CN1642568A - 治疗细胞消融治疗引起的胃肠毒性的方法和组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及缓解和减少由细胞消融治疗引起的胃肠毒性和功能不良的药物制剂和方法,其中免疫调节肽可单独使用或与其它治疗剂联合使用。本发明还提供对细胞消融癌症治疗的改进,其中施用本发明肽协同细胞消融治疗使增加了最大耐受剂量的细胞消融剂用于改善功效和肿瘤反应。
Description
相关申请的相互参照
本申请要求于2002年2月26日提交的美国临时专利申请NO.60/360,211的权益,该申请的全部内容纳入本文中作参考。
发明技术领域
本发明涉及对罹患化疗和放射治疗的胃肠并发症,包括腹泻、粘膜炎、口炎和直肠炎的个体的新治疗。
发明背景
在过去几十年间,已开发了有潜在疗效的化疗和放射治疗技术用于几乎所有的人类肿瘤的治疗。虽然它们适当改善了生存时间和降低了肿瘤死亡率,但由这些治疗引起的主要毒性反应仍是获得治愈上的限速步骤。Wilmore,Cancer 79:1794-1803(1997)。
化疗法和放射通过几种不同的机制对快速增殖的细胞施加它们的细胞消融效应,最终导致细胞周期停滞和细胞凋亡。但是,这些治疗的细胞毒性作用不是肿瘤特异性的,通常显示快速细胞周转的正常组织对化疗的毒性效应最敏感。特别是,骨髓和胃肠粘膜中正常细胞的损伤经常使患者的治疗变复杂化。虽然在医治骨髓毒性反应带来的骨髓抑制和中性白细胞减少上已经取得明显的进展,例如,通过使用重组集落刺激因子如Neupogen和Epogen,但是目前没有可以选择性预防细胞消融胃肠损伤的制剂。Boushey等,Cancer Res.61:687-93(2001)。结果,特征为严重粘膜炎和腹泻的胃肠毒性常常限制细胞消融治疗的剂量和持续时间,导致对易感患者的效果下降。(同上)因此胃肠道代表在许多癌症患者中防止进一步剂量提高的下一个限速器官。(同上)Wilmore,(上述)。
肠粘膜的上皮衬是通过腺管内细胞持续增殖来保持的,其最终依赖腺管干细胞。在增殖后细胞分化和在绒毛上迁移,在该处成熟肠细胞被替代并从端部脱落。化疗或放射治疗的细胞消融剂量通过杀死腺管干细胞损害了粘膜的吸收和屏障作用,从而损害了正常的再生。Farrell等,Cancer Res.58:933-39(1998)。当损伤细胞脱落的,粘膜变薄和裸露,伴有细胞更新延迟、粘膜萎缩、炎症和经常溃疡。Balsari等,Br.J.Cancer 85:1964-67(2001)。
因此,进行细胞消融治疗的患者常出现可致命的肠粘膜炎和腹泻。Cascinu,Curr.Opin.Oncol.7:325-29(1995)。而且,由于经常发生肠吸收缺少,这些细胞消融治疗的胃肠效应可加重和延长。厌食症、粘膜炎、腹痛性痉挛、食物摄入后爆发性腹泻和对静脉治疗的依赖(它会抑制食欲)都损害了肠对肠营养物的接触,从而限制了刺激正常肠上皮增殖的机体能力。Wilmore,(上述)。 而且,在严重粒细胞减少的患者中,由于粘膜炎引起的溃疡可导致广泛的血源性细菌播散,因为该损伤成为细菌进入血流的入口。Balsari等,(上述)。需要住院来维持机体水合作用、控制疼痛和预防或治疗感染。
特别是联合细胞消融治疗,胃肠症状会很严重使治疗必须调整或完全停止,从而损害对肿瘤疾病的疗效。在辅助治疗中,减少或削弱严重的胃肠症状的能力会大大影响治疗期间的生活质量和患者的整体生存。这尤其对用于胃肠癌症或与高剂量联合细胞消融治疗有关的进行骨髓移植的患者的剂量提高治疗是确实的。Wilmore,(上述)。
但是,不幸的是,还没有预防或治疗由化疗和/或放射治疗引起的胃肠毒性的公认的制剂。Boushey等,(上述)。通常用于一种胃肠并发症治疗的制剂,如用于腹泻的高剂量洛哌丁胺,通常对其他严重毒性有很少作用和没有作用,如粘膜炎。而且,已有的针对特定症状,如腹泻和粘膜炎的制剂获得的疗效是不足的。因此,需要能够缓解细胞消融治疗引起的胃肠毒性的制剂。
相关文献
Wilmore,(上述),综述了对胃肠道细胞毒性治疗的效果并描述了代谢支持方法。已尝试使用萨利多胺(thalidomide)(Govindarajan等,Lancet 356:566-7(2000),白细胞介素15(Cao等,Cancer Res.58;3270-74(1998);合成的细菌脂肽(Shinohara等,Clin.Cancer Res.,5:2148-56(1999)和胰高血糖素样肽(GLP)-2(Boushey等,(上述))防止由伊里诺坎(irinotecan)引起的胃肠毒性。Farrell等,(上述),描述了使用角质形成细胞生长因子防止由联合化疗和放射疗法引起的胃肠损伤,而Orazi等公开了白细胞介素11的使用。Lab.Invest.75:33-42(1996)。Kimura等,J.Pharm.Pharmacol.53:1373-78(2001)描述了用脱乙酰壳多糖(chitosan)防止阿霉素的胃肠道副作用,而Balsari等,Br.J.Cancer 85:1964-7(2001)公开了阿霉素特异性单克隆抗体的使用。Woo等,参见下文,描述了用克拉霉素减轻环磷酰胺在小鼠中引起的粘膜炎。
Buelow等,Transplantation 59:649-654(1995)和其中引用的参考文献。Manolios等,Nature Medicine 3:84-88(1997)描述了源自合理设计的调节T细胞活性的寡肽。Clayberger等在WO 95/13288中描述了能调节T细胞活性的肽。描述通过计算机使用结构活性关系设计化合物的方法的参考文献包括Grassy等,J ofMolecular Graphics 13:356-367(1995);Haiech等,J.of Morecular Graphics 13:46-48(1995);Yasri等,Protein Engineering 11:959-976(1996);Ashton等,DrugDiscovery Today 1:71-78(1996);和Iyer等,Curr.Pharm.Des.8:2217-2229(2002)。
发明概要
本发明涉及治疗和缓解由于增强的细胞消融治疗引起的胃肠毒性和功能不良的药物制剂和方法。特别是,本文公开的各种方法和组合物对化疗和放射治疗引起的胃肠并发症包括腹泻、粘膜炎(如口腔和食管)、口炎和直肠炎提供了有效的预防和治疗。本文提供的各种方法和组合物明显改善了进行癌症治疗期间的生活质量,使化学治疗剂和放射治疗暴露的剂量增加以最大地杀死转移细胞,改善长期存活。
在一个实施方案中,提供了一种减少细胞消融治疗引起的胃肠毒性和功能不良的方法,包括单独施用免疫调节肽或与另外的治疗剂联合施用,如消炎药、止泻药、镇痛药等。当与另外的治疗剂联合施用时,免疫调节肽和另外的制剂可同时施用或相继施用。在一特别优选实施方案中,免疫调节肽与止泻药如洛哌丁胺联合施用。
在进一步的实施方案中,提供了包含本文描述的免疫调节肽连同至少一种另外的治疗剂包括,如消炎药、止泻药、镇痛药等的新组合的药物制剂和试剂盒。
在另一个实施方案中,本发明提供了增加细胞消融治疗(如化疗和放射治疗)最大耐受剂量的方法,包括施用免疫调节肽以减少剂量限制性的胃肠毒性。优选免疫调节肽的剂量可有效增加细胞消融治疗的最大耐受剂量(MTD)至少1/4(1.25X)或1/3(1.33X),更优选增加1/2(1.5X),最优选增加1.5X到2X或更多。在进一步的实施方案中,提供了采用这些增加剂量的化疗和放射治疗,连同缓解相关毒性的新的联合疗法的改善癌症治疗的方法。
用于主题组合物和方法的合适的免疫调节肽可调节各种免疫系统细胞的活性,特别是T细胞,和/或抑制炎性细胞因子的产生。在一个优选实施方案中,主题肽包含一个或多个细胞调节肽,该肽在待定的美国专利申请U.S.S.N 09/028,083和U.S.S.N08/838,918和相应的国际出版物WO 98/46633中公开,本文纳入该公开文件作为参考。在一特别优选实施方案中,免疫调节肽包含序列Arg-nL-nL-nL-Arg-nL-nL-nL-Gly-Tyr,其中nL是正亮氨酸,所有的氨基酸是D-立体异构体(本文中也指bc 1nL和/或RDP58)。
在一方面,该肽在N-或C-末端有氨基酸延伸以提供另外的功能,如将肽定位到受损组织,增加半衰期,或结合各种化合物。在另一方面,该细胞调节肽是低聚体,特别是活性序列的二聚体,或是呈状肽的式。该肽可包含天然产生的氨基酸,或优选一个或多个D-立体异构体。
附图的简要描述
图1描述c 1nL肽的构象空间群集,在本文也称为RDP58。绘出的构象从bc 1nL轨迹的群分析得到。
图2描述了肽轨迹在D2肽参考轨迹的主平面中的投影。
图3是显示施用RDP58肽对使用CPT-11的鼠肿瘤模型的死亡率的剂量依赖效应的图。
图4是显示施用RDP58肽在减少使用5-FU的鼠肿瘤模型的死亡率中的效应的图。
图5是显示RDP58肽联合CPT-11施用于鼠肿瘤模型的保持抗肿瘤效果的图。
图6是显示施用RDP58肽减少使用CPT-11的鼠肿瘤模型的死亡率的图。
图7是显示RDP58肽施用于鼠肿瘤模型明显增加CPT-11的最大耐受剂量的图。
图8是显示联合RDP58肽和增大剂量的CPT-11改善携带肿瘤的小鼠的生存率。
图9是阐明联合施用RDP58肽治疗和提高CPT-11剂量所得改善肿瘤反应的柱形图。
发明的详细描述
提供了治疗化疗和/或放射治疗引起的主要胃肠并发症,包括腹泻、粘膜炎、口炎和直肠炎的方法和组合物。该方法涉及口服施用通过计算机辅助的合理设计从已知的来源于HLA分子开发的新类型合成肽的成员。见,例如,美国专利申请09/028,083和国际申请WO 98/46633,纳入本文作为参考。这些新肽已显示出特殊的免疫调节活性,包括如在翻译水平有效抑制TNF-α产生(Iyer等,J.Biol.Chem.275:17051-57(2000))和上调血红素氧合酶-1(HO-1)的细胞表达(Iyer等,1998;Cuturi等,Mol.Med.5:820-32(1999))。前导化合物,本文鉴定为RDP 58,是包含由下列序列的D-氨基酸组成的10个氨基酸肽:Arg-nL-nL-nL-Arg-nL-nL-nL-Gly-Tyr,其中nL是正亮氨酸。
如本文所示,口服施用这些新肽化合物可以有效的缓解由细胞消融治疗引起的许多胃肠毒性。这样,本发明肽可以用于预防和治疗由细胞消融治疗引起的胃肠并发症如腹泻和粘膜炎,及通常伴随原发性并发症的绞痛、不适、脱水、电解质失衡和继发性感染。在进一步的实施方案中,本发明肽的使用有利地使细胞消融剂的剂量提高或联合细胞消融治疗以增加肿瘤细胞杀伤从而改善整体的患者生存。
本发明的方法使用与事实上任何细胞消融疗法引起的胃肠毒性,包括放射治疗和化疗。例如,头和颈部癌症放射治疗后常有急性粘膜炎,该粘膜毒性被认为是进一步加强治疗的主要限制因素。见,如,Bensadoun等,Eur.Arch.Otorhinolaryngol.258:481-7(2001)。本发明肽可用于缓解由头和颈部癌症放射疗法引起的粘膜炎,以及针对其他部位的放射治疗侵及的胃肠道,如前列腺癌症放射治疗可引起胃肠道的结直肠部分中的直肠炎,和用于骨髓移植的全身放射治疗方案。
本发明肽也可用于缓解单独使用或联合放射治疗的化疗剂引起的胃肠毒性。例如,与喜树碱类似物伊里诺坎(CPT-11)有关的主要剂量限制性毒性是延时性或迟发性腹泻,当伴随中性白细胞减少时会十分严重。Rougier等,J.Clin.Oncol.15:251-60(1997)。高达30%的腹泻患者对惯用的制剂如洛哌丁胺没有反应,需要住院、剂量调整和/或中断化疗。Cunningham等,Lancet 352:1413-18(1998)。如本文所示,口服本发明肽有效缓解此毒性。
本发明肽也可用于治疗其他常用化疗剂包括,如,甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、环磷酰胺和阿霉素,及紫杉烷和长春花生物碱引起的粘膜炎。由于粘膜炎本身和其产生的易感的继发性局部和系统性感染,进行细胞消融治疗的患者的严重胃肠粘膜炎导致明显的发病率和死亡率。Woo等,Pharm.Res.41:527-32(2000)。尽管研究多年,至今开发的粘膜炎治疗没有足够的有益效果。(同上)。结果,粘膜炎仍是与许多类型的化疗剂有关的主要剂量限制性毒性,包括广泛用于治疗各种类型的实体肿瘤的阿霉素。见Marina等,Clin.Cancer Res.8:413-8(2002)。使用本发明肽预防和/或治疗粘膜损伤可以增加这些制剂的剂量及由于胃肠毒性而禁忌的更有效的给药方案。
如本文所述,使用本发明肽缓解这些加强细胞消融治疗引起的胃肠毒性和功能不良。减少或缓解细胞消融治疗过程中的胃肠毒性和功能不良包括但不限于,临床征象如腹泻、粘膜炎、口炎、直肠炎、直肠出血、吸收不良、腹痛、体重减轻、发热、贫血、大便隐血、粪便白细胞和组织学指征如腺管脓肿、白细胞浸润、细胞凋亡、透壁性肉芽肿炎症、浅表性粘膜炎症和粘膜下炎症等的减少。而且,在本文使用的症状的定义内包括与细胞消融治疗引起的肠功能紊乱和炎症有关的生化和分子标记水平的变化,包括,但不限于趋炎细胞因子(如TNF-α、干扰素-γ、IL-1、IL-6、IL-12等)的增加,白细胞激活的酶标记(如髓过氧化物酶、COX-2表达、iNOS表达等)的变化,细胞凋亡(如DNA断裂,半胱天科酶活化等),及其他本领域内已知的变化。虽然一个指标可以用途胃肠功能不良减少的指征,但优选使用超过一个的指标,更优选使用指标的组合,包括临床征象、组织学指征和分子/生化标记。
