ES2284828T3 - Propeptidos de gdf modificados y estabilizados y usos de los mismos. - Google Patents

Abstract

Propéptido de GDF-8 modificado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una mutación que modifica la secuencia de aminoácidos en el resto que corresponde a la posición 76 de SEC ID nº: 5, en el que el propéptido de GDF-8 modificado tiene una semivida incrementada in vivo o in vitro, con relación a un propéptido de GDF-8 no modificado correspondiente.

Description

Propéptidos de GDF modificados y estabilizados y usos de los mismos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a inhibidores de las proteínas del Factor 8 de Diferenciación del Crecimiento (GDF-8), y a métodos para su uso. Más particularmente, la invención proporciona propéptidos modificados y estabilizados de proteínas del GDF-8, los cuales inhiben la actividad del GDF-8. La invención es particularmente útil para prevenir o tratar trastornos en seres humanos o animales en los que sería terapéuticamente beneficioso un aumento en el tejido del músculo esquelético. Dichos trastornos incluyen trastornos musculares o neuromusculares (tales como la esclerosis lateral amiotrófica, la distrofia muscular, la atrofia muscular, la enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, el síndrome de emaciación muscular, sarcopenia o caquexia), enfermedades o trastornos metabólicos (tales como diabetes de tipo 2, diabetes mellitus no dependiente de insulina, hiperglucemia, u obesidad), trastornos del tejido adiposo (tales como obesidad), o trastornos degenerativos óseos (tales como osteoporosis).

Antecedentes de la invención

El Factor 8 de Crecimiento y Diferenciación (GDF-8), también conocido como miostatina, es un miembro de la superfamilia del Factor beta Transformante del Crecimiento (TGF-\beta), de factores de crecimiento estructuralmente relacionados, los cuales poseen importantes propiedades morfogenéticas y reguladoras del crecimiento (Kingsley et al. (1994) Genes Dev. 8:133-46; Hoodless et al. (1998) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 228:235-72). El GDF-8 es un regulador negativo de la masa muscular esquelética, y existe un interés considerable en la identificación de factores que regulen su actividad biológica. Por ejemplo, el GDF-8 está muy expresado en el músculo esquelético en desarrollo y adulto. La mutación nula del GDF-8 en ratones transgénicos se caracteriza por una notable hipertrofia e hiperplasia del músculo esquelético (McPherron et al. (1997) Nature 387:83-90). Incrementos similares en la masa del músculo esquelético son evidentes en mutaciones del GDF-8 que ocurren de manera natural en ganado (Ashmore et al. (1994) Growth 38:501-507; Swatland y Kieffer (1994) J. Anim. Sci. 38:752-757; McPherron y Lee (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:12457-12461; y Kambadur et al. (1997) Genome Res. 7:910-915). Estudios recientes han demostrado también que la emaciación muscular asociada con infección por VIH en seres humanos está acompañada de aumentos en la expresión de la proteína del GDF-8 (Gonzalez-Cadavid et al. (1998) PNAS 95:14938-43). Además, el GDF-8 puede modular la producción de enzimas específicas del músculo (por ejemplo, la creatina quinasa), y modular la proliferación de mioblastocitos (documento WO 00/43781).

Además de sus propiedades reguladoras del crecimiento y morfogenéticas en el músculo esquelético, el GDF-8 también puede estar involucrado en un gran número de otros procesos fisiológicos (por ejemplo, homeostasis de la glucosa), así como también en condiciones anormales tales como en el desarrollo de la diabetes de tipo 2 y trastornos del tejido adiposo, tales como la obesidad. Por ejemplo, el GDF-8 modula la diferenciación de preadipocitos a adipocitos (Kim et al. (2001) B.B.R.C. 281:902-906).

