EA003739B1 - Гидрофобно-модифицированные белки, способы их получения и их применение - Google Patents

Abstract

Описаны гидрофобно-модифицированные белки, способы их получения, а также их применение в производстве лекарственного средства для лечения неврологических заболеваний. Гидрофобная структурная единица присоединена к находящемуся на поверхности аминокислотному остатку белка. Гидрофобная структурная единица может быть представлена липидом или пептидом. Альтернативно белок может быть дериватизирован с помощью самых разнообразных химических реакций, в результате которых идет присоединение гидрофобной структуры к белку. Предпочтительный белок выделен из организмов млекопитающих, и его выбирают из группы, состоящей из хеджхог Соник, Индиан и Дезерт. Гидрофобная структурная единица используется в качестве подходящей точки связывания, к которой может быть присоединена такая везикула как клеточная мембрана, липосома или мицелла. Описан также способ изменения состояния роста клеток, отвечающих на передачу сигнала белком хеджхог, а также применение липофильно-модифицированного полипептида хеджхог в производстве лекарственного средства для изменения состояния роста клеток.

Description

Известно, что некоторые белки проявляют более высокую биологическую активность, будучи присоединенными к другим структурным единицам за счет образования многомерных комплексов, где белки имеют возможность действовать вместе с другими компонентами, или же за счет других изменений в физикохимических свойствах белка, например, за счет абсорбции белка, его биораспределения и изменения времени полупревращения. В соответствии с изложенным, сфера интересов в биотехнологии включает в себя разработку способов модификации физико-химических свойств белков таким образом, чтобы они могли быть использованы в меньших количествах, с меньшим числом побочных эффектов, по новому назначению и менее затратно.

Например, способность к связыванию у отдельно взятого белка (например, у лиганда и соответствующего ему рецептора) может быть невысокой. Но клетки производят от сотен до тысяч копий специальных поверхностных рецепторов, и многие взаимодействия типа лиганд-рецептор протекают одновременно. Если в связывании на поверхности клетки участвуют многие молекулы, то общее эффективное связывание оказывается больше, чем сумма эффектов связывания отдельных молекул. В отличие от этого отделение лигандных белков от поверхности клетки и очистка их, или же выделение их с помощью приемов, использующих рекомбинантную ДНК, например, с целью применения в качестве лекарственных средств, приводит к тому, что они действуют в виде мономеров и теряют преимущество, проявляющееся при совместном действии многих других копий того же самого белка, компактно ассоциированных на поверхности клетки. Обусловленное такой изоляцией низкое сродство белка к его рецептору может стать серьезным препятствием на пути эффективного применения его в качестве лекарственного средства для блокирования специфических путей связывания, поскольку ему приходится конкурировать с высокой склонностью клеток к межклеточным взаимодействиям. Эффективное лечение в этом случае может быть обеспечено за счет постоянного введения средства и/или использования более высоких дозировок. В то же время, такие препятствия можно обойти, если удается обеспечить многомерность форм изолированного белка.

Точно так же можно получить положительный эффект при модифицировании других физико-химических свойств биологически активных белков, например, таким образом, чтобы индуцировалась ассоциация белка с мембраной и происходила его локализация в месте поступления, а также чтобы усиливалась способность к связыванию или, иначе, к взаимодействию с соответствующей мишенью. Такие изменения могут оказывать влияние и на фармакологическое распределение белка.

Разработаны многочисленные способы генерирования сопряженных белков. Многие из этих способов не отличаются высокой специфичностью, то есть они не ориентируют точку связывания на какой-то определенный сайт на молекуле белка. В результате этого обычные обеспечивающие связывание средства могут атаковать функциональные сайты или стерически блокировать активные центры, лишая этим связанные белки активности. Более того, связанные продукты могут быть ориентированы таким образом, что активные центры не могут проявлять эффект синергизма и тогда эффективность этих продуктов не превышает эффективность самого мономерного белка.

Дополнительным побудительным мотивом для поиска новых способов модификации белка являются белки с Ν-концевым цистеиновым остатком, который подвержен реакциям окисления или другим химическим превращениям, снижающим активность или время полупревращения. В дополнение к этому, некоторые буферы, обычно используемые для очистки белка, имеют компоненты или загрязнения, которые могут трансформировать Ν-концевой цистеин. Даже когда избегают применения таких буферов, Ν-концевой цистеин через какое-то время может претерпеть превращения в результате действия веществ, содержащихся в используемой для хранения посуде или в воздухе. Следовательно, используемые в лекарственных формах буферы должны содержать в своем составе защитные вещества типа дитиотреитола для предотвращения модификации и/или окисления цистеина. Однако такие вещества защитного действия сами проявляют заметную биологическую активность, и поэтому они могут осложнять проведение экспериментов и неблагоприятно влиять на терапевтическое действие лекарственной формы.

В соответствии с изложенным имеется потребность в разработке более специфичных средств для получения модифицированных продуктов или их многомерных форм, а также для изменения свойства белка с целью повышения его стабильности, активности, фармакокинетических и фармакодинамических характеристик.

В одном из аспектов изобретения авторы решили проблему по разработке удобного способа получения модифицированных форм биологически активных белков. Соответствующие изобретению способы могут использоваться для получения многомерных форм белков и/или они могут использоваться для изменения их физикохимических свойств. Авторы изобретения показали, что модифицирование белка (то есть присоединение или добавление гидрофобной структурной единицы к существующей аминокислоте или замена аминокислоты гидрофобной струк турной единицей) таким образом, чтобы ввести гидрофобную структурную единицу в молекулу белка, может привести к усилению биологической активности белка и/или его стабильности. Так, например, Ν-концевой цистеин может использоваться в качестве удобной мишени для присоединения гидрофобной структурной единицы, например, липида, и модифицирования активного белка.

Альтернативно для модифицирования активности белка гидрофобная структурная единица может быть присоединена к С-концовому остатку биологически активного белка, например, хеджхог-белка. Для увеличения активности белка гидрофобная структурная единица может быть также присоединена к остатку аминокислоты во внутренней части цепи, при условии, что такая модификация не влияет на активность белка, например, на способность белков связываться с рецептором или корецептором, или не влияет на трехмерную структуру белка. Предпочтительно, когда гидрофобная структурная единица присоединена к аминокислотному остатку, который находится на поверхности белка, когда белок находится в его нативной форме. Соответствующая изобретению гидрофобная модификация представляет собой в общем удобный способ создания белков с измененными физико-химическими свойствами по сравнению с немодифицированными формами.

В основу настоящего изобретения положено обнаруженное авторами изобретения явление, когда в результате экспрессии полной длины Соник хеджхог-белка в клетках насекомого и в клетках млекопитающих в его полной форме (остатки 1-174 в полной последовательности), в дополнение к холестерину у С-концевого остатка, проводилась также его дериватизация жирной кислотой по его Ν-концевому остатку, и тогда оказалось, что такая форма хеджхог-белка проявляет 30-кратное увеличение активности по сравнению с растворимым, немодифицированным хеджхог-белком в опытах ίη νίίτο.

В соответствии с этим один из аспектов изобретения относится к изолированному белку, включающему в себя Ν-концевую аминокислоту и С-концевую аминокислоту, причем белок выбирают из группы, состоящей из белка с цистеином в качестве Ν-концевой аминокислоты, к которой присоединена по меньшей мере одна гидрофобная структурная единица; включающей в себя белок, Ν-концевая аминокислота которого не является цистеином, соединенным с гидрофобной структурной единицей; и включающей в себя белок, в котором гидрофобная структурная единица заменяет Ν-концевую аминокислоту. Гидрофобная структурная единица может быть представлена гидрофобным пептидом или каким-либо липидом или любой другой гидрофобной химической структурной единицей.

Белок может быть модифицирован по его Ν-концевой аминокислоте, и предпочтительно, чтобы Ν-концевой аминокислотой являлся цистеин или его функциональное производное. Белок может быть модифицирован по его Сконцевой аминокислоте или же одновременно как по Ν-концевой аминокислоте, так и по Сконцевой аминокислоте, или, по крайней мере, по одной из аминокислот внутри цепи (то есть между Ν-концевой и С-концевой аминокислотами), возможны и различные комбинации этих конфигураций. Белок может быть внеклеточным, предназначенным для передачи сигналов белком, и в предпочтительных вариантах - это хеджхог-белок, включая Соник, Индиан и Дезерт хеджхог-белки, источником которого являются организмы позвоночных, наиболее предпочтительно организм человека.

Другой вариант представлен изолированным белком формы:

А-Сук-[8р]-В-Х, где А означает гидрофобную структурную единицу,

Сук означает цистеин или его функциональный эквивалент, [8р] означает необязательную спейсерную пептидную последовательность,

В означает белок, включающий в себя разнообразные аминокислоты, среди которых, по крайней мере, одна необязательная спейсерная пептидная последовательность и

Х означает необязательно другую гидрофобную структурную единицу, связанную с белком.

Изолированный белок может быть внеклеточным сигнализирующим белком, предпочтительно это хеджхог-белок. Этот белок может быть модифицирован не менее чем по одной другой аминокислоте не менее чем с одной гидрофобной структурной единицей. В других вариантах белок находится в контакте с везикулой, выбираемой из группы, состоящей из клеточной мембраны, мицеллы и липосомы.

Другой аспект изобретения относится к изолированному белку с С-концевой аминокислотой и Ν-концевой тиапролиновой группой, причем тиапролиновая группа образована в результате взаимодействия альдегида с Νконцевым цистеином в молекуле белка. Еще один аспект изобретения относится к изолированному белку с С-концевой аминокислотой и Ν-концевой амидной группой, которая образована при взаимодействии тиоэфира жирной кислоты с Ν-концевым цистеином белка. И еще один аспект изобретения относится к изолированному белку с С-концевой аминокислотой и Ν-концевой малеимидной группой, причем Νконцевая малеимидная группа образована в результате реакции малеимидной группы с Νконцевым цистеином белка. Еще один аспект изобретения относится к изолированному белку с С-концевой аминокислотой и Ν-концевой аце тамидной группой. И еще один аспект изобретения относится к изолированному белку с Сконцевой аминокислотой и Ν-концевой тиоморфолиновой группой.

В таких вариантах С-концевая аминокислота белка может быть модифицирована гидрофобной структурной единицей. Изолированный белок может представлять собой внеклеточный сигнальный белок наиболее предпочтительно это хеджхог-белок.

Соответствующие изобретению способы включают в себя способ получения мультивалентного белкового комплекса, где имеется стадия присоединения в присутствии везикулы гидрофобной структурной единицы к Νконцевому цистеину белка или к функциональному эквиваленту Ν-концевого цистеина. Стадия присоединения может включать в себя присоединение липидной структурной единицы, выбираемой из насыщенных и ненасыщенных жирных кислот с числом атомов углерода от 2 до 24. Белок может быть внеклеточным сигнальным белком, предпочтительно это хеджхогбелок, выбираемый из группы, состоящей из Соник, Индиан и Дезерт хеджхог-белков.

И еще один способ согласно изобретению представляет собой способ модификации физико-химических свойств белка, включающий в себя введение, по крайней мере, одной гидрофобной структурной единицы в фрагмент Νконцевого цистеина в молекуле белка или в фрагмент функционального эквивалента Νконцевого цистеина. Гидрофобная структурная единица может быть липидной структурной единицей, выбираемой из насыщенных и ненасыщенных жирных кислот с числом атомов углерода от 2 до 24. Она может быть представлена и гидрофобным белком. Белок, модифицированный с использованием этого способа, может быть сигнальным внеклеточным белком, предпочтительно это хеджхог-белок, выбираемый из группы, состоящей из Соник, Индиан и Дезерт хеджхог-белков. Белковые комплексы, получаемые этими способами, также входят в объем притязаний настоящего изобретения.

Другие внеклеточные сигнальные белки за исключением хеджхог-белка - это гельсолин, интерферон, интерлейкин, фактор некроза опухолей, колониестимулирующий фактор моноцитов, колониестимулирующий фактор гранулоцитов, колониестимулирующий фактор гранулоцитов/макрофагов, эритропоэтин, фактор роста из тромбоцитов, гормон роста и инсулин.

Другой способ представлен способом модификации белка, (такого как внеклеточный сигнальный белок), на Ν-конце которого находится цистеин. Этот способ включает в себя взаимодействие Ν-концевого цистеина с тиоэфиром жирной кислоты с образованием амида, причем такая модификация усиливает биологическую активность белка.

Еще один способ представлен способом модификации белка (такого как внеклеточный сигнальный белок), на Ν-конце которого находится цистеин, причем способ включает в себя взаимодействие Ν-концевого цистеина с малеимидной группой, и в результате такой модификации возрастает биологическая активность белка. Другие варианты этого способа включают в себя взаимодействие Ν-концевого цистеина с альдегидной группой, с ацетамидной группой или с тиоморфолиновой группой.

Еще один способ представляет собой способ модификации белка (такого как внеклеточный сигнальный белок), включающий в себя присоединение к белку гидрофобного пептида. Гидрофобная структурная единица может быть присоединена к аминокислоте белка, выбираемой из группы, включающей в себя Ν-концевую аминокислоту, С-концевую аминокислоту, аминокислоту, находящуюся между Ν-концевой аминокислотой и С-концевой аминокислотой, возможна и комбинация перечисленных точек присоединения. В одном из вариантов настоящее изобретение относится к хеджхогполипептидам, которые модифицированы липофильными структурными единицами. В некоторых вариантах соответствующие настоящему изобретению хеджхог-белки модифицированы липофильной структурной единицей или липофильными структурными единицами в одном или в нескольких участках внутри зрелого, обработанного внеклеточного домена, они также могут быть дериватизированы по Ν- или по Сконцевому остатку зрелого полипептида или же такая дериватизация может быть исключена. В других вариантах полипептид модифицируют по С-концевому остатку гидрофобной структурной единицей отличной от стерола. В еще одном варианте полипептид модифицирован по Ν-концевому остатку циклической (предпочтительно полициклической) липофильной группой. Возможны также различные сочетания приведенных выше вариантов. Соответствующий изобретению терапевтический способ представляет собой способ лечения неврологических расстройств у пациента, включающий в себя введение в организм пациента гидрофобно модифицированного белка согласно изобретению.

Краткое описание рисунков

Фиг. 1. Характеристика пальмитоилированной формы 81111. Связанную форму 81111 человека иммуноафинным способом очищают от клеток насекомых Н1дй Р1уе™ и анализируют методом 8Ό8-ΡΆΟΕ. Белок окрашивают с помощью Соошакые Ыие (линия а, Б Нс Тес1по1ощек. 1пс., предварительное окрашивание маркером с высокой молекулярной массой; линия Ь, растворимый 811 (0,6 мкг); линия с, связанный 811 (0,6 мкг); линия б, смесь растворимого и связанного 811 (по 0,6 мкг каждого). Способность 811 и [НН (см. линия 1) подвергаться мо дификации пальмитиновой кислотой была проверена с использованием свободной от клеток системы, описанной в примере 2. Растворимые формы хеджхог-белка (3 мкг на образец) инкубируют в течение 1 ч с микросомами печени крысы, АТФ, коферментом А и ³Н-пальмитиновой кислотой и анализируют методом 808РАСЕ для определения степени пальмитоилирования. Образцы, показанные линиями е-ί, проявляют флуорографически (линия е, 811; линия £, бек 1-10 811, линия д от Цис-1 до Сер 811, линия 1, III; линия ΐ, Гис-маркированный 811) и по линиям _)-к окрашиванием Соотакые (линия _), 811; линия к, бек 1-10 811).

Фиг. 2. Анализ очищенного 811 методом масс-спектрометрии с электрораспылением. Растворимый 811 человека (А) и связанный 811 человека с присоединенным гидрофобным фрагментом (В) анализируют методом Е81-М8 на тройном квадрупольном масс-спектрометре М1сготакк ОшИгсо II, оборудованном источником ионов с электрораспылением. Все полученные при электрораспылении масс-спектральные данные регистрируют и хранят в графическом виде, а обрабатывают их с помощью системы для обработки данных Мюготакк МаккЬуих. Представлены спектры молекулярных масс (отнесение масс на основе системы обработки данных).

Фиг. 3. Анализ связанного 811 методом ВЭЖХ с обращенной фазой. Растворимый 811 человека (А), связанный 811 человека из клеток насекомых Нщ1 Рще™ (В), связанный 811 человека из клеток ΕΒΝΑ-293 (С), и ассоциированный с клетками 811 крысы (Ό) хроматографируют с обращенной фазой на приборе ВЭЖХ с колонкой иатготе Ьоге Уубас С₄ (2,1 мм внутренний диаметр х 250 мм). Колонку проявляют градиентным способом, повышая концентрацию ацетонитрила в 0,1%-ной трифторуксусной кислоте от 0 до 80% в течение 30 мин при скорости 0,25 мл/мин, продукт элюирования пропускают через детектор с набором фотодиодов для длин волн от 200 до 300 нм (приведены данные при 214 нм). Соответствующие пикам фракции собирают и после этого характеризуют методом 808-РАСЕ и масс-спектрометрически (данные сведены в табл. 3, 4 и 5).

Фиг. 4. Характеристика 811 методом ЬСМ8. Связанный 811 человека (А) и растворимый 811 человека (В) алкилируют 4-винилпиридином (образец 1 мкл/100 мкл в 6М гидрохлорида гуанидина, 1 мМ ЭДТА, 100 мМ гидрохлорида Трис, рН 8,0), осаждают этанолом и обрабатывают эндопротеиназой Ьук-С в 50 мМ гидрохлориде Трис с рН 7,0, 2М мочевины при отношении фермента к белку, равном 1:5, как это было описано ранее (27). Продукты ферментации анализируют методом ВЭЖХ с обращенной фазой, соединенным с тройным квадрупольным масс-спектрометром с электрораспылением М1сготакк ОиаНго II. Результаты сканирования обрабатывают с помощью системы обработки данных Мюготакк МаккЬшх (представлены полные ионные хроматограммы опытов). Звездочками отмечены положения Ν-концевых пептидов, подтвержденные с помощью МАБО! Ρ8Ό или Ν-концевого секвенирования по Эдману.

Фиг. 5. Секвенирование Ν-концевого 811пептида при определении МΑ^^I Ρ8Ό. Полученный действием эндопротеиназы Ьук-С Νконцевой пептид из связанного 811 человека направляют на определение МΑ^^I Ρ8Ό на масс-спектрометре Уоуадег-ΟΕ™ 8ТР с регистрацией времени пролета. Предсказанные продукты фрагментации и номенклатура установленных ионных фрагментов представлены в верхней части рисунка (РА означает пальмитоильный кислотный остаток, 4νρ означает 4пиридилэтильную группу). Остальная часть рисунка представляет собой полученный в опыте молекулярный масс-спектр. Значимые ионы перечислены с использованием схематично представленной номенклатуры. Рассчитанные массы (в Да) для Ь₄-Ь₈ равны 447,3, 504,3, 601,4, 658,4, 814,5, 871,5, 1018,6 и 1075,6 соответственно. Для у1-у8 массы (Да) равны 147,1, 204,1, 351,2, 408,2, 564,3, 621,3, 718,4 и 775,4 соответственно. Рассчитанная масса для ζ₈ равна 758,4 Да. Наблюдаемая масса для Ь₈ дополнительно содержит 18 Да от присоединенной воды.

Фиг. 6. Увеличение активности связанного 811 в опыте на С3Н10Т1/2. Относительные активности растворимого и связанного 811 человека в чистом виде (А) или в присутствии антихеджхог нейтрализующего МаЬ 5Е1 (В) оценивают на клетках С3Н10Т1/2 по данным определения индукции щелочной фосфатазы. Представленные числа отражают средние значения двойных определений. (А) Последовательные двукратные разбавления растворимого (6) и связанного (8) 811 инкубируют с клетками в течение 5 дней и определяют конечный уровень активности щелочной фосфатазы, измеренный при 405 нм с использованием хромогенного субстрата щелочной фосфатазы п-нитрофенилфосфата. (В) Серийные разведения МаЬ 5Е1 инкубируют с растворимым 811 (5 мкг/мл: черные столбцы) или со связанным 811 (0,25 мкг/мл: серые столбцы) или же без добавления 811 в контрольных опытах с носителем (белые столбцы) в течение 30 мин, затем анализируют в опыте с С3Н10Т1/2.

Фиг. 7. Анализ 811 в опыте по связыванию с рецептором. Относительную активность растворимого (6) и связанного (8) 811 определяют в опыте по связыванию с ра1с1еб на ра1с1ебтрансфектных ΕΒΝΑ-293 клетках РАС8анализом. Серийные разведения исследуемых образцов инкубируют с клетками ΕΒΝΑ-293, промывают и затем определяют процент связывания, измеряемый по способности образцов конкурировать с 811-¾ за связывание с клетками. Связанный 811-¾ количественно определи ют по среднему значению флуоресценции, используя для считывания пробу на Р1ТСмеченное анти-1д антитело. Эти данные соответствуют гиперболической кривой нелинейной регрессии.

Фиг. 8. Выравнивание хеджхог-белков человека по Ν-концевым фрагментам. Хеджхогбелки человека массой 20 кДа (Соник 81111. Дезерт Э11 и Индиан 111) выравнивают относительно их Ν-концевого цистеина (Су 5-1 в полной последовательности). В полноразмерном белке предшественнике 811 этот цистеин обычно является Су5-24 из-за того, что в нем присутствует естественная сигнальная последовательность, которая отщепляется при секреции. Фактическое положение цистеина может незначительно изменяться у различных видов.

Фиг. 9. Согласованная последовательность Ν-концевого фрагмента хеджхог-белков человека.

Фиг. 10. Влияние длины липидной цепи на активность Соник хеджхог-белка человека. В соответствии с настоящим изобретением синтезируют ряд модифицированных жирной кислотой хеджхог-белков и определяют влияние длины цепи жирной кислоты на активность хеджхог-белка, используя описанную ранее индукцию щелочной фосфатазы клетками С3Н10Т1/2. Результаты опытов представлены в графическом виде.

Фиг. 11. Опыт на клетках С3Н10Т1/2 с пальмитоилированным, миристоилированным, лауроилированным, деканоилированным и октаноилированным Соник хеджхог-белком человека. Пальмитоилированный, лауроилированный, деканоилированный и октаноилированный Соник хеджхог-белок человека в виде раствора в 5 мМ №₂НРО₄ с рН 5,5, 150 мМ №С1, 1% октилглюкозида, 0,5 мМ ЭТТ и миристоилированный Соник хеджхог-белок человека в виде раствора в 150 мМ №С1, 0,5 мМ ЭТТ испытывают на клетках С3 Н10Т1/2, измеряя индукцию щелочной фосфатазы. Числовые значения представляют собой среднее из двух измерений. Последовательные трехкратные разбавления пальмитоилированного (о), миристоилированного (·), лауроилированного (□), деканоилированного () и октаноилированного (Δ) и немодифицированного (▲ и х) Соник хеджхог-белка человека инкубируют с клетками в течение 5 дней и определяют конечное значение уровней щелочной фосфатазы, измерения проводят при 405 нм, используя в качестве хромогенного субстрата пнитрофенилфосфат. Пальмитоилированный, миристоилированный, лауроилированный и деканоилированный белки испытывались в одном эксперименте с немодифицированным белком, показанным как (▲), в то время как октаноилированный белок испытывался в другом эксперименте с немодифицированным белком, показанным как (х). Стрелка на у-оси обозначает фоновый уровень щелочной фосфатазы без добавленного хеджхог-белка.

Фиг. 12. Общие структуры различных гидрофобно модифицированных форм хеджхогбелка. (А) Производные амидов жирных кислот, где В означает углеводородную цепь жирной кислоты, (В) тиазолидиновые производные, где В означает углеводород, (С) замещение аминокислотой, где В означает боковую цепь гидрофобной аминокислоты, (Ό) малеинимидное производное, где В означает углеводород, (Е) 8Н означает свободную тиольную группу в Νконцевом цистеине хеджхог-белка естественного типа, (Р) иодацетамидное производное, где В! означает углеводород и В2 означает Н или углеводород, и (С) тиоморфолинильное производное, где В означает углеводород. Для всех структур НН означает хеджхог.

Фиг. 13. Относительная активность различных гидрофобно модифицированных форм хеджхог-белка в опыте на клетках С3Н10Т1/2. Значения ЕС₅₀ (2мкг/мл) немодифицированного Соник хеджхог-белка естественного типа представлены, как 1х. Активность других белков представлена в виде отношения ЕС50 белка естественного типа к ЕС₅₀ модифицированного белка. Модификации относятся к Ν-концу белка, если не указано иное.

Фиг. 14. Относительная активность немодифицированного, миристоилированного и мутанта С111 Соник хеджхог-белка человека в опыте на вызванной малонатом стриарной патологии. Рисунок показывает снижение объема вызванного малонатом патологического изменения полосатого тела крысы, которое наблюдается при введении немодифицированного, миристоилированного или мутанта С111 Соник хеджхог-белка.

Фиг. 15. Иллюстрация специфических активностей модифицированного малеимидным способом и немодифицированного хеджхогполипептидов.

Подробное описание изобретения

В основу настоящего изобретения частично положено то, что Соник хеджхог-белок человека, получаемый в результате экспрессии полной длины его структуры в клетках насекомого или в клетках млекопитающих, имеет гидрофобную пальмитоильную группу, присоединенную к α-аминогруппе Ν-концевого цистеина. Это первый известный авторам изобретения пример, когда внеклеточный сигналирующий белок модифицирован таким образом, и в отличие от направленных на тиольную группу модификаций с помощью пальмитиновой кислоты, которые легко обратимы, такое новое Νзамещение пальмитоильной структурной единицей вероятно очень устойчиво по аналогии с модификацией миристиновой кислотой.

Прямым следствием этого начального открытия явилось обнаружение авторами изобретения факта, что увеличение гидрофобного ха рактера сигналирующего белка может увеличивать биологическую активность белка. В частности, авторы изобретения обнаружили, что присоединение гидрофобной структурной единицы к сигналирующему белку, например, к хеджхог-белку, может повышать активность белка. Авторы изобретения обнаружили, что Νконцевой цистеин в биологически активных белках не только представляет собой удобный реакционный центр для присоединения гидрофобной структурной единицы, изменяя таким образом физико-химические свойства белка, но модификации Ν-концевого цистеина могут также сопровождаться увеличением стабильности белка. В дополнение к этому, присоединение гидрофобной структурной единицы к аминокислотному остатку в средней части пептидной цепи на поверхности белковой структуры увеличивает активность белка. Авторы изобретения используют этот пример, демонстрируя лежащую в основе изобретения гидрофобную модификацию хеджхог-белка, например, липидами и гидрофобной аминокислотой.

Один из аспектов настоящего изобретения представлен открытием того, что в дополнение к этим эффектам, проявляющимся в результате присоединения холестерина к С-концу внеклеточных фрагментов белка, по крайней мере, некоторые виды биологической активности генных продуктов неожиданно усиливаются при дериватизации белка липофильными структурными единицами в других реакционных центрах белка и/или структурными единицами, отличными от холестерина. Некоторые аспекты настоящего изобретения направлены на получение хеджхог-полипептидов, которые модифицированы не по Ν-концевым или С-концевым остаткам получаемой в результате естественного процессинга формы белка, а по другим реакционным центрам, и/или которые модифицированы по этим концевым остаткам отличными от стерольных липофильными структурными единицами на С-конце или жирной кислотой на Νконце.

Как описано в конвенционных заявках на международный патент № 95/18856 и № 96/ 17924 (все они специально включены в прилагаемый список литературы), хеджхогполипептиды в общем случае используют ίη νίνο и ίη νίίτο для исправления и/или для регуляции функционального проявления широкого спектра клеток, тканей и органов; они находят ряд терапевтических применений, распространяющихся на защиту нервной ткани, на нейрорегенерацию, усиление невральной функции, на регуляцию образования и восстановления костной и хрящевой ткани, на регуляцию сперматогенеза, на регуляцию легких, печени и других происходящих от примитивной кишки органов, на регуляцию кроветворной функции и так далее. В соответствии с этим, соответствующие настоящему изобретению способы и компози ции включают в себя применение дериватизированных хеджхог-полипептидов для всех аналогичных областей применения, если при этом используются хеджхог-белки. Более того, эти способы могут быть применены на клеточных культурах (ίη νίίτο) или на клетках в организме животного (ίη νίνο).

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к лекарственным формам, включающим в себя в качестве активного ингредиента хеджхог-полипептид, дериватизированный одной или несколькими липофильными структурными единицами представленными здесь способами.

Хеджхог-лечение, о котором идет речь, показывает свою эффективность как на организме человека, так и на животных. Животные субъекты, на которых может быть распространено настоящее изобретение, представлены как домашними животными, так и домашним скотом, которых выращивают в качестве домашних любимцев или в коммерческих целях. В качестве примера можно привести собак, кошек, крупный рогатый скот, лошадей, овец, свиней и коз.

Хеджхог-белки представляют собой семейство внеклеточных сигналирующих белков, которые регулируют различные аспекты эмбрионального развития как у позвоночных, так и у беспозвоночных (обзоры по этой теме 1, 2). Лучше всего охарактеризованным хеджхогбелком является Соник хеджхог (81111). участвующий в начальной и последующей дифференциации, в образовании апикального эктодермального гребня, мезодермы задней кишки, позвоночного столба, периферических конечностей, в развитии ребер и в развитии легких, он индуцирует вентральные клетки в спинном мозге, в заднем мозге и в переднем мозге (3-8). Полного понимания механизма действия хеджхог-белков еще не достигнуто, но последние биохимические и генетические данные позволяют предположить, что рецептор 811 продуцируется геном супрессором злокачественных опухолей и связан локально (9, 10) и что в пути сигналирования с участием хеджхог-белка вовлечены другие белки (δΐηοοίΐοηοά (10, 11), СиЬйи8 пЦеггирШк, (12, 13) и Гикей (14)).

811 человека синтезируется в виде белка предшественника с массой 45 кДа, который расщепляется по автокаталитическому механизму с образованием: (I) Ν-концевого фрагмента с массой 20 кДа, который отвечает за всю известную сигналирующую активность хеджхог-белка (8ЕО ΙΌ N08. 1-4), и (II) С-концевого фрагмента белка 25 кДа, который характеризуется автопроцессинговой активностью (15-17). В состав Ν-концевого фрагмента входят аминокислотные остатки 24-197 полной длины последовательности в белке предшественнике.

Ν-Концевой фрагмент остается ассоциированным с мембраной благодаря присоединению холестерина к его С-концу (18,19). Этот холе стерин имеет решающее значение для ограничения тканевой локализации сигнала от хеджхог-белка. Присоединение холестерина катализируется С-концевым доменом на стадии процессинга.

Все ссылки, приведенные в подробном описании, приводятся в списке литературы, если не указано иное.

I. Определения.

Далее следует детальное описание изобретения, в которое включены приведенные ниже определения.

«Аминокислота» - мономерная единица пептида, полипептида или белка. В состав встречающихся в природе пептидов, полипептидов и белков входят двадцать аминокислот, все из которых являются Ь-изомерами. Этот термин включает в себя также аналоги аминокислот, а также Ό-изомеры белковых аминокислот и их аналоги.

«Белок» - любой полимер, основу которого составляют любые из 20 аминокислот. Правда, понятие «полипептид» часто используют по отношению к сравнительно большим полипептидам, а понятие «пептид» часто используется по отношению к небольшим полипептидам, но при использовании этих понятий их значения часто перекрываются и изменяются. Используемое здесь понятие «белок» относится к пептидам, белкам и полипептидам, если не указано иное.

«Ν-конец» - это понятие относится к первой аминокислоте (аминокислоте номер 1) в полной форме белка.

«Ν-концевой цистеин» - означает аминокислотный остаток (номер 1), показанный в 8ЕО ΙΌ N08. 1-4. Это понятие относится также к любому цистеину, находящемуся в положении 1 любого другого белка, или к функциональному эквиваленту этого цистеина (см. раздел IV).

«Спейсерная» последовательность - это понятие относится к короткой последовательности, это может быть даже одна единственная аминокислота, которая может быть встроена между подвергающейся гидрофобной модификации аминокислотой (например, такой как Νконцевой цистеин или его функциональный эквивалент) и остальной частью белка. Разделитель предназначен для того, чтобы обеспечить пространственное разделение между гидрофобной модификацией (например, модифицированным Ν-концевым цистеином) и остальной частью белка и таким образом предотвратить взаимодействие модифицированной части с белковой функцией и/или облегчить соединение модифицированного участка (например, Νконцевого цистеина) с липидом, везикулой или с другой гидрофобной структурной единицей. В соответствии с этим, если белок модифицирован по его Ν-концевому цистеину и по другой аминокислоте на другом участке, то спейсерных последовательностей может быть две или более.

«Связанный» белок - это понятие относится к гидрофобно модифицированному белку в соответствии с настоящим изобретением.

«Мультивалентный белковый комплекс» это множественность белков (то есть один или более одного). Липид или другая гидрофобная структурная единица присоединены не менее чем к одному из множества белков. Липид или другая гидрофобная структурная единица может находиться в контакте с везикулой, но это не обязательно. Если белок не содержит липида или другой гидрофобной структурной единицы, то такой белок может быть присоединен межмолекулярной связью к другому белку, в составе которого есть липид или гидрофобная структурная единица. Каждый белок может быть таким же, как остальные, или отличаться от них, и каждый липид или другая гидрофобная структурная единица могут быть как одинаковыми, так и разными.

«Везикула» - это любое агрегированное состояние липофильных молекул. Везикула может быть получена из биологических источников (например, это аналогичный клеточной мембране липидный бислой или поверхностноактивный состав на основе желчных кислот) или же из не биологических источников (например, это везикулы из подобных описанным в разделе IV небиологических повехностно-ак-тивных веществ). Форма, тип и конфигурация везикул не могут быть использованы для ограничения объема притязаний настоящего изобретения.