对用于缓解和/或减少进行细胞消融治疗的患者的胃肠毒性和功能不良,该免疫调节肽可单独使用或联合其他治疗剂,如氧基团清除剂如超氧化物歧化酶或消炎药如皮质类固醇、氢化可的松、泼尼松等;止泻药如洛哌丁胺等,抗细菌剂如青霉素、头孢菌素、杆菌肽等;抗寄生虫剂如奎纳克林、氯喹等;抗真菌剂如制霉菌素、庆大霉素等;抗病毒剂如阿昔洛韦、更昔洛韦、病毒唑、干扰素等;镇痛药如水杨酸、对乙酰氨基酚、布洛芬、氟比洛芬、吗啡等;局部麻醉剂如利多卡因、布比卡因、苯佐卡因等;生长因子如集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子等;抗组胺药如苯海拉明、氯苯克那敏等;抗恶心药;营养添加剂如甲酰四氢叶酸,和其他物质。
因此,许多治疗剂可用于本发明。这些药物组合物包括,但不限于本发明肽与止泻药、消炎药和/或镇痛药的组合物。例如,一个实施方案可包括含有本文所述免疫调节肽的组合物,特别是序列Arg-nL-nL-nL-Arg-nL-nL-nL-Gly-Tyr的D-立体异构体、洛哌丁胺和镇痛药。本领域技术人员可制备其它组合物(如不同的消炎药和镇痛药组合物)。在本文中,使用的肽是单一肽序列,或本发明不同的肽序列的混合物,或包括本发明肽的天然类似物(如B 2705.75-84)。
本文描述的方法和组合物有利地用于减少或缓解任何形式的细胞消融治疗引起的胃肠毒性和/或功能不良,特别是针对快速分裂细胞包括肿瘤细胞和上皮细胞的治疗。受益于本发明的潜在抗肿瘤制剂的非限制性例子包括铂化合物(如螺铂、顺铂和卡铂)、喜树碱和相关类似物如伊里诺坎(CPT-11)、紫杉烷如紫杉醇、有丝分裂抑制剂如依托泊苷和长春花生物碱包括,如,长春新碱、长春碱和长春瑞宾,甲氨蝶呤、氟尿嘧啶(5-FU)、阿霉素、丝裂霉素、安丝菌素、博来霉素、阿糖胞苷、阿糖腺苷、巯基聚赖氨酸、二甲磺酸丁酯、苯丁酸氮芥、(左旋)苯丙氨酸氮芥(如PAM,L-PAM或苯丙氨酸芥)、巯基嘌呤、米托坦、盐酸丙卡巴肼、更生菌素(放线菌素D)、盐酸柔红霉素、盐酸多索鲁比辛、普卡霉素(光神霉素)、氨基苯乙哌啶酮、雌二醇氮芥磷酸钠、氟他胺、醋酸亮丙瑞林、醋酸甲地孕酮、柠檬酸他募昔芬、睾内酯、腈环氧雄烷、安丫啶(m-AMSA)、天冬酰胺酶(L-天冬酰胺酶)欧文菌属天冬酰胺酶、依托泊苷(VP-16)、干扰素α-2a、干扰素α-2b、替尼泊苷(VM-26)、硫酸长春碱(VLB)、硫酸长春新碱、硫酸博来霉素、阿拉伯糖、羟基脲、丙卡巴肼和达卡巴嗪;及放射性药物如放射性碘和磷产品等。
免疫调节肽
适用于本发明的组合物和方法的免疫调节肽能抑制细胞产生炎性细胞因子包括,如肿瘤坏死因子-α(TNF-α),干扰素(INF-α),白细胞介素(IL)-1,IL-8,IL-12及其他细胞因子、化学因子、造血生长因子等。优选的免疫调节肽包括或包含待定的美国专利申请U.S.S.N.08/838,916和U.S.S.N.09/028,083中描述的一个或多个细胞调节寡肽,本文纳入作为参考。特别优选用于直接的方法和组合物是包含序列Arg-nL-nL-nL-Arg-nL-nL-nL-Gly-Tyr,其中nL是正亮氨酸和所有的氨基酸是D-立体异构体。
另外,可用于本发明的以前已知的活性化合物包括HLA-Bα1结构域,特别是75到84的氨基酸和这个序列不超过2个氨基酸的变异被替代及其中氨基酸不包括R和Y(见,如,WO 95/13288和Buelow等,上述)。还知道有基于包括该序列的人类TCR-α跨膜区域的序列和来自该序列不超过2个突变的序列(见澳大利亚申请PN 0589和PN0590,于1995年1月16日提出)。这些序列包括2个碱性氨基酸,其中2个碱性氨基酸被4个脂族疏水氨基酸分隔,虽然该申请指明可存在3到5个疏水氨基酸。突变是指一个氨基酸被另一个取代或插入或缺失,每一个被计为一次突变。在某些实施方案中,用于本文的优选免疫调节肽可排除以前已知的活性化合物。
通常,用于本文的术语“免疫调节肽”指包含上述所有的肽化合物,及类似物、衍生物、融合蛋白等。在优选实施方案中,免疫调节肽的核心序列最好包含被三到四个疏水氨基酸分隔的两个碱性氨基酸,特别是三个疏水氨基酸,特别是其中N-末端是碱性氨基酸。更理想的是,C-末端氨基酸是芳族氨基酸,特别是酪氨酸。特别感兴趣的是至少一个寡肽核心末端氨基酸是寡肽末端氨基酸,可以是单体或寡聚形式的化合物。
更特别的是,用于本发明的组合物和方法的较佳的免疫调节肽包含具有序列B-X-X-X-B-X-X-X-J-Tyr的寡肽,其中B是碱性氨基酸,优选Lys或Arg,特别是Arg在至少一个位置,优选在两个位置;J是Gly,B或一个从5到6个碳原子的脂族疏水氨基酸,特别是Gly或B;X是一个脂族或芳族氨基酸。在一个实施方案中,至少三个X氨基酸残基是相同的非极性脂族氨基酸,优选至少四个是相同的非极性脂族氨基酸,更优选至少五个是相同的非极性脂族氨基酸,最优选全部是相同的非极性脂族氨基酸。在一个优选实施方案中,非极性脂族氨基酸是从5到6个碳原子,特别是6个碳原子,特别是非极性脂族氨基酸Val,IIe,Leu,和nL。因此,在某些实施方案中,X是除了带电荷的脂族氨基酸以外的任何氨基酸,优选除了极性脂族氨基酸以外的任何氨基酸。
由B-X-X-X-B-X-X-X-J-Tyr肽序列中的X显示的六个氨基酸中,优选至少3个是5到6个碳原子的脂族氨基酸,更优选至少4个是有5到6个碳原子的脂族氨基酸,最优选至少5个是5到6个碳原子更特别是6个碳原子的脂族氨基酸。在一个较佳实施方案中,脂族氨基酸是5到6个碳原子的非极性脂族氨基酸,特别是Val,IIe,Leu,和nL。其他氨基酸可以是无电荷的脂族氨基酸,特别是非极性脂族氨基酸或芳族氨基酸。
特别感兴趣的组合物有下列公式:
Arg-U-X-X-Arg-X-X-X-J-Tyr
其中所有的符号已在上文中定义,除了U,它包含无电荷的脂族氨基酸或芳族氨基酸,特别是非极性的脂族氨基酸或芳族氨基酸。
氨基酸可以是天然产生的氨基酸或它的D-异构体。这些肽可有一个或多个D-立体异构体氨基酸,直至所有的氨基酸。另外,免疫调节肽可包含本发明肽的低聚体,特别是它的二聚体,或包含环状肽,即环形结构,如下文进一步描述。
为了本发明的目的,氨基酸(大部分天然氨基酸或它们的D-立体异构体)将按照以下种类分解:
1.脂族
(a)非极性脂族:
Gly,Ala,Val,nL,Ile,Leu
(b)极性脂族:
(1)无电荷:
Cys,Met,Ser,Thr,Asn,Gln
(2)有电荷
Asp,Glu,Lys,Arg
2.芳香族
Phe,His,Trp,Tyr
其中,Pro可以包括在非极性脂族氨基酸,但通常不包括。“nL”代表正亮氨酸,其中非极性脂族氨基酸可被其他异构体取代。
肽的N-和C-末端的一个或两个可被总共不超过约100个氨基酸延伸,通常总共不超过约30个氨基酸,更通常不超过约20个氨基酸,通常不超过约9个氨基酸,其中氨基酸有少于25%,通常少于20%极性氨基酸,更特别的是,少于20%是有电荷氨基酸。因此,上述序列在任何一个方向的延伸主要与亲脂性、无电荷氨基酸,特别是非极性的脂族氨基酸和芳族氨基酸有关。肽可包含L-氨基酸、D-氨基酸,或D和L-氨基酸的混合物。在寡肽被表达为融合或嵌合蛋白质时,要考虑氨基酸延伸数目的例外情况,如下文所述。
肽可以是低聚体形式,特别是肽的二聚体,可以是头对头、尾对尾,或头对尾,不超过肽的约6次重复。该低聚体可含有一个或多个的D-立体异构体氨基酸,直至所有的氨基酸。该低聚体可包含或不包含肽之间的连接序列。当使用连接序列时,合适的接头包括含有无电荷氨基酸和(Gly)n,其中n是1-7,Gly-Ser(如,(GS)n,(GSGGS)n和(GGGS)n,其中n至少是1),Gly-Ala,Ala-Ser或如本领域中已知的其他柔性接头。可使用Gly或Gly-Ser的接头,由于这些氨基酸相对未构筑,允许单个肽与细胞靶分子相互作用和在低聚体的肽之间限制结构扰动。
免疫调节肽可是一种结构限制形式如从约9-50个氨基酸的环状肽,通常12到36个氨基酸,其中特定氨基酸以外的氨基酸可表现为一个桥。因此,例如,末端加入半胱氨酸使二硫桥形成一种环形肽。在一些情况下,可以使用氨基酸以外的物质来环化肽。双功能交联剂被用于连接该肽的两个或多个的氨基酸。环形成的其他方法描述于Chen等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5872-5876(1992);Wu等,ProteinEngineering 6:471-478(1993);Anwer等,Int.J.Pep.Protein res.36:392-399(1990);和Rivera-Baeza等,Neuropeptides 30:327-333(1996);所有纳入本文作为参考。另一方面,结构限制的肽可通过添加二聚化序列到肽的N-和C-末端制成,其中二聚化序列之间相互作用形成环状类型结构(见WO/0166565,纳入本文作为参考)。在其他情况下,本发明肽与其他蛋白质表达为融合体,为在表面暴露结构上限制显示提供了支架,如卷曲螺旋或β转角结构的环。
免疫调节肽的一个或两个,通常一个末端,可用亲脂基团取代,通常是脂族或芳烷基,脂族链中有8到36个碳原子,通常8到24个碳原子和少于两个杂环原子,该杂环原子通常是氧、氮和硫。如下文进一步描述,该链可以是饱和或不饱和的,最好有不超过3个脂族不饱和部位,通常不超过2个脂族不饱和部位。方便的是,可以使用商品化脂族脂肪酸、乙醇和胺,如辛酸、癸酸、十二烷酸、豆蔻酸和豆蔻基乙醇、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸和硬脂胺、油酸、亚油酸、二十二碳六烯酸等。(见美国专利6,225,444,纳入本文作为参考)。优选是长14-22个碳原子间的无分支天然产生的脂肪酸。其他亲脂分子包括甘油脂质和固醇,如胆固醇。该亲脂基团可按照常规的方法与寡肽上合适的功能基团反应,这常在载体上的合成期间,取决于寡肽附着于载体的部位。寡肽导入脂质体腔内与其他治疗制剂(如免疫抑制制剂)一起脂质附着用于将肽和制剂施用入宿主中。也知道增加亲脂性可增加化合物的运输穿过内皮细胞,因此可用于促进该化合物从肠或血流到周围组织的摄取。
免疫调节肽的末端氨基或羧基基团可通过烷化、胺化或酰化来修饰以提供酯、酰胺或取代的氨基基团,其中烷基或酰基基团可有约1到30个碳原子,通常1到24个碳原子,优选为1到3或8到24个碳原子,特别是12到18个碳原子。肽和它的衍生物也可以通过乙酰化或甲基化修饰来改变化学特性,例如亲脂性。其他修饰包括使谷氨酰和天冬酰胺酰残基分别脱氨基为相应的谷氨酰和天冬氨酰残基;脯氨酸和赖氨酸的羟基化;丝氨酸或苏氨酸的羟基基团的磷酸化;和赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的氨基基团的甲基化(见T.E.Creighton,《蛋白质结构和分子特性》(Proteins:Structure and Molecular properties),W.H.Freeman&Co.SanFranscisco,CA,1983)。
取决于它们的预期作用,特别是施用于哺乳动物宿主,本发明肽可被修饰或附着于其他化合物以掺入载体分子中,改变肽的生物利用率,延长或缩短半衰期,控制分布到各种组织或血流中,减少或增加与血液成分结合等。本发明肽可通过连接头结合于其他成分,这些接头在生理环境如血液、脑脊液、消化液等中是可切除割不可切割的。肽可与有功能基团的肽的任何部位连续,如羟基、硫醇、羧基、氨基等。理想地,在N-末端或C-末端进行修饰。为了这些目的,本发明肽可通过共价附着的聚合物进行修饰,如聚乙二醇、聚丙二醇、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚脯氨酸、聚(二乙烯-醚-共-顺丁烯二酸酐),聚(苯乙烯-共-顺丁烯二酸酐)等。水溶性聚合物,如已知聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮与未修饰的化合物相比,可减少附着化合物从血液中的清除。修饰也可以增加水性介质中的溶解度和减少肽的积聚。
在另一方面,优选的是肽与小分子结合用于检测和分离肽,和靶向或运输免疫调节肽到特定的细胞组织和器官中当它们本身导入动物时,不引发免疫反应的物质是小分子结合物,包括半抗原。通常,半抗原是分子量小于约2kD的小分子,更优选分子量小于约1kD。半抗原包括小的有机分子(如,p-硝基酚、地高辛、海洛因、可卡因、吗啡、仙人球毒碱、麦角酸、四氢大麻酚、大麻酚、类固醇、戊烷、生物素等)。例如为了检测或提纯的目的,与半抗原结合是用半抗原特异性抗体或特异性结合伙伴,如结合生物素的抗生物素蛋白完成的。
也可使用将结合物靶向特定细胞或组织的小分子。已知生物素-抗生物素蛋白复合物的存在增加这类修饰肽穿过内皮细胞的摄取。肽与碳水化合物部分的连接,例如连接β-糖苷到肽上的丝氨酸残基形成β-O连接的糖苷,增强糖苷衍生物通过葡萄糖转运体的转运(Polt,R.等.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:7144-7118(1994);Oh等,“药物输送和靶向”,刊载于《作为药物靶标的膜转运蛋白》(Membrane Transportersas Drug targets),Amidon,G.L.和Sadee,W.编,59-88页,Plenum Press,NewYork,1999)。这些类型的改进都包含在本发明的范围内。
