MXPA03007063A

MXPA03007063A - Propeptidos modificados y estabilizados del gdf, y el uso de los mismos.

Info

Publication number: MXPA03007063A
Application number: MXPA03007063A
Authority: MX
Inventors: Peang Khor Soo
Original assignee: Wyeth Corp
Priority date: 2001-02-08
Filing date: 2002-02-08
Publication date: 2004-10-15
Also published as: JP5013618B2; US8710025B2; US7737116B2; JP2006001938A; US8222384B2; US7560441B2; CY1106629T1; HK1062457A1; EP1397492B1; ES2284828T3; WO2002068650B1; ZA200508954B; SG165982A1; PL372888A1; SG187989A1; NO333427B1; CA2437218A1; DE60219006D1; CA2674673A1; US20100305194A1

Abstract

Se describen propetidos modificados y estabilizados de proteinas del Factor de Diferenciacion del Crecimiento, tales como el GDF-8 y la Proteina Morfogenica de Hueso 11. Tambien se describen metodos para la preparacion y para el uso de los propeptidos modificados para prevenir o tratar desordenes en seres humanos o animales, en quienes seria terapeuticamente benefico un aumento del tejido muscular. Dichos desordenes incluyen desordenes musculares o neuromusculares (tales como la esclerosis amiotropica lateral, distrofia muscular, atrofia muscular, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, sindrome de desgaste muscular, sarcopenia o caquexia), enfermedades o desordenes metabolicos (tales como diabetes tipo 2, diabetes mellitus dependiente de insulina, hiperglicemia u obesidad), desordenes del tejido adiposo (tales como la obesidad) y desordenes degenerativos oseos (tales como la osteoporosis).

Description

PROPÉPTIDOS DE GDF MODIFICADOS Y ESTABILIZADOS, Y USOS DE LOS MISMOS Campo de la Invención Esta invención se relaciona con inhibidores de las proteínas del Factor 8 de Diferenciación del Crecimiento (GDF-8) y a métodos para su uso. Más particularmente, la invención provee propéptidos de proteínas del GDF-8, modificados y estabilizados, los cuales inhiben la actividad del GDF-8. La invención es particularmente útil para prevenir o tratar desórdenes en seres humanos o animales en los que sería terapéuticamente benéfico un aumento en el tejido del músculo esquelético. Dichos desórdenes incluyen desórdenes musculares o neuromusculares (tales como la esclerosis lateral amiotrópica, distrofia muscular, atrofia muscular, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, síndrome de emaciación muscular, sarcopenia o caquexia), enfermedades o desórdenes metabólicos (tales como diabetes tipo 2, diabetes mellitus no dependiente de insulina, hiperglicemia u obesidad), desórdenes del tejido adiposo (tales como la obesidad) y desórdenes degenerativos óseos (tales como la osteoporosis).

Antecedentes de la Invención El Factor 8 de Crecimiento y Diferenciación (GDF-8), también conocido como miostatina, es un miembro de la superfamilia de factores de crecimiento estructuralmente relacionados con el Factor beta de Crecimiento de Transformación (TGF-ß), la totalidad de los cuales poseen importantes propiedades morfogenéticas y reguladoras del crecimiento (Kingsley et al. (1994) Genes Dev. 8:133-46; Hoodless et al. (1998) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 228:235-72). El GDF-8 es un regulador negativo de la masa muscular esquelética, y existe un interés considerable en la identificación de factores que regulen su actividad biológica. Por ejemplo, el GDF-8 es altamente expresado en el músculo esquelético en desarrollo y de adulto. La nula mutación del GDF-8 en ratones transgénicos se caracteriza por una notable hipertrofia e hiperplasia del músculo esquelético (McPherron et al. (1997) Nature 387:83-90). Incrementos similares en la masa del músculo esquelético son evidentes en mutaciones que ocurren de manera natural del GDF-8 en ganado (Ashmore et al. (1994) Growth 38:501-507; Swatland and Kieffer (1994) J. Anim. Sci. 38:752-757; McPherron and Lee (1997) Proc. Nati Acad. Sel U.S.A. 94:12457-12461; y Kambadur et al. (1997) Genome Res. 7:910-915). Estudios recientes también han demostrado que la emaciación muscular asociada con infección por VIH en seres humanos, es acompañada por aumentos _en la expresión de proteína del GDF-8 (Gonzalez-Cadavid et al. (1998) PNAS 95:14938-43). Además, el GDF-8 puede regular la producción de enzimas específicas de músculo (por ejemplo, cinasa de creatina) y modular la proliferación de células mioblastos (WO 00/43781). Además de sus propiedades reguladoras del crecimiento y morfogenéticas en el músculo esquelético, el GDF-8 también puede estar involucrado en un gran número de otros procesos fisiológicos (por ejemplo, homeostasis de la glucosa), así como también en condiciones anormales tales como en el desarrollo de la diabetes tipo 2 y desórdenes del tejido adiposo, tales como la obesidad. Por ejemplo, el GDF-8 modula la diferenciación del preadipocito en adipocitos (Kim et al. (2001) B.B.R.C. 281:902-906). De manera similar que con el TGF-ß-?, -2 y -3, la proteína del GDF-8 es sintetizada como una proteína precursora que consiste en un propéptido con terminación amino y un dominio maduro con terminación carboxi (McPherron and Lee, 1997, supra) así como también como una secuencia de señal que dirige la proteína hacia el dominio extracelular y también se segmenta de la proteína. Se cree que antes de la segmentación del propéptido, la proteína precursora de GDF-8 forma un homodímero. El propéptido con terminación amino es entonces escindido del dominio maduro y el propéptido segmentado puede permanecer unido de manera no covalente al dímero del dominio maduro, inhibiendo su actividad biológica (Miyazono et al. (1998) J. Biol. Chem. 263:6407-6415; Wakefield et al. (1998) J. Biol. Chem. 263:7646-7654; y Brown et al. (1990) Growth Factors 3:35-43). Se cree que dos propéptidos del GDF-8 se unen al dímero maduro del GDF-8 (Thies et al. (2001) Growth Factors 18:251-259). Debido a esta propiedad de inactivación, se conoce al propéptido como el "péptido asociado con la latencia" (LAP), y el complejo del dominio maduro y el propéptido generalmente se refieren como el "pequeño complejo latente" (Gentry and Nash (1990) Biochemistry 29:6851-6857; Derynck et al. (1995) Nature 316:701-705; y Massague (1990) Am. Rev. Cell. Biol. 12:597-641). Se cree que el dominio maduro es activo como un homodímero cuando se retira el propéptido. También se conoce que otras proteínas se unen al GDF-8 o a proteínas estructuralmente relacionadas e inhiben su actividad biológica. Dichas proteínas inhibidoras incluyen a la folistatina (Gamer et al. (1999) Dev. Biol. 208:222-232) y a proteínas relacionadas con la folistatina. Adicionalmente, un gran número de desórdenes en seres humanos y animales están asociados con la pérdida de o con tejido muscular firncionalmente dañado, incluyendo la distrofia muscular, atrofia muscular, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, síndrome de emaciación muscular, sarcopenia, y caquexia. Hasta la fecha, existen muy pocas terapias confiables y efectivas para estos desórdenes. Los terribles síntomas asociados con estos desórdenes podrían ser reducidos de manera importante mediante el empleo de terapias que aumenten la cantidad de tejido muscular en pacientes que padecen de estos desórdenes. Tales terapias mejorarían de manera importante la calidad de vida de estos pacientes y podrían mejorar muchos efectos de estas enfermedades. De esta manera, existe en el estado de la técnica la necesidad de identificar nuevas terapias que contribuyan a un aumento global en el tejido muscular en pacientes que sufren de estos desórdenes. La presente invención llena esta necesidad al proveer propéptidos de GDF modificados y estabilizados o propéptidos de BMP-11 que conservan su actividad biológica y que inhiben la actividad de las proteínas del GDF. Los propéptidos modificados de la invención pueden ser utilizados para tratar desórdenes en seres humanos o animales, en los que sería terapéuticamente benéfico un aumento en el tejido muscular.

Compendio y Objetivos de la Invención El GDF-8 está involucrado en la regulación de muchos procesos biológicos críticos.

Debido a su función clave en estos procesos, el GDF-8 puede ser un objetivo deseable para la intervención terapéutica. Si bien el propéptido de GDF-8 que ocurre de manera natural puede ser un medio atractivo de modulación del GDF desde una perspectiva de eficacia y toxicidad, los presentes inventores han descubierto que la vida media circulatoria del propéptido natural puede ser demasiado corta para que la molécula tenga una utilidad terapéutica y profiláctica práctica. En consecuencia, la presente invención está fundamentada, cuando menos en parte, en el descubrimiento de que el propéptido del Factor 8 de Diferenciación del Crecimiento (GDF-8)) inhibe la actividad de la proteína del GDF-8, y que otras proteínas del Factor beta de Crecimiento de Transformación (TGF-ß) que están relacionadas en estructura al GDF-8, tales como la Proteína Morfogénetica Ósea 11 (BMP-11, también conocida como GDF-11), también son inhibidas por el propéptido de GDF-8. La presente invención, de esta manera, provee composiciones y métodos para la inhibición de proteínas de GDF, así como también para la identificación, preparación y uso de tales inhibidores. Como se anotó anteriormente, la presente invención también esta fundamentada, en parte, en el descubrimiento de que el propéptido de GDF-8 natural tiene una vida media in vivo relativamente corta, lo cual puede evitar la utilidad profiláctica o terapéutica práctica. Así, la presente invención provee propéptidos de GDF-8 modificados y propéptidos de BMP-11 modificados que tienen propiedades farmacocinéticas mejoradas, tales como una vida media circulatoria incrementada o una protección aumentada contra la degradación proteolítica. Los propéptidos de GDF-8 o los propéptidos de BMP-11 que se describen en la presente pueden ser estabilizados por cualquier medio que se conoce en la técnica. Por ejemplo, en una modalidad, el propéptido modificado es una proteína de fusión que comprende un propéptido de GDF-8 y la región Fe de una molécula de IgG. Las proteínas de fusión del propéptido de GDF-8 pueden comprender, como la subunidad activa, el propéptido de una proteína de GDF-8, o una parte activa del propéptido del GDF-8, fusionad a una región Fe de una molécula de IgG. En otras modalidades, o en adición, el propéptido de GDF-8 puede estar glucosilado, o unido a albúmina o a un polímero no proteináceo. En otras modalidades, el propéptido modificado es una proteína de fusión que comprende un propéptido de BMP-11 y la región Fe de una molécula de IgG. Las proteínas de fusión del propéptido de BMP-11 pueden comprender, como la subunidad activa, el propéptido de una pro teína de BMP-11, o una parte activa del propéptido de BMP-11, fusionado a una región Fe de una molécula de IgG. En otras modalidades, o en adición, el propéptido de BMP-11 puede estar glucosilado, o unido a albúmina o a un polímero no proteináceo. Los propéptidos modificados de GDF-8 o los propéptidos modificados de BMP-11 de la presente invención son capaces de inhibir la actividad, expresión, procesamiento, o secreción de una proteína de GDF-8, GDF-8 maduro, o un homodímero de GDF-8 u otra molécula activa de GDF-8. Los propéptidos modificados de GDF-8 o los propéptidos modificados de BMP-11 de la presente invención pueden ser administrados a un paciente, en una dosis terapéuticamente efectiva, para tratar o prevenir condiciones médicas en las que sería terapéuticamente benéfico un aumento en el tejido muscular. Las enfermedades y los desórdenes que pueden ser tratados mediante los propéptidos modificados de GDF-8 o los propéptidos modificados de BMP-11, incluyen, pero no se limitan a, desórdenes musculares o neuromusculares (tales como la esclerosis lateral amiotrópica, distrofia muscular, atrofia muscular, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, síndrome de emaciación muscular, sarcopenia o caquexia), enfermedades o desórdenes metabóficos (tales como diabetes tipo 2, diabetes mellitus no dependiente de insulina, biperglicemia u obesidad), desórdenes del tejido adiposo (tales como la obesidad) y enfermedades degenerativas óseas (tales como la osteoporosis).

Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 muestra las actividades biológicas relativas del GDF-8, BMP-11 y activina en un ensayo de gen reportero. La Figura 2 muestra las propiedades de unión de GDF-8 humano biotinilado y purificado, en un ensayo de unión de ActRUB. La Figura 3 muestra la inducción de la actividad de reportero de pGL3(CAGA)12 en el ED50 para GDF-8, BMP-11 y activina en la presencia del propéptido de GDF-8. La Figura 4 muestra la inhibición dependiente de dosis de la unión de GDF-8 biotinilado a ActRUB por el propéptido de GDF-8. La Figura 5 muestra la unión del GDF-8 a células de L6. La Figura 6 muestra la inhibición dependiente de dosis de la unión específica de GDF-8 a células de L6 por el propéptido de GDF-8. La Figura 7A muestra la secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión de propéptido de GDF-8 de murino-Fc. La Figura 7B muestra una proteína de fusión de propéptido de GDF-8 de murino-Fc con un corto ligador de glicina-serina-glicina-serina (GSGS) separando al propéptido de GDF-8 de la región Fe.

La Figura 8A muestra los efectos del propéptido de GDF-8 humano y dos proteínas de fusión de propéptido de GDF-8 de murino-Fc sobre la unión del GDF-8 en una prueba ELISA competitiva de ActRDB. La Figura 8B es una tabla de comparación de valores de IC50 de propéptido de GDF-8 humano y dos proteínas de fusión de propéptido de GDF-8 de murino-Fc. La Figura 9 muestra las actividades biológicas relativas de propéptido de GDF-8 humano y proteína de fusión de propéptido de GDF-8 de murino-Fc en un ensayo de gen reportero. La Figura 10 muestra la farmacocinética de propéptido de GDF-8 yodado y una proteína de fusión de propéptido de GDF-8-Fc después de una sola administración intravenosa de 0.2 µg ratón o 2 µ§/?????, respectivamente. La Figura HA muestra la secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión de propéptido de GDF-8 humano-Fe de IgGl. La Figura 1 IB muestra la secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión de propéptido de GDF-8 humano-Fc de IgGl modificada para función reducida de efector. La Figura 12 muestra la inhibición dependiente de dosis de la unión de GDF-8 en una prueba de ELISA competitiva de Act UB por el propéptido de GDF-8 humano y dos proteínas de fusión de propéptido de GDF-8 humano-Fc. La Figura 13 es una gráfica que muestra que el propéptido modificado de GDF-8, administrado in vivo, aumenta la masa del gastrocnemio y cuadríceps, y también disminuye la masa de grasa, pero no afecta la masa del riñon e hígado en comparación con ratones no tratados o ratones tratados con la proteína de control, IgG2aFc. Las Figuras 14A-P ilustran secuencias de aminoácidos y ácido nucleico que corresponden a las SEQ ID NO: 1 a 16, y las anotaciones que allí se hacen.

