DE60219006T2

DE60219006T2 - Modifizierte und stabilisierte GDF Propeptide und ihre Verwendungen

Info

Publication number: DE60219006T2
Application number: DE60219006T
Authority: DE
Inventors: Neil M. Dover WOLFMAN; Soo Peang Winchester KHOR; Kathleen N Cambridge TOMKINSON
Original assignee: Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 2001-02-08
Filing date: 2002-02-08
Publication date: 2007-12-13
Anticipated expiration: 2022-02-09
Also published as: JP2009091366A; NO333427B1; WO2002068650A3; ZA200306064B; TWI329129B; ES2284828T3; ZA200508954B; DK1397492T3; PL372888A1; NZ550297A; US7202210B2; NO20033456D0; US20070149455A1; MXPA03007063A; US8222384B2; NO20033456L; US7560441B2; US20100305194A1; US20030104406A1; CA2437218A1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich auf Inhibitoren der Wachstumsdifferenzierungsfaktor-8 (GDF-8) Proteine und Verfahren für ihre Verwendung. Insbesondere schlägt die Erfindung modifizierte und stabilisierte Propeptide der GDF-8 Proteine vor, die die Aktivität des GDF-8 inhibieren: Die Erfindung ist besonders brauchbar zur Verhütung oder Behandlung von humanen oder tierischen Störungen, bei denen eine Vermehrung des Skelettmuskelgewebes therapeutisch von Nutzen wäre. Solche Störungen umfassen muskuläre oder neuromuskuläre Störungen (wie amyotrophe Lateralsklerose, muskuläre Dystrophie, Muskelatrophie, congestive obstruktive Lungenkrankheit, Muskelzerfallssyndrom, Sarkopenie oder Kachexie), Stoffwechselerkrankungen oder -störungen (wie Typ-2-Diabetes, nichtinsulinabhängiger Diabetes mellitus, Hyperglykämie oder Obesitas), adipöse Gewebestörungen (wie Obesitas) oder Knochendegenerationskrankheiten (wie Osteoporose).
Hintergrund der Erfindung
Der Wachstums- und Differenzierungsfaktor-8 (GDF-8), auch als Myostatin bekannt, ist ein Mitglied der Transformierungswachstumsfaktor-beta (TGF-β) Superfamilie strukturell verwandter Wachstumsfaktoren, die alle wichtige wachstumsregulierende und morphogenetische Eigenschaften besitzen (Kingsley et al., (1994) Genes Dev. 8: 133-46; Hoodless et al., (1998) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 228: 235-72). Der GDF-8 ist ein negativer Regulator der Skelettmuskelmasse, und es besteht ein großes Interesse an der Identifikation der Faktoren, die seine biologische Aktivität steuern. Zum Beispiel ist der GDF-8 stark exprimiert im Skelettmuskel im Entwicklungs- und Erwachsenenzustand. Die GDF-8 Null-Mutation bei transgenen Mäusen ist durch eine ausgeprägte Hypertrophie und Hyperplasie des Skelettmuskels gekennzeichnet (McPherron et al., (1997) Nature 387: 83-90). Ähnliche Vermehrungen der Skelettmuskelmasse zeigen sich bei natürlich auftretenden Mutationen des GDF-8 beim Rind (Ashmore et al., (1974) Growth 38: 501-507; Swatland und Kieffer (1994) J. Anim. Sci. 38: 752-757; McPherron und Lee (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 12457-12461 und Kambadur et al., (1997) Genome Res. 7: 910-915). Jüngste Studien haben auch erwiesen, dass der mit einer HIV-Infektion einhergehende Muskelschwund beim Menschen von Anstiegen der GDF-8 Proteinexpression begleitet ist (Gonzalez-Cadavid et al., (1998) PNAS 95: 14938-43). Hinzu kommt, dass der GDF-8 die Produktion von muskelspezifischen Enzymen (z. B. die Kreatinkinase) und die Myoblastzellenproliferation modulieren kann (WO 00/43781).
Zusätzlich zu seinen wachstumsregulierenden und morphogenetischen Eigenschaften im Skelettmuskel kann der GDF-8 auch bei einer Anzahl von anderen physiologischen Prozessen beteiligt sein (z. B. bei der Glucosehomöostase), sowie bei abnormen Bedingungen wie der Entwicklung des Typ-2-Diabetes und adipöser Gewebestörungen wie der Obesitas. Zum Beispiel moduliert der GDF-8 die Differenzierung von Präadipozyten zu Adipozyten (Kim et al., (2001) B.B.R.C. 281: 902-906).
Wie der TGF-β-1, -2 und -3 wird das GDF-8 Protein als ein Vorläuferprotein synthetisiert, das aus einem aminoterminalen Propeptid und einer carboxyterminalen reifen Domäne (McPherron und Lee, 1997, supra) sowie einer Signalsequenz besteht, die das Protein zur extrazellulären Domäne lenkt und auch vom Protein abgespalten wird. Man nimmt an, dass vor der Spaltung des Propeptids das GDF-8 Vorläuferprotein ein Homodimer bildet. Das aminoterminale Propeptid wird dann von der reifen Domäne abgespalten und das gespaltene Propeptid kann auf nicht-kovalente Weise an das reife Domänendimer gebunden bleiben, wobei es dessen biologische Aktivität hemmt (Miyazono et al., (1988) J. Biol. Chem. 263: 6407-6415, Wakefield et al., (1988) J. Biol. Chem. 263: 7646-7654, und Brown et al., (1990) Growth Factors 3: 35-43). Man nimmt an, dass zwei GDF-8 Propeptide an das reife GDF-8 Dimer binden (Thies et al., (2001) Growth Factors 18: 251-259). Dank seiner inaktivierenden Eigenschaft ist das Propeptid als das "latenzassoziierte Peptid" (LAP) bekannt und der Komplex der reifen Domäne und des Propeptids wird allgemein als der "kleine latente Komplex" bezeichnet (Gentry und Nash, (1990) Biochemistry 29: 6851-6857, Derynck et al., (1995) Nature 316: 701-705 und Massague, (1990) Ann. Rev. Cell Biol. 12: 597-641). Man nimmt an, dass die reife Domäne als ein Homodimer aktiv ist, wenn das Propeptid entfernt wird. Von anderen Proteinen weiß man ebenfalls, dass sie an GDF-8 oder strukturell verwandte Proteine binden und deren biologische Aktivität hemmen. Solche inhibitorischen Proteine umfassen das Follistatin (Gamer et al., (1999) Dev. Biol. 208: 222-232) und follistatinverwandte Proteine.
Ferner ist eine Anzahl menschlicher und tierischer Störungen mit dem Verlust von Muskelgewebe oder mit funktionell gestörtem Muskelgewebe, einschließlich der muskulären Dystrophie, Muskelatrophie, congestiven obstruktiven Lungenkrankheit, des Muskelzerfallssyndroms, der Sarkopenie und Kachexie verbunden. Bis heute existieren sehr wenige zuverlässige oder effektive Therapien für diese Störungen. Die schrecklichen mit diesen Störungen verbundenen Symptome könnten durch den Einsatz von Therapien, die den Anteil des Muskelgewebes bei an diesen Störungen leidenden Patienten vergrößern, wesentlich reduziert werden. Solche Therapien würden die Lebensqualität für diese Patienten signifikant verbessern und könnten viele Auswirkungen dieser Störungen lindern. Es besteht somit in der Technologie der Bedarf, neue Therapien zu identifizieren, die zu einer Gesamtvermehrung des Muskelgewebes bei an diesen Störungen leidenden Patienten beitragen.
Vorliegende Erfindung befriedigt diesen Bedarf, indem sie modifizierte und stabilisierte GDF-Propeptide vorschlägt, die ihre biologische Aktivität behalten und die Aktivität der GDF-Proteine hemmen. Die erfindungsgemäßen modifizierten Propeptide können zur Behandlung von Störungen bei Menschen oder Tieren, bei denen eine Vermehrung des Muskelgewebes therapeutisch von Nutzen wäre, eingesetzt werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Der GDF-8 ist bei der Regulierung vieler kritischer biologischer Prozesse beteiligt. Dank seiner Schlüsselfunktion bei diesen Prozessen kann der GDF-8 ein wünschenswertes Target für die therapeutische Intervention sein. Obwohl natürlich vorkommendes GDF-8 Propeptid ein attraktives Mittel der GDF-Modulation aus einer Wirksamkeits- und Toxizitätsperspektive sein kann; haben vorliegende Erfinder entdeckt, dass die Blutkreislaufhalbwertzeit des natürlichen Propeptids zu kurz für das Molekül sein kann, als dass es einen praktischen therapeutischen oder prophylaktischen Nutzen bringen könnte.
Dementsprechend basiert vorliegende Erfindung zumindest zu einem Teil auf der Entdeckung, dass das Propeptid des Wachstumsdifferenzierungsfaktors 8 (GDF-8) die Aktivität des GDF-8 Proteins hemmt und dass andere Proteine des Transformationswachstumsfaktors-beta (TGF-β), die in ihrer Struktur mit dem GDF-8 verwandt sind, wie das Knochenmorphogenese-Protein-11 (BMP-11, auch als GDF-11 bekannt), ebenfalls durch das GDF-8 Propeptid gehemmt werden. Somit schlägt vorliegende Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren zur Hemmung der GDF-Proteine, sowie Verfahren zur Identifizierung, Herstellung und Verwendung solcher Inhibitoren vor.
Wie oben erwähnt basiert die vorliegende Erfindung auch zum Teil auf der Entdeckung, dass das natürliche GDF-8 Propeptid eine relativ kurze in vivo Halbwertzeit besitzt, die eine praktische therapeutische oder prophylaktische Brauchbarkeit verhindern kann. Daher schlägt die vorliegende Erfindung modifizierte GDF-8 Propeptide vor, die verbesserte pharmakokinetische Eigenschaften, wie eine erhöhte Blutkreislaufhalbwertzeit oder einen besseren Schutz vor dem proteolytischen Abbau, besitzen.
Die vorliegend offen gelegten GDF-8 Propeptide können durch jedes in der Technologie bekannte Mittel statbilisiert werden. Zum Beispiel ist bei einer Ausführung das modifizierte Propeptid ein Fusionsprotein, das ein GDF-8 Propeptid und die Fc-Region eines IgG-Moleküls umfasst. GDF-8 Propeptidfusionsproteine können als aktive Untereinheit das Propeptid eines GDF-8 Proteins oder einen aktiven Abschnitt des GDF-8 Propeptids, fusioniert mit einer Fc-Region eines IgG-Moleküls, umfassen. Bei weiteren Ausführungen oder zusätzlich kann das GDF-8 Propeptid glykosyliert oder an ein Albumin oder ein nicht-eiweißartiges Polymer gebunden sein.
Die erfindungsgemäßen modifizierten GDF-8 Propeptide sind fähig, die Aktivität, Expression, Bearbeitung oder Sekretion eines GDF-8. Proteins, reifen GDF-8 oder eines GDF-8 Homodimers oder eines sonstigen aktiven GDF-8 Moleküls zu hemmen. Die erfindungsgemäßen modifizierten GDF-8 Propeptide können einem Patienten in einer therapeutisch wirksamen Dosis zur Behandiung oder Verhütung medizinischer Zustände verabreicht werden, bei denen eine Vermehrung des Muskelgewebes therapeutisch von Nutzen wäre. Krankheiten und Störungen, die durch modifizierte GDF-8 Propeptide behandelt werden können, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, muskuläre oder neuromuskufäre Störungen (wie arnyotrophe Lateralsklerose, muskuläre Dystrophie, Muskelatrophie, congestive obstruktive Lungenkrankheit, Muskelzerfallssyndrom, Sarkopenie oder Kachexie), Stoffwechselerkrankungen oder -störungen (wie Typ-2-Diabetes, nichtinsulinabhängiger Diabetes mellitus, Hyperglykämie oder Obesitas), adipöse Gewebestörungen (wie Obesitas) oder Knochendegenerationskrankheiten (wie Osteoporose).
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1 zeigt die relativen biologischen Aktivitäten von GDF-8, BMP-11 und Activin bei einem Reportergenassay.
2 zeigt die Bindungseigenschaften des gereinigten biotinierten humanen GDF-8 bei einem ActRIIB Bindungsassay.
3 zeigt die Induktion der Reporteraktivität des pGL3(CAGA)₁₂ mit der ED₅₀ für GDF-8, BMP-11 und Activin in Gegenwart des GDF-8 Propeptids.
4 zeigt die dosisabhängige Hemmung der biotinierten GDF-8 Bindung an ActRIIB durch das GDF-8 Propeptid.
5 zeigt die Bindung des GDF-8 an L6-Zellen.
6 zeigt die dosisabhängige Hemmung der GDF-8 spezifischen Bindung an L6-Zellen durch das GDF-8 Propeptid.
7A zeigt die Aminosäurensequenz eines mausspezifischen GDF-8 Propeptid-Fc-Fusionsproteins.
7B zeigt ein mausspezifisches GDF-8 Propeptid-Fc-Fusionsprotein mit einem kurzen Glycin-Serin-Glycin-Serin (GSGS) Binder, der das GDF-8 Propeptid von der Fc-Region trennt.
8A zeigt die Wirkungen des humanen GDF-8 Propeptids und zweier mausspezifischer GDF-8 Propeptid-Fc-Fusionsproteine auf die GDF-8 Bindung bei einem ActRllB Kompetitions-ELISA.
8B ist eine Tabelle, die die IC₅₀'s des humanen GDF-8 Propeptids und zweier mausspezifischer GDF-8 Propeptid-Fc-Fusionsproteine vergleicht.
9 zeigt die relativen biologischen Aktivitäten des humanen GDF-8 Propeptids und des mausspezifischen GDF-8 Propeptid-Fc-Fusionsproteins bei einem Reportergenassay.
10 zeigt die Pharmakokinetik eines iodierten GDF-8 Propeptids und eines GDF-8 Propeptid-Fc-Fusionsproteins nach einer einmaligen intravenösen Verabreichung von jeweils 0,2 μg/Maus oder 2 μg/Maus.
11A zeigt die Aminosäurensequenz eines humanen GDF-8 Propeptid-IgG1 Fc-Fusionsproteins.
11B zeigt die Aminosäurensequenz eines humanen GDF-8 Propeptid-IgG1 Fc-Fusionsproteins, das zum Zweck der reduzierten Effektorfunktion modifiziert wurde.
12 zeigt die dosisabhängige Hemmung der GDF-8 Bindung bei einem ActRIIB Kompetitions-ELISA durch humanes GDF-8 Propeptid und zwei humane GDF-8 Propeptid-Fc-Fusionsproteine.
13 ist ein Graph, der zeigt, dass ein modifiziertes GDF-8 Propeptid, das in vivo verabreicht wurde, die Masse des Gastroknemius und Quadrizepses vermehrt und die Fettmasse vermindert, die Nieren- oder Lebermasse jedoch nicht beeinflusst, verglichen mit unbehandelten oder mit dem Kontrollprotein, IgG2aFc, behandelten Mäusen.
14A-P stellen Aminosäuren- und Nucleinsäurensequenzen, die den SEQ ID Nr. 1-16 entsprechen, sowie Anmerkungen dazu dar.
Definitionen
Die Begriffe "GDF-8", "GDF-8 Protein" oder "GDF-8 Polpeptid" beziehen sich auf einen spezifischen Wachstums- und Differenzierungsfaktor einschließlich, aber nicht ausschließlich, des in der SEQ ID Nr. 1 Dargestellten und sämtlicher gegenwärtig bekannter oder später beschriebener Homologe davon, einschließlich der Homologe anderer Arten. Besonders bevorzugt sind Säugetierhomologe, am meisten bevorzugt humane Homologe. Vorliegende Erfindung umfasst auch GDF-8 Moleküle und Homologe aus allen anderen Quellen, einschließlich, aber nicht ausschließlich, des GDF-8 von Rind, Hund, Katze, Huhn, Maus, Ratte, Schwein, Schaf, Truthahn, Pavian und Fisch. Verschiedene GDF-8 Moleküle sind von McPherron et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 12457-12461 beschrieben worden. Homologe sind in der Technologie wohlbekannt. Die Homologie kann durch jede in der Technologie bekannte Methode oder wie hier beschrieben bestimmt werden. Der GDF-8 oder das GDF-8 Protein kann natürlich vorkommen oder synthetisch sein. Diese Begriffe schließen die vollständige unbearbeitete Vorläuferform des Proteins ein ("GDF-8 Vorläuferprotein"), sowie die reifen Formen, die sich aus der posttranslationellen Spaltung des Propeptids ergeben. Die Begriffe beziehen sich auch auf irgendwelche Fragmente oder Varianten des GDF-8, die eine oder mehrere der mit einem GDF-8 Protein verbundenen biologischen Aktivitäten, wie sie hier erörtert werden, besitzen, einschließlich der Sequenzen, die durch konservierende oder nicht-konservierende Veränderungen der Aminosäurensequenz modifiziert wurden.
Der Begriff "reifer GDF-8" bezieht sich auf das Protein oder Polypeptid, das von der carboxyterminalen Domäne des GDF-8 Vorläuferproteins abgespalten wird. Eine humane Form des reifen GDF-8 Proteins ist in der SEQ ID Nr. 3 dargestellt. Der reife GDF-8 kann natürlich vorkommen oder synthetisch sein. Der reife GDF-8 kann als ein Monomer, Homodimer oder in einem GDF-8 latenten Komplex vorliegen. Je nach den in vivo oder in vitro Bedingungen kann der reife GDF-8 ein Gleichgewicht unter einigen oder allen diesen unterschiedlichen Formen herstellen. Ohne Einschränkung bezüglich des Mechanismus nimmt man an, dass der reife GDF-8 als Homodimer biologisch aktiv ist. In seiner biologisch aktiven Form wird der reife GDF-8 auch als "aktiver GDF-8" bezeichnet.