免疫调节肽可附着于各种标记部分如放射性标记和荧光标记用于检测和追踪。荧光标记包括,但不限荧光素、曙红、Alexa氟、俄勒冈绿、罗丹明绿、四甲基罗丹明、罗丹明红、得克萨斯红、香豆素和NBD荧光团、QSY 7、dabcyl和dabsyl生色团、BIODIPY、Cy5等。
在一方面,为了各种目的肽可与各种其他肽或蛋白质连接。肽可连接于肽或蛋白质以提供便利的键合用的功能度,如用于酰胺或取代胺形成的氨基,如还原胺化;用于硫醚或二硫化物形成的硫醇基;用于酰胺形成的羧基等。特别感兴趣的是肽有至少2个,更通常3个,和不超过约60个赖氨酸基团,特别是约4到20个聚赖氨酰,通常6到18个赖氨酸单位,称为多抗原肽系统(MAPS),其中本发明肽是连接于赖氨酸氨基基团,通常至少约20%,更通常至少约50%的可用的氨基基团,以提供多肽产品(Butz,S.等,Pept.Res.7:20-23(1994))。这样可获得具有许多本发明肽的分子,其中本发明肽的方向是在同一方向;实际上有连接基团以提供尾对尾的二聚化或寡聚化。
在另一方面,其他天然产生的或合成的肽和蛋白质可用于提供载体免疫原产生本发明肽的抗体,其中抗体作为检测免疫调节肽的试剂或鉴定其他具有类似构象的肽的试剂。用于产生抗体的合适载体包括,其中,血蓝蛋白(如,匙孔血蓝蛋白-KLH);白蛋白(如,牛血清白蛋白,卵白蛋白,人血清白蛋白等);免疫球蛋白;甲状腺球蛋白(如,牛甲状腺球蛋白);毒素(如,白喉类毒素、破伤风类毒素);和多肽如聚赖氨酸,如上所述,或多聚丙胺酸-赖氨酸。虽然蛋白质是优选的载体,可使用其他载体,优选高分子量化合物,包括碳水化合物、多糖、脂多糖、核酸,和有足够大小和免疫原性的类似物。另外,产生的抗体可用于制备可与本发明肽竞争结合靶位置的抗独特型抗体。这些抗独特型抗体可用于鉴别本发明肽结合的蛋白质。
在另一方面,肽结合于其他肽或蛋白质是为了将免疫调节肽靶向细胞和组织,或给肽增加另外的功能度。对于靶向,用于结合的蛋白质或肽是基于为治疗而靶向的细胞或组织选择的。(Lee,R.等,Arthritis.Rheum.46:2109-2120(2002);Pasqualini,R.Q.J.Nucl.Med.43:159-62(1999);Pasqualini,R.Nature 380:364-366(1996);本文纳入作为参考)。蛋白质也可包含聚氨基酸,包括但不限于聚精氨酸;和聚赖氨酸、聚天冬氨酸等,它们可掺入其他聚合物中,如聚乙二醇,以制备含有结合的肽的小泡或颗粒。
在另一方面,本发明肽可联合其他肽或蛋白质一起表达,使得成为多肽链的一部分,或是在内部,或是在N-或C-末端形成嵌合蛋白或融合蛋白。本文中“融合多肽”或“融合蛋白”或“嵌合蛋白”指一种蛋白质由许多蛋白质成分组成,尽管这些成分常以原来状态结合,通过肽键在各个氨基和羧基末端连接以形成连续多肽。在本文上下文中大多数指至少2个,较佳实施方案通常使用3到12个成分,虽然可使用更多。应理解的是,蛋白质成分可直接连接或通过一个如下文所述的肽接头/间隔连接。
融合多肽可用于许多肽或蛋白质以构象限制形式显示本发明肽,用于靶向细胞和组织,靶向胞内区室,在细胞或生物体内追踪融合蛋白,和筛选结合肽的其他分子。用于产生融合蛋白的蛋白质包括各种报告蛋白、结构蛋白、细胞表面受体、受体配体、毒素和酶。示范性的蛋白质包括荧光蛋白(如,维多利亚水母(AequoriaVictoria),GFP,肾形海鳃(Renilla reniformis),GFP,缪勒氏海鳃(Renillamuelleri),GFP,荧光素酶等,和它们的变体);β-半乳糖苷酶;碱性磷酸酶;大肠杆菌麦芽糖结合蛋白;丝状噬菌体的外被蛋白(如,次要外被蛋白,pIII,或主要外被蛋白,pVIII,用于噬菌体展示);T细胞受体;卡律蝎毒素等。
融合蛋白也包括或单独或作为大蛋白序列的一部分与蛋白质片段或其他肽融合。因此,融合多肽可包含融合伙伴。本文中“融合伙伴”指可给予该类型蛋白质所有成员以共同功能和能力的肽的相关序列。融合伙伴可以是异源的(即,非宿主细胞天生的)或合成的(即,非任何细胞天生的)。融合伙伴包括但不限于,a)展示结构,它提供构象限制或稳定形式的本发明肽;b)导向序列,它使该肽定位于亚细胞或胞外区室;c)稳定序列,它影响该肽或编码该肽的核酸的稳定性或保护其免于降解;d)连接序列,它在构象上断开寡肽与融合伙伴的联系;和e)上述的任何组合。
在一方面,融合伙伴是一种展示结构。本文使用的“展示结构”指融合到本发明肽以构象限制形式展示肽的序列。较佳的展示结构通过在溶剂暴露外表面,如环状结构,展示肽来增强与其他结合伙伴的结合相互作用。通常,该展示结构包括连接到免疫调节肽的N-末端的第一部分和连接到本发明肽的C-末端的第二部分。即,本发明肽是插入到展示结构中的。优选地,挑在靶细胞中表达时选或设计具有最小生物活性的结构。
优选地,展示结构通过显示或展示肽或外部环使肽的可达性最大化。合适的展示结构包括,但不限于卷红螺旋干结构、小体结构、β-转角上的环、二聚化序列、半胱氨酸连接的结构、转谷氨酰胺酶连接的结构、环肽、螺旋桶、亮氨酸拉链基序等。
在一个实施方案中,展示结构是一个卷曲螺旋结构,它使本发明肽展示在外部环上(见Myszka等,Biochemistry 33:2362-2373(1994)),如卷曲螺旋亮氨酸拉链结构域(见Martin等,EMBO J.13:5303-5309(1994))。展示结构也包含小体结构,它主要由最小抗体互补区组成。该小体结构一般提供沿着折叠蛋白质中三级结构的单面显示的两个肽区域(见Bianchi等,J.Mol.Biol.236:649-659(1994);Tramontano等,J.Mol.Recognit.7:9-24(1994))。
在另一方面,展示结构包括两个二聚化序列。该二聚化序列可为相同或不同的,在生理条件下以足够的亲和力非共价结合,在结构上限制该显示的肽;即,如果一个二聚化序列用于本发明寡肽的每个末端,产生的结构可显示结构限制形式的本发明肽。许多序列适合二聚化序列(见例如,WO 99/51625;本文纳入作为参考)。可使用本领域已知的任何数量的蛋白质-蛋白质相互作用序列。
在进一步方面,展示序列给予结合金属离子的能力以产生构象上限制的二级结构。因此,例如,使用C2H2锌指序列。C2H2序列有两个半胱氨酸和两个组氨酸使锌离子被螯合。已知锌指结构域在多锌指肽中独立地发生形成结构上独立、柔性连接的结构域(见Nakaseko Y.等.J.Mol.Biol.228:619-636(1992))。大体共有的序列是(5个氨基酸)-C-(2到3个氨基酸)-C-(4到12个氨基酸)-H-(3个氨基酸)-H-(5个氨基酸)。一个较佳实施例或许是3到20个氨基酸-HIRSHTG的-FQCEEC-随机肽。类似地,可使用有共有序列-C-(2个氨基酸)-C-(4到20个随机肽)-H-(4个氨基酸)-C-的CCHC盒(见Bavoso,A.等,Biochem.Biophys.Res.Commun.242:385-389(1998))。其他实施例包括(1)-VKCFNC-4到20个随机氨基酸-HTARNCR-,基于核壳蛋白P2;(2)从Lasp-1 LIM结构域的天然产生的锌结合肽修饰的序列(Hammarstrom,A.等,Biochemistry 35:12723-32(1996));(3)-MNPNCARCG-4到20个随机氨基酸-HKACF-,基于NMR结构的整体1 ZFP(Hammarstrom等,上述)。
又在另一方面,展示序列是一个包含两个或多个半胱氨酸残基的序列,使二硫键形成,产生构象上限制的结构。即,使用在本发明免疫调节肽的每个末端含有肽序列的半胱氨酸产生如上所述的环肽结构。环形结构减少展示的肽对蛋白水解的易感性和增加对其靶分子的可接近性。如本领域熟练技术人员所理解的,当分泌引导序列被用于引导该肽到胞外空间时,此特别实施方案是特别适合的。
在另一个实施方案中,融合伙伴是一个引导序列。引导序列包含能使表达的产物结合到预定的分子或分子类型上而保留表达产物的生物活性的结合序列;融合蛋白或融合伙伴的序列信号选择性降解;和能组成性地定位肽到预定的细胞部位的序列。典型的细胞部位包括亚细胞部位(如高尔基体、内质网、细胞核、核仁、核膜、线粒体、分泌小泡、溶酶体)和使用分泌信号的胞外定位。
本领域中已知各种引导序列。靶向到细胞核是通过使用核定位信号(NLS)来实现的。NLSs通常是短的,正电荷结构域引导蛋白质,其中NLSs出现在细胞核。典型的NLSs序列包括SV40大T抗原的单个基本NLSs(Kalderon等,Cell 39:499-509(1984));人类维甲酸受体-β核定位信号(NF-kB p50和p65(Ghosh等,Cell62:1019-1029(1990));Nolan等,Cell 64:961-999(1991));和以核浆素为例的双基本NLSs’(Dingwall等,J.Cell Biol.107:641-649(1988))。
在另一方面,该引导序列是膜锚定序列。肽通过信号序列被引导到膜并通过疏水跨膜结构域(称为TM)稳定地掺入在膜中。如本领域已知的,该TM片段的适当地定位在表达的融合蛋白上以在胞内或胞外展示本发明肽。膜锚定序列和信号序列包括,但不限于那些源自(a)I类整合膜蛋白如IL-2受体β链;Hatekeyama等Science244:551-556(1989))和胰岛素受体β链(Hatekeyama等(上述));(b)II类整合膜蛋白如中性肽链内切酶(Malfroy等,Biochem,Biophys.Res.Commun.144:59-66(1987));和(c)III类蛋白质如人细胞色素P450 NF25(Hatekeyama等,上述);和来自CD8、ICAM-2、IL-8R、和LFA-1的那些。
膜锚定序列还包括GPI锚,它导致在GPI锚序列和脂质双层之间通过糖基-磷脂酰肌醇形成共价键。在各种蛋白质中发现GPI锚序列,包括Thy-1和DAF(见Homans等,Nature 333:269-272(1988))。类似地,酰化序列使脂质部分附着,如异戊二烯化(即,法尼基和香叶基-香叶基;见Farnsworth等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:11963-11967(1994)和Aronheim等,Cell 78:949-61(1994)),豆蔻酰化(Stichney,J.T.Methods Enzymol.332:64-77(2001)),或棕榈酰化。在一方面,本发明肽与脂质基团在末端结合,以能够连接到脂质膜,如脂质体。
其他胞内引导序列是溶酶体引导序列(如,在LAMP-1和LAMP-2中的序列;Uthayakumar等,Cell Mol.Biol.Res.41:405-420(1995)和Konecki等,Biochem.Biophys.Res.Comm.205:1-5(1994));线粒体定位序列(如,线粒体基质序列、线粒体内膜序列、线粒体膜间序列、或线粒体外膜序列;见Shatz,G.Eur.J.Biochem.165:1-6(1987));内质网定位序列(如,钙网蛋白,Pelham,H.R.Royal Soc.London Transaction B:1-10(1992);腺病毒E3/19K蛋白质,Jackson等,EMBO J.9:3153-3162(1990));和过氧化物酶体定位序列(如,荧光素酶过氧化物酶体基质序列,Keller等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 4:3264-3268(1987))。
在另一方面,引导序列是影响肽分泌的分泌信号序列。已知大量的分泌序列与位于感兴趣的肽的氨基末端时引导肽分泌入胞外空间中,特别是由细胞分泌肽,包括移植细胞。合适的分泌信号包括在IL-2(Villinger等,J.Immuno.155:3946-3954(1995)),生长因子(Roskam等,Nucleic Acids Res.7:305-320(1979)),前胰岛素原,和流感HA蛋白中发现的信号。
融合伙伴还可包含稳定序列,它赋于融合蛋白或编码它的核酸的稳定性。因此,例如,在起始蛋氨酸(如,MG或MGG)后掺入苷氨酸可稳定或保护融合蛋白通过泛素化作为Varshavsky的每个N-末端规则降解,从而增加细胞中的半衰期。
可加入另外的氨基酸以标记肽来检测或纯化。这些序列可包含抗体识别的抗原表位(如,flag标志)或结合配体,如金属离子的序列。各种标记序列和配体结合序列是本领域熟知的。这些包括,但不限于聚组氨酸(如,被抗体识别且结合二价金属离子的6xHis标记);聚组氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)标记;流感HA标记多肽;c-myc标记;Flag肽(Hopp等,Biotechnology 6:1204-1210(1988));KT3抗原表位肽;微管蛋白抗原表位肽(Skinner等J.Biol.Chem.266:15163-12166(1991));和T7基因10蛋白肽标记(Lutz-Freyermuth等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6363-6397(1990))。
