CN1735425A - 用于治疗间质性膀胱炎的细胞调节肽 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于治疗膀胱疾病的方法和组合物。更具体地说，本发明涉及治疗间质性膀胱炎和相关疾病的方法。本发明还包括用于改善与间质性膀胱炎相关的各种表现的方法，其中包括降低组胺的释放、调节P物质的表达、调节神经生长因子的表达、调节各种细胞因子的表达以及维持尿/血屏障的完整性。

Description

用于治疗间质性膀胱炎的细胞调节肽

1.相关申请的交叉参照

本申请要求2002年11月15日提交的第60/426,684号美国临时申请和2005年5月15日提交的第60/470,839号美国临时申请的优先权，本文已将这两者纳入作为参考。

2.技术领域

本发明涉及用于治疗膀胱疾病的方法和组合物，更具体地说，本发明涉及用于治疗间质性膀胱炎和相关疾病的疗法。

3发明背景

膀胱是一种膜性肌肉器官，其功能为储存尿液、尿液成分的维持以及适时排尿。其结构基本由四层组成：上皮层、固有层、肌肉层(即逼尿肌)和膀胱周围软组织。上皮层顺着膀胱排列，与尿液接触，被称为移行上皮或膀胱上皮，其功能是维持尿液与血液之间的化学梯度。固有层位于上皮层之下，由结缔组织和血管组成。肌粘膜通常是一层不连续的细平滑肌，位于固有层之内。这一浅层平滑肌与肌粘膜或逼尿肌不同，后者是由粗平滑肌束组成的深层肌肉，形成了膀胱壁。膀胱周围软组织包括膀胱的外层，由脂肪、纤维组织和血管组成。膀胱功能障碍很常见，可使患者虚弱。

间质性膀胱炎(IC)是一种原因不明的膀胱疾病，临床症状包括慢性尿频、尿急、夜尿和膀胱/骨盆痛。原来认为间质性膀胱炎只影响中年女性，现在发现所有年龄段的男女都会发生。

根据对膀胱细胞的检查结果将IC分为两类。其中非溃疡性IC是最常见的，其特征是在进行膀胱水分离术时发生肾丝球状出血(即针尖样出血(pinpointbleeding))。溃疡性IC约占10％，其特征是存在Hunner溃疡，这是一种细胞壁上的星行粘膜溃疡。但是，很多IC患者在进行细胞检查时未发现变化，因此细胞检查指标的严重程度与临床症状之间没有密切的相关关系。

对剥离的上皮进行组织病理学检测发现固有层内有大量的白细胞和浆细胞浸润、逼尿肌层内血管混杂和纤维化(MacDermott，J.P.等，J.Urol.145：274-278(1991))。但是这些特征只限于一小部分具有脓尿和膀胱容量小的患者。中性粒细胞只见于溃疡(Lynes，W.L.等，Amer.J.Surg.Pathol.14：969-976(1990))。炎症部位很少见到巨噬细胞，炎性浸润常见于逼尿肌内。许多具有临床症状的患者并没有慢性炎症。由于组织病理学的指标多变并且不一致，因此诊断IC时需要综合考虑各种指标。

现在有各种理论来解释IC的病因，其中包括上皮完整性受损、感染、神经性炎症、肥大细胞活化和自身免疫。一些研究表明IC患者上皮组织的通透性增加(见Lavelle，J.P.等，Am.J.Physiol.Renal.Physiol.278：F540-F553(2000))。受影响的膀胱内粘膜糖胺聚糖发生质的变化、尿路上皮的超微结构缺损且尿素的运输加快。大多数IC患者膀胱内滴注KCl溶液时都会感觉疼痛和尿急，说明其上皮结构受损。同样，在膀胱内滴注尿素溶液再排干后IC患者的尿素浓度比对照组要低，说明IC患者的粘膜通透性升高。

虽然感染也被怀疑为IC的致病原因，但是用PCR分析活组织标本却未检测到致病性细菌的存在(Keay，S.等，J.Urol.159：280-283(1998))。另外，通过检测膀胱内的细菌、真菌和病毒发现IC患者与对照患者之间无显著性的差异(Duncan，J.L.等，Urology 49：48-51(1997))。到目前为止还未发现IC的致病因子。

几项研究表明神经性炎症因子可能对IC的发生产生影响，其中包括神经肽物质P及其受体、神经激肽1受体(NK-1受体)。对感觉神经元的刺激可导致P物质的释放，已知P物质可刺激肥大细胞释放炎症调节因子和组织胺。IC动物模型的膀胱和尿液内的P物质增多(Hammond，T.G.等，Ann J.Physiol.Renal Physiol 278：F440-F451(2000))，活组织检查发现含有P物质的神经纤维明显增多。膀胱内注射P物质可引起小鼠膀胱的炎症，而感觉神经纤维脱敏可降低尿道膀胱的过度屈曲。NK-1受体拮抗剂可消除或降低P物质介导的膀胱炎，NK-1受体敲除小鼠的膀胱炎症明显减轻(Saban，R.等，Amer.J.Path.156：775-780(2000))。这些试验还说明P物质通路参与IC的过程，因为IC患者膀胱活组织标本内NK-1受体的表达升高(Marchand，J.E.等，Br.J.Urol.81：224-228(1998))。

P物质这些可能的功能预示着肥大细胞也可能参与导致IC的生理过程。IC膀胱逼尿肌和粘膜下层内的肥大细胞数目增多，这些增多的肥大细胞见于含P物质的感觉神经附近。30-65％的IC患者有肥大细胞增生，并且组胺和类胰蛋白酶的水平升高。令人感兴趣的是，在肥大细胞缺失小鼠Kit(W)/Kit(W-v)内无法用试验来诱导出膀胱的炎症(见Saban，R.等，Physiol.Genomics 10：35-43(2001)；Saban，R.等，Am.J.Physiol.Renal Physiol.282：F202-F210(2002))。从理论上推测，与感觉神经肽有关的肥大细胞数目的增加导致了肥大细胞介导的免疫反应。但是，逼尿肌层内肥大细胞数目的增多并不能解释IC上皮受损的状态。此外，在逼尿肌层内很少见到炎症细胞。

自身免疫也被怀疑为IC的致病原因，因为IC和自身免疫疾病，如红斑狼疮、过敏性哮喘、多发性硬化症、炎性肠病和Sjorgren病具有流行病学上的相关性。IC患者易患这些自身免疫疾病。但是，IC患者外周血的淋巴细胞表型(如CD4/CD8细胞的比例)是正常的，这与自身免疫疾病红斑狼疮、原发性胆汁性肝硬变或多发性硬化症的表现相反(MacDermott，J.P.等，J.Urol.145：274-278(1991))。膀胱活组织标本的组织学检查表明淋巴细胞浸润增多，但是与膀胱各种结构内存在的淋巴细胞类型是相矛盾的(MacDermott等，同上；Hanno，P.等，J.Urol.143：278-281(1990))。虽然早期的试验也显示循环内存在膀胱特异性的抗体，但是以后的试验却得出了相反的数据，说明这些体液免疫因子可能是组织损伤的间接结果。因此，还没有证据表明免疫系统功能失调和IC之间有确定的联系。

淋巴细胞浸润的存在和肥大细胞数目的增多暗示炎症网络在IC中发挥作用。从活化的肥大细胞培养物中获得的条件培养基可诱导膀胱上皮细胞系合成细胞因子TNF-α、IL-1b和IL-8以及粘附分子ICAM-1(Batler，R.A.等，J.Urol.168：819-825(2002))。另一方面，在被诊断为IC的患者的尿液中炎症介质并没有显著升高。尿液内细胞因子IL-4、IL-10、IL-12、TNF-α、hGM-CSF、IL-1b和IFN-γ；前列腺素E2、D2和F2a；以及血栓素的浓度在IC患者和非IC患者之间没有显著差异(Felson，D.等，J.Urol.152：355-361(1994)；Peters，K.M.Adult Urology 54：450-453(1999))。某些具有活动IC的患者体内细胞因子IL-2、IL-6和IL-8的水平升高，但是大多数炎症细胞因子TNF-α或IFN-γ的水平并没有改变(Peters，K.M.，同上)。逼尿肌层内肥大细胞数目增多却没有炎症细胞浸润，通常也没有巨噬细胞，这些矛盾的现象使炎症级联与IC之间的关系变得模糊起来。令人感兴趣的是，BCG(卡介苗)对改善IC的症状有某些疗效，研究表明膀胱内滴注BCG可增加IL-1、IL-2、IFN-γ和TNF-α的水平(见Peters，K.M.等，同上；Bohle，A.J.Urol 144：59-64(1990))。

由于IC的病因不明，因此IC的治疗方法少而多变。如上面所提到的BCG治疗IC的症状有些效果。木聚硫钠(Elmiron^)是一种肝素衍生物，被认为不仅可以帮助修复和保护受损的膀胱上皮，而且可以抑制肥大细胞释放组胺(Chiang，G.等，J.Urol.164(6)：2119-2125(2000))。二甲亚砜(DMSO)可减轻膀胱疼痛，说明具有抗炎作用。免疫抑制药物环孢菌素(Forsell，T.等，J.Urol.155：1591-1593(1996))和氨甲喋呤(Moran，P.A.等，Aust N Z J Obstet Gynaecol.39：468-471(1999))具有减轻IC症状的疗效。由于目前缺少标准而有效的IC治疗措施，因此本领域需要其他有效的IC治疗措施。于是本发明提供了治疗IC的组合物和方法。

4.发明概述

本发明涉及用于治疗膀胱疾病的方法和组合物。更具体地说，本发明涉及治疗间质性膀胱炎(IC)和相关疾病的方法。已知肽组合物具有多种生物活性，其中包括调节免疫反应、炎症细胞因子的表达水平以及p38MAP激酶、JNK、TRAF和IRAK介导的信号转导通路。寡肽的这种不同特性可影响IC的各种症状，其中包括抑制组胺的释放、改变P物质的表达水平、调节神经生长因子(NGF)的表达水平以及调节细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-12的表达水平。试验还证实组合物可降低受损组织内多形核细胞、T细胞和肥大细胞的浸润以及维持或恢复膀胱的尿液/血液屏障。

因此，本发明提供了治疗IC的方法，该方法包括给予患者治疗有效量的含RDP58寡肽的组合物。急性和/或慢性IC都可以用这种组合物治疗。

由于RDP58寡肽具有不同的效应，因此本文所提供的方法还可以用于调节或改善IC相关的一种或多种表现，这些表现很多都与疾病的进展有关。笼统地说，该方法包括使受IC影响的组织或细胞与药物有效量的RDP58组合物接触以减轻疾病的表现。

另一方面，使肥大细胞与药物有效量的RDP58组合物接触以抑制或降低受疾病影响的组织或细胞内的组胺水平。

另一方面，使受疾病影响的组织或细胞与药物有效量的寡肽接触以降低P物质的水平。

另一方面，使受疾病影响的组织或细胞与药物有效量的寡肽接触以降低NGF的水平。

另外，使受疾病影响的组织或细胞与药物有效量的寡肽接触以调节细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-12的表达水平。

利用药物有效量的本发明的组合物治疗还可以保持或恢复尿液/血液屏障的完整性。寡肽可限制膀胱通透性的降低，使慢性疾病的膀胱通透性恢复到与正常膀胱一样的水平。

RDP58组合物包括使用可有效治疗IC和相关疾病的其他药物。联合治疗包括使用类固醇、免疫抑制剂、三环类抗抑郁药、硫酸化的多糖、DMSO、辣椒辣素、抗组胺药及其混合物。

本发明提供的疗法是各种不同的包含RDP58和药学上可接受的载体的组合物。所述载体包括用于使药物进入患者体内、到达组织或细胞的赋形剂或稀释剂，特别是用于膀胱内给药的稀释剂。

多肽的给药方式可以是任何方便的方式，其中包括将寡肽或编码所需多肽的核酸直接运送到受损组织或细胞部位。优选的给药方法是膀胱内滴注本发明的组合物。另外，多肽也可以通过各种途径使其间接到达膀胱，包括静脉注射和系统给药。