Die Formulierung "GDF-8 Aktivität" bezieht sich auf eine oder mehrere der physiologisch wachstumsregulierenden oder morphogenetischen Aktivitäten, die mit dem aktiven GDF-8 Protein verbunden sind. Zum Beispiel ist der aktive GDF-8 ein negativer Regulator der Skelettmuskelmasse. Der aktive GDF-8 kann auch die Produktion muskelspezifischer Enzyme (z. B. Kreatinkinase) regulieren, die Myoblastzellenproliferation stimulieren und die Präadipozytendifferenzierung zu Adipozyten modulieren. Man nimmt auch an, dass der GDF-8 die Sensitivität gegenüber Insulin und der Glucoseaufnahme in peripheren Geweben erhöht, insbesondere im Skelettmuskel oder in den Adipozyten. Dementsprechend umfassen die biologischen Aktivitäten des GDF-8 auch die Hemmung der Muskelbildung, des Muskelzellwachstums, der Muskelentwicklung, die Verminderung der Muskelmasse, Regulierung von muskelspezifischen Enzymen, die Hemmung der Myoblastzellenproliferation, Steuerung der Präadipozytendifferenzierung zu Adipozyten, Erhöhung der Sensitivität gegenüber Insulin, Regulierungen der Glucoseaufnahme, Glucosehämostase und Steuerung der neuronalen Zellentwicklung und -erhaltung, ohne dass diese Aufzählung erschöpfend wäre. Eine humane Form des vollständigen GDF-8 Vorläuferproteins ist in der SEQ ID Nr. 1 dargestellt.
Der Ausdruck "GDF-8 Propeptid" bezieht sich auf ein Polypeptid, das von der aminoterminalen Domäne des GDF-8 Vorläuferproteins abgespalten ist. Das GDF-8 Propeptid ist mit einer oder mehrerer der biologischen Aktivitäten assoziiert, einschließlich zum Beispiel der Fähigkeit, an ein reifes GDF-8 Protein oder Homodimer zu binden, eine oder mehrere der biologischen GDF-8 Aktivitäten zu hemmen, die Muskelentwicklung zu verbessern, die Muskelmasse zu vergrößern, die Muskelbildung zu fördern und die Muskelzellenproliferation zu fördern. Das GDF-8 Propeptid kann natürlich vorkommen oder synthetisch sein. Ein Beispiel eines GDF-8 Propeptids umfasst zum Beispiel eine humane Form des GDF-8 Propeptids, das mit der SEQ ID Nr. 5 dargestellt ist. Bei einer Ausführung ist das GDF-8 Propeptid fähig, sich an die Propeptidbindungsdomäne des reifen GDF-8 zu binden. Bei einer weiteren Ausführung ist das GDF-8 Propeptid fähig, eine oder mehrere der Aktivitäten eines reifen GDF-8 zu hemmen.
Der Begriff "GDF-8 Inhibitor" umfasst jedes Agens, das fähig ist, die Aktivität, Expression, Bearbeitung oder Sekretion eines GDF-8 Proteins, eines reifen GDF-8 oder eines GDF-8 Homodimers oder eines sonstigen aktiven GDF-8 Moleküls, einschließlich aber nicht ausschließlich der modifizierten GDF-8 Propeptide und modifizierten BMP-11 Propeptide, zu hemmen. Ein GDF-8 Inhibitor umfasst auch jedes Agens, das fähig ist, die Bindung eines GDF-8 Propeptids an ein reifes GDF-8 Molekül oder an ein GDF-8 Homodimer zu steigern. Solche Inhibitoren umfassen Proteine, Antikörper, Peptide, Peptidomimetika, Ribozyme, Antisense-Oligonukleotide, doppelsträngige RNA und andere kleine Moleküle, ohne dass diese Aufzählung erschöpfend wäre. Bei einer Ausführung wird die Aktivität eines GDF-8 Proteins durch ein modifiziertes GDF-8 Propeptid wie in den Beispielen 3 bis 6 beschrieben inhibiert. Bei einer weiteren Ausführung wird die Aktivität eines GDF-8 Proteins durch ein modifiziertes BMP-11 Propeptid inhibiert.
Die Formulierung " GDF-8 latenter Komplex" bezieht sich auf einen Proteinkomplex, der zwischen einem reifen GDF-8 Homodimer und einem GDF-8 Propeptid gebildet ist. Ohne Einschränkung hinsichtlich des Mechanismus nimmt man an, das zwei GDF-8 Propeptide sich mit zwei Molekülen des reifen GDF-8 in dem Homodimer vereinigen, um einen inaktiven tetrameren oder latenten Komplex zu bilden. Der latente Komplex kann andere GDF-Inhibitoren an Stelle von oder zusätzlich zu einem oder mehreren der GDF-8 Propeptide umfassen.
Der Begriff "modifiziertes GDF-8 Propeptid" bezieht sich auf einen GDF-8 Inhibitor, der ein modifiziertes GDF-8 Propeptid, ein Fragment oder eine Variante davon, die eine oder mehrere der biologischen Aktivitäten eines GDF-8 Propeptids besitzen, und ferner eine stabilisierende Modifikation wie hier ausgeführt umfasst. Variante Formen des GDF-8 Propeptids umfassen zum Beispiel GDF-8 Propeptide, die modifiziert worden sind, so dass sie Mutationen (einschließlich Insertion, Deletion und Substitution von Aminosäuren) an den proteolytischen Spaltungsstellen des Signalpeptids oder Propeptids beinhalten, damit die Stellen für die proteolytische Spaltung weniger anfällig sind. Bei einer bevorzugten Ausführung hat das modifizierte GDF-8 Propeptid eine wesentlich erhöhte Halbwertzeit verglichen mit derjenigen des entsprechenden unmodifizierten GDF-8 Propeptids. Bei einer sehr bevorzugten Ausführung hat das erfindungsgemäße modifizierte GDF-8 Propeptid eine erhöhte in vivo Halbwertzeit (gemessen zum Beispiel durch die in Beispiel 8 ausgeführte Methode). Bei einer weiteren Ausführung ist das modifizierte GDF-8 Propeptid fähig, eine oder mehrere der Aktivitäten eines reifen GDF-8 zu hemmen.
Die Begriffe "BMP-11", "BMP-11 Protein" oder "BMP-11 Polypeptid" beziehen sich auf einen spezifischen Wachstums- und Differenzierungsfaktor einschließlich, aber nicht ausschließlich desjenigen, der in SEQ ID Nr. 7 dargestellt ist, und alle gegenwärtig bekannten oder später beschriebenen Homologe davon, einschließlich der Homologe anderer Arten. Besonders bevorzugt sind Säugetierhomologe, am meisten bevorzugt sind humane Homologe. Verschiedene BMP-11 Moleküle sind bei McPherron et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 12457-12461 beschrieben. Homologe sind in der Technologie wohlbekannt. Die Homologie kann durch jede in der Technologie bekannte Methode oder wie hier beschrieben bestimmt werden. Das BMP-11 oder BMP-11 Protein kann natürlich vorkommen oder synthetisch sein. Diese Begriffe umfassen die vollständige unbearbeitete Vorläuferform des Proteins ("BMP-11 Vorläuferprotein"), sowie die reifen Formen, die aus der posttranslationellen Spaltung des Propeptids resultieren. Die Begriffe beziehen sich auf alle Fragmente oder Varianten des BMP-11, die eine oder mehrere der mit einem BMP-11 Protein assoziierten biologischen Aktivitäten, wie sie hier erörtert werden, aufweisen, einschließlich der Sequenzen, die durch konservierende oder nicht-konservierende Veränderungen der Aminosäumnsequenz modifiziert worden sind.
Der Begriff "reifes BMP-11" bezieht sich auf das Protein oder Polypeptid, das von der carboxyterminalen Domäne des BMP-11 Vorläuferproteins abgespalten wird. Eine humane Form des reifen BMP-11 Proteins wird mit der SEQ ID Nr. 9 vorgeschlagen. Das reife BMP-11 kann natürlich vorkommen oder synthetisch sein. Das reife BMP-11 kann als ein Monomer, Homodimer oder in einem BMP-11 latenten Komplex vorliegen. Je nach den in vivo oder in vitro Bedingungen kann das reife BMP-11 ein Gleichgewicht unter einigen oder allen diesen unterschiedlichen Formen herstellen. Ohne Einschränkung bezüglich des Mechanismus nimmt man an, dass das reife BMP-11 als Homodimer biolagisch aktiv ist. In seiner biologisch aktiven Form wird das reife BMP-11 auch als "aktives BMP-11" bezeichnet.
Der Begriff "BMP-11 Propeptid" bezieht sich auf ein Polypeptid, das von der aminoterminalen Domäne des BMP-11 Vorläuferproteins abgespalten wird. Das BMP-11 Propeptid ist mit einer oder mehreren der biologischen Aktivitäten einschließlich aber nicht ausschließlich der Fähigkeit, ein reifes GDF-8 Protein oder Homodimer zu binden, eine oder mehrere der biologischen GDF-8 Aktivitäten zu hemmen, die Muskelentwicklung zu verbessern, die Muskelmasse zu vermehren, die Muskelbildung zu fördern und die Muskelzellenproliferation zu fördern, assoziiert. Das BMP-11 Propeptid kann natürlich vorkommen oder synthetisch sein. Ein Beispiel eines BMP-11 Propeptids schließt eine humane Form des in der SEQ ID Nr. 11 dargestellten BMP-11 ein, ohne darauf beschränkt zu sein.
Der Begriff "modifiziertes BMP-11 Propeptid" bezieht sich auf einen GDF-8 Inhibitor, der ein modifiziertes BMP-11 Propeptid oder ein Fragment oder eine Variante davon, die eine oder mehrere der biologischen Aktivitäten eines BMP-11 Propeptids aufweisen, und ferner eine stabilisierende Modifikation wie hier beschrieben umfasst. Variante Formen des BMP-11 Propeptids umfassen zum Beispiel BMP-11 Propeptide, die modifiziert wurden, so dass sie Mutationen (einschließlich Insertion, Deletion und Substitution von Aminosäuren) an den proteolytischen Spaltungsstellen des Signalpeptids oder Propeptids beinhalten, damit die Stellen mehr oder weniger anfällig für die proteolytische Spaltung sind.
Die erfindungsgemäßen GDF-8 Propeptide werden gemeinsam „GDF-Propeptide" genannt.
Die erfindungsgemäßen GDF-8 Proteine werden gemeinsam "GDF Polypeptide" oder "GDF-Proteine" genannt.
Die erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen schlagen GDF-Inhibitoren vor, die die Aktivität des GDF-Proteins relativ zur Aktivität eines GDF-Proteins verglichen mit demselben GDF-Protein, das nicht an einen Inhibitor gebunden ist, reduzieren. Bei einigen Ausführungen wird die Aktivität eines GDF-Proteins, wenn es an eine oder mehrere der modifizierten GDF-Propeptide gebunden ist, um wenigstens etwa 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% oder 55%, vorzugsweise um wenigstens etwa 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86% oder 88%, bevorzugter um wenigstens etwa 90%, 91%, 92%, 93% oder 94%, und noch mehr bevorzugt um wenigstens etwa 95% bis 100% reduziert, relativ zu demselben GDF-Protein, das nicht an diese modifizierten Propeptide gebunden ist. Bei einer bevorzugten Ausführung ist der GDF-Inhibitor ein modifiziertes GDF-8 Propeptid, das kovalent an eine Fc-Region eines IgG-Moleküls gebunden ist.
Der Begriff "Stabilisierungsmodifikation" bedeutet irgendeine in der Technologie bekannte oder hier beschriebene Modifikation, die in der Lage ist, ein Protein zu stabilisieren, wobei die in vitro Halbwertzeit eines Proteins erhöht, die Blutkreislaufhalbwertzeit eines Proteins erhöht und/oder der proteolytische Abbau eines Proteins reduziert wird. Solche stabilisierenden Modifikationen umfassen Fusionsproteine (einschließlich zum Beispiel Fusionsproteine, die ein GDF-Propeptid und ein zweites Protein umfassen), die Modifikation einer Glykosylierungsstelle (einschließlich zum Beispiel Zufügung einer Glykosylierungsstelle zu einem GDF-Propeptid) und die Modifikation des Kohlenhydratanteils (einschließlich zum Beispiel der Entfernung der Kohlenhydratanteile aus einem GDF-Propeptid), ohne dass diese Aufzählung erschöpfend wäre. Im Falle einer stabilisierenden Modifikation, die ein Fusionsprotein umfasst (z. B. derart, dass ein zweites Protein mit einem GDF-Propeptid fusioniert ist), kann das zweite Protein als "stabilisierender Abschnitt" oder "stabilisierendes Protein" bezeichnet werden. Zum Beispiel umfasst bei einer Ausführung ein erfindungsgemäßes modifiziertes GDF-8 Propeptid eine Fusion zwischen einem humanen GDF-8 Propeptid (mit einer inaktivierten Spaltungsstelle) und einem IgG-Molekül (wobei das IgG als das stabilisierende Protein oder als der stabilisierende Abschnitt fungiert). Wie er hier verwendet wird umfasst ein "stabilisierender Abschnitt" zusätzlich zum Hinweis auf ein zweites Protein eines Fusionsproteins auch nichteiweißartige Modifikationen wie einen Kohlenhydratanteil oder ein nicht-eiweißartiges Polymer.
Die Begriffe „isoliert" oder „gereinigt" beziehen sich auf ein Molekül, das im Wesentlichen frei von seiner natürlichen Umgebung ist. Zum Beispiel ist ein isoliertes Protein im Wesentlichen frei von zellulärem Material oder sonstigen kontaminierenden Proteinen aus der Zell- oder Gewebequelle, aus der es stammt. Die Formulierung "im Wesentlichen frei von zellulärem Material" bezieht sich auf Zubereitungen, wobei das isolierte Protein wenigstens zu 70 bis 80% (w/w) rein, bevorzugter wenigstens zu 80 bis 89% (w/w) rein, noch bevorzugter zu 90 bis 95% rein und am meisten bevorzugt wenigstens zu 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% (w/w) rein ist.
Der Begriff "Spaltungsstelle" bezieht sich auf eine proteolytische Stelle in einem Protein oder Polypeptid, auf die ein proteolytisches Enzym einwirkt, wodurch die Spaltung der Peptidbindung herbeigeführt wird. Bei einer Ausführung ist eine erfindungsgemäße Spaltungsstelle durch den Einbuchstaben-Aminosäurencode "RSRR" dargestellt.
Der Begriff "Fc-Region eines IgG-Moleküls" bezieht sich auf die Fc-Domäne eines Immunglobulins des Isotyps IgG, wie es Fachleuten der Technologie wohlbekannt ist. Die Fc-Region eines IgG-Moleküls ist der Abschnitt des IgG-Moleküls (IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4), der für die Erhöhung der in vivo Serumhalbwertzeit des IgG-Moleküls verantwortlich ist. Das bevorzugte IgG-Molekül ist der IgG1.
Der Begriff "in vitro Halbwertzeit" bezieht sich auf die Stabilität eines Proteins, die außerhalb des Kontextes eines lebenden Organismus gemessen wird. Assays zur Messung der in vitro Halbwertzeit sind in der Technologie wohlbekannt und umfassen zum Beispiel SDS-PAGE, ELISA, zellbasierte Assays, Pulse-Chase, Western Blotting, Northern Blotting usw.. Diese und weitere brauchbare Assays sind in der Technologie wohlbekannt.
Die Formulierung "in vivo Halbwertzeit" bezieht sich auf die Stabilität eines Proteins in einem Organismus. Die in vivo Halbwertzeit kann mittels einer Anzahl in der Technologie bekannter Verfahren, die unter anderen die in vivo Serumhalbwertzeit und Blutkreislaufhalbwertzeit erfassen, sowie mittels in den vorliegenden Beispielen ausgeführter Assays gemessen werden.
Die Formulierung "in vivo Serumhalbwertzeit" bezieht sich auf die Halbwertzeit eines im Blut eines Organismus zirkulierenden Proteins. Bei einer Ausführung wird die in vivo Halbwertzeit wie in Beispiel 8 beschrieben gemessen. Weitere in der Technologie bekannte Methoden können zur Messung der in vivo Halbwertzeit angewandt werden.
Der Begriff "Säugetier" schließt in der Technologie bekannte Definitionen ein und bezieht sich auch auf alle Tiere, die als Säugetiere klassifiziert sind, einschließlich der Menschen, Haus- und Farmtiere und Zoo-, Sport- oder Haustiere wie Hunde, Katzen, Schafe, Schweine, Kühe usw. Bei einer bevorzugten Ausführung ist das Säugetier der Mensch.
Der Begriff "TGF-β Superfamilie" bezieht sich auf eine Familie strukturell verwandter Wachstumsfaktoren, von denen alle physiologisch wichtige wachstumsregulierende und morphagenetische Eigenschaften besitzen. Diese Familie verwandter Wachstumsfaktoren ist in der Technologie wohlbekannt (Kingsley et al., (1994) Genes Dev. 8: 133-46, und Hoodless et al., (1998) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 228: 235-72). Die TGF-β Superfamilie umfasst knochenmorphogenetische Proteine (BMPs), Activine, Inhibine, Mullerian Inhibiting Substance, den Glia-abgeleiteten neurotrophischen Faktor und eine immer noch ansteigende Anzahl von Wachstums- und Differenzierungsfaktoren (GDFs), wie der GDF-8 (Myostatin). Viele dieser Proteine sind mit dem GDF-8 in ihrer Struktur verwandt, wie das BMP-11 (auch als GDF-11 bekannt), und/oder durch ihre Aktivität, wie das Activin.
Der Begriff "Behandlung" bezieht sich sowohl auf die therapeutische Behandlung als auch auf prophylaktische oder präventive Maßnahmen. Diejenigen, die der Behandlung bedürfen, können Individuen sein, die bereits an einer besonderen medizinischen Störung leiden, sowie solche, bei denen die Störung später auftreten kann (d. h. solche, die Präventivmaßnahmen benötigen).
Die Begriffe "Transformation" und "Transfektion" beziehen sich auf eine Vielfalt in der Technologie anerkannter Techniken zur Einführung fremder Nukleinsäuren (z. B. DNA und RNA) in eine Wirtszelle, einschließlich der Kalziumphosphat- oder Kalziumchlorid-Kopräzipitation, DEAE-dextranvermittelte Transfektion, Lipofektion und Elektroporation, ohne dass diese Aufzählung erschöpfend wäre.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Vorliegende Erfindung basiert zum Teil auf der Entdeckung, dass GDF-Propeptide eine kurze in vivo Halbwertzeit besitzen und dadurch ihre Wirksamkeit als pharmakologische Inhibitoren der GDF-8- oder BMP-11-Aktivität reduziert ist. Dementsprechend besitzt die Erfindung nach einem Aspekt als Hauptmerkmal ein modifiziertes und stabilisiertes GDF-8 Propeptid, das verbesserte pharmakokinetische Eigenschaften besitzt, insbesondere eine erhöhte Blutkreislaufhalbwertzeit.
