂，但从其生物利用度方面来看则妨碍了他们的医药应用。因此需要可靠的手段来将药物，特别是大分子转运入细胞。
迄今，已建议对许多转运分子进行护送以跨越生物膜。Ryser等(1979)提出使用赖氨酸的高分子聚合物来增加各种分子跨越细胞膜的转运，极高分子量的聚合物较优。虽然该作者设想了诸如鸟氨酸和精氨酸等其他带正电荷残基的聚合物，但没有显示这类聚合物的实施手段。
Frankel等(1991)报道了使选定的分子与HIV的tat蛋白偶联可增加这些分子的细胞摄入。但是，使用tat蛋白有某些缺点，包括其不适宜的聚合和不溶性质。
Barsoum等(1994)和Fawell等(1994)提出使用含tat碱性区域(残基49-57，序列为RKKRRQRRR)的tat蛋白的较短片段。Barsoum等注意到，中等长度的聚精氨酸聚合物(MW 5000-15000道尔吨)不能使β-半乳糖苷酶转运跨越细胞膜(如Barsoum一文的第3页)，这与Ryser等(同上)的建议相反。
其他研究显示，衍生自Antennapedia同源域的16个氨基酸肽-胆固醇偶联物可被培养的神经元迅速地内化(Brugidou等，1995)。但是，该肽稍短的片段(15个残基)不能有效地被细胞摄入(Derossi等，1996)。
本发明部分根据申请人这样的发现：某些聚合物的偶联物由毗邻的、高碱性亚单位，特别是含鸟嘌呤基或脒基部分的亚单位构成，结果小分子或大分子能有效地明显增加所连接分子的跨越生物膜转运。而且，转运速率明显高于由49-57残基构成的碱性HIV tat肽的转运速率。
发明综述
本发明的一个方面包括增加选定化合物跨越生物膜的转运方法。在该方法里，生物膜与含生物活性剂的偶联物接触，使所述的生物活性剂与至少一个转运聚合物共价连接。该偶联物能有效地促进活性剂以比非偶联形式的生物活性剂的跨膜转运速率更大的速率进行跨生物膜转运。
在一个实施方案中，该聚合物由6-25个亚单位构成，它们中的至少50％含胍基或脒基的侧链部分，其中该聚合物至少含6个，更好至少含7个胍基或咪基侧链部分。在另一个实施方案中，该聚合物由6-20个、7-20个或7-15个亚单位构成。更佳的是，聚合物里亚单位的至少70％，更好的是90％为含胍基或脒基侧链部分。优选的是胍基或脒基的侧链部分不要被一个以上的非胍基或非脒基亚单位与另一部分分隔开。在更具体的实施方案中，该聚合物含至少6个毗邻的亚单位，每个含一个胍基或脒基，优选的是含至少6个或7个毗邻的胍基侧链部分。
在另一个实施方案中，该转运聚合物含6-25个相邻的亚单位，7-25个，6-20个或较佳的是7-20个相邻的亚单位，每个含一个胍基或脒基侧链部分，任选的条件是毗连亚单位之一可含有活性剂与之连接的非精氨酸残基。
优选的是，每个转运聚合物为线性。在优选的实施方案中，生物活性剂与转运聚合物的末端连接。
在另一个具体的实施方案中，偶联物含单个转运聚合物。
在优选的实施方案里，例举的增强转运的聚合物是肽，其中精氨酸残基构成了亚单位。这类聚精氨酸肽可全部由D-、全部L-、或混合的D-和L-精氨酸构成，可包括其它氨基酸。更优选的是，至少一个，较佳的是所有的亚单位是D-精氨酸残基，以增加在输送偶联物至其生物靶标期间该聚合物的生物稳定性。
该方法可用来增加选定的治疗剂通过许多生物膜，包括，但不限于，原核细胞膜、真核细胞膜和细胞壁。原核细胞膜的例子包括细菌膜；真核细胞膜的例子包括，但不限于，树突细胞、上皮细胞、内皮细胞、角质细胞、肌肉细胞、真菌细胞、细菌细胞、植物细胞等。
根据本发明优选的技术方案，在室温(23℃)或37℃下用实施例6的方法测量时，本发明转运聚合物的表观亲和力(Km)至少是tat肽(49-57)测得亲和力的10倍，较佳的是至少100倍。
生物活性剂(包含治疗剂)包括，但不限于，典型的为金属螯合物形式的金属离子；小的有机分子，如抗癌药(如紫杉烷)和抗微生物剂分子(如抗细菌或真菌，如酵母)：和大分子，如核酸、肽、蛋白质和其类似物。在一个优选实施方案里，该活性剂是核酸或核酸类似物，如任选地含一个或多个2’-脱氧核苷亚单位的核酶(ribozyme)使稳定性增加。或者，该活性剂是肽核酸(PNA)。在另一个优选的技术方案里，活性剂是多肽，如蛋白质抗原，而生物膜是抗原提呈细胞(APC)的细胞膜。在另一个实施方案，所选择的活性剂能促进或引起对选择的肿瘤抗原的免疫应答。在另一个优选的实施方案里。活性剂是抗癌化合物紫杉烷(taxane)或紫杉氧化物(taxoid)。在另一个实施方案里，活性剂不是多肽，较佳的是非多肽治疗剂。在更一般的实施方案里，活性剂优选的分子量低于10kDa。
活性剂可通过接头与聚合物连接，这使偶联物里的构型有屈曲性且使活性剂和其生物靶标之间易于相互作用。在一个实施方案里，接头是可断裂的接头，如，含有可被酶裂解或溶剂介导裂解的可断裂接头基团，如酯、酰胺或二硫基团。在另一个实施方案里，可断裂的接头含光裂解基团。
在更具体的实施方案里，可断裂的接头含远离生物活性剂的第一可断裂基团和紧靠活性剂的第二可断裂基团，这样第一可断裂基团的断裂产生了接头活性剂偶联物，它含能进行分子内反应以断裂第二可断裂基团的亲核部分，从而从接头和聚合物中释放出活性剂。
在另一个实施方案里，本发明可用来筛选许多偶联物，看看有无所选定的生物活性，从多个候选试剂里选出需要的偶联物。使偶联物与允许偶联物摄入细胞时显示出可检出信号的细胞接触，所得信号大小可以说明偶联物转运所选定生物活性剂的效果。该方法特别可用来试验本身不能或几乎不能进入细胞显示生物活性的试剂的活性。在一个技术方案中，从组合库里选择候选的活性剂。
本发明也包括用于上述方法进行筛选的偶联物库。
本发明的另一方面，包括输送生物活性剂通过生物膜的药物组合物。该组合物包括含有生物活性剂和药学上可接收的赋形剂以及与上述至少一种转运聚合物共价连接的偶联物。聚合物可有效地使生物活性剂的透膜转运速率大于非偶联形式的生物活性剂的透膜转运速率。组合物另外可与说明书一起包装供使用。
本发明的另一个方面包括用上述的药物组合物治疗哺乳动物，特别是治疗人的治疗方法。
本发明的这些和其他目的和特征在结合附图读了下列发明详述后可以完全明了。
附图简述
图1A和1B是细胞摄入含tat碱性肽(49-57，SEQ ID NO：1)，poly-Lys(K9，SEQID NO：2)和poly-Arg(R4-R9和r4-r9，SEQ ID NO：3-8和12-17)的某些多肽-荧光素偶联物对肽浓度的函数图；图1C是浓度为2.5μM偶联物测得的偶联物摄入水平的柱状图(实施例2-3)；
图2A-2F显示计算机形成的共聚焦显微图(实施例4)，它们显示37℃Jwrkat细胞与6.25μM荧光素(图A和D)偶联的tat(49-57)、荧光素标记的7聚-L-精氨酸(R7)(图B和E)/或荧光素标记的7聚-D-精氨酸(r7)(图C和F)培养10分钟后发射r荧光(2A-2C)和传导光(2D-2F)；
图3显示细胞摄入某些poly-Arg-荧光素偶联物(r9，R9，R15，R20和R25，SEQ IDNO：17和8-11)对偶联物浓度的函数(实施例5)；
图4显示细胞摄入荧光素偶联tat(49-57)和poly-Arg-荧光素偶联物(R9，R8和R7)在没有0.5％叠氮钠(左侧的4个柱状图)和有0.5％叠氮钠(在侧4个柱状图)时的柱状图(实施例7)。
图5A-5C显示细菌细胞对所选择的聚合偶联物(K9、R9、r4、r5、r6、67、r8和R9)的摄入水平对偶联物浓度的函数；图5A比较了与大肠杆菌HB 101细胞培养时，R9和r9偶联物观察到的摄入水平对偶联物浓度的函数；图5B显示了与大肠杆菌HB 101细胞培养时，对K9和r4-r9偶联物观察到的摄入水平；图5C比较了与牛链球菌细胞培养时，r9和K9偶联物的摄入水平；
图6A-6E显示本发明例举的含可断裂接头的偶联物；图6F和6G显示paclitaxel和“TAXOTERE”的化学结构和构成物骨架原子的常规数目；图6H显示了紫杉氧化物化合物的总体化学结构和环原子数目。
图7显示抑制小鼠T细胞分泌γ-干扰素(γ-INF)对正义-PNA-r7偶联物(SEQ ID NO：18)、反义PNA-r7偶联物(SEQ ID NO：19)和非偶联反义PNA(SEQID NO：20)深度的函数，其中PNA序列是根据γ-干扰素的基因序列。
发明详述
1、定义
本文的术语“生物膜”指含脂质的屏障，它将细胞或细胞群与细胞外空间隔开。生物膜包括，但不限于，细胞质膜、细胞壁、细胞内细胞器膜，如线粒体膜、核膜之类。
术语“跨膜浓度”指与加入特定组合物的膜一侧相反、或跨越此膜的膜另一侧中化合物存在的浓度。例如，当将化合物加到细胞的细胞外液时，细胞内测得的该化合物量即为此化合物的跨膜浓度。
“生物活性剂”或“生物活性物质”指被细胞摄入后导致细胞结构、功能或组成发生可见改变的化学物质，如小分子、大分子或金属离子。可观察到的改变包括一种或多种mRNA表达的增加或减少，一种或多种蛋白质表达的增加或减少，蛋白质或其他细胞组份的磷酰基化，酶的抑制或活化，结合对成员之间的结合抑制或活化，代谢合成速率的增加或减少，细胞增殖的增加或减少等等。
术语“大分子”指(MW大于1000道尔吨)的大分子，可例举的是，但不限于，生物来源或合成来源的肽、蛋白质、寡核苷酸和聚核苷酸。
“小的有机分子”指分子量(MW)低于或等于1000道尔顿的含碳试剂。