De manera similar a TGF-\beta-1, 2 y 3, la proteína del GDF-8 es sintetizada como una proteína precursora que consiste en un propéptido amino terminal y un dominio maduro carboxi terminal (McPherron y Lee, 1997, más arriba), así como también una secuencia de señal que dirige la proteína hacia el dominio extracelular y también se escinde de la proteína. Se cree que antes de la escisión del propéptido, la proteína de GDF-8 precursora forma un homodímero. El propéptido amino terminal se escinde entonces del dominio maduro, y el propéptido escindido puede permanecer unido de manera no covalente al dímero del dominio maduro, inhibiendo su actividad biológica (Miyazono et al. (1998) J. Biol. Chem. 263:6407-6415; Wakefield et al. (1998) J. Biol. Chem. 263:7646-7654; y Brown et al. (1990) Growth Factors 3:35-43). Se cree que dos propéptidos del GDF-8 se unen al dímero maduro del GDF-8 (Thies et al. (2001) Growth Factors 18:251-259). Debido a esta propiedad inactivante, el propéptido se conoce como el "péptido asociado con la latencia" (LAP), y el complejo del dominio maduro y el propéptido se denomina generalmente como el "pequeño complejo latente" (Gentry y Nash (1990) Biochemistry 29:6851-6857; Derynck et al. (1995) Nature 316:701-705; y Massague (1990) Am. Rev. Cell. Biol. 12:597-641). Se cree que el dominio maduro es activo como un homodímero cuando se elimina el propéptido. También se sabe que otras proteínas se unen al GDF-8 o a proteínas estructuralmente relacionadas, e inhiben su actividad biológica. Tales proteínas inhibidoras incluyen folistatina (Gamer et al. (1999) Dev. Biol. 208:222-232) y proteínas relacionadas con la folistatina.

Adicionalmente, un gran número de trastornos en seres humanos y animales están asociados con la pérdida de o con tejido muscular funcionalmente dañado, incluyendo distrofia muscular, atrofia muscular, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, síndrome de emaciación muscular, sarcopenia, y caquexia. Hasta la fecha, existen muy pocas terapias fiables o eficaces para estos trastornos. Los terribles síntomas asociados con estos trastornos se podrían reducir de manera importante mediante el empleo de terapias que aumenten la cantidad de tejido muscular en pacientes que padecen de estos trastornos. Tales terapias mejorarían de manera significativa la calidad de vida de estos pacientes, y podrían mejorar muchos efectos de estas enfermedades. De este modo, existe en el estado de la técnica la necesidad de identificar nuevas terapias que contribuyan a un aumento global del tejido muscular en pacientes que sufren estos trastornos.

La presente invención llena esta necesidad al proporcionar propéptidos de GDF modificados y estabilizados que conservan su actividad biológica y que inhiben la actividad de las proteínas del GDF. Los propéptidos modificados de la invención se pueden usar para tratar trastornos en seres humanos o animales en los que sería terapéuticamente beneficioso un aumento del tejido muscular.

Sumario de la invención

El GDF-8 está involucrado en la regulación de muchos procesos biológicos críticos. Debido a su función clave en estos procesos, el GDF-8 puede ser una diana deseable para la intervención terapéutica. Si bien el propéptido de GDF-8 de origen natural puede ser un medio atractivo de modulación del GDF desde una perspectiva de eficacia y toxicidad, se ha descubierto que la semivida circulatoria del propéptido natural puede ser demasiado corta para que la molécula tenga una utilidad terapéutica o profiláctica práctica.

En consecuencia, la presente invención se basa, por lo menos en parte, en el descubrimiento de que el propéptido del Factor 8 de Diferenciación del Crecimiento (GDF-8) inhibe la actividad de la proteína del GDF-8, y que otras proteínas del Factor beta Transformante del Crecimiento (TGF-\beta) que están relacionadas estructuralmente con el GDF-8, tales como la Proteína Morfogénetica Ósea 11 (BMP-11; también conocida como GDF-11), también son inhibidas por el propéptido de GDF-8. La presente invención proporciona de este modo composiciones y métodos para inhibir las proteínas de GDF, así como también métodos para identificar, obtener y usar tales
inhibidores.