5.附图的简述

图1描述的是在体外用脂多糖(LPS)、RDP58肽(bc 1nL)、LPS+RDP58多肽或仅用介质(对照)处理后膀胱组织内的TNF-α水平。

图2显示的是用LPS、P物质(SP)或离子霉素诱导后组胺从大鼠嗜碱性白细胞(RBL-2H3)内的释放以及RDP58对培养物内组胺释放的抑制效应。

图3A-3D显示的是在试验性急性IC模型内RDP58寡肽对生化标记物水平的影响：图3A-TNF-α；图3B-IL-6；图3C-P物质；图3D-组胺释放；以及图3E-NGF。

图4显示的是在实验性急性IC模型内膀胱内滴注FITC-葡聚糖后通过测定血清FITC-葡聚糖的水平来确定膀胱的通透性。

图5A和5B显示的是在各种处理条件下血清FITC-葡聚糖的水平以及RDP58寡肽在维持尿液/血液屏障完整性方面的作用。如图所示，通过给动物滴注LPS来诱导急性膀胱炎(即″LPS″和″RDP58″)。不同稀释度的血清的荧光强度显示在图5A中。

图6显示的是膀胱滴注LPS或LPS+RDP58后血清中FITC-葡聚糖的大约百分率。百分率是指血清中的FITC-葡聚糖占滴注如膀胱的量的比例。

图7A和7B显示的是在慢性IC动物模型中RDP58多肽对TNF-α和IL-6表达水平的影响。

图8显示的是在慢性IC动物模型中RDP58多肽对膀胱通透性的影响。

图9A-9D显示的是慢性IC动物模型的膀胱组织切片进行苏木精-伊红染色和CD45免疫染色的照片，动物滴注盐水(对照)或LPS。

图10A-10F显示的是慢性IC动物模型的膀胱组织切片进行CD3免疫染色的照片，动物只滴注盐水。

图11A-11H显示的是慢性IC动物模型最后一次滴注LPS后72小时(图11A-11D)或7天(图11E-11F)的膀胱组织切片进行CD3免疫染色的照片。与盐水处理动物相比，组织切片显示存在CD3阳性细胞。

图12A-12D慢性IC动物模型先用LPS处理再用RDP58处理后的膀胱组织切片进行CD3免疫染色的照片(图12A：RDP58处理后24小时；图12B：RDP58处理后72小时)。RDP58处理可导致CD3阳性细胞的减少。

6.发明详述

6.1治疗间质性膀胱炎

本发明涉及治疗间质性膀胱炎(IC)和相关疾病的方法和组合物。组合物包含PCT出版物WO 98/46633和同时待批的序列号为09/028,083和08/838,916的美国专利申请描述的化合物，本文都已纳入作为参考。据文献描述，这些寡肽化合物可调节免疫反应、抑制炎症细胞因子的产生，还可以影响p38 MAP激酶、JNK、TRAF和IRAK介导的信号通路。通过这些通路传导的信号与不同类型的疾病相关。本文显示RDP58多肽的各种生物活性具有调节IC不同症状的特性，因此是一种可治疗多种疾病的治疗药物。

本文所用的术语″间质性膀胱炎″或″IC″是指具有一种或多种间质性膀胱炎表现的障碍、疾病或情况。表现包括临床症状(如尿频和尿急、夜尿以及膀胱/骨盆痛)；诊断指标(如滴注KCl溶液的反应、水分离术时肾丝球状出血；存在Hunner溃疡)和组织病理学指标，如淋巴细胞浸润、肥大细胞数目增多以及上皮结构的改变(如膀胱通透性)。其他表现包括疾病标记表达水平的改变或表达，其中包括而不限于P物质、IL-2、IL-6、IL-8、糖蛋白51、抗增殖因子、神经生长因子(NGF)；组胺以及其他因子(见Erickson，D.R.，Urology 57(增补本6A)：15-21(2001)，本文已纳入作为参考)。虽然一种表现就可以作为IC的指标，但是优选根据一种以上的表现作出判断，更优选的是综合各种表现作出判断，包括综合临床症状、组织学检查结果以及分子/生化标记。

本发明的多肽或寡肽组合物可调节或改善急性和慢性IC动物模型的各种表现。改善是指疾病状况的好转，反映为疾病的各种表现的变化。本文显示RDP58多肽可改变炎症细胞因子的水平，特别是受损膀胱内TNF-α和IFN-γ的表达水平；减少肥大细胞释放组胺；影响P物质的表达；以及影响神经生长因子(NGF)的表达。在组织学水平上，用RDP58多肽处理可减少多形核细胞(PMN)、T细胞和肥大细胞的浸润；减轻IC相关的水肿；以及减轻或抑制膀胱血液/尿液屏障的退化。

相应的，本发明提供了治疗IC的方法，该方法通过给予患者治疗有效量的包含RDF58寡肽的组合物来治疗IC。既可以治疗急性IC，也可以治疗慢性IC。急性IC与肥大细胞、中性粒细胞和巨噬细胞浸润有关，而慢性IC通常与T细胞浸润有关。如本文所描述，RDP58多肽在急性膀胱炎模型内可抑制多形核细胞和肥大细胞的浸润。对于慢性膀胱炎来说，本发明的多肽可减少受影响组织内的T细胞浸润，这可以通过检测CD3或CD45阳性细胞的存在来确定。应当理解的是，对急性和慢性状态的这些描述并不意味着将这种状态局限于可用寡肽治疗的范围，而是仅仅反映了本领域已知的与其他疾病状态的区别。

本发明的多肽还可用于调节、最好是改善与IC有关的一种或多种表现。受疾病影响的组织或细胞与药物有效量的含RDP58寡肽的组合物接触，其中所含有的RDP58寡肽的量足以调节或改善IC的表现。相应的，在一个方面，多肽用于减少或抑制IC内的肥大细胞活化，这可以通过测定组胺或肥大细胞的其他内含物，如蛋白多糖和丝氨酸蛋白酶的释放来确定。试验表明肥大细胞活化后会合成趋化因子、细胞因子和脂质递质(如前列腺素和白三烯)，后者通过促进其他细胞因子和趋化因子的释放以及补充炎症细胞如嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞来介导慢性炎症反应。IC内可见肥大细胞增生，肥大细胞缺乏的小鼠实验性膀胱炎的严重程度明显降低(Bjorling，D.E.，J Urol.162(1)：231-236(1999))。如本文所描述，RDP58多肽能降低肥大细胞释放组胺的水平，也可以减少IC受损组织内肥大细胞的数量。

在另一个方面，RDP58多肽用于降低IC受损组织或细胞部位P物质的水平。P物质从膀胱壁内持续释放(Saban，R.等，Br.J.Urol.79：516-524(1997))。P物质从受IC影响的膀胱传入神经末梢释放以后就可以刺激肥大细胞的活化和组胺的释放，进而诱导或加速疾病状态。反过来，肥大细胞脱颗粒的产物可活化感觉神经C纤维释放P物质，形成一个正性反馈使肥大细胞持续活化(Suzuki，R.等，J.Immunol.163：2410-2415(1999))。P物质还是伤害感受通路的介质，通过与神经激肽受体结合而活化之，引起与IC相关的膀胱/骨盆痛。相应的，在另外的实施方式中，通过使用本发明的多肽降低P物质的水平也有助于减轻疾病相关的疼痛。

RDP58多肽还可用于降低受IC影响的组织或细胞内神经生长因子(NGF)的水平或表达。有几种膀胱疾病的NGF水平升高，其中包括特发性感觉神经急迫和IC(Lowe，E.M.等，Br.J.Urol.79(4)：572-527(1997))。神经生长因子可使传入神经致敏，诱导膀胱过度活动，这是IC的症状之一。另外，NGF可以提高伤害感受通路的敏感性，因此使疾病的疼痛感升高(Lowe，同上)。与P物质水平下降的效应一样，通过使用本发明的多肽来降低NGF的水平也有助于减轻疼痛。

在另一个方面，RDP58多肽用于降低或抑制受IC影响的组织或细胞内各种细胞因子的表达，特别是TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-12的表达。TNF-α和IFN-γ都是重要的炎症细胞因子，负责激发和传播炎症反应。这些细胞因子的产生可导致巨噬细胞的活化，巨噬细胞的活化反过来又产生其他的前炎症细胞因子(包括IL-1)；TNF-α；趋化因子(包括IL-8)；以及介质IL-6、IL-12和IL-18。这些相关的细胞因子、趋化因子和脂质递质网络通过T淋巴细胞和巨噬细胞的活化、补充血源性效应细胞分泌更多的炎症递质，进一步放大了炎症级联反应，最终导致组织损伤。IL-6和IL-12可能通过激发损伤组织的体液免疫反应来介导炎症反应。

在另一个方面，RDP58多肽用于维持或恢复IC受损膀胱的尿液/血液屏障。膀胱炎的膀胱上皮与正常的膀胱上皮在结构上及分子水平上有所不同，这可能导致了上皮的通透性下降，因为向IC患者膀胱内滴注尿素或糖时粘膜的通透性升高(见Erickson，D.R.等，J.Urol.164(2)：419-422(2000))。IC患者的尿液内有血细胞进一步说明了粘膜出现破裂，相应的尿液/血液屏障被破坏。用RDP58治疗可维持或恢复IC急性模型和慢性模型的膀胱通透性。

一般来说，IC和相关疾病的治疗方法包括给予患者或受试者药物有效量或治疗有效量的RDP58组合物或它们的混合物。

本文所用的术语“疗法”是指治疗性或预防性疗法，或者疾病、失调或不良状态的抑制方法。疗法包括在疾病症状出现前和/或疾病的表现或其他表现出现后给予适当剂型的本发明的多肽以降低疾病的严重程度、阻止疾病的进展或消除疾病。疾病的预防包括延长或延迟疾病症状的出现，特别是那些疾病易感人群。治疗的效果可根据上述表现的变化来判断。

RDP58多肽作为治疗或预防药物可单独使用或与其他治疗药物一起使用。在这种情况下，所使用的寡肽可以是单一的寡肽序列，或者是本发明不同寡肽序列的混合物，或者是包含本发明多肽的天然类似物的混合物，这方面将在下文作进一步描述。

其他可用于治疗疾病的治疗药物或药理活性药物可与RDP寡肽联合使用。对于IC来说，可与寡肽联合使用的药物包括而不限于类固醇(如地塞米松等)、免疫抑制剂(如环孢菌素、氨甲喋呤等)；三环类抗抑郁药(如阿米替林、doxapin)；硫酸化的多糖(如木聚硫钠)；抗组胺药(如羟嗪、西米替丁等)；DMSO以及辣椒辣素，C纤维传入神经毒素(Fagerli，J.，Can J Urol.6(2)：737-744(1999))。

在膀胱炎是由致病因子引起的情况下，本发明的多肽可与直接消除或杀伤致病因子的药物一起使用。这些药物包括抗生素、抗真菌药和抗病毒药，这些都是本领域所熟知的。这些药物可在给予本文所描述的多肽之前、同时或之后使用。

应当理解的是，上述的讨论虽然涉及到IC的治疗，但是本发明的方法和组合物也可以用于治疗具有IC的上述一个或多个表现的非间质性膀胱炎。非间质性膀胱炎包括放射性膀胱炎、细菌性膀胱炎和化学性膀胱炎。如本文所描述，放射性膀胱炎是指膀胱细胞暴露于损伤剂量的辐射，如离子辐射(如X射线和γ射线)之下而引起的膀胱炎，这种离子辐射是在对原发的尿道恶性肿瘤或其他骨盆恶性肿瘤(前列腺、膀胱、结肠/直肠)进行外部或腔内放射治疗时产生的。细菌性膀胱炎是指由于膀胱和/尿道细菌感染引起的。可成为致病因子的细菌性致病原包括大肠杆菌、腐生葡萄球菌、奇异变形菌、克雷白菌或肠球菌。化学性膀胱炎是指由于膀胱接触毒素或刺激性化学物质而引起的膀胱炎。典型的化学性膀胱炎见于膀胱内滴注或膀胱植入化疗药如三胺硫磷、环磷酰胺、丝裂霉素C和阿霉素及其类似物戊柔比星的膀胱癌患者。

6.2多肽/寡肽组合物

适用于治疗IC的RDP58多肽组合物至少包含一种PCT出版社WO 98/46633和同时待决的序列号为09/028,083和08/838,916的美国专利申请所描述的肽、多肽或寡肽，本文已特地纳入作为参考。这些肽在上述文献中被描述为能够抑制淋巴细胞的细胞毒活性、抑制炎症细胞因子的产生以及与那些细胞因子相关的炎症反应、抑制含血红素的酶的活性、以及延迟那些易患自身免疫疾病的哺乳动物患病的时间。

