PT1397492E - Pró-péptidos gdf modificados e estabilizados e as suas utilizações - Google Patents

Description

ΡΕ1397492 1 DESCRIÇÃO "PRÓ-PÉPTIDOS GDF MODIFICADOS E ESTABILIZADOS E SUAS UTILIZAÇÕES"

Campo da Invenção

Esta invenção refere-se a inibidores das proteínas do Factor de Diferenciação e Crescimento-8 (GDF-8) e métodos para a sua utilização. Mais particularmente, a invenção proporciona pró-péptidos modificados e estabilizados das proteínas GDF-8 que inibem a actividade de GDF-8. A invenção é particularmente útil para tratar ou prevenir distúrbios em humanos ou animais em que um aumento no tecido do músculo esquelético seria terapeuticamente benéfico. Estes distúrbios incluem distúrbios musculares ou neuromusculares (tais como esclerose lateral amiotrópica, distrofia muscular, atrofia muscular, doença pulmonar obstrutiva congestiva, síndrome do gasto muscular, sarco-penia, ou caquexia), doenças ou distúrbios metabólicos (tais como diabetes de tipo 2, diabetes mellitus não dependente da insulina, hiperglicémia, ou obesidade), distúrbios do tecido adiposo (tais como obesidade), ou doenças degenerativas dos ossos (tais como osteoporose).

Antecedentes da Invenção 0 Factor de Diferenciação e Crescimento-8 (GDF- 2 ΡΕ1397492 8), também conhecido como miostatina, é um membro da superfamília do Factor-beta de Transformação do Crescimento (TGF-β) de factores de crescimento estruturalmente relacionados, todos os quais possuem propriedades importantes de regulação do crescimento e morfogenéticas (Kingsley et al. (1994) Genes Dev. 8:133-46; Hoodless et al. (1998) Curr.

Topics Microbiol. Immunol. 228:235-72) . GDF-8 é um regulador negativo da massa do músculo esquelético, e existe um interesse considerável na identificação de factores que regulam a sua actividade biológica. Por exemplo, a GDF-8 é altamente expressa no músculo esquelético adulto e em desenvolvimento. A mutação nula de GDF-8 em ratinhos transgénicos é caracterizada por uma hipertrofia e hiperplasia marcada do músculo esquelético (McPherron et al. (1997) Nature 387:83-90). Aumentos semelhantes na massa do músculo esquelético são evidentes em mutações de GDF-8 de ocorrência natural em gado (Ashmore et al. (1974) Growth 38:501-507; Swatland e Kieffer (1994) J. Anim. Sei. 38:752-757; McPherron e Lee (1997) Proc. Natl. Acad Sei. U.S.A. 94:12457-12461; e Kambadur et al. (1997) Genome Res. 7:910-915). Estudos recentes também demonstraram que o gasto muscular associado a infecção de HIV em humanos é acompanhado por aumentos na expressão da proteina GDF-8 (Gonzalez-Cadavid et al. (1998) PNAS 95:14938-43). Adicionalmente, a GDF-8 pode modular a produção de enzimas especificas do músculo (e.g., cinase de creatina) e modular a proliferação de células do mioblasto (WO 00/43781). 3 ΡΕ1397492

Adicionalmente às suas propriedades de regulação do crescimento e morfogenéticas no músculo esquelético, a GDF-8 também pode estar envolvida em vários outros processos fisiológicos (e.g., homeostasia da glucose), assim como estados anormais, tais como no desenvolvimento de diabetes de tipo 2 e distúrbios do tecido adiposo, tais como obesidade. Por exemplo, a GDF-8 modula a diferenciação de pré-adipócitos em adipócitos (Kim et al. (2001) B.B.R.C. 281:902-906).

Tal como TGF-β-Ι, -2, e -3, a proteína GDF-8 é sintetizada como uma proteína precursora consistindo num pró-péptido aminoterminal e um domínio carboxi-terminal maduro (McPherron e Lee, 1997, supra) assim como uma sequência sinal que dirige a proteína para o seu domínio extracelular e é também clivada da proteína. Crê-se que antes da clivagem do pró-péptido, a proteína precursora de GDF-8 forma um homodímero. O pró-péptido amino-terminal é então clivado do domínio maduro e o pró-péptido clivado pode permanecer ligado de forma não covalente ao dímero do domínio maduro, inibindo a sua actividade biológica (Miyazono et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:6407-6415; Wakefield et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:7646-7654; e Brown et al. (1990) Growth Factors 3:35-43). Crê-se que dois pró-péptidos de GDF-8 se ligam ao dímero maduro de GDF-8 (Thies et al. (2001) Growth Factors 18:251-259). Devido a esta propriedade inactivante, o pró-péptido é conhecido como o "péptido associado à latência" (LAP), e o complexo do domínio maduro e pró-péptido é normalmente 4 ΡΕ1397492 referido como o "complexo latente pequeno" (Gentry e Nash (1990) Biochemistry 29:6851-6857; Derynck et al. (1995) Nature 316:701-705; e Massague (1990) Ann. Rev. Cell Biol. 12:597-641). Crê-se que o domínio maduro seja activo como o homodímero quando o pró-péptido é removido. São também conhecidas outras proteínas que se ligam a GDF-8 ou a proteínas estruturalmente relacionadas e inibem a sua actividade biológica. Essas proteínas inibidoras incluem folistatina (Gamer et al. (1999) Dev. Biol. 208:222-232) e proteínas relacionadas com a folistatina.

Além disso, vários distúrbios humanos e animais estão associados à perda de, ou diminuição funcional, do tecido muscular, incluindo distrofia muscular, atrofia muscular, doença pulmonar obstrutiva congestiva, síndrome do gasto muscular, sarcopenia, e caquexia. Até à data, existem muito poucas terapêuticas fiáveis ou eficazes para estes distúrbios. Os sintomas terríveis associados a estes distúrbios podem ser substancialmente reduzidos empregando terapêuticas que aumentam a quantidade de tecido muscular em doentes que padecem dos distúrbios. Essas terapêuticas iriam melhorar significativamente a qualidade de vida para estes doentes e poderia melhorar muitos efeitos dessas doenças. Assim, existe uma necessidade na técnica para identificar novas terapêuticas que contribuam para um aumento global do tecido muscular em doentes que padecem desses distúrbios. A presente invenção preenche esta necessidade 5 ΡΕ1397492 proporcionando pró-péptidos de GDF modificados e estabilizados que retêm a sua actividade biológica e inibem a actividade de proteínas GDF. Os pró-péptidos modificados da invenção podem ser utilizados para tratar distúrbios em humanos ou animais em que um aumento no tecido muscular seria terapeuticamente benéfico.

Sumário da Invenção A GDF-8 está envolvida na regulação de muitos processos biológicos críticos. Devido à sua função chave nestes processos, GDF-8 pode ser um alvo desejável para intervenção terapêutica. Embora o pró-péptido de GDF-8 que ocorre naturalmente possa ser um meio atractivo de modulação de GDF de uma perspectiva de eficácia e toxicidade, os presentes inventores descobriram que a meia vida em circulação do pró-péptido natural pode ser demasiado curta para a molécula possuir utilidade prática terapêutica ou profilática.

Consequentemente, a presente invenção baseia-se, pelo menos em parte, na descoberta de que o pró-péptido do Factor-8 de Diferenciação e Crescimento (GDF-8) inibe a actividade da proteína GDF-8, e que outras proteínas do Factor-beta de Transformação do Crescimento (TGF-β) que estão relacionadas na estrutura com GDF-8, tais como Proteína-11 Morfogenética do Osso (BMP-11; também conhecida como GDF-11), também são inibidas pelo pró-péptido de GDF-8. A presente invenção proporciona assim composições e 6 ΡΕ1397492 métodos para inibir proteínas GDF, assim como métodos para identificar, mascarar e utilizar esses inibidores.

Como referido acima, a presente invenção é também baseada, em parte, na descoberta de que o pró-péptido de GDF-8 natural possui uma meia vida in vivo relativamente curta, que pode prevenir a utilidade prática terapêutica ou profilática. Deste modo, a presente invenção proporciona pró-péptidos de GDF-8 modificados possuindo propriedades farmacocinéticas melhoradas, tais como aumento da meia vida em circulação ou aumento da protecção da deqradação proteolítica.

Os pró-péptidos de GDF-8 presentemente revelados podem ser estabilizados através de quaisquer meios conhecidos na técnica. Por exemplo, numa forma de realização, o pró-péptido modificado é uma proteína de fusão compreendendo um pró- -péptido de GDF -8 e a região Fc de uma molécula IgG. As proteínas de fusão pró-péptido de GDF-8 podem compreender, como a subunidade activa, o pró-péptido de uma proteína GDF-8, ou uma porção activa do pró-péptido de GDF-8, fundido com uma região Fc de uma molécula IgG. Noutras formas de realização, ou adicionalmente, o pró-péptido de GDF-8 pode ser glicosilado, ou ligado a albumina ou um polímero não proteico.

Os pró-péptidos de GDF-8 modificados da invenção são capazes de inibir a actividade, expressão, processamento, ou secreção de uma proteína GDF-8, GDF-8 madura, ou 7 ΡΕ1397492 um homodímero de GDF-8 ou outra molécula de GDF-8 activa. Os pró-péptidos de GDF-8 modificados da invenção podem ser administrados a um doente, numa dose terapeuticamente eficaz, para tratar ou prevenir estados médicos em que um aumento no tecido muscular seria terapeuticamente benéfico. Doenças e distúrbios que podem ser tratados pelos pró-péptidos de GDF-8 modificados incluem, mas não estão limitados a, distúrbios musculares ou neuromusculares (tais como esclerose lateral amiotrópica, distrofia muscular, atrofia muscular, doença pulmonar obstrutiva congestiva, sindrome do gasto muscular, sarcopenia, ou caquexia), doenças ou distúrbios metabólicos (tais como diabetes de tipo 2, diabetes mellitus não dependente da insulina, hiperglicémia, ou obesidade), distúrbios do tecido adiposo (tais como obesidade), e doenças degenerativas dos ossos (tais como osteoporose).

Breve Descrição das Figuras A Figura 1 apresenta as actividades biológicas relativas de GDF-8, BMP-11 e activina num ensaio de gene repórter. A Figura 2 apresenta as propriedades de ligação de GDF-8 humana purificada biotinilada num ensaio de ligação a ActRIIB. A Figura 3 apresenta indução de actividade repórter de pGL3(CAGA)i2 à ED50 para GDF-8, BMP-11, e activina na presença de pró-péptido de GDF-8. ΡΕ1397492 A Figura 4 apresenta a inibição dependente da dose de ligação de GDF-8 biotinilada a ActRIIB pelo pró-péptido de GDF-8. A Figura 5 apresenta a ligação de GDF-8 a células L6. A Figura 6 apresenta a inibição dependente da dose de ligação especifica de GDF-8 a células L6 pelo pró-péptido de GDF-8. A Figura 7A apresenta a sequência de aminoácidos de uma pró-péptido de GDF-8 de murideo-Fc. A Figura 7B apresenta uma proteína de fusão de pró-péptido de GDF-8 de murídeo-Fc com um ligando curto glicina-serina-glicina-serina (GSGS) separando o pró-péptido de GDF-8 da região Fc. A Figura 8A apresenta os efeitos do pró-péptido de GDF-8 humano e duas proteínas de fusão de pró-péptido de GDF-8 de murídeo-Fc na ligação de GDF-8 num ensaio de competição com ActRIIB por ELISA. A Figura 8B é uma tabela comparando as IC5o de pró-péptido de GDF-8 humano e duas proteínas de fusão pró-péptido de GDF-8 de murídeo-Fc. 9 ΡΕ1397492 A Figura 9 apresenta as actividades biológicas relativas de pró-péptido de GDF-8 humano e proteína de fusão pró-péptido de GDF-8 de murídeo-Fc num ensaio de gene repórter. A Figura 10 apresenta a farmacocinética de pró-péptido de GDF-8 iodinado e uma proteína de fusão pró-péptido de GDF-8-Fc após uma única administração intravenosa de 0,2 pg/ratinho ou 2 pg/ratinho, respectivamente. A Figura 11A apresenta a sequência de aminoácidos de uma proteína de fusão pró-péptido de GDF-8 humano-IgGl Fc. A Figura 11B apresenta a sequência de aminoácidos de uma proteína de fusão pró-péptido de GDF-8 humano-IgGl Fc modificada para a função efectora reduzida. A Figura 12 apresenta a inibição dependente da dose de ligação de GDF-8 numa competição com ActRIIB por ELISA pelo pró-péptido de GDF-8 humano e duas proteínas de fusão pró-péptido de GDF-8 humano-Fc. A Figura 13 é um gráfico demonstrando que o pró-péptido de GDF-8 modificado administrado in vivo aumenta a massa do gastrocnemius e quadrícipes, e diminui a massa gorda, mas não afecta a massa do rim ou do fígado em comparação com ratinhos não tratados ou ratinhos tratados com a proteína de controlo, IgG2aFc. 10 ΡΕ1397492

As Figuras 14A-P ilustram as sequências de aminoácidos e de ácido nucleico correspondendo a SEQ ID NoS 1-16 e anotações destes.