Definiciones Los términos "GDF-8", "proteína de GDF-8" o "polipéptido de GDF-8" se refieren a un factor específico de crecimiento y diferenciación que incluye, pero no se limita a aquel que se establece en la SEQ ID NO:l, y cualquiera que se conozca ahora u homólogos de estos que se describen más adelante, incluyendo homólogos de otras especies. Los que se prefieren de manera particular son los homólogos de mamífero, y los que más se prefieren son los homólogos de ser humano. La presente invención también abarca a moléculas de GDF-8 y homólogos provenientes de todas las otras fuentes, incluyendo, pero no limitándose a, GDF-8 de bovino, perro, gato, pollo, murino, rata, cerdo, ovino, pavo, mandril y pez. Diversas moléculas del GDF-8 han sido descritas en McPherron et al. (1997) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 94: 12457-12461. Se conocen bien en la técnica a los homólogos. La homología puede determinarse por cualquier método conocido en la técnica, o como se describe aquí. El GDF-8 o la proteína del GDF-8 pueden ocurrir de manera natural o en forma sintética. Estos términos incluyen a la forma precursora no procesada de longitud completa de la proteína ("proteína precursora del GDF-8"), así como también las formas maduras que resultan de la segmentación postraducción del propéptido. Los términos también se refieren a cualesquiera fragmentos o variantes del GDF-8 que mantienen una o más actividades biológicas asociadas con la proteína del GDF-8, como se describe aquí, incluyendo secuencias que han sido modificadas con cambios conservativos o no conservativos a la secuencia de aminoácidos. "GDF-8 maduro" se refiere a la proteína o polipéptido que es segmentado del dominio con terminación carboxi de la proteína precursora del GDF-8. En la SEQ ID NO:3 se proporciona una forma humana de la proteína del GDF-8 maduro. El GDF-8 maduro puede ocurrir de manera natural o en forma sintética. El GDF-8 maduro puede estar presente como un monómero, homodímero, o puede estar presente en un complejo latente de GDF-8. Dependiendo de las condiciones in vivo o in vitro, el GDF-8 maduro puede establecer un equilibrio entre cualquiera o la totalidad de estas formas diferentes. Sin limitación respecto al mecanismo, se cree que el GDF-8 maduro es biológicamente activo como un homodímero. En su forma biológicamente activa, el GDF-8 maduro también es referido como "GDF-8 activo." La frase "actividad de GDF-8" se refiere a una o más actividades fisiológicamente reguladoras del crecimiento o morfogenéticas, asociadas con la proteína del GDF-8 activo. Por ejemplo, el GDF-8 activo es un regulador negativo de la masa del músculo esquelético. El GDF-8 activo también puede modular la producción de enzimas específicas de músculo (por ejemplo, cinasa de creatina), estimular la proliferación de células mioblasto, y modular la diferenciación de los preadipocitos en adipositos. También se cree que el GDF-8 aumenta la sensibilidad a la insulina y a la absorción de glucosa en tejidos periféricos, particularmente en músculo esquelético o adipositos. En consecuencia, las actividades biológicas del GDF-8 incluyen, pero no se limitan a, la inhibición de la formación de músculo, inhibición del crecimiento de células de músculo, inhibición del desarrollo del músculo, disminución en la masa muscular, regulación de enzimas específicas de músculo, inhibición de la proliferación de células mioblasto, modulación de la diferenciación de los preadipocitos en adipositos, aumento en la sensibilidad a la insulina, regulaciones de la absorción de glucosa, hemostasis de la glucosa, y modulación del desarrollo y mantenimiento de células neuronales. En la SEQ ID NO: 1 se proporciona una forma humana de la proteína precursora del GDF-8 de longitud completa. "Propéptido de GDF-8" se refiere a un polipéptido que es segmentado del dorninio con terminación amino de la proteína precursora del GDF-8. El propéptido de GDF-8 está asociado con una o más actividades biológicas que incluyen pero no se limitan a la capacidad de unirse a proteína u homodímero de GDF-8 maduro, la capacidad de inhibir una o más actividades biológicas del GDF-8, la capacidad de mejorar el desarrollo muscular, la capacidad de mejorar la masa muscular, la capacidad de promover la formación de músculo, la capacidad de promover la proliferación de células de músculo. El propéptido de GDF-8 puede ocurrir de manera natural o puede ser sintético. Un ejemplo de un propéptido del GDF-8 incluye, pero no se limita a la forma humana del propéptido del GDF-8 que se provee en la SEQ ID NO: 5. En una modalidad, el propéptido del GDF-8 es capaz de unirse al dominio de la unión del propéptido de GDF-8 maduro. En otra modalidad, el propéptido del GDF-8 es capaz de inhibir una o más actividades de un GDF-8 maduro. El término "inhibidor de GDF-8" incluye cualquier agente capaz de inhibir la actividad, expresión, procesamiento, o secreción de una proteína de GDF-8, GDF-8 maduro, o un homodímero de GDF-8 u otra molécula activa de GDF-8 incluyendo pero no limitándose a propéptidos de GDF-8 modificados y propéptidos de BMP-11 modificados. Un inhibidor de GDF-8 también incluye cualquier agente capaz de mejorar la unión de un propéptido de GDF-8 a una molécula de GDF-8 maduro, o a un homodímero de GDF-8. Tales inhibidores incluyen pero no se limitan a proteínas, anticuerpos, péptidos, peptidorniméticos, ribozimas, oligonucleótidos anti-sentido, ARN de doble cadena, y otras pequeñas moléculas. En una modalidad, la actividad de una proteína de GDF-8 es inhibida por un propéptido de GDF-8 modificado como se describe en los Ejemplos 3 - 6. En otra modalidad, la actividad de una proteína de GDF-8 es inhibida por un propéptido de BMP-11 modificado. "Un complejo latente de GDF-8" se refiere a un complejo de proteínas formado entre un homodímero de GDF-8 maduro y un propéptido de GDF-8. Sin limitación en cuanto al mecanismo, se cree que dos propéptidos de GDF-8 se asocian con dos moléculas de GDF-8 maduro en el homodímero para formar un complejo tetramérico inactivo o latente. El complejo latente puede incluir otros inhibidores de GDF en lugar de o en adición a uno o más de los propéptidos de GDF-8. El término "propéptido de GDF-8 modificado" se refiere a un inhibidor de GDF-8 que comprende un propéptido de GDF-8 modificado, fragmento o variante de éste, el cual retiene una o más actividades biológicas de un propéptido de GDF-8 y que además comprende una modificación de estabilización como se establece aquí mismo. Las formas variantes del propéptido de GDF-8 incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, propéptidos de GDF-8 que han sido modificados para que incluyan mutaciones (incluyendo la inserción, eliminación y substitución de aminoácidos) en el péptido señal o sitios de escisión proteolítica de propéptido para hacer que estos sitios sean menos susceptibles a la segmentación proteolítica. En una modalidad preferida, el propéptido de GDF-8 modificado tiene una vida media substancialmente aumentada con relación a aquella del correspondiente propéptido de GDF-8 no modificado. En una modalidad altamente preferida, el propéptido de GDF-8 modificado de la invención tiene una vida media in vivo incrementada (según se determina, por ejemplo, por el método establecido en el Ejemplo 8). En otra modalidad, el propéptido de GDF-8 modificado es capaz de inhibir una o más actividades del GDF-8 maduro. Los términos "BMP-11", "proteína de BMP-11" o "polipéptido de BMP-11" se refieren a un factor de crecimiento y diferenciación específico que incluye pero no se limita a aquel que se establece en la SEQ ID NO: 7, y cualquier homólogo de éste que se conozca actualmente o que se descubra más tarde, incluyendo homólogos de otras especies. Los homólogos de mamífero son los que se prefieren de manera particular, más preferiblemente los homólogos de seres humanos. La presente invención también abarca moléculas de BMP-11 y homólogos provenientes de otras fuentes, incluyendo pero no limitándose a BMP-11 de bovino, perro, gato, pollo, murino, rata, cerdo, ovino, pavo, mandril y pez. Varias moléculas de la BMP-11 han sido descritas en McPherron et al. (1997) Proc. Nat. Acad. Sel USA 94: 12457-12461. Se conocen bien en la técnica a los homólogos. La homología puede determinarse por cualquier método conocido en la técmca, o como se describe aquí. La BMP-11 o la proteína de BMP-11 pueden ocurrir de manera natural o en forma sintética. Estos términos incluyen a la forma precursora sin procesar de longitud completa de la proteína ("proteína precursora de BMP-11"), así como también las formas maduras que resultan de la segmentación post-traducción del propéptido. Los témiinos también se refieren a cualesquiera fragmentos o variantes de la BMP-11 que mantengan una o más actividades biológicas asociadas con una proteína de BMP-11, como se describe aquí mismo, incluyendo secuencias que han sido modificadas con cambios conservativos o no conservativos a la secuencia de aminoácidos. "BMP- 11 madura" se refiere a la proteína o polipéptido que es segmentado del dominio con terminación carboxi de la pro teína precursora de la BMP-11. En la SEQ ID NO: 9 se proporciona una forma humana de la proteína de la BMP-11 madura. La BMP-11 madura puede ocurrir de manera natural o en forma sintética. La BMP-11 madura puede estar presente como un monómero, homodímero, o puede estar presente en un completo latente de BMP-11. Dependiendo de las condiciones in vivo o in vitro, la BMP-11 madura puede establecer un equilibrio entre cualquiera o la totalidad de estas formas diferentes. Sin limitación respecto al mecanismo, se cree que la BMP- 11 madura es biológicamente activa como un homodímero. En su forma biológicamente activa, la BMP-11 madura también es referida como "BMP-11 activa." "Propéptido de BMP- 11" se refiere a un polipéptido que es segmentado del dominio con terminación amino de la proteína precursora de la BMP-11. El propéptido de BMP-11 está asociado con una o más actividades biológicas que incluyen pero no se limitan a la capacidad de unirse a proteína u homodímero de GDF-8 maduro, la capacidad de inhibir una o más actividades biológicas de GDF-8, la capacidad de mejorar el desarrollo muscular, la capacidad de mejorar la masa muscular, la capacidad de promover la formación de músculo y la capacidad de promover la proliferación de células de músculo. El propéptido de BMP-11 puede ocurrir de manera natural o puede ser sintético. Un ejemplo de un propéptido de la BMP-11 incluye, pero no se limita a una forma humana del propéptido de la BMP-11 que se provee en la SEQ ID NO: 11. En una modalidad, el propéptido de la BMP- 11 es capaz de unirse al dominio de la unión del propéptido del GDF-8 maduro. En otra modalidad, el propéptido de BMP-11 es capaz de inhibir una o más actividades de un GDF-8 maduro. El término "propéptido de BMP-11 modificado" se refiere a un inhibidor de GDF-8 que comprende un propéptido de BMP-11 modificado, o f agmento o variante de éste, el cual retiene una o más actividades biológicas de un propéptido de BMP-11 y que además comprende una modificación de estabilización como se establece aquí mismo. Las formas variantes del propéptido de BMP-11 incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, propéptidos de BMP-11 que han sido modificados para que incluyan mutaciones (incluyendo la inserción, eliminación y substitución de aminoácidos) en el péptido señal o sitios de escisión proteolítica de propéptido para hacer que estos sitios sean más o menos susceptibles a la segmentación proteolítica. En una modalidad preferida, el inhibidor de propéptido de BMP- 11 es modificado para proveer una vida media aumentada (medida en una modalidad en el Ejemplo 8) con relación a aquella del correspondiente propéptido de BMP-11 no modificado. En otra modalidad, el propéptido de BMP-11 modificado es capaz de inhibir una o más actividades del GDF-8 maduro. Los propéptidos de GDF-8 de la invención y los propéptidos de BMP- 11 de la invención son referidos de manera colectiva como "propéptidos de GDF." Las proteínas de GDF-8 de la invención y las proteínas de BMP-11 de la invención son referidas de manera colectiva como "polipép idos de GDF" o "proteínas de GDF." Los métodos y composiciones de la invención proveen inhibidores de GDF que reducen la actividad de proteína de GDF relativa a la actividad de una proteína de GDF como se compara con la misma proteína de GDF no unida por un inhibidor. En ciertas modalidades, la actividad de una proteína de GDF, cuando es ligada por uno o más de los propéptidos de GDF modificados se reduce cuando menos aproximadamente 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% o 50%, preferiblemente cuando menos aproximadamente 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86% u 88%, más preferiblemente cuando menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93 % o 94%, y aún más preferiblemente cuando menos aproximadamente 95% a 100% con relación a la misma proteína de GDF que no es ligada por dichos propéptidos modificados. En una modalidad preferida, el inhibidor de GDF es un propéptido de GDF-8 modificado o un propéptido de BMP-11 modificado, unido en forma covalente a una región Fe de una molécula de IgG. El término "modificación de estabilización" es cualquier modificación conocida en la técnica o que se establece aquí mismo y que es capaz de estabilizar una proteína, mejorar in vitro la vida media de una proteína, mejorar la vida media circulatoria de una proteína y/o reducir la degradación proteolítica de una protema. Dichas modificaciones de estabilización incluyen pero no se limitan a proteínas de fusión (incluyendo, por ejemplo, proteínas de fusión que comprenden un propéptido de GDF y una segunda proteína), modificación de un sitio de glucosilación (incluyendo, por ejemplo, la adición de un sitio de glucosilación a un propéptido de GDF), y modificación de la fracción carbohidrato (incluyendo, por ejemplo, remoción de fracciones carbohidrato de un propéptido de GDF). En el caso de una modificación de estabilización que comprende una proteína de fusión (por ejemplo, tal que una segunda proteína está fusionada a un propéptido de GDF), la segunda proteína puede ser referida como una "porción estabilizada" o una "proteína estabilizadora." Por ejemplo, en una modalidad, un propéptido de GDF-8 de la invención comprende una fusión entre un propéptido de GDF-8 humano (con un sitio de segmentación inactivado) y una molécula de IgG (IgG la cual actúa como la proteína estabilizadora o la porción estabilizadora). Como se emplea aquí, además de referirse a una segunda proteína de una proteína de fusión, una "porción estabilizadora" también incluye modificaciones no proteináceas tales como una fracción de carbohidrato, o polímero no proteináceo. Los términos "aislado" o "purificado" se refieren a una molécula que está substanciahnente libre de su medio ambiente natural. Por ejemplo, una proteína aislada está substanciahnente libre de material celular u otras proteínas contaminantes provenientes de la célula o de la fuente de tejido de la cual se deriva. La frase "substanciahnente libre de material celular" se refiere a preparaciones en donde la proteína aislada es cuando menos 70% a 80% pura (peso/peso), más preferiblemente cuando menos 80-89% (peso/peso) pura, aún más preferiblemente 90-95% pura, y todavía más preferiblemente cuando menos 96%, 97%, 98%, 99% o 100% pura (peso/peso). El término "sitio de segmentación" se refiere a un sitio proteolítico en una proteína o polipéptido sobre el que actúa una enzima proteolítica, resultando en la escisión del enlace péptido. En una modalidad, un sitio de segmentación de la invención es "RSRR" como se representa por el código de aminoácidos de una sola letra. El término "región Fe de una molécula de IgG" se refiere al dominio Fe de una inmunoglobulina del isotipo IgG, como se conoce bien por aquellos capacitados en la técnica. La región Fe de una molécula de IgG es aquella porción de la molécula de IgG (IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4) que es responsable del aumento de la vida media en suero in vivo de la molécula de IgG. Preferiblemente, la molécula de IgG es IgGl . "Vida media in vitro" se refiere a la estabilidad de una proteína medida fuera del contexto de un organismo vivo. Las pruebas para medir la vida media in vitro se conocen bien en la técnica e mcluyen, pero no se limitan a, SDS-PAGE, ELISA, ensayos basados en célula, pulse-chase, western blotting, northern blotting, etc. Existen otros ensayos útiles que se conocen bien en la técnica. "Vida media in vivo" se refiere a la estabilidad de una proteína en un organismo. La vida media in vivo puede ser medida por un número de métodos que se conocen en la técnica y que incluyen pero no se limitan a, vida media en suero in vivo, vida media circulatoria, y los ensayos que se establecen en los ejemplos aquí mismo. "Vida media en suero in vivo" se refiere a la vida media de una proteína que circula en la sangre de un organismo. En una modalidad, la vida media in vivo se mide como se establece en el Ejemplo 8. Pueden usarse otros métodos que se conocen en la técnica para medir la vida media in vivo. El término "mamífero" incluye definiciones conocidas en la técnica y también se refieren a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo a los seres humanos y animales domésticos y de granja, así como de zoológico, de deportes o mascotas tales como perros, gatos, ovejas, cerdos, vacas, etc. En una modalidad preferida el mamífero es un ser humano. El término "superfamilia de TGF-ß" se refiere a una familia de factores de crecimiento estructuralmente relacionados, la totalidad de los cuales poseen propiedades reguladoras del crecimiento y morfogenéticas, que son fisiológicamente importantes. Esta familia de factores de crecimiento relacionados se conoce bien en la técnica (Kingsley et al. Genes Dev. 8:133-46; y Hoodless et al. (1998) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 228:235-72). La superfamilia de TGF-ß incluye Proteínas Morfogenéticas de Hueso (BMPs), Activitas, Inhibinas, Sustancia de Inhibición MuUeriana, Factor Neurotrófico Derivado de Glial, y un todavía creciente número de Factores de Crecimiento y Diferenciación (GDFs), tales como GDF-8 (miostatina). Muchas de estas proteínas están relacionadas en estructura al GDF-8, tal como la BMP-11 (también conocida como GDF-11), y/o en actividad, tal como la activina. El término "tratamiento" se refiere tanto a tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas. Aquellos que necesitan tratamiento pueden incluir a individuos que ya tienen un desorden médico particular así como también a aquellos que finalmente adquieren el desorden (esto es, aquellos de requieren de medidas preventivas). Los términos "transformación" y "transfección" se refieren a una variedad de metodologías que se reconocen en el estado de la técnica para introducir ácido nucleico extraño (esto es, ADN y ARN) en una célula hospedera, incluyendo pero no limitándose a co-precipitación de fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección y electroporación.