RDP58肽的核心序列包含两个碱性氨基酸，这两个碱性氨基酸被3到4个疏水性氨基酸、通常是3个疏水性氨基酸隔开，优选的是N末端为碱性氨基酸。C末端优选芳香族氨基酸，特别是酪氨酸。特别有趣的是，至少有一个寡肽核心的末端氨基酸是寡肽的末端氨基酸，位于化合物的单体或低聚物内。

本文所描述的组合物和方法中所用的RDP58肽优选具有序列B-X-X-X-B-X-X-X-J-Tyr的寡肽，其中B是碱性氨基酸，优选Lys或Arg，特别是至少在一个位置上是Arg，优选在两个位置上都是Arg。J是Gly、B或具有5到6个碳原子的脂肪族疏水性氨基酸，特别是Gly或B；X是脂肪族或芳香族氨基酸。在一个实施方式中，至少3个X氨基酸残基是相同的非极性脂肪族氨基酸，优选的是至少有4个相同的非极性脂肪族氨基酸，更优选的是至少有5个相同的非极性脂肪族氨基酸，最优选的是全部都是相同的非极性脂肪族氨基酸。在一个优选实施方式中，非极性脂肪族氨基酸是具有5到6个碳原子的氨基酸，特别是具有6个碳原子的氨基酸，尤其是非极性脂肪族氨基酸Val、Ile、Leu和nL。因此，在某些实施方式中，X是除带电荷的脂肪族氨基酸之外的任意氨基酸，优选除极性脂肪族氨基酸之外的任意氨基酸。

B-X-X-X-B-X-X-X-J-Tyr肽序列中的X所代表的6个氨基酸中优选至少有3个是具有5到6个碳原子的脂肪族氨基酸，更优选的是有4个，最优选的是有5个是具有5到6个碳原子的脂肪族氨酸，特别是具有6个碳原子的脂肪族氨基酸。在一个优选实施方式中，脂肪族氨酸是具有5到6个碳原子的非极性脂肪族氨酸，特别是Val、Ile、Leu和nL。其他的氨基酸可以是不带电荷的脂肪族氨基酸，特别是非极性脂肪族氨基酸或芳香族氨基酸。

特别适宜的组合物包括具有序列Arg-U-X-X-Arg-X-X-X-J-Tyr的RDP58肽，其中所有的符号都在上面给出了定义，除了U之外，U代表不带电荷的脂肪族氨基酸或芳香族氨基酸，特别是非极性的脂肪族氨基酸或芳香族氨基酸。

寡肽的氨基酸可以是L或D异构体形式，这样肽的一个或多个氨基酸，甚至所有氨基酸都是D立体异构体。另外，肽可以是本发明的肽的低聚物，特别是其二聚物，或者包含具有环状结构的环状肽，在下文有进一步的描述。

为了说明本发明，具有L或D异构体构型的氨基酸分为下列几类：

1. 脂肪族氨基酸

(a)非极性脂肪族氨基酸：

Gly、Ala、Val、nL、Ile、Leu

(b)极性脂肪族氨基酸：

(1) 不带电荷的：

Cys、Met、Ser、Thr、Asn、Gln

(2) 带电荷的：

Asp、Glu、Lys、Arg

2. 芳香族氨基酸：

Phe、His、Trp、Tyr

其中Pro可以包括在非极性脂肪族氨基酸之内，但是通常不包括在内。″nL″代表正亮氨酸，其中非极性脂肪族氨基酸可用其他异构体取代。

典型的RDP-58肽包括：

bc#
											1	Arg	Leu	Leu	Leu	Arg	Leu	Leu	Leu	Gly	Tyr
2	Arg	Val	Leu	Leu	Arg	Leu	Leu	Leu	Gly	Tyr
											3	Arg	Ile	Leu	Leu	Arg	Leu	Leu	Leu	Gly	Tyr
4	Arg	Leu	Val	Leu	Arg	Leu	Leu	Leu	Gly	Tyr
											5	Arg	Leu	He	Leu	Arg	Leu	Leu	Leu	Gly	Tyr
6	Arg	Leu	Leu	Val	Arg	Leu	Leu	Leu	Gly	Tyr
											7	Arg	Leu	Leu	He	Arg	Leu	Leu	Leu	Gly	Tyr
8	Arg	Leu	Leu	Leu	Arg	Val	Leu	Leu	Gly	Tyr
											9	Arg	Leu	Leu	Leu	Arg	He	Leu	Leu	Gly	Tyr

10	Arg	Leu	Leu	Leu	Arg	Leu	Val	Leu	Gly	Tyr
											11	Arg	Leu	Leu	Leu	Arg	Leu	Ile	Leu	Gly	Tyr
12	Arg	Leu	Leu	Leu	Arg	Leu	Leu	Val	Gly	Tyr
											13	Arg	Leu	Leu	Leu	Arg	Leu	Leu	Ile	Gly	Tyr
14	Arg	Trp	Leu	Leu	Arg	Leu	Leu	Leu	Gly	Tyr
											15	Arg	Leu	Trp	Leu	Arg	Leu	Leu	Leu	Gly	Tyr
16	Arg	Leu	Leu	Trp	Arg	Leu	Leu	Leu	Gly	Tyr
											17	Arg	Leu	Leu	Leu	Arg	Trp	Leu	Leu	Gly	Tyr
18	Arg	Leu	Leu	Leu	Arg	Leu	Trp	Leu	Gly	Tyr
											19	Arg	Leu	Leu	Leu	Arg	Leu	Leu	Trp	Gly	Tyr
20	Arg	Tyr	Leu	Leu	Arg	Leu	Leu	Leu	Gly	Tyr
											21	Arg	Leu	Tyr	Leu	Arg	Leu	Leu	Leu	Gly	Tyr
22	Arg	Leu	Leu	Tyr	Arg	Leu	Leu	Leu	Gly	Tyr
											23	Arg	Leu	Leu	Leu	Arg	Tyr	Leu	Leu	Gly	Tyr
24	Arg	Leu	Leu	Leu	Arg	Leu	Tyr	Leu	Gly	Tyr
											25	Arg	Leu	Leu	Leu	Arg	Leu	Leu	Tyr	Gly	Tyr
1nL	Arg	nL	nL	nL	Arg	nL	nL	nL	Gly	Tyr

nL＝正亮氨酸

RDP58肽的一个优选实施方式包含序列Arg-nL-nL-nL-Arg-nL-nL-nL-Gly-Tyr，其中nL是正亮氨酸，除了甘氨酸之外所有的氨基酸都是D立体异构体。

其他的RDP肽描述于1998年4月10日提交的PCT申请PCT/US98/07231、1997年4月11日提交的第08/838,916号美国专利申请和1998年2月23日提交的第09/028,083号美国专利中，本文特地完整纳入作为参考。一般来说，本文所用的术语“RDP58肽”或“RDP58寡肽”包括上述所有肽化合物。

在另外的实施方式中，其他已知的肽如HLA肽和TCR肽可作为RDP58组合物的组分用于本发明中。这些肽包括HLA-Bα1-结构域，特别是75到84位的氨基酸以及这个序列的突变株，其中可取代的氨基酸不超过2个(见WO 95/13288；美国专利No.5,723,128；5,753,625；5,888,512；6,162,434和6,436,903；所有文献都已特地纳入本文所谓参考)。另外还包括人TCR-α的跨膜区，这个跨膜区由该序列和该序列的不超过2个氨基酸发生突变的序列组成(见1995年1月16日提交的第PN 0589和PN 0590号澳大利亚专利申请，本文已特地纳入作为参考)。这些序列包含2个碱性氨基酸，其中这2个碱性氨基酸被4个疏水性脂肪族氨基酸隔开，虽然专利申请中认为可以存在3到5个疏水性氨基酸。通过突变可以用其他的氨基酸来取代其中的每一个氨基酸，或者插入或缺失其中的每一个氨基酸，每个取代、插入或缺失都是一个突变。一般来说，本文所用的术语“肽”或“寡肽”包括上述所有肽化合物以及这些肽的类似物、衍生物或融合蛋白等。

本发明的肽可用本领域技术人员所熟知的各种常规方法加以修饰。肽末端的氨基和/或羧基可通过烷基化作用、酰胺化作用或酰化作用来修饰以形成酯、酰胺或取代氨基基团，其中烷基或酰基可以是约1到30个碳原子，通常是1到24，优选1到3或8到24，特别是12到18个碳原子的基团。利用常规的化学合成方法就可以做到。肽或其衍生物还可以通过乙酰化或甲基化加以修饰以改变其化学特性，例如其亲脂性。乙酰化，特别是N末端游离氨基的乙酰化方法是本领域所熟知的。对于C末端来说，羧基可通过用乙醇进行酯化或酰胺化加以修饰形成-CONH₂、CONHR或CONR，其中R是羟二价羰基(hydroxycarbyl)(1-6个碳原子)。酯化和酰胺化的方法利用大家所熟知的技术就可以完成。其他的修饰包括谷酰基和天冬酰基脱氨基分别形成相应的谷酰基和天冬酰基；脯氨酸和赖氨酸的羟基化；丝氨酸或苏氨酸羟基的磷酸化；以及赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链氨基的甲基化(见T.E.Creighton，《蛋白质：结构和分子特性》(Proteins：Structure and Molecular Properties)，W.H.Freeman & Co.SanFrancisco，CA，1983)。

在另一方面，肽的一个或两个，通常是一个末端被亲脂性的基团取代，通常是8到36个碳原子的脂肪族氨基酸残基或芳烷基，优选的是8到24个碳原子的基团，脂肪族侧链中的杂原子少于两个，通常是氧、氮和硫。如下面进一步描述的，侧链可以是饱和的或者是不饱和的，脂肪族不饱和侧链的位点最好不超过3个，通常不超过2个。为了方便，市售的脂肪族脂肪酸、乙醇和胺就可以使用，如辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸和肉豆蔻醇、软脂酸、软脂烯酸、硬脂酸和硬脂酰胺、油酸甘油酯、亚麻油酸、二十二碳六烯酸等(见美国专利No.6,225,444，本文已纳入作为参考)。优选的是未分枝的天然脂肪酸，长度在14-22个碳原子之间。其他的亲脂性分子包括甘油脂质和固醇，如胆固醇。通过常规的方法亲脂基团可与寡肽内的合适功能基团发生反应，通常在固相支持物上合成时发生，根据寡肽在支持物上粘附的位点不同而不同。脂质连接物可用于将寡肽和其他治疗性药物一起引入到脂质体的腔隙内，这样脂质体就可以作为载体将肽和药物运送到宿主体内。已知增加亲脂性就可以增加化合物穿过内皮细胞的能力，因此可用于促进这类化合物被小肠摄取并通过血流进入到组织周围。

在其他的实施方式中，肽的N端或C端，或者二者同时被延伸到总长度不超过约100个氨基酸、通常总长度不超过约30个氨基酸、更常见的是不超过约20个、约9个氨基酸，其中25％以下是极性氨基酸，更常见的是约20％以下是极性氨基酸，更特别的是20％以下是带电荷的氨基酸。因此，上述序列在任意一个方向上的延伸都可以用亲脂性不带电荷的氨基酸，特别是非极性的脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸进行。肽可以包含L氨基酸、D氨基酸或D和L氨基酸的混合。除非考虑到氨基酸延伸的数目时，寡肽都可以表示为下述的融合蛋白或嵌合蛋白。

肽还可以是低聚物的形式，特别是肽的二聚物，可以是头对头、尾对尾或头对尾连接，因此低聚物内不超过6个肽重复单位。低聚物可以含有一个或多个D立体异构体氨基酸，甚至全部氨基酸都是D立体异构体。低聚物内的肽与肽之间可以用连接子，也可以不用。当使用连接子序列时，合适的连接子包括那些含不带电荷的氨基酸和(Gly)n的序列，其中n等于1-7，Gly-Ser(如(GS)_n、(GSGGS)_n和(GGGS)_n，其中n至少等于1)，Gly-Ala、Ala-Ser或其他易弯曲的连接子，这是本领域所熟知的。Gly或Gly-Ser连接子可以使用，因为这些氨基酸相对来说对肽的结构影响都不大，可以使每个肽都能与细胞靶分子相互作用，限制了低聚物的肽与肽之间的结构干扰。应当理解的是除氨基酸之外的连接子也可用于构建肽低聚物。