Vorliegende Erfindung schlägt neuartige modifizierte GDF-Propeptide vor, die inaktive Komplexe mit GDF-Proteinen (zum Beispiel GDF-8 und BMP-11 Proteinen) in vitro und in vivo bilden. Die erfindungsgemäßen modifizierten GDF-Propeptide binden bevorzugt an eine Propeptidbindungsdomäne auf dem reifen GDF-Protein. Dementsprechend umfasst bei einigen Ausführungen der Erfindung das modifizierte GDF-Propeptid ein Fusionsprotein zwischen einem GDF-Propeptid und einem Stabilisierungsprotein. Ein Stabilisierungsprotein kann irgendein Protein sein, das die Gesamtstabilität des modifizierten GDF-Propeptids steigert.
Wie der in der Technologie geschulte Fachmann erkennen wird, kann ein solches Fusionsprotein optional ein Binderpeptid zwischen dem Propeptidabschnitt und dem Stabilisierungsabschnitt umfassen. Wie es in der Technologie wohlbekannt ist, werden Fusionsproteine derart zubereitet, dass das zweite Protein im Rahmen mit dem ersten Protein fusioniert wird, so dass das resultierende Translationsprotein sowohl das erste als auch das zweite Protein umfasst. Zum Beispiel kann bei der vorliegenden Erfindung ein Fusionsprotein derart zubereitet werden, dass der GDF-Propeptidabschnitt mit einem zweiten Protein fusioniert wird (z. B. einem Stabilisierungsproteinabschnitt.) Ein solches Fusionsprotein wird so zubereitet, dass das resultierende Translationsprotein sowohl den Propeptidabschnitt als auch den Stabilisierungsabschnitt enthält.
Bei anderen Ausführungen umfasst das GDF-Propeptid ein GDF-Propeptid, das modifiziert wurde, um eine höhere in vivo Blutkreislaufhalbwertzeit zu besitzen verglichen mit einem unmodifizierten GDF-Propeptid. Obwohl der genaue Mechanismus und Zeitablauf der Bindung des modifizierten GDF-Propeptids unbekannt sind, nimmt man an, dass die erfindungsgemäßen modifizierten GDF-8 Propeptide an den reifen GDF-8 und reifen BMP-11 binden. Bei einer bevorzugten Ausführung schlägt die vorliegende Erfindung modifizierte GDF-Propeptide vor, die inaktive Komplexe mit GDF-8 oder BMP-11 Proteinen in vivo oder in vitro bilden. Bei einer Ausführung binden sich die GDF-Propeptide bevorzugt an eine Propeptidbindungsdomäne auf dem reifen GDF-8 oder reifen BMP-11 Protein. Eine solche Bindung kann zum Beispiel nach Freigabe des unveränderten Propeptids an der Stelle der GDF-8- und BMP-11-Aktivität, nach Verdrängung des unveränderten Propeptids durch das modifizierte GDF-8 Propeptid und/oder nach Abspaltung des Propeptids von dem GDF-8 und BMP-11 Vorläuferprotein eintreten. Ungeachtet des Mechanismus führt die Bindung des modifizierten GDF-8 Propeptids zur Reduzierung einer oder mehrerer der mit dem GDF-8 assoziierten biologischen Aktivitäten relativ zu einem reifen GDF-8 Protein, das nicht durch dasselbe modifizierte Propeptid gebunden ist. Bei einer bevorzugten Ausführung reduzieren die modifizierten GDF-8 Propeptide die GDF-8- und BMP-11-Aktivität, die mit der negativen Regulierung der Skelettmuskelmasse verbunden ist.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführung schlägt vorliegende Erfindung modifizierte GDF-Propeptide vor, die inaktive Komplexe mit BMP-11 Proteinen in vivo oder in vitro bilden. Bei einer Ausführung binden sich die GDF-Propeptide bevorzugt an eine Propeptidbindungsdomäne auf dem reifen BMP-11 Protein. Bei noch einer weiteren Ausführung ist das modifizierte GDF-Propeptid ein Fusionsprotein, das ein GDF-Propeptid und eine Fc-Region eines IgG-Moleküls (als Stabilisierungsprotein) umfasst. Solche GDF-Inhibitoren können ein GDF-Propeptid (zum Beispiel wie es in der SEQ ID Nr. 5 dargestellt ist) oder ein Fragment oder eine Variante dieses Propeptids, die eine oder mehrere der biologischen Aktivitäten eines GDF-Propeptids besitzen, umfassen. Solche modifizierten GDF-Propeptide sind zur Hemmung der Aktivität der GDF-Proteine fähig. Die erfindungsgemäß verwendeten GDF-8 Propeptide können synthetisch hergestellt, von natürlich vorkommenden (nativen) GDF-8 Propeptiden abgeleitet oder rekombinant hergestellt werden unter Verwendung einer Vielfalt von Reagenzien, Wirtszellen und Verfahren, die in der Gentechnik wohlbekannt sind. Bei einer Ausführung umfasst das modifizierte GDF-8 Propeptid ein humanes GDF-8 Propeptid, das kovalent an ein IgG-Molekül oder ein Fragment davon gebunden ist. Das GDF-8 Propeptid kann angrenzend an die Fc-Region des IgG-Moleküls fusioniert oder an die Fc-Region des IgG-Moleküls über ein Binderpeptid angeheftet sein. Die Verwendung solcher Binderpeptide ist in der Technologie der Proteinbiochemie wohlbekannt.
Bei gewissen Ausführungen, bei denen die erfindungsgemäßen modifizierten GDF-Propeptide Fusionsproteine umfassen, ist der GDF-Propeptidabschnitt dieses Fusionsproteins bevorzugt wenigstens etwa zu 75 bis 80% identisch mit der SEQ ID Nr. 5, bevorzugter wenigstens etwa zu 81% bis etwa 85% identisch mit der SEQ ID Nr. 5, noch bevorzugter wenigstens etwa zu 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93% oder 94% identisch mit der SEQ ID Nr. 5 und noch mehr bevorzugt wenigstens etwa zu 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% identisch mit der SEQ ID Nr. 5. Bei einer bevorzugten Ausführung umfassen die GDF-8 Propeptide eine Sequenz, die identisch ist mit den in der SEQ ID Nr. 5 dargestellten Sequenzen. Bei noch einer weiteren bevorzugten Ausführung kann der GDF-Propeptidabschnitt eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins ein Fragment oder eine Variante des in der SEQ ID Nr. 5 dargestellten GDF-Propeptids umfassen, so lange das Fragment oder die Variante eine oder mehrere der biologischen Aktivitäten eines GDF-Propeptids besitzt. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführung umfassen die modifizierten GDF-8 Propeptide eine mutante Version der SEQ ID Nr. 5, wobei die Mutante modifiziert wurde, damit sie eine oder mehrere Mutationen einschließt (einschließlich Insertion, Deletion oder Substitution), so lange das Fragment oder die Variante eine oder mehrere der biologischen Aktivitäten eines GDF-Propeptids besitzt.
Von kritischer Bedeutung bei erfindungsgemäßen Ausführungen, die modifizierte, Fusionsproteine umfassende GDF-Propeptide involvieren, ist, dass es wesentlich ist, dass das Fusionsprotein derart hergestellt oder konstruiert wird, dass die native proteolytische Spaltungsstelle (z. B. RSRR) im GDF-Propeptid im resultierenden Fusionsprotein unterbrochen, zerstört, inaktiviert oder entfernt ist. Wie es der Fachmann der Technologie erkennen wird, würde eine solche Unterlassung dazu führen, dass das zweite Protein (z. B. der Stabilisierungsabschnitt) des Fusionsproteins vom ersten Protein (dem Propeptidabschnitt) des Fusionsproteins abgespalten wird. Dementsprechend schlägt ein kritischer Aspekt der Erfindung die Inaktivierung oder Eliminierung der nativen Spaltungsstelle der GDF-Propeptide vor, wenn ein solches Propeptid verwendet wird, um ein Fusionsprotein herzustellen, das ein erfindungsgemäßes modifiziertes GDF-Propeptid ist. Verfahren zur Inaktivierung einer solchen proteolytischen Spaltungsstelle sind in der Technologie bekannt und umfassen zum Beispiel Mutation, Deletion oder Insertion der Aminosäure oder Nucleotidsequenz der proteolytischen Spaltungsstelle.
Bei noch anderen Ausführungen der Erfindung können Mutationen in der GDF-Sequenz durchgeführt werden, damit die Stellen weniger anfällig für die proteolytische Spaltung sind. Zum Beispiel kann bei einer Ausführung eine solche Mutante eine Punktmutation an den Aminosäuren 45, 46, 49, 50, 52, 53, 63, 64, 65, 66, 98 oder 99 der SEQ ID Nr. 1 enthalten. Bei einer bevorzugten Ausführung ist die Punktmutation eine Punktmutation an der Aminosäure 99 der SEQ ID Nr. 1. Bei einer besonders bevorzugten Ausführung ist die Punktmutation eine Punktmutation der Aminosäure der 99 der SEQ ID Nr. 1 von Asp bis Ala. Auch die Computeranalyse (unter Verwendung einer kommerziell erhältlichen Software, z. B. MacVector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.) kann eingesetzt werden, um protealytische Spaltungsstellen zu identifizieren. Wie es der Fachmann der Technologie erkennen wird, können sämtliche beschriebene Mutationen, Varianten oder Modifikationen alternativ auf Nukleinsäurenebene durchgeführt werden. Solche Techniken sind in der Technologie wohlbekannt.
Tabelle 2
Beispielhafte Aminosäuren, die mutierbar sind, um eine Spaltung des Propeptids zu verhindern:

GDF-8 (Die Aminosäurenziffern verweisen auf die SEQ ID Nr. 1)
Arg-45
Gln-46
Lys-49
Ser-50
Arg-52
Ile-53
Lys-63
Leu-64
Arg-65
Leu-66
Arg-98
Asp-99
BMP-11 (Die Aminosäurenziffern verweisen auf die SEQ ID Nr. 7)
Asp-122
Ala-123
Glu-286
Leu-287

Wie oben erwähnt machten die vorliegenden Erfinder die Entdeckung, dass die GDF-Propeptide eine kurze in vivo Halbwertzeit besitzen. Daher muss das GDF-Propeptid, damit es pharmazeutisch als ein therapeutisches oder prophylaktisches Mittel brauchbar sein kann, zum Zweck einer erhöhten Langlebigkeit unter physiologischen Bedingungen chemisch oder physikalisch stabilisiert werden.
GDF-Propeptide können stabilisiert oder modifiziert werden durch irgendein in der Technologie bekanntes Mittel, so lange das modifizierte GDF-Propeptid eine Fähigkeit beibehält, ein GDF-Protein oder reifes GDF-Protein zu inhibieren. Bei einer bevorzugten Ausführung behält das modifizierte GDF-Propeptid seine Fähigkeit, sich an sein Target GDF-Protein oder eine GDF-Propeptidbindungsstelle zu binden. Bei einer bevorzugten Ausführung umfasst das modifizierte GDF-Propeptid ein GDF-8 Propeptid, das auf angrenzende Weise oder über einen Binder mit einer Fc-Region eines IgG-Moleküls fusioniert ist. Die Fc-Region des IgGs übt einen schützenden oder stabilisierenden Effekt auf das Propeptid aus (und wirkt dadurch wie eine Stabilisierungsmodifikation), was sich in den verbesserten pharmakokinetischen Eigenschaften widerspiegelt (d.h. durch eine erhöhte Serumhalbwertzeit) des Fusionsproteins, verglichen mit dem entsprechenden unmodifizierten GDF-8 Propeptid.
Bei einer besonderen Ausführung umfasst das modifizierte GDF-8 Propeptid ein humanes GDF-8 Propeptid oder eine Mutante des humanen GDF-8 Propeptids und das IgG-Molekül ist die Fc-Region eines IgG1 oder eines IgG4 oder eine Fc-Region des zum Zweck einer reduzierten Effektorfunktion modifizierten IgG1. Bei einer Ausführung ist das IgG-Fragment das IgG1 (SEQ ID Nr. 15). Bei einer anderen Ausführung ist das IgG-Fragment das zum Zweck einer reduzierten Effektorfunktion modifizierte IgG1 (SEQ ID Nr. 16). Beispiele von zum Zweck einer reduzierten Eftektorfunktion modifizierten Molekülen umfassen die Modifikation der humanen IgG1-Fc-Fusion, damit sie Alanin (A) an den Aminosäurenpositionen 14 und 17 wie in der SEQ ID Nr. 16 dargestellt enthält.
Modifizierte GDP-8 Propeptide können nach Standardproteinisolierungsund -reinigungsverfahren, die in der Technologie wohlbekannt sind, isoliert oder gereinigt werden.
Vorliegende Erfindung schlägt auch Verfahren zur Herstellung von modifizierten GDF-Propeptiden vor, die eine erhöhte in vivo oder in vitro Halbwertzeit aufweisen. Bei einer bevorzugten Ausführung umfasst das Verfahren die Zubereitung eines modifizierten GDF-Propeptids, das ein GDF-8-/IgG1-Fc-Fusionsprotein umfasst, durch Präparation eines cDNA Moleküls, das kodiert:

(1) ein GDF-Propeptid (zum Beispiel ein humanes GDF-8 Propeptid, SEQ ID Nr. 5), das modifiziert ist, um die proteolytische Spaltungsstelle und die Fc-Region eines IgG-Moleküls (zum Beispiel eine humane IgG1-Fc-Region, SEQ ID Nr. 15) zu inaktivieren;
(2) die Expression der cDNA in einem geeigneten prokaryotischen oder eukaryotischen Expressionssystem unter Verwendung geeigneter Expressionsplasmide und -zellen und
(3) die Isolierung und Reinigung des exprimierten Fusionsproteins, das das modifizierte GDF-Propeptid enthält, wobei das modifizierte GDF-Propeptid eine erhöhte in vivo oder in vitro Halbwertzeit, verglichen mit einem unmodifizierten GDF-Propeptid, aufweist.

Ein Beispiel eines solchen bevorzugten erfindungsgemäßen modifizierten GDF-Propeptids ist in 11A dargestellt.
cDNA Expressionssysteme sind in der Molekularbiologie wohlbekannt als Verfahren zur Isolierung und Reinigung exprimierter Proteine (Die Beispiele 2 und 7 nachfolgend liefern Beispiele solcher Ausführungen).
Bei einer alternativen Ausführung können die cDNA Konstrukte, die zur Expression solcher Fusionsproteine verwendet werden, Nucleotide enthalten, die ein Binderpeptid zwischen den das GDF-Propeptid kodierenden Nucleotiden und der IgG-Fc-Region (oder dem Stabilisierungsabschnitt) kodieren. Die Orientierung des Binderpeptids relativ zur GDF- oder IgG-Fc-Region ist unwichtig. Das Binderpeptid kann Nucleotide umfassen, die 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 oder mehr Aminosäuren in der Länge kodieren. Bei einer besonderen Ausführung umfasst das Binderpeptid Nucleotide, die für die aus Glycin-Serin-Glycin-Serin (GSGS) bestehende Aminosäuresequenz kodieren.
Bei einer weiteren Ausführung können die Expressionsplasmide optional Tags enthalten, die eine geeignete Isolierung und Reinigung der exprimierten Proteine ermöglichen. Die Verwendung solcher markierten Expressionsplasmide und die Verfahren zur Isolierung und Reinigung der markierten Proteinprodukte sind in der Technologie wohlbekannt.
Die erfindungsgemäßen GDF-Propeptide umfassen spezifisch Fusionsproteine, bei denen der GDF-Propeptidabschnitt des Moleküls identisch oder zu mehr als 60% homolog mit den GDF entsprechenden Sequenzen einer besonderen Art ist, während der Stabilisierungsabschnitt wie die Fc-Region des IgG-Moleküls identisch oder zu mehr als 60% homolog mit den IgG entsprechenden Sequenzen einer unterschiedlichen Art sein kann. Zum Beispiel kann das humane GDF-8 Propeptid oder ein Fragment davon mit einer Fc-Region eines IgG-Moleküls einer Maus oder umgekehrt fusioniert sein, so lange das resultierende Fusionsprotein die gewünschte biologische Aktivität aufweist, nämlich die Inhibierung der biologischen GDF-Aktivität, was in den Beispielen 3 bis 6 ausgeführt ist. Bei bevorzugten Ausführungen der Erfindung sind erfindungsgemäße Fusionsproteine Chimäre von humanen Proteinen. In der Technik ist man sich klar darüber, dass Chimären- oder Fusionsproteine humaner Proteine bei der Behandlung des Menschen bevorzugt werden.
Als eine Alternative der oben beschriebenen Fc-Fusionsproteine oder zusätzlich zu diesen können die GDF-Propeptide durch eine Vielfalt von anderen Methoden und Quellenmaterialien, die in der Proteintechnologie wohlbekannt und fertig zubereitet erhältlich sind, stabilisiert werden. Solche Methoden und Materialien umfassen zum Beispiel die Glykosylierung oder Bindung an Albumin oder ein nicht-eiweißartiges Polymer, wie nachstehend im Detail beschrieben wird. Die modifizierten GDF-Propeptide können isoliert und gereinigt werden nach in der Technologie wohlbekannten Standardtechniken der Proteinisolierung und -reinigung.
GDF-Propeptide oder modifizierte GDF-Propeptide können durch eine Vielfalt in der Technologie bekannter Techniken produziert werden. Zum Beispiel können solche Propeptide (z. B. chemisch oder rekombinant) synthetisiert, isoliert und gereinigt und auf ihre Fähigkeit, Komplexe mit einem reifen GDF-8- oder reifen BMP-11-Protein zu bilden, getestet werden unter Anwendung hier beschriebener oder in der Technologie bekannter Methoden. Propeptide können synthetisiert werden unter Anwendung von Standardtechniken der Proteinchemie wie den bei Bodansky M. in Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin (1993), und Grant G. A. (Ed.) in Synthetic Peptides: A User's Guide, W. H. Freeman and Company, New York (1992) beschriebenen, deren Inhalte durch die Erwähnung hiermit einbezogen werden. Außerdem sind automatisierte Peptidsynthetisierer im Handel erhältlich (z. B. das Advanced ChemTech Model 396, Milligen/Biosearch 9600).