融合伙伴包括连接肽和以无阻碍结构显示的肽的接头或束缚序列。如上所述,有用的接头包括甘氨酸聚合物(G)n,其中n是1到约7,甘氨酸-丝氨酸聚合物(如,(GS)n,(GSGGS)n和(GGGS)n,其中n至少是1),甘氨酸-丙胺酸聚合物,丙胺酸-丝氨酸聚合物和其他本领域已知的其他柔性接头。接头优选是甘氨酸或甘氨酸一丝氨酸聚合物,因为这些氨基酸是相对无结构的、亲水的,且有效连接蛋白质和肽的片段。
在本发明中,可使用融合伙伴的组合物。可使用展示结构、引导序列、拯救序列、标记序列和稳定序列的任何数量的组合物,有或没有不联合连接序列。
用于本发明的方法和组合物的免疫调节肽可用许多方法制备。化学合成肽是本领域中熟知的。固相合成是常用的,可使用各种商品化合成设备,如Applied BiosystemsInc.,Foster City,CA;Beckman;等的自动合成仪。也可使用溶液相合成方法,虽然它不太方便。通过使用这些标准技术,天然产生的氨基酸可被非天然的氨基酸所取代,特别是D-立体异构体,和具有不同长度或功能度的侧链的氨基酸。用于连接到小分子、标记部分、肽或蛋白质,或用于形成环化肽的功能基团可在化学合成期间被导入到分子中。此外,小分子和标记部分可在合成过程中被附着。优选地,功能基团的导入和连接于其他分子最低限度地影响本发明肽的结构和功能。
可使用常规的化学合成方法使N-和C-末端衍生化。本发明的免疫调节肽可含有一个酰基,如一个乙酰基。酰化的方法,和特别对N-末端的游离氨基酸进行乙酰化的方法是本领域熟知的。对于C-末端,羧基可以用乙醇酯化或酰胺化形成-CONH2,CONHR,或CONR来修饰,其中每个R是羟二价碳基(1-6碳)。酯化或酰胺化的方法用熟知的技术进行。
本文使用的本发明免疫调节肽还可以盐的形式出现,通常是药学上可接受的盐形式。包括无机钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐等。各种肽的有机盐包括,但不限于乙酸、丙酸、丙酮酸、顺丁烯二酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、水杨酸等。
免疫调节肽及其衍生物的合成也可使用重组技术进行。对于重组生产,可与间插氨基酸或序列串联制备编码单寡肽的核酸序列或优选制备编码许多本发明肽的核酸序列,这可剪切单肽或头尾二聚体。当缺少蛋氨酸或色氨酸时,可掺入间插的蛋氨酸或色氨酸,这使单氨基酸可用CNBr或BNPS-Skatole(2-(2-硝基苯亚磺酸)-3-甲基-3-溴假吲哚)分别切割。另一个方法是,通过使用酶切割的特定蛋白酶识别的序列或起自我剪切位点作用的序列完成切割(如,口蹄疫病毒属和心病毒属;Donnelly,M.L.J.Gen.Virol.78:13-21(1997);Donnelly,M.L.J.Gen.Virol.82:1027-41(2001),本文纳入作为参考)。本发明肽也可作为较大的肽的一部分制成,该肽可被分离,寡肽通过蛋白酶剪切或化学剪切获得。特定的序列和制备发方式可按方便性、经济情况、纯度要求等条件确定。为了制备这些组合物,编码特定的肽、蛋白质、或融合蛋白的基因被连接到编码本发明的免疫调节肽的DNA序列以形成融合核酸,该核酸被导入表达载体中。融合核酸的表达在合适的启动子和其它控制序列的控制下,如以下定义的那样,用于在特定的宿子细胞或生物体中表达(见,Sambrook等,《分子生物学:实验室手册》MolecularBiology:A Laboratiry Manual),第3版,Cold Spring Harbor Laboratories.ColdSpring Harbor,NY,2001;Ausubel等>《最新分子生物学实验指南》(CurrentProtocols in Molecular Biology),Johm Wiley&Sons,New York,NY,1988,最新到2002年;本文纳入作为参考)。
当免疫调节肽的合成或是通过编码本发明肽的核酸时,核酸被克隆入表达载体并导入细胞或宿主中。传递表达载体或是自身复制的染色体外载体或是整合入宿主染色体中的载体,例如基于逆转录酶病毒的载体,具有位点特异性的重组序列的载体,或同源重组的载体。通常,这些载体包括可操作连接于编码肽的核酸的控制序列。“控制序列”指在特定宿主生物体中表达本发明肽需要的核酸序列。因此,控制序列包括核酸转录和翻译所需的序列,包括,但不限于启动子序列、增强子或转录激活子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列;多聚腺苷酸化信号等。
许多启动子被用于表达本发明的肽。启动子可为组成性的、诱导性的、和/或细胞特异性的且可包含天然启动子、和合成启动子(如tTA四环素诱导性启动子),或是各种启动子的杂交体。启动子的选择是基于,其中,在待表达蛋白质的细胞或生物体中,需要表达的水平和表达的调节。合适的启动子是细菌启动子(如pL I噬菌体启动子,tac启动子,lac lac启动子等);基于酵母的启动子(如GAL14启动子,乙醇脱氢酶启动子,色氨酸合酶启动子,铜诱导型CUPI启动子等),植物启动子(如CaMV S35,nopoline合酶启动子、烟草花叶病毒启动子等),昆虫启动子(如苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒,伊蚊DNV病毒p&和p61,hsp70等),和表达哺乳动物细胞的启动子(如泛素基因启动子、核糖体基因启动子、β-球蛋白启动子、胸苷激酶启动子、热激蛋白启动子,和核糖体基因启动子等),及特别的病毒启动子,如巨细胞病毒(CMV)启动子、猿病毒(SV40)启动子和逆转录病毒启动子。
本文中“可操作连接的”指核酸被置于与另一个核酸有功能关系中。在本文中,可操作连接指控制序列相对于编码本发明肽的核酸序列以编码的肽发生表达的形式定位。载体可包含质粒或包含病毒载体,例如如果细胞是分裂的细胞,逆转录病毒载体是有用的传递系统,如果细胞是非分裂的细胞,慢病素和腺病毒是有用的传递系统。特别优选的是自身灭活逆转录病毒载体(SIN载体),它在3’-LTR灭活病毒启动子,因此允许使用插入病毒载体的非病毒启动子控制异源基因的表达(见例如Hoffman等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:5185(1996)。如本领域技术人员所理解的是,对于所有的真核细胞,尤其是高等真核生物通过股型修饰系统允许使用逆转录病毒载体(Morgan,R.A.等,J.Virol.67:4712-21(1993);Yang等,Hum.GeneTher.6:1203-13(1995))。
另外,表达载体也含有可选择的标记基因允许选择转化的宿主细胞。通常,该选择赋予可检测的表型,富集含有表达载体的细胞和在表达与不表达选择基因的细胞间的进一步区别。选择基因是本领域熟知的,且随使用的宿主细胞而变化。合适的选择基因包括使细胞对药物抗性的基因,允许在营养缺乏的培养基中生长的基因,和报告基因(如β-半乳糖苷酶、荧光蛋白、葡糖醛酸糖苷酶等),上述都是本领域熟知的且熟练技术人员可获得的。
有许多技术可用于将核酸导入活细胞中。本文中“导入”指核酸以适合核酸后来表达的方式进入细胞。导入核酸的技术随核酸是否在体外转入培养细胞或在体内进入指定宿主生物体的细胞和宿主生物体的类型而变化。在体外导入核酸的例子包括使用脂质体、Lipofectin、电穿孔、微注射、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀和生物射弹粒子轰击。体内转移技术包括直接导入核酸、使用病毒载体、通常是逆转录病毒载体、和脂质体介导的转染,如病毒包被的脂质体介导的转染。表达本发明肽的核酸可短暂地或稳定地存在于细胞质中或稳定地整合入宿主的染色体中(即通过使用标准调节序列、选择标记等)。合适的选择基因和标记基因被用于本发明的表达载体。
在一些情况下,最好是包括靶向靶细胞或组织的制剂,如对细胞表面蛋白或靶细胞特异的抗体,靶细胞上受体的配体,细胞膜上的脂质成分,或细胞表面上的碳水化合物。如果使用脂质体,连接被内吞的细胞表面蛋白的蛋白质可被用于靶向和/或促进摄取。这些包括非限制性例子,如用于特定细胞类型的衣壳蛋白或其片段,进行内化的蛋白质的抗体(见Wu等J.Biol.Chem.262:4429-4432(1987);Wagner等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:3410-3414(1990)),和指导定位的蛋白质(如靶向大脑的转铁蛋白受体的抗体)或在体内增强半衰期。
表达可在横跨原核生物和真核生物的大范围的宿主细胞中进行,包括细菌、酵母、植物、昆虫和动物。本发明的免疫调节肽可在烟草、拟南芥植物、昆虫施奈德细胞和哺乳动物细胞大肠杆菌,酿酒酵母,粟酒酵母、如COS、CHO、HeLa等,或是胞内形式或以分泌形式融合肽到合适信号肽。从宿主细胞分泌可通过融合编码肽的DNA和编码信号肽的DNA来进行。分泌信号是本领域熟知的细菌、酵母、昆虫、植物、和哺乳动物系统。表达肽的核酸可插入细胞中,例如组织表达的干细胞或肠表达的细菌,及移植到宿主中以提供体内肽来源的细胞。
如果需要,各种基团在合成或表达期间可被导入肽中,使之连接于其他分子或连接于表面。因此,半胱氨酸可用于制成硫醚或环肽,组氨酸用于连接于金属离子复合物,羧基基团用于形成酰胺或酯,氨基基团用于形成酰胺等。当导入半胱氨酸残基用来环化肽时,在温和氧化剂的存在下进行二硫键的形成。可使用化学氧化剂,或具有肽的半胱氨酸被暴露于氧以形成连锁,通常在合适的溶液如含有DMSO的水性缓冲液中。如上所述,脂质可化学附着或使用表达肽中合适的脂质化序列附着。
为了连接各种分子到本发明的肽上,肽上的功能基团和其他分子在合适的连接(如交联)剂存在下反应。连接的类型或使用的交联剂取决于功能基团,如被使用的伯胺、巯基、羰基、碳水化合物和羧酸。试剂可以是固定剂和交联剂,可以是同双功能、异双功能、或三功能交联剂(Pierce Endogen,Chicago,IL)。常用的固定剂和交联剂包括甲醛、戊二醛、1,1-双(重氮乙酰)-2-苯乙烷、N-羟琥珀酰亚胺酯、双琥珀亚胺酰酯、顺丁烯二酰亚胺(如,双-N-顺丁烯二酰亚胺-1-8-辛烷),和碳二亚胺(如,N-乙基-N’-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺;二环己基碳二亚胺。包括烷基或长2-20个碳的取代烷基链的间隔分子可用于分隔连接。优选的是,未被选择进行修饰的肽上的反应功能基团在肽与其他反应分子偶联前被保护以限制不需要的副反应。本文使用的“保护基团”是连接于特定功能基团的分子,该分子选择性地可除去以再暴露功能基团(见Greene,T.W.和Wuts,P.G.M.《有机合成中的保护基团》(Protective Groups in Organic Synthesis)(第三版),John Wiley&Sons,Inc.,NewYork,1999)。肽可与保护的氨基酸前体合成或在合成后但在与交联剂反应前与保护基团反应。连接也可以是间接的,例如通过附着一个生物素部分,它可与化合物或偶联于链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白的分子接触。
对于以结合形式使活性降低的肽,选择肽和连接的化合物之间的连锁十分不稳定导致在需要条件下剪切,例如在转运到需要的细胞或组织后。生物不稳定共价键,如,亚氨基键和酯是本领域中熟知的(见美国专利5,108,921,本文纳入作为参考)。这些修饰使肽以可能较的低活的形式施用,然后通过切割不稳定的键活化。
在一个较佳实施方案中,本发明的免疫调节肽可在合成或表达后纯化或分离。“纯化”或“分离”是指没有肽被合成或表达的环境和以可以实际应用的形式存在。因此纯化或分离指肽或其衍生物是完全纯的,即纯度超过90%,优选超过95%纯,更优选超过99%纯。肽和其衍生物可以用本领域技术人员熟知的方法分离和纯化,取决于样品中存在的其他成分。标准纯化方法包括电泳、免疫、和层析技术,包括离子交换、疏水、亲和、大小排斥、反相HPLC和层析聚焦。蛋白质也可通过选择性溶解度来纯化,例如在盐或有机溶剂存在下。需要纯化的程度会随着本发明肽的使用而变化。因此,在一些情况下不需要纯化。
在大多数部分,使用的组合物会包含至少20%重量的所需产物,更通常至少约75%重量,优选至少约95%重量,和通常至少约99.5%重量,和有关涉及产品制备方法的污染物,纯化步骤,和它的预期用途,例如用于治疗目的的药物载体。通常,该百分比会基于总蛋白质。
本发明肽用于治疗进行细胞消融治疗(如化疗和放射治疗)患者中的胃肠毒性和功能不良。另外,这些肽使临床肿瘤学家可增加细胞消融剂的最大耐受剂量,从而在肿瘤反应和预期寿命方面提供明显改善。
另外的治疗剂
另外的治疗或药物活性剂也可与上述组合物有利地联合使用,包括皮质类固醇(如泼尼松,甲基泼尼松龙,地塞米松等);免疫调节剂(如干扰素,包括干扰素B1a,干扰素-B1b);免疫抑制剂(如硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、环孢菌素);消炎化合物,包括,但不限于非类固醇消炎化合物(如柳氮胺吡啶、氨基水杨酸盐、塞勒科西、脂毒素等);止泻药如洛哌丁胺、羟基脲;和已知增加IL-2和IL-12水平的萨利度胺。