肽在结构上还可以是强迫的形式，如约9-50个氨基酸、通常是12-36个氨基酸的环状肽，其中除特殊氨基酸之外都可以作为连接桥而存在。因此，在末端添加半胱氨酸可以形成二硫化物连接桥生成环状肽。在某些情况下，人们可以利用氨基酸之外的物质使肽形成环状。形成环的其他方法描述于Chen，S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5872-5876(1992)；Wu，T.P.等，Protein Engineering6：471-478(1993)；Anwer，M.K.等，Int.J.Pep.Protein Res.36：392-399(1990)和Rivera-Baeza，C.等，Neuropeptides 30：327-333(1996)；所有文献都已纳入本文作为参考。另外，结构上是强迫形式的肽也可用通过在肽的N末端或C末端添加二聚化的序列来实现，其中二聚化序列之间的相互作用导致了肽环状结构的形成(见WO/0166565，本文已纳入作为参考)。在另外的例子中，本发明的肽与其他蛋白形成融合蛋白，其他蛋白作为一个脚手架呈现在暴露结构的表面，如卷曲螺旋环或β-转角结构。

根据其使用目的不同，特别是给予哺乳动物宿主时，本发明的肽可以通过连接其他化合物加以修饰以掺入载体分子、改变肽的生物利用度、延长或缩短肽的半衰期、控制肽在各种组织或血流中的分布、减少或增加肽与血液成分的结合等。本发明的肽可以通过连接子与其他成分结合，连接子在生理环境中，如血液、脑脊液、消化液等环境中可被裂解或不被裂解。可以在存在功能基团的肽的任何位点上进行连接，如羟基、巯醇、羧基、氨基等。但是，修饰最好在N端或C端进行。例如，本发明的肽可以通过共价连接聚合物加以修饰，如聚乙二醇、聚丙烯二醇、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷、聚脯氨酸、聚(二乙烯-乙醚-共-马来酐)(poly(divinyl-ether-co-maleic anhydride))、聚(苯乙烯-共-马来酐)(poly(styrene-c-maleic anhydride))等。已知水溶性的聚合物如聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷可以降低其连接的化合物从血流中清楚的速率。修饰也可以增加化合物在水性介质中的溶解度、降低肽的聚集。

6.3肽连接物和融合蛋白

在另一方面，肽优选与小分子连接以便于肽的检测和分离，以及便于寡肽靶向到或运输到特定的细胞、组织和器官。小分子连接物包括半抗原，半抗原自身进入动物体内后并不能激发免疫反应。一般来说，半抗原是分子量低于约2kD，优选的是低于约1kD的小分子。半抗原包括有机小分子(如对硝基苯酚、地高辛、海洛因、可卡因、吗啡、三甲氧苯乙胺、麦角酸、四氢大麻酚、大麻酚、类固醇、戊双眯、生物素等)。为了便于检测或纯化，半抗原可以通过与半抗原特异性的抗体或特异性的结合伴侣如可结合半抗原的亲和素结合。

可以使结合物靶向到特定细胞或组织的小分子也可以使用。已知生物素-亲和素复合物的存在可提高经过这种修饰的肽穿过内皮细胞的能力。肽与碳水化合物基序的连接可增强糖苷衍生物通过葡萄糖转运子转移的速度，例如与通过寡肽上的丝氨酸残基与β-糖苷结合形成β-O连接糖苷(Polt，R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：7144-7118(1994)；Oh等，“药物运输与靶向性”(Drug Transport and targeting)收录在《膜转运子作为药物靶位》(Membrane Transporters as Drug Targets)，59-88(Amidon，G.L和Sadee，W.编辑)，Plenum Press，New York，(1999)。这两种类型的修饰都包括在本发明的范围之内。

寡肽可连接上各种标记基序，如放射性标记物和荧光标记物以便于检测和示踪。荧光标记物包括而不限于荧光素、伊红、Alexa Fluor、俄勒冈绿(Oregon Green)、罗丹明绿、四甲基罗丹明、罗丹明红、得克萨斯红、香豆素和NBD荧光分子、QSY 7、dabcyl和dabsyl发色团、BIODIPY、Cy⁵等。

一方面，为了各种目的肽可以连接各种各样的其他肽或蛋白。肽与其他肽或蛋白的连接可以是为了提高结合功能，如氨基用于形成酰胺或取代氨基，如还原氨化作用；巯基用于形成巯醚或二硫化物；羧基用于形成酰胺等。特别有用的是至少含有2个赖氨酸、通常是3个赖氨酸，但最多不超过约60个赖氨酸的肽，尤其是具有约4到20、通常是6到18个赖氨酸单位、被称为多抗原肽系统(MAPS)的多聚赖氨酸，其中本发明的肽可以结合到赖氨酸的氨基上，一般至少约有20％、通常至少有约50％的氨基可以被结合，形成多肽产物(Butz，S.等，Pept.Res.7：20-23(1994))。利用这种方法可以得到一个本发明的肽聚合物，其中肽的方向一致；实际上，这种连接基团可以提供尾对尾的二聚化或寡聚化。

另一方面，也可以用其他天然或合成肽和蛋白作为载体免疫原来制备本发明肽的抗体，其中抗体可作为试剂用于检测寡肽或鉴定具有相似构型的其他肽。适于制备抗体的载体包括血蓝蛋白(如匙孔戚血蓝蛋白-KLH)；白蛋白(如牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白等)；免疫球蛋白；甲状腺球蛋白(如牛甲状腺球蛋白)；毒素(如白喉类毒素、破伤风类毒素)；以及多肽如多聚赖氨酸或多聚丙氨酸-赖氨酸。虽然蛋白质是优选的载体，但是其他载体，尤其是高分子量的化合物也可以使用，如足够长、免疫原性足够强的碳水化合物、多糖、脂多糖、核酸等。另外，所得到的抗体可用于制备抗独特型抗体，抗独特型抗体可与本发明的肽竞争结合靶位点。这些抗独特型抗体可用于鉴定能与本发明的肽结合的蛋白质。

另一方面，肽可以与其他肽或蛋白连接使寡肽能靶向到细胞和组织，或者为肽增加其他的功能。为了达到靶向的目的，用于连接的蛋白或肽要根据需要靶向治疗的细胞或组织来选择(Lee，R.等，Arthritis.Rheum.46：2109-2120(2002)；Pasqualini，R.，Q.J.Nucl.Med.43：159-62(1999)；Pasgualini，R.，Nature 380：364-366(1996)；本文已纳入作为参考)。蛋白质还可以是多聚氨基酸，其中包括而不限于多聚精氨酸、多聚赖氨酸和多聚天冬氨酸等，这些聚合物可以掺入到其他聚合物如聚乙二醇中以制备载体或含连接肽的颗粒。

另一方面，本发明的肽可以作为多肽链的一部分和其他肽或蛋白一起表达，位于多肽链的内部或位于N端或C端形成嵌合蛋白或融合蛋白。本文的术语“融合多肽”、“融合蛋白”或“嵌合蛋白”是指由多个蛋白成分组成的蛋白质，一般以天然状态相连接，由一个肽连接子通过各自的氨基或羧基末端相互连接形成一个连续的多肽。多个蛋白成分是指至少两个成分，在优选实施方式中一般是指3到12个成分，但是也可以更多。优选的是蛋白成分直接相连接或者通过肽连接子/垫片相连接，如下面所提到的。

融合多肽可以被制备成各种肽或蛋白从而以构型限制的形式展示本发明的寡肽，达到靶向到细胞和组织、靶向到细胞内区域、示踪细胞或有机体内的融合蛋白以及筛选能结合寡肽的其他分子的目的。用于制备融合蛋白的蛋白质包括各种报告蛋白、结构蛋白、细胞表面受体、受体配基、毒素和酶。典型的蛋白包括荧光素蛋白(如水母(Aequoria Victoria)GFP、海肾(Renilla reniformis)GFP、Renilla muelleri GFP、荧光素酶等，及其突变株)；β半乳糖苷酶；碱性磷酸酶；大肠杆菌麦芽糖结合蛋白；丝状噬菌体的包被蛋白(如微小包被蛋白pIII或主要包被蛋白pVIII，用于噬菌体展示)；T细胞受体；卡律(布德)蝎毒素等。

融合蛋白还可以是与蛋白片段、或者单独的或作为大蛋白序列一部分的其他肽融合。因此，融合多肽包括融合伴侣。“融合伴侣”用于本文中是指与肽相关的序列，其中的肽可以赋予蛋白的所有成员相同的功能或活性。融合伴侣可以是异源的(即对于宿主细胞来说不是天然的)或合成的(即对任何细胞来说都不是天然的)。融合伴侣包括而不限于a)呈递结构(presentation sctructure)，赋予寡肽以构型限制或稳定的形式；b)靶向序列，使肽定位到亚细胞区域或细胞外区域；c)稳定序列，影响肽的稳定性或者保护肽或其编码核酸不被降解；d)连接序列，使寡肽与融合伴侣在构型上相区分；以及e)上述序列的任意组合。

融合伴侣一方面是呈递结构。“呈递结构”用于本文中是指一个序列与本发明的肽融合时可以赋予该肽以构型限制的形式。优选的呈递结构可以通过使肽在溶剂中暴露外表面如环而增强肽与其他结合伴侣的相互作用。一般来说，这种呈递结构包含与寡肽N端连接的第一部分和与寡肽C端连接的第二部分。就是说本发明的肽被插入到呈递结构中。优选的呈递结构选择或被设计成在靶细胞内表达时具有很低的生物活性。

优选的呈递结构对肽的易接近性最大，可以展示或呈递肽或外环。合适的呈递结构包括而不限于卷曲螺旋主干结构、小体结构、β-转角上的环、二聚化结构、半胱氨酸连接结构、谷氨酰胺转移酶连接结构、环形肽、螺旋栅、亮氨酸拉链基序等。

在一个实施方式中，呈递结构是卷曲螺旋结构，可使本发明的肽被呈递到外环上(Myszka，D.G.等，Biochemistry 33：2363-2373(1994))，如卷曲螺旋亮氨酸拉链结构域(Martin，F.等，EMBO J.13：5303-5309(1994))。呈递结构还包括小体结构，主要由小抗体补体区组成。一般来说，小体结构沿着折叠蛋白三级结构的一个面上可以提供两个被呈递的肽区(Bianchi，E.等，J.Mol.Biol.236：649-659(1994)；Tramontano，A.等，J.Mol.Recognit.7：9-24(1994))。

另一方面，呈递结构包含两个二聚化序列。两个二聚化序列可以是相同的，也可以是不同的，二者在生理条件下以足够的亲和力彼此非共价相连，使被展示的肽维持结构上的强迫性。因此，如果寡肽的两个末端都有一个二聚化序列，那么所得到的结构就可以使本发明的肽展示限制性的结构或以强迫的形式存在。许多序列都适于作为二聚化序列(见WO 99/51625；本文已纳入作为参考)。本领域熟知的许多蛋白-蛋白相互作用序列都可用于此目的。

在另一个方面，呈递序列可赋予肽结合金属离子的能力，从而产生出一种构型限制性的二级结构。例如C2H2锌指序列。C2H2序列含有两个半胱氨酸和两个组氨酸，锌离子嵌合其中。已知在多种锌指肽中锌指结构域都可以独立地形成，成为一个结构独立的、易弯曲的连接结构域(Nakaseko，Y.等，J.Mol.Biol.228：619-636(1992))。常见的共有序列是(5个氨基酸)-C-(2-3个氨基酸)-C-(4-12氨基酸)-H-(3个氨基酸)-H-(5个氨基酸)。优选的例子是-FQCEEC-3到20个氨基酸的随机肽-HIRSHTG。同样，也可以使用具有共有序列-C-(2个氨基酸)-C-(4到20随机肽)-H-(4个氨基酸)-C-的CCHC盒(Bavoso，A.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.242：385-389(1998))。其他的例子包括(1)-VKCFNC-4到20个随机氨基酸-HTARNCR-，来源于核外壳蛋白P2；(2)经修饰的来源于Lasp-1 LIM结构域的天然锌结合肽序列(Hammarstrom，A.等，Biochemistry 35：12723-32(1996))；以及(3)-MNPNCARCG-4到20个随机氨基酸-HKACF-，基于NMR结构体系1ZFP(Hammarstrom等，同上)。