Como se ha señalado anteriormente, la presente invención también se basa, en parte, en el descubrimiento de que el propéptido de GDF-8 natural tiene una semivida in vivo relativamente corta, lo cual puede evitar la utilidad terapéutica o profiláctica práctica. Así, la presente invención proporciona propéptidos de GDF-8 modificados que tienen propiedades farmacocinéticas mejoradas, tales como una mayor semivida circulatoria o una mayor protección contra la degradación proteolítica.

Los propéptidos de GDF-8 descritos en la presente memoria se pueden estabilizar por cualquier medio conocido en la técnica. Por ejemplo, en una forma de realización, el propéptido modificado es una proteína de fusión que comprende un propéptido de GDF-8 y la región Fc de una molécula de IgG. Las proteínas de fusión del propéptido de GDF-8 pueden comprender, como la subunidad activa, el propéptido de una proteína de GDF-8, o una parte activa del propéptido del GDF-8, fusionado a una región Fc de una molécula de IgG. En otras formas de realización, o además, el propéptido de GDF-8 puede estar glucosilado, o enlazado a albúmina o a un polímero no proteináceo.

Los propéptidos de GDF-8 modificados de la invención son capaces de inhibir la actividad, la expresión, el procesamiento, o la secreción de una proteína de GDF-8, GDF-8 maduro, o un homodímero de GDF-8 u otra molécula de GDF-8 activa. Los propéptidos de GDF-8 modificados de la invención se pueden administrar a un paciente, en una dosis terapéuticamente efectiva, para tratar o prevenir afecciones médicas en las que sería terapéuticamente beneficioso un aumento del tejido muscular. Las enfermedades y los trastornos que pueden ser tratados mediante los propéptidos de GDF-8 modificados incluyen, pero no se limitan a, trastornos musculares o neuromusculares (tales como la esclerosis lateral amiotrófica, la distrofia muscular, la atrofia muscular, la enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, el síndrome de emaciación muscular, la sarcopenia o la caquexia), enfermedades o trastornos metabólicos (tales como diabetes de tipo 2, diabetes mellitus no dependiente de insulina, hiperglucemia, u obesidad), trastornos del tejido adiposo (tales como obesidad) y enfermedades degenerativas óseas (tales como la osteoporosis).

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra las actividades biológicas relativas del GDF-8, BMP-11 y activina en un ensayo de gen informador.

La Figura 2 muestra las propiedades de unión de GDF-8 humano biotinilado y purificado, en un ensayo de unión a ActRIIB.

La Figura 3 muestra la inducción de la actividad informadora de pGL3(CAGA)_{12} a la ED_{50} para GDF-8, BMP-11 y activina, en presencia del propéptido de GDF-8.

La Figura 4 muestra la inhibición dependiente de la dosis de la unión de GDF-8 biotinilado a ActRIIB, mediante el propéptido de GDF-8.

La Figura 5 muestra la unión del GDF-8 a células de L6.

La Figura 6 muestra la inhibición dependiente de la dosis de la unión específica de GDF-8 a células de L6, mediante el propéptido de GDF-8.

La Figura 7A muestra la secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión murina del propéptido de GDF-8 con Fc.

La Figura 7B muestra una proteína de fusión murina del propéptido de GDF-8 con Fc, con un ligador corto de glicina-serina-glicina-serina (GSGS) que separa el propéptido de GDF-8 de la región Fc.

La Figura 8A muestra los efectos del propéptido de GDF-8 humano y de dos proteínas de fusión murinas del propéptido de GDF-8 con Fc sobre la unión del GDF-8, en un ELISA competitivo de ActRIIB.

La Figura 8B es una tabla que compara los valores de IC_{50} del propéptido de GDF-8 humano y de dos proteínas de fusión murinas del propéptido de GDF-8 con Fc.