Alternativ können die modifizierten oder unmodifizierten GDF-Propeptide oder Fragmente davon rekombinant produziert werden unter Anwendung verschiedener Expressionssysteme (z. B. E. coli, Eierstockzellen von chinesischen Hamstern, COS-Zellen, Baculovirus), wie sie in der Technologie wohlbekannt sind. Zum Beispiel kann das exprimierte Propeptid des GDF-8 gereinigt werden zum Beispiel mittels der bei Bottinger et al., (1996) PNAS 93: 5877-5882 und Gentry und Nash (1990) Biochemistry 29: 6851-6857 beschriebenen Verfahren, deren Inhalte durch die Erwähnung hiermit einbezogen werden, oder irgendeine andere zur Reinigung von Peptiden anerkannte Methode. Alternativ kann das modifizierte oder unmodifizierte GDF-Propeptid oder ein Fragment davon zum Beispiel für die nachfolgende Reinigung mittels etablierter Techniken der Proteintechnologie mit FLAG oder 6-His markiert werden.
Die modifizierten oder unmodifizierten GDF-8 Propeptide können ferner durch Verdauung natürlich vorkommender oder rekombinant produzierter GDF-8 oder BMP-11 mittels zum Beispiel einer Protease, z. B. Trypsin, Thermolysin, Chymotrypsin, Pepsin oder des paarigen basischen Aminosäurenkonversionsenzyms (PACE) produziert werden. Die Computeranalyse (mittels kommerziell erhältlicher Software, z. B. MacVector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.) kann eingesetzt werden, um die proteolytischen Spaltungsstellen zu identifizieren. Alternativ können solche GDF-Propeptide aus natürlich vorkommendem oder rekombinant produziertem GDF-8 mittels in der Technologie bekannter Standardtechniken wie der chemischen Spaltung (z. B. Cyanbromid, Hydroxylamin) produziert werden.
Die proteolytischen oder synthetischen GDF-8 Propeptidabschnitte des modifizierten GDF-Propeptids können so viele Aminosäurenreste umfassen, wie erforderlich sind, um das GDF-Targetprotein zu binden und dadurch teilweise oder vollständig die GDF-8 oder BMP-11 Aktivität zu hemmen. Die folgenden Beispiele 4 bis 6 stellen Ausführungen der Bindungs- und Inhibierungsassays dar. Insbesondere sind funktionelle Fragmente von GDF-8 Propeptidsequenzen, die die Fähigkeit, GDF-8 zu modulieren oder inhibieren, vom Umfang der Erfindung mit erfasst. Die GDF-8 Propeptidabschnitte umfassen vorzugsweise wenigstens 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60,70, 80 oder 90 Aminosäuren; bevorzugter wenigstens 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180 oder 190 Aminosäuren und am meisten bevorzugt wenigstens 200, 210, 220, 230 oder 240 oder mehr Aminosäuren in der Länge. Bei einer bevorzugten Ausführung besteht der GDF-8 Propeptidabschnitt des modifizierten GDF-8 Propeptids aus 243 Aminosäuren in der Länge, d. h. entsprechend der SEQ ID Nr. 5.
Die Signalsequenz für den humanen GDF-8 ist in der SEQ ID Nr. 13 dargestellt und umfasst die ersten 23 Aminosäuren der SEQ ID Nr. 1.
Die Signalsequenz für den humanen BMP-11 ist in der SEQ ID Nr. 14 dargestellt und umfasst die ersten 24 Aminosäuren der SEQ ID Nr. 7. Die Identifikation einer partiellen GDF-8 oder BMP-11 Propeptidsequenz als ein funktionelles Fragment des GDF-8 oder BMP-11 Propeptids kann leicht bestimmt werden, zum Beispiel durch die in den nachfolgenden Beispielen 4 bis 6 beschriebenen Assays.
Zusätzlich zu abgeschnittenen Propeptidsequenzen umfassen die erfindungsgemäßen Propeptidvarianten spezifisch GDF-Propeptide, die Punktmutationen oder sonstige Modifikationen aufweisen (einschließlich Insertion, Deletion und Substitution), so lange solche Varianten eine oder mehrere der gewünschten biologischen oder inhibitorischen Aktivitäten eines GDF-Propeptids besitzen. Eine solche Aktivität kann zum Beispiel wie in den Beispielen 4 bis 6 beschrieben gemessen werden. Solche Modifikationen können in das Molekül eingeführt werden, um die Aktivität, die Blutkreislauf- oder Lagerungshalbwertzeit oder Produktion des GDF-8 Propeptids zu steigern. Zum Beispiel können Punktmutationen in eine oder mehrere der proteolytischen Spaltungsstellen eingeführt werden, um den proteolytischen Abbau des modifizierten GDF-8 Propeptids in vivo zu verhindern oder hemmen. Die Computeranalyse (mittels einer kommerziell erhältlichen Software, z. B. MacVector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.) kann eingesetzt werden, um die proteolytischen Spaltungsstellen zu identifizieren.
Dementsprechend umfassen Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen GDF-Propeptide zusätzlich zu den Wildtyp-cDNA kodierenden Sequenzen, spezifisch cDNA kodierende Sequenzen, die die Wildtyp-GDF-Propeptide kodieren, sich aber in der cDNA-Sequenz von der Wildtyp-GDF-cDNA-Sequenz unterscheiden dank der Degenerationen des genetischen Codes oder alleler Variationen (natürlich vorkommende Basenänderungen in der Artenpopulation, die zu einer Aminosäurenänderung führen können oder nicht). Die Erfindung berücksichtigt auch DNA-Sequenzen, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen (bei einer Ausführung wie in T. Maniatis et al., (1982) Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, S. 387-389 beschrieben) zu einer Nucleinsäure, die ein GDF-Propeptid kodiert, oder zu einer Nucleinsäure, die ein Protein oder Polypeptid kodiert, das die Fähigkeit besitzt, an ein besonderes GDF-Protein zu binden, wie in den Beispielen 4 bis 6 ausgeführt, hybridisieren. Variationen bei den cDNA-Sequenzen, die durch Punktmutationen oder induzierte Modifikationen (z. B. Insertion, Deletion und Substitution) hervorgerufen werden, um die Aktivität, Halbwertzeit oder Produktion der dadurch kodierten GDF-8 Propeptide zu steigern, sind auch für die vorliegende Erfindung von Nutzen. Computerprogramme, die für die Bestimmung der DNA-Sequenzhomologie brauchbar sind, sind in der Technologie bekannt und hier beschrieben.
Die Fähigkeit eines modifizierten GDF-Propeptids, einen nicht-kovalenten Komplex mit einem GDF-Protein zu bilden, kann durch eine Vielfalt in der Technologie bekannter Verfahren ausgewertet werden, einschließlich der Größenexklusionschromatographie und/oder Kreuzbindungsanalysen, wie in Beispiel 2 beschrieben. Wie in Beispiel 2 dargestellt bildet das GDF-8 Propeptid eine nicht-kovalente Verbindung mit einem reifen GDF-8 Protein. Der reife GDF-8/GDF-8 Propeptidkomplex hat eine offensichtliche Molarmasse von etwa 75 kDa.
Wie oben erwähnt können GDF-Propeptide außer durch das Fc-Fusionsverfahren durch eine Anzahl anderer Techniken stabilisiert werden. Bei einer Ausführung ist ein Stabilisierungsabschnitt kovalent gebunden an einen GDF-Propeptidabschnitt, um ein Fusionsprotein zu erzeugen. Zum Beispiel kann das GDF-8 Propeptid an ein nicht-eiweißartiges Polymer oder mehrere der Vielfalt nicht-eiweißartiger Polymere gebunden sein, z. B. an einen Polyethylenglycol, Polypropylenglycol oder an Polyoxyalkylene, in der in den U.S. Patenten mit den Nummern 4.640.835, 4.496.689, 4.301.144, 4.670.417, 4.791.192 oder 4.179.337 beschriebenen Weise. Bei gewissen Ausführungen sind die GDF-Propeptide chemisch modifiziert durch kovalente Konjugation mit einem Polymer, um deren zirkulierende Halbwertzeit zu erhöhen. Bevorzugte Polymere und Verfahren zu deren Anheftung an Peptide sind auch in den U.S. Patenten mit den Nummern 4.766.106, 4.179.337, 4.495.285 und 4.609.546 beschrieben.
Bei einer anderen Ausführung kann das GDF-8 Propeptid derart modifiziert sein, dass es ein verändertes Glykosylierungsmuster aufweist (d. h. verschieden vom Wildtyp-Glykosylierungsmuster). Wie er hier verwendet wird bedeutet der Begriff „verändert", dass eine oder mehrere der Kohlehydratanteile dem Wildtyp-GDF-Propeptid zugefügt oder von diesem entfernt wurden. Die Glykosylierung von Proteinen und Polypeptiden ist typischerweise entweder N-gebunden oder O-gebunden. N-gebunden bezieht sich auf die Anheftung des Kohlehydratanteils an die Seitenkette eines Asparaginrests. Die Tripeptidsequenzen Asparagin-X-Serin und Asparagin-X-Threonin, wobei X irgendeine Aminosäure außer Prolin ist, sind die Erkennungssequenzen für die enzymatische Anheftung des Kohlehydratanteils an die Asparaginseitenkette. So kreiert die Anwesenheit eines dieser Tripeptidsequenzen in einem Polypeptid eine potentielle Glykosylierungsstelle. O-gebundene Glykosylierung bedeutet die Anheftung eines der Zucker N-Aceylgalactosamin, Galactose oder Xylose an eine Hydroxyaminosäure, am häufigsten Serin oder Threonin, wenngleich 5-Hydroxyprolin oder 5-Hydroxylysin ebenfalls verwendet werden können.
Die Hinzufügung von Glykosylierungsstellen zu dem GDF-Propeptid oder die Deletion von diesem wird praktischerweise durchgeführt durch Veränderung der Aminosäurensequenz derart, dass es eine oder mehrere der oben beschriebenen Tripeptidsequenzen enthält oder diese ihm fehlen (für N-gebundene Glykosylierungsstellen). Die Veränderung kann auch erfolgen durch Hinzufügung zur Sequenz des Wildtyp-GDF-Propeptids eines oder mehrerer Serin- oder Threoninreste oder durch deren Substitution (für O-gebundene Glykosylierungsstellen). Der Einfachheit halber wird die Aminosäurensequenz des GDF-Propeptids vorzugsweise durch Veränderungen auf DNA-Ebene verändert, Techniken, die in der Technologie wohlbekannt sind.
Ein weiteres Mittel zur Vergrößerung der Anzahl der Kohlehydratanteile auf dem GDF-Propeptid besteht in der chemischen oder enzymatischen Kopplung von Glycosiden an das GDF-Propeptid. Diese Verfahren sind insofern vorteilhaft, als sie keine Produktion des GDF-Propeptids in einer Wirtszelle erfordern, die Glykosylierungsfähigkeiten für die N- oder O-gebundene Glykosylierung besitzt. Je nach der angewandten Kopplungsmethode kann der (können die) Zucker angeheftet sein an (a) Arginin und Histidin, (b) freie Carboxylgruppen, (c) freie Sulfhydrylgruppen wie solche von Cystein, (d) freie Hydroxylgruppen wie solche von Serin, Threonin oder Hydroxyprolin, (e) aromatische Reste wie solche von Phenylalanin, Tyrosin oder Tryptophan oder (f) die Amidgruppe des Glutamins. Diese Verfahren sind in dem am 11. September 1987 veröffentlichten Dokument WO 87/05330 und bei Aplin und Wriston (1981), CRC Crit. Rev. Biochem., S. 259-306 beschrieben.
Die Entfernung von auf dem GDF-Propeptid vorhandenen Kohlehydratanteilen kann chemisch oder enzymatisch erfolgen. Die chemische Deglykosylierung erfordert die Exposition des GDF-Propeptids gegenüber der Verbindung Trifluormethansulfonsäure oder einer äquivalenten Verbindung. Diese Behandlung führt zur Spaltung der meisten oder aller Zucker mit Ausnahme des Bindungszuckers (N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamir), während die Aminosäurensequenz intakt bleibt.
Die chemische Deglykosylierung ist durch Hakimuddin et al., (1987), Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 und Edge et al., (1981), Anal. Biochem. 118: 131 beschrieben worden. Die enzymatische Spaltung der Kohlehydratanteile auf GDF-Propeptiden kann durch die Verwendung einer Vielfalt von Endo- und Exoglycosidasen erzielt werden, wie bei Thotakura et al., (1987), Meth. Enzymol. 138: 350 beschrieben ist.
Ist das modifizierte GDF-Propeptid wie oben beschrieben ein GDF-Propeptid-Fc-Fusionsprotein, kann die Fc-Region des IgG-Moleküls auch modifiziert sein, um ein verändertes Glykosylierungsmuster zu ergeben.
Bei einer weiteren Ausführung wird ein GDF-Propeptid an das Proteinalbumin oder ein Derivat des Albumins gebunden. Verfahren zur Bindung von Proteinen und Polypeptiden an das Proteinalbumin oder Albuminderivate sind in der Technologie wohlbekannt. Siehe z. B. das U.S. Patent Nr. 5.116.944 (Sivam et al.), das hiermit durch Erwähnung einbezogen ist.
Der in der Technologie geschulte Fachmann wird erkennen, dass gewisse Aminosäuren durch andere Aminosäuren in einer Proteinstruktur substituiert werden können, ohne die Aktivität des Proteins negativ zu beeinflussen. So wird von den Erfindern erwartet, dass verschiedene Änderungen der Aminosäurensequenzen der modifizierten oder unmodifizierten GDF-Propeptide oder solche Propeptide kodierenden DNA-Sequenzen ohne nennenswerten Verlust ihrer biologischen Verwendbarkeit oder Aktivität vorgenommen werden können. Bei einer Ausführung wird diese Aktivität in den Beispielen 4 bis 6 gemessen. Solche Änderungen umfassen Deletionen, Insertionen, Verkürzungen, Substitutionen, Fusionen und Ähnliches, ohne dass diese Aufzählung erschöpfend wäre. Zum Beispiel sind Veränderungen der Aminosäurensequenzen an proteolytischen Spaltungsstellen innerhalb des modifizierten GDF-Propeptids ausdrücklich im Umfang dieser Erfindung mit erfasst.
Bei der Durchführung solcher Veränderungen kann der hydropathische Index der Aminosäuren berücksichtigt werden. Die Bedeutung des hydropathischen Aminosäurenindexes bei der Übertragung einer interaktiven biologischen Funktion auf ein Protein ist in der Technologie allgemein bekannt (Kyte und Doolittle, (1982), J. Mol. Biol. 157: 105-132). Man geht davon aus, dass der relative hydropathische Charakter der Aminosäure zur sekundären Struktur des resultierenden Proteins beiträgt, das seinerseits die Interaktion des Proteins mit anderen Molekülen, zum Beispiel mit Enzymen, Substraten, Rezeptoren, DNA, Antikörpern, Antigenen und Ähnlichem definiert.
Jeder Aminosäure wurde ein hydropatischer Index zugewiesen auf der Basis ihrer Hydrophobizität und Ladungscharakteristika (Kyte und Doolittle, 1982, supra); diese sind Isoleucin (+4,5), Valin (+4,2), Leucin (+3,8), Phenylalanin (+2,8), Cystein/Cystin (+2,5), Methionin (+1,9), Alanin (+1,8), Glycin (-0,4), Threonin (-0,7), Serin (-0,8), Tryptophan (-0,9), Tyrosin (-1,3), Prolin (-1,6), Histidin (-3,2), Glutamat (-3,5), Glutamin (-3,5), Aspartat (-3,5), Asparagin (-3,5), Lysin (-3,9) und Arginin (-4,5).
Bei der Durchführung solcher Änderungen wird die Substitution von Aminosäuren, deren hydropatische Indici innerhalb ±2 liegen, bevorzugt, solche, die innerhalb ±1 liegen, werden besonders bevorzugt und solche, die innerhalb ±0,5 liegen, sogar ganz besonders bevorzugt.
Es ist auch klar in der Technologie, dass die Substitution ähnlicher Aminosäuren effektiv auf der Basis der Hydrophilizität erfolgen kann. Zum Beispiel stellt das U.S. Patent 4.554.101 fest, dass die größte lokale durchschnittliche Hydrophilizität eines Proteins, die durch die Hydrophilizität seiner angrenzenden Aminosäuren bestimmt wird, mit einer biologischen Eigenschaft des Proteins korreliert.
Wie im U.S. Patent Nr. 4.554.101 detailliert ausgeführt wurden Aminosäureresten die folgenden Hydrophilizitätswerte zugewiesen: Arginin (+3,0), Lysin (+3,0), Aspartat (+3,0 ±1), Glutamat (+3,0 ±1), Serin (+0,3), Asparagin (+0,2), Glutamin (+0,2), Glycin (0), Threonin (-0,4), Prolin (-0,5 ±1), Alanin (-0,5), Histidin (-0,5), Cystein (-1,0), Methionin (-1,3), Valin (-1,5), Leucin (-1,8), Isoleucin (-1,8), Tyrosin (-2,3), Phenylalanin (-2,5) und Tryptophan (-3,4).
Bei der Durchführung solcher Änderungen wird die Substitution von Aminosäuren bevorzugt, deren Hydrophilizitätswerte innerhalb ±2 liegen, solche die innerhalb ±1 liegen, werden besonders bevorzugt und solche innerhalb +0,5 werden sogar ganz besonders bevorzugt.
Die Modifikationen können konservierend sein, so dass die Struktur oder biologische Funktion des Proteins durch die Veränderung nicht beeinflusst wird. Solche konservierende Aminosäurenmodifikationen basieren auf der relativen Ähnlichkeit der Aminosäurenseitenkettensubstituenten, zum Beispiel, ihrer Hydrophobizität, Hydrophilizität, Ladung, Größe und Ähnlichem. Beispielhafte konservierende Substitutionen, die verschiedene der vorstehenden Charakteristika berücksichtigen, sind den Fachleuten der Technologie wohlbekannt und umfassen: Arginin und Lysin, Glutamat und Aspartat, Serin und Threonin, Glutamin und Asparagin und Valin, Leucin und Isoleucin. Die Aminosäurensequenz der modifizierten GDF-Propeptide können modifiziert werden, damit sie irgendeine Anzahl von konservierenden Änderungen aufweisen, so lange die Bindung des modifizierten GDF-Propeptids an sein GDF Targetprotein nicht negativ beeinflusst wird.