在本发明的另一个方面，呈递结构是含有两个或多个半胱氨酸残基的序列，这样就可以形成二硫键来维持构型的强迫性。也就是说寡肽的两个末端各有一个含半胱氨酸的肽序列，从而形成如上所述的环形肽。环形结构可以降低被呈递的肽对蛋白水解的敏感性，提高其接近靶分子的能力。本领域的技术人员认为这个特殊的实施方式在使用分泌靶序列引导肽分泌到细胞外时尤其适用。另外，可被蛋白酶如基质金属蛋白酶(如MMP-2或明胶酶A、MMP-9或明胶酶B、MMP-7或基质溶解因子)识别和裂解的序列也可以使用。这些残基可用于形成环形肽以延长肽的半衰期或提高其透过膜的能力。环形肽随后在目的部位被适当的蛋白酶裂解释放出有活性的线性肽。

在其他的实施方式中，融合伴侣是靶向性序列。靶向性序列包含能使表达的产物与预定的分子或一类分子结合同时能保持表达产物生物活性的结合序列；能提供信号特异性降解融合蛋白或结合伴侣的序列；以及能使肽定位到预定细胞部位的序列。典型的细胞定位包括亚细胞定位(如高尔基体、内质网、核、核膜、线粒体、分泌小泡、溶酶体)及通过分泌信号序列定位到细胞外。

本领域已经发现许多靶向性序列。靶向到细胞核可通过使用核定位信号(NLS)来达到。一般来说，NLS是短的带正电荷的结构域，可以引导蛋白定位到细胞核内。典型的NLS序列包括SV40大T抗原的单碱性NLS(Kalderon，D.等，Cell 39：499-509(1984))；人视黄酸受体β核定位信号(NF-κB p50和p65(Ghosh，S.等，Cell 62：1019-1029(1990))；Nolan，G.等，Cell 64：961-999(1991))；以及双碱性的NLS，如核质蛋白(Dingwall，C.等，J.Cell Biol.107：841-849(1988))。

另一方面，靶向性序列可以是膜锚定序列。肽通过信号序列达到膜上后可以通过一个疏水性的跨膜区(被命名为TM)稳定地插入到膜上。在表达的融合蛋白合适位置上的TM可以使肽展示于胞内或胞外，这是本领域所熟知的。膜锚定序列和信号序列包括而不限于那些来源于如下蛋白的序列：(a)I类整合膜蛋白如IL-2受体β链(Hatakeyama，M.等，Science 244：551-556(1989))和胰岛素受体β链(Hetakeyama等，同上)；(b)II类整合膜蛋白如神经内肽酶(Malfroy，B.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.144：59-66(1987))；以及(c)III型蛋白如人细胞色素P450 NF25(Hetakeyama等，同上)；以及来源于CD8、ICAM-2、IL-8R和LFA-1的序列。

膜锚定序列还包括GPI锚定子，GPI锚定子与脂双层之间可通过糖苷基-磷脂酰肌醇形成共价键。GPI锚定子序列见于各种蛋白，其中包括Thy-l和DAF(Homans，S.W.等，Nature 333：269-272(1988))。同样，酰化序列也可用于将肽锚定于脂质上，如异戊二烯化作用(即法呢酰基和香叶酰基-香叶酰基；见Farnsworth，C.C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：11963-11967(1994)和Aronheim，A.等，Cell 78：949-61(1994))，豆蔻酰化作用(Stickney，J.T.Methods Enzymol.332：64-77(2001))或棕榈酰化作用。一方面，本发明的肽可以一个末端结合到脂质基团上，因此肽能够与脂质膜如脂质体相结合。

其他细胞内靶向性序列包括溶酶体靶向性序列(如LAMP-1和LAMP-2上的序列；Uthayakumar，S.等，Cell Mol.Biol.Res.41：405-420(1995)和Konecki，D.S.等，Biochem.Biophys.Res.Comm.205：1-5(1994))；线粒体定位序列(如线粒体基质序列，线粒体内膜序列，线粒体中间膜序列或线粒体外膜序列；Shatz，G.，Eur.J.Biochem.165：1-6(1987))；内质网定位序列(如钙网蛋白，Pelham，H.R.Royal Soc.LondonTransactions B：1-10(1992)；腺病毒E3/19K蛋白，Jackson，M.R.等，EMBO J.9：3153-3162(1990))；以及过氧化物酶体定位序列(如荧光素酶过氧化物酶体基质序列，Keller，G.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 4：3264-3268(1987))。

另一方面，靶向性序列是可影响肽分泌的分泌信号序列。已知许多分泌信号序列连接到目的肽氨基端时都可以引导肽分泌到细胞外，特别适用于细胞分泌的肽，其中包括移植的细胞。适宜的分泌信号包括IL-2的分泌信号(Villinger，F.等，J.Immuno.155：3946-3954(1995))、生长激素的分泌信号(Roskam，W.G.等，NucleicAcids Res.7：305-320(1979))、前胰岛素原和流感病毒HA蛋白的分泌信号。

融合伴侣还包括稳定序列，它可以增加融合蛋白及其编码核酸的稳定性。例如，在起始氨基酸蛋氨酸之后插入甘氨酸(如MG或MGG)可稳定融合肽或保护融合肽不因Varshavsky N端法则而通过泛素化作用被降解，因此可延长融合肽在细胞内的半衰期。

在肽上还可以添加氨基酸作为标记以利于检测或纯化。这些序列包括可被抗体识别的表位或可结合配基如金属离子的序列。许多标记序列和配基结合序列都是本领域所熟知的。其中包括而不限于多聚组氨酸(如6×His标记，该标记可被抗体识别，并且能结合二价金属离子)；多聚组氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)标记；流感病毒HA标记多肽；c-myc标记；Flag肽(Hopp等，BioTechnology 6：1204-1210(1988))；KT3表位；微管蛋白表位(Skinner等，J.Biol.Chem.266：15163-12166(1991))；以及T7基因10蛋白肽标记(Lutz-Freyermuth等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：6363-6397(1990))。

融合伴侣包括用于连接肽并以自由的结构呈递肽的连接子或系链序列。如上面所描述，适用的连接子包括甘氨酸聚合物(G)n，其中n约等于7，甘氨酸-丝氨酸聚合物(如(GS)n，(GSGGS)n和(GGGS)n，其中n至少等于1)，甘氨酸-丙氨酸聚合物，丙氨酸-丝氨酸聚合物以及本领域已知的其他易弯曲的连接子。优选的连接子是甘氨酸聚合物或甘氨酸-丝氨酸聚合物，因为这些氨基酸对结构的影响相对较小，并且是亲水性的，可有效地连接蛋白和肽的片段。

在本发明中，还可以使用融合伴侣的各种组合物。任意数目的呈递结构、靶向性序列、救援序列、标记序列和稳定序列的组合都可以使用，带有或者不带连接子序列。

6.4肽的制备及其盐

RDP58寡肽可用各种方法制备。肽的化学合成是本领域所熟知的。固相合成是常用的方法，现在已经有多种商业化的合成装置，如Applied Biosystems Inc.，FosterCity，CA、Beckman等公司的自动合成仪。利用这些标准的技术，天然氨基酸可被非天然氨基酸取代，特别是D立体异构体，以及用带有不同长度和不同功能的侧链的氨基酸取代。用于连接小分子、标记基序、肽或蛋白的功能基团，或者用于形成环形肽的功能基团可在化学合成过程中引入到分子内。另外，小分子和标记基序也可在合成过程中连接到肽上。所引入的功能基团以及与其他分子的连接最好对目的肽的结构和功能的影响达到最小。

本发明的肽还可以盐的形式存在，一般是以药学上可接受的盐的形式存在。其中包括无机钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐等。也可以是肽的各种有机酸的盐，其中包括而不限于乙酸盐、丙酸盐、丙酮酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、肉桂酸盐、水杨酸盐等。

寡肽及其衍生物还可以通过重组技术合成。利用重组技术合成肽时，需要制备编码单链寡肽的核酸序列，但是最好是制备编码一组肽的核酸序列，其中的肽串联在一起，肽与肽之间由间隔氨基酸或序列隔开，这些间隔氨基酸或序列用于裂解单个肽或者形成头对尾的二聚物。如果肽链中没有蛋氨酸或色氨酸，可以插入间隔蛋氨酸或色氨酸，这样分别采用CNBr或BNPS-甲基吲哚(2-(2-硝基苯基硫酰基)-3-甲基-3-溴假吲哚(BNPS-Skatole(2-(2-nitrophenylsulfenyl)-3-methyl-3-bromoindolenine)就可以裂解单个氨基酸。另外，还可以插入能被特异性蛋白酶识别的序列通过酶催化裂解，或者插入具有自身裂解活性的序列(如apthoviruse和心肌病毒的2A序列；Donnelly，M.L.，J.Gen.Virol.78：13-21(1997)；Donnelly，M.L.，J.Gen.Virol.82：1027-41(2001)，本文已纳入作为参考)。本发明的肽还可以作为较大肽的一部分来制备，分离出来后通过蛋白酶裂解或化学裂解获得寡肽。特定序列及其制备方法根据简单、经济的原则及所需要的纯度等因素来确定。为了制备这些组合物，将编码特定肽、蛋白或融合蛋白的基因与编码本发明的寡肽的DNA序列连接起来，然后导入到表达载体内。融合核酸在适宜启动子和其他调控序列的控制下表达，这些调控序列在下文中有描述，表达是在特定的宿主细胞或宿主生物体内进行(Sambrook等，Molecular Biology：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborPress，Cold Spring Harbor，N.Y.(第三版，2001)；Ausubel，F.等，Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，NY，(更新到2002)(1988)；本文已纳入作为参考)。

为了使各种分子与本发明的肽相连接，寡肽上的功能基团与其他分子在存在适当连接试剂(交联试剂)的条件下反应。选择何种连接试剂或交联试剂要根据功能基团而定，如伯胺基、巯基、羰基、碳水化合物和羧酸。试剂可以是固定剂和交联剂，可以是同源双功能交联剂、异源双功能交联剂或三功能交联剂(Pierce Endogen，Chicago，IL)。常用的固定剂和交联剂包括甲醛、戊二醛、1，1-二(叠氮乙酰基)-2-苯乙烷、N-羟基琥珀酰亚胺醚、双琥珀酰亚胺醚、马来酰亚胺(如双-N-马来酰亚胺-1-8-辛烷)和碳化二亚胺(如N-乙基-N’-(3-二甲基丙氨基)-碳化二亚胺)、二环己基碳化二亚胺。含有2-20个碳原子长度烷基或取代烷基侧链的占位分子可用于将连接物隔开。在肽与其他活波分子连接前寡肽上不进行修饰的活波功能基团最好保护起来以避免发生不需要的副反应。“保护基”用于本文中是指可与特定功能基团结合的并且可以被选择性地去掉从新暴露功能基团的分子(Greene，T.W.and Wuts，P.G.M.《有机合成中的保护基》(Protective Groups in Organic Synthesis)，John Wiley& Sons，Inc.，New York(第三版，1999))。肽可以用被保护的氨基酸前体合成，或者在合成之后而在与交联剂反应之前与保护基反应。连接还可以是间接连接，例如通过连接一个生物素基序，生物素基序再与偶联链亲和素或亲和素的化合物或分子连接。

对于那些连接形式的活性会降低的寡肽来说，寡肽与其连接化合物之间的连接应选择有足够易变性的连接，这样在预期的条件下就可以被裂解，例如转移到目的细胞或组织内时。生物易变性共价键如亚氨键和醚都是本领域熟知的(见美国专利No.5,108,921，本文已纳入作为参考)。这些修饰可以使寡肽在给药时以低活性的形式存在，而到体内后就可以通过易变性共价键的裂解而活化。