术语“治疗剂”“治疗组合物”和“治疗物质”指(但不限于)，对哺乳动物使用有益的任何组合物。这类试剂可为离子、小的有机分子、肽、蛋白质或多肽、寡核苷酸和寡糖形式。
术语“非多肽制剂”和“非多肽治疗剂”指转运聚合偶联物部分，它不包括增加转运的聚合物，它是除了多肽以外的生物活性剂。非多肽制剂的例子是反义寡核苷酸，它可与聚-精氨酸肽偶联以形成能增加跨生物膜输送的偶联物。
术语“聚合物”指两个或多个相同的，或不相同的亚单位通过共价键连接成为直链。肽是聚合物的一个例子。它可由相同或不同的氨基酸亚单位经肽键连接而成。
术语“肽”指D-或L-氨基酸、或D-和L-氨基酸混合物经肽键连接的单链化合物。一般来说，肽含有至少两个氨基酸残基，长度不到大约50个氨基酸。
本文使用的术语“蛋白质”指线性排列的由肽键连接的氨基酸构成的化合物，但不是肽，它有着十分明确的构型。蛋白质与肽相反，通常由50个或更多的氨基酸链构成。
本文的“多肽”指有至少两个氨基酸残基的聚合物，它含有一个或多个肽键。“多肽”涵盖了肽和蛋白质，而不管多肽是否有十分明确的构型。
术语“胍基”指有化学式-HN＝C(NH2)NH的部分(非质子形式)。如精氨酸含有胍基部分，也指2-氨基-5-胍基戊酸或α-氨基-δ-胍基戊酸。“胍盐”指正电荷的偶联酸形式。
“脒基”指具有化学式-C(＝NH)(NH2)的部分。“脒盐”指带正电荷的偶联酸形式。
术语“聚-精氨酸”或“poly-Arg”指由相邻的氨基酸残基构成的聚合序列：聚-L-精氨酸指所有均是L-精氨酸；聚-D-精氨酸指所有均是D-精氨酸。聚-L-精氨酸也可这样缩写：大写的“R”后面跟着肽中L-精氨酸的数目(如R8代表相毗连L-精氨酸残基的8-聚)；聚-D-精氨酸可这样缩写：小写的“r”后面跟着肽中D-精氨酸的数目(r8代表相毗连D-精氨酸残基的8聚体)。
本文氨基酸残基由它们的全名或标准的单个字母或三个字母表示：G，Gly，甘氨酸；H，His，组氨酸；I，Ile，异亮氨酸；K，Lys，赖氨酸；L，Leu，亮氨酸；M，Met，甲硫氨酸；N，Asn，天冬氨酸；P，Pro，脯氨酸；Q，Gln，谷氨酰胺；R，Arg，精氨酸；S，Ser，丝氨酸；T，Thr，苏氨酸；V，Val，缬氨酸；W，Trp，色氨酸；X，Hyp，羟基脯氨酸；Y，Tyr，酪氨酸。
II.聚合物部分的结构
在一个实施方案里，本发明的转运聚合物含有6-25个亚单位长短的聚合物，如上所述。相对于非偶联生物剂的转运速率而言，偶联物能有效地增加其通过生物膜的转运速率。虽然例举的聚合组合物是肽，但该聚合物可含有非肽类骨架和/或下面将进一步讨论的亚单位。
在本发明的一个重要方面，当生物活性剂需要跨膜转运才能显示出它们的生物效应，且与表面受体结合不能显示出其生物效应，即，这类生物活性剂不会进入细胞时，本发明的偶联物特别适用于输送此类生物活性剂跨越细胞或细胞器膜。还有，本发明偶联物特别适用于以下类型的生物活性剂，即此类活性剂需要跨膜转运才能显示其生物活性、而其本身(未与转运聚合物或某些其它修饰形式偶联)不能或几乎不能进入细胞显示生物活性的这类生物活性剂。
广义来说，用于偶联的转运聚合物宜包括亚单位的线性骨架。骨架通常含有选自碳、氮、氧、硫和磷的杂原子，骨架链原子主要由碳构成，每个亚单位含有包括末端胍基或脒基的侧链部分。
虽然相邻侧链部分之间的空间距离在亚单位之间通常是一致的，但用于本发明的聚合物也包括沿骨架侧链部分之间的可变空间距离。
侧链部分从骨架伸展出来的方式是其中央的胍基或脒基碳原子(NH2基团连接其上)通过侧链接头物与骨架相连，所述接头宜含至少2个接头链原子，更佳的是2-5个链原子，结果中央碳原子是离开骨架的第三到第六链原子。链原子优选的是亚甲基碳原子，但也可存在一个或多个其它原子，如氧、硫或氮。优选的是，骨架和胍基或脒基的中央碳原子之间为4个原子长的链，如精氨酸侧链。
本发明转运聚合物序列可侧接一个或多个非胍基/非-脒基亚单位，或诸如氨基己酸基团接头，它们不明显影响含聚合物的相应偶联物，如甘氨酸、丙氨酸和半胱氨酸的膜转运速度。任何游离氨基酸末端基团可用封闭基团，如乙酰基或苄基覆盖以防止体内泛有化(ubiquitination)。
被转运的活性剂可根据实施方案连接到转运聚合物上。在一个优选的实施方案中，活性剂或通过与转运聚合物的末端连接，或与聚合物里的内部亚单位经合适的连接基团连接到一个转运聚合物上。
在第二个实施方案里，活性剂用上述相同的方法与一个以上的聚合物连接。该实施方案稍差，因为它可导致相邻细胞交联。
在第三实施方案里，偶联物含有的两个活性剂部分不与聚合物的两个末端之一连接。对于该实施方案，优选的是活性剂的分子量低于10kDa。
关于上述的第一和第三技术方案，活性剂通常可与胍基或脒基侧链任一相连，这样它们是游离的可与靶膜相互作用。
可通过直接合成方案制备本发明的偶联物。此外，偶联产物在长度和组成上通常是基本均质的，这样它们的作用比异质混合物的作用具有更大的一致性和再现性。
根据本发明的一个重要方面，本申请人业已发现，将单个转运聚合物连接于各种类型的生物活性剂之一上，即使在偶联物里不要求存在大的疏水部分也足以明显增加活性剂跨越生物膜的摄入速率。事实上，由于疏水部分与脂质体双层的粘合，与大的疏水部分连接可能会明显妨碍或防止穿膜转运。因此，本发明包括不含大疏水部分，如脂质和脂肪酸分子的偶联物。在另一个实施方案中，该方法用于治疗患者的非中枢神经系统(non-CNS)疾病，此病不需要通过血脑屏障进行输送。
A.聚合物组份
氨基酸：在一个实施方案里，转运聚合物由D或L氨基酸残基构成。在转运聚合物里使用天然L-氨基酸的优点在于：降解产物对细胞或器官相对无毒。优选的氨基酸亚单位是精氨酸(α-氨基-δ-胍基戊酸)和α-氨基-ε-氨基己酸(同配位的脒基类似物)。丙氨酸里胍基的pKa约12.5。
更一般来说，优选的是每个聚合物的亚单位含有高度碱性侧链部分，它的(i)pKa大于11，更优选的是12.5或更大，和(ii)在其质子状态，含至少两个双生的氨基(NH2)，双生氨基有共振稳定的正电荷，这赋予该部分双重的特征。
也可使用其它的氨基酸，α-氨基-β-胍基丙酸，如α-氨基-γ-胍基丁酸或α-氨基-ε-胍基己酸(在骨架链和中央胍基碳之间分别含2、3或5个接头原子)。
D-氨基酸也可用于转运聚合物。含专有的D-氨基酸的组合物具有减少酶降解的优点。但是，它们也可在靶细胞里保持完整。若聚合物仍然连接时制剂是有生物活性的，这样的稳定性通常是没有问题的。对于以偶联形式是非活性的制剂来说，应在偶联物中包括在作用位点可断裂(如在细胞里通过酶或溶剂介导的断裂作用)的接头以促进该剂在细胞或细胞器里的释放。
其它亚单位：也可选择其它合适的非氨基酸亚单位用来形成转运聚合物。这类亚单位可包括，但不限于，羟基氨基酸、N-甲基氨基酸氨基醛等等，它们导致聚合物的肽键减少。如下面所讨论的那样，根据选定的骨架的性质可使用其它类型亚单位。
B.骨架类型
可使用各种类型骨架以安排和放置侧链胍基和/或脒基部分，如硫醚或磺酰基连接的烷基骨架部分，羟基酸酯(相当于用酯连接代替酰胺连接)，用氮代替α-碳以形成氮杂类似物，氨基甲酸酯基团连接的烷基骨架部分，聚乙烯亚胺(PEI)和氨基醛，这使聚合物由仲胺组成。
更详细的骨架名单包括N-取代酰胺(CONR代替CONH连接)，酯(CO2)，还原的酮亚甲烷(COCH2)或亚甲基氨基(CH2NH)，硫代酰胺(CSNH)，膦酸酯(phosphinate)(PO2RCH2)，膦酰胺和膦酰胺酯(PO2RNH)，倒肽(retropetide)(NHCO)，反式-烯(CR＝CH)，氟代烯(CF＝CH)，二甲烷(CH2CH2)，硫代醚(CH2S)，羟基亚乙烷(CH(OH)CH2)，亚甲烷氧基(CH2O)，四唑(CN4)，倒硫酰胺(NHCS)，反还原的(NHCH2)，磺酰氨基(SO2NH)，亚甲基磺酰氨基(CHRSO2NH)，倒磺酰氨基(NHSO2)和类肽(N-取代甘氨酸)，带有丙二酸和/或偕-二氨基烷基亚单位，如Fletcher等(1998)综述，纳入本文供参考。也可使用类肽骨架(N-取代的甘氨酸)(如Kessler，1993；Zuckermann等，1992；和Simon等，1992)。许多前述取代导致近似同型空间配位的聚合物骨架，它相对于由α-氨基酸形成的骨架。
支持本发明所进行的研究里使用了多肽(如肽骨架)。但是，其它骨架，如上述骨架也可以增加生物稳定性(例如体内抵抗酶降解)。
C.聚合物转运分子的合成
用本技术领域公知的任何方法来构建聚合物。例举性的肽聚合物可化学合成得到，优选的是用肽合成仪(Applied Biosystems型号433)或可用本技术领域公知的方法进行重组合成。当转运聚合物是一种肽或与所需蛋白质融合的多肽时，通常使用重组合成。
在固相肽合成中，N-甲基和羟基-氨基酸可用来代替常规的氨基酸。但是，制备带有还原肽键的聚合物需要合成含还原肽键的氨基酸二聚物。将这类二聚物用标准的固相合成方法掺入聚合物中。其它合成方法是公知的，可在Fletcher等(1998)，Simon等(1992)中找到，本文引作参考。
III.转运聚合物与生物活性剂的连接
本发明的转运聚合物可通过化学或重组方法共价连接到生物活性剂上。
A.化学连接
诸如小有机分子和大分子的生物活性剂可通过本技术领域公知的许多方法(如参见Wong1991)，或直接地(如用碳化二亚胺)或通过连接部分，连接到本发明的转运聚合物上。具体讲，适合于大多数应用的通常是易于形成氨基甲酸酯、酯、硫代醚、二硫连接和腙的连接。若在物质穿越细胞膜后需要连接物在胞质里易于降解，则酯和二硫连接较优。