La Figura 9 muestra las actividades biológicas relativas del propéptido de GDF-8 humano y de la proteína de fusión del propéptido de GDF-8 murino con Fc, en un ensayo de gen informador.

La Figura 10 muestra la farmacocinética del propéptido de GDF-8 y de una proteína de fusión del propéptido de GDF-8 con Fc, yodados, después de una sola administración intravenosa de 0,2 \mug/ratón o 2 \mug/ratón, respectivamente.

La Figura 11A muestra la secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión humana del propéptido de GDF-8 con Fc de IgG1.

La Figura 11B muestra la secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión humana del propéptido de GDF-8 con Fc de IgG1, modificada para una función efectora reducida.

La Figura 12 muestra la inhibición dependiente de la dosis de la unión de GDF-8 en un ELISA competitivo de ActRIEB por el propéptido de GDF-8 humano y dos proteínas de fusión humanas de propéptido de GDF-8 con Fc.

La Figura 13 es una gráfica que muestra que el propéptido de GDF-8 modificado, administrado in vivo, aumenta la masa del gastrocnemio y del cuadriceps, y disminuye la masa de grasa, pero no afecta a la masa del riñón o del hígado, en comparación con ratones no tratados o con ratones tratados con la proteína de control, IgG2aFc.

Las Figuras 14A-P ilustran secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos que corresponden a las SEC ID nº: 1 a 16, y las anotaciones que allí se hacen.

Definiciones

Las expresiones "GDF-8", "proteína de GDF-8" o "polipéptido de GDF-8" se refieren a un factor específico de crecimiento y diferenciación que incluye pero no se limita al que se expone en la SEC ID nº:1, y cualquiera de sus homólogos conocidos ahora o descritos más tarde, incluyendo homólogos de otras especies. Se prefieren de manera particular los homólogos de mamífero, y los más preferidos son los de ser humano. La presente invención también abarca a moléculas de GDF-8 y homólogos procedentes de todas las otras fuentes, incluyendo pero sin limitarse a GDF-8 de bóvido, perro, gato, pollo, múrido, rata, porcino, ovino, pavo, mandril y pez. En McPherron et al. (1997) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 94: 12457-12461 se han descrito diversas moléculas del GDF-8. Los homólogos son bien conocidos en la técnica. La homología se puede determinar por cualquier método conocido en la técnica, o como se describe en la presente memoria. El GDF-8 o la proteína del GDF-8 pueden ser de origen natural o sintético. Estos términos incluyen la forma precursora no procesada de longitud completa de la proteína ("proteína precursora del GDF-8"), así como también las formas maduras que resultan de la escisión tras la traducción del propéptido. Los términos también se refieren a cualesquiera fragmentos o variantes del GDF-8 que mantienen una o más actividades biológicas asociadas con una proteína del GDF-8, como se describe en la presente memoria, incluyendo secuencias que se han modificado con cambios conservativos o no conservativos con respecto a la secuencia de
aminoácidos.

La expresión "GDF-8 maduro" se refiere a la proteína o polipéptido que se escinde del dominio carboxi terminal de la proteína precursora del GDF-8. En la SEC ID nº:3 se proporciona una forma humana de la proteína del GDF-8 maduro. El GDF-8 maduro puede se de origen natural o sintético. El GDF-8 maduro puede estar presente como un monómero, homodímero, o puede estar presente en un complejo latente de GDF-8. Dependiendo de las condiciones in vivo o in vitro, el GDF-8 maduro puede establecer un equilibrio entre cualquiera o la totalidad de estas formas diferentes. Sin limitación respecto al mecanismo, se cree que el GDF-8 maduro es biológicamente activo como un homodímero. En su forma biológicamente activa, el GDF-8 maduro también se denomina como "GDF-8 activo".