如本领域熟练技术人员所理想的,在某些情况中由病原体感染进一步并发胃肠毒性和功能不良,本发明的肽可与消除或杀灭病原体的药物合用。这些药物包括如本领域熟知的抗生素、抗真菌制剂、抗原虫剂,和抗病毒剂。这些药物可与本文所述的肽治疗前、共同治疗、或治疗后使用。
本发明也可联合使用消炎细胞因子、生长因子,或白细胞迁移抑制化合物。有用的细胞因子包括,但不限于IL-4,IL-10,IL-11,和IL-13,特别是已知抑制炎性细胞因子产生和参与修复免疫系统的IL-4和IL-10。生长因子包括转化生长因子-β(TGF-β)和GM-CSF。这些细胞因子和生长因子可作为纯化蛋白施用—从天然或重组来源中获得—或以表达这些肽的核酸形式施用,特别是作为融合蛋白。白细胞迁移抑制化合物,包括,其中,针对粘附分子的抗体和参与细胞粘附的同源受体,特别是白细胞粘附于内皮细胞,如E-,L-,P-选择蛋白;血管细胞粘附分子-1(VCAM-1);粘膜地址素细胞粘附分子(MAdCAM-1);和细胞间粘附分子-1(ICAM-1);和它们的同源受体,如α4β1和α4β7。
在另一个实施方案中,免疫调节肽还结合其他促炎细胞因子活性的抑制剂或减少这些细胞因子合成的制剂。这些包括阻断细胞因子功能的制剂,如IL-5,IL-6,IL-8,IL-18,IL-23,TNF-α和IFN-γ的抗体,和对它们同源受体的抗体和细胞因子受体拮抗剂(见例如,美国专利6,436,927)。另外,阻断剂包括可溶性受体蛋白,例如融合IgC结构域的受体,结合细胞因子以减少CD4+T-细胞的激活,巨噬细胞,和参与炎性反应进程的粒细胞。
药物制剂
本发明组合物单独或联合,可用于体外、活体外,和体内,取决于特别的应用。一致的是,本发明提供施用包含药学上可接受的载体和药学上有效量的一种或多种本发明肽,及它们的合适的盐的药物组合物。该药物组合物可以制成粉剂、颗粒、溶液、悬液、气雾剂、固体、丸剂、片剂、胶囊、凝胶剂、局部乳膏、拴剂、透皮贴片等。
如上所述,本发明肽的药学上可接受的盐包括任何本领域认可的药学上可接受的盐包括有机和无机酸和/或碱。盐的例子包括钠、钾、铵、钙、和伯胺、仲胺、叔胺、低级烃的,如甲基、乙基和丙基。其他盐包括有机酸,如乙酸、丙酸、丙酮酸、顺丁烯二酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、安息香酸、肉桂酸、水杨酸等。
本文使用的“药学上可接受的载体”包括本领域熟练技术人员熟知的配制备药物组合物的任何标准的药学上可接受的载体。因此,本发明肽本身,如表现为药学上可接受的盐、或作为结合物、或编码这类肽的核酸载体,可被制备成药学上可接受的稀释液;例如,盐水、磷酸缓冲盐(PBS),水性乙醇、或葡萄糖溶液、甘露醇、葡聚糖、丙二醇、油(如,植物油、动物油、合成油等),微晶纤维素、羧甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、硬脂酸镁、磷酸钙、明胶、聚山梨醇酯80等,或在合适赋形剂中作为固体制剂。当这类制剂是组合物的一部分时,药物组合物还含有抗逆转录病毒制剂。而且,制剂可包括杀菌剂、稳定剂、缓冲剂、乳化剂、防腐剂、甜味剂、润滑剂等。如果是口服途径施用,可使用合适的肠包衣或其他合适的保护方法例如存在于聚合物基质如微粒或PH敏感性水凝胶中来保护寡肽免受降解。
其中,合适的制剂可见《雷明纯制药科学》(Remington’s PharmaceuticalSciences),第17版,Mack Publishing Co.,Philadelphia,PA,1985和《药物赋形剂手册》(Handbook of Pharmaceutical Excipients),第3版,Kibbe,A.H.编,Washington DC,American Pharmaceutical Association,2000;本文纳入作为参考。本文所述的药物组合物以本领域熟练技术人员熟知的方法制备(如,通过本领域常规的方法,包括混合、溶解、制粒、研磨、乳化、包囊、截留或冻干方法)。
另外,肽单独或与其他制剂包括化疗剂也可被导入或包囊入脂质体腔中用来传递和延长该肽制剂在活体外或在体内的使用寿命。如本领域已知的,脂质体可分成不同的类型:多层(MLV)、稳定多层(SPLV)、小单层(SUV)或大单层(LUV)小泡。脂质体可用各种脂质化合物制备,该脂质化合物可以是合成的或天然产生的,包括磷脂酰醚和酯,如磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱;类固醇如胆固醇;脑苷脂、鞘磷脂、甘油脂、和其他脂质(见例如美国专利5,833,948)。
阳离子脂质也适合形成脂质体。通常,阳离子脂质有净正电荷和亲脂部分,如固醇或酰基或二酰基侧链。优选头部基团是正电荷的。典型的阳离子脂质包括1,2-二油基氧-3-(三甲氨)丙烷;N-[1-(2,3-二四脱环氧)丙基]-N,N-二甲基-N-N-溴化羟乙铵;N-[1-(2,3-二油基氧)丙基]-N,N-二甲基-N-溴化羟乙铵;N-[1-(2,3-二油基氧)丙基]-N,N,N-三甲氯化铵;3-[N-(N’,N’-二甲氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇;和二甲基十八烷基铵。
特别感兴趣的是促融脂质体,其特征是在适合的生理条件变化或促融成分,特别是促融肽或蛋白质存在时,与细胞膜融合的能力。在一方面,促融脂质体在与温度和/或PH变化影响的细胞膜融合时是PH和温度敏感的(见例如,美国专利4,789,633和4,873,089)。通常,PH敏感的脂质体是酸敏感的。因此,在PH是弱酸性的生理环境中可增强融合,例如溶酶体、内体和炎性组织的环境。该特性使在脂质体的内吞作用后脂质体直接释放到胞内环境中(见Mizoue,T.Int.J.Pharm.237:129-137(2002))。
促融脂质体的另一种形式包含含有融合增强剂的脂质体。即,当被导入脂质体或附着于脂质时,该制剂增强脂质体与其他细胞膜的融合,从而导致脂质体成分释放到细胞中。制剂可以是融合增强肽或蛋白,包括流感病毒的血凝素HA2(Schoen,P.Gene Ther.6:823-832(1999));仙台病毒包膜糖蛋白(Mizuguchi,H.Biochem.Biophys.Res.Commun.218:402-407(1996));小泡口腔炎病毒包膜糖蛋白(VSV-G)(Abe,A.等,J Virol 72:6159-63(1998));肽片段或融合增强蛋白的模拟物;和合成的融合增强肽(Kono,K.等,Biochem.Biophys.Acta.1164:81-90(1993));Pecheur,E.I.Biochemistry37:2361-71(1998);美国专利6,372,720)。
脂质体还包括用亲水聚合物衍生物的小泡,如美国专利5,013,556和5,395,619,本文在纳入作为参考。(也见Kono,k等,J.Controlled Release 68:225-35(2000);Zlipsky,S.等,Bioconjug.Chem.6:705-708(1995))以延长在体内的循环寿命。包衣的亲水聚合物或脂质体的衍生包括聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯甲基醚、聚天冬酰胺,羟甲基纤维素、羟乙基纤维素等。另外,如上所述,附着蛋白与被内吞的细胞表面蛋白结合,如对特定细胞类型回性的衣壳蛋白或它们的片段,和经历内化的细胞表面蛋白的抗体(见Wu等,上述;Wagner等,上述),可用于靶向和或促进脂质体对特定细胞类型或组织的摄取。
脂质体可通过本领域熟知的方法制备(见例如,Szoka,F.等,Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467-508(1980))。一种典型的方法是脂质薄膜水合技术,该技术中脂质成分与有机溶剂混合接着蒸发溶剂产生脂质薄膜。薄膜在水性缓冲溶液中水合,优选含有本发明肽或核酸,产生乳剂,该乳剂被超声处理或挤出以减少大小和多分散性。其他方法包括反相蒸发(见Pidgeon,C.等,Biochemistry 26:17-29(1987);Duzgunes,N.等,Biochim.Biophys.Acta.732:289-99(1983));冷冻和融化磷脂混合物,和醚灌注。
在另一个较佳实施方案中,载体是微粒、微囊、微球体、和纳米颗粒形式,可以是生物可降解或非生物可降解(见例如,《微包囊:方法和工业应用,药物和制药科学》(Microencapsulates:Methods and Industrial Applications,Drugs andPhamaceutical Science),73卷,Benita,S.编,Marcel Dekker Inc.,New York,1996;纳入作为参考)。本文使用的微粒、微球体、微囊和纳米颗粒指颗粒,通常是固体,含有释放的物质。该物质在颗粒的核心内或附着于颗粒的聚合物网。通常,微粒(或微囊或微球体)和纳米颗粒之间的差异是大小之一。如本文使用的,微粒的粒度范围在约1到约>1000微米。纳米微粒的粒度范围在约10到约1000nm。
各种材料可用于制备微粒。非生物可降解微囊和微粒包括,但不限于由聚砜、聚(丙烯睛-共-乙烯氯化物),乙烯-乙烯基乙酸,羟乙基异丁烯酸酯-甲基-异丁烯酸酯共聚物制成的。这些可用于移植目的,其中包囊的肽从胶囊中扩散出来。在另一方面,微囊和微粒是基于生物可降解聚合物,优选显示低毒性和对免疫系统有良好耐受的。这些包括基于微囊和微粒由纤维蛋白、酪蛋白、血清白蛋白、胶原、明胶、卵磷脂、脱乙酰壳聚糖、藻酸盐、或聚氨基酸如聚赖氨酸制成的蛋白。用于包囊的生物可降解合成聚合物可包含聚合物如聚交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚(交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚(己内酯)、聚二噁酮三甲基碳酸盐、多羟基醇酸盐(如,聚(β-羟丁酸))、聚(γ-乙基谷氨酸盐)、聚(DTH亚氨基羰基(双酚A亚氨基碳酸盐)、聚(原酯)、和聚氰基丙烯酸盐。各种制备含有本发明组合物的微粒的方法是本领域熟知的包括溶剂除去方法(见例如,美国专利4,389,330);乳化和蒸发(Maysinger,D.等,Exp.Neuro.141:47-56(1996);Jeffrey,H.等,Pharm.Res.10:362-68(1993)),喷雾干燥和挤出方法。
另一类载体是纳米颗粒,通常适合静脉内施用。亚微米和纳米颗粒通常由本领域已知的两亲性双阻滞、三阻滞或多阻滞共聚物制成。用于形成纳米颗粒的聚合物包括,但不限于聚乳酸(PLA;见Zambaux等,J.Control Release 60:179-188(1999)),聚(交酯-共-乙交酯),聚(交酯-共-乙交酯)和聚己内酯的混合物,双阻滞聚合物聚(I-亮氨酸-阻滞-I-谷氨酸),双阻滞和三阻滞聚乳酸(PLA)和聚环氧乙烷(PEO)(见De Jaeghere,F.等,Pharm.Dev.Technol.;5:473-83(2000)),丙烯酸盐、芳基酰胺、聚苯乙烯等。如所述的微粒、纳米颗粒可以是非生物可降解或生物可降解。纳米颗粒也可由聚(烷氰基丙烯酸盐),例如聚(丁基氰基丙烯酸盐),其中肽被吸收在纳米颗粒上和包被表面活性剂(如聚山梨醇酯80)。制备纳米颗粒的方法与制备微粒的方法相似,包括,其中,在连续水相中乳剂聚合,乳化-蒸发,溶剂置换,乳化-扩散技术(见Kreuter,J.“纳米颗粒制备和应用”,刊载于《医学和药学中的徵胶囊和纳米颗粒》(Microcapsules and nanoparticles in medicine and pharmacy),(M.Donbrow(编),125-148页,CRC Press,Boca Rotan,FL,1991;在此纳入作为参考)。
水凝胶也用于释放本发明肽到宿主中。通常,水凝胶是交联的,可通透各种药物化合物包括肽的亲水聚合物网络。水凝胶有聚合物膨胀的可选择性触发的优点,导致截留药物化合物的控制释放。依赖聚合物网络的组合物,膨胀和随后的释放可以被各种刺激所触发,包括PH、离子强度、热量、电、超声波、和酶活性。用于水凝胶组合物的聚合物的非限制性例子包括,其中,由聚(交酯-共-乙交酯)、聚(异丙基丙烯酰胺);聚(甲基丙烯酸-g-聚乙二醇);聚丙烯酸和聚(氧丙烯-共-氧乙烯)乙二醇形成的聚合物,和天然化合物如硫酸软骨素、脱乙酰壳多糖、明胶、或合成及天然聚合物的混合物,例如壳多糖-多聚(环氧乙烷)。聚合物是可逆或不可逆地交联以形成用本发明的寡肽包埋的脱乙酰凝胶(见例如,美国专利6,451,346;6,410,645;6,432,440;6,395,299;6,361,797;6,333,194;6,297,337;Johnson,O.等,NatureMed.2:795(1996);在此全文纳入作为参考。