SEQ ID NO: NOMBRE TIPO 1 Proteína precursora del GDF-8 humano proteína 2 Proteína precursora del GDF-8 humano ADN 3 GDF-8 maduro, humano proteína 4 GDF-8 maduro, humano ADN 5 Propéptido de GDF-8 humano proteína 6 Propéptido de GDF-8 humano ADN 7 Proteína precursora de BMP-11 humana proteína 8 Proteína precursora de BMP-11 humana ADN 9 BMP-11 madura, humana proteína 10 BMP-11 madura, humana ADN 11 Propéptido de BMP-11 humano proteína 12 Propéptido de BMP-11 humano ADN 13 Secuencia señal de GDF-8 proteína 14 Secuencia señal de BMP-11 proteína 15 IgG-Fc proteína 16 IgG-Fc modificado proteína Descripción Detallada de las Modalidades Preferidas La presente invención está fundamentada, en parte, en el descubrimiento de que los propéptidos de GDF tienen una corta vida media in vivo, por medio de lo cual se reduce su efectividad como inhibidores farmacológicos de la actividad del GDF-8 o de la BMP-11. En consecuencia, en un aspecto, la invención provee un propéptido de GDF-8 o BMP- 11 modificado y estabilizado que tiene propiedades farmacocinéticas mejoradas, específicamente una vida media circulatoria incrementada. La presente invención provee novedoso propéptidos de GDF modificados que forman complejos inactivos con proteínas de GDF (por ejemplo, proteínas de GDF-8 y BMP-11) in vitro e in vivo. Los propéptidos de GDF modificados de la invención, preferiblemente se unen a un dominio de unión de propéptido en la proteína de GDF madura. En consecuencia, en ciertas modalidades de la invención, el propéptido de GDF modificado comprende una proteína de fusión entre un propéptido de GDF y una proteína estabilizadora. Una protema estabilizadora puede ser cualquier proteína que mejore la estabilidad global del propéptido de GDF modificado. Como se reconocerá por alguien capacitado en la técnica, dicha proteína de fusión puede opcionalmente comprender un péptido ligador entre la porción de propéptido y la porción de estabilización. Como se conoce bien en la técnica, las proteínas de fusión se preparan de tal forma que la segunda proteína está fusionada en marco con la primera proteína de manera tal que la proteína traducida resultante comprende tanto la primera proteína como la segunda proteína. Por ejemplo, en la presente invención, una proteína de fusión puede ser preparada de forma tal que la porción del propéptido de GDF esté fusionado a una segunda protema (por ejemplo, una porción de proteína estabilizadora). Dicha proteína de fusión se prepara de manera tal que la proteína traducida resultante contenga tanto la porción del propéptido como la porción estabilizadora. En otras modalidades, el propéptido de GDF comprende un propéptido de GDF que está modificado para que tenga vida media circulatoria mayor in vivo, en comparación con el propéptido de GDF sin modificar. Si bien no se conoce el mecanismo preciso ni los tiempos de la unión del propéptido de GDF modificado, se cree que los propéptidos de GDF-8 modificados y los propéptidos de BMP-11 modificados de la invención se unen al GDF-8 maduro y a la BMP-11 madura. En una modalidad preferida, la presente invención provee propéptidos de GDF modificados que forman complejos inactivos con proteínas de GDF-8 y BMP-11 in vivo o in vitro. En una modalidad, los propéptidos de GDF preferiblemente se unen a un dominio de unión de propéptido en la proteína del GDF-8 maduro o de la BMP-11 madura. Dicha unión puede ocurrir, por ejemplo, en seguida a la liberación de propéptido natural en el sitio de actividad del GDF-8 y la BMP-11, en seguida al desplazamiento del propéptido natural por el propéptido modificado de GDF-8 y de BMP-11, y/o en seguida a la segmentación del propéptido proveniente de la proteína precursora del GDF-8 y de la BMP-11. Independientemente del mecanismo, la unión del propéptido de GDF-8 modificado y/o del propéptido de BMP-11 modificado resulta en una reducción en una o más de las actividades biológicas asociadas con el GDF-8, con relación a proteína de GDF-8 madura que no es ligada por el mismo propéptido modificado. En una modalidad preferida, los propéptidos modificados del GDF-8 y la BMP-11 reducen la actividad del GDF-8 y la BMP-11, asociada con la regulación negativa de la masa muscular esquelética. En otra modalidad preferida, la presente invención provee propéptidos de GDF modificados que forman complejos inactivos con proteínas de BMP-11 in vivo o in vitro. En una modalidad, los propéptidos de GDF preferiblemente se unen a un dominio de unión de propéptido en la proteína madura de BMP-11. En todavía otra modalidad, el propéptido de GDF modificado es una proteína de fusión que comprende un propéptido de GDF y una región Fe de una molécula de IgG (como proteína de estabilización). Dichos inhibidores de GDF pueden comprender un propéptido de GDF (por ejemplo como se establece en las SEQ ID NO: 5 u 11) o un fragmento o variante de dicho propéptido, el cual retiene una o más actividades biológicas de un propéptido de GDF. Tales propéptidos de GDF modificados son capaces de inhibir la actividad de proteínas de GDF. Los propéptidos de GDF-8 o BMP-11 utilizados en la invención pueden ser producidos de manera sintética, derivados de propéptidos de GDF-8 o BMP-11 (naturales) que ocurren de manera natural, o pueden ser producidos de manera recombinante, utilizando cualquiera de una variedad de reactivos, células hospederas y métodos que se conocen bien en la técnica de la ingeniería genética. En una modalidad, el propéptido de GDF-8 modificado o el propéptido de BMP-11 modificado comprende un propéptido de GDF-8 humano o un propéptido de BMP-11 humano, covalentemente unido a una molécula de IgG o un fragmento de ésta. El propéptido de GDF-8 o BMP- 11 puede estar fusionado adyacente a la región Fe de la molécula de IgG, o unido a la región Fe de la molécula de IgG vía un péptido ligador. El uso de tales péptidos ligadores se conoce bien en la técnica de la bioquímica de las proteínas. En ciertas modalidades en donde los propéptidos de GDF modificados de la invención comprenden proteínas de fusión, la porción del propéptido de GDF de dicha proteína de fusión es preferiblemente cuando menos aproximadamente 75-80 idéntico a la SEQ ID NO: 5 u 11, más preferiblemente cuando menos aproximadamente 81% a 85% idéntico a la SEQ ID NO: 5 u 11, aún más preferiblemente cuando menos aproximadamente 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93% o 94% idéntico a la SEQ ID NO: 5 u 11, y todavía aún más preferiblemente cuando menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntico a la SEQ ID NO: 5 u 11. En una modalidad preferida, los propéptidos de GDF-8 o BMP-11 comprenden una secuencia idéntica a las secuencias que se presentan en SEQ ID NO: 5 u 11. En todavía otra modalidad preferida, la porción del propéptido de GDF de una proteína de fusión de la invención puede comprender un fragmento de una variante del propéptido de GDF establecido en la SEQ ID NO: 5 u 11, en tanto que el fragmento o variante retenga una o más actividades biológicas de un propéptido de GDF. En otra modalidad preferida, los propéptidos modificados de GDF-8 o BMP-11 comprenden una versión muíante de la SEQ ID NO: 5 u 11, en donde el muíante ha sido modificado para incluir una o más mutaciones (incluyendo inserción, eliminación, o substitución) en íanío que el fragmento o variante retenga una o más actividades biológicas de un propéptido de GDF. De manera crítica, en modalidades de la invención que involucran propéptidos de GDF modificados que comprenden proteínas de fusión, es esencial que la proteína de fusión sea producida o diseñada de forma íal que el sitio de segmentación proteolítica naíural (por ejemplo, RSRR) en el propéptido de GDF se rompa, destruya, inacíive o elimine en la proíeína de fusión resultaníe. Como alguien capaciíado en la íécnica lo reconocerá, la falla en la consecución de esto resultaría en que la segunda proteína (por ejemplo, la porción estabilizadora) de la proíeína de fusión se escinda de la primera proíeína (la poción del propéptido) de la proíeína de fusión. En consecuencia, un aspecto crítico de la invención prevé que para la inactivación o eliminación del sitio de segmentación natural para el propéptido de GDF cuando se utiliza dicho propéptido el preparar una proteína de fusión que sea un propéptido de GDF modificado de la invención. Los métodos para la inactivación de dicho sitio de segmentación proteolítico se conocen bien en la técnica e incluyen pero no se limitan a la mutación, eliminación o inserción de la secuencia de aminoácidos o nucleótidos del sitio de segmentación proteolítico. En todavía otras modalidades de la invención, las mutaciones pueden ser hechas en la secuencia de GDF para hacer que los sitios sean menos susceptibles a la escisión proteolítica. Por ejemplo, en una modalidad, dicho mutante puede contener una mutación puntual en los aminoácidos 45, 46, 49, 50, 52, 53, 63, 64, 65, 66, 98 o 99 de la SEQ ID NO: 1, o en los aminoácidos 122, 123, 286 o 287 de la SEQ ID NO: 7. En otra modalidad, dichas mutaciones puntuales pueden hacerse en los aminoácidos de la SEQ ID NO: 11. En una modalidad preferida, la mutación puntual es una mutación puntual en el aminoácido 99 de la SEQ ID NO: 1. En una modalidad particularmente preferida, la mutación puntual es una mutación puntual del aminoácido 99 de la SEQ ID NO: 1 de Asp a Ala. En otra modalidad preferida, dicha mutación puntual puede ser hecha en los aminoácidos de la SEQ ID NO: 11. El análisis por computadora (usando un programa que está comercialmente disponible, por ejemplo, Mac Vector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.) también puede utilizarse para identificar sitios de segmentación proteolítica. Como se reconocerá por alguien capacitado en la técnica, cualquiera de las mutaciones, variantes o modificaciones descritas pueden alternativamente ser hechas al nivel del ácido nucleico. Dichas técnicas se conocen bien en la técnica.

Tabla 2 Aminoácidos Ejemplares, Mutables, para Prevenir la Segmentación de Propéptido GDF-8 (Números de aminoácidos referidos a la SEQ ID NO: 1) Arg-45 Gln-46 Lys-49 Ser-50 Arg-52 Ile-53 Lys-63 Leu-64 Arg-65 Leu-66 Arg-98 Asp-99 BMP-11 (Números de aminoácidos referidos a la SEQ ID NO: 7) Asp-122 Ala-123 Glu-286 Leu-287 Como se anotó anteriormente, los presentes inventores han hecho el descubrimiento de que los propéptidos de GDF tienen una corta vida media in vivo. De esta manera, para que sea farmacéuticamente útil como una agente terapéutico o profiláctico, el propéptido de GDF debe ser química o físicamente estabilizado para una longevidad incrementada bajo condiciones fisiológicas. Los propéptidos de GDF pueden ser estabilizados o modificados por cualquier medio conocido en la técnica, en tanto que el propéptido modificado de GDF mantenga una capacidad de inhibir una proteína de GDF o proteína de GDF madura. En una modalidad preferida, el propéptido de GDF modificado mantiene su capacidad de unirse a su proteína de GDF blanco o un sitio de unión de propéptido de GDF. En una modalidad preferida, el propéptido de GDF modificado comprende un propéptido de GDF-8 o un propéptido de BMP-11 fusionado adyacente a o a través de un ligador, a una región Fe de una molécula de IgG. La región Fe de la IgG provee un efecto protector o estabilizador en el propéptido (y de esta manera actúa como una modificación de estabilización), como se refleja en las propiedades farmacocinéticas mejoradas (esto es, vida media en suero incrementada) de la proteína de fusión cuando se comprara con el correspondiente propéptido de GDF-8 no modificado o con el propéptido de BMP-11 no modificado.

En una modalidad particular, el propéptido de GDF-8 modificado comprende un propéptido de GDF-8 humano o un muíante de propéptido de GDF-8 humano, y la molécula de IgG es la región Fe de una IgGl, o una IgG4, o una región Fe de IgGl modificada por función de efector reducida. En una modalidad, el fragmento de IgG es IgGl (SEQ ID NO: 15). En otra modalidad, el fragmento de IgG es IgGl modificada por función de efector reducida (SEQ ID NO: 16). Ejemplos de moléculas modificadas para función de efector reducida incluyen la modificación de la fusión de IgGl humana-Fe para incluir alanina (A) en las posiciones de aminoácido 14 y 17 como se establece en la SEQ ID NO: 16. Los propéptidos modificados de GDF-8 o BMP-11 pueden ser aislados o purificados de acuerdo con procedimientos estándar de aislamiento y purificación de proteína que se conocen bien en la técnica. En otra modalidad, el propéptido modificado de GDF comprende un propéptido humano de BMP-11 o un muíante de propéptido de BMP-11 humana, y una molécula de IgG que es la región Fe de una IgGl, o una IgG4, o un fragmento de IgGl modificado para función de efector reducida. En una modalidad preferida, el estabilizador es la región Fe de IgGl humana (SEQ ID NO: 15) o la región Fe de IgGl humana modificada para función de efector reducida (SEQ ID NO: 16). El propéptido de BMP-11 puede estar fusionado adyacente a o vía un ligador, a una región Fe de una molécula de IgG, como se describe aquí mismo. La presente invención también provee métodos para preparar propéptidos de GDF modificados que tienen una vida media aumentada in vivo o in vitro. En una modalidad preferida, el método comprende la preparación de un propéptido de GDF modificado que comprende una proteína de fusión de GDF-8 Fc de IgGl o BMP-11/Fc de IgGl mediante la preparación de una molécula de ADNc que codifica para: (1) un propéptido de GDF (por ejemplo, propéptido de GDF-8 humano, SEQ ?) NO: 5), o propéptido de BMP-11 humano, SEQ ID NO: 11) el cual está modificado para inactivar el sitio de segmentación proteolítico y la región Fe de una molécula de IgG (por ejemplo, región Fe de IgGl humana, SEQ ID NO: 15); (2) expresando el ADNc en un sistema de expresión procariótico o eucariótico apropiado usando plásmidos y células de expresión apropiadas; y (3) aislando y purificando la proteína de fusión expresada que contiene el propéptido de GDF modificado, en donde el propéptido de GDF modificado tiene una vida media aumentada in vivo o in vitro como se compara con un propéptido de GDF no modificado. Un ejemplo de tal propéptido de GDF modificado de la invención se establece en la Figura 11 A. Los sistemas de expresión de ADNc se conocen bien en la técnica de la biología molecular como son los métodos para el aislamiento y purificación de las proteínas expresadas (los ejemplos 2 y 7 descritos aquí mismo, proveen ejemplos de tales modalidades). En una modalidad alterna, las construcciones de ADNc utilizadas para la expresión de dichas proteínas de fusión pueden contener nucleótidos que codifican para un péptido ligador entre los nucleótidos que codifican para el propéptido de GDF y la región Fe de IgG (o porción estabilizadora). No es importante la orientación del péptido ligador con relación al GDF o región Fe de IgG. El péptido ligador puede comprender nucleótidos que codifican para 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 o más aminoácidos de longitud. En una modalidad particular, el péptido ligador comprende nucleótidos que codifican para la secuencia de aminoácidos que consisten en glicina-serma-glicina-serina (GSGS). En otra modalidad, los plásmidos de expresión pueden contener opcionalmente etiquetas que permiten el asilamiento y purificación convenientes de las proteínas expresadas. Se conoce bien en la técnica el uso de tales plásmidos de expresión etiquetados y los métodos para el aislamiento y la purificación de los productos de proteína etiquetados.

Los propéptidos del GDF de la invención incluyen específicamente proteínas de fusión en las que la porción de la molécula del propéptido de GDF es idéntica o mayor del 60% homologa a las correspondientes secuencias de GDF provenientes de una especie particular, en tanto que la porción estabilizadora, tal como la región Fe de la molécula de IgG puede ser idéntica o mayor del 60% homologa a las correspondientes secuencias de IgG provenientes de una especie diferente. Por ejemplo, el propéptido de GDF-8 humano o fragmento de éste puede estar fusionado a una región Fe de una molécula de IgG de ratón, o viceversa, en tanto que la proteína de fusión resultante presente la actividad biológica deseada, es decir, la inhibición de la actividad biológica del GDF, como se materializa en los Ejemplos 3 - 6. En modalidades preferidas de la invención, las proteínas de fusión son quimeras de proteínas humanas. Como se comprenderá en la técnica, se preferirán en el tratamiento de seres humanos a las proteínas de fusión o quimeras de proteínas humanas. Como una alternativa o en adición a las proteínas de fusión-Fc anteriormente descritas, los propéptidos de GDF pueden ser estabilizados mediante una variedad de otros métodos y materiales fuente que se conocen bien y que están fácilmente disponibles en la técnica de las proteínas. Tales métodos y materiales incluyen, por ejemplo, glucosilación, o enlace a albúmina o un polímero no proteináceo, como se describe con detalle más adelante. Los propéptidos de GDF modificados pueden ser aislados y purificados usando técnicas estándar de aislamiento y purificación de proteínas que se conocen bien en la técnica de las proteínas. Los propéptidos de GDF o propéptidos de GDF modificados pueden ser producidos mediante una variedad de técnicas que se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, tales propéptidos pueden ser sintetizados (por ejemplo, química o recombinantemente), aisladas y purificadas, y probados en cuanto a su capacidad de formar complejos con proteína de GDF-8 madura o proteína de BMP-11 madura utilizando los métodos descritos aquí mismo o mediante métodos que se conocen en la técnica. Los propéptidos pueden ser sintetizados usando técnicas estándar de química de las proteínas tales como aquellas descritas en Boudansky, M. Principies of Peptide Síntesis, Springer Verlag, Berlín (1993) y Grant G.A. (ed.), Synthetic Peptides; A User's Guide, W. H. Freeman and Company, New York (1992), el contenido de los cuales se incorpora aquí mediante esta referencia. Además, existen sintetizadores de péptidos automatizados comercialmente disponibles (por ejemplo, Advanced ChemTech Model 396; Milligen/Biosearch 9600). Alternativamente, los propéptidos de GDF modificados o no modificados o fragmentos de éstos pueden producirse de manera recombinante usando varios sistemas de expresión (por ejemplo, E. Coli, células de Ovario de Hámster Chino, células COS, báculo virus) como se conoce bien en la técnica. Por ejemplo, el propéptido expresado de GDF-8 o BMP-11 puede ser purificado mediante, por ejemplo, el uso del método descrito en Bottinger et al. (1996) PNAS 93:5877-5882 y gentry and Nash (1990) Biochemistry 29:6851-6857, el contenido de los cuales se incorporan a la presente con esta referencia, o cualquier otro método reconocido en la técnica para la purificación de péptidos.

