DE69830192T2

DE69830192T2 - Hydrophobisch-modifizierte Hedgehog Protein Zusammensetzungen und Verfahren

Info

Publication number: DE69830192T2
Application number: DE69830192T
Authority: DE
Inventors: Blake R. Pepinsky; Chenhui Zeng; P. Darren BAKER; Dingyi Wen; P. Kevin WILLIAMS; A. Ellen GARBER; L. Kathryn STRAUCH; R. Frederick TAYLOR; H. Paul WEINRUB; C. Russell PETTER; Alphonse Galdes; Jeffrey Porter
Original assignee: Curis Inc; Biogen Idec Inc; Biogen Idec MA Inc
Current assignee: Biogen Inc; Curis Inc; Biogen MA Inc
Priority date: 1997-12-03
Filing date: 1998-12-03
Publication date: 2006-01-12
Anticipated expiration: 2018-12-04
Also published as: EA200000605A1; PT1036092E; WO1999028343A3; KR20010032753A; EE200000308A; IS5499A; WO1999028343A9; JP2001525336A; TR200001612T2; HUP0100535A2; NZ504752A; PL341430A1; EA003739B1; NO20002789D0; MXPA00005494A; IS2163B; HUP0100535A3; AU757497B2; PL197833B1; ATE295372T1

Description

Hintergrund der Erfindung
Es ist bekannt, dass bestimmte Proteine eine größere biologische Aktivität aufweisen, wenn sie an andere Reste gebunden sind, und zwar entweder durch Bildung von multimeren Komplexen, bei denen die Proteine eine Gelegenheit zum Zusammenwirken haben, oder über andere Veränderungen in den physikochemischen Eigenschaften des Proteins, z. B. der Absorption, Bioverteilung und Halbwertszeit des Proteins. Somit beinhaltet ein derzeitiges Forschungsgebiet der Biotechnologie die Entwicklung von Verfahren zur Modifizierung der physikochemischen Eigenschaften von Proteinen, so dass sie in geringeren Mengen, mit geringeren Nebenwirkungen, auf neuen Verabreichungswegen und kostengünstiger verabreicht werden können.
Beispielsweise kann die Bindungsaffinität eines beliebigen einzelnen Proteins (z. B. als Ligand für seinen verwandten Rezeptor) gering sein. Jedoch exprimieren Zellen normalerweise Hunderte bis Tausende Kopien eines bestimmten Oberflächenrezeptors und es können zahlreiche Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen gleichzeitig stattfinden. Wenn zahlreiche Oberflächenmoleküle an der Bindung beteiligt sind, ist die gesamte wirksame Affinität größer als die Summe der Bindungsaffinitäten der einzelnen Moleküle. Wenn im Gegensatz dazu Ligandenproteine von der Zelloberfläche entfernt und gereinigt werden oder durch rekombinante DNA-Techniken für die Verwendung, z. B. als Therapeutika, isoliert werden, wirken sie als Monomere und verlieren den Vorteil, dass sie mit zahlreichen anderen Kopien des gleichen Proteins, die eng an der Oberfläche einer Zelle miteinander assoziiert sind, zusammenwirken. Somit kann in isoliertem Zustand die geringe Affinität eines Proteins für seinen Rezeptor einen schweren Nachteil bezüglich seiner Wirksamkeit als Therapeutikum zur Blockierung eines speziellen Bindungsweges darstellen, da es gegen die Zell- Zell-Wechselwirkungen von hoher Avidität konkurrieren muss. Eine wirksame Behandlung könnte eine konstante Verabreichung und/oder höhere Dosen erforderlich machen. Derartige Nachteile ließen sich jedoch vermeiden, wenn sich Mittel zur Bereitstellung multimerer Formen eines isolierten Proteins auffinden ließen.
Gleichermaßen wäre es wertvoll, weitere physikochemische Eigenschaften von biologisch aktiven Proteinen zu modifizieren, so dass beispielsweise ein Protein zur Assoziation mit einer Membran angeregt wird, wobei es an der Verabreichungsstelle lokalisiert wird und seine Fähigkeit zur Bindung an ein bestimmtes Ziel oder zu einer anderweitigen Wechselwirkung mit diesem Ziel verstärkt wird. Derartige Veränderungen können auch die pharmakologische Verteilung des Proteins beeinflussen.
Es wurden verschiedene Verfahren zur Entwicklung von gekuppelten Proteinen konzipiert. Viele dieser Verfahren sind nicht hochgradig spezifisch, d. h. sie sind nicht auf den Punkt der Kupplung an eine bestimmte Stelle am Protein ausgerichtet. Infolgedessen können herkömmliche Kupplungsmittel funktionelle Stellen angreifen oder sterisch aktive Zentren blockieren, wodurch die gekuppelten Proteine inaktiv werden. Ferner orientieren sich die gekuppelten Produkte möglicherweise so, dass die aktiven Zentren nicht synergistisch zusammenwirken können, so dass die Produkte nicht wirksamer als das monomere Protein allein sind.
Weitere Motivationen zum Auffinden neuer Verfahren zur Proteinmodifikation ergeben sich daraus, dass Proteine mit einem N-terminalen Cysteinrest gegenüber einer Oxidation oder anderen chemischen Modifikationen, die die Aktivität oder die Halbwertszeit beeinträchtigen können, empfindlich sind. Ferner weisen bestimmte Puffer, die üblicherweise bei der Proteinreinigung eingesetzt werden, Bestandteile oder Verunreinigungen auf, die das N-terminale Cystein modifizieren können. Selbst wenn diese Puffer vermieden werden, wird das N-terminale Cystein im Laufe der Zeit modifiziert, möglicherweise aufgrund von Chemikalien in den Lagerungsfläschchen oder in der Luft. Infolgedessen müssen Zubereitungspuffer ein Schutzmittel, wie Dithiothreit, enthalten, um eine Modifikation und/oder Oxidation von Cystein zu verhindern. Jedoch weisen die Schutzmittel selbst eine erhebliche biologische Aktivität auf und können daher Experimente kompliziert gestalten und die therapeutische Eignung einer Zubereitung nachteilig beeinflussen.
WO-A-97/40852 betrifft ein Verfahren zum Modifizieren eines antigenen Peptids, um die Bindungsaffinität eines MHC-Komplexes zu erhöhen.. Jedoch finden sich in WO-A-97/40852 keine Ausführungen über die Modifikation eines Peptids oder Proteins mit dem Ziel, seine Aktivität zu erhöhen.
PNAS, Bd. 94 (Juni 1997), S. 6116–6120, beschreibt die Palmitoylierung von G-Protein-Untereinheiten am Cys in der Nähe des N-Terminus, beschreibt aber nicht die Modifikation eines Peptids oder Proteins mit dem Ziel, die Aktivität der Peptide oder Proteine zu erhöhen.
Biochem. J., Bd. 328(1) (November 1997), S. 23–31 beschreibt die Bindung von Liposomen an G-Protein-Untereinheiten, beschreibt aber nicht die Modifikation eines Peptids oder Proteins zur Erhöhung von dessen Aktivität.
Biochemistry, Bd. 33(51) (1994), S. 15469–15482 beschreibt modifizierte Proteine, wie BPTI, beschreibt aber nicht die Modifizierung von Peptiden oder Proteinen zur Verstärkung ihrer Aktivität.
WO-A-96/16668 beschreibt Hedgehog-Proteine, beschreibt aber ebenfalls nicht die Modifikation von Peptiden oder Proteinen zur Erhöhung ihrer Aktivität.
WO-A-98/30576 beschreibt die Verknüpfung von Hedgehog-Sequenzen mit Cholesterol über N-terminales Cys, beschreibt aber nicht die Modifikation von Peptiden zur Erhöhung ihrer Aktivität.
Demzufolge besteht auf dem einschlägigen Gebiet ein Bedürfnis zur Entwicklung spezifischerer Mittel zur Bereitstellung derivatisierter Produkte oder multimerer Formen davon, um die Eigenschaften des Proteins mit dem Ziel zu verändern, seine Stabilität, Wirkungsstärke, Pharmakokinetik und Pharmakodynamik zu beeinflussen.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Gemäß einem Aspekt der Erfindung haben wir das Problem zum Auffinden eines Weges, in zweckmäßiger Weise modifizierte Formen von biologisch aktiven Proteinen herzustellen, gelöst. Die erfindungsgemäßen Verfahren können zur Derivatisierung multimerer Formen der Proteine und/oder zur Veränderung ihrer physikochemischen Eigenschaften herangezogen werden. Wir haben festgestellt, dass eine Modifikation eines Hedgehog-Proteins (d. h. das Addieren oder Anheften eines hydrophoben Restes an eine vorhandene Aminosäure oder das Ersetzen einer Aminosäure durch einen hydrophoben Rest) in der Weise, dass der hydrophobe Rest in das Protein eingeführt wird, die biologische Aktivität und/oder Stabilität des Proteins erhöhen kann. Beispielsweise kann ein N-terminales Cystein als zweckmäßiges "Ziel" verwendet werden, um einen hydrophoben Rest (z. B. ein Lipid) anzuheften und dadurch die biologisch aktiven Proteine zu modifizieren.
Alternativ kann ein hydrophober Rest an einen C-terminalen Rest eines biologisch aktiven Hedgehog-Proteins angeheftet werden, um die Aktivität des Proteins zu modifizieren. Ein hydrophober Rest kann auch an einen internen Aminosäurerest angeheftet werden, um die Aktivität des Proteins zu verstärken, vorausgesetzt, dass die Modifikation nicht die Aktivität des Proteins beeinträchtigt, z. B. die Fähigkeit des Proteins zur Bindung an einen Rezeptor oder Corezeptor, oder die dreidimensionale Struktur des Proteins nicht beeinträchtigt. Vorzugsweise wird der hydrophobe Rest an einen internen Aminosäurerest angeheftet, d. h. an die Oberfläche des Proteins, wenn das Protein in seiner nativen Form vorliegt. Die erfindungsgemäße hydrophobe Modifikation bietet ein allgemein geeignetes Verfahren zur Erzeugung von Proteinen, deren physikochemische Eigenschaften im Vergleich zu nicht-modifizierten Formen verändert sind.
Die Erfindung beruht auf dem Befund, dass wir bei der Expression von Sonic-Hedgehog-Protein von voller Länge in Insekten- oder Säugetierzellen feststellten, dass die reife Form des Proteins (Reste 1–174 in der reifen Sequenz) zusätzlich zum Vorliegen von Cholesterol am C-Terminus auch an seinem N-terminalen Ende mit einer Fettsäure derivatisiert ist. In signifikanter Weise zeigte diese Form von Hedgehog bei einem in vitro-Test eine etwa 30-fach erhöhte Wirkungsstärke, verglichen mit löslichem, nicht-modifiziertem Hedgehog.
Ein Aspekt der Erfindung betrifft daher ein isoliertes Hedgehog-Protein, das eine N-terminale Aminosäure und eine C-terminale Aminosäure umfasst, wobei das Protein aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: einem Protein mit einem N-terminalen Cystein, an das mindestens ein hydrophober Rest angeheftet ist; einem Protein mit einer N-terminalen Aminosäure, bei der es sich nicht um ein Cystein, an das mindestens ein hydrophober Rest angehängt ist, handelt; und einem Protein mit einem hydrophoben Rest, der die N-terminale Aminosäure ersetzt. Beim hydrophoben Rest kann es sich um ein hydrophobes Peptid oder um ein beliebiges Lipid oder um einen beliebigen anderen chemischen Rest, der hydrophob ist, handeln.
Das Protein kann an seiner N-terminalen Aminosäure modifiziert sein und vorzugsweise handelt es sich bei der N-terminalen Aminosäure um ein Cystein oder um ein funktionelles Derivat davon. Das Protein kann an der C-terminalen Aminosäure oder sowohl an der N-terminalen als auch an der C-terminalen Aminosäure oder an mindestens einer internen Aminosäure, die zwischen der N-terminalen und der C-terminalen Aminosäure liegt, modifiziert sein oder es kann sich auch um verschiedene Kombinationen dieser Konfigurationen handeln. Beim Protein kann es sich um ein extrazelluläres signalgebendes Protein handeln und in bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich beim Protein um ein Hedgehog-Protein, das aus einer Wirbeltierquelle erhältlich ist, vorzugsweise aus einer humanen Quelle, und Sonic-, Indian- und Desert-Hedgehog umfasst.
Bei einer weiteren Ausführungsform handelt es sich um ein isoliertes Hedgehog-Protein der Form A-Cys-[Sp]-B-X, wobei A einen hydrophoben Rest bedeutet;
Cys ein Cystein oder ein funktionelles Äquivalent davon bedeutet;
[Sp] eine fakultative Abstandshalter-Peptidsequenz bedeutet;
B ein Hedgehog-Protein bedeutet, das eine Mehrzahl von Aminosäuren umfasst, einschließlich mindestens einer fakultativen Abstandshalter-Peptidsequenz; und
X einen fakultativen weiteren hydrophoben Rest, der mit dem Protein verknüpft ist, bedeutet.
Das Hedgehog-Protein kann an mindestens einer weiteren Aminosäure mit mindestens einem hydrophoben Rest modifiziert sein. In weiteren Ausführungsformen steht das Protein in Kontakt mit einer Vesikel, die aus der aus einer Zellmembran, einer Mizelle und einem Liposom ausgewählten Gruppe ausgewählt ist.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein isoliertes Hedgehog-Protein mit einer C-terminalen Aminosäure und einer N-terminalen Thiaprolingruppe, wobei die Thiaprolingruppe durch Umsetzung eines Aldehyds mit einem N-terminalen Cystein des Proteins gebildet worden ist. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein isoliertes Hedgehog-Protein mit einer C-terminalen Aminosäure und einer N-terminalen Amidgruppe, wobei die Amidgruppe durch Umsetzung eines Fettsäurethioesters mit einem N-terminalen Cystein des Proteins gebildet worden ist. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein isoliertes Hedgehog-Protein mit einer C-terminalen Aminosäure und einer N-terminalen Maleinimidgruppe, wobei die N-terminale Maleinimidgruppe durch Umsetzung einer Maleinimidgruppe mit dem N-terminalen Cystein des Proteins gebildet worden ist. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein isoliertes Hedgehog-Protein mit einer C-terminalen Aminosäure und einer N-terminalen Acetamidgruppe. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein isoliertes Hedgehog-Protein mit einer C-terminalen Aminosäure und einer N-terminalen Thiomorpholingruppe.
Bei diesen Ausführungsformen kann die C-terminale Aminosäure des Proteins mit einem hydrophoben Rest modifiziert sein.
Die erfindungsgemäßen Verfahren umfassen ein Verfahren zur Erzeugung eines mehrwertigen Proteinkomplexes, wobei das Verfahren die Stufe der Verknüpfung – in Gegenwart einer Vesikel – eines hydrophoben Restes mit einem N-terminalen Cystein eines Proteins oder einem funktionellen Äquivalent des N-terminalen Cysteins umfasst. Die Verknüpfungsstufe kann die Verknüpfung eines Lipidrestes umfassen, der aus gesättigten und ungesättigten Fettsäuren mit 2 bis 24 Kohlenstoffatomen ausgewählt ist. Beim Protein kann es sich um ein Hedgehog-Protein handeln, das aus der aus Sonic-, Indian- und Desert-Hedgehog bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Bei einem weiteren erfindungsgemäßen Verfahren handelt es sich um ein Verfahren zum Modifizieren einer physikochemischen Eigenschaft eines Hedgehog-Proteins, wobei das Verfahren die Einführung mindestens eines hydrophoben Restes in ein N-terminales Cystein des Proteins oder in ein funktionelles Äquivalent des N-terminalen Cysteins umfasst. Beim hydrophoben Rest kann es sich um einen Lipidrest handeln, der aus gesättigten und ungesättigten Fettsäuren mit 2 bis 24 Kohlenstoffatomen ausgewählt ist. Es kann sich auch um ein hydrophobes Protein handeln. Bei dem unter Anwendung dieses Verfahrens modifizierten Protein kann es sich um ein Hedgehog-Protein handeln, das aus der aus Sonic-, Indian- und Desert-Hedgehog bestehenden Gruppe ausgewählt ist. Ein Proteinkomplex, der durch diese Verfahren erzeugt worden ist, fällt ebenfalls unter die vorliegende Erfindung.
Bei einem weiteren Verfahren handelt es sich um ein Verfahren zum Modifizieren eines Hedgehog-Proteins (z. B. eines extrazellulären signalgebenden Proteins), das ein N-terminales Cystein aufweist. Dieses Verfahren umfasst die Umsetzung des N-terminalen Cysteins mit einem Fettsäurethioester unter Bildung eines Amids, wobei die Modifikation die biologische Aktivität des Proteins verstärkt.
Bei einem weiteren Verfahren handelt es sich um ein Verfahren zum Modifizieren eines Hedgehog-Proteins mit einem N-terminalen Cystein, wobei das Verfahren die Umsetzung des N-terminalen Cysteins mit einer Maleinimidgruppe umfasst, wobei eine derartige Modifikation die biologische Aktivität des Proteins verstärkt. Weitere Ausführungsformen dieses Verfahrens beinhalten die Umsetzung des N-terminalen Cysteins mit einer Aldehydgruppe, einer Acetamidgruppe oder einer Thiomorpholingruppe.
Ein weiteres Verfahren besteht in einem Verfahren zum Modifizieren eines Hedgehog-Proteins, das das Anheften eines hydrophoben Peptids an das Protein umfasst. Der hydrophobe Rest kann an eine Aminosäure des Proteins angeheftet werden, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus der N-terminalen Aminosäure, der C-terminalen Aminosäure, einer zwischen der N-terminalen Aminosäure und der C-terminalen Aminosäure liegenden Aminosäure und Kombinationen davon ausgewählt ist. In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Hedgehog-Polypeptide bereit, die mit lipophilen Resten modifiziert ist. In bestimmten Ausführungsformen sind die erfindungsgemäßen Hedgehog-Proteine durch einen oder mehrere lipophile Reste an einer oder mehreren internen Stellen der reifen, prozessierten, extrazellulären Domäne modifiziert und können gegebenenfalls auch mit lipophilen Resten an den N- oder C-terminalen Resten des reifen Polypeptids derivatisiert sein. Bei weiteren Ausführungsformen ist das Polypeptid am C-terminalen Rest mit einem hydrophoben Rest, der von einem Sterol abweicht, modifiziert. Bei weiteren Ausführungsformen ist das Polypeptid am N-terminalen Rest mit einer cyclischen (vorzugsweise polycyclischen) lipophilen Gruppe modifiziert. Ferner kommen verschiedene Kombinationen der vorstehenden Ausführungsformen in Betracht. Bei einer erfindungsgemäßen Verwendung handelt es sich um eine Verwendung eines erfindungsgemäßen, hydrophob modifizierten Hedgehog-Proteins zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer neurologischen Störung.
Kurze Beschreibung der Figuren
1. Charakterisierung einer palmitoylierten Form von Shh. Eine gebundene Form von humanem Shh wurde aus High Five^R-Insektenzellen einer Immunoaffinitätsreinigung unterzogen und durch SDS-Page analysiert. Das Protein wurde mit Coomassie-Blau gefärbt (Bahn a, Life Technologies, Inc., vorgefärbt mit hochmolekularen Markern; Bahn b, lösliches Shh (0,6 μg); Bahn c, gebundenes Shh (0,6 μg); Bahn d, Gemisch von löslichem plus gebundenem Shh (jeweils 0,6 μg)). Die Fähigkeit von Shh und Ihh (vergl. Bahn h) zur Modifikation mit Palmitinsäure wurde unter Verwendung eines in Beispiel 2 beschriebenen zellfreien Systems getestet. Lösliche Formen von Hedgehog-Protein (3 μg/Probe) wurden 1 Stunde mit Rattenleber-Mikrosomen, ATP, Coenzym A und ³H-Palmitinsäure inkubiert und sodann durch SDS-PAGE auf die Palmitoylierung analysiert. Die in den Bahnen e–i dargestellten Proben wurden durch Fluorographie sichtbar gemacht (Bahn e, Shh; Bahn f, des-1-10-Shh; Bahn g, Cys-1 bis Ser-Shh; Bahn h, Ihh; Bahn i, mit His markiertes Shh) und in den Bahnen j–k, Coomassie-Färbung (Bahn j, Shh; Bahn k, des-1-10-Shh).
2. Analyse von gereinigtem Shh durch ESI-MS. Lösliches, humanes Shh (A) und gebundenes, humanes Shh (B) wurden durch ESI-MS an einem Micromass Quattro II-Dreifachquadrupol-Massenspektrometer, der mit einer Elektrospray-Ionenquelle ausgerüstet war, analysiert. Sämtliche Elektrospray-Massenspektrumdaten wurden gewonnen, im Profilmodus gespeichert und unter Verwendung des Micromass MassLynx-Datensystems verarbeitet. Molekül-Massenspektren sind dargestellt (die Massenzuordnungen wurden vom Datensystem erzeugt).
3. Analyse von gebundenem Shh durch Umkehrphasen-HPLC. Lösliches, humanes Shh (A), gebundenes, humanes Shh aus High Five^R-Insektenzellen (B), gebundenes, humanes Shh aus EBNA-293-Zellen (C) und zellassoziiertes Ratten-Shh (D) wurden der Umkehrphasen-HPLC an einer Vydac C₄-Säule mit enger Bohrung (2,1 mm Innendurchmesser × 250 mm) unterworfen. Die Säule wurde mit einem 30 Minuten-0-80 %-Acetonitril-Gradienten in 0,1 % Trifluoressigsäure mit 0,25 ml/min entwickelt. Das ausströmende Produkt wurde unter Verwendung eines Photodioden-Felddetektors von 200–300 nm überwacht (Daten bei 214 nm dargestellt). Peakfraktioen wurden gesammelt und ferner durch SDS-PAGE und MS charakterisiert (Daten in den Tabellen 3, 4 und 5 zusammengestellt).
4. Charakterisierung von Shh durch LC-MS. Gebundenes, humanes Shh (A) und lösliches, humanes Shh (B) wurden mit 4-Vinylpyridin alkyliert (1 μl/100 μl Probe in 6 M Guanidin-HCl, 1 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0), mit Ethanol gefällt und mit Endoproteinase-Lys-C in 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,0, 2 M Harnstoff bei einem Enzym:Protein-Verhältnis 1:5 gemäß Literaturangaben (27) verdaut. Die Verdauungsprodukte wurden "in line" durch Umkehrphasen-HPLC mit einem Elektrospray-Micromass Quattro II-Dreifachquadrupol-Massenspektrometer analysiert. Eine Abtastung wurde während des gesamten Ansatzes durchgeführt. Eine Bearbeitung wurde unter Verwendung des Micromass MassLynx-Datensystems vorgenommen (die gesamten Ionenchromatogramme aus den Ansätzen sind dargestellt). Sterne geben die Positionen des N-terminalen Peptids an, die entweder durch MALDI-PSD oder durch N-terminale Edman-Sequenzierung bestätigt wurden.
5. Sequenzierung des N-terminalen Shh-Peptids durch MALDI-PSD-Messung. Das N-terminale Endoproteinase-Lys-C-Peptid von gebundenem, humanem Shh wurde der MALDI-PSD-Messung an einem Voyager-DE^R-STR-Flugzeit-Massenspektrometer unterworfen. Das vorhergesagte Fragmentierungsmuster und die Nomenklatur für die erfassten Fragmentionen sind oben am Feld angegeben (PA, Palmitoylsäure; 4vp, 4-Pyridylethylgruppe). Der Rest der Figur zeigt das im Ansatz erzeugte molekulare Massenspektrum. Relevante Ionen sind unter Anwendung der im Schema definierten Nomenklatur bezeichnet. Die berechneten Massen (Da) für b₁-b₈ betragen 447,3, 504,3, 601,4, 658,4, 814,5, 871,5, 1018,6 bzw. 1075,6. Für y₁-y₈ betragen die Massen (Da) 147,1, 204,1, 351,2, 408,2, 564,3, 621,3, 718,4 bzw. 775,4. Die berechnete Masse für z₈ beträgt 758,4 Da. Die beobachtete Masse für b₈ enthält zusätzlich 18 Da aufgrund von addiertem Wasser.
6. Verstärkte Aktivität von gebundenem Shh beim C3H10T1/2-Test. Die relativen Wirkungsstärken von löslichem und gebundenem, humanem Shh allein (A) oder in Gegenwart des neutralisierenden anti-Hedgehog-Mab 5E1 (B) wurden an C3H10T1/2-Zellen zur Messung der Induktion von alkalischer Phosphatase bestimmt. Die aufgeführten Zahlen geben die Mittelwerte von Zweifachbestimmungen an. (A) Zweifach-Reihenverdünnungen von löslichem (6) und gebundenem (8) Shh wurden mit den Zellen 5 Tage inkubiert. Die sich ergebenden Werte für die Aktivität von alkalischer Phosphatase wurden bei 405 nm unter Verwendung des chromogenen Substrats für alkalische Phosphatase, nämlich p-Nitrophenylphosphat, gemessen. (B) Reihenverdünnungen von Mab5E1 wurden mit löslichem Shh (5 μg/ml: schwarze Balken) oder gebundenem Shh (0,25 μg/ml: graue Balken) oder mit Trägerkontrolle ohne Zusatz von Shh (weißer Balken) 30 Minuten inkubiert und sodann dem C3H10T1/2-Test unterworfen.
7. Analyse von Shh in einem Rezeptor-Bindungstest. Die relative Wirkungsstärke von löslichem (6) und gebundenem (8) Shh zur "patched"-Bindung wurde an "patched"-transfizierten EBNA-293-Zellen durch FACS-Analyse bestimmt. Reihenverdünnungen der Testproben wurden mit den EBNA-293-Zellen inkubiert, gewaschen und anschließend einer Messung der prozentualen Bindung aufgrund der Fähigkeit der Proben zur Konkurrenz mit Shh-Ig in Bezug auf die Bindung an die Zellen unterworfen. Gebundenes Shh-Ig wurde quantitativ durch die mittlere Fluoreszenz unter Verwendung einer FITC-markierten anti-Ig-Antikörpersonde als Ablesung bestimmt. Die Daten wurden durch nicht-lineare Regression an eine hyperbolische Kurve angepasst.
8. Ausrichtung des N-terminalen Fragments von humanen Hedgehog-Proteinen. Die humanen 20 kDa-Hedgehog-Proteine (Sonic "Shh", Desert "Dhh" und Indian "Ihh") werden bezüglich ihres N-terminalen Cysteins ausgerichtet (Cys-1 in der reifen Sequenz). Bei diesem Cystein handelt es sich normalerweise um Cys-24 im Shh-Vorläuferprotein von voller Länge, und zwar aufgrund der Anwesenheit der natürlichen Signalsequenz, die während der Sekretion entfernt wird. Die tatsächliche Position des Cysteins kann aufgrund von Speziesunterschieden geringfügig variieren.
9. Konsensus-Sequenz des N-terminalen Fragments von humanen Hedgehog-Proteinen.
10. Einfluss der Lipid-Kettenlänge auf die Aktivität von humanem Sonic-Hedgehog. Eine Reihe von Fettsäure-modifizierten Hedgehog-Proteinen wurde erfindungsgemäß synthetisiert. Der Einfluss der Fettsäure-Kettenlänge auf die Hedgehog-Aktivität wurde unter Verwendung des hier beschriebenen C3H10T1/2-alkalische Phosphatase-Induktionstests getestet. Die Ergebnisse sind als Balkendiagramm dargestellt.
11. C3H10T1/2-Test von palmitoyliertem, myristyliertem, lauroyliertem, decanoyliertem und octanoyliertem, humanem Sonic-Hedgehog. Palmitoyliertes, lauroyliertes, decanoyliertes und octanoyliertes, humanes Sonic-Hedgehog, das in 5 mM Na₂HPO₄, pH-Wert 5,5, 150 mM NaCl, 1 % Octylglucosid, 0,5 mM DTT zubereitet war, und myristoyliertes, humanes Sonic-Hedgehog, das in 150 mM NaCl, 0,5 mM DTT zubereitet war, wurden an C3H10T1/2-Zellen zur Messung der Induktion von alkalischer Phosphatase getestet. Die Zahlenwerte geben den Mittelwert von Zweifachbestimmungen an. Dreifach-Reihenverdünnungen von palmitoyliertem (o), myristoyliertem (⦁), lauroyliertem (☐), decanoyliertem (∎), octanoyliertem (Δ) und unmodifiziertem
und x), humanem Sonic-Hedgehog wurden mit den Zellen 5 Tage inkubiert. Die erhaltenen Werte für die alkalische Phosphatase wurden bei 405 nm unter Verwendung des chromogenen Substrats p-Nitrophenylphosphat gemessen. Die palmitoylierten, myristoylierten, lauroylierten und decanoylierten Proteine wurden in einem Experiment mit dem unmodifizierten Protein, das als
dargestellt ist, getestet, während das octanoylierte Protein in einem weiteren Experiment mit dem als (x) dargestellten unmodifizierten Protein getestet wurde. Der Pfeil auf der y-Achse bezeichnet den Hintergrundwert für alkalische Phosphatase in Abwesenheit von zugesetztem Hedgehog-Protein.
12. Allgemeine Strukturen verschiedener, hydrophob modifizierter Formen von Hedgehog. (A) Fettsäureamidderivat, wobei R eine Kohlenwasserstoffkette einer Fettsäure bedeutet; (B) Thiazolidinderivat, wobei R einen Kohlenwasserstoff bedeutet; (C) Aminosäuresubstitution, wobei R eine hydrophobe Aminosäure-Seitenkette bedeutet; (D) Maleinimidderivat, wobei R einen Kohlenwasserstoff bedeutet; (E) SH = freies Thiol am N-terminalen Cystein von Wildtyp-Hedgehog; (F) ein Iodacetamidderivat, wobei R₁ einen Kohlenwasserstoff bedeutet und R₂ entweder H oder einen Kohlenwasserstoff bedeutet; und (G) Thiomorpholinylderivat, wobei R einen Kohlenwasserstoff bedeutet. Für sämtliche Strukturen gilt: HH = Hedgehog.
13. Relative Wirkungsstärke verschiedener hydrophob modifizierter Formen von Hedgehog beim C3H10T1/2-Test. Der EC₅₀-Wert (2 μg/ml) von unmodifiziertem humanem Wildtyp-Sonic-Hedgehog wird als 1 x bezeichnet. Die Wirkungsstärke der übrigen Proteine wird als das Verhältnis des EC₅₀-Werts von Wildtypprotein dividiert durch den EC₅₀-Wert des modifizierten Proteins angegeben. Die Modifikationen liegen am N-Terminus des Proteins vor, sofern nichts anderes angegeben ist.
14. Relative Wirkungsstärke der unmodifizierten, myristoylierten und C1II-Mutante von humanem Sonic-Hedgehog in einem durch Malonat induzierten Ratten-Striatum-Läsionstest. Die Figur zeigt die Verringerung des durch Malonat induzierten Läsionsvolumens, die sich aus der Verabreichung der unmodifizierten, der myristoylierten oder der C1II-Mutante von humanem Sonic-Hedgehog in das Ratten-Striatum ergibt.
15. zeigt die spezifischen Aktivitäten von mit Maleinimid modifizierten und unmodifizierten Hedgehog-Polypeptiden.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung beruht teilweise auf dem Befund, dass humanes Sonic-Hedgehog, das als Konstrukt von voller Länge entweder in Insekten oder in Säugetierzellen exprimiert wird, eine hydrophobe Palmitoylgruppe aufweist, die an das α-Amin des N-terminalen Cysteins angeheftet ist. Dies ist nach Kenntnis der Erfinder das erste Beispiel für ein extrazelluläres signalgebendes Protein, das auf derartige Weise modifiziert ist. Im Gegensatz zu thiolverknüpften Palmitinsäure-Modifikationen, deren Bindung leicht reversibel ist, ist es wahrscheinlich, dass dieser neue, N-verknüpfte Palmitoylrest in Analogie zur Myristinsäure-Modifikation sehr stabil ist.
Als direkte Folge dieser anfänglichen Entdeckung haben die Erfinder festgestellt, dass mit zunehmender hydrophober Natur eines Hedgehog-Proteins die biologische Aktivität des Proteins zunehmen kann. Insbesondere haben die Erfinder festgestellt, dass durch Anheften eines hydrophoben Restes an ein Hegedhog-Protein die Aktivität des Proteins verstärkt werden kann. Die Erfinder haben festgestellt, dass das N-terminale Cystein von biologisch aktiven Hedgehog-Proteinen nicht nur eine zweckmäßige Stelle zum Anheften eines hydrophoben Restes und dadurch zum Modifizieren der physikochemischen Eigenschaften des Proteins bietet, sondern dass Modifikationen des N-terminalen Cysteins auch die Stabilität des Proteins erhöhen können. Ferner verstärkt die Addition eines hydrophoben Restes an einen internen Aminosäurerest an der Oberfläche der Proteinstruktur die Aktivität des Proteins.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung befasst sich mit der Entdeckung, dass zusätzlich zu den Wirkungen, die bei einer Cholesterol-Addition an den C-Terminus von extrazellulären Fragmenten des Proteins zu erkennen sind, mindestens bestimmte der biologischen Aktivitäten der Hedgehog-Genprodukte in unerwarteter Weise durch Derivatisierung des Proteins mit lipophilen Resten an anderen Stellen des Proteins und/oder durch Reste, die von Cholesterol abweichen, verstärkt werden. Bestimmte Aspekte der Erfindung befassen sich mit Präparaten von Hedgehog-Polypeptiden, die an Stellen modifiziert sind, die von den N-terminalen oder C-terminalen Resten der natürlichen, prozessierten Form des Proteins abweichen und/oder die an derartigen terminalen Resten mit lipophilen Resten, bei denen es sich nicht um ein Sterol am C-Terminus oder um eine Fettsäure am N-Terminus handelt, modifiziert sind.