Definições

Os termos "GDF-8", "proteína GDF-8", ou "poli-péptido GDF-8" refere-se a um factor de crescimento e diferenciação específico incluindo, mas não limitado aquele apresentado em SEQ ID N°:l, e quaisquer homólogos destes agora conhecidos ou mais tarde descritos, incluindo homólogos de outras espécies. São particularmente preferidos homólogos de mamíferos, muito preferencialmente de humanos. A presente invenção também compreende moléculas de GDF-8 e homólogos de todas as outras frontes, incluindo, mas não limitados a GDF-8 de bovino, cão, gato, galinha, murídeo, rato, porco, ovino, peru, babuíno, e peixe. Foram descritas várias moléculas de GDF-8 em McPherron et ai. (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:12457-12461. Os homólogos são bem conhecidos na técnica. A homologia pode ser determinada por quaisquer métodos conhecidos na técnica, ou como aqui descrito. A GDF-8 ou proteína de GDF-8 pode ocorrer naturalmente ou ser sintética. Estes termos incluem a forma de precursor de comprimento total não processada de uma proteína ("proteína do precursor de GDF-8"), assim como as formas maduras que resultam da clivagem pós-tradução do pró-péptido. Os termos também se referem a quaisquer fragmentos ou variantes de GDF-8 que mantêm uma 11 ΡΕ1397492 ou mais actividades biológicas associadas a uma proteína GDF-8, como aqui discutido, incluindo sequências que foram modificadas com alterações conservadoras e não conservadoras à sequência de aminoácidos. "GDF-8 madura" refere-se a uma proteína ou polipéptido que é clivado do domínio carboxi-terminal da Proteína precursora de GDF-8. É proporcionada uma forma humana da proteína GDF-8 madura na SEQ ID N°:3. A GDF-8 madura pode ocorrer naturalmente ou ser sintética. A GDF-8 madura pode estar presente como um monómero, homodímero, ou pode estar presente num complexo de GDF-8 latente. Dependendo das condições in vivo ou in vitro, a GDF-8 madura pode estabelecer um equilíbrio entre qualquer uma ou todas estas formas diferentes. Sem limitação ao mecanismo, crê-se que a GDF-8 madura seja biologicamente activa como homodímero. Na sua forma biologicamente activa, a GDF-8 madura é também referida como "GDF-8 activa". A frase "actividade de GDF-8" refere-se a uma ou mais actividades de regulação de crescimento fisiológico ou morfogenéticas associadas com proteína de GDF-8 activa. Por exemplo, a GDF-8 activa é um regulador negativo de massa de músculo esquelético. A GDF-8 activa pode também modular a produção de enzimas específicas do músculo (e.g., cinase de creatina), estimular a proliferação de células do mioblasto, e modular a diferenciação de pré-adipócitos em adipócitos. Também se crê que a GDF-8 aumente a sensibilidade à incorporação da insulina e glucose nos tecidos 12 ΡΕ1397492 periféricos, particularmente no músculo esquelético ou adipócitos. Consequentemente, as actividades biológicas de GDF-8 incluem, mas não estão limitadas a, inibição de formação muscular, inibição do crescimento de células musculares, inibição de desenvolvimento muscular, diminuição na massa muscular, regulação de enzimas especificas do músculo, inibição da proliferação de células do mioblasto, modulação da diferenciação de pré-adipócitos em adipócitos, aumentando a sensibilidade à insulina, regulações da incorporação de glucose, hemostasia da glucose, e modula o desenvolvimento e manutenção neuronal celular. É proporcionada uma forma humana da proteína precursora de GDF-8 de comprimento total na SEQ ID N°:l. "Pró-péptido de GDF-8" refere-se a um polipéptido que é clivado do domínio amino-terminal da proteína precursora de GDF-8. 0 pró-péptido de GDF-8 é associado a uma ou mais actividades biológicas incluindo, mas não limitadas à capacidade para se ligar a uma proteína GDF-8 madura ou homodímero, a capacidade para inibir uma ou mais actividades biológicas de GDF-8, a capacidade para aumentar o desenvolvimento muscular, a capacidade para aumentar a massa muscular, a capacidade para promover a formação muscular, e a capacidade para promover a proliferação de células musculares. 0 pró-péptido de GDF-8 pode ocorrer naturalmente ou ser sintético. Um exemplo de um pró-péptido de GDF-8 inclui, mas não está limitado à forma humana do pró-péptido de GDF-8 proporcionado na SEQ ID N°:5. Numa forma de realização, o pró-péptido de GDF-8 é capaz de se 13 ΡΕ1397492 ligar ao domínio de ligação ao pró-péptido de GDF- 8 madura. Noutra forma de realização, o pró-péptido de GDF-8 é capaz de inibir uma ou mais actividades de uma GDF-8 madura. 0 termo "inibidor de GDF-8" inclui qualquer agente capaz de inibir a actividade, expressão, processamento, ou secreção de uma proteína GDF-8, GDF-8 madura, ou um homodímero de GDF-8 ou outra molécula de GDF-8 activa incluindo, mas não limitada a pró-péptidos de GDF-8 modificada e pró-péptidos de BMP-11 modificada. Um inibidor de GDF-8 também inclui qualquer agente capaz de aumentar a ligação de um pró-péptido de GDF-8 a uma molécula de GDF-8 madura, ou a um homodímero de GDF-8. Esses inibidores incluem mas não estão limitados a proteínas, anticorpos, péptidos, peptidomiméticos, ribozimas, oligonucleótidos anti-sentido, ARN de cadeia dupla, e outras moléculas pequenas. Numa forma de realização, a actividade de uma proteína GDF-8 é inibida por um pró-péptido de GDF-8 modificado como descrito nos Exemplos 3-6. Noutra forma de realização, a actividade de uma proteína de GDF-8 é inibida por um pró-péptido de BMP-11 modificada. "Complexo de GDF-8 latente" refere-se a um complexo de proteínas formado entre um homodímero de GDF-8 madura e um pró-péptido de GDF-8. Sem limitação em relação ao mecanismo, crê-se que dois pró-péptidos de GDF-8 se associam com duas moléculas de GDF-8 madura no homodímero para formar um complexo inactivo tetramérico ou latente. 0 14 ΡΕ1397492 complexo latente pode incluir ouros inibidores de GDF em vez de, ou adicionalmente a, um ou mais dos pró-péptidos de GDF-8. 0 termo "pró-péptido de GDF-8 modificado" refere-se a um inibidor de GDF-8 que compreende um pró-péptido de GDF-8 modificado, fragmento ou variante deste que retém uma ou mais actividades biológicas de um pró-péptido de GDF-8 e compreende ainda uma modificação estabilizadora como aqui apresentada adiante. As formas variantes de pró-péptido de GDF-8, incluem, mas não estão limitadas a, por exemplo, pró-péptidos de GDF-8 que foram modificadas para incluir mutações (incluindo inserção, deleção, e substituição de aminoácidos) nos sitios de clivagem proteolitica de péptido sinal ou pró-péptido para tornar os sítios menos suscep-tíveis à clivagem proteolitica. Numa forma de realização preferida, o pró-péptido de GDF-8 modificado possui uma meia vida substancialmente aumentada em relação à do pró-péptido de GDF-8 não modificado correspondente. Numa forma de realização altamente preferida, o pró-péptido de GDF-8 modificada da invenção possui uma meia vida aumentada in vivo (como medida, por exemplo, através do método apresentado adiante no Exemplo 8). Noutra forma de realização, o pró-péptido de GDF-8 modificada é capaz de inibir uma ou mais actividades de uma GDF-8 madura.

Os termos "BMP-11", "proteína BMP-11", ou "poli-péptido BMP-11" referem-se a um factor de crescimento e diferenciação específico incluindo mas não limitado ao 15 ΡΕ1397492 apresentado adiante na SEQ ID N°:7, e quaisquer seus homólogos agora conhecidos ou descritos mais tarde, incluindo homólogos de outras espécies. São particularmente preferidos homólogos de mamíferos, mais preferencialmente de humano. Várias moléculas de BMP-11 foram descritas em McPherron et al. (1997) Proc. Natl. Acad Sei. USA 94:12457-12461. Homólogos são bem conhecidos na técnica. A homologia pode ser determinada por qualquer método conhecido na técnica, ou como aqui descrito. BMP-11 ou proteína BMP-11 pode ocorrer naturalmente ou ser sintética. Estes termos incluem a forma precursora de comprimento total não processada de uma proteína ("proteína precursora de BMP-11"), assim como as formas maduras resultantes da clivagem de pós-tradução do pró-péptido. Os termos também se referem a quaisquer fragmentos ou variantes de BMP-11 que mantêm uma ou mais actividades biológicas associadas com uma proteína BMP-11, como aqui discutido, incluindo sequências que foram modificadas com alterações conservadoras ou não conservadoras para a sequência de aminoácidos. "BMP-11 madura" refere-se a um proteína ou polipéptido que é clivado a partir do domínio carboxi-terminal da proteína precursora de BMP-11. Uma forma humana de proteína BMP-11 madura é proporcionada na SEQ ID N°:9. A BMP-11 madura pode ocorrer naturalmente ou ser sintética. A BMP-11 madura pode estar presente como um monómero, homodímero, ou pode estar presente num complexo de BMP-11 latente. Dependendo das condições in vivo ou in vitro, a BMP-11 madura pode estabelecer um equilíbrio entre quais- 16 ΡΕ1397492 quer ou todas essas formas diferentes. Sem limitação em relação ao mecanismo, crê-se que a BMP-11 madura é biologicamente activa como homodimero. Na sua forma biologicamente activa, a BMP-11 madura é também referida como "BMP-11 activa." "Pró-péptido de BMP-11" refere-se a um poli-péptido que é clivado do domínio amino-terminal da proteína precursora de BMP-11. 0 pró-péptido de BMP-11 está associado com uma ou mais actividades biológicas incluindo, mas não limitadas a, capacidade para se ligar a uma proteína GDF-8 madura ou homodimero, a capacidade para inibir uma ou mais actividades biológicas de GDF-8, a capacidade para aumentar o desenvolvimento muscular, a capacidade para aumentar a massa muscular, a capacidade para promover a formação muscular, e a capacidade para promover a proliferação das células musculares. 0 pró-péptido de BMP-11 pode ocorrer naturalmente ou ser sintético. Um exemplo de um pró-péptido de BMP-11 inclui, mas não está limitado a uma forma humana de BMP-11 apresentada na SEQ ID N°: 11. 0 termo "pró-péptido de BMP-11 modificado" refere-se a um inibidor de GDF-8 que compreende um pró-péptido de BMP-11 modificado, ou fragmento ou variante deste, que retém uma ou mais actividades biológicas de um pró-péptido de BMP-11 e compreende ainda uma modificação estabilizadora como aqui apresentado adiante. Formas variantes de pró-péptido de BMP-11, incluem, mas não estão 17 ΡΕ1397492 limitadas a, por exemplo, pró-péptidos de BMP-11 que foram modificados para incluir mutações (incluindo inserção, deleção, e substituição de aminoácidos) nos sitios de clivagem proteolitica do péptido sinal ou pró-péptido para tornar os sítios mais ou menos sensíveis à clivagem proteolitica.

Os pró-péptidos de GDF-8 da invenção são referidos colectivamente como "pró-péptidos de GDF."

As proteínas de GDF-8 da invenção são referidas colectivamente como "polipéptidos de GDF" ou "proteínas GDF" .

Os métodos e composições da invenção proporcionam inibidores de GDF que reduzem a actividade de proteína de GDF relativa à actividade de uma proteína GDF em comparação com a mesma proteína de GDF não ligada por um inibidor. Em certas formas de realização, a actividade de uma proteína GDF, quando ligada por um ou mais dos pró-péptidos de GDF modificados é reduzida em pelo menos cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, ou 55%, preferen- cialmente pelo menos cerca de 60% , 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, ou 88%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, ou 94%, e ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 95% a 100% em relação à mesma proteína de GDF que não está ligada pelos referidos pró-péptidos modificados. Numa forma de realização preferida, o inibidor de GDF é um pró-péptido 18 ΡΕ1397492 de GDF-8 modificado ligado covalentemente a uma região Fc de uma molécula IgG. 0 termo "modificação estabilizadora" é qualquer modificação conhecida na técnica ou aqui apresentada adiante capaz de estabilizar uma proteína, aumentando a meia vida in vitro de uma proteína, aumentando a meia vida em circulação de uma proteína e/ou reduzindo a degradação proteolítica de uma proteína. Essas modificações estabilizadoras incluem, mas não estão limitados a, proteínas de fusão (incluindo, por exemplo, proteínas de fusão compreendendo um pró-péptido de GDF e uma segunda proteína), modificação de um sítio de glicosilação (incluindo, por exemplo, adição de um sítio de glicosilação a um pró-péptido de GDF), e modificação de unidade de hidrato de carbono (incluindo, por exemplo, remoção de unidades de hidrato de carbono de um pró-péptido de GDF) . No caso de uma modificação estabilizadora que compreende uma proteína de fusão (e.g., de modo a que a segunda proteína seja fundida a um pró-péptido de GDF), a segunda proteína pode ser referida como uma "porção estabilizadora" ou "proteína estabilizadora". Por exemplo, numa forma de realização, um pró-péptido de GDF-8 modificado da invenção compreende uma fusão entre um pró-péptido humano de GDF-8 (com um sítio de clivagem inactivado) e uma molécula de IgG (cujo IgG actua como a proteína estabilizadora ou porção estabilizadora). Como aqui utilizado, adicionalmente em referência a uma segunda proteína da proteína de fusão, uma "porção estabilizadora" também inclui modificações não proteicas, 19 ΡΕ1397492 tais como uma unidade de hidrato de carbono, ou polímero não proteico.

Os termos "isolada" ou "purificada" referem-se a uma molécula que é substancialmente isenta do seu ambiente natural. Por exemplo, uma proteína isolada é substancialmente isenta de material celular ou outras proteínas contaminantes da fonte de células ou tecido do qual deriva. A frase "substancialmente isenta de material celular" refere-se a preparações em que a proteína isolada é pelo menos 70% a 80% (p/p) pura, mais preferencialmente pelo menos 80-89% (p/p) pura, ainda mais preferencialmente 90-95% pura, e muito preferencialmente pelo menos 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% (p/p) pura. O termo "sítio de clivagem" refere-se a um sítio proteolítico numa proteína ou polipéptido que é processada por uma enzima proteolítica, resultando na clivagem da ligação peptídica. Numa forma de realização, um sítio de clivagem da invenção é "RSRR" como representado pelo código de aminoácidos de uma letra. O termo "região Fc de uma molécula de IgG" refere-se ao domínio Fc de uma imunoglobulina do isotipo

IgG, como é conhecida dos especialistas na técnica. A região Fc de uma molécula de IgG é aquela porção de molécula de IgG (IgGl, IgG2, IgG3, e IgG4) que é responsável por aumentar a meia vida in vivo no soro da molécula de IgG. Preferencialmente, a molécula de IgG é IgGl. 20 ΡΕ1397492 "Meia vida in vitro" refere-se à estabilidade de uma proteína medida fora do contexto de um organismo vivo. Ensaios para medir a meia vida in vitro são bem conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados a, SDS-PAGE, ELISA, ensaios à base de células, pesquisa por pulso, transferência de western, transferência de northern, etc. Estes e outros ensaios úteis são bem conhecidos na técnica. "Meia vida in vivo" refere-se à estabilidade de uma proteína num organismo. A meia vida in vivo pode ser medida por um número de métodos conhecidos na técnica incluindo, mas não limitado a, meia vida in vivo no soro, a meia vida em circulação, e ensaios aqui apresentados nos exemplos adiante. "Meia vida no soro in vivo" refere-se à meia vida de uma proteína em circulação no sangue de um organismo. Numa forma de realização, a meia vida in vivo é medida como apresentado adiante no Exemplo 8. Podem ser utilizados outros métodos conhecidos na técnica para medir a meia vida in vivo. O termo "mamífero" inclui definições conhecidas na técnica e também se refere a qualquer animal classificado como um mamífero, incluindo humanos, animais domésticos e de quinta, e animais de zoo, desportos, ou de companhia, tais como cães, gatos, ovelhas, porcos, vacas, etc. Numa forma de realização preferida, o mamífero é humano. 21 ΡΕ1397492 0 termo "superfamília de TGF-β" refere-se a uma família de factores de crescimento estruturalmente relacionados, possuindo todos eles propriedades fisiologi-camente importantes de regulação do crescimento e morfo-genéticas. Esta família de factores de crescimento relacionados é bem conhecida na técnica (Kingsley et al. (1994) Genes Dev. 8:133-46; e Hoodless et al. (1998) Curr.

Topics Microbiol. Immunol. 228:235-72). A superfamília de TGF-β inclui Proteínas Morfogenéticas do Osso (BMPs), Activinas, Inibinas, Substância de Inibição da Mulleriana, Factor Neurotrófico derivado da Glia, e um número ainda crescente de Factores de crescimento e diferenciação (GDFs), tais como GDF-8 (miostatina). Muitas destas proteínas são relacionadas em estrutura com GDF-8, tais como BMP-11 (também conhecido como GDF-11), e/ou actividade, tais como activina. 0 termo "tratamento" refere-se tanto ao tratamento terapêutico como a medidas profiláticas ou preventivas. Aqueles em necessidade de tratamento podem incluir indivíduos já possuindo um distúrbio médico particular, assim como aqueles que podem, em último caso, adquirir o distúrbio (i.e., aqueles em necessidade de medidas preventivas) .

Os termos "transformação" e "transfecção" referem-se a uma variedade de técnicas reconhecidas na técnica para introduzir ácido nucleico estranho (e.g., DNA e RNA) numa célula hospedeira, incluindo, mas não limitados 22 ΡΕ1397492 a co-precipitação com fosfato de cálcio ou cloreto de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano, lipofecção, e electroporação.