在一个较佳实施方案中,凝胶聚合物是丙烯酸聚合物,优选carbomer(如,羧基聚亚甲基),如Carbopol(如,Carbopol 420-430,,475,488,493,910,934P,974P等;Brock等,Pharmacotherapy 14:430-437(1994)),其为丙烯酸与聚链烯基多醚交联的非线性聚合物。其他类型的carbomer包括与多功能化合物交联的丙烯酸,如聚烯丙基蔗糖。除了水合的优点和膨胀成凝胶,该凝胶截留的本发明的化合物并限制它们的释放,carbomer凝胶是粘膜粘合的。聚合物粘附到肠粘膜,因此产生肽的局部释放(见Hutton等,Clin.Sci.78:265-271(1990);Pullan等,Gut 34:676-679(1993)。在此纳入作为参考)。另外,这些聚合物有限制肠蛋白酶活性的优点。
因此,肽或核酸编码及抗逆转录病毒剂的浓度可经验性地确定,与用于特定目的的常规过程相一致。通常,对于施用活体外或体内用于治疗的肽,本发明制剂按药理有效的剂量给予。“药理上有效量”或“药理上有效剂量”是足以产生所需生理效果的量或能获得所需结果的量,特别是治疗紊乱或疾病情况,包括减少或消除紊乱或疾病的一个或多个症状,这种情况在本文指胃肠毒性和功能不良。
施用到宿主的量随施用物质、施用目的,如预防或治疗,宿主状态、施用方式、施用的数量、施用之间的间隔等而变化。这些可以由本领域熟练技术人员凭经验决定和可以按照治疗反应的程度调整。确定合适剂量要考虑的因素包括,但不限于受治疗者的大小和重量、受治疗者的年龄和性别、症状的严重程度、疾病的期、传递制剂的方法、制剂的半衰期、和制剂的效力。要考虑的疾病的期包括疾病是否是急性或慢性、复发或缓解期、疾病的进程。确定治疗有效量的施用剂量和时间是本领域一般技术人员可以确定的。在本发明的内容中,与细胞消融治疗有关的胃肠毒性常在施用每轮细胞消融治疗后以规律和复发方式出现,这样本发明肽的预防性施用也可能考虑到相关毒性的可预测特性。
对于本发明中使用的任何化合物,治疗有效剂量和最大耐受剂量可由本领域熟知的方法确定。例如,起始有效剂量最初可由细胞培养测定估计确定。可使用炎性反应的指标,如促炎性细胞因子,或CTL活性抑制的表达水平。其中,LC50(即对细胞培养中约50%细胞致死的剂量)和IC50(即抑制剂量)可通过细胞培养测定来确定。可在动物模型中订出剂量从产生循环浓度或组织浓度,最大耐受剂量按在本文提供的实施例中举例确定。
如所注意到的,毒性和疗效通常由细胞培养测定和/或实验动物决定,一般是确定LD50(对50%试验群体的致死剂量)和ED50(50%试验群体中的疗效)。毒性和疗效的剂量比是治疗指数。以组合物单独或联合使用,显示高治疗指数较佳。有效量的确定是本领域熟练技术人员所熟知的,特别是本文提供的详细公开内容。本领域熟练技术人员知道如何基于其他动物模型中确定的计量来计算对受治疗者的剂量,特别是哺乳动物,更特别是人。从一种动物的剂量转换成另一种动物(如从鼠到人)的特定转换因子是本领域熟知且充分描述的,如,在食品与药品管理署的网站www.Fda.gov/cder/cancer/animalframe.htm(在肿瘤方法部分),本文纳入作为参考。
通常,在制剂直接施用到宿主的情况下,本发明提供组合物的推注或输注的施用范围约0.1到50,更通常约1-25mg/kg宿主体重。该量通常按照肽和抗逆转录病毒剂的半衰期调整,其中半衰期通常至少1分钟,更通常至少约10分钟,最好在约10分钟到12小时的范围中。短半衰期可以接受,只要用个体剂量、持续输注或重复剂量可获得效果。使用的制剂可以单位剂量形式出现,如安瓿、胶囊、丸剂、或以多剂量容器或可注射形式。
可使用剂量范围中的较低部分和更低的剂量,其中肽有增强的半衰期或被作为一个长效制剂提供,如包含颗粒的缓释组合物,在延长的时间段维持肽的聚合物基质(如胶原蛋白基质,carbomer等),使用泵在延长的时间段以完全持续的速度连续输注肽。宿主或受治疗者可以是任何哺乳动物包括家畜、宠物、实验室动物、灵长类动物、特别是人类。
除了将本发明的肽组合物直接施用到体外培养细胞,特别是活体外细胞,或体内哺乳动物宿主,也可施用编码本发明肽的核酸分子(DNA或RNA),从而提供了需要施用本发明肽的有效来源。如上所述,编码本发明肽的核酸分子可以克隆入许多熟知的表达质粒中的任何一种(见Sambrook等,上述)和/或病毒载体,优选是腺病毒或逆转录病毒载体(见例如,Jacobs等,J.Virol.66:2086-2095(1992),Lowenstein,Bio/Technology 12:1075-1079(1994)和berkner,Biotechniques 6:616-624(1988)),在合适环境中,在控制序列的转录调节下,起促进核酸表达的作用。基于核酸的载体可直接施用到活体外细胞或组织(如,活体外细胞的病毒感染以移植肽产生细胞)或到体内所需的部位,如通过注射、导管、口服(如水凝胶)等,或,在基于病毒载体的情况下通过全身性施用。组织特异性启动子可任选地使用,保证感兴趣的肽只在特定的组织或选定的细胞类型中表达。重组制备该基于核酸的载体的各种方法是本领域熟知的,施用基于核酸的载体用于肽生产的技术是本领域熟知的。
为本发明的目的,施用方法的选择取决于治疗的病情,本发明组合物的形式,和药物组合物。本发明肽的施用可有各种途径,包括,但不限于皮肤、皮下、静脉内、口、局部、透皮、腹膜内、肌肉内、鼻内、和直肠(如结肠施用)。例如,微粒、微球体、和微胶囊制剂可用于口服、肌肉内、或皮下施用。另外,脂质体和纳米颗粒是适合静脉内施用的。药物组合物的施用可以通过单一途径或与几个途径同时进行。例如,口服施用可与直肠或局部一起施用到受损区域。另一方面是,口服施用可联合静脉内或胃肠外注射使用。
在一个较佳实施方案中,施用的方法是通过口服给药,以粉剂、片剂、丸剂、胶囊的形式。口服施用的药物制剂可通过联合一个或多个肽和抗逆转录病毒剂与合适的赋形剂,如糖(如乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇),纤维素(如淀粉、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羧甲基纤维素等),明胶、甘氨酸、糖精、碳酸镁、碳酸钙、聚合物如聚乙二醇、或聚乙烯吡咯烷酮等。丸剂、片剂、或胶囊可有肠溶衣,在胃中保持完整但在肠中溶解。各种肠溶衣是本领域熟知的,许多是市场上买得到的,包括,但不限于甲基丙烯酸-甲基丙烯酸酯共聚物、聚合物纤维素醚、邻苯二甲酸醋酸纤维素、邻苯二甲酸聚乙酸乙烯酯、邻苯二甲酸羟丙甲基纤维素等。可选择的是,该肽的口服制剂是在合适的稀释液中制备的。合适的稀释液包括各种液体形式(如糖浆、浆、悬液等)水性稀释液如水、盐水、磷酸缓冲盐、水性乙醇、糖溶液(如蔗糖、甘露醇、或山梨醇)、甘油,明胶的水性悬液、甲基纤维素、羟甲基纤维素、环糊精等。如本文使用的,稀释液或水性溶液也包括婴儿配方,假定细胞消融治疗对婴儿和儿童也是必要的。在某些实施方案中,使用亲脂溶剂,包括油、例如植物油、花生油、芝麻油、橄榄油、玉米油、红化油、大豆油等。);脂肪酸酯、如油酸、甘油三酯等;胆固醇衍生物,包括胆固醇油酸、胆固醇亚油酸、胆固醇豆蔻酸等;脂质体等。
在另一个较佳实施方案,施用是由直肠进行的。这可使用适合局部应用的制剂,其形式为软膏、酊剂、乳剂或通过使用拴剂、灌肠剂、泡沫等形式的组合物应用到肠腔中。栓剂可含有常规栓剂基质如在室温下是固体或半固体但在体温下是液体的可可奶油、聚乙二醇、聚乙二醇、或甘油酯。
在另一个较佳实施方案中,施用是在皮肤、皮下、腹膜内、肌肉中、静脉内进行的。如上所述,这些是以肽形式溶解或悬浮在合适的水性介质中。另外,注射的药物组合物在亲脂性溶剂中制备,亲脂性溶剂包括,但不限于油如植物油、橄榄油、花生油、棕榈油、大豆油、红花油等;合成脂肪酸酯,如油酸乙酯或甘油三酯;胆固醇衍生物,包括胆固醇油酸、胆固醇亚油酸、胆固醇豆蔻酸等;或脂质体等。该组合物可在亲脂性溶剂中或任选以油/水乳剂直接制备(见例如,Liu.F.等,Pharm.Res.12:1060-1064(1995);Prankerd,R.J.J.Parent.Sci.Tech.44:139-49(1990);美国专利5,651,991)。
释放系统也包括持续释放或长期释放方法,为本领域熟练技术人员熟知的。本文使用的“持续释放”或“长期释放”指释放系统给予药学上有效量的本发明化合物超过一天,优选超过一周,更优选至少约30天到60天或更长。长期释放系统可包含可植入的含有本发明肽的固体或凝胶,如以上所述的生物可降解聚合物;泵,包括蠕动泵和碳氟化合物推进泵;渗透泵和微型渗透泵等。蠕动泵在泵每次启动时传递固定量的药物,储器被再次充满,经皮地通过一个口较佳。控制器调整剂量,也可提供释放剂量、残余剂量和释放频率的读出显示。碳氟化合物推进泵使用碳氟化合物液体来运行泵。碳氟化合物液体施加超过大气压的蒸汽压力并压缩含有药物的室释放药物。渗透泵(和微型渗透泵)使用渗透压以恒定的速度释放药物。药物包含在不渗透的隔膜中,该隔膜被渗透剂所包围。半渗透膜含有渗透剂,整个泵被置于箱中。水通过半渗透膜的扩散挤压容纳药物的隔膜,迫使药物进入血流、组织、或器官中。这些和其他这类植入物治疗炎性疾病特别有用,尤其是那些出现复发或性质是进行性的,通过以持续、长期方式全身性(如静脉内或皮下)或局限的剂量释放本发明的寡肽。
本发明也包含以试剂盒或包装制剂形式中的本文公开的治疗组合物。本文使用的试剂盒或包装制剂包括免疫调节肽及其盐的一种或多种剂量,和任选的至少一种另外的用于联合治疗的治疗剂如抗炎或抗腹泻剂,在容纳剂量的容器中,附有同时或连续使用到患者的说明书。例如,包装可包含以粉剂混合于水性溶液中的形式连同药物载体的肽,其可被患者摄取。另一个包装药物的例子是预加压力的注射器,使组合物可在结肠内释放。包装或试剂盒包括合适的说明书,其包含图表、记录(如音频、视频、光盘),和提供使用联合治疗指导的计算机程序。
上述本发明的特定实施方案是用于阐明和描述的目的。它们并非是详尽的或限制本发明于公开的严谨形式,并且明显地可根据上述内容进行许多修改和变化。
本文中提到的所有文献和专利申请被纳入作为参考,其程度与每篇单个出版物或专利申请被具体和单独地指明纳入作为参考是相同的。
实施例
如美国专利申请U.S.S.N.08/838,916和U.S.S.N.09/028,083和相关文献中所公开的内容,包括Grassy等,参数是基于过去发现有抑制T细胞活性的特性的寡肽确定的(见如Buelow等,上述)。免疫抑制活性必需的构象空间是按照Yasri等,上述。描述的步骤计算的。使用这些参数(见表1),确定了具有已知T细胞抑制活性的化合物,设计和测试新的细胞调节肽,并发现有相等或超过已知活性化合物的活性。用于预测和设计肽和假肽的免疫抑制活性的计算机程序按以下内容进行:
1.方法
在显示或不显示免疫抑制活性的肽的起始实验数据组的基础上,推论出:
i.共有序列包含活性所需的氨基酸,且允许新肽或假肽文库的开发;
ii.一系列理化和拓扑特性涉及活性和通过变量制图技术转化成一系列约束(Grassy等,J.of Molecular Graphics 13:356-367(1995))。
2.变量制图(Variable Mapping)
该方法是基于理化和构象约束,如从训练组数据的结果推论出的。
理化约束
该方法需要确定定义为所述生物活性的特性范围的理化约束。用于确定约束组置的计算方法被命名为变量制图(Variable Mapping)并在下文中描述。
变量制图方法
该定性技术由活性和非活性分子的分布(球形或百分比方式)的评价为特定参数值的函数组成。所有图(活性-特性)的重叠显示,对于某些参数,需要产生活性化合物的极限值(低和/或较高)。该图解方法在活性和分子特性之间给出了定性非线性从属的诊断。关于涉及受体配体互相作用的特性,已明确建立了确定受体适应性的严格偶然性的存在,意味着包含某些结构和理化特性。该方法产生简单的规则可用于预测未知产物的活性。图示显示相对于违反规则的数目的成功数目使人们比较研究中的整组分子的活性分布。
3.用于定义参与肽和假肽的免疫抑制活性的约束的理化和拓扑参数
亲脂性
肽的亲脂性以logP表示(其中logP是指定的肽在水和n-辛醇之间的分配系数)。分子logP值可使用Ghose等,J.Chem.Inf.Comput.29:163(1989)确定的原子增加logP值来计算。如起始数据设定分析所示,免疫抑制肽的亲脂性必须≥-6.85。
拓扑指数
Balaban指数(Balaban,Chem.Phys.89:399(1982)):
用于连接的分子图(H抑制的)的Balaban指数按下式计算:
其中M是图中边缘的数量,μ是图的网络秩,即在G成为非循环前必须除去边缘的最小数量,Di=∑Dij(j=1)是在两个顶点间最短路径的距离矩阵。
分子体积
分子体积是假设每个元素的标准范德华半径来计算的。该计算是在肽的延伸构彖上进行的。
椭圆体积
该体积是确定分子惯性动量的三个成分后计算的,假定组成原子的平均原子质量。该计算是在肽的延伸构彖上进行的。
摩尔折射率
摩尔折射率是使用Ghose等,上述确定的原子摩尔折射率值计算的。
偶极矩:
该参数是在肽的延伸构彖上计算的。一个分子的总偶极矩以Debye单位表示:
μ=e∑riqi
其中ri是原子i到原点的距离,qi是原子i的电荷。原子上的电荷使用Charge-2方法计算(Abraham and Smith.,J.Comput.Aided Mol.Design 3:175-187(1989))。
Kier Chir V4:
该指数是L.B.Kier开发的连通性指数之一。Kier Chir V4按许多步骤计算(包括H)。
a.确定和计算肽的分子图上长度4的所有路径。
b.计算下列数量的长度4的每条路径:
Cs v=П[(v j)]-0.5
其中j=1,4,其中δ=Zi-hj是以价电子Zi的总数和结合于原子i的氢原子的hj数间的差异定义原子。
c.图上有关长度4的整组子图的所有这些值的求和法:
x=∑(Cv s)
Kier Chir Alpha:
Kier Chir alpha 1(Kα
1
)
如果A是分子的原子的总数(包括H,Kα1等于:
与:
ri是原子i的共价半径,rCsp3是碳sp3的共价半径,Pi是沿着研究中的肽的分子图的长度=1的路径的总数。
Kier Chir alpha 2(Kα
2
)
如果A是分子的原子的总数(包括H),Kα2等于:
与:
ri是原子i的共价半径,rCsp3是碳sp3的共价半径,P2是沿着研究中的肽的分子图的长度=2的路径的总数。
柔性Phi:
基于上述公式,分子的柔性可以定义为:
Phi=(Kα1)(Kα2)/A
其中A是原子的总数(包括H)。
原子和基团计数:
下列原子类型的数目也用作约束:
-肽的氧原子总数
-肽的氮原子总数
下列基团的数目也用作约束:
-乙基的总数
-羟基的总数
4.限制因素的评价
肽或假肽文库的产生
从上文所述的共有序列Arg-X-X-X-Arg-X-X-X-X-Tyr(其中X是氨基酸)开始,和在较早类似公式中计算前述的理化和拓扑参数和这些参数是否在起始训练组定义的约束内。例如,从X=Leu,nLeu,Trp,Tyr,Gly或Val开始,产生了279,936个分子的文库,其中只有26个满足所需的约束。
获得生物活性所需的特性范围总结于下表1。
表1
理化和结构参数的评价范围
特性 | 最小 | 最大 |
LogP | -6.849 | -0.004 |
椭圆体积(3) | 5785.5 | 29460.00 |
分子体积(3) | 660.9 | 1050.4 |
摩尔折射率 | 221.30 | 359.3 |
Kier Chir V4 | 3.325 | 5.342 |
Kappa α2 | 26.120 | 44.31 |
柔性 | 22.50 | 40.3 |
Balaban指数 | 2.846 | 6.701 |
总偶极 | 3.423 | 80.79 |
氧原子数 | 10 | 15 |
氮原子数 | 8 | 20 |
乙基数 | 0 | 1 |
羟基数 | 1 | 3 |
5.参与肽和假肽的免疫抑制活性的构象空间的鉴定
3D结构的空间自相关向矢量
分子结构的自相关描述的概念首先是Broto等,Eur.J.Med.Chem.19:66-70(1984)介绍的。该矢量基本代表了源自分子的原子间距离矩阵的离散距离分布。该矢量的第一成分(A0)是等于结构的原子数,其他成分A1...An通过原子对的数目定义,该原子对被较低限度(n-1)Di定义的范围内的距离所分隔,其中n是矢量的bin的顺序,Di是增加的距离。类似地,可计算原子特性P的分布。在此情况下,加重的自相关成分APn是通过原子i,j上特性值P产物的总和获得的,具有属于距离间隔[(n-1)Di,nDi]的相互距离。矢量的成分数是通过nmax=(Dmax/Di)+1定义的,其中Dmax是结构中最大原子间距离。
自相关矢量显示一些有用的特性:
●该矢量使构象数据明显减少。整个构象由有限组的n数值描述。
●该矢量在3D协调数据的基础上很容易计算。因此,可以在分子动力模拟期间计算和储存此矢量,存储大小的减少涉及该过程,与一套完整距离矩阵的典型存储相比,比平常的存储有更长的模拟。
●构象的自相关矢量是过渡地和轮流地恒定的,也是与分子的原子编号无关的。
●该矢量对构象中次要和主要变化都敏感:构象变化越大,矢量中修改的成分越多。敏感性取决于选择计算的距离增加,但增加从0.5或1(小分子)到5(大分子)是平常模拟的良好选择(Yasri等,Protein Engineering 11:959-976(1996))。
可能只能分析结构的一部分或本结构的一小套特定原子,如蛋白中Ca,N原子,重原子等。该矢量完全由结构的知识来定义,所以可使用该矢量无需任何参考进行不同结构的比较。
使用3D自相关矢
量进行分子动力学分析
使用AMBER 4.1进行分子动力学模拟,应用到HLA-B2702.75-84肽(氨基酸序列Arg-Glu-Asn-Leu-Arg-IIe-Ala-Leu-Arg-Tyr)和它们的各种活性和无活性的衍生肽。一纳秒的动力学模拟产生一组103构彖(每皮可秒一个构彖)。对于每个构彖使用TSAR与1的距离增加计算3D自相关矢量,整组构彖被存储为3D自相关矢量对时间矩阵(103xn)。
工作的目的是,通过使用相关参考文献中引用的方法比较活性和无活性肽的构彖空间,定义引起免疫抑制活性的构彖空间。
6.统计分析
簇分析
为了比较不同的构彖,确定了通过它们的未称量过的3D自相关矢量成分定义的多维空间中所有这些构彖之间的距离矩阵。两个化合物的结构越相似,它们的距离越短。该方法提供了严格分子适合的量化。使用起始构彖作为参考,该距离的数值类似于均方根偏差。
主要成分分析(PCA)
PCA是数据分析的多维统计方法,适合表示在它们特性的多维空间中的分子(分子描述符)。PCA可用于将大量描述符减少到产生于原始描述符的线性组合的少量合成直角变量。该方法保留了最大部分的全部起始信息。该原始变量被标准化,且使用经典的Jacobi变换途径计算协方差矩阵的对角线化。3K自相关图矢量的成分提供了不同构彖的3K结构的良好描述,但因为它们包含太多数据不容易看见而难以掌握。PCA可减少数据的维数到包含尽可能多的原始信息的2D或3d图像。使用PCA,免疫抑制肽显示出良好定义的普通构造空间。所有能达到这些构彖规格的肽可显示免疫抑制活性。
肽bc 1nL生物活性构彖的构彖空间坐标
图1显示二维构彖空间和肽bc 1nL(RDP58)的相关构彖,其中bc 1nL肽有氨基酸序列Arg-nL-nL-nL-Arg-nL-nL-nL-Gly-Tyr和其中“nL”是正亮氨酸(见下文)。所画的结构是通过应用簇分析方法在肽bc 1nL的全部轨道上获得的。
肽bc 1nL的主要构彖
在它的构彖空间中主要见到bc 1nL的构彖的结构特性(图1,(1),(2),(3),(4)和(5))总结于表II。这些特性涉及中三个第一主要成分定义的三维空间的坐标(PCA坐标),和回转半径(Rg)。
表2
肽bc 1nL的动力学构彖的空间坐标(PCA坐标)和回转半径(Rg)
构彖 | PCA坐标 | Rg | ||
PC1 | PC2 | PC3 | ||
(1) | 0.785 | -2.816 | -0.531 | 9.92 |
(2) | 0.382 | -0.899 | -0.164 | 7.99 |
(3) | -0.811 | 0.345 | -0.481 | 6.93 |
(4) | 0.741 | 0.950 | -1.092 | 6.76 |
(5) | -2.096 | -0.296 | 0.770 | 6.67 |
活性肽的构彖空间
D2(氨基酸序列Arg-Val-Asn-Leu-Arg-IIe-Ala-Leu-Arg-Tyr)肽的轨道通过3D自相关方法描述,通过主要成分分析来分析数据。这提供了由包含在轨道期间见到的所有构彖的2第一主要成分定义的主要计划。D2肽轨道用作轨道参考,所有计算出的轨道被投射入其主要计划中。(图2)
免疫抑制肽显示良好定义的普通构彖空间特征有以下几点:
PCA维数:
PC1:最小=-2.0;最大=2.0
PC2:最小=-2.0;最大=1.0
PC3:最小=-1.0;最大=1.0
设计了定义为bc肽的下列肽:
表3
bc# | ||||||||||
1 | Arg | Leu | Leu | Leu | Arg | Leu | Leu | Leu | Gly | Tyr |
2 | Arg | Val | Leu | Leu | Arg | Leu | Leu | Leu | Gly | Tyr |
3 | Arg | IIe | Leu | Leu | Arg | Leu | Leu | Leu | Gly | Tyr |
4 | Arg | Leu | Val | Leu | Arg | Leu | Leu | Leu | Gly | Tyr |
5 | Arg | Leu | IIe | Leu | Arg | Leu | Leu | Leu | Gly | Tyr |
6 | Arg | Leu | Leu | Val | Arg | Leu | Leu | Leu | Gly | Tyr |
7 | Arg | Leu | Leu | Iie | Arg | Leu | Leu | Leu | Gly | Tyr |
8 | Arg | Leu | Leu | Leu | Arg | Val | Leu | Leu | Gly | Tyr |
9 | Arg | Leu | Leu | Leu | Arg | IIe | Leu | Leu | Gly | Tyr |
10 | Arg | Leu | Leu | Leu | Arg | Leu | Val | Leu | Gly | Tyr |
11 | Arg | Leu | Leu | Leu | Arg | Leu | IIe | Leu | Gly | Tyr |
12 | Arg | Leu | Leu | Leu | Arg | Leu | Leu | Val | Gly | Tyr |
13 | Arg | Leu | Leu | Leu | Arg | Leu | Leu | IIe | Gly | Tyr |
14 | Arg | Trp | Leu | Leu | Arg | Leu | Leu | Leu | Gly | Tyr |
15 | Arg | Leu | Trp | Leu | Arg | Leu | Leu | Leu | Gly | Tyr |
16 | Arg | Leu | Leu | Trp | Arg | Leu | Leu | Leu | Gly | Tyr |
17 | Arg | Leu | Leu | Leu | Arg | Trp | Leu | Leu | Gly | Tyr |
18 | Arg | Leu | Leu | Leu | Arg | Leu | Trp | Leu | Gly | Tyr |
19 | Arg | Leu | Leu | Leu | Arg | Leu | Leu | Trp | Gly | Tyr |
20 | Arg | Tyr | Leu | Leu | Arg | Leu | Leu | Leu | Gly | Tyr |
21 | Arg | Leu | Tyr | Leu | Arg | Leu | Leu | Leu | Gly | Tyr |
22 | Arg | Leu | Leu | Tyr | Arg | Leu | Leu | Leu | Gly | Tyr |
23 | Arg | Leu | Leu | Leu | Arg | Tyr | Leu | Leu | Gly | Tyr |
24 | Arg | Leu | Leu | Leu | Arg | Leu | Tyr | Leu | Gly | Tyr |
25 | Arg | Leu | Leu | Leu | Arg | Leu | Leu | Tyr | Gly | Tyr |
1nL | Arg | nL | nL | nL | Arg | nL | nL | nL | Gly | Tyr |
nL=正亮氨酸
实施例2
RDP58治疗减少CPT-11引起的胃肠毒性
在接受CPT-11治疗的癌症患者中腹泻的出现限制了施用最大有效的化疗。本研究评价了RDP58作为潜在保护剂以减弱CPT-11引起的胃肠毒性和在鼠肿瘤模型中发生的死亡率。在剂量探索研究中,正常、非肿瘤携带小鼠在腹腔内注射200mg/kgCPT-11,每天一次,连续三天,同时口服给予0,2.5,5.0或10mg/kg RDP58。如图3和表4所示,RDP58显示在首次注射CPT-11后十二天的生存中有剂量依赖性增加。
表4
毒性反应(%) | ||||
CPT-11(mg/kg/剂量) | RDP58(mg/kg/天) | 最大体重减少 | 腹泻 | 死亡率 |
200 | 无 | 29.4±4.3 | 97(29/30)b | 73(22/30) |
200 | 2.5 | 27.8±3.7 | 67(10/15)b | 60(9/15) |
200 | 5 | 25.6±4.4a | 40(12/30)b | 23(7/30) |
200 | 10 | 24.6±1.9a | 33(5/15)b | 7(1/15) |
a:p<0.05,ANOVA b:p=0.001,Cochran-Armitage趋势测试
治疗组中只有十五分之一的小鼠死于CPT-11治疗,与之相比对照组中死亡三十分之二十二。也观察到在接受RDP58的小鼠中腹泻出现有剂量依赖性减少。另外,接受5.0和10.0mg/kg RDP58的小鼠显示在最大总体重减轻上与未接受RDP58治疗的小鼠相比有减少。
实施例3
RDP58治疗减少5-FU引起的胃肠毒性