6.5核酸，表达载体和导入方法

如果利用编码肽的核酸来合成或转运寡肽，那么就需要将核酸克隆到表达载体内，然后再导入到细胞或宿主内。表达载体可以是自我复制型的染色体外的载体，也可以是可整合到宿主染色体上的载体，例如逆转录病毒来源的载体，具有位点特异性重组序列或可以进行同源重组的载体。一般来说，这些载体都包含调控序列，调控序列与编码寡肽的核酸相连。“调控序列”是指目的肽在特定宿主体内表达所必需的核酸序列。因此，调控序列包括核酸转录和翻译所需要的序列，这些序列包括而不限于启动子序列、增强子或转录活化序列、核糖体结合位点、转录起始序列和终止序列、多聚腺苷酸信号等。

许多启动子都可用于表达本发明的肽。启动子可以是组成的、可诱导的和/或细胞特异性的，可以是天然启动子、合成的启动子(如tTA四环素可诱导启动子)或不同启动子的杂合子。要根据表达蛋白所需要的宿主细胞或宿主生物、需要表达的水平以及表达的调节等因素来选择启动子。适宜的启动子有细菌启动子(如pLI噬菌体启动子、tac启动子、lac启动子等)、酵母来源的启动子(如GAL4启动子、乙醇脱氢酶启动子、色氨酸合成酶启动子、铜可诱导CUPI启动子等)、植物启动子(如CaMVS35、胭脂氨酸(nopoline)合成酶启动子、烟草花叶病毒启动子等)、昆虫启动子(如Autographa核多角体病毒、Aedes DNV病毒p&和p61、hsp70等)和可在哺乳动物细胞内表达的启动子(如泛素基因启动子、核糖体基因启动子、β球蛋白启动子、胸苷激酶启动子、热休克蛋白启动子和核糖体基因启动子等)，以及特殊的病毒启动子，如巨细胞病毒(CMV)启动子、猿病毒(SV40)启动子和逆转录病毒启动子。

本文中的术语“可操作的连接”是指核酸与其他核酸建立功能的关系。按照这种定义，可操作的连接意味着调控序列放置的位置相对于编码肽的核酸序列来说是可以使其编码的肽被表达的方式。如果细胞是可分裂的细胞，可以用质粒和病毒载体作为转移系统，如逆转录病毒载体，如果细胞是非分裂细胞，就要用慢病毒载体或腺病毒载体作为转移系统。特别优选的是可自身灭活的逆转录病毒载体(SIN载体)，其3’-LTR位置有灭活的病毒启动子，因此可以通过将非病毒启动子插入到病毒载体内来控制外源基因的表达(见Hofmann，A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：5185-5190(1996))。通过赋予载体假型来修饰载体系统从而使逆转录病毒适用于所有的真核细胞，特别是高等生物的真核细胞将是本领域技术人员所期望的(Morgan，R.A.等，J.Virol.67：4712-4721(1993)；Yang，Y.等，Hum.Gene Ther.6：1203-1213(1995))。

另外，表达载体还可以包含筛选标记基因以便于筛选转化的宿主细胞。一般来说，通过一种可检测的表型来筛选可以富集含有表达载体的细胞，还可以区分表达和不表达筛选基因的细胞。筛选基因是本领域所熟知的，根据宿主细胞的不同可以选择不同的筛选基因。适宜的筛选基因包括赋予细胞耐药性的基因、使细胞能够在营养缺陷的培养基中生长的基因以及报告基因(如β半乳糖苷酶、荧光蛋白、葡糖醛酸酶等)。所有这些都是本领域熟知的，也是本领域技术人员能够获得的。

有许多方法可用于将核酸导入到活细胞内。“导入”用于本文中是指核酸以适于其随后表达的方式进入到细胞内。选择何种导入技术要根据核酸是在体外被转移到培养的细胞内还是在体内被转移到目的宿主生物的细胞内以及宿主生物的种类而定。体外导入核酸的典型方法包括脂质体、Lipofectin^、电穿孔、微注射、细胞融合、二乙氨乙基葡聚糖、钙磷酸盐沉淀和生物射弹颗粒射击法。体内转移技术包括直接导入核酸、利用病毒载体，一般是用逆转录病毒载体以及脂质体介导的转染，如包被病毒的脂质体介导的转染。表达本发明的肽的核酸可在胞浆内瞬时存在或稳定存在，或者稳定整合到宿主的染色体上(即通过使用标准的调节序列、筛选标记等)。适宜的筛选基因和标记基因可用于本发明的表达载体内。

在某些情况下，需要使用一些能靶向到靶细胞或靶组织的因子，如细胞表面蛋白或靶细胞特异性的抗体、靶细胞上受体的配基、细胞膜上的脂质成分或细胞表面的糖类。如果用脂质体进行转导，那么可以使用能与细胞表面具有内吞作用的蛋白相结合的蛋白来达到靶向性和/或促进摄取的目的。这些蛋白包括而不限于对特定类型的细胞具有亲嗜性的外壳蛋白或其片段、能产生内化作用的蛋白的抗体(Wu，G.Y.等，J.Biol.Chem.262：4429-4432(1987)；Wagner，E.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：3410-3414(1990))、或者能够延长其半衰期的蛋白。

从原核到真核的多种宿主细胞都可用于表达，其中包括细菌、酵母、植物、昆虫和动物。本发明的寡肽可在大肠杆菌、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、烟草或阿拉伯芥、昆虫Schneider细胞以及哺乳动物细胞，如COS、CHO、HeLa等内表达，表达的蛋白可以是细胞内的，也可以是肽和适当信号肽融合的分泌形式的蛋白。使编码寡肽的DNA与编码信号肽的DNA融合可以产生分泌型的蛋白。细菌、酵母、昆虫、植物和哺乳动物表达系统的分泌信号是本领域熟知的。表达寡肽的核酸还可以被插入到细胞内，例如干细胞内以获得组织表达，或者插入到细菌内以获得在肠道内的表达，还可以将细胞移植到宿主内提供体内的寡肽表达源。

6.6纯化肽

在一个优选实施方式中，本发明的寡肽在合成或表达后需要被纯化或分离出来。“纯化”或“分离”是指将肽从其合成或表达的环境中游离出来，形成实际可使用的形式。因此纯化的或分离的肽是指肽或其衍生物实质上是纯的，即纯度超过90％、优选的是超过95％、更优选的是超过99％。寡肽及其衍生物的纯化和分离方法是本领域所熟知的，具体选择何种方法要根据样品中存在的其他成分而定。标准的纯化方法包括电泳技术、免疫学技术和色谱技术，其中包括离子交换、疏水层析、亲和层析、分子排阻层析、反相HPLC和层析聚焦。还可以根据蛋白的溶解度不同来纯化，例如根据在盐或有机溶剂中的不同溶解度。需要纯化的程度根据寡肽的用途不同而不同，在某些情况下根本不需要进行纯化。

大多数情况下，相对于制备方法、纯化方法及其期望的用途，如加入药学上可接受的载体用于治疗而产生的杂质来说，所使用的组合物至少含有重量比占20％的目的产物，更常见的是至少约占75％，优选的是至少约占95％，通常是至少约占99.5％。通常来说，所说的百分比是指占总蛋白的百分比。

6.7药学上可接受的组合物

根据用途的不同，本发明的组合物可单独或与其他药物联合在体外或体内使用。相应的，本发明涉及给予药学上可接受的组合物的方法，该组合物含有药学上可接受的载体和药物有效量的一种或多种本发明的肽或其适当的盐。药学上可接受的组合物可以制备成粉末、颗粒、溶液、悬液、气溶胶、固体、丸剂、片剂、胶囊、凝胶、局部用乳膏、栓剂、透皮贴(如通过透皮的离子等渗作用)等。

如上所述，肽的药学上可接受的盐可以是本领域所熟知的任何药学上可接受的盐，其中包括有机和无机酸和/或碱。盐的例子有钠盐、钾盐、锂盐、氨盐、钙盐以及伯、仲和叔胺、短链醚，如甲醚、乙醚和丙醚。其他的盐包括有机酸形成的盐，如乙酸、丙酸、丙酮酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、水杨酸等。

本文所用的术语“药学上可接受的载体”包括本领域技术人员所熟知的用于制备药学上可接受的组合物制剂的任何标准的药学上可接受的载体。因此，本发明的肽自身，如以药学上可接受的盐或结合物的形式存在，或者编码该肽的核酸都可以用药学上可接受的稀释剂，如盐水、磷酸盐缓冲液(PBS)、水乙醇或葡萄糖溶液、D-甘露醇、葡聚糖、丙二醇、油(如蔬菜油、动物油、合成油等)、微晶纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、硬脂酸镁、磷酸钙、明胶、吐温80等制备成制剂，或者用适当的赋形剂制备成固体制剂。制剂内可以包含抗菌药、稳定剂、缓冲剂、乳化剂、防腐剂、甜味剂、润滑剂等。如果通过口服途径给药，寡肽需要使用适宜的肠衣或其他适宜的保护措施，如置于聚合物基质如微离子或pH敏感性水凝胶内来避免其被降解。

适宜的制剂见于《Remington制药学》(Remington’s Pharmaceutical Seiences)，Mack Publishing Co.，Philadelphia，PA(第17版，1985)和《药学上可接受的赋形剂手册》(Handbook of Pharmceutical Excipients)，第三版，Washington DC，美国药学协会(American Pharmaceutical Association)(Kibbe，A.H.编辑，2000)的描述，本文已完整纳入作为参考。本文所描述的药学上可接受的组合物可用本领域技术人员熟知的方法制备(如通过本领域的常规方法，其中包括而不限于混合、溶解、粉碎、打磨、乳化、包裹、内陷或冻干过程)。

另外，肽还可以装入或包裹到脂质体的腔内进行转移以延长肽在体外或体内的存活时间。如本领域所熟知的，脂质体可分为如下几类：多层载体(MLV)、稳定的多层载体(SPLV)、小单层载体(SUV)和大单层载体(LUV)。可以用各种脂质化合物制备脂质体，脂质化合物可以是合成的，也可以是天然的，其中包括磷脂酰醚和磷脂酰酯，如磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱；类固醇如胆固醇；脑苷脂；鞘磷脂；甘油脂以及其他脂质(见美国专利No.5,833,948)。

阳离子脂质也适于制备脂质体。阳离子脂质通常带正电荷，带有亲脂成分，如固醇或酰基、二酰基侧链。头部的基团优选带正电荷的。典型的阳离子脂质包括1，2-二油氧酰-3-(三甲基氨基)丙烷；N-[1-(2，3，-二四去环氧)丙基]-N，N-二甲基-N-N-羟基乙基溴化铵；N-[1-(2，3-二油氧酰)丙基]-N，N-二甲基-N-羟基乙基溴化铵；N-[1-(2，3-二油氧酰)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵；3-[N-(N’，N’-二甲基氨基乙烷)氨甲酰]胆固醇；以及二甲基二十八烷基酰铵。

特别让人感兴趣的是融合脂质体，该脂质体在生理条件下经适当变化或者如果存在融合成分，尤其是融合肽或蛋白就能够与细胞膜融合。一方面，融合脂质体是pH和温度敏感性的，因此它与细胞膜的融合受温度和/或pH变化的影响(见美国专利No.4,789,633和4,873,089)。一般来说，pH敏感性的脂质体对酸敏感。因此，中等酸度的生理环境，如溶酶体、核内体和炎症组织的环境会促进融合。这个特性可使脂质体内含物在脂质体发生内吞作用后直接释放到细胞内环境中(Mizoue，T.，Int.J.Pharm.237：129-137(2002))。

另一种形式的融合脂质体包括含有融合促进剂的脂质体。也就是说，这种融合促进剂被掺入到脂质体或粘附到脂质上时就可以促进脂质体与其他细胞膜的融合，从而使脂质体内含物进入到细胞内。融合促进剂可以是具有促进融合作用的肽或蛋白，其中包括流感病毒的血球凝集素HA2(Schoen，P.，Gene Ther.6：823-832(1999))；仙台病毒包膜糖蛋白(Mizuguchi，H.，Biochem.Biophys.Res.Commun.218：402-407(1996))；水泡性口炎病毒包膜糖蛋白(VSV-G)(Abe，A.等，J Virol.72：6159-63(1998))；融合促进蛋白的肽片段或模拟物；以及合成的融合促进肽(Kono，K.等，Biochim.Biophys.Ada.1164：81-90(1993)；Pecheur，E.I.，Biochemistry 37：2361-71(1998)；U.S.Patent No.6,372,720)。