SEQ ID NO: NOME TIPO 1 proteína precursora de GDF-8 humana proteína 2 proteína precursora de GDF-8 humana DNA 3 GDF-8 humana madura proteína 4 GDF-8 humana madura DNA 5 pró-péptido de GDF-8 humana proteína 6 pró-péptido de GDF-8 humana DNA 7 proteína precursora de BMP-11 humana proteína 8 proteína precursora de BMP-11 humana DNA 9 BMP-11 humana madura proteína 10 BMP-11 humana madura DNA 11 pró-péptido de BMP-11 humana proteína 12 pró-péptido de BMP-11 humana DNA 13 sequência sinal de GDF-8 proteína 14 sequência sinal de BMP-11 DNA 15 IgG-Fc proteína 16 IgG-Fc modificada DNA

Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção baseia-se, em parte, na descoberta de que pró-péptidos de GDF possuem uma meia vida in vivo curta, reduzindo desse modo a sua eficiência como inibidores farmacológicos de GDF-8 ou actividade de BMP-11. Consequentemente, num aspecto, a invenção apresenta pró-péptido de GDF-8 modificado e estabilizado possuindo propriedades farmacocinéticas melhoradas, especificamente um aumento da meia vida em circulação. 23 ΡΕ1397492 A presente invenção proporciona novos pró-péptidos de GDF modificados que formam complexos inactivos com proteínas GDF (por exemplo proteínas GDF-8 e BMP-11) ín vitro e in vivo. Os pró-péptidos de GDF modificados da invenção ligam-se preferencialmente a um domínio de ligação do pró-péptido na proteína GDF madura. Consequentemente, em certas formas de realização da invenção, o pró-péptido de GDF modificado compreende uma proteína de fusão entre um pró-péptido de GDF e uma proteína estabilizadora. Uma proteína estabilizadora pode ser qualquer proteína que aumente a estabilidade global do pró-péptido de GDF modificado. Como será reconhecido por um especialista na técnica, essa proteína de fusão pode compreender opcionalmente um péptido ligante entre a porção pró-péptido e a porção estabilizadora. Como é bem conhecido na técnica, as proteínas de fusão são preparadas de modo a que a segunda proteína é fundida em grelha com a primeira proteína, de modo a que a proteína traduzida resultante compreenda ambas a primeira e a segunda proteínas. Por exemplo, na presente invenção, a proteína de fusão pode ser preparada de modo a que a porção de pró-péptido de GDF é fundida com uma segunda proteína (e.g. um porção de proteína estabilizadora.) Essa proteína de fusão é preparada de modo a que a proteína traduzida resultante contenha tanto a porção de pró-péptido como a porção estabilizadora.

Noutras formas de realização, o pró-péptido de GDF compreende um pró-péptido de GDF que é modificado para 24 ΡΕ1397492 possuir maior meia vida em circulação in vivo em comparação com pró-péptido de GDF não modificado. Embora o mecanismo preciso e momento da ligação do pró-péptido de GDF modificado sejam desconhecidos, crê-se que os pró-péptidos de GDF-8 modificados da invenção se ligam à GDF-8 madura e à BMP-11 madura. Numa forma de realização preferida, a presente invenção proporciona pró-péptidos de GDF modificados que formam complexos inactivos com proteínas GDF-8 ou BMP-11 in vivo ou in vitro. Numa forma de realização, os pró-péptidos de GDF ligam-se preferencialmente ao dominio de ligação do pró-péptido na proteína GDF-8 madura ou BMP-11 madura. Essa ligação pode ocorrer, por exemplo, após a libertação do pró-péptido nativo no local da actividade de GDF-8 e BMP-11, após a deslocação do pró-péptido nativo pelo pró-péptido de GDF-8 modificado, e/ou após clivagem do pró-péptido da proteína precursora de GDF-8 e BMP-11. Independentemente do mecanismo, a ligação do pró-péptido de GDF-8 modificado resulta numa redução em uma ou mais das actividades biológicas associadas com GDF-8, em relação à proteína de GDF-8 madura que não está ligada pelo mesmo pró-péptido modificado. Numa forma de realização preferida, os pró-péptidos de GDF-8 modificados reduzem a actividade de GDF-8 e BMP-11 associada com a regulação negativa da massa do músculo esquelético.

Noutra forma de realização preferida, a presente invenção proporciona pró-péptidos de GDF modificados que formam complexos inactivos com proteínas BMP-11 in vivo ou in vitro. Numa forma de realização, os pró-péptidos de GDF 25 ΡΕ1397492 ligam-se preferencialmente a um dominio de ligação do pró-péptido na proteína BMP-11 madura. Ainda noutra forma de realização, o pró-péptido de GDF modificado é uma proteína de fusão compreendendo um pró-péptido de GDF e uma região Fc de uma molécula IgG (como uma proteína estabilizadora) . Esses inibidores de GDF podem compreender um pró-péptido de GDF (por exemplo como aqui apresentado adiante na SEQ ID N°:5) ou um fragmento ou variante do referido pró-péptido que retém uma ou mais actividades biológicas de um pró-péptido GDF. Esses pró-péptidos de GDF modificados são capazes de inibir uma actividade de proteínas GDF. Os pró-péptidos de GDF-8 utilizados na invenção podem ser produzidos sinteticamente, derivados daqueles pró-péptidos de GDF-8 que ocorrem naturalmente (nativos), ou ser produzidos recombinantemente, utilizando qualquer uma de uma variedade de reagentes, células hospedeiras e métodos que são bem conhecidos na técnica da engenharia genética. Numa forma de realização, o pró-péptido de GDF-8 modificado compreende um pró-péptido de GDF-8 humano ligado covalen-temente a uma molécula de IgG ou um fragmento desta. 0 pró-péptido de GDF-8 pode ser fundido adjacente à região Fc da molécula de IgG, ou ligados à região Fc da molécula de IgG através de um péptido ligando. A utilização desses péptidos ligantes é bem conhecida na técnica da bioquímica de proteínas.

Em certas formas de realização, quando o pró-péptido de GDF modificadas da invenção compreende proteínas de fusão, a porção de pró-péptido de GDF da referida 26 ΡΕ1397492 proteína de fusão é preferencialmente pelo menos cerca de 75-80% idêntica a SEQ ID N°: 5, mais preferencialmente pelo menos cerca de 81% até cerca de 85% idêntica a SEQ ID N°: 5, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, ou 94% idêntica a SEQ ID N°:5, e ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica a SEQ ID N°: 5. Numa forma de realização preferida, os pró-péptidos de GDF-8 compreendem uma sequência idêntica às sequências apresentadas em SEQ ID N°:5. Ainda noutra forma de realização preferida, a porção de pró-péptido de GDF de uma proteína de fusão da invenção pode compreender um fragmento da variante do conjunto de pró-péptidos de GDF apresentada na SEQ ID N°: 5, desde que o fragmento ou variante retenha uma ou mais actividades biológicas de um pró-péptido de GDF. Noutra forma de realização preferida, os pró-péptidos de GDF-8 modificados compreendem uma versão mutante da SEQ ID N°: 5 em que o mutante foi modificado para incluir uma ou mais mutações (incluindo inserção, deleção, ou substituição) desde que o fragmento ou variante retenha uma ou mais actividades biológicas de um pró-péptido de GDF.

Criticamente, nas formas de realização da invenção envolvendo pró-péptidos de GDF modificados compreendendo proteínas de fusão, é essencial que a proteína de fusão seja produzida ou concebida de modo a que o sítio de clivagem proteolítica nativo (e.g. RSRR) no pró-péptido de GDF é interrompido, destruído, inactivado ou removido na proteína de fusão resultante. Como um especialista na 27 ΡΕ1397492 técnica reconhecerá, a incapacidade de o fazer resultará na segunda proteína (e.g., a porção estabilizadora) da proteína de fusão ser clivada da primeira proteína (a porção pró-péptido) da proteína de fusão. Consequentemente, um aspecto crítico da invenção proporciona a inactivação ou eliminação do sítio de clivagem nativa para pró-péptidos de GDF quando se utiliza esse pró-péptido para preparar uma proteína de fusão que é um pró-péptido de GDF modificado da invenção. Métodos para inactivar esse sítio de clivagem proteolítica são conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados a, mutação, deleção, ou inserção da sequência de aminoácidos ou nucleótidos do sítio de clivagem proteolítica.

Ainda noutras formas de realização da invenção, as mutações podem ser produzidas na sequência de GDF para tornar os sítios menos susceptíveis à clivagem proteolítica. Por exemplo, numa forma de realização, esse mutante pode conter uma mutação pontual nos aminoácidos 45, 46, 49, 50, 52, 53, 63, 64, 65, 66, 98 ou 99 da SEQ ID N°:l. Numa forma de realização preferida, a mutação pontual é uma mutação pontual no aminoácido 99 da SEQ ID N°:l. Numa forma de realização particularmente preferida, a mutação pontual é uma mutação pontual do aminoácido 99 de SEQ ID N°: de Asp a Ala. Também pode ser utilizada análise de computador (utilizando um software comercialmente disponível, e.g., MacVector, Omega, PCGene, Molecular Simula-tion, Inc.) para identificar sítios de clivagem proteolítica. Como será reconhecido por um especialista na 28 ΡΕ1397492 técnica qualquer uma das mutações descritas, podem ser realizadas alternativamente variantes ou modificações ao nível do ácido nucleico. Essas técnicas são bem conhecidas na técnica.

Tabela 2

Aminoácidos Exemplares Mutáveis para Prevenir Clivagem de Pró-péptido: GDF-8 (Os números de aminoácidos referem-se a SEQ ID N°:l) Arg-45 Gln-46 Lys-49 Ser-50 Arg-52 Ile-53 Lys-63 Leu-64 Arg-65 Leu-66 Arg-98 Asp-99 BMP-11 (Os números de aminoácidos referem-se a SEQ ID N°:7) Asp-122 Ala-123 Glu-286

Leu-287 29 ΡΕ1397492

Como referido acima, os presentes inventores fizeram a descoberta de que os pró-péptidos de GDF possuem uma meia vida curta in vivo. Assim, para ser farmaceu-ticamente útil como o agente terapêutico ou profilático, o pró-péptido de GDF deve ser quimicamente ou fisicamente estabilizado para aumentar a longevidade em condições fisiológicas.

Os pró-péptidos de GDF podem ser estabilizados ou modificados por quaisquer meios conhecidos na técnica, desde que o pró-péptido de GDF modificado mantenha uma capacidade para inibir uma proteína GDF ou proteína GDF madura. Numa forma de realização preferida, o pró-péptido de GDF modificado mantém a sua capacidade para se ligar à sua proteína GDF alvo ou um sítio de ligação ao pró-péptido de GDF. Numa forma de realização preferida, o pró-péptido de GDF modificado compreende um pró-péptido de GDF-8 fundido adjacente a, ou através de, um ligando, a uma região Fc de uma molécula de IgG. A região Fc da IgG proporciona um efeito protector ou estabilizante no pró-péptido (e através deste actua como uma modificação estabilizadora) , como reflectido nas propriedades farmaco-cinéticas melhoradas (í.e., meia vida no soro aumentada) da proteína de fusão em comparação com o pró-péptido de GDF-8 modificado correspondente.

Numa forma de realização particular, o pró-péptido de GDF-8 modificado compreende um pró-péptido de GDF-8 humano ou um mutante de pró-péptido de GDF-8 humano, 30 ΡΕ1397492 e a molécula de IgG é a região Fc de uma IgGI, ou uma IgG4, ou uma região Fc de IgGI modificado para função efectora reduzida. Numa forma de realização, o fragmento de IgG é IgGI (SEQ ID N°:15). Noutra forma de realização, o fragmento de IgG é IgGI modificado para função efectora reduzida (SEQ ID N°:16). Exemplos de moléculas modificadas para função efectora reduzida incluem modificação de fusão de IgGl-Fc humana para incluir alanina (A) nos aminoácidos das posições 14 e 17 como apresentado na SEQ ID N°:16.

Podem ser isolados ou purificados pró-péptidos de GDP-8 modificada, de acordo com processos de isolamento e purificação de proteína convencional bem conhecidos na técnica. A presente invenção também proporciona métodos para produzir pró-péptidos de GDF modificados possuindo meia vida aumentada in vivo ou in vitro. Numa forma de realização preferida, o método compreende preparar um pró-péptido de GDF modificado compreendendo uma proteína de fusão GDF-8/Fc de IgGI, preparando uma molécula de cDNA codificando: (1) um pró-péptido de GDF (por exemplo pró-péptido de GDF-8 humana, SEQ ID N°:5), que é modificado para inactivar o sítio de clivagem proteolítica e a região Fc de uma molécula de IgG (por exemplo, região Fc de IgGI humana, SEQ ID N°:15); (2) expressar o cDNA num sistema de expressão 31 ΡΕ1397492 procariótica ou eucariótica apropriada utilizando plasmideos e células de expressão apropriada; e (3) isolar e purificar a proteína de fusão expressa contendo o pró-péptido de GDF modificado, em que o pró-péptido de GDF modificado possui meia vida in vivo ou in vitro aumentada em comparação com um pró-péptido de GDF não modificado.

Um exemplo de tal pró-péptido de GDF modificado preferido da invenção é apresentado na Figura 11A. São bem conhecidos sistemas de expressão de cDNA na técnica da biologia molecular como são métodos para isolamento e purificação das proteínas expressas (Exemplos 2 e 7, aqui, proporcionam exemplos dessas formas de realização).

Numa forma de realização alternativa, as construções de cDNA utilizadas para expressão dessas proteínas de fusão podem conter nucleótidos que codificam um péptido ligante entre os nucleótidos codificando o pró-péptido de GDF e a região Fc de IgG (ou porção estabilizadora) . A orientação do péptido ligante em relação ao GDF ou região Fc de IgG não é importante. 0 péptido ligante pode compreender nucleótidos codificando 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 ou mais aminoácidos em comprimento. Numa forma de realização particular, o péptido ligante compreende nucleótidos codificando uma sequência de aminoácidos consistindo em glicina-serina-glicina-serina (GSGS). 32 ΡΕ1397492

Noutra forma de realização, os plasmídeos de expressão podem conter opcionalmente etiquetas permitindo o isolamento e purificação convenientes das proteínas expressas. A utilização desses plasmídeos de expressão etiquetados e os métodos para isolamento e purificação dos produtos de proteína marcada são bem conhecidos na técnica.

Os pró-péptidos de GDF da invenção incluem especificamente proteínas de fusão em que a porção de pró-péptido de GDF da molécula é idêntica ou superior a 60% homólogos a sequências de GDF correspondentes de uma espécie particular, enquanto que a porção estabilizadora, tal como a região Fc da molécula de IgG pode ser idêntica ou superior a 60% homóloga a sequências de IgG correspondentes de uma espécie diferente. Por exemplo, o pró-péptido de GDF-8 humano ou fragmento deste pode ser fundido com uma região Fc de uma molécula de IgG de ratinho, ou vice versa, desde que a proteína de fusão resultante exiba a actividade biológica desejada, nomeadamente, a inibição da actividade biológica de GDF, como incorporada nos Exemplos 3 - 6. Em formas de realização preferidas da invenção, as proteínas de fusão da invenção são quimeras de proteínas humanas. Como será entendido na técnica, a proteína quimérica humana ou proteínas de fusão serão preferidas no tratamento de indivíduos humanos.

Como uma alternativa, ou adicionalmente às proteínas de fusão de Fc acima descritas, os pró-péptidos 33 ΡΕ1397492 de GDF podem ser estabilizados por uma variedade de outros métodos e recursos materiais que são bem conhecidos e estão imediatamente disponíveis na técnica da proteína. Esses métodos e materiais incluem, por exemplo, glicosilação, ou ligação a albumina ou um polímero não proteico, como descrito em detalhe abaixo. Os pró-péptidos de GDF modificados podem ser isolados e purificados utilizando técnicas convencionais de isolamento e purificação de proteínas bem conhecidas na técnica das proteínas.