进行第二个研究确定RDP58是否也可限制5-FU引起的腹泻。正常、非肿瘤携带小鼠以每天100ng/kg 5-FU治疗,连续两天,同时口服给予10mg/kg RDP58或只给水。如图4和表5所示,施用5-FU后十二天,RDP58治疗的动物的生存率为90%,与之相比,未治疗动物的生存率仅10%。与RDP58治疗的动物只有十分之三相比,对照组中所有十个动物都有腹泻。而且,观察到接受RDP58的组中总体重减轻明显减少。
表5
毒性(%) | ||||
5-FU(mg/kg/剂量) | RDP58(mg/kg/天) | 最大体重减少 | 腹泻 | 死亡率 |
100 | 无 | 34.7±4.6 | 100(10/10) | 90(9/10) |
100 | 10 | 13.9±3.8b | 30(3/10) | 10(1/10) |
b:p<0.05,ANOV
实施例4
RDP58减少治疗相关的死亡率和胃肠毒性而不减少CPT-11的效力
为了确定RDP58是否改变CPT-11治疗的效力,携带CT-26肿瘤的小鼠用CPT-11治疗三个疗程,100mg/kg每日x3,并口服5.0mg/kg RDP58。两组显示在肿瘤重量上有类似的下降(图5,RDP58治疗组减少55%,无RDP58治疗组减少61%)。但是,给予RDP58的组的生存明显增加(图6)。与对照组中40%死亡率相比,在RDP58组中未观察到治疗相关的死亡。
实施例5
RDP58治疗增加CPT-11的最大剂量
为了确定同时口服RDP58治疗是否可增加CPT-11的最大剂量而不伴有死亡率的增加,正常非肿瘤携带小鼠0,100,200,300 CPT-11qd×3注射或400mg/kg CPT-11在0,1和2天i.p.注射每日×3。在第三天开始给予10mg/kg RDP58在饮用水中口服。监测小鼠的体重减轻、腹泻的发生率和死亡率直至第十二天研究结束。CPT-11组的LD50是约450mg/kg/总剂量。如图7所示,施用RDP58增加LD50到约725mg/kg/总剂量,或约1.6x倍。
实施例6
RDP58治疗增加CPT-11的最大剂量降低死亡率和改善肿瘤反应
为了确定使用RDP58治疗减少GI毒性和死亡率可使CPT-11剂量增加,我们比较了最大耐受剂量(MTD)的伊里诺坎(CPT-11),2×MTD CPT-11,或2×MTD加10mg/kgRDP58治疗的肿瘤携带小鼠的治疗死亡率和肿瘤反应。按照我们的治疗方案,我们发现MTD为600mg/kg CPT-11(每注射66.7mg/kg×9次注射,总共12天)。在该治疗组中没有动物死于CPT-11,与非治疗的对照相比肿瘤体积减少约40%(图9)。以1200mg/kg CPT-11或1200mg/kg CPT-11+10mg/kg RDP58治疗的动物显示肿瘤体积减少超过80%。但是,在2×MTD CPT-11组中只有50%(6/12)的动物在整个治疗方案中存活,而CPT-11+RDP58组有83%(10/12)的存活,如图8所示。虽然死亡率数据在95%可信水平没有统计学意义(p=0.067,Log-Rank试验),该数据强烈支持逐步提高RDP58剂量可增加MTD,从而改善抗癌症反应的结论。
实施例7
RDP58治疗减少放射治疗引起的直肠炎
这些研究评价了施用RDP58肽预防和减少放射治疗相关的胃肠道应激。研究1发现随后功效研究中使用的放射的最佳剂量和方案。研究2评定RDP58在使用逐步提高的放射剂量的非肿瘤携带动物中的保护效应。研究3评定影响较佳肿瘤反应的放射剂量的增加是否可达到而不伴有毒性反应的增加。这些研究确定了口服施用RDP58是否可防止或减少与治疗有关的胃肠毒性并使得在治疗如,转移性结直肠肿癌、前列腺癌和卵巢癌中增加较大肿瘤反应的剂量。
研究1-放射剂量最佳化:正常健康鼠被给予逐渐提高的放射剂量以确定在90%对照动物中导致腹泻的放射剂量。每天监测动物的体重减轻、腹泻发生率和发病率。体重减轻>25%或显示严重应激征兆的动物被人道地处死。造出大约90%的治疗动物中产生腹泻的最佳剂量和方案用于下一个研究。可选择的是,肠的组织学分析可用于确定组织损伤。
研究2-在正常,非肿瘤携带动物中给予逐步提高的放射剂量评估RDP58活性:起始研究使用10mg/kg RDP58每天管饲。该剂量已显示减少伊里诺坎(CPT-11)和5-氟尿嘧啶(5-FU)治疗有关的小鼠中的死亡率和腹泻和增加CPT-11的LD50从约465mg/kg到720mg/kg总剂量。监测小鼠的体重减轻、腹泻发生率和发病率。如果在起始放射剂量显示出保护作用,将进行放射剂量升高研究以确定10mg/kg RDP58是否增加放射暴露而防止或减少GI毒性和死亡率。对选择的对照和RDP58治疗的动物也进行肠上皮的组织学分析来确定临床观察。
研究3-在肿瘤携带动物中放射剂量逐步提高:使用腹水瘤的同系肿瘤模型。C57BL/6小鼠被腹膜注射(i.p.)EL-4鼠胸腺瘤或BALB/c小鼠被注射CT-26结直肠癌细胞且允许形成腹水瘤。可选择的是,肺转移性4T1模型可被用于使用全身放射的研究。小鼠按照研究2所述开始口服10mg/kg RDP58。有腹水的小鼠用30Gy治疗;优化放射的剂量和方案以诱导接受放射而没有同时使用RDP58的动物中至少90%动物产生腹泻。监测小鼠的体重减轻、腹泻发生率和发病率。放射治疗结束后30天,小鼠被处死,并确定肿瘤的重量、组织学或肉眼评估吸出的腹水体积。对选择的对照和RDP58治疗的动物也进行肠组织的组织学分析。
上述数据显示免疫调节肽可明显改善体重减轻,减少腹泻症状,和改善CPT-11和5-FU施用的生存率。这些数据进一步提示RDP58通过限制腹泻—主要剂量限制性毒性,使得CPT-11剂量逐步提高,从而改善长期生存。
本文中提到的所有出版物和专利申请被纳入作为参考,其程度与每篇单个出版物或专利申请被具体和单独地指明纳入作为参考是相同的。本发明被充分描述,对于本领域普通技术人员来说,不脱离本发明所附权利要求的精神或范围的多种变化和改进是显而易见的。
Claims (18)
1.一种减少细胞消融治疗引起的胃肠毒性反应的方法,包括对进行细胞消融治疗的患者施用药学上有效量的一种免疫调节肽,其中所述免疫调节肽包含氨基酸序列为
B-X-X-X-B-X-X-X-J-Tyr的寡肽,其中
B是Lys或Arg;
X是脂族或芳族氨基酸;
J是Gly,Lys或Arg,
其中所述氨基酸是天然产生的L-异构体,它们的D-异构体,和正亮氨酸。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述寡肽中
B是Arg;
X是从5到6个碳原子的包括正亮氨酸的脂族非极性氨基酸,芳族氨基酸或它们的D-异构体,有至少3个同样的脂族非极性氨基酸在所述的寡肽中;和
J是Gly或Arg。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于,对于所述的寡肽,被X定义的至少5个氨基酸是缬氨酸、亮氨酸或正亮氨酸,及被X定义的任何残余氨基酸是Trp或Tyr。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,对于所述的寡肽,被X定义的git5个氨基酸是相同的。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的寡肽选自:
(a)Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-Leu-Leu-Leu-Gly-Tyr;
(b)Arg-Val-Leu-Leu-Arg-Leu-Leu-Leu-Gly-Tyr;
(c)Arg-IIe-Leu-Leu-Arg-Leu-Leu-Leu-Gly-Tyr;
(d)Arg-Leu-Val-Leu-Arg-Leu-Leu-Leu-Gly-Tyr;
(e)Arg-Leu-IIe-Leu-Arg-Leu-Leu-Leu-Gly-Tyr;
(f)Arg-Leu-Leu-Val-Arg-Leu-Leu-Leu-Gly-Tyr;
(g)Arg-Leu-Leu-IIe-Arg-Leu-Leu-Leu-Gly-Tyr;
(h)Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-Val-Leu-Leu-Gly-Tyr;
(i)Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-IIe-Leu-Leu-Gly-Tyr;
(j)Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-Leu-Val-Leu-Gly-Tyr;
(k)Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-Leu-IIe-Leu-Gly-Tyr;
(l)Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-Leu-Leu-Val-Gly-Tyr;
(m)Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-Leu-Leu-IIe-Gly-Tyr;
(n)Arg-Trp-Leu-Leu-Arg-Leu-Leu-Leu-Gly-Tyr;
(o)Arg-Leu-Trp-Leu-Arg-Leu-Leu-Leu-Gly-Tyr;
(p)Arg-Leu-Leu-Trp-Arg-Leu-Leu-Leu-Gly-Tyr;
(q)Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-Trp-Leu-Leu-Gly-Tyr;
(r)Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-Leu-Trp-Leu-Gly-Tyr;
(s)Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-Leu-Leu-Trp-Gly-Tyr;
(t)Arg-Tyr-Leu-Leu-Arg-Leu-Leu-Leu-Gly-Tyr;
(u)Arg-Leu-Tyr-Leu-Arg-Leu-Leu-Leu-Gly-Tyr;
(v)Arg-Leu-Leu-Tyr-Arg-Leu-Leu-Leu-Gly-Tyr;
(w)Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-Tyr-Leu-Leu-Gly-Tyr;
(x)Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-Leu-Tyr-Leu-Gly-Tyr;
(y)Arg-Leu-Leu-Leu-Arg-Leu-Leu-Tyr-Gly-Tyr;和
(z)Arg-nL-nL-nL-Arg-nL-nL-nL-Gly-Tyr。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的方法进一步包括使用至少一种选自止泻药、消炎药和镇痛药的另外的治疗剂。
7.如权利要求6所述的方法,其特征在于,所述的至少一种另外的治疗剂是止腹泻药。
8.如权利要求6所述的方法,其特征在于,所述的免疫调节肽和所述的至少一种另外的治疗剂是同时或连续施用的。
9.一种用来减少细胞消融治疗引起的胃肠毒性的药物制剂,包含:
a)包含序列Arg-nL-nL-nL-Arg-nL-nL-nL-Gly-Tyr的寡肽,其中nL是正亮氨酸,所有的氨基酸是D-立体异构体;和
b)至少一种选自止泻药、消炎药和镇痛药的另外的治疗剂。
10.如权利要求9所述的药物制剂,其特征在于,所述的至少一种另外的治疗剂是止泻药。
11.一种改善细胞消融癌症治疗的方法,包括联合药学上有效量的免疫调节肽施用增加最大耐受剂量的细胞消融剂,其中所述的免疫调节肽包含氨基酸序列为
B-X-X-X-B-X-X-X-J-Tyr的寡肽,其中
B是Lys或Arg;
X是脂族或芳族氨基酸;
J是Gly,Lys或Arg,
其中所述氨基酸是天然产生的L-异构体,它们的D-异构体,和正亮氨酸。
12.如权利要求11所述的方法,其特征在于,所述寡肽中
B是Arg;
X是从5到6个碳原子的包括正亮氨酸的脂族非极性氨基酸,芳族氨基酸或它们的D-异构体,至少3个同样的脂族非极性氨基酸在所述的寡肽中;和
J是Gly或Arg。
13.如权利要求10所述的方法,其特征在于,所述的细胞消融剂的最大耐受剂量与没有所述的免疫调节肽的细胞消融剂的最大耐受剂量相比增加至少1.5x。
14.如权利要求10所述的方法,其特征在于,所述的细胞消融剂的最大耐受剂量与没有所述的免疫调节肽的细胞消融剂的最大耐受剂量相比增加至少2x。
15.如权利要求10所述的方法,其特征在于,对于所述的寡肽,被X被定义的至少5个氨基酸是缬氨酸、亮氨酸或正亮氨酸,及被X定义的任何残余氨基酸是Trp或Tyr。
16.如权利要求10所述的方法,其特征在于,对于所述的寡肽,被X定义的至少5个氨基酸是相同的。
17.如权利要求10所述的方法,其特征在于,所述的免疫调节肽和所述的细胞消融剂是同时或连续施用的。
18.如权利要求17所述的方法,其特征在于,所述的免疫调节肽在所述的细胞消融剂施用前施用。
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