Wie in den PCT-Veröffentlichungen WO-95/18856 und WO-96/17924 beschrieben wird, eignen sich Hedgehog-Polypeptide im allgemeinen für die in vitro- und in vivo-Reparatur und/oder Regulation des funktionellen Verhaltens einer Vielzahl von Zellen, Geweben und Organen und weisen therapeutische Anwendungsmöglichkeiten auf, die in den Bereichen der Neuroprotektion, Neuroregeneration, Verstärkung der neuralen Funktion, Regulierung von Knochen- und Knorpelbildung und -reparatur, Regulation der Spermatogenese, Regulation von Lunge, Leber und anderen Organen, die aus dem Primaten-Darm entstehen, Regulation der hämatopoetischen Funktion und dergl. liegen. Demzufolge umfassen die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung die Verwendung der derivatisierten Hedgehog-Polypeptide für alle derartigen Anwendungsmöglichkeiten sofern Hedgehog-Proteine beteiligt sind. Außerdem können die vorliegenden Verfahren an Zellen durchgeführt werden, die in Kultur (in vitro) bereitgestellt werden, oder an Zellen in einem vollständigen Tier (in vivo).
Gemäß einem Aspekt werden erfindungsgemäß pharmazeutische Präparate bereitgestellt, die als Wirkstoff ein Hedgehog-Polypeptid umfassen, das durch einen oder mehrere lipophile Reste, wie sie hier beschrieben werden, derivatisiert ist.
Die vorliegenden Hedgehog-Behandlungen eignen sich sowohl bei humanen als auch bei tierischen Subjekten. Tierische Subjekte, auf die die Erfindung anwendbar ist, umfassen sowohl Haustiere als auch Viehbestände, die entweder als Hausgenossen oder für gewerbliche Zwecke gehalten werden. Zu Beispielen gehören Hunde, Katzen, Rinder, Pferde, Schafe, Schweine und Ziegen.
Bei den Hedgehog-Proteinen handelt es sich um eine Familie von extrazellulären signalgebenden Proteinen, die verschiedene Aspekte der embryonalen Entwicklung sowohl bei Wirbeltieren als auch bei wirbellosen Tieren regulieren (bezüglich einer Übersicht wird auf 1, 2 verwiesen). Bei dem am besten charakterisierten Hedgehog-Protein handelt es sich um Sonic-Hegedhog (Shh). Es ist beteiligt an der Anterior-Posterior-Musterbildung, der Bildung einer apikalen, ektodermalen Kante, des Hinterdarm-Mesoderms, der Wirbelsäule, der distalen Gliedmaßen, der Rippenentwicklung und der Lungenentwicklung und an der Induktion von ventralen Zelltypen im Rückenmark, Hinterhirn und Vorderhirn (3–8). Während der Mechanismus der Wirkung von Hedgehog-Proteinen nicht vollständig aufgeklärt ist, lassen die neuesten biochemischen und genetischen Daten darauf schließen, dass der Rezeptor für Shh das Produkt des Tumor-Suppressorgens, "patched" (9, 10), ist und dass andere Proteine, "smoothened" (10, 11), Cubitus interruptus (12, 13) und "fused" (14) am Hedgehog-Signalgebungsweg beteiligt sind.
Humanes Shh wird als ein 45 kDa-Vorläuferprotein synthetisiert, das autokatalytisch unter Bildung folgender Bestandteile gespalten wird: (2) ein N-terminales 20 kDa-Fragment, das für sämtliche bekannten Hedgehog-Signalgebungsaktivitäten verantwortlich ist (SEQ ID NOS. 1–4); und (II) ein C-terminales 25 kDa-Fragment, das die Autoprozessierungsaktivität enthält (15–17). Das N-terminale Fragment besteht aus den Aminosäureresten 24–197 der Vorläufersequenz von voller Länge.
Das N-terminale Fragment bleibt durch die Addition eines Cholesterols an seinem C-Terminus membranassoziiert (18, 19). Dieses Cholesterol ist kritisch für die Beschränkung der Gewebelokalisierung des Hedgehog-Signals. Die Addition des Cholesterols wird während der Prozessierungsstufe durch die C-terminale Domäne katalysiert.
I. Definitionen
Nachstehend wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die folgende ausführliche Beschreibung erläutert, wobei die folgenden Definitionen gelten:
"Aminosäure": eine monomere Einheit eines Peptids, Polypeptids oder Proteins. Es gibt 20 Aminosäuren, die in natürlich vorkommenden Peptiden, Polypeptiden und Proteinen auftreten und bei denen es sich durchweg um L-Isomere handelt. Der Ausdruck umfasst auch Analoge der Aminosäuren und D-Isomere der Protein-Aminosäuren und ihrer Analogen.
"Protein": beliebige Polymere, die im wesentlichen aus beliebigen der 20 Aminosäuren bestehen. Obgleich der Ausdruck "Polypeptid" häufig in Bezug auf relativ große Polypeptide verwendet wird und der Ausdruck "Peptid" häufig in Bezug auf kleine Polypeptide verwendet wird, ist die Verwendung dieser Ausdrücke im Stand der Technik überlappend und variabel. Sofern nichts anderes angegeben ist, bezieht sich der hier verwendete Ausdruck "Protein" auf Peptide, Proteine und Polypeptide.
"N-terminales Ende": dieser Ausdruck bezieht sich auf die erste Aminosäure (Aminosäure Nr. 1) der reifen Form eines Proteins.
"N-terminales Cystein": dieser Ausdruck bezieht sich auf den Aminosäurerest (Nr. 1) gemäß der Darstellung in SEQ ID NOS. 1–4. Er bezieht sich ferner auf ein beliebiges Cystein in Position 1 eines beliebigen anderen Proteins oder auf funktionelle Äquivalente dieses Cysteins (vergl. Abschnitt IV).
Der Ausdruck "Abstandshalter"-Sequenz bezieht sich auf eine kurze Sequenz, die so klein wie eine einzelne Aminosäure sein kann, die zwischen einer hydrophob zu modifizierenden Aminosäure (z. B. das N-terminale Cystein oder ein funktionelles Äquivalent davon) und den Rest des Proteins eingeführt werden kann. Ein Abstandshalter dient dazu, eine Trennung zwischen der hydrophoben Modifikation (z. B. dem modifizierten, N-terminalen Cystein) und dem Rest des Proteins zu gewährleisten, um zu verhindern, dass die Modifikation die Proteinfunktion beeinträchtigt, und/oder um es der Modifikation (z. B. dem N-terminalen Cystein zu erleichtern, eine Bindung mit einem Lipid, einer Vesikel oder einem anderen hydrophoben Rest einzugehen. Wenn somit ein Protein an seinem N-terminalen Cystein und an einer Aminosäure an einer anderen Stelle modifiziert ist, so können zwei oder mehr Spacer-Sequenzen vorliegen.
Der Ausdruck "gebundenes" ("tethered") Protein bezieht sich auf ein erfindungsgemäßes, hydrophob modifiziertes Protein.
Der Ausdruck "mehrwertiger Proteinkomplex" bezieht sich auf eine Mehrzahl von Proteinen (d. h. eines oder mehrere). Ein Lipid oder ein anderer hydrophober Rest ist an mindestens eines der Mehrzahl von Proteinen gebunden. Das Lipid oder der andere hydrophobe Rest kann gegebenenfalls in Kontakt mit einer Vesikel stehen. Wenn einem Protein ein Lipid oder ein anderer hydrophober Rest fehlt, so kann das Protein mit einem Protein, das ein Lipid oder einen anderen hydrophoben Rest aufweist, vernetzt oder an dieses gebunden sein. Die einzelnen Proteine können gleich oder verschieden sein und die einzelnen Lipide oder anderen hydrophoben Reste können gleich oder verschieden sein.
Der Ausdruck "Vesikel" bezieht sich auf ein beliebiges Aggregat von lipophilen Molekülen. Die Vesikel kann aus einer biologischen Quelle (z. B. einer Lipid-Doppelschicht, wie eine Zellmembran oder ein von Cholinsäure abgeleitetes Detergenspräparat) oder von einer nicht-biologischen Quelle (z. B. eine nicht-biologische Detergens-Vesikel gemäß der Beschreibung im Abschnitt VI) erhalten werden. Die Gestalt, der Typ und die Konfiguration der Vesikel beschränken den Schutzumfang der Erfindung nicht.
Der Ausdruck "funktionelles Äquivalent" eines Aminosäurerestes (z. B. eines N-terminalen Cysteins) bedeutet folgendes: (i) eine Aminosäure mit ähnlichen reaktiven Eigenschaften, wie sie der Aminosäurerest hat, der durch das funktionelle Äquivalent ersetzt worden ist; (ii) eine Aminosäure eines Liganden eines erfindungsgemäßen Polypeptids, wobei die Aminosäure ähnliche Bindungseigenschaften an einen hydrophoben Rest (z. B. ein Lipid) wie der Aminosäurerest aufweist, der durch das funktionelle Äquivalent ersetzt worden ist; (iii) ein Nichtaminosäure-Molekül mit ähnlichen Bindungseigenschaften an einen hydrophoben Rest (z. B. ein Lipid) wie der Aminosäurerest, der durch das funktionelle Äquivalent ersetzt worden ist.
Der Ausdruck "genetische Fusion" bezieht sich auf eine kolineare, kovalente Verknüpfung von zwei oder mehr Proteinen oder Fragmenten davon über ihre individuellen Peptidgerüste durch eine genetische Expression eines Polynucleotidmoleküls, das für diese Proteine kodiert.
Bei den Ausdrücken "chimäres Protein" oder "Fusionsprotein" handelt es sich um eine Fusion einer ersten Aminosäuresequenz, die für ein Hedgehog-Polypeptid kodiert, mit einer zweiten Aminosäuresequenz, die eine Domäne definiert, die in bezug zu einer beliebigen Domäne des hh-Proteins fremd und nicht im wesentlichen homolog dazu ist. Ein chimäres Protein kann eine fremde Domäne aufweisen, die (obgleich in einem unterschiedlichen Protein) in einem Organismus gefunden wird, der ebenfalls das erste Protein exprimiert, oder es kann sich um eine "Interspezies-", "intergenetische" und eine ähnliche Fusion von Proteinstrukturen handeln, die durch unterschiedliche Arten von Organismen exprimiert werden. Im allgemeinen lässt sich ein Fusionsprotein durch die allgemeine Formel (X)_n-(hh)_m-(Y)_n wiedergeben, wobei hh die Gesamtheit oder einen Teil des Hedgehog-Proteins repräsentiert, X und Y jeweils unabhängig voneinander Aminosäuresequenzen repräsentieren, die nicht natürlicherweise als Polypeptidkette, die an die Hedgehog-Sequenz angrenzt, auftreten, m eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 oder mehr ist und n bei jedem Auftreten unabhängig voneinander 0 oder eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 oder mehr bedeutet (n und m haben vorzugsweise einen Wert von nicht mehr als 5 oder 10).
Der Ausdruck "Mutante" bedeutet eine beliebige Veränderung im genetischen Material eines Organismus, insbesondere eine beliebige Veränderung (z. B. Deletion, Substitution, Addition oder Alteration) in einer Wildtyp-Polynucleotidsequenz oder eine beliebige Veränderung in einem Wildtyp-Protein.
Der Ausdruck "Wildtyp" bedeutet die natürlich auftretende Polynucleotidsequenz eines Exons eines Proteins oder eines Teils davon bzw. eine Proteinsequenz oder einen Teil davon, die normalerweise in vivo existieren.
Der Ausdruck "Standardhybridisierungsbedingungen" bedeutet Salz- und Temperaturbedingungen, die im wesentlichen 0,5 × SSC bis etwa 5 × SSC und 65 °C sowohl für die Hybridisierung als auch für den Waschvorgang entsprechen. Der hier verwendete Ausdruck "Standardhybridisierungsbedingungen" stellt eine Arbeitsdefinition dar und umfasst einen Bereich von Hybridisierungsbedingungen; vergl. auch Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, Abschnitte 6.3.1–6.3.6 (1989).
Der Ausdruck "Expressionskontrollsequenz" bedeutet eine Sequenz von Polynucleotiden, die die Expression von Genen steuert und reguliert, wenn sie mit diesen Genen funktionell verknüpft ist.
Der Ausdruck "funktionell verknüpft" bedeutet eine Polynucleotidsequenz (DNA, RNA), die funktionell mit einer Expressionskontrollsequenz verknüpft ist, wenn die Expressionskontrollsequenz die Transkription und Translation dieser Polynucleotidsequenz steuert und reguliert. Der Ausdruck "operativ verknüpft" beinhaltet, dass ein geeignetes Startsignal (z. B. ATG) vor der zu exprimierenden Polynucleotidsequenz vorliegt und der korrekte Leseraster aufrechterhalten wird, um eine Expression der Polynucleotidsequenz unter der Steuerung der Expressionskontrollsequenz sowie die Bildung des erwünschten Polypeptids, das durch die Polynucleotidsequenz kodiert wird, aufrechtzuerhalten.
Der Ausdruck "Expressionsvektor" bedeutet ein Polynucleotid, z. B. ein DNA-Plasmid oder einen Phagen (unter anderen üblichen Beispielen), das eine Expression mindestens eines Gens ermöglicht, wenn der Expressionsvektor in eine Wirtszelle eingeführt wird. Der Vektor kann zur Replikation in einer Zelle befähigt sein oder nicht.
Der Ausdruck "isoliert" (der austauschbar mit "im wesentlichen rein" verwendet wird) bedeutet bei Anwendung auf eine Nucleinsäure, d. h. Polynucleotidsequenzen, die für Polypeptide kodieren, ein RNA- oder DNA-Polynucleotid, einen Teil eines genomischen Polynucleotids, cDNR oder ein synthetisches Polynucleotid, die aufgrund ihrer Herkunft oder aufgrund von Manipulation folgende Eigenschaften aufweisen: (i) keine Assoziation mit der Gesamtheit eines Polynucleotids, mit dem es in der Natur assoziiert ist (z. B. Vorliegen in einer Wirtszelle als ein Expressionsvektor oder als ein Teil davon); oder (ii) Verknüpfung mit einer Nucleinsäure oder einem anderen chemischen Rest, die von der Nucleinsäure oder dem Rest, mit dem sie in der Natur verknüpft sind, abweichen; oder (iii) kein Vorkommen in der Natur. Unter dem Ausdruck "isoliert" ist ferner eine Polynucleotidsequenz zu verstehen, die folgende Eigenschaften aufweist: (i) in vitro amplifiziert, beispielsweise durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR); (ii) chemisch synthetisiert; (iii) rekombinant durch Klonierung hergestellt; oder (iv) gereinigt, z. B. durch Spaltung und Geltrennung.
Der Ausdruck "im wesentlichen reine Nucleinsäure" bedeutet eine Nucleinsäure, die nicht unmittelbar an eine oder beide der Kodierungssequenzen angrenzt, an die sie normalerweise im natürlich auftretenden Genom des Organismus, aus dem die Nucleinsäure abgeleitet ist, angrenzt. Eine im wesentlichen reine DNA umfasst auch eine rekombinante DNA, die Bestandteil eines Hybridgens ist, das für zusätzliche Hedgehog-Sequenzen kodiert.
Der Ausdruck "isoliert" (mit "im wesentlichen rein" in austauschbarer Weise verwendet) bedeutet bei Anwendung auf Polypeptide ein Polypeptid oder einen Teil davon, die aufgrund ihrer Herkunft oder einer Manipulation folgende Eigenschaften aufweisen: (i) Anwesenheit in einer Wirtszelle als Expressionsprodukt eines Teils eines Expressionsvektors; oder (ii) Verknüpfung mit einem Protein oder einem anderen chemischen Rest, die sich von dem Protein oder dem chemischen Rest, an die sie in der Natur gebunden sind, unterscheiden; oder (iii) fehlendes Auftreten in der Natur, beispielsweise ein Protein, das chemisch manipuliert ist, in dem mindestens ein hydrophober Rest an das Protein angeheftet oder addiert ist, so dass das Protein sich in einer Form befindet, die in der Natur nicht auftritt. Unter "isoliert" ist ferner ein Protein zu verstehen, das folgende Eigenschaften aufweist: (i) chemisch synthetisiert; oder (ii) in einer Wirtszelle exprimiert und von assoziierten und kontaminierenden Proteinen gereinigt. Der Ausdruck bedeutet im allgemeinen ein Polypeptid, das von anderen Proteinen und Nucleinsäuren, mit denen es natürlicherweise vorkommt, getrennt worden ist. Vorzugsweise ist das Polypeptid auch von Substanzen, wie Antikörpern oder Gelmatrices (Polyacrylamid), die zu seiner Reinigung verwendet werden, getrennt.
Der hier verwendete Ausdruck "heterologer Promotor" bedeutet einen Promotor, der nicht von Natur aus mit einem Gen oder einer gereinigten Nucleinsäure assoziiert ist.
Der hier verwendete Ausdruck "homolog" ist synonym mit dem Ausdruck "Identität" und bezieht sich auf die Sequenzähnlichkeit zwischen zwei Polypeptiden, Molekülen oder Nucleinsäuren. Wenn eine Position in jeder der zwei verglichenen Sequenzen durch die gleiche Basen- oder Aminosäure-Monomeruntereinheit besetzt ist (wenn beispielsweise eine Position in jeder der beiden DNA-Moleküle durch Adenin besetzt ist oder eine Position in jedem der beiden Polypeptide durch einen Lysinrest besetzt ist), so sind die jeweiligen Moleküle in dieser Position homolog. Die prozentuale Homologie zwischen zwei Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl von übereinstimmenden oder homologen Positionen, die den beiden Sequenzen gemeinsam sind, dividiert durch die Anzahl der verglichenen Positionen × 100. Wenn beispielsweise 6 von 10 Positionen in zwei Sequenzen übereinstimmen oder homolog sind, so weisen die beiden Sequenzen eine Homologie von 60 % auf. Beispielsweise haben die DNA-Sequenzen CTGACT und CAGGTT eine Homologie von 50 % (3 der insgesamt 6 Positionen stimmen überein). Im allgemeinen wird ein Vergleich vorgenommen, wenn zwei Sequenzen so zueinander ausgerichtet sind, dass sich eine maximale Homologie ergibt. Eine derartige Ausrichtung kann beispielsweise unter Anwendung des Verfahrens von Needleman et al., J. Mol. Biol., Bd. 48 (1970), S. 443–453, erreicht werden, das zweckmäßigerweise durch Computerprogramme, wie das Align-Programm (DNAstar, Inc.) ausgeführt wird. Homologe Sequenzen haben identische oder ähnliche Aminosäurereste gemeinsam, wobei es sich bei ähnlichen Resten um konservative Substitutionen für entsprechende Aminosäurereste in einer ausgerichteten Referenzsequenz oder um "zulässige Punktmutationen" handelt. Diesbezüglich handelt es sich bei einer "konservativen Substitution" eines Restes in einer Referenzsequenz um solche Substitutionen, die physikalisch oder funktionell ähnlich mit den entsprechenden Referenzresten sind, die beispielsweise in Bezug auf Größe, Gestalt, elektrische Ladung, chemische Eigenschaften, einschließlich der Fähigkeit zur Bildung von kovalenten Bindungen oder Wasserstoffbrückenbindungen, oder dergl. ähnlich sind. Besonders bevorzugte konservative Substitutionen sind solche, die die Kriterien für eine "akzeptierte Punktmutation" gemäß Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, Bd. 5, Suppl. 3, Kapitel 22, (1978), S. 354–352, Nat. Biomed. Res. Foundation, Washington, D.C., definiert sind.
Bei den hier in austauschbarer Weise verwendeten Ausdrücken "Hedgehog-Protein" oder "Hedgehog-Polypeptid" handelt es sich um mindestens einen Bereich, der aus der Konsensus-Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 besteht. Der Ausdruck bedeutet auch ein Hedgehog-Polypeptid oder eine funktionelle Variante eines Hedgehog-Polypeptids oder ein Homologes eines Hedgehog-Polypeptids oder eine funktionelle Variante davon mit biologischer Aktivität. Insbesondere umfassen diese Ausdrücke "Präparate von Hedgehog-Proteinen und Peptidylfragmente davon", und zwar sowohl agonistische als auch antagonistische Formen, wie aus dem speziellen Zusammenhang hervorgeht. Der hier verwendete Ausdruck "bioaktives Fragment eines Hedgehog-Proteins" bezieht sich auf ein Fragment des Hedgehog-Polypeptids von voller Länge, wobei das Fragment spezifisch agonistisch oder antagonistisch gegen induktive Ereignisse wirkt, die durch Wildtyp-Hedgehog-Proteine vermittelt werden. Beim bioaktiven Hedgehog-Fragment handelt es sich vorzugsweise um einen löslichen, extrazellulären Bereich eines Hedgehog-Proteins, wobei die Löslichkeit sich auf physiologisch verträgliche Lösungen bezieht. Beispielhafte bioaktive Fragmente sind in den PCT-Veröffentlichungen WO-95/18856 und WO-96/17924 beschrieben. In bevorzugten Ausführungsformen binden die erfindungsgemäßen Hedgehog-Polypeptide an das Patched-Protein.
Der Ausdruck "entspricht" bedeutet in Bezug auf ein spezielles Polypeptid oder auf eine spezielle Nucleinsäuresequenz, dass die Sequenz von Interesse mit der Referenzsequenz, der das Produkt entspricht, identisch oder homolog dazu ist.
Die Ausdrücke "Peptid(e)", "Protein(e)" und "Polypeptid(e)" werden hier in austauschbarer Weise verwendet. Die Ausdrücke "Polynucleotidsequenz" und "Nucleotidsequenz" werden hier ebenfalls in austauschbarer Weise verwendet. Die Ausdrücke "Hedgehog-Fragment" und "N-terminales Hedgehog-Fragment" werden in austauschbarer Weise mit dem Ausdruck "Hedgehog" verwendet.
Ein Hedgehog-Molekül weist eine "biologische Aktivität" auf, wenn es mindestens eine der folgenden Eigenschaften besitzt: (i) das Molekül erfüllt die Hedgehog-Konsensus-Kriterien gemäß der Definition in (SEQ ID NO: 4) und weist die Fähigkeit zur Bindung an seinen Rezeptor "Patched" auf oder kodiert bei der Expression für ein Polypeptid, das diese Eigenschaft besitzt; (ii) das Molekül erfüllt die Hedgehog-Konsensus-Kriterien gemäß der hier gegebenen Definition oder kodiert bei Expression für ein Polypeptid, das diese Eigenschaft aufweist; und (iii) es kann in C3H10T1/2-Zellen eine alkalische Phosphatase-Aktivität induzieren. Im allgemeinen besitzt jedes Protein "biologische Aktivität", wenn das Protein in vitro Wirkungen, Eigenschaften oder Charakteristiken aufweist, von denen der Fachmann erkennt, dass sie repräsentativ oder angemessen für eine vernünftige Vorhersage der in vivo-Effekte des Proteins sind.
Der Ausdruck "hydrophob" bezieht sich auf die Tendenz von chemischen Resten, die nicht-polare Atome aufweisen, zu Wechselwirkungen miteinander anstelle einer Wechselwirkung mit Wasser oder anderen polaren Atomen. Materialien die "hydrophob" sind, sind meistens in Wasser unlöslich. Natürliche Produkte mit hydrophoben Eigenschaften umfassen Lipide, Fettsäuren, Phospholipide, Sphingolipide, Acylglycerine, Wachse, Sterole, Steroide, Terpene, Prostaglandine, Thromboxane, Leukotriene, Isoprenoide, Retenoide, Biotin und hydrophobe Aminosäuren, wie Tryptophan, Phenylalanin, Isoleucin, Leucin, Valin, Methionin, Alanin, Prolin und Tyrosin. Ein chemischer Rest ist ferner hydrophob oder weist hydrophobe Eigenschaften auf, wenn seine physikalischen Eigenschaften durch die Anwesenheit von nicht-polaren Atomen festgelegt werden. Der Ausdruck umfasst lipophile Gruppen.
Der Ausdruck "lipophile Gruppe" bedeutet im Zusammenhang mit der Bindung an ein Polypeptid eine Gruppe mit einem hohen Kohlenwasserstoffanteil, was der Gruppe eine hohe Affinität für Lipidphasen verleiht. Bei einer lipophilen Gruppe kann es sich beispielsweise um eine relativ langkettige Alkyl- oder Cycloalkylgruppe (vorzugsweise n-Alkylgruppe) mit etwa 7 bis 30 Kohlenstoffatomen handeln. Die Alkylgruppe kann in einem "Schwanz" mit einer Hydroxygruppe oder einer primären Amingruppe enden. Zur weiteren Erläuterung umfassen lipophile Moleküle natürlich auftretende und synthetische aromatische und nicht-aromatische Reste, wie Fettsäuren, Ester und Alkohole, weitere Lipidmoleküle, Käfigstrukturen, wie Adamantan und Buckminsterfullerene, sowie aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Perylen, Phenanthren, Anthracen, Naphthalin, Pyren, Chrysen und Naphthacen.
Der Ausdruck "interne Aminosäure" bedeutet beliebige Aminosäuren in einer Peptidsequenz, bei denen es sich weder um die N-terminale Aminosäure noch um die C-terminale Aminosäure handelt.
Der Ausdruck "Oberflächen-Aminosäure" bedeutet beliebige Aminosäuren, die bei Faltung des Proteins in seiner nativen Form einem Lösungsmittel ausgesetzt sind.
Eine "wirksame Menge" eines Hedgehog-Polypeptids bedeutet im Zusammenhang mit den vorliegenden Behandlungsverfahren eine Menge eines Polypeptids in einem Präparat, das bei Anwendung als Teil eines erwünschten Dosierungsschemas beispielsweise eine Veränderung der Geschwindigkeit der Zellproliferation und/oder des Differenzierungszustands einer Zelle und/oder der Überlebensrate einer Zelle gemäß klinisch akzeptablen Standards für die zu behandelnde Störung oder den kosmetischen Zweck herbeiführt.
Bei einem "Patienten" oder "Subjekt", die mit dem vorliegenden Verfahren zu behandeln sind, handelt es sich entweder um einen Menschen oder um ein Tier.
Der Ausdruck "Wachstumszustand" einer Zelle bezieht sich auf die Proliferationsrate der Zelle und den Differenzierungszustand der Zelle.
Sofern nichts anderes angegeben ist, bedient sich die erfindungsgemäße Praxis herkömmlicher Techniken der Zellbiologie, der Zellkultur, der Molekularbiologie, der Mikrobiologie, der rekombinanten DNA-Chemie, der Proteinchemie und der Immunologie, die alle dem Wissen des Fachmanns entsprechen. Derartige Techniken sind in der Literatur beschrieben.
II. Allgemeine Eigenschaften von isolierten Hedgehog-Proteinen
Der Polypeptidteil der Hedgehog-Zusammensetzungen des vorliegenden Verfahrens lässt sich durch eine Vielzahl von Techniken erzeugen, einschließlich Reinigung von natürlich auftretenden Proteinen, auf rekombinante Weise erzeugte Proteine und synthetische chemische Verfahren. Polypeptidformen der Hedgehog-Therapeutika leiten sich vorzugsweise von Wirbeltier-Hedgehog-Proteinen ab und weisen beispielsweise Sequenzen auf, die natürlich auftretenden Hedgehog-Proteinen oder Fragmenten davon aus Wirbeltierorganismen entsprechen. Es ist jedoch darauf hinzuweisen, dass das Hedgehog-Polypeptid einem Hedgehog-Protein (oder einem Fragment davon) entsprechen kann, das in einem beliebigen metazoischen Organismus auftritt.
Bei den in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten isolierten Hedgehog-Proteinen handelt es sich um natürlich auftretende oder rekombinante Proteine der Hedgehog-Familie, die entweder aus Nichtwirbeltier- oder Wirbeltierquellen erhältlich sind (vergl. die nachstehenden Literaturstellen). Mitglieder der Wirbeltier-Hedgehog-Proteinfamilie haben eine Homologie mit Proteinen gemeinsam, die durch das Drosophila-Hedgehog (hh)-Gen kodiert werden (33). Bisher wurden durch kombiniertes Screening von Mäusegenom- und cDNA-Bibliotheken drei Säugetier-hh-Gegenstücke mit den Bezeichnungen Sonic-Hedgehog (Shh), Indian-Hedgehog (Ihh) und Desert-Hedgehog (Dhh) identifiziert, die auch in anderen Säugern, einschließlich des Menschen, sowie in Fischen und Vögeln vorkommen. Zu weiteren Mitgliedern gehören Moonrat-Hedgehog (Mhh) sowie Hühner-Sonic-hh und Zebrafisch-Sonic-hh.
Mäuse- und Hühner-Shh- und Mäuse-Ihh-Gene kodieren für Glycoproteine, die einer Spaltung unterliegen, wodurch sich ein aminoterminales Fragment von etwa 20 kDa (vergl. 8) und ein carboxyterminales Fragment von etwa 25 kDa ergeben. Das besonders bevorzugte 20 kDa-Fragment weist die Konsensus-Sequenz SEQ ID NO: 4 auf und umfasst die Aminosäuresequenzen von SEQ ID NOS: 1–3. Verschiedene andere Fragmente, die den 20 kDa-Rest umfassen, fallen unter den Umfang der derzeit beanspruchten Erfindung. Zu Veröffentlichungen, die diese Sequenzen sowie ihre chemischen und physikalischen Eigenschaften beschreiben, gehören (34–38); PCT-Patentanmeldungen WO-95/23223 (Jessell, Dodd, Roelink und Edlund), WO-95/18856 (Ingham, McMahon und Tabin) und WO-96/17924 (Beachy et al.).
Zu Familienmitgliedern, die sich in den erfindungsgemäßen Verfahren eignen, gehören beliebige der natürlich vorkommenden, nativen Hedgehog-Proteine, einschließlich allele, phylogenetische Gegenstücke oder andere Varianten davon, unabhängig davon, ob es sich um Produkte aus natürlichen Quellen oder chemisch hergestellte Produkte unter Einschluss von Muteinen oder mutanten Proteinen sowie um rekombinante Formen und neue, aktive Mitglieder der Hedgehog-Familie handelt. Zu besonders geeigneten Hedgehog-Polypeptiden gehören SEQ ID NOS: 1–4.
Im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete, isolierte Hedgehog-Polypeptide sind biologisch aktiv. Die Polypeptide umfassen eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie von mindestens 60 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % oder 99 % zu einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NOS: 1–4. Das Polypeptid kann auch eine Aminosäuresequenz umfassen, die im wesentlichen gleich mit einer Aminosäuresequenz in SEQ ID NOS: 1–4 ist. Das Polypeptid weist eine Länge von mindestens 5, 10, 20, 50, 100 oder 150 Aminosäuren auf und umfasst mindestens 5, vorzugsweise mindestens 10, insbesondere mindestens 20 und ganz besonders mindestens 50, 100 oder 150 zusammenhängende Aminosäuren aus SEQ ID NOS: 1–4.
Die bevorzugten erfindungsgemäßen Polypeptide umfassen eine Hedgehog-Polypeptidsequenz sowie eine weitere N-terminale und/oder C-terminale Aminosäuresequenz oder sie können die Gesamtheit oder ein Fragment der Hedgehog-Aminosäuresequenz umfassen. Beim isolierten Hedgehog-Polypeptid kann es sich auch um ein rekombinantes Fusionsprotein handeln, das einen ersten Hedgehog-Bereich und einen zweiten Polypeptid-Bereich umfasst, z. B. einen zweiten Polypeptid-Bereich mit einer Aminosäuresequenz, die mit Hedgehog nicht verwandt ist. Beim zweiten Polypeptid-Bereich kann es sich beispielsweise um eine Histidin-Markierung, ein Maltose-Bindungsprotein, Glutathion-S-transferase, eine DNA-Bindungsdomäne oder eine Polymerase-Aktivierungsdomäne handeln.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide umfassen solche Peptide, die als Folge des Vorliegens von Mehrfachgenen, alternativen Transkriptionsereignissen, alternativen RNA-Spleißereignissen und alternativen translationalen und posttranslationalen Ereignissen entstehen. Das Polypeptid kann vollständig durch synthetische Maßnahmen hergestellt werden oder es kann in Systemen, z. B. gezüchteten Zellen, exprimiert werden, wobei im wesentlichen die gleichen posttranslationalen Modifikationen entstehen, die vorliegen, wenn das Protein in einer nativen Zelle exprimiert wird, oder es kann eine Expression in Systemen erfolgen, die zum Weglassen der posttranslationalen Modifikationen, die bei Expression in einer nativen Zelle vorliegen, führen.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich beim isolierten Hedgehog um ein Hedgehog-Polypeptid mit einer oder mehreren der folgenden Eigenschaften:

(i) es weist eine Sequenzidentität von mindestens 30, 40, 42, 50, 60, 70, 80, 90 oder 95 % mit den Aminosäuresequenzen von SEQ ID NOS: 1–4 auf;
(ii) es weist ein Cystein oder ein funktionelles Äquivalent davon am N-terminalen Ende auf;
(iii) es kann in C3H10T1/2-Zellen die Aktivität von alkalischer Phosphatase induzieren;
(iv) es weist eine gesamte Sequenzidentität von mindestens 50 %, vorzugsweise mindestens 60 % und insbesondere mindestens 70, 80, 90 oder 95 % mit einem Polypeptid von SEQ ID NO: 1–4 auf;
(v) es kann aus natürlichen Quellen, wie Säugetierzellen, isoliert werden;
(vi) es kann mit "Patched" binden oder in Wechselwirkung treten; und
(vii) es ist hydrophob modifiziert (d. h. mindestens ein hydrophober Rest ist an das Polypeptid gebunden), aber an der C-terminalen Aminosäure nicht mit einem Sterol modifiziert.

III. Herstellung von rekombinanten Polypeptiden
Die hier beschriebenen isolierten Polypeptide lassen sich durch beliebige geeignete, aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren herstellen. Derartige Verfahren reichen von direkten Protein-Syntheseverfahren bis zur Konstruktion einer DNA-Sequenz, die für isolierte Polypeptidsequenzen kodiert, und Expression derartiger Sequenzen in einem geeigneten, transformierten Wirt.
In einer Ausführungsform eines rekombinanten Verfahrens wird eine DNA-Sequenz konstruiert, indem man eine DNA-Sequenz, die für ein Wildtyp-Protein von Interesse kodiert, isoliert oder synthetisiert. Gegebenenfalls kann die Sequenz einer Mutagenese durch ortspezifische Mutagenese unterzogen werden, um funktionelle Analoge davon bereitzustellen; vergl. beispielsweise (40) und das US-Patent 4 588585. Ein weiteres Verfahren zur Konstruktion einer DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid von Interesse kodiert, besteht in der chemischen Synthese unter Verwendung eines Oligonucleotid-Synthesegeräts. Derartige Oligonucleotide können vorzugsweise auf der Basis der Aminosäuresequenz des angestrebten Polypeptids konstruiert werden, wobei vorzugsweise solche Codons ausgewählt werden, die in der Wirtszelle, in der das rekombinante Polypeptid von Interesse erzeugt werden soll, begünstigt sind.
Zur Synthese einer isolierten Polynucleotidsequenz, die für ein isoliertes Polypeptid von Interesse kodiert, können übliche Verfahren herangezogen werden. Beispielsweise kann eine vollständige Aminosäuresequenz zur Konstruktion eines rücktranslatierten Gens verwendet werden; vergl. Maniatis et al., a.a.O. Ferner kann ein DNA-Oligomeres, das eine Nucleotidsequenz enthält, die für das spezielle isolierte Polypeptid kodiert, synthetisiert werden. Beispielsweise können mehrere kleine Oligonucleotide, die für Bereiche des angestrebten Polypeptids kodieren, synthetisiert und anschließend verknüpft werden. Die einzelnen Oligonucleotide enthalten typischerweise 5'- oder 3'-Überhänge für einen komplementären Zusammenbau.
Nach dem Zusammenbau (durch Synthese, ortsgerichtete Mutagenese oder ein anderes Verfahren) werden die mutanten DNA-Sequenzen, die für ein spezielles isoliertes Polypeptid von Interesse kodieren, in einen Expressionsvektor inseriert und funktionell mit einer Expressionskontrollsequenz, die sich für die Expression des Proteins in einem gewünschten Wirt eignet, verknüpft. Ein einwandfreier Zusammenbau kann durch Nucleotidsequenzierung, Restriktionskartierung und Expression eines biologisch aktiven Polypeptids in einem geeigneten Wirt bestätigt werden. Wie es aus dem Stand der Technik bekannt ist, muss zur Erzielung hochgradiger Expressionsniveaus eines transfizierten Gens in einem Wirt das Gen operativ mit transkriptionalen und translationalen Expressionskontrollsequenzen verknüpft werden, die im gewählten Expressionswirt funktionell sind.
Die Wahl der Expressionskontrollsequenz und des Expressionsvektors hängt von der Wahl des Wirts ab. Eine Vielzahl von Expressionswirt/Vektor-Kombinationen kann herangezogen werden. Zu geeigneten Expressionsvektoren für eukaryontische Wirte gehören beispielsweise Vektoren, die für Expressionskontrollsequenzen aus SV40, Rinder-Papillomavirus, Adenovirus und Cytomegalovirus umfassen. Zu geeigneten Expressionsvektoren für bakterielle Wirte gehören bekannte bakterielle Plasmide, wie Plasmide aus Escherichia coli, einschließlich pCR1, pBR322, pMB9 und deren Derivate, Plasmide mit einem breiteren Wirtsbereich, wie M13, und filamentöse, einzelsträngige DNA-Phagen. Zu bevorzugten E. coli-Vektoren gehören pL-Vektoren, die den lambda-Phagen-pL-Promotor (US-Patent 4 874 702), pET-Vektoren, die den T7-Polymerase-Promotor enthalten (Studier et al., Methods in Enzymology, Bd. 185 (1990), S. 60–89), und der pSP72-Vektor (Kaelin et al., a.a.O.). Zu geeigneten Expressionsvektoren für Hefezellen gehören beispielsweise 2T und zentromere Plasmide.
Ferner können beliebige Sequenzen einer breiten Vielzahl von Expressionskontrollsequenzen in diesen Vektoren verwendet werden. Zu geeigneten Expressionskontrollsequenzen gehören die Expressionskontrollsequenzen, die mit Strukturgenen der vorstehenden Expressionsvektoren assoziiert sind. Zu Beispielen für geeignete Expressionskontrollsequenzen gehören der frühe und der späte Promotor von SV40 oder Adenovirus, das lac-System, das trp-System, das TAC- oder TRC-System, der Hauptoperator und die Promotorregionen des lambda-Phagen, beispielsweise pL, die Kontrollregionen des fd-Überzugsproteins, der Promotor für 3-Phosphoglyceratkinase oder andere glycolytische Enzyme, die Promotoren von saurer Phosphatase, z. B. Pho5, die Promotoren des Hefe-α-Paarungssystems und andere Sequenzen, von denen bekannt ist, dass sie die Expression von Genen von prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen und deren Viren steuern, sowie verschiedene Kombinationen davon.
Beliebige geeignete Wirte können zur Herstellung der hier beschriebenen isolierten Hedgehog-Polypeptide in großen Mengen verwendet werden, einschließlich Bakterien, Pilze (einschließlich Hefen), Pflanzen, Insekten, Säugetiere oder andere geeignete Tierzellen oder Zelllinien sowie transgene Tiere oder Pflanzen. Insbesondere umfassen diese Wirte bekannte eukaryontische und prokaryontische Wirte, wie Stämme von E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, Pilze, Hefen (z. B. Hansenula), Insektenzellen, wie Spodoptera frugiperda (SF9) und High Five^R (vergl. Beispiel 1), Tierzellen, wie Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO), Mäusezellen wie NS/O-Zellen, Zellen des afrikanischen grünen Affen, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 und BMT 10 und humane Zellen sowie Pflanzenzellen.
Es ist darauf hinzuweisen, dass nicht alle Vektoren und Expressionskontrollsequenzen gleichermaßen zur Expression eines gegebenen, isolierten Polypeptids funktionieren. Ferner funktionieren auch nicht alle Wirte gleichermaßen mit dem gleichen Expressionssystem. Jedoch kann ein Fachmann unter diesen Vektoren, Expressionskontrollsystemen und Wirten ohne übermäßiges Experimentieren eine Auswahl treffen. Beispielsweise muss zur Herstellung eines isolierten Polypeptids von Interesse in einer Tierkultur im Großmaßstab die Kopienzahl des Expressionsvektors gesteuert werden. Amplifizierbare Vektoren sind aus dem Stand der Technik bekannt; vergl. beispielsweise (41) und die US-Patente 4 470 461 und 5 122 464.
Eine derartige funktionelle Verknüpfung einer DNA-Sequenz mit einer Expressionskontrollsequenz umfasst die Bereitstellung eines Translationsstartsignals im korrekten Leseraster strangaufwärts von der DNA-Sequenz. Wenn die zu exprimierende spezielle DNA-Sequenz nicht mit einem Methionin beginnt, endet das Startsignal mit einer zusätzlichen Aminosäure (Methionin), die sich am N-Terminus des Produkts befindet. Wenn ein hydrophober Rest mit dem N-terminalen, methionylhaltigen Protein zu verknüpfen ist, kann das Protein direkt in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verwendet werden. Da aber dennoch das bevorzugte N-terminale Ende des Proteins aus Cystein bestehen soll (oder einem funktionellen Äquivalent davon), muss das Methionin vor der Verwendung entfernt werden. Aus dem Stand der Technik sind Verfahren zur Entfernung von derartigen N-terminalen Methioninen aus Polypeptiden, die damit exprimiert worden sind, bekannt. Beispielsweise ermöglichen bestimmte Wirte und Fermentationsbedingungen eine in vivo-Entfernung von im wesentlichen dem gesamten N-terminalen Methionin. Andere Wirte erfordern die in vitro-Entfernung des N-terminalen Methionins. Derartige in vitro- und in vivo-Verfahren sind aus dem Stand der Technik bekannt.
Die durch einen transformierten Wirt erzeugten Proteine können nach einem beliebigen geeigneten Verfahren gereinigt werden. Zu derartigen üblichen Verfahren gehören die Chromatographie (z. B. Ionenaustausch-, Affinitäts- und Größen-Säulenchromatographie), die Zentrifugation, die differentielle Löslichkeit oder beliebige andere übliche Techniken zur Proteinreinigung. Für die Immunoaffinitätschromatographie (vergl. Beispiel 1) kann ein Protein, z. B. Sonic-Hedgehog, durch Bindung an eine Affinitätssäule isoliert werden, die Antikörper gegen Sonic-Hedgehog oder ein verwandtes Protein, die an einen stationären Träger angeheftet worden sind, umfasst. Alternativ können Affinitätsmarkierungen, wie Hexahistidin, die Maltose-Bindungsdomäne, die Influenza-Überzugsequenz und Glutathion-S-transferase, am Protein angebracht werden, um eine einfache Reinigung durch Passage über eine geeignete Affinitätssäule zu ermöglichen. Isolierte Proteine können auch physikalisch charakterisiert werden, wobei man Techniken, wie Proteolyse, kernmagnetische Resonanz und Röntgenkristallographie, heranzieht.
A. Herstellung von Fragmenten und Analogen
Fragmente eines isolierten Proteins (z. B. Fragmente von SEQ ID NOS: 1–4) können ferner in wirksamer Weise durch rekombinante Verfahren, durch proteolytischen Verdau oder durch chemische Synthese hergestellt werden, wobei man sich bekannter, dem Fachmann geläufiger Verfahren bedient. Bei rekombinanten Verfahren können interne oder terminale Fragmente eines Polypeptids erzeugt werden, indem man ein oder mehr Nucleotide von einem Ende (für ein terminales Fragment) oder von beiden Enden (für ein internes Fragment) einer DNA-Sequenz, die für das isolierte Hedgehog-Polypeptid kodiert, entfernt. Die Expression der mutagenisierten DNA liefert Polypeptidfragmente. Ein Verdau mit "am Ende knabbernden" Endonucleasen kann ebenfalls DNAs erzeugen, die für eine Reihe von Fragmenten kodieren. DNAs, die für Fragmente eines Proteins kodieren, können auch durch willkürliches Abscheren, Restriktionsverdau oder eine Kombination beider Wege erzeugt werden. Proteinfragmente können direkt aus intakten Proteinen erzeugt werden. Peptide können speziell durch proteolytische Enzyme gespalten werden, wozu (ohne Beschränkung hierauf) Plasmin, Thrombin, Trypsin, Chymotrypsin oder Pepsin gehören. Jedes dieser Enzyme ist für den Typ der Peptidbindung, den es angreift, spezifisch. Trypsin katalysiert die Hydrolyse von Peptidbindungen, bei denen die Carbonylgruppe von einer basischen Aminosäure, üblicherweise Arginin oder Lysin, stammt. Pepsin und Chymotrypsin katalysieren die Hydrolyse von Peptidbindungen aus aromatischen Aminosäuren, wie Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin. Alternative Sätze von gespaltenen Proteinfragmenten werden durch Verhinderung der Spaltung an einer Stelle, die für ein proteolytisches Enzym empfindlich ist, erzeugt. Beispielsweise ergibt die Umsetzung der ε-Aminosäuregruppe von Lysin mit Ethyltrifluorthioacetat in einer schwach basischen Lösung blockierte Aminosäurereste, deren benachbarte Peptidbindung nicht mehr gegenüber einer Hydrolyse durch Trypsin empfindlich ist. Proteine lassen sich modifizieren, um Peptidverknüpfungen zu schaffen, die gegenüber proteolytischen Enzymen empfindlich sind. Beispielsweise führt eine Alkylierung von Cysteinresten mit β-Halogenethylaminen zu Peptidverknüpfungen, die durch Trypsin hydrolysiert werden (51). Ferner können chemische Reagenzien, die Peptidketten an speziellen Resten spalten, verwendet werden. Beispielsweise spaltet Cyanogenbromid Peptide an Methioninresten (52). Somit können Proteine mit verschiedenen Kombinationen von Modifikatoren, proteolytischen Enzymen und/oder chemischen Reagenzien in Fragmente von gewünschter Länge ohne Überlappung der Fragmente aufgeteilt oder in überlappende Fragmente einer gewünschten Länge aufgeteilt werden.
Fragmente lassen sich ferner chemisch unter Anwendung von aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren synthetisieren, z. B. mit der Merrifield-Festphasen-Fmoc- oder t-Boc-Chemie (vergl. Merrifield, Recent Progress in Hormone Research, Bd. 23 (1967), S. 451.
Beispiele für herkömmliche Verfahren, die die Herstellung und das Testen von Fragmenten und Analogen ermöglichen, sind nachstehend erläutert. Diese oder analoge Verfahren können zur Herstellung und zum Screening von Fragmenten und Analogen eines isolierten Polypeptids (z. B. Hedgehog) verwendet werden, von dem gezeigt werden kann, dass es biologisch aktiv ist. Ein beispielhaftes Verfahren zum Testen darauf, ob Fragmente und Analoge von Hedgehog biologisch aktiv sind, findet sich in Beispiel 3.
B. Herstellung von veränderten DNA- und Peptidsequenzen: Statistische Verfahren
Aminosäuresequenz-Varianten eines Proteins (z. B. die Varianten SEQ ID NOS: 1–4) lassen sich durch statistische Mutagenese von DNA herstellen, die für das Protein oder einen speziellen Bereich davon kodiert. Zu geeigneten Verfahren gehören die PCR-Mutagenese und die Sättigungsmutagenese. Eine Bibliothek von willkürlichen Aminosäuresequenz-Varianten lässt sich auch durch Synthese eines Satzes von degenerierten Oligonucleotidsequenzen erzeugen. Verfahren zur Erzeugung von Aminosäuresequenz-Varianten eines vorgegebenen Proteins unter Verwendung von veränderten DNAs und Peptiden sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die nachstehenden Beispiele für derartige Verfahren sollen den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung nicht einschränken, sondern dienen lediglich der Erläuterung repräsentativer Techniken. Fachleute erkennen, dass auch andere Verfahren diesbezüglich geeignet sind.
PCR-Mutagenese: Kurz zusammengefasst, Taq-Polymerase (oder eine andere Polymerase) wird zur Einführung von willkürlichen Mutationen in ein kloniertes DNA-Fragment verwendet (42). Die PCR-Bedingungen werden so gewählt, dass die Zuverlässigkeit der DNA-Synthese durch Taq-DNA-Polymere verringert wird, wobei man beispielsweise ein dGTP/dATP-Verhältnis von 5 verwendet und der PCR-Reaktion Mn²⁺ zusetzt. Der Pool von amplifizierten DNA-Fragmenten wird in geeignete Klonierungsvektoren inseriert, um willkürliche mutante Bibliotheken bereitzustellen.
Sättigungsmutagenese: Ein Verfahren ist allgemein in (43) beschrieben. Kurz zusammengefasst, die Technik umfasst die Erzeugung von Mutationen durch chemische Behandlung oder Bestrahlung von einzelsträngiger DNA in vitro und die Synthese eines cDNA-Strangs. Die Mutationsfrequenz wird durch die Schwere der Behandlung moduliert und es lassen sich im wesentlichen sämtliche möglichen Basensubstitutionen erhalten.
Degenerierte Oligonucleotid-Mutagenese: Eine Bibliothek von homologen Peptiden lässt sich aus einem Satz von degenerierten Oligonucleotidsequenzen erhalten. Eine chemische Synthese von degenerierten Sequenzen lässt sich in einem automatischen DNA-Synthesegerät bewerkstelligen. Die synthetischen Gene werden sodann in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert; vergl. beispielsweise (44, 45) und Itakura et al., Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Symposium on Macromolecules, Hrsg. A. G. Walton, Elsevier, Amsterdam (1981), S. 273–289.
C. Herstellung von veränderten DNA- und Peptidsequenzen: Direkte Verfahren
Eine nicht-willkürliche oder gerichtete Mutagenese ergibt spezifische Sequenzen oder Mutationen in spezifischen Bereichen einer Polynucleotidsequenz, die für ein isoliertes Polypeptid kodiert, um Varianten bereitzustellen, die Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von Resten der bekannten Aminosäuresequenz des isolierten Polypeptids umfassen. Die Mutationsstellen können individuell oder in Serie modifiziert werden, beispielsweise durch: (1) zunächst Substituieren mit konservierten Aminosäuren und anschließend mit einer radikaleren Auswahl, je nach den erzielten Ergebnissen; (2) Deletion des Zielrestes; oder (3) Insertion von Resten der gleichen oder einer unterschiedlichen Klasse neben der entsprechenden Stelle oder Kombinationen der Optionen 1–3.
Klar ausgedrückt, handelt es sich bei derartigen ortsgerichteten Verfahren um einen Weg, bei dem ein N-terminales Cystein (oder ein funktionelles Äquivalent) in eine vorgegebene Polypeptidsequenz eingeführt werden kann, um die Haftungsstelle für einen hydrophoben Rest bereitzustellen.
Alanin-Scanning-Mutagenese: Dieses Verfahren lokalisiert solche Reste oder Bereiche eines erwünschten Proteins, bei denen es sich um bevorzugte Stellen für die Mutagenese handelt (46). Beim Alanin-Screening werden ein Rest oder eine Gruppe von Zielresten ausgewählt und durch Alanin ersetzt. Dieses Ersetzen kann die Wechselwirkung der Aminosäure mit benachbarten Aminosäuren und/oder mit der wässrigen oder Membranumgebung beeinflussen. Produkte, die eine funktionelle Empfindlichkeit gegenüber den Substitutionen aufweisen, werden sodann durch Einführung weiterer oder anderer Varianten an den Substitutionsstellen verfeinert.
Oligonucleotidvermittelte Mutagenese: Eine Version dieses Verfahrens zur Herstellung von Substitutions-, Deletions- und Insertionsvarianten von DNA kann herangezogen werden (47). Kurz zusammengefasst, die gewünschte DNA wird verändert, indem man einen Oligonucleotid-Primer, der für eine DNA-Mutation kodiert, mit einer DNA-Matrize hybridisiert, bei der es sich typischerweise um die einzelsträngige Form eines Plasmids oder eines Phagen handelt, die die unveränderte oder Wildtyp-DNA-Sequenzmatrize des angestrebten Proteins (z. B. des Hedgehog-Proteins) enthalten. Nach der Hybridisierung wird eine DNA-Polymerase zur Herstellung des zweiten und komplementären Strangs von DNA der Matrize verwendet, die den Oligonucleotid-Primer enthält und für eine gewählte Veränderung in der gewünschten DNA-Sequenz kodiert. Im allgemeinen werden Oligonucleotide mit einer Länge von mindestens 25 Nucleotiden verwendet. Ein optimales Oligonucleotid weist 12 bis 15 Nucleotide auf, die vollständig komplementär zur Matrize an beiden Seiten der Mutation sind. Dies gewährleistet, dass das Oligonucleotid einwandfrei mit dem einzelsträngigen DNA-Matrizenmolekül hybridisiert.
Kassettenmutagenese: Dieses Verfahren (48) erfordert ein Plasmid oder einen anderen Vektor, der die zu mutierende Proteinuntereinheit-DNA enthält. Das oder die Codons in der Proteinuntereinheit-DNA werden identifiziert und eine einzige Restriktionsendonuclease-Stelle wird auf jeder Seite der identifizierten Mutationsstelle(n) inseriert, wobei man sich des vorstehend beschriebenen Oligonucleotid-gerichteten Mutageneseverfahrens bedient. Das Plasmid wird sodann an diesen Stellen geschnitten, um es zu linearisieren. Ein doppelsträngiges Oligonucleotid, das für die Sequenz der DNA zwischen den Restriktionsstellen kodiert, das aber die angestrebte(n) Mutation(en) enthält, wird unter Anwendung üblicher Verfahren synthetisiert. Die beiden Stränge werden getrennt synthetisiert und sodann miteinander unter Anwendung üblicher Verfahren hybridisiert. Bei diesem doppelsträngigem Oligonucleotid handelt es sich um die "Kassette". Sie weist 3'- und 5'-Enden auf, die mit den Enden des linearisierten Plasmids verträglich sind, so dass es direkt darin ligiert werden kann. Das Plasmid enthält nunmehr die mutierte, angestrebte Proteinuntereinheit-DNA-Sequenz.
Kombinationsmutagenese: In einer Version dieses Verfahrens (Ladner et al., WO-88/06630) werden die Aminosäuresequenzen für eine Gruppe von Homologen oder anderen verwandten Proteinen ausgerichtet, vorzugsweise um die höchstmögliche Homologie zu fördern. Sämtliche Aminosäuren, die an einer gegebenen Position der ausgerichteten Sequenzen auftreten, können zur Schaffung eines degenerierten Satzes von Kombinationssequenzen ausgewählt werden. Die vielgestaltige Bibliothek wird durch Kombinationsmutagenese auf dem Nucleinsäureniveau erzeugt und von einer vielgestaltigen Genbibliothek kodiert. Beispielsweise kann ein Gemisch von synthetischen Oligonucleotiden enzymatisch in die Gensequenz ligiert werden, so dass der degenerierte Satz von möglichen Sequenzen in Form von individuellen Peptiden oder alternativ als ein Satz von Proteinen, die den gesamten Satz von degenerierten Sequenzen enthalten, exprimierbar ist.
D. Andere Varianten von isolierten Polypeptiden
Unter die Erfindung fallen isolierte Moleküle, wozu folgende Produkte gehören: allele Varianten, natürliche Mutanten, induzierte Mutanten und Proteine, die durch DNA kodiert werden, die unter Bedingungen hoher oder geringer Stringenz mit einer Nucleinsäure hybridisiert, die für ein Polypeptid kodiert, z. B. das N-terminale Fragment von Sonic-Hedgehog (SEQ ID NO: 1), und Polypeptide, die spezifisch durch Antiseren gegen Hedgehog-Peptide gebunden werden, insbesondere durch Antiseren gegen ein aktives Zentrum oder die Bindungsstelle von Hedgehog. von sämtlichen hier beschriebenen Varianten wird erwartet, dass sie (i) die biologische Funktion des ursprünglichen Proteins behalten und (ii) die Fähigkeit zur Verknüpfung mit einem hydrophoben Rest (z. B. einem Lipid) behalten.
Die erfindungsgemäßen Verfahren beinhalten auch die Verwendung von Fragmenten, vorzugsweise biologisch aktiven Fragmenten, oder Analogen eines isolierten Peptids, wie Hedgehog. Speziell handelt es sich bei einem biologisch aktiven Fragment oder Analogen um ein Produkt, das eine beliebige in vivo- oder in vitro-Aktivität aufweist, die charakteristisch für das in SEQ ID NOS: 1–4 dargestellte Peptid oder für ein anderes, natürlich auftretendes, isoliertes Hedgehog ist. Insbesondere weist das hydrophob modifizierte Fragment oder Analoge eine Aktivität von mindestens 10 %, vorzugsweise 40 % oder mehr oder insbesondere mindestens 90 % der Aktivität von Sonic-Hedgehog (vergl. Beispiel 3) bei einem beliebigen in vivo- oder in vitro-Test auf.
Analoge können sich von einem natürlich auftretenden, isolierten Protein in der Aminosäuresequenz und/oder auf eine Art und Weise, an der die Sequenz nicht beteiligt ist, unterscheiden. Die besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Polypeptide weisen bevorzugte Nichtsequenz-Modifikationen auf, die eine chemische in vivo- oder in vitro-Derivatisierung (z. B. des N-terminalen Endes) sowie mögliche Veränderungen in Bezug auf Acetylierung, Methylierung, Phosphorylierung, Amidierung, Carboxylierung oder Glycosylierung umfassen.
Weitere Analoge umfassen ein Protein, wie Sonic-Hedgehog oder biologisch aktive Fragmente, deren Sequenzen sich von der Wildtyp-Konsensussequenz (z. B. SEQ ID NO: 4) durch eine oder mehrere konservative Aminosäuresubstitutionen oder durch eine oder mehrere nicht-konservative Aminosäuresubstitutionen oder durch Deletionen oder Insertionen unterscheiden, die die biologische Aktivität des isolierten Proteins nicht beseitigen. Konservative Substitutionen umfassen typischerweise die Substitution einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen Eigenschaften, z. B. Substitutionen innerhalb der folgenden Gruppen: Valin, Alanin und Glycin; Leucin und Isoleucin; Asparaginsäure und Glutaminsäure; Asparagin und Glutamin; Serin und Threonin; Lysin und Arginin; und Phenylalanin und Tyrosin. Die nicht-polaren hydrophoben Aminosäuren umfassen Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin. Die polaren, neutralen Aminosäuren umfassen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin. Die positiv geladenen (basischen) Aminosäuren umfassen Arginin, Lysin und Histidin. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren umfassen Asparaginsäure und Glutaminsäure. Weitere konservative Substitutionen sind für den Fachmann leicht ersichtlich. Beispielsweise kann für die Aminosäure Alanin eine konservative Substitution durch einen der Bestandteile D-Alanin, Glycin, beta-Alanin, L-Cystein und D-Cystein vorgenommen werden. Für Lysin kann ein Ersatz durch einen der Bestandteile D-Lysin, Arginin, D-Arginin, Homoarginin, Methionin, D-Methionin, Ornithin oder D-Ornithin vorgenommen werden.
Im allgemeinen handelt es sich bei Substitutionen, von denen erwartet werden kann, dass sie Veränderungen in den funktionellen Eigenschaften von isolierten Polypeptiden herbeiführen, um solche, bei denen (i) ein polarer Rest, z. B. Serin oder Threonin, durch einen hydrophoben Rest ersetzt ist oder an dessen Stelle tritt, z. B. Leucin, Isoleucin, Phenylalanin oder Alanin; (ii) ein Cysteinrest durch einen anderen Rest ersetzt ist (oder an dessen Stelle tritt) (vergl. Beispiel 10); (iii) ein Rest mit einer elektropositiven Seitenkette, z. B. Lysin, Arginin oder Histidin, durch einen Rest mit einer elektronegativen Seitenkette, wie Glutaminsäure oder Asparaginsäure, ersetzt ist oder an dessen Stelle tritt; oder (iv) ein Rest mit einer voluminösen Seitenkette, z. B. Phenylalanin, durch einen Rest ohne eine derartige Seitenkette, z. B. Glycin, ersetzt ist oder an dessen Stelle tritt.
Bei weiteren Analogen, die im Rahmen der erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, handelt es sich um solche mit Modifikationen, die die Peptidstabilität erhöhen. Derartige Analoge können beispielsweise eine oder mehrere Nichtpeptidbindungen (die die Peptidbindung ersetzen) in der Peptidsequenz enthalten. Ferner gehören dazu Analoge, die Reste umfassen, die von natürlich auftretenden L-Aminosäuren abweichen, z. B. D-Aminosäure oder nicht-natürlich auftretende oder synthetische Aminosäuren, wie beta- oder gamma-Aminosäuren und cyclische Analoge. Der Einbau von D-Aminosäuren anstelle von L-Aminosäuren in das isolierte Hedgehog-Polypeptid kann dessen Beständigkeit gegen Proteasen erhöhen (vergl. US-Patent 5 219 990, a.a.O.).
Der Ausdruck "Fragment", der auf ein isoliertes Hedgehog-Analoges angewandt wird, kann einen kleinen Bestandteil, wie eine einzelne Aminosäure bedeuten, vorausgesetzt, dass die biologische Aktivität erhalten bleibt. Es kann sich um ein Produkt mit mindestens etwa 20 Resten, typischerweise mindestens etwa 40 Resten und vorzugsweise mindestens etwa 60 Resten handeln. Fragmente lassen sich durch dem Fachmann geläufige Verfahren erzeugen. Die Fähigkeit eines als Kandidat in Frage kommenden Fragments, die biologische Aktivität von isoliertem Hedgehog aufzuweisen, kann nach dem Fachmann geläufigen Verfahren, die hier beschrieben werden, bestimmt werden.
V. Herstellung von hydrophoben Derivaten
Die Erfinder haben festgestellt, dass durch Steigerung der gesamten hydrophoben Natur eines Hedgehog-Proteins die biologische Aktivität des Proteins erhöht wird. Die Wirkungsstärke eines signalgebenden Proteins, wie Hedgehog, kann erhöht werden: (a) durch chemische Modifikation, z. B. Addition eines hydrophoben Restes an die Sulfhydrylgruppe und/oder das α-Amin des N-terminalen Cysteins (Beispiele 8 und 9); (b) durch Ersetzen des N-terminalen Cysteins durch eine hydrophobe Aminosäure (Beispiel 10); oder (c) durch Ersetzen des N-terminalen Cysteins durch eine unterschiedliche Aminosäure und durch anschließende chemische Modifikation des substituierten Restes, so dass ein hydrophober Rest an die Substitutionsstelle addiert wird.
Ferner bleibt die biologische Aktivität des Proteins erhalten oder wird verstärkt, indem man eine Modifikation eines Hedgehog-Proteins an einem internen Rest an der Oberfläche des Proteins mit einem hydrophoben Rest vornimmt: (a) durch Ersetzen des internen Restes durch eine hydrophobe Aminosäure; oder (b) durch Ersetzen des internen Restes durch eine unterschiedliche Aminosäure und anschließend durch chemische Modifikation des substituierten Restes, so dass ein hydrophober Rest an der Stelle der Substitution addiert wird (vergl. Beispiel 10).
Ferner bleibt die biologische Aktivität des Proteins erhalten oder wird verstärkt, indem man eine Modifikation eines Hedgehog-Proteins am C-Terminus mit einem hydrophoben Rest vornimmt: (a) durch Ersetzen des C-terminalen Restes durch eine hydrophobe Aminosäure; oder (b) durch Ersetzen des C-terminalen Restes durch eine unterschiedliche Aminosäure und anschließende chemische Modifikation des substituierten Restes, so dass ein hydrophober Rest an der Substitutionsstelle addiert wird.
Es gibt eine Vielzahl von lipophilen Resten, mit denen Hedgehog-Polypeptide derivatisiert werden können. Bei einer lipophilen Gruppe kann es sich beispielsweise um eine relativ langkettige Alkyl- oder Cycloalkylgruppe (vorzugsweise n-Alkylgruppe) mit etwa 7 bis 30 Kohlenstoffatomen handeln. Die Alkylgruppe kann am Schwanz mit einer Hydroxylgruppe oder einem primären Amin enden. Beispielsweise umfassen lipophile Moleküle natürlich auftretende und synthetische aromatische und nicht-aromatische Reste, wie Fettsäuren, Ester und Alkohole, weitere Lipidmoleküle, Käfigstrukturen, wie Adamantan und Buckminsterfullerene, sowie aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Perylen, Phenanthren, Anthracen, Naphthalin, Pyren, Chrysen und Naphthacen.
Besonders geeignet als lipophile Moleküle sind alicyclische Kohlenwasserstoffe, gesättigte und ungesättigte Fettsäuren und andere Lipid- und Phospolipidreste, Wachse, Cholesterol, Isoprenoide, Terpene und polyalicyclische Kohlenwasserstoffe, einschließlich Adamantan und Buckminsterfullerene, Vitamine, Polyethylenglykol oder Oligoethylenglykol, (C₁-C₁₈)-Alkylphosphatdiester, -O-CH₂-CH(OH)-O-(C₁₂-C₁₈)-Alkyl und insbesondere Konjugate mit Pyrenderivaten. Beim lipophilen Rest kann es sich um einen lipophilen Farbstoff, der zur erfindungsgemäßen Verwendung geeignet ist, handeln, beispielsweise (ohne Beschränkung hierauf) Diphenylhexatrien, Nil-Rot, N-Phenyl-1-naphthylamin, Prodan, Laurodan, Pyren, Perylen, Rhodamin, Rhodamin B, Tetramethylrhodamin, Texas-Rot, Sulforhodamin, 1,1'-Didodecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanin-perchlorat, Octadecylrhodamin B und die von der Fa. Molecular Probes Inc, erhältlichen BODIPY-Farbstoffe.
Zu weiteren Beispielen für lipophile Reste gehören aliphatische Gruppen mit Carbonylresten, wie 1- oder 2-Adamantylacetyl, 3-Methyladamant-1-ylacetyl, 3-Methyl-3-brom-1-adamantylacetyl, 1-Decalinacetyl, Campheracetyl, Camphanacetyl, Noradamantylacetyl, Norbornanacetyl, Bicyclo[2.2.2]oct-5-enacetyl, 1-Methoxybicyclo[2.2.2]oct-5-en-2-carbonyl, cis-5-Norbornen-endo-2,3-dicarbonyl, 5-Norbornen-2-ylacetyl,(1R)-(-)-Myrtentanacetyl, 2-Norbornanacetyl, Anti-3-oxo-tricyclo[2.2.1.0<2,6>]heptan-7-carbonyl, Decanoyl, Dodecanoyl, Dodecenoyl, Tetradecadienoyl, Decinoyl oder Dodecinoyl.
Strukturen für beispielhafte hydrophobe Modifikationen sind in 12 dargestellt. Wenn eine geeignete Aminosäure an einer speziellen Position nicht verfügbar ist, kann eine ortsgerichtete Mutagenese dazu herangezogen werden, eine reaktive Aminosäure an diese Stelle zu bringen. Zu reaktiven Aminosäuren gehören Cystein, Lysin, Histidin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Serin, Threonin, Tyrosin, Arginin, Methionin und Tryptophan. Eine Mutagenese kann dazu herangezogen werden, eine reaktive Aminosäure an den N- oder C-Terminus oder an eine interne Position zu bringen.
Wir haben beispielsweise festgestellt, dass es möglich ist, ein N-terminales Cystein eines biologisch aktiven Hedgehog-Proteins chemisch zu modifizieren oder das N-terminale Cystein insgesamt zu beseitigen und doch die biologische Aktivität des Proteins zu erhalten, vorausgesetzt, dass der modifizierte oder substituierte chemische Rest hydrophob ist. Die Erfinder haben festgestellt, dass eine Verstärkung der biologischen Hedgehog-Aktivität grob mit der Hydrophobizität der Modifikation korreliert. Zusätzlich zur Verstärkung der Aktivität des Proteins beseitigt eine Modifikation oder ein Ersatz des N-terminalen Cysteins unerwünschte Vernetzungsreaktionen und/oder Modifikationen des Cysteins, die während der Herstellung, Reinigung, Zubereitung und Lagerung des Proteins erfolgen können. Das Thiol eines N-terminalen Cysteins ist aufgrund seiner Nähe zum α-Amin, das den pKa-Wert des Cysteins verringert und die Protonendissoziation erhöht, und aufgrund der Bildung des reaktiven Thiolations bei neutralem oder saurem pH-Wert sehr reaktiv.
Wir haben nachgewiesen, dass bei einem Signalgebungstest auf Zellbasis ein Ersatz des N-terminalen Cysteins von Hedgehog durch eine hydrophobe Aminosäure zu einem Protein mit einer erhöhten Wirkungsstärke führt. Durch Ersatz des Cysteins beseitigt dieser Weg die Schwierigkeit der Unterdrückung von anderen unerwünschten Modifikationen des Cysteins, die während der Herstellung, Reinigung, Zubereitung und Lagerung des Proteins auftreten können. Die Allgemeingültigkeit dieses Weges wird durch unsere Feststellung gestützt, dass drei verschiedene hydrophobe Aminosäuren, nämlich Phenylalanin, Isoleucin und Methionin, jeweils eine aktivere Form von Hedgehog ergeben. Daher sollte ein Ersatz des Cysteins durch eine beliebige andere hydrophobe Aminosäure zu einem aktiven Protein führen. Da wir ferner eine Korrelation zwischen der Hydrophobizität einer Aminosäure oder der chemischen Modifikation und der Wirkungsstärke des entsprechenden modifizierten Proteins beim C3H10T1/2-Test festgestellt haben (z. B. Phe > Met, langkettige Fettsäuren > kurze Kettenlänge), könnte die Addition von mehr als einer hydrophoben Aminosäure an die Hedgehog-Sequenz in Betracht gezogen werden, was die Wirkungsstärke des Proteins über den Wert hinaus, der mit einer einzelnen Aminosäureaddition erzielt wird, erhöhen könnte. Tatsächlich führt die Addition von zwei aufeinanderfolgenden Isoleucinresten an den N-Terminus von humanem Sonic-Hedgehog zu einer Erhöhung der Wirkungsstärke beim C3H10T1/2-Test, verglichen mit der Mutante, bei der nur ein einziges Isoleucin addiert ist (vergl. Beispiel 10). Somit ist zu erwarten, dass die Addition von hydrophoben Aminosäuren am N- oder C-Terminus eines Hedgehog-Proteins in einer Oberflächenschleife oder in einer gewissen Kombination von Positionen zu einer aktiveren Form des Proteins führt. Bei der Substitutionsaminosäure muss es sich nicht um eine der 20 üblichen Aminosäuren handeln. Es wurde über die Substitution mit nicht-natürlichen Aminosäuren an speziellen Stellen in Proteinen berichtet (78, 79). Dies würde einen Vorteil darstellen, wenn die Aminosäure einen stärker hydrophoben Charakter aufwiese, gegenüber einem proteolytischen Angriff beständiger wäre oder dazu verwendet werden könnte, das Hedgehog-Protein in vivo an einen bestimmten Ort zu dirigieren, der seine Aktivität stärker oder spezifischer machen würde. Nicht-natürliche Aminosäuren können an speziellen Stellen im Protein während der in vitro-Translation eingebaut werden. Es wird über Fortschritte bei der Schaffung von in vivo-Systemen berichtet, die die Herstellung von derartigen modifizierten Proteinen in größerem Maßstab erlauben.
Es ist überraschend, dass ein erfindungsgemäß modifiziertes Hedgehog-Protein seine biologische Aktivität behält. Erstens ist das N-terminale Cystein in sämtlichen bekannten Hedgehog-Proteinsequenzen, einschließlich Fische, Frösche, Insekten, Vögel und Säugetiere, konserviert. Daher lässt sich vernünftigerweise erwarten, dass die freie Sulfhydrylgruppe des N-terminalen Cysteins für die Struktur oder Aktivität des Proteins von Bedeutung ist. Zweitens sind Hedgehog-Proteine, denen ein N-terminales Cystein fehlt, aufgrund einer proteolytischen Spaltung oder einer Mutation zu hydrophilen Aminosäuren (z. B. Asparaginsäure oder Histidin) in einem C3H10T1/2-Test auf Zellbasis, wie er in Beispiel 3 beschrieben ist, inaktiv.
Es gibt zahlreiche Modifikationen des N-terminalen Cysteins, die das Thiol schützen und einen hydrophoben Rest anhängen. Diese Modifikationen werden nachstehend ausführlich erörtert. Der Fachmann kann feststellen, welche Modifikation sich für eine spezielle therapeutische Anwendung am besten eignet. Zu Faktoren, die eine derartige Bestimmung beeinflussen, gehören die Kosten und die Einfachheit der Herstellung, der Reinigung und der Zubereitung, Löslichkeit, Stabilität, Wirkungsstärke, Pharmakodynamik und -kinetik, Sicherheit, Immunogenizität und Gewebezielrichtung.
A. Chemische Modifikationen der primären Aminosäuresequenz
Die chemische Modifikation des N-terminalen Cysteins zum Schutz des Thiols unter gleichzeitiger Aktivierung durch einen hydrophoben Rest kann vom Fachmann auf zahlreichen Wegen vorgenommen werden. Der Sulfhydrylrest mit dem Thiolation als aktiver Spezies stellt die reaktivste funktionelle Gruppe in einem Protein dar. Es gibt zahlreiche Reagenzien, die mit Thiol rascher als mit anderen Gruppen reagieren; vergl. Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking (S. S. Wong, CRC Press, Boca Raton, FL, 1991). Vom Thiol am N-terminalen Cystein, wie es bei allen Hedgehog-Proteinen gefunden wird, ist zu erwarten, dass es reaktiver ist als interne Cysteine innerhalb der Sequenz. Dies ist auf die enge Nachbarschaft zum α-Amin zurückzuführen, was den pKa-Wert des Thiols senkt, woraus sich ein höheres Maß der Protonendissoziation zum reaktiven Thiolation bei neutralem oder saurem pH-Wert ergibt. Ferner ist eine Exposition des Cysteins am N-Terminus der Struktur wahrscheinlicher als bei den übrigen beiden Cysteinen in der Hedgehog-Sequenz, die in die Proteinstruktur eingebettet sind. Wir haben festgestellt, dass das N-terminale Cystein die einzige Aminosäure darstellt, die nach 1-stündiger Umsetzung mit N-Ethylmaleinimid beim pH-Wert 5,5 (vergl. Beispiel 9) und nach einer 18-stündigen Umsetzung mit N-Isopropyliodacetamid beim pH-Wert 7,0 (vergl. Beispiel 9) modifiziert ist. Zu weiteren Beispielen für derartige Verfahren gehören die Umsetzung mit anderen α-Halogenacetylverbindungen, Organoquecksilberverbindungen, Disulfidreagenzien und anderen N-substituierten Maleinimiden. Zahlreiche hydrophobe Derivate dieser aktiven Spezies sind handelsüblich (z. B. Ethyliodacetat (Aldrich, Milwaukee, WI), Phenyldisulfid (Aldrich) und N-Pyrenmaleinimid (Molecular Probes, Eugene, OR)) oder lassen sich leicht synthetisieren (z. B. N-Alkyliodacetamide (84), N-Alkylmaleinimide (85) und Organoquecksilberverbindungen (86)). Wir haben gezeigt, dass das N-terminale Cystein an humanem Sonic-Hedgehog spezifisch mit N-Isopropyliodacetamid modifiziert werden kann und dass das hydrophob modifizierte Protein beim C3H10T1/2-Test 2-fach stärker wirkt als das unmodifizierte Protein (vergl. Beispiel 9). Es ist zu erwarten, dass eine Modifikation von Shh mit einem langkettigen Alkyliodacetamidderivat zu einem modifizierten Protein mit einer noch höheren Verstärkung der Wirkung führt. Derartige N-Alkyliodacetamide lassen sich vom Fachmann leicht unter Verwendung handelsüblicher Ausgangsmaterialien synthetisieren.
Ein weiterer Aspekt bezüglich der Reaktivität eines N-terminalen Cysteins besteht darin, dass es an chemischen Reaktionen teilnehmen kann, die aufgrund seiner 1,2-Aminothiolkonfiguration einzigartig sind. Ein Beispiel ist die Umsetzung mit Thioestergruppen unter Bildung einer N-terminalen Amidgruppe über eine rasche S- nach N-Verschiebung des Thioesters. Diese chemische Reaktion kann synthetische Peptide aneinander kuppeln und kann zur Addition einer oder mehrerer, natürlicher oder nicht-natürlicher Aminosäuren oder anderer hydrophober Gruppen über das in entsprechender Weise aktivierte Peptid herangezogen werden. Ein weiteres Beispiel, das hier dargelegt wird, besteht in der Umsetzung mit Aldehyden unter Bildung des Thiazolidin-Addukts. Zahlreiche hydrophobe Derivate von Thiolestern (z. B. C₂-C₂₄-gesättigte und ungesättigte Fettacyl-Coenzym A-ester (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)), Aldehyde (z. B. Butyraldehyd, n-Decylaldehyd und n-Myristylaldehyd (Aldrich)) und Ketone (z. B. 2-, 3- und 4-Decanon (Aldrich)) sind im Handel erhältlich oder lassen sich leicht synthetisieren (87, 88). Auf ähnliche Weise können Thiomorpholinderivate, die durch in Beispiel 9 beschriebene 1-Brom-2-Butanon-Chemie beispielhaft erläutert sind, aus verschiedenen α-Halogenketon-Ausgangsmaterialien hergestellt werden (88). Da es leicht ist, alternative Wege zur Modifikation des Thiols des N-terminalen Cysteins oder eines beliebigen Cysteins in einem Protein aufzufinden, möchten wir nicht auf die speziellen, hier dargelegten Beispiele festgelegt werden.
Das α-Amin eines Proteins kann im Vergleich zu anderen Aminen in einem Protein bevorzugt modifiziert werden, da sein geringerer pKa-Wert zu größeren Mengen der reaktiven, unprotonierten Form bei neutralem oder saurem pH-Wert führt. Wir haben gezeigt, dass eine Modifikation des N-terminalen Amins mit einer langkettigen Fettsäureamidgruppe unter Aufrechterhaltung einer freien Cystein-Thiolgruppe das Hedgehog-Protein stark um zwei Größenordnungen aktiviert (vergl. Beispiel 8). Daher ist zu erwarten, dass chemische Reaktionen, die bevorzugt auf eine Umsetzung mit dem N-terminalen Amin abgestellt sind, für eine Erhöhung der Wirkungsstärke der Hedgehog-Proteine wertvoll sind. Arylhalogenide, Aldehyde und Ketone, Säureanhydride, Isocyanate, Isothiocyanate, Imidoester, Säurehalogenide, N-Hydroxysuccinimidyl (z. B. Sulfo-NHS-acetat), Nitrophenylester, Acylimidazole und andere aktivierte Ester gehören zu Produkten, von denen bekannt ist, dass sie mit Aminfunktionen reagieren.
Durch Ersatz des N-terminalen Cysteins von Hedgehog mit bestimmten anderen Aminosäuren können andere chemische Verfahren dazu herangezogen werden, einen hydrophoben Rest an den N-Terminus zu addieren. Ein Beispiel besteht darin, ein Serin oder Threonin an den N-Terminus zu bringen, diese Aminosäure unter Bildung eines Aldehyds zu oxidieren und anschließend das Protein mit einem chemischen Rest, der eine 1,2-Aminothiolstruktur aufweist (z. B. einem Cystein), zu konjugieren. Ein zweites Beispiel besteht darin, ein Histidin an den N-Terminus zu bringen, um es mit einer C-terminalen Thiocarbonsäure zu kuppeln.
Chemische Modifikation von anderen Aminosäuren
Es gibt spezielle chemische Verfahren zur Modifikation zahlreicher weiterer Aminosäuren. Daher besteht ein weiterer Weg zur Synthese einer aktiveren Form von Hedgehog darin, einen hydrophoben Rest chemisch an eine Aminosäure im Hedgehog, die sich vom N-terminalen Cystein unterscheidet, zu binden, Wenn eine geeignete Aminosäure nicht an der gewünschten Position verfügbar ist, kann eine ortsgerichtete Mutagenese dazu herangezogen werden, die reaktive Aminosäure an diese Stelle in der Hedgehog-Struktur zu bringen, unabhängig davon, ob es sich um den N- oder C-Terminus oder um eine andere Position handelt. Zu reaktiven Aminosäuren gehören Cystein, Lysin, Histidin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Serin, Threonin, Tyrosin, Arginin, Methionin und Tryptophan. Somit lässt sich das Ziel zur Schaffung einer stärker hydrophoben Form von Hedgehog durch zahlreiche chemische Maßnahmen erreichen. Wir möchten nicht durch eine spezielle chemische Reaktion oder eine Modifikationsstelle festgelegt werden, da unsere Ergebnisse die Allgemeingültigkeit dieser Vorgehensweise stützen.
Das Hedgehog-Polypeptid kann auf zahlreichen Wegen mit dem hydrophoben Rest verknüpft werden, wozu chemische Kupplungsverfahren oder gentechnische Manipulationen gehören.
Beispielsweise gibt es eine große Anzahl von chemischen Vernetzungsmitteln, die dem Fachmann geläufig sind. Erfindungsgemäß handelt es sich bei den bevorzugten Vernetzungsmitteln um heterobifunktionelle Vernetzungsmittel, die zur Verknüpfung des Hedgehog-Polypeptids und des hydrophoben Restes in einer stufenartigen Vorgehensweise verwendet werden können. Heterobifunktionelle Vernetzungsmittel eröffnen die Möglichkeit, spezifischere Kupplungsverfahren zur Konjugation an Proteine zu konzipieren, wodurch das Auftreten von unerwünschten Nebenreaktionen, wie die Bildung von Protein-Homopolymeren verringert wird. Aus dem Stand der Technik ist eine große Vielzahl von heterobifunktionellen Vernetzungsmitteln bekannt. Hierzu gehören: Succinimidyl-4-(N-maleinimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxylat (SMCC), m-Maleinimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS); N-Succinimidyl-(4-iodacetyl)-aminobenzoat (SIAB), Succinimidyl-4-(p-maleinimidophenyl)-butyrat (SMPB), 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid (EDC); 4-Succinimidyloxycarbonyl-α-methyl-α-(2-pyridyldithio)-toluol (SMPT), N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat (SPDP), Succinimidyl-6-[3-(2-pyridyldithio)-propionat]-hexanoat (LC-SPDP). Vernetzungsmittel mit N-Hydroxysuccinimidresten lassen sich als N-Hydroxysulfosuccinimid-Analoge erhalten, die im allgemeinen eine größere Wasserlöslichkeit aufweisen. Ferner lassen sich Vernetzungsmittel mit Disulfidbrücken innerhalb der verknüpfenden Kette anstelle der Alkylderivate herstellen, so dass der Anteil der Linker-Spaltung in vivo verringert wird.
Zusätzlich zu den heterobifunktionellen Vernetzungsmitteln gibt es eine Anzahl von weiteren Vernetzungsmitteln, einschließlich homobifunktionelle und photoreaktive Vernetzungsmittel. Disuccinimidylsuberat (DSS), Bismaleinimidohexan (BMH) und Dimethylpimellinimidat·2 HCl (DMP) sind Beispiele für geeignete homobifunktionelle Vernetzungsmittel, Bis-[β-(4-azidosalicylamido)-ethyl]-disulfid (BASED) und N- Succinimidyl-6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)-hexanoat (SANPAH) sind Beispiele für geeignete photoreaktive Vernetzungsmittel zur erfindungsgemäßen Verwendung. Bezüglich eines neueren Übersichtsartikels über Protein-Kupplungstechniken wird auf Means et al., Bioconjugate Chemistry, Bd. 1 (1990), S. 2–12 (durch Verweis aufgenommen) Bezug genommen.
Eine besonders geeignete Klasse der vorstehend erwähnten heterobifunktionellen Vernetzungsmittel enthält die primäre reaktive Aminogruppe N-Hydroxysuccinimid (NHS) oder das wasserlösliche Analoge davon, nämlich N-Hydroxysulfosuccinimid (Sulfo-NHS). Primäre Amine (Lysin-ε-gruppen) bei alkalischen pH-Werten sind unprotoniert und reagieren durch nucleophilen Angriff auf NHS oder Sulfo-NHS-ester. Diese Umsetzung führt zur Bildung einer Amidbindung und zur Freisetzung von NHS oder Sulfo-NHS als Nebenprodukt.
Eine weitere reaktive Gruppe, die als Teil eines heterobifunktionellen Vernetzungsmittels geeignet ist, ist eine reaktive Thiolgruppe. Zu üblichen reaktiven Thiolgruppen gehören Maleinimide, Halogene und Pyridyldisulfide. Maleinimide reagieren spezifisch mit freien Sulfhydrylgruppen (Cysteinresten) innerhalb von Minuten unter leicht sauren bis neutralen Bedingungen (pH-Wert 6,5–7,5). Halogene (Iodacetylfunktionen) reagieren mit -SH-Gruppen bei physiologischen pH-Werten. Diese beiden reaktiven Gruppen führen zur Bildung von stabilen Thioetherbindungen.
Bei der dritten Komponente des heterobifunktionellen Vernetzungsmittels handelt es sich um einen Abstandshalterarm oder eine Brücke. Die Brücke stellt die Struktur dar, die die beiden reaktiven Enden verbindet. Das offensichtlichste Merkmal der Brücke besteht in der Herbeiführung einer sterischen Hinderung. In einigen Fällen kann eine längere Brücke leichter den zur Verknüpfung von zwei komplizierten Biomolekülen erforderlichen Abstand überbrücken. Beispielsweise weist SMPB eine Spanne von 14,5 Å auf.
Bei der Herstellung von Protein-Protein-Konjugaten unter Verwendung von heterobifunktionellen Reagenzien handelt es sich um ein zweistufiges Verfahren unter Beteiligung einer Aminreaktion und einer Sulfhydrylreaktion. Bei der ersten Stufe, nämlich der Aminreaktion, soll das gewählte Protein ein primäres Amin enthalten. Dabei kann es sich um Lysin-ε-amine oder ein primäres -α-Amin handeln, das am N-Terminus der meisten Proteine auftritt. Dieses Protein soll keine freien Sulfhydrylgruppen enthalten. Sofern beide, miteinander zu konjugierende Proteine freie Sulfhydrylgruppen enthalten, kann ein Protein so modifiziert werden, dass sämtliche Sulfhydrylgruppen blockiert sind, wozu man beispielsweise N-Ethylmaleinimid verwendet (vergl. Partis et al., J. Pro. Chem., Bd. 2 (1983), S. 263, durch Verweis aufgenommen). Das Ellman-Reagenz kann zur Berechnung der Menge der Sulfhydrylgruppen in einem bestimmten Protein verwendet werden (vergl. z. B. Ellman et al., Arch. Biochem. Biophys., Bd. 74 (1958), S. 443, und Riddles et al., Anal. Biochem., Bd. 94 (1979), S. 75, durch Verweis aufgenommen).
Der Reaktionspuffer soll frei von fremden Aminen und Sulfhydrylen sein. Der pH-Wert des Reaktionspuffers soll 7,0–7,5 betragen. Dieser pH-Bereich verhindert die Umsetzung von Maleinimidgruppen mit Aminen, so dass die Maleinimidgruppe für die zweite Umsetzung mit Sulfhydrylen bewahrt wird. Die NHS-Ester enthaltenden Vernetzungsmittel weisen eine begrenzte Wasserlöslichkeit auf. Sie sind in einer möglichst geringen Menge eines organischen Lösungsmittels (DMF oder DMSO) vor Einführung des Vernetzungsmittels in das Reaktionsgemisch zu lösen. Das Vernetzungsmittel/Lösungsmittel bildet eine Emulsion, die den Ablauf der Umsetzung ermöglicht.
Die Sulfo-NHS-esteranalogen sind stärker wasserlöslich und können direkt dem Reaktionspuffer zugesetzt werden. Puffer von hoher Ionenstärke sind zu vermeiden, da sie tendenziell zu einem "Aussalzen" der Sulfo-NHS-ester führen. Um einen Verlust an Reaktivität aufgrund von Hydrolyse zu vermeiden, wird das Vernetzungsmittel dem Reaktionsgemisch unmittelbar nach Bildung der Proteinlösung zugesetzt.
Die Umsetzungen können in konzentrierten Proteinlösungen wirksamer vorgenommen werden. Je stärker alkalisch der pH-Wert des Reaktionsgemisches ist, desto rascher läuft die Reaktion ab. Die Geschwindigkeit der Hydrolyse der NHS- und Sulfo-NHS-ester nimmt auch mit steigendem pH-Wert zu. Höhere Temperaturen erhöhen die Reaktionsgeschwindigkeiten sowohl der Hydrolyse als auch der Acylierung.
Nachdem die Umsetzung beendet ist, wird das erste Protein mit einem reaktiven Sulfhydrylrest aktiviert. Das aktivierte Protein kann aus dem Reaktionsgemisch durch einfache Gelfiltration oder Dialyse isoliert werden. Zur Durchführung der zweiten Stufe der Vernetzung, der Sulfhydrylreaktion, muss die für die Umsetzung mit Maleinimiden, aktivierten Halogenen oder Pyridyldisulfiden gewählte lipophile Gruppe eine freie Sulfhydrylgruppe aufweisen. Alternativ kann ein primäres Amin unter Addition einer Sulfhydrylgruppe modifiziert werden.
In sämtlichen Fällen ist der Puffer zu entgasen, um eine Oxidation von Sulfhydrylgruppen zu vermeiden. EDTA kann zur Chelatbildung etwaiger oxidierender Metalle, die im Puffer enthalten sein können, zugesetzt werden. Puffer sollen frei von jeglichen sulfhydrylhaltigen Verbindungen sein.
Maleinimide reagieren spezifisch mit -SH-Gruppen im leicht sauren bis neutralen pH-Bereich (6,5–7,5). Ein neutraler pH-Wert reicht für Umsetzungen unter Beteiligung von Halogenen und Pyridyldisulfiden aus. Unter diesen Bedingungen reagieren Maleinimide im allgemeinen mit -SH-Gruppen innerhalb von Minuten. Längere Reaktionszeiten sind für Halogene und Pyridyldisulfide erforderlich.
Das bei der Aminreaktionsstufe hergestellte erste sulfhydrylreaktive Protein wird unter geeigneten Pufferbedingungen mit der sulfhydrylhaltigen lipophilen Gruppe vermischt. Die Konjugate können aus dem Reaktionsgemisch durch Verfahren, wie Gelfiltration, oder durch Dialyse isoliert werden.
Nachstehend sind Beispiele für aktivierte lipophile Reste für die Konjugation aufgeführt: N-(1-Pyren)-maleinimid; 2,5-Dimethoxystilben-4'-maleinimid; Eosin-5-maleinimid; Fluorescein-5-maleinimid; N-(4-(6-Dimethylamino-2-benzofuranyl)-phenyl)-maleinimid; Benzophenon-4-maleinimid; 4-Dimethylaminophenylazophenyl-4'-maleinimid (DABMI), Tetramethylrhodamin-5-maleinimid, Tetramethylrhodamin-6-maleinimid, Rhodaminrot^R-C2-maleinimid, N-(5-Aminopentyl)-maleinimid, Trifluoressigsäuresalz, N-(2-Aminoethyl)-maleinimid, Trifluoressigsäuresalz, Oregongrün^R-488-maleinimid, N-(2-((2-(((4-Azido-2,3,5,6-tetrafluor)-benzoyl)-amino)-ethyl)-dithio)-ethyl)-maleinimid (TFPAM-SS1), 2-(1-(3-Dimethylaminopropyl)-indol-3-yl)-3-(indol-3-yl)-maleinimid-(bisindolylmaleinimid; GF 109203X), BODIPY^R FL-N-(2-Aminoethyl)-maleinimid, N-(7-Dimethylamino-4-methylcumarin-3-yl)-maleinimid (DACM), Alexa^R 488 C5-maleinimid, Alexa^R 594C5-maleinimid, Natriumsalz-N-(1-pyren)-maleinimid, 2,5-Dimethoxystilben-4'-maleinimid, Eosin-5-maleinimid, Fluorescein-5-maleinimid, N-(4-(6-Dimethylamino-2-benzofuranyl)-phenyl)-maleinimid, Benzophenon-4-maleinimid, 4-Dimethylaminophenylazophenyl-4'-maleinimid, 1-(2-Maleinimidylethyl)-4-(5-(4-methoxyphenyl)-oxazol-2-yl)-pyridiniummethansulfonat, Tetramethylrhodamin-5-maleinimid, Tetramethylrhodamin-6-maleinimid, Rhodaminrot^R-C2-maleinimid, N-(5-Aminopentyl)-maleinimid, N-(2-Aminoethyl)-maleinimid, N-(2-((2-(((4-Azido-2,3,5,6-tetrafluor)-benzoyl)-amino)-ethyl)-dithio)-ethyl)-maleinimid, 2-(1-(3-Dimethylaminopropyl)-indol-3-yl)-3-(indol-3-yl)-maleinimid, N-(7-Dimethylamino-4-methylcumarin-3-yl)-maleinimid (DACM), 11H-Benzo[a]fluoren, Benzo[a]pyren.
In einer Ausführungsform kann das Hedgehog-Polypeptid unter Verwendung von Pyrenmaleinimid derivatisiert werden, das von der Fa. Molecular Probes (Eugene, Oreg.) erhältlich ist, z. B. N-(1-Pyren)-maleinimid oder 1-Pyrenmethyliodacetat (PMIA-Ester). Wie in 1 dargestellt, wies das von Pyren abgeleitete Hedgehog-Protein ein Aktivitätsprofil auf, das zeigte, dass es nahezu um zwei Größenordnungen aktiver als die unmodifizierte Form des Proteins war.
B. Herstellung von hydrophoben Peptidderivaten
Erfindungsgemäß kann das Protein auch unter Verwendung eines hydrophoben Peptids modifiziert werden. Der hier verwendete Ausdruck "Peptid" umfasst eine Sequenz von mindestens einem Aminosäurerest. Vorzugsweise weist das Peptid eine Länge zwischen 1 Aminosäure und 18–26 Aminosäuren auf, wobei der letztgenannte Bereich die typische Länge eines membranüberspannenden Segments eines Proteins darstellt. Um ein Peptid mit hydrophobem Charakter zu erzeugen, werden die Aminosäuren vorwiegend unter den folgenden hydrophoben Aminosäuren ausgewählt: Phenylalanin, Isoleucin, Leucin, Valin, Methionin, Tryptophan, Alanin, Prolin und Tyrosin. Das hydrophobe Peptid kann auch nicht-natürliche Aminosäureanaloge mit hydrophobem Charakter oder D-Aminosäuren, Peptoidbindungen, eine N-terminale Acetylierung oder andere Merkmale aufweisen, die die Empfindlichkeit des Peptids gegenüber einer Proteolyse verringern. Verfahren zur Substitution mit nicht-natürlichen Aminosäuren an speziellen Stellen in Proteinen sind bekannt (78, 79).
Im allgemeinen wird ein hydrophobes Peptid an verschiedene Stellen eines Proteins angeheftet. Bei einer Stelle kann es sich um den N-terminalen Rest handeln. Alternativ wird das hydrophobe Peptid an die Stelle des N-terminalen Restes gesetzt. Bei einer weiteren Ausführungsform wird ein hydrophobes Peptid an den C-Terminus des Proteins angeheftet. Alternativ kann das hydrophobe Peptid an die Stelle des C-terminalen Restes gesetzt werden. Beim C-Terminus kann es sich um die native C-terminale Aminosäure handeln, es kann sich aber auch um den C-Terminus eines gekürzten Proteins handeln, so dass das hydrophobe Peptid an die endgültige, C-terminale Aminosäure der gekürzten Form, die immer noch als "C-Terminus" bezeichnet wird, angeheftet wird. Ein gekürztes Hedgehog-Protein behält seine Aktivität, wenn bis zu 11 Aminosäuren von der nativen C-terminalen Sequenz deletiert werden. Das hydrophobe Peptid kann auch zwischen dem N-terminalen Rest und dem internen Rest unmittelbar neben dem N-terminalen Rest oder zwischen dem C-terminalen Rest und dem unmittelbar neben dem C-terminalen Rest liegenden Rest oder auch zwischen zwei interne Reste eingeführt werden.
In bestimmten Ausführungsformen handelt es sich beim lipophilen Rest um ein amphipathisches Polypeptid, wie Magainin, Cecropin, Attacin, Melittin, Gramicidin S, alpha-Toxin von Staph. aureus, Alamethicin oder ein synthetisches amphipathisches Polypeptid. Fusogene Überzugsproteine aus viralen Teilchen können ebenfalls eine zweckmäßige Quelle für amphipathische Sequenzen für die vorliegenden Hedgehog-Proteine darstellen.
C. Herstellung von Lipidderivaten