Pró-péptidos de GDF ou pró-péptidos de GDF modificados podem ser produzidos por uma variedade de técnicas conhecidas na técnica. Por exemplo, esses pró-péptidos podem ser sintetizados (e.g., quimicamente ou de forma recombinante), isolados e purificados, e testados quanto à sua capacidade para formar complexos com proteína GDF-8 madura ou BMP-11 madura utilizando os métodos aqui descritos ou métodos conhecidos na técnica. Os pró-péptidos podem ser sintetizados utilizando técnicas de química de proteínas convencionais, tais como as descritas em Bodansky, M. Principies of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlim (1993) e Grant G.A. (ed.), Synthetic Peptides: A User's Guide, W.H. Freeman and Company, New York (1992), cujos conteúdos são aqui incorporados como referência. Adicionalmente, estão disponíveis comercialmente sintetizadores de péptidos automatizados (e.g., Advanced ChemTech Model 396; Milligen/Biosearch 9600).

Alternativamente, os pró-péptidos de GDF modifi- 34 ΡΕ1397492 cados ou não modificados ou fragmentos destes podem ser produzidos de forma recombinante utilizando vários sistemas de expressão (e.g., E. coli, células de Ovário de Hamster Chinês, células COS, baculovirus) como são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, o pró-péptido de GDF-8 expresso pode ser purificado, por exemplo, utilizando o método descrito em Bottinger et al. (1996) PNAS 93:5877-5882 e Gentry e Nash (1990) Biochemistry 29:6851-6857, cujos conteúdos são aqui incorporados como referência, ou qualquer outro método para purificar péptidos reconhecidos na técnica. Alternativamente, o pró-péptido de GDF modificado ou não modificado ou fragmento deste pode ser etiquetado com, por exemplo, FLAG ou 6-His para subsequente purificação, utilizando técnicas estabelecidas na técnica das proteínas.

Os pró-péptidos de GDF-8 modificados ou não modificados pode ainda ser produzidos por digestão de GDF-8 ou BMP-11 que ocorre naturalmente ou produzida de forma recombinante utilizando, por exemplo, uma protease, e.g., tripsina, termolisina, quimiotripsina, pepsina, ou enzima de conversão de aminoácidos básicos emparelhados (PACE). Pode ser utilizada análise de computador (utilizando um software disponível comercialmente, e.g., MacVector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.) para identificar sítios de clivagem proteolítica. Alternativamente, esses pró-péptidos de GDF podem ser produzidos a partir de GDF-8 que ocorre naturalmente ou produzido de forma recombinante, tais como técnicas convencionais conhecidas na técnica, tal 35 ΡΕ1397492 como por clivagem química (e.g., brometo de cianogénio, hidroxilamina).

As porções do pró-péptido de GDF-8proteolíticas ou sintéticas do pró-péptido de GDF modificado podem compreender tantos resíduos de aminoácidos quantos sejam necessários para ligação à proteína de GDF alvo, inibindo desse modo, parcialmente ou completamente, a actividade de GDF-8 ou BMP-11. Os Exemplos 4-6, aqui, ilustram formas de realização de ensaios de ligação e de inibição. Em particular, os fragmentos funcionais das sequências de pró-péptido de GDF-8 que mantêm a capacidade para modular ou inibir GDF-8, estão incluídos dentro do âmbito da invenção. As porções do pró-péptido de GDF-8 compreendem preferencialmente pelo menos 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, ou 90 aminoácidos; mais preferencialmente pelo menos 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, ou 190 aminoácidos; e

muito preferencialmente pelo menos 200, 210, 220, 230, ou 240 ou mais aminoácidos de comprimento. Numa forma de realização preferida, a porção do pró-péptido de GDF-8 do pró-péptido de GDF-8 modificado tem 243 aminoácidos de comprimento, i.e., correspondendo a SEQ ID N°:5. A sequência sinal para GDF-8 humana é apresentada na SEQ ID N°: 13, e inclui os primeiros 23 aminoácidos da SEQ ID N° : 1. A sequência sinal para BMP-11 humana é apresentada na SEQ ID N°: 14 e inclui os primeiros 24 aminoácidos da SEQ ID N°: 7. A identificação de uma sequência parcial 36 ΡΕ1397492 de pró-péptido de GDF-8 ou de BMP-11 como um fragmento funcional de pró-péptido de GDF-8 ou BMP-11 pode ser rapidamente determinada, por exemplo, utilizando os ensaios descritos nos Exemplos 4-6, aqui.

Adicionalmente às sequências de pró-péptido truncadas, as variantes de pró-péptido aqui incluem espe-cificamente pró-péptidos de GDF possuindo mutações pontuais ou outras modificações (incluindo inserção, deleção, e substituição); desde que essas variantes contenham uma ou mais actividades biológicas ou inibidoras desejadas de um pró-péptido de GDF. Essa actividade pode ser medida, por exemplo, como descrito nos Exemplos 4-6. Essas modificações podem ser introduzidas numa molécula para aumentar a actividade, meia vida em circulação ou armazenamento, ou produção do pró-péptido de GDF-8. Por exemplo, as mutações pontuais podem ser introduzidas num ou mais sitios de clivagem proteolítica para prevenir ou inibir a degradação proteolitica do pró-péptido de GDF-8 modificado, in vivo. Pode ser utilizada análise de computador (utilizando um software comercialmente disponível, e.g., MacVector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.) para identificar sítios de clivagem proteolítica.

Consequentemente, os métodos de preparação de pró-péptidos de GDF da invenção incluem especificamente, adicionalmente às sequências codificantes de cDNA de tipo selvagem, sequências codificantes de cDNA que codificam os pró-péptidos de GDF de tipo selvagem, mas que diferem na 37 ΡΕ1397492 sequência de cDNA da sequência de cDNA de GDF de tipo selvagem, devido às degenerações do código genético ou variações alélicas (alterações de bases que ocorrem naturalmente na população da espécie que pode resultar ou não numa alteração de aminoácidos). A invenção também contempla sequências de DNA que hibridam em condições de hibridação restringente (numa forma de realização como descrito em T. Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, pp. 387-389) com um ácido nucleico codificando um pró-péptido de GDF ou um ácido nucleico codificando uma proteína ou polipéptido possuindo a capacidade para se ligar a uma proteína de GDF particular, como incorporado nos Exemplos 4-6. Variações nas sequências de cDNA provocadas por mutações pontuais ou por modificações induzidas (e.g., inserção, deleção, e substituição) para aumentar a actividade, meia vida ou produção dos pró-péptidos de GDF-8 codificados deste modo são também úteis para a presente invenção. Programas de computador úteis na determinação da homologia de sequências de DNA são conhecidos na técnica e são aqui descritos. A capacidade de um pró-péptido de GDF modificado para formar um complexo não covalente com uma proteína de GDF pode ser avaliada por uma variedade de métodos conhecidos na técnica, incluindo cromatografia de exclusão por tamanho e/ou análise de ligação cruzada, como aqui descrito no Exemplo 2. Como apresentado no Exemplo 2, o pró-péptido de GDF-8 forma uma associação não covalente com 38 ΡΕ1397492 a proteína de GDF-8 madura. O complexo de madura GDF-8/pró-péptido de GDF-8 possui um peso molecular aparente de aproximadamente 75 kDa.

Como referido acima, adicionalmente ao método de fusão de Fc, os pró-péptidos de GDF podem ser estabilizados por uma variedade de outras técnicas. Numa forma de realização, a porção estabilizadora é ligado covalentemente a uma porção de pró-péptido de GDF para criar uma proteína de fusão. Por exemplo, o pró-péptido de GDF-8 pode ser ligado a um ou mais de uma variedade de polímeros não proteicos, e.g., polietilenoglicol, polipropilenoglicol, ou polioxialquilenos, do modo apresentado nas Patentes U.S. Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 ou 4,179,337. Em certas formas de realização, os pró-péptidos de GDF são quimicamente modificados por conjugação covalente com um polímero para aumentar a sua meia vida em circulação. Polímeros preferidos, e métodos para os ligar a péptidos, também são descritos nas Patentes U.S. Nos. 4,766,106; 4,179,337; 4,495,285; e 4,609,546.

Noutra forma de realização, o pró-péptido de GDF-8 pode ser modificado para possuir um padrão de glicosi-lação alterado (i.e., alterado em relação ao padrão de glicosilação selvagem). Como aqui utilizado, "alterado" significa possuir um ou unidades de hidratos de carbono adicionados ou removidos de/a partir de o pró-péptido de GDF de tipo selvagem. A glicosilação de proteínas e polipéptidos está tipicamente ou ligada a N ou ligada a O. 39 ΡΕ1397492

Ligada a N refere-se à ligação da unidade de hidratos de carbono à cadeia lateral de um residuo de asparagina. As sequências tripeptidicas asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, quando X é qualquer aminoácido excepto prolina, são o reconhecimento de sequências para a ligação enzi-mática da unidade de hidrato de carbono à cadeia lateral de asparagina. Assim, a presença de qualquer uma destas sequências tripeptidicas num polipéptido cria um sitio de glicosilação potencial. A glicosilação ligada a 0 refere-se à ligação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galac-tose, ou xilose a um hidroxiaminoácido, normalmente serina ou treonina, embora também possam ser utilizadas 5-hidroxi-prolina ou 5-hidroxilisina. A adição ou deleção de sítios de glicosilação ao pró-péptido é convenientemente realizada alterando a sequência de aminoácidos de modo a que contenha ou omita uma ou mais das sequências tripeptidicas acima descritas (para sítios de glicosilação ligados a N) . A alteração também pode ser realizada pela adição de, ou substituição por, um ou mais resíduos de serina ou treonina à sequência do pró-péptido de GDF de tipo selvagem (para sítios de glicosilação ligados a 0) . Para facilidade, a sequência de aminoácidos do pró-péptido de GDF é preferencialmente alterada através de alterações ao nível do DNA, cujas técnicas são bem conhecidos na técnica.

Outro meio de aumentar o número de unidades de hidratos de carbono no pró-péptido de GDF é através de 40 ΡΕ1397492 acoplamento químico ou enzimático de glicósidos ao pró-péptido de GDF. Estes procedimentos são vantajosos na medida em que não requerem a produção do pró-péptido de GDF numa célula hospedeira que possui capacidades de glico-silação para glicosilação ligada a N- ou 0-. Dependendo do modo de acoplamento utilizado, o(s) açúcar(es) podem ser ligados a (a) arginina e histidina; (b) grupos carboxilo livres; (c) grupos sulfidrilo livres tais como os de cisteína; (d) grupos hidroxilo livres, tais como os de serina, treonina, ou hidroxiprolina; (e) resíduos aromáticos, tais como os de fenilalanina, tirosina, ou tri-ptofano; ou (f) o grupo amida da glutamina. Estes métodos são descritos em WO 87/05330 publicada a 11 de Set. de 1987, e em Aplin e Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306. A remoção de quaisquer unidades de hidrato de carbono presentes no pró-péptido de GDF podem ser realizados quimicamente ou enzimaticamente. A desglicosilação química requer exposição do pró-péptido de GDF ao composto de ácido trifluorometanossulfónico, ou um composto equivalente. Este tratamento resulta na clivagem da maioria ou de todos os açúcares, excepto o açúcar de ligação (N-acetil-glucosamina ou N-acetilgalactosamina), enquanto que deixa a sequência de aminoácidos intacta. A desglicosilação química é descrita por Haki-muddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259:52 e por Edge et al. (1981) Anal. Biochem. 118:131. A clivagem 41 ΡΕ1397492 enzimática das unidades de hidrato de carbono nos pró-péptidos de GDF pode ser alcançada através da utilização de uma variedade de endo- e exo-glicosidases como descrito por Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol. 138:350.

Quando o pró-péptido de GDF modificado é uma proteína de fusão pró-péptido de GDF-Fc, como descrito acima, a região Fc da molécula de igG também pode ser modificada para possuir um padrão de glicosilação alterado.

Noutra forma de realização, um pró-péptido de GDF é ligado a uma proteína de albumina ou um derivado de albumina. Métodos para ligar proteínas e polipéptidos para a proteína albumina ou derivados de albumina são bem conhecidos na técnica. Ver e.g., Patente U.S. N°. 5,116,944 (Sivam et al.), aqui incorporado por referência. É entendido por um especialista na técnica que certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos numa estrutura de proteína sem afectar de forma adversa a actividade da proteína. É assim contemplado pelos inventores que podem ser realizadas várias alterações nas sequências de aminoácidos dos pró-péptidos de GDF modificado ou não modificads, ou sequências de DNA codificando esses pró-péptidos, sem perda apreciável da sua utilidade ou actividade biológica. Numa forma de realização, essa actividade é medida nos Exemplos 4-6. Essas alterações podem incluir, mas não estão limitadas a, deleções, inserções, truncagens, substituições, fusões, e afins. Por 42 ΡΕ1397492 exemplo, alterações de sequências de aminoácidos em sítios de clivagem proteolítica no pró-péptido de GDF modificado são explicitamente incluídas na presente invenção.

Ao realizar essas alterações, o índice hidro-pático de aminoácidos pode ser considerado. A importância do índice de aminoácidos hidropático ao conferir função biológica interactiva numa proteína é geralmente compreendida na técnica (Kyte e Doolittle (1982) J. Mol. Biol. 157:105-132). É aceite que o carácter hidropático relativo dos aminoácidos contribui para a estrutura secundária da proteína resultante, que por sua vez define a interacção da proteína com outras moléculas, por exemplo, enzimas, substratos, receptores, DNA, anticorpos, antigénios, e semelhantes. A cada aminoácido foi atribuído um índice hidropático com base nas suas características de hidrofobicidade e de carga (Kyte e Doolittle, 1982, supra); estes são isoleucina (+4,5), valina (+4,2), leucina (+3,8), fenil-alanina (+2,8), cisteína/cistina (+2,5), metionina (+1,9), alanina (+1,8), glicina (-0,4), treonina (-0,7), serina (-0,8), triptofano (-0,9), tirosina (-1,3), prolina (-1,6), histidina (-3,2), glutamato (-3,5), glutamina (-3,5), aspartato (-3,5), asparagina (-3,5), lisina (-3,9), e arginina (-4,5) .

Ao realizar essas alterações, é preferida a substituição de aminoácidos cujos índices hidropáticos 43 ΡΕ1397492 estão dentro de +2, aqueles que estão dentro de ±1 são particularmente preferidos, e aqueles dentro de ±0,5 são ainda mais particularmente preferidos.

Também é entendido na técnica que a substituição de tipo de aminoácidos pode ser realizada eficazmente com base na hidrofilicidade. Por exemplo, a Patente U.S. 4,554,101 refere que a hidrofilicidade média local mais elevada de uma proteína, como determinada pela hidrofilicidade dos seus aminoácidos adjacentes, está correlacionada com uma propriedade biológica da proteína.

Como detalhado na Patente U.S. N°. 4,554,101, foram atribuídos os seguintes valores de hidrofilicidade aos resíduos de aminoácidos: arginina (+3,0), lisina (+3,0), aspartato (+3,01), glutamato (+3,01), serina (+0,3), asparagina (+0,2), glutamina (+0,2), glicina (0), treonina (-0,4), prolina (-0,51), alanina (-0,5), histidina (-0,5), cisteína (-1,0), metionina (-1,3), valina (-1,5), leucina (-1,8), isoleucina (-1,8), tirosina (-2,3), fenil-alanina (-2,5), e triptofano (-3,4).

Ao realizar essas alterações, a substituição de aminoácidos cujos valores de hidrofilicidade estão dentro estão dentro de +2, aqueles que estão dentro de +1 são particularmente preferidos, e aqueles dentro de +0,5 são ainda mais particularmente preferidos.