Alternativamente, el propéptido de GDF modificado o no modificado o fragmento de éste puede etiquetarse con, por ejemplo, FLAG o 6-His para purificación subsiguiente usando metodologías establecidas en la técnica de de las proteínas. Los propéptidos de GDF-8 o BMP-11 modificados o sin modificar además pueden ser producidos mediante digestión de GDF-8 o BMP-11 que ocurren de manera natural o que fueron producidos de manera recombinante usando, por ejemplo, una proteasa, es decir, tripsina, termolisina, quimotripsina, pepsina o enzima de conversión de aminoácido básico emparejado (PACE). Puede utilizarse en análisis por computadora (usando un programa comercialmente disponible, por ejemplo, Mac Vector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.) para identificar los sitios de segmentación proteolítica. Alternativamente, tales propéptidos de GDF pueden ser producidos a partir de GDF-8 o BMP-11 que ocurren de manera natural o que son producidos de manera recombinante, tal como mediante técnicas estándar que se conocen en la técnica, tales como mediante segmentación química (por ejemplo, bromuro de cianógeno, mdroxilamina). Las porciones del propéptido de GDF-8 o BMP-11 proteolíticos o sintéticos del propéptido de GDF modificado pueden comprender tantos residuos de aminoácido como sea necesario para unirse a la proteína de GDF blanco, inhibiendo de esta manera, parcial o completamente, la actividad del GDF-8 o de la BMP-11. Los Ejemplos 4 - 6 que aquí se presentan, ilustran modalidades de ensayos de unión e inhibición. En particular, están incluidos dentro del alcance de la invención fragmentos funcionales de secuencias de propéptido de GDF-8 y/o BMP-11 que mantienen la capacidad de modular o inhibir al GDF-8. Las porciones de propéptido de GDF-8 preferiblemente comprenden cuando menos 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 aminoácidos, más preferiblemente cuando menos 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180 o 190 aminoácidos; y más preferiblemente cuando menos 200, 210, 220, 230 o 240 o más aminoácidos de longitud. En una modalidad preferida, la porción de propéptido de GDF-8 del propéptido de GDF-8 modificado es de 243 aminoácidos de longitud, esto es, correspondiente a las SEQ ID NO: 5; y la porción de propéptido de BMP-11 del propéptido de BMP-11 es de 274 aminoácidos de longitud, esto es, correspondiente a la SEQ ID NO: 11. La secuencia señal para GDF-8 humano se establece en la SEQ ID NO: 13, e incluye los primeros 23 aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. En una modalidad, la secuencia del propéptido de BMP-11 comienza con la secuencia de aminoácidos AEGPAAA. La secuencia señal para BMP- 11 humana se establece en la SEQ ID NO: 14 e incluye los primeros 24 aminoácidos de la SEQ ID NO: 7. La identificación de una secuencia de propéptido de GDF-8 o BMP-11 parcial como un fragmento funcional de propéptido de GDF-8 o BMP-11 puede determinarse fácilmente, por ejemplo, utilizando los ensayos descritos en los Ejemplos 4-6 que se presentan aquí mismo. Además de las secuencias de propéptido truncadas, las variantes de propéptido aquí descritas incluyen de manera específica a propéptidos de GDF que tienen mutaciones puntuales u otras modificaciones (incluyendo inserción, eliminación y substitución); en tanto que tales variantes contengan una o más de las actividades biológicas o inhibidoras deseadas de un propéptido de GDF. Tal actividad puede ser medida, por ejemplo, como se describe en los Ejemplos 4-6. Tales modificaciones pueden ser introducidas dentro de la molécula para mejorar la actividad, vida media circulatoria o de almacenamiento, o la producción del propéptido de GDF-8 o BMP-11. Por ejemplo, las mutaciones puntuales pueden ser introducidas dentro de uno o más sitios de segmentación proteolítica para prevenir o inhibir la degradación proteolítica del propéptido de GDF-8 modificado, in vivo. El análisis por computadora (usando un programa que está comercialmente disponible, por ejemplo, MacVector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.) puede utilizarse para identificar sitios de segmentación proteolítica. En consecuencia, los métodos para la preparación de los propéptidos de GDF de la invención incluyen de manera específica, además de las secuencias de codificación de ADNc de tipo no cultivado, secuencias de codificación de ADNc que codifican para los propéptidos de GDF de tipo no cultivado pero que difieren en la secuencia de ADNc de la secuencia de ADNc del GDF de tipo no cultivado debido a las degeneraciones del código genético o variantes alélicas (cambios de bases que ocurren de manera natural en las poblaciones de especies que pueden o no resultar en un cambio de aminoácidos). La invención también contempla secuencias de ADN que hibridan bajo condiciones de hibridación astringentes (en una modalidad como se describe en T. Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, pp 387-389) a un ácido nucleico que codifica para un propéptido de GDF o un ácido nucleico que codifica para una proteína o un polipéptido que tiene la capacidad de unirse a una proteína de GDF particular, como se materializa en los Ejemplos 4-6. También son útiles para la presente invención variaciones en las secuencias de ADNc causadas por mutaciones puntuales o mediante modificaciones inducidas (por ejemplo, inserción, eliminación y substitución) para mejorar la actividad, vida media o producción de los propéptidos de GDF-8 o BMP-11 que se codifican mediante éstas. Los programas de computación útiles en la determinación de la homología de la secuencia de ADN se conocen en la técnica y se describen aquí mismo. La capacidad de un propéptido de GDF modificado para formar un complejo no covalente con una proteína de GDF puede ser evaluada mediante una variedad de métodos que se conocen en la técnica, incluyendo la cromatografía de exclusión por tamaño y/o análisis de reticulación, como se describe en el Ejemplo 2 que aquí mismo se presenta. Como se muestra en el Ejemplo 2, el propéptido de GDF-8 forma una asociación no covalente con proteína de GDF-8 madura. El complejo de GDF-8 maduro/propéptido de GDF-8 tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 75 kDa. Como se estableció anteriormente, en adición al método de fusión de Fe, los propéptidos de GDF pueden ser estabilizados mediante un número de otras técmcas. En una modalidad, una porción estabilizadora se liga covalentemente a una porción de propéptido de GDF para crear una proteína de fusión. Por ejemplo, el propéptido de GDF-8 puede ser ligado a uno o más de una variedad de polímeros no proteináceos, por ejemplo, polietilen glicol, propilen glicol, o polioxialquilenos, en la forma que se establece en las patentes de los Estados Unidos de América números 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 o 4,179,337, las cuales se incorporan a la presente mediante esta referencia. En ciertas modalidades, los propéptidos de GDF son químicamente modificados mediante conjugación covalente a un polímero para incrementar su vida media circulatoria. Los polímeros y los métodos preferidos para unirlos a péptidos también se describen en las patentes de los Estados Unidos de América números 4,766,106; 4,179,337; 4,495,285 y 4,609,546, las cuales se incorporan a la presente mediante esta referencia. En otra modalidad, el propéptido de GDF-8 puede ser modificado para que tenga un patrón de glucosilación alterado (esto es, alterado del patrón de glucosilación de tipo no cultivado). Como se emplea aquí, "alterado" significa que tiene una o más fracciones carbohidrato agregadas o eliminadas a/desde el propéptido de GDF de tipo no cultivado. La glucosilación de proteínas y polipéptidos es típicamente ya sea con enlace N o con enlace O. Enlace N se refiere a la unión de la fracción de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo esparraguina. Las secuencias de tripéptido esparraguina-X-serina y esparraguina-X-treonina, en donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para unión enzimática de la fracción de carbohidrato a la cadena lateral de esparraguina. De esta manera, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptido en un polipéptido crea un sitio de glucosilación potencial. Glucosilación con enlace O se refiere a la unión de uno o más azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también puede usarse la 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina. La adición o eliminación de sitios de glucosilación al propéptido de GDF se lleva a cabo de manera conveniente mediante la alteración de la secuencia de aminoácidos tal que contenga o se omita una o más de las secuencias de tripéptido anteriormente descritas (para sitios de glucosilación con enlace N). La alteración también puede ser llevada a cabo mediante la adición de, o las substitución por, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del propéptido de GDF de tipo no cultivado (para sitios de glucosilación con enlace O). Por facilidad, la secuencia de aminoácidos del propéptido de GDF preferiblemente se altera a través de cambios a nivel de ADN, cuyas metodologías se conocen bien en la técnica. Otros medios para aumentar el número de fracciones de carbohidrato en el propéptido de GDF son mediante acoplamiento químico o enzimático de glucósidos al propéptido de GDF. Estos procedimientos son ventajosos ya que estos no requieren de la producción del propéptido de GDF en una célula hospedera que tenga capacidades de glucosilación para glucosilación con unión N o unión O. Dependiendo del modo de acoplamiento utilizado, el(los) azúcar(es) puede(n) ser unido(s) a (a) argi ina e histidina; (b) grupos carboxilo libres; (c) grupos sulfhidrilo libres tales como aquellos de cisterna; (d) grupos hidroxilo libres tales como aquellos de serina, treonina o hidroxiprolina; (e) residuos aromáticos tales como aquellos de fenilalanina, tirosina o triptofan; o (f) el grupo amida de glutamina. Los métodos se describen en WO 87/05330, publicada el 11 de septiembre de 1987, así como en Aplin and Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., pp 259-306, las cuales se incorporan a la presente por esta referencia. La remoción de cualquier f acción de carbohidrato presente en el propéptido de GDF puede ser llevada a cabo de manera química o enzimática. La deglucosilación química requiere de la exposición del propéptido de GDF al compuesto de ácido trifluorometanosulfónico, o a un compuesto equivalente. Este tratamiento resulta en la segmentación de la mayoría de la totalidad de los azúcares, excepto el azúcar de unión (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), en tanto que se deja intacta la secuencia de aminoácidos. La deglucosilación química se describe por Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259:52 y por Edge et al. (1981) Anal. Biochem. 118:131. La segmentación enzimática de fracciones de carbohidrato en propéptidos de GDF puede lograrse mediante el uso de una variedad de endo- y exo-glucosidasas como se describe por Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol. 138:350. Cuando el propéptido de GDF modificado es una proteína de fusión de propéptido de GDF-Fc, como se describió anteriormente, la región Fe de la molécula de IgG también puede ser modificada para que tenga un patrón de glucosilación alterado. En otra modalidad, un propéptido de GDF es ligado a la albúmina de proteína o a un derivado de albúmina. Se conocen bien en la técnica métodos para ligar proteínas y polipéptidos a albúmina de proteína o derivados de albúmina. Ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos de América número 5,116,944 (Sivam et al.), la cual se incorpora a la presente mediante esta referencia. Se comprenderá por alguien con conocimientos regulares en la técnica que ciertos aminoácidos pueden ser substituidos por otros aminoácidos en una estructura de proteína sin afectar de manera adversa la actividad de la proteína. Se contempla por lo tanto por los inventores que pueden hacerse varios cambios en las secuencias de aminoácidos de los propéptido de GDF modificados y sin modificar, o las secuencias de ADN, sin pérdida apreciable de su utilidad o actividad biológica. En una modalidad, dicha actividad se mide en los Ejemplos 4-6. Tales cambios pueden incluir, pero no se limitan a, eliminaciones, inserciones, cortes, substituciones, fusiones y similares.. Por ejemplo, están explícitamente abarcadas por la presente invención alteraciones de las secuencias de aminoácidos en sitios de segmentación proteolítica dentro del propéptido de GDF modificado. En la realización de tales cambios, puede considerarse el índice hidropático de los aminoácidos. Generalmente se comprende en la técnica la importancia del índice hidropático de aminoácidos al conferir función biológica interactiva en una proteína (Kyte and Doolittle (1982) J Mol. Biol. 157:105-132). Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, la cual a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, substratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos y similares. A cada aminoácido se le ha sido asignado un índice hidropático sobre la base de su hidrofobicidad y características de carga (Kyte and Doolittle, 1982, supra); estos son isoleucina (+4.5), valina (+4.2), leucina (+3.8), fenilalanina (+2.8), cisteina/cistina (+2.5), metionina (+1.9), alanina (+1.8), glicina (-0.4), treonina (-0.7), serina (-0.8), triptofan (-0.9), tirosina (-1.3), prolina (-1.6), histidina (-3.2), glutamato (-3.5), glutamina (-3.5), aspartato (-3.5), esparraguina (-3.5), lisina (-3.9), y arginina (-4.5). Al hacer dichos cambios, se prefiere la substitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de +2, se prefieren de manera particular aquellos que se encuentran dentro de ±1, y todavía son de manera particular más preferibles aquellos que se encuentran dentro de ±0.5. También se comprende en la técnica que la substitución de aminoácidos similares puede ser hecha de manera efectiva sobre la base de la hidrofilidad. Por ejemplo, la patente de los Estados Unidos de América número 4,554,101 establece que la hidrofilidad promedio local más grande de una proteína, según se gobierna por la hidrofilidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con una propiedad biológica de la proteína. Como se detalla en la patente de los Estados Unidos de América número 4,554,110, los siguientes valores de hidrofihdad han sido asignados a los residuos de aminoácidos: arginina (+3.0), lisina (+3.0), aspartato (+3.0+1), glutamato (+3.0+1), serina (+3.0), esparraguina (+2.0), glutamina (+2.0), glicina (0), treonina (-0.4), prolina (-0.5±1), alanina (-0.5), histidina (-0.5), cisterna -(1.0), metionina (-1.3), valina (-1.5), leucina (-1.8), isoleucina (-1.8), tirosina (-2.3), fenilalanina (-2.5) y triptofan (-3.4).

En la realización de dichos cambios, se prefiere la substitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilidad están dentro de +2, se prefieren de manera particular aquellos que se encuentran dentro de ±1, y todavía son de manera particular más preferibles aquellos que se encuentran dentro de +0.5. Las modificaciones pueden ser conservativas de manera tal que la estructura o función biológica de la proteína no es afectada por el cambio. Dichas modificaciones de aminoácido conservativas se basan en la similitud relativa de los substituyentes de la cadena lateral de aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilidad, carga, tamaño y similares. Se conocen bien en la técnica las substituciones conservativas ejemplares que toman en consideración varias de las características precedentes, e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y esparraguina; y valina, leucina e isoleucina. La secuencia de aminoácidos de los propéptidos de GDF modificados puede ser modificada para que tenga cualquier número de cambios conservativos, en tanto que la unión del propéptido de GDF modificado a su proteína de GDF blanco no se afecte de manera adversa. De manera preferible se determina la similitud o identidad de secuencia relativa (también conocida en las técnicas de la biología molecular y de las proteínas como su homología de secuencia) utilizando los programas '¾est Fit" o "Gap" del Sequence Análisis Software Package1^ (Versión 10, Genetics Computer Group, Inc., University of Wisconsin Biotecnology Center, Madison, WI). "Gap" utiliza el algoritmo de Needleman and Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970) para encontrar el alineamiento de dos secuencias que maximiza el número de empates y reduce el número de aberturas. "Best Fit" realiza un alineamiento óptimo del mejor segmento de similitud entre dos secuencias. Los alineamientos óptimos se encuentran insertando aberturas para maxrmizar el número de empates usando el algoritmo de homología local de Smith and Waterman (Srnith and Waterman, 1981; Smith et al., 1983). El Sequence Análisis Software Package1^ descrito anteriormente contiene un número de herramientas de análisis de secuencia útiles para la identificación de homólogos de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos que se describen en la presente. Por ejemplo, el programa "BLAST" (Alschul, et al. 1990) investiga secuencias similares a una secuencia pregunta (ya sea péptido o ácido nucleico) en una base de datos específica (por ejemplo, bases de datos de secuencias mantenidas en el Nacional Center for Biotechnology Information (NCBI) en Bethesda, Maryland, E.U.A.), "FastA" (Lipman and Pearson, 1985; ver también Pearson and Lipman, 1988; Pearson, et al., 1990) realiza una búsqueda de similitudes de Pearson and Lipman entre una secuencia pregunta y un grupo de secuencias del mismo tipo (ácido nucleico o proteína); "TfastA" realiza una búsqueda de similitudes de Pearson and Lipman entre una secuencia pregunta de proteína y cualquier grupo de secuencias de nucleótidos (traduce las secuencias de nucleótidos en todos los seis marcos de lectura antes de efectuar la comparación); "FastX" realiza una búsqueda de similitudes de Pearson and Lipman entre una secuencia pregunta de nucleótidos y un grupo de secuencias de proteína, tomando en cuenta cambios de marco. "TfastX" realiza una búsqueda de similitudes de Pearson and Lipman entre una secuencia pregunta de proteína y cualquier grupo de secuencias de nucleótidos, tomando en cuenta cambios de marco (traduce ambas cadenas de la secuencia de ácido nucleico antes de realizar la comparación. Alguien capacitado en la técnica reconocerá que los propéptidos de GDF modificados o sin modificar pueden contener cualquier número de substituciones a sus secuencias de aminoácidos sin alterar sus propiedades biológicas. En una modalidad preferida, tales cambios son substituciones conservativas de aminoácidos, las cuales se conocen bien en la técnica. Se conocen bien por aquellos capacitados en la técnica de la bioquímica de las proteínas substituciones conservativas ejemplares que toman en consideración varias de las características precedentes, e incluyen, pero no se limitan a: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y esparraguina; y valina, leucina e isoleucina. En ciertas modalidades de la invención, la estabilidad in vivo de una proteína puede medirse en un gran número de formas. En una modalidad, se cosechan muestras de suero o tejido en una variedad de puntos de tiempo en seguida a la liberación de la proteína ya sea en forma intravenosa o intraperitoneal, o la proteína es radioetiquetada, esto es, con yodo-125, utilizando métodos que se conocen bien en la técnica. La cantidad de radiactividad presente en cada muestra de suero o tejido puede ser determinada utilizando un contador gamma. En otra modalidad, la integridad/estabilidad de la proteína en el suero puede evaluarse mediante SDS-PAGE seguido ya sea de autoradiografía o análisis Western blot. En otra modalidad, la actividad biológica de la proteína puede ser medida empleando cualquiera de un número de ensayos funcionales que se conocen bien en la técnica, incluyendo la prueba de ELISA, o ensayos basados en célula.