«Функциональный эквивалент» аминокислотного остатка (например, Ν-концевого цистеина) - это (ί) аминокислота с такими же реакционными свойствами, что и заменяемый этим функциональным эквивалентом аминокислотный остаток; (и) это аминокислота лиганда соответствующего изобретению полипептида с аминокислотным остатком, который имеет те же самые возможности для связывания с гидрофобной (например, липидной) структурной единицей, какие имел заменяемый функциональным эквивалентом аминокислотный остаток; (ΐϊϊ) это молекула, не относящаяся к аминокислотам, которая имеет те же самые возможности для связывания с гидрофобной (например, липидной) структурной единицей, какие имел заменяемый функциональным эквивалентом аминокислотный остаток.

«Генетическое слияние» - этот термин относится к коллинеарному образованию ковалентной связи между двумя или более белками или фрагментами белков через их индивидуальный пептидный остов путем генетической экспрессии полинуклеотидной молекулы, кодирующей эти белки.

«Химерный белок» или «белок, полученный слиянием» представляет собой продукт слияния первой аминокислотной последовательности, кодированной как хеджхогполипептид, со второй аминокислотной после довательностью, определяющей домен, который отличается от какого-либо домена 1111-белка и в основном не гомологичен ему. Химерный белок может содержать чуждый домен, который находится (даже в составе другого белка) в организме, где идет экспрессия и первого белка, или это может быть «межвидовое», «межгенное» и т.п. слияние белковых структур, происходящих от разных организмов. В общем случае полученный слиянием белок может быть представлен общей формулой (Х)_м-(йй)_т-(У)_м. где означает весь хеджхог-белок или его часть, Х и Υ независимо друг от друга означают аминокислотные последовательности, которые не являются естественными соседями хеджхог-последовательности в полипептидной цепи, т означает целое число, равное или больше 1, и в каждом случае п, независимо для первого и второго фрагмента, равно 0 или означает целое число, равное или больше 1 (предпочтительно п и т не больше 5 или 10).

Мутантный - это термин, относящийся к любому изменению в генетическом материале организма, в частности любое изменение (то есть деления, замещение, вставка или альтерация) в естественном типе полинуклеотидной последовательности или любое изменение в естественном типе белка.

Естественный тип - это естественная полинуклеотидная последовательность экзона белка или ее часть или же соответственно это последовательность в белке или часть ее в таком виде, в каком она обычно существует ίη νίνο.

Стандартные условия гибридизации - это солевые и температурные условия, преимущественно эквивалентные значениям от 0,5 Х 88С до примерно 5 Х 88С и 65°С как для гибридизации, так и для промывки. Понятие «стандартные условия гибридизации» используется здесь в качестве операционного определения и включает в себя спектр условий гибридизации. См. также ОнггеШ Ρτοΐοοοίδ ίη Мо1еси1аг В1о1о§у, 1о1п ^11еу & δοηκ, 1пс. Ыете ΥοιΈ разделы 6.3.16.3.6 (1989).

«Контролирующая экспрессию последовательность» - это последовательность полинуклеотидов, которая контролирует и регулирует экспрессию генов при оперативном связывании с этими генами.

«Оперативно связанный» - это полинуклеотидная последовательность (ДНК, РНК), оперативно связанная с контролирующей экспрессию последовательностью, когда контролирующая экспрессию последовательность контролирует и регулирует транскрипцию и трансляцию этой нуклеотидной последовательности. В понятие «оперативно связанный» входит соответствующий сигнал начала процесса (например АТС) в передней части экспрессируемой полинуклеотидной последовательности и сохранение корректной рамки считывания для обеспечения экспрессии полинуклеотидной по следовательности под контролем контролирующей экспрессию последовательности и образование целевого полипептида, кодируемого полинуклеотидной последовательностью.

«Вектор экспрессии» - это полинуклеотид, например, ДНК-плазмида или фаг (наряду с другими обычными примерами), который запускает экспрессию, по крайней мере, одного гена, когда вектор экспрессии вводится в клетку-хозяина. Этот вектор может иметь способность к репликации в клетке, но это не обязательно.

«Изолированный» (используется наравне с термином «практически чистый») - этот термин, будучи применен к нуклеиновой кислоте, то есть к полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептиды, относится к полинуклеотиду ДНК или РНК, к части геномного полинуклеотида, к кДНК или к синтетическому полинуклеотиду, который по своему происхождению или в результате манипуляций: (ί) не ассоциирован со всем полинуклеотидом, с которым он ассоциирован в естественных условиях (например, он присутствует в клетке-хозяине в роли вектора экспрессии или его части); или (и) соединен с нуклеиновой кислотой или с другой химической структурной единицей, которая отлична от той, с которой он соединен в естественных условиях; или (ίίί) он не существует в природе. Понятие «изолированный» относится также к полинуклеотидной последовательности, которая: (ί) размножена ίη νίΐτο, например, в результате полимеразной цепной реакции (ПЦР);

(ίί) синтезирована химическим путем; (ίίί) получена путем рекомбинантного клонирования; или (ίν) очищена в результате расщепления и разделения с помощью геля.

Тогда «практически чистая нуклеиновая кислота» представляет собой нуклеиновую кислоту, которая не находится в непосредственном соседстве с одной или с обеими кодирующими последовательностями, с которыми она обычно связана в естественном состоянии генома в организме, послужившем источником этой нуклеиновой кислоты. Практически чистая ДНК включает в себя также рекомбинантную ДНК, которая является частью гибридного гена, кодирующего последовательность хеджхог-белка.

«Изолированный» (используется наравне с термином «практически чистый») - этот термин, будучи применен к полипептиду, относится к полипептиду или к его части, которые по своему происхождению или в результате манипуляций (ί) присутствуют в клетке-хозяине в качестве продукта экспрессии вектора экспрессии или его части; или (ίί) соединены с белком или с другой химической структурой, которая отлична от той, с которой они соединены в естественных условиях; или (ίίί) они не существуют в природе, например это белок, который подвергался химическим превращениям с присоедине нием или добавлением, по крайней мере, одной гидрофобной структурной единицы с образованием белка, который в естественных условиях не встречается. Понятие «изолированный» относится также к белку, который: (1) получен синтетическим путем; или (ίί) получен в результате экспрессии в клетке хозяине и очищен от ассоциированных и загрязняющих белков. В общем случае это понятие относится к полипептиду, который отделен от других белков и нуклеиновых кислот, вместе с которыми он обычно встречается. Предпочтительно полипептид отделяют и от таких веществ как антитела или гелевые матрицы (полиакриламид), которые используют для его очистки.

«Гетерологичный промотор» - это понятие используется здесь для обозначения промотора, который в естественных условиях не ассоциирован с геном или с очищенной нуклеиновой кислотой.

«Гомологичный» - это используемое здесь понятие является синонимом понятия «идентичность» и относится к подобию в последовательности двух белковых молекул или двух нуклеиновых кислот. Если положение в двух сравниваемых последовательностях занимает одна и та же мономерная субъединица основания или аминокислоты (например, если положение в каждой из двух молекул ДНК занято аденином или положение в каждом из двух пептидов занято лизином), то тогда соответствующие молекулы гомологичны по этому положению. Процент гомологичности между двумя последовательностями представляет собой результат деления числа парных или гомологичных положений в двух последовательностях на число сравниваемых положений и умножения на 100. Например, если 6 из 10 положений в двух последовательностях парные или гомологичные, то гомологичность этих двух последовательностей составляет 60%. В другом примере последовательности ДНК СТОЛ СТ и СЛССТТ имеют 50%-ную гомологию (парные 3 положения из общего числа, равного 6). В общем случае сравнение проводят таким образом, чтобы две последовательности сопоставлялись в положении, которое дает максимальную гомологию. Такое сопоставление может быть проведено с использованием, например, способа №ей1етап е! а1., 1. Μοί. ΒίοΙ. 48, 443-453 (1970), воплощаемого обычно в такие компьютерные программы как Л1щп ргодгат (ΩΝΑδΙαΓ. 1пс.). Гомологичные последовательности объединяют идентичные или подобные аминокислотные остатки, когда подобные остатки представлены консервативными заменами или «допустимыми точечными мутациями» соответствующих аминокислотных остатков в соответственно сопоставленной последовательности. С этой точки зрения «консервативная замена» сопоставляемого остатка в последовательности представляет собой такие замены, которые по физическим показателям или функционально подобны соответствующим сопоставляемым остаткам, например, при этом сохраняется размер, форма, электрический заряд, химические свойства, включая способность к образованию ковалентных или водородных связей, и тому подобное. В частности, предпочтение отдается таким консервативным замена, которые соответствуют критериям, определяемым для «допустимой точечной мутации» и описанным в работе Эау1юГГ е! а1., 5: А11ак оГ Рто!еш 8ес.|иепсе апй 81тис1ите, 5: 8ирр1. 3, с1ар!ег 22: 354-352, Να!. Вютей. Век. Еоипйа!юп, ^акЫпд!оп, Э.С. (1978).

Понятия «хеджхог-белок» или «хеджхогполипептид» которые могут заменять друг друга при их использовании, в рамках настоящего изобретения относятся к согласованной аминокислотной последовательности 8 ЕС ΙΌ ΝΟ: 4 или по крайней мере к части ее. Это понятие включает в себя хеджхог-полипептид или функциональный вариант хеджхог-полипептида, или гомолог хеджхог-полипептида, или функциональный вариант, который проявляет биологическую активность. В частности, сюда входит получение белков и их пептидильных фрагментов, которые могут быть представлены как агонистическими, так и антагонистическими формами, что будет освещено в специальном контексте. Используемое при этом понятие «биологически активный фрагмент хеджхог-белка» относится к фрагменту полной длины хеджхогполипептида, когда этот фрагмент проявляет свойства специфичного агониста или антагониста индуктивного отклика, медиатором которого служат естественные типы хеджхог-белков. Предпочтительно биологически активный фрагмент хедхог-белка представляет собой растворимую внеклеточную часть хеджхог-белка, когда растворимость относится к сравнимым по физиологическим показателям растворам. Примеры биологически активных фрагментов описаны в конвенционных заявках на международный патент № 95/18856 и № 96/17924. В предпочтительных вариантах соответствующие настоящему изобретению хеджхог-полипептиды связываются с пэтч-белком.

Понятие «соответствует чему-либо», отнесенное к определенной последовательности в полипептиде или в нуклеиновой кислоте, означает, что последовательность, о которой идет речь, идентична или гомологична соотносимой последовательности, о которой говорится как о соответствующей.

Понятия «пептид (пептиды)», «белок (белки)» и «полипептид (полипептиды)» в представленных материалах заменяют друг друга. Понятия «полинуклеотидная последовательность» и «нуклеотидная последовательность» также заменяют здесь друг друга. Понятия «фрагмент хеджхог-белка» и «Ν-концевой фрагмент хеджхог-белка» используются наравне с понятием «хеджхог-белок».

Молекула хеджхог-белка имеет «биологическую активность» в том случае, если она имеет хотя бы одно из перечисленных далее свойств; (ί) молекула отвечает критериям согласованности, определяемым последовательностью (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 4), и она способна связываться с ее рецептором в интегрированном виде или молекула кодирует в результате экспрессии полипептид, который имеет эти характеристики; (ίί) в молекуле собраны определенные здесь для хеджхог-белка критерии согласованности или она кодирует в результате экспрессии полипептид, который имеет эти характеристики; и (ш) молекула может индуцировать активность щелочной фосфатазы в клетках С3Н10Т1/2. В общем случае любой белок имеет «биологическую активность», если белок проявляет в опытах ίη νίΐΓΟ активность, свойства или характеристики, которые любой специалист в этой области может определить как соответствующие, сопоставимые или в разумных пределах предсказуемые по отношению к эффектам ίη νίνο.

Понятие «гидрофобный» относится к тенденции химических структурных единиц с неполярными атомами взаимодействовать с такими же атомами более предпочтительно, чем с водой или другими полярными атомами. «Гидрофобные» материалы чаще всего нерастворимы в воде. Натуральные продукты с гидрофобными свойствами включают в себя липиды, жирные кислоты, фосфолипиды, сфинголипиды, ацилглицерины, воски, стеролы, стероиды, терпены, простагландины, тромбоксаны, лейкотриены, изопреноиды, ретиноиды, биотин и такие гидрофобные аминокислоты как триптофан, фенилаланин, изолейцин, лейцин, валин, метионин, аланин, пролин и тирозин. Химическая структурная единица гидрофобна или имеет гидрофобные свойства, если ее физические свойства определяются присутствием неполярных атомов. Это понятие включает в себя и липофильные группы.

Понятие «липофильная группа» в данном контексте связанное с полипептидом, относится к группе, отмеченной высоким содержанием углеводородной составляющей, которая придает группе высокое сродство к липидным фазам. Липидная группа может быть, например, сравнительно длинноцепочечной алкильной или циклоалкильной (предпочтительно н-алкильной) группой с примерным числом атомов углерода от 7 до 30. Алкильная группа может заканчиваться гидроксильным или первичным аминным «хвостом». Дополнительно это иллюстрируется тем, что липофильные молекулы включают в себя получаемые из природных источников и синтетические ароматические и неароматические структурные единицы, например, жирные кислоты, сложные эфиры и спирты, другие липидные молекулы, такие каркасные структуры, как адамантан и бак-минстерфуллерены, а также такие ароматические углеводоро ды, как бензол, перилен, фенантрен, антрацен, нафталин, пирен, хризен и нафтацен.

Фраза «внутренняя аминокислота» относится к любой аминокислоте в пептидной последовательности, которая не является ни Νконцевой аминокислотой, ни С-концевой аминокислотой.

Фраза «поверхностная аминокислота» относится к любой аминокислоте в пептидной последовательности, которая обращена к растворителю, когда белок свернут в свою нативную форму.

Фраза «внеклеточный регуляторный белок» относится к любому белку, который секретируется клеткой или который связан с клеткой с ее внешней стороны и который при связывании с рецептором для этого белка на клеткемишени вызывает в клетке-мишени отклик.

«Эффективное количество», например, хеджхог-полипептида с учетам соответствующих способов лечения, относится к количеству полипептид в лекарственной форме, которое, будучи применено в качестве части предписанного режима дозировки, вызывает, например, изменение скорости клеточного деления и/или состояния дифференцировки клетки и/или изменение доли сохранившихся клеток в соответствии с клинически приемлемыми стандартами для лечения отклонений или для косметических целей.

«Пациент», или «субъект», которого лечат соответствующим способом, может быть человеком или отличным от человека животным.

«Состояние роста» клетки относится к скорости деления клетки и к состоянию дифференцировки клетки.

Практикой настоящего изобретения рекомендуются, если не указано иное, обычные приемы клеточной биологии, культивирования клеток, молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантной ДНК, химии белков и иммуннологии, которыми владеют специалисты в этой области. Такие приемы описаны в литературе.

ΙΙ. Общие свойства изолированных хеджхог-белков.

Полипептидная часть композиций хеджхог-белков может быть получена способом согласно изобретению с помощью разнообразных приемов, включающих в себя очистку содержащихся в природных субстратах белков, белков, полученных рекомбинантным способом и методами синтетической химии. Полипептидные формы хеджхог-лекарств предпочтительно происходят от хеджхог-белков позвоночных, например, они имеют соответствующие естественным хеджхог-белкам или их фрагментам последовательности из организмов позвоночных. Хотя следует отдавать должное и тому, что хеджхог-полипептид может соответствовать хеджхог-белку (или его фрагменту), который содержится в каком-либо метазойном организме.

Изолированные хеджхог-белки, используемые в соответствующих настоящему изобретению способах, представляют собой встречающиеся в природе или рекомбинантные белки семейства хеджхог-белков, и источниками для них могут служить как беспозвоночные, так и позвоночные (см. приведенные далее ссылки). Члены семейства хеджхог-белков позвоночных имеют гомологию с белками, которые кодируются геном Бгокорййа-хеджхог (йй) (33). В настоящее время комбинированный скрининг мышиной геномной и кДНК библиотек привел к идентификации трех йй двойников млекопитающих, относящихся к Соник хеджхог (8йй), Индиан хеджхог (1йй) и Дезерт хеджхог (Бйй), которые есть также у других млекопитающих, включая человека, а также у рыб и у птиц. Другие члены включают в себя Мунрат хеджхог (Мйй), а также Соник йй цыплят и Соник йй рыбы зебры.

Гены 8йй мыши и цыплят, а также 1йй мыши кодируют гликопротеины, которые подвергаются расщеплению с образованием аминоконцевого фрагмента с массой около 20 кДа (см. фиг. 8) и карбоксиконцевого фрагмента с массой около 25 кДа. Наиболее предпочтительный фрагмент 20 кДа имеет согласованную последовательность 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 4 и включает в себя аминокислотные последовательности 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ8: 1-3. В рамках настоящего изобретения рассматриваются и другие разнообразные фрагменты, которые включают в себя структурную единицу 20 кДа. В число сообщений, посвященных этим последовательностям, а также их химическим и физическим свойствам, входят (3438); конвенционная заявка на международный патент № 95/23223 (1екке11, Όοάά, Воейпк и Ей1ипй), заявка на международный патент № 95/18856 (1пдйат, МсМайоп и ТаЫп) и заявка на международный патент № 96/17924 (Веасйу еί а1.).

Семейство членов, которые могут найти применение в соответствующих изобретению способах, включает в себя любые из встречающихся в естественных условиях нативных хеджхог-белков, в том числе аллельные, филогенетические двойники или другие возможные варианты, полученные из естественных источников или полученные химическим путем, включая мутеины или мутантные белки, а также рекомбинантные формы и новые активные члены семейства хеджхог-белков. В частности, находят применение полипептиды, включающие 8ЕО ΙΌ ΝΟ8: 1-4.

Изолированные хеджхог-полипептиды, используемые в способе согласно изобретению, проявляют биологическую активность. Полипептиды включают аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 60, 80, 90, 95, 98 или 99% гомологична аминокислотной последовательности из 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ8: 1-4. Полипептид может также включать в себя практически ту же самую аминокислотную последовательность, что и аминокислотная последовательность в 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ8: 1-4. Длину полипептида определяют не менее чем в 5, 10, 20, 50, 100 или 150 аминокислот, в числе которых не менее 5, предпочтительно не менее 10, предпочтительнее не менее 20 и наиболее предпочтительно не менее 50, 100 или 150 соединенных вместе аминокислот из 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ8: 1-4.

Предпочтительные последовательности согласно включают в себя хеджхог-полипептидную последовательность, а также другие Νконцевые и/или С-концевые аминокислотные последовательности, или же они могут включать в себя всю хеджхог-последовательность аминокислот или ее фрагмент. Изолированный хеджхог-полипептид может также представлять собой рекомбинантный слитый белок, в составе которого есть первая хеджхог часть и вторая полипептидная часть, например, вторая полипептидная часть его имеет аминокислотную последовательность, не относящуюся к хеджхог-белку. Вторая полипептидная часть может быть, например, гистидиновой меткой, связывающим мальтозу белком, глутатион-8трансферазой, связывающим ДНК доменом или доменом, активирующим полимеразу.

Соответствующие изобретению полипептиды включают в себя те из них, которые образуются в результате существования множественных генов, альтернативных эффектов транскрипции, альтернативных эффектов сплайсинга ДНК и альтернативных трансляционных и посттрансляционных эффектов. Полипептид может быть получен полностью синтетическим путем или он может образоваться в результате экспрессии в системе, например, в культивируемых клетках, что приводит практически к тем же самым посттрансляционным модификациям, которые имеют место при экспрессии белка в нативной клетке, или же в системе, которая образуется в результате пропуска посттрансляционных модификаций, имеющих место при экспрессии в нативной клетке.

В предпочтительном варианте изолированный хеджхог-полипептид представляет собой хеджхог-полипептид с одной или с несколькими из следующих характеристик:

(ί) его последовательность, по крайней мере, на 30, 40, 42, 50, 60, 70, 80, 90 или 95% идентична аминокислотам из 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ8: 1-4;

(ίί) Ν-концевом у него служит цистеин или его функциональный эквивалент;

(ш) он может индуцировать активность щелочной фосфатазы в клетках С3Н10Т1/2;

(ίν) идентичность его полной последовательности полипептиду 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ8: 1-4 равна по крайней мере 50%, предпочтительно по крайней мере 60%, более предпочтительно по крайней мере 70, 80, 90 или 95%;

(ν) он может быть выделен из таких естественных источников как клетки млекопитающих;

(νί) он может связываться или взаимодействовать с интегрированной системой и (νίί) он гидрофобно модифицирован (то есть он имеет по крайней мере одну гидрофобную структурную единицу, присоединенную к полипептиду).

III. Другие белки.

Поскольку существуют приемы для встраивания цистеинового остатка (или его функционального эквивалента) в первичную полипептидную последовательность, в принципе любой белок может быть превращен в его гидрофобно модифицированную форму с использованием представленных здесь способов.

Вирусные рецепторы, клеточные рецепторы и клеточные лиганды могут быть полезны в этом отношении, так как они типично связываются с клетками тканей, демонстрирующими многочисленные копии рецепторов. Применение могут найти вирусно-клеточные белковые рецепторы, из которых вместе могут быть образованы комплексы с помощью способов согласно изобретению, включая 1САМ1, рецептор риновирусов; СИ2, рецептор вируса ЭпштейнаБарр; СЭ4. рецептор вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). Другие белки включают в себя членов семейства молекул клеточной адгезии, например, ЕЬАМ-1 и УСАМ-1 и УСАМ-1Й, а также их лимфоцитных двойников (лигандов); ассоциированных с лимфоцитами антигенов ЬБА1, ЬБА2 (СИ2) и ЬБА3 (СИ58), СИ59 (второй лиганд СИ2), членов семейства СИ11/СИ18 и такие самые поздние антигены как УБА4 и их лиганды.

Иммуногены из различных патогенов (например, из бактериальных, грибковых, вирусных и других эукариотических паразитов) могут быть также использованы в качестве полипептидов в способах согласно изобретению. Бактериальные иммуногены включают в себя, не ограничиваясь этим, бактериальные источники, отвечающие за бактериальные формы пневмонии и пневмоцистную пневмонию. Паразитарные источники включают в себя паразита малярии Р1актобшт. Вирусные источники включают в себя поксвирусы (например, оспу крупного рогатого скота, йегрек к1тр1ех, цитомегаловирусы); аденовирусы; паповавирусы (например, вирусы, вызывающие образование папиллом); парвовирусы (например, аденоассоциированные вирусы); ретровирусы (например, НТЬУ I, НТЬУ II, Н1У I и Н1У II) и другие. Иммуноглобулины или их фрагменты могут также выступать в роли полипептидов, которые могут быть модифицированы в соответствии с настоящим изобретением. С использованием общепринятых способов (49) можно генерировать моноклональные Бай-фрагменты, узнающие специфические антигены, и использовать индивидуальные Бай-домены в качестве функциональных единиц в соответствующих изобретению многомерных структурах. Таким образом можно использовать другие белки, включающие в себя гельсолин (50), цитокины, в число которых входят разнообразные интерфероны (интерферон-α, интерферон-β и интерферон-γ), разнообразные интерлейкины (например, ГЕ-1, 2, -3, -4 и подобные им), факторы некроза опухоли-α и -β; колониестимулирующий фактор моноцитов (М-С8Б), колониестимулирующий фактор гранулоцитов (С-С8Б), колониестимулирующий гранулоцитов/макрофагов (СМС8Б), эритропоэтин, фактор роста из тромбоцитов (РИСБ), а также гормоны человека и животных, включая гормоны роста и инсулин.

В общем случае структура соответствующих настоящему изобретению модифицированных белков имеет общую формулу А-С’ук-|8р|В-[8р]-Х, где А означает гидрофобную структурную единицу, Сук означает цистеин или его функциональный эквивалент, [8р] означает необязательную спейсерную пептидную последовательность, В означает белок (который, необязательно может иметь еще одну спейсерную пептидную последовательность) и Х означает гидрофобную структурную единицу, связанную (необязательно через спейсерный пептид) с Сконцевым фрагментом белка или другим участком на поверхности белка, причем дериватизированный белок включает в себя по крайней мере один из А или X. Если Х представлен холестерином, тогда В может быть, а может и не быть хеджхог-белком. Как обсуждалось выше, роль спейсерного фрагмента состоит в том, чтобы обеспечить разделение между гидрофобной структурной единицей и остальной частью белка и тем самым облегчить образование связи гидрофобной структурной единицы (например, модифицированного Ν-концевого цистеина) с другой структурной единицей, которая может быть липидом или везикулой. Спейсер нужен также для того, чтобы затруднить взаимодействие модифицирующего фрагмента с белковой функцией. Длина спейсера может не превышать длины одной единственной аминокислоты. В общем случае предпочтение отдается пролинам и глицинам. В частности, предпочтительная разделяющая последовательность присутствует в Соник хеджхог-белке - это аминокислотная последовательность С-Р-С-Р.

ТУ. Получение рекомбинантных полипептидов.

Описываемые здесь изолированные полипептиды могут быть получены любым известным подходящим для этого способом. Такие способы простираются от прямых синтетических методик до конструирования последовательности ДНК, кодирующей последовательности изолированных полипептидов и приводящей к экспрессии этих последовательностей в подходящем трансформированном хозяине.

В одном из вариантов реализации рекомбинантного способа последовательность ДНК конструируют путем выделения или синтеза последовательности ДНК, кодирующей естественный тип представляющего интерес белка. При желании такая последовательность может быть подвергнута сайт-специфическому мутагенезу для получения ее функционального аналога. См., например, (40) и патент США № 4588585. Другой способ конструирования последовательности ДНК, кодирующей представляющий интерес полипептид, может быть представлен химическим синтезом с использованием олигонуклеотидного синтезатора. Дизайн таких олигонуклеотидов может быть предпочтительно основан на аминокислотной последовательности целевого полипептида, для этого предпочтительно выбирают такие кодоны, которые более благоприятны для клетки-хозяина, в которой будет продуцироваться представляющий интерес рекомбинантный полипептид.

Стандартные способы могут быть применены для синтеза изолированной полинуклеотидной последовательности, кодирующей представляющий интерес изолированный полипептид. Например, полная аминокислотная последовательность может быть использована для конструирования ретранслированного гена (см. Машабк е( а1., выше). Кроме того, возможен синтез олигомера ДНК, содержащего нуклеотидную последовательность, которая кодирует конкретный изолированный полипептид. Например, можно синтезировать несколько небольших олигонуклеотидов, кодирующих части целевого полипептида, и после этого объединить их. Такие индивидуальные олигонуклеотиды обычно содержат «свешивающиеся» 5'- или по 3'-участки для последующей комплементарной сборки.

После сборки (синтетическим путем, сайтспецифическим мутагенезом или другим способом) мутантные последовательности ДНК, кодирующие представляющий интерес конкретный изолированный полипептид, внедряют в вектор экспрессии и оперативно соединяют с контролирующей экспрессию последовательностью, которая подходит для экспрессии белка в желательном хозяине. Правильность сборки может быть подтверждена секвенированием нуклеотида, ограниченным картированием и экспрессией биологически активного полипептида в подходящем хозяине. В этой области хорошо известно, что для получения высокого уровня экспрессии трансфектного гена в хозяине ген должен быть оперативно соединен с транскрибирующими и транслирующими последовательностями контроля экспрессии, которые функционально значимы в выбранном для экспрессии хозяине.

Выбор последовательности контроля экспрессии и вектора экспрессии зависит от выбора хозяина. Используется широкое разнообразие комбинаций из хозяина экспрессии и вектора. В качестве векторов экспрессии для эукариотических хозяев используются, например, векторы, включающие в себя последовательности контроля экспрессии из 8У40, вируса бычьей папилломы, аденовируса и цитомегаловируса. Могут быть использованы векторы экспрессии для бактерий-хозяев, включая такие известные бактериальные плазмиды, как плазмиды из Екбег1сЫа со11, в том числе рСКГ, рВК.322, рМВ9 и их производные, плазмиды более широкого спектра хозяев, например, М13 и фаги с однонитевыми ДНК. Предпочтительные векторы Е.СоН включают в себя векторы рЬ, содержащие рЬ промотор лямбда-фага (патент США № 4874702), векторы рЕТ, содержащие промотор Т7 полимеразы (8(ыб1ег е( а1., МеЛобк ίη Епхуто1оду 185: 60-89, 1990 1) и вектор р8Р72 (Каебп е! а1., см. выше). Могут быть использованы и векторы экспрессии для дрожжевых клеток, например, включая 2Т и центромерные плазмиды.

В дополнение к этому в таких векторах может быть использовано широкое разнообразие контролирующих экспрессию последовательностей. В число таких используемых контролирующих экспрессию последовательностей входят контролирующие экспрессию последовательности, которые ассоциированы со структурными генами предыдущих векторов экспрессии. Примеры используемых контролирующих экспрессию последовательностей включают в себя, например, ранние и поздние промоторы 8У40 или аденовируса, 1ас-систему, бр-систему, ТАС- или ТВС-систему, область главного оператора и промотора фага лямбда, например, рЬ, контрольную область Гб-белка оболочки, промотор для 3-фосфоглицераткиназы или других гликолитических ферментов, промотеры кислой фосфатазы, например, Р1о5, промотеры системы α-спаривания дрожжей и другие системы, о которых известно, что они контролируют экспрессию генов прокариотических и эукариотических клеток и их вирусов, а также их разнообразные комбинации.

Любой подходящий хозяин может быть использован для количественного получения описанных здесь изолированных хеджхогполипептидов, включая бактерии, грибки (в том числе дрожжи), растения, насекомых, млекопитающих или другие подходящие клетки животных или линии клеток, а также трансгенные животные и растения. В частности, в число этих хозяев могут входить хорошо известные эукариотические и прокариотические хозяева, такие как штаммы Е.соб, Ркеиботопак, Вас111ик, 81гер1:отусек, грибки, дрожжи (например, Напкепи1а), такие клетки насекомых как 8робор1ега Ггищрегба (8Е9) и Нщ11 Е1уе™ (см. пример 1), такие клетки животных как клетки яичника китайского хомяка (СНО), такие клетки мыши, как Ν8/0-клетки, клетки зеленой африканской обезьяны С081, С08 7, В8С 1, В8С 40 и ВМТ 10, а также клетки человека и клетки растений.

Следует понимать, что не все векторы и контролирующие экспрессию последовательности будут функционировать одинаково хорошо при экспрессии данного изолированного полипептида. Точно так же не все хозяева будут функционировать одинаково хорошо с той же самой системой экспрессии. Однако специалист в этой области может провести селекцию среди этих векторов, контролирующих экспрессию систем и хозяев без чрезмерных экспериментирований. Например, для получения изолированного представляющего интерес полипептида в широкомасштабной культуре животных нужно контролировать число копий вектора экспрессии. В этой области хорошо известны амплифицируемые векторы. См., например, (41) и патенты США № 4470461 и № 5122464.

Такое оперативное присоединение последовательности ДНК к контролирующей экспрессию последовательности включает в себя обеспечение трансляции стартового сигнала в правильную рамку считывания по ходу последовательности ДНК. Если полученная в результате экспрессии определенная последовательность ДНК не начинается с метионина, то стартовый сигнал приведет к появлению дополнительной аминокислоты (метионина), локализованной на Ν-конце продукта. Если гидрофобная структурная единица должна присоединиться к Ν-концу содержащего метионин белка, то белок можно использовать непосредственно в соответствующей изобретению композиции. Тем не менее, поскольку Ν-конец белка предпочтительно должен быть представлен цистеином (или его функциональным эквивалентом), метионин должен быть удален перед использованием. Способы удаления таких Ν-концевых метионинов с полипептидов, которые были получены вместе с ними при экспрессии, известны. Например, некоторые хозяева и условия ферментации позволяют проводить удаление практически всех Ν-концевых метионинов ίη νίνο. Другие хозяева нуждаются в удалении Νконцевого метионина ίη νίίτο. Такие способы ίη νίνο и ίη νίίτο хорошо известны в этой области.

Белки, продуцируемые трансформированными хозяевами, могут быть очищены в соответствии с любым подходящим для этого способом. Такие стандартные способы включают в себя хроматографию (например, ионоοбменную, аффинную и гель-хроматографию на колонке, центрифугирование, способ дифференциальной растворимости или любые другие стандартные приемы для очистки белков. Для иммуноаффинной хроматографии (см. пример 1) такой белок как Соник хеджхог может быть изолирован путем связывания его на аффинной колонке, содержащей фиксированные на стационарном носителе антитела, выработанные на Соник хеджхог или на родственный ему белок. Альтернативно аффинные метки, например, гексагистидин, домен связывания мальтозы, последовательность оболочки гриппа и глутатион-8трансфераза, могут быть присоединены к белку для того, чтобы упростить его очистку при пропускании через соответствующую аффинную колонку. Изолированные белки могут быть также охарактеризованы физически с использованием таких приемов как протеолиз, ядерный магнитный резонанс и рентгеновская кристаллография.

А. Продуцирование фрагментов и аналогов.

Фрагменты изолированного белка (например, фрагменты 8ЕС ΙΌ Ν08: 1-4) могут быть также эффективно продуцированы рекомбинантными способами, протеолитическим ферментированием или путем химического синтеза с использованием известных специалисту в этой области способов. В рекомбинантных способах внутренние или концевые фрагменты полипептида могут быть получены в результате удаления одного или нескольких нуклеотидов с одного конца (для концевого фрагмента) или с обоих концов (для внутреннего фрагмента) последовательности ДНК, которая кодирует изолированный хеджхог-полипептид. Экспрессия мутантной ДНК производит полипептидные фрагменты. Ферментация с «откусывающими концевые кусочки» эндонуклеазами также может генерировать молекулы ДНК, которые кодируют набор фрагментов. Молекулы ДНК, которые кодируют фрагменты белка, могут быть также получены в результате неизбирательных разрывов, ограниченной ферментации или комбинации этих методик. Фрагменты белка могут быть получены прямо из целостного белка. Пептиды могут быть подвергнуты специфическому расщеплению протеолитическими ферментами, в число которых входят плазмин, тромбин, трипсин, химотрипсин или пепсин, но и не только они. Каждый из этих ферментов специфичен к типу атакуемых пептидных связей. Трипсин катализирует гидролиз пептидных связей, карбонильная группа которых происходит от основной аминокислоты, обычно от аргинина или от лизина. Пепсин и химотрипсин катализируют гидролиз пептидных связей ароматических аминокислот, например, триптофана, тирозина и фенилаланина. Альтернативные наборы полученных расщеплением белка фрагментов образуются в результате предотвращения расщепления в том месте, на которое нацелен протеолитический фермент. Например, реакция εаминогруппы кислоты лизина с этилтрифтортиоацетатом в умеренно основном растворе приводит к блокированным аминокислотным остаткам, и соединенная с ними пептидная связь уже не чувствительна к гидролизу трипсином.