As modificações podem ser conservadoras de modo a 44 ΡΕ1397492 que a estrutura ou função biológica da proteína não seja afectada pela alteração. Essas modificações de aminoácidos conservadoras são baseadas na semelhança relativa dos substituintes da cadeia lateral dos aminoácidos, por exemplo, a sua hidrofobicidade, hidrofilicidade, carga, tamanho, e semelhantes. Substituições conservadoras exemplares que tomam várias das características antecedentes em consideração são bem conhecidas dos especialistas na técnica e incluem: arginina e lisina; glutamato e aspartato; serina e treonina; glutamina e asparagina; e valina, leucina, e isoleucina. A sequência de aminoácidos do pró-péptido de GDF modificado pode ser modificada para possuir qualquer número de alterações conservadoras, de modo a que a ligação do pró-péptido de GDF modificado à sua proteína GDF alvo não seja adversamente afectada. A semelhança relativa ou identidade da sequência (também conhecida nas áreas de proteínas e biologia molecular como homologia de sequências) é preferencialmente determinada utilizando os programas "Best Fit" ou "Gap" do Sequence Analysis Software Package™ (Versão 10; Genetics Computer Group, Inc., University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, WI) . "Gap" utiliza o algoritmo de Needleman e Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970) para encontrar o alinhamento de duas sequências que maximiza o número de emparelhamentos e minimiza o número de intervalos. "BestFit" realiza um alinhamento óptimo do melhor segmento de semelhança entre duas sequências. Os alinhamentos óptimos são encontrados inserindo intervalos para maximizar 45 ΡΕ1397492 o número de emparelhamentos utilizando o algoritmo da homologia local de Smith e Waterman (Smith e Waterman, 1981; Smith, et al., 1983). 0 Sequence Analysis Software Package descrito acima contém várias outras ferramentas de análise de sequência úteis para identificar homólogos das sequências de nucleótidos e aminoácidos revelados presentemente. Por exemplo, o programa "BLAST" (Altschul, et al., 1990) pesquisa as sequências semelhantes à sequência a pesquisar (seja um péptido ou ácido nucleico) num base de dados especificada (e.g., bases de dados de sequências mantidas no National Center for Biotechnology Information (NCBI) em Bethesda, Maryland, USA); "FastA" (Lipman e Pearson, 1985; ver também Pearson e Lipman, 1988; Pearson, et al., 1990) realiza uma pesquisa de Pearson e Lipman para a semelhança entre uma sequência a pesquisar e um grupo de sequências do mesmo tipo (ácido nucleico ou proteína); "TfastA" realiza uma pesquisa de Pearson e Lipman para a semelhança entre uma sequência de proteína a pesquisar e qualquer grupo de sequências de nucleótidos (traduz as sequências de nucleótidos em todas as seis grelhas de leitura antes de realizar a comparação) ; "FastX" realiza uma pesquisa de Pearson e Lipman para a semelhança entre uma sequência de nucleótidos a pesquisar e um grupo de sequências de proteína, tomando em consideração as grelhas. "TfastX" realiza uma pesquisa de Pearson e Lipman para a semelhança entre uma proteína a analisar e qualquer grupo de sequências de nucleótidos, tomando em consideração as 46 ΡΕ1397492 grelhas (traduz ambas as cadeias da sequência nucleica antes de realizar a comparação) .

Um especialista na técnica reconhecerá que os pró-péptidos de GDF modificados ou não modificados podem conter qualquer número de substituições nas suas sequências de aminoácidos sem alterar as suas propriedades biológicas. Numa forma de realização preferida, essas alterações são substituições de aminoácidos conservadoras, que são bem conhecidas na técnica. Substituições conservadoras exemplares que tomam em consideração várias das carac-terísticas em consideração são bem conhecidas dos especialistas na técnica de proteínas e bioquímica e incluem, mas não estão limitados a: arginina e lisina; glutamato e aspartato; serina e treonina; glutamina e asparagina; e valina, leucina, e isoleucina.

Em certas formas de realização da invenção, a in vivo estabilidade de uma proteína pode ser medida de várias maneiras. Numa forma de realização, são recolhidas amostras de soro ou tecido a uma variedade de pontos de tempo seguido por distribuição da proteína quer intravenosamente ou intraperitonealmente ou a proteína é marcada radio-activamente, í.e. com iodo-125, utilizando métodos bem conhecidos dos especialistas na técnica. A quantidade de radioactividade presente em cada amostra de soro ou de tecido pode ser determinada utilizando um contador gama. Noutra forma de realização, a integridade/estabilidade de uma proteína no soro pode ser avaliada por SDS-PAGE seguido 47 ΡΕ1397492 quer por autorradiografia ou análise de transferência de Western. Noutra forma de realização, a actividade biológica da proteína pode ser medida utilizando qualquer um de uma variedade de ensaios funcionais, incluindo um ensaio de ELISA ou à base de células conhecido na técnica. Métodos de Tratamento da Doença

Os pró-péptidos de GDF da presente invenção são úteis para prevenir ou tratar vários distúrbios médicos em humanos ou animais. Os pró-péptidos de GDF são preferencialmente utilizados para inibir ou reduzir uma ou mais actividades associadas com uma proteína GDF. Numa forma de realização altamente preferida, o pró-péptido de GDF modificado inibe ou reduz uma ou mais das actividades da GDF-8 madura em relação a uma proteína GDF-8 madura que não é ligada pelo mesmo pró-péptido. Numa forma de realização preferida, a actividade da proteína GDF-8 madura, quando ligada por um ou mais dos pró-péptidos de GDF modificados, é inibida em pelo menos 50%, preferencialmente pelo menos 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, ou 88%, mais preferencialmente pelo menos 90, 91, 92, 93, ou 94%, e ainda mais preferencialmente pelo menos 95% a 100% em relação a uma proteína GDF-8 madura que não é ligada por um ou mais dos pró-péptidos de GDF modificado. O distúrbio médico a ser tratado ou prevenido pelos pró-péptidos de GDF modificados é preferencialmente um distúrbio muscular ou neuromuscular (tais como, 48 ΡΕ1397492 esclerose lateral amiotrópica, distrofia muscular, atrofia muscular, doença pulmonar obstrutiva congestiva, sindrome do gasto muscular, sarcopenia, ou caquexia), uma doença metabólica (tais como diabetes de tipo 2, diabetes mellitus não dependente da insulina, hiperglicémia, ou obesidade), um distúrbio de tecido adiposo (tais como obesidade), ou doença degenerativa do osso (tais como osteoporose) . 0 estado médico é mais preferencialmente um distúrbio muscular ou neuromuscular, tais como esclerose lateral amiotrópica, distrofia muscular, atrofia muscular, doença pulmonar congestiva obstrutiva, sindrome do gasto muscular, sarcopenia, ou caquexia. Noutra forma de realização preferida, o estado médico é uma doença ou distúrbio metabólico, tais como os que resultam de metabolismo disfuncional da glucose e/ou resistência à insulina, tais como diabetes de tipo 2 ou diabetes mellitus não dependente da insulina, ou distúrbios metabólicos, tais como hiperglicémia ou obesidade. Os pró-péptidos de GDF são utilizados preferencialmente para prevenir ou tratar os distúrbios médicos em mamíferos, mais preferencialmente em humanos.

Os pró-péptidos ou composições de pró-péptidos de GDF da presente invenção são administrados em quantidades terapeuticamente eficazes. Como aqui utilizado, uma "quantidade eficaz" do pró-péptido de GDF modificado é uma dosagem que é suficiente para reduzir a actividade de proteínas GDF para atingir um resultado biológico desejado (e.g., aumentar a massa do músculo esquelético). Numa forma 49 ΡΕ1397492 de realização, o resultado biológico desejado pode ser qualquer beneficio terapêutico incluindo um aumento na massa muscular, um aumento na força muscular, melhoria do metabolismo, diminuição da adiposidade, ou homeostasia melhorada da glucose. Esses melhoramentos podem ser medidos por uma variedade de métodos incluindo aqueles que medem a massa corporal magra e gorda (tais como análise de varrimento por raios x de confronto), força muscular, lipidos no soro, leptina no soro, glucose no soro, hemoglobina glicada, tolerância à glucose, e melhoramento na complicação secundária da diabetes. De um modo geral, a quantidade terapeuticamente eficaz pode variar com a idade do indivíduo, peso, condição física, e sexo, assim como a gravidade do estado médico no indivíduo. A dosagem pode ser determinada por um médico e ajustada, conforme a necessidade, para se adaptar aos efeitos observados do tratamento. De um modo geral, as composições são administradas de modo a que os pró-péptidos de GDF sejam fornecidos a uma dose entre 50 pg/kg e 20 mg/kg. Preferencialmente, os pró-péptidos de GDF são administrados como uma dose de bolus, para maximizar os níveis de pró-péptidos GDE em circulação para o maior período de tempo em circulação após a dose. A infusão contínua pode também ser utilizada após a dose de bolus. A presente invenção também proporciona métodos para tratar ou prevenir doenças ou distúrbios metabólicos resultantes de homeostasia da glucose anormal. A homeostasia da glucose normal requer, inter alia, a orquestração 50 ΡΕ1397492 finamente afinada da secreção de insulina pelas células beta pancreáticas em resposta a alterações subtis nos niveis de glucose no sangue. Uma das acções fundamentais da insulina é estimular a incorporação de glucose do sangue para os tecidos, especialmente músculo e gordura.

Consequentemente, a presente invenção proporciona um método para tratar de diabetes mellitus e distúrbios relacionados, tais como obesidade ou hiperglicémia, administrando a um indivíduo um pró-péptido de GDF modificado ou composição de pró-péptido de GDF modificado numa quantidade suficiente para melhorar os sintomas da doença. A diabetes de Tipo 2 ou mellitus não dependente da insulina (NIDDM), em particular, é caracterizada por uma tríade de (1) resistência à acção da insulina na incorporação de glucose nos tecidos periféricos, especialmente músculo esquelético e adipócitos, (2) a acção da insulina debilitada para inibir a produção de glucose hepática, e (3) secreção de insulina desregulada (DeFronzo, (1997) Diabetes Rev.5:177-269). Por isso, os indivíduos que padecem da diabetes de tipo 2 podem ser tratados de acordo com a presente invenção pela administração de um pró-péptido de GDF modificado, que aumenta a sensibilidade à insulina e a incorporação de glucose pelas células.

De um modo semelhante, também podem ser tratadas outras doenças e distúrbios metabólicos caracterizados por disfunção da insulina (e.g., resistência, inactividade, ou deficiência) e/ou transporte de glucose insuficiente nas 51 ΡΕ1397492 células de acordo com a presente invenção pela administração de um pró-péptido de GDF modificado, que aumenta a sensibilidade à insulina e incorporação de glucose pelas células. 0 pró-péptido de GDF modificado ou composições de pró-péptido de GDF modificado da presente invenção são administrados em quantidades terapeuticamente eficazes. Quando utilizado para o tratamento de diabetes e distúrbios relacionados, uma "quantidade eficaz" do pró-péptido de GDF modificado é uma dosagem que é suficiente para reduzir a actividade de proteínas GDF para alcançar um ou mais resultados terapêuticos desejados, tais como, por exemplo, um aumento na sensibilidade à insulina ou incorporação de glucose pelas células, uma diminuição na massa gorda corporal ou uma alteração desejada nos lípidos no soro, leptina no soro, glucose no soro, hemoglobina glicada, tolerância à glucose, ou melhoramento na complicação secundária da diabetes. De um modo geral, uma quantidade terapeuticamente eficaz pode variar com a idade do indivíduo, condição, e sexo, assim como a gravidade da disfunção da insulina no indivíduo. A dosagem pode ser determinada por um médico e ajustada, conforme a necessidade, para adequar os efeitos observados do tratamento. De um modo geral, as composições são administradas de modo a que os pró-péptidos de GDF sejam administrados a uma dose entre 50 pg/kg e 20 mg/kg. Preferencialmente, os pró-péptidos de GDF são administrados como uma dose de bolus, para maximizar os níveis de pró-péptidos de GDF em circulação durante o maior 52 ΡΕ1397492 período de tempo após a dose. Também pode ser utilizada infusão contínua após a dose de bolus. A presente invenção também proporciona terapêutica génica para a produção de pró-péptidos de GDF in vivo. Essa terapêutica atingiria o seu efeito terapêutico através da introdução das sequências polinucleotídicas do pró-péptido de GDF em células ou tecidos possuindo os distúrbios como listados acima. A distribuição das sequências polinucleotídicas do pró-péptido de GDF pode ser alcançada utilizando um vector de expressão recombinante, tal como um vírus quimérico ou um sistema de dispersão coloidal. É especialmente preferida para distribuição terapêutica das sequências polinucleotídicas pró-péptido de GDF a utilização de lipossomas direccionados. Vários vectores virais que podem ser utilizados para terapêutica génica como aqui ensinado incluem adeno-vírus, vírus herpes, vaccinia, ou, preferencialmente, um vírus de RNA, tal como um retrovírus. Preferencialmente, o vector retroviral é um derivado de um retrovírus de murídeo ou aves. Exemplos de vectores retrovirais em que pode ser inserido um único gene estranho incluem, mas não estão limitados a: vírus da leucemia de murídeo de Moloney (MoMuLV), vírus do sarcoma de murídeo de Harvey (HaMuSV), vírus do tumor mamário de murídeo (MuMTV), e Vírus de Sarcoma de Rous (RSV). Vários vectores retrovirais podem incorporar adicionalmente múltiplos genes. Todos estes vectores podem transferir ou incorporar um gene para um 53 ΡΕ1397492 marcador seleccionável, de modo a que as células transduzidas possam ser identificadas e criadas inserindo uma sequência polinucleotidica de pró-péptido de GDF de interesse no vector virai, juntamente com outro gene que codifica o ligando para um receptor numa célula alvo especifica, por exemplo, o vector é agora especifico para o alvo. Os vectores retrovirais podem ser tornados específicos para o alvo ligando, por exemplo, um açúcar, um glicolipido, ou uma proteína. É conseguido direccionamento preferido utilizando um anticorpo. Os especialistas na técnica reconhecerão que as sequências polinucleotídicas específicas podem ser inseridas no genoma retroviral ou ligadas a um envelope virai para permitir a distribuição específica para o alvo do vector retroviral contendo o polinucleótido pró-péptido de GDF. Numa forma de realização preferida, o vector é direccionado para as células musculares ou tecido muscular.

Uma vez que os retrovírus recombinantes são defeituosos, eles necessitam de linhas de células auxiliares que contêm plasmídeos codificando todos os genes estruturais dos retrovírus sob o controlo de sequências reguladoras em LTR. Estes plasmídeos têm falta de uma sequência de nucleótidos que permita o mecanismo de empacotamento para reconhecer um transcrito de RNA para encapsidação. As linhas de células auxiliares que possuem deleções do sinal de empacotamento incluem, mas não estão limitadas a PSI.2, PA317 e PAI2, por exemplo. Estas linhas celulares produzem viriões vazios, uma vez que não é 54 ΡΕ1397492 empacotado nenhum genoma. Se um vector retroviral é introduzido nessas células em que o sinal de empacotamento está intacto, mas os genes estruturais são substituídos por outros genes de interesse, o vector pode ser empacotado e o vector virião produzido.

Alternativamente, podem ser transfectadas direc-tamente outras células de cultura de tecidos com plasmídeos codificando os genes retrovirais estruturais gag, pol e env, por transfecção convencional com fosfato de cálcio. Estas células são então transfectadas com o vector plasmídico contendo os genes de interesse. As células resultantes libertam o vector retroviral no meio de cultura.