La frase "actividad de GDF-8" se refiere a una o más actividades fisiológicamente reguladoras del crecimiento o morfogenéticas, asociadas con la proteína del GDF-8 activo. Por ejemplo, el GDF-8 activo es un regulador negativo de la masa del músculo esquelético. El GDF-8 activo también puede modular la producción de enzimas específicas del músculo (por ejemplo, creatina quinasa), estimular la proliferación de mioblastocitos, y modular la diferenciación de los preadipocitos a adipositos. También se cree que el GDF-8 aumenta la sensibilidad a la insulina y a la absorción de glucosa en tejidos periféricos, particularmente en músculo esquelético o adipocitos. En consecuencia, las actividades biológicas del GDF-8 incluyen, pero no se limitan a, la inhibición de la formación de músculo, la inhibición del crecimiento de células del músculo, la inhibición del desarrollo del músculo, la disminución de la masa muscular, la regulación de enzimas específicas del músculo, la inhibición de la proliferación de mioblastocitos, la modulación de la diferenciación de los preadipocitos a adipocitos, el aumento de la sensibilidad a la insulina, las regulaciones de la absorción de glucosa, la hemostasis de la glucosa, y la modulación del desarrollo y mantenimiento de células neuronales. En la SEC ID nº: 1 se proporciona una forma humana de la proteína precursora del GDF-8 de longitud completa.

La expresión "Propéptido de GDF-8" se refiere a un polipéptido que se escinde del dominio amino terminal de la proteína precursora del GDF-8. El propéptido de GDF-8 está asociado con una o más actividades biológicas que incluyen pero no se limitan a la capacidad para unirse a proteína u homodímero de GDF-8 maduro, la capacidad para inhibir una o más actividades biológicas del GDF-8, la capacidad para potenciar el desarrollo muscular, la capacidad para potenciar la masa muscular, la capacidad para promover la formación de músculo, la capacidad para promover la proliferación de células del músculo. El propéptido de GDF-8 puede ser de origen natural o sintético. Un ejemplo de un propéptido del GDF-8 incluye, pero no se limita a, la forma humana del propéptido del GDF-8 provista en la SEC ID nº: 5. En una forma de realización, el propéptido del GDF-8 es capaz de unirse al dominio de unión al propéptido del GDF-8 maduro. En otra forma de realización, el propéptido del GDF-8 es capaz de inhibir una o más actividades de un GDF-8 maduro.

La expresión "inhibidor de GDF-8" incluye cualquier agente capaz de inhibir la actividad, expresión, procesamiento, o secreción de una proteína de GDF-8, GDF-8 maduro, o un homodímero de GDF-8 u otra molécula de GDF-8 activa, incluyendo pero sin limitarse a propéptidos de GDF-8 modificados y propéptidos de BMP-11 modificados. Un inhibidor de GDF-8 también incluye cualquier agente capaz de ponteciar la unión de un propéptido de GDF-8 a una molécula de GDF-8 maduro, o a un homodímero de GDF-8. Tales inhibidores incluyen pero no se limitan a proteínas, anticuerpos, péptidos, peptidomiméticos, ribozimas, oligonucleótidos antisentido, ARN bicatenarios, y otras pequeñas moléculas. En una forma de realización, la actividad de una proteína de GDF-8 es inhibida por un propéptido de GDF-8 modificado como se describe en los Ejemplos 3 - 6. En otra forma de realización, la actividad de una proteína de GDF-8 es inhibida por un propéptido de BMP-11 modificado.

La expresión "Un complejo latente de GDF-8" se refiere a un complejo de proteínas formado entre un homodímero de GDF-8 maduro y un propéptido de GDF-8. Sin limitación en cuanto al mecanismo, se cree que dos propéptidos de GDF-8 se asocian con dos moléculas de GDF-8 maduro en el homodímero, para formar un complejo tetramérico inactivo o latente. El complejo latente puede incluir otros inhibidores de GDF en lugar de o además de uno o más de los propéptidos de GDF-8.