Белки могут быть модифицированы так, чтобы образовались пептидные связи, которые чувствительны к протеолитическим ферментам. Например, алкилирование цистеиновых остатков β-галогенэтиламинами делает пептидные связи гидролизующимися трипсином (51). В дополнение к этому могут быть использованы химические реагенты, которые расщепляют пептидные цепи по специфическим остаткам. Например, бромциан расщепляет пептиды по метиониновым остаткам (52). В соответствии с изложенным, при обработке белков различными комбинациями модификаторов, протеолитическими ферментами и/или химическими реагентами белки могут быть разделены на фрагменты желаемой длины без перекрывания фрагментов или разделены на перекрывающиеся фрагменты желаемой длины.

Фрагменты могут быть также синтезированы химическим путем с использованием таких известных в этой области приемов как твердофазный синтез Меррифильда с Е-птос или ίВ0С химизмом. МегпПе1й. Песен) Ргодгекк ίη Ηοηηοικ Пе5еагс1 23: 451 (1967).

Далее обсуждаются примеры методик первого рода, которые позволяют получать и испытывать фрагменты и аналоги. Эти или аналогичные способы могут быть использованы для получения и скрининга фрагментов и аналогов изолированного полипептида (например, хеджхог), который, как можно показать, обладает биологической активностью. В качестве примера может быть приведен способ выявления биологической активности у фрагментов и аналогов хеджхог-белка, представленный в примере 3.

В. Получение измененных ДНК и пептидных последовательностей: неспецифические способы.

Варианты аминокислотных последовательностей белка (например, варианты 8ЕО ΙΌ Ν08: 1-4) могут быть получены в результате неспецифического мутагенеза ДНК, которая кодирует белок или определенную его часть. Используемые для этого способы включают в себя РСК-мутагенез и насыщающий мутагенез. Библиотека случайных вариантов аминокислотных последовательностей может быть также получена при синтезе набора вырожденных олигонуклеотидных последовательностей. Способы генерирования вариантов аминокислотных последовательностей конкретного белка с использованием измененной ДНК и пептидов хорошо известны в этой области. Следующие далее примеры таких способов не могут служить основанием для сужения объема притязаний настоящего изобретения, но прежде всего служат для иллюстрации показательных приемов. Лица, имеющие обычную специализацию в этой области, поймут, что для этого могут быть использованы и другие способы.

РСК-Мутагенез: кратко, Тад-полимераза (или другая полимераза) используется для вве дения случайных мутаций в клонированный фрагмент ДНК (42). Условия РСК. выбирают таким образом, чтобы точность синтеза ДНК была понижена Тад-ДНК полимерами с использованием, например, соотношения йГТФ/йАТФ, равного пяти, и добавления Мд²⁺ к РСПреакции. Пул амплифицированных фрагментов ДНК внедряют в подходящий вектор клонирования для получения библиотек случайных мутаций.

Насыщающий мутагенез: один способ описан в общем виде в (43). Кратко, эта техника включает в себя генерирование мутаций в результате химической или радиационной обработки однонитевой ДНК ίη νίίτο или синтеза нити кДНК. Частота мутаций модулируется интенсивностью обработки, и в основном могут быть получены все возможные замены оснований.

Мутагенез вырожденных олигонуклеотидов: библиотека гомологичных пептидов может быть генерирована из набора вырожденных олигонуклеотидных последовательностей. Химический синтез вырожденных последовательностей может быть выполнен на автоматическом синтезаторе ДНК, и синтетические гены после этого присоединяют к подходящему вектору экспрессии. См., например, (44, 45) и 11акига еί а1. ^^ιηΝηηηΐ ΌΝΆ, Ргас. 3^гй С1еуе1анй 8νιηρο5ίιιιη οη Μас^οтο1еси1е8, ρρ. 273-289 (Α^^Κοη, ей.), ЕБеу^ес Атйегйат, 1981.

С. Получение измененных ДНК и пептидных последовательностей: направленные способы.

Избирательный, или направленный, мутагенез приводит к получению специфических последовательностей или мутаций в специфических частях полинуклеотидной последовательности, кодирующей изолированный полипептид, для получения вариантов, которые включают в себя делеции, вставки или замещения остатков известной аминокислотной последовательности изолированного полипептида. Точки мутаций могут быть изменены индивидуально или в сериях, например, путем: (1) замещения сначала сохранившихся аминокислот и затем с большим выбором радикалов, в зависимости от достигнутых результатов; (2) удаления целевых остатков или (3) встраивания остатков того же самого или другого класса, примыкающих к локализованному месту, или путем комбинации вариантов 1-3.

Очевидно, что такие сайт-направленные способы представляют собой один из путей, по которым Ν-концевой цистеин (или функциональный эквивалент) может быть введен в данную полипептидную последовательность, чтобы в нем появился сайт для присоединения гидрофобной структурной единицы.

Сканирующий аланиновый мутагенез: этот способ определяет местонахождение тех остатков или участков целевого белка, которые пред ставляют собой предпочтительные участки для мутагенеза (46). В аланиновом скрининге выбирают остаток или группу остатков-мишеней и замещают на аланин. Это замещение может влиять на взаимодействие аминокислоты с соседними аминокислотами и/или с окружающим водным или мембранным окружением. Свойства тех из них, у которых имеется функциональная чувствительность к замещениям, после этого могут быть улучшены за счет введения дополнительных или других вариантов по месту замещения или вместо него.

Мутагенез с помощью олигонуклеотидов: одна из версий этого способа может быть использована для получения вариантов ДНК с замещением, делецией или со вставкой (47). Кратко, желаемую ДНК изменяют путем гибридизации олигонуклеотидного праймера, кодирующего мутацию ДНК, и матрицы ДНК, которая в типичном случае представляет собой однонитевую форму плазмиды или фага, содержащую неизмененную или дикого типа последовательность ДНК матрицы целевого белка (например, хеджхог-белка). После гибридизации используют ДНК-полимеразу для того, чтобы сделать вторую и комплементарную нить ДНК матрицы, в составе которой будет оли-гонуклеотидный праймер и которая будет кодировать выбранное изменение в желаемой последовательности ДНК. В общем случае используют олигонуклеотиды, длина которых составляет не менее 25 нуклеотидов. Оптимальный олигонуклеотид будет содержать от 12 до 15 нуклеотидов, которые полностью комплементарны матрице с обеих сторон от мутации. Это обеспечивает то, что олигонуклеотид будет правильно гибридизован с однонитевой ДНК молекулы матрицы.

Кассетный мутагенез: для этого способа (48) требуется плазмида или иной вектор, которые содержат предназначенную для мутации белковую субъединицу ДНК. Кодон (кодоны) в белковой субъединице ДНК идентифицируют и встраивают единственный сайт рестриктирующей эндонуклеазы с каждой из сторон от идентифицированного мутантного сайта (мутантных сайтов), используя описанный выше направленный на олигонуклеотид способ мутагенеза. После этого плазмиду разрезают по этим сайтам с целью ее линеаризации. Двухнитевой олигонуклеотид, кодирующий последовательность ДНК между сайтами рестрикции, но содержащий желаемую мутацию (желаемые мутации), синтезируют с использованием стандартных процедур. Две нити синтезируют раздельно и после этого гибридизуют вместе, используя стандартные способы. Этот двухнитевой олигонуклеотид представляет собой «кассету» и у него есть 3'- и 5'-концы, которые совместимы с концами линеаризованной плазмиды так, что непосредственно по ним их можно соединить. Теперь плазмида содержит желаемую мутантную белковую субъединицу последовательности ДНК.

Комбинаторный мутагенез: по одной из версий данного способа (Ьабиег с1 а1., международная заявка на патент № 88/06630) аминокислотные последовательности для группы гомологов или других родственных белков выравнивают, предпочтительно до достижения максимально возможной степени гомологии. Все аминокислоты, которые проявляются в данном положении выровненной последовательности, могут быть выбраны для создания вырожденного набора комбинаторных последовательностей. В результате комбинаторного мутагенеза на уровне нуклеиновых кислот создается пестрая библиотека и она кодируется пестрой библиотекой генов. Например, смесь синтетических олигонуклеотидов может быть ферментативным путем присоединена к генной последовательности так, чтобы стала возможной экспрессия вырожденного набора потенциальных последовательностей в индивидуальные белки, или альтернативно, в набор белков, содержащих полный набор вырожденных последовательностей.

Ό. Другие варианты изолированных полипептидов.

В настоящее изобретение включены такие изолированные молекулы, как аллельные варианты, естественные мутанты, индуцированные мутанты и белки, кодированные ДНК, гибридизующейся в более или менее жестких условиях с образованием нуклеиновой кислоты, которая кодирует такие полипептиды как Ν-концевой фрагмент Соник хеджхог (8ЕО ΙΌ Ν0:1), и полипептиды, специфично связанные антисыворотками с хеджхог-пептидами, в первую очередь антисыворотками с активными центрами или связывающими сайтами хеджхог. Все описанные здесь варианты предназначены для (ί) сохранения биологической функции исходного белка и (ίί) сохранения способности к связыванию с гидрофобной структурной единицей (например, с липидом).

Соответствующие настоящему изобретению способы показывают также использование фрагментов, предпочтительно биологически активных фрагментов, или аналогов такого изолированного пептида как хеджхог. В первую очередь биологически активный фрагмент или аналог имеет некоторую активность ίη νίνο или ίη νίΐτο, которая характерна для пептида, показанного в 8ЕО ΙΌ Ν08: 1-4, или для другого изолированного хеджхог, встречающегося в естественных условиях. Наиболее предпочтительно, чтобы гидрофобно модифицированный фрагмент или аналог имел не менее 10%, предпочтительно 40% или еще больше, или же наиболее предпочтительно не менее 90% активности Соник хеджхог (см. пример 3) в любом опыте ίη νίνο или ίη νίΐτο.

Аналоги могут отличаться от встречающегося в естественных условиях изолированного белка аминокислотной последовательностью или таким образом, что последовательность в этом не участвует, или же и тем и другим. Наиболее предпочтительные соответствующие настоящему изобретению полипептиды имеют предпочтительно не затрагивающие последовательность модификации, включающие химическую дериватизацию ίη νίνο или ίη νίίτο (например, по Ν-концу), а также возможными изменениями являются ацетилирование, метилирование, фосфорилирование, амидирование, карбоксилирование или гликозилирование.

Другие аналоги включают в себя такой белок как Соник хеджхог или его биологически активные фрагменты, последовательность которых отличается от согласованных последовательностей естественного типа (например, 8Ε0 ΙΌ ΝΟ: 4) одной или более консервативными заменами аминокислот или же одной или более неконсервативными заменами аминокислот, а также делециями или вставками, которые не лишают изолированный белок биологической активности. Консервативные замены в типичном случае включают в себя замену одной аминокислоты другой с подобными характеристиками, например, это замена в следующих группах: валин, аланин и глицин; лейцин и изолейцин; аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; аспарагин и глутамин; серин и треонин; лизин и аргинин; фенилаланин и тирозин. Неполярные гидрофобные аминокислоты включают в себя аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин. Полярные нейтральные аминокислоты включают в себя глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин. Положительно заряженные (основные) аминокислоты включают в себя аргинин, лизин и гистидин. Отрицательно заряженные (кислые) аминокислоты включают в себя аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту. Другие консервативные замены могут быть хорошо известны работникам с обычной специализацией. Например, для консервативной замены аминокислоты аланина могут быть взяты любой из Ό-аланина, глицина, бета-аланина, Ь-цистеина и Ό-цистеина. Для лизина заменой может быть любой из Ό-лизина, аргинина, Όаргинина, гомоаргинина, метиони-на, Όметионина, орнитина или Ό-орнитина.

В общем случае можно ожидать, что замены приведут к изменениям в функциональных свойствах изолированных полипептидов в тех случаях, когда (ί) полярный остаток, например, серина или треонина, заменяют (или замещают) гидрофобным остатком, например, лейцином, изолейцином, фенилаланином или аланином; (ίί) цистеиновый остаток заменяют (или замещают) любым другим остатком (см. пример 10); (ш) остаток с электроположительной боковой цепью, например, лизина, аргинина или гистидина, заменяют (или замещают) остатком с электроотрицательной боковой цепью, например, глутаминовой кислотой, аспарагиновой кислотой; или (ίν) остаток с объемной боковой цепью, например, фенилаланина, заменяют (или замещают) остатком без такой боковой цепи, например, глицином.

Другие аналоги, используемые в рамках соответствующих изобретению способов, представлены модификациями, которые повышают стабильность пептидов. Такие аналоги могут содержать, например, одну или несколько непептидных связей (которые заменяют пептидные связи) в пептидной последовательности. Также включаются аналоги, в составе которых есть остатки, отличные от естественных Ьаминокислот, такие, как Ό-аминокислоты или же не встречающиеся в природе или синтетические аминокислоты, например, бета- или гаммааминокислоты и циклические аналоги. Включение Ό- вместо Ь-аминокислот в изолированный хеджхог-полипептид может повысить его стабильность по отношению к протеазам. См. патент США № 5219990 8ирга.

Понятие «фрагмент», примененное по отношению к изолированному хеджхог-аналогу, может включать такое малое как одна единственная аминокислота при условии, что при этом сохраняется биологическая активность. В нем может быть, по крайней мере, около 20 остатков, более характерно, по крайней мере, примерно 40 остатков, предпочтительно, по крайней мере, около 60 остатков в длину. Фрагменты могут быть получены способами, которые известны специалисту в этой области. Способность кандидата на роль фрагмента проявлять биологическую активность изолированного хеджхог может быть оценена описанными здесь способами, которые известны специалисту в этой области.

V. Получение гидрофобных производных.

Авторы изобретения обнаружили, что повышение общей гидрофобной природы сигналирующего белка, например, хеджхог-белка, приводит к повышению биологической активности этого белка. Эффективность такого сигналирующего белка как хеджхог может быть повышена путем: (а) химической модификации, например, добавлением гидрофобной структурной единицы к сульфгидрильной и/или к αаминогруппе Ν-концевого цистеина (примеры 8 и 9); (Ь) замены Ν-концевого цистеина гидрофобной аминокислотой (пример 10); или (с) замены Ν-концевого цистеина другой аминокислотой и последующей химической модификации заменяющего остатка, например, добавлением гидрофобной структурной единицы по месту замены.

В добавление к этому модификация белка, например хеджхог-белка, по внутреннему остатку на поверхности белка гидрофобной структурной единицей путем: (а) замены внутреннего остатка гидрофобной аминокислотой; или (Ь) замены внутреннего остатка другой аминокислотой и последующей химической модификации заменяющего остатка, например, добавле нием гидрофобной структурной единицы по месту замены (см. пример 10), сохраняет или увеличивает биологическую активность белка.

В добавление к этому модификация белка, например хеджхог-белка, по С-концу гидрофобной структурной единицей путем: (а) замены Сконцевого остатка гидрофобной аминокислотой; или (Ь) замены С-концевого остатка другой аминокислотой и последующей химической модификации заменяющего остатка, например, добавлением гидрофобной структурной единицы по месту замены, сохраняет или увеличивает биологическую активность белка.

Имеется широкий спектр липофильных структурных единиц, которыми могут быть дериватизированы хеджхог-полипептиды. Липофильная группа может быть представлена, например, сравнительно длинной алкильной цепью или циклоалкильной группой (предпочтительно это н-алкильная группа) с числом атомов углерода приблизительно от 7 до 30. Алкильная группа может заканчиваться гидроксильным или первичным аминным «хвостом». Дополнительно это иллюстрируется тем, что липофильные молекулы включают в себя получаемые из природных источников и синтетические ароматические и неароматические структурные единицы, например, жирные кислоты, сложные эфиры и спирты, другие липидные молекулы, такие каркасные структуры как адамантан и бакминстерфуллерены, а также такие ароматические углеводороды как бензол, перилен, фенантрен, антрацен, нафталин, пирен, хризен и нафтацен.

В частности, в качестве липофильных молекул могут найти применение алициклические углеводороды, насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты и другие липидные и фосфолипидные структурные единицы, воски, холестерин, изопреноиды, терпены и полиалициклические углеводороды, включая адамантан и бакминстерфуллерены, витамины, полиэтиленгликоль или олигоэтиленгликоль, ди(С1-С18)-алкиловые эфиры фосфорной кислоты, -О-СН₂-СН(ОН)-О-(С1₂-С1₈)-алкил, и в частности, конъюгаты с пиреновыми производными. Липофильная структурная единица может быть представлена липофильным красителем, пригодным для использования его в рамках настоящего изобретения, включая, но не ограничивая этим, дифенилгексатриен, Найл красный, Ν-фенилЛ-нафтиламин, продан, лауродан, пирен, перилен, родамин, родамин В, тетраметилродамин, Техас красный, сульфородамин, перхлорат 1,1 '-дидодецил-3,3,3',3'-тетраметилиндокарбоцианина, октадецилродамин В и ВООШУ-красители, поставляемые Мо1еси1аг РгоЬек Шс.

В число других примеров липофильных структурных единиц входят группы алифатических карбонильных радикалов, включая 1- или 2-адамантилацетил, 3 -метиладамантан-1илацетил, 3 -метил-3 -бром-1 -адамантилацетил, 1-декалинацетил, камфорацетил, камфанацетил, норадамантилацетил, норборнанацетил, бицикло [2.2.2]-окт-5 -енацетил, 1 -метоксибицикло [2.2.2]-окт-5 -ен-2-карбонил, цис-5-норборненэндо-2,3-дикарбонил, 5-норборнен-2-илацетил, (1В)-(-)-миртентанацетил, 2-норборнанацетил, анти-3-оксотрицикло-[2.2.1.0<2,6>]-гептан-7карбонил, деканоил, додеканоил, додеценоил, тетрадекадиеноил, дециноил или додециноил.

Структуры примеров гидрофобных модификаций показаны на фиг. 12. Если подходящая аминокислота недоступна в специфическом положении, то можно использовать сайтнаправленный мутагенез для того, чтобы поместить на это место реакционноспособную аминокислоту. В число реакционноспособных аминокислот входят цистеин, лизин, гистидин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, серин, треонин, тирозин, аргинин, метионин и триптофан. Мутагенез можно использовать для того, чтобы поместить реакционноспособную аминокислоту в Ν- или в С-конец или же во внутреннее положение.

Например, авторы изобретения обнаружили, что существует возможность химической модификации Ν-концевого цистеина биологически активного белка, такого как хеджхог-белок, или полного элиминирования Ν-концевого цистеина при все еще полном сохранении биологической активности белка, при условии, что модифицирующая или замещающая химическая структурная единица имеет гидрофобные свойства. Авторы изобретения нашли, что усиление биологической активности хеджхог-белка грубо коррелирует с гидрофобностью модификации. В дополнение к усилению активности белка модифицирование или замена Ν-концевого цистеина исключает нежелательные перекрестные реакции и/или модифицирования цистеина, которые могут протекать при получении, очистке, приготовлении лекарственных форм и при хранении белка. Тиольная группа Ν-концевого цистеина очень реакционноспособна, что связано с близостью к α-аминогруппе, которая снижает значение рКа цистеина и усиливает протонную диссоциацию и образование реакционноспособного тиолятного иона при нейтральном или кислом значении рН.

Авторы изобретения показали, что замена Ν-концевого цистеина хеджхог-белка гидрофобной аминокислотой приводит к получению белка с повышенной эффективностью в опытах по передаче сигнала в клетках. Такой основанный на замене цистеина подход исключает проблему супрессии или нежелательных превращений цистеина, которые могут протекать при получении, очистке, приготовлении лекарственных форм и при хранении белка. Общий характер такого подхода подтверждается тем, что авторы изобретения нашли три различных гидрофобных аминокислоты (фенилаланин, изо лейцин и метионин), каждая из которых приводит к более активной форме хеджхог. Следовательно, замещение цистеина какой-либо иной гидрофобной аминокислотой может привести к образованию активного белка. К тому же, поскольку авторы изобретения обнаружили корреляцию между гидрофобностью аминокислоты или ее химической модификации и эффективностью соответствующего модифицированного белка в опыте на С3Н10Т1/2 (например, Фен > Мет, длинноцепочечная жирная кислота > короткоцепочечная), можно предвидеть, что добавление более чем одной гидрофобной аминокислоты к хеджхог-последовательности приведет к еще большему повышению эффективности белка, чем это достигалось добавлением одной единственной аминокислоты. В действительности, добавление двух следующих один за другим остатков изолейцина к Ν-концу Соник хеджхог человека приводит к повышению эффективности в опыте на С3Н10Т1/2 по сравнению с мутантом, содержащим один единственный добавленный изолейцин (см. пример 10). Тогда, добавляя гидрофобные аминокислоты к Ν-концу или к С-концу хеджхог-белка, к находящейся на поверхности петле или к некоторой комбинации положений, можно ожидать образования более активной формы белка. Замещенная аминокислота не должна быть одной из 20 обычных аминокислот. Имеются сообщения о замещающих неестественных аминокислотах в специфических сайтах в белках (78, 79), и это может привести к положительным результатам, если аминокислота имеет более гидрофобный характер, устойчива к протеолитической атаке или может быть использована для того, чтобы способствовать направлению хеджхог-белка в определенный сайт ίη νίνο, что может сделать его активность более эффективной или более избирательной. Неприродные аминокислоты могут быть встроены в специфические сайты в белках во время трансляции ίη νίνο, и сообщалось о достигнутых успехах в создании ίη νίνο систем, которые будут позволять осуществление производства таких модифицированных белков в более широких масштабах.

Неожиданно оказалось, что белок, например хеджхог-белок, модифицированный в соответствии с настоящим изобретением, сохраняет свою биологическую активность. Во-первых, Νконцевой цистеин сохраняется во всех известных последовательностях хеджхог-белков, включая рыб, лягушек, насекомых, птиц и млекопитающих. Вследствие этого разумно было ожидать, что свободный сульфгидрил Νконцевого цистеина играет важную роль в строении или в активности белка. Вовторых, хеджхог-белки, у которых отсутствует Νконцевой цистеин, по причине протеолитического расщепления или мутационной замены на гидрофильные аминокислоты (например, на аспарагиновую кислоту или на гистидин), неак тивны в опытах на клетках С3Н10Т1/2, как это описано в примере 3.

Существует много модификаций Νконцевого цистеина, которые защищают тиол и прибавляют гидрофобную структурную единицу. Эти модификации обсуждаются далее более подробно. Специалист в данной области может определить, какая модификация наиболее благоприятна для конкретного случая терапевтического использования. Факторы, влияющие на принятие такого решения, включают в себя стоимость и простоту производства, очистки и перевода в лекарственную форму, сюда входит растворимость, стабильность, эффективность, фармакодинамика и кинетика, безопасность, иммуногенные свойства и тканевая избирательность.

А. Химические модификации первичной аминокислотной последовательности.

Химическая модификация Ν-концевого цистеина с целью защиты тиола, сопровождающаяся активацией гидрофобной структурной единицей, может быть проведена специалистом в этой области многими путями. Сульфгидрильная структурная единица с тиолятным ионом в качестве активной функциональной единицы представляет собой наиболее реакционноспособную функциональную группу в белке. Существует много реагентов, которые взаимодействуют с тиолом скорее, чем с какой-либо другой из групп. См. С1ет181гу ο£ Рго1ет ΟοηίιίβαΙίοη αηά ΟΐΌ55-Ρίη1<ίη§ (δ.δ.^οη^, СКС Рге§8, Вοса Κηΐοη, РЬ, 1991). От тиола Ν-концевого цистеина, например, такого, как в хеджхог-белках, можно ожидать более высокой реакционной способности, чем от цистеина внутри последовательности. Это связано с близостью к αаминогруппе, которая снижает значение рК_а тиола, что приводит к более высокой степени протонной диссоциации и к повышению реакционной способности тиолятного иона при нейтральном или кислом значении рН. В добавление к этому, цистеин на Ν-конце структуры с большей вероятностью находится в экспонированном положении, чем два других цистеина в хеджхог-последовательности, которые погребены в белковой структуре. Авторы изобретения показали, что Ν-концевой цистеин оказывается единственной модифицированной аминокислотой после реакции в течение 1 ч с Νэтилмалеимидом при рН 5,5 (см. пример 9) и после реакции в течение 18 ч с Νизопропилиодацетамидом при рН 7,0 (см. пример 9). Другими примерами таких способов может быть реакция с другими α-галогенацетильными соединениями, с ртутьорганическими соединениями, дисульфидными реагентами и с другими Ν-замещенными малеимидами. Многочисленные гидрофобные производные этих активных агентов имеются в продаже (например, этилиодацетат(А1бпс1, МП\уаикее

VI), фенилдисульфид (А1йпсй) и Ν-пиренмалеимид (Мо1еси1аг РтоЬек, Еидепе ОВ)) или их можно легко синтезировать (например, Νалкилиодацетамиды (84), Ν-алкилмалеимиды (85) и ртутьорганические соединения (86). Авторы изобретения показали, что Ν-концевой цистеин Соник хеджхог человека может быть специфично модифицирован Ν-изопропилиодацетамидом и что гидрофобно-модифицированный белок в два раза более эффективен в опыте СЗН10Т1/2, чем немодифицированный белок (см. пример 9). Ожидается, что модификация 81 1 длинноцепочечным производным алкилиодацетамида приведет к модифицированному белку с еще большим усилением эффективности. Такие Ν-алкилиодацетамиды могут быть легко синтезированы специалистом в этой области с использованием поступающих в продажу исходных продуктов.

Другой аспект, касающийся реакционной способности Ν-концевого цистеина, состоит в том, что он может принимать участие в химических превращениях, которые уникальны для его конфигурации 1,2-аминотиола. Одним из примеров является реакция с тиоэфирными группами с образованием Ν-концевой амидной группы в результате быстрого сдвига тиоэфира с 8 на Ν. Эта реакционная химия может соединять вместе синтетические пептиды и ее можно использовать для добавления одной или нескольких природных или неприродных аминокислот или гидрофобных групп через подходящий для этого активированный пептид. Другой демонстрируемый здесь пример представлен реакцией с альдегидом для получения тиазолидинового аддукта. Многочисленные гидрофобные производные тиоловых эфиров (например, сложные эфиры С₂-С₂₄ насыщенных и ненасыщенных жирных кислот и кофермента А (8щта С11е1шса1 Со., 8!. Ьошк МО), альдегиды (например, масляный альдегид, н-дециловый альдегид и нмиристиловый альдегид (А1йпсй)) и кетоны (например, 2-, 3- и 4-деканон (А1йпсй)) имеются в продаже или могут быть легко синтезированы (87, 88). Аналогичным образом могут быть приготовлены тиоморфолиновые производные, что показано на примере описанной в примере 9 химии 1-бром-2-бутанона, из разнообразных αгалогенкетонов в качестве исходных продуктов (88). Поскольку нахождение альтернативных путей для модификации тиола в Ν-концевом цистеине или любого цистеина в белке не представляет сложности, авторы изобретения не хотят быть связаны специфическими представленными здесь примерами.

В белке α-амин более предпочтителен для модифицирования по сравнению с другими аминами в белке, потому что его более низкое значение рКа обеспечивает и более высокое содержание реакционноспособной непротонированной формы при нейтральных и кислых рН.

Авторы изобретения показали, что модификация Ν-концевого амина амидной группой на основе длинноцепочечной жирной кислоты с сохранением свободной тиольной группы в цистеине, активирует хеджхог-белок более чем на два порядка величины (см. пример 8). Вследствие этого ожидается, что химизм, который может быть направлен на предпочтительное взаимодействие с Ν-концевым амином, должен быть использован для повышения эффективности хеджхог-белка. Арилгалогениды, альдегиды и кетоны, ангидриды кислот, изоцианаты, изотиоцианаты, имидоэфиры, галогениды кислот, Νгидроксисукцинимидильные соединения (например, сульфо-ИН8-ацетат), нитрофениловые эфиры, ацилимидазолы и другие активированные эфиры известны как соединения, реагирующие с аминными функциями.

При замещении Ν-концевого цистеина в хеджхог-белке некоторыми другими аминокислотами могут быть использованы другие химические способы для добавления гидрофобной структурной единицы к Ν-концу. Один из примеров представлен помещением серина или треонина на Ν-конец, окислением этой аминокислоты с образованием альдегида и после этого сочетанием белка с химической структурной единицей, содержащей 1,2-аминотиольную структуру (например, с цистеином). Вторым примером может служить помещение гистидина на Ν-конец для сочетания с С-концевой тиокарбоновой кислотой.

Химическая модификация других аминокислот

Существуют специальные химические способы для модификации многих других аминокислот. В соответствии с этим другой путь синтеза более активной формы хеджхог может быть представлен химическим присоединением гидрофобной структурной единицы не к Νконцевому цистеину, а к другой, отличной от него, аминокислоте в хеджхог. Если подходящая аминокислота недоступна в желаемом положении, то можно использовать сайтнаправленный мутагенез для помещения реакционноспособной аминокислоты в такой сайт в хеджхог-структуре, не затрагивая при этом Νили С-концы или же другое положение. В число реакционноспособных аминокислот входят цистеин, лизин, гистидин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, серин, треонин, тирозин, аргинин, метионин и триптофан. В соответствии с этим цель создания более гидрофобной формы хеджхог может быть достигнута многими химическими средствами, и авторы изобретения не желают ограничивать себя конкретным химизмом или сайтом для модификации, поскольку полученные результаты подтверждают общий характер такого подхода. Хеджхог-полипептид может быть связан с гидрофобной структурной единицей рядом способов, включая средства для химического сочетания или генную инженерию.

Для иллюстрации далее приводится большое число химических средств для образования межмолекулярных связей, которые известны специалистам в этой области. В рамках настоящего изобретения предпочтительными средствами для образования межмолекулярных связей являются гетеробифункциональные образователи межмолекулярных связей, которые могут быть использованы для связывания хеджхогполипептида и гидрофобной структурной единицы постадийным способом. Гетеробифункциональные образователи межмолекулярных связей обеспечивают возможность для разработки более специфичных способов сочетания для сопряжения в белки, снижая при этом вероятность таких нежелательных побочных реакций как образование гомопротеиновых полимеров. В этой области известно множество гетеробифункциональных образователей межмолекулярных связей. В их число входят: сукцинимидил-4-(Я-малеимидометил)-циклогексан-1карбоксилат (8МСС), м-малеимидобензоил-Νгидроксисукцинимидный эфир (МВ 8), Νсукцинимидил-(4-иодацетил)аминобензоат (8ΙΑΒ), сукцинимидил-4-(п-малеимидофенил) бутират (8МРВ), гидрохлорид 1-этил-3-(3диметиламинопропил)карбодиимида (ЕЭС), 4сукцинимидилоксикарбонил-а-метил-а-(2пиридилдитио)толуол (8МРТ), Νсукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (8ΡΌΡ), сукцинимидил 6-[3-(2-пиридилдитио) пропионат]гексаноат (ЬС-8РЭР). Эти средства для образования межмолекулярных связей с Νгидроксисукцинимидными структурными единицами могут быть получены как Νгидроксисульфосукцинимидные аналоги, которые в общем случае показывают повышенную растворимость в воде. В дополнение к этому, вместо алкильных производных можно синтезировать такие средства для образования межмолекулярных связей, в связывающей цепи которых есть дисульфидные мостики, чтобы снизить число разрывов в связывающих цепях ίη νίνο.

В дополнение к гетеробифункциональным образователям межмолекулярных связей существует большое число других средств для образования межмолекулярных связей, включая гомобифункциональные и фотореактивные образователи межмолекулярных связей. Дисукцинимидилсуберат (Ό88), бисмалеимидогексан (ВМН) и диметилпимелинимидат-2НС1 (ΌΜΡ) могут служить в качестве примеров используемых гомобифункциональных средств для образования межмолекулярных связей, а бис-[в-(4азидосалициламидо)этил]дисульфид (ВЛ8ЕЭ) и Ы-сукцинимидил-6-(4'-азидо -2' -нитро фениламино)гексаноат (8ΑΝΡΑΗ) служат в качестве примеров фотореактивных межмолекулярных связывателей, подходящих для использования в рамках настоящего изобретения. Последний обзор по технике сочетания белков, Мсюъ е! а1.

(1990) Вюсшуидай С1еш1йгу, 1:2-12, включен в приведенный здесь список литературы.

Особенно удобный для использования класс перечисленных выше гетеробифункциональных межмолекулярных связывателей, реагирующих с первичной аминогруппой, представляют собой Ν-гидроксисукцинимид (ΝΗ8) или его растворимый в воде аналог Νгидроксисульфосукцинимид (5ΐι1Γο-ΝΗ8). Первичные амины (эпсилонгруппы лизина) при щелочных значениях рН депротонируются и реагируют в результате нуклеофильной атаки с эфирами ΝΗ8 или сульфо-ЯН8. Эта реакция приводит к образованию амидной связи и выделению ΝΗ8 или сульфо-№Н8 в виде побочного продукта.

Другая реакционноспособная группа, которая может быть использована в качестве части гетеробифункционального межмолекулярного связывателя, представлена реакционноспособной тиольной группой. Обычно реакционноспособные тиольные группы взаимодействуют с малеимидами, галогенами и пиридилдисульфидами. Малеимиды избирательно реагируют со свободными сульфгидридами (цистеиновые остатки) в течение минут в слабокислых или нейтральных средах (рН 6,5-7,5). Галогены (иодацетильные функции) реагируют с Н8-группами при физиологических значениях рН. Обе эти реакционноспособные группы приводят к образованию стабильных тиоэфирных связей.