Métodos de Tratamiento de Enfermedades Los propéptidos de GDF de la presente invención son útiles para prevenir o tratar varios desórdenes médicos en seres humanos o animales. Los propéptidos de GDF preferiblemente se utilizan para inhibir o reducir una o más actividades asociadas con una proteína de GDF. En una modalidad altamente preferida, el propéptido de GDF modificado inhibe o reduce una o más de las actividades del GDF-8 maduro con relación a una proteína de GDF-8 madura que no es ligada por el mismo propéptido. En una modalidad preferida, la actividad de la proteína de GDF-8 madura, cuando es ligada por uno o más de los propéptidos de GDF modificados, se inhibe cuando menos 50%, preferiblemente cuando menos aproximadamente 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86% u 88%, más preferiblemente cuando menos 90%, 91%, 92%, 93% o 94%, y aún más preferiblemente cuando menos 95% a 100% con relación a una proteína de GDF-8 maduro que no es ligada por uno o más de los propéptidos de GDF modificados. El desorden médico que está siendo tratado o prevenido por los propéptidos de GDF modificados preferiblemente es desorden muscular o neuromuscular (tales como la esclerosis lateral amiotrópica, distrofia muscular, atrofia muscular, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, síndrome de emaciación muscular, sarcopenia o caquexia), una enfermedad metabólica (tal como diabetes tipo 2, diabetes mellitus no dependiente de insulina, hiperglicemia u obesidad), un desorden del tejido adiposo (tal como la obesidad) o enfermedad degenerativa ósea (tal como la osteoporosis). La condición médica más preferiblemente es un desorden muscular o neuromuscular, tal como la esclerosis lateral amiotrópica, distrofia muscular, atrofia muscular, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, síndrome de emaciación muscular, sarcopenia o caquexia. En otra modalidad preferida, la condición médica es una enfermedad o desorden metabólico, tal como aquel que resulta de un metabolismo disfuncional de la glucosa y/o resistencia a la insulina, tal como diabetes tipo 2, diabetes mellitus no dependiente de insulina, o desórdenes metabólicos tales como hiperglicemia u obesidad. Los propéptidos de GDF preferiblemente se emplean para prevenir o tratar tales desórdenes médicos en mamíferos, más preferiblemente en seres humanos. Los propéptidos de GDF o composiciones de propéptidos de GDF de la presente invención se administran en cantidades terapéuticamente efectivas. Como se emplea aquí, una "cantidad efectiva" del propéptido de GDF modificado es una dosis que es suficiente para reducir la actividad de proteínas de GDF para lograr una respuesta biológica deseada (por ejemplo, aumentar la masa muscular esquelética). En una modalidad, la respuesta biológica deseada puede ser cualquier beneficio terapéutico, incluyendo un aumento de la masa muscular, un aumento de la fuerza muscular, un metabolismo mejorado, una adiposidad reducida, o una homeostasis de glucosa mejorada. Tales mejoras pueden ser medidas mediante una variedad de métodos que incluyen aquellos que miden la masa de carne magra y grasa corporal (tal como análisis de barrido doble por rayos X), fuerza muscular, lípidos en suero, leptina en suero, glucosa en suero, hemoglobina glicatada, tolerancia a la glucosa, y mejoras en la complicación secundaria de diabetes. Generalmente, una cantidad terapéuticamente efectiva puede variar con la edad, peso, condición física y sexo del sujeto, así como también con la severidad de la condición médica en dicho sujeto. La dosis puede ser determinada por un médico y ajustada, según se requiera, para adaptarse a los efectos observados del tratamiento. Generalmente, las composiciones se administran de manera que los propéptidos de GDF se proporcionen en una dosis de entre 50 µg Kg y 20 mg/Kg. Preferiblemente, los propéptidos de GDF se dan como una dosis de bolo, para maximizar los niveles circulantes de los propéptidos de GDF para la longitud de tiempo más larga después de la dosis. También puede ser utilizada la infusión continua después de la dosis de bolo. La presente invención también provee métodos para prevenir o tratar enfermedades metabólicas o desórdenes que resultan de la glucohomeostasis anormal. La homeostasis normal de glucosa requiere, entre otras cosas, de la orquestación sintonizada finamente de la secreción de insulina por las células pancreáticas beta en respuesta a cambios sutiles en los niveles de glucosa en sangre. Una de las acciones fundamentales de la insulina es la de estimular la absorción de glucosa proveniente de la sangre en los tejidos, especialmente músculo y grasa.

En consecuencia, en una modalidad, la presente invención provee un método para tratar la diabetes mellitus y desórdenes relacionados, tales como la obesidad o la hiperglicemia, mediante la administración a un sujeto de un propéptido de GDF o composición de propéptido de GDF modificado en una cantidad suficiente para mejorar los síntomas de la enfermedad. La diabetes Tipo 2 o diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM), en particular, se caracteriza por una triada de (1) resistencia a la acción de la insulina en la absorción de glucosa en tejidos periféricos, especialmente músculo esquelético y adipocitos, (2) acción dañada de la insulina para inhibir la producción de glucosa hepática, y (3) secreción mal regulada de insulina (DeFronzo, (1997) Diabetes Rev. 5:177-269). Por lo tanto, los sujetos que padecen de diabetes tipo 2 pueden ser tratados de acuerdo con la presente invención mediante la administración de un propéptido de GDF modificado, lo cual aumenta la sensibilidad a la insulina y a la absorción de glucosa por parte de las células. De manera similar, pueden tratarse de acuerdo con la presente invención otras enfermedades y desórdenes metabólicos caracterizados por la disfunción de la insulina (esto es, resistencia, inactividad, o deficiencia) y/o transporte insuficiente de la glucosa hacia las células, mediante la administración de un propéptido de GDF modificado, lo cual incrementa la sensibilidad a la glucosa y la absorción de glucosa por parte de las células. El propéptido de GDF modificado o las composiciones de propéptido de GDF modificado de la presente invención se administran en cantidades terapéuticamente efectivas. Cuando se utiliza para el tratamiento de la diabetes y desórdenes relacionados, una "cantidad efectiva" del propéptido de GDF modificado es una dosis que es suficiente para reducir la actividad de proteínas de GDF para lograr uno o más resultados terapéuticos deseados, tales como, por ejemplo, un aumento en la sensibilidad a la insulina o a la absorción de glucosa por parte de las células, una disminución en la masa de grasa corporal o un cambio deseado en lípidos en suero, leptina en suero, glucosa en suero, hemoglobina glicatada, tolerancia a la glucosa, o mejoramiento en la complicación secundaria de la diabetes. Generalmente, una cantidad terapéuticamente efectiva puede variar con la edad, peso, condición física y sexo del sujeto, así como también con la severidad de la disfimción de la insulina en dicho sujeto. La dosis puede ser determinada por un médico y ajustada, según se requiera, para adaptarse a los efectos observados del tratamiento. Generalmente, las composiciones se administran de manera que los propéptidos de GDF se proporcionen en una dosis de entre 50 ug/Kg y 20 mg/Kg. Preferiblemente, los propéptidos de GDF se dan como una dosis de bolo, para maximizar los niveles circulantes de los propéptidos de GDF para la longitud de tiempo más larga después de la dosis. También puede ser utilizada la infusión continua después de la dosis de bolo. La presente invención también provee terapia génica para la producción in vivo de los propéptidos de GDF. Dicha terapia lograría su efecto terapéutico mediante la introducción de las secuencias de polinucleótidos del propéptido de GDF dentro de las células o tejidos que tienen los desórdenes de la lista anterior. La liberación de las secuencias de polinucleótidos del propéptido de GDF puede llevarse a cabo utilizando un vector de expresión recombinante tal como un virus quimérico o un sistema de dispersión coloidal. Se prefiere de manera especial para la liberación terapéutica de las secuencias de polinucleótidos del propéptido de GDF, el uso de liposomas blanco. Varios vectores virales que pueden ser utilizados para la terapia génica, como se enseña aquí mismo, incluyen adenovirus, virus de herpes, vaccinia, o, preferiblemente, un virus de A N tal como un retrovirus. Preferiblemente, el vector retroviral es un derivado de un retrovirus de murino o aviario. Los ejemplos de vectores retrovirales en los que puede insertarse un único gene extraño incluyen, pero no se limitan a: virus de leucemia de murino de Moloney (MoMuLV), virus de sarcoma de murino de Harvey (HaMuSV), virus de tumor mamario de murino (MuMTV), y Virus de Sarcoma de Rous (RSV). Una cantidad de vectores retrovirales adicionales pueden incorporar múltiples genes. La totalidad de estos vectores pueden transferir o incorporar un gene para un marcador susceptible de ser seleccionado de manera que células transductadas pueden ser identificadas y generadas mediante la inserción de una secuencia de polinucleótidos del propéptido de GDF de interés dentro del vector retroviral, conjuntamente con otro gene que codifica para el ligando para un receptor en una célula blanco específica, por ejemplo, el vector ahora es específico para el blanco. Los vectores retrovirales pueden hacerse específicos para el blanco mediante la unión, por ejemplo, de un azúcar, glucolípido, o proteína. La marcación como blanco preferida se lleva a cabo utilizando un anticuerpo. Aquellos capacitados en la técnica reconocerán que pueden insertarse secuencias específicas de polinucleótidos dentro del genoma retroviral o unidas a una envolvente viral para permitir la liberación específica de blanco del vector retroviral que contiene el polinucleótido del propéptido de GDF. En una modalidad preferida, el vector es marcado como blanco para células de músculo o tejido muscular. Puesto que los retrovirus recombinantes son defectuosos, estos requieren de líneas celulares auxiliadoras que contienen plásmidos que codifican para la totalidad de los genes estructurales del retrovirus bajo el control de secuencias reguladoras dentro del LTR. Estos plásmidos carecen de un secuencia de nucleótidos que hace posible que el mecanismo de empaque reconozca un transcripto de AR para encapsulación. Las líneas celulares auxiliadoras que tienen deleciones de la señal de empaque incluyen, pero no se limitan a, PSI.2, PA317 y PA12, por ejemplo. Estas líneas celulares producen viriones vacíos, puesto que ningún genoma está empacado. Si un vector retroviral es introducido dentro de dichas células en la que la señal de empaque está intacta, pero los genes estructurales están reemplazados con otros genes de interés, el vector puede ser empacado y el virion del vector producido. Alternativamente, otras células de cultivo de tejido pueden ser transfectadas directamente con plásmidos que codifican para genes gag, pol y env estructurales retrovirales, mediante transfección convencional de fosfato de calcio. Estas células son entonces transfectadas con plásmido vector que contiene los genes de interés. Las células resultantes liberan el vector retroviral dentro del medio de cultivo. Otro sistema de liberación marcado como blanco para el polinucleótido del propéptido de GDF es un sistema de dispersión coloidal. Los sistemas de dispersión coloidal incluyen complejos de macromoléculas, nanoc psulas, microesferas, perlas, y sistemas de base lípido que incluyen emulsiones aceite en agua, micelas, micelas mezcladas y liposomas. El sistema coloidal preferido de esta invención consiste en un liposoma. Los liposomas son vesículas de membrana artificiales que son útiles como vehículos de liberación in vitro e in vivo. Puede encapsularse ARN, ADN y viriones intactos dentro del interior acuoso y ser liberados hacia las células en una forma biológicamente activa (Ver, por ejemplo, Fraley et al., Trends Biochem. Sci. 6:77, 1981). Se conocen bien en la técnica métodos para la transferencia eficiente de genes utilizando un vehículo de liposoma, ver, por ejemplo, Mannino, et al., Biotechniques, 6:682, 1988. La composición del liposoma usualmente es una combinación de fosfolípidos, normalmente en combinación con esteroides, especialmente colesterol. También pueden usarse otros fosfolípidos u otros lípidos. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, fuerza iónica y de la presencia de cationes divalentes. Ejemplos de lípidos útiles en la producción de liposomas incluyen a los compuestos de fosfatidilo, tales como fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, esfíngolípidos, cerebrósidos y gangliósidos. Los fosfolípidos ilustrativos incluyen a la fos atidilcolina de huevo, dipalmitoilfosfatidilcolina y a la diesteroilfosfatidilcolina. La marcación como blanco de liposomas también es posible sobre la base de, por ejemplo, especificidad de órgano, especificidad de célula, y especificidad de organelo y se conoce bien en la técnica. Los métodos para el tratamiento o la prevención de las condiciones médicas antes señaladas, con los propéptidos de GDF modificados también pueden ser empleados para inhibir otras proteínas que se encuentran en la superfamilia del TGF-ß?. Muchas de estas proteínas están relacionadas en estructura con el GDF-8, tal como la BMP-11. En consecuencia, en otra modalidad, la invención provee métodos de tratamiento de los desórdenes antes mencionados mediante la administración a un sujeto de un propéptido de GDF modificado que es capaz de inhibir una proteína que no es de GDF-8, ya sea solo o en combinación con un propéptido de GDF modificado contra GDF-8.

Composiciones de Propéptido de GDF Modificado La presente invención provee composiciones que comprenden los propéptidos de GDF modificados. Tales composiciones pueden ser adecuadas para uso y administración farmacéutica a pacientes. Las composiciones típicamente comprenden uno o más de los propéptidos de GDF modificados de la presente invención y un . excipiente farmacéuticamente aceptable. Como se emplea aquí, la frase "excipiente farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifungicidas, agentes isotónicos y de retardación de la absorción, y similares, que son compatibles con la administración farmacéutica. Se conoce bien en la técnica el uso de tales medios y agentes para substancias farmacéuticamente activas. Excipiente farmacéuticamente aceptables, ejemplares, pueden encontrarse en "The handbook of Pharmaceutical Excipiente" 3rd Ed. 2000, Am. Pharmaceutical Press, A.E. Kibbe ed. Las composiciones también pueden contener otros compuestos activos que proporcionan funciones terapéuticas complementarias, adicionales o mejoradas. Las composiciones farmacéuticas también pueden estar incluidas en un contenedor, paquete o despachador conjuntamente con instrucciones para su administración. Una composición farmacéutica de la invención se formula para que sea compatible con su ruta de administración pretendida. Los métodos para llevar a cabo la administración se conocen por aquellos con conocimientos normales en la técnica. También puede ser posible obtener composiciones que puedan ser tópica u oralmente administradas, o que puedan ser capaces de transmitirse a través de membranas mucosas. La administración puede, por ejemplo, ser intravenosa (I.V.), intraperitoneal (I.P.), intramuscular (I.M.), intracavidades, subcutánea (S.C.) o transdérmica. Las modalidades preferidas incluyen inyecciones I.V., I.P., I.M. y S.C. En una modalidad preferida, las composiciones farmacéuticas de la invención se administración de forma intravenosa. Las soluciones o suspensiones utilizadas para aplicación intradérmica o subcutánea típicamente incluyen uno o más de los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijados, polietilen glicoles, glicerina, propilen glicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como el alcohol de bencilo o parabenos de metilo; antioxidantes tales como el ácido ascórbico o el bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como el ácido etilendiaminotetraacético; reguladores tales como los acetatos, citratos o fosfatos; y agentes para el ajuste de tonicidad tales como el cloruro de sodio o la dextrosa. El pH puede ser ajustado con ácidos o bases, tales como el ácido clorhídrico o el hidróxido de sodio. Tales preparaciones pueden estar encerradas en ampolletas, jeringas desechables o frascos de dosis múltiples hechos de vidrio o plástico. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para inyección incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los portadores adecuados incluyen solución salmuera fisiológica, agua bacterioestática, Cremophor ELMR (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina regulada de fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe fluir al grado de que exista un fácil manejo con la jeringa. Debe ser estable bajo condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse contra la acción de contaminación de microorganismos tales como bacterias y hongos. El portador debe ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilen glicol y polietilen glicol líquido, y similares), así como mezclas adecuadas de éstos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento tal como la lecitina, mediante la conservación del tamaño de partícula requerida en, el caso de una dispersión y mediante el uso de tensoactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede lograrse mediante varios agentes antibacterianos o anti-hongos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir en la composición agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como el manitol, sorbitol, cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede fomentarse mediante la inclusión en la composición de una agente que demore la absorción, por ejemplo, monoestearato de alurninio y gelatina. Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un portador comestible. Por ejemplo, pueden estar encerradas en cápsulas de gelatina o comprimidas en tabletas. Para propósitos de administración terapéutica oral, los propéptidos de GDF pueden estar incorporados con excipientes y utilizados en forma de tabletas, trociscos, o cápsulas. Agentes de unión farmacéuticamente compatibles y/o materiales adyuvantes pueden incluirse como parte de la composición. Las tabletas, pildoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de una naturaleza similar; un ligador tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente de desintegración tal como ácido algínico, Primogel, o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un glidant tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sucrosa o sacarina; o un agente saborizante tal como menta, salicilato de metilo o saborizante de naranja. Para la administración por inhalación, los propéptidos de GDF pueden ser liberados en forma de un rocío en aerosol desde un recipiente o despachador a presión que contenga un propelente adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono, o un nebulizador.