脂质体还包括亲水性聚合物衍生的载体，如美国专利No.5,013,556和5,395,619所描述，本文已纳入作为参考(另见Kono，K.等，J.Controlled  Release 68：225-35(2000)；Zalipsky，S.等，Bioconjug.Chem.6：705-708(1995))，这种脂质体可延长内含物在体内的循环半衰期。可用于包被或衍生脂质体的亲水性聚合物有聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯甲酯、聚天冬酰胺、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素等。另外，如上面所描述，那些能与细胞表面具有内吞作用的蛋白结合的粘附蛋白，如对特定类型的细胞具有亲嗜性的外壳蛋白或其片段以及细胞表面能发生内化作用的蛋白的抗体都可用于使脂质体靶向到特定的细胞或组织，或者促进特定的细胞或组织摄取脂质体。

脂质体可用本领域所熟知的方式制备(见Szoka，F.等，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9：467-508(1980))。一个经典的方法是脂质膜水合技术，其中先将脂质成分混合到有机溶剂中，然后再蒸发溶剂获得脂质膜。水性缓冲溶液，最好含有本发明的肽或核酸，中膜的水合作用会形成一种乳液，乳液经超声或挤压以降低其中颗粒的直径，提高其分散度。其他的方法包括反向蒸发(见Pidgeon，C.等，Biochemistry26：17-29(1987)；Duzgunes，N.等，Biochim.Biophys.Acta.732：289-99(1983))，磷脂混合物的冻溶和醚输注。

在其他的优选实施方式中，载体可以是能生物降解或不能生物降解的微粒子、微囊、微球和纳米颗粒的形式(见“微包裹：方法和工业应用”(Microencapsulates：Methods and Industrial Applications)，收于《药物和制药学》(Drugs andPharmaceutical Sciences)，37卷，Marcel Dekker Inc.，New York(Benita，S.编辑，1996)；本文已纳入作为参考)。本文中所述的微粒子、微球、微囊和纳米颗粒一般是指含有需被转移物质的固体颗粒。物质位于颗粒的核内或连接到颗粒的聚合物网上。一般来说，微粒子(或微囊、微球)与纳米颗粒之间的差别只是颗粒直径的差别。本文中微粒子的颗粒大小范围约为1-1000微米，纳米颗粒的大小范围约为10-1000nm。

许多材料都可用于制备微粒子。不能生物降解的微囊和微粒子包括而不限于由聚砜、聚(丙烯腈-共-氯乙烯)、乙烯-乙烯乙酸酯、羟乙基甲基丙烯酸酯-甲基-甲基丙烯酸酯共聚物制备的微囊和微粒子。这些微粒子可用于移植，其中包裹的肽可从囊中弥散出来。另一方面，也可以用生物降解的聚合物制备微囊和微粒子，最好用那些低毒的并且可被免疫系统良好耐受的聚合物，其中包括由纤维蛋白、酪蛋白、血清白蛋白、胶原、明胶、卵磷脂、壳聚糖、岩藻酸或多聚氨基酸如多聚赖氨酸制备的蛋白性微囊和微粒子。用于包裹的合成的生物降解聚合物包括聚合物如聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、丙交酯-7交酯共聚物(PLGA)、聚乙酸内酯、聚二氧六环酮环丙烷羧酸酯、聚羟基烷酸酯(如聚(β-羟基丁酸酯))、聚(γ-谷氨酸乙酯)、聚(DTH亚胺甲酰(双酚丙烷A亚胺羧酸酯)、聚(正醚)和聚氰基丙烯酸酯制备的聚合物。用于制备包含本发明的组合物的微粒子的方法是本领域所熟知的，其中包括溶剂去除过程(见美国专利No.4,389,330)；乳化和蒸发(Maysinger，D.等，Exp.Neuro.141：47-56(1996)；Jeffrey，H.等，Pharm.Res.10：362-68(1993))、喷雾干燥和挤出法。

另一种类型的载体是纳米颗粒，一般适用于静脉注射。亚微粒和纳米颗粒通常用本领域熟知的双亲性的双嵌段、三嵌段或多嵌段共聚物制备。用于制备纳米颗粒的聚合物包括而不限于聚乳酸(PLA；见Zambaux等，J.Control Release 60：179-188(1999))、丙交酯-乙交酯共聚物、丙交酯-乙交酯共聚物和polycarprolactone的混合物、双嵌段的聚(I-亮氨酸-嵌段-I-谷氨酸酯)、双嵌段和三嵌段的聚乳酸(PLA)和聚环氧乙烷(PEO)(De Jaeghere，F.等，Pharm.Dev.Technol.，5：473-83(2000))、丙烯酸酯、芳基酰胺、聚苯乙烯等。和微粒子一样，纳米颗粒可以是生物可降解的，也可以是不能被生物降解的。纳米颗粒还可以用聚(烷基氰基丙烯酸酯)制备，如聚(丁基氰基丙烯酸酯)，其中肽被吸附到纳米颗粒上并用表面活性剂包被(如吐温80)。制备纳米颗粒的方法与制备微粒子的方法一样，包括在连续的水相中乳化聚合、乳化-蒸发以及乳化-弥散技术等(见Kreuter，J.“纳米颗粒的制备和应用”(Nano-particle Preparation and Applications)，收于《医学和药学中的微囊和纳米颗粒》(Microcapsules and nanoparticles in medicine and pharmacy)，125-148页，(M.Donbrow编)CRC Press，Boca Rotan，FL(1991)；本文已纳入作为参考)。

水凝胶也可用于将药物转移到宿主内。一般来说，水凝胶是交联的亲水性的聚合物网络，允许多种药物化合物渗透，其中包括肽。水凝胶的优点在于可选择性地触发聚合物膨胀，这样就可以使其中的药物化合物获得控释。根据聚合物网络中组合物的不同，可以选择不同的刺激因素来激发水凝胶的膨胀及随后的释放，如pH、离子强度、加热、电流、超声和酶催化。可用于水凝胶组合物中的聚合物包括而不限于丙交酯-乙交酯共聚物、聚(N-异丙基丙烯酰胺)；聚(甲基丙烯酸-g-聚乙二醇)；聚丙烯酸和聚(氧化丙烯-共-氧化乙烯)甘油；以及天然化合物如chrondroitansulfate、壳聚糖、明胶、纤维蛋白原形成的聚合物，或者合成的聚合物和天然聚合物的混合物，例如壳聚糖-聚氧化乙烯。聚合物通过可逆的或不可逆的交联形成凝胶，其中包埋了本发明的寡肽(见美国专利No.6,451,346；6,410,645；6,432,440；6,395,299；6,361,797；6,333,194；6,297,337；Johnson，O.等，Nature Med.2：795(1996)；本文都已完整纳入作为参考)。

6.8剂量和给药方式

按照常规的程序根据目的的不同可凭经验来确定肽及其编码核酸的浓度。一般来说，用于体外或体内治疗目的的肽应以药物有效量给药。“药物有效量”或“药理有效剂量”是指足以产生所期望的生理效应的量，或者足以达到所期望的结果的量，对于治疗疾病来说，这种效果包括减轻或消除该疾病的一种或多种症状或表现。

给药剂量的选择需要根据药物的种类、给药的目的如治疗还是预防、患者的状况、给药方式、给药次数、给药间隔等因素而定。本领域的技术人员根据经验可以作出判断，并且可以根据治疗后反应的程度加以调整。确定合适剂量时需要考虑的因素包括而不限于患者的身高和体重、患者的年龄和性别、症状的严重程度、疾病的临床阶段、给药方法、药物的半衰期以及药物的活性。需要考虑的疾病阶段包括疾病是急性的还是慢性的、复发期还是缓解期以及疾病的进展状况。本领域的技术人员都了解如何确定治疗有效量的剂量和给药时间。

对于用于本发明的任何化合物来说，其治疗有效剂量都可以通过本领域熟知的方法很容易地确定。例如，可以根据细胞培养试验的结果初步估计起始有效剂量。炎症反应的指标和肽活性的数据也可以使用，如前炎症细胞因子(如TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-12等)的表达水平、CTL活性的抑制、IC疾病标记(如组胺、P物质等)是否出现。然后将这种剂量的药物给予动物模型，测定循环或组织中的药物浓度，其中包括通过细胞培养试验所得到的IC₅₀。

另外，毒性和治疗效应通常用细胞培养试验和/或动物试验来确定，一般来说，毒性和疗效是由LD₅₀(试验群的50％死亡的剂量)和ED₅₀(试验群中50％产生治疗效果的剂量)决定的。毒性和疗效的剂量比就是治疗指数。单独使用或联合使用的组合物优选治疗指数比较高的。如何确定有效量是本领域技术人员所熟知的，特别是阅读了本说明书以后。

一般来说，如果直接给予宿主肽组合物，那么本发明的组合物需要制成丸剂或者进行输液，给药剂量约为每千克体重0.01-50mg，更常用的是约0.1-25mg。根据肽的半衰期可以调整给药剂量，其中半衰期一般至少为1分钟，更常见的是至少约10分钟，希望的范围为约10分钟到12小时。短的半衰期也可以接受，只要单次给药、连续输注或重复给药时能达到预期的效果就可以。给药剂型可以是单位剂量的剂型，如装入安瓿、胶囊、丸剂内，或者是多次剂量，如装入多剂量容器内，或者是可注射的。处于剂量范围较低部分的剂量甚至低剂量也可以使用，例如颗粒型的缓释组合物，其中聚合物基质可使肽的释放维持相当长的时间(如胶原基质、卡波姆等)，或者利用一个泵以恒定的速率在一段时间内持续输注肽，等等。根据不同的给药途径还可以调整给药剂量。因此，如果是系统给药，口服或者静脉注射，剂量要根据生物利用度适当加以调整。宿主或患者可以是任何哺乳动物，其中包括家畜、宠物、试验动物、特别是人。

除了将肽组合物在体外直接给予细胞培养物、特别是体外培养的细胞、或者在体内直接给予哺乳动物宿主以外，还可以给予编码肽的核酸(DNA或RNA)，这样就提供了肽的有效来源。如上所述，编码肽的核酸可以克隆到多种大家所熟知的质粒(Sambrook等，同上)和/或病毒载体内，尤其是腺病毒载体或逆转录病毒载体(见Jacobs等，J.Virol.66：2086-2095(1992)；Lowenstein，Bio/Technology 12：1075-1079(1994)和Berkner，Biotechniques 6：616-624(1988))，核酸置于调控序列的转录控制之下，这些调控序列在合适的环境中就可以促进核酸的表达。这种核酸载体可以在体外直接转导细胞或组织(如在体外用病毒感染细胞，然后再移植这些产生肽的细胞)或者通过注射、导管、口服(如水凝胶)等途径转移到预定的部位，如果是病毒载体则可以进行系统注射。载体内还可以插入组织特异性的启动子，以确保目的肽只在特定的组织或所选择的细胞类型中表达。制备这种核酸载体的重组方法以及注射核酸载体以产生肽的技术都是本领域熟知的。

为了实现本发明，要根据所治疗的疾病、肽和药学上可接受的组合物的剂型来确定给药方法。寡肽可通过多种方式给药，其中包括而不限于皮肤给药、皮下注射、静脉注射、口服、局部给药、透皮给药、腹腔注射、肌肉注射和膀胱内给药。例如，微粒子、微球和微囊适于通过口服、肌肉注射或皮下注射给药。脂质体和纳米颗粒还适于通过静脉注射给药。药学上可接受的组合物可以通过一种途径给药，也可以通过多种途径同时给药，例如，口服给药的同时进行静脉注射或胃肠外注射。

在一个优选实施方式中，给药方式是口服，剂型是粉末、片剂、丸剂或胶囊。口服的药学上可接受的制剂可以通过一种或多种肽与适当的赋形剂混合而制备，如糖(如乳糖、蔗糖、D甘露醇或山梨醇)、纤维素(如淀粉、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羧甲基纤维素等)、明胶、甘氨酸、糖精、碳酸镁、碳酸钙、聚合物如聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮等。丸剂、片剂或胶囊可以包被肠衣，这样就可以使制剂在胃内保持完整而到小肠内溶解。各种肠衣都是本领域熟知的，很多肠衣已经商业化，其中包括而不限于甲基丙烯酸-甲基丙烯酸酯共聚物、纤维素醚聚合物、醋酞纤维素、聚乙烯乙酸酯、羟丙基甲基纤维素苯二甲酸酯等。另外，肽的口服制剂可用合适的稀释剂制备。合适的稀释剂包括各种液态(如糖浆、混悬液、悬浮液等)的水性稀释剂，如水、盐水、磷酸盐缓冲液、含水乙醇、糖(如蔗糖、D甘露醇或山梨醇)溶液、甘油、明胶的水溶液、甲基纤维素、羟甲基纤维、环糊精等。在某些实施方式中，可以使用亲脂性的溶剂，如蔬菜油、花生油、芝麻油、橄榄油、玉米油、红花油、大豆油等；脂肪酸酯如油酸酯、三甘油三酯等；胆固醇衍生物如胆固醇油酸酯、胆固醇十四烷脂肪酸酯等；脂质体等。