Outro sistema de distribuição direccionado para o polinucleótido pró-péptido de GDF é um sistema de dispersão coloidal. Sistemas de dispersão coloidal incluem complexos de macromolécula, nanocápsulas, microsferas, esferas, e sistemas à base de lípidos, incluindo emulsões óleo-em-água, micelas, micelas mistas, e lipossomas. 0 sistema coloidal preferido desta invenção é um lipossoma. Os lipossomas são vesículas de membrana artificiais que são úteis como veículos de distribuição in vitro e in vivo. Podem ser encapsulados RNA, DNA e viriões intactos no interior aquoso e serem distribuídos às células numa forma biologicamente activa (Ver e.g., Fraley, et al., Trends Biochem. Sei., 6:77, 1981). Métodos para transferência eficiente de genes utilizando um veículo de lipossomas, são 55 ΡΕ1397492 conhecidos na técnica, ver e.g., Mannino, et al., Biotechniques, 6:682, 1988. A composição do lipossoma é normalmente uma combinação de fosfolípidos, normalmente em combinação com esteróides, especialmente colesterol. Também podem ser utilizados outros fosfolípidos ou outros lípidos. As características físicas dos lipossomas dependem do pH, força iónica, e da presença de catiões divalentes.

Exemplos de lípidos úteis na produção de lipossomas incluem compostos de fosfatidilo, tais como fosfa-tidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfati-diletanolamina, esfingolípidos, cerebrósidos, e ganglió-sidos. Fosfolípidos ilustrativos incluem fosfatidilcolina de ovo, dipalmitoilfosfatidilcolina e distearoilfosfa-tidilcolina. 0 direccionamento de lipossomas também é possível com base em, por exemplo, especificidade para os órgãos, especificidade para a célula, e especificidade para o organito e é conhecido na técnica.

Os métodos de tratamento ou prevenção das condições médicas acima com o pró-péptido de GDF modificado podem também ser utilizados para inibir outras proteínas na superfamília de TGF-βΙ. Muitas destas proteínas estão relacionadas na estrutura com GDF-8, tais como BMP-11. Consequentemente, noutra forma de realização, a invenção proporciona métodos de tratamento dos distúrbios acima mencionados administrando a um indivíduo um pró-péptido de 56 ΡΕ1397492 GDF modificado capaz de inibir uma proteína não GDF-8, quer isoladamente ou em combinação com um pró-péptido de GDF modificado contra GDF-8.

Composições de Pró-péptido de GDF Modificado A presente invenção proporciona composições compreendendo os pró-péptidos de GDF modificados. Essas composições podem ser adequadas para utilização farmacêutica e administração a doentes. As composições compreendem tipicamente um ou mais pró-péptidos de GDF modificados da presente invenção e um excipiente farma-ceuticamente aceitável. Como aqui utilizada, a frase "excipiente farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e de retardamento da absorção, e semelhantes, que são compatíveis com a administração farmacêutica. A utilização desses meios e agentes para substâncias farmaceuticamente activas é bem conhecida na técnica. Excipientes farmaceuticamente aceitáveis exemplares podem ser encontrados em "The Handbook of Pharmaceutical Excipients" 3a Ed. 2000, Am. Pharmaceutical Press, A.E. Kibbe, ed. As composições também podem conter outros compostos activos proporcionando funções terapêuticas suplementares, adicionais, ou aumentadas. As composições farmacêuticas podem também estar incluídas num recipiente, pacote, ou dispensador, juntamente com instruções para administração. 57 ΡΕ1397492

Uma composição farmacêutica da invenção é formulada para ser compatível com a sua via de administração pretendida. Métodos para realizar a administração são bem conhecidos dos especialistas na técnica. Pode também ser possível obter composições que podem se administradas topicamente ou oralmente, ou que podem ser capazes de transmissão através das membranas mucosas. A administração pode, por exemplo, ser intravenosa (I.V.), intraperitoneal (I.P.), intramuscular (I.M.), intracavi-dade, subcutânea (S.C.) ou transdérmica. Formas de realização preferidas incluem injecção I.V., I.P., I.M. e S.C. Numa forma de realização preferida, as composições farmacêuticas da invenção são administradas intravenosamente .

Soluções ou suspensões utilizadas para aplicação intradérmica ou subcutânea incluem tipicamente um ou mais dos seguintes componentes: um diluente estéril, tais como água para injecção, solução salina, óleos fixados, polietilenoglicóis, glicerina, propilenoglicol ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos, tais como álcool benzílico ou metilparabenos; antioxidantes, tais como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes, tais como ácido etilenodiaminatetra-acético; tampões, tais como acetatos, citratos ou fosfatos; e agentes para o ajusto da tonicidade, tais como cloreto de sódio ou dextrose. 0 pH pode ser ajustado com ácidos ou bases, tais como ácido clorídrico ou hidróxido de sódio. Essas 58 ΡΕ1397492 preparações podem ser encapsuladas em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de dose múltipla fabricados de vidro ou plástico.

Composições farmacêuticas adequadas para injecção incluem soluções estéreis aquosas ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções injectáveis estéreis ou dispersões. Para administração intravenosa, veículos adequados incluem soro fisiológico, água bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em todos os casos, a composição tem que ser estéril deve ser fluida até ao ponto em que exista a facilidade de aplicação em seringa. Deve ser estável nas condições de fabrico e armazenamento e deve ser preservada contra a acção conta-minante de microrganismos, tais como bactérias e fungos. 0 veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, e polietilenoglicol líquido, e semelhantes) , e misturas adequadas deste. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, através da utilização de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pela utilização de tensioactivos. A prevenção da acção de microrganismos pode ser alcançada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, e semelhantes. Em muitos casos, pode ser preferível incluir agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, 59 ΡΕ1397492 tais como manitol, sorbitol, cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injectáveis pode ser realizada incluindo na composição um agente que retarda a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

Composições orais, de um modo geral, incluem um diluente inerte ou um veículo comestível. Por exemplo, elas podem ser inseridas em cápsulas de gelatina ou comprimidas em comprimidos. Para o objectivo da administração terapêutica oral, os pró-péptidos de GDF podem ser incorporados com excipientes e utilizados na forma de comprimidos, pastilhas, ou cápsulas. Agentes de ligação farmaceuti-camente compatíveis, e/ou materiais adjuvantes podem ser incluídos como parte da composição. Os comprimidos, pílulas, cápsulas, pastilhas, e semelhantes podem conter qualquer um dos seguintes ingredientes, ou compostos de uma natureza semelhante; um ligando, tal como celulose micro-cristalina, goma tragacanto ou gelatina; um excipiente, tal como amido ou lactose, um agente desintegrante, tal como ácido algínico, Primogel, ou amido de milho; um lubrificante, tal como estearato de magnésio ou Sterotes; um deslizante, tal como dióxido de silício coloidal; a agente adoçante, tal como sacarose ou sacarina; ou um agente aromatizante, tal como hortelã-pimenta, salicilato de metilo, ou aromatizante de laranja.

Para administração por inalação, os pró-péptidos de GDF podem ser distribuídos na forma de um spray de 60 ΡΕ1397492 aerossóis de recipiente pressurizado ou dispensador que contém um propulsor adequado, e.g., um gás, tais como dióxido de carbono, ou um nebulizador. A administração sistémica também pode ser por meio transmucosal ou transdérmico. Para a administração transmucosal ou transdérmica, são utilizados na formulação penetrantes apropriados para a barreira ser permeada. Esses penetrantes são, de um modo geral, conhecidos na técnica, e incluem, por exemplo, para a administração transmucosal, detergentes, sais biliares, e derivados do ácido fusidico. A administração transmucosal pode ser realizada através da utilização de sprays nasais ou supositórios. Para administração transdérmica, os compostos activos são formulados em unguentos, salvas, géis, ou cremes como são de um modo geral conhecidos na técnica.

Os pró-péptidos de GDF também podem ser preparados na forma de supositórios (e.g., com bases de supositório convencionais, tais como manteiga de cacau e outros glicéridos) ou enemas de retenção para distribuição rectal.

Numa forma de realização, os pró-péptido de GDF modificados são preparados com veículos que irão proteger o composto contra a eliminação rápida do corpo, tais como uma formulação de libertação controlada, incluindo implantes e sistemas de distribuição microencapsulados. Podem ser utilizados polímeros biodegradáveis tais como acetato de 61 ΡΕ1397492 etileno vinilo, polianidridos, ácido poliglicólico, colagénio, poliortoésteres, e ácido poliláctico. Métodos para a preparação dessas formulações serão óbvios para o especialista na técnica. Os materiais também podem ser obtidos comercialmente de Alza Corporation e Nova Pharmaceuticals, Inc. Suspensões lipossomais contendo os pró-péptido de GDF modificados também podem ser utilizados como veículos farmaceuticamente aceitáveis. Estes podem ser preparados de acordo com métodos conhecidos dos especialistas na técnica, por exemplo, como descrito na Patente U.S. N°. 4,522,811. É especialmente vantajoso formular composições orais ou parentéricas na forma de dosagem unitária para facilidade de administração e uniformidade da dosagem. A forma de unidade de dosagem, como aqui utilizado refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para o indivíduo a ser tratado; cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de composto activo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico requerido. A especificação para as formas unitárias de dosagem da invenção são ditadas por, e directamente dependente das características únicas do composto activo e do efeito terapêutico particular a ser alcançado, e as limitações inerentes na técnica da formulação de compostos, tal como um composto activo para o tratamento de indivíduos. A toxicidade e eficiência terapêutica desses 62 ΡΕ1397492 compostos pode ser determinada por procedimentos farmacêuticos convencionais nas culturas de células ou animais experimentais, e.g., para determinar a LD50 (a dose letal para 50% da população) e a ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população) . A proporção da dose entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o indice terapêutico e pode ser expresso como a proporção LD5o/ED5o. São preferidos os pró-péptidos de GDF que apresentam indices terapêuticos elevados.

Os resultados obtidos a partir dos ensaios de cultura de células e os estudos em animais podem ser utilizados na formulação de um intervalo de dosagem para utilização em humanos. A dosagem destes compostos está preferencialmente num intervalo de concentrações circulantes que incluem a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar neste intervalo dependendo da forma de dosagem empregue e da via de administração utilizada. Para qualquer pró-péptido GDF modificado utilizado na presente invenção, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir dos ensaios de cultura de células. A dose pode ser formulada em modelos animais para conseguir um intervalo de concentração no plasma circulante que inclui a IC5o (i.e., a concentração do pró-péptido GDF modificado teste que atinge uma inibição semi-máxima dos sintomas) como determinado em cultura de células. Os níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatografia líquida de elevado desempenho. Os efeitos de qualquer dosagem particular podem ser monitorizados através de um 63 ΡΕ1397492 bioensaio adequado. Os exemplos de bioensaios adequados incluem ensaios de replicação de DNA, ensaios com base na transcrição, ensaios de ligação proteína GDF/receptor, ensaios de cinase de creatina, ensaios com base na diferenciação de pré-adipócitos, ensaios com base na incorporação de glucose em adipócitos, e ensaios imunológicos.

Os exemplos que se seguem proporcionam formas de realização preferidas da invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Purificação de GDF-8 0 meio condicionado a partir de uma linha de células seleccionada que expressa uma proteína recombinante GDF-8 humana (GDF-8 madura + pró-péptido GDF8) foi acidificada a pH 6,5 e aplicada numa coluna de troca aniónica 80 x 50 mm POROS HQ em tandem com uma coluna de troca de catiões 80 x 50 mm POROS SP (Perseptive Biosystems) . O fluxo recuperado foi ajustado a pH 5,0 e aplicado a uma coluna de troca catiónica 75 x 20 mm POROS SP (Perseptive Biosystems) e eluído com um gradiente de NaCl. As fracções contendo o GDF-8, como indicado por electroforese em gel de poliacrilamida e dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE), foram misturadas, acidificadas com ácido trifluoroacético (TFA) a pH 2-3, depois foram adicionadas até 200 mL com 0,1% de TFA para baixar a viscosidade. A mistura foi então aplicada 64 ΡΕ1397492 numa coluna C5 250 x 21,2 mm (Phenomenex) precedida por uma coluna de guarda 60 x 21,2 mm (Phenomenex) e eluída com um gradiente TFA/CH3CN, para separar o GDF-8 maduro do pró-péptido GDF8. As fracções misturadas contendo o GDF-8 maduro foram concentradas por liofilização para remover 0 acetonitrilo e foram adicionados 20 mL de 0,1% de TFA. A amostra foi então aplicada a uma coluna C5 250 x 10 mm (Phenomenex) aquecida a 60°C para ajudar na separação. Isto foi repetido até não se conseguir mais separação. As fracções contendo GDF-8 maduro foram então misturadas e trazidas até 40% de acetonitrilo e aplicadas a uma coluna de exclusão por tamanho 600 x 21,2 BioSep S-3000 (Phenomenex) precedida por uma coluna de guarda de 60 x 21.2. As fracções contendo GDF-8 maduro purificado foram misturadas e concentradas para utilização em experiências subsequentes. Os rendimentos típicos do dímero de GDF-8 maduro foram de 0,33 mg de proteína por litro de meio condicionado.

As fracções da coluna C5 contendo o pró-péptido GDF8 foram misturadas, o acetonitrilo foi removido por evaporação, foram adicionados 20 mL de 0,1% de TFA, e a amostra foi então injectada numa coluna C5 250 x 10 mm a 60°C.Isto foi repetido até não se conseguir mais separação. As fracções contendo o pró-péptido GDF8 foram então misturadas e trazidas até 40% de acetonitrilo e aplicadas numa coluna de exclusão por tamanho 600 x 21,2 BioSep S-3000 (Phenomenex) precedida por uma coluna de guarda 60 x 21.2. As fracções contendo o pró-péptido GDF8 purificadas 65 ΡΕ1397492 foram misturadas e concentradas para utilização em experiências subsequentes. Um rendimento tipico do pró-péptido GDF8 foi 0,24 mg de proteína por litro de meio condicionado

Em SDS-PAGE, o GDF-8 maduro purificado migrou como uma banda larga a 25 kDa sob condições não desna-turantes e 13 kDa sob condições redutoras. Foi reportado um perfil de SDS-PAGE semelhante para GDF-8 de murídeo (McPherron et al. (1997) Nature 387: 83-90), e reflecte a natureza dimérica da proteína madura. O peso molecular aparente do pró-péptido GDF8 purificado foi de 38 kDa sob condições de redução e não redutoras. Isto indica que o pró-péptido GDF8 é monomérico. A diferença entre o peso molecular aparente e o peso molecular previsto do pró-péptido de GDF-8, ~ 26 kDa, pode reflectir a adição de hidrato de carbono, uma vez que a sua sequência de aminoácidos contém um potencial sítio de glicosilação ligado a N (McPherron et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94: 12457-12461). Assim, o processo acima levou à produção de dímero GDF-8 maduro purificado e activo e pró-péptido GDF8.

Exemplo 2: Características de GDF-8 Humano Recombinante Purificado

Foram misturados 50 pg de cada GDF-8 maduro purificado e pró-péptido GDF8 purificado e dialisados em 50 66 ΡΕ1397492 mM de fosfato de sódio, pH 7,0, e sujeitos a cromatografia numa coluna de exclusão por tamanho 300 x 7,8 mm BioSep S-3000 (Phenomenex). O peso molecular do complexo GDF-8 maduro/pró-péptido foi determinado a partir do tempo de eluição, utilizando padrões de peso molecular (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) sujeitos a cromatografia na mesma coluna.

Quando o pró-péptido de GDF-8 purificado foi incubado com GDF-8 maduro purificado a pH neutro, as duas proteínas pareceram complexar, como indicado pelo perfil de exclusão por tamanho. O pico primário de proteína eluído aos 12,7 minutos possuía um peso molecular estimado de 78 kDa a partir dos padrões de pesos moleculares (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) sujeitos a cromatografia na mesma coluna. O tamanho do complexo é mais consistente com um dímero do GDF-8 maduro associado com dois monómeros de pró-péptido, formando assim um complexo tetramérico.