Die relative Sequenzähnlichkeit oder -identität (in den Technologien der Protein- und Molekularbiologie auch als Sequenzhomologie bekannt) wird vorzugsweise bestimmt unter Anwendung der "Best Fit" oder "Gap" Programme des Sequenz Analysis Software Package^TM (Version 10, Genetics Computer Group, Inc., Biotechnologie Center der Universität Wisconsin, Madison, WI). "Gap" verwendet den Algorithmus von Needleman und Wunsch (Needleman und Wunsch, 1970), um den Abgleich der beiden Sequenzen, die die Anzahl der Übereinstimmungen maximiert und die Anzahl der Lücken minimiert, zu finden. "BestFit" führt einen optimalen Abgleich des Segments mit der besten Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen durch. Optimale Abgleiche werden gefunden durch das Einfügen von Lücken zur Maximierung der Anzahl der Übereinstimmungen unter Anwendung des lokalen Homologiealgorithmus von Smith und Waterman (Smith und Waterman, 1981; Smith et al., 1983).
Das oben beschriebene Sequenzanalysen-Softwarepaket enthält eine Anzahl weiterer nützlicher Sequenzanalysen-Tools zur Identifizierung von Homologen der vorliegend offen gelegten Nucleotid- und Aminosäurensequenzen. Zum Beispiel sucht das "BLAST" Programm (Altschul et al., 1990) nach Sequenzen, die einer Abfragesequenz ähneln (entweder Peptid oder Nucleinsäure) in einer spezifizierten Datenbank (z. B. Sequenzdatenbanken, die vom National Center for Biotechnology Information (NCBI) in Bethesda, Maryland, USA) unterhalten werden; "FastA" (Lipman und Pearson, 1985; siehe auch Pearson und Lipman, 1988; Pearson et al., 1990) führt eine Pearson-und-Lipman-Suche durch nach der Ähnlichkeit zwischen einer Abfragesequenz und einer Gruppe von Sequenzen desselben Typs (Nucleinsäure oder Protein); „TfastA" führt eine Pearson-und-Lipman-Suche durch nach der Ähnlichkeit zwischen einer Proteinabfragesequenz und irgendeiner Gruppe von Nucleotidsequenzen (es übersetzt die Nucleotidsequenzen in alle sechs Leserahmen, bevor es den Vergleich durchführt); „FastX" führt eine Pearson-und-Lipman-Suche durch nach der Ähnlichkeit zwischen einer Nucleotidabfragesequenz und einer Gruppe von Proteinsequenzen unter Berücksichtigung der Rahmenverschiebungen. „TfastX" führt eine Pearson-und-Lipman-Suche nach der Ähnlichkeit zwischen einer Proteinabfragesequenz und irgendeiner Gruppe von Nucleotidsequenzen unter Berücksichtigung der Rahmenverschiebungen durch (es übersetzt beide Stränge der Nucleinsequenz, bevor es den Vergleich durchführt).
Der Fachmann der Technologie wird erkennen, dass die modifizierten oder unmodifizierten GDF-Propeptide irgendeine Anzahl von Substitutionen ihrer Aminosäurensequenzen ohne Veränderung ihrer biologischen Eigenschaften aufweisen können. Bei einer bevorzugten Ausführung sind solche Änderungen konservierende Aminosäurensubstitutionen, die in der Technologie wohlbekannt sind. Beispielhafte konservierende Substitutionen, die verschiedene der vorstehenden Charakteristika berücksichtigen, sind den Fachleuten der Technologie der Proteinbiochemie wohlbekannt und umfassen: Arginin und Lysin, Glutamat und Aspartat, Serin und Threonin, Glutamin und Asparagin und Valin, Leucin und Isoleucin, ohne dass diese Aufzählung erschöpfend wäre.
Bei einigen erfindungsgemäßen Ausführungen kann die in vivo Stabilität eines Proteins auf vielfältige Weise gemessen werden. Bei einer Ausführung werden Serum- oder Gewebeproben zu unterschiedlichen Zeitpunkten entnommen nach Verabreichung des Proteins entweder intravenös oder intraperitoneal, oder das Protein wird radiomarkiert, d. h. mit Iod-125, unter Anwendung den Fachleuten wohlbekannter Verfahren. Die Menge der Radioaktivität, die in jeder Serum- oder Gewebeprobe vorhanden ist, kann mittels eines Gamma-Zählers bestimmt werden. Bei einer weiteren Ausführung kann die Integrität/Stabilität des Proteins im Serum durch SDS-PAGE, gefolgt von entweder Autoradiographie oder Western-Blot-Analyse bestimmt werden. Bei einer weiteren Ausführung kann die biologische Aktivität des Proteins unter Anwendung irgendeines der Anzahl in der Technologie bekannter funktioneller Assays, einschließlich eines ELISA- oder zellbasierten Assays, gemessen werden.
Methoden der Krankheitsbehandlung
Die erfindungsgemäßen GDF-Propeptide sind zur Verhütung und Behandlung verschiedener medizinischer Störungen bei Mensch oder Tier brauchbar. Die GDF-Propeptide werden bevorzugt verwendet, um eine oder mehrere der mit einem GDF-Protein zusammenhängenden Aktivitäten zu hemmen oder reduzieren. Bei einer stark bevorzugten Ausführung hemmt oder reduziert das modifizierte GDF-Propeptid eine oder mehrere der Aktivitäten des reifen GDF-8 verglichen mit einem reifen GDF-8 Protein, das nicht durch dasselbe Propeptid gebunden ist. Bei einer bevorzugten Ausführung wird die Aktivität des reifen GDF-8 Proteins, wenn es an eines oder mehrere der modifizierten GDF-Propeptide gebunden ist, wenigstens zu 50%, bevorzugt wenigstens zu 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86 oder 88%, mehr bevorzugt wenigstens zu 90, 91, 92, 93 oder 94% und sogar noch mehr bevorzugt wenigstens zu 95% bis 100% verglichen mit einem reifen GDF-8 Protein, das nicht durch eines oder mehrere der modifizierten GDF-Propeptide gebunden ist, gehemmt.
Die medizinische Störung, die mit den modifizierten GDF-Propeptiden behandelt oder verhütet werden soll, ist vorzugsweise eine muskuläre oder neuromuskuläre Störung (wie amyotrophe Lateralsklerose, muskuläre Dystrophie, Muskelatrophie, congestive obstruktive Lungenkrankheit, Muskelzerfallssyndrom, Sarkopenie oder Kachexie), eine Stoffwechselerkrankung (wie Typ-2-Diabetes, nichtinsulinabhängiger Diabetes mellitus, Hyperglykämie oder Obesitas), eine adipöse Gewebestörung (wie Obesitas) oder Knochendegenerationskrankheit (wie Osteoporose). Der medizinische Zustand ist am meisten bevorzugt eine muskuläre oder neuromuskuläre Störung wie amyotrophe Lateralsklerose, muskuläre Dystrophie, Muskelatrophie, congestive obstruktive Lungenkrankheit, Muskelzerfallssyndrom, Sarkopenie oder Kachexie. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführung ist der medizinische Zustand eine Stoffwechselerkrankung oder -störung wie diejenige, die durch einen dysfunktionellen Glucosestoffwechsel verursacht wird und/oder eine Insulinresistenz, wie der Typ-2-Diabetes oder nichtinsulinabhängige Diabetes mellitus, oder Stoffwechselstörungen wie Hyperglykämie oder Obesitas. Die GDF-Propeptide werden bevorzugt verwendet, um solche medizinischen Störungen bei Säugetieren, am bevorzugtesten beim Menschen zu verhüten oder behandeln.
Die erfindungsgemäßen GDF-Propeptide oder Propeptidzusammensetzungen werden verabreicht in therapeutisch wirksamen Mengen. Wie sie hier verwendet wird, ist eine "wirksame Menge" des modifizierten GDF-Propeptids eine Dosierung, die ausreicht, um die Aktivität des GDF-Proteins zu reduzieren, um ein gewünschtes biologisches Ergebnis zu erzielen (zu. B. Vermehrung der Skelettmuskelmasse). Bei einer Ausführung kann das gewünschte biologische Ergebnis irgendein therapeutischer Nutzen sein, einschließlich der Vermehrung der Muskelmasse, einer Erhöhung der Muskelkraft, eines verbesserten Stoffwechsels, einer verminderten Adipositas oder verbesserten Glucosehomöostase. Solche Verbesserungen können durch eine Vielfalt an Methoden gemessen werden, einschließlich solcher zur Messung der Körperfleisch- und -fettmasse (wie die duale Röntgenstrahlenszintigraphieanalyse), der Muskelkraft; Serumlipide, des Serumleptins, der Serumglucose, des glykosylierten Hämoglobins, der Glucosetoleranz und Verbesserung bei der sekundären Komplikation des Diabetes. Im Allgemeinen kann eine therapeutisch wirksame Menge mit dem Alter des Patienten, dem Gewicht, des physischen Zustands und Geschlechts, sowie der Schwere des medizinischen Zustands der Person variieren. Die Dosierung kann durch einen Arzt bestimmt und erforderlichenfalls angepasst werden, um sich an die beobachteten Wirkungen der Behandlung anzupassen. Im Allgemeinen werden die Zusammensetzungen derart verabreicht, dass die GDF-Propeptide in einer Dosis zwischen 50 μg/kg und 20 mg/kg gegeben werden. Bevorzugt werden die GDF-Propeptide als eine Bolusdosis verabreicht, um die Blutkreislaufspiegel der GDF-Propeptide für die längste Zeitdauer nach Verabreichung der Dosis zu maximieren. Eine kontinuierliche Infusion kann ebenfalls nach der Bolusdosis durchgeführt werden.
Vorliegende Erfindung schlägt auch Verfahren vor zur Verhütung oder Behandlung von Stoffwechselkrankheiten oder -störungen, die durch eine abnorme Glucosehomöostase verursacht werden. Die normale Glucosehomöostase erfordert unter anderem das fein abgestimmte Zusammenspiel der Insulinsekretion durch die Betazellen des Pankreas als Antwort auf subtile Veränderungen der Blutglucosespiegel. Eine der grundlegenden Aktionen des Insulins besteht darin, die Aufnahme der Glucose aus dem Blut in die Gewebe, insbesondere in das Muskel- und Fettgewebe zu stimulieren.
Demgemäß schlägt die vorliegende Erfindung ein Verfahren vor zur Behandlung des Diabetes mellitus und damit zusammenhängender Störungen, wie Obesitas oder Hyperglykämie, durch die Verabreichung an einen Patienten eines modifizierten GDF-Propeptids oder einer modifizierten GDF-Propeptidzusammensetzung in einer Menge, die ausreicht, um die Symptome der Krankheit zu lindern. Der Typ-2- oder insulin-nichtabhängige Diabetes mellitus (NIDDM) insbesondere ist charakterisiert durch eine Dreifachwirkung (1) der Resistenz gegen die Insulinaktion auf die Glucoseaufnahme in peripheren Geweben, insbesondere im Skelettmuskel und in den Adipozyten, (2) der beeinträchtigten Insulinaktion zur Hemmung der Leberglucoseproduktion und (3) der dysregulierten Insulinsekretion (DeFronzo, (1997) Diabetes Rev. 5: 177-269). Daher können Personen, die an Typ-2-Diabetes leiden erfindungsgemäß durch Verabreichung eines modifizierten GDF-Propeptids behandelt werden, das die Sensitivität gegenüber Insulin und der Glucoseaufnahme durch Zellen erhöht.
Desgleichen können andere Krankheiten und Stoffwechselstörungen, die durch eine Insulindysfunktion gekennzeichnet sind (z. B. Resistenz, Inaktivität oder Defizienz), und/oder ein insuffizienter Glucosetransport in die Zellen ebenfalls erfindungsgemäß durch Verabreichung eines modifizierten GDF-Propeptids, das die Sensitivität gegenüber Insulin und Glucoseaufnahme durch die Zellen erhöht, behandelt werden.
Das modifizierte GDF-Propeptid oder modifizierte GDF-Propeptidzusammensetzungen dieser Erfindung werden in therapeutisch wirksamen Mengen verabreicht. Zur Behandlung von Diabetes und verwandter Störungen angewandt ist eine "wirksame Menge" des modifizierten GDF-Propeptids eine Dosierung, die ausreicht, um die Aktivität des GDF-Proteins zu reduzieren, um eine oder mehrere der gewünschten therapeutischen Resultate zu erreichen, wie zum Beispiel eine Steigerung der Insulinsensitivität oder Glucoseaufnahme durch die Zellen, eine Verminderung der Körperfettmasse oder eine gewünschte Änderung der Serumlipide, des Serumleptins, der Serumglucose, des glykosylierten Hämoglobins, der Glucosetoleranz oder eine Verbesserung der sekundären Komplikation des Diabetes. Im Allgemeinen kann eine therapeutisch wirksame Menge je nach dem Alter der Person, ihres Zustands und Geschlechts sowie der Schwere ihrer Insulindysfunktion variieren. Die Dosierung kann von einem Arzt bestimmt und erforderlichenfalls verändert werden, um sie an die beobachteten Wirkungen der Behandlung anzupassen. Im Allgemeinen werden die Zusammensetzungen derart verabreicht, dass die GDF-Propeptide in einer Dosis zwischen 50 ug/kg und 20 mg/kg gegeben werden. Vorzugsweise werden die GDF-Propeptide als Bolusdose verabreicht, um die Blutkreislaufspiegel der GDF-Propeptide für eine längstmögliche Zeitdauer nach Verabreichung zu maximieren. Eine kontinuierliche Infusion kann nach der Bolusdose ebenfalls durchgeführt werden.
Vorliegende Erfindung schlägt auch eine Gentherapie für die in vivo Produktion der GDF-Propeptide vor. Eine solche Therapie erreicht ihre therapeutische Wirkung durch Einführung der GDF-Propeptidpolynucleotidsequenzen in Zellen oder Gewebe, die die oben aufgeführten Störungen aufweisen. Die Freisetzung von GDF-Propeptidpolynucleotidsequenzen kann durch Verwendung eines rekombinanten Expressionsvektors wie eines chimären Virus oder eines kolloidalen Dispersionssystems erreicht werden. Besonders bevorzugt für die therapeutische Freisetzung von GDF-Propeptidpolynucleotidsequenzen ist die Verwendung von zielgerichteten Liposomen.
Verschiedene virale Vektoren, die wie hier gelehrt zur Gentherapie verwendet werden können, umfassen das Adenovirus, Herpesvirus, Vaccinia-Virus oder bevorzugt ein RNA Virus wie ein Retrovirus. Vorzugsweise ist der retrovirale Vektor ein Derivat eines Maus- oder Vogelretrovirus. Beispiele von retroviralen Vektoren, in die ein einzelnes fremdes Gen eingefügt werden kann, umfassen: Moloney-Maus-Leukämie-Virus (MoMuLV), Harvey-Maus-Sarkom-Virus (HaMuSV), Maus-Mammatumor-Virus (MuMTV) und Rous-Sarkom-Virus (RSV), ohne dass diese Aufzählung erschöpfend wäre. Eine Anzahl zusätzlicher retroviraler Vektoren kann multiple Gene aufnehmen. Alle diese Vektoren können ein Gen transferieren oder einbauen für einen auswählbaren Marker, so dass transduzierte Zellen identifiziert und generiert werden können. Durch das Einfügen einer GDF-Propeptidpolynucleotidsequenz von Interesse in den viralen Vektor, zusammen mit einem anderen Gen, das den Liganden für einen Rezeptor auf einer spezifischen Targetzelle kodiert, zum Beispiel, wird der Vektor targetspezifisch. Retrovirale Vektoren können targetspezifisch gemacht werden durch das Anheften, zum Beispiel, eines Zuckers, eines Glycofipids oder eines Proteins. Bevorzugtes Targeting erfolgt durch die Verwendung eines Antikörpers. Fachleute der Technologie werden erkennen, dass spezifische Polynucleotidsequenzen in das retrovirale Genom eingefügt oder an eine virale Hülle angeheftet werden können, um die targetspezifische Freisetzung des retroviralen Vektors, der das GDF-Propeptidpolynucleotid enthält, zu ermöglichen. Bei einer bevorzugten Ausführung zielt der Vektor auf Muskelzellen oder Muskelgewebe ab.
Da rekombinante Retroviren defekt sind, erfordern sie Helferzelllinien, die Plasmide enthalten, die sämtliche strukturellen Gene des Retrovirus unter der Kontrolle der regulativen Sequenzen innerhalb der LTR kodieren. Diesen Plasmiden fehlt eine Nucleotidsequenz, die den Einhüllungsmechanismus in die Lage versetzt, ein RNA Transkript für die Ummantelung zu erkennen. Helferzelllinien, die Deletionen des Einhüllungssignals aufweisen, umfassen zum Beispiel PSI.2, PA317 und PA12. Diese Zelllinien produzieren leere Virionen, weil kein Genom umhüllt ist. Wird ein retroviraler Vektor in solche Zellen eingeführt, in denen das Einhüllungssignal intakt ist, die strukturellen Gene aber durch andere Gene von Interesse ersetzt sind, kann der Vektor verhüllt und das Vektorvirion produziert werden.
Alternativ können andere Gewebekulturzellen direkt mit Plasmiden, die die retroviralen strukturellen Gene gag, pol und env kodieren, durch konventionelle Kalzium-Phosphat-Transfektion transfiziert werden. Diese Zellen werden dann mit dem Vektorplasmid transfiziert, das die Gene von Interesse enthält. Die resultierenden Zellen setzen den retroviralen Vektor in das Kulturmedium frei.