La administración sistémica también puede ser por medios transmucosales o transdérmicos. Para la admimstración transmucosal o transdérmica, se utilizan en la formulación agentes de penetración apropiados para que la barrera sea penetrada. Dichos agentes de penetración generalmente se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, para la adrninistración transmucosal detergentes, sales biliares y derivados del ácido fusídico. La adrninistración transmucosal puede ser llevada a cabo a través del uso de aspersiones nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en ungüentos, bálsamos, geles o cremas, como se conoce generalmente en la técnica. Los propéptidos de GDF también pueden estar preparados en forma de supositorios (por ejemplo, con bases convencionales para supositorios tales como mantequilla de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para liberación rectal. En una modalidad, los propéptidos de GDF modificados se preparan con portadores que protegerán al compuesto en contra de la eliminación rápida del cuerpo, tales como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de liberación microencapsulados. Pueden utilizarse polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como el vinil acetato de etileno, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Para aquellos capacitados en la técnica serán claros los métodos para la preparación de tales formulaciones. Los materiales también pueden obtenerse comercialmente en Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. También pueden utilizarse como portadores farmacéuticamente aceptables a las suspensiones liposomales que contengan los propéptidos de GDF modificados. Estas pueden ser preparadas de acuerdo con los métodos que se conocen por aquellos capacitados en la técnica, por ejemplo, como se describe en la patente de los Estados Unidos de América número 4,552,811. Es especialmente ventajoso el formular composiciones orales o parenterales en forma de dosis unitaria para una fácil administración y para uniformidad de la dosis. La forma de dosis unitaria, como se usa aquí, se refiere a unidades físicamente discretas que son adecuadas como dosis unitarias para el sujeto que va a ser tratado; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéuticamente requerido. La especificación para las formas de unidad de dosis de la invención están dictadas por y dependen directamente de las características únicas del compuesto activo y del efecto terapéutico particular que se va a lograr, así como de las limitaciones inherentes en la técnica de la formulación de combinados de dicho compuesto activo para el tratamiento de individuos. La toxicidad y la eficacia terapéutica de tales compuestos pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándares en cultivos de células o animales experimentales, por ejemplo, para la determinación de la LD50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población). La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación LD50/ED50. Se prefieren los propéptidos de GDF que presentan grandes índices terapéuticos. Pueden utilizarse los datos obtenidos a partir de ensayos de cultivos de células y estudios en animales, en la formulación de un intervalo de dosis para uso en seres humanos. La dosificación de tales compuestos recae preferiblemente dentro de un mtervalo de concentraciones circulatorias que incluyen la ED50 con poca o nula toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este mtervalo dependiendo de la forma de dosis empleada y de la ruta de administración utilizada. Para cualquier propéptido de GDF modificado que se utiliza en la presente invención, la dosis terapéuticamente efectiva puede ser estimada inicialmente a partir de ensayos en cultivos de células. Una dosis puede ser formulada de modelos de animal para lograr un intervalo de concentración de plasma circulatoria que incluya el IC50 (esto es, la concentración del propéptido de GDF modificado, de prueba, que logra una inhibición media-máxima de los síntomas) según se determina en un cultivo de células. Los niveles de plasma pueden ser medidos, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución. Los efectos de cualquier dosis particular pueden ser monitoreada mediante un bioensayo adecuado. Ejemplos de bioensayos adecuados incluyen ensayos de replicación de ADN, ensayos basados en la trascripción, ensayos de unión receptor/proteína de GDF, ensayos de cinasa de creatina, ensayos basados en la diferenciación de pre-adipocitos, ensayos basados en la absorción de glucosa en adipocitos, y ensayos inmunológicos.

Los siguientes ejemplos proporcionan modalidades preferidas de la invención. Alguien con conocimientos normales en la técnica reconocerá que pueden llevarse a cabo numerosas modificaciones y variantes sin alterar el espíritu o alcance de la presente invención. Se cree que tales modificaciones y variaciones están abarcadas dentro del alcance de la invención. Los ejemplos no limitan de manera alguna la invención. El contenido completo de todas las referencias, patentes y solicitudes de patente publicadas que se han sido citadas a lo largo de esta descripción se incorporan a la presente mediante esta referencia.

Ejemplos Ejemplo 1 : Purificación del GDF-8 Medio acondicionado proveniente de una línea celular seleccionada que expresa proteína de GDF-8 humano, recombinante (GDF-8 maduro + propéptido de GDF-8) se acidificó a un pH de 6.5 y se aplicó a una columna de intercambio aniónico POROS HQ de 80 x 50 mm, en tandeo, a una columna de intercambio catiónico POROS SP de 80 x 50 mm (Perseptive Biosystems). El flujo a través de éstas se ajustó a pH 5.0 y se aplicó a una columna de intercambio catiónico POROS SP de 75 x 20 mm (Perseptive Biosystems) y se eluyó con un gradiente de NaCl. Las fracciones que contenían GDF-8, como se indica por electroforesis en dodecil sulfato de sodio - gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), se acumularon, acidificaron con ácido trifluoroacético (TFA) a un pH 2-3, posteriormente se llevaron hasta 200 mi con TFA al 1% para bajar la viscosidad. El acumulado se aplicó posteriormente a una columna de C5 de 250 x 21.2 mm (Phenomenex) precedida por una columna guard de 60 x 21.2 mm (Phenomenex) y se eluyó con un gradiente de TFA/CH3CN, para separar el GDF-8 maduro del propéptido de GDF-8. Las fracciones acumuladas que contenían GDF-8 maduro se concentraron mediante liofilización para eliminar el acetonitrilo y se agregaron 20 mi de TFA al 0.1%. La muestra se aplicó entonces a una columna de C5 de 250 x 10 mm (Phenomenex) calentada a 60 °C para ayudar en la separación. Esto se repitió hasta que ya no pudo lograrse separación adicional. Las fracciones que contenían GDF-8 maduro se acumularon entonces y se llevaron a acetonitrilo al 40% y se aplicaron a una columna de exclusión por tamaño BioSep S-3000 de 600 x 21.2 (Phenomenex) precedida por una columna guard de 60 x 21.2. Las fracciones que contenían GDF-8 maduro y purificado se acumularon y se concentraron para uso en experimentos subsecuentes. Las producciones típicas del dímero de GDF-8 maduro fueron de 0.33 mg de proteína por litro de medio acondicionado. Las fracciones de la columna de C5 que contenían propéptido de GDF-8 se acumularon, se eliminó el acetonitrilo mediante evaporación, se agregaron 20 mi de TFA al 1%, y las muestras se inyectaron posteriormente sobre la columna de C5 de 250 x 10 mm a 60 °C. Esto se repitió hasta que ya no se logró separación adicional. Las fracciones que contenían propéptido de GDF-8 se acumularon entonces y se llevaron a acetonitrilo al 40% y se aplicaron a una columna de exclusión por tamaño BioSep S-3000 de 600 x 21.2 (Phenomenex) precedida por una columna guard de 60 x 21.2. Las fracciones que contenían propéptido de GDF-8 purificado se acumularon y se concentraron para uso en experimentos subsecuentes. Una producción típica del propéptido de GDF-8 fue de 0.24 mg de proteína por litro de medio acondicionado. En análisis SDS-PAGE, el GDF-8 maduro y purificado emigró tanto como una banda ancha a 25 kDa bajo condiciones no reductoras y 13 kDa bajo condiciones reductoras. Se ha reportado un perfil de SDS-PAGE similar para GDF-8 de murino (McPherron et al. (1997) Nature 387:83-90), y refleja la naturaleza dimérica de la proteína madura. El peso molecular aparente del propéptido de GDF-8 purificado era de 38 kDa bajo tanto condiciones reductoras como no reductoras. Esto indica que el propéptido de GDF-8 es monomérico. La diferencia entre el peso molecular aparente y el peso molecular pronosticado del propéptido de GDF-8, ~26 kDa, puede reflejar la adición de carbohidrato, puesto que su secuencia de aminoácidos contiene un potencial sitio de glucosilación ligado a N (McPherron et al., (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 94:12457-12461). De esta forma, el proceso anterior conduce a la producción de propéptido de GDF-8 y dímero de GDF-8 maduro, activo y purificado.

Ejemplo 2: Características de GDF-8 Humano Recombinante y Purificado Se mezclaron 50 ug de GDF-8 maduro y purificado y propéptido de GDF-8 purificado y se dializaron en fosfato de sodio 50 mM, pH 7.0, y se sometieron a cromatografía en una columna de exclusión por tamaño BioSep S-3000 de 300 x 7.8 (Phenomenex). El peso molecular del complejo de GDF-8 maduro/propéptido se determinó a partir del tiempo de elución, utilizando estándares de peso molecular (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) sometidos a cromatografía en la misma columna. Cuando el propéptido de GDF-8 purificado se incubó con GDF-8 maduro y purificado, a un pH neutro, las dos proteínas parecieron forma un complejo, como se indica por el perfil de exclusión por tamaño. El pico de proteína principal que eluyó a los 12.7 minutos tenía un peso molecular estimado de 78 kDa a partir de estándares de peso molecular (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) sometidos a cromatografía en la misma columna. El tamaño del complejo es más consistente con un dímero del GDF-8 maduro que se asocia con dos monómeros de propéptido, formando de esta manera un complejo tetramérico. Para confirmar esta observación, una preparación que contenía tanto GDF-8 maduro como propéptido de GDF-8 se incubó con o sin clorhidrato de l-etil-3-[3-dimetilaminopropiljcarbodiamida 100 mM (EDC, Pierce) durante 1 hora a temperatura ambiente, se acidificó con HC1 a un pH de 2-3, y se concentró con un concentrador Micron-10 (Amicon) para SDS-PAGE, usando un gel de archilamida al 10% regulado con tricina. Las proteínas fueron visualizadas mediante teñido con azul de Coomassie. Se observó una banda correspondiente a un peso molecular de aproximadamente 75 kDa solo en la muestra en la que se agregó EDC y no en la pista de control, confirmando la presencia de un complejo de GDF-8 maduro/propéptido de GDF-8. Esto valida al ensayo como útil para la medición de la actividad y la concentración de dímero de GDF-8 maduro y purificado.

Ejemplo 3: Actividad Biológica In Vitro de GDF-8 Purificado Para demostrar la actividad del GDF-8, se desarrolló un ensayo de gen reportero (RGA) utilizando una secuencia de vector reportero pGL3(CAGA)12 acoplada a luciferasa. La secuencia de CAGA se reportó previamente que era una secuencia susceptible de responder a TGF-ß dentro del promotor del gene inducido por TGF-ß, PAI-1 (Dennler et al., (1998) EMBO J. 17:3091-3100). El vector reportero que contenía 12 cajas de CAGA se preparó utilizando el plásmido reportero básico, pGL3 (Promega Corporation, Madison, WI, EUA, No. de Catálogo E1751). La caja TATA y el sitio de iniciación de transcripción proveniente del promotor tardío principal de adeno virus (-35/+ 10) se insertaron entre los sitios Bglll y Hindlll. Se recocieron oligonucleótidos que contenían doce repeticiones de AGCCAGACA de las cajas CAGA y se clonaron en el sitio Xhol. La línea celular de rabdomiosarcoma humano, A204 (ATCC HTB-82), se transfectó de manera transitoria con pGL3(CAGA)12 usando reactivo de transfección FuGE E 6 (Roche Diagnostics, Indianápolis, EUA, No. de Catálogo 1814443). Enseguida a la transfección, las células se cultivaron en placas de 48 pozos en medio 5A de McCoy (Life Technologies, Rockville, Maryland, EUA, No. de Catálogo 21500-079) complementado con glutamina 2 nM, 100 U/ml de estreptomicina, 100 g/ml, de penicilina y suero de ternera fetal al 10% durante 16 horas. Las células fueron entonces tratadas con GDF-8, BMP- 11 o activina en medio 5 A de McCoy con glutamina, estreptomicina, penicilina y 1 mg/ml de albúmina de suero de bovino durante 6 horas a 37 °C. Se cuantiñcó la luciferasa en las células tratadas utilizando el Luciferase Assay System (Promega Corporation, Madison WL EUA, No. de Catálogo E1483). Los resultados del ensayo se ilustran en la Figura 1. Para el GDF-8, los resultados se expresan como media ±S.E. (desviación estándar) para tres experimentos separados. Para la BMP-11 y la activina los resultados son representativos de dos experimentos separados. Los resultados muestran que el GDF-8 máximamente activó el constructo reportero 10 veces, con una ED50 de 10 ng/ml de GDF-8, indicando que el GDF-8 recombinante y purificado era biológicamente activo. La BMP-11, que era 90% idéntica al GDF-8 en el nivel de aminoácidos (Gamer et al. (1999) Dev. Biol. 208:222-232 y Nakashima et al. (1999) Mech. Dev. 80:185-189), y la activina produjeron una respuesta biológica similar, indicando que el ensayo del gen reportero es un ensayo adecuado para detectar la actividad biológica in vitro del GDF-8, BMP-11 o activina.

Ejemplo 4: Propiedades de Unión del GDF-8 Purificado Se biotiniló el complejo latente de GDF-8 en una proporción de 20 moles de EZ-link sulfo-NHS-Biotin (Pierce, Rockville, Illinois, EUA, No. de Catálogo 21217) para 1 mol del complejo de GDF-8 durante 2 horas en hielo, se inactivo con TFA al 0.5% y se sometió a cromatografía en una columna C4 Júpiter de 250 x 4.6 mm (Phenomenex) para separar GDF-8 maduro de propéptido de GDF-8. Las fracciones de GDF-8 maduro y biotinilado que eluyeron con un gradiente de TFA/CH3CN se acumularon, se concentraron y cuantificaron mediante el equipo MicroBCA protein Assay Reagent Kit (Pierce, Rockville, Illinois, EUA, No. de Catálogo 23235). Se recubrieron quimeras de ActRUB-Fc recombinantes (R&D Systems, Mirmeapolis, MN, EUA, No. de Catálogo 339-RB/CF) en placas de ensayo de 96 pozos con fondo plano (Costar, NY, No. de Catálogo 3590) a 1 µg/ml en regulador de carbonato de sodio 0.2M durante toda la noche a 4 °C. Las placas posteriormente fueron bloqueadas con un 1 mg/ml de albúmina de suero de bovino y se lavaron en seguida al protocolo de ELISA estándar. Se agregaron 100 µ? de alícuotas de GDF-8 biotinilado en varias concentraciones, a la placa de ELISA bloqueada, se incubaron durante 1 hora, se lavaron y se detectó la cantidad de GDF-8 unido, mediante Streptavidin-peroxidasa de raíz fuerte (SA-HRP, BD PharMingen, San Diego, CA, EUA, No. de Cat. 13047E) seguido de la adición de TMB (KPL, Gaithersburg, Maryland, EUA, No. de Cat. 50-76-04). Las mediciones colorimétricas se realizaron a 450 nM en un lector de microplacas de Molecular Devices. Como se muestra en la Figura 2, el GDF-8 biotinilado, se unió a ActRUB, el receptor tipo ? de GDF-8 putativo con una ED50 de 12 ng/ml, indicando que el ensayo de unión de ActRE es un ensayo de unión in vitro sensible para GDF-8.

Ejemplo 5: Inhibición de GDF-8 y BMP-11 mediante Propéptido de GDF-8 Cuando se preincubó GDF-8 con propéptido de GDF-8 durante 1 hora a temperatura ambiente, la actividad biológica del GDF-8 se redujo. La Figura 3 muestra la inducción de la actividad del reportero pGL3(CAGA)12 a la ED50 para GDF-8, 10 ng/ml, en la presencia de propéptido de GDF-8. El propéptido de GDF-8 redujo la inducción de GDF-8 en una forma que responde a la dosis, con un IC50 de 25 ng/ml (0.6 nM). El propéptido de GDF-8 también inhibió la actividad biológica de la BMP-11 en el mismo grado. En contraste, la actividad de la activina en este ensayo no fue afectada por el propéptido de GDF-8, presumiblemente debido a la relativamente baja homología entre el GDF-8 y la activina, en comparación con el GDF-8 y la BMP-11. De manera similar, la Figura 4 muestra que la preincubación del propéptido de GDF-8 con el GDF-8 biotinilado a 5 ng/ml inhibió la unión del GDF-8 a ActRUB en el ensayo de unión de ActRIIB, como se describió en el Ejemplo 4, con un ICs0 de 0.3 nM. En conclusión, el propéptido de GDF-8 de la invención es un potente inhibidor subnanomolar de la actividad del GDF-8 y la BMP- 11 in vitro, según se mide en el ensayo del gen reportero y el ensayo de unión de ActRUB. En consecuencia, este ensayo muestra que el propéptido de GDF-8 es activo y es un potente inhibidor de la actividad del GDF-8 en esta prueba.