可用各种功能基团(羟基、氨基、卤素等)将生物活性剂连接到转运聚合物上。优选的是已知不是生物活性剂活性位点的部分的基团，特别是如果多肽或它的部分在输送后仍需与物质连接的话，更应如此。
聚合物，如实施例1制备的肽，通常用氨基末端保护基团，如FMOC进行制备。对于在将多肽从合成树脂上裂解下来和侧链去保护的条件下，能保存下来的生物活性剂，可将FMOC从完整的树脂连接的多肽的N-末端上裂解下来，这样活性剂方能连接游离的N-末端胺。在这样的情况下，将待连接的试剂通常用本技术领域公知的方法活化，以产生活性酯或活性碳酸酯部分，它们与聚合物氨基能分别有效地形成酰胺或氨基甲酸酯连接。当然，也可用其它连接化学物质。
为了使副反应最少，可用常规的保护基团，如苄酯基(CBZ)、二一t-BOC、PMC、Pbf、N-NO2等封闭胍基和脒基。
交联反应用已知的偶联方法，在下述一种溶剂里进行，如N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯烷酮、二氯甲烷、水等中进行偶联反应。偶联剂的例子包括O-苯并三唑基氧基四甲基脲阳离子六氟磷酸盐(HATU)、二环己基碳化二亚胺，溴-三(吡咯烷基)溴化鏻(PyBroP)等。其它试剂包括，如N，N-二甲氨基吡啶(DMAP)、4-吡咯烷基吡啶、N-羟基琥珀亚酰胺、N-羟基苯并三唑等。
对于直至从连接的转运聚合物释放出来才具有活性的生物活性剂，接头宜选易于断裂的接头，这意味它在体内是受酶裂解或溶剂介导的裂解。为了达到此目的，含羧酸酯键和二硫键的接头是优选的，前者可被酶或化学水解，后者如在谷胱甘肽的存在下用二硫键交换所切断。
在一个优选的实施方案里，可断裂的接头含远离活性剂的第一可断裂基团，和紧靠活性剂的第二可断裂基团，这样，第一可断裂基团的断裂产生了含亲核部分的接头活性剂偶联物，它能进行分子内反应以断裂第二可断裂基团，从而将活性剂从接头和聚合物中释放出来。该实施方案将通过下面讨论的各种小分子偶联物作进一步阐述。
B.融合多肽
根据本技术领域公知的方法，用重组方法通过构建包含所需多肽和转运肽的融合蛋白质的载体，可使本发明的转运肽聚合物连接到生物活性多肽剂上。一般来说，转运肽组份将通过短肽接头与所需多肽的C-末端或N-末端连接。
IV.生物活性剂通过生物膜转运的增加
A.测定跨越生物膜的转运
评估本发明聚合物转运生物分子和其它治疗物质通过生物膜能力的模型系统，包括测量聚合物转运共价连接的荧光分子通过膜的能力的系统。例如，荧光(＝376MW)可作为转运小的有机分子(实施例2)的模型。对于大分子的转运，转运聚合物可与大的多肽，如卵清蛋白(分子量45kDa；如实施例14)融合。通过连接荧光标记有利于检测摄入的大分子。也可通过共聚焦显微镜来分析细胞摄入(实施例4)。
B.增加通过生物膜的转运
在为了支持本发明所进行的实验中，根据实施例2和3所描述的方法，通过摄入与荧光素连接的转运肽，评估了跨膜转运和伴随发生的细胞摄入。简言之，在37℃、23℃或3℃下，用悬浮在缓冲液里的荧光偶联物培育细胞悬液不同时间。培养后，停止反应，离心收集细胞并用荧光激活细胞分栋法(FACS)分析荧光。
在所用的条件下，偶联物的细胞摄入是不饱和的。结果，不能计算肽的ED50值。故将数据绘制成柱状图，这样可直接比较单一偶联物浓度下的细胞摄入。
图1A-1C显示了研究结果，其中测定了长度为4-9个精氨酸亚单位的L-精氨酸(R；图1A)或D-精氨酸(r；图1B)的聚合物将荧光素转运入Jurkat细胞的能力。为了比较，也测定了HIV tat残基49-57(“49-57”)和L-赖氨酸(K9)九聚体的输运水平。图1C显示了偶联物浓度为12.5μM时摄入水平的柱状图。
如图所示，由6个或更多精氨酸残基构成的荧光标记肽聚合物比tat序列49-57更能有效地进入了细胞。特别是，其摄入的增加至少是tat 49-57水平的两倍，甚至多达6～7倍。单独摄入荧光素可忽略。赖氨酸九聚体(K9)几乎不显示出摄入，这表明，与具有可比长度的含胍聚合物相反，短的赖氨酸聚合物作为跨膜转运是无效的。
参见图1B，D-精氨酸的均聚物比L-精氨酸显示出更活泼的转运。然而，摄入水平的级别大致相同。对于D-均聚物，有7-9个精氨酸的肽显示出大致相等的活性。六聚体(R6或r6)效果略差，但仍显示出比tat(49-57)高约2-3倍的转运活性。
D-和L-精氨酸聚合物增虽跨膜转运的能力通过共聚焦显微镜得到证实(图2A-2F和实施例4)。与上述FACS数据一致，用R9(图2B和2E)或r9(图2C和2F)培养的细胞胞质有明亮的荧光，这表明有高水平的偶联物转运进入细胞。相反，同样浓度的tat(49-57)只显示出微弱的染色(图2A和2D)。共聚焦显微镜也强调了这一，即D-精氨酸聚合物(图2C)进入细胞比L-精氨酸组成的聚合物(图2F)更有效。
从上述来看，显然，在药物跨细胞质膜转运中，本发明的转运聚合物比HIV tat肽47-59更有效。此外，聚-赖氨酸九聚体作为转运剂是无效的。
为了确定毗连的含胍均聚物的最佳长度，检验了一系列较长的精氨酸均聚体偶联物(R15、R20、R25和R30)。为了检查明显较长的聚合物的作用，也对平均分子量12,000道尔吨(≈100氨基酸)的L-精氨酸聚合物进行了试验(实施例5)。然而，为了避免沉淀问题，在测试带有≈12,000MW聚合物材料的偶联物时降低了试验中的血清水平。用上述FACS分析细胞摄入，测量活细胞的平均荧光。也测量了每个偶联物的细胞毒性。
参见图3，摄入带有15个或更多精氨酸的L-精氨酸均聚偶联物所显示的细胞摄入，明显不同于含9个或更少精氨酸聚合物的偶联物的摄入。较长偶联物的曲线较平坦，与R9和r9偶联物的曲线交叉。较高浓度(＞3μM)R9和r9的摄入明显比较长聚合物的摄入好。但是，在较低浓度下，与较长肽培育的细胞显示更强的荧光。
依据这些数据，很显然r9和R9进入细胞的速率大于含15个或更多毗连的精氨酸聚合物的速率。但是，R9(L-肽)的生物半衰期比较长偶联物的短，精测是因为(由于血清酶)较长肽的蛋白水解产生的片段仍然有转运活性。相反，D-异构体(r9)没有蛋白质降解的证据，这与血清蛋白质酶对L-多肽的特异性高是一致的。
因此，看来转运聚合物总的转运效率依赖于跨膜摄入(少于15个毗连精氨酸的聚合物较好)效率与蛋白水解失活(较长的聚合物较好)易感性的相对程度。因此，优选的是含7-20个，更好是7-15个毗连的胍残基的聚合物。
值得注意的是，高分子量聚精氨酸偶联物(12,000MW)未显示出可检测到的摄入。该结果与Barsoum等(1994)观察到的结果一致，提示精氨酸聚合物具有明显不同于赖氨酸聚合物所显示的转运性质。此外，已发现12,000的聚精氨酸偶联物是高度有毒的(实施例5)。总之，聚合物的毒性随着长度的增加而增加，但在所有浓度试验中只有12,000MW偶联物显示出高毒性。
用Michaelis-Menten动力学分析D-和L-精氨酸聚合物的细胞摄入时，Jurkat细胞的摄入速率如此有效，以致只有在3℃(冰上)进行试验时方能得到精确的Km值。Michaelis常数(Km)的推定受体肽的转运最大速率(v最大)和表观亲和力衍生自Lineweaver-Burk图，所述的图是与各种浓度D-和L-精氨酸的九聚体培养30秒、60秒、120秒和240秒后观察Jurkat细胞荧光得到。
动力学分析也揭示，在结合和横越推定的细胞转运位点时富含精氨酸的聚合物显示出比，例如tat(49-57)肽，更强的能力，因为九聚的聚-L-精氨酸(44μM)的转运Km值明显比tat肽(722μM)的Km值低。此外，D-精氨酸九聚体显示出在此试验测试的聚合物中最低的Km值(7μM)(表1)，即高大约100倍的表观亲和力。根据本发明优选的实施方案，在室温(23℃)或37℃下测定时，本发明的转运聚合物的表观亲和力(Km)至少比用实施例6程序测得的tat的亲和力大至少10倍，更佳是至少大100倍。
                              表1
                       KM(μM)         V最大(μM/秒)
H3N-RRRRRRRR-COO’               44.43            0.35
H3N-rrrrrrr-COO’                7.21             0.39
tat 49-57                722              0.38
为了支持本发明所进行的实验表明，聚合物促进的转运依赖于细胞的代谢完整性。向细胞加入毒性量的叠氮钠(0.5％w/v)导致抑制了约90％的偶联物摄入(实施例7)。图4的结果显示：(i)跨膜转运对叠氮钠敏感，提示有能量依赖性(细胞摄入)，和(ii)相对于HIV tat(49-57)，本发明的多胍聚合物(R9、R8、R7)具有优越性。
不归于任何特定的理论，以上数据表明，转运过程，是一个通过含胍阳离子或脒阳离子聚合物特异性识别存在于细胞质膜中的分子转移体，而介导的能量依赖过程。