Eine weitere Form eines von der Erfindung umfassten Hedgehog-Proteins ist ein Protein, das mit einer Vielzahl von Lipidresten derivatisiert ist. Im allgemeinen handelt es sich bei einem "Lipid" um ein Mitglied einer heterogenen Klasse von hydrophoben Substanzen, die durch eine variable Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln und großenteils durch ihre Unlöslichkeit in Wasser charakterisiert sind. Die Hauptklasse von Lipiden, die unter die vorliegende Erfindung fallen, sind Fettsäuren und Sterole (z. B. Cholesterol). Erfindungsgemäße derivatisierte Proteine enthalten Fettsäuren, bei denen es sich um cyclische, acyclische (d. h. geradkettige, gesättigte oder ungesättigte) Monocarbonsäuren handelt. Beispielsweise weisen gesättigte Fettsäuren die folgende allgemeine Formel auf: CH₃(CH₂)_nCOOH. In der nachstehenden Tabelle sind Beispiele für einige Fettsäuren aufgeführt, die in zweckmäßiger Weise unter Anwendung herkömmlicher chemischer Verfahren derivatisiert werden können. Tabelle 2 Beispiele für gesättigte und ungesättigte Fettsäuren Gesättigte Säuren: CH₃(CH₂)_nCOOH

Wert von n	Bezeichnung
2	Buttersäure
4	Capronsäure
6	Caprylsäure
8	Caprinsäure
10	Laurinsäure
12	Myristinsäure*
14	Palmitinsäure*
16	Stearinsäure*
18	Arachidinsäure*
20	Behensäure
22	Lignocerinsäure

ungesättigte Säuren

CH₃CH=CHCOOH	Crotonsäure
CH₃(CH₂)₃CH=CH(CH₂)₇COOH	Myristolsäure
CH₃(CH₂)₅CH=CH(CH₂)₇COOH	Palmitolsäure
CH₃(CH₂)₇CH=CH(CH₂)₇COOH	Ölsäure
CH₃(CH₂)₃(CH₂CH=CH)₂(CH₂)₇COOH	Linolsäure
CH₃(CH₂CH=CH)₃(CH₂)₇COOH	Linolensäure
CH₃(CH₂)₃(CH₂CH=CH)₄(CH₂)₃COOH	Arachidonsäure