Третий компонент гетеробифункциональных межмолекулярных связывателей представляет собой разделительный фрагмент, или мостик. Мостик - это структура, которая соединяет два реакционно-способных конца. Наиболее наглядным атрибутом мостика является эффект стерического препятствия. В некоторых примерах более длинный мостик может более легко обеспечить разделяющее пространство, которое необходимо для связывания двух сложных биомолекул. Например, 8МРВ имеет промежуток 14,5 Ангстрем.

Получение белок-белковых конъюгатов с использованием гетеробифункциональных реагентов представляет собой двухстадийный процесс, включающий в себя реакцию амина и реакцию сульфгидрила. Для первой стадии, реакции амина, выбранный белок должен иметь первичный амин. Это может быть эпсилон-амин лизина или первичный альфа-амин, находящийся на Ν-конце большинства белков. Белок не должен содержать свободные сульфгидрильные группы. В случае, когда оба предназначенные для конъюгации белка содержат свободные сульфгидрильные группы, один из белков может быть модифицирован таким образом, чтобы все сульфгидрилы были блокированы с использованием, например, Ν-этилмалеимида (см. Раг418 е! а1. (1983) I. Рго. С1ет. 2:263, эта ссылка приведена в списке литературы). Реактив Эллмана может найти применение для расчета ко личества сульфгидрилов в конкретном белке (см., например, Е11тап еί а1. (1958) Агсй. Βίοсйет. Вюрйук. 74:443 и К1йй1ек еί а1. (1979) Апа1. Вюсйет. 94:75, эта ссылка приведена в списке литературы).

Реакционный буфер не должен содержать посторонние амины и сульфгидрилы. Реакционный буфер должен поддерживать рН 7,0-7,5. Этот интервал значений рН предохраняет малеимидные группы от реакции с аминами, сохраняя малеимидную группу для второй реакции с сульфгидрилами.

Межмолекулярные связыватели, содержащие эфиры ΝΗ8, имеют ограниченную растворимость в воде. Их следует растворять в минимальном количестве органического растворителя (ДМФ или ДМСО) до введения межмолекулярного связывателя в реакционную смесь.

Межмолекулярный связыватель и растворитель образуют эмульсию, которая обеспечивает протекание реакции.

Лучше растворимы в воде эфиры сульфоΝΗ8, поэтому их можно добавлять сразу в реакционный буфер. Буферов с высокой ионной силой следует избегать, поскольку они имеют тенденцию к «высаливанию» эфиров сульфо-ΝΗδ. Для того чтобы предотвратить потерю реакционной способности в результате гидролиза, межмолекулярный связыватель прибавляют к реакционной смеси сразу после растворения раствора белка.

Реакция может протекать более эффективно в концентрированных растворах белков. Чем более щелочное рН реакционной смеси, тем выше скорость реакции. Скорость гидролиза эфиров ΝΗ8 и сульфо-ΝΗδ также повышается с ростом значений рН. Повышенные температуры повышают скорость обеих реакций гидролиза и ацилирования.

По завершении реакции первый белок уже активирован по сульфгидрильной реакционной структурной единице. Активированный белок может быть выделен из реакционной смеси простой гель-фильтрацией или диализом. Для проведения второй стадии реакции образования межмолекулярных связей, сульфгидрильной реакции, липофильная группа, выбранная для реакции с малеимидами, активированными галогенами или с пиридилдисульфидами, должна содержать свободный сульфгидрил. Альтернативно, надо модифицировать первичный амин с добавлением сульфгидрила.

Во всех случаях буфер должен быть деаэрирован во избежание окисления сульфгидрильных групп. Для хелатирования вызывающих окисление металлов, которые могут присутствовать в буфере, можно добавлять ЕБТА. Буферы не должны содержать какие-либо соединения с сульфгидрильными группами.

Малеимиды избирательно реагируют с Н8группами в средах со значениями рН от слабокислых до нейтральных (6,5-7,5). Нейтрального рН достаточно для реакции с участием галогенов и пиридилдисульфидов. В этих условиях малеимиды в общем случае реагируют с Н8группами в течение минут. Более длительное время взаимодействия требуется для галогенов и пиридилдисульфидов.

Первый реагирующий по сульфгидрилу белок, полученный на аминной стадии реакции, смешивают с содержащей сульфгидрил липофильной группой в условиях подходящего буфера. Конъюгаты могут быть выделены из реакционной смеси такими способами как гельфильтрация или диализ.

Примерами активированных липофильных структур для конъюгации служат Ν-(1-пирен) малеимид, 2,5-диметоксистильбен-4'-малеимид, эозин-5-малеимид, флуоресцеин-5-малеимид, Ν(4-(6-диметиламино-2-бензофуранил)фенил) малеимид, бензофенон-4-малеимид, 4-диметиламино фенилазо фенил-4'-малеимид (Б А В МΙ), тетраметилродамин-5-малеимид, тетраметилродамин-6-малеимид, малеимидное производное Родамина красного ТМ С2, трифторацетат Ν-(5аминопентил)малеимида, трифторацетат Ν-(2аминоэтил)малеимида, малеимидное производное Орегон зеленого ТМ 488, Ν-(2-((2-(((4азидо-2,3,5,6-тетрафтор)бензоил)амино)этил) дитио)этил)малеимид (ТРРАМ-δδΙ), 2-(1-(3диметиламинопропил)индол-3-ил)-3-(индол-3ил)малеимид (бисиндолилмалеимид, СР109203Х). ΒΟ^IРΥ® РЬ №(2-аминоэтил)малеимид, Ν-(7диметиламино-4-метилкумарин-3-ил)малеимид (БАСМ), А1ехаТМ 488 С5 малеимид, А1ехаТМ 594 С5 малеимид, натриевая соль Ν-(1-пирен) малеимида, 2,5-диметоксистильбен-4'-малеимида, эозин-5-малеимида, флуоресцеин-5-малеимида, №(4-(6-диметиламино-2-бензофуранил)фенил)малеимида, бензофенон-4-малеимида, 4-диметиламинофенилазофенил-4'-малеимида, метансульфонат 1-(2-малеимидилэтил)-4-(5-(4-метоксфенил)оксазол-2-ил)пиридиния, тетраметилродамин-5-малеимид, тетраметилродамин-6малеимид, малеимидное производное Родамина красного ТМ С2, №(5-аминопентил)-малеимид, №(2-аминоэтил)малеимид, №(2-((2-(((4-азидо2,3,5,6-тетрафтор)бензоил)амино)этил)дитио) этил)малеимид, 2-(1-(3 -диметиламинопропил)индол-3 -ил)-3 -(индол-3 -ил)малеимид Ν-(7-диметиламино -4-метилкумарин-3-ил)малеимид (БАСМ), 11Н-бензо [а] флуорен, бензо[а]-пирен.

В одном из вариантов хеджхог-полипептид может быть дериватизирован с использованием пиренмалеимида, который может быть приобретен у фирмы Мо1еси1аг Ргойек (Еидепе, ΟΐΌβ.), например, это №(1-пирен)малеимид или 1пиренметилиодацетат (РММ эфир). Фиг. 1 иллюстрирует, что пиреновые производные хеджхог-белка имеют спектр активности, которая примерно на два порядка по величине превосходит активность немодифицированной формы белка.

B. Получение пептидных гидрофобных производных.

В соответствии с настоящим изобретением, белок может быть также модифицирован с использованием гидрофобного пептида. Используемый здесь термин «пептид» включает в себя последовательность, состоящую не менее чем из одного аминокислотного остатка. Предпочтительно пептид имеет длину в пределах от одной аминокислоты до 18-26 аминокислот, причем последнее значение - это типичная длина пронизывающего мембрану сегмента белка. Аминокислоты для создания пептида с гидрофобным характером выбирают преимущественно из следующих далее гидрофобных аминокислот: фенилаланин, изолейцин, лейцин, валин, метионин, триптофан, аланин, пролин и тирозин. Гидрофобный пептид может также содержать неприродные аналоги аминокислот с гидрофобным характером или Ό-аминокислоты, пептидные связи, Ν-концевое ацетилирование или другие особенности, которые снижают чувствительность пептида к протеолизу. Способы замещения неприродными аминокислотами в специфических сайтах протеинов известны (78, 79).

В общем случае гидрофобный пептид присоединяют по различным сайтам белка. Одним из сайтов может быть Ν-концевой остаток. Альтернативно Ν-концевой остаток замещают гидрофобным пептидом. В другом варианте гидрофобный пептид присоединяют к С-концевому остатку белка. Альтернативно С-концевой остаток замещают гидрофобным пептидом. С-конец может быть представлен нативной С-концевой аминокислотой, но это может быть и С-конец усеченного белка, и тогда гидрофобный пептид присоединяется к последней С-концевой аминокислоте усеченной формы, о которой и в этом случае можно говорить как о «С-конце». Усеченный хеджхог-белок сохраняет активность, если в нативной С-концевой последовательности удалено до одиннадцати аминокислот. Гидрофобный пептид может быть также встроен между Ν-концевым остатком и внутренним остатком, который непосредственно соседствует с Ν-концевым остатком, или между С-концевым остатком и остатком, который непосредственно соседствует с С-концевым остатком, или же между двумя внутренними остатками.

В некоторых вариантах липофильная структурная единица представляет собой амфипатический полипептид, например, магаинин, цекропин, аттацин, мелиттин, грамицидин 8. альфа-токсин 81ар11. аигеик, аламетицин или синтетический амфипатический полипептид. Способствующие слиянию клеток оболочечные белки из вирусных частиц также могут быть подходящим источником амфипатических последовательностей для соответствующих хеджхог-белков.

C. Получение липидных производных.

Другая форма белка, входящая в объем притязаний настоящего изобретения, представлена белком, который дериватизирован разнообразными липидными структурными единицами. В общем «липид» - это представитель гетерогенного класса гидрофобных соединений, характеризующихся переменной растворимостью в органических растворителях и нерастворимостью для большей части соединений в воде. Главный класс липидов, которые входят в объем притязаний настоящего изобретения, представлен жирными кислотами и стеринами (например, холестерином). Соответствующие настоящему изобретению производные белков содержат жирные кислоты, которые представлены циклическими, ациклическими (то есть с неразветвленной цепью) насыщенными или ненасыщенными монокарбоновыми кислотами. Представители насыщенных жирных кислот имеют общую формулу СН₃(СН₂)_пСООН. Далее следует таблица со списком примеров некоторых жирных кислот, которые могут быть обычным образом дериватизированы с использованием обычных химических способов.

Таблица 2. Примеры насыщенных и ненасыщенных жирных кислот.

Насыщенные кислоты СН3(СН2)пСООН
Значение η	Тривиальное название
2	Масляная кислота
4	Капроновая кислота
6	Каприловая кислота
8	Каприновая кислота
10	Лауриновая кислота
12	Миристиновая кислота*
14	Пальмитиновая кислота*
16	Стеариновая кислота*
18	Арахидиновая кислота*
20	Бегеновая кислота
22	Лигноцериновая кислота
Ненасыщенные кислоты
СН3СН=СНСООН	Кротоновая кислота
СН3(СН2)3СН=СН(СН2)7СООН	Миристолеиновая кислота*
СН3(СН2)5СН=СН(СН2)7СООН	Пальмитолеиновая кислота*
СН3(СН2)7СН=СН(СН2)7СООН	Олеиновая кислота*
СН3(СН2)3(СН2СН=СН)2	Линолевая кислота
(СН2)7СООН
СН3(СН2СН=СН)3(СН2)7СООН	Линоленовая кислота
СН3(СН2)3(СН2СН=СН)4(СН2)3	Арахидоновая кислота
СООН

Звездочка (*) означает жирную кислоту, которая обнаруживается в рекомбинантном хеджхог-белке, выделяемом из растворимого компонента.

Другие липиды, которые могут быть присоединены к белку, включают в себя жирные кислоты с разветвленной цепью и липиды фосфолипидной группы, такие как фосфатидилинозиты (то есть, фосфатидилинозит-4-монофосфат и фосфатидилинозит-4,5-дифосфат), фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин и такие изопреноиды, как фарнезильная или геранильная группы.

Авторы изобретения показали, что модифицированные липидами хеджхог-белки могут быть выделены в чистом виде из натуральных источников или же они могут быть получены химической модификацией растворимого немодифицированного белка. Для белка, выделенного в чистом виде из натурального источника, показано, что когда Соник хеджхог-белок человека полной длины (8НН), полученный в результате экспрессии в клетках насекомого и связанный с мембраной 81111, очищают от обработанных поверхностно-активным веществом клеток, используя для этого комбинацию хроматографиии на 8Р-сефарозе и иммуноаффинную хроматографию, то очищенный белок мигрирует на восстановительных 8И8-РАСЕ гелях в виде единственной узкой полосы с наблюдаемой массой 20 кДа (см. пример 1). Растворимые и связанные с мембраной 811-белки легко определяются способом ВЭЖХ с обращенной фазой, когда связанные формы элюируются позже в градиенте концентрации ацетонитрила (см. пример 1 и фиг. 3). Затем было показано, что Соник хеджхог человека связан с мембраной в двух формах, причем одна форма содержит холестерин и вследствие этого ее характеристики аналогичны данным, приводившимся ранее для хеджхог ЭгокорННа (18), тогда как вторая, новая форма содержит продукты модификации как холестерином, так и пальмитиновой кислотой. Растворимую и связанную формы 811 анализируют методом масс-спектрометрии с электрораспылением, используя тройной квадрупольный масс-спектрометр, снабженный источником ионов с электрораспылением (пример 1), а также масс-спектрометр с жидкостной хроматографией (см. пример 1). Идентичность Νконцевого пептида, полученного при ферментации с эндопротеиназой Ьук-С связанного 8НН, подтверждена масс-спектрометрическим измерением МАРШ Ρ8Ό на МАРЭ! массспектрометре с определением времени пролета. Сайт пальмитоилирования, определяемый комбинацией метода пептидного картирования и анализа последовательности, находится на Νконце белка (остаток 1 на последовательности зрелого белка в 8ЕО ПЭ N08: 1-4). Обе связанные формы одинаково активны в опыте на щелочной фосфатазе С3Н10Т1/2, но, что интересно, обе они примерно в 30 раз более эффективны, чем растворимый 811 человека, у которого отсутствует связывание (связывания). Липидная модификация не оказывает существенного влияния на наблюдаемое сродство к связыванию со скоплением его рецепторов (фиг. 7).

Далее была изучена полезность дериватизированных форм в ходе испытаний относительных эффективностей растворимого и связанного 8НН в чистом виде или в присутствии анти-хеджхог нейтрализующего Май 5Е1 на клетках С3Н10Т1/2 по результатам измерения индукции щелочной фосфатазы. Более того, относительная способность растворимого и связанного 811 связываться со скоплением рецепторов была подтверждена на пэтч-трансфициро ванных клетках ΕΒΝΆ-293 методом анализа БАС8 (пример 3).

Для модифицированного липидами хеджхог, полученного при химической модификации растворимого немодифицированного белка в опыте на С3Н10Т1/2, показано, что пальмитиновая кислота и другие липиды могут быть добавлены к растворимому 811 для получения модифицированных липидами форм с повышенной эффективностью (пример 8). Авторами изобретения показано (примеры 1, 2 и 8), что тиол и α-амин Ν-концевого цистеина участвуют в реакции дериватизации липидом. Не желая связывать себя какой-либо специальной теорией, авторы считают, что липидная модификация белков начинается с образования тиоэфирного промежуточного соединения, и после этого липидная структурная единица переносится на αамин Ν-конца через стадию образования циклического интермедиата. В связи с этим, в общем случае, реакционно-способная липидная структурная единица может находиться в виде тиоэфиров насыщенных или ненасыщенных карбоновых кислот, таких, как тиоэфиры кофермента А. Такие материалы и их производные могут включать в себя, например, такие коммерчески доступные производные кофермента А как пальмитолеоилкофермент А, арахидоилкофермент А, арахидоноилкофермент А, лауроилкофермент А и подобные им. Эти материалы свободно поставляет 8щта СНет1еа1 Сотрапу (81. Ьошк, МО., 1998 са!а1од рр. 303-306).

Влияние различных липидных структурных единиц на функциональную активность хеджхог-белка определено опытным путем (см. пример 8 и фиг. 10 и 11). Точно так же можно легко определить влияние разных липидных структурных единиц на функциональную активность других белков, таких как описанные в разделе III, с использованием способов, которые известны работникам с обычной специализацией. Например, функциональное исследование гельсолина (50), различных интерферонов (интерферон-α, интерферон-β и интерферон-γ), различных интерлейкинов (например, ТС-1, -2, -3, -4 и подобные им), факторов-α и -β некроза злокачественных опухолей и других факторов роста, которые были модифицированы липидами в соответствии с настоящим изобретением, могут быть выполнены с использованием хорошо известных методик.

Хотя мы установили химические способы, с помощью которых жирные кислоты могут быть присоединены к Ν-концевому цистеину хеджхог-белков, можно ожидать, что липиды могут быть присоединены по тем же самым или по другим сайтам через катализируемые ферментами реакции. Пальмитоилирование белков ίη νί\Ό катализируется классом ферментов, известных как пальмитоил-СоА : протеин-3пальмитоилтрансферазы. На очищенных фер ментах было продемонстрировано ацилирование белковых субстратов ίη уйго (80, 81). Субстратные специфичности пальмитоилтрансферазных ферментов определены не очень хорошо; анализ сайтов пальмитоилирования клеточных и вирусных белков мало чего дает для согласования окружающих модифицированный цистеиновый остаток последовательностей, но подразумевает совместное присутствие лизинового или аргининового остатка на расстоянии двух аминокислот от цистеина и объемных гидрофобных аминокислот рядом с цистеином. Аминоконцевая последовательность 81111, ССРСРСЕС, может совпадать с этой согласованной последовательностью и служить для узнавания сайта для пальмитоилирования.

В качестве альтернативы может быть проведено миристоилирование аминного конца хеджхог-белков с использованием Ν-миристоилтрансферазы (ΝΜΤ), большое количество этих ферментов было хорошо охарактеризовано как у млекопитающих (82), так и в дрожжах (83). Узнающий сайт для Ν-миристоилтрансферазы может быть встроен в Ν-концевую последовательность хеджхог для облегчения его узнавания ферментом. Обе эти стратегии требуют использования производных ацильных остатков жирных кислот и кофермента А в качестве субстратов, и эти производные использовались для неферментативного ацилирования жирными кислотами Соник хеджхог человека, как это описано в примере 8. Альтернативно, белок с встроенной последовательностью узнавания может быть миристоилирован в ходе экспрессии в подходящей для этого линии клеток. Другой способ модифицирования такого белка, как хеджхог, гидрофобной структурной единицей представляет собой создание сайта узнавания для присоединения изопреноидной группы к С-концу белка. Сайт узнавания для фарнезильного и геранил-геранильного присоединения известен и белок может быть модифицирован во время экспрессии в эукариотической клетке (Се1Ь е( а1., Сиг. Орт. С1ет. Вю1. 2: 4048 (1998).

У[. Многомерные белковые комплексы.

Описываемые здесь гидрофобно модифицированные белки особенно легко поддаются переводу их в многомерные белковые комплексы. Многомерные белковые комплексы, соответствующие настоящему изобретению, включают в себя белки, которые могут быть прикреплены через их гидрофобную (например, липидную) структурную единицу к везикуле. Везикула может быть биологической мембраной естественного происхождения, отделенной от естественного материала, или же везикула может представлять собой синтетическую конструкцию. Предпочтительные везикулы представляют собой преимущественно сферические структуры, состоящие из амфифилов, например, из поверхностно-активных веществ или фосфо липидов. Липиды этих сферических везикул организованы обычно таким образом, что они образуют один или более структурных слоев, например, мультиламеллярные везикулы (многослойные подобные луковице оболочки из липидных бислоев, которые включают водный объем между бислоями) или мицеллы.

В частности, липосомы - это маленькие сферические везикулы, составленные в первую очередь из различных типов липидов, фосфолипидов и вторичных липофильных компонент. Эти компоненты обычно организованы в бислойное образование, подобное липидной организации биологических мембран.

В типичном случае полярный конец компоненты липидной или подобной липиду молекулы находится в контакте с окружающим раствором, обычно с водным раствором, тогда как неполярный, гидрофобный конец липида или подобной липиду молекулы находится в контакте с неполярным, гидрофобным концом другой липидной или подобной липиду молекулы. Образующаяся бислойная мембрана (то есть везикула) избирательно проницаема для молекул определенного размера, гидрофобности, формы и чистого заряда. В большинстве случаев везикулы по природе представляют собой липиды или они подобны липидам, хотя существуют альтернативные липосомные бислойные образования, включающие в себя поверхностноактивное вещество с липидом или с холестерином.

Липосомным везикулам может быть в частности отдано предпочтение, поскольку они нашли широкое применение в терапии, диагностике, в промышленности и в торговле. Их используют для доставки молекул, которые не очень хорошо растворимы в воде, или когда желательно направленное по времени высвобождение. По причине их селективной проницаемости для многих химических соединений липосомы находят применение в качестве средств доставки для лекарственных средств и биологических материалов. В соответствии с этим, дериватизированные липидами белки, например, хеджхог, могут стать многомерными, будучи интегрированы в липидный бислой липосомных везикул. По достижении целевого сайта липосомы могут деградировать (например, при действии ферментов желудочно-кишечного тракта) или они могут слиться с мембранами клеток.

Известны различные способы получения таких везикул как липосомы. Хорошо известно производство фосфолипидных везикул (53). Имеется общий обзор по обычно используемым для этого способам (54). Наиболее известны из них (1) ультразвуковая обработка раствора, содержащего липиды, за которой иногда следует выпаривание или лиофильная сушка и регидратация (см. например, 8йуег, Вюсйетййу, рр. 290-291, Егеетап & Со., Νονν Уогк, (1988), и (55); (2) гомогенизация липидного раствора, иногда при высоком давлении и с большим уси лием диспергирования (см., например, патент США № 4743449, опубликован 10 мая 1988, и патент США № 4753788, опубликован 28 июня 1988); (3) гидратация, иногда сопровождающаяся ультразвуковой обработкой высушенной пленки образующих везикулы липидов, когда липидная пленка получена выпариванием раствора липида, растворенного в органическом растворителе (см., например, патент США № 4452747, опубликован 5 июня 1984, патент США № 4895719, опубликован 23 января 1990, и патент США № 4946787, опубликован 7 августа 1990); (4) лиофильная сушка или упаривание и регидратация (см., например, патент США № 4897355, опубликован 30 января 1990, европейский патент № 267050, опубликован 5 ноября 1988, патент США № 4776991, опубликован 11 октября 1988, европейский патент № 172007, опубликован 19 февраля 1986, и заявка на патент Австралии № АИ-А-48713/85, опубликован 24 апреля 1986); инъекция или инфузия раствора липида в растворителе в водную среду или обратный процесс (см., например, (56), патент США № 4921757, опубликован 1 мая 1990, патент США № 4781871, опубликован 1 ноября 1988, заявка на международный патент № 87/02396, опубликована 24 марта 1988 и патент США № 4895452, опубликован 23 января 1990); (6) распылительная сушка (см., например, заявка на патент Австралии № АИ-А-48713/85, опубликована 24 апреля 1986 и патент США № 4830858, опубликован 16 мая 1989); (7) фильтрация (см., например, заявка на международный патент № 85/01161); (8) выпаривание с обращением фаз, см., например, (57); и (9) комбинации приведенных выше способов, см., например, (58) и (59).

Предпочтительные липиды и подобные липидам компоненты, подходящие для использования при получении везикул, включают в себя фосфолипиды, смеси фосфолипидов, полярные липиды, нейтральные липиды, жирные кислоты и их производные. Предпочтительные липиды характеризуются тем, что, будучи диспергированы в воде в чистом виде при температуре выше температуры липидного перехода, они находятся в липидной эмульсионной фазе. В некоторых вариантах липид содержит одну единственную алифатическую цепь с числом атомов углерода более 12, которая может быть насыщенной или ненасыщенной или может иметь другие замещения. В число подходящих липидов входят сложноэфирные, спиртовые и кислотные формы таких жирных кислот как стеарат, олеиновая кислота, линолевая кислота, арахидат, арахидоновая кислота и другие кислоты с одной алифатической цепью. Другие кандидаты включают в себя сложно-эфирные, спиртовые и кислотные формы ретинолов, в частности, ретинола и ретиноевой кислоты. В число других предпочтительных липидов входят фосфатидилхолин (РС), фосфатидил глицерин (РС) и их производные, полученные синтетически или выделенные из различных натуральных источников.

В некоторых вариантах везикулы могут быть стерически стабилизированы за счет встраивания полиэтиленгликоля (РЕС) или головных РЕС-групп синтетического фосфолипида (РЕС, конъюгированный с дистеароилфосфатидилэтаноламином (Э8РЕ), см., например, (61)). Предпочтение отдается поверхностноактивным веществам, которые хорошо смешиваются, например, это Т^ссн'™, Τηΐοη™, додецилсульфат натрия (8Ό8), лаурелсульфат натрия или октилгликозид натрия.

Предпочтительные поверхностно-активные вещества образуют мицеллы при добавлении к водному раствору выше температуры фазового перехода поверхностно-активных веществ. Поверхностно-активные вещества могут состоять из одной или более алифатических цепей. Эти алифатические цепи могут быть насыщенными, ненасыщенными или содержать различные виды замещений, например, это может быть этоксилирование; в типичном случае алифатическая цепь содержит более 12 атомов углерода. В дополнение к этому в число подходящих поверхностно-активных веществ входят лаурил-, миристил-, линолеил- или стеарилсульфобетаин; лаурил-, миристил-, линолеилили стеарилсаркозин, линолеил-, миристил- или цетилбетаин; лауроамидопропил-, кокамидопропил-, линолеиламидопропил-, миристамидопропил-, пальмамидопропил- или изостеарамидопропилбетаин (например, лаурамидопропил); миристамидопропил-, пальмамидопропил- или изостеарамидопропилдиметиламин; натрийметилкокоил- или динатрийметилолеилтаурат; а также продукты серии ΜΟΝΑρυΛΤ (Μοηα Ιηάιΐδποδ, 1пс., ΕαΙΟΓδοη, Ν.Ρ), см. также пример 4.

Предпочтительными стеролами и эфирами стеролов, которые подходят для использования при получении многомерных белковых комплексов, являются холестерин, (РС), фосфатидилглицерин (РС) и их производные, полученные синтетически или выделенные из различных натуральных источников.

В некоторых вариантах везикулы могут быть стерически стабилизированы за счет встраивания полиэтиленгликоля (РЕС) или головных РЕС-групп синтетического фосфолипида (РЕС, конъюгированный с дистеароилфосфатидилэтаноламином (Э8РЕ), см., например, (61)). Предпочтение отдается поверхностноактивным веществам, которые хорошо смешиваются, например, это Т^ссн'™, Τηΐοη™, додецилсульфат натрия (8Ό8), лаурелсульфат натрия или октилгликозид натрия.

Предпочтительные поверхностно-активные вещества образуют мицеллы при добавлении к водному раствору выше температуры фазового перехода поверхностно-активных веществ. Поверхностно-активные вещества могут состоять из одной или более алифатических цепей. Эти алифатические цепи могут быть насыщенными, ненасыщенными или содержать различные виды замещений, например, это может быть этоксилирование; в типичном случае алифатическая цепь содержит более 12 атомов углерода. В дополнение к этому в число подходящих поверхностно-активных веществ входят лаурил-, миристил-, линолеил- или стеарилсульфобетаин; лаурил-, миристил-, линолеилили стеарил-саркозин, линолеил-, миристилили цетил-бетаин; лауроамидопропил-, кокамидопропил-, линолеиламидопропил-, миристамидопропил-, пальмамидопропил- или изостеарамидопропилбетаин (например, лаурамидопропил); миристамидопропил-, пальмамидопропилили изостеарамидопропилдиметиламин; натрийметилкокоил- или динатрийметилолеилтаурат; а также продукты серии ΜΟΝΑρυΑΤ (Мопа 1пби5пс5. 1пс., Ра!ег8ои, Ν.Ι.), см. также пример 4.

Предпочтительными стеролами и эфирами стеролов, которые подходят для использования при получении многомерных белковых комплексов, являются холестерин, холестанол, сульфат холестерина и другие аналоги и производные холестерина. Тот факт, что везикула может включать в себя множество различных липидов и поверхностно-активных веществ, позволяет с большой гибкостью подходить к конструированию связанных комплексов белоквезикула с желаемыми свойствами. Например, можно получать везикулы, которые связывают различное число белков при изменении липидного состава исходного материала для создания более крупных везикул или путем повышения процентного содержания фосфатидилинозитольных липидов в везикуле.

VII. Практическая ценность.

В общем случае описываемые здесь модифицированные белки могут найти применение для лечения тех же самых медицинских состояний, для лечения которых могут быть использованы и немодифицированные формы белков. Правда, описываемые здесь гидрофобно модифицированные белки показывают иногда значительные улучшения по сравнению с немодифицированными формами. Во-первых, их повышенная эффективность позволяет проводить лечение меньшими количествами белка и в более короткие временные сроки. Это может быть важно как для системного применения, так и для применения на ЦНС. Во-вторых, замена Νконцевого цистеина на менее реакционноспособную аминокислоту допускает более простое оформление производства, приготовления лекарственных форм и хранения белка для клинического использования. В-третьих, фармакодинамика белка при гидрофобной модификации изменяется и это позволяет белкам локализоваться недалеко от места введения, что приводит к повышению их безопасности за счет ми нимизации системного воздействия и к росту эффективности за счет увеличения локальной концентрации. Соответствующие изобретению белки могут также найти применение в диагностических композициях и в способах для распознавания соответствующих им рецепторов.

В качестве примера по первому пункту служит то, что время полупревращения хеджхог при его системном введении очень мало и для достижения лечебного отклика на белок требуются многократные инъекции. Более высокая эффективность модифицированных форм и возможность приготовления липосомных лекарственных форм дают средства для достижения эффекта при меньшем числе медикаментозных воздействий. При применении на ЦНС более высокая эффективность обеспечивает возможность инъекционного введения адекватного количества белка в малых объемах непосредственно в ЦНС.

Важность второго пункта иллюстрируется обнаружением авторами изобретения того, что Ν-концевой цистеин в хеджхог очень чувствителен к химической атаке, будь то с образованием химического аддукта или по схеме окислительной димеризации с другим хеджхог-белком. Для предотвращения этого при очистке используются специальные буферы и приемы, а на конечной стадии получения лекарственной формы используется дитиотреитол. Эти меры предосторожности требуют тщательного изучения эффектов буфера в лекарственной форме на подопытных животных.

И в качестве примера по третьему пункту: чем более ограничена область, на которую распространяется белок из точки его введения, тем выше локальная концентрация. Такая повышенная локальная концентрация может приводить к более специфичным клиническим откликам во время лечения неврологических расстройств после непосредственной инъекции в соответствующую область головного или спинного мозга.

Точно так же модифицированные белки могут быть использованы для локального введения в места перелома костей для помощи в лечении этих переломов, в половые железы для лечения нарушений в репродуктивной сфере, внутрь глаза для лечения нарушений зрения и под кожу для лечения дерматологических состояний и для стимуляции местного роста волос. Таким образом, локализация гидрофобномодифицированных белков в месте введения снижает возможность нежелательного системного воздействия на другие ткани и органы.

Для терапевтического использования соответствующие настоящему изобретению гидрофобно-модифицированные белки вводят в состав фармацевтически приемлемых стерильных, изотонических лекарственных форм, которые могут вводиться стандартными средствами, хорошо известными в этой сфере. Лекарственные формы - это предпочтительно жидкости или это могут быть лиофилизованные порошки. Предполагается, что терапевтическое введение, например, многомерных белковых комплексов, может распространяться и на липосомы с описываемыми здесь производными белков.

Специалист с обычными познаниями в данной области отдает себе отчет в том, что в конкретном случае введения дозировка и клиническое применение соответствующего настоящему изобретению гидрофобно-модифицированного белка будет изменяться в зависимости от конкретного белка и его биологической активности.

В качестве единственного примера применения соответствующего настоящему изобретению белка в терапевтическом контексте, терапевтические гидрофобно-модифицированные хеджхог-белки могут быть введены пациентам, страдающим от разнообразных неврологических расстройств. Способность хеджхог-белка регулировать нейрональную дифференциацию в ходе развития нервной системы, а также предположительно и во взрослом состоянии, показывает, что от гидрофобно-модифицированного хеджхог вполне можно ожидать упрощения контроля над нейронами взрослого человека по отношению к поддержанию жизнедеятельности, функционирования и контроля над процессом старения нормальных клеток; по отношению к восстановительным и регенеративным процессам в поврежденных клетках, также по отношению к предупреждению дегенерации и преждевременной гибели, в основе которой лежит утрата дифференциации в определенных патологических условиях. В свете этого представленные гидрофобно-модифицированные хеджхогкомпозиции при лечении способом локальной инфузии могут предотвращать и/или снижать остроту неврологических состояний, причиной которых являются (ί) острое, подострое или хроническое заболевание нервной системы, включая травматическое повреждение, химическое повреждение, сосудистое повреждение и дефицит (такие, как ишемия при ударе) вместе с инфекционным и вызванным злокачественной опухолью повреждением; (ίί) старение нервной системы, включая болезнь Альцгеймера; (ίίί) хронические нейродегенеративные заболевания нервной системы, включая болезнь Паркинсона, хорею Хантингтона, боковой амилотрофический склероз и подобные им заболевания; (ίν) хронические иммунологические заболевания нервной системы, включая рассеянный склероз. Гидрофобно-модифицированный белок может также вводиться инъекционным путем в спинномозговую жидкость, например, для того, чтобы бороться с недостаточностью клеток мозга, или же в лимфатическую систему или в ток крови, когда требуется направить его на другие ткани или органы с системно-специфическими нарушениями.