其它支持本发明的实验显示，本发明的偶联物能有效地使生物活性剂跨膜转移通过各种类型的细胞膜，包括人T细胞(Jurkat)、B细胞(鼠CH27)、淋巴瘤T细胞(小鼠EL-4)、肥大细胞瘤细胞(鼠P388)、一些小鼠T细胞杂交瘤、神经细胞(PC-12)、成纤维细胞(鼠RT)、肾细胞(鼠HELA)、成髓细胞瘤(鼠K562)；和主要的组织细胞，包括所有的人血细胞(红血球除外)，如T和B淋巴细胞、巨噬细胞、树突细胞和嗜酸性的细胞；嗜碱性白细胞、肥大细胞、内皮细胞、心脏组织细胞、肝脏细胞、脾脏细胞、淋巴结细胞和角质细胞。
如实施例8和图5A-5C所示，该偶联物也可有效地跨越革兰阴性菌和革兰阳性菌细腻(膜)。一般来说，发现D-精氨酸亚单位的聚合物进入革兰阳性和革兰阴性菌的速率比L-精氨酸聚合物观察到的转移速率明显快得多。这由图5A显示：当与大肠杆菌HB 101(原核生物)细胞培养时显示，r9偶联物(D-精氨酸)的摄入水平比R9偶联物(L-精氨酸)的摄入水平高得多。该现象可能是由于L-聚合物被细菌酶的蛋白分解所降解。
图5B显示与大肠杆菌HB 101细胞培养时D-精氨酸偶联物的摄入水平与聚-L-赖氨酸偶联物(K9)相比，是长度(r4-r9)的函数、从中可见，聚精氨酸偶联物显示了与用真核生物细胞观察到的图2B有相似的趋势，短于r6的聚合物显示出低的摄入水平，摄入水平增长是长度的函数。
如图5C所示，革兰阳性菌，如牛链球菌用精氨酸而不是赖氨酸聚合物也能有效着色。
更广义地说，在37℃下观察到细菌的最大摄入水平。但是，当在室温或3℃培养时，观察到明显的染色。共聚焦显微镜显示，用0.5％叠氮钠预处理细菌抑制了跨越革兰阳性菌和革兰阴性菌内质膜的转运，但不抑制跨越细胞壁(革兰阳性菌)进入周质间隙的转运。
因此，本发明包括的偶联物含有抗微生物剂，如细抗菌和抗真菌化合物制剂以用来预防或抑制微生物增殖或感染，并供消毒表面以改进医用安全性。另外，本发明可用来向植物细胞内转运，特别是绿叶植物。
支持本发明的其它研究已显示，跨越细菌膜的移位是能量和温度共同依赖的，这与先前对其它类型细胞观察到的现象一致。
V.治疗组合物
A.小的有机分子
小有机分子治疗剂可很好地连接到本文所述的线性聚合组合物上，以促进或增加跨越生物膜的转运。例如，通过与本文所述聚合物转运分子连接，可有利于高电荷制剂，如左旋多巴(L-3，4-二羟基-苯丙氨酸；L-DOPA)的递送。也可考虑类肽和肽模拟剂(如，Langston，1997；Glannis等，1997)。本发明对递送在水性液体(如血清和盐水)里溶解不良的小有机分子有利。因此，治疗效率受低溶解度限制的化合物可按照本发明进行较高剂量的给药，相对于非偶联物形式而言，由于细胞摄入水平高，这些人物以偶联物形式作为分子基础可能更有效。
因为常常涉及小分子拓扑表面的重要部分，因此，为了发挥生物活性在特定的情况下，在跨越了靶生物膜后，偶联物的小分子部分可能需要与连接的转运聚合物和接头部分(若有的话)断开，以使小分子试剂发挥生物活性。对于这类情况，偶联物宜包括可断裂的接头以便在通过生物膜后释放游离的药物。
一个方法，偶联物可包括二硫键如图6A所示，它显示偶联物(I)含有通过作为接头的N-乙酰基保护的半胱氨酸基团，与细胞毒试剂，如6-巯基嘌呤连接的转运聚合物T。因此，细胞毒试剂通过二硫键与6-巯基连接，转运聚合物通过酰胺键与半胱氨酸羰基部分连接。通过还原或二硫交换断裂二硫键导致释放游离的细胞毒试剂。
实施例9A中提供了合成含二硫键偶联物的方法。该产物含Arg残基七聚体，它通过N-乙酰基-Cys-Ala-Ala接头与6-巯基嘌呤连接，其中Ala残基作为附加的空间臂使二硫键更易影响巯基和还原剂以利于在细胞中的断裂。该实施例的接头也说明了酰胺键的应用，它可在细胞里被酶断裂。
本发明的另一个方面，偶联物包括暴露于电磁辐射下会断裂的可光断裂接头。图6B揭示了连接键的例子，它显示，偶联物(II)含通过β-硝基苯甲酸酯接头部分连接于6-巯基嘌呤的转运聚合物T。聚合物T通过酰胺与苯甲酸酯羰基的键合连接于硝基苯甲酸酯部分，该细胞毒试剂通过其6-巯基连接到对-亚甲基上。如下形成化合物：使6-巯基嘌呤与对-溴甲基-间-硝基苯甲酸在NaOCH3/甲醇存在下加热进行反应，然后使苯甲酸酯羧酸与转运聚合物偶联，如γ-氨基丁酸接头的氨基与聚合物连接(实施例9B)。由于与巯基甲基部分相邻的硝基，光照偶联物导致6-巯基嘌呤的释放。该方法可用于本技术领域公知的光疗法，特别是在机体的选定部位局部发挥药物的活性。
优选的是，如下所述，可断裂接头含第一和第二可断裂基团，它们可协同将生物活性剂从聚合物上断裂下来。即，可断裂接头含有远离活性剂的第一可断裂基团和紧靠活性剂的第二可断裂基团，这样第一可断裂基团的断裂产生了含亲核部分的接头-活性剂偶联物，它能进行分子内反应以断裂第二可断裂基团，从而将活性剂从接头和聚合物中释放出来。
图6C显示了含有与抗癌药，5-氟尿嘧啶(5FU)连接的转运聚合物T的偶联物(III)。这里，连接键由修饰的赖氨酰残基提供。转运聚合物连接到α-氨基上，5-氟尿嘧啶通过α-羰基连接。赖氨酰ε-氨基已被修饰成邻-羟甲基硝基苯的氨基甲酸酯，它包括偶联物里的第一可光断裂基团。光照使硝基苯部分从偶联物上断裂下来，留下氨基甲酸酯，它也快速地分解产生游离的ε-氨基，一种有效的亲核基团。使ε-氨基与和5-氟尿嘧啶基团的酰胺键进行分子内反应导致环化，而释放5-氟尿嘧啶基团。
图6D显示了含有与抗癌药，paclitaxel的2’-氧相连的转运聚合物T的偶联物(IV)。连接部分提供的连接键包括(i)与转运聚合物相连的氮原子，(ii)位于氮原子对面的磷酸单酯，和(iii)与氮原子相间的羧甲基，它通过羧酸酯键与paclitaxel的2’-氧连接。偶联物上磷酸基团的酶促裂解产生游离的苯酚羟基。该亲核基团然后立即与羧酸酯进行分子内反应释放出paclitaxel，与它的生物靶标结合。实施例9C描述了制备该类偶联型配对物的合成方案。
图6E解释了另一种方案，其中转运聚合物与生物活性剂，如paclitaxel通过氨烷基羧酸连接。优选的是，接头的氨基通过3-5个链原子(n＝3-5)(优选的是3或4个链原子)连接于接头的羧基碳上，链原子以亚甲基碳为宜。如图6E所示，接头的氨基通过酰胺键连接到转运聚合物上，并通过酯键连接被连接到paclitaxel部分。酶裂解酰胺键释出聚合物并产生了游离的亲核氨基。该游离氨基然后可与酯基团进行分子内反应从paclitaxel释放出接头。
图6D和6E说明了本发明的另一个方面，包括紫杉烷(taxane)和taxoid抗癌偶联物，它相对于相应的非偶联形式而言具有增加的跨膜转运速率。该偶联物抑制癌症细胞生长尤为有用。据信，紫杉烷和taxoid通过促进微管聚合至一定程度(并抑制去聚合反应)，可破坏细胞功能，抑制细胞复制最终导致细胞死亡，而显示出它们的抗癌效果。
术语“紫杉烷”指paclitaxel(图6F，R’＝乙酰基，R”＝苄基)，其商品名为“TAXOL”，为天然形成的、合成的或生物基因工程类似物，如图6G所示，其骨架核心含有paclitaxel的A、B、C和D环。图6F也表示“TAXOTERETM”结构(R’＝H，R”＝BOC)，它是Rhone-poulenc出售的溶解性稍好的paclitaxel合成类似物。如图6H所示，“Taxoid”指含有paclitaxel的基础A、B和C环的天然形成的、合成的或生物基因工程的paclitaxel类似物。如Suffness(1995)所综述的特别是第12-14章，以及后续paclitaxel文献所综述的各种紫杉烷和taxoid化合物的大量合成和生物学信息。此外，如Suffness在第8和13章所述的那样，可得到细胞系的某个宿主来预测这些人物对某些类型癌症的抗癌活性。
转运聚合物通过紫杉烷或taxoid中合适的连接部位与紫杉烷或taxiod部分偶联。方便的话，转运聚合物通过C2’-氧原子、C7-氧原子用如上所述的连接方法进行连接。转运聚合物通过C7-氧偶联导致紫杉烷偶联物具有抗癌和抗肿瘤活性。因此，接头可断裂或不可断裂。通过C2’-氧偶联则明显降低了抗癌活性，故可断裂接头对该位点偶联是优选的。也可使用其它连接位点，如C10。
应当明白，本发明的紫杉烷和taxoid偶联物相对于紫杉醇(≈0.25微克/毫升)和taxotere(6-7微克/毫升)具有改进的水溶解性。因此，不需要大量助溶剂，如“CREMOPHOR EL”(聚环氧乙烷蓖麻油)、聚山梨醇酯80(聚环氧乙烷山梨酸单油酸酯，也称为“TWEEN 80”)和乙醇，结果可减少与通常这些助溶剂相关的副作用，如过敏性反应、呼吸困难、血压过低和脸红。
B.金属
如实施例10所示，金属可用诸如texaphyrin或二乙烯三胺五乙酸(DTPA)的螯合剂，与本发明的转运膜偶联而转运进入原核细胞和真核细胞。这些偶联物可用来递送金属离子以供显影或治疗。可例举的金属离子包括Eu，Lu，Pr，Gd，Tc99m，Ga67，In111，Y90，Cu67和Co57。用下列实施例描述的基于细胞的试验，可对偶联候选物进行初步的膜转运研究。例如，用铕离子，可用时间-分辨荧光测量术来监测细胞摄入。对于细胞毒性金属离子，可通过检测细胞毒性来监测摄入。
C.大分子
本发明增加转运的方法特别适合于增加许多大分子跨越生物膜的转运，所述的大分子包括，但不限于，蛋白质、核酸、多糖和其类似物。核酸的例子包括DNA和RNA形成的寡核苷酸和聚核苷酸，和它们的类似物，它们具有选定的序列目的是与互补靶序列(如单链或双链的反义序列)杂交或表达核酸转录物或这些序列所编码的蛋白质。类似物包括带电荷(优选的是不带电荷)的骨架类似物，如磷酸酯(优选的是甲基磷酸酯)，膦酰胺(N3’或N5’)，硫代磷酸酯骨架，不带电荷的吗啉代-基聚合物，和蛋白质核酸(PNA)。这类分子可用于各种治疗方案，包括酶替代疗法、基因疗法和反义疗法。