Ejemplo 6: Inhibición de la Unión del Receptor de GDF-8 mediante Propéptido de GDF-8 Se yodó GDF-8 con cloraniina T como se describe por Frolik et al., (1984) J. Biol.

Chem. 259:10995-10999 a una actividad específica de 100-200 µ?/µ& El GDF-8 yodado mostró actividad biológica comparable con GDF-8 no marcado en el ensayo del reportero de (CAGA)i2 descrito en el Ejemplo 3. El GDF-8 marcado con 125I se evaluó en cuanto a unión específica a una línea celular de mioblastos, L6. Las células mioblastos L6 (ATCC CRL-1458) se hicieron crecer hasta confluencia en medio de Eagle modificado por Dulbecco, complementado con suero fetal de ternera al 10% inactivado con calor, en placas de 24 pozos gelatinizados. Se llevó a cabo la unión de equilibrio como se describe en Song et al., (1995) Endocrinolog 136:4293-4297, el cual se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia. 1 ng/ml de GDF-8 marcado con 125I (con o sin GDF-8 no marcado) se incubó con células L6 confluentes durante 4 horas a 4 °C. Después de lavar las células, se extrajo el [l25I]GDF-8 unido y se cuantificó con un contador gamma. Los resultados se expresan como media ±S.D. de determinaciones por triplicado y son representativos de tres experimentos separados. Como se muestra en la Figura 5, el [125I]GDF-8 se unió a células L6 con una elevada afinidad. De manera notable, la BMP-11, pero no el TGF-ß?, desplazó la unión de [125I]GDF-8, indicando que el GDF-8 y la BMP- 11 (pero no el TGF-ß?) comparten un receptor común en estas células (datos no mostrados). De un análisis Scatchard de la unión de GDF-8, se estimó que el valor de Kd era de 140 pM. Además, cuando se preincubó 1 ng ml de 125I-GDF-8 con propéptido de GDF-8 durante 1 hora a temperatura ambiente, la unión de GDF-8 específica a células L6 podía ser inhibida aumentando las concentraciones de propéptido de GDF-8 no marcado (Figura 6). Los resultados se expresan como media ±S.D. de determinaciones por triplicado y son representativos de dos experimentos separados. El IC5o para 1 ng/ml de GDF-8 fue 140 ng/ml de propéptido de GDF-8. Como queda en evidencia por estos datos, el propéptido de GDF-8 inhibe la actividad biológica del GDF-8 mediante el bloqueo de la unión del receptor de GDF-8.

Ejemplo 7: Inhibición de la Actividad de GDF-8 mediante Proteínas de Fusión de Propéptido de GDF-8-Fc Como se muestra en el Ejemplo 8, de más adelante, el propéptido de GDF-8 de murino tiene una vida media in vivo relativamente corta. Para incrementar la biodisponibilidad del propéptido de GDF-8, se construyeron fusiones entre el propéptido de GDF-8 y una región Fe de IgG2a de murino usando técnicas estándar de ingeniería genética. Se introdujeron cuatro mutaciones en la región Fe para reducir la función efectiva, como se describe en Steurer et al. (1995) J. Immunol. 155:1165-1174. Utilizando metodología PCR estándar, se prepararon dos constructos de fusión mediante la fusión de un ADNc que codificaba para el propéptido de GDF-8 de murino (aminoácidos 1-267) a la región Fe de IgG2a de murino (Figura 7). La fusión 1 (Figura 7A) codifica para los primeros 265 aminoácidos del propéptido de GDF-8 de murino (incluyendo un líder secretorio de 24 aminoácidos) fusionado en marco a 233 aminoácidos de la región Fe de IgG2a de murino iniciando en el primer aminoácido en la sección de gozne. La Fusión 2 (Figura 7B) es construida en una forma similar a la Fusión 1, excepto porque un corto ligador de glicina-serina-glicina-serina (GSGS) separa al propéptido de GDF-8 de la región Fe de murino. Las dos quimeras fueron introducidas en un vector de expresión eucariótico, pED (Kaufman et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4485-4490) y se expresó de manera transitoria en células M6 de COS-1 (Horowitz et al. (1983) Journal of Molecular and Applied Genetics 2:147-159), utilizando reactivo de transfección Lipofectarnine 2000 (Gibco BRL. Life Technologies, Rockville, Maryland, EUA, No. de Cat. 11668-019) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de 24 horas de incubación se agregó R1CD1 (un medio de cultivo libre de suero de DMEM/F12 modificado). Se acumuló medio acondicionado (CM), se reemplazó R1CD1 fresco y se cosechó el CM otra vez 60 horas más tarde. El medio acondicionado se acumuló entonces y se purificó sobre Protein A Sepharose CL-4B (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, HP7 9NA, Inglaterra, No. de Cat. 17-07080-01) después de la adición de 1/10 de volumen de Tris 1M, pH 8.0. La proteína purificada se eluyó en ácido acético 0.1M, NaCl 150 mM e inmediatamente se neutralizó con 1/20 de volumen de Tris 3M, pH 9.0. Las proteínas fueron cuantificadas utilizando un protocolo estándar de ELISA de IgG de murino, y se ensayaron en ELISA competitivo de ActRUB conjuntamente con un propéptido de GDF-8 de murino purificado, como se describe en el Ejemplo 5. En la Figura 8 se muestran los resultados. Los ICs0 de las fusiones de propéptido de GDF-8-Fc se encuentran en el intervalo nanomolar bajo y no existe diferencia entre la fusión 1 y la 2. La fusión 1 (sin ligador entre el propéptido de GDF-8 e IgG2a de murino) se seleccionó para su uso en la preparación de una línea celular CHO estable, y se probó en cuanto la inhibición del GDF-8 en el ensayo de RGA. Se subclonó ADNc de propéptido de GDF-8-Fc en el plásmido pHTop de expresión de CHO y se transfectó en células CHO/A2, como se describió en Thies et a. (2001), Growth Factors 18:251-259, el cual se incorpora en su totalidad a la presente mediante esta referencia. Se estableció una línea celular estable (PF-4/0.02) seleccionando células en metotrexato 0.02 M. Se cosechó medio acondicionado que contenía la proteína de fusión de propéptido de GDF-8-Fc proveniente de una línea seleccionada y se ajustó su pH mediante la adición de 10% v/v de Tris 1M, pH 8.0 y se purificó sobre Pharmacia rProteinA Sepharose Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech, Bucldnghamshire, HP7 9NA, Inglaterra, No. de Cat. 17-1279-02) previamente equilibrada con Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7.5. Las fracciones fueron eluidas con ácido acético 100 mM, NaCl 150 mM, pH 2.5 e inmediatamente se neutralizaron agregando 5% v/v de Tris 3M, pH 9.0. Las fracciones pico fueron acumuladas y se cargaron sobre una columna de exclusión por tamaño Pharmacia Superdex 200 Size Exclusión Column (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, HP7 9NA, Inglaterra, No. de Cat. 17-1069-91). Se agrego 5% de Tween 80 a las fracciones para prevenir la agregación. Las fracciones se evaluaron mediante SDS-PAGE en geles de Tricina al 10% de Novex (Novex, San Diego, CA, EUA, No. de Cat. EC66755).

Las fracciones acumuladas se cuantifícaron mediante espectrofotometría y se ensayaron en cuanto a actividad en el ensayo de unión de ActRUB como se describió en el Ejemplo 4, así como también en el ensayo del gen reportero (Figura 9). El ICs0 de la fusión de propéptido de GDF-8 purificado-Fe fue de 1.3 nM. Los datos muestran que el propéptido de GDF modificado de la invención comprendiendo una proteína de fusión de propéptido de GDF-8-Fc tiene retenida una potente actividad inhibitoria (neutralización) en comparación con el propéptido de GDF-8.

Ejemplo 8: Farmacocin ética Se evaluó la farmacocinética (PK) del propéptido de GDF-8 (referido aquí como "GDF8-Pro") y de la proteína de fusión de propéptido de GDF-8-Fc (referida aquí como "GDF8-ProFc") en ratones C57B1/6J a una dosis de 0.2 ug/ratón (GDF8-Pro) o 2 ug/ratón (GDF8-ProFc) después de una sola administración intravenosa. Los animales recibieron una mezcla de GDF8-Pro marcada con 125I o GDF8-ProFc sin marcar a las dosis de la lista anterior y se determinaron concentraciones de suero basadas en radiactividad de 125I en el suero y la actividad específica de la dosis inyectada. La Figura 10 muestra la concentración de suero contra curvas de tiempo tanto para GDF8-Pro como GDF8-ProFc. La Tabla 1 muestra los parámetros de PK para GDF8-Pro y GDF8-ProFc después de una sola administración intravenosa de 2 µ^te?,??. Las concentraciones de suero y los parámetros de PK para el GDF8-Pro están normalizados a una dosis de 2 µg ratón para propósitos comparativos. Tabla 1 T ½: vida media durante la fase de eliminación terminal Cmax: concentración pico máxima MRT: tiempo de residencia medio Vi : volumen inicial de distribución Vss: volumen de distribución en estado estacionario. Nota: parámetros de PK de GDF8-Pro normalizados a una dosis de 2 µ§/?a??? Como se puede apreciar en la Figura 10, la separación es de 400 veces más lenta, y la vida media es 100 veces más larga para el GDF8-ProFc en comparación con el GDF8-Pro. Tanto el volumen de distribución inicial como el volumen de distribución en estado estacionario son aproximadamente 3 veces mayores para el GDF8-Pro en comparación para el GDF8-ProFc, indicando que el GDF8-Pro se distribuye en un mayor grado fuera del espacio vascular en comparación con el GDF8-ProFc. Si bien el efecto de estabilización de la región Fe de una molécula de IgG en un propéptido de GDF se ejemplifica usando la proteína de fusión de propéptido de GDF-Fc de ratón (esto es, ambos componentes derivados de ratón), los métodos de la presente invención pueden ser aplicados a cualquier combinación de componentes de propéptido de GDF e IgG, sin importar la proteína precursora particular o la especie animal desde la cual se derivan los componentes, siempre que la proteína de fusión sea construida de manera apropiada para retener actividad (esto es, como se describe aquí mismo).

Ejemplo 9: Derivación y Actividad de Dos Fusiones de Propéptido de GDF-8 Humano-Fc Se prepararon dos constructos de fusión de propéptido de GDF-8-Fc, usando metodología PCR estándar, para la evaluación del potencial terapéutico. Se fusionó un ADNc que codifica para el propéptido de GDF-8 humano (SEQ ID NO: 5) a la región Fe de IgGl humana (SEQ ID NO: 15, Figura 11 A) o Fe de IgGl humana modificada para función de efector reducida (SEQ ID NO: 16, Figura 1 IB). 1. Proteína de fusión de propéptido de GDF-8 humano-Wt Fe de IgGl (Figura 11 A): Los primeros 264 aminoácidos del propéptido de GDF-8 humano (incluyendo los aminoácidos 1-241 de la SEQ ID NO: 5 y el péptido señal de 23 aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 13) se fusionaron en marco con los 232 aminoácidos de la región constante de IgGl humana, comenzando en el primer aminoácido en la región de gozne (SEQ ID NO: 15). 2. Propéptido de GDF-8 humano-IgG muíante (Figura 1 IB). Los primeros 264 aminoácidos de propéptido de GDF-8 humano, como se describió anteriormente, se fusionaron en marco con los 227 aminoácidos de una región Fe de IgGl humana muíante (SEQ ID NO: 16). Dos mutaciones, residuos alanina (Ala-14 y Ala-17) como se esíablece en la SEQ ID NO: 16 fueron introducidas con el fin de reducir la función de efector como se describe en Lund et al (1991) J Immun. 147:2657-2662 y Morgan et al. (1995) Immunology 86:319-324. Las dos proteínas de fusión se introdujeron en un vector de expresión eucariótico, pED (Kaufman et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4485-4490) y se expresaron de manera transitoria en células M6 de COS-1 (Horowitz et al. (1983) Journal of Molecular and Applied Genetics 2:147-159), utilizando reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (Gibco B L. Life Technologies, ockville, Maryland, EUA, No. de Cat. 11668-019) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de 24 horas de incubación se agregó R1CD1 (un medio de cultivo libre de suero de DMEM F12 modificado). Se acumuló medio acondicionado (CM), se reemplazó R1CD1 fresco y se cosechó el CM otra vez 60 horas más tarde. El medio acondicionado se acumuló entonces y se purificó sobre Protein A Sepharose CL-4B (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, HP7 9NA, Inglaterra, No. de Cat. 17-07080-01) después de la adición de 1/10 de volumen de Tris 1M, pH 8.0. La proteína purificada eluyó en ácido acético 0.1M, NaCl 150 mM e inmediatamente se neutralizó con 1/20 de volumen de Tris 3M, pH 9.0. Las proteínas fueron cuantificadas utilizando un protocolo estándar de ELISA de IgG de humano, y se ensayó en la prueba de unión de ActRUB conjuntamente con un propéptido de GDF-8 de humano purificado, como se describe en el Ejemplo 5. En la Figura 12 se muestran los resultados. En conclusión, ambas proteínas de fusión de propéptido humano-Fc son potentes inhibidores de la unión del GDF-8 a ActRUB .

Ejemplo 10: Prueba In Vivo de Proteína de Fusión de Propéptido de GDF-8-Fc La proteína de fusión de propéptido de GDF-8 de murino-Fc (proveniente del Ejemplo 9) se probó en ratones adultos. Se tomaron al azar ratones BALB/c hembra, adultos, de siete a nueve semanas de edad, con respecto al peso corporal y se colocaron en grupos de siete (excepto por el grupo sin tratamiento, el cual era de seis ratones). A los ratones se les aplicó la dosis dos veces por semana mediante inyección I.P. con una dosis semanal total de 10 ug, 100 ug 0 1,000 ug por animal durante cinco semanas. Las inyecciones de control fueron de IgG2a de murino-Fc a un equivalente molar para la dosis más alta de propéptido-Fc. Al final del estudio, se retiraron y se pesaron gastrocnemio, cuadríceps, almohadilla de grasa epidedimaria, riñon e hígado. La Figura 13 muestra la masa promedio del tejido, con las barras de error indicando el error estándar de la media. El asterisco (*) indica una diferencia estadísticamente importante (p<0.01 usando una prueba T de estudiantes) cuando se compara con los ratones tratados con la proteína de control, IgG2aFc. La actividad de bloqueo del GDF-8 in vivo mediante inyección I.P. de proteína de fusión de propéptido de GDF-8-Fc a un régimen de 1 mg/semana (ratones tratados) resultó en un aumento del 6.2% en gastrocnemio y un aumento del 11.3% masa del músculo cuadríceps en comparación con los ratones de control que no recibieron proteína de fusión de propéptido de GDF-8-Fc. Además, la actividad de bloqueo del GDF-8 in vivo mediante inyección I.P. de proteína de fusión de propéptido de GDF-8-Fc a un régimen de 100 ug/semana (ratones tratados) resultó en un aumento del 23.0% en la masa de la almohadilla de grasa. El tratamiento con la dosis alta (lmg/semana) también condujo a una disminución en la masa de la almohadilla de grasa, pero debido a la variabilidad en la masa de la almohadilla de grasa, la diferencia no fue estadísticamente importante (p=0.047). No hubo efecto del tratamiento sobre la masa de otros tejidos probados, incluyendo hígado y riñon. En resumen, el propéptido de GDF-8 modificado bloqueó la actividad del GDF-8 in vivo y condujo a un aumento en la masa muscular y en una disminución en la masa de grasa. En resumen, el bloqueo de la actividad del GDF-8 in vivo mediante inyección I.P. de proteína de fusión de propéptido de GDF-8-Fc (ratones tratados) resultó en masa incrementada del músculo de gastrocnemio y cuadríceps, en comparación con ratones de control que no recibieron proteína de fusión de propéptido de GDF-8-Fc.

Equivalentes Aquellos capacitados en la técnica reconocerán, o serán capaces de discernir utilizando no más que experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las modalidades específicas de la invención que ha sido descrita aquí mismo. Se tiene la intención de que tales equivalentes estén abarcados por las siguientes reivindicaciones.