Соответствующие настоящему изобретению хеджхог-композиции могут быть использованы для спасения, например, различных нейронов от гибели, вызванной повреждением, а также для управления воспроизведением таких нейронов после повреждения такого рода. Такое повреждение является следствием состояний, включающих в себя, но не ограничиваемых этим, инфарктную травму ЦНС, инфекцию, метаболическое заболевание, дефицит питательных веществ и действие токсических агентов (например, при лечении цисплатиной). Некоторые хеджхог-белки делают неопластически или гиперпластически трансформированные клетки постмитотическими или апоптотическими. Поэтому такие композиции могут использоваться для лечения, например, злокачественных глиом, медулобластом и нейроэктодермальных опухолей.

Эти белки могут быть также связаны с обнаруживаемыми метками, например, с флуороскопически и радиографически непрозрачными веществами, и тогда их вводят субъекту для того, чтобы получить изображение тканей, в которых идет экспрессия хеджхог-рецепторов. Белки могут быть также связаны с такими веществами как пероксидаза хрена, и тогда они могут найти применение в качестве иммуноцитохимических красителей, позволяющих визуализировать области хеджхог-лиганд-положительных клеток в гистологических срезах. Соответствующие настоящему изобретению гидрофобно модифицированные белки в чистом виде или в виде мультивалентных белковых комплексов могут быть использованы для специфического нацеливания медицинской терапии на рак и опухоли, в которых идет экспрессия хеджхогрецепторов. Такие материалы могут стать более эффективными для лечения рака при использовании их в качестве средств для доставки антинеопластических лекарств, токсинов и цитоцидных радионуклидов, например иттрия 90.

Токсин может быть также сопряжен с гидрофобно модифицированным хеджхог (или с везикулами, содержащими его мультивалентные комплексы) для селективного нацеливания и уничтожения отзывающихся на хеджхогклеток, таких, как опухоль с экспрессией хеджхог-рецептора (хеджхог-рецепторов). Могут быть использованы и другие токсины, известные специалистам в этой области. В числе таких токсинов можно назвать, не ограничиваясь этим, экзотоксин Р8еийοтοηа8, дифтерийный токсин и сапорин. Этот подход может оказаться успешным, поскольку экспрессия хеджхогрецептора (рецепторов) идет в очень ограниченном числе тканей. Другой подход к такой лекарственной терапии состоит в применении меченного радиоизотопами гидрофобно-модифицированного белка (или его мультивалентного комплекса). Такие радиационномеченные соединения будут предпочтительно нацеливать радиоактивность на сайты в клетках, где идет экспрессия рецептора (рецепторов) белка, обходя нормальные ткани. В зависимости от используемого радиоизотопа радиация, излучаемая реактивно меченным белком, который связан с раковой клеткой, может также убивать расположенные рядом злокачественные раковые клетки, в которых экспрессия рецепторов белка не идет. Возможно применение самых разных радионуклидов. Радиоактивный иод (например ¹³¹Σ) был успешно применен с моноклональными антителами против ί.Ό20. присутствующего в В-клетках лимфом (63).

Предназначенные для использования в терапии белковые композиции переводят в лекарственные формы, а дозировку устанавливают в соответствии с хорошо зарекомендовавшей себя медицинской практикой, принимающей во внимание нарушение, являющееся объектом терапии, состояние индивидуального пациента, место высвобождения изолированного полипептида, способ его введения и другие известные практикующему специалисту факторы. Лекарственное средство может быть приготовлено для введения путем смешения белка, содержащей белок везикулы или дериватизированного комплекса с требуемой степенью чистоты с физиологически приемлемыми носителями (то есть с носителями, которые не токсичны для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях).

Предполагается, что локальное поступление по месту будет первым путем для терапевтического введения соответствующего настоящему изобретению белка. Также предполагается внутривенное введение или введение через катетер или через другие хирургические трубочки. Альтернативные пути включают таблетки и подобные формы, поступающие в продажу пульверизаторы для жидких лекарственных форм, а также ингаляцию лиофилизованных или аэрозольных лекарственных форм. Жидкие лекарственные формы могут использоваться после возвращения их в это состояние из порошкообразных лекарственных форм.

Доза для введения зависит от свойств везикулы и используемого белка, например, от его способности к связыванию и от времени полупревращения в плазме ίη νί\Ό, от концентрации везикул и белка в лекарственной форме, от способа введения, от места и скорости поступления, от клинической переносимости данного пациента, от болезненного состояния, поразившего пациента и так далее, насколько это входит в компетенцию врача. В общем случае предпочтительны дозы от примерно 5х10^-7 до 5х10^-9 молей/л белка на пациента за прием, хотя доза зависит от природы белка.

В ходе следующих одно за другим введений могут быть применены различные дозировки.

Настоящее изобретение направлено также на фармацевтическую форму, которая включает хеджхог-белок, модифицированный в соответствии с настоящим изобретением, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. В одном из вариантов лекарственная форма включает также везикулы.

Соответствующие изобретению гидрофобно модифицированные хеджхог-белки могут найти применение и в способах генной терапии.

Для нейродегенеративных нарушений доступны некоторые модельные опыты на животных, результаты которых, как считается, имеют некоторую ценность при экстраполяции их на клинику. Для болезни Паркинсона модельные опыты включают предупреждение или выздоровление у грызунов или у приматов, когда нигрально-стриарный дофаминэргический путь нарушается системным введением МРТР или местным (внутричерепным) введением 6гидроксидофамина [6-ΟΗΌΑ], двух селективных дофаминэргических токсинов. Специфическими модельными опытами были: модельные опыты на получавших МРТР мышах (64); модельные опыты на получавших МРТР приматах (мартышка или резус) (65); а также модельные опыты на крысах с односторонним разрушением, вызванным 6-ΟΗΌΑ (66). Для ΑΣ8 (боковой амиотрофический склероз) модельные опыты включали лечение некоторых линий мышей, которые показывают спонтанную дегенерацию двигательных нейронов, включая мышей \\юЬЬ1ег (67) и ртп (68), а также трансгенных мышей с экспрессией мутированного гена супероксидазы дисмутазы человека (18ΟΌ), который связывают с семейной ΑΣ8 (69). Для повреждений спинного мозга наиболее распространенный модельный опыт включает контузионное повреждение крыс, вызванное падением калиброванного груза или повреждение жидкостью (гидродинамическое) (70). Для Хантингтона модельный опыт включает защиту от разрушения эксцитотоксином (NМ^Α, хинолиновая кислота, каиновая кислота, 3-нитропропионовая кислота, АМРА) полосатого тела у крыс (71,72). В последнее время был также описан модельный опыт на трансгенных мышах с избыточной экспрессией 1ιιιη1ίη§1ίη гена человека с повторением размноженного тринуклеотидного фрагмента (73). Для рассеянного склероза у мышей и у крыс индуцируют ЕАЕ иммунизацией МВР (основной белок миелина) или пассивным переносом Т-клеток, активированных МВР (74). Для Альцгеймера целесообразным модельным опытом на мелких грызунах является определение защиты от разрушения йтЬпа-Гогшх у крыс (септальное разрушение), главного пучка нервов, обеспечивающих холинэргическую иннервацию гиппокампа (75), а также использование трансгенных мышей с избыточной экспрессией бета-амилоидного гена человека. Для периферических нейропатий целесообразным модель ным опытом является защита от потери проводимости периферических нервов, вызванной такими химиотерапевтическими средствами, как таксол, винкристин и цисплатин на мышах и крысах (76).

Настоящее изобретение далее будет представлено более подробно на следующих, не ограничивающих объем притязаний примерах.

Пример 1. Соник хеджхог человека подвергается липидной модификации при экспрессии в клетках насекомых.

A. Экспрессия Соник хеджхог человека.

Готовят кДНК для Соник хеджхог (811) человека полной длины в виде фрагмента 1,6 кб ЕсоМ, субклонированного в рВ1иезсг1р1 8К⁺ (20) (подарок Дэвида Бамкрота из ОпЮдепу, 1пс., СатЬпбде МА). Сайты 5' и 3' ΝοΐΙ, находящиеся непосредственно по бокам 811 открытой рамки считывания, добавляют мутагенезом с удалением одного сайта, используя для этого набор Р1агтас1а в соответствии с протоколом рекомендаций производителя. После этого 1,4 кб ΝοΐΙ фрагмент, несущий полную длину 811 кДНК, субклонируют в вектор экспрессии насекомого, рРайВас (ЫГе Тес1по1од1е5, 1пс.). Рекомбинантный бакуловирус генерируют с использованием процедуры, поставляемой ЫГе Тес1по1од1е5, 1пс. Полученный вирус используют для создания фонда вируса с высоким титром. Способы, используемые для производства и очистки 811, описаны ниже. Присутствие ассоциированного с мембраной 811 проверяют методом РАС8 и ХУеЧегп Ь1о! анализа. Максимальная экспрессия происходит через 48 ч после инфицирования. Для ХУеЧегп Ь1о! анализа отстоявшуюся жидкость и лизаты клеток из зараженных 811 или незараженных клеток направляют на анализ 8Э8-РАСЕ на гель с градиентом 1020% в восстановительной среде, переносят электрофоретически на нитроцеллюлозу и проявляют 811 поликлональной антисывороткой кролика, вырабатываемой на Ν-концевой 811 15-тег, в конъюгате из «замочной скважины (принцип ключ-замок)» на пептид в прочном соединении с гемоцианином. Лизаты клеток получают в результате инкубации клеток в течение 5 мин при 25°С в 20 ММ Ν;·ι₂ΗΡΘ₄ рН 6,5, 1% ΝοηίώΑ Р-40 и 150 мМ №01 или 20 мМ Трис-НС1 рН 8,0, 50 мМ №С1, 0,5% \οηκ№ Р-40 и 0,5% деоксихолата натрия, а затем осаждают центрифугированием взвесь при 13000 об/мин в течение 10 мин при 4°С в центрифуге ЕррепбогГ.

B. Очистка связанного с мембраной Соник хеджхог человека.

Связанную с мембраной форму 811 получают на клетках Н1д1-Ргуе™ насекомого (Ιηνί(годеп) с использованием рекомбинантного бакуловируса, в котором кодирована обсуждавшаяся выше полная длина 811. Н1д1-Ргуе™ клетки выращивают при 28°С в освобожденной от сыворотки среде Г900 II (ЫГе Тес1по1од1е5, 1пс.) в биореакторе на 10 л с контролем по со держанию кислорода. Клетки заражают вирусом на поздней 1од-фазе при содержании примерно 2х10⁶ клеток/мл при МО1, равном 3 и собирают выращенные клетки через 48 ч после инфицирования (жизнеспособность клеток ко времени сбора была > 50%). Клетки отделяют центрифугированием и промывают в 10 мМ №₂НРО₄ рН 6,5, 150 мМ №С1 рН плюс 0,5 мМ РМ8Р. Образующийся осадок клеток (150 г массы во влажном состоянии) суспендируют в 1,2 л 10 мМ №₂НРО₄ рН 6,5, 150 мМ №С1, 0,5 мМ РМ8Р, 5 мкМ пепстатина А, 10 мкг/мл лейпептина и прибавляют затем 2 мкг/мл Е64 и 120 мл 10%ного раствора ТгНоп Х-100.

После инкубации в течение 30 мин на льду отделяют частички центрифугированием (1500 х д, 10 мин). Все последующие операции проводят при температуре 4-6°С. Значение рН жидкости над осадком устанавливают равным 5,0 запасом раствора 0,5М МЕ8 рН 5,0 (конечная концентрация 50 мМ) и загружают в колонку на 150 мл 8Р-8ер1аго§е Рак! Γ1ο\ν (Р1агтааа); колонку промывают 300 мл 5 мМ №₂НРО₄ рН 5,5, 150 мМ №С1, 0,5 мМ РМ8Р, 0,1% ΧοηκΕί Р-40, затем 200 мл 5 мМ №₂НРО₄ рН 5,5, 300 мМ №С1, 0,1% ΝοηίώΑ Р-40 и элюируют связанный хеджхог 5 мМ №₂НРО₄ рН 5,5, 800 мМ №С1, 0,1% ΝοηκΕ! Р-40.

Затем 811 направляют на афинную хроматографию на 5Е1-8ер1аго§е геып, которая получена сочетанием 4 мг антител на 1 мл с активированной Ο’ΝΒγ 8ер1аго§е 4В гект. Сборник элюатов 8Р-8ер1аго§е разбавляют двумя объемами 50 мМ НЕРЕ8 рН 7,5 и всю партию загружают на 5Е1 смолу (1 ч). Смолу собирают в колонку, промывают содержащим РВ8 раствором 0,1% гидрированного Тгйоп Х-100 (Са1Ьюс1ет) с объемом, равным десяти объемам колонки и элюируют 25 мМ NаН₂ΡО₄ рН 3,0, 200 мМ №С1, 0,1% гидрированного Тгйоп Х-100. Полученные при элюировании фракции нейтрализуют 0,1 объема 1М НЕРЕ8 рН 7,5 и анализируют на общее содержание белка по данным измерения поглощения при 240-340 нм и на чистоту методом 8Э8-РАСЕ. Фракции хранят при -70°С.

Фракции с максимальной концентрацией, полученные на трех стадиях афинной очистки, объединяют, разбавляют 1,3 объемами 50 мМ НЕРЕ8 рН 7,5, 0,2% гидрированного ТгНоп X100 и снова всю партию загружают на смолу 5Е1. Смолу собирают в колонку, промывают тремя объемами колонки РВ8 рН 7,2, 1% октилглюкозида (И8 Вюс1етюа1 Со гр.) и элюируют 25 мМ NаН₂ΡО₄ рН 3,0, 200 ММ ЫаС1, 1% октилглюкозида. Полученные при элюировании фракции нейтрализуют и анализируют описанным выше способом, затем объединяют, фильтруют через 0,2 микронный фильтр, делят на аликвоты и хранят при -70°С.

Когда полную длину Соник хеджхог (811) человека получают экспрессией в клетках насекомого Н1д1 Нуе™, то более 95% Ν-концевых фрагментов находятся в ассоциированном с клетками виде, что определяется методом Vек!егп Ь1о!йпд. По данным 8Э8-РАСЕ очищенный белок мигрирует в виде одной узкой полосы с наблюдаемой массой 20 кДа (фиг. 1, линия с). Скорость миграции белка примерно на 0,5 кДа выше чем у растворимой версии белка, продуцируемого Е.Сой (фиг. 1, линии Ь-й), что согласуется с опубликованными ранее данными (19). Аналогично ранее описанному (19) растворимый и связанный с мембраной 811, белки также легко определяются методом ВЭЖХ с обращенной фазой, так как связанная форма элюируется позже раствором с градиентом ацетонитрила. Требуемая для элюирования связанной с мембраной формы концентрация ацетонитрила равна 60%, тогда как для растворимой формы она равна всего лишь 45%, чем демонстрируется значительное повышение гидрофобности белка.

С. Масс-спектрометрический анализ связанного с мембраной Соник хеджхог человека.

Аликвоты 81 1 подвергают хроматографированию методом ВЭЖХ с обращенной фазой на колонке С4 (Ууйас, Са!. №. 214ТР104, размеры колонки: 4,6 мм внутренний диаметр х 250 мм) при комнатной температуре. Связанные компоненты элюируют градиентным способом, повышая концентрацию ацетонитрила в 0,1%ной трифторуксусной кислоте от 0 до 80% в течение 30 мин при скорости протекания 1,4 мл/мин. Жидкость с колонки анализируют на длине волны 280 нм и собирают фракции в течение 0,5 мин. Аликвоты фракций объемом 25 мкл, содержащие белок, сушат в 8реей Уас испарителе, растворяют в буфере для проведения электрофореза образцов и анализируют методом 8Э8-РАСЕ. Содержащие хеджхог фракции объединяют, упаривают в 4 раза на 8реей Уас испарителе и определяют содержание белка по данным абсорбции при 280 нм с коэффициентом экстинкции 1,33 для 1 мг/мл раствора 8йй. Образцы анализируют методом Ε8Ι-Μ8 на тройном квадрупольном масс-спектрометре М1сготакк ОиаИго II, снабженном источником ионов с электрораспылением. Объем 6 мкл очищенного методом ВЭЖХ хеджхог впрыскивают непосредственно в источник ионов со скоростью 10 мкл в минуту, используя в качестве растворителя 50% воды, 50% ацетонитрила, 0,1% муравьиной кислоты в шприц-насосе. Сканирование проводят на все время инфузии образца. Все полученные при электрораспылении данные масс-спектра регистрируют и хранят в графическом виде, а обрабатывают их с помощью системы для обработки данных Мюготакк МаккЬупх.

Пептиды, полученные при ферментации пиридилэтилированного 8йй с эндопротеиназой Ьук-С, анализируют на приборе ВЭЖХ с обращением фаз, соединенным с тройным квадрупольным масс-спектрометром Мюготакк ОиаИго II. Продукты ферментации разделяют на колон ке Вейакй С 18 с использованием системы М1сйгот™ иЙга-Гак! Мюгорго!ет Апа1ухег со скоростью протекания 50 мкл/мин градиентным способом, повышая концентрацию ацетонитрила в 0,05%-ной трифторуксусной кислоте от 5 до 85%. На сканах фиксируют данные с т/ζ 4002000 на прогон и обрабатывают их по описанной выше методике.

Секвенирование Ν-концевого пептида от связанного 8йй осуществляют способом Рок! 8оигсе Ьесау, (Р8О)-измерение, на массспектрометре с определением времени пролета (ТОР) Уоуадег-ЭЕ™ 8ТВ (Рег8ер!1уе Вюкук!етк, Ргатшдйат, МА) с использованием а-циано-4-гидроксикоричной кислоты в качестве матрицы (22, 23). Точно 0,5 мкл очищенного методом ВЭЖХ пептида после эндопротеиназы Ьук-С смешивают с 0,5 мкл матриц на пластинке-мишени.

Для получения полной картины фрагментационных ионов вольтаж на зеркалах снижают от 20 до 1,2 кВ в 11 этапов.

Данные масс-спектрометрии при ионизации электрораспылением для растворимой и связанной с мембраной форм 8йй показывают первичные образования с массами 19560 и 20167 Да, соответственно (фиг. 2). Измеренная масса 19560 Да соответствует предсказанной массе 8йй, начинающегося с Цис-1 и заканчивающегося Гли-174 (рассчитанное значение массы равно 19560,02 Да). В отличие от этого масса 20167 Да не согласуется с каким-либо из полезных предсказаний, а разница в массах между присоединенной и растворимой формами, равная 607 Да, не может быть отнесена к какойлибо известной модификации или к какомулибо отклонению в протеолитическом превращении. Ранее Ройег е! а1. (18) показали, что Ьгокорййа хеджхог содержит холестериновую структурную единицу и тогда не исключена возможность, что различие в массе в системе человека объясняется, по крайней мере от части, холестерином (расчетная масса для этерифицированного холестерина равна 368,65 Да). Присутствие минорной компоненты в масс-спектре связанного 8йй при 19796 Да, что на 371 Да отличается от первичного пика, подтверждает эту точку зрения.

Еще одно доказательство для холестерина было получено при обработке связанного 8йй слабой щелочью в условиях, когда возможен разрыв связи холестерина без расщепления пептидных связей (18), с повторным анализом продуктов реакции методом масс-спектрометрии (М8). Вкратце, полученный из клеток насекомого 8йй обрабатывают 50 мМ КОН в 95%-ном метаноле в течение 1 ч при комнатной температуре и после этого анализируют методом Е8Е М8 или ферментируют с эндопротеиназой ЬукС и анализируют методом ЬС (жидкостная хроматография)-М8 на тройном квадрупольном масс-спектрометре М1сготакк-Оиа11го II. В об разцах, направлявшихся на ЬС-М8, белки сначала обрабатывают 4-винилпиридином. Базовая обработка сдвигала значение массы на 387 Да, что согласуется с потерей холестерина и воды (см. табл. 3). Масса растворимого 81111 при такой обработке не меняется. Вместе эти наблюдения позволяют предположить, что связанный с мембраной 81111 человека содержит две модифицирующих единицы: холестерин и вторую структурную единицу с массой 236 Да. Сходство в массах между этим значением и массой пальмитоильной группы (238 Да) предполагает, что белок может быть пальмитоилирован. Более точные оценки масс, обсуждаемые далее, показывают коррелляцию в 0,1 Да для предсказанной массы пальмитоильной структурной единицы.

Таблица 3. Характеризация связанного 811 методом М8.

Расчетные значения масс определяют с использованием средних масс остатков в части а и моноизотопно протонированных масс в части 1

Белок	Масса (Да)
	Рассчитано	Измерено
а. Обработанный КОН 811
Несвязанный (-обработка)	19560,02	19560
Несвязанный (+обработка)	19560,02	19561
Связанный (-обработка)	20167,14	20167
Связанный (+обработка)	19798,49	19780
1. Ν-концевой эндопротеиназный
Ьу8-С пептид (МН+)*
Несвязанный	983,49	983,50
Связанный	1221,72	1221,79

* Все значения масс для описываемых в таблице пептидов представляют собой протонированные массы

Вслед за этим было определено, что связанный 811 может быть фракционирован на разновидности методом ВЭЖХ с модифицированным градиентом элюирования и авторы изобретения разработали простой опыт с ВЭЖХ для количественного определения различных форм. Результаты этих опытов представлены на фиг. 3. В этом опыте первым элюируется немодифицированный 811 (пик 2), а в конце выходит продукт, содержащий модифицированный и холестерином и пальмитиновой кислотой 811 (пик 3). Сложная форма пика 3 отражает присутствие видоизмененной формы пальмитоильной группы, что было определено путем секвенирования при измерении ΜΆΤΌΙ Ρ8Ό. Такой вариант на 2 Да меньше чем предсказывалось, и поэтому он может содержать ненасыщенную связь (эти данные не показаны).

Ό. Локализация модификации пальмитиновой кислотой в последовательности Соник хеджхог человека.

Точку пальмитоилирования в последовательности 811 человека определяют с помощью комбинации пептидного картирования и анализа последовательности. Фиг. 4В показывает результаты анализа пептидного картирования растворимого белка по данным ЬС-М8. Данные по массам, охватывающие более 98% последовательности растворимого 811, могут быть под считаны по данным этого анализа. Пик, отмеченный звездочкой, соответствует Ν-концевому пептиду (остатки 1-9 плюс 4-винилпиридин, наблюдаемая масса 983,50 Да, рассчитанная масса 983,49 Да, табл. 3). По данным соответствующего анализа связанного продукта (фиг. 4А) этот пептид в нем отсутствует и вместо него наблюдается более гидрофобный пептид с массой 1221,79 Да (звездочкой отмечен).

Структурная единица 1221,79 Да согласуется с присутствием модифицированной формы Ν-концевого пептида, то есть 983,49 Да для пептидной компоненты плюс 238,23 Да. Пептид 1221,79 Да был затем направлен на анализ последовательности методом ΜΆΣΌΙ Ρ8Ό измерения. Полученный спектр Ρ8Ό показан на фиг. 5. Были определены ионы, соответствующие фрагментам 11, 12, 14, 15, 18 + Н₂О, у8, у7, у5, у4, у3, у2 и у1, что подтверждает последовательность. В дополнение к этому, ионы 11 и 12 показывают, что пальмитоилирован пиридилэтилированный аддукт с Цис-1. Только ионы, содержавшие Цис-1, содержали добавочную массу 238,23 Да.

Поскольку цистеин представляет собой обычный сайт пальмитоилирования белков ίη νίνο, обнаружение нового аддукта с присоединением к Ν-концевому цистеину не оказалось неожиданным. Хотя два осколка явно свидетельствовали о том, что липид присоединен к аминогруппе цистеина, а не к тиоловой. Вопервых, при изучении картированием 4винилпиридин использовался в качестве спектроскопической метки для обнаружения свободных тиольных групп (27). Пиридилэтилирование высокоизбирательно по отношению к цистеиновым тиолам и оно добавляет 105 Да к аддукту, что может быть обнаружено в массспектре. Наблюдавшиеся фрагменты с Цис-1 в спектре Ρ8Ό содержали как пальмитоильные, так и пиридилэтильные модификации, что указывало на присутствие свободных тиольных групп. Во вторых, связанный 811 подвергался автоматизированному секвенированию Ν-конца по Эдману и при этом не было получено ни одной последовательности, подразумевавшей блокировку Ν-концевого α-амина. В отличие от этого, соответствующая растворимая форма 811 легко подвергается секвенированию.

Пример 2. Соник хеджхог человека может быть модифицирован пальмитиновой кислотой в бесклеточной системе.

Растворимый 811 метят ³Н-пальмитиновой кислотой в бесклеточной системе с использованием измененной версии опубликованной методики (24). Неочищенную микросомальную фракцию из печени крысы готовят, подвергая последовательному центрифугированию гомогенат печени при 3000 х д в течение 10 мин, 9000 х д в течение 20 мин и 100000 х д в течение 30 мин. Осадок, полученный при 100000 х д суспендируют в 10 мМ НЕБЕ8 рН 7,4, 10% са65 харозы и снова суспендируют при 100000 х д в течение 20 мин. Полученный осадок (из 10 г печени) суспендируют в 3 мл 20мМ Трис-НС1 рН 7,4, 150 мМ №С1, 1 мМ ΕΌΤΑ, 10 мкг/мл лейпептина, 0,15% Ττίίοη Х-100, делят на аликвоты и хранят при -70°С. Реакции проводят на смесях, содержащих 3 мкг 811, 1 мкл микросом крысы, 50 нг/мл кофермента А (81дта), 0,3 мМ АТФ, 20мМ Трис-НС1 рН 7,4,150 мМ №С1, 1 мМ ΕΌΤΑ, 10 мкг/мл лейпептина и 0,5 цКи[9,10-3Н]-пальмитиновой кислоты (50

Ки/ммоль; Νονν Епд1апй №.1с1еаг), при комнатной температуре в течение 1 ч. Реакции останавливают редуцирующим электрофорезом образца в буфере, направляют на 808-РАСЕ на геле с градиентом 10-20% и проявляют флуорографически.

Как показано на фиг. 1 (линия с), 811 легко метится радиоактивным трассером. Ни один примерно из ста других белков в реакционной массе не метится (см. соответствующую диаграмму на окрашенном Сοοта88^е Ь1ие геле на линии _)), что демонстрирует высокую степень избирательности реакции пальмитоилирования. В качестве еще одного способа подтверждения избирательности реакции пальмитоилирования авторами изобретения были испытаны два варианта 811, в которых сайт для пальмитоилирования был удален. На фиг. 1 линия Г показывает результаты анализа урезанной формы растворимого 811, в котором отсутствуют 10 первых остатков аминокислот от полной последовательности, а линия д соответствует мутантной форме 811, содержащего на его Ν-конце точечную мутацию с заменой единственного Цис-1 на Сер. Ни один из этих вариантов не был помечен.

Значение Ν-концевого цистеина в качестве сайта для дериватизации липидом демонстрируется тем, что естественный тип растворимого 811 метится легко, тогда как мутационная замена Ν-концевого цистеина на серии не метится. Неспособность пометить Ν-концевой сериновый мутант противоречит простому механизму реакции, в ходе которой пальмитоильная структурная единица напрямую присоединяется к Νконцевому α-амину, поскольку тогда в условиях эксперимента серин был бы заменителем цистеина.

Авторы изобретения исследовали также роль свободного Ν-конца с использованием формы растворимого 811 с удлинением в виде Ν-концевого гистидина (Гис-метка). Растворимый 811 человека, используемый в этих опытах, был получен первоначально в виде полученного слиянием белка с Гис-меткой и с сайтом расщепления энтерокиназой в месте присоединения полной последовательности, а после этого его обработали энтерокиназой для отделения Гисметки. 811 с Гис-меткой не подвергается пальмитоилированию несмотря на присутствие свободной тиоловой группы цистеина (см. фиг. 1, линия ί). В то время как нельзя исключить воз можность того, что Ν-концевое удлинение стерически ингибирует протекание пальмитоилирования, Цис-1 находится в РГ положении сайта энтерокиназного расщепления и вполне доступен для ферментативного превращения. В соответствии с этим, похоже, что и тиоловая группа и α-амин в Цис-1 участвуют в реакции пальмитоилирования. Поскольку все известные реакции пальмитоилирования направлены на боковые цепи Цис-, Сер- или Тре-остатков, можно сделать вывод о том, что модификация хеджхог начинается с образования тиоэфирного интермедиата и что пальмитоильная структурная единица затем переносится на Ν-конец с образованием циклического интермедиата. Эта гипотеза подтверждена в ходе изучения модификации Соник хеджхог человека с использованием пальмитоил-кофермента А (см. пример 8).

Пример 3. Демонстрация повышенной эффективности ацилированного жирной кислотой Соник хеджхог человека естественного происхождения в опыте на клетках (С3Н10Т1/2).

Функцию 811 изучают в опыте на клетках с измерением индукции щелочной фосфатазы в клетках С3Н10Т1/2 (25) с регистрацией результатов в течение 5 дней. Опыты проводят в формате 96 ячеек. Образцы испытывают дважды. Для связанного 811 (100 мкг/мл) образцы сначала разбавляют в 200 раз нормальной средой для выращивания, затем вдоль по пластинке проводят серию двукратных разбавлений. Ячейки нормализуют по возможному эффекту от добавляемого октилглюкозида, вводя 0,005% октилглюкозида в культуральную среду. Опыты по блокированию с использованием нейтрализующего тАЬ 5Е1 (26) мелких грызунов проводят, смешивая 811 с серийными разбавлениями антитела в течение 30 мин при комнатной температуре в культуральной среде до того, как добавляют исследуемые образцы на пластинки.

В этом опыте растворимый 811 человека вызывает зависящий от дозы ответ с 1С₅₀ равным 1 мкг/мл и с максимальным сигналом при 3 мкг/мл (фиг. 6а). Связанный 811 человека с присоединенным к С-концу холестерином и с пальмитоильной группой на Ν-конце подобным образом вызывает в этом эксперименте зависящий от дозы ответ, но при 1С₅₀, равном 0,03 мкг/мл, и при максимальном сигнале при 0,1 мкг/мл, показывая этим, что он более чем в 30 раз более активен, чем растворимый 811. Для того, чтобы проверить является ли наблюдаемая активность специфичной для хеджхог, авторы изобретения изучили протекает ли ингибирование активности анти-хеджхог нейтрализующими тАЬ 5Е1. Оба 811, и растворимый и связанный, ингибируются при обработке 5Е1 (фиг. 6В). Ингибирование связанного 811 требует в десять раз больше 5Е1, что согласуется с его повышенной активностью в этом опыте.

Связанный 811 исследовали в опыте на взаимодействие с рецептором, показывая этим его способность к петч-связыванию, с использованием модифицированной версии недавно опубликованного эксперимента (10). Связанный 811 показывает зависящее от дозы взаимодействие с клетками, в которых идет петч-экспрессия, с наблюдаемой величиной [С₅₀, равной 400 нг/мл (фиг. 7). В том же самом опыте пэтчвзаимодействие происходит с растворимым 811 с наблюдаемой 1С₅₀, равной 150 нг/мл, показывая этим, что связанная форма лишь немного менее прочно связывается с его рецептором.

Пример 4. Анализ связанного Соник хеджхог человека после его встраивания в липосомы.

Этот пример показывает, что эксперименты по встраиванию в позитивно и негативно заряженные липосомы разбавлением поверхностного активного вещества в широкой области отношений липид/белок (масса/масса) от 1:1 до 100:1 не оказывают влияния на активность связанного 811 в опытах на С3Н10Т1/2.

Встраивание в липосомы, содержащие фосфолипиды, представляет собой практически ценный способ приготовления лекарственной формы для содержащего липид белка, поскольку это позволяет содержащему липид белку находиться в близком к нормальному окружении. Для исследования возможности применения такой лекарственной формы для связанного 811 использовался метод разбавления поверхностно-активного вещества при встраивании белка в липосому (60), когда предварительно сформированные липосомы смешивают с октилглюкозидом и изучаемым белком и после этого разбавляют поверхностно-активное вещество до концентрации ниже критической концентрации мицеллообразования, вызывая таким образом встраивание. Хотя для этого можно использовать любой из большого числа чистых липидов или их смесей, авторы изобретения использовали в качестве моделей две поступающие в продажу смеси: набор для отрицательно заряженных липосом, содержащий яичный Ь-а-фосфатидилхолин, дицетилфосфат и холестерин (Са1. №. Д-4262; 81дта, 81.Ьошк, МО), и набор для положительно заряженных липосом, содержащий яичный фосфататидилхолин, стеариламин и холестерин (Са1. №. Д-4137; 81дта).

Вкратце, липиды переносят в пробирку из пирекса, сушат в токе азота и удаляют остаточный растворитель лиофильной сушкой. Липид суспендируют в 10 мМ НЕРЕ8, рН 7,5, 100 мМ №С1, 2,0% октилглюкозида, перемешивают и обрабатывают ультразвуком до тех пор, пока суспензия приобретет вид опалесцирующей жидкости. Затем липид фильтруют через фильтр 0,2 микрона. К аликвотам связанного 811 из зараженных бакуловирусом клеток насекомого Н1д1 Иуе™ в октилглюкозиде прибавляют 400-, 1000-, 5000- и 20000-кратный избыток липида (масса/масса) и после предварительной инкубации в течение 15 мин образцы разбавляют и испытывают на активность в опыте на С3Н10Т1/2.

Прибавление как позитивных, так и негативных липосом не оказывает какого-либо эффекта на активность хеджхог, показывая этим, что липидный носитель представляет собой перспективную лекарственную форму. Для проверки того, что хеджхог действительно оказался встроен в нее, параллельные образцы подвергают центрифугированию в условиях, когда связанный 811 обычно образует осадок, а липосомы всплывают на поверхность образца. В этих условиях связанный белок всплывал на поверхность, показывая этим, что его встраивание имело место.

Пример 5. Характеризация связанного с мембраной Соник хеджхог человека из клеток млекопитающих (ΕΒΝΑ-293).