例如，蛋白质核酸(PNA)是DNA的类似物，其中骨架是与脱氧核糖骨架结构上同(homomorphous)形的。它由N-(2-氨基乙基)甘氨酸单位构成，核碱基(nucleobase)连接其上。PNA含所有四种天然核碱基，遵从Watson-Crick碱基配对定理与互补的寡核苷酸杂交，就碱基识别来说它是真正的DNA模拟物(Egholm等，1993)。PNA骨架由肽键形成，而不是磷酸酯，这使它适合用于反义疗法。由于骨架不带电荷，所形成的PNA/DNA或PNA/RNA双体显示出比正常更高的热稳定性。PNA具有额外的优点：它们不被核酸酶或蛋白酶所识别。另外，PNA可在自动肽合成仪上用标准的t-Boc化学方法合成。PNA然后易于与本发明的转运聚合物连接。
美国专利5,594,122描述了用本发明的方法增加转运入细胞的反义寡核苷酸的例子。这类寡核苷酸的目标是治疗人免疫缺陷病毒(HIV)。例如按照已建立的方法在肽和寡核苷酸的5’端之间通过琥珀酸酯接头形成酰胺键，使转运聚合物与反义寡核苷酸偶联。实施例11进一步阐述了PNA偶联物的使用。
图7显示如实施例11所述，用含PNA序列的本发明偶联物抑制T细胞分泌γ-干扰素(γ-IFN)所得到的结果。可见，当偶联物存在量高于10μM时，反义PNA偶联物能有效地阻断γ-IFN分泌。相反，单独用反义-PNA偶联物或非偶联的反义PNA未见抑制作用。
能转运跨越生物膜的另一类大分子例子是蛋白质，特别是酶。治疗蛋白质包括，但不限于，取代的酶。治疗酶包括，但不限于，用于治疗溶酶体(lysozomal)葡糖脑苷脂酶缺乏(Gaucher疾病)的alglucerase，用于治疗黏多糖(贮积)病的α-L-iduronidase，用于治疗桑菲利波B综合征的α-N-乙酰基葡萄糖胺酶，用于治疗胰腺缺乏的脂肪酶，用于治疗严重联合免疫缺陷综合征的腺苷脱胺酶，用于治疗与丙糖磷酸酯异构酶缺乏有关的神经肌肉功能障碍的丙糖磷酸酯异构酶。
另外，本发明的重要方面内容是，蛋白质抗原可递送入抗原提呈细胞(APC)，在胞质小室中，被降解成肽。然后肽转运入内质网中与新生的HLAI类分子结合，并在细胞表面上展示。这类“活化的”APC可作为I类限制性抗原特异性细胞毒T-淋巴细胞(CTL)的诱导剂，CTL然后识别和消灭显示有特定抗原的细胞。能执行该过程的APC包括，但不限于，某些巨噬细胞、B细胞和树突细胞。在一个实施方案里，蛋白质抗原是肿瘤抗原以引起或促进对肿瘤细胞的免疫应答。
将分离或溶解的蛋白质转运进入APC的胞质随之活化CTL是例外的，因为，注入分离或溶解的蛋白质不会导致APC活化或诱导CTL。因此，与本发明转运增强组合物交联的抗原可以在体外或体内起着刺激细胞免疫应答的作用。
实施例14提供了支持本发明的实验细节，其中典型的蛋白质抗原(卵清蛋白)与R7聚合物交联后，被递送给APC。接着将APC加入到细胞毒T淋巴细胞(CTL)中，导致产生CD8+卵清蛋白特异性的细胞毒T细胞(激活的CTL)。相反，接触未修饰卵清蛋白的APC不能激活CTL。
在平行实验里，使组织相容的树突细胞(特殊类型的APC)接触卵清蛋白-R7偶联物，然后注入小鼠。分析这些小鼠的血样品表明有卵清蛋白特异性CTL存在。对照鼠给予已接触过未修饰卵清蛋白的树突细胞不显示有卵清蛋白特异性CTL应答。这些实验例举了通常与巨噬细胞递送，特别是蛋白质递送入细胞相关的特殊用途。
在另一个实施方案里，本发明用来向胞质递送免疫特异性抗体或抗体片段以干扰诸如微生物感染等有害的生物过程。最近的实验显示，细胞内抗体在植物和哺乳动物细胞里可以成为有效的抗病毒剂(如Tavladoraki等，1993；和Shaheen等，1996)。这些方法通常使用单链可变区片段(scFv)，其中抗体的重链和轻链合成成为单个多肽。重链和轻链可变区由可弯曲的接头肽(如15个氨基酸的肽)分开产生一个28KDa分子，它保留了高亲和性的结合部位。广泛应用该技术的主要障碍在于其摄入受感染细胞中的效率。但通过将转运聚合物连接到scFv片段上，可能增加细胞的摄入程度，使免疫特异性片段结合，并消除了微生物的重要组份，如HIVRev.HIV逆转录酶和整合酶蛋白质。
D.多肽
本文描述的增加转运方法所递送的肽包括，但不限于，效应器多肽，受体片段等等。例子包括通过蛋白质介导的胞内信号用于有膦酰化位点的肽。这类蛋白质的例子包括，但不限于，蛋白激酶C，RAF-1，p21Ras，NF-κB，C-JUN和膜受体，如IL-4受体，CD28，CTLA-4，V7和MHCI类和II类抗原的胞质尾。
当转运增强分子也是一种肽时，可用自动肽合成仪或上述产生编码融合肽的聚核苷酸的重组方法进行合成。
在支持本发明的实验中(实施例15)，用R7聚合物序列在其C末端合成了跨膜蛋白质V7(也称为CD101)的胞质尾区域的10个氨基酸片段。该尾区域已知物理上与介导RAF-1激酶(一种细胞活化MAP激酶途径中的关键酶)失活相关。V7-R7偶联物被加到T-细胞中，接着用洗涤剂裂解下细胞。通过抗-V7鼠抗体与山羊抗鼠IgG结合测试了该可溶性组分的免疫沉淀情况。
不用肽处理时，已知与V7相关并因与V7结合而灭活的一种激酶RAF-1，与V7共同沉淀下来。用肽处理的细胞里，RAF-1蛋白从V7免疫复合体里消除了。同样的肽处理不会破坏RAF-1和p21Ras构成的复合体，这排除了RAF-1受V7肽非特异性修饰的可能性。这些结果显示，胞质尾区V7肽，与本发明膜转运增强肽偶联时能进入靶细胞，并与生理效应分子RAF-1特异性结合。这类结合可用来破坏某些细胞内过程。
研究的第二个方面，偶联物的V7部分可用蛋白激酶C在体外膦酰化。已接触过膦酰化的V7尾肽而不是非膦酰化的V7尾肽的T细胞的抗-RAF-1沉淀，表明对RAF-激酶活性的强烈抑制。这些研究证明了两个原理。第一，本发明的转运聚合物能有效地将高电荷(膦酰化)分子转运通过细胞膜。第二，虽然膦酰化和非膦酰化的V7尾肽能与RAF-1结合，但只有膦酰化肽改变了RAF-1激酶活性。
VI.筛选试验的方法和文库
在另一个实施方案里，本发明可用来筛选一个或多个具有选定生物活性的偶联物。其中偶联物从一个或多个候选试剂里形成。使偶联物与细胞接触，细胞摄入偶联物显示出可检测信号，这样，信号的数量是偶联物对选定的生物活性转运有效的指标。
该实施方案的一个优点在于它特别可用来测试本身不能或几乎不能进入细胞以显示出生物活性的制剂的活性。这样，本发明提供了特别有效的方法来鉴定活性剂，这些活性剂由于缺乏有效和方便的方法特其转运进入细胞或细胞器而不能进入大规模筛选程序(被选出来)。
优选的是，本发明提供了一种或多种候选剂作为偶联物的组合文库，这些偶联物可用本技术领域知道的任何一种组合合成方法来制备。例如，Thompson和Ellman(1996)认为，至少有5个不同的方法可在固体支持物上制备组合文库，即(1)合成不连续的化合物，(2)分开(split)合成(分开和合并)，(3)可溶的文库去卷绕(deconvolution)，(4)通过分析方法测定结构，和(5)编码策略，其中活性候选物的化学组分在试验中显示出阳性生物活性后，由独特的标记来确定。解决方案的文库合成包括至少(1)空间分开合成和(2)合成汇集(Thompson，同上)。Lam等(1997)中可以找到组合合成法的进一步阐述，它特别描述了一珠一化合物的方法。
这些方法很适合制备本发明的偶联物，包括所需的合适的保护方案。例如，对于在一个或多个固体支持物上构建的文库，可将转运肽部分首先连接到支持物上，然后通过合适的反应功能团将候选制剂构造或悬挂组合到聚合物上。液相合成可用相似或不同的方法。在固体支持物上形成的文库宜用已知的方法通过裂解连接基团从支持物上断下来(Thompson等和Lan等，同上)。
可用能诱导出与偶联物的效应成比例的可检测信号的许多细胞试验之一种来分析对一个或多个候选偶联物。方便的话，将候选物与细胞在多孔板中培养，通过用板读数仪器定测定量的信号(如荧光、反射光、吸收光或化学发光)测量生物效应。或者，取出孔中的培养混合物供进一步加工和/或分析。活性化合物或非活性化合物的结构若不是已知的，则可进行测定，该信息可用来鉴定主要的化合物，并进一步致力于合成和筛选。
例如，实施例11叙述的γ-干扰素分泌试验很适合于多孔形式，这样通过基于铕的荧光检测，可用板读数仪来测定活性分泌抑制剂。用已建立的癌细胞系(如国立卫生研究院(NIH)和国立癌症研究所(NCI)提供)可筛选抗癌药。例如，可用台盼兰染料排除法来测定抗癌药的细胞毒性。
另一个例子包括涉及抑制细胞信号传导的试验，如IL-4受体抑制，阻断细胞增殖试验和基因表达试验。在典型的基因表达试验中，特感兴趣的基因放置在合适启动子的控制下，其下游放置一个能产生诸如β-半乳糖苷酶或萤火虫荧光素酶等报告分子的基因。根据报告信号的减少可检测出抑制效应。
本发明也包括用于上述方法筛选的偶联物文库。该文库包括具有一种或多种所选生物活性的多个候选剂，每个都与本发明的至少一个转运聚合物偶联。优选的是，偶联物文库是组合性文库。在另一个实施方案里，本发明包括规则排列的分布在众多有索引导样品孔中的、供试验和鉴定所需活性剂的、不同聚合物一活性剂偶联物。