Ein weiteres zielgerichtetes Freisetzungssystem für ein GDF-Propeptidpolynucleotid ist ein kolloidales Dispersionssystem. Kolloidale Dispersionssysteme umfassen Makromolekülkomplexe, Nanokapseln, Mikrokugeln, Perlen und lipidbasierte Systeme einschließlich Öl-in-Wasser-Emulsionen, Micellen, gemischte Micellen und Liposome. Das bevorzugte erfindungsgemäße kolloidale System ist ein Liposom. Liposome sind künstliche Membranbläschen, die als in vitro und in vivo Freisetzungsvehikel brauchbar sind. RNA, DNA und intakte Virionen können innerhalb des wässrigen Innern eingekapselt sein und an Zellen in einer biologisch aktiven Form abgegeben werden (siehe z. B. Fraley et al., Trends Biochem. Sci., 6: 77, 1981). Methoden für einen effizienten Gentransfer, die ein Liposomvehikel benutzen, sind in der Technologie bekannt, siehe z. B. Mannino et al., Biotechniques, 6: 682, 1988. Die Zusammensetzung des Liposoms ist üblicherweise eine Kombination von Phospholipiden, üblicherweise in Kombination mit Steroiden, insbesondere Cholesterin. Andere Phospholipide oder andere Lipide können ebenfalls verwendet werden. Die physikalischen Charakteristika von Liposomen hängen vom pH-Wert, von der Ionenstärke und der Anwesenheit divalenter Kationen ab.
Beispiele von Lipiden, die für die Liposomenproduktion brauchbar sind, umfassen Phosphatidylverbindungen, wie Phosphatidylglycerin, Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Phosphatidylethanolamin, Sphingolipide, Cerebroside und Ganglioside. Beispielhafte Phospholipide umfassen Ei-Phosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin und Distearoylphosphatidylcholin.
Das Targeting von Liposomen ist auch auf der Basis zum Beispiel der Organspezifität, Zellspezifität und Organellspezifität möglich und in der Technologie bekannt.
Die Methoden der Behandlung oder Verhütung oben erwähnter medizinischer Zustände mit den modifizierten GDF-Propeptiden können auch angewandt werden, um andere Proteine in der TGF-β1 Superfamilie zu inhibieren. Viele dieser Proteine sind in der Struktur mit dem GDF-8 verwandt, wie das BMP-11. Dementsprechend schlägt bei einer weiteren Ausführung die Erfindung Verfahren vor zur Behandlung der oben erwähnten Störungen durch Verabreichung an eine Person eines modifizierten GDF-Propeptids, das zur Inhibierung eines nicht-GDF-8 Proteins fähig ist, entweder allein oder in Kombination mit einem modifizierten GDF-Propeptid gegen den GDF-8.
Modifizierte GDF-Propeptidzusammensetzungen
Vorliegende Erfindung schlägt Zusammensetzungen vor, die die modifizierten GDF-Propeptide umfassen. Solche Zusammensetzungen können für die pharmazeutische Verwendung und Verabreichung an Patienten geeignet sein. Die Zusammensetzungen umfassen typischerweise eines oder mehrere der erfindungsgemäßen modifizierten GDF-Propeptide und einen pharmazeutisch annehmbaren Arzneistoffträger. Wie sie hier verwendet wird umfasst die Formulierung "pharmazeutisch annehmbarer Arzneistoffträger" irgendwelche und sämtliche Lösemittel, Dispersionsmedien, Überzüge, antibakterielle Mittel und Fungistatika, isotonische und absorptionsverzögernde Mittel und Ähnliches, die mit einer pharmazeutischen Verabreichung vereinbar sind. Die Verwendung solcher Medien und Agenzien für pharmazeutisch aktive Substanzen ist in der Technologie wohlbekannt. Beispielhafte pharmazeutisch annehmbare Arzneistoffträger finden sich in "The Handbook of Pharmaceutical Excipients" 3. Ed. 2000, Am. Pharmaceutical Press, A. E. Kibbe, Ed.. Die Zusammensetzungen können auch weitere aktive Verbindungen enthalten, die ergänzende, zusätzliche oder gesteigerte therapeutische Funktionen ergeben. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch in einem Behälter, einer Verpackung oder einem Spender enthalten sein, begleitet von den Verabreichungshinweisen.
Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung wird derart zubereitet, dass sie mit ihrer beabsichtigten Verabreichungsroute kompatibel ist. Die Verabreichungsverfahren sind den Fachleuten der Technologie bekannt. Es kann auch möglich sein, Zusammensetzungen zu erhalten, die topisch oder oral verabreicht werden oder die zur Übertragung durch Schleimhautmembranen fähig sind. Die Verabreichung kann zum Beispiel intravenös (i.v.), intraperitoneal (i.p.), intramuskulär (i.m.), intrakavitär, subkutan (s.k.) oder transdermal erfolgen. Bevorzugte Ausführungen umfassen die i.v., i.p., i.m. und s.k. Injektion. Bei einer bevorzugten Ausführung werden die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen intravenös verabreicht.
Lösungen oder Suspensionen für die intradermale oder subkutane Anwendung schließen typischerweise eine oder mehrere der folgenden Komponenten ein: ein steriles Verdünnungsmittel wie Wasser für die Injektion, Salzlösung, fixierte Öle, Polyethylenglykole, Glycerin, Propylenglykol oder sonstige synthetische Lösemittel, antibakterielle Mittel wie Benzylalkohol oder Methylparabens, Antioxidanzien wie Ascorbinsäure oder Natriumbisulfit, chelatbildende Mittel wie Ethylendiamintetraessigsäure, Puffer wie Acetate, Citrate oder Phosphate und Mittel zur Anpassung der Tonizität wie Natriumchlorid oder Dextrose. Der pH-Wert kann mit Säuren oder Basen wie Salzsäure oder Natriumhydroxid eingestellt werden. Solche Zubereitungen können in aus Glas oder Kunststoff hergestellten Ampullen, Einwegspritzen oder Fläschchen zur Mehrfachdosierung enthalten sein.
Zur Injektion geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen umfassen sterile wässrige Lösungen oder Dispersionen und sterile Pulver für die unvorbereitete Zubereitung einer sterilen injizierbaren Lösung oder Dispersion. Für die intravenöse Verabreichung umfassen geeignete Träger physiologische Salzlösung, bakteriostatisches Wasser, Cremophor EL^TM (BASF, Parsippany, NJ) oder phosphatgepufferte Salzlösung (PBS). In allen Fällen muss die Zusammensetzung steril sein und sollte bis zu einem Grad fließend sein, dass eine leichte Spritzenzubereitung möglich ist. Sie muss unter Herstellungs- und Lagerungsbedingungen stabil und vor der kontaminierenden Wirkung von Mikroorganismen wie Bakterien und Pilzen geschützt sein. Der Träger kann ein Lösungs- oder Dispersionsmedium sein, das zum Beispiel Wasser, Ethanol, Polyol (zum Beispiel Glyzerin, Propylenglykol und flüssigen Polyetheylenglykol und Ähnliches) und geeignete Mixturen davon enthält. Die geeignete Fluidität kann zum Beispiel durch Verwendung eines Auftrags wie Lecithin, durch Beibehaltung der erforderlichen Partikelgröße im Falle der Dispersion und durch Verwendung von Tensiden aufrechterhalten werden. Die Verhinderung der Aktion von Mikroorganismen kann erreicht werden durch verschiedene antibakterielle Mittel und Fungistatika, zum Beispiel Parabens, Chlorbutanol, Phenol, Ascorbinsäure, Thimerosal und Ähnliches. In vielen Fällen wird es bevorzugt werden, isotonische Mittel, zum Beispiel Zucker, Polyalkohole wie Manitol, Sorbitol, Natriumchlorid in die Zusammensetzung mit aufzunehmen. Eine verlängerte Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann durch Aufnahme eines Mittels, das die Absorption verzögert, zum Beispiel, Aluminiummonostearat und Gelatine, in die Zusammensetzung herbeigeführt werden.
Orale Zusammensetzungen umfassen im Allgemeinen ein inertes Verdünnungsmittel oder einen essbaren Träger. Sie können zum Beispiel in Gelatinekapseln eingeschlossen oder zu Tabletten komprimiert sein. Zum Zweck der oralen therapeutischen Verabreichung können die GDF-Propeptide mit Arzneistoffträgern eingebaut und in Form von Tabletten, Pastillen oder Kapseln verwendet werden. Pharmazeutisch kompatible Bindungsmittel und/oder adjuvante Materialien können als Teil der Zusammensetzung integriert sein. Die Tabletten, Pillen, Kapseln, Pastillen und Ähnliches können irgendeine der folgenden Bestandteile oder Verbindungen ähnlicher Natur enthalten: einen Binder wie mikrokristalline Zellulose, Tragacanthgummi oder Gelatine, einen Arzneistoffträger wie Stärke oder Lactose, ein Zerkleinerungsmittel wie Alginsäure, Primogel oder Maisstärke, ein Schmiermittel wie Magnesiumstearat oder Sterote, ein Gleitmittel wie kolloidales Siliziumdioxid, einen Süßstoff wie Saccharose oder Saccharin, oder einen Geschmacksstoff wie Pfefferminze, Methyisalicylat oder Orangenaroma.
Für die Verabreichung durch Inhalation können die GDF-Propeptide in der Form eines Aerosolsprays aus einem Druckbehälter oder -spender, der ein geeignetes Treibmittel, z. B. ein Gas wie Kohlendioxid, oder einen Zerstäuber enthält, freigesetzt werden.
Die systemische Verabreichung kann auch durch transmukosale oder transdermale Mittel erfolgen. Für die transmukosale oder transdermale Verabreichung werden Durchdringungsmittel in der Formulierung verwendet, die geeignet sind, die Barriere zu durchdringen. Solche Durchdringungsmittel sind im Allgemeinen in der Technologie bekannt und umfassen zum Beispiel für die transmukosale Verabreichung Detergenzien, Gallensalze und Fusidinsäurederivate. Die transmukosale Verabreichung kann mittels Verwendung von Nasensprays oder Suppositorien erfolgen. Für die transdermale Verabreichung werden die aktiven Verbindungen in Salben, Balsamen, Gelen oder Cremes, wie allgemein in der Technologie bekannt, präpariert.
Die GDF-Propeptide können auch in der Form von Suppositorien (z. B. auf herkömmlicher Suppositorienbasis wie Kakaobutter und anderen Glyceriden) oder mittels Retentionsenemas für die rektale Freisetzung verabreicht werden.
Bei einer Ausführung werden die modifizierten GDF-Propeptide mit Trägern zubereitet, die die Verbindung vor schneller Ausscheidung aus dem Körper schützen, wie in Form eines kontrollierten Freisetzungspräparats, einschließlich Implantate und Freisetzungssysteme in Mikrokapseln. Biologisch abbaubare, biokompatible Polymere können eingesetzt werden wie Ethylenvinylacetat, Polyanhydride, Polyglycolsäure, Kollagen, Polyorthoester und Polylactid. Die Verfahren zur Zubereitung solcher Präparate sind den Fachleuten der Technologie vertraut. Die Materialien können auch kommerziell von der Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc., bezogen werden. Liposomale Suspensionen, die die modifizierten GDF-Propeptide enthalten, können auch als pharmazeutisch annehmbare Träger verwendet werden. Diese können zubereitet werden nach Fachleuten der Technologie bekannten Verfahren, zum Beispiel nach der Beschreibung im U.S. Patent Nr. 4.522.811.
Es ist besonders vorteilhaft, orale oder parenterale Zusammensetzungen für eine leichte Verabreichung und einheitliche Dosierung in einer Darreichungsform zuzubereiten. Der Begriff Darreichungsform bezieht sich, wie er hier verwendet wird, auf physikalisch getrennte Einheiten, die als einheitliche Dosierungen an den zu behandelnden Patienten angepasst sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge der aktiven Verbindung enthält, die errechnet wurde als die Menge, die den gewünschten therapeutischen Effekt in Verbindung mit dem erforderlichen pharmazeutischen Träger erzielt. Die Spezifikation für die erfindungsgemäßen Darreichungsformen wird von den einzigartigen Charakteristika der aktiven Verbindung und dem besonderen zu erreichenden therapeutischen Effekt sowie den der Technik der Herstellung einer solchen aktiven Verbindung zur Behandlung von Individuen innewohnenden Grenzen diktiert und hängt direkt davon ab.
Die Toxizität und therapeutische Effizienz solcher Verbindungen kann mittels pharmazeutischer Standardverfahren in Zellkulturen oder an Versuchstieren bestimmt werden, z. B. zur Bestimmung der LD₅₀ (der Letaldosis bei 50% der Population) und der ED₅₀ (der therapeutisch wirksamen Dosis bei 50% der Population). Das Dosisverhältnis zwischen toxischen und therapeutischen Effekten ist der therapeutische Index und kann als LD₅₀/ED₅₀-Verhältnis ausgedrückt werden. GDF-Propeptide, die hohe therapeutische Indici aufweisen, werden bevorzugt.
Die aus Zellkulturassays und Tierversuchen gewonnenen Daten können bei der Zubereitung einer Reihe von Dosierungen für die Verwendung beim Menschen verwendet werden. Die Dosierung solcher Verbindungen liegt vorzugsweise innerhalb eines Bereichs zirkulierender Konzentrationen, die die ED₅₀ mit geringer oder ohne Toxizität einschließen. Die Dosierung kann innerhalb dieses Bereichs variieren je nach der verwendeten Darreichungsform und der benutzten Verabreichungsroute. Für jedes für die Erfindung verwandte modifizierte GDF-Propeptid kann die therapeutisch wirksame Dosis anfänglich aus den Zellkulturassays geschätzt werden. Eine Dosis kann in Tiermodellen präpariert werden, um einen Bereich der zirkulierenden Plasmakonzentration zu erhalten, der die IC₅₀ einschließt (d. h. die Konzentration des getesteten modifizierten GDF-Propeptids, die eine halbmaximale Inhibition der Symptome erzielt), wie sie in der Zellkultur bestimmt wurde. Die Plasmaspiegel können zum Beispiel durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie gemessen werden. Die Wirkungen irgendeiner besonderen Dosierung können durch einen geeigneten Bioassay überwacht werden. Beispiele geeigneter Bioassays umfassen DNA-Replikationsassays, transkriptionsbasierte Assays, GDF-Protein-/Rezeptorbindungsassays, Kreatinkinaseassays, auf der Differenzierung der Präadipozyten basierte Assays, auf der Glukoseaufnahme in Adipozyten basierte Assays und immunologische Assays.
Die folgenden Beispiele stellen bevorzugte Ausführungen der Erfindung dar.
BEISPIELE
Beispiel 1: Reinigung des GDF-8
Konditionierte Medien aus einer ausgewählten Zelllinie, die ein rekombinantes humanes GDF-8 Protein (des reifen GDF-8 + reifen GDF-8 Propeptids) exprimierten, wurden bis zum pH-Wert 6,5 azidifiziert und auf eine 80 × 50 mm POROS HQ Anionenaustauschsäule im Tandem mit einer 80 × 50 mm POROS SP Kationenaustauschsäule appliziert (Perseptive Biosystems). Der Durchfluss wurde auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt und auf eine 75 × 20 mm POROS SP Kationenaustauschsäule appliziert (Perseptive Biosystems) und mit einem NaCl-Gradienten eluiert. Fraktionen, die den GDF-8 enthielten, was mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) angezeigt wird, wurden zusammengefasst, mit Trifluoressigsäure (TFA) bis zum pH-Wert 2 bis 3 azidifiziert, dann mit 0,1% TFA auf 200 ml gebracht, um die Viskosität zu verringern. Der Pool wurde dann auf eine 250 × 21,2 mm C₅-Säule appliziert (Phenomenex), der eine 60 × 21,2 mm Vorsäule (Phenomenex) vorgeschaltet war, und mit einem TFA/CH₃CN-Gradienten eluiert, um den reifen GDF-8 vom GDF-8 Propeptid zu trennen. Zusammengefasste Fraktionen, die den reifen GDF-8 enthielten, wurden durch Lyophilisation konzentriert, um das Acetonitril zu entfernen, und 20 ml 0,1% TFA wurden hinzugefügt. Die Probe wurde dann auf eine 250 × 10 mm C₅-Säule (Phenomenex) appliziert, auf 60°C erhitzt, um die Trennung zu fördern. Dies wurde wiederholt, bis eine weitere Trennung nicht mehr erreicht werden konnte. Fraktionen, die den reifen GDF-8 enthielten, wurden dann zusammengefasst und bis auf 40% Acetonitril gebracht und auf eine 600 × 21,2 BioSep S-3000 Größenexklusionssäule (Phenomenex) appliziert, der eine 60 × 21,2 Vorsäule vorgeschaltet war. Fraktionen, die den gereinigten reifen GDF-8 enthielten, wurden zusammengefasst und für die Verwendung in nachfolgenden Experimenten konzentriert. Typische Ausbeuten des reifen GDF-8 Dimers betrugen 0,33 mg Protein pro Liter der konditionierten Medien.
C₅ Säulenfraktionen, die das GDF-8 Propeptid enthielten, wurden zusammengefasst, das Acetonitril wurde durch Verdampfung entfernt, 20 ml 0,1% TFA wurden zugefügt und die Probe wurde dann auf die 250 × 10 mm C₅-Säule bei 60°C injiziert. Dies wurde wiederholt, bis eine weitere Trennung nicht mehr erreicht werden konnte. Fraktionen, die das GDF-8 Propeptid enthielten, wurden dann zusammengefasst und auf 40% Acetonitril gebracht und auf eine 600 × 21,2 BioSep S-3000 Größenexklusionssäule (Phenomenex) appliziert, der eine 60 × 21,2 Vorsäule vorgeschaltet war. Fraktionen, die das gereinigte GDF-8 Propeptid enthielten, wurden zusammengefasst und für die Verwendung in nachfolgenden Experimenten konzentriert. Eine typische Ausbeute des GDF-8 Propeptids betrug 0,24 mg Protein pro Liter der konditionierten Medien.
Bei der SDS-PAGE migrierte der gereinigte reife GDF-8 als ein breites Band mit 25 kDa unter nicht-reduzierenden Bedingungen und 13 kDa unter reduzierenden Bedingungen. Ein ähnliches SDS-PAGE-Profil wurde bezüglich des Maus-GDF-8 berichtet (McPherron et al., (1997) Nature 387: 83-90) und reflektiert die dimere Natur des reifen Proteins.