Der Stern (*) bezeichnet die Fettsäuren, von denen wir feststellten, dass sie in rekombinantem Hedgehog-Protein aus einem löslichen Konstrukt sezerniert wurden.
Zu weiteren Lipiden, die an das Protein angeheftet werden können, gehören verzweigtkettige Fettsäuren und solche der Phospholipidgruppe, wie Phosphatidylinosite (d. h. Phosphatidylinosit-4-monophosphat und Phosphatidylinosit-4,5-biphosphat), Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin und Isoprenoide, wie Farnesyl oder Geranylgruppen.
Wir haben nachgewiesen, dass lipidmodifizierte Hedgehog-Proteine entweder aus einer natürlichen Quelle gereinigt werden können oder durch chemische Modifikation des löslichen, nicht-modifizierten Proteins erhalten werden können. Für ein aus einer natürlichen Quelle gereinigtes Protein haben wir gezeigt, dass dann, wenn humanes Sonic-Hedgehog (Shh) von voller Länge in Insektenzellen exprimiert wurde und membrangebundenes Shh, das aus den mit Detergens behandelten Zellen unter Kombination einer SP-Sepharose-Chromatographie und einer Immunoaffinitätschromatographie gereinigt wurde, das gereinigte Protein an reduzierenden SDS-PAGE-Gelen als eine einzige scharfe Bande mit einer scheinbaren Masse von 20 kDa wanderte (vergl. Beispiel 1). Die löslichen und membrangebundenen Shh-Proteine waren durch Umkehrphasen-HPLC leicht unterscheidbar, wo die gebundenen Formen im Acetonitrilgradienten später eluiert wurden (vergl. Beispiel 1 und 3). Wir zeigten anschließend, dass humanes Sonic-Hedgehog an Zellmembranen in zwei Formen gebunden ist, nämlich eine Form, die ein Cholesterol enthält und daher analog zu den früher für Drosophila-Hedgehog berichteten Daten ist (18), und eine zweite neue Form, die sowohl eine Cholesterol- als auch eine Palmitinsäure-Modifikation enthält. Lösliche und gebundene Formen von Shh wurden durch Elektrospray-Massenspektrometrie unter Verwendung eines Dreifachquadrupol-Massenspektrometers, der mit einer Elektrospray-Ionenquelle ausgerüstet war (Beispiel 1), wie auch durch Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (vergl. Beispiel 1) analysiert. Die Identität des N-terminalen Peptids aus mit Endoproteinase-Lys-C verdautem, gebundenem Shh wurde durch MALDI-PSD-massenspektrometrische Messung an einem MALDI-Flugzeit-Massenspektrometer bestätigt. Die Palmitoylierungsstelle wurde durch eine Kombination von Peptidkartierung und Sequenzanalyse identifiziert. Sie befindet sich am N-Terminus des Proteins (Rest 1 der Sequenz des reifen Proteins in SEQ ID NOS: 1–4). Beide gebundenen Formen waren beim C3H10T1/2-alkalischen Phosphatasetest gleichermaßen aktiv, waren aber interessanterweise beide etwa 30-fach stärker wirksam als lösliches humanes Shh, bei dem keine Bindung vorliegt. Die Lipidmodofikationen beeinflussten nicht in signifikanter weise die scheinbare Bindungsaffinität von Shh für seinen Rezeptor, "Patched" (7).
Wir testeten anschließend die Eignung der derivatisierten Formen zum Testen der relativen Wirkungsstärken von löslichem und gebundenem Shh allein oder in Gegenwart des anti-Hedgehog-neutralisierenden Mab5E1 an C3H10T1/2-Zellen zur Messung der Induktion von alkalischer Phosphatase. Außerdem wurde die relative Wirkungsstärke von löslichem und gebundenem Shh zur Bindung an "Patched" unter Verwendung von "Patched"-transfizierten EBNA-293-Zellen durch FACS-Analyse bestimmt (Beispiel 3).
Für lipidmodifiziertes Hedgehog, das durch chemische Modifikation des löslichen, nicht-modifizierten Proteins erhalten wurde, zeigten wir, dass Palmitinsäure und andere Lipide an lösliches Shh unter Erzeugung von lipidmodifizierten Formen mit einer erhöhten Wirkungsstärke beim C3H10T1/2-Test addiert werden können (Beispiel 8). Wir zeigten (Beispiele 1, 2 und 8), dass das Thiol und α-Amin am N-terminalen Cystein zur Lipid-Derivatisierungsreaktion beiträgt. Ohne Festlegung auf eine bestimmte Theorie wird angenommen, dass die Lipid-Modifikation an Proteinen mit der Bildung eines Thioester-Zwischenprodukts beginnt und der Lipidrest anschließend auf das α-Amin des N-Terminus unter Bildung eines cyclischen Zwischenprodukts übertragen wird. Im allgemeinen kann daher der reaktive Lipidrest in Form von Thioestern von gesättigten oder ungesättigten Carbonsäuren, wie Coenzym A-thioestern vorliegen. Derartige Materialien und ihre Derivate umfassen beispielsweise handelsübliche Coenzym A-Derivate, wie Palmitoleoyl-coenzym A, Arachidoyl-coenzym A, Arachidonoyl-coenzym A, Lauroyl-coenzym A und dergl. Diese Materialien können leicht von der Fa. Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, 1998-Katalog, S. 303–306) bezogen werden.
Der Einfluss von verschiedenen Lipidresten auf die funktionelle Aktivität von Hedgehog-Protein wurde getestet (vergl. Beispiel 8 und 10 und 11). Gleichermaßen lässt sich der Einfluss verschiedener Lipidreste auf die funktionelle Aktivität anderer Proteine, wie sie beispielsweise im vorstehenden Abschnitt III beschrieben wurden, in zweckmäßiger Weise unter Anwendung von dem Fachmann geläufigen Verfahren testen. Beispielsweise lassen sich funktionelle Tests von Gelsolin (50), verschiedener Interferone (Interferon-α, Interferon-β und Interferon-γ), verschiedener Interleukine (z. B. IL-1, -2, -3, -4 und dergl.), der Tumornekrosefaktoren α und β und anderer Wachstumsfaktoren, die erfindungsgemäß lipidmodifiziert sind, unter Anwendung von bekannten Verfahren durchführen.
Obgleich wir chemische Mittel bereitgestellt haben, mit denen eine Fettsäure an das N-terminale Cystein von Hedgehog-Proteinen angeheftet werden kann, ist zu erwarten, dass Lipide an die gleichen oder andere Stellen unter Anwendung enzymatisch katalysierter Reaktionen angeheftet werden können. Die Palmitoylierung von Proteinen wird in vivo durch eine Klasse von Enzymen katalysiert, die als Palmitoyl-CoA:Protein-S-palmitoyltransferasen bekannt sind. Unter Verwendung von gereinigten Enzymen wurde eine in vitro-Acylierung von Proteinsubstraten dargelegt (80, 81). Die Substratspezifitäten der Palmitoyltransferase-Enzyme sind nicht gut definiert; eine Analyse von Palmitoylierungsstellen von zellulären und viralen Proteinen hat nur wenig Bedeutung bezüglich der Konsensus-Sequenz, die den modifizierten Cysteinrest umgibt, lässt aber auf die gemeinsame Anwesenheit eines Lysin- oder Argininrestes innerhalb von zwei Aminosäuren, nämlich Cystein und großen, hydrophoben Aminosäuren in der Nähe des Cysteins schließen. Die aminoterminale Sequenz von Shh CGPGRGFG passt möglicherweise zu dieser Konsensus-Sequenz und kann als Erkennungsstelle für die Palmitoylierung dienen.
Als Alternative kann eine Myristoylierung des Aminoterminus von Hedgehog-Proteinen durchgeführt werden, indem man eine N-Myristoyl-transferase (NMT) verwendet, von denen eine Anzahl sowohl in Säugetieren (82) als auch in Hefe (83) gut charakterisiert worden ist. Eine Erkennungsstelle für N-Myristoyl-transferase kann gentechnisch in die N-terminale Hedgehog-Sequenz eingeführt werden, um die Erkennung durch das Enzym zu erleichtern. Beide Strategien erfordern die Verwendung von Fettsäureacyl-coenzym A-derivaten als Substraten, wie sie für die nicht-enzymatische Fettsäureacylierung von humanem Sonic-Hedgehog gemäß Beispiel 8 verwendet werden. Alternativ kann ein Protein mit einer gentechnisch konstruierten Erkennungssequenz während der Expression in einer geeigneten Zelllinie myristoyliert werden. Ein weiteres Verfahren zum Modifizieren eines Proteins, wie Hedgehog, mit einem hydrophoben Rest besteht in der Erzeugung einer Erkennungsstelle für die Addition einer Isoprenoid-Gruppe am C-Terminus des Proteins. Die Erkennungsstelle für die Addition von Farnesyl und Geranyl-geranyl ist bekannt und das Protein kann während der Expression in einer eukaryontischen Zelle modifiziert werden (Gelb et al., Cur. Opin. Chem. Biol., Bd. 2 (1998), S. 40–48).
VI. Multimere Proteinkomplexe
Die hier beschriebenen modifizierten Hedgehog-Proteine eignen sich besonders zur Bildung von multimeren Proteinkomplexen. Zu erfindungsgemäßen multimeren Proteinkomplexen gehören Proteine, die gegebenenfalls über ihren hydrophoben Rest (z. B. ein Lipid) an eine Vesikel gebunden sind. Bei der Vesikel kann es sich um eine natürlich vorkommende biologische Membran, die von natürlichem Material gereinigt worden ist, handeln, oder die Vesikel kann auf synthetischem Wege konstruiert werden. Bei bevorzugten Vesikeln handelt es sich im wesentlichen um sphärische Strukturen, die aus amphiphilen Produkten, z. B. Tensiden oder Phospholipiden, hergestellt worden sind. Die Lipide dieser sphärischen Vesikel sind im allgemeinen in Form von Lipiden mit einer oder mehreren Strukturschichten organisiert, z. B. in Form von multilamellaren Vesikeln (mehrfache, zwiebelartige Schalen von Lipid-Doppelschichten, die zwischen den Doppelschichten ein wässriges Volumen einschließen) oder Mizellen.
Insbesondere handelt es sich bei Liposomen um kleine, sphärische Vesikel, die primär aus verschiedenen Lipiden und Phospholipiden und sekundär aus lipophilen Komponenten zusammengesetzt sind. Diese Komponenten sind normalerweise in einer Doppelschichtformation angeordnet, ähnlich der Lipidanordnung von biologischen Membranen.
Typischerweise steht das polare Ende eines Lipidbestandteils oder eines lipidartigen Moleküls in Kontakt mit der umgebenden Lösung, üblicherweise einer wässrigen Lösung, während das nicht-polare, hydrophobe Ende des Lipids oder lipidartigen Moleküls in Kontakt mit dem nicht-polaren, hydrophoben Ende eines weiteren Lipids oder lipidartigen Moleküls steht. Die sich ergebende Doppelschichtmembran (d. h. Vesikel) ist selektiv für Moleküle einer bestimmten Größe, hydrophoben Beschaffenheit, Gestalt und Nettoladung durchlässig. Die meisten Vesikel sind von Lipidnatur oder lipidartiger Natur, obgleich auch alternative Liposomen-Doppelschichtzubereitungen, die ein Tensid mit einem Lipid oder einem Cholesterol umfassen, existieren.
Liposomen-Vesikel können insofern besonders bevorzugt sein, als sie zahlreiche therapeutische, diagnostische, industrielle und gewerbliche Anwendungen finden. Sie werden zur Abgabe von Molekülen verwendet, die nicht leicht in Wasser löslich sind, oder wenn eine zeitlich abgestimmte Freisetzung angestrebt wird. Aufgrund ihrer selektiven Permeabilität gegenüber zahlreichen chemischen Verbindungen eignen sich Liposomen als Abgabeträger für Arzneistoffe und biologische Materialien. Somit lassen sich lipidderivatisierte Proteine, wie Hedgehog, als Multimere gestalten, indem man sie der Lipiddoppelschicht von Liposomen-Vesikeln einverleibt. Beim Erreichen der Zielstelle können die Liposomen abgebaut werden (beispielsweise durch Enzyme im Magendarmtrakt) oder sie können mit Membranen von Zellen fusionieren.
Es sind verschiedene Verfahren zur Herstellung von Vesikeln, z. B. Liposomen, bekannt. Die Herstellung von Phospholipid-Vesikeln ist bekannt (53). Bezüglich einer allgemeinen Übersicht über herkömmlicherweise verwendete Verfahren wird auf (54) verwiesen. Darunter sind folgende Verfahren besonders gebräuchlich: (1) Ultraschallbehandlung einer Lösung mit einem Gehalt an Lipiden, wonach sich gelegentlich eine Verdampfung/Lyophilisation und Rehydratisierung anschließen (vergl. z. B. Stryer, Biochemistry, Freeman & Co., New York, (1988), S. 290–291; und (55)); (2) Homogenisierung einer Lipidlösung, gelegentlich bei hohem Druck oder unter hoher Scherkraft (vergl. z. B. US-Patent 4 743 449, Ausgabetag 10. Mai 1988, und US-Patent 4 753 788, Ausgabetag 28. Juni 1988); (3) Hydratisierung und gelegentlich Ultraschallbehandlung eines getrockneten Films von vesikelbildenden Lipiden, wobei der Lipidfilm durch Eindampfen einer Lösung von Lipiden in einem organischen Lösungsmittel hergestellt wird (vergl. z. B. US-Patent 4 452 747, Ausgabetag 5. Juni 1984, US-Patent 4 895 719, Ausgabetag 23. Januar 1990, und US-Patent 4 946 787, Ausgabetag 7. August 1990); (4) Lyophilisierung unter Eindampfung und Rehydratisierung (vergl. z. B. US-Patent 4 897 355, Ausgabetag 30. Januar 1990, EP-267 050, veröffentlicht am 5. November 1988, US-Patent 4 776 991, Ausgabetag 11. Oktober 1988, EP-172 007, veröffentlicht am 19. Februar 1986, und australische Patentanmeldung AU-A-48713/85, veröffentlicht am 24. April 1986); (5) Lösungsmittelinjektion oder -infusion einer Lipidlösung in ein wässriges Medium oder umgekehrt (vergl. z. B. (56); US-Patent 4 921 757, Ausgabetag 1. Mai 1990, US-Patent 4 781871, Ausgabetag 1. November 1988, WO-87/02396, veröffentlicht am 24. März 1988, und US-Patent 4 895 452, Ausgabetag 23. Januar 1990); (6) Sprühtrocknung (vergl. z. B. australische Patentanmeldung AU-A-48713/85, veröffentlicht am 24. April 1986, und US-Patent 4 830 858, Ausgabetag 16. Mai 1989); (7) Filtration (vergl. z. B. WO-85/01161), (8) Umkehrphaseneindampfung (vergl. z. B. (57)); und (9) Kombinationen der vorstehenden Verfahren (vergl. z. B. (58) und (59)).
Zu bevorzugten Lipiden und lipidartigen Bestandteilen, die sich zur Herstellung von Vesikeln eignen, gehören Phospholipide, ein Gemisch von Phospholipiden, polaren Lipiden, neutralen Lipiden, Fettsäuren und ihren Derivaten.
Ein bevorzugtes Lipid ist so beschaffen, dass es bei alleiniger Dispersion in Wasser bei einer Temperatur über der Lipid-Übergangstemperatur in einer Lipid-Emulsionsphase vorliegt. Bei bestimmten Ausführungsformen handelt es sich beim Lipid um eine einzelne aliphatische Kette mit mehr als etwa 12 Kohlenstoffatomen, die entweder gesättigt oder ungesättigt sein kann oder auf andere Weise substituiert sein kann. Zu geeigneten Lipiden gehören die Ester-, Alkohol- und Säureformen der folgenden Fettsäuren: Stearat, Ölsäure, Linolsäure, Arachidat, Arachidonsäure und andere einzelkettige aliphatische Säuren. Zu weiteren Kandidaten gehören die Ester-, Alkohol- und Säureformen der Retinole, insbesondere Retinol und Retinoesäure. Zu weiteren bevorzugten Lipiden gehören Phosphatidylcholin (PC), Phosphatidylglycerin (PG) und deren Derivate, die synthetisch erzeugt oder aus einer Vielzahl natürlicher Quellen abgeleitet werden.
Bei bestimmen Ausführungsformen kann die Vesikel sterisch durch Einverleibung von Polyethylenglykol (PEG) oder durch PEG-Kopfgruppen eines synthetischen Phospholipids (PEG konjugiert an Distearoyl-Phosphatidylethanolamin (DSPE) stabilisiert sein; vergl. z. B. (61)). Bevorzugte Tenside sind solche mit guter Mischbarkeit, z. B. Tween^R, Triton^R, Natriumdodecylsulfat (SDS), Natriumlaurylsulfat oder Natriumoctylglycosid.
Bevorzugte Tenside bilden bei Zugabe zu wässrigen Lösungen oberhalb der Phasenübergangstemperatur des Tensids Mizellen. Die Tenside können aus einer oder mehreren aliphatischen Ketten zusammengesetzt sein. Diese aliphatischen Ketten können gesättigt, ungesättigt oder anderweitig substituiert sein, z. B. durch Ethoxylierung. Typischerweise enthält die aliphatische Kette mehr als etwa 12 Kohlenstoffatome. Nachstehend sind weitere geeignete Tenside aufgeführt: Lauryl-, Myristyl-, Linoleyl- oder Stearylsulfobetain; Lauryl-, Myristyl-, Linoleyl- oder Stearylsarcosin; Linoleyl-, Myristyl- oder Cetylbetain; Lauroamidopropyl-, Cocamidopropyl-, Linolamidopropyl-, Myristamidopropyl-, Palmidopropyl- oder Isostearamidopropylbetain (z. B. Lauroamidopropyl); Myristamidopropyl-, Palmidopropyl- oder Isostearamidopropyldimethylamin; Natriummethylcocoyl- oder Dinatriummethyloleyltaurat; und die MONAQUAT-Reihe (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.); vergl. auch Beispiel 4.
Zu bevorzugten Sterolen und Sterolestern, die sich zur Verwendung bei der Herstellung von multimeren Proteinkomplexen eignen, gehören Cholesterol, Cholestanol, Cholesterolsulfat und andere Cholesterol-Analoge und Derivate. Die Tatsache, dass eine Vesikel zahlreiche unterschiedliche Lipide und Tenside umfassen kann, ermöglicht eine hohe Flexibilität bei der Konstruktion eines gebundenen Protein-Vesikel-Komplexes mit erwünschten Eigenschaften. Beispielsweise kann man Vesikel herstellen, die eine unterschiedliche Anzahl von Proteinen binden, indem man die Lipidzusammensetzung der Ausgangsmaterialien variiert, um größere Vesikel zu schaffen, oder indem man den prozentualen Anteil der Phosphatidylinosit-lipide in der Vesikel erhöht.
VII: Anwendungsmöglichkeiten
Im allgemeinen eignen sich die hier beschriebenen modifizierten Proteine zur Behandlung der gleichen medizinischen Zustände, die mit den nicht-modifizierten Formen der Hedgehog-Proteine behandelt werden können. Jedoch bieten die hier beschriebenen, hydrophob modifizierten Proteine mehrere erhebliche Verbesserungen gegenüber den nicht-modifizierten Formen. Erstens ermöglicht die erhöhte Wirkungsstärke eine Behandlung mit geringeren Proteinmengen und über kürzere Zeiträume. Dies ist sowohl bei systemischen als auch bei ZNS-Anwendungen von Bedeutung. Zweitens ermöglicht der Ersatz des N-terminalen Cysteins durch eine chemisch weniger reaktive Aminosäure eine leichtere Herstellung, Zubereitung und Lagerung eines Proteins für die klinische Verwendung. Drittens werden die pharmakodynamischen Eigenschaften eines Proteins durch eine hydrophobe Modifikation verändert, was es ermöglicht, die Proteine in der Nähe der Verabreichungsstelle zu lokalisieren, wodurch ihre Sicherheit unter Minimierung der systemischen Belastung erhöht wird und ihre Wirksamkeit durch Erhöhung der lokalen Konzentration gesteigert wird. Die erfindungsgemäßen Proteine eignen sich auch in diagnostischen Zusammensetzungen und Verfahren zum Nachweis ihrer entsprechenden Rezeptoren.
Als ein Beispiel für den ersten Sachverhalt wurde festgestellt, dass die Halbwertszeit von Hedgehog nach systemischer Anwendung sehr gering ist und dass mehrfache Injektionen erforderlich sind, um eine robuste Reaktion auf das Protein zu erreichen. Die höhere Wirkungsstärke der modifizierten Formen und die Möglichkeit der Zubereitung in Liposomen bietet ein Mittel, eine Reaktion mit weniger Behandlungen zu erreichen. Für ZNS-Anwendungen bietet die höhere Wirkungsstärke ein Mittel, eine angemessene Proteinmenge in den kleinen Volumina, die für eine direkte Injektion für das ZNS erforderlich sind, zuzuführen.
Die Bedeutung des zweiten Sachverhalts wird durch die Tatsache erläutert, dass wir festgestellt haben, dass das N-terminale Cystein von Hedgehog hochgradig gegenüber einem chemischen Angriff empfindlich ist, entweder unter Bildung von anderen chemischen Addukten oder unter oxidativer Dimerisierung mit einem anderen Hedgehog-Protein. Um dies zu verhindern, werden während der Reinigung spezielle Puffer und Verfahren angewendet und Dithiothreit wird in der endgültigen Zubereitung eingesetzt. Diese Vorsichtsmaßnahmen erfordern eine sorgfältige Bewertung der Einflüsse des Zubereitungspuffers in Tiermodellen.
Ein Beispiel für den dritten Sachverhalt besteht darin, dass der Bereich, in dem das Protein von der Verabreichungsstelle weg diffundiert, um so begrenzter ist, je höher die lokale Konzentration ist. Diese höhere lokale Konzentration kann daher spezifischere klinische Reaktionen während der Behandlung von neurologischen Störungen nach einer direkten Injektion in den erwünschten Bereich des Gehirns oder des Rückenmarks ermöglichen.
Gleichermaßen können die modifizierten Proteine lokal verabreicht werden, und zwar an den Ort von Knochenbrüchen, um die Heilung der Frakturen zu unterstützen, in die Gonaden, um Fertilitätsstörungen zu behandeln, intraokular, um Augenstörungen zu behandeln, und unter die Haut, um dermatologische Zustände zu behandeln und um das lokale Haarwachstum zu stimulieren. Eine Lokalisierung der hydrophob modifizierten Proteine an der verabreichungsstelle verringert daher eine mögliche unerwünschte systemische Belastung anderer Gewebe und Organe.
Für die therapeutische Anwendung werden die erfindungsgemäßen, hydrophob modifizierten Proteine in die Form von pharmazeutisch verträglichen, sterilen, isotonen Zubereitungen gebracht und gegebenenfalls durch auf dem einschlägigen Gebiet bekannte, übliche Mittel verabreicht. Die Zubereitung ist vorzugsweise flüssig oder kann als lyophilisiertes Pulver vorliegen. Es kommt in Betracht, dass beispielsweise eine therapeutische Verabreichung eines multimeren Proteinkomplexes Liposomen umfasst, denen die hier beschriebenen derivatisierten Proteine einverleibt sind.
Für den Fachmann ist es ersichtlich, dass die speziellen Bedingungen in Bezug auf Verabreichung, Dosierung und klinische Anwendungen eines erfindungsgemäßen, hydrophob modifizierten Proteins je nach dem speziellen Protein und dessen biologischer Aktivität variieren.
Als ein Beispiel für die therapeutische Anwendung der erfindungsgemäßen Proteine lassen sich Hedgehog-Proteine, die in therapeutischer Weise hydrophob modifiziert sind, an Patienten verabreichen, die an einer Vielzahl von neurologischen Zuständen leiden. Die Fähigkeit von Hedgehog-Protein zur Regulierung der neuronalen Differenzierung während der Entwicklung des Nervensystems und vermutlich auch im erwachsenen Zustand zeigt, dass von hydrophob modifiziertem Hedgehog in vernünftiger Weise erwartet werden kann, dass es die Kontrolle von erwachsenen Neuronen in Bezug auf Aufrechterhaltung, funktionelles Verhalten und Alterung von normalen Zellen; Reparatur- und Regenerationsvorgänge in läsionierten Zellen; und Verhinderung des Abbaus und des vorzeitigen Todes, der sich aus einem Differenzierungsverlust bei bestimmten pathologischen Zuständen ergibt, erleichtert. In Anbetracht dieser Tatsache können die vorliegenden, hydrophob modifizierten Hedgehog-Zusammensetzungen bei Behandlung durch lokale Infusion die Schwere von neurologischen Zuständen, die sich aufgrund folgender Tatsachen ergeben, verhindern und/oder verringern: (i) akute, subakute oder chronische Schädigung des Nervensystems, einschließlich einer traumatischen Schädigung, chemischen Schädigung, Gefäßschädigung und Defiziten (z. B. Ischämie nach Schlaganfall), zusammen mit infektiösen und tumorinduzierten Schädigungen; (ii) Alterung des Nervensystems, einschließlich Alzheimer-Krankheit; (iii) chronische neurodegenerative Krankheiten des Nervensystems, einschließlich Morbus Parkinson, Chorea Huntington, amyotrophe Lateralsklerose und dergl.; und (iv) chronische immunologische Krankheiten des Nervensystems, einschließlich multipler Sklerose. Das hydrophob modifizierte Protein kann auch in die zerebrospinale Flüssigkeit injiziert werden, um auf Mangelzustände von Hirnzellen einzuwirken, oder je nach Bedarf in das Lymphsystem oder in den Blutkreislauf, um auf spezielle Störungen von Geweben oder des Organsystems einzuwirken.
Erfindungsgemäße Hedgehog-Zusammensetzungen können beispielsweise zur Rettung verschiedener Neuronen vor einem läsionsinduzierten Tod sowie zur Reprojektionsführung dieser Neuronen nach einer derartigen Schädigung verwendet werden. Eine derartige Schädigung kann Zuständen zugeschrieben werden, die (ohne Einschränkung hierauf) ZNS-Traumainfarkte, Infektionen, Stoffwechselkrankheiten, Ernährungsmangelzustände und toxische Mittel (z. B. Behandlung mit Cisplatin) einschließen. Bestimmte Hedgehog-Proteine bewirken, dass neoplastische oder hyperplastische, transformierte Zellen entweder postmitotisch oder apoptotisch werden. Derartige Zusammensetzungen können daher beispielsweise bei der Behandlung von malignen Gliomen, Medulloblastomen und neuroektodermalen Tumoren verwendet werden.
Die Proteine können auch mit nachweisbaren Markern, wie fluoroskopisch oder radiographisch undurchsichtigen Substanzen verknüpft werden und einem Subjekt verabreicht werden, um eine Abbildung von Geweben, die Hedgehog-Rezeptoren exprimieren, zu ermöglichen. Die Proteine können auch an Substanzen, wie Meerrettich-peroxidase, gebunden werden, die als immunozytochemische Färbemittel verwendet werden, um Bereiche von Hedgehog-Liganden-positiven Zellen an histologischen Schnitten sichtbar zu machen. Erfindungsgemäße, hydrophob modifizierte Proteine können entweder allein oder in Form von mehrwertigen Proteinkomplexen dazu herangezogen werden, eine spezifische Zielrichtung von medizinischen Therapien gegen Krebs und Tumoren, die den Rezeptor für das Protein exprimieren, zu bewirken. Derartige Materialien können als Krebstherapeutika wirksamer gemacht werden, indem man sie als Abgabeträger für antineoplastische Arzneistoffe, Toxine und zytozide Radionuclide, wie Yttrium 90, verwendet.
Ein Toxin kann auch mit einem hydrophob modifizierten Hedgehog (oder vesikelhaltigen mehrwertigen Komplexen davon) konjugiert werden, um eine selektive Zielrichtung auf Hedgehog-reaktive Zellen und deren Abtötung zu bewirken, z. B. eines oder mehrerer tumorexprimierender Hedgehog-Rezeptoren. Weitere Toxine sind gleichermaßen geeignet, wie es dem Fachmann geläufig ist. Derartige Toxine umfassen (ohne Beschränkung hierauf) Pseudomonas-Exotoxin, Diphtheria-Toxin und Saporin. Dieser Weg sollte sich als erfolgreich erweisen, da Hedgehog-Rezeptoren in einer sehr begrenzten Anzahl von Geweben exprimiert werden. Ein weiterer Weg für derartige medizinische Therapien ist die Verwendung eines mit Radioisotopen markierten, hydrophob modifizierten Proteins (oder von mehrwertigen Komplexen davon). Derartige radioaktiv markierte Verbindungen lenken die Radioaktivität zielgerichtet vorzugsweise an Stellen in Zellen, die Proteinrezeptoren exprimieren, wobei normale Gewebe ausgespart werden. Je nach dem verwendeten Radioisotop kann die von einem radioaktiv markierten Protein, das an eine Tumorzelle gebunden ist, emittierte Strahlung auch in der Nähe davon befindliche maligne Tumorzellen, die nicht den Proteinrezeptor exprimieren, abtöten. Es kann eine Vielzahl von Radionucliden verwendet werden. Radioiod (beispielsweise ¹³¹I) hat sich als erfolgreich bei Verwendung mit monoklonalen Antikörpern gegen CD20, die an B-Zelllymphomen vorhanden sind, erwiesen (63).
Die therapeutisch zu verwendenden Proteinzusammensetzungen werden in einer Art und Weise zubereitet und zu Dosierungen verarbeitet, wie es der medizinischen Praxis unter Berücksichtigung der zu behandelnden Störung, des Zustands des einzelnen Patienten, der Abgabestelle des isolierten Polypeptids, dem Verabreichungsverfahren und anderen Faktoren, die dem Arzt bekannt sind, entspricht. Das Therapeutikum kann zur Verabreichung zubereitet werden, indem man ein Protein, eine proteinhaltige Vesikel oder einen derivatisierten Komplex im gewünschten Reinheitsgrad mit physiologisch verträglichen Trägern (d. h. Trägern, die für die Empfänger in den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch sind) vermischt.
Es kommt in Betracht; dass die lokale Abgabe an die Behandlungsstelle den primären Weg für die therapeutische Verabreichung der erfindungsgemäßen Proteine darstellt. Es kann auch eine intravenöse Abgabe oder eine Abgabe durch einen Katheter oder einen anderen chirurgischen Schlauch in Betracht gezogen werden. Zu alternativen Verabreichungswegen gehören Tabletten und dergl., handelsübliche Zerstäubungsgeräte für flüssige Zubereitungen und eine Inhalation von lyophilisierten oder aerosolisierten Zubereitungen. Flüssige Zubereitungen können nach Rekonstitution von Pulverzubereitungen eingesetzt werden.
Die verabreichte Dosis hängt von den Eigenschaften der verwendeten Vesikel und des verwendeten Proteins, d. h. von dessen Bindungsaktivität und in vivo-Plasmahalbwertszeit, der Konzentration von Vesikel und Protein in der Zubereitung, dem Verabreichungsweg, der Dosierungsstelle und -rate, der klinischen Verträglichkeit durch den betroffenen Patienten, dem pathologischen Zustand, von dem der Patienten betroffen ist, und dergl. ab, wie es dem Arzt geläufig ist. Im allgemeinen werden Dosen von 5 × 10^–7 bis 5 × 10^–9 M Protein pro Patient pro Verabreichung bevorzugt, obgleich die Dosierung von der Art des Proteins abhängt. Unterschiedliche Dosierungen können während einer Reihe von aufeinanderfolgenden Verabreichungen eingesetzt werden.
Die Erfindung ist auch auf eine pharmazeutische Zubereitung abgestellt, die ein erfindungsgemäß modifiziertes Hedgehog-Protein in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst. Gemäß einer Ausführungsform umfasst die Zubereitung auch Vesikel.
Die erfindungsgemäßen, hydrophob modifizierten Hedgehog-Proteine eignen sich auch für gentherapeutische Verfahren.
Für neurodegenerative Störungen stehen verschiedene Tiermodelle zur Verfügung, von denen angenommen wird, dass sie von gewissem Wert für klinische Vorhersagen sind. Bei der Parkinson-Krankheit beinhalten die Modelle den Schutz oder die Erholung von Nagetieren oder Primaten, bei denen der nigral-striatale, dopaminerge Stoffwechselweg entweder durch systemische Verabreichung von MPTP oder durch lokale (intrakraniale) Verabreichung von 6-Hydroxydopamin (6-OHDA), d. h. zwei selektive, dopaminerge Toxine, geschädigt ist. Spezielle Modelle sind das Mäusemodell mit MPTP-Behandlung (64); das Primatenmodell (Krallenaffe oder Rhesusaffe) mit MPTP-Behandlung (65); oder das Rattenmodell mit unilateraler 6-OHDA-Läsion (66). Bei ALS (amyotrophe Lateralsklerose) beinhalten die Modelle eine Behandlung von verschiedenen Mäusestämmen, die eine spontane, motorische Neuronendegeneration zeigen, einschließlich Wobbler-Mäuse (67) und pmn-Mäuse (68) und von transgenen Mäusen, die das humane, mutierte Superoxidase-dismutase (hSOD)-Gen, das mit familiärer ALS verknüpft ist, exprimieren (69). Bei Schädigungen des Rückenmarks beinhalten die gebräuchlichsten Modelle eine Kontusionsschädigung von Ratten entweder durch einen kalibrierten Gewichtsverlust oder durch Fluidschädigung (hydrodynamische Schädigung) (70). Bei Morbus Huntington beinhalten Modelle den Schutz gegen eine Excitotoxin-Schädigung (NMDA, Chinolinsäure, Kaininsäure, 3-Nitropropionsäure, APMA) des Striatums bei Ratten (71, 72). Kürzlich wurde ein Modell von transgenen Mäusen, die die humane, expandierte Trinucleotid-Wiederholungssequenz im Huntington-Gen überexprimieren, ebenfalls beschrieben (73). Bei multipler Sklerose wird in Mäusen und Ratten EAE durch Immunisierung mit MBP (basisches Myelinprotein) oder durch passive Übertragung von mit MBP aktivierten T-Zellen induziert (74). Bei Alzheimer besteht ein einschlägiges Mäusemodell in der Bestimmung des Schutzes gegen Läsionen der Fimbria-Fornix in Ratten (septale Läsion), des Hauptnervenbündels, das die cholinerge Innervation des Hippocampus (75) bewirkt, sowie in der Verwendung von transgenen Mäusen, die das humane beta-Amyloid-Gen überexprimieren. Bei peripheren Neuropathien besteht ein einschlägiges Modell im Schutz gegen einen Verlust der peripheren Nervenleitung, die durch chemotherapeutische Mittel, wie Taxol, Vincristin und Cisplatin, bei Mäusen und Ratten hervorgerufen wird (76).
Nachstehend wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele näher beschrieben.
Beispiel 1
Humanes Sonic-Hedgehog ist bei Expression in Insektenzellen lipidmodifiziert.
A. Expression von humanem Sonic-Hedgehog