VI.应用
本发明的组合物和方法特别适用于人和兽医治疗领域。一般来说，给药剂量应当能向治疗部位有效地递送皮摩尔(picomolar)到微摩尔浓度的治疗组合物。合适的剂量和浓度将取决于诸如治疗组合物或药物、要递送的部位和给药途径等因素，所有这些都可根据本技术领域公知的方法恁经验而得出。从用本领域公知的实验动物模式来评价剂量的研究中可得到进一步的指导。
若需要可通过可接受的给药模式给予本发明的化合物和合适的药用赋形剂。这样，给药可为(例如)静脉注射、局部外用、皮下给药、透皮给药、肌肉注射、口服、关节内注射、非胃肠道给药、腹腔内给药、鼻内给药或吸入给药。制剂可为固体、半固体、冻干粉末或液体剂型，如，片剂、丸剂、胶囊剂、粉末剂、溶液、悬浮液、乳剂、栓剂、潴留灌肠剂、栓剂、软膏剂、洗剂、气雾剂等等，优选的是适合单剂给药或精确剂量给药的单位剂型。
组合物通常包括常规的药用载体或赋形剂，可另外包括其它医用剂、载体、佐剂等等。优选的是，组合物含5％-75％重量的本发明化合物，剩余部分由合适的药用赋形剂构成。对于特定的组合物和给药途径，合适的赋形剂将由本技术领域公知的方法而确定，如(Gennaro，1990)。
对于口服，这类赋形剂包括药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、明胶、蔗糖、碳酸镁等等。组合物可为溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释制剂等等形式。
在一些实施方案里，药用组合物可为丸剂、片剂或胶囊形式，因此，组合物除了生物活性偶联物外，还含下列物质：诸如乳糖、蔗糖、磷酸二钙等稀释剂；诸如淀粉或其衍生物等崩解剂；诸如硬脂酸镁等的润滑剂；和诸如淀粉、阿拉伯胶、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、纤维素和它们的衍生物等粘合剂。
制剂的活性化合物可配制成栓剂，包括，如约0.5-50％本发明化合物，它们分散在聚乙二醇(PEG)载体(如PEG 1000(96％)和PEG 4000(4％))里。
可这样指标液体组合物：将化合物(约0.5-20％)和任选的药用佐剂溶解或分散在载体如盐水(如0.9％w/v氯化钠)，右旋糖水溶液，甘油，乙醇等中，以形成溶液或悬浮液供静脉给药。活性化合物可配制成潴留灌肠剂。
需要时，给药的组合物也可含少量无毒辅助物质，如湿润剂或乳化剂，pH缓冲剂，如乙酸钠、单月桂酸山梨醇酯或三乙醇胺油酸酯。
对于局部给药，组合物可以任何合适的形式，如洗剂或透皮贴剂给予。对于吸入递送给药，组合物可以干燥粉末或液体形式通过喷雾器给药。
制备这类剂型的方法是公知的或对于本技术领域是公知的：如参见Remington’s Pharmaceutical Sciences(1980)。所给予的组合物在任何情况下含一定量的前体药物和/或活性化合物，此含量为根据本发明技术给药时能有效地缓解所治疗疾病的药用有效量。
一般来说，本发明的化合物以治疗有效量的，即足以进行治疗的剂量给予，它可根据被治疗的个体和疾病状态而基化。典型的是，每日的治疗有效剂量为0.1-100mg/kg体重。大多数情况下每天的总给药剂量为1-30毫克/千克体重，或对于70千克的人每天的剂量为约70毫克到2100毫克。
偶联物的稳定性可通过聚合物的骨架和侧链的组成和立体化学作进一步控制。对于多肽聚合物，D-异构体通常耐内源性蛋白酶，因此在血清和细胞里具有较长的半衰期。当需要较长的作用持续时间时，D-多肽聚合物因此是合适的。L-多肽聚合物由于对蛋白酶敏感，其半衰期较短，因此可选择用未赋予较短的作用效果。一旦观察到副作用就中止治疗，这使副作用更易于消除。含D和L-残基混合物的多肽具有中间程度的稳定性。均-D-聚合物通常是优选的。
下列实施例供叙述而非限定本发明。
实施例1
肽合成
用FastMOCTM化学原科和市售的Wang树脂和Fmoc保护的氨基酸，根据本技术领域公知的技术(Bonifaci)在Applied Niosystems肽合成器上用固相技术合成肽。用C4或C18反相HPLC柱纯化肽，它们的结构用氨基酸分析和质谱来证实。
实施例2
荧光分析
这样合成荧光肽：用氨基己酸修饰肽的氨基末端，然后在溶于N-甲基吡咯烷酮的(2-1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲阳离子六氟磷酸盐/N-羟基苯并三唑存在下与荧光素异硫代氰酸酯反应。产物经凝胶过滤纯化。
在37℃、23℃或4℃下，将肽或偶联物以含2％胎牛血清的PBS pH7.2(PBS/FCS)配成一浓度范围与96孔板里的悬浮细胞(106/毫升)一起培育不同时间。培养15分钟后，离心沉淀细胞，用含1％叠氮钠的PBS/FCS洗涤三次，与胰蛋白酶/EDTA(Gibco)37℃培养5分钟，然后用PBS/FCS/NaN3洗涤两次。将沉淀重悬于含2％FCS和0.1％碘化丙锭的PBS中，在FACScan上分析(Becton Dickenson，美国加利福尼亚)。碘化丙锭阳性的细胞排除在分析外。为了分析精氨酸聚合物，降低光电倍增管的电压一个数量级以允许更精确地进行测量。
实施例3
tat碱性肽对多-精氨酸肽
通过实施例2的方法测量了下列多肽的摄入水平：(1)含HIV tat残基49-57的多肽(Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg＝序列识别号：1)，(2)L-Lys残基九聚体(K9，SEQ ID NO：2)，和(3)含四到九个Arg残基的均-L或均-多肽(SEQ ID NO：3-8和12-17)。结果如图2A-2C所示。
实施例4
共聚焦细胞显微镜
如上制备用荧光多精氨酸肽培育的细胞供结合试验，在Cell Sciences ImagingFacility (Stanford University，美国加利福尼亚斯坦福)上用扫描单束激光共聚焦显微镜，以激发光波长488nm(氩离子激光)和发射带宽510-550(用带通过过滤器)进行分析。将含有与荧光素偶联的tat(49-57)，R7或r7的偶联物(6.25μM)37℃与Jurkat细胞培育10分钟。图2A-2F显示tat(49-57)(图2A和2C)，R7(图2B和2E)和r7(图2C和2F)发射的荧光(图2A-2C)和发射光(2D-2F)的结果。
实施例5
长度范围研究
用实施例2所述的荧光试验对下列多精氨酸的均聚物进行试验，将r9，R9，R15，R20，R25和R30与细胞37℃培养15分钟然后沉淀细胞。另外，将平均分子量为12,000道尔吨的L-精氨酸聚合物的混合物(约100个氨基酸)(Sigma Chem.CO.)在用荧光素异硫氰酸酯标记并经凝胶过滤(“SEPHADEX”G-25)纯化后进行试验。细胞经FACS分析，测量活细胞的平均荧光。也通过计算碘化丙锭染色的细胞(死亡细胞的特征)百分数来测量每个偶联物的细胞毒性。R9，R9，R15，R20和R25偶联物的摄入结果如图3所示。
市售的聚精氨酸(12,000MW)沉淀了血清蛋白质，最可能是α1-酸糖蛋白。因此，在由该材料制备的偶联物的试验里，胎牛血清水平降低了10-倍。
12,000Mwpoly-Arg组合物在800nM到50μM浓度下是有毒的，它被图3排除在外。含20个或更多的精氨酸残基的poly-L-Arg偶联物在大于12μM浓度时有毒性，故毒性随着长度增加而增加。
实施例6
摄入的动力学
为了测量细胞摄入的V最大和Km参数，对实施例2用的试验方法作下列变化。使肽与细胞4℃在96-孔板50微升PBS/FCS里培养0.5，1，2和4分钟，一式三份。在培养结束时，通过以5毫升PBS/FCS稀释样品而淬灭反应，离心并用PBS/FCS、胰蛋白酶/EDTA洗涤，最后再用PBS/FCS洗涤一次，取出溶于含碘化丙锭的PBS/FCS中的沉淀，在FACScan上分析。FACS数据用于Lineweaver-Burk等式来分析Michaelis-Menten动力学。表1显示了tat(49-57)、R9和r9的荧光偶联物的动力学数据。
实施例7
代谢抑制剂对转运的作用
在0.5％叠氮钠(以含2％FCS的PBS配制)中培育悬浮细胞(106/ml)30分钟。培养结束时，加入荧光肽(tat(49-57)，R7，R8或R9)到最终浓度为12.5μM。培养30分钟后，如实施例2(除了都用含0.1％叠氮钠的洗涤缓冲液外)，对细胞进行洗涤。结果如图5所示。
实施例8
转运进入细菌细胞
使革兰阴性菌(大肠杆菌株HB101)和革兰阳性菌(牛链球菌)在合适的培养基里以对数生长时相生长。在偶联物浓度为3-50μM时用各种浓度的含L-精氨酸(R4-R9)、D-精氨酸(r4-r9)或L-赖氨酸(K9)的线性聚合物的荧光偶联物与细胞培养物(4×108/毫升)一起37℃培养30分钟。洗涤细胞，置于含碘化丙锭的PBS(以特别死亡的细胞)中，用FACS和荧光显微镜分析。结果如图5A-5C所示。
实施例9
带典型可断裂接头的偶联物
A.6-巯基嘌呤半胱氨酸二硫化偶联物
A1.硫醇活性。在室温下搅拌时将N-乙酰基-Cys(SH)-Ala-Ala-(Arg)7-CO2H(12.2mg，0.0083毫摩尔)溶于3毫升3∶1 AcOH∶H2O中。向该溶液里加入二硫代-双(5-硝基吡啶)(DTNP)(12.9mg，0.0415毫摩尔，5当量)。使溶液在室温下搅拌24小时，混合物变成亮黄色。真空除去溶剂，将残留物再溶于5毫升H2O，用乙酸乙酯萃取3次以除去过量DTNP。冻干水层，使用产物而无需进一步的纯化。