Die wahrnehmbare Molekülmasse des gereinigten GDF-8 Propeptids betrug 38 kDa sowohl unter reduzierenden als auch unter nicht-reduzierenden Bedingungen. Dies weist darauf hin, dass das GDF-8 Propeptid monomer ist. Der Unterschied zwischen der wahrnehmbaren Molekülmasse und der vorausgesagten Molekülmasse des GDF-8 Propeptids, ~26 kDa, kann die Zugabe von Kohlehydrat reflektieren, da seine Aminosäurensequenz eine potentielle N-gebundene Glykosylierungsstelle enthält (McPherron et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 12457-12461). So führte das oben beschriebene Verfahren zur Produktion des gereinigten und aktiven reifen GDF-8 Dimers und GDF-8 Propeptids.
Beispiel 2: Charakteristika des gereinigten rekombinanten humanen GDF-8
50 ug jeweils des gereinigten reifen GDF-8 und gereinigten GDF-8 Propeptids wurden gemixt und in 50 mM Natriumphosphat, pH-Wert 7,0, dialysiert und auf einer 300 × 7,8 mm BioSep S-3000 Größenexklusionssäule (Phenomenex) chromatographiert. Die Molekülmasse des reifen GDF-8-/Propeptid-Komplexes wurde nach der Elutionszeit bestimmt unter Verwendung von Molekülmassenstandards (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), die auf derselben Säule chromatographiert wurden.
Wurde das gereinigte GDF-8 Propeptid mit dem gereinigten reifen GDF-8 bei neutralem pH-Wert inkubiert, bildeten die beiden Proteine einen Komplex, was durch das Größenexklusionsprofil angezeigt wurde. Das primäre, nach 12,7 Minuten eluierte Proteinpeak hatte eine geschätzte Molekülmasse von 78 kDa nach den Molekülmassenstandards (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), die auf derselben Säule chromatographiert wurden. Die Größe des Komplexes ist am meisten übereinstimmend mit einem Dimer des reifen GDF-8, das sich mit zwei Monomeren des Propeptids assoziiert und so einen tetrameren Komplex bildet.
Um diese Beobachtung zu bestätigen, wurde eine Zubereitung, die sowohl den reifen GDF-8 als auch das GDF-8 Propeptid enthielt, mit oder ohne 100 mM 1-Ethyl 3-[3-Dimethylaminopropyl]Carbodiamidhydrochlorid (EDC, Pierce) für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, mit HCl zum pH-Wert 2 bis 3 azidifiziert und mit einem Micron-10 Konzentrator (Amicon) für die SDS-PAGE unter Verwendung eines tricingepufferten 10% Acrylamidgels konzentriert. Die Proteine wurden visualisiert durch Coomassie Blue Färbung. Ein Band, das einer Molekülmasse von etwa 75 kDa entsprach, wurde nur in der Probe, zu der EDC zugefügt wurde, und nicht im Kontrollstreifen beobachtet, wodurch die Anwesenheit des reifen GDF-8/GDF-8 Propeptidkomplexes bestätigt wurde. Dies validiert den Assay als brauchbar zur Messung der Aktivität und Konzentration des gereinigten reifen GDF-8 Dimers.
Beispiel 3: Biologische in vitro Aktivität des gereinigten GDF-8 Um die Aktivität des GDF-8 nachzuweisen, wurde ein Reportergenassay (RGA) entwickelt, wobei eine Reportervektor pGL3(CAGA)₁₂ Sequenz gekoppelt an Luciferase verwendet wurde. Bisher wurde über die CAGA-Sequenz berichtet, dass sie eine TGF-β-Antwortsequenz innerhalb des Promotors des TGF-β-induzierten Gens PAI-1 sei (Dennler et al., (1998) EMBO J. 17: 3091-3100).
Der Reportervektor, der 12 CAGA Boxen enthält, wurde hergestellt unter Verwendung des basischen Reporterplasmids pGL3 (Promega Corporation, Madison, WI, USA, Kat. Nr. E1751). Die TATA Box und Transkriptionsinitiationsstelle des Adenovirus major late Promotors (-35/+10) wurde zwischen die BgIII- und HindIII-Stellen eingefügt. Oligonucleotide, die zwölf Repeats der CAGA Boxen AGCCAGACA enthielten, wurden geglüht und in die XhoI Stelle geklont. Die humane Rhabdomyosarkomzelllinie A204 (ATCC HTB-82) wurde vorübergehend mit pGL3(CAGA)₁₂ transfiziert unter Verwendung des FuGENE 6 Transfektionsreagens (Roche Diagnostics, Indianapolis, USA, Kat. Nr. 1814443). Nach der Transfektion wurden die Zellen auf 48-Wellplatten im McCoy's 5A Medium gezüchtet (Life Technologies, Rockville, Maryland, USA, Kat. Nr. 21500-079), mit 2 mM Glutamin, 100 IE/ml Streptomycin, 100 μg/ml Penicillin und 10% fetalem Kalbserum für 16 h ergänzt. Die Zellen wurden dann mit GDF-8, BMP-11 oder Aktivin in McCoy's 5A Medien mit Glutamin, Streptomycin, Penicillin und 1 mg/ml Rinderserumalbumin für 6 h bei 37°C behandelt. Die Luciferase wurde in den behandelten Zellen unter Anwendung des Luciferase-Assaysystems (Promega Corporation, Madison, WI, USA, Kat. Nr. E1483) quantifiziert. Die Resultate des Assays sind in 1 dargestellt. Für den GDF-8 sind die Resultate als Durchschnitt ± Standardfehler aus drei getrennten Experimenten ausgedrückt. Für BMP-11 und Aktivin sind die Resultate aus zwei getrennten Experimenten repräsentativ.
Die Resultate zeigen, dass GDF-8 das Reporterkonstrukt maximal zehnfach aktivierte mit einer ED₅₀ von 10 ng/ml GDF-8, was beweist, dass der gereinigte rekombinante GDF-8 biologisch aktiv war. BMP-11, das zu 90% mit dem GDF-8 auf Aminosäurenebene identisch ist (Gamer et al., (1999) Dev. Biol. 208: 222-232, und Nakashima et al., (1999) Mech. Dev. 80: 185-189), und Aktivin lösten eine ähnliche biologische Antwort aus, was beweist, dass der Reportergenassay ein geeigneter Assay ist, um die biologische in vitro Aktivität von GDF-8, BMP-11 oder Aktivin zu detektieren.
Beispiel 4: Bindungseigenschaften des gereinigten GDF-8
Der GDF-8 latente Komplex wurde biotiniert im Verhältnis von 20 mol EZ-link Sulfo-NNS-Biotin (Pierce, Rockford, Illinois, USA, Kat. Nr. 21217) zu 1 mol des GDF-8 Komplexes für 2 Stunden auf Eis, mit 0,5% TFA inaktiviert und auf einer C4 Jupiter 250 × 4,6 mm Säule (Phenomenex) der Chromatographie unterzogen, um den reifen GDF-8 vom GDF-8 Propeptid zu trennen. Biotinierte reife GDF-8 Fraktionen, die mit einem TFA/CH₃CN Gradienten eluierten, wurden zusammengefasst, konzentriert und mit dem MicroBCA Protein Assay Reagens Kit (Pierce, Rockford, IL, USA, Kat. Nr. 23235) quantifiziert.
Rekombinante ActRIIB-Fc-Chimäre (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA Kat. Nr. 339-RB/CF) wurden auf 96-Well-Flachboden-Assayplatten (Costar, NY, Kat. Nr. 3590) mit 1 μg/ml in 0,2 M Natriumcarbonatpuffer über Nacht bei 4°C aufgetragen. Die Platten wurden dann mit 1 mg/ml Rinderserumalbumin blockiert und nach dem Standard-ELISA-Protokoll gewaschen. 100 μl biotinierter GDF-8 Aligoute in verschiedenen Konzentrationen wurden zur blockierten ELISA-Platte hinzugefügt, 1 Stunde lang inkubiert, gewaschen und die Menge des gebundenen GDF-8 wurde durch Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase detektiert (SA-HRP, BD PharMingen, San Diego, CA, USA, Kat. Nr. 13047E), gefolgt von der Zugabe von TMB (KPL, Gaithersburg, Maryland, USA, Kat. Nr. 50-76-04). Kolorimetrische Messungen wurden bei 450 nM in einem Mikroplattenleser für Molekularvorrichtungen durchgeführt.
Wie in 2 dargestellt, weist der biotinierte an ActRIIB gebundene GDF-8, der mutmaßliche GDF-8 Typ-II-Rezeptor mit einer ED₅₀ von 12 ng/ml, darauf hin, dass der ActRII Bindungsassay ein sensitiver in vitro Bindungsassay für den GDF-8 ist.
Beispiel 5: Inhibition des GDF-8 und BMP-11 durch das GDF-8 Propeptid
Wurde der GDF-8 mit dem GDF-8 Propeptid für 1 Stunde bei Raumtemperatur präinkubiert, war die biologische Aktivität des GDF-8 reduziert. 3 zeigt die Induktion der pGL3(CAGA)₁₂ Reporteraktivität bei der ED₅₀ für GDF-8 von 10 ng/ml in Gegenwart des GDF-8 Propeptids. Das GDF-8 Propeptid reduzierte die GDF-8 Induktion als Antwort auf die Dosis mit einer IC₅₀ von 25 ng/ml (0,6 nM). Das GDF-8 Propeptid inhibierte auch die biologische Aktivität des BMP-11 in demselben Ausmaß. Im Gegensatz dazu wurde die Aktivität des Aktivins in diesem Assay durch das GDF-8 Propeptid nicht beeinflusst, wahrscheinlich auf Grund der relativ niedrigen Homologie zwischen GDF-8 und Aktivin, verglichen mit GDF-8 und BMP-11.
Auf ähnliche Weise zeigt 4, dass die Präinkubation des GDF-8 Propeptids mit biotiniertem GDF-8 von 5 ng/ml die GDF-8 Bindung an ActRIIB im ActRIIB Bindungsassay inhibierfe, wie in Beispiel 4 beschrieben, mit einer IC₅₀ von 0,3 nM. Daraus wird geschlossen, dass das erfindungsgemäße GDF-8 Propeptid ein potenter subnanomolarer Inhibitor der GDF-8- und BMP-11-Aktivität in vitro ist, wie es im Reportergenassay und ActRIIB Bindungsassay gemessen wurde. Dementsprechend beweist dieser Assay, dass das GDF-8 Propeptid aktiv und ein potenter Inhibitor der GDF-8-Aktivität in diesem Assay ist.
Beispiel 6: Inhibition der GDF-8-Rezeptorbindung durch das GDF-8 Propeptid
Der GDF-8 wurde mit Chloramin T wie bei Frolik et al., (1984) J. Biol. Chem. 259: 10995-10999 beschrieben zu einer spezifischen Aktivität von 100-200 μCi/μg iodiert. Der iodierte GDF-8 zeigte eine vergleichbare biologische Aktivität mit dem nicht markierten GDF-8 im (CAGA)₁₂ Reporterassay, der in Beispiel 3 beschrieben ist. ¹²⁵I-markierter GDF-8 wurde auf die spezifische Bindung an eine Myoblastzelllinie, L6, hin ausgewertet.
L6-Myoblastzellen (ATCC CRL-1458) wurden bis zur Konfluenz in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium, das mit 10% hitze-inaktiviertem fetalem Kalbserum ergänzt wurde, auf gelatinisierten 24-Wellplatten gezüchtet. Eine Gleichgewichtsbindung wurde durchgeführt wie bei Song et al., (1995) Endocrinology 136: 4293-4297 beschrieben. Diese Schrift wird in ihrer Gesamtheit durch Erwähnung in diese Offenlegung integriert. 1 ng/ml ¹²⁵I GDF-8 (mit oder ohne unmarkiertem GDF-8) wurde mit konfluenten L6-Zellen für 4 Stunden bei 4°C inkubiert. Nach dem Waschen der Zellen wurde gebundener [¹²⁵I]GDF-8 extrahiert und mit einem Gammazähler quantifiziert. Die Resultate sind als Durchschnitt ± Standardfehler aus dreifacher Bestimmung ausgedrückt und sind für drei getrennte Experimente repräsentativ.
Wie in 5 dargestellt, band sich ¹²⁵I-GDF-8 an L6-Zellen mit hoher Affinität. Auffallend war, dass BMP-11, nicht aber TGF-β1, die ¹²⁵I-GDF-8 Bindung verdrängte, was zeigte, dass GDF-8 und BMP-11 (jedoch nicht TGF-β1) einen gemeinsamen Rezeptor auf diesen Zellen teilen (die Daten sind nicht dargestellt). Aus einer Scatchard Analyse der GDF-8 Bindung wurde geschätzt, dass K_d 140 pM betrug. Ferner konnte, wenn 1 ng/ml ¹²⁵I-GDF-8 mit GDF-8 Propeptid für 1 Stunde bei Raumtemperatur präinkubiert wurde, die spezifische GDF-8 Bindung an L6-Zellen mit steigenden Konzentrationen unmarkierten GDF-8 Propeptids inhibiert werden (6). Die Resultate sind als Durchschnitt ± Standardfehler aus dreifacher Bestimmung ausgedrückt und sind für zwei getrennte Experimente repräsentativ. Der IC₅₀-Wert für 1 ng/ml GDF-8 betrug 140 ng/ml GDF-8 Propeptid. Wie durch diese Daten nachgewiesen wurde, inhibiert das GDF-8 Propeptid die biologische Aktivität des GDF-8 durch Blockierung der GDF-8 Rezeptorbindung.
Beispiel 7: Inhibition der GDF-8 Aktivität durch GDF-8 Propeptid-Fc-Fusionsproteine
Wie in Beispiel 8 nachstehend gezeigt, hat das Maus-GDF-8 Propeptid eine relativ kurze in vivo Halbwertzeit. Um die Bioverfügbarkeit des GDF-8 Propeptids zu erhöhen, wurden Fusionen zwischen dem GDF-8 Propeptid und einer Maus-IgG2a-Fc-Region unter Anwendung von Standardgentechniken konstruiert.
Vier Mutationen wurden in die Fc-Region eingeführt, um die Effektorfunktion zu reduzieren, wie es bei Steurer et al., (1995) J. Immunol. 155: 1165-1174 beschrieben ist. Unter Anwendung der Standard-PCR-Methodik wurden zwei Fusionskonstrukte durch Fusion einer cDNA, die das Maus-GDF-8 Propeptid kodiert (Aminosäuren 1 bis 267), mit einer Maus-IgG2a-Fc-Region (7) hergestellt. Die Fusion 1 (7A) kodiert die ersten 265 Aminosäuren des Maus-GDF-8 Propeptids (einschließlich eines 24 Aminosäuren-Sekretionsleaders), die im Rahmen fusioniert sind mit 233 Aminosäuren der Maus-IgG2a-Fc-Region, beginnend bei der ersten Aminosäure im Gelenkabschnitt. Die Fusion 2 (7B) ist auf ähnliche Weise wie Fusion 1 konstruiert, mit der Ausnahme, dass ein kurzer Glycin-Serin-Glycin-Serin (GSGS) Binder das GDF-8 Propeptid von der Maus-Fc-Region trennt.
Die beiden Chimären wurden in einen eukaryotischen Expressionsvektor pED (Kaufman et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4485-4490) eingeführt und vorübergehend in COS-1 M6-Zellen exprimiert (Horowitz et al., (1983) Journal of Molecular and Applied Genetics 2: 147-159), unter Verwendung des Lipofectamin 2000 Transfektionsreagens (Gibco BRL, Life Technologies, Rockville, Maryland, USA, Kat. Nr. 11668-019) nach dem Protokoll des Herstellers. Nach 24 Stunden Inkubation wurde R1CD1 (ein modifiziertes DMEM/F12 serumfreies Kulturmedium) hinzugefügt. Konditioniertes Medium (KM) wurde zusammengefasst, frisches R1CD1 ersetzt und KM 60 Stunden später wieder geerntet. Die konditionierten Medien wurden dann zusammengefasst und über Protein A Sepharose CL-4B (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, HP7 9NA, England, Kat. Nr. 17-07080-01) nach Zugabe von 1/10tel Volumen 1 M Tris pH 8,0 gereinigt. Das gereinigte Protein wurde in 0,1 M Essigsäure, 150 mM NaCl eluiert und sofort mit 1/20tel Volumen 3 M Tris pH 9,0 neutralisiert. Die Proteine wurden nach dem Standard-Maus-IgG-ELISA-Protokoll quantifiziert und mittels ActRIIB Kompetitions-ELISA zusammen mit einem gereinigten humanen GDF-8 Propeptid wie in Beispiel 5 beschrieben getestet. Die Resultate sind in 8 dargestellt. Die IC₅₀'s der GDF-8 Propeptid-Fc-Fusionen liegen im niedrigen nanomolaren Bereich und es besteht kein Unterschied zwischen Fusion 1 und Fusion 2. Die Fusion 1 (kein Binder zwischen GDF-8 Propeptid und Maus-IgG2a) wurde zur Verwendung bei der Herstellung einer stabilen CHO-Zelllinie ausgewählt und auf die Inhibition des GDF-8 hin im RGA-Assay getestet.
Die GDF-8 Propeptid-Fc-cDNA wurde in das CHO-Expressionsplasmid pHTop subkloniett und in CHO/A2-Zellen transfiziert wie bei Thies et al., (2001) Growth Factors 18: 251-259 beschrieben. Diese Schrift ist in ihrer Gesamtheit in diese Offenlegung durch die Erwähnung einbezogen.
Eine stabile Zelllinie (PF-4/0,02) wurde durch Auswahl von Zellen in 0,02 M Methotrexat erstellt. Konditioniertes Medium, das das GDF-8 Propeptid-Fc-Fusionsprotein aus einer ausgewählten Linie enthielt, wurde geerntet und sein pH-Wert durch Zugabe von 10% v/v 1 M Tris pH 8,0 eingestellt und über Pharmacia rProteinA Sepharose Fast Flow (Amersham Phannacia Biotech, Buckinghamshire, HP7 9NA, England, Kat. Nr. 17-1279-02), der zuvor mit 50 mM Tris 150 mM NaCl pH 7,5 ausbalanciert worden war, gereinigt. Die Fraktionen wurden mit 100 mM Essigsäure, 150 mM NaCl pH 2,5 eluiert und sofort durch Zugabe von 5% v/v 3 M Tris pH 9,0 neutralisiert. Die Peakfraktionen wurden zusammengefasst und auf eine Pharmacia Superdex 200 Größenexklusionssäule (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, HP7 9NA, England, Kat. Nr. 17-1069-01) aufgetragen. 0,05% Tween 80 wurde zu den Fraktionen zugefügt, um eine Zusammenballung zu verhindern. Die Fraktionen wurden durch SDS-PAGE auf Novex 10% Tricingelen (Novex, San Diego, CA, USA, Kat. Nr. EC66755) ausgewertet.