Для определения, является ли пальмитоилирование общим способом модификации для Соник хеджхог или это специфично для получения его в клетках насекомого, белок также получают в системе млекопитающих в клетках ΕΒΝΑ-293. Для экспрессии полной длины 811 в клетках млекопитающих клонируют 1,4 кб №ίΙ фрагмент, включающий полную длину 811 (см. пример 1), в производное вектора СН269рСЕР4 ([пуЦгодеп, 8ап Э1едо, СА (21)). Этой конструкцией проводят трансфекцию клеток ΕΒΝΑ-293, используя для этого липофектамин (ЫГе Тес1по1од1ек, 1пс.) и собирают клетки через 48 ч после трансфекции. Экспрессию поверхностного 811 проверяют методом ЕАС8 и анализа \Уек1егп Ь1о1.

Связанный 811 из клеток ΕΒΝΑ 293 фракционируют методом ВЭЖХ с обращением фаз на колонке пагго\у Ьоге С₄ (см. фиг. 3). Пики анализируют методом Ε8Ι-Μ8 (части а и Ь в табл. 4) или ΜΑΡΌΙ-ТОЕ М8 на массспектрометре Ешшдап ЬакегМа!, используя в качестве матрицы а-циано-4-гидроксикоричную кислоту (часть с в табл. 4). По данным 8Ό8ΡΑΟΕ белок мигрирует несколько скорее, чем растворимый 811, он задерживается на С4колонке ВЭЖХ с обращенной фазой, а по данным масс-спектрометрии он содержит ион, соответствующий модификации пальмитиновой кислотой плюс холестерин. Хотя в отличие от полученного на клетках насекомого продукта, где более 80% продукта содержат одновременно модификацию и пальмитиновой кислотой и холестерином, картина элюирования методом ВЭЖХ и данные масс-спетрометрии показывают, что большая часть белка из клеток млекопитающих не имеет пальмитоильной структурной единицы (см. табл. 4 на фиг. 3С). В соответствии с этим, в пике 2 из клеток ΕΒΝΑ 293 отношение укороченного (бек-1-10) к интактному белку по данным сигнала в масс-спектре составляет 50%, тогда как для пика 1 всего лишь около 10% 811 было укорочено. Интересно, что продукты, выделяемые как клетками насекомо го так и клетками млекопитающих, показывают сравнимые активности в опыте на С3Н10Т1/2, и это предполагает что функциональны обе модификации, будь то с холестерином или с холестерином плюс пальмитиновая кислота. В последующем надо будет определить, используется ли сайт присоединения второго липида просто для дальнейшей стабилизации ассоциации белка с мембраной или же он играет более активную роль и влияет на конформацию или на белок-белковые контакты.

Дериватизация белков жирными кислотами представляет собой обычную посттрансляционную модификацию, которая происходит позже в процессах созревания (28, 29). Для производных цистеина - это динамический процесс, в который вовлечены различные ферменты, добавляющие или удаляющие модифицирующие остатки на сульфгидрильной группе. Наиболее известные функции таких дериватизаций (например, пальмитоилирование) состоят в изменении физико-химических свойств белка, то есть в нацеливании белка на место его действия, на промотирование белок-белковых взаимодействий и на посредническое участие во взаимодействии белка с мембраной (30). Для хеджхог, где различие в степени пальмитоилирования в препаратах из клеток насекомого или из клеток млекопитающих (80% в клетках насекомого по сравнению с 30% в клетках млекопитающих) было неожиданным, мы не знаем имеет ли это биологическое значение или просто отражает различие в клеточном функционировании двух тестируемых систем для присоединения или удаления пальмитиновой кислоты. Маловероятно, что различие в степени модификации в клетках насекомого и млекопитающих связано со строением, поскольку связанный хеджхог из ЭгокорНПа, который продуцируется клетками насекомого, обеднен пальмитиновой кислотой несмотря на то, что у него такая же Ν-концевая последовательность.

Таблица 4. Масс-спектрометрический анализ связанного Соник хеджхог человека из ΕΒNΆ-293

Белок	Масса
Рассчитано	Найдено
а. Бактериальная экспрессия (несвязанный)	19560,02	19560
й. Бакуловирусная экспрессия (связанный) +пальмитиновая кислота	19798,49	19796
+пальмитиновая кислота/холестерин	20167,14	20168
с. Экспрессия в клетках ΕΒNΆ-293 (связанный) пик 1 (9% от общего хеджхог) несвязанный	19560,02	19581
несвязанный (бек 1-9)	18700,02	18712
пик 2 (61% от общего хеджхог) +холестерин	19928,67	19934
+холестерин (бек 1-10)	18912,48	18889
пик 3 (30% от общего хеджхог) +пальмитоил/холестерин	20167,14	20174

Пример 6. Липидные модификации Соник хеджхог крысы.

Этот пример иллюстрирует, что с растворимой версией Соник хеджхог крысы связываются разнообразные липиды, когда ген 8НН крысы, кодирующими остатки 1-174, участвует в экспрессии в клетках насекомого НщН БКе™, в основном так же, как и для полной длины 8НН человека по примеру 1. Липидная модификация приводит к ассоциации этой фракции с мембраной. Ν-Концевой фрагмент (остатки 1-174 неизмененного Соник хеджхог крысы) отличается всего лишь на 2 аминокислотных остатка от Νконцевого фрагмента Соник хеджхог человека. В Ν-концевом фрагменте Соник хеджхог крысы треонин заменяет серии в положении 44 и аспарагиновая кислота заменяет глицин в положении 173. Если идет экспрессия Соник хеджхог крысы без автопроцессингового домена в клетках насекомого НЦН БВе™ с бакуловирусной системой экспрессии, то большая часть белка секретируется в культуральную среду, так как у него отсутствует способность присоединять холестерин к С-концу. Эта растворимая форма имеет специфическую биологическую активность (определена в опыте по индукции щелочной фосфатазы в С3Н10Т1/2, пример 3), которая подобна активности растворимого Ν-концевого фрагмента Соник хеджхог человека, полученного экспрессией в Е.сой и очищенного.

Тем не менее, небольшая фракция общего белка остается ассоциированной с клетками насекомого. Ассоциированный с клетками Соник хеджхог белок крысы выделяют в чистом виде в основном так же, как это описано в примере 1, и оказалось что он заметно более активен в опыте на щелочную фосфатазу (эти данные не представлены), чем растворимые Ν-концевые фрагменты Соник хеджхог человека или крысы, выделенные из Е. Сой и НЦН БКе™ клеток насекомого с бакуловирусной системой экспрессии соответственно. Последовательные анализы Νконцевых фрагментов Соник хеджхог крысы методом ВЭЖХ и масс-спектрометрии с электрораспылением (как это описано в примере 1) позволяют предположить, что белок модифицирован липидами и что при этом имеется более одного типа липидных модификаций. Это подтверждается следующими наблюдениями:

1. Ассоциированные с клетками формы позже чем растворимые Ν-концевые фрагменты Соник хеджхог человека и крысы элюируются с С4 колонки (Уубас са1а1од питйег 214ТР104) при ВЭЖХ с обращенной фазой при проявлении линейным градиентом 0-70% ацетонитрила в 0,1% трифторукусной кислоте за 30 мин.

2. Массы ассоциированных с клетками форм согласуются с ожидаемыми для модифицированных липидами белков, как это показано в табл. 5.

Таблица 5. Массы различных модифицированных ли-

пидами форм Соник хеджхог крысы
Белок	Аддукт	Ожидаемая масса* (МН*)	Наблюдаемая масса

Немодифицирован	Отсутствует	19632,08	19632
Миристоил	СН3(СН2)12СО-	19842,50	19841
Пальмитоил	СН3(СН2)14СО-	19870,55	19868
Стеароил	СН3(СН2)16СО-	19898,60	19896
Арахидоил	СН3(СН2)18СО-	19926,66	19925

* Для расчета ожидаемых масс использовались средние массы.

Локализацию липидной структурной единицы определяют с помощью комбинации анализа последовательности и пептидного картирования. Автоматическое Ν-концевое секвенирование по Эдману модифицированных липидами форм показывает, что Ν-конец блокирован, что предполагает присоединение липида по α-амину Ν-концевого цистеина. Эндо-Лиз-С-пептидное картирование, масс-спектрометрия МАЬЭ1-Т0Р и анализ МАЬЭ1 Р8Э (как это описано в примере 1) алкилированных 4-винилпиридином модифицированных липидами форм использовались для подтверждения локализации липидных модификаций и для определения их точных масс.

Массы Ν-концевых пептидов (включая остатки 1-9 плюс 4-винилпиридин, присоединенный к тиольной боковой цепи Ν-концевого цистеина), несущие липидные модификации, совпадают с ожидаемыми для модифицированных липидами пептидов с точностью до 0,1 Да, как это показано в табл. 6.

Таблица 6. Массы Ν-концевых пептидов, выделенных из различных модифицированных липидами форм Соник хеджхог крысы

Белок	Аддукт	Ожидаемая масса* (МН+)	Наблюдаемая масса(МН+)
Миристоил	СН3(СН2)12СО-	1193,69	1193,76
Пальмитоил	СН3(СН2)14СО-	1221,72	1221,65
Стеароил	СН3(СН2)16СО-	1249,75	1249,71

* Для расчета ожидаемых масс использовались моноизотопные массы

В дополнение к представленным в табл. 6 модифицированным липидами пептидам были получены также пептиды с массами 1191,74, 1219,84 и 1247,82. Эти массы совпадают с ненасыщенными формами миристата, пальмитата и, соответственно, стеарата, хотя положение двойной связи в алкильной цепи не определялось. Эти наблюдения показывают, что как насыщенные, так и ненасыщенные жирные кислоты могут быть ковалентно присоединены к Νконцевому цистеину. Как в случае насыщенных, так и ненасыщенных модифицированных липидами пептидов анализ методом МАЬЭ1 Р8Э, как это описано в примере 1, подтверждает, что липиды присоединены ковалентной связью к Νконцевому остатку цистеина.

Пример 7. Липидная модификация Индиан хеджхог.

Для того чтобы определить, является ли реакция пальмитоилирования уникальной для 811 человека или она может также протекать и на других хеджхог-белках, авторы изобретения провели проверку возможности пальмитоилиро вания по описанной в примере 2 методике на Индиан хеджхог человека (получен экспрессией в Е.то! в виде Гис-маркированного, полученного слиянием белка с сайтом энтерокиназного расщепления непосредственно рядом с началом зрелой последовательности, очищен точно так же, как рекомбинантный Соник хеджхог человека (см. пример 9). Индиан хеджхог человека подвергался модификации (см. фиг. 1, линия 1), демонстрируя этим, что пальмитоилирование вероятнее всего является общей характерной особенностью хеджхог-белков. Способность к непосредственному маркированию 811 и Ι11 радиоактивной пальмитиновой кислотой в системе, свободной от клеток, представляет собой простое средство для отбора аминокислот, участвующих в реакции модификации. Кроме того, пальмитоилированный описанным в примере 8 способом Индиан хеджхог значительно более эффективен в опыте на С3Н10Т1/2, чем немодифицированный Ι11.

Пример 8. Липидные модификации Соник хеджхог с помощью ацилкофермента А.

Ацилирование ίη νίίτο белка, содержащего Ν-концевой цистеин, может быть проведено в двухстадийной химической реакции тиоэфирным донором жирной кислоты. На первой стадии ацильная группа тиоэфирного донора переносится на сульфгидрил Ν-концевого цистеина в белке в ходе спонтанной реакции переэтерификации. После этого ацильная структурная единица претерпевает сдвиг от 8 к Ν α-амина Νконцевого цистеина с образованием стабильной амидной связи. Прямое ацилирование аминной функции в белке может также протекать при продолжительной инкубации с тиоэфиром, но присутствие цистеина в белке ускоряет реакцию и позволяет контролировать сайт ацилирования. В представленных примерах использовались приобретаемые коммерческим путем производные кофермента А (81дта С1ет1са1 С^тра^, 8ί. Ροιιίδ МО), но другие тиоэфирные группы приводят к такому же результату. В действительности некоторые уходящие группы тиоэфиров, такие, как сложные тиобензильные эфиры, могут, как ожидается, реагировать с более высокой скоростью. Внутренние остатки цистеина могут также промотировать ацилирование соседних лизинов (то есть, как во внутренней цистеинлизиновой паре) и это может быть легко проверено с помощью синтетических пептидов. Вторичное ацилирование протекающее на белке во время реакции с тиоэфирами, может быть предотвращено за счет контроля состава буфера, рН или за счет регионаправленного мутагенеза соседних лизинов.

При предварительном анализе влияния ацилирования на способность Соник хеджхог человека индуцировать щелочную фосфатазу в клетках С3Н10Т1/2 реакционные смеси содержали 1 мг/мл Соник хеджхог человека (51 мкМ), 500 мкМ соответствующего коммерческого ацилкофермента А (в число исследованных соединений входили ацетил-СоА (С2:0), бутирилСоА (С4:0), гексаноил-СоА (С6:0), октаноилСоА (С8:0), деканоил-СоА (С10:0), лауроилСоА (С12:0), миристоил-СоА (С14:0), пальмитоил-СоА (С16:0), пальмитолеоил-СоА (С16:1), стеароил-СоА (С18:0), арахидоил-СоА (С20:0), бегеноил-СоА (С22:0), лигноцероил-СоА (С24:0), сукцинил-СоА и бензоил-СоА), 25 мМ ΌΤΤ и 50 мМ Ν;·ι₂ΗΡΘ₄ рН 7,0. Реакции инкубировали при комнатной температуре в течение 3 ч и сразу после этого анализировали (без очистки) на биологическую активность в опыте с С3Н10Т1/2, как это описано в примере 3. Образцы для анализа методом ВЭЖХ с обращением фаз или другими физическими методами обычно хранят при температуре -70°С. Анализ ВЭЖХ проводят на С4 Vуάас колонке с обращением фаз (внутренний диаметр 4,6 мм х 250 мм, частицы 5 мкм), хроматографируя градиентом от 5% ацетонитрила до 85% ацетонитрила в 0,1%-ной водной трифторукусной кислоте за 40 мин при скорости протекания 1 мл/мин. Выходящую с колонки жидкость анализируют при 280 нм, собирают фракции с нескольких опытов и анализируют их на хеджхог-белок методом 8Ό8-ΡΑΟΕ, проявляя окрашиванием с помощью Соотакые и способом ХУеЧегп ЫоШпд.

Сравнение активности различных реакционных смесей (рисунок 10) показывает, что длина цепи в пределах от 12 до 18 атомов углерода оптимальна при индуцировании высокой активности щелочной фосфатазы по сравнению с немодифицированным белком. Дальнейшее повышение длины цепи приводит к заметному снижению активности, а присутствие двойной связи в ненасыщенном пальмитолеоил-СоА (С 16:1) дает такую же активность, что и от полностью насыщенного пальмитоил-СоА (С 16:0). По данным анализа методом ВЭЖХ с обращением фаз сделано наблюдение, что многие из производных на основе короткоцепочечных ацил-СоА не реагируют с хеджхог-белком и поэтому зависимость биологической активности, показанная на фиг.10, не является истинным отражением роли длины ацильной цепи.

Для получения данных по истинной активности модифицированных белков и по зависимости активности от длины ацильной цепи авторами изобретения разработаны способы синтеза и очистки индивидуальных Ν-концевых ацилированных форм. Пальмитоилированный, миристоилированный, лауроилированный, деканоилированный и октаноилированные Соник хеджхог-белки человека, несущие единственную ацильную цепь, присоединенную к α-амину Ν-концевого цистеина, получают в реакционных смесях, содержащих 0,80 мг/мл (41 мкМ) Соник хеджхог человека, 410 мкМ (10-кратный молярный избыток) для каждого из пальмитоилСоА, миристоил-СоА или лауроил-СоА, или 4,1 мМ (100-кратный избыток) для каждого из де каноил-СоА или октаноил-СоА, 25 мМ ΌΤΤ (для реакционных смесей, содержащих пальмитоил-СоА, миристоил-СоА или лауроил-СоА) или 0,5 мМ ΌΤΤ (для реакционных смесей, содержащих деканоил-СоА или октаноил-СоА) и мМ Να₂ΗΡΘ₄ рН 7,0. Реакционные смеси инкубируют при 28°С в течение 24 ч. Реакция Νконцевого цистеина с ацильными тио-эфирами состоит в переносе ацильной группы на сульфгидрил в результате спонтанной реакции переэтерификации, за которой следует сдвиг от 8 на N α-амина с образованием стабильной амидной связи. После этого свободный сульфгидрил подвергается второй реакции переэтерификации с образованием белка с жирной кислотой, присоединенной через тиоэфирную связь к сульфгидрилу. Присоединенную тиоэфирной связью ацильную группу удаляют последовательным прибавлением 0,11 объема 1М №ьНРО₄ рН 9,0 и 0,11 объема 1М гидроксиламина (конечная концентрация 0,1М) с последующей инкубацией при 28°С в течение 18 ч, в результате чего остается только присоединенный к белку ациламид (62). После этого прибавляют 0,25 объема 5% октилглюкозида (конечная концентрация 1%) и инкубируют смесь в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем очищают белки в присутствии 1% октилглюкозида с использованием катионных ионобменных хроматографий на 8Р8ерНаго5е (РЕагтаае) Рак! Р1оте и Вю 8са1е 8 (Вюгаб). Очищенные белки диализируют с раствором 5 мМ №ьНРО₄ рН 5,5, 150 мМ №С1, 1% октилглюкозида, 0,5 мМ ΌΤΤ и хранят при 70°С. Присутствие октилглюкозида требуется для поддержания полной растворимости; удаление этого поверхностноактивного вещества разбавлением или диализом приводит к потере 75, и 15% пальмитоилированного, миристоилированного и лауроилированного белков соответственно. Ε8Ι-Μ8 очищенных методом ВЭЖХ белков подтверждает их чистоту: пальмитоилированный Соник хеджхог, получена масса = 19798, рассчитана масса = 19798,43; миристоилированный Соник хеджхог, получена масса = 19770, рассчитана масса = 19770,33; лауроилированный Соник хеджхог, получена масса = 19742, рассчитана масса = 19742,33; деканоилированный Соник хеджхог, получена масса = 19715, рассчитана масса = 19714,28; октаноилированный Соник хеджхог, получена масса = 19686, рассчитана масса = 19686,23.

Исследование различных ацилированных форм Соник хеджхог человека в опыте С3Н10Т1/2 (фиг. 11) показывает, что активность белков зависит от длины цепи. Пальмитоилированный, миристоилированный и лауроилированный белки показывают примерно одинаковую активность со значениями ЕС₅₀ 5-10 нг/мл (100-200 кратное повышение активности по сравнению с немодифицированным белком). Деканоилированный Соник хеджхог человека с значением ЕС₃₀ 60-70 нг/мл (15-30 кратное по вышение активности по сравнению с немодифицированным белком) менее активен чем пальмитоилированная, миристоилированная и лауроилированная формы, тогда как октаноилированная форма наименее активна с ЕС50 100200 нг/мл (10-кратное повышение активности по сравнению с немодифицированным белком). Все ацилированные формы более активны чем немодифицированный белок, у которого ЕС50 равна 1000-2000 нг/мл. В дополнение к снижению величины ЕС50 пальмитоилированный, миристоилированный и лауроилированный белки индуцируют примерно в два раза больше активности щелочной фосфатазы чем немодифицированный белок, тогда как деканоилированный и октаноилированный белки индуцируют примерно в 1,5 раза больше.

В дополнение к наблюдаемому в опыте на С3 Н10Т1/2 повышению эффективности миристоилированной формой Соник хеджхог человека, эта форма значительно более эффективна чем немодифицированный белок при индуцировании вентральных нейронов переднего мозга в эксплантате эмбриональной стадии Е11 мозгового пузыря мозга крысы. Инкубация Е11 эксплантата мозгового пузыря с различными концентрациями немодифицированного или миристоилированного Соник хеджхог с последующим окрашиванием эксплантатов для продуктов й1х и 1к1е1-1 /2 генов (маркеры вентральных нейронов переднего мозга) показывает, что индукция немодифицированным белком начинается только с 48 нМ, тогда как индукция миристоилированной формой наблюдается уже с 3 нМ. Более того, если немодифицированный белок индуцирует ограниченную экспрессию при 3070 нМ, то миристоилированный белок индуцирует развернутую экспрессию при всего лишь 48 нМ. Аналогичное повышение эффективности наблюдалось, когда эксплантаты эмбриональной стадии Е9 предполагаемого мозгового пузыря инкубировали или с немодифицированным или же с миристоилированным белками. Окрашивание эксплантатов для продуктов Ыкх2.1 гена (ранний маркер вентральных нейронов переднего мозга) показывает, что немодифицированный белок индуцирует Ыкх2.1 только при 384 нМ, тогда как для миристоилированного белка экспрессия Ыкх2.1 наблюдалась при всего лишь 12 нМ. Более того, при 48 нМ миристоилированного Соник хеджхог экспрессия Ыкх2.1 носила развернутый характер, тогда как на немодифицированной форме она при этой концентрации не проявлялась.

Кроме того, было показано, что миристоилированный Соник хеджхог человека проявляет значительно более выраженное защитное действие чем немодифицированный белок, снижая объем патологических изменений, причиной которых является введение малоната в полосатое тело мозга крысы (см. пример 16).

Пример 9. Химические производные Νконцевого цистеина Соник хеджхог человека.

А. Общие методы.

Алкилирование белков. Образцы, содержащие около 20 мкг белка в 50 мкл 6М гидрохлорида гуанидина, 50 мМ №₂ΗΡΟ₄ рΗ 7,0 обрабатывают 0,5 мкл 4-винилпиридина в течение 2 ч при комнатной температуре. 8Пиридилэтилированный белок осаждают добавлением 40 объемов охлажденного этанола. Раствор выдерживают при -20°С в течение 1 ч и центрифугируют при 14000 х д в течение 8 мин при 4°С. Жидкость над осадком отбрасывают и промывают осадок охлажденным этанолом. Белок хранят при -20°С.

Картирование пептида. Алкилированный белок (0,4 мкг/мл в 1М гидрохлорида гуанидина, 20 мМ №₂ΗΡΟ.·ι рΗ 6,0) ферментируют с эндо-Лиз-С (^ако Риге Сйетка1 ШйикМек, Ий.) в соотношении 1:20. Ферментацию проводят при комнатной температуре в течение 30 ч. Реакцию останавливают подкислением 5 мкл 25% трифторуксусной кислоты. Продукт ферментации анализируют на \Уа1егк 2690 8ерагайоп Мойи1е с набором фотодиодных детекторов Мойе1 996. Перед введением добавляют твердый гидрохлорид гуанидина к продукту ферментации до концентрации 6М для растворения нерастворенного материала. Для разделения используют колонку Ууйас С₁₈ (2,1 мм внутренний диаметр х 250 мм) с обращением фаз и градиент 0,1% трифторуксная кислота/ацетонитрил и 0,1% трифторуксусная кислот/ацетонитрил в течение 90 мин при скорости протекания 0,2 мл/мин. Индивидуальные пики отбирают ручным способом для масс-анализа.

Определение масс. Молекулярные массы интактных белков определяют методом массспектроскопии с ионизацией электрораспылением (Е8ГМ8) на тройном квадрупольном массспектрометре Мюготакк ЦиаИго ΙΙ. Образцы обессоливают с помощью соединенной с ним системы Мюйгот ШгаГак! МюгоргсИет Апа1ухег с колонкой ВейакИ С₄ (1 мм в диаметре х 50 мм). Скорость протекания 20 мкл/мин. Все данные масс-спектров с электрораспылением обрабатывают с помощью системы Мюготакк МаккЬупх йаίа. Молекулярные массы пептидов определяют методом масс-спектрометрии при лазерной десорбционной ионизации из матрицы с регистрацией времени пролета (МА^^I-ТΟР-М8) на приборе Уоуадег-БЕ™ 8ТВ (Рег8ерЩе Вюкукίетк, Ргаттдйат, МА). Секвенирование модифицированного пептида проводят измерением РокГкоигсе йесау (Р8Б) на том же самом приборе. В качестве матрицы используют а-циано-4гидроксикоричную кислоту.

Ν-Концевое секвенирование. Белки секвенируют деградацией по Эдману на Регкш-Е1тег АррНей Вюкук1етк тойе1 447А Ри1кей-Ыс.|шй РгФеш 8ес.|иепсег. РТН-Тиапролин получают по ходу анализа прямым введением тиапролина (тиазолидин-4-карбоновой кислоты) в картридж загрузки образцов секвенсера.

Бактериальная экспрессия и очистка Νконцевого фрагмента естественного типа растворимого Соник хеджхог человека, используемого для химической модификации. Бактериальные таблетки из клеток с экспрессией 811 с общим содержанием белка 4-5% оттаивают, ресуспендируют в лизирующем буфере (25 мМ №1₂НРО₄ рН 8, 150 мМ ИаС1, 1 мМ ΕΌΤΑ, 1 мМ РМ8Р, 0,5 мМ ΌΤΤ) при соотношении 1:4 (масса/объем) и лизируют двукратным пропусканием через пресс Саи1ш (т£д. Λ₽ν Ραηηίο, Копенгаген, Дания) при давлении 844 кг/см² (12000 р.8.1.). Все последующие стадии очистки проводят при температуре 2-8°С, если не указано иное. Гомогенат центрифугируют при 19000 х д в течение 60 мин и к полученному продукту лизирования прибавляют МЕ8 0,5М рН 5 в соотношении 1:10 (объем/объем). Продукт лизирования пропускают через колонку 8Р сефарозы с высоким пропусканием (Р1агтааа, Р|8са1а\уау, Νί) (из расчета 4 г массы влажной Е.то! на мл смолы), находящуюся в равновесии с 25 мМ №₂НРО₄ рН 5,5, 150 мМ №С1. Колонку промывают четырьмя объемами колонки (Ον выравнивающего буфера, затем 3 Ον 25 мМ №ьНРО₄ рН 5,5, 200 мМ ЫаС1, 0,5 мМ ΌΤΤ и элюируют Н|81ад-811 800 мМ №1С1 в том же буфере. Полученные при элюировании фракции анализируют на абсорбцию при 280 нм и методом 8Ό8РАСЕ. К объединенным растворам с пиками 811, содержащим фракции с 8Р 8ср1аго5С, прибавляют имидазол (из емкости с раствором 1М при рН 7) и №1С1 (из емкости с раствором 5М) до конечных концентраций 20 мМ и 1М соответственно и этот материал пропускают через ΝΤΑ-Νί адагозе (Стадсн, 8ан1а С1ага, СА) колонку (20 мг/мл смолы), находящуюся в равновесии с 25 мМ №₂НРО₄ рН 8, 1М ИаС1, 20 мМ имидазола, 0,5 мМ ΌΤΤ. Колонку промывают 5 Πν того же самого буфера и элюируют Н181ад811 3 σν 25 мМ №1₂НРО₄ рН 8, 1М ИаС1, 200 мМ имидазола, 0,5 мМ ΌΤΤ. Содержание белка в объединенных элюатах с ΝΤΑ-Νί колонки определяют по поглощению при 280 нм. Объединенные элюаты нагревают до комнатной температуры и прибавляют равный объем 2,5М сульфата натрия. Стадию с фенилсефарозой проводят при комнатной температуре. Материал пропускают через колонку фенилсефарозы с высоким пропусканием (Р1агтааа, Р|8са1а^ау, ΝΓ) (20 мг/мл смолы), находящуюся в равновесии с 25 мМ №1₂НРО₄ рН 8, 400 мМ ИаС1, 1,25 мМ сульфата натрия, 0,5 мМ ΌΤΤ. Н|81ад-811 элюируют 25 мМ №1₂НРО₄ рН 8, 400 мМ ИаС1, 0, 5 мМ ΌΤΤ. В типичном случае из 0,5 кг бактериальной пасты (вес во влажном состоянии) получают 2-3 г Н18-маркированного 811. Продукт фильтруют через 0,2 мкм фильтр, делят на аликвоты и хранят при -70°С. Чистота Н18маркированного 811 по данным 8Ό8 РΑСΕ со ставляет около 95%. Для дополнительной оценки характеристик очищенного продукта направляют образцы на исследование методом массспектрометрии с электрораспылением (Е81-М8). Примерно у 50% белка отсутствует Ν-концевой метионин.

Для отщепления гексагистидиновой метки проводят инкубацию энтерокиназы (В ίο/у те, 8ап ^^едο. СΑ) с Н1з1ад-811 при соотношении фермент:811, равном 1:1000 (масса/масса), в течение 2 ч при 28°С. Нерасщепленный НМад811 и свободный НМад отделяют пропусканием продукта ферментации через вторую ΝΤΑ-Νί агарозную колонку (20 мг 811/мл смолы). До загрузки на колонку прибавляют имидазол (из емкости с 1М раствором при рН 7) и №1С1 (из емкости с 5М раствором) к продукту ферментации до конечной концентрации 20 мМ и 600 мМ соответственно. Этот материал пропускают через ΝΤΑ-Νί колонку, находящуюся в равновесии с 25 мМ №1₂НРО₄ рН 8, 600 мМ ИаС1, 20 мМ имидазола 0,5 мМ ΌΤΤ, и собирают проходящую через нее жидкость. Колонку промывают 1 СV того же самого буфера и объединяют промывную жидкость с прошедшим через колонку раствором. К фракции, которая не связалась с ΝΤΑ-Νί агарозой, прибавляют МЕ8 (из 0,5М раствора при рН 5) до конечной концентрации 50 мМ и два объема воды. Этот материал пропускают через вторую 8Р сефарозную колонку с высоким пропусканием (20 мг/мл смолы), находящуюся в равновесии с 5 мМ №₂НРО₄ рН 5,5, 150 мМ ЫаС1, 0,5 мМ ΌΤΤ. Колонку промывают 3 Ην выравнивающего буфера и 1 ϋν того же самого буфера с добавлением 300 мМ ЫаС! Для элюирования 811 берут 5 мМ №₂НРО₄ рН 5,5, 800 мМ ЫаС1, 0,5 мМ ΌΤΤ. Данные атомной абсорбции показывают, что 811 на этой стадии содержит 0,5 мольного эквивалента Ζη⁺² К элюированному 811 прибавляют эквимолярную концентрацию ΖηΟ₂ и проводят диализ белка с 5 мМ №1₂НРО₄ рН 5,5, 150 мМ №С1, 0,5 мМ ΌΤΤ. Получаемый 811 по даным 8^8-РΑСΕ имеет чистоту >98%, по данным хроматографии с исключением размера (8ЕС), Е81-М8 и атомной абсорбции он содержит от 0,9 до 1,1 Ζη⁺² на 811.

Данные Е81-М8 для НМад 811 и продуктов, образующихся в результате удаления ЫЧад объединены в табл. 7.

Таблица 7. Характеризация 8Ы методом Е81-М8

Белок	Масса (Да)
Вычислено	Найдено
Н181а§-8Ы (-Мет)	21433,82	21434
(интактный)	21565,01	21565
811 после расщепления энтерокиназой	19560,02	19560

В. Специфические химические модификации.

Модификации Соник хеджхог человека Νэтилмалеинимидом. К очищенному 811 в 5 мМ №1₂НРО₄ рН 5,5, 150 мМ №С1, 0,5 мМ ΌΤΤ прибавляют 10 мМ Ν-этилмалеинимид, 1 ч выдерживают во льду и после этого проводят диализ с 5 мМ №ьНРО.-| рН 5,5, 150 мМ ЖС1. Данные МΑ^^I-ΤΟР-М8 показывают, что модифицированный Ν-этилмалеинимидом (ЫЕМ) белок увеличивает массу на 126 Да, что свидетельствует о модификации этим реагентом только одного цистеинового остатка. Данные Ν-концевого секвенирования показывают, что белок секвенируется и что в первом цикле при этом обнаруживается необычный пик, вероятно имеющий отношение к РТН-ЫЕМ-Сук (данные не представлены). Масс-спектрометрический анализ пиридилэтилированного NΕМ-8Ы в условиях денатурации, показывает, что алкилируются только два цистеиновых остатка в белке, подтверждая, что только тиольная группа остатка Ν-концевого цистеина модифицируется действием NΕМ в нативных условиях (таблица 8). Два других цистеиновых остатка, которые вероятно погружены в гидрофобную сердцевину белка, не могут быть модифицированы без предварительной денатурации.

Таблица 8. Характеризация НЕМ-модифицированного 811 методом М8

Белок	Масса (вычислено)	Масса (найдено)
Пиридилэтилированный КЕМ 8Ы		19895 Да
Если содержит 2 свободных Сукостатка	19895 Да
Если содержит 3 свободных Сукостатка	20000 Да

При испытании в опыте на С3Н10Т1/2 (см. пример 3) модифицированный Ν-этилмалеинимидом хеджхог-белок равен по активности немодифицированному белку. Это показывает, что свободный сульфгидрил на Ν-конце хеджхог не обязателен для проявления активности и что Ν-этилмалеинимидная структурная единица достаточно гидрофобна для придания определенной активности хеджхог по сравнению с другими более гидрофильными модификациями, например, с заменой Цис-1 на Гис или Асп, что приводит к снижению активности.

Модификация Соник хеджхог человека формальдегидом с образованием Ν-концевого тиапролина, а также с ацетальдегидом и с масляным альдегидом с образованием Ν-концевых тиапролиновых производных.

Для модификации формальдегидом очищенный 811 в виде раствора 3 мг/мл в 5 мМ №₂НРО₄ рН 5,5, 150 мМ ИаС1, 0,5 мМ ΌΤΤ обрабатывают 0,1%-ным формальдегидом с добавлением 10% метанола или без него при комнатной температуре в течение времени от 1 до 6 ч. Белок или направляют на диализ с 5 мМ №₂НРО₄ рН 5,5, 150 мМ ЖС1, или же очищают на колонке СМ-Рогок (РегкерЖе Вюкук1етк), как это описано выше, и после этого направляют на диализ с 5 мМ Ж₂НРО₄ рН 5,5, 150 мМ ЖС1. Для модификаций с ацетальдегидом или с масляным альдегидом очищенный 811 в виде раствора 3 мг/мл в 5 мМ №₂НРО₄ рН 5,5, 150 мМ ЖС1, 0,5 мМ ΌΤΤ обрабатывают 0,1% ацетальдегида или масляного альдегида при комнатной температуре в течение 1 ч и затем очищают белок на колонке СМ-Рогок. Данные Е8Е М8 для форм белка после его обработки формальдегидом, ацетальдегидом и масляным альдегидом показывают увеличение масс на 13, 27 и 54 Да соответственно, по сравнению с немодифицированным белком (табл. 9).