A2.与药物连接。在室温、氩气下搅拌使N-乙酰基-Cys(SH)-Ala-Ala-(Arg)7-CO2H(0.0083毫摩尔)溶于1毫升脱气的H2O(pH＝5)中。将在0.5毫升DMF中6-巯基嘌呤(1.42mg，0.0083毫摩尔，1当量)加到混合物中。在惰性气体和室温下搅拌18小时进行反映。18小时后出现亮黄色，这表明有游离的5-硝基-2-硫代吡啶存在。减压除去溶剂，残留物经HPLC纯化，得到所需的产品(I，图6A)，总得率50％。
B.光可断裂的紫杉酚偶联物
在氮气下将3-硝基-4-(溴甲基)苯甲酸(100毫克，0.384毫摩尔)溶于无水甲醇。向该溶液中加入甲醇(methoxide)钠(88微升，25％(w/w)在甲醇中，0.384毫摩尔，1当量)，然后加入6-巯基嘌呤(58.2毫克，0.384毫摩尔，1当量)。使混合物温热到回流，搅拌3小时。然后冷却反应混合物，过滤，用6N HCl酸化淬灭。然后将反应体积减少到一半，此时产物沉淀下来，通过过滤收集沉淀。残留物再溶于甲醇，(需要时)过滤，减压浓缩得到所需的硫化物(II，图6B)的黄色粉末固体，得率50％。
C.磷酸盐-可断裂的紫杉酚
C1.在0℃通过吸液器向邻-羟基苯乙酸(15.0克，0.099摩尔)在H2O(39毫升)中的悬浮液里慢慢加入硝酸液(12毫升，65％在8毫升H2O中)。溶液0℃再搅拌1.5小时。然后将混合物温热到室温，再搅拌0.5小时。将该异质性溶液倒入冰(10克)，过滤除去不溶的原(ortho)-硝基异构体。减压浓缩红色溶液，将稠厚的残留物再溶于6N HCl，通过硅藻土过滤。减压除去溶剂以得到所需的2-羟基-4-硝基-苯乙酸的淡褐红色固体(得率40％)。产物(IV-a)用于下一步骤而无需进一步纯化。
C2.在氩气氛围下将产物IV-a(765毫克，3.88毫摩尔)溶于新蒸馏的THF(5毫升)中。将溶液冷却到0℃，通过注射器滴加入硼烷-THF(1.0M在THF中，9.7毫升，9.7毫摩尔，2.5当量)，有氢气溢出。再搅拌反应16小时，慢慢温热到室温。慢慢加入1M HCl(激烈吹泡)和10毫升乙酸乙酯来淬灭反应。分离各层，水层用乙酸乙酯萃取5次。合并的有机层用盐水洗涤，硫酸镁干燥。真空蒸发溶剂，残留物经快速柱层析纯化(1∶1己烷∶乙酸乙酯)得到所需的硝基-醇(IV-b)的淡黄色固体(85％得率)。
C3.硝基醇(IV-b)(150毫克，0.819毫摩尔)溶于含二叔丁基二碳酸酯(190毫克，1.05当量)和10％Pd-C(10毫克)的无水DMF(5毫升)中。将混合物放在Parr装置里，加压/净化5次。将溶液加压到47psi，振摇24小时。通过硅藻土过滤来淬灭反应，减压除去溶剂。残留物经柱层析纯化(1∶1己烷∶乙酸乙酯)得到保护的苯胺产物(IV-c)的棕褐色晶体，得率70％。
C4.在氩气氛围下将TBDMS-Cl(48毫克，0.316毫摩尔)溶于新蒸馏的二氯甲烷(4毫升)中。向该溶液加入咪唑(24毫克，0.347毫摩尔，1.1当量)，马上形成白色沉淀。使溶液在室温下搅拌30分钟，此时迅速加入产物IV-c(80mg，0.316毫摩尔，1.0当量)在二氯甲烷/THF(1.0毫升)里的溶液。所得的混合物在室温下再搅拌18小时。加入饱和的氯化铵水溶液来淬灭反应。分离各层，水层用乙酸乙酯萃取3次，合并的有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥。浓缩有机相得到甲硅烷基醚-苯酚产物(IV-d)的淡黄色油(得率90％)。
C5.在氩气下将甲硅烷基醚-苯酚IV-d(150mg，0.408毫摩尔)溶于新蒸馏的THF(7毫升)中，使溶液冷却到0℃。然后通过注射器滴加正丁基锂(n-BuLi)(2.3M在己烷里，214微升)。马上见到从淡黄色到深红色的颜色改变。5分钟后，在氩气下向搅拌着的溶液迅速加入四苄基焦磷酸盐(242毫克，0.45毫摩尔，1.1当量)。使溶液在惰性气体下再搅拌18小时，慢慢温热到室温，此时形成白色沉淀。加入饱和氯化铵水溶液和10毫升乙酸乙酯来淬灭反映。分离各层，水层用乙酸乙酯萃取5次。合并的有机层用盐水洗涤，用硫酸镁干燥。蒸发除去溶剂，残留物经快速柱层析纯化(1∶1己烷∶乙酸乙酯)，得到所需的磷酸盐-甲硅烷基醚(IV-e)的淡橙色油(得率90％)。
C6.在室温下，将磷酸盐-甲硅烷基醚(IV-3e)(10毫克，0.0159毫摩尔)溶于2毫升无水乙醇。向该搅拌着的溶液里加入20微升浓HCl(1％v∶v溶液)，搅拌混合物，直到TLC分析表明反应完全为止。加入固体碳酸钾以淬灭反应，使混合物快速通过硅胶过滤并浓缩，得到粗制的醇-二苄基磷酸盐产物(IV-f)的淡黄色油(100％得率)。
C7.在氩气下将醇IV-f(78mg，0.152毫摩尔)溶于新蒸馏的二氯甲烷(10毫升)中。向该溶液加入Dess-Martin periodinane(90mg，0.213毫摩尔，1.4当量)。搅拌溶液，反应进程用TLC分析监测。一旦TLC表明反应完全，加入1∶1饱和碳酸钠水溶液：饱和硫代硫酸钠水溶液来淬灭反应。让双相混合物在室温下搅拌1小时。分离各层，水层用乙酸乙酯萃取3次。合并的有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥。减压除去溶剂得到醛产物(IV-g)的淡褐色油(100％得率)。
C8.在惰性气体下将醛IV-g(78mg，0.152毫摩尔)溶于叔丁醇/水(3.5升)中。向快速搅拌的溶液加入2-甲基-2-丁烯(1.0M在THF里，1.5毫升)，磷酸钠-单碱式(105毫克，0.76毫摩尔，5当量)和氯化钠(69毫克，0.76毫摩尔，5当量)。让溶液在室温下搅拌8小时。浓缩溶液，残留物酸化，用乙酸乙酯萃取3次。合并的有机相经硫酸镁干燥。再减压浓缩溶液，残留物经柱层析(2∶1乙酸乙酯∶己烷)纯化得到所需的羧酸-二苄基磷酸盐(IV-h)的淡黄色油(得率65％)。
C9.在氩气、室温下，将酸IV-h(8.0mg，0.0152毫摩尔，1.1当量)溶于新蒸馏的二氯甲烷(2毫升)中。向该混合物加入paclitaxel(12mg，0.0138毫摩尔，1当量)，然后加入DMAP(2毫克，0.0138毫摩尔，1当量)和DCC(3.2mg，0.0152毫摩尔，1.1当量)。让混合物在室温下再搅拌4小时，此时形成了轻度沉淀。一旦TLC分析表明反应完成，减压除去溶剂，残留物经快速柱层析(1∶1己烷∶乙酸乙酯)纯化得到paclitaxel-C2’-羧酸酯(IV-I)的白色晶体(得率65％)。
C10.在氩气和室温下，将酯IV-I(5.0毫克)溶于纯净的甲酸(1.0毫升)中，搅拌30分钟。一旦TLC显示反应完成，减压浓缩溶液，残留物经快速硅胶过滤纯化得到所需的苯胺-紫杉酚化合物(IV-j)的白色粉末，得率50％。
C11.向(聚二-CBZ)-保护的AcHN-RRRRRRR-CO2H(1.2当量，0.1-1.0M)在无水DMF里的溶液加入邻-苯并三唑基氧基四甲基脲阳离子六氟磷酸盐(HATU，1.0当量)和催化量DMAP(0.2当量)。在隋性气体室温搅拌溶液5分钟。向该混合物加入溶于无水DMF(最小溶解体积)中的紫杉酚-苯胺衍生物(IV-j)。室温再搅拌所得溶液5小时。通过减压浓缩反应混合物来中止反应。粗制的反应混合物经HPLC纯化得到所需的物质(IV，图6D)。
实施例10
金属离子的转运
将3.93克DTPA溶于100毫升HEPES缓冲液中，加入溶于8毫升HEPES缓冲液的1.52毫升氯化铕原子标准溶液(Aldrich)，室温搅拌30分钟。层析分离并冻干得到的Eu-DTPA螯合剂复合物。该复合物然后通过固相肽化学技术与多肽氨基末端偶联。通过时间分辨荧光法来检测铕离子的细胞摄入。
实施例11
摄入PNA-肽偶联物
用固相化学，采用市售的Fmoc试剂(PerSeptive Biosystems，Cambridge，美国马里兰)在Applied Biosystems 433A肽合成仪或Millipore Expedite核酸合成系统上合成PNA肽偶联物。将D或L-精氨酸的聚合物连接到PNA的氨基或羧基末端，这分别与核酸的5’和3’末端类似。通过向偶联物的氨基末端加入氨基己酸空间臂，然后连接生物素或荧光素也可对偶联物进行修饰以包含荧光素或生物素。用95％TFM，2.5％三异丙基硅烷和2.5％苯酚水溶液使PNA-肽偶联物从固相上断裂下来。过滤除去树脂，蒸发除去残留的酸。用C-18反相柱进行HPLC，纯化产物，冻干产物。所需的PNA-聚合物偶联物用激光脱附质谱鉴定。
A.抑制细胞分泌γ-IFN
1.PNA-肽偶联物。制备下列正义和反义PNA-肽偶联物来抑制γ-INF产生，其中r＝D-精氨酸，R＝L-精氨酸：
正义：
NH2-rrrrrrr-AACGCTACAC-COOH     (SEQ ID NO：18)
反义：
NH2-rrrrrrr-GTGTAGCGTT-COOH     (SEQ ID NO：19)
荧光反义：
X-rrrrrrr-GTGTAGCGTT-COOH       (X-SEQ ID NO：19)
其中X＝荧光素-氨基己酸酯
生物素化反义：