Die cDNA von humanem Sonic-Hedgehog (Shh) von voller Länge wurde als ein 1,6 kb-EcoRI-Fragment, das in pBluescript SK^– subkloniert war (20), bereitgestellt (von David Bumcrot von der Fa. Ontogeny, Inc., Cambridge, MA, zur Verfügung gestellt). Die 5'- und 3'-NotI-Stellen, die unmittelbar den offenen Shh-Leseraster flankieren, wurden durch Einzelstellen-Eliminationsmutagenese unter Verwendung eines Pharmacia-Kits gemäß dem vom Hersteller empfohlenen Verfahren addiert. Das 1,4 kb NotI-Fragment, das die Shh-cDNA von voller Länge trug, wurde sodann in den Insekten-Expressionsvektor pFastBac (Life Technologies, Inc.) subkloniert. Rekombinantes Baculovirus wurde unter Anwendung der von Life Technologies, Inc., bereitgestellten Verfahren erzeugt. Das erhaltene Virus wurde zur Erzeugung eines Virus-Vorrats mit hohem Titer verwendet. Die Verfahren zur Erzeugung und Reinigung von Shh sind nachstehend beschrieben. Die Anwesenheit von membranassoziiertem Shh wurde durch FACS und Western-Blot-Analyse geprüft. Die maximale Expression erfolgte 48 Stunden nach der Infektion. Für die Western-Blot-Analyse wurden Überstände und Zelllysate von Shh-infizierten oder nicht-infizierten Zellen der SDS-PAGE an einem 10–20 %-Gradientengel unter reduzierenden Bedingungen unterworfen, und elektrophoretisch auf Nitrocellulose übertragen, wonach das Shh mit einem polyklonalen Kaninchen-Antiserum, das gegen ein N-terminales Shh-15-meres-Peptid-Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin-Konjugat erzeugt worden war, nachgewiesen. Die Zelllysate wurden hergestellt, indem man den Zellen 5 Minuten bei 25 °C in 20 mM Na₂HPO₄, pH-Wert 6,5, 1 % Nonidet P-40 und 150 mM NaCl oder 20 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 50 mM NaCl, 0,5 % Nonidet P-40 und 0,5 % Natriumdesoxycholat inkubierte und anschließend Teilchen bei 13 000 U/min 10 Minuten bei 4 °C in einer Eppendorf-Zentrifuge pelletisierte.
B. Reinigung von membrangebundenem, humanem Sonic-Hedgehog
Die membrangebundene Form von Shh wurde in High Five^R-Insektenzellen (Invitrogen) hergestellt, wobei das vorstehend erörterte rekombinante Baculovirus, das für Shh von voller Länge kodiert, verwendet wurde. High Five^R-Zellen wurden bei 28 °C in serumfreiem sf900 II-Medium (Life Technologies, Inc.) in einem 10 Liter fassenden Bioreaktor, der in Bezug auf Sauerstoff kontrolliert war, gezüchtet. Die Zellen wurden in der späten logarithmischen Phase bei etwa 2 × 10⁶-Zellen/ml mit Virus mit einem MOI-Wert von 3 infiziert und 48 Stunden nach der Infektion geerntet (die Lebensfähigkeit der Zellen betrug zum Erntezeitpunkt >50 %). Die Zellen wurden durch Zentrifugation gewonnen und in 10 mM Na₂HPO₄, pH-Wert 6,5, 150 mM NaCl plus 0,5 mM PMSF, gewaschen. Das erhaltene Zellpellet (150 g Feuchtgewicht) wurde in 1,2 Liter 10 mM Na₂HPO₄, pH-Wert 6,5, 150 mM NaCl, 0,5 mM PMSF suspendiert. 5 μM Pepstatin A, 10 μg/ml Leupeptin und 2 μg/ml E64 sowie 120 ml einer 10%igen Lösung von Triton X-100 wurden sodann zugegeben.
Nach 30-minütiger Inkubation auf Eis wurden teilchenförmige Produkte durch Zentrifugation (1 500 × g, 10 min) entfernt. Sämtliche folgenden Stufen wurden bei 4–6 °C durchgeführt. Der pH-Wert des Überstands wurde mit einer Vorratslösung von 0,5 M MES, pH-Wert 5,0 (Endkonzentration 50 mM) auf 5,0 eingestellt und das Produkt wurde auf eine 150 ml-SP-Sepharose Fast Flow-Säule (Pharmacia) aufgesetzt. Die Säule wurde mit 300 ml 5 mM Na₂HPO₄, pH-Wert 5,5, 150 mM NaCl, 0,5 mM PMSF, 0,1 % Nonidet P-40 und sodann mit 200 ml 5 mM Na₂HPO₄, pH-Wert 5,5, 300 mM NaCl, 0,1 % Nonidet P-40 gewaschen. Gebundenes Hedgehog wurde mit 5 mM Na₂HPO₄, pH-Wert 5,5, 800 mM NaCl, 0,1 % Nonidet P-40 eluiert.
Anschließend wurde das Shh einer Immunoaffinitätschromatographie an einem 5E1-Sepharose-Harz, das durch Konjugation von 4 mg Antikörper pro ml CNBr-aktiviertem Sepharose-4B-Harz hergestellt worden war, unterworfen. Der SP-Sepharose-Elutionspool wurde mit zwei Volumina 50 mM HEPES, pH-Wert 7,5, verdünnt und absatzweise auf das 5E1-Harz aufgesetzt (1 h). Das Harz wurde in einer Säule gesammelt, mit 10 Säulenvolumina PBS mit einem Gehalt an 0,1 % hydriertem Triton X-100 (Calbiochem) gewaschen und mit 25 mM NaH₂PO₄, pH-Wert 3,0, 200 mM NaCl, 0,1 % hydriertem Triton X-100 eluiert. Die Elutionsfraktionen wurden mit 0,1 Volumen 1 M HEPES, pH-Wert 7,5, neutralisiert und in Bezug auf den Gehalt an Gesamtprotein durch Absorptionsmessungen bei 240–340 nm und in Bezug auf die Reinheit durch SDS-PAGE analysiert. Die Fraktionen wurden bei –70 °C aufbewahrt.
Peakfraktionen von drei Affinitätsstufen wurden vereinigt, mit 1,3 Volumina 50 mM HEPES, pH-Wert 7,5, 0,2 % hydriertem Triton X-100 verdünnt und erneut absatzweise auf das 5E1-Harz aufgesetzt. Das Harz wurde in einer Säule gewonnen, mit drei Säulenvolumina PBS, pH-Wert 7,2, 1 % Octylglucosid (US Biochemical Corp.) gewaschen und mit 25 mM NaH₂PO₄, pH-Wert 3,0, 200 mM NaCl, 1 % Octylglucosid gewaschen. Die Elutionsfraktionen wurden auf die vorstehend angegebene Weise neutralisiert und analysiert, vereinigt, durch ein 0,2 μm-Filter filtriert, in Aliquotanteile aufgeteilt und bei –70 °C gelagert.
Wenn humanes Sonic-Hedgehog (Shh) von voller Länge in High Five^R-Insektenzellen exprimiert wurde, wurden mehr als 95 % des N-terminalen Fragments durch Western-Blotting in einer zellassoziierten Form nachgewiesen. Bei SDS-PAGE wanderte das gereinigte Protein als eine einzige scharfe Bande mit einer scheinbaren Masse von 20 kDa (1, Bahn c). Das Protein wanderte um etwa 0,5 kDa rascher als eine lösliche Version des Proteins, die in E. coli erzeugt worden war (1, Bahnen b–d), was mit früher veröffentlichten Daten übereinstimmt (19). Gleichermaßen waren, wie früher beschrieben (19), die löslichen und membrangebundenen Shh-Proteine leicht durch Umkehrphasen-HPLC unterscheidbar, wo die gebundene Form später im Acetonitril-Gradienten eluiert wurde. Die für die Elution der membrangebundenen Form erforderliche Acetonitril-Konzentration betrug 60 %, gegenüber nur 45 % für die lösliche Form, was auf eine signifikante Zunahme der Hydrophobizität des Proteins hinweist.
C. Massenspektrometrische Analyse von membrangebundenem humanem Sonic-Hedgehog
Aliquotanteile von Shh wurden einer Umkehrphasen-HPLC an einer C₄-Säule (Vydac, Kat. Nr. 214TP104, Säulenabmessungen 4,6 mm Innendurchmesser × 250 mm) bei Umgebungstemperatur unterworfen. Gebundene Komponenten wurden mit einem 30-minütigen 0–80 % Gradienten von Acetonitril in 0,1 % Trifluoressigsäure bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1,4 ml/min eluiert. Das aus der Säule ausströmende Produkt wurde bei 280 nm überwacht und Fraktionen von 0,5 min wurden gesammelt. 25 μl-Aliquotanteile von proteinhaltigen Fraktionen wurden in einem Speed Vac-Konzentrator getrocknet, in Elektrophorese-Probenpuffer gelöst und durch SDS-PAGE analysiert. Hedgehog enthaltende Fraktionen wurden vereinigt, 4-fach in einem Speed Vac-Konzentrator eingeengt und einer Bestimmung des Proteingehalts aufgrund der Absorption bei 280 nm unter Ansetzen eines Extinktionskoeffizienten von 1,33 für eine 1 mg/ml-Lösung von Shh unterzogen. Proben wurden einer ESI-MS-Analyse an einem Micromass Quattro II-Dreifachquadrupol-Massenspektrometer, der mit einer Elektronenspray-Ionenquelle ausgestattet war, unterworfen. Ein Volumen von 6 μl HPLC-gereinigtem Hedgehog wurde direkt in die Ionenquelle mit einer Geschwindigkeit von 10 μl/min unter Verwendung von 50 % Wasser, 50 % Acetonitril, 0,1 % Ameisensäure als Lösungsmittel in der Spritzenpumpe infundiert. Während der gesamten Probeninfusion wurde ein Scanningvorgang durchgeführt. Sämtliche Elektrospray-Massenspektrumsdaten wurden gewonnen, im Profilmodus gespeichert und unter Verwendung des Micromass MassLynx-Datensystems verarbeitet.
Peptide eines Endoproteinase-Lys-C-Verdaus von pyridylethyliertem Shh wurden durch Umkehrphasen-HPLC im Anschluss an den Micromass Quattro II-Dreifachquadrupol-Massenspektrometer analysiert. Das Verdauungsprodukt wurde an einer Reliasil C₁₈-Säule unter Verwendung eines Michrom^R-Ultrafast-Microprotein-Analyzer-Systems mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 50 μl/min unter Verwendung eines 5–85 %-Acetonitril-Gradienten in 0,05 % Trifluoressigsäure getrennt. Während des gesamten Ansatzes wurde ein Scanning von m/z 400–2000 durchgeführt. Die Verarbeitung erfolgte auf die vorstehend angegebene Weise.
Eine Sequenzierung des N-terminalen Peptids von gebundenem Shh wurde durch Post Source Decay (PSD)-Messung an einem Voyager DE^R-STR (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA)-Flugzeit (TOF)-Massenspektrometer unter Verwendung von α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure als Matrix (22, 23) durchgeführt. Genau 0,5 μl HPLC-gereinigtes Endoproteinase-Lys-C-Peptid wurden mit 0,5 μl Matrix auf der Targetplatte vermischt. Um das gesamte Spektrum von Fragmentionen abzudecken, wurden die Spiegelspannungen in 11 Stufen von 20 auf 1,2 kv verringert.
Elektrosprayionisation-Massenspektrometriedaten für die lösliche und membrangebundene Form von Shh zeigten primäre Spezies mit Massen von 19 560 bzw. 20 167 Da (2). Die gemessene Masse von 19 560 Da stimmt mit der vorhergesagten Masse für Shh, beginnend mit Cys-1 und endend mit Gly-174, überein (berechnete Masse 19 560,02 Da). Im Gegensatz dazu stimmte die Masse von 20 167 Da weder mit einer verfügbaren Vorhersage überein, noch konnte der Unterschied zwischen den Massen der gebundenen und der löslichen Form von 607 Da durch irgendeine bekannte Modifikation oder durch eine abweichende proteolytische Prozessierung erklärt werden. Früher zeigten Porter et al. (18), dass Drosophila-Hedgehog einen Cholesterolrest enthält und dass die Massendifferenz im humanen System möglicherweise zumindest teilweise auf Cholesterol zurückzuführen war (die berechnete Masse für verestertes Cholesterol beträgt 368,65 Da). Die Anwesenheit einer untergeordneten Komponente im Massenspektrum von gebundenem Shh mit 19 796 Da, was sich vom primären Peak um 371 Da unterscheidet, unterstützte diese Auffassung.
Ein weiterer Beweis für Cholesterol wurde erhalten, indem man das gebundene Shh mit mildem Alkali unter Bedingungen, die die Cholesterol-Bindung ohne Lösung von Peptidbindungen aufbrechen kann (18), behandelte und anschließend eine erneute Analyse der Reaktionsprodukte durch Massenspektrometrie (MS) durchführte. Kurz zusammengefasst, von Insektenzellen abgeleitetes Shh wurde mit 50 mM KOH, 95 % Methanol 1 h bei Umgebungstemperatur behandelt und sodann durch ESI-MS analysiert oder mit Endoproteinase-Lys-C verdaut und einer Flüssigchromatographie-MS-Analyse am Micromass Quattro II-Dreifachquadrupol-Massenspektrometer unterworfen. Bei Proben, die der LC-MS unterworfen wurden, wurden die Proteine zunächst mit 4-Vinylpyridin behandelt. Die Basenbehandlung verschob die Masse um 387 Da, was mit einem Verlust von Cholesterol plus Wasser übereinstimmt (vergl. Tabelle 3). Die Masse von löslichem Shh wurde durch Basenbehandlung nicht beeinflusst. Insgesamt lassen diese Beobachtungen darauf schließen, dass membrangebundenes, humanes Shh zwei Modifikationen enthält, einen Cholesterolrest und einen zweiten Rest mit einer Masse von 236 Da. Die Ähnlichkeit der Masse zwischen diesem Wert und der Masse einer addierten Palmitoylgruppe (238 Da) lässt darauf schließen, dass das Protein palmitoyliert ist. Genauere Massenbestimmungen, die nachstehend erörtert werden, ergaben eine Korrelation innerhalb von 0,1 Da mit der vorhergesagten Masse eines Palmitoylrestes.
Tabelle 3 Charakterisierung von gebundenem Shh durch MS. Die berechneten Massenwerte wurden unter Verwendung von durchschnittlichen Restmassen in Teil a und von protonierten Monoisotopen-Massen in Teil b bestimmt.
Anschließend stellten wir fest, dass gebundenes Shh durch HPLC mit einem modifizierten Elutionsgradienten in Subspezies fraktioniert werden konnte. Wir entwickelten einen einfachen HPLC-Test für die quantitative Bestimmung der verschiedenen Formen. Die Ergebnisse dieser Analysen sind in 3 aufgeführt. Bei diesem Test wurde zunächst unmodifiziertes Shh eluiert (Peak 1), anschließend mit Cholesterol modifiziertes Shh (Peak 2) und schließlich Produkt, das sowohl mit Cholesterol als auch mit Palmitinsäure modifiziertes Shh enthält (Peak 3). Die komplizierte Gestalt von Peak 3 spiegelt die Anwesenheit einer modifizierten Form der Palmitoylgruppe wieder, die durch Sequenzierung unter MALDI-PSD-Messung identifiziert wurde. Die Variante war um 2 Da kleiner als vorausgesagt und kann daher eine ungesättigte Bindung enthalten (Daten nicht aufgeführt).
D. Lokalisierung der Palmitinsäure-Modifikation innerhalb der humanen Sonic-Hedgehog-Sequenz
Die Palmitoylierungsstelle innerhalb der humanen Sequenz wurde unter Anwendung einer Kombination der Peptidkartierung und der Sequenzanalyse identifiziert. 4B zeigt die Ergebnisse einer Peptid-Kartierungsanalyse des löslichen Proteins mit einer LC-MS-Ablesung. Massendaten für über 98 % der löslichen Shh-Sequenz konnten durch die Analyse erklärt werden. Der mit einem Peak versehene Stern entspricht dem N-terminalen Peptid (Reste 1–9 plus 4-Vinylpyridin, beobachtete Masse 983,50 Da, berechnete Masse 983,49 Da; Tabelle 3). Bei der entsprechenden Analyse des gebundenen Produkts (4A) fehlte dieses Peptid, statt dessen wurde ein hydrophoberes Peptid mit einer Masse von 1221,79 Da festgestellt (mit einem Stern bezeichnet).
Der 1221,79 Da-Rest stimmt mit dem Vorliegen einer modifizierten Form des N-terminalen Peptids überein, d. h. 983,49 Da für die Peptidkomponente plus 238,23 Da. Das 1221,79 Da-Peptid wurde anschließend der Sequenzanalyse durch MALDI-PSD-Messung unterworfen. Das erhaltene PSD-Spektrum ist in 5 dargestellt. Ionen, die den Fragmenten b1, b2, b4, b5, b8 + H₂O, y8, y7, y5, y4, y3, y2 und y1 entsprechen, wurden nachgewiesen, was die Sequenz bestätigte. Ferner zeigten die b1- und b2-Ionen, dass das pyridylethylierte Cys-1-Addukt palmitoyliert war. Nur Cys-1 enthaltende Ionen enthielten die zusätzliche 238,23 Da-Masse.
Da Cystein in vivo eine normale Palmitoylierungsstelle für Proteine darstellt, war die Feststellung nicht überraschend, dass das neue Addukt an das N-terminale Cystein gebunden war. Jedoch ließen zwei Beweise darauf schließen, dass das Lipid an die Aminogruppe des Cysteins und nicht an das Thiol gebunden war. Erstens setzten wir bei der Peptid-Kartierungsstudie 4-Vinylpyridin als spektroskopische Markierung zur Überwachung von freien Thiolgruppen ein (27). Die Pyridylethylierung ist hochgradig spezifisch für Cystein-Thiole und addiert ein 105 Da-Addukt, das durch MS nachgewiesen werden kann. Die beobachteten Cys-1 enthaltenden Fragmente im PSD-Spektrum enthielten sowohl Palmitoyl- als auch Pyridylethyl-Modifikationen, was auf die Anwesenheit einer freien Thiolgruppe schließen lässt. Zweitens wurde das gebundene Shh einer automatisierten N-terminalen Edman-Sequenzierung unterworfen und es wurde keine Sequenz erhalten, die auf eine Blockierung des N-terminalen α-Amins schließen ließ. Im Gegensatz dazu lässt sich die entsprechende lösliche Form von Shh leicht sequenzieren.
Beispiel 2
Humanes Sonic-Hedgehog kann in einem zellfreien System mit Palmitinsäure modifiziert werden.
Lösliches Shh wurde mit ³H-Palmitinsäure in einem zellfreien System unter Anwendung einer modifizierten Version eines veröffentlichten Verfahrens (24) markiert. Eine rohe mikrosomale Fraktion aus Rattenleber wurde hergestellt, indem ein Leberhomogenisat einer sequenziellen Zentrifugation mit 3 000 g für 10 min, 9 000 g für 20 min und 100 000 g für 30 min unterworfen wurde. Das 100 000 g-Pellet wurde in 10 mM HEPES, pH-Wert 7,4, 10 % Saccharose, suspendiert und erneut 20 Minuten mit 100 000 g zentrifugiert. Das endgültige Pellet (von 10 g Leber abgeleitet) wurde in 3 ml 20 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 μg/ml Leupeptin, 0,15 % Triton X-100 suspendiert, einer Aliquotbildung unterworfen und bei –70 °C aufbewahrt. Reaktionen mit 3 μg Shh, 1 μl Rattenmikrosomen, 50 ng/ml Coenzym A (Sigma), 0,3 mM ATP, 20 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 μg/ml Leupeptin und 0,5 μCi-[9,10-³H]-Palmitinsäure (50 Ci/mmol, New England Nuclear) wurden 1 Stunde bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Reaktionen wurden mit reduzierendem Elektrophorese-Probenpuffer gestoppt. SDS-PAGE wurde an einem 10–20 % Gradientengel durchgeführt. Die Visualisierung erfolgte durch Fluorographie.
Wie in 1 dargestellt (Bahn e) lässt sich Shh leicht mit dem radioaktiven Tracer markieren. Keines der ungefähr 100 übrigen Proteine im Reaktionsgemisch wurde markiert (vergl. das entsprechende, mit Coomassie-Blau gefärbte Gelprofil in Bahn j), was eine hochgradige Spezifität der Palmitoylierungsreaktion zeigt. Als weiteren Beweis für die Spezifität der Palmitoylierungsreaktion testeten wir zwei Shh-Varianten, bei denen die Palmitoylierungsstelle beseitigt worden war. 1 (Bahn f) zeigt die Ergebnisse der Analyse einer geschnittenen Form von löslichem Shh, dem die ersten 10 Aminosäurereste der reifen Sequenz fehlten. Bahn g zeigt eine mutante Form von Shh, das an seinem N-terminalen Ende eine einzige Punktmutation von Cys- zu Ser zeigt. Keine der Varianten war markiert.
Die Bedeutung des N-terminalen Cysteins als Stelle der Lipid-Derivatbildung wird durch die Tatsache betont, dass lösliches Wildtyp-Shh leicht markiert wird, während das bei der Mutante mit Serin anstelle von terminalem Cystein nicht der Fall war. Die Unfähigkeit, die Mutante mit N-terminalem Serin zu markieren, spricht gegen einen einfachen Reaktionsmechanismus, gemäß dem der Palmitylrest direkt an das N-terminale α-Amin gebunden ist, da unter den Testbedingungen das Cystein durch Serin substituiert worden sein sollte.
Wir testeten ferner die Rolle des freien N-Terminus unter Verwendung einer löslichen Form von Shh mit einer N-terminalen Histidin (His)-Markierungserweiterung. Das bei dieser Untersuchung verwendete lösliche, humane Shh war zunächst als ein His-markiertes Fusionsprotein mit einer Enterokinase-Spaltungsstelle an der Verbindung mit der reifen Sequenz hergestellt und sodann mit Enterokinase zur Entfernung der His-Markierung prozessiert worden. Das His-markierte Shh wurde trotz des Vorliegens der freien Thiolgruppe des Cysteins nicht palmitoyliert (vergl. 1, Bahn i). Obgleich wir die Möglichkeit nicht ausschließen können, dass die N-terminale Erweiterung sterisch das Auftreten der Palmitoylierung hemmt, befindet sich Cys-1 an der P1-Position der Enterokinase-Spaltungsstelle und ist für die enzymatische Prozessierung leicht zugänglich. Somit hat es den Anschein, dass sowohl das Thiol als auch das α-Amin von Cys-1 einen Beitrag zur Palmitoylierungsreaktion leisten. Da sämtliche bekannten Palmitoylierungsreaktionen auf die Seitenketten von Cys-, Ser- oder Thr-Resten abzielen, nehmen wir an, dass die Modifikation von Hedgehog mit der Bildung eines Thioester-Zwischenprodukts beginnt und dass anschließend der Palmitoylrest durch Bildung eines cyclischen Zwischenprodukts auf den N-Terminus übertragen wird. Diese Hypothese wurde bei Untersuchungen der Modifikation von humanem Sonic-Hedgehog unter Verwendung von Palmitoyl-Coenzym A bestätigt (vergl. Beispiel 8).
Beispiel 3: Nachweis einer erhöhten Wirkungsstärke von natürlich auftretendem, mit Fettsäure acyliertem, humanem Sonic-Hedgehog in einem Test auf Zellbasis (C3H10T1/2)
Shh wurde auf seine Funktion in einem Test auf Zellbasis unter Messung der Induktion von alkalischer Phosphatase in C3H10T1/2-Zellen (25) bei einer Ablesung von 5 Tagen getestet. Der Test wurde in einem Format mit 96 Vertiefungen durchgeführt. Die Proben wurden im Doppelversuch angesetzt. Für gebundenes Shh (100 μg/ml) wurden die Proben zunächst 200-fach mit normalem Wachstumsmedium verdünnt und anschließend 2-fachen Reihenverdünnungen auf den Platten unterworfen. Die Vertiefungen wurden auf potentielle Einflüsse des zugesetzten Octylglucosids normiert, indem 0,005 % Octylglucosid dem Kulturmedium zugesetzt wurden. Blockierungsuntersuchungen unter Verwendung von neutralisierendem Mäuse-mAb 5E1 (26) wurden durch 30-minütiges Vermischen von Shh mit Reihenverdünnungen des Antikörpers bei Umgebungstemperatur in Kulturmedium durchgeführt, bevor die Testproben auf die Platten gegeben wurden.
Bei diesem Test erzeugt lösliches, humanes Shh eine dosisabhängige Reaktion mit einem IC₅₀-Wert von 1 μg/ml und einem maximalen Signal bei 3 μg/ml (6A). Gebundenes humanes Shh mit am C-Terminus gebundenem Cholesterol und einer Palmitoylgruppe am N-Terminus erzeugte gleichermaßen eine dosisabhängige Reaktion bei diesem Test, jedoch mit einem IC₅₀-Wert von 0,03 μg/ml und einem maximalen Signal bei 0,1 μg/ml, was zeigt, dass es etwa 30-fach stärker wirksam als lösliches Shh war. Um zu bestätigen, dass die beobachtete Aktivität für Hedgehog spezifisch war, testeten wir, ob die Aktivität mit dem neutralisierenden anti-Hedgehog-mAb 5E1 gehemmt werden konnte. Sowohl lösliches als auch gebundenes Shh wurden durch 5E1-Behandlung gehemmt (6B). Die Hemmung von gebundenem Shh erforderte die 10-fache 5E1-Menge, was mit der erhöhten Aktivität beim Test übereinstimmt.
Gebundenes Shh wurde in einem Rezeptor-Bindungstest getestet, wobei dessen Fähigkeit zur Bindung von "Patched" getestet wurde. Dabei wurde eine modifizierte Version eines kürzlich veröffentlichten Tests (10) herangezogen. Das gebundene Shh zeigte eine dosisabhängige Bindung an Zellen, die "Patched" exprimierten, mit einem scheinbaren IC₅₀-Wert von 400 ng/ml (7). Beim gleichen Test erfolgte eine Bindung von löslichem Shh an "Patched" mit einem scheinbaren IC₅₀-Wert von 150 ng/ml, was darauf hinweist, dass die gebundene Form nur geringfügig weniger stark an ihren Rezeptor bindet.
Beispiel 4
Analyse von gebundenem humanem Sonic-Hedgehog nach Rekonstitution in Liposomen
Dieses Beispiel erläutert, dass Rekonstitutionsexperimente zu positiv und negativ geladenen Liposomen durch Detergensverdünnung über einen breiten Bereich von Lipid:Protein-Verhältnissen (Gew./Gew.) von 1:1 bis 100:1 keinen Einfluss auf die Aktivität von gebundenem Shh beim C3H10T1/2-Test hatten.
Die Rekonstitution zu phospholipidhaltigen Liposomen ergibt eine wertvolle Zubereitung für lipidhaltige Proteine, da sie es ermöglicht, dass ein lipidhaltiges Protein in einer nahezu normalen Einstellung vorliegt. Um zu testen, ob eine derartige Zubereitung für gebundenes Shh geeignet war, bedienten wir uns eines Detergens-Verdünnungsverfahrens, um das Protein in ein Liposom einzuverleiben (60). Dabei werden Liposomen mit Octylglucosid und dem Protein von Interesse vermischt und anschließend wird das Detergens unterhalb seiner kritischen Mizellenkonzentration zugegeben, um die Rekonstitution zu betreiben. Obgleich eine große Anzahl von reinen Lipiden und Lipidgemischen verwendet werden kann, wählten wir zwei handelsübliche Gemische als Modelle: ein negativ geladenes Liposomenkit mit einem Gehalt an L-α-Phosphatidylcholin aus Ei, Dicetylphosphat und Cholesterol (Kat. Nr. L-4262, Sigma, St. Louis, MO) und ein positiv geladenes Liposomenkit aus Phosphatidylcholin aus Ei, Stearylamin und Cholesterol (Kat. Nr. L-4137, Sigma).
Kurz zusammengefasst, wir übertrugen die Lipide in ein Pyrex-Röhrchen, führten eine Trocknung unter einem Stickstoffstrom durch und entfernten restliches Lösungsmittel durch Lyophilisation. Sodann wurde das Lipid in 10 mM HEPES, pH-Wert 7,5, 100 mM NaCl, 2,0 % Octylglucosid suspendiert, aufgewirbelt und einer Ultraschallbehandlung unterworfen, bis die Suspension ein opaleszierendes Erscheinungsbild annahm. Sodann wurde das Lipid durch ein 0,2 μm-Filter filtriert. Aliquotanteile von gebundenem Shh aus mit Baculovirus infizierten High Five^R-Insektenzellen wurden in Octylglucosid mit einem 400-, 1 000-, 5 000- und 20 000-fachen Überschuss an Lipid (Gew./Gew.) behandelt. Nach 15-minütiger Vorinkubation wurden die Proben verdünnt und im C3H10T1/2-Test auf ihre Aktivität getestet.
Weder die positive noch die negative Liposomenbehandlung hatte einen Einfluss auf die Aktivität des Hedgehog, was zeigt, dass ein Lipidträger eine geeignete Zubereitung darstellt. Um zu bestätigen, dass das Hedgehog tatsächlich rekonstituiert wurde, wurden parallele Proben einer Zentrifugation unter Bedingungen unterworfen, bei denen das gebundene Shh normalerweise ein Pellet bilden würde und die Liposomen an der Oberfläche der Probe schwimmen würden. Unter diesen Bedingungen schwamm gebundenes Shh an der Oberfläche, was zeigt, dass die Rekonstitution erfolgt war.
Beispiel 5
Charakterisierung von membrangebundenem, humanem Sonic-Hedgehog aus Säugetier-Zellen (EBNA-293)
Um festzustellen, ob eine Palmitoylierung einen allgemeinen Modifizierungsweg für Sonic-Hedgehog darstellt oder ob sie spezifisch für Insektenzellen ist, wurde das Protein auch in einem Säugetiersystem in EBNA-293-Zellen erzeugt. Zur Expression von Shh von voller Länge in Säugetierzellen wurden das 1,4 kb-NotI-Fragment, das das Shh von voller Länge enthielt (vergl. Beispiel 1), in ein Derivat des Vektors CH269 pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA (21)) kloniert. Das Konstrukt wurde unter Verwendung von Lipofectamin (Life Technologies, Inc.) in EBNA-293-Zellen transfiziert. Die Zellen wurden 48 Stunden nach der Transfektion geerntet. Die Expression von Oberflächen-Shh wurde durch FACS und durch Western-Blot-Analyse bestätigt.
Gebundenes Shh aus EBNA-293-Zellen wurde durch Umkehrphasen-HPLC an einer C4-Säule mit enger Bohrung fraktioniert (vergl. 3). Die Peaks wurden durch ESI-MS (Teile a und b von Tabelle 4) oder durch MALDI-TOF-MS an einem Finnigan LaserMat-Massenspektrometer unter Verwendung von α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure als Matrix (Teil c von Tabelle 4) analysiert. Bei SDS PAGE wanderte das Protein geringfügig rascher als lösliches Shh, wurde an der C₄-Säule bei der Umkehrphasen-HPLC-Analyse verzögert und enthielt gemäß Massenspektrometrie ein Ion, das der Palmitinsäure-plus Cholesterol-Modifikation entsprach. Im Gegensatz zu dem von Insektenzellen abgeleiteten Produkten, bei dem mehr als 80 % des Produkts sowohl die Palmitinsäure- als auch die Cholesterol-Modifikation enthielt, ergaben jedoch das HPLC-Elutionsprofil und die Daten der Massenspektrometrie, dass dem Großteil des von Säugetierzellen abgeleiteten Proteins der Palmitoylrest fehlte (vergl. Tabelle 4 und 3C). Beim Peak 2 aus EBNA-293-Zellen betrug nämlich das Verhältnis von geschnittenem (des-1-10) zum intakten Protein gemäß dem MS-Signal 50 %, während für den Peak 1 nur etwa 10 % des Shh geschnitten waren. Interessanterweise zeigten sowohl das Produkt der Insektenzellen als auch das von Säugetierzellen abgeleitete Produkt eine vergleichbare Aktivität beim C3H10T1/2-Test, was darauf schließen lässt, dass sowohl die Cholesterol-Modifikation als auch die Cholesterol-plus-Palmitinsäure-Modifikation funktionell waren. Ob die zweite Lipid-Bindungsstelle nur zur weiteren Stabilisierung der Assoziation des Proteins an die Membran dient oder ob sie eine aktivere Rolle spielt und die Konformation oder Protein-Protein-Kontakte beeinflusst, bleibt noch zu klären.
Eine Fettsäure-Derivatisierung von Proteinen stellt eine übliche posttranslationale Modifikation dar, die bei Reifungsvorgängen spät erfolgt (28, 29). Für Cystein-Derivate ist der Prozess dynamisch, wobei separate Enzyme beteiligt sind, die die Modifikation an der Sulfhydrylgruppe hinzufügen und entfernen. Die häufigsten Funktionen einer derartigen Derivatisierung (z. B. Palmitoylierung) bestehen in einer Veränderung der physikochemischen Eigenschaften des Proteins, d. h. um ein Protein zielgerichtet an eine Funktionsstelle zu bringen, Protein-Protein-Wechselwirkungen zu fördern und Protein-Membran-Wechselwirkungen zu vermitteln (30). Obgleich bei Hedgehog die Differenz im Ausmaß der Palmitoylierung in von Insektenzellen abgeleiteten Präparaten und in von Säugetierzellen abgeleiteten Präparaten überraschend war (80 % bei Insektenzellen gegenüber 30 % bei Säugetierzellen), wissen wir nicht, ob diese Differenz biologisch von Bedeutung ist oder ob sie lediglich Unterschiede in der zellulären Maschinerie der beiden Testsysteme in Bezug auf die Addition und Entfernung von Palmitinsäure wiederspiegelt. Es ist unwahrscheinlich, dass der Unterschied im Ausmaß der Modifikation in Insekten- und Säugetierzellen speziesbezogen ist, da gebundenem Drosophila-Hedgehog, das in Insektenzellen erzeugt worden ist, trotz der identischen N-terminalen Sequenz Palmitinsäure fehlt (19).
Tabelle 4 Massenspektrometrische Analyse von von EBNA-293 abgeleitetem, gebundenem humanem Sonic-Hedgehog
Beispiel 6
Lipidmodifikationen von Ratten-Sonic-Hedgehog
Dieses Beispiel erläutert, dass eine Vielzahl von Lipiden an eine lösliche Version von Ratten-Sonic-Hedgehog gebunden wird, wenn das Ratten-Shh-Gen, das für die Reste 1–174 kodiert, in High Five^R Insektenzellen exprimiert wird, im wesentlichen wie für humanes Shh in voller Länge gemäß Beispiel 1. Die Lipidmodifikation bewirkt eine Membranassoziierung dieser Fraktion. Das N-terminale Fragment (Reste 1–174 von unprozessiertem Ratten-Sonic-Hedgehog) unterscheidet sich nur um zwei Aminosäurereste vom N-terminalen Fragment des humanen Sonic-Hedgehog. Im N-terminalen Fragment von Ratten-Sonic-Hedgehog sind Serin in Position 44 durch Threonin und Glycin in Position 173 durch Asparaginsäure ersetzt. wenn Ratten-Sonic-Hedgehog, dem die Autoprozessierungsdomäne fehlt, im High-Five^R-Insektenzellen/Baculovirus-Expressionssystem exprimiert wird, wird der Großteil des Proteins in das Kulturmedium sezerniert, da ihm die Fähigkeit zur Bindung eines Cholesterolrestes am C-Terminus fehlt. Diese lösliche Form weist eine spezifische biologische Aktivität (gemessen durch den C3H10T1/2-alkalische Phosphatase-Induktionstest von Beispiel 3) auf, die ähnlich wie die des löslichen, N-terminalen Fragments von humanem Sonic-Hedgehog ist, das von E. coli exprimiert und gereinigt worden ist.
Jedoch bleibt eine kleine Fraktion des gesamten Proteins mit den Insektenzellen assoziiert. Das zellassoziierte Ratten-Sonic-Hedgehog-Protein wurde im wesentlichen gemäß den Angaben in Beispiel 1 gereinigt. Es wurde festgestellt, dass es beim alkalischen Phosphatase-Test wesentlich aktiver ist (Daten nicht aufgeführt) als die löslichen, N-terminalen Fragmente von humanem oder Ratten-Sonic-Hedgehog, das aus dem E. coli- bzw. dem High-Five^R-Insektenzellen/Baculovirus-Expressionssystem gereinigt worden war. Anschließende Analysen von N-terminalen Ratten-Sonic-Hedgehog-Fragmenten durch HPLC und Elektrospray-Massenspektrometrie (in Beispiel 1 beschrieben) lassen darauf schließen, dass das Protein lipidmodifiziert ist und dass mehr als ein Typ der Lipidmodifikation vorliegt. Zu Beweisen hierfür gehören die folgenden Beobachtungen:

1. Die zellassoziierten Formen werden später als die löslichen, N-terminalen Fragmente von humanem und Ratten-Sonic-Hedgehog aus einer C₄-Umkehrphasen-HPLC-Säule (Vydac Katalog Nr. 214TP104), die mit einem linearen, 30-minütigen 0–70 %-Acetonitril-Gradient in 0,1 % Triofluoressigsäure entwickelt wird, eluiert.
2. Die Massen der zellassoziierten Formen stimmen mit den für die lipidmodifizierten Proteine erwarteten Massen überein, wie in Tabelle 5 dargelegt ist.

Tabelle 5 Massen verschiedener, lipidmodifizierter Formen von Ratten-Sonic-Hedgehog
Die Position des Lipidrestes wurde unter Verwendung einer Kombination von Sequenzanalyse und Peptidkartierung bestimmt. Eine automatisierte, N-terminale Edman-Sequenzierung der lipidmodifizierten Formen zeigte, dass der N-Terminus blockiert war, was darauf schließen lässt, dass das Lipid am α-Amin des N-terminalen Cysteins gebunden war. Eine endo-Lys-C-Peptidkartierung, eine MALDI-TOF-Massenspektrometrie und eine MALDI-PSD-Analyse (gemäß den Angaben von Beispiel 1) der mit 4-Vinylpyridin alkylierten, lipidmodifizierten Formen wurden zur Bestätigung der Position der Lipidmodifikationen und zur Bestimmung ihrer exakten Massen herangezogen. Die Massen der N-terminalen Peptide (Reste 1–9 plus 4-Vinylpyridin, gebunden an die Thiolseitenkette des N-terminalen Cysteins) mit den Lipidmodifikationen stimmten innerhalb von 0,1 Da mit der für die lipidmodifizierten Peptide erwarteten Masse überein, wie in Tabelle 6 dargelegt ist.
Tabelle 6 Massen der N-terminalen Peptide die aus verschiedenen lipidmodifizierten Formen von Ratten-Sonic-Hedgehog isoliert worden sind
Zusätzlich zu den in Tabelle 6 aufgeführten lipidmodifizierten Peptiden wurden ferner Peptide mit den Massen 1191,74, 1219,84 und 1247,82 nachgewiesen. Diese Massen stimmen mit ungesättigten Formen von Myristat, Palmitat bzw. Stearat überein, obgleich die Position der Doppelbindung in der Alkylkette nicht bestimmt wurde. Diese Beobachtungen zeigen, dass sowohl gesättigte als auch ungesättigte Fettsäuren kovalent an das N-terminale Cystein gebunden werden können. Die in Beispiel 1 beschriebene MALDI-PSD-Analyse bestätigte sowohl für die mit gesättigten als auch mit ungesättigten Lipiden modifizierten Peptide, dass die Lipide kovalent an den N-terminalen Cysteinrest gebunden waren.
Beispiel 7
Lipidmodifikation von Indian-Hedgehog
Um festzustellen, ob die Palmitoylierungsreaktion für humanes Shh einzigartig ist oder ob sie auch bei anderen Hedgehog-Proteinen auftreten kann, testeten wir, ob humanes Indian-Hedgehog (exprimiert in E. coli als ein His-markiertes Fusionsprotein mit einer Enterokinase-Spaltungsstelle unmittelbar neben dem Beginn der reifen Sequenz und genauso wie rekombinantes humanes Sonic-Hedgehog gereinigt (vergl. Beispiel 9)) unter Anwendung des in Beispiel 2 beschriebenen Tests palmitoyliert werden kann. Humanes Indian-Hedgehog wurde modifiziert (vergl. 1, Bahn h), was darauf hinweist, dass die Palmitoylierung vermutlich ein gemeinsames Merkmal von Hedgehog-Proteinen ist. Die Fähigkeit zur direkten Markierung von Shh und Ihh mit radioaktiver Palmitinsäure in einem zellfreien System ergab ein einfaches Screening auf Aminosäuren, die bei der Modifikationsreaktion beteiligt sind. Außerdem war Indian-Hedgehog, das gemäß dem Verfahren von Beispiel 8 palmitoyliert war, beim C3H10T1/2-Test erheblich wirkungsstärker als unmodifiziertes Ihh.
Beispiel 8
Lipidmodifikationen von Sonic-Hedgehog unter Verwendung von Acyl-coenzym A
Die in vitro-Acylierung eines Proteins mit einem Gehalt an einem N-terminalen Cystein kann über ein 2-stufiges Verfahren durch chemische Reaktion mit einem Fettsäurethioester-Donator erfolgen. Bei der ersten Stufe wird die Acylgruppe des Thioester-Donators auf die Sulfhydrylgruppe des N-terminalen Cysteins am Protein durch eine spontane Umesterungsreaktion übertragen. Anschließend unterliegt der Acylrest einer Verschiebung von S nach N auf das α-Amin des N-terminalen Cysteins unter Bildung einer stabilen Amidbindung. Eine direkte Acylierung einer Aminfunktion an einem Protein kann auch bei einer verlängerten Inkubation mit einem Thioester erfolgen, jedoch beschleunigt das Vorliegen eines Cysteins am Protein die Umsetzung und ermöglicht eine Kontrolle der Acylierungsstelle. In den vorliegenden Beispielen wurden handelsübliche Coenzym A-Derivate (Sigma Chemical Company, St, Louis, MO) verwendet, wobei aber auch andere Thioestergruppen zum gleichen Ergebnis führen würden. Tatsächlich ist zu erwarten, dass bestimmte austretende Thioestergruppen, wie Thiobenzylester, rascher reagieren. Interne Cysteinreste können ebenfalls die Acylierung auf benachbarte Lysine (d. h. wie in einem internen Cystein-Lysin-Paar) fördern. Dies kann zweckmäßigerweise unter Verwendung von synthetischen Peptiden getestet werden. Sekundäre Acylierungen, die am Protein während der Umsetzung mit Thioestern erfolgen, können durch Steuerung der Pufferzusammensetzung, des pH-Werts oder durch ortsgerichtete Mutagenese der benachbarten Lysine verhindert werden.
Bei vorausgehenden Analysen über den Einfluss der Acylierung auf die Fähigkeit von humanem Sonic-Hedgehog zur Induktion von alkalischer Phosphatase in C3H10T1/2-Zellen enthielten die Reaktionsgemische 1 mg/ml humanes Sonic-Hedgehog (51 μM), 500 μM des speziellen handelsüblichen Acyl-coenzyms A (zu den getesteten Verbindungen gehörten Acetyl-CoA (C2:0), Butyryl-CoA (C4:0), Hexanoyl-CoA (C6:0), Octanoyl-CoA (C8:0), Decanoyl CoA (C10:0), Lauroyl-CoA (C12:0), Myristoyl-CoA (C14:0), Palmitoyl-CoA (C16:0), Palmitoleoyl-CoA (C16:1), Stearoyl-CoA (C18:0), Arachidoyl-CoA (C20:0), Behenoyl-CoA (C22:0), Lignoceroyl-CoA (C24:0), Succinyl-CoA und Benzoyl-CoA), 25 mM DTT und 50 mM Na₂HPO₄, pH-Wert 7,0. Die Reaktionsgemische wurden 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und sodann sofort (ohne Reinigung) einem Test ihrer biologischen Aktivität beim C3H10T1/2-Test gemäß der Beschreibung in Beispiel 3 unterzogen. Proben für die Analyse durch Umkehrphasen-HPLC und andere physikalische Methoden wurden üblicherweise bei –70 °C aufbewahrt. Die HPLC-Analyse wurde an einer Vydac C₄-Umkehrphasensäule (Innendurchmesser 4,6 mm × 250 mm, Teilchengröße 5 μm) mit einem 40 min-Gradienten von 5 % Acetonitril bis 85 % Acetonitril in wässriger 0,1 % TFA bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min durchgeführt. Das ausströmende Produkt wurde bei 280 nm überwacht. Fraktionen wurden in einigen Experimenten gesammelt und durch SDS-PAGE auf Hedgehog-Protein unter Nachweis mit Coomassie-Färbung und durch Western-Blotting analysiert.
Ein Vergleich der Aktivität der verschiedenen Reaktionsgemische (10) zeigt, dass eine Kettenlänge von 12 bis 18 Kohlenstoffatomen optimal in Bezug auf eine Induktion einer starken Aktivität von alkalischer Phosphatase ist, verglichen mit dem unmodifizierten Protein. Eine weitere Steigerung der Kettenlänge führte zu einer offensichtlichen Verringerung der Aktivität. Die Anwesenheit einer Doppelbindung im ungesättigten Palmitoleoyl-CoA (C16:1) ergab die gleiche Aktivität wie bei vollständig gesättigtem Palmitoyl-CoA (C16:0). Bei Umkehrphasen-HPLC-Analyse der Reaktionsgemische stellten wir fest, dass zahlreiche kürzerkettige Acyl-CoA-Derivate nicht mit dem Hedgehog-Protein reagiert hatten. Daher stellte die Abhängigkeit der in 10 dargestellten biologischen Aktivität kein echtes Abbild der Acylkettenlänge dar.
Um Daten über die echte Aktivität der modifizierten Proteine und über die Abhängigkeit der Aktivität von der Acylkettenlänge zu erhalten, entwickelten wir Verfahren für die Synthese und Reinigung der einzelnen, N-terminalen, acylierten Formen. Palmitoylierte, myristoylierte, lauroylierte, decanoylierte und octanoylierte, humane Sonic-Hedgehog-Proteine, bei denen eine einzige Acylkette am α-Amin des N-terminalen Cysteins gebunden war, wurden in Reaktionsgemischen mit einem Gehalt an 0,80 mg/ml (41 μM) humanem Sonic-Hedgehog 410 μM (10-facher molarer Überschuss) an Palmitoyl-CoA, Myristoyl-CoA oder Lauroyl-CoA oder 4,1 mM (100-facher molarer Überschuss) an Decanoyl-CoA oder Octanoyl-CoA, 25 mM DTT (für Reaktionsgemische mit einem Gehalt an Palmitoyl-CoA, Myristoyl-CoA oder Lauroyl-CoA) oder 0,5 mM DTT (für Reaktionsgemische mit einem Gehalt an Decanoyl-CoA oder Octanoyl-CoA)und 40 mM Na₂HPO₄, pH-Wert 7,0, hergestellt. Die Reaktionsgemische wurden 24 Stunden bei 28 °C inkubiert. Eine Umsetzung des N-terminalen Cysteins mit Acylthioestern führt zu einer Übertragung der Acylgruppe auf die Sulfhydrylgruppe durch eine spontane Umesterungsreaktion, wonach eine Verschiebung von S zu N auf das α-Amin unter Bildung einer stabilen Amidbindung erfolgt. Die freie Sulfhydrylgruppe unterliegt sodann einer zweiten Umesterungsreaktion, woraus sich ein Protein mit einer Fettsäureacylgruppe, die über eine Thioesterbindung an die Sulfhydrylgruppe gebunden ist, ergibt. Die thioesterverknüpfte Acylgruppe wurde durch aufeinanderfolgende Zugabe von 0,11 Volumenteilen 1 M Na₂HPO₄, pH-Wert 9,0, und 0,11 Volumenteilen 1 M Hydroxylamin (endgültige Konzentration 0,1 M) unter anschließender 18-stündiger Inkubation bei 28 °C entfernt, wodurch nur das an das Protein gebundene Acylamid verblieb (62). 0,25 Volumenteile 5 % Octylglucosid wurden sodann zugegeben (Endkonzentration 1 %) und das Gemisch wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Sodann wurden die Proteine in Gegenwart von 1 % Octylglucosid unter Anwendung einer SP-Sepharose Fast Flow (Pharmacia)-Chromatographie und einer Bio Scale S (Biorad)-Kationenaustauscher-Chromatographie gereinigt. Die gereinigten Proteine wurden gegen 5 mM Na₂HPO₄, pH-Wert 5,5, 150 mM NaCl, 1 % Octylglucosid und 0,5 mM DTT dialysiert und bei –70 °C aufbewahrt. Die Anwesenheit von Octylglucosid war zur Aufrechterhaltung der vollständigen Löslichkeit erforderlich. Nach Entfernung des Detergens durch Verdünnung und Dialyse ergab sich ein Verlust von 75 %, 41 % bzw. 15 % des palmitoylierten, myristoylierten bzw. lauroylierten Proteins. Eine ESI-MS-Analyse der HPLC-gereinigten Proteine bestätigte deren Integrität: palmitoyliertes Sonic-Hedgehog, gemessene Masse = 19 798, berechnete Masse = 19 798,43; myristoyliertes Sonic-Hedgehog, gemessene Masse = 19 770, berechnete Masse = 19 770,33; lauroyliertes Sonic-Hedgehog, gemessene Masse = 19 742, berechnete Masse = 19 742,33; decanoyliertes Sonic-Hedgehog, gemessene Masse = 19 715, berechnete Masse = 19 714,28; octanoyliertes Sonic-Hedgehog, gemessene Masse = 19 686, berechnete Masse = 19 686,23.
Eine Analyse der verschiedenen acylierten Formen von humanem Sonic-Hedgehog beim C3H10T1/2-Test (11) zeigte, dass die Aktivität der Proteine von der Kettenlänge abhängig war. Die palmitoylierten, myristoylierten und lauroylierten Proteine zeigten eine annähernd gleiche Aktivität mit EC₅₀-Werten von 5–10 ng/ml (100- bis 200-fache Steigerung der Wirkungsstärke im Vergleich zum unmodifizierten Protein). Decanoyliertes, humanes Sonic-Hedgehog mit einem EC₅₀-Wert von 60–70 ng/ml (15- bis 30-fache Zunahme der Wirkungsstärke im Vergleich zum unmodifizierten Protein) war weniger aktiv als die palmitoylierten, myristoylierten und lauroylierten Formen, während die octanoylierte Form mit einem EC₅₀-Wert von 100–200 ng/ml die geringste Aktivität aufwies (10-fache Zunahme der Wirkungsstärke im Vergleich zum unmodifizierten Protein). Sämtliche acylierten Formen waren wirkungsstärker als das unmodifizierte Protein, das einen EC₅₀-Wert von 1000–2000 ng/ml aufwies. Zusätzlich zur Abnahme des EC₅₀-Werts induzierten die palmitoylierten, myristoylierten und lauroylierten Proteine die Aktivität von alkalischer Phosphatase etwa 2-fach stärker als das unmodifizierte Protein, während die decanoylierten und octanoylierten Proteine eine etwa 1,5-fach stärkere Induktion bewirkten.
Zusätzlich zur Zunahme der Wirkungsstärke der myristoylierten Form von humanem Sonic-Hedgehog, die beim C3H10T1/2-Test beobachtet wurde, ist diese Form bezüglich der Induktion von ventralen Vorhirn-Neuronen in Explantaten von Ratten-Endhirn im embryonalen Stadium El1 signifikant stärker wirksam als das unmodifizierte Protein. Eine Inkubation von E11-Endhirn-Explantaten mit verschiedenen Konzentrationen von unmodifiziertem oder myristoyliertem Sonic-Hedgehog und eine anschließende Färbung der Explantate für die Produkte der dlx- und islet-1/2-Gene (Marker für ventrale Vorhirn-Neuronen) zeigt, dass eine Induktion durch das unmodifizierte Protein erstmals bei 48 nM beobachtet wird, während eine Induktion durch die myristoylierte Form erstmals bei 3 nM beobachtet wird. Außerdem induziert das unmodifizierte Protein eine eingeschränkte Expression bei 3070 nM, während das myristoylierte Protein eine ausgedehnte Expression bei nur 48 nM induziert. Eine ähnliche Zunahme der Wirkungsstärke wurde beobachtet, wenn Explantate von mutmaßlichem Endhirn im embryonalen Zustand E9 entweder mit dem unmodifizierten oder dem myristoylierten Protein inkubiert wurden. Eine Färbung der Explantate für das Produkt des Nkx2.1-Gens (ein früher Marker der ventralen Vorhirn-Neuronen) zeigte, dass das unmodifizierte Protein Nkx2.1 erstmals bei 384 nM induzierte, während für das myristoylierte Protein eine Expression von Nkx2.1 erstmals bei 12 nM festgestellt wurde. Außerdem war bei einer Konzentration des myristoylierten Sonic-Hedgehog von 48 nM die Expression von Nkx2.1 ausgedehnt, während sie bei dieser Konzentration unter Verwendung der unmodifizierten Form nicht nachweisbar war.
Ferner wurde gezeigt, dass myristoyliertes, humanes Sonic-Hedgehog signifikant wirkungsstärker als das unmodifizierte Protein in Bezug auf eine Verringerung des Läsionsvolumens, die sich bei einer Verabreichung von Malonat in das Striatum des Rattenhirns ergibt (vergl. Beispiel 16), war.
Beispiel 9
Chemische Derivate des N-terminalen Cysteins von humanem Sonic-Hedgehog
A. Allgemeine Verfahren
Alkylierung von Proteinen: Proben mit einem Gehalt an etwa 20 μg des Proteins in 50 μ1 6 M Guanidin-hydrochlorid, 50 mM Na₂HPO₄ pH-Wert 7,0, wurden 2 Stunden bei Raumtemperatur mit 0,5 μl 4-Vinylpyridin behandelt. Das S-pyridylethylierte Protein wurde durch Zugabe von 40 Volumenteilen gekühltem Ethanol ausgefällt. Die Lösung wurde 1 Stunde bei –20 °C aufbewahrt und sodann 8 Minuten bei 4 °C mit 14 000 g zentrifugiert. Die Überstände wurden verworfen. Der Niederschlag wurde mit gekühltem Ethanol gewaschen. Das Protein wurde bei –20 °C aufbewahrt.
Peptid-Kartierung: Alkyliertes Protein (0,4 mg/ml in 1 M Guanidin-hydrochlorid, 20 mM Na₂HPO₄, pH-Wert 6,0) wurde mit endo-Lys-C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in einem Verhältnis von 1:20 verdaut. Die Verdauung wurde 30 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Sodann wurde die Umsetzung durch Ansäuerung mit 5 μl 25 % Triofluoressigsäure gestoppt. Das Verdauungsprodukt wurde an einem Waters 2690 Separation Module-Gerät mit einem Modell 996-Photodioden-Reihendetektor analysiert. Vor der Injektion wurde das Verdauungsprodukt mit Guanidin-hydrochlorid in einer Konzentration von 6 M versetzt, um unlösliches Material aufzulösen. Eine Umkehrphasen-Vydac-C₁₈-Säule (2,1 mm Innendurchmesser × 250 mm) wurde für die Trennung verwendet, wobei ein 90 Minuten-Gradient von 0,1 % Trifluoressigsäure/Acetonitril und 0,1 % Trifluoressigsäure/Acetonitril mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,2 ml/min eingesetzt wurde. Einzelne Peaks wurden manuell für die Massenanalyse gesammelt.
Massenbestimmung: Die Molekülmassen von intakten Proteinen wurden durch Elektrospray-Ionisationsmassenspektroskopie (ESI-MS) an einem Micromass Quattro II-Dreifachquadrupol-Massenspektrometer bestimmt. Proben wurden unter Verwendung eines Online-Michrom Ultrafast MicroProtein Analyzer-Systems mit einer Reliasil-C₄-Säule (1 mm Innendurchmesser × 50 mm) entsalzt. Die Fließgeschwindigkeit betrug 20 μL/min. Sämtliche Elektrospray-Massenspektrumsdaten wurden unter Verwendung des Micromass MassLynx-Datensystems verarbeitet. Die Molekülmassen der Peptide wurden durch matrixgestützte Laser-Desorptionsionisation-Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) an einem Voyager-DE^R-STR-Gerät (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA) bestimmt. Die Sequenzierung des modifizierten Peptids wurde durch Post-source-Zerfall (PSD)-Messung am gleichen Instrument durchgeführt. α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure wurde als Matrix verwendet.
N-terminale Sequenzierung: Proteine wurden durch Edman-Abbau an einem Perkin-Elmer Applied Biosystems Modell 477A Pulsed-Liquid Protein Sequencer-Gerät sequenziert. PTH-Thiaprolin wurde on-line durch direktes Beladen der Probenbeladungskartusche des Sequenziergeräts mit Thiaprolin (Thiazolidin-4-carbonsäure) hergestellt.
Bakterielle Expression und Reinigung des für die chemische Modifikation verwendeten terminalen Fragments von löslichem, humanem Wildtyp-Sonic-Hedgehog: Bakterielle Pellets von Zellen, die Shh in einer Menge von 4–5 % des gesamten Proteins exprimierten, wurden aufgetaut, in Lysispuffer (25 mM Na₂HPO₄, pH-Wert 8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0,5 mM DTT) in einem Verhältnis von 1:4 (Gew./Vol.) resuspendiert und durch zwei Durchgänge durch eine Gaulin-Presse (Produkt der Fa. APV Rannie, Kopenhagen, Dänemark) bei 12 000 psi lysiert. Sämtliche anschließenden Reinigungsstufen wurden bei 2–8 °C durchgeführt, sofern nichts anderes angegeben ist. Das Homogenisat wurde 60 Minuten mit 19 000 g zentrifugiert. 0,5 M MES, pH-Wert 5, wurde zum erhaltenen Lysat in einem Verhältnis von 1:10 (Vol./Vol.) gegeben. Das Lysat (vom pH-Wert 5,5) wurde auf eine SP-Sepharose-Fast Flow-Säule (Pharmacia, Piscataway, NJ) (4 g E. coli-Feuchtgewicht/ml Harz), die mit 25 mM Na₂HPO₄, pH-Wert 5,5, 150 mM NaCl äquilibriert worden war, aufgesetzt. Die Säule wurde mit 4 Säulenvolumina (CV) Äquilibrationspuffer und anschließend mit 3 CV 25 mM Na₂HPO₄, pH-Wert 5,5, 200 mM NaCl, 0,5 mM DTT gewaschen. Histag-Shh wurde mit 800 mM NaCl im gleichen Puffer eluiert. Die Elutionsfraktionen wurden auf ihre Absorption bei 280 nm und durch SDS-PAGE analysiert. Imidazol (1 M Vorratslösung vom pH-Wert 7 und NaCl (5 M Vorratslösung) wurden zu einem Pool der Shh enthaltenden Peakfraktionen aus dem SP-Sepharose-Eluat gegeben, wobei Endkonzentrationen von 20 mM bzw. 1 M erzielt wurden. Dieses Material wurde auf eine NTA-Ni-Agarose-Säule (Qiagen, Santa Clara, CA) (20 mg/ml Harz), die mit 25 mM Na₂HPO₄, pH-Wert 8, 1 M NaCl, 20 mM Imidazol, 0,5 mM DTT äquilibriert worden war, aufgesetzt. Die Säule wurde mit 5 CV des gleichen Puffers gewaschen und Histag-Shh wurde mit 3 CV 25 mM Na₂HPO₄, pH-Wert 8, 1 M NaCl, 200 mM Imidazol, 0,5 mM DDT eluiert. Der Proteingehalt im Eluatpool aus der NTA-Ni-Säule wurde durch Absorption bei 280 nm bestimmt. Der Pool wurde auf Raumtemperatur erwärmt und sodann mit einem gleichen Volumen an 2,5 M Natriumsulfat versetzt. Die Phenyl-Sepharose-Stufe wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. Das Material wurde auf eine Phenyl-Sepharose Fast Flow-Säule (Pharmacia, Piscataway, NJ) (20 mg/ml Harz), die mit 25 mM Na₂HPO₄, pH-Wert 8, 400 mM NaCl, 1,25 M Natriumsulfat, 0,5 mM DTT äquilibriert worden war, aufgesetzt. Histag-Shh wurde mit 25 mM Na₂HPO₄, pH-Wert 8, 400 mM NaCl, 0,5 mM DTT eluiert. Typischerweise gewannen wir 2–3 g His-markiertes Shh aus 0,5 kg Bakterienpaste (Feuchtgewicht). Das Produkt wurde durch ein 0,2 μm-Filter filtriert, in Aliquotanteile aufgeteilt und bei –70 °C aufbewahrt. Das His-markierte Shh war gemäß Bestimmung durch SDS-PAGE zu etwa 95 % rein. Als weitere Bestimmung der Eigenschaften des gereinigten Produkts wurden Proben einer Bewertung durch Elektrospray-Ionisationsmassenspektrometrie (ESI-MS) unterworfen. Bei etwa 50 % des Proteins fehlte das N-terminale Methionin.
Zur Abspaltung der Hexahistidin-Markierung wurde Enterokinase (Biozyme, San Diego, CA) mit dem Histag-Shh bei einem Verhältnis von Enzym zu Shh von 1:1000 (Gew./Gew.) 2 Stunden bei 28 °C inkubiert. Nicht-gespaltenes Histag-Shh und freies Histag wurden durch Passage des Verdauungsprodukts durch eine zweite NTA-Ni-Agarose-Säule (20 mg Shh/ml Harz) entfernt. Vor dem Aufsetzen wurde das Verdauungsprodukt mit Imidazol (1 M Vorratslösung vom pH-Wert 7) und NaCl (5 M Vorratslösung) versetzt, wobei Endkonzentrationen von 20 mM bzw. 600 mM erzielt wurden. Dieses Material wurde auf eine NTA-Ni-Säule, die in 25 mM Na₂HPO₄, pH-Wert 8, 600 mM NaCl, 20 mM Imidazol, 0,5 mM DTT äquilibriert worden war, aufgesetzt. Das durchfließende Material wurde gesammelt. Die Säule wurde mit 1 CV des gleichen Puffers gewaschen. Die Waschflüssigkeit wurde mit dem durchfließenden Material vereinigt. MES (0,5 M Vorratslösung vom pH-Wert 5) wurde zu der ungebundenen NTA-Ni-Agarose-Fraktion in einer Endkonzentration von 50 mM gegeben. 2 Volumenteile Wasser wurden zugegeben. Dieses Material wurde auf eine zweite SP-Sepharose Fast Flow-Säule (20 mg/ml Harz), die mit 5 mM Na₂HPO₄, pH-Wert 5,5, 150 mM NaCl, 0,5 mM DTT äquilibriert worden war, aufgesetzt. Die Säule wurde mit 3 CV Äquilibrationspuffer und 1 CV des gleichen Puffers mit einem Gehalt an 300 mM NaCl gewaschen. Shh wurde mit 5 mM Na₂HPO₄, pH-Wert 5,5, 800 mM NaCl, 0,5 mM DTT eluiert. Die Atomabsorptionsdaten ergaben, dass Shh in diesem Stadium 0,5 Moläquivalent Zn²⁺ enthielt. Eine äquimolare Konzentration von ZnCl₂ wurde zum Shh-Elutionsprodukt gegeben. Das Protein wurde gegen 5 mM Na₂HPO₄, pH-Wert 5,5, 150 mM NaCl, 0,5 mM DTT dialysiert. Das erhaltene Shh wies eine Reinheit von >98 % auf, wie durch SDS-PAGE, Größenausschlusschromatographie (SEC) und ESI-MS bestimmt wurde. Gemäß Atomabsorption enthielt es 0,9 bis 1,1 Zn²⁺/Shh.
Die ESI-MS-Daten für Histag-Shh und die Produkte nach Entfernung des Histags sind in Tabelle 7 zusammengestellt.
Tabelle 7 Charakterisierung von Shh durch ESI-MS
B. Spezifische chemische Modifikationen
Modifikation von humanem Sonic-Hedgehog mit N-Ethylmaleinimid: Gereinigtes Shh wurde in 5 mM Na₂HPO₄, pH-Wert 5,5, 150 mM NaCl, 0,5 mM DTT mit 10 mM N-Ethylmaleinimid 1 Stunde auf Eis behandelt und sodann gegen 5 mM Na₂HPO₄, pH-Wert 5,5, 150 mM NaCl dialysiert. Die MALDI-TOF-MS-Daten zeigten, dass das mit N-Ethylmaleinimid (NEM) modifizierte Protein eine Massenzunahme von 126 Da aufwies, was zeigt, dass nur ein Cysteinrest in Shh durch das Reagenz modifiziert worden war. Die Daten der N-terminalen Sequenzierung zeigten, dass das Protein sequenzierbar ist und dass ein ungewöhnlicher Peak, vermutlich durch PTH-NEM-Cys bedingt, im ersten Zyklus nachgewiesen wurde (Daten nicht aufgeführt). Eine massenspektrometrische Analyse des pyridylethylierten NEM-Shh unter Denaturierungsbedingungen ergab, dass nur zwei Cysteinreste im Protein alkyliert waren, was bestätigt, dass nur die Thiolgruppe des N-terminalen Cysteinrestes durch NEM unter nativen Bedingungen modifiziert wurde (Tabelle 8). Die beiden übrigen Cysteinreste, die offensichtlich im hydrophoben Kern des Proteins eingeschlossen sind, können ohne vorherige Denaturierung nicht modifiziert werden.
Tabelle 8 Charakterisierung von NEM-modifiziertem Shh durch MS
Beim Test mit dem C3H10T1/2-Test (vergl. Beispiel 3) zeigte das modifizierte N-Ethylmaleinimid-Hedgehog-Protein eine gleiche Aktivität wie das unmodifizierte Protein. Dies belegt, dass ein freies Sulfhydryl am N-Terminus von Hedgehog für die Aktivität nicht erforderlich war und dass der N-Ethylmaleinimidrest ausreichend hydrophob ist, um dem Hedgehog eine gewisse Aktivität zu verleihen, verglichen mit anderen, stärker hydrophilen Modifikationen, wie eine Umwandlung von Cys-1 in His oder Asp, was zu einer Aktivitätsverringerung führt.
Modifikation von humanem Sonic-Hedgehog mit Formaldehyd unter Bildung eines N-terminalen Thiaprolins sowie mit Acetaldehyd und Butyraldehyd unter Bildung von N-terminalen Thiaprolia-Derivaten: Für die Formaldehyd-Modifikation wurde gereinigtes Shh in einer Konzentration von 3 mg/ml in 5 mM Na₂HPO₄, pH-Wert 5,5, 150 mM NaCl, 0,5 mM DTT mit 0,1 % Formaldehyd mit oder ohne 10 % Methanol 1 bis 6 Stunden bei Raumtemperatur behandelt. Das Protein wurde entweder gegen 5 mM Na₂HPO₄, pH-Wert 5,5, 150 mM NaCl dialysiert oder an einer CM-Poros-Säule (Perseptive Biosystems) gemäß den nachstehenden Angaben gereinigt und anschließend gegen 5 mM Na₂HPO₄, pH-Wert 5,5, 150 mM NaCl dialysiert. Zur Modifikation mit Acetaldehyd oder Butyraldehyd wurde gereinigtes Shh in einer Konzentration von 3 mg/ml in 5 mM Na₂HPO₄, pH-Wert 5,5, 150 mM NaCl, 0,5 mM DTT mit 0,1 % Acetaldehyd oder Butyraldehyd 1 Stunde bei Raumtemperatur behandelt und sodann wurde das Protein an einer CM-Poros-Säule gereinigt. ESI-MS-Daten für die mit Formaldehyd, Acetaldehyd und Butyraldehyd behandelten Formen des Proteins ergaben, dass ihre Massen 13 Da, 27 Da und 54 Da höher waren als beim unmodifizierten Protein (Tabelle 9).
Tabelle 9 Erwartete und beobachtete Massen von humanem Sonic-Hedgehog nach Behandlung mit Formaldehyd Acetaldehyd und Butyraldehyd
Für das mit Formaldehyd behandelte Protein zeigte eine Peptidkartierung gemäß den vorstehenden Angaben, dass die Modifikation im Peptid an einer Stelle erfolgte, die die ersten 9 N-terminalen Reste überspannte und dass die genaue Massenzunahme 12 Da betrug. Die Ergebnisse von MALDI-PSD-MS-Untersuchungen dieses Peptids ergaben, dass die Modifikation an Cys-1 erfolgte und durch eine Modifikation des N-terminalen α-Amins und der Thiol-Seitenkette von Cys-1 unter Bildung eines Thiaprolins erklärt werden konnte (vergl. 12). Die Struktur des Thiaprolins wurde durch automatisierte, N-terminale Edman-Sequenzierung unter Verwendung von "on-line" hergestelltem PTH-Thiaprolin als Standard bestätigt. Für die mit Acetaldehyd und Butyraldehyd behandelten Proteine stimmten die ESI-MS-Daten mit den Modifikationen überein, die mit Hilfe der gleichen Chemie wie bei der Umsetzung mit Formaldehyd auftraten, obgleich die genaue Modifikationsstelle nicht festgestellt wurde. Beim Test auf der Basis von C3H10T1/2-Zellen waren die mit Formaldehyd, Acetaldehyd und Butyraldehyd modifizierten Proteine etwa 8-fach, 2-fach bzw. 3-fach stärker wirksam als das unmodifizierte Shh.
Modifikation von humanem Sonic-Hedgehog mit N-
Isopropyliodacetamid: Dieses Beispiel zeigt, dass eine Modifikation von humanem Shh mit einem hydrophoben Derivat von Iodacetamid die Wirkungsstärke des Proteins im Vergleich zum unmodifizierten Shh verstärken kann. Gereinigtes Shh (1 mg/ml in 5 mM Na₂HPO₄, pH-Wert 7,0, 150 mM NaCl, 0,1 mM DTT) wurde 18 Stunden bei 4 °C mit 1 mM N-Isopropyliodacetamid (NIPIA) inkubiert. Sodann wurde DTT in einer Endkonzentration von 10 mM zugegeben und die Probe wurde gründlich gegen 5 mM Na₂HPO₄, pH-Wert 5,5, 150 mM NaCl, 0,5 mM DTT dialysiert. Die Probe wurde an SP-Sepharose Fast-Flow-Harz gereinigt und weiter gegen 5 mM Na₂HPO₄, pH-Wert 5,5, 150 mM NaCl, 0,5 mM DTT dialysiert. Die ESI-MS-Daten ergaben eine vollständige Umwandlung in eine Spezies mit einer Masse von 19 660, was dem vorhergesagten Massewert (19 659) für das einfach modifizierte Protein entsprach. Eine spezifische Modifikation am N-terminalen Cystein wurde durch Peptidkartierung von proteolytischen Fragmenten bestätigt. Beim Testen mit dem Test auf der Basis von C3H10T1/2-Zellen war das mit NIPIA modifizierte, humane Shh etwa 2-fach stärker wirksam als das unmodifizierte Protein. Während die Modifikation des Proteins nur eine mäßige Steigerung der Wirkungsstärke ergab, ist zu erwarten, dass eine Modifikation des Proteins mit langkettigen Alkyliodacetamid-Derivaten zu hydrophob modifizierten Formen des Proteins mit einer größeren Steigerung der Wirkungsstärke führt, möglicherweise zu einer nahezu 100- bis 200-fachen Steigerung, die für die palmitoylierten, myristoylierten und lauroylierten Shh-Proteine festgestellt wurde (vergl. Beispiel 8).
Modifikation von humanem Sonic-Hedgehog mit 1-Brom-2-butanon unter Bildung eines 6-gliedrigen hydrophoben Rings am N-Terminus: Ein Thiomorpholinyl-(tetrahydrothiazinyl)-Derivat von Shh wurde hergestellt, indem man humanes Shh-N (3 mg/ml in 5 mM Na₂HPO₄, pH-Wert 5,5, 150 mM NaCl, 0,15 mM DTT) mit 11 mM 1-Brom-2-butanon 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubierte und anschließend 60 Minuten bei Raumtemperatur mit 5 mM NaCNBH₃ reduzierte. Das Reaktionsprodukt wurde an einer CM-Poros-Säule (Perseptive Biosystems) gemäß den nachstehenden Angaben gereinigt und gegen 5 mM Na₂HPO₄, pH-Wert 5,5, 150 mM NaCl, 0,5 mM DTT dialysiert. ESI-MS und die Daten einer proteolytischen Peptidkartierung ergaben, dass es sich bei dem Produkt um ein Gemisch des erwarteten Thiomorpholinyl-Derivats (berechnete Masse = 19 615, beobachtete Masse = 19 615) und zwei Formen des Proteins jeweils mit 16 zusätzlichen Masseeinheiten handelte. Bei einer dieser Formen handelt es sich vermutlich um das nicht-cyclisierte Ketothioether-Zwischenprodukt. Das Gemisch wurde im C3H10T1/2-Test getestet, wobei sich ergab, dass es etwa 5-fach stärker wirksam als das nicht-modifizierte Protein war.
Beispiel 10
Gentechnisch hergestellte Mutationen von humanem Sonic-Hedgehog
A. Gentechnisch hergestellte Mutationen des N-terminalen Cysteins
In diesem Beispiel zeigen wir, dass ein spezifisches Ersetzen des N-terminalen Cysteins von humanem Sonic-Hedgehog (Cys-1) durch einzelne oder mehrere hydrophobe Aminosäurereste zu einer erhöhten Wirkungsstärke im Vergleich zum Wildtypprotein bei dem in Beispiel 3 beschriebenen Test auf der Basis von C3H10T1/2-Zellen führt.
Konstruktion von Shh-Cys-1-Mutanten: Das 584 bp-NcoI-XhoI-Restriktionsfragment mit dem His-markierten N-terminalen Wildtyp-Shh-Fragment aus p6H-SHH wurde in den von pUC abgeleiteten Klonierungsvektor pNN05 subkloniert, um das Plasmid pEAG649 zu konstruieren. Cys-1-Mutanten von löslichem, humanem Shh wurden durch Eliminationsmutagenese an einer einzigen Stelle der pEAG649-Plasmidmatrize unter Verwendung eines Pharmacia-Kits gemäß dem vom Hersteller empfohlenen Verfahren hergestellt. Bei der Konstruktion der Mutageneseprimer wurde dann, wenn eine angestrebte Mutation keine Restriktionsstellenänderung hervorrief, eine stumme Mutation, die eine Restriktionsstellenänderung hervorruft, in ein benachbartes Codon eingeführt, um die Identifizierung von mutanten Klonen nach der Mutagenese zu erleichtern. Um eine fehlerhafte Codonanwendung zu vermeiden, wurden substituierte Codons unter den Codons ausgewählt, die mindestens 1-mal an einer anderen Stelle in der humanen Shh-cDNA-Sequenz auftreten. Die folgenden Mutageneseprimer wurden eingesetzt: (1) für C1F: 5' GGC GAT GAC GAT GAC AAA TTC GGA CCG GGC AGG GGG TTC 3' (SEQ ID NO: ), die eine ApoI-Stelle einführt, zur Herstellung von pEAG837; (2) für C1I: 5' GGC GAT GAC GAT GAC AAA ATA GGA CCG GGC AGG GGG TTC 3' (SEQ ID NO: ), die eine RsrII-Stelle beseitigt, zur Herstellung von pEAG838; und (3) für C1M: 5' GGC GAT GAC GAT GAC AAA ATG GGC CCG GGC AGG GGG TTC GGG 3' (SEQ ID NO: ), die sowohl die RsrII- als auch AvaII-Stellen beseitigt, um pEAG839 herzustellen. Die Mutationen wurden durch DNA-Sequenzierung über ein 180 bp-NcoI-BglII-Restriktionsfragment mit den mutanten N-Termini des Shh-Proteins in den Plasmiden pEAG837-839 bestätigt. Expressionsvektoren wurden konstruiert, indem von den einzelnen Plasmiden das 180 bp-NcoI-BglII-Fragment und das 404 bp BglII-XhoI-Fragment aus pEAG649 in das mit Phosphatase behandelte 5,64 kb-Xho-NcoI-pET11d-Vektorgerüst von p6H-SHH subkloniert wurden. Die Anwesenheit der eingeführten Restriktionsstellenänderung wurde im Expressionsvektor für jede Cys-1-Mutante bestätigt (C1F in pEAG840, C1I in pEAG841 und C1M in pEAG842). Expressionsvektoren wurden in kompetentes E. coli-BL21 (DE3) pLysS (Stratagene) gemäß dem vom Hersteller empfohlenen Verfahren transformiert und auf LB-Agarplatten mit einem Gehalt an 100 μg/ml Ampicillin und 30 μg/ml Chloramphenicol selektiert. Individuelle Kolonien wurden selektiert und transformierte Bakterien wurden bis zu einem A₆₀₀-Wert von 0,4–0,6 gezüchtet und 3 Stunden mit 0,5 mM IPTG induziert. Bakterielle Pellets wurden in Bezug auf die Expression der mutanten Proteine durch reduzierende SDS-PAGE und durch Western-Blotting analysiert.
Eine lösliche, humane Shh-Mutante mit mehrfachen N-terminalen, hydrophoben Substitutionen (ClII) wurde durch Einzelstellen-Eliminationsmutagenese unter Verwendung eines Pharmacia-Kits gemäß dem vom Hersteller empfohlenen Verfahren hergestellt. Bei der Konstruktion der Mutageneseprimer wurde dann, wenn eine angestrebte Mutation keine Restriktionsstellenänderung hervorrief, eine stumme Mutation, die eine Restriktionsstellenänderung hervorruft, in ein benachbartes Codon eingeführt, um die Identifizierung von mutanten Klonen nach der Mutagenese zu erleichtern. Um eine fehlerhafte Codonanwendung zu vermeiden, wurden substituierte Codons unter den Codons ausgewählt, die mindestens 1-mal an einer anderen Stelle in der humanen Shh-cDNA-Sequenz auftreten. Die folgenden Mutageneseprimer wurden am C1F-Matrizenplasmid pEAG837 für C1II verwendet: 5' GCG GCG ATG ACG ATG ACA AAA TCA TCG GAC CGG GCA GGG GGT TCG GG 3' (SEQ ID NO: ), die eine ApoI-Stelle entfernt, um pEAG872 herzustellen. Mutationen wurden durch DNA-Sequenzierung über ein 0,59 kb-NcoI-XhoI-Restriktionsfragment mit dem mutanten C1II-Shh bestätigt. Ein Expressionsvektor wurde durch Subklonieren des NcoI-XhoI-Fragments des mutanten Plasmids in das mit Phosphatase behandelte 5,64 kb-XhoI-NcoI-pET11d-Vektorgerüst von p6H-SHH konstruiert. Die Anwesenheit der eingeführten Restriktionsstellenänderung wurde im Expressionsvektor für die C1II-Mutante pEAG875 erneut bestätigt. Der Expressionsvektor wurde in kompetentes E. coli-BL21 (DE3) pLysS (Stratagene) gemäß dem von Hersteller empfohlenen Verfahren transformiert und auf LB-Agarplatten mit einem Gehalt an 100 μg/ml Ampicillin und 30 μg/ml Chloramphenicol selektiert. Individuelle Kolonien wurden selektiert und transformierte Bakterien wurden bis zu einem A₆₀₀-Wert von 0,4–0,6 gezüchtet und 3 Stunden mit 0,5 mM IPTG induziert. Bakterielle Pellets wurden gemäß den vorstehenden Angaben analysiert, um die Expression von mutantem Shh-Protein zu bestätigen.
Reinigung von Cys-1-Mutanten von humanem Sonic- Hedgehog: Die mit His markierten, mutanten Hedgehog- Proteine wurden aus bakteriellen Pellets gemäß den vorstehenden Angaben für das Wildtyp-Protein mit Ausnahme der folgenden beiden Modifikationen gereinigt. (1) Die Phenyl-Sepharose-Stufe wurde weggelassen und statt dessen wurde der Proteinpool aus der ersten NTA-Ni-Agarose-Säule in 25 mM Na₂HPO₄, pH-Wert 8, 400 mM NaCl, 0,5 mM DTT bei der Vorbereitung für die Enterokinase-Spaltungsstufe dialysiert. (2) Die Ionenaustauschstufe am Schluss wurde von einer Stufenelution an SP-Sepharose-Fast Flow in eine Gradientenelution aus einer CM-Poros-Säule (Perseptive Biosystems) abgeändert. Dies wurde in 50 mM Na₂HPO₄, pH-Wert 6,0, mit einem 0–800 mM NaCl-Gradienten über 30 Säulenvolumina hinweg durchgeführt. Die vereinigten Peakfraktionen aus dieser Stufe wurden in 5 mM Na₂HPO₄, pH-Wert 5,5, 150 mM NaCl dialysiert und bei –80 °C aufbewahrt. Eine massenspektrometrische Analyse der gereinigten Proteine ergab die vorhergesagten Masseionen für jede gereinigte Form.
Aktivität der Cys-1-Mutanten von humanem Sonic-Hedgehog: Wie in Tabelle 10 dargelegt, weist eine Mutation des N-terminalen Cysteins eine signifikante Wirkung auf die Wirkungsstärke des erhaltenen Hedgehog-Proteins beim C3H10T1/2-Test auf. Für einzelne Änderungen korreliert im allgemeinen die Wirkungsstärke mit der Hydrophobizität der substituierten Aminosäure, d. h. Phenylalanin und Isoleucin ergeben die stärkste Aktivierung und Methionin erweist sich als weniger aktivierend, während Histidin und Asparaginsäure die Aktivität im Vergleich zum Wildtyp-Cystein verringern. Ersetzt man das Cystein durch 2 Isoleucinreste, so ergibt sich eine zusätzliche Steigerung der Aktivität gegenüber der einzelnen Isoleucin-Substitution. Aufgrund der Tatsache, dass 9 Aminosäuren im Vergleich zu Cystein als stärker hydrophob eingestuft werden (Proteins: Structures and Molecular Properties, 2. Auflg., 1993, T. E. Creighton, W. H. Freeman Co., S. 154), stellen die vorstehend getesteten Substitutionen in klarer Weise keinen erschöpfenden Überblick über die möglichen Mutationen am N-Terminus, die zur Entstehung von aktiveren Formen von Hedgehog führen können, dar. Jedoch belegen die Ergebnisse, dass eine Aktivierung nicht auf eine einzelne Aminosäurestruktur beschränkt ist und dass eine Substitution von mehr als einer Aminosäure zu einer weiteren Steigerung der Wirkungsstärke führen kann. Daher kann ein Fachmann Formen von Hedgehog mit anderen Aminosäuresubstitutionen am N-Terminus erzeugen, von denen zu erwarten ist, dass sie im Vergleich zum Wildtyp-Protein eine höhere Wirkunsstärke aufweisen.
Tabelle 10 Relative Wirkungsstärke von Aminosäure-Modifikationen von humanem Sonic-Hedgehog beim C3H10T1/2-Test
B. Gentechnisch hergestellte Mutationen von internen Resten
Konstruktion der C1II/A169C-Mutante: Die lösliche, humane Shh-Mutante C1II/A169C (mit einer Cystein-Substitution anstelle des entbehrlichen C-terminalen Restes A169, für den eine hohe, fraktionelle Lösungsmittelzugänglichkeit vorhergesagt wird) wurde durch Einzelstellen-Eliminationsmutagenese unter Verwendung eines Pharmacia-Kits gemäß dem von Hersteller empfohlenen Verfahren und unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Mutagenese-Oligo-Konstruktionsprinzipien hergestellt. Der folgende Mutageneseprimer 5' GAG TCA TCA GCC TCC CGA TTT TGC GCA CAC CGA GTT CTC TGC TTT CAC C 3' (SEQ ID NO: ) wurde an der C1II-Shh-Matrize pEAG872 verwendet, um eine FspI-Stelle zur Herstellung von pSYS049 zu addieren. Die C1II/A169C-Mutationen wurden durch DNA-Sequenzierung über ein 0,59 kb-NcoI-XhoI-Restriktionsfragment bestätigt. Der Expressionsvektor pSYS050 wurde durch Subklonierung des NcoI-XhoI-Fragments in das mit Phosphatase behandelte 5,64 kb-XhoI-NcoI-pET11d-Vektorgerüst von p6H-SHH konstruiert. Die Anwesenheit der eingeführten Restriktionsstellenänderung wurde im Expressionsvektor erneut bestätigt. Der Expressionsvektor wurde in kompetentes E. coli BL21(DE3)pLysS transformiert. Kolonien wurden auf die vorstehend angegebene Weise selektiert, induziert und auf Shh-Expression abgesucht.
Reinigung der C1II/A169C-Mutante: Die C1II/A169C-Mutante wurde gemäß den Angaben in Beispiel 9 für Wildtyp-Shh gereinigt, mit Ausnahme der folgenden Modifikationen: (1) EDTA wurde im Lysis-Puffer weggelassen; (2) die Reihenfolge der NTA-Ni- und SP-Sepharose-Stufen wurde vertauscht und die Phenyl-Sepharose-Stufe wurde weggelassen; (3) nach Klärung der lysierten Bakterien durch Zentrifugation wurde der Überstand mit zusätzlichem NaCl bis zu einer Endkonzentration von 300 mM versetzt; (4) der Elutionspuffer aus der NTA-Ni-Säule enthielt 25 mM Na₂HPO₄, pH-Wert 8,0, 200 mM Imidazol, 400 mM NaCl; (5) der Elutionspool aus der NTA-Ni-Säule wurde mit 3 Volumenteilen 100 mM MES, pH-Wert 5,0, verdünnt, bevor er auf die SP-Sepharose-Säule aufgesetzt wurde; (6) vor der Zugabe von Enterokinase wurde der SP-Sepharose-Elutionspool mit einem halben Volumenteil 50 mM Na₂HPO₄, pH-Wert 8,0, verdünnt; und (7) der Elutionspuffer der endgültigen SP-Sepharose-Säule enthielt 0,2 mM DTT und der Elutionspool aus dieser Stufe wurde in Aliquotanteile aufgeteilt und bei –70 °C aufbewahrt.
Hydrophobe Modifikation und Aktivität der C1II/A169C-Mutante: Zur Modifikation mit N-(1-Pyren)-maleinimid (Sigma) wurde gereinigtes C1II/A169C in einer Konzentration von 4,6 mg/ml in 5 mM Na₂HPO₄, pH-Wert 5,5, 800 mM NaCl, 0,2 mM DTT mit einem gleichen Volumen an 50 mM MES, pH-Wert 6,5, verdünnt. Sodann wurde Pyren-maleinimid aus einer 2,5 mg/ml-Vorratslösung in DMSO in einer Menge von 1/20 des Volumens zugegeben. Die Probe wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wurde weiteres DTT bis zu 0,5 mM zugegeben und die Probe wurde eine weitere Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Das modifizierte Protein wurde direkt im C3H10T1/2-Test gemäß den Angaben in Beispiel 3 auf seine Aktivität getestet. Vor der Modifikation betrug die spezifische Aktivität des Proteins EC₅₀ = 0,22 μg/ml, während nach der Behandlung mit Pyren-maleinimid die spezifische Aktivität auf EC₅₀ = 0,08 μg/ml gestiegen war. Erhöhungen der spezifischen Aktivität des modifizierten Produkts bis zum 3-fachen wurden häufig beobachtet, was zeigt, dass die Zugabe der hydrophoben Gruppe nahe am C-Terminus von Shh zu einer weiteren Zunahme der Aktivität im Vergleich zum C1II-Ausgangsmaterial führte. Beim Vergleich mit unmodifiziertem Wildtyp-Sonic-Hedgehog-Protein war das mit N-(1-Pyren)-maleinimid modifizierte C1II-Protein etwa 30-fach stärker wirksam. Während Pyren-maleinimid ein einfaches Testsystem zur Bewertung der Modifikation an dieser Stelle darstellt, können auch andere hydrophobe Maleinimide oder andere auf Cystein abgestellte chemische Verfahren herangezogen werden.
Beispiel 11
Vergleich der Wirkungsstärke von verschiedenen, hydrophob modifizierten Formen von humanem Sonic-Hedgehog im C3H10T1/2-Test
Die Aktivität von verschiedenen, hydrophob modifizierten Formen von humanem Sonic-Hedgehog (hergestellt unter Anwendung der im Abschnitt V beschriebenen chemischen Verfahren und gentechnischen Verfahren) wurde gemäß Beispiel 3 im C3H10T1/2-Test getestet.
Die Derivate wurden über einen Konzentrationsbereich gemäß den Angaben in Beispiel 3 getestet. Die Konzentration eines Hedgehog-Derivats, die zu 50 % der maximalen Reaktion beim Test führte, wurde mit der Wildtyp-Konzentration verglichen. Die relativen Aktivitäten sind nachstehend in Tabelle 11 und in 13 angegeben.
Tabelle 11 Relative Wirkungsstärke von Hedgehog-Derivaten beim C3H10T1/2-Test
Der C3H10T1/2-Test belegt, dass eine große Vielzahl von hydrophoben Modifikationen an Hedgehog die Aktivität des Proteins im Vergleich zum unmodifizierten Wildtyp-Protein erhöht. Hydrophile Modifikationen (Asparaginsäure und Histidin) weisen nicht diese Wirkung auf.
Beispiel 12
Bewertung der Wirksamkeit von hydrophob modifiziertem, humanem Sonic-Hedgehog in einem durch Malonat induzierten Ratten-Striatum-Läsionstest
Eine Injektion von Malonat, einem Inhibitor des mitochondriellen Enzyms Succinat-dehydrogenase, in das Ratten-Striatum (Nagetier-Äquivalent von Primaten-Nucleus caudatus und Putamen) verursacht eine Degeneration von mittelgroßen bedornten Neuronen des Striatums. Beim Menschen stellt eine Degeneration der mittelgroßen gedornten Neuronen im Nucleus caudatus und Putamen das primäre pathologische Merkmal der Huntington-Krankheit dar. Somit kann die durch Malonat induzierte striatale Läsion bei Ratten als Modell für den Test herangezogen werden, ob hydrophob modifizierte Hedgehog-Proteine den Tod der Neuronen, die bei der Huntington-Krankheit degenerieren, verhindern kann.
Sprague-Dawley-Ratten erhielten eine Injektion verschiedener Konzentrationen von hydrophob modifiziertem, humanem Sonic-Hedgehog in das Striatum unter Anwendung stereotaktischer Techniken. Stereotaktische Injektionen (2 μl) wurden unter Betäubung mit Natrium-Pentobarbital (40 mg/kg) durchgeführt und an den folgenden Koordinaten platziert: 0,7 mm vor dem Scheitel, 2,8 mm lateral zur Mittellinie und 5,5 mm ventral zur Oberfläche des Schädels am Scheitel. Zu verschiedenen Zeitpunkten (üblicherweise 48 Stunden) nach Injektion des hydrophob modifizierten Proteins wurden die Ratten mit Isofluran betäubt und erhielten eine stereotaktische Injektion von Malonat (2 μmol in 2 μl) an den gleichen Koordinaten des Striatums. 4 Tage nach der Injektion von Malonat wurden die Ratten getötet. Ihre Gehirne wurden für eine histologische Analyse entnommen. Coronale Schnitte wurden durch das Striatum in einer Dicke von 25 μm vorgenommen und einer Färbung auf Cytochrom-oxidase-Aktivität unterzogen, um geschädigtes Gewebe von ungeschädigtem Gewebe zu unterscheiden. Das Volumen der Läsion im Striatum wurde unter Verwendung eines Bildanalysensystems gemessen.
Der Einfluss von hydrophob modifiziertem, humanem Sonic-Hedgehog-Protein bei dem durch Malonat induzierten Ratten-Striatum-Läsionsmodell ist in 14 dargestellt. Unmodifiziertes Sonic-Hedgehog (hergestellt gemäß Beispiel 9), myristoyliertes Shh (hergestellt gemäß Beispiel 8) und die C1II-Mutante von Shh (hergestellt in Beispiel 10) verringerten in diesem Modell alle das Läsionsvolumen in einem ähnlichen Ausmaß. Jedoch zeigten die hydrophob modifizierten Proteine (myristoyliertes Shh und C1II-Shh) eine Steigerung der Wirkungsstärke im Vergleich zu unmodifiziertem Sonic-Hedgehog.
Beispiel 13
N-Octylmaleinimid-Derivatisierung von Shh-N
Für eine Endkonzentration von 1 mg/ml