Para confirmar esta observação, foi incubada uma preparação contendo GDF-8 maduro e pró-péptido GDF8 com ou sem 100 mM de cloridrato de 3-[3-dimetilaminopropil]-carbodiamida de 1-etilo (EDC, Pierce) durante 1 hora à temperatura ambiente, acidificada com HC1 a pH 2-3, e concentrada com um concentrador Micron-10 (Amicon) para SDS-PAGE, utilizando um gel de acrilamida a 10% tamponado com tricina. As proteínas foram visualizadas por coloração com azul de Coomassie. Foi adicionada uma banda correspondente a um peso molecular de cerca de 75 kD observada 67 ΡΕ1397492 apenas na amostra EDC e não na faixa de controlo, confirmando a presença do complexo GDF-8 maduro/pró-péptido GDF8. Isto valida o ensaio como útil para medir a actividade e concentração do dimero GDF-8 maduro purificado.

Exemplo 3: Actividade biológica In Vitro de GDF-8 Purificado

Para demonstrar a actividade de GDF-8, foi desenvolvido um ensaio de gene repórter (RGA) utilizando uma sequência do vector pGL3(CAGA)12 repórter acoplada a luciferase. A sequência CAGA foi previamente reportada como sendo uma sequência que respondia a TGF-β no promotor do gene induzido de TGF-β, PAI-1 (Dennler et al. (1998) EMBO J. 17: 3091-3100) . O vector repórter contendo 12 caixas CAGA foi preparado utilizando o plasmideo repórter básico, pGL3 (Promega Corporation, Madison, WI, USA, Cat. N° E1751) . A caixa TATA e o sitio de iniciação de transcrição do principal promotor tardio de adenovirus (-35/+10) foram inseridos entre os sítios BglII e AíndlII. Os oligonucleó-tidos contendo doze repetições das caixas CAGA AGCCAGACA foram emparelhados e clonados no sítio Xhol. A linha de células de rabdomiossarcoma humano, A204 (ATCC HTB-82), foi transfectado de modo transiente com pGL3(CAGA)i2 utilizando o reagente de transfecção FuGENE 6 (Roche Diagnostics, Indianapolis, USA, Cat. N° 1814443) . Após a transfecção, as células foram cultivadas em placas de 48 poços em meio de 68 ΡΕ1397492

McCoy 5A (Life Technologies, Rockville, Maryland, USA, Cat. N° 21500-079) suplementado com 2 mM de glutamina, 100 U/mL de estreptomicina, 100 pg/mL de penicilina e 10% de soro fetal de vitela durante 16 h. As células foram então tratadas com GDF-8, BMP-11 ou activina em meio de McCoy 5A com glutamina, estreptomicina, penicilina e 1 mg/mL de albumina de soro bovino durante 6 h a 37°C. A luciferase foi quantificada nas células tratadas utilizando o Luciferase Assay System (Promega Corporation, Madison, WI, USA, Cat. N° E1483) . Os resultados do ensaio estão ilustrados na Figura 1. Para GDF-8, os resultados estão expressos como a média +S.E. para três experiências separadas. Para MP-11 e activina, os resultados são representativos de duas experiências separadas.

Os resultados mostram que o GDF-8 activou de forma máxima a construção repórter em 10 vezes, com um ED50 de 10 ng/mL de GDF-8, indicando que o GDF-8 recombinante purificado estava biologicamente activo. O BMP-11, que é 90% idêntico ao GDF-8 ao nivel dos aminoácidos (Gamer et al. (1999) Dev. Biol. 208: 222-232 e Nakashima et al. (1999) Mech. Dev. 80: 185-189), e a activina estimularam uma resposta biológica semelhante, indicando que o ensaio do gene repórter é um ensaio adequado para detectar a actividade biológica in vitro de GDF-8, BMP-11 ou activina.

Exemplo 4: Propriedades de Ligação de GDF-8 Purificado O complexo latente de GDF-8 foi biotinilado a uma 69 ΡΕ1397492 razão de 20 moles de EZ-link Sulfo-NHS-Biotin (Pierce, Rockford, Illinois, USA, Cat. N° 21217) para 1 mole do complexo GDF-8 durante 2 horas em gelo, inactivada com 0,5% de TFA, e sujeita a cromatografia numa coluna C4 Júpiter 250 x 4.6 mm (Phenomenex) para separar a GDF-8 madura do pró-péptido GDF8. As fracções de GDF-8 biotinilada madura eluidas com um gradiente de TFA/CH3CN foram misturadas, concentradas e quantificadas por MicroBCA Protein Assay Reagent Kit (Pierce, Rockford, IL, USA, Cat. No. 23235). A quimera recombinante ActRUB-Fc (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA Cat. N° 339-RB/CF) revestiu placas de ensaio de fundo plano de 96 poços (Costar, NY, Cat. N° 3590) a 1 pg/mL em 0.,2 M de tampão de carbonato de sódio durante a noite a 4°C. As placas foram então bloqueadas com 1 mg/mL de albumina do soro bovino e lavadas seguindo o protocolo convencional de ELISA. Foram adicionadas 100 pL de aliquotas de GDF-8 biotinilado a várias concentrações à placa de ELISA bloqueada, incubadas durante 1 hora, lavadas, e a quantidade de GDF-8 ligado foi detectada através de Streptavidin-Horseradish peroxidase (SA-HRP, BD PharMingen, San Diego, CA, USA, Cat. N° 13047E) seguido pela adição de TMB (KPL, Gaithersburg, Maryland, USA, Cat. N° 50-76-04) . As medições colorimétricas foram efectuadas a 450 nM num leitor de microplacas Molecular Devices.

Como apresentado na Figura 2, o GDF-8 biotinilado ligado a ActRIIB, o receptor putativo do tipo II de GDF-8 com um ED50 de 12 ng/mL, indicando que o ensaio de ligação 70 ΡΕ1397492 a ActRII é um ensaio de ligação sensível in vitro para GDF-

Exemplo 5: Inibição de GDF-8 e BMP-ll pelo Pró-péptido GDF8

Quando GDF-8 foi pré-incubado com o pró-péptido GDF8 durante 1 hora à temperatura ambiente, a actividade biológica de GDF-8 foi reduzida. A Figura 3 apresenta a indução da actividade pGL3(CAGA)i2 repórter na ED50 para GDF-8, 10 ng/mL, na presença do pró-péptido de GDF-8. O pró-péptido GDF8 reduziu a indução de GDF-8 numa forma de resposta à dose, com um IC50 de 25 ng/mL (0,6 nM) . O pró-péptido GDF8 inibiu também a actividade biológica de BMP-ll na mesma extensão. Em contraste, a actividade de activina neste ensaio não foi afectada pelo pró-péptido GDF8, presumivelmente devido à homologia relativamente baixa entre GDF-8 e activina, em comparação com GDF-8 e BMP-ll.

Do mesmo modo, a Figura 4 mostra que a pré-incubação do pró-péptido de GDF-8 com o GDF-8 biotinilado a 5 ng/mL inibiu a ligação de GDF-8 a ActRIIB no ensaio de ligação a ActRIIB, como descrito no Exemplo 4, com uma IC5o de 0,3 nM. Em conclusão, o pró-péptido GDF8 da invenção é um potente inibidor subnanomolar da actividade de GDF-8 e BMP-ll in vitro, como medido no ensaio do gene repórter e no ensaio de ligação a ActRIIB. De acordo com o exposto, este ensaio mostra que o pró-péptido GDF8 é activo e é um potente inibidor da actividade de GDF-8 neste ensaio. 71 ΡΕ1397492

Exemplo 6: Inibição da Ligação de GDF-8 ao Receptor através Pró-péptido GDF8 0 GDF-8 foi iodinado com cloramina T como descrito por Frolik et al. (1984) J. Bíol. Chem. 259: 10995-10999 para uma actividade especifica de 100-200 pCi/pg. O GDF-8 iodinado apresentou uma actividade biológica comparável ao GDF-8 não marcado no ensaio repórter (CAGA)i2 descrito no Exemplo 3. O GDF-8 marcado com 125I foi avaliado para ligação especifica a uma linha de células de mioblasto, L6.

As células de mioblasto L6 (ATCC CRL-1458) foram cultivadas para confluência no meio Eagle modificado de Dulbecco suplementado com 10% de soro de vitela fetal inactivado pelo calor em placas gelatinizadas de 24 poços. A ligação de equilíbrio foi efectuada como descrito em Song et al. (1995) Endocrinology 136: 4293-4297, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade. Foi incubado 1 ng/mL de 125I GDF-8 (com ou sem GDF-8 não marcado) com células L6 confluentes durante 4 horas a 4o C. Após lavagem das células, o [125I] GDF-8 ligado foi extraído e quantificado com um contador gama. Os resultados são expressos como a média +S.E. de determinações em triplicado e são representativos de três experiências separadas.

Como apresentado na Figura 5, o 125I-GDF-8 ligado a células L6 com elevada afinidade. Nomeadamente, BMP-11, 72 ΡΕ1397492 η ο c mas não TGF-βΙ, deslocou a ligação de I-GDF-8, indicando que GDF-8 e BMP-11 (mas não TGF-βΙ) partilham um receptor comum nestas células (dados não apresentados). A partir de uma análise Scatchard da ligação de GDF-8, a Kd foi estimada como sendo 140 pM. Além disso, quando 1 pg/mL de 125I-GDF-8 foi pré-incubada com pró-péptido GDF8 durante 1 hora à temperatura ambiente, a ligação especifica de GDF-8 às células L6 pode ser inibida com concentrações crescentes de pró-péptido GDF8 não marcado (Figura 6) . Os resultados são expressos como a média +S.E. de determinações em triplicado e são representativos de três experiências separadas. A IC50 para 1 ng/mL de GDF-8 foi 140 ng/ml de pró-péptido GDF8. Como evidenciado por estes dados, o pró-péptido GDF8 inibe a actividade biológica de GDF-8 através do bloqueio da ligação de GDF-8 ao receptor.

Exemplo 7: Inibição da Actividade de GDF-8 através de proteínas de Fusão Pró-péptido GDFÕ-Fc

Como apresentado no Exemplo 8 a seguir, o pró-péptido GDF8 de murídeo possui um tempo de meia vida in vivo relativamente curto. Para aumentar a biodisponibi-lidade do pró-péptido GDF8, as fusões entre o pró-péptido GDF8 e a região Fc de IgG2a de murídeo foram construídas utilizando técnicas de engenharia genética convencionais.

Foram introduzidas quatro mutações na região Fc para reduzir a função efectora, como descrito em Steurer et al. (1995) J. Immunol. 155: 1165-1174. Utilizando metodolo- 73 ΡΕ1397492 gias convencionais de PCR, foram preparadas duas construções de fusão através da fusão de um cDNA codificando um pró-péptido GDF8 de murideo (aminoácidos 1-267) para a região Fc de IgG2a de murideo (Figura 7). A fusão 1 (Figura 7A) codifica os primeiros 265 aminoácidos do pró-péptido GDF8 de murideo (incluindo um lider secretor de 24 aminoácidos) fundidos em fase com 233 aminoácidos da região Fc de IgG2a de murideo com inicio no primeiro aminoácido na secção de charneira. A fusão 2 (Figura 7B) é construída de forma semelhante à Fusão 1, excepto que um ligante curto glicina-serina-glicina-serina (GSGS) separa o pró-péptido GDF8 da região Fc de murideo.

As duas quimeras foram introduzidas num vector de expressão eucariótica, pED (Kaufman et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4485-4490) e expressas de forma transiente em células COS-1 M6 (Horowitz et al. (1983) Journal of Molecular and Applied Genetics 2: 147-159), utilizando o reagente de transfecção Lipofectamina 2000 (Gibco BRL, Life Technologies, Rockville, Maryland, USA, Cat. N° 11668-019) de acordo com o protocolo do fabricante. Após 24 horas de incubação, foi adicionado R1CD1 (um meio de cultura modificado DMEM/F12 isento de soro). O meio condicionado (CM) foi misturado, foi substituído por R1CD1 fresco, e o CM foi de novo recolhido 60 horas depois. O meio condicionado foi então misturado em Protein A Sepharose CL-4B (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, HP7 9NA, Inglaterra, Cat. N° 17-07080-01) após adição de 1/10 do volume de 1 M de Tris, pH 8,0. A proteína purificada foi 74 ΡΕ1397492 eluída em 0,1 M de ácido acético, 150 mM de NaCl e imediatamente neutralizado com 1/20 do volume de 3 M de Tris, pH 9,0. As proteínas foram quantificadas utilizando um protocolo convencional de ELISA de IgG de murideo, e ensaiadas na ELISA de competição de ActRIIB com um pró-péptido GDF8 purificado humano, como descrito no Exemplo 5. Os resultados são apresentados na Figura 8. As IC5o das fusões do pró-péptido GDF8-Fc situam-se no intervalo nanomolar baixo e não existe diferença entre a fusão 1 e 2. A fusão 1 (sem ligando pró-péptido GDF8 e IgG2a de murideo) foi seleccionada para utilização na preparação de um linha de células CHO estável, e testada para a inibição de GDF-8 no ensaio RGA. O cDNA do pró-péptido GDF8-FC foi subclonado no plasmideo de expressão em CHO pHTop e transfectado em células CHO/A2, como descrito em Thies et al. (2001) Growth Factors 18: 251-259, que é incorporado na sua totalidade por referência. Uma linha de células estável (PF-4/0.02) foi estabelecida através da selecção de células em 0,02 M de metotrexato. O meio condicionado contendo a proteína de fusão pró-péptido GDF8-Fc de uma linha seleccionada foi recolhida e o seu pH foi ajustado por adição de 10% v/v de 1 M de Tris, pH 8,0 e purificado em Pharmacia rProteinA Sepharose Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, HP7 9NA, Inglaterra, Cat. N° 17-1279-02) previamente equilibrada com 50 mM de Tris, 150 mM NaCl, pH 7,5. As fracções foram eluídas com 100 mM de Ácido Acético, 150 mM de NaCl, pH 2,5 e imediatamente neutralizado por 75 ΡΕ1397492 adição de 5% v/v de 3 M de Tris, pH 9,0. As fracções do pico foram misturadas e aplicadas numa Coluna de Exclusão por Tamanho Pharmacia Superdex 200 (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, HP7 9NA, Inglaterra, Cat. No. 17-1069-01). Foi adicionado 0,05% de Tween 80 às fracções para evitar a agregação. As fracções foram por SDS-PAGE em géis Novex 10% Tricina (Novex, San Diego, CA, USA, Cat. N° EC66755).

As fracções misturadas foram quantificadas por espectrofotometria e ensaiadas quanto à actividade no ensaio de ligação a ActRIIB, como descrito em Exemplo 4, assim como no ensaio do gene repórter (Figura 9). A IC50 da fusão pró-péptido GDF8-Fc foi 1,3 nM. Os dados mostram que o pró-péptido GDF modificado da invenção, compreendendo a proteína de fusão pró-péptido de GDF-8-Fc reteve a potente actividade inibidora (neutralizante) em comparação com o pró-péptido GDF8.

Exemplo 8: Farmacocinética A farmacocinética (PK) do pró-péptido de GDF-8 (aqui referido como "GDF8-Pro") e proteína de fusão pró-péptido de GDF-8-Fc (aqui referido como "GDF8-ProFc") foi avaliada em ratinhos C57B1/6J a uma dose de 0,2 pg/ratinho (GDF8-Pro) ou 2 pg/ratinho (GDF8-ProFc) após uma única administração intravenosa. Os animais receberam uma mistura i o c de GDF8-Pro ou GDF8-ProFc não marcadas e marcadas com I nas doses listadas acima e as concentrações de soro foram no soro e a 125

determinadas com base na radioactividade I 76 ΡΕ1397492 actividade específica da dose injectada. A Figura 10 apresenta a concentração de soro versus as curvas de tempo para a GDF8-Pro e GDF8-ProFc. A tabela 1 apresenta os parâmetros de PK para GDF8-Pro e GDF8-ProFc após uma única administração intravenosa de 2 pg/ratinho. As concentrações de soro e parâmetros de PK para a GDF8-Pro são normalizadas para uma dose de 2 pg/ratinho para efeitos comparativos.