Таблица 9. Вычисленные и найденные массы Соник хеджхог человека, обработанного формальдегидом, ацетальдегидом и масляным альдегидом

Белок	Вычисленная масса* (МН+)	Найденная масса* (МН+)
Немодифицирован	19560,02	19560
Обработан формальдегидом	19572,03	19573
Обработан ацетальдегидом	19586,06	19587
Обработан масляным альдегидом	19614,11	19614

* Для расчета ожидаемых значений масс использованы средние массы

Для обработанного формальдегидом белка пептидное картирование, описанное выше, показало, что сайт модификации локализован в первых 9 Ν-концевых остатках пептида и что точный прирост массы равен 12 Да. Результаты исследования этого пептида методом МΑ^^IР8Э М8 показывают, что модификация прошла по Цис-1 и ее можно объяснить модификацией Ν-концевого α-амина и тиольной боковой цепи Цис-1 с образованием тиапролина (см. фиг. 12). Строение тиапролина подтверждается автоматизированным Ν-концевым секвенированием по Эдману с использованием получаемого в ходе эксперимента РТН-тиапролина в качестве стандарта. Для белков, обработанных ацетальдегидом и масляным альдегидом, данные Е8ГМ8 согласуются по подобию химических процессов с модификациями, вызываемыми реакцией с формальдегидом, хотя точный сайт модификации не установлен. При испытании в опыте, основанном на клетках С3Н10Т1/2, модифицированные формальдегидом, ацетальдегидом и масляным альдегидом белки примерно в 8 раз, в 2 раза и соответственно в 3 раза более эффективны, чем немодифицированный 811.

Модификация Соник хеджхог человека Νизопропилиодацетамидом

Этот пример показывает, что модификация 811 человека гидрофобным производным иодацетамида может повысить эффективность белка по сравнению с немодифицированным 811. Очищенный 8Ы (1 мг/мл в 5 мМ Ж₂НРО₄ рН 7,0, 150 мМ ЖС1, 0,1 мМ ΌΤΤ) инкубируют с 1 мМ Ν-изопропилиодацетамида (ΝΜΑ) при 4°С в течение 18 ч. Затем прибавляют ΌΤΤ до достижения конечной концентрации 10 мМ и образец подвергают экстенсивному диализу с 5 мМ Ж₂НРО₄ рН 5,5, 150 мМ ИаС1, 0,5 мМ ΌΤΤ. Образец очищают на смоле 8Р 8ер1агоке Рак! Р1о\у и снова направляют на дальнейший диализ с 5 мМ Ж₂НРО₄ рН 5,5, 150 мМ ИаС1, 0,5 мМ

ΌΤΤ. Данные Ε8Ι-Μ8 показывают полное превращение в продукт с массой 19660, соответствующей ожидаемому для белка с однократной модификацией значению (19659). Специфическая модификация Ν-концевого цистеина подтверждается пептидным картированием протеолитических фрагментов. При испытании в опыте, основанном на клетках С3Н10Т1/2, ΝΙΡΙΑмодифицированный Соник хеджхог человека примерно в 2 раза более эффективен, чем немодифицированный белок. В то время как модификация белка приводит лишь к скромному повышению эффективности, ожидается, что модификация белка производными иод-ацетамида с более длинной алкильной цепью приведет к гидрофобно модифицированным формам белка с гораздо более серьезным повышением эффективности, возможно близкой к 100-200кратному росту, наблюдаемому для пальмитоилированного, миристоилированного и лауроилированного 811 белков (см. пример 8). Модификация Соник хеджхог человека 1-бром2-бутаноном с образованием шестичленного гидрофобного цикла на Ν-конце

Тиоморфолинильное (тетрагидротиазинильное) производное 811 получают при инкубировании 811-Ν человека (3 мг/мл в 5 мМ №₂№О₄ рН 5,5, 150 мМ №С1, 0,15 мМ ΌΤΤ) с 11 мМ 1-бром-2-бутаноном при комнатной температуре в течение 60 мин с последующим восстановлением 5 мМ NаСNΒНз при комнатной температуре в течение 60 мин. Продукт реакции очищают на колонке СМ-Ρογοκ Βίο5у51еш5) по описанной ниже методике и подвергают диализу с 5 мМ №₂№О₄ рН 5,5, 150 мМ №С1, 0,5 мМ ΌΤΤ. Данные Ε8Ι-Μ8 и протеолитического пептидного картирования показывают, что продукт представляет собой смесь ожидаемого тиоморфолинильного производного (вычисленная масса = 19615, найденная масса = 19615) и двух форм белка с 16 дополнительными единицами массы у обоих. Одна из этих форм, предположительно, представляет собой нециклизованный кетотиоэфирный интермедиат. Эту смесь испытывают в опыте на С3Н10Т1/2, который показывает, что она приблизительно в 5 раз более эффективна, чем немодифицированный белок.

Пример 10. Мутации Соник хеджхог человека методами генной инженерии.

А. Мутации методами генной инженерии Ν-концевого цистеина.

В этом примере показано, что специфическая замена Ν-концевого цистеина Соник хеджхог человека (Цис-1) одним или несколькими гидрофобными аминокислотными остатками приводит к повышению эффективности по сравнению с естественным типом белка в опыте, основанном на клетках С3Н10Т1/2, который описан в примере 3.

Конструирование мутантов 811 по Цис-1

Рестрикционный фрагмент 584 1ρ ΝοοΙΧ1οΙ, несущий Гис-маркированный Ν-концевой фрагмент естественного типа 811 от р6Н-8НН субклонируют в производный от рИС клонирующий вектор ρΝΝ05 для конструирования плазмиды рЕАС649. Мутанты по Цис-1 растворимого 811 человека получают в результате элиминационного мутагенеза по одному единственному сайту матрицы плазмиды рЕАС649 с использованием набора Ρΐιαηηαοία в соответствии с рекомендованным производителем порядком действий. Если при дизайне мутагенных праймеров желаемая мутация не приводит к изменению в рестрикционном сайте, то в соседний кодон вводят скрытую мутацию, вызывающую изменение рестрикционного сайта, для облегчения идентификации мутантных клонов последующего мутагенеза. Для исключения использования необычных кодонов замещающие кодоны выбирают из тех, которые встречаются хотя бы один раз где-либо в последовательности кДНК 811 человека. Используются следующие мутагенные праймеры: (1) для С1Р: 5' ССС 6ΑΤ САС 6ΑΤ САС ААА ГГС ССА ССС ССС АСС ССС ΤΤΟ 3' (8ЕЦ ΙΌ NО: 5 ), который вводит сайт Αρο1 для получения ΡЕΑС837; (2) для СН: 5' ССС СΑΤ САС СΑΤ САС ААА ΑΤΑ ССА ССС ССС АСС ССС ТСС 3' (8 ЕС) ΙΌ 6), которому недостает сайта ΚκγΙΙ для производства рЕАС838, и (3) для С1М: 5' ССС СΑΤ САС СΑΤ САС ААА АТС ССС ССС ССС АСС ССС ΤΤΡ ССС 3' (8 ЕС) ΙΌ 7), которому недостает обоих сайтов ΚδΙΙ и ΑνаII для производства рЕАС839. Мутации подтверждаются секвенированием ДНК через рестрикционный фрагмент 180 1р NсοI-ΒдШ, несущий Ν-концы мутантного 8НН-белка в плазмидах рЕАС837839. Векторы экспрессии конструируют путем субклонирования каждого из фрагментов мутантных плазмид: 180 1р NсοI-ΒдШ фрагмента и 404 1р ВдШ-ΧΜ фрагмента из рЕАС649 в обработанную фосфатазой 5,64 кб основу вектора Χ1οΙ-ΝοοΙ рЕП16 из р6Н-8НН. Присутствие введенного изменения в рестрикционном сайте дополнительно подтверждается в векторе экспрессии для каждого мутанта по Цис-1 (С1Р в рЕАС840, СИ в рЕАС841 и С1М в рЕАС842). Векторы экспрессии трансформируют в компетентную Е.С.оН ВЬ21(ОЕ3)рЬу88 (81га1аде1ге) в соответствии с рекомендуемым производителем порядком действий и проводят селекцию на агаровых пластинках ЬВ, содержащих 100 мкг/мл ампициллина и 30 мкг/мл хлорамфеникола. Индивидуальные колонии отбирают, и выращивают трансформированные бактерии на А600 с 0,40,6 и индуцире.1'1 в течение 3 ч в 0,5 мМ ΙΡΤ6. Бактериальные осадки анализируют на экспрессию мутантных белков редукцией 8Ό8-ΡΛ6Ε и методом ХУеЧегп Шйтд.

Растворимый мутант 811 человека с многократными Ν-концевыми гидрофобными замещениями (С1И) получают в результате эли минирующего мутагенеза по одному единственному сайту с помощью набора Рйагтааа в соответствии с рекомендованным производителем порядком действий. Если при дизайне мутагенных праймеров желаемая мутация не приводит к изменению в рестрикционном сайте, то в соседний кодон вводят «молчащую» мутацию, вызывающую изменение рестрикционного сайта, для облегчения идентификации мутантных клонов последующего мутагенеза. Для исключения использования необычных кодонов замещающие кодоны выбирают из тех, которые встречаются хотя бы один раз где-либо в последовательности кДНК 8йй человека. Используется следующий мутагенный праймер на С1Р матрице плазмиды рЕАО837 для С1П: 5' ОСО ОСО АТО АСО АТО АСА ААА ТСА ТСО ОАС СОО ОСА ООО ООТ ТСО ОО 3' (8ЕЦ ГО ΝΟ: 8 ), который вводит сайт Аро1 для получения рЕАО872. Мутации подтверждаются секвенированием ДНК через рестрикционный фрагмент 0,59 кб КсоЬХйоЦ несущий мутантный С1П 8НН. Векторы экспрессии конструируют путем субклонирования NсοI-XйοI фрагмента мутантных плазмид в обработанную фосфатазой 5,64 кб ХМ-Л^ рЕТ11й основу вектора р6Н-8НН. Присутствие введенного изменения в рестрикционном сайте дополнительно подтверждается в векторе экспрессии для С1П мутанта рЕАО875. Вектор экспрессии трансформируют в компетентную Е.СоН ВЬ21(ОЕ3)рЬук8 (8!га!адепе) в соответствии с рекомендуемым производителем порядком действий и проводят селекцию на агаровых пластинках ЬВ, содержащих 100 мкг/мл ампициллина и 30 мкг/мл хлорамфеникола. Индивидуальные колонии отбирают, и выращивают трансформированные бактерии на А600 с 0,4-0,6 и индуцируют в течение 3 ч в 0,5 мМ ГРТО. Бактериальные осадки анализируют как это описано выше для подтверждения экспрессии мутантного 8йй-белка.

Очистка мутантов по Цис-1 Соник хеджхог человека

Гис-маркированные мутанты хеджхогбелков выделяют из бактериальных осадков так, как это описано для белка естественного типа за исключением двух изменений. (1) Стадию с Рйепу1 8ерйагоке исключают и вместо этого собранный с первой колонки НТА-Νί с агарозой белок подвергают диализу в 25 мМ №₂НРО₄ рН 8, 400 мМ №С1, 0,5 мМ ОТТ в качестве подготовки к стадии расщепления энтерокиназой. (2) На финальной операции заменяют операцию с ионобменной смолой 8Р 8ерйагоке Рак! Е1о\у на градиентное элюирование с СМ-Рогок колонки (РегкерБуе Вюкук!етк). Это проводят в 50 мМ №ьНРО₄ рН 6,0 с градиентом №1С1 от 0 до 800 мМ на 30 объемах колонки. Собранные фракции с максимумами концентраций с этой стадии направляют на диализ в 5 мМ №ьНРО₄ рН 5,5, 150 мМ №1С1 и хранят при -80°С. Массспектрометрия очищенных белков показывает предсказанные массы ионов для каждой из очищенных форм.

Активность Цис-1 мутантов Соник хеджхог человека

Как показано в табл. 10, мутации по Νконцевому цистеину оказывают существенное влияние на эффективность образующегося хеджхог-белка в опыте на С3Н10Т1/2. При однократных изменениях эффективность в общем случае коррелирует с гидрофобностью замещающей аминокислоты, то есть фенилаланин и изолейцин дают максимальную активацию, метионин активирует слабее, тогда как гистидин и аспарагиновая кислота снижают активность по сравнению с цистеином в естественном типе. Замена цистеина двумя изолейцинами приводит к дополнительному повышению активности по сравнению с заменой на один изолейцин. Известно, что девять аминокислот характеризуются большей гидрофобностью, чем цистеин (Рго!етк: к!гис!игек апй то1еси1аг ргорегйек. 2^пй ей, 1993, Т.Е. Сге1дй!оп, ’№.Н.Егеетап Со. Раде 154), испытанные здесь варианты замещений, конечно, не представляют собой исчерпывающий обзор возможных мутаций по Ν-концу, которые могут вывести на более активные формы хеджхог. Тем не менее эти результаты демонстрируют, что активация не ограничивается структурой одной единственной аминокислоты и что замещение более чем одной аминокислоты может привести к дальнейшему повышению активности. Вследствие этого специалист в данной области может создать формы хеджхог с другими заменами аминокислотами на Ν-конце, от которых можно ожидать более высокой эффективности, чем от белка естественного типа.

Таблица 10. Относительная эффективность аминокислотных модификаций Соник хеджхог человека в опыте с С3Н10Т1/2

Ν-Конец	Относительная эффективность
С (природный тип)	IX
М	2Х
Е	4Х
I	4Х
II	10Х

В. Мутации внутренних остатков способами генной инженерии.

Конструирование С1П/А169С мутанта

Растворимый мутант 8йй человека С1П/А169С (с заменой цистеина на необязательный С-концевой остаток А169, для которого предсказана высокая дробная совместимость с растворителем) получают в результате элиминирующего мутагенеза по одному единственному сайту с помощью набора Рйагтааа в соответствии с рекомендованным производителем порядком действий и с использованием принципов мутагенного олигодизайна, описанных выше. Используется следующий мутагенный праймер 5' ОАО ТСА ТСА ОСС ТСС СОА ТТТ ТОС ОСА САС СОА ОТТ СТС ТОС ТТТ САС С 3' (8ЕЦ ГО NΟ: 9) на С1П 8йй матрице рЕАС872 для добавления сайта Б^ для получения р8У8049. Мутации СШ/А169С подтверждаются секвенированием ДНК через рестрикционный фрагмент 0,59 кб Nсо!-XНо!. Вектор экспрессии р8У8050 конструируют путем субклонирования Nсо!-XНо! фрагмента в обработанную фосфатазой 5,64 кб XНо!-Nсо! рЕТ11б. основу вектора р6Н-8НН. Присутствие введенного изменения в рестрикционном сайте дополнительно подтверждается в векторе экспрессии. Вектор экспрессии трансформируют в компетентную Е.Сой ВЬ21(ПЕ3)рЬук8, проводят селекцию колоний, индуцируют и отбирают для экспрессии 8НН по описанной выше методике.

Очистка мутанта СШ/А169С

Мутант СШ/А169С выделяют так, как это описано в примере 9 для 8НН естественного типа за исключением следующих далее изменений. (1) Из состава буфера для лизирования исключают ЕИТА. (2) Порядок стадий с №ГА-№ и с 8Р 8ерНагоке меняют, а стадию с РНепу1 8ерНагоке исключают. (3) После осветления лизированных бактерий центрифугированием к жидкости над осадком добавляют дополнительное количество №1С1 до конечной концентрации 300 мМ. (4) Элюирующий буфер с колонки №ГА-№ содержит 25 мМ №ьНР0₄ рН 8,0, 200 мМ имидазола, 400 мМ №С1. (5) Собранные с колонки NТΆ-N^ элюаты разбавляют тремя объемами 100 мМ МЕ8 рН 5,0 до загрузки их на колонку с 8Р 8ерНагоке. (6) До того, как добавляют энтерокиназу, собранные с 8Р 8ерНагоке элюаты разбавляют половиной объема 50 мМ №ьНР0₄ рН 8,0. (7) Элюирующий буфер с ЭТТ для последней колонки с 8Р 8ерНагоке содержит 0,2 мМ ЭТТ и собранные элюенты с этой стадии делят на аликвоты и хранят при -70°С.

Гидрофобная модификация и активность мутанта С1П/А169С

Для модифицирования Ν-(1-пирен) малеинимидом (81дта) очищенный СШ/А169С при 4,6 мг/мл в 5 мМ №ьНР0₄ рН 5,5, 800 мМ №С1, 0,2 мМ ЭТТ разбавляют равным объемом 50 мМ МЕ8 рН 6,5 и прибавляют двадцатую часть его объема из емкости пиренмалеинимида с 2,5 мг/л в ДМСО. Образец инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте. В это время добавляют дополнительное количества ЭТТ до 0,5 мМ и инкубируют образец далее в течение еще одного часа при комнатной температуре. Проверку модифицированного белка на активность проводят сразу в опыте на С3Н10Т1/2 так, как это описано в примере 3. До проведения модификации специфическая активность белка была ЕС₅₀ = 0,22 мкг/мл, тогда как после обработки пиренмалеинимидом специфическая активность повысилась до ЕС50 = 0,08 мкг/мл. Повышение специфической активности модифицированного продукта примерно в 3 раза наблюдается часто и означает, что добавление гидрофобной группы вблизи С-конца 8НН приводит к дальнейшему повышению активно сти по сравнению с исходным материалом С1П. Если же сравнивать с естественным немодифицированным типом Соник хеджхог-белка, то модифицированный Ν-( 1 -пирен)малеинимидом белок С1П примерно в 30 раз более активен. В тот время как пиренмалеинимид представляет собой простую экспериментальную систему для разработки модификаций по данному сайту, возможно также использование других гидрофобных малеинимидов или других направленных на цистеин химических превращений.

Пример 11. Сравнение эффективности различных гидрофобно модифицированных форм Соник хеджхог человека в опыте на С3Н10Т1/2.

Активность различных гидрофобномодифицированных форм Соник хеджхог человека (приготовленных с использованием химических превращений или методов генной инженерии, описанных в разделе У) испытывалась в опыте на С3Н10Т1/2 так, как это описано в примере 3.

Производные испытывались в интервале приведенных в примере 3 концентраций. Концентрация производного хеджхог, которая вызывала 50% от максимального отклика в опыте, сравнивалась с концентрацией его естественного типа. Относительные активности представлены в приведенной ниже табл. 11 и на фиг.13.

Таблица 11. Относительная активность производных хеджхог в опыте на С3Н10Т1/2

Модификация	ЕС50 (в х-раз более активен, чем естественный тип 8НН)
С:16 пальмитоил	100
С:14 миристоил	100
С:12 лауроил	100
С:10 деканоил	33
Изолейцил-изолейцил с А169С	30
пиренил	10
С:8 октаноил	10
Изолейцил-изолейцил	8
С:0 тиапролил	5
Тиоморфолинил	4
Фенилаланил	4
Изолейцил	2
Ν-Изопропилацетамидил	2
Метионил	1
Ν-Этилмалеимидил	1
Цистеинил (природный тип)	<1
Аспартил	<1
Гистидил

Опыт на С3Н10Т1/2 демонстрирует, что широкое разнообразие гидрофобных модификаций на хеджхог повышает активность белка по сравнению с немодифицированным естественным типом белка. Гидрофильные модификации (аспарагиновая кислота и гистидин) такого эффекта не имеют.

Пример 12. Оценка эффективности гидрофобно модифицированного Соник хеджхог человека в опыте на патологическом изменении полосатого тела у крыс, вызванном инъекцией малоната.

Инъекция малоната, ингибитора митохондриального фермента сукцинатдегидрогеназы, в полосатое тело крысы (у грызунов это эквивалент хвостатого ядра и чечевицеобразного ядра приматов) вызывает дегенерацию стриарных срединных звездчатых нейронов. У людей дегенерация срединных звездчатых нейронов в хвостатом ядре и в чечевицеобразном ядре является первичным патологическим признаком болезни Хантингтона. В соответствии с этим, вызванное малонатом патологическое изменение полосатого тела у крыс может быть использовано в качестве модели для тестирования возможности предотвращения гидрофобномодифицированными хеджхог-белками гибели нейронов, которые подвергаются дегенерации при болезни Хантингтона.

Крысы 8ргадие-Оа^1еу получали инъекции различных концентраций гидрофобию модифицированных Соник хеджхог человека в полосатое тело с использованием стереотаксических технических приемов. Стереотаксические инъекции (2 мкл) осуществляли при обезболивании натрий-пентабарбиталом (40 мг/кг), а координаты введения были таковы: 0,7 мм перед брегмой, 2,8 мм в сторону от средней линии и на 5,5 мм внутрь от черепа у брегмы. По истечении различных сроков после инъекции гидрофобно модифицированного белка (обычно через 48 ч) анестезируют крыс изофлураном и проводят стереотаксическую инъекцию малоната (2 мкмоля в 2 мкл) по тем же самым координатам в полосатое тело. Через четыре дня после инъекции малоната крыс усыпляют и извлекают их мозг для гистологического анализа. Через полосатое тело делают поперечные срезы толщиной 25 мкм и проводят окрашивание с целью определения цитохромоксидазной активности для того, чтобы различить неповрежденную ткань от ткани с патологическими изменениями. Объем измененной ткани в полосатом теле определяют с помощью системы анализа изображений.

Эффект гидрофобномодифицированного Соник хеджхог-белка человека в модельном опыте на вызванном малонатом патологическом изменении полосатого тела крыс демонстрируется на фиг. 14. Немодифицированный Соник хеджхог (получен по примеру 9), миристоилированный 811 (получен по примеру 8) и С111 мутант 811 (получен по примеру 10), все они уменьшают объем патологических изменений в этом модельном опыте. Тем не менее, гидрофобно модифицированные белки (миристоилированный 811 и С111 811) демонстрируют повышенную эффективность по сравнению с немодифицированным Соник хеджхог.

Пример 13. Дериватизация κΗ1-Ν Νоктилмалеинимидом.

Для конечной концентрации 1 мг/мл

1) Готовят 20 мМ раствор октилмалеинимида (молекулярная масса 209) в ДМСО (~4,2 мг/мл).

2) Разбавляют готовый раствор 10 мг/мл 8Η1-Ν (в 5 мМ №₂НР0₄ рН 5,5, 150 мМ №С1,

0,5 мМ ΌΤΤ) в десять раз добавлением РВ8 (СЛот ргойий # 20012-027, рН 7,2) для получения раствора κΗ1-Ν 1 мг/мл (или 50 иМ). [Примечание: ΌΤΤ, который наряду с κΗ1-Ν последовательно реагирует с малеинимидом, также имеет в этом растворе концентрацию 50 мкМ.]

3) Сразу после этого прибавляют 1/200 объема октилмалеинимида к 1 мг/мл &Η1-Ν (то есть 5 мкл на 1 мл). Это соответствует молярному отношению 2:1 (100 мкМ на 50 мкМ) октилмалеинимида к &Η1-Ν.

4) Перемешивают этот раствор, осторожно опрокидывая пробирку, и инкубируют его в течение 1 ч при комнатной температуре.

5) В заключение в каждую пробирку прибавляют 1/1000 объема 0,35М ΌΤΤ для удаления всего остаточного октилмалеинимида и для создания восстановительной среды.

6) Для того, чтобы контролировать носитель, объединяют раствор носителя (5 мМ №₂№0₄ рН 5,5, 150 мМ №С1, 0,5 мМ ΌΤΤ) с РВ8 (Οί^ο ргойий # 20012-027, рН 7,2) в соотношении 1:10. Прибавляют 1/400 объема 20 мМ октилмалеинимида в ДМСО и 1/400 объема ДМСО, чтобы получить конечную концентрацию 50 мкМ Ν-октилмалеинимида и 0,5% ДМСО. После этого прибавляют 1:1000 объема 0,35М ΌΤΤ.

Примерный состав раствора 1 мг/мл Νоктилмалеинимидного &Η1-Ν

РВ8 (~ρΗ 7,2);

мкМ конъюгата κΗ1-Ν с Νоктилмалеинимидом;

мкМ конъюгата ΌΤΤ с Νоктилмалеинимидом;

350 мкМ ΌΤΤ;

0,5% ДМСО.

Примерный состав раствора Ν-октилмалеинимидного носителя

РВ8 (~рН 7,2);

мкМ конъюгата ΌΤΤ с Νоктилмалеинимидом;

350 мкМ ΌΤΤ;

0,5% ДМСО.

Для конечной концентрации 3 мг/мл

1) Готовят 60 мМ раствор октилмалеинимида (молекулярная масса 209) в ДМСО (~12,6 мг/мл).

2) Разбавляют готовый раствор 10 мг/мл 8Η1-Ν (в 5 мМ №ьНРО₄ рН 5,5, 150 мМ №С1, 0,5 мМ ΌΤΤ) в десять раз добавлением РВ8 (СЛот [эгойнО # 20012-027, рН 7,2) для получения раствора κΗ1-Ν 3 мг/мл (или 150 иМ). [Примечание: ΌΤΤ, который наряду с κΗ1-Ν последовательно реагирует с малеинимидом, также имеет в этом растворе концентрацию 150 мкМ.]

3) Сразу после этого прибавляют 1/200 объема октилмалеинимида к 3 мг/мл &Η1-Ν (то есть 5 мкл на 1 мл). Это соответствует молярному отношению 2:1 (300 мкМ на 150 мкМ) октилмалеинимида к &Η1-Ν.

4) Перемешивают этот раствор, осторожно опрокидывая пробирку, и инкубируют его в течение 1 ч при комнатной температуре.

5) В заключение в каждую пробирку прибавляют 1/1000 объема 0,35М ОТТ для удаления всего остаточного октилмалеинимида и для создания восстановительной среды.

6) Для того, чтобы контролировать носитель, объединяют раствор носителя (5 мМ №₂НР0₄ рН 5,5, 150 мМ №С1, 0,5 мМ ОТТ) с РВ8 (СЛот ргобис! # 20012-027, рН 7,2) в соотношении 3:7. Прибавляют 1/400 объема 60 мМ октилмалеимида в ДМСО и 1/400 объема ДМСО, чтобы получить конечную концентрацию 150 мкМ Ν-октилмалеимида и 0,5% ДМСО. После этого прибавляют 1:1000 объема 0,5М ОТТ.

Примерный состав раствора 3мг/мл Νоктилмалеимидного кНЬ-Ν

РВ8 (~рН 7,2;

150 мкМ конъюгата кНЬ-Ν с Νоктилмалеимидом;

150 мкМ конъюгата ОТТ с Νоктилмалеимидом;

500 мкМ ОТТ;

0,5 % ДМСО.

Примерный состав раствора Ν-октилмалеинимидного носителя

РВ8 (~рН 1,2);

150 мкМ конъюгата ОТТ с Νоктилмалеимидом;

500 мкМ ОТТ;

0,5 % ДМСО.

Список литературы

1. Ρе^^^тοη, Ν. (1995) Се11 80, 517-520.

2. Ιοίη^οη, В.Ь., апб ТаЬт, С. (1995) Се11 81, 313-316.

3. В1661е, ВГО.е! а1. (1993) Се11 75,14011416.

4. Мктапбег, Ь., е! а1. (1994) №11иге 371, 609-612.

5. Ьаийег, Е., е! а1. (1994) Се11 79, 993-1003.

6. ^ЬеПк, Ό.Ι, е! а1. (1995) ^еνе1οртеη! 121, 3163-3174.

7. СЫапд.С., е! а1. (1996) Ханне 382, 407413.

8. Ве11и8С1, 8., е! а1. (1997) ^еνе1οртеη! 124,53-63.

9. Μа^^дο, V., е! а1. (1996) №11иге 384,176179.

10. 8йпе, О.М., е! а1. (1996) №11иге 384,129134.

11. Α^άο, 1., е1 а1. (1996) Се11 86, 221-232.

12. ^οт^ηдиеζ, М., е! а1. (1996) 8с1епсе 272, 1621-1625.

13. ΑΚχαπάκ, С., е! а1. (1996) Сепек & Эеу. 10, 2003- 2013.

14. ТЬегопб, Р.Р., е! а1. (1996) Ргос. №И. Αсаά. 8с1. ϋ8Α 93, 4224-4228.

15. Ьее, И, е! а1. (1994) 8с1епсе 266,15281536.

16. Витсго!, Ώ.Α., е! а1. (1995), Мс1. Се11 Вю1. 15, 2294-2303.

17. Ροήе^, ΙΑ., е! а1. (1995) Хтиге 374, 363366.

18. Ρο^ιе^. Ι.Α., е! а1. (1996) 8с1епсе 274, 255-258.

19. Ροήе^, ΙΑ., е! а1. (1995) Се11 86, 21-34.

20. Μа^^дο, V., е! а1. (1995) Сегютюк 28, 44-51.

21. 8αηκο1α, М., е! а1. (1997) Ргос. №!1. Αсаά. 8с1. ϋ8Α 94, 6238-6243.

22. 8репд1ег, В., е! а1. (1992) Вар16. Соттин. Макк 8рес!гот. 6, 105-108.

23. 8репд1ег, В., е! а1. (1992) ТРЬук. С1ет. 96, 9678- 9684.

24. Сагоп, !М. (1997) Мс1. Вю1. Се11 8, 621636.

25. Κίη!ο,Ν, е! а1. (1997) РЕВ 8 Ье!!к. 404,319-323.

26. Епсюп,!, е! а1. (1996) Се11 87. 661-673.

27. XV еп, Ό., е! а1. (1996) Вгос1ет1к!гу 30, 9700-9709.

28. Β^ζζοζе^ο. 0.Α. (1996) Ме!1. Еηζутο1. 250, 361-382.

29. '№е6едаег!пег, Р.В., е! а1. (1995) 1. Вю1. С1ет. 270, 503-506.

30. ОгокепЬасЬ, ϋ.ν., е! а1. (1997) 1. Вю1. С1ет. 272, 1956-1964.

31. Рерткку, В.В., е! а1. (1991) 1. Вго1. С1ет. 266, 18244-18249.

32. Тапака На11, Т.М., е! а1. (1995) №!иге 378, 212-216.

33. ΜοЬ1е^ апб ναητ (1992) ^еνе1οртеη! 115, 957-971.

34. На11 е! а1., (1995) Хтиге 378, 212-216.

35. Еккег е! а1., (1995) Сиггеп! Вюкду 5, 944-955.

36. Рап е! а1., (1995) Се11 81,457-465.

37. СЬапд е! а1., (1994) ^еνе1οртеη! 120, 3339-3353

38. Ес1е1аг6 е! а1., (1993) Се11 75, 14141430.

39. Епсгоп е! а1., (1995) Се11 81, 747-756.

40. Ζο2112γ е! а1., (1984) Ргос. №!1. Αсаά 8с1. υ8Α, 81, 5662-66.

41. КаиГтап апб 81агр, (1982) Μο1. Се11. Вю1., 2, 1304-1319.

42. Ьеипд е! а1., (1989) ТесЬтцие 1, 11-15.

43. Мауегк е! а1., (1989) 8аепсе 229,242.

44. Нагапд, 8.Α., (1983) Те1га1е6гоп 39,3.

45. Иакига е! а1., (1984) Αηη. Веν. ВгосЬет. 53, 323.

46. СипшпдЬат апб Vе11к, (1989) 8с1епсе 244,1081-1085.

47. Αώ21ιη;ιη е! а1., (1983) ΌΝΑ 2, 183.

48. №е11к е! а1., (1985) Сепе 34, 315.

49. ЭДГОИике е! а1., (1989) 8аепсе 246, 1275-1281.

50. Н.Ь. Υίη апб Т.Р. 8!οкке1, (1979) №!иге 281, 583-586.

51. Ьш61еу, (1956) Хтиге 178, 647.

52. Сгокк апб ^йк1р, (1961) 1. Αт. С1ет. 8ос. 83, 1510.

53. Э.М. Науегкбск апб М. С1акег, (1987) Ргос. №!1. /Хсас1. 8сй υ8Α 64, 4475-4478.

54. 8/ока е! а1., (1980) Αηη. Неу. Β^^κ, Βϊθο^. 9, 467-508.

55. Обката е! а1., (1984) С1ет. Р1агт. Βυ11. 32, 2442.

56. ΒαΙ/π е! а1., (1973) Β^οΐ™. Β^^κ. ΑοΙα 298, 1015-1019.

57. 8хока е! а1., (1978) Ргос. №11. Αсаб. 8ск υ8Α 75, 4191 -4199.

58. Р1ск, (1981) ΑγοΙ. ЕтсНет. Β^^κ. 212, 186-194.

59. Какабага е! а1., (1977) 1. Βϊθ1. С1ет. 251, 7384-7390.

60. Наскег е! а1., (1979) Αγο1. Ейскет. Βϊθрбук. 198, 470-477.

61. Рарабаб.)орои1ок е! а1., (1991) Ргос. №111. /Хсай 8οί. υ8Α 88,11460-11464.

62. Сбои, Т.С. апб Ыртапп, Е. (1952) 1. ΒΪΘ1. Сбет. 196, 89.

63. Катткк е! а1., (1993) №\ν Ε^! 1. Меб. 329, 459.

64. Тотас е! а1., (1995) Ха1иге 373, 335-339.

65. Сакб е! а1., (1996) Ха1иге 380, 252-255.

66. НоГГег е! а1., (1994) Хеигокс1епсе Ьей. 182, 107-111.