1) Eine 20 mM-Lösung von Octylmaleinimid (MG = 209) in DMSO wird hergestellt (~4,2 mg/ml).
2) Eine Vorratslösung von 10 mg/ml Shh-N (in 5 mM NaPO₄, pH-Wert 5,5, 150 mM NaCl, 0,5 mM DTT) wird 10-fach mit PBS (Gibco Produkt-Nr. 20012-027, pH-Wert 7,2) verdünnt, wodurch eine Shh-N-Lösung mit 1 mg/ml (oder 50 μM) entsteht. (Anmerkung: DTT, das mit Shh-N um Maleinimid bei der anschließenden Reaktion konkurriert, befindet sich ebenfalls in einer Konzentration von 50 μM in dieser Lösung.)
3) Die Shh-N-Lösung mit 1 mg/ml wird sofort mit 1/200 Volumenteilen Octylmaleinimid (d. h. 5 μl/ml) versetzt. Es ergibt sich ein 2:1-Molverhältnis (100 μM:50 μM) von Octylmaleinimid zu Shh-N.
4) Diese Lösung wird durch vorsichtiges Umkippen des Röhrchens vermischt und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
5) Schließlich wird jedes Röhrchen mit 1/1000 Volumenteilen 0,35 M DTT als Abfangmittel für etwaiges restliches Octylmaleinimid und als Reduktionsmittel versetzt.
6) Für eine Träger-Kontrolle wird eine Lösung des Trägers (5 mM NaPO₄, pH-Wert 5,5, 150 mM NaCl, 0,5 mM DTT) mit PBS (Gibco Produkt-Nr. 20012-027, pH-Wert 7,2) in einem Verhältnis von 1:10 versetzt. 1/400 Volumenteile 20 mM Octylmaleinimid in DMSO und 1/400 Volumenteile DMSO werden zugegeben, wodurch sich eine Endkonzentration von 50 μM N-Octylmaleinimid und 0,5 % DMSO ergibt. Schließlich werden 1:1000 Volumenteile 0,35 M DTT, zugegeben.

Annähernde Zusammensetzung der Shh-N-Lösung mit 1 mg/ml N-Octylmaleinimid

PBS (~pH-Wert 7,2)
50 μM an N-Octylmaleinimid konjugiertes Shh-N
50 μM an N-Octylmaleinimid konjugiertes DTT
350 μM DTT
0,5 % DMSO

Annähernde Zusammensetzung der N-Octylmaleinimid-Trägerlösung

PBS (~pH-Wert 7,2)
50 μM an N-Octylmaleinimid konjugiertes DTT
350 μM DTT
0,5 % DMSO

Für eine Endkonzentration von 3 mg/ml

1) Eine 60 mM-Lösung von Octylmaleinimid (MG = 209) in DMSO (~12,6 mg/ml) wird hergestellt.
2) Eine Vorratslösung von 10 mg/ml Shh-N (in 5 mM NaPO₄, pH-Wert 5, 5, 150 mM NaCl, 0, 5 mM DTT) wird 10-fach mit PBS (Gibco Produkt-Nr. 20012-027, pH-Wert 7,2) verdünnt, wodurch eine Shh-N-Lösung mit 3 mg/ml (oder 150 μM) entsteht. (Anmerkung: DTT, das mit Shh-N um Maleinimid bei der anschließenden Reaktion konkurriert, befindet sich ebenfalls in einer Konzentration von 150 μM in dieser Lösung.)
3) Die Shh-N-Lösung mit 3 mg/ml wird sofort mit 1/200 Volumenteilen Octylmaleinimid (d. h. 5 μl/ml) versetzt. Es ergibt sich ein 2:1-Molverhältnis (300 μM:150 μM) von Octylmaleinimid zu Shh-N.
4) Diese Lösung wird durch vorsichtiges Umkippen des Röhrchens vermischt und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
5) Schließlich wird jedes Röhrchen mit 1/1000 Volumenteilen 0,35 M DTT als Abfangmittel für etwaiges restliches Octylmaleinimid und als Reduktionsmittel versetzt.
6) Für eine Träger-Kontrolle wird eine Lösung des Trägers (5 mM NaPO₄, pH-Wert 5,5, 150 mM NaCl, 0,5 mM DTT) mit PBS (Gibco Produkt-Nr. 20012-027, pH-Wert 7,2) in einem Verhältnis von 3:7 versetzt. 1/400 Volumenteile 60 mM Octylmaleinimid in DMSO und 1/400 Volumenteile DMSO werden zugegeben, wodurch sich eine Endkonzentration von 150 μM N- Octylmaleinimid und 0,5 % DMSO ergibt. Schließlich werden 1:1000 Volumenteile 0,5 M DTT, zugegeben.

Annähernde Zusammensetzung der Shh-N-Lösung mit 3 mg/ml N-Octylmaleinimid

PBS (~pH-Wert 7,2)
150 μM an N-Octylmaleinimid konjugiertes Shh-N
150 μM an N-Octylmaleinimid konjugiertes DTT
500 μM DTT
0,5 % DMSO

Annähernde Zusammensetzung der N-Octylmaleinimid-Trägerlösung

PBS (~pH-Wert 7,2)
150 μM an N-Octylmaleinimid konjugiertes DTT
500 μM DTT
0,5 % DMSO
0,5 % DMSO

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Alle oben genannten Druckschriften und Veröffentlichungen werden hiermit durch Inbezugnahme mit eingeschlossen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Protein, umfassend eine N-terminale Aminosäure und eine C-terminale Aminosäure, wobei es sich bei dem Protein um ein Hedgehog-Protein handelt, das ausgewählt ist aus: (a) einem Protein mit einem N-terminalen Cystein, an das mindestens ein hydrophober Rest angeheftet ist; (b) ein Protein mit einer N-terminalen Aminosäure, bei der es sich nicht um ein Cystein, an das mindestens ein hydrophober Rest angehängt ist, handelt; (c) ein Protein mit mindestens einem hydrophoben Rest, der die N-terminale Aminosäure ersetzt; wobei das Hedgehog-Protein nicht an der C-terminalen Aminosäure mit einem Sterol modifiziert ist und wobei der hydrophobe Rest aus Peptiden ausgewählt ist, die mindestens eine hydrophobe Aminosäure oder einen Lipidrest umfassen.
Protein nach Anspruch 1, wobei es sich bei den hydrophoben Resten um ein Peptid handelt, das mindestens eine hydrophobe Aminosäure umfasst.
Protein nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem hydrophoben Rest um ein Lipid handelt.
Protein nach Anspruch 1, wobei das Protein ferner einen hydrophoben Rest umfasst, der die C-terminale Aminosäure ersetzt oder an diese angehängt ist.
Protein nach Anspruch 1, wobei das Hedgehog-Protein ein bioaktives Fragment eines Hedgehog-Proteins umfasst.
Protein nach Anspruch 1, wobei es sich bei der N-terminalen Aminosäure um ein funktionelles Derivat von Cystein handelt.
Protein nach Anspruch 1, wobei das Protein sowohl an der N-terminalen Aminosäure als auch an der C-terminalen Aminosäure modifiziert ist.
Protein nach Anspruch 4 oder 7, wobei das Protein einen hydrophoben Rest aufweist, der mindestens eine Aminosäure, die zwischen der N-terminalen und der C-terminalen Aminosäure liegt, ersetzt oder an diese angehängt ist.
Protein nach Anspruch 1, wobei das Protein einen hydrophoben Rest aufweist, der mindestens eine Aminosäure, die zwischen der N-terminalen und der C-terminalen Aminosäure liegt, ersetzt oder an diese angehängt ist.
Protein nach Anspruch 3, wobei es sich bei dem Lipidrest um eine Fettsäure handelt, die aus gesättigten und ungesättigten Fettsäuren mit 2 bis 24 Kohlenstoffatomen ausgewählt ist.
Protein nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Protein um ein Hedgehog-Protein handelt, das aus einer Wirbeltierquelle erhältlich ist.
Protein nach Anspruch 11, wobei das Hedgehog-Protein vom Menschen oder der Ratte erhältlich ist.
Protein nach Anspruch 11, wobei das Wirbeltier-Hedgehog-Protein aus Sonic-, Indian-, Desert-Hedgehog oder einem bioaktiven Fragment davon ausgewählt ist.
Protein nach Anspruch 1, ferner umfassend eine Vesikel in Kontakt mit dem hydrophoben Rest.
Protein nach Anspruch 14, wobei die Vesikel unter einer Zellmembran, einer Mizelle und einem Liposom ausgewählt ist.
Protein nach Anspruch 13, wobei das Hedgehog-Protein eine Aminosäuresequenz gemäß einer der Sequenzen SEQ ID NO: 1–4 aufweist.
Protein nach Anspruch 13, wobei dem Hedgehog-Protein verglichen mit einem Wildtyp-Hedgehog-Protein 1 bis etwa 10 Aminosäuren am C-Terminus fehlen.
Protein nach Anspruch 13, wobei das Protein eine mindestens 60%-ige Aminosäureidentität mit Sonic-, Indian- oder Desert-Hedgehog aufweist und das Protein ein "patched"-Protein bindet.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 18 zur Verwendung als Arzneimittel.
Verwendung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 18 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer neurologischen Störung.
Isoliertes Protein nach Anspruch 1 mit einer C-terminalen Aminosäure und einer N-terminalen Thioprolingruppe, wobei die Gruppe durch Umsetzung eines Aldehyds mit einem N-terminalen Cystein des Proteins gebildet worden ist.
Isoliertes Protein nach Anspruch 1 mit einer C-terminalen Aminosäure und einer N-terminalen Amidgruppe, wobei die Gruppe durch Umsetzung eines Fettsäurethioesters mit einem N-terminalen Cystein des Proteins gebildet worden ist.
Isoliertes Protein nach Anspruch 1 mit einer C-terminalen Aminosäure und einer N-terminalen Maleinimidgruppe, wobei die N-terminale Maleinimidgruppe durch Umsetzung einer Maleinimidgruppe mit dem N-terminalen Cystein des Proteins gebildet worden ist.
Isoliertes Protein nach einem der Ansprüche 21 bis 23, wobei die C-terminale Aminosäure des Proteins mit einem hydrophoben Rest modifiziert ist.
Verfahren zur Erzeugung eines mehrwertigen Proteinkomplexes nach Anspruch 1, umfassend die Stufe der Verknüpfung – in Gegenwart einer Vesikel – eines hydrophoben Restes mit einem N-terminalen Cystein eines Proteins oder einem funktionellen Äquivalent des N-terminalen Cysteins, wobei es sich beim mehrwertigen Proteinkomplex um einen mehrwertigen Hedgehog-Proteinkomplex handelt.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Stufe des Verknüpfens das Verknüpfen eines Lipidrestes umfasst, der aus gesättigten und ungesättigten Fettsäuren zwischen 2 bis 24 Kohlenstoffatomen ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei es sich bei dem Protein um ein Hedgehog-Protein oder um ein bioaktives Fragment davon handelt.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei das Hedgehog-Protein unter Sonic-, Indian-, Desert-Hedgehog oder einem bioaktiven Fragment davon ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei das Hedgehog-Protein eine Aminosäuresequenz nach einer der Sequenzen SEQ ID NO: 1–4 aufweist.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Stufe der Verknüpfung das Verknüpfen mit einer Vesikel umfasst, das aus einer Zellmembran, einem Liposom und einer Mizelle ausgewählt ist.
Verfahren zum Modifizieren eines Hedgehog-Proteins, umfassend das Einführen mindestens eines hydrophoben Restes in ein N-terminales Cystein des Hedgehog-Proteins oder in ein funktionelles Äquivalent des N-terminalen Cysteins, um ein Protein nach Anspruch 1 zu bilden.
Verfahren nach Anspruch 31, ferner umfassend das Kontaktieren des hydrophoben Restes mit einer Vesikel.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei es sich bei dem hydrophoben Rest entweder um einen Lipidrest, der aus gesättigten und ungesättigten Fettsäuren mit 2 bis 24 Kohlenstoffatomen ausgewählt ist, oder um ein hydrophobes Protein handelt.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei es sich bei dem Protein um ein Hedgehog-Protein oder um ein bioaktives Fragment davon handelt.
Verfahren nach Anspruch 34, wobei das Hedgehog-Protein unter Sonic-, Indian-, Desert-Hedgehog oder einem bioaktiven Fragment davon ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 34, wobei das Hedgehog-Protein eine Aminosäuresequenz gemäß einer der Sequenzen von SEQ ID NO: 1–4 aufweist.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei die Stufe des Kontaktierens das Kontaktieren mit einer Vesikel, die aus einer Zellmembran, einem Liposom und einer Mizelle ausgewählt ist, umfasst.
Proteinkomplex, hergestellt durch das Verfahren nach Anspruch 25.
Modifiziertes Protein, hergestellt durch das Verfahren von Anspruch 31.
Verfahren zum Modifizieren eines Hedgehog-Proteins, das ein N-terminales Cystein enthält, umfassend das Umsetzen des N-terminalen Cysteins mit einem Fettsäurethioester unter Bildung eines Proteins nach Anspruch 1 mit einem Amid, wobei eine derartige Modifikation die biologische Aktivität des Proteins verstärkt.
Verfahren nach Anspruch 52, wobei es sich bei dem Protein um ein Hedgehog-Protein oder um ein bioaktives Fragment davon handelt.
Verfahren nach Anspruch 41, wobei das Hedgehog-Protein unter Sonic-, Indian-, Desert-Hedgehog oder einem bioaktiven Fragment davon ausgewählt ist.
Verfahren zum Modifizieren eines Hedgehog-Proteins, das ein N-terminales Cystein enthält, umfassend das Umsetzen des N-terminalen Cysteins mit einer Maleinimidgruppe unter Bildung eines Proteins nach Anspruch 1, wobei eine derartige Modifikation die biologische Aktivität des Proteins verstärkt.
Verfahren nach Anspruch 43, wobei es sich bei dem Protein um ein Hedgehog-Protein oder um ein bioaktives Fragment davon handelt.
Verfahren nach Anspruch 44, wobei das Hedgehog-Protein unter Sonic-, Indian-, Desert-Hedgehog oder einem bioaktiven Fragment davon ausgewählt ist.
Isoliertes Hedgehog-Protein nach Anspruch 1, das eine C-terminale Aminosäure und eine N-terminale Acetamidgruppe aufweist, wobei diese Gruppe durch Umsetzen eines substituierten Acetamids mit einem N-terminalen Cystein des Proteins gebildet worden ist.
Isoliertes Hedgehog-Protein nach Anspruch 1 mit einer C-terminalen Aminosäure und einer N-terminalen Thiomorpholingruppe, wobei diese Gruppe durch Umsetzen einer Halogenketongruppe mit einem N-terminalen Cystein des Proteins gebildet worden ist.
Verfahren zum Modifizieren eines Hedgehog-Proteins, das ein N-terminales Cystein enthält, umfassend das Umsetzen des N-terminalen Cysteins mit einer substituierten Acetamidgruppe unter Bildung eines Proteins nach Anspruch 1, wobei die Modifikation die biologische Aktivität des Proteins verstärkt.
Verfahren nach Anspruch 48, wobei es sich bei dem Protein um ein Hedgehog-Protein oder um ein bioaktives Fragment davon handelt.
Verfahren nach Anspruch 49, wobei das Hedgehog-Protein unter Sonic-, Indian-, Desert-Hedgehog oder einem bioaktiven Fragment davon ausgewählt ist.
Verfahren zum Modifizieren eines Hedgehog-Proteins, das ein N-terminales Cystein enthält, umfassend das Umsetzen des N-terminalen Cysteins mit einer Halogenketongruppe unter Bildung eines Proteins nach Anspruch 1, wobei eine derartige Modifikation die biologische Aktivität des Proteins verstärkt.
Verfahren nach Anspruch 51, wobei es sich bei dem Protein um ein Hedgehog-Protein oder um ein bioaktives Fragment davon handelt.
Verfahren nach Anspruch 52, wobei das Hedgehog-Protein unter Sonic-, Indian-, Desert-Hedgehog oder einem bioaktiven Fragment davon ausgewählt ist.
Rekombinantes Hedgehog-Polypeptid, modifiziert mit einem oder mehreren lipophilen Resten, wobei der eine oder die mehreren lipophilen Reste die biologische Aktivität des Polypeptids verstärken.
Hedgehog-Polypeptid nach Anspruch 54, wobei das Hedgehog-Polypeptid unter Sonic-, Indian-, Desert-Hedgehog oder einem bioaktiven Fragment davon ausgewählt ist.
Protein nach Anspruch 54 oder 55, wobei das Hedgehog-Polypeptid eine Aminosäuresequenz gemäß einer der Sequenzen SEQ ID NO: 1–4 aufweist.
Protein nach Anspruch 55, wobei das Hedgehog-Polypeptid eine mindestens 60%-ige Aminosäureidentität mit Sonic-, Indian- oder Desert-Hedgehog aufweist und das Protein ein "patched"-Protein bindet.
Protein nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Protein um ein Hedgehog-Polypeptid handelt, das mit einem oder mehreren lipophilen Resten an internen Aminosäureresten modifiziert ist.
Protein nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Protein um ein Hedgehog-Polypeptid handelt, das mit einem oder mehreren lipophilen aromatischen Kohlenwasserstoffen modifiziert ist.
Hedgehog-Polypeptid nach einem der Ansprüche 54 bis 59, wobei das Polypeptid als gereinigtes Proteinpräparat bereitgestellt wird.
Hedgehog-Polypeptid nach einem der Ansprüche 54 bis 59, wobei das Polypeptid als pharmazeutisches Präparat bereitgestellt wird.
Hedgehog-Polypeptid nach einem der Ansprüche 54 bis 59, wobei die lipophilen Reste aus Fettsäuren, Lipiden, Estern, Alkoholen, Käfigstrukturen und aromatischen Kohlenwasserstoffen ausgewählt sind.
Hedgehog-Polypeptid nach Anspruch 59 oder 62, wobei der aromatische Kohlenwasserstoff aus Benzol, Perylen, Phenanthren, Anthracen, Naphthalin, Pyren, Chrysin und Napthacen ausgewählt ist.
Hedgehog-Polypeptid nach Anspruch 63, wobei es sich bei dem aromatischen Kohlenwasserstoff um ein Pyren handelt.
Hedgehog-Polypeptid nach einem der Ansprüche 54 bis 59, wobei die lipophilen Reste aus Isoprenoiden, Terpenen und polyalicyclischen Kohlenwasserstoffen ausgewählt sind.
Polypeptid nach Anspruch 65, wobei die lipophilen Reste aus Adamantanen, Buckminsterfullerenen, Vitaminen, Polyethylenglykol, Oligoethylenglykol, (C₁-C₁₈)-Alkylphosphatdiestern und =OCH₂-CH(OH)-O-(C₁₂-C₁₈)-Alkyl ausgewählt sind.
Hedgehog-Polypeptid nach Anspruch 66, wobei die lipophilen Reste ausgewählt sind aus: 1- oder 2-Adamantylacetyl, 3-Methyladamant-1-ylacetyl, 3-Methyl-3-brom-1-adamantylacetyl, 1-Decalinacetyl, Campheracetyl, Camphanacetyl, Noradamantylacetyl, Norbornanacetyl, Bicyclo[2.2.2]-oct-5-enacetyl, 1-Methoxybicyclo[2.2.2]-oct-5-en-2-carbonyl, cis-5-Norbornen-endo-2,3-dicarbonyl, 5-Norbornen-2-ylacetyl, (1R)-(-)-Myrtentanacetyl, 2-Norbornanacetyl, anti-3-Oxotricyclo[2.2.1.0<2,6>)-heptan-7-carbonyl, Decanoyl, Dodecanoyl, Dodecenoyl, Tetradecadienoyl, Decinoyl und Dodecinoyl.
Hedgehog-Polypeptid nach einem der Ansprüche 54 bis 59, wobei der lipophile Rest aus Resten ausgewählt ist, die die biologische Aktivität des Polypeptids im Vergleich zum unmodifizierten Hedgehog-Polypeptid verstärken.
Lipophil modifiziertes Hedgehog-Polypeptid nach einem der Ansprüche 54 bis 59 zur Verwendung als Arzneimittel.
Verwendung eines lipophil modifizierten Hedgehog-Polypeptids nach einem der Ansprüche 54 bis 59 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Veränderung des Wachstumszustands einer Zelle, die auf eine Hedgehog-Signalgebung reagiert.