Tabela 1 T . (hrs) Cmax (ng/mL) Eliminação (mL/hr) MRT (hrs) VI (mL) Vss (mL) GDF8 ProFc GDF-8-Pro 232 2,2 1392 390 0,03 12, 4 286 2,3 1,4 5,1 8,7 28,3 T.: tempo de meia vida durante a fase terminal de eliminação. Cmax : pico de concentração de soro MRT: tempo médio de residência VI: volume de distribuição inicial Vss: volume de distribuição no estado estacionário Nota: parâmetros de PK de GDF8-pg/ratinho. Pro PK normalizados para uma dose de 2

Como pode ser observado na Figura 10, a eliminação é 400 vezes mais lenta, e o tempo de meia-vida é 100 vezes superior para a GDF8-ProFc em comparação com GDF8-Pro. O volume inicial de distribuição e o volume de distribuição no estado estacionário são aproximadamente 3-vezes superiores para a GDF8-Pro em comparação com o de GDF8-ProFc, indicando que a GDF8-Pro se distribui numa grande extensão para além do espaço vascular em comparação com a GDF8-ProFc. 77 ΡΕ1397492

Embora o efeito estabilizador da região Fc de uma molécula de IgG num pró-peptido GDF seja exemplificado utilizando a proteína de fusão pró-péptido GDF de ratinho-Fc (i.e., ambos os componentes derivados de ratinho), os métodos da presente invenção podem ser aplicados a qualquer combinação do pró-péptido GDF e componentes IgG, apesar da proteína precursora particular ou a espécie animal a partir da qual os componentes adequadamente construída para reter actividade (i.e., como aqui descrito).

Exemplo 9: Derivação e Actividade de duas fusões Pró-péptidos GDF-8 humanos Fc

Foram preparadas duas construções de fusão pró-péptidos GDF-8-Fc, utilizando a metodologia de PCR convencional, para avaliação do potencial terapêutico. Um cDNA que codifica o pró-péptido de GDF-8 humano (SEQ ID NO: 5) foi fundido com a região Fc de IgGl humana (SEQ ID NO: 15; Figura 11A) ou Fc de IgGl humana modificada para reduzir a função efectora (SEQ ID NO: 16; Figura 11B). 1. Proteína de fusão pró-péptido GDF8 Humano-IgGl-Fc do tipo selvagem (Figura 11A):

Os primeiros 264 aminoácidos do pró-péptido GDF8 humano (incluindo os aminoácidos 1-241 de SEQ ID NO:5 e o péptido sinal de 23 aminoácidos como apresentado em SEQ ID NO: 13) foram fundidos em fase com os 232 aminoácidos da região constante da IgGl humana, com início no primeiro aminoácido na região de charneira (SEQ ID NO: 15). 78 ΡΕ1397492 2. Pró-péptido GDF8 humano-IgGl mutante (Figura 11B):

Os primeiros 264 aminoácidos do Pró-péptido GDF8 humano, como acima descrito, foram fundidos em fase com os 227 aminoácidos de uma região Fc de IgGl humana com mutação (SEQ ID N0:16). Duas mutações, de residuos de alanina (Ala-14 e Ala-17) como apresentado em SEQ ID NO: 16, foram to em Lund et al. (1991) J. Immun. 147:2657-2662 e Morgan et al. (1995) Immunology 86: 319-324.

As duas proteínas de fusão foram introduzidas num vector de expressão eucariótico, pED (Kaufman et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4485-4490) e expresso de modo transiente em células COS-1 M6 (Horowitz et al. (1983) Journal of Molecular and Applied Genetics 2: 147-159), utilizando o reagente de transfecção Lipofectamina 2000 (Gibco BRL, Life Technologies, Rockville, Maryland, USA, Cat. No.11668-019) de acordo com o protocolo do fabricante. Após 24 horas de incubação, foi adicionado Rl CD 1 (um meio de cultura DMEM/F12 isento de soro modificado). O meio condicionado foi misturado (CM), foi substituído R1CD1 fresco, e foi de novo recolhido CM 60 horas depois. Foi então misturado o meio condicionado e purificado por Protein A Sepharose CL-4B (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, HP7 9NA, Inglaterra, Cat. No. 17-07080-01) após adição de 1/10 do volume de 1 M de Tris pH 8,0. a proteína purificada foi eluída em ácido acético 0,1 M, 150 mM de NaCl e imediatamente neutralizada com 1/20 do volume de 3 M de Tris pH 9,0. As proteínas foram quantificadas 79 ΡΕ1397492 utilizando um protocolo de ELISA de IgG humana convencional, e ensaiada no ensaio de ligação a ActRIIB em conjunto com o pró-péptido GDF8, purificado humano, como descrito no Exemplo 5. Os resultados são apresentados na Figura 12. Em conclusão, as proteínas de fusão pró-péptido humano-Fc são inibidores potentes da ligação de GDF-8 a ActRIIB.

Exemplo 10: Teste in vivo da proteína de fusão pró-péptido de GDF-8-Fc A proteína de fusão pró-péptido GDF8 de muríneo-Fc (a partir do Exemplo 9) foi testada em ratinhos adultos. Murganhos BALB/c fêmeas, de sete a nove semanas de idade, adultos, foram aleatorizados no que respeita ao peso corporal e colocados em grupos de sete (excepto para o grupo de tratamento, que tinha seis ratinhos). Os ratinhos foram doseados duas vezes por semana por injecção I.P. com uma dose total semanal de 10 pg, 100 pg, ou 1000 pg por animal durante cinco semanas. As injecções controlo foram IgG2a de murídeos-Fc a um equivalente molar à elevada dose pró-péptido-Fc. No final do estudo, foram removidos e pesados os gastrocnemius, quadrícepes, gordura epididímica da pata, rim, e fígado. A Figura 13 apresenta a massa média de tecido, com as barras de erro indicando o erro padrão da média. O asterisco (*) indica uma diferença estatisticamente significativa (p<0,01 utilizando um teste T de student) em comparação com os ratinhos tratados com a proteína controlo, IgG2aFc. O bloqueio da actividade de GDF-8 in vivo por injecção I.P. da proteína de fusão do 80 ΡΕ1397492 pró-péptido de GDF-8-Fc a 1 mg/semana (ratinhos tratados) resultou num aumento de 6,2% nos gastrocnemius e um aumento de 11,3% na massa do músculo quadricepe em comparação com os ratinhos controlo que não receberam a proteina de fusão pró-péptido GDF8-Fc. Adicionalmente, o bloqueio da actividade de GDF-8 in vivo por injecção I.P. da proteina de fusão do pró-péptido de GDF-8-Fc a 100 pg/semana (ratinhos tratados) resulta no aumento de 23,0% na massa de gordura da almofada da pata. O tratamento de dose elevada (1 mg/semana) levou também a uma diminuição na massa gorda da pata, mas devido à variabilidade na gordura da almofada da pata, a diferença não foi amplamente estatisticamente significativa (p=0,047). Não se verificou efeito do tratamento na massa de outros tecidos testados, incluindo o fígado e rim. Em resumo, o pró-péptido GDF8 modificado bloqueou a actividade de GDF-8 in vivo e levou a um aumento na massa muscular e uma diminuição na massa de gordura. Em resumo, o bloqueio da actividade de GDF-8 in vivo por injecção I.P. da proteína de fusão pró-péptido de GDF-8-Fc (ratinho tratado) resultou numa massa muscular de gastrocnemius e quadricepe aumentada em comparação com os ratinhos controlo que não receberam a proteína de fusão pró-péptido de GDF-8-Fc.

Equivalentes

Os especialistas na técnica reconhecerão, ou serão capazes de certificar não utilizando mais do que a experimentação de rotina, muitas equivalentes às formas de realização específicas da invenção aqui descrita. ΡΕ1397492 81

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> American Home Products Corporation <120> Pró-péptidos de GDF Modificados e estabilizados e Suas Utilizações <130> 01997.002000 <140> Ainda não atribuído <141> 2001-02-07 <150> US 60/267,509 <151> 2001-02-08 <160 > 16 <170> Patentln version 3.1

<210> 1 <211> 375 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0 > 1

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Lisboa, 1 de Junho de 2007

Claims (39)

1 ΡΕ1397492 REIVINDICAÇÕES 1. Pró-péptido de GDF-8 modificado compreendendo uma sequência de aminoácidos que possui uma mutação que modifica a sequência de aminoácidos no resíduo correspondente à posição 76 da SEQ ID NO: 5, em que o pró-péptido de GDF-8 modificado possui um tempo de meia vida aumentado in vivo ou in vitro em relação a um pró-péptido de GDF-8 correspondente não modificado.

2. Pró-péptido de GDF-8 modificado da reivindicação 1, em que a sequência de aminoácidos é pelo menos 75% idêntica à SEQ ID NO: 5 ou um seu fragmento que é capaz de inibir uma actividade de GDF-8 em que o referido fragmento compreende uma mutação que modifica a sequência de aminoácidos no resíduo correspondente à posição 76 da SEQ ID NO: 5.

3. Pró-péptido de GDF-8 modificado da reivindicação 1, em que a sequência de aminoácidos é pelo menos 75% idêntica à SEQ ID NO: 5.

4. Pró-péptido de GDF-8 modificado de qualquer uma das reivindicações 1-3, em que o pró-péptido de GDF-8 modificado compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 ou um seu fragmento que é capaz de inibir uma actividade de GDF-8, excepto que a sequência de aminoácidos ou fragmento possui uma mutação no resíduo correspondente à posição 76 de SEQ ID NO: 5. 2 ΡΕ1397492

5. Pró-péptido de GDF-8 modificado da reivindicação 4, em que o pró-péptido de GDF-8 modificado compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, excepto que possui uma mutação no resíduo correspondente à posição 76 de SEQ ID NO: 5.

6. Pró-péptido de GDF-8 modificado de qualquer uma das reivindicações 1-5, em que a mutação que modifica a sequência de aminoácidos no resíduo correspondente à posição 7 6 de SEQ ID NO: 5 é seleccionada a partir de uma mutação por substituição, deleção, e inserção.

7. Pró-péptido de GDF-8 modificado da reivindicação 6, em que o resíduo correspondente à posição 76 de SEQ ID NO: 5 é alanina.

8. Pró-péptido modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que é inactivado um sítio de clivagem proteolítica através de uma mutação no referido sítio.

9. Pró-péptido modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que o pró-péptido modificado compreende ainda uma porção estabilizadora fundida com o pró-péptido.

10. Pró-péptido modificado da reivindicação 9, em que a porção estabilizadora compreende uma região Fc de uma molécula IgG. 3 ΡΕ1397492

11. Pró-péptido modificado da reivindicação 10, em que a molécula IgG compreende uma região Fc de IgGl ou de IgG4.

12. Pró-péptido modificado da reivindicação 10, em que a molécula IgG é IgGl ou IgG4.

13. Pró-péptido modificado da reivindicação 10, em que a sequência de aminoácidos da molécula IgG é pelo menos 75% idêntica à SEQ ID NO: 15.

14. Pró-péptido modificado da reivindicação 10, em que a sequência de aminoácidos da molécula IgG é SEQ ID NO: 15.

15. Pró-péptido modificado da reivindicação 10, em que a sequência de aminoácidos da molécula IgG é pelo menos 75% idêntica à SEQ ID NO: 16.

16. Pró-péptido modificado da reivindicação 10, em que a sequência de aminoácidos da molécula IgG é SEQ ID NO: 16.

17. Pró-péptido modificado da reivindicação 10, em que o pró-péptido é fundido com a região Fc da molécula IgG através de um péptido ligante.

18. Pró-péptido modificado de acordo com qual- 4 ΡΕ1397492 quer uma das reivindicações 1 a 3, em que o pró-péptido modificado possui um sitio de glicosilação alterado.

19. Pró-péptido modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que o pró-péptido modificado compreende pelo menos uma unidade de hidrato de carbono.

20. Pró-péptido modificado da reivindicação 9, em que a porção estabilizadora compreende albumina ou um derivado de albumina.

21. Pró-péptido modificado da reivindicação 9, em que a porção estabilizadora compreende um polímero não proteico.

22. Pró-péptido modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que o pró-péptido modificado compreende ainda uma marca de purificação.

23. Molécula de ácido nucleico que codifica o pró-péptido de GDF-8 modificado de qualquer uma das reivindicações 1-22.

24. Molécula de ácido nucleico da reivindicação 23, compreendendo pelo menos 20 nucleótidos contíguos como apresentado em SEQ ID NO: 2.

25. Molécula de ácido nucleico da reivindicação 5 ΡΕ1397492 23, compreendendo pelo menos 20 nucleótidos contíguos como apresentado em SEQ ID NO: 6.

26. Molécula de ácido nucleico da reivindicação 24, compreendendo pelo menos 50 nucleótidos contíguos como apresentado em SEQ ID NO: 2.

27. Molécula de ácido nucleico da reivindicação 24, compreendendo pelo menos 50 nucleótidos contíguos como apresentado em SEQ ID NO: 6.

28. Composição farmacêutica compreendendo o pró-péptido modificado de qualquer uma das reivindicações 1 a 22 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

29. Composição farmacêutica compreendendo a molécula de ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 23 a 27 e um veículo ou vector farmaceuticamente aceitável.

30. Método de preparar um pró-péptido de GDF-8 modificado da reivindicação 1 compreendendo: (a) preparar uma molécula de cDNA que codifica o pró-péptido de GDF-8 modificado da reivindicação 1, em que o sítio de clivagem proteolítica é modificado; (b) preparar uma molécula de cDNA que codifica a região Fc de uma molécula de IgG; e (c) fundir as moléculas de cDNA dos passos (a) e (b) para produzir um pró-péptido de GDF-8 modificado.

31. Método da reivindicação 30, compreendendo 6 ΡΕ1397492 ainda preparar um oligonucleótido de cadeia dupla que codifica um péptido ligante e fundir as moléculas de cDNA dos passos (a) e (b) com a extremidade do oligonucleótido de cadeia dupla que codifica o péptido ligante.

32. Método da reivindicação 31, em que o péptido ligante compreende a sequência de aminoácidos consistindo em GSGS.

33. Célula recombinante isolada compreendendo um ácido nucleico que codifica um pró-péptido de GDF-8 modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22.

34. Célula recombinante isolada da reivindicação 33, em que o referido ácido nucleico compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma porção estabilizadora .

35. Pró-péptido modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22 para utilização como um medicamento.

36. Utilização de um pró-péptido modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22 na preparação de um medicamento para o tratamento de um ou mais estados seleccionados a partir de distúrbio muscular, distúrbio neuromuscular, distúrbio metabólico e distúrbio degenerativo do osso. 7 ΡΕ1397492

37. Utilização de um pró-péptido modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22 na preparação de um medicamento para o tratamento de um ou mais estados seleccionados a partir de esclerose amio-trófica lateral, distrofia muscular, atrofia do músculo, doença pulmonar obstrutiva congestiva, sindrome do gasto muscular, sarcopenia e caquexia.

38. Utilização de um pró-péptido modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22 na preparação de um medicamento para o tratamento de osteoporose.

39. Utilização de um pró-péptido modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22 na preparação de um medicamento para aumentar a massa muscular. Lisboa, 1 de Junho de 2007