Die zusammengefassten Fraktionen wurden durch Spektrophotometrie quantifiziert und auf ihre Aktivität im ActRIIB Bindungsassay wie in Beispiel 4 beschrieben, sowie im Reportergenassay (9) getestet. Die IC₅₀ der gereinigten GDF-8 Propeptid-Fc-Fusion betrug 1,3 nM. Die Daten zeigen, dass das erfindungsgemäße modifizierte GDF-Propeptid, das ein GDF-8 Propeptid-Fc-Fusionsprotein umfasst, eine potente inhibitorische (neutralisierende) Aktivität verglichen mit dem GDF-8 Propeptid bewahrt hat.
Beispiel 8: Pharmakokinetik
Die Pharmakokinetik (PK) des GDF-8 Propeptids (nachstehend "GDF8-Pro" bezeichnet) und des GDF-8 Propeptid-Fc-Fusionsproteins (nachstehend "GDF8-ProFc" bezeichnet) wurde an C57BI/6J Mäusen mit einer Dosis von 0,2 μg/Maus (GDF8-Pro) oder 2 ug/Maus (GDF8-ProFc) nach einer einzigen intravenösen Verabreichung ausgewertet. Die Tiere erhielten eine Mixtur von unmarkiertem und ¹²⁵I-markiertem GDF8-Pro oder GDF8-ProFc in den oben genannten Dosen und die Serumkonzentrationen wurden basierend auf der I¹²⁵ Radioaktivität im Serum und der spezifischen Aktivität der injizierten Dosis bestimmt. 10 zeigt die Serumkonzentrationen im Verhältnis zu den Zeitkurven sowohl für das GDF8-Pro als auch für das GDF8-ProFc. Tabelle 1 zeigt die PK-Parameter für das GDF8-Pro und das GDF8-ProFc nach einer einzigen intravenösen Verabreichung von 2 μg/Maus. Die Serumkonzentrationen und PK-Parameter für das GDF8-Pro sind zu Vergleichszwecken auf eine Dosis von 2 μg/Maus normiert. TABELLE 1

T_1/2: Halbwertzeit während der terminalen Eliminierungsphase
C_mx: Peakserumkonzentration
MRT: mittlere Verweildauer
V₁: anfängliches Verteilungsvolumen
V_ss: Verteilungsvolumen im Dauerzustand

Anmerkung: Die GDF8-Pro PK-Parameter sind auf eine Dosis von 2 μg/Maus normiert.
Wie sich aus 10 ergibt, ist die Clearance 400fach langsamer und die Halbwertzeit 100fach größer beim GDF8-ProFc verglichen mit dem GDF8-Pro. Sowohl das anfängliche Verteilungsvolumen als auch das Verteilungsvolumen im Dauerzustand sind annähernd 3fach größer beim GDF8-Pro verglichen mit dem GDF8-ProFc, was darauf hinweist, dass sich das GDF8-Pro in einem größeren Maße außerhalb des Gefäßraums verteilt verglichen mit dem GDF8-ProFc.
Obwohl der stabilisierende Effekt der Fc-Region eines IgG-Moleküls auf einem GDF-Propeptid beispielhaft dargestellt ist anhand des Maus-GDF-Propeptid-Fc-Fusionsproteins (d. h. beide Komponente von der Maus abgeleitet), können die erfindungsgemäßen Verfahren auf jede Kombination von GDF-Propeptid- und IgG-Komponenten angewendet werden, ungeachtet des besonderen Vorläuferproteins oder der Tierart, von der die Komponenten abgeleitet sind, vorausgesetzt, dass das Fusionsprotein auf geeignete Weise konstruiert wurde, so dass es die Aktivität bewahrt (d. h. wie hier beschrieben ist).
Beispiel 9: Ableitung und Aktivität zweier humaner GDF-8 Propeptid-Fc-Fusionen
Zwei GDF-8 Propeptid-Fc-Fusionskonstrukte wurden unter Anwendung des Standard-PCR-Verfahrens zur Auswertung des therapeutischen Potentials präpariert. Eine cDNA, die das humane GDF-8 Propeptid (SEQ ID Nr. 5) kodiert, wurde mit der humanen IgG1-Fc-Region (SEQ ID Nr. 15, 11A) oder der modifizierten humanen IgG1-Fc zur reduzierten Effektorfunktion (SEQ ID Nr. 16, 11B) fusioniert.
1. Humanes GDF-8 Propeptid-IgG1-Wildtyp-Fc-Fusionsprotein (11A):
Die ersten 264 Aminosäuren des humanen GDF-8 Propeptids (einschließlich der Aminosäuren 1-241 der SEQ ID Nr. 5 und des 23-Aminosäure-Signalpeptids wie in SEQ ID Nr. 13 dargestellt) wurden im Rahmen mit den 232 Aminosäuren der humanen IgG1 konstanten Region fusioniert, beginnend mit der ersten Aminosäure in der Gelenkregion (SEQ ID Nr. 15).
2. Humane GDF-8 Propeptid-IgG1-Mutante (11B):
Die ersten 264 Aminosäuren des humanen GDF-8 Propeptids wurden wie oben beschrieben im Rahmen mit den 227 Aminosäuren einer mutierten humanen IgG1-Fc-Region (SEQ ID Nr. 16) fusioniert. Zwei Mutationen, Alaninreste (Ala-14 und Ala-17) wie in SEQ ID Nr. 16 dargestellt, wurden eingeführt, um die Effektorfunktion zu reduzieren, wie es bei Lund et al., (1991) J. Immun. 147: 2657-2662, und Morgan et al., (1995) Immunology 86: 319-324 beschrieben ist.
Die beiden Fusionsproteine wurden in einen eukaryotischen Expressionsvektor pED (Kaufman et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4485-4490) eingeführt und vorübergehend in COS-1 M6 Zellen exprimiert (Horowitz et al., (1983) Journal of Molecular and Applied Genetics 2: 147-159) unter Verwendung des Lipofectamin 2000 Transfektionsreagens (Gibco BRL, Life Technologies, Rockville, Maryland, USA, Kat. Nr. 11668-019) nach dem Protokoll des Herstellers. Nach 24 Stunden Inkubation wurde R1CD1 (ein modifiziertes DMEM/F12 serumfreies Kulturmedium) zugefügt. Das konditionierte Medium (KM) wurde zusammengefasst, frisches R1CD1 ersetzt und KM 60 Stunden später wieder geerntet. Die konditionierten Medien wurden dann zusammengefasst und über Protein A Sepharose CL-4B (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, HP7 9NA, England, Kat. Nr. 17-07080-01) nach Zugabe von 1/10tel Volumen 1 M Tris pH 8,0 gereinigt. Das gereinigte Protein wurde in 0,1 M Essigsäure, 150 mM NaCl eluiert und sofort mit 1/20tel Volumen 3 M Tris pH 9,0 neutralisiert. Die Proteine wurden unter Anwendung eines humanen IgG-ELISA-Standardprotokolls quantifiziert und im ActRIIB Bindungsassay zusammen mit einem gereinigten humanen GDF-8 Propeptid wie in Beispiel 5 beschrieben getestet. Die Resultate sind in 12 dargestellt. Schlussfolgernd wird festgestellt, dass beide humane Propeptid-Fc-Fusionsproteine potente Inhibitoren der GDF-8 Bindung an ActRIIB sind.
Beispiel 10: In Vivo Testen des GDF-8 Propeptid-Fc-Fusionsproteins
Das Maus-GDF-8 Propeptid-Fc-Fusionsprotein (des Beispiels 9) wurde an erwachsenen Mäusen getestet. Sieben bis neun Wochen alte erwachsene weibliche BALB/c Mäuse wurden im Hinblick auf das Körpergewicht randomisiert und in Gruppen von sieben eingeteilt (mit Ausnahme der unbehandelten Gruppe, in der sich sechs Mäuse befanden). Die Mäuse bekamen zweimal pro Woche eine intraperitoneale Injektion bei einer Gesamtwochendosis von 10 ug, 100 ug, oder 1000 ug pro Tier während fünf Wochen. Die Kontrollinjektionen bestanden aus Maus-IgG2a-Fc in der molaren Äquivalenz zur hohen Dosis des Propeptid-Fc. Am Ende der Studie wurden Gastroknemius, Quadrizeps, ein epididymales Fettpolster, Niere und Leber entfernt und gewogen. 13 zeigt die durchschnittliche Gewebemasse, mit den Fehlerstrichen, die den Standardfehler des Durchschnittswertes angeben. Die Sternchen (*) geben einen statistisch signifikanten Unterschied an (p < 0,01 mittels eines Student-t-Tests) verglichen mit den Mäusen, die mit dem Kontrollprotein IgG2aFc behandelt wurden. Die blockierende GDF-8 Aktivität in vivo durch intraperitoneale Injektion des GDF-8 Propeptid-Fc-Fusionsproteins mit 1 mg/Woche (behandelte Mäuse) führte zu einer Erhöhung von 6,2% in der Muskelmasse des Gastroknemius und 11,3% des Quadrizepses, verglichen mit den Kontrollmäusen, die das GDF-8 Propeptid-Fc-Fusionsprotein nicht erhielten. Außerdem führt die blockierende GDF-8 Aktivität in vivo durch intraperitoneale Injektion des GDF-8 Propeptid-Fc-Fusionsproteins mit 100 ug/Woche (behandelte Mäuse) zu einer Erhöhung von 23,0% der Fettpolstermasse. Die hochdosierte Behandlung (1 mg/Woche) führte auch zu einer Verringerung der Fettpolstermasse, aber dank der Variabilität der Fettpolstermasse war der Unterschied statistisch nicht hochsignifikant (p = 0,047). Es gab keinen Behandlungseffekt auf die anderen getesteten Gewebemassen, einschließlich der Leber und Niere. Zusammenfassend wird festgestellt, dass das modifizierte GDF-8 Propeptid die GDF-8 Aktivität in vivo blockierte und zu einer Vermehrung der Muskelmasse und Verringerung der Fettmasse führte. Zusammengefasst führte die blockierende GDF-8 Aktivität in vivo durch intraperitoneale Injektion des GDF-8 Propeptid-Fc-Fusionsproteins (behandelte Mäuse) zu einer Vermehrung der Gastroknemius- und Quadrizepsmuskelmasse verglichen mit den Kontrollmäusen, die das GDF-8 Propeptid-Fc-Fusionsprotein nicht erhielten.
Äquivalente
Fachleute der Technologie werden, wenn sie auch nur Routinexperimente durchführen, auf viele Äquivalente zu den hier beschriebenen spezifischen Ausführungen dieser Erfindung stoßen oder in der Lage sein, solche festzustellen. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Modifiziertes GDF-8 Propeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die eine Mutation aufweist, die die Aminosäuresequenz an dem Rest modifiziert, der der Position 76 der SEQ ID Nr. 5 entspricht, wobei das modifizierte GDF-8 Propeptid eine erhöhte in vivo oder in vitro Halbwertzeit verglichen mit einem entsprechenden unmodifizierten GDF-8 Propeptid hat.
Das modifizierte GDF-8 Propeptid nach Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz mindestens zu 75% identisch ist mit der SEQ ID Nr. 5 oder einem Fragment davon, das fähig ist, eine GDF-8 Aktivität zu hemmen, wobei dieses Fragment eine Mutation aufweist, die die Aminosäuresequenz an dem der Position 76 der SEQ ID Nr. 5 entsprechenden Rest modifiziert.
Das modifizierte GDF-8 Propeptid nach Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz mindestens zu 75% mit der SEQ ID Nr. 5 identisch ist.
Das modifizierte GDF-8 Propeptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das modifizierte GDF-8 Propeptid die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR. 5 oder ein Fragment davon umfasst, das fähig ist, eine GDF-8 Aktivität zu hemmen, außer, dass die Aminosäuresequenz oder das Fragment eine Mutation an dem der Position 76 der SEQ ID Nr. 5 entsprechenden Rest aufweist.
Das modifizierte GDF-8 Propeptid nach Anspruch 4, wobei das modifizierte GDF-8 Propeptid die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 5 umfasst, außer, dass sie eine Mutation an dem der Position 76 der SEQ ID Nr. 5 entsprechenden Rest aufweist.
Das modifizierte GDF-8 Propeptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Mutation, die die Aminosäuresequenz an dem der Position 76 der SEQ ID Nr. 5 entsprechenden Rest modifiziert, aus einer Substitutions-, Deletions- und Insertionsmutation ausgewählt ist.
Das modifizierte GDF-8 Propeptid nach Anspruch 6, wobei der der Position 76 der SEQ ID Nr. 5 entsprechende Rest Alanin ist.
Das modifizierte Propeptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, wobei eine proteolytische Spaltungsstelle durch die Mutation an dieser Stelle inaktiviert wird.
Das modifizierte Propeptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das modifizierte Propeptid weiter einen Stabilisierungsabschnitt, der mit dem Propeptid fusioniert ist, umfasst.
Das modifizierte Propeptid nach Anspruch 9, wobei der Stabilisierungsabschnitt eine Fc-Region eines IgG Moleküls umfasst.
Das modifizierte Propeptid nach Anspruch 10, wobei das IgG Molekül eine IgG1 oder IgG4 Fc-Region umfasst.
Das modifizierte Propeptid nach Anspruch 10, wobei das IgG Molekül IgG1 oder IgG4 ist.
Das modifizierte Propeptid nach Anspruch 10, wobei die Aminosäuresequenz des IgG Moleküls mindestens zu 75% mit der SEQ ID Nr. 15 identisch ist.
Das modifizierte Propeptid nach Anspruch 10, wobei die Aminosäuresequenz des IgG Moleküls die SEQ ID Nr. 15 ist.
Das modifizierte Propeptid nach Anspruch 10, wobei die Aminosäuresequenz des IgG Moleküls mindestens zu 75% mit der SEQ ID Nr. 16 identisch ist.
Das modifizierte Propeptid nach Anspruch 10, wobei die Aminosäuresequenz des IgG Moleküls die SEQ ID Nr. 16 ist.
Das modifizierte Propeptid nach Anspruch 10, wobei das Propeptid mit der Fc-Region des IgG Moleküls über ein Bindungspeptid fusioniert ist.
Das modifizierte Propeptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das modifizierte Propeptid eine veränderte Glykosylierungsstelle aufweist.
Das modifizierte Propeptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das modifizierte Propeptid mindestens einen Kohlehydratanteil umfasst.
Das modifizierte Propeptid nach Anspruch 9, wobei der Stabilisierungsabschnitt Albumin oder ein Derivat des Albumins umfasst.
Das modifizierte Propeptid nach Anspruch 9, wobei der Stabilisierungsabschnitt ein nicht-eiweißartiges Polymer umfasst.
Das modifizierte Propeptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das modifizierte Propeptid weiter einen Reinigungs-Tag umfasst.
Nukleinsäuremolekül, das das modifizierte GDF-8 Propeptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 22 kodiert.
Das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 23, das mindestens 20 aneinander hängende Nukleotide wie in der SEQ ID Nr. 2 dargestellt umfasst.
Das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 23, das mindestens 20 aneinander hängende Nukleotide wie in der SEQ ID Nr. 6 dargestellt umfasst.
Das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 24, das mindestens 50 aneinander hängende Nukleotide wie in der SEQ ID Nr. 2 dargestellt umfasst.
Das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 24, das mindestens 50 aneinander hängende Nukleotide wie in der SEQ ID Nr. 6 dargestellt umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die das modifizierte Propeptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 22 und einen pharmazeutisch annehmbaren Arzneistoffträger umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die das Nukleinsäuremolekül nach irgendeinem der Ansprüche 23 bis 27 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Vektor umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines modifizierten GDF-8 Propeptids nach Anspruch 1, das folgende Schritte umfasst: (a) Zubereitung eines cDNA Moleküls, das das modifizierte GDF-8 Propeptid nach Anspruch 1 kodiert, wobei die proteolytische Spaltungsstelle modifiziert ist; (b) Zubereitung eines cDNA Moleküls, das die Fc-Region eines IgG Moleküls kodiert; und (c) Fusion des cDNA Moleküls der Schritte (a) und (b), um ein modifiziertes GDF-8 Propeptid zu produzieren.
Verfahren nach Anspruch 30, das ferner das Herstellen eines doppelsträngigen Oligonukleotids umfasst, das ein Bindungspeptid kodiert, und Fusionieren der cDNA Moleküle der Schritte (a) und (b) mit einem der Enden des das Bindungspeptid kodierenden doppelsträngigen Oligonukleotids.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei das Bindungspeptid die aus GSGS bestehende Aminosäuresequenz umfasst.
Eine isolierte rekombinante Zelle, die eine Nukleinsäure umfasst, die ein modifiziertes GDF-8 Propeptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 22 kodiert.
Die isolierte rekombinante Zelle nach Anspruch 33, wobei die Nukleinsäure eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die einen Stabilisierungsabschnitt kodiert.
Ein modifiziertes Propeptid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 22 zur Verwendung als Medikament.
Verwendung eines modifizierten Propeptids nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 22 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Zustands oder mehrerer Zustände, die aus muskulären Störungen, neuromuskulären Störungen, Stoffwechselstörungen und Knochendegenerationsstörungen ausgewählt sind.
Verwendung eines modifizierten Propeptids nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 22 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Zustands oder mehrerer Zustände, die aus amyotropher Lateralsklerose, muskulärer Dystrophie, muskulärer Atrophie, congestiver obstruktiver Lungenkrankheit, Muskelszerfallssyndrom, Sarkopenie und Kachexie ausgewählt sind.
Verwendung eines modifizierten Propeptids nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 22 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der Osteoporose.
Verwendung eines modifizierten Propeptids nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 22 bei der Herstellung eines Medikaments zur Vermehrung der Muskelmasse.