在其他的优选实施方式中，通过皮肤、皮下注射、腹腔注射、肌肉注射和静脉注射给药。如上所述，肽是以溶于或悬浮于适当水性介质中的形式存在。另外，注射用的药学上可接受的组合物可用亲脂性的溶剂制备，其中包括而不限于油，如蔬菜油、橄榄油、花生油、棕榈油、大豆油、红花油等；合成的脂肪酸酯，如油酸乙酯或三甘油三酯；胆固醇衍生物，如胆固醇油酸酯、胆固醇亚油酸酯、胆固醇十四烷脂肪酸酯等；或上述的脂质体。组合物可直接用亲脂性溶剂制备，或者制备成油/水乳剂的形式(见Liu，F.等，Pharm.Res.12：1060-1064(1995)；Prankerd，R.J.J.Parent.Sci.Tech.44：139-49(1990)；和美国专利No.5,651,991)。

在一个优选的特殊实施方式中，本发明的组合物通过膀胱内滴注给药。滴注过程通常包括将一个导管插入到尿道内，然后在膀胱内注满含本发明组合物的合适稀释剂。注满膀胱可通过人工输注或肾泵进行。电动药物注射器也有助于膀胱内给药(见Riedl，C.R.等，J.Endourol.12：269-72(1998)；本文已纳入作为参考)。

转运系统还包括持续释放或长期释放方法，这也是本领域技术人员所熟知的。“持续释放”用于本文中是指转移系统转移药理治疗量的化合物的时间超过1天，优选超过1周，最好的是至少约30到60天或更长。长期释放系统包括含肽的可植入固体或凝胶，如上述的生物可降解聚合物(Brown，D.M.等，Anticancer Drugs 7：507-513(1996))；泵，如蠕动移液泵和碳氟化物推进泵；渗透泵和微渗透泵等。蠕动移液泵的每一次开启都可以转移一定量的药物，其储存装置可以被重新注满，优选通过植入皮下的一个接口添加药物。控制装置可以设定给药的剂量，还可以显示已转移的剂量、剩余的剂量以及给药的频率。碳氟化物推进泵利用碳氟化物液体来驱动泵。碳氟化物液体可产生高于大气压的一种蒸气压力使储存槽内的药物释放。渗透泵(和微渗透泵)利用渗透压以恒定的速率释放药物。可以将肽组合物加到可植入的膜内，膜的周围被渗透试剂包裹。半透膜可装入渗透试剂，整个泵置于一个盒子内。通过半透膜弥散出的水挤压含药物的膜，从而推动药物进入血流、器官或组织。这些转移系统以及其他类似的植入物特别适用于治疗症状反复发作的疾病或者不断恶化的疾病，利用这种转移系统可以持续的方式长期地给予系统剂量(静脉或皮下)或局部剂量的本发明的寡肽。

本发明的寡肽还可以制备成试剂盒或包装制剂的形式。本文的试剂盒或包装制剂包括单次或多次剂量的含有一种或多种寡肽及其盐的药学上可接受的组合物，组合物被装入到容器内，可用于治疗特定的疾病。例如，包装盒内可装入肽和药学上可接受的载体的混合粉末，用水溶液溶解后进行注射或膀胱内滴注。包装盒或试剂盒内包括说明书，说明书包括图、资料(如声音资料、影像资料、磁盘)和计算机程序来指导如何使用。

上述对本发明的特殊实施方式的描述是为了说明和描述本发明，这些描述不是穷尽性的，也不意味着将本发明局限于描述的形式上，显然，根据上述的指导原则对本发明作出修改和改变是可能的。

本说明书提到所有文献和专利申请都已纳入本文作为参考，在同样程度上这就好似将各个出版物或专利申请逐一并入本文作为参考。

7.实施例

7.1实施例1：RDP58寡肽对膀胱细胞产生细胞因子的影响

本实施例检测了RDP58肽bc-1nL抑制膀胱细胞产生细胞因子的能力。在第一个试验中，用CO₂麻醉BALB/c小鼠，排尿后取膀胱。用含青霉素和链霉素的RMPI 1640培养基温和洗涤膀胱，并将其剪成1-2mm的块。将等量的组织加入到0.5ml RPMI培养基中37℃孵育过夜，培养基中含有1μg LPS(大肠杆菌055：B5；Sigma)、50μl RDP58肽(1mg/ml)(终浓度为50μM)、1μg LPS+50μl RDP58肽、或者只有培养基。18小时后收集培养物上清，离心使之澄清，通过ELISA检测其中的细胞因子TNF-α和IFN-γ。

在所有存在RDP58肽的组中，TNF-α的产生被抑制约30％。同样，在一组存在RDP58肽的组中，IFN-γ的产生被抑制约10％，而另一组被抑制67％。因此，这些结果说明RDP58肽可有效抑制膀胱细胞产生细胞因子。

在第二个试验中，将12只小鼠的膀胱分为四组，每组三个膀胱，剪成1-2mm的块。等量的组织在含上述LPS、LPS+RDP58肽或只有培养基的培养基中孵育过夜。离心培养物使之澄清后通过ELSA检测上清中的TNF-α。

结果显示RDP肽的存在可将产生的TNF-α抑制到单独LPS组的约3.9-13％，平均为9.8％±4.1％(p＜0.001)(表V)。因此，RDP58肽可持续而有效地抑制膀胱细胞产生TNF-α。

                                表V

LPS处理的膀胱细胞表达的TNF-α水平^a

	对照	LPS	RDP58	RDP58/LPS	占LPS诱导的表达水平的百分比b
						组1	0	473.1	0	49.6	10.5
组2	53.6	444.6	17.1	52.6	11.8
						组3	0	361.1	0	47.1	13.0
组4	0	431.1	10.6	16.6	3.9
						平均值	13.4	427.5	6.9	41.5	9.8
标准差	26.8	47.6	8.4	16.7	4.1

^aTNF-α水平的浓度单位为pg/ml

^bRDP58/LPS处理样品所表达的TNF-α占单独LPS处理样品所表达的TNF-α的百分比。

7.2实施例2：急性间质性膀胱炎模型

急性间质性膀胱炎的诱导

在小鼠尿道内插管注入150μl含15μg大肠杆菌脂多糖(LPS)的溶液诱导急性IC模型，对照组注入150μl盐水。45分钟以后排空膀胱，在30分钟内灌注150μl蒸馏水(DW)或者RDP58(1mg/ml)。处理完后4小时切下膀胱进行检测(每组3只)。

分析细胞因子、神经生长因子和P物质

切下的膀胱用PBS洗涤，然后放入500μl含10％ FBS的RPMI/Pen/Strep培养基中。用无菌手术剪将膀胱剪成1mm的块，用RPMI培养基在37℃、5％CO₂孵育过夜(16小时)。然后将样品收集到离心管内，约3000rpm离心去掉膀胱组织块和碎片。上清冷冻在-70℃用于ELISA分析。检测P物质用Assay Designs，Inc.(Cat.No.900-018)的试剂盒，检测NGF用Chemicon International(Cat.No.CYT304)的夹心ELISA系统，检测细胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-6用Biosource(Camarillo，CA：TNF-α免疫检测试剂盒Cat.No.KMC3011C；IL-6免疫检测试剂盒Cat.No.KMC0061C；以及IFN-γ免疫检测试剂盒Cat No.KM4021C)的ELISA试剂盒。

组胺分析

组胺的检测用HTRF Bioassay Kit(CIS bio international，France)。试验中样品内的组胺与标记的组胺连接物竞争，阻止标记的抗组胺抗体与连接物结合，因此连接物上的标记物与抗体之间的FRET降低。组胺体外释放试验使用大鼠嗜碱性细胞系RBL-2H3。

测定膀胱的通透性

膀胱的通透性通过在小鼠尿道内插管注入150μl含15μg LPS的溶液诱导急性膀胱炎来测定。45分钟以后排空膀胱，在30分钟内灌注150μl FITC标记的葡聚糖(25mg/ml)。FITC标记的葡聚糖是含有95％ α-D连接的无水葡萄糖聚合物，FITC随机连接到羟基上。葡聚糖确实不与血浆蛋白结合，可在体内稳定存在24小时以上。

注入FITC标记的葡聚糖后，从心脏取血，4000rpm离心5分钟分离血清。测定血清在485nm/535nm处的荧光强度。确定RDP58寡肽对膀胱通透性的影响时，对照组的动物灌注盐水，LPS诱导组的动物灌注盐水或RDP59。空白动物不进行任何处理，既不灌注盐水也不灌注LPS。

7.3实施例3：慢性间质性膀胱炎模型

慢性间质性膀胱炎的诱导

在小鼠尿道内插管注入150μl含15μg大肠杆菌脂多糖(LPS)的溶液诱导慢性IC模型，对照组注入150μl盐水。每周处理动物3次，连续处理2周。为了确定RDP58的效应，LPS灌注后14天膀胱内灌注肽。处理后24或72小时取膀胱进行组织学分析。RDP58处理后24小时取膀胱，在体外进行组织培养，按上述方法分析其细胞因子表达水平。用FITC标记的葡聚糖试验分析膀胱的通透性。

组织的组织学分析

经治疗后取各组动物的膀胱然后切片。用苏木精-伊红染色后进行形态学检查。用抗CD45和抗CD3抗体进行免疫学染色来检查切片中T细胞分化标记分子CD3或CD45是否存在。

Claims (20)

1.一种治疗间质性膀胱炎的方法，所述方法包括：

给予受到影响的受试者药物有效量的含RDP58寡肽的组合物。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述RDP58寡肽由下列氨基酸序列构成：

Arg-nL-nL-nL-Arg-nL-nL-nL-Gly-Tyr。

3.如权利要求1所述的方法，其中，至少有一个末端氨基酸是经修饰的氨基酸。

4.如权利要求3所述的方法，其中，所述经修饰的氨基酸是酰胺化的氨基酸或其盐。

5.如权利要求1所述的方法，其中，所述一个或多个氨基酸是D异构体。

6.如权利要求5所述的方法，其中，所有的氨基酸都是D异构体。

7.如权利要求1所述的方法，其中，所述给药方式是膀胱内灌注。

8.如权利要求1所述的方法，其中，所述间质性膀胱炎是急性间质性膀胱炎。

9.如权利要求1所述的方法，其中，所述间质性膀胱炎是慢性间质性膀胱炎。

10.一种治疗间质性膀胱炎的方法，所述方法包括使受疾病影响的组织或细胞与药物有效量的含RDP58寡肽的组合物接触以减轻间质性膀胱炎的表现。

11.如权利要求10所述的方法，其中，所述表现是组胺释放，且所述细胞是肥大细胞。

12.如权利要求10所述的方法，其中，所述表现是P物质的表达。

13.如权利要求10所述的方法，其中，所述表现是NGF的表达。

14.如权利要求10所述的方法，其中，所述表现是TNF-α的表达。

15.如权利要求10所述的方法，其中，所述表现是尿液/血液屏障的退化。

16.如权利要求10-15中任一所述的方法，其中，所述RDP58寡肽由下列氨基酸序列构成：

Arg-nL-nL-nL-Arg-nL-nL-nL-Cly-Tyr。

17.如权利要求16所述的方法，其中，所述寡肽的一个或多个氨基酸是D异构体。

18.如权利要求17所述的方法，其中，所述寡肽的所有氨基酸都是D异构体。

19.如权利要求16所述的方法，其中，至少有一个末端氨基酸残基是经修饰的氨基酸。

20.如权利要求19所述的方法，其中，所述经修饰的氨基酸是酰胺化的氨基酸或其盐。

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