Claims

Novedad de la Invención I. Un propéptido de GDF-8 modificado, el cual comprende un propéptido de GDF-8, en donde el propéptido de GDF-8 modificado tiene una vida media incrementada in vivo o in vitro, con relación a un correspondiente propéptido de GDF-8 no modificado.
2. El propéptido de GDF-8 modificado de la reivindicación 1, en donde el propéptido de GDF-8 comprende una secuencia de aminoácidos que es cuando menos 75% idéntica a la SEQ ID NO: 5.
3. El propéptido de GDF-8 modificado de la reivindicación 1, en donde el propéptido de GDF-8 es idéntico a la SEQ ID NO: 5.
4. El propéptido de GDF-8 modificado de la reivindicación 1, en donde el propéptido de GDF-8 contiene un sitio de segmentación proteolítico inactivado.
5. El propéptido de GDF-8 modificado de la reivindicación 4, en donde el sitio de segmentación proteolítico es inactivado mediante una mutación en dicho sitio.
6. El propéptido de GDF-8 modificado de la reivindicación 1, en donde el propéptido de GDF-8 además comprende una porción estabilizadora fusionada al propéptido de GDF-8.
7. El propéptido de GDF-8 modificado de la reivindicación 6, en donde la porción estabilizadora comprende una región Fe de una molécula de IgG.
8. El propéptido de GDF-8 modificado de la reivindicación 7, en donde la molécula de IgG es IgGl o IgG4, o derivados de éstas.
9. El propéptido de GDF-8 modificado de la reivindicación 7, en donde la molécula de IgG es IgGl.
10. El propéptido de GDF-8 modificado de la reivindicación 7, en donde la secuencia de aminoácidos de la molécula de IgG es cuando menos 75% idéntica a la SEQ ID NO: 15.
II. El propéptido de GDF-8 modificado de la reivindicación 7, en donde la secuencia de aminoácidos de la molécula de IgG es idéntica a la SEQ ID NO: 15.
12. El propéptido de GDF-8 modificado de la reivindicación 7, en donde la secuencia de aminoácidos de la molécula de IgG es cuando menos 75% idéntica a la SEQ ID NO: 16.
13. El propéptido de GDF-8 modificado de la reivindicación 7, en donde la secuencia de aminoácidos de la molécula de IgG es la SEQ ID NO: 16.
14. El propéptido de GDF-8 modificado de la reivindicación 6, en donde el propéptido de GDF-8 está fusionado a la región Fe de la molécula de IgG a través de un péptido ligador.
15. El propéptido de GDF-8 modificado de la reivindicación 1, en donde el propéptido de GDF-8 modificado tiene un sitio de glucosilación alterado.
16. El propéptido de GDF-8 modificado de la reivindicación 1, en donde el propéptido de GDF-8 modificado comprende cuando menos una fracción de carbohidrato.
17. El propéptido de GDF-8 modificado de la reivindicación 6, en donde la porción estabilizadora comprende albúmina o un derivado de albúmina.
18. El propéptido de GDF-8 modificado de la reivindicación 6, en donde la porción estabilizadora comprende un polímero no proteináceo.
19. El propéptido de GDF-8 modificado de la reivindicación 1, en donde el propéptido de GDF-8 modificado además comprende una o más mutaciones puntuales, en donde dicha mutación puntual inhibe la segmentación proteolítica.
20. El propéptido de GDF-8 modificado de la reivindicación 1, en donde el propéptido de GDF-8 modificado además comprende una etiqueta de purificación.
21. Un ácido nucleico que codifica para un propéptido de GDF-8 modificado en donde dicho propéptido de GDF-8 modificado tiene una vida media incrementada in vivo o in vitro, con relación a un correspondiente propéptido de GDF-8 no modificado.
22. El ácido nucleico de la reivindicación 21, el cual comprende cuando menos 20 nucleótidos contiguos como se establece en la SEQ ID NO: 2.
23. El ácido nucleico de la reivindicación 21, el cual comprende cuando menos 20 nucleótidos contiguos como se establece en la SEQ ID NO: 6.
24. El ácido nucleico de la reivindicación 21, el cual comprende cuando menos 50 nucleótidos contiguos como se establece en la SEQ ID NO: 2.
25. El ácido nucleico de la reivindicación 21, el cual comprende cuando menos 50 nucleótidos contiguos como se establece en la SEQ ID NO: 6.
26. El ácido nucleico de la reivindicación 21, el cual comprende además un ácido nucleico que codifica para una proteína estabilizadora.
27. El ácido nucleico de la reivindicación 26, en donde la porción estabilizadora codifica para una proteína de IgG.
28. El ácido nucleico de la reivindicación 26, en donde la porción estabilizadora codifica para albúmina o un derivado de albúmina.
29. El ácido nucleico de la reivindicación 21, en donde el ácido nucleico codifica para un propéptido de GDF-8 modificado con un sitio de glucosilación alterado.
30. El ácido nucleico de la reivindicación 21, en donde el ácido nucleico codifica para un propéptido de GDF-8 modificado con una fracción de carbohidrato alterada.
31. Una composición farmacéutica que comprende el propéptido de GDF-8 modificado de la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable.
32. Una composición farmacéutica que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 21 y un portador o vector farmacéuticamente aceptable.
33. Un método para preparar un propéptido de GDF-8 modificado, el cual comprende las etapas de: (a) preparar una molécula de ADNc que codifica para el propéptido de GDF-8, en donde el sitio de segmentación proteolítica está modificado; (b) preparar una molécula de ADNc que codifica para la región Fe de la molécula de IgG; y (c) fusionar las moléculas de ADNc de las etapas (a) y (b) para producir un propéptido de GDF-8 modificado.
34. El método de la reivindicación 33, el cual comprende además la preparación de un oligonucleótido de doble cadena que codifica para un péptido ligador, y fusionar las moléculas de ADNc de las etapas (a) y (b) a cualquier extremo del oligonucleótido de doble cadena que codifica para el péptido ligador.
35. El método de la reivindicación 33, en donde el péptido ligador comprende la secuencia de aminoácidos consistente en GSGS.
36. Una célula recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica para un propéptido de GDF-8 modificado.
37. La célula recombinante de la reivindicación 36, en donde dicho ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una porción estabilizadora.
38. Un método para el tratamiento de un paciente que padece de un desorden médico o enfermedad, el cual comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un propéptido de GDF-8 modificado y un excipiente farmacéuticamente aceptable a dicho paciente, en donde el propéptido de GDF-8 modificado tiene una vida media incrementada in vivo o in vitro, con relación a un correspondiente propéptido de GDF-8 no modificado.
39. El método de la reivindicación 38, en donde el propéptido de GDF-8 comprende una secuencia de aminoácidos que es cuando menos 75% idéntica a la SEQ ID NO: 5.
40. El método de la reivindicación 38, en donde el propéptido de GDF-8 es la SEQ ID NO: 5.
41. El método de la reivindicación 38, en donde el propéptido de GDF-8 contiene una mutación en uno o más sitios de segmentación proteolítica.
42. El método de la reivindicación 38, en donde el propéptido de GDF-8 modificado además comprende una región Fe de una molécula de IgG.
43. El método de la reivindicación 42, en donde la molécula de IgG es IgGl o IgG4, o derivados de éstas.
44. El método de la reivindicación 42, en donde la molécula de IgG es IgGl .
45. El método de la reivindicación 42, en donde molécula de IgG es cuando menos 75% idéntica a la SEQ ID NO: 15.
46. El método de la reivindicación 42, en donde la región Fe de la molécula de IgG es idéntica a la SEQ ID NO: 15.
47. El método de la reivindicación 42, en donde molécula de IgG es cuando menos 75% idéntica a la SEQ ID NO: 16.
48. El método de la reivindicación 42, en donde la región Fe de la molécula de IgG es idéntica a la SEQ ID NO: 16.
49. El método de la reivindicación 38, en donde el propéptido de GDF-8 modificado tiene un sitio de glucosilación alterado.
50. El método de la reivindicación 38, en donde el propéptido de GDF-8 modificado comprende cuando menos una fracción de carbohidrato.
51. El método de la reivindicación 38, en donde el propéptido de GDF-8 modificado además comprende albúmina o un derivado de albúmina.
52. El método de la reivindicación 38, en donde el propéptido de GDF-8 modificado además comprende un polímero no proteináceo.
53. El método de la reivindicación 38, en donde el desorden médico es un desorden muscular, un desorden neuromuscular, un desorden metabólico o un desorden degenerativo óseo.
54. El método de la reivindicación 38, en donde el desorden médico es un desorden muscular o un desorden neuromuscular.
55. El método de la reivindicación 38, en donde el desorden médico es un desorden metabólico.
56. El método de la reivindicación 38, en donde el desorden médico es esclerosis lateral amiotrópica, distrofia muscular, atrofia muscular, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, síndrome de emaciación muscular, sarcopenia o caquexia.
57. El método de la reivindicación 38, en donde el desorden médico es esclerosis lateral amiotrópica o distrofia muscular.
58. El método de la reivindicación 38, en donde el desorden médico es obesidad, desórdenes del tejido adiposo, diabetes tipo 2 o diabetes mellitus no dependiente de insulina.
59. El método de la reivindicación 38, en donde el desorden médico es osteoporosis.
60. Un propéptido de BMP-11 modificado, el cual comprende un propéptido de BMP-11, en donde el propéptido de BMP-11 modificado tiene una vida media incrementada in vivo o in vitro, con relación a un correspondiente propéptido de BMP-11 no modificado.
61. El propéptido de BMP-11 modificado de la reivindicación 60, en donde el propéptido de BMP-11 comprende una secuencia de aminoácidos que es cuando menos 75% idéntica a la SEQ ID NO: 11.
62. El propéptido de BMP-11 modificado de la reivindicación 60, en donde el propéptido de BMP-11 es idéntico a la SEQ ID NO: 11.
63. El propéptido de BMP-11 modificado de la reivindicación 60, en donde el propéptido de BMP-11 contiene un sitio de segmentación proteolítico inactivado.
64. El propéptido de BMP-11 modificado de la reivindicación 62, en donde el sitio de segmentación proteolítico es inactivado mediante una mutación en dicho sitio.
65. El propéptido de BMP-11 modificado de la reivindicación 60, en donde el propéptido de BMP-11 modificado además comprende una porción estabilizadora fusionada al propéptido de BMP-11.
66. El propéptido de BMP-11 modificado de la reivindicación 65, en donde la porción estabilizadora comprende una región Fe de una molécula de IgG.
67. El propéptido de BMP-11 modificado de la reivindicación 66, en donde la molécula de IgG es IgGl o IgG4, o derivados de éstas.
68. El propéptido de BMP-11 modificado de la reivindicación 66, en donde la molécula de IgG es IgGl .
69. El propéptido de BMP-11 modificado de la reivindicación 66, en donde la secuencia de ammoácidos de la molécula de IgG es cuando menos 75% idéntica a la SEQ ID NO: 15.
70. El propéptido de BMP-11 modificado de la reivindicación 66, en donde la secuencia de aminoácidos de la molécula de IgG es idéntica a la SEQ ID NO: 15.
71. El propéptido de BMP-11 modificado de la reivindicación 66, en donde la secuencia de aminoácidos de la molécula de IgG es cuando menos 75% idéntica a la SEQ ID NO: 16.
72. El propéptido de BMP-11 modificado de la reivindicación 66, en donde la secuencia de aminoácidos de la molécula de IgG es la SEQ ID NO: 16.
73. El propéptido de BMP-11 modificado de la reivindicación 65, en donde el propéptido de BMP-11 está fusionado a la región Fe de la molécula de IgG a través de un péptido ligador.
74. El propéptido de BMP-11 modificado de la reivindicación 60, en donde el propéptido de BMP-11 tiene un sitio de glucosilación alterado.
75. El propéptido de BMP-11 modificado de la reivindicación 60, en donde el propéptido de BMP-11 modificado comprende cuando menos una fracción de carbohidrato.
76. El propéptido de BMP-11 modificado de la reivindicación 65, en donde la porción estabilizadora comprende albúmina o un derivado de albúmina.
77. El propéptido de BMP-11 modificado de la reivindicación 65, en donde la porción estabilizadora comprende un polímero no proteináceo.
78. El propéptido de BMP-11 modificado de la reivindicación 60, en donde el propéptido de BMP-11 modificado además comprende una o más mutaciones puntuales, en donde dicha mutación puntual inhibe la segmentación proteolítica.
79. El propéptido de BMP-11 modificado de la reivindicación 60, en donde el propéptido de BMP-11 modificado además comprende una etiqueta de purificación.
80. Un ácido nucleico que codifica para un propéptido de BMP-11 modificado en donde dicho propéptido de BMP-11 modificado tiene una vida media incrementada in vivo o in vitro, con relación a un correspondiente propéptido de BMP-11 no modificado.
81. El ácido nucleico de la reivindicación 80, el cual comprende cuando menos 20 nucleótidos contiguos como se establece en la SEQ ID NO: 8.
82. El ácido nucleico de la reivindicación 80, el cual comprende cuando menos 20 nucleótidos contiguos como se establece en la SEQ ID NO: 12.
83. El ácido nucleico de la reivindicación 80, el cual comprende cuando menos 50 nucleótidos contiguos como se establece en la SEQ ID NO: 8.
84. El ácido nucleico de la reivindicación 80, el cual comprende cuando menos 50 nucleótidos contiguos como se establece en la SEQ ID NO: 12.
85. El ácido nucleico de la reivindicación 80, el cual comprende además un ácido nucleico que codifica para una porción estabilizadora.
86. El ácido nucleico de la reivindicación 85, en donde la porción estabilizadora codifica para una proteína de IgG.
87. El ácido nucleico de la reivindicación 85, en donde la porción estabilizadora codifica para albúmina o un derivado de albúmina.
88. El ácido nucleico de la reivindicación 80, en donde el ácido nucleico codifica para un propéptido de BMP- 11 modificado con un sitio de glucosilación alterado.
89. El ácido nucleico de la reivindicación 80, en donde el ácido nucleico codifica para un propéptido de BMP- 11 modificado con una fracción de carbohidrato alterada.
90. Una composición farmacéutica que comprende el propéptido de BMP- 11 modificado de la reivindicación 61 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
91. Una composición farmacéutica que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 80 y un portador o vector farmacéuticamente aceptable.
92. Un método para preparar un propéptido de BMP- 11 modificado, el cual comprende las etapas de: (a) preparar una molécula de ADNc que codifica para el propéptido de BMP-11, en donde el sitio de segmentación proteolítica esta modificado; (b) preparar una molécula de ADNc que codifica para la región Fe de la molécula de ¾G; y (c) fusionar las moléculas de ADNc de las etapas (a) y (b) para producir un propéptido de BMP-11 modificado.
93. El método de la reivindicación 92, el cual comprende además la preparación de un oligonucleótido de doble cadena que codifica para un péptido ligador, y fusionar las moléculas de ADNc de las etapas (a) y (b) a cualquier extremo del oligonucleótido de doble cadena que codifica para el péptido ligador.
94. El método de la reivindicación 92, en donde el péptido ligador comprende la secuencia de aminoácidos consistente en GSGS.
95. Una célula recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica para un propéptido de BMP-11 modificado.
96. La célula recombinante de la reivindicación 95, en donde dicho ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una porción estabilizadora.
97. Un método para el tratamiento de un paciente que padece de un desorden médico o enfermedad, el cual comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un propéptido de BMP-11 modificado y un excipiente farmacéuticamente aceptable a dicho paciente, en donde el propéptido de BMP-11 modificado tiene una vida media incrementada in vivo o in vitro, con relación a un correspondiente propéptido de BMP-11 no modificado.
98. El método de la reivindicación 97, en donde el propéptido de BMP-11 comprende una secuencia de aminoácidos que es cuando menos 75% idéntica a la SEQ ID NO: 11.
99. El método de la reivindicación 97, en donde el propéptido de BMP-11 es la SEQ ID NO: 11.
100. El método de la reivindicación 97, en donde el propéptido de BMP-11 contiene una mutación en uno o más sitios de segmentación proteolítica.
101. El método de la reivindicación 97, en donde el propéptido de BMP-11 modificado además comprende una región Fe de una molécula de IgG.
102. El método de la reivindicación 101, en donde la molécula de IgG es IgGl o IgG4, o derivados de éstas.
103. El método de la reivindicación 101, en donde la molécula de IgG es IgGl.
104. El método de la reivindicación 101, en donde molécula de IgG es cuando menos 75% idéntica a la SEQ ID NO: 15.
105. El método de la reivindicación 101, en donde la región Fe de la molécula de IgG es idéntica a la SEQ ID NO: 15.
106. El método de la reivindicación 101, en donde molécula de IgG es cuando menos 75% idéntica a la SEQ ID NO: 16.
107. El método de la reivindicación 101, en donde la región Fe de la molécula de IgG es idéntica a la SEQ ID NO: 16.
108. El método de la reivindicación 97, en donde el propéptido de BMP-11 modificado tiene un sitio de glucosilación alterado.
109. El método de la reivindicación 97, en donde el propéptido de BMP-11 modificado comprende cuando menos una fracción de carbohidrato.
110. El método de la reivindicación 97, en donde el propéptido de BMP-11 modificado además comprende albúmina o un derivado de albúmina.
111. El método de la reivindicación 97, en donde el propéptido de BMP-11 modificado además comprende un polímero no proteináceo.
112. El método de la reivindicación 97, en donde el desorden médico es un desorden muscular, un desorden neuromuscular, un desorden metabólico o un desorden degenerativo óseo.
113. El método de la reivindicación 97, en donde el desorden médico es un desorden muscular o un desorden neuromuscular.
114. El método de la reivindicación 97, en donde el desorden médico es un desorden metabólico.
115. El método de la reivindicación 97, en donde el desorden médico es esclerosis lateral amiotrópica, distrofia muscular, atrofia muscular, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, síndrome de emaciación muscular, sarcopenia o caquexia.
116. El método de la reivindicación 97, en donde el desorden médico es esclerosis lateral amiotrópica o distrofia muscular.
117. El método de la reivindicación 97, en donde el desorden médico es obesidad, desórdenes del tejido adiposo, diabetes tipo 2 o diabetes mellitus no dependiente de insulina.
118. El método de la reivindicación 97, en donde el desorden médico es osteoporosis.