67. Эисбеп, б.XV. апб 81псб, 8.1, (1968), Р№иго1. Йеигокигд. РкусЫа!гу 31, 535-542.

68. Кеппе1 е! а1., (1996) Nеи^оЬ^о1оду оГ Эйеаке 3, 137-147.

69. Н1ррк е! а1., (1995) Ргос. №111. Αοι6. 8с1, υ8Α, 92:689-693

71. №сбо1коп, Ь. е! а1., (1995)

66,507-521 72. Βеа1, М.Е. е! а1., (1993) 1. №игокс1епсе 13, 4181-4192.

73. Панек, 8. е! а1., (1997) Се11 90,537-548.

74. НеЬг-Ка!/, Н. (1993) 1п!. Неу. 1ттипо1. 9, 237-285.

75. Иогд е! а1., (1990) Нгат Нек., 518, 295-298.

76. ΑрГе1 е! а1., (1991) Απη. Кейто!, 29, 87-90.

77. ^гсп, С. 1. е! а1., (1989) 8с1епсе 244, 182-188.

78. Тбогкоп, 1. 8. е! а1., (1998) Ме!бобк Мо1. ΒΪΘ1. 77, 43-73.

79. Пак, А. К. е! а1., (1997) 1. Βω! Сбет. 272, 11021-11025.

80. БегиНаите, Ь. & Некб, М. Ό. (1995) 1. ΒΪΘ1. Сбет. 270, 22399-22405.

81. Нам Н. У. е! а1., (1995) Мо1. Се11. Βϊθсбет. 149-150, рр. 191 -202.

82. Эигошо, Н. 1. е! а1., (1993) т Ыр1б МобШсабоп оГ Рго!ешк, М. 1. 8с11ектдег, еб.

83. Кги!кс1, Н. С. & 1птап, 1. К. (1993) Αηа1. ЕтсНет. 209, 109-116.

84. Ней/, 1. Н. е! а1., (1968) Αγο1. Ейскет. Β^^^ 12, 627-636.

85. 8!еГашш, 8. е! а1., (1972) Αγο1. Б|осбет. Β^^^ 151, 28-34.

86. КатадисЫ, Α. 1. (1981) Бюскет. (Токуо) 89, 337-339.

87. Ноике, Н. О. (1972) ш Мобегп 8уп!1ебс Неасбопк, V. Α. Беп)апип, еб.

Эквиваленты

Все цитированные выше источники и публикации включены в приведенный здесь список литературы.

Нами описано большое число вариантов реализации настоящего изобретения, но тем не менее любому лицу с обычной специализацией в данной области очевидно, что наши базовые варианты могут быть изменены с целью получения других вариантов, использующих процессы и составы настоящего изобретения. В соответствии с этим, с признательностью будет воспринято понимание того, что объем настоящего изобретения включает все альтернативные варианты и вариации, определенные предыдущей спецификацией и следующей далее формулой изобретения, а также понимание того, что изобретение не ограничено специфическими вариантами, представленными в примерах.

8ΕρυΕΝΟΕ Ы8Т1Ы6 <110» 81одеп, 1пс.

<120» НУОКОРНОВ1САЬЬУ-МО01?1ЕО ΡΚΟΤΕΙΝ С0МРО81Т1О№ АМЗ

МЕТНО05 <1зо» вио-рёа-о67 <140» 504752 <141» 1996-12-03 <150» ₽СТ/и598/25676 <151» 1998-12-03 <160» 9 <170» РаЬепЫп Уег. 2.1 <210» 1 <211» 175 <212» РЙТ <213» Исто вар!епз <400» 1

Сув С1у ₽го <31у Агд ν»1 ν«1 О1у 8ег Агд Агд Агд Рго Рго Агд Ьув

1015

Ьеи Уа1 Рго Ьеи А1а Туг Ьув О1п РЬе Зег Рго Аза Уа1 Рго С1и Ьув

2530

ТЬг ьеи С1у А1а 5ег С1у Агд Туг С1и 01у Ьув Не А1а Агд Зег Зег

4045 <31 и Агд РЬе Ьуе (31и Ьеи ТЬг Рго Ляп Туг Ава Рго Авр 11е Не РЬе

5560

Буе Авр С1и С1и авп ТЬг О1у А1а Авр Агд Ьеи мес ТЬх б1п Агд Сув

70 7580 ьув Авр Агд Ьеи Азп Вег Ьеи А1а Не Зег Уа1 Мес Авп С1п Тгр Рхо 85 9095

В1у Уа1 Ьув Беи Агд Уа1 ТЬг О1и О1у Тгр Авр В1и Авр О1у XI· Н1Э

100 105110

Зег С1и О1и Зег ьеи Ηίβ Туг <31и <31у Агд А1а Уа1 Азр Не ТЬг ТЬг

115 120125

Зег Авр Агд Азр Агд Авп Ьув Туг О1у Беи Ьеи А1а Агд Ьеи А1а Уа1

130 135140 <31и А1а С1у РЬе Азр тгр Уа1 Туг Туг О1и Зег Ьув А1а Шв νβΐ Ηίβ

145 150 155160

Сув 5ег Уа1 Буе Зег <31и Шз 5ег А1а А1а А1а Ьуз ТЬг 31у 31у

165 17017$ <210» 2 «211» 174 <212» ΡΚΤ «213а нолю зарбепз <400» 2

Сув 1

С1у Рго ОХу

Агд 01у РЬе О1у 5

Ьув

Агд Агд Н1в Рго Ьуе ьув

ьеи

10

15

ТЬг

Рго

Ьеи

АХа

туг

Ьуз

О1п

РЬе

Не

Рго

АНП

νβΐ

АХа

61и

Ьув

ТЬг

20

25

30

Ьеи

О1у

А1а

Зег

О1у

Агд

Туг

О1и

О1у Ьуа

11е

Зег

Агд

Авп

Зег

01и

35

40

45

Агд

РЬе

Ьуз

О1и

Ьеи

ты

Рго

АЗП

тут

Азп

РГО

Авр

11е

Не

РЬе

Ьуе

50

55

60

Авр

О1и

01 и

Авп

ТЬг

С1у

А1а

Авр

Агд

Ьеи

МеЕ

ТЬг

О1п

Агд

Суз

Ьуз

65

70

75

60

Авр

ьуз

Ьеи

Азп

А1а

Ьеи

А1а

11е

Зет

УаХ

ИВЕ

Авп

С1П

тгр

РГО

С1у

65

90

95

νβΐ

Ьуз

Ьеи

Агд

Уа1

ты

□Хи

О1у

Тгр

Азр

ОХи

Азр

О1у

Н1з

НХз

Зег

100

105

110

О1и

С1и

зет

Ьеи

Н15

Туг

(Э1и

<31у Ахд

А1а

УаХ

Авр

11е

ТЬг

ТЬг

5ег

115

120

125

Азр

Ахд

Азр

Агд

Зег

Ьуа

Туг

ОХу

МеЕ

Ьеи

А1а

Агд

Ьеи

А1а

УаХ

С1и

130

135

140

А1а

ОХу

РЬе

Азр

Тгр

УаХ

Туг

Туг

ОХи

зет

Ьуз

А1а

Н1в

Не

Н1в

Суз

145

150

155

160

Зег

Уа1

Ьуз

АХ а

О1и

Азп

эег

УаХ

А1а

А1а

Ьуз

Зег

О1у ОХу

165 170 <210» 3 «211» 176 <212» РЙТ <213» Нолю вархепв <400» 3

Сув С1у Рго О1у Агд О1у Рго ν»1 ОХу Ахд Ахд Ахд Туг А1а Ахд Ьув 15 10 15

О1п Ьеи Уа1 Рго Ьеи Ьеи Туг Ьув О1п РЬе Уа1 Рго О1у УаХ Рго О1и 20 25 30 <222» (13) <223> хаа® ₽го, κιε, ог туг <220» <221» 3ΙΤΕ <222» (14) <223» Хаа- Рго ог А1а <220» <221» 51ТЕ <222» (15) <223» Хаа® Агд ог Ьув <220>

<221> 5ΙΤΕ <222» (17) <223» хаа® апу атгйпо ас1<1 <220» <221» 3ΪΤΕ <222> (19) <223* Хаа- Уа1 ог ТПг <220» <221» 3ΙΤΕ <222» (22) <223» Хаа- АХа ог Ьеи <220» <221» 5ΙΤΕ <222» (27) <223» Хаа® Зет, Не, ог V®!

<220» <221» 3ΙΤΕ <222» (29) <223» хаа- Азп ог С1у <220» <221» 3ΙΤΕ <222» (31) <223» Хаа® Рго ог А1а <220» <221» 3ΙΤΕ <222» (41) <223» Хаа® Туг ог А1а <220» <221» 5ХТЕ <222» (45) <223> Хаа® Не ог Уа1

Агд ТЬг Ьеи С1у А1а Зег С1у Рго А1а О1и С1у Агд УаХ А1а Агд С1у

35

40

45

5ег

О1и

Агд

РЬе

Агд

Авр

Ьеи

УаХ

Рго

Азп

Туг

Азп

Рго

Азр

Не

Не

50

55

60

РЬе

Ьув

Авр

С1и

ОХи

АВП

Зег

С1у

АХа

Авр

Агд

Ьеи

Мес

ТЬг

О1и

Агд

65

70

75

80

Сув

Ьуз

ОХи

Агд

νβΐ

Авп

А1а

Ьеи

АХа

Не

А1а

УаХ

Мес

Азп

мег

Тгр

85

90

95

РГО

О1у

УаХ

Агд

Ьеи

Агд

Уа1

ТЬг

С1и

<31у

тгр

Авр

СХи

Аар

ОХу

Н1в

100

105

1X0

Н13

А1а

С1п

Αερ

Зег

Ьеи

Н15

Туг

ОХи

ОХу

Агд

АХа

Ьеи

Азр

Не

ТЬг

115

120

125

ТЬг

Зег

Авр

Агд

Авр

Агд

Авп

Ьув

туг

С1у

Ьеи

Ьеи

АХа

Агд

Ьеи

А1а

130

135

140

Уа1

О1и

А1а

О1у

РЬе

Авр

тгр

УаХ

туг

туг

ОХи

Зег

Агд

Авп

ΗΪΒ

Уа1

145

150

155

160

Н13

Уа1

Зег

УаХ

Ьув

А1а

Авр

АВП

Зег

Ьеи

АХа

ν*1

Агд

АХа

О1у

О1у

165 170 175

<210»	4
<211»	176
<212»	РйТ
<213»	Ното	εβρίβΠΐ	5
<220»
<221»	3ΙΤΕ
<222»	(б)
<223»	Хаа®	УаХ	ог	ОХу
<220»
<221»	3ΙΤΕ
<222»	(7)
<223»	Хаа®	νβΐ.	РЬе, ог Рго
<220»
<221*	3ΙΤΕ
<222»	(0)
<223»	хаа-	о1у	ог	УаХ
<220»
<221»	δΙΤΕ
<222»	(9)
<223»	Хаа-	8ег	ог	□1у
<220>
<221>	51ТБ
<222»	(10)
<223>	Хаа-	Агд	ог	Ьув
<220»
<221»	8ΙΤΕ

<220>

<221» 3ΙΤΕ <222» (46) <223» Хаа» А1а ог Зег <220» <221» 5ΙΤΕ «222» (48) <223» Хаа® Зег, Авл, ог 01у <220» <221» 3ΙΤΕ <222» (54) <223» хаа- 31и ог Азр <220» <221» 3ΙΤΕ <222» (56) <223» Хаа- ТЬг ог Уа1 <220» <221» 3ΙΓΕ <222* (71) <223» Хаа® ТЫ ох 6»г <220» <221* 3ΙΤΕ <222» (79) <223» Хаа- 01п ог (31 и <220» <221» 8ΣΤΕ <222* (83) <223» Хаа® Азр аг <31и <220» <221» 3ΙΤΕ <222» (84) <223* Хаа® Агд ог Ьув <220» <221» δΙΤΕ <222* (85) <223» Хаа® Ьеи ог Уа1 <220* <221» 5ΙΤΕ <222» (91) <223» Хаа® Зег ог А1а <220» <221* 5ΙΤΕ <222» (95) <223» хаа- О1п ог мес <220» <221» 3ΙΤΕ <222» (114) <223» Хаа» 2ег от А1а <220» <221» 2ΙΤΕ <222» (115) <223» Хаа· <31и ог О1п <220» <221» 5ΙΤΕ <222» (116) <223> Хаа· б1и ог Аар <220» <221» 81ГБ <222» (135) <223» Хаа» Азп ог Зег «220» <221» зхте <222» (139) <223» Хаа» Ьей ог Мер <220» <221» 8ΙΤ8 <222» (157) <223» Хаа» ьув ог Агд <220» <221» 8ΙΤΕ <222> (158) <223» Хаа» А1а ог Азп <220» <221» 3ΙΤΕ <222» (160) <223» хаа- ν*1 ог Пв <220» <221» 8ΙΤΒ <222» (162) <223» Хаа- Суз ог Уа1 <220» <221» 8ΙΤΕ <222» (166) <223» Хаа- Зег ог А1а <220» <221» 5ΙΤΕ <222» (167) <223» Хаа» С1и от Азр <220» <221» 3ΙΤΞ <222» (168) «223» ХаачИ1г ог Аеп <220» <221» 3ΙΤΕ <222» (170) <223» Хаа- А1а, Уа1, ог Ьув «220» <221» 3ΙΤΕ <222» (173) <223» Хаа» Ьуз ог Агд <220» <221» 5ΙΤΕ <222» (174) <223» Хаа- ТЪг, бег ог А1а

<40 С

1> 4

Суз

С1у

Рго

<31у

Агд

Хаа

хаа

хаа

хаа

Хаа

Агд

Агд

хаа

Хаа

Хаа

ьуа

1

5

10

15

Хаа

Ьей

Хаа

Рго

Ьей

Хаа

Туг

Ьув

б1п

РЬе

Хаа

РГО

Хаа

Уа1

Хаа

<51 и

20

25

30

Ьуя

ТЪг

Ьей

С1у

А1а

Зег

С1у

Агд

хаа

С1и

б1у

ьуз

хаа

хаа

Агд

хаа

35

40

45

зег

С1и

Агд

РНе

ьуз

Хаа

Ъеи

Хаа

₽го

Аяп

Тут

Αβη

Рго

Авр

Не

Не

50

55

60

РЬе

Ьув

Авр

61и

01 и

Авп

Хаа

б1у

А1а

Авр

Агд

Ьей

Мес

ΤίΐΓ

Хаа

Агд

65

70

75

ВО

Суз

Ьуа

Хаа

Хаа

Хаа

Аеп

Зег

Ьей

А1а

Не

Хаа

νβΐ

мес

Аеп

хаа

тгр

95

90

95

Рго

01 у

V*!

Ъуз

Ьей

Агд

Уа1

ТАг

О1и

С1у

Тгр

Аар

□1и

Аар

О1у

Н1в

100

105

НО

Ηίβ

Хаа

Хаа

Хаа

Зег

Ьей

Н1в

Туг

О1и

61у

лгд

А1а

νβΐ

Авр

Не

тпг

115

120

125

ТЬг Зег Авр лгд Авр Агд Хаа Ьув Туг О1у Хаа Ьей А1а Агд Ьей А1а 130 135 140

Уа1 О1и А1а 01у РЬв Аар Тгр νβΐ Туг Тут <31и Зег Хаа Хаа Н1в Хаа

145 150 155160

Ηίβ Хаа Зег νβΐ Ьуе Хаа Ха· Хаа Зег Хаа А1а А1а Хаа Хаа О1у01 у

165 170175 <210»5 <211»39 <212» ОМА <213» Агс1£1с1а1 Зедиепсе <220>

«223» Рптег <400»5 ддсдасдасд асдасаааес сддассдддс адддддссс39 <210» б <211»39 <212» ΟΝΑ <213» АгС1£1с1а1 ведиепсе <220» <223» Рптег «400» б ддсдасдасд аЕдасааааЪ аддассдддс адддддССс39 <210»7 <211»42 <212» ОНА <213» Агс1£1с1а1 Зедиепсе <220» <223» Рптег <400»7 ддсдаьдасд аЕдасаааак дддсссдддс адддддсссд дд42 <210> 8 <211»47 <212> ОНА <213» Аг£1£1с1а1 Зедиепсе <220» <22Э» ₽г!тег <400» в дсддсдаЬда сдаьдасааа ассаьсддас сдддсадддд дььсддд47 <210»9 <211»49 <212» ОМА <213» ΑτΕί£ιοίβ1 Зедиепсе <220» <223» Рптег <400> 9 дадссаосад ссссссдаск есдедсасас сдадЕГсссГ дсСССсасс 49

Claims (85)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Изолированный белок, включающий в себя Ν-концевую аминокислоту и С-концевую аминокислоту, который выбран из (a) белка с Ν-концевым цистеином, соединенным, по меньшей мере, с одной гидрофобной структурной единицей;

   (b) белка с Ν-концевой аминокислотой, отличной от цистеина, соединенного, по меньшей мере, с одной гидрофобной структурной единицей; и (c) белка, по меньшей мере, с одной гидрофобной структурной единицей, заменяющей Ν-концевую аминокислоту; при условии, что в изолированном белке, если он представлен природным фрагментом хеджхог-полипептида, гидрофобная структурная единица не является пальмитоильной группой на Ν-конце полипептида, и где белок включает в себя аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 70% идентична любой из последовательностей 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 1-4, и где белок связывается с пэтч-белком.
2. 2. Белок по п.1, где гидрофобная структурная единица представляет собой пептид, содержащий, по меньшей мере, одну гидрофобную аминокислоту.
3. 3. Белок по п.1, где гидрофобная структурная единица представляет собой липид.
4. 4. Белок по п.1, который дополнительно содержит гидрофобную структурную единицу, заменяющую С-концевую аминокислоту или присоединенную к С-концевой аминокислоте.
5. 5. Белок по п.1, который является белком, передающим внеклеточный сигнал.
6. 6. Белок по п.1, где Ν-концевая аминокислота является функциональным производным цистеина.
7. 7. Белок по п.1, модифицированный как по Ν-концевой аминокислоте, так и по С-концевой аминокислоте.
8. 8. Белок по п.4 или 7, имеющий гидрофобную структурную единицу, присоединенную, по меньшей мере, к одной аминокислоте, промежуточной между Ν-концевой и С-концевой аминокислотами, или заменяющую ее.
9. 9. Белок по п.1, имеющий гидрофобную структурную единицу, присоединенную, по меньшей мере, к одной аминокислоте, промежуточной между Ν-концевой и С-концевой аминокислотами, или заменяющую ее.
10. 10. Белок по п.3, где липидная структурная единица представляет собой жирную кислоту, выбранную из насыщенных и ненасыщенных жирных кислот с числом атомов углерода от 2 до 24.
11. 11. Белок по п.1, который является белком хеджхог, выделяемым из позвоночных.
12. 12. Белок по п.11, отличающийся тем, что белок хеджхог выделяют из человека или крыса.
13. 13. Белок по п.11, отличающийся тем, что белок хеджхог позвоночных выбран из хеджхог Соник, Индиан и Дезерт.
14. 14. Белок по п.1, дополнительно содержащий везикулу, контактирующую с гидрофобной структурной единицей.
15. 15. Белок по п.14, где везикула выбрана из клеточной мембраны, мицеллы и липосомы.
16. 16. Белок по п.11, где белок хеджхог имеет аминокислотную последовательность, соответствующую одной из последовательностей 8ЕЦ ГО N0: 1-4.
17. 17. Белок по п.13, отличающийся тем, что на С-конце белка хеджхог отсутствуют от 1 до 10 аминокислот по сравнению с белком хеджхог дикого типа.
18. 18. Белок по п.11, который содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 80% идентичную хеджхог Соник, Индиан или Дезерт, и который связывается с пэтчбелком.
19. 19. Изолированный белок по п.1, имеющий вид

    А-Сук-[8р]-В-[8р]-Х, где

    А означает гидрофобную структурную единицу;

    Сук означает цистеин или его функциональный эквивалент;

    [8р] означает необязательную спейсерную пептидную последовательность;

    В означает белок, включающий в себя многочисленные аминокислоты, и, необязательно, другую спейсерную пептидную последовательность и

    Х означает, необязательно, другую гидрофобную структурную единицу, связанную с аминокислотой белка В, при условии, что в изолированном белке, если он представлен природным фрагментом хеджхог-полипептида, гидрофобная структурная единица не является пальмитоильной группой на Ν-конце полипептида.
20. 20. Изолированный белок по п.19, представляющий собой белок хеджхог.
21. 21. Изолированный белок по п.20, где Х, если он имеется, представлен холестерином.
22. 22. Изолированный белок по п.19, где белок В модифицирован, по меньшей мере, по одной другой аминокислоте, по меньшей мере, одной гидрофобной структурной единицей.
23. 23. Изолированный белок по п.19, где связь А-Сук осуществляется через аминогруппу цистеина.
24. 24. Изолированный белок по п.19, дополнительно включающий в себя контактирующую с ним везикулу.
25. 25. Изолированный белок по п.24, где контактирующая с ним везикула выбрана из клеточной мембраны, мицеллы и липосомы.
26. 26. Везикула с присоединенными к ней двумя или более белками, причем, по меньшей мере, два из этих белков имеют вид белка по п.19.
27. 27. Везикула по п.26, выбранная из клеточной мембраны, липосомы и мицеллы.
28. 28. Изолированный белок, имеющий Сконцевую аминокислоту и Ν-концевую тиопролиновую группу, причем указанная группа образована в результате реакции альдегида с Νконцевым цистеином белка, где указанный белок включает в себя аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 70% идентична любой из последовательностей 8ЕЦ ГО Ν0: 1-4, и где белок связывается с пэтчбелком.
29. 29. Изолированный белок, имеющий Сконцевую аминокислоту и Ν-концевую амидную группу, причем указанная группа образована в результате реакции тиоэфира жирной кислоты с Ν-концевым цистеином белка, где указанный белок включает в себя аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 70% идентична любой из последовательностей 8ЕЦ ГО Ν0: 1-4, и где белок связывается с пэтч-белком.
30. 30. Изолированный белок, имеющий Сконцевую аминокислоту и Ν-концевую малеимидную группу, причем указанная Ν-концевая малеимидная группа образована в результате реакции малеимидной группы с Ν-концевым цистеином белка, где указанный белок включает в себя аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 70% идентична любой из последовательностей 8ЕЦ ГО Ν0: 1-4, и где белок связывается с пэтч-белком.
31. 31. Изолированный белок по пп.28, 29 или 30, где С-концевая аминокислота белка модифицирована гидрофобной структурной единицей.

    100
32. 32. Изолированный белок по п.31, содержащий аминокислотную последовательность, идентичную любой из последовательностей 8ЕО ГО ΝΟ: 1-4.
33. 33. Изолированный белок по п.32, где Сконцевая гидрофобная структурная единица представляет собой холестерин.
34. 34. Способ получения мультивалентного белкового комплекса, включающий в себя стадию связывания в присутствии везикулы гидрофобной структурной единицы с Ν-концевым цистеином белка или с функциональным эквивалентом Ν-концевого цистеина, где указанный белок включает в себя аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 70% идентична любой из последовательностей 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 1-4, и где белок связывается с пэтчбелком.
35. 35. Способ по п.34, где стадия связывания включает в себя связывание липидной структурной единицы, выбранной из насыщенных и ненасыщенных жирных кислот с числом атомов углерода от 2 до 24.
36. 36. Способ по п.34, где белок содержит аминокислотную последовательность, идентичную любой из последовательностей 8ЕЦ ГО ΝΟ: 1-4.
37. 37. Способ по п.34, где белком является белок хеджхог, выбранный из хеджхог Соник, Индиан и Дезерт.
38. 38. Способ по п.36, где стадия связывания включает в себя связывание с везикулой, выбранной из клеточной мембраны, липосомы и мицеллы.
39. 39. Способ модификации физикохимического свойства белка, включающий в себя введение, по меньшей мере, одной гидрофобной структурной единицы в Ν-концевой цистеин белка или в функциональный эквивалент Ν-концевого цистеина, где указанный белок включает в себя аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 70% идентична любой из последовательностей 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 1-4, и где белок связывается с пэтчбелком.
40. 40. Способ по п.39, дополнительно включающий в себя контактирование гидрофобной структурной единицы с везикулой.
41. 41. Способ по п.39, где гидрофобная структурная единица представляет собой либо липидную структурную единицу, выбранную из насыщенных и ненасыщенных жирных кислот с числом атомов углерода от 2 до 24, либо гидрофобный белок.
42. 42. Способ по п.39, где белок содержит аминокислотную последовательность, идентичную любой из последовательностей 8ЕЦ ГО ΝΟ: 1-4.
43. 43. Способ по п.39, где белком является белок хеджхог, выбранный из хеджхог Соник, Индиан и Дезерт.
44. 44. Способ по п.40, где стадия контактирования включает в себя контактирование с везикулой, выбранной из клеточной мембраны, липосомы и мицеллы.
45. 45. Белковый комплекс, полученный способом по п.34.
46. 46. Модифицированный белок, полученный способом по п.39.
47. 47. Способ модификации белка, обладающего биологической активностью и содержащего Ν-концевой цистеин, включающий в себя реакцию Ν-концевого цистеина с тиоэфиром жирной кислоты с образованием амида, причем такая модификация повышает биологическую активность белка, где указанный белок включает в себя аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 70% идентична любой из последовательностей 8ЕЦ ГО ΝΟ: 1-4, и где белок связывается с пэтч-белком.
48. 48. Способ по п.47, где белок содержит аминокислотную последовательность, идентичную любой из последовательностей 8ЕЦ ГО ΝΟ: 1-4.
49. 49. Способ по п.48, где белком является белок хеджхог, выбранный из хеджхог Соник, Индиан, Дезерт и их функциональных вариантов.
50. 50. Способ модификации белка, обладающего биологической активностью и содержащего Ν-концевой цистеин, включающий в себя взаимодействие Ν-концевого цистеина с малеимидной группой, причем такая модификация повышает биологическую активность белка, где указанный белок включает в себя аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 70% идентична любой из последовательностей 8ЕЦ ГО ΝΟ: 1-4, и где белок связывается с пэтч-белком.
51. 51. Способ по п.50, где белок содержит аминокислотную последовательность, идентичную любой из последовательностей 8ЕЦ ГО ΝΟ: 1-4.
52. 52. Способ по п.50, где белком является белок хеджхог, выбранный из хеджхог Соник, Индиан, Дезерт и их функциональных вариантов.
53. 53. Способ модификации белка, который связывается с внеклеточным рецептором, включающий в себя присоединение к белку гидрофобного пептида, причем белок обладает биологической активностью, а гидрофобный пептид усиливает биологическую активность, где указанный белок включает в себя аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 70% идентична любой из последовательностей 8ЕЦ ГО ΝΟ: 1-4, и где белок связывается с пэтч-белком.
54. 54. Способ по п. 53, где гидрофобный пептид присоединен к аминокислоте белка, выбранной из Ν-концевой аминокислоты, Сконцевой аминокислоты, аминокислоты, расположенной между Ν-концевой аминокислотой и

    101

    102

    С-концевой аминокислотой, и комбинации этих вариантов.
55. 55. Способ по п.53, где белок представляет собой белок хеджхог.
56. 56. Способ по п.53, где белком является белок хеджхог, выбранный из хеджхог Соник, Индиан и Дезерт.
57. 57. Терапевтическое применение белка по любому из пп.1 или 11, включающее в себя введение этого белка субъекту с целью лечения у него неврологического заболевания, повреждения глаза, кожного повреждения или заболевания или повреждения костной или хрящевой ткани.
58. 58. Способ лечения неврологического расстройства у пациента, включающий в себя введение пациенту белка по любому из пп.1 или 11.
59. 59. Белок по п.1, представляющий собой белок, передающий внеклеточный сигнал.
60. 60. Способ по п.54, где стадия присоединения включает в себя замену, по меньшей мере, Ν-концевой аминокислоты белка, по меньшей мере, одной гидрофобной аминокислотой.
61. 61. Способ по п.60, где, по меньшей мере, одна гидрофобная аминокислота представляет собой множество изолейциновых остатков.
62. 62. Способ по п.61, дополнительно включающий в себя химическую модификацию, по меньшей мере, одного из изолейциновых остатков.
63. 63. Изолированный белок, имеющий Сконцевую аминокислоту и Ν-концевую ацетамидную группу, которая образована в результате реакции замещенного ацетамида с Νконцевым цистеином белка, где указанный белок включает в себя аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 70% идентична любой из последовательностей 8ЕЦ ΙΌ NО: 1-4, и где белок связывается с пэтчбелком.
64. 64. Изолированный белок, имеющий Сконцевую аминокислоту и Ν-концевую тиоморфолиновую группу, которая образована в результате реакции галогенкетонной группы с Νконцевым цистеином белка, где указанный белок включает в себя аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 70% идентична любой из последовательностей 8ЕЦ ΙΌ NО: 1-4, и где белок связывается с пэтчбелком.
65. 65. Способ модификации белка, имеющего биологическую активность и содержащего Νконцевой цистеин, включающий в себя взаимодействие Ν-концевого цистеина с замещенной ацетамидной группой, причем такая модификация повышает биологическую активность белка, где указанный белок включает в себя аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 70% идентична любой из последовательностей 8ЕЦ ΙΌ NО: 1-4, и где белок связывается с пэтч-белком.
66. 66. Способ по п.65, где белок включает в себя аминокислотную последовательность, идентичную любой из последовательностей 8ЕО ΙΌ ЦО: 1-4.
67. 67. Способ по п.65, где белком является белок хеджхог, выбранный из хеджхог Соник, Индиан, Дезерт и их функциональных вариантов.
68. 68. Способ модификации белка, имеющего биологическую активность и содержащего Νконцевой цистеин, включающий в себя взаимодействие Ν-концевого цистеина с галогенкетонной группой, причем такая модификация повышает биологическую активность белка, где указанный белок включает в себя аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 70% идентична любой из последовательностей 8ЕЦ ΙΌ ЫО: 1-4, и где белок связывается с пэтч-белком.
69. 69. Способ по 68, где белок включает в себя аминокислотную последовательность, идентичную любой из последовательностей 8ЕЦ ΙΌ ЦО: 1-4.
70. 70. Способ по п.68, где белком является белок хеджхог, выбранный из хеджхог Соник, Индиан, Дезерт и их функциональных вариантов.
71. 71. Полипептид хеджхог, где указанный полипептид хеджхог включает в себя аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 70% идентична любой из последовательностей 8ЕЦ ΙΌ ΝΌ: 1-4, и где полипептид связывается с пэтч-белком, модифицированный одной или более липофильными структурными единицами, при условии, что в случае, когда полипептид хеджхог представляет собой зрелый Ν-концевой протеолитический фрагмент белка хеджхог, липофильная структурная единица не является стеролом на С-концевом остатке, а в случае, когда полипептид хеджхог является природным фрагментом полипептида хеджхог, липофильная структурная единица не является пальмитоильной группой на Ν-концевом остатке.
72. 72. Полипептид хеджхог по п.71, где указанный полипептид модифицирован одной или несколькими липофильными структурными единицами по внутренним аминокислотным остаткам.
73. 73. Полипептид хеджхог по п.71, где указанный полипептид модифицирован одним или более липофильными ароматическими углеводородами.
74. 74. Полипептид хеджхог по любому из пп.71-73, который представлен в виде очищенного белкового препарата.
75. 75. Полипептид хеджхог по любому из пп.71-73, который представлен в виде лекарственного препарата.
76. 76. Полипептид хеджхог по п.71 или 72, где липофильные структурные единицы выбраны из жирных кислот, липидов, сложных эфи

    103

    104 ров, спиртов, каркасных структур и ароматических углеводородов.
77. 77. Полипептид хеджхог по п.73 или 76, где ароматический углеводород выбран из бензола, перилена, фенантрена, антрацена, нафталина, пирена, хризена и нафтацена.
78. 78. Полипептид хеджхог по п.77, где ароматический углеводород представляет собой пирен.
79. 79. Полипептид хеджхог по п.71 или 72, где липофильные структурные единицы выбраны из изопреноидов, терпенов и полиалициклических углеводородов.
80. 80. Полипептид хеджхог по п.79, где липофильные структурные единицы выбраны из адамантанов, бакминстерфуллеренов, витаминов, полиэтиленгликоля, олигоэтиленгликоля, (С1-С1₈)диалкиловых эфиров фосфорной кислоты, О-СН₂-СН(ОН)-О-(С)₂-С1₈)алкила.
81. 81. Полипептид хеджхог по п.80, где липофильные структурные единицы выбраны из 1или 2 -адамантилацетила, 3 -метиладамант-1илацетила, 3 -метил-3 -бром-1-адамантилацетила, 1-декалинацетила, камфорацетила, камфанацетила, норадамантилацетила, норборнанацетила, бицикло [2.2.2] окт-5 -енацетила, 1 -метоксиби- цикло [2.2.2] окт-5 -ен-2-карбонила, цис-5-норборненэндо-2,3-дикарбонила, 5-норборнен-2илацетила, (1В)-(-)-миртентанацетила, 2норборнанацетила, анти-3-оксотрицикло[2.2.1.0<2,6>] гептан-7-карбонила, деканоила, додеканоила, додеценоила, тетрадекадиеноила, дециноила и додециноила.
82. 82. Полипептид хеджхог по любому из пп.71-73, где липофильная структурная единица или липофильные структурные единицы усиливают биологическую активность полипептида относительно немодифицированного полипептида хеджхог.
83. 83. Способ изменения состояния роста клетки, отвечающей на передачу сигнала белком хеджхог, включающий в себя контактирование клетки с липофильно-модифицированным полипептидом хеджхог по любому из пп.71-73.
84. 84. Применение белка по любому из пп.118 в производстве лекарственного средства для лечения неврологического заболевания.
85. 85. Применение липофильно-модифицированного полипептида хеджхог по любому из пп.71-73 в производстве лекарственного средства для изменения состояния роста клетки, отвечающей на передачу сигнала белком хеджхог.