Z-rrrrrrr-GTGTAGCGTT-COOH       (Z-SEQ ID NO：19)
其中Z＝生物素-氨基己酸酯
2.T-细胞摄入。
为了显示PNA-多精氨酸偶联物能有效地进入细胞，用氨基己酸空间臂将使荧光素异硫氰酸酯与SEQ ID NO：18的氨基末端偶联来合成上述的荧光反义偶联物(X-SEQ ID NO：19)。
这样测试细胞摄入：用0.5％叠氮钠或磷酸盐缓冲盐预处理30分钟，并用各种用量(100nM到50μM)荧光素标记的正义和反义PNA-r7偶联物，以及单用反义PNA(没有r7片段)培育Jurkat人T细胞系(5×105细胞/孔)。用共聚焦显微镜和FACS分析进入细胞的反义PNA的量。在两种情况下，荧光信号只存在于没有接触过叠氮化物的细胞里，荧光信号量取决于荧光偶联物的用量和培育的温度和时间。
3.γ-IFN试验。如下测量小鼠T细胞系(克隆11.3)分泌γ-干扰素的量：在96孔板上，用各种量的抗原(由精子鲸肌球蛋白的残基110-121构成的肽)和DBA/2小鼠(H-2d，5×105)组织相容的脾细胞(它作为抗原提呈细胞(APC))与105T细胞一起培育。37℃培养24小时后，将100微升上清液转移到用市售抗γ-IFN单克隆抗体(Mab)(Pharmingen，San Diego，美国加利福尼亚)包被的微滴定板上。室温培养1小时后，用含1％胎牛血清和0.1％Tween 20的PBS洗涤板，一秒后，加入生物素化的γ-IFN Mab。培养二小时后，如前洗涤板，加入铕(Eu)-链霉半和素(Delphia-Pharmacia)。再培养一小时后，加入酸性缓冲剂以释放Eu，通过Delphia板读数器上的时间分辨荧光计数测量。荧光量与已产生的γ-IFN量成正比，采用已知量的γ-IFN制作标准曲线对其作精确定量测定。
4.偶联物抑制γ-IFN的产生。如下分析PNA-多精氨酸偶联物抑制γ-IFN分泌的能力：将上述各种浓度的γ-IFN偶联物和亚适剂量的肽抗原(0.5μM)加到克隆11.3T细胞和组织相容脾细胞的混合物里。也对缺乏多精氨酸部分的PNA和非-偶联的D-精氨酸七聚体进行了试验。
24小时后，取出等分的培养的上清液，用上述第3节所述的荧光结合试验来测量γ-IFN量。用反义PNA-r7偶联物处理细胞导致IFN分泌减少70％，而等摩尔量的正义PNA-r7、缺乏r7的反义PNA或单独r7未显示出抑制作用(图7)。
实施例12
大蛋白抗原转运入APC
在硫代(sulfo)-MBS(杂双官能团交联剂)(Pierce Chemical CO.，Rockford，美国伊利诺斯)的存在下，使含半胱氨酸的多肽聚合物(Cys-Ala-Ala-Ala-Arg7，SEQID NO：21)与卵清蛋白(45kDa)反应，产生卵清蛋白与聚L精氨酸七聚体的偶联物。肽偶联于卵清蛋白的摩尔比通过氨基酸分析来定量。偶联产物命名为OV-R7。将该偶联物加入B-细胞(最终浓度＝10μM)中，(B细胞也称为抗原提呈细胞(APC)，用标准方法进行分离)。使APC与OV-R7一起培育，然后加到由标准方法分离得到的细胞毒T-淋巴细胞制剂里。使CTL接触已与OV-R7培育过细胞，产生了CD8+卵清蛋白特异性CTL。
在另一个实验中，使组织相容的树突细胞(一类特异性的APC)接触卵清蛋白-R7偶联物，然后注入小鼠。随后分析这些小鼠的血液显示有卵清蛋白-特异性CTL存在。对照小鼠给予已接触过未修饰卵清蛋白的树突细胞。对照小数没有出现卵清蛋白-特异性CTL反应。
实施例13
增加V7-衍生肽的摄入
按照标准方法，用肽合成仪(Applied Biosystems Model433)使7精氨酸残基连接到V7的C-末端上来合成由V7(白细胞表面蛋白)的C-末端胞质尾区域构成的偶联物，它具有序列KLSTLRSNT(SEQ ID NO：22；Ruegg等，1995)。将此偶联物加入用标准方法分离出来的T-细胞中(最终浓度＝10μM)，37℃培育数小时到过夜。用洗涤剂(1％Triton X-100)溶解细胞。除去DNA，用抗-V7鼠单克隆抗体结合山羊抗鼠IgG对溶解组分(含蛋白质)进行免疫沉淀。RAF-1是与V7有关，并且因与V7结合而失活的一种激酶。
不用肽处理时，RAF-1蛋白与V7共同沉淀。在肽处理的细胞中，RAF-1蛋白从V7免疫复合体里消失。同样的肽不能破坏RAF-1和p21 Ras组成的复合体，这排除了V7肽对RAF-1的非特异性修饰。
在第二个研究里，V7-聚精氨酸偶联物的V7肽部分体外用蛋白激酶C膦酰化。已接触过膦酰化V7尾肽，但没有接触过非膦酰化V7尾肽的T细胞的抗-RAF-1沉淀，证明RAF-激酶活性受到强烈抑制。
虽然本发明已参照特定的方法和技术方案作了阐述，但应当明白，可能作出的各种修饰和改变没有背离本发明的精神。

Claims (31)

1.一种增强所选定化合物跨越生物膜转运的方法，它包括，
使生物膜与含有共价连接于转运聚合物的生物活性剂的偶联物接触，
其中所述聚合物由6-25个亚单位构成，它们的至少50％含胍基或脒基侧链部分，该聚合物含至少6个毗连的胍基和/或脒基侧链部分，
从而所述接触能有效地促进所述偶联物以大于非偶联形式的生物活性剂的跨膜转运速率通过所述生物膜。
2.根据权利要求1所述的方法，其中聚合物里的至少70％亚单位含胍基侧链部分。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中没有一个胍基或脒基侧链部位与另一部分被一个以上的非胍基或非脒基亚单位所分开。
4.根据前述任一权利要求所述的方法，其中所述的聚合物由7-20个亚单位构成。
5.根据前述任一权利要求所述的方法，其中各亚单位含胍基。
6.根据前述任一权利要求所述的方法，其中所述聚合物包括含至少6个毗连精氨酸残基的肽。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述聚合物由7-20个肽亚单位构成。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述亚单位都是精氨酸残基。
9.根据权利要求6-8任一所述的方法，其中至少一个所述精氨酸残基是D-构型。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述精氨酸残基都是D-构型。
11.根据前述任一权利要求所述的方法，其中所述偶联物含至少两个这样的转运聚合物。
12.根据前述任一权利要求所述的方法，其中所述的生物膜是真核细胞膜。
13.根据权利要求1-11任一所述的方法，其中所述的生物膜是原核细胞膜。
14.根据前述任一权利要求所述的方法，其中所述活性剂是核酸或核酸类似物。
15.根据权利要求1-13任一所述的方法，其中所述活性剂是肽核酸。
16.根据权利要求1-13任一所述的方法，其中所述活性剂是多肽。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述多肽是蛋白质抗原，所述的生物膜是抗原提呈细胞的细胞膜。
18.根据权利要求1-13任一所述的方法，其中所述的活性剂是肿瘤抗原。
19.根据权利要求1-13任一所述的方法，其中所述的活性剂是紫杉烷化合物。
20.根据权利要求1-13任一所述的方法，其中所述的活性剂是金属离子。
21.根据权利要求1-13任一所述的方法，其中所述的活性剂是抗微生物化合物。
22.根据前述任一权利要求所述的方法，其中所述聚合物与所述活性剂通过可裂解接头偶联。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述可裂解接头含酯基团。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述的可裂解接头含二硫基团。
25.根据权利要求22所述的方法，其中所述的可裂解接头含远离活性剂的第一可裂解基团和紧靠活性剂的第二可裂解基团，因此第一可裂解基团断裂产生含亲核部分的接头一活性剂偶联物，它能进行分子内反应以断裂第二可断裂基团，从所述的接头和聚合物中释放出活性剂。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述第一基团是酰氨基，所述的第二基团是酯基团，酰胺基团的断裂产生游离氨基，它进行分子内反应以断裂酯基团。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述第一基团是磷酸酯基团，所述第二基团是羧酸酯基团，因此磷酸酯基团断裂产生游离的羟基，它进行分子内反应以断裂羧酸酯基团。
28.根据前述任一权利要求所述的方法，用于筛选具有选定生物活性的多个偶联物，其中所述偶联物由多个候选活性剂形成，所述的接触包括使各个偶联物与偶联物摄入细胞时能显示可检测信号的细胞接触，因而信号的数量是偶联物转运选定生物活性的效果的指针。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述的候选活性剂选自组合文库。
30.一种输送生物活性剂跨越生物膜的药物组合物，它包括：
如前述任一权利要求所述的偶联物，和
药学上可接收的赋形剂。
31.一种如权利要求29所述的偶联物的组合文库。
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