La expresión "propéptido de GDF-8 modificado" se refiere a un inhibidor de GDF-8 que comprende un propéptido de GDF-8 modificado, un fragmento o una variante de éste, el cual retiene una o más actividades biológicas de un propéptido de GDF-8, y comprende además una modificación estabilizadora como se establece en la presente memoria. Las formas variantes del propéptido de GDF-8 incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, propéptidos de GDF-8 que han sido modificados para que incluyan mutaciones (incluyendo la inserción, supresión y sustitución de aminoácidos) en el péptido señal o sitios de escisión proteolítica del propéptido, para hacer que estos sitios sean menos susceptibles a la escisión proteolítica. En una forma de realización preferida, el propéptido de GDF-8 modificado tiene una semivida sustancialmente mayor con relación a la del correspondiente propéptido de GDF-8 no modificado. En una forma de realización muy preferida, el propéptido de GDF-8 modificado de la invención tiene una semivida in vivo incrementada (según se determina, por ejemplo, por el método expuesto en el Ejemplo 8). En otra forma de realización, el propéptido de GDF-8 modificado es capaz de inhibir una o más actividades de un GDF-8
maduro.

Las expresiones "BMP-11", "proteína de BMP-11" o "polipéptido de BMP-11" se refieren a un factor de crecimiento y diferenciación específico que incluye pero no se limita a aquel expuesto en la SEC ID nº: 7, y cualquiera de sus homólogos que se conozca actualmente o que se describa más tarde, incluyendo homólogos de otras especies. Los homólogos de mamífero son los que se prefieren de manera particular; lo más preferible, los homólogos de seres humanos. En McPherron et al. (1997) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 94: 12457-12461 se han descrito diversas moléculas de la BMP-11. Los homólogos son bien conocidos en la técnica. La homología se puede determinar por cualquier método conocido en la técnica, o como se describe en la presente memoria. La BMP-11 o la proteína de BMP-11 puede ser de origen natural o sintética. Estos términos incluyen la forma precursora sin procesar de longitud completa de la proteína ("proteína precursora de BMP-11"), así como también las formas maduras que resultan de la escisión tras la traducción del propéptido. Los términos se refieren también a cualesquiera fragmentos o variantes de la BMP-11 que mantengan una o más actividades biológicas asociadas con una proteína de BMP-11, como se describe en la presente memoria, incluyendo secuencias que se han modificado con cambios conservativos o no conservativos con respecto a la secuencia de aminoácidos.

"BMP-11 madura" se refiere a la proteína o polipéptido que se escinde del dominio carboxi terminal de la proteína precursora de BMP-11. En la SEC ID nº: 9 se proporciona una forma humana de la proteína de BMP-11 madura. La BMP-11 madura puede ser de origen natural o sintético. La BMP-11 madura puede estar presente como un monómero, homodímero, o puede estar presente en un completo latente de BMP-11. Dependiendo de las condiciones in vivo o in vitro, la BMP-11 madura puede establecer un equilibrio entre cualquiera o todas estas formas diferentes. Sin limitación respecto al mecanismo, se cree que la BMP-11 madura es biológicamente activa como un homodímero. En su forma biológicamente activa, la BMP-11 madura también se denomina como "BMP-11 activa".

"Propéptido de BMP-11" se refiere a un polipéptido que se escinde del dominio amino terminal de la proteína precursora de BMP-11. El propéptido de BMP-11 está asociado con una o más actividades biológicas, incluyendo pero sin limitarse a la capacidad para unirse a una proteína u homodímero de GDF-8 maduro, la capacidad para inhibir una o más actividades biológicas de GDF-8, la capacidad para potenciar el desarrollo muscular, la capacidad para potenciar la masa muscular, la capacidad para promover la formación de músculo y la capacidad para promover la proliferación de células de músculo. El propéptido de BMP-11 puede ser de origen natural o sintético. Un ejemplo de un propéptido de BMP-11 incluye, pero no se limita a, una forma humana del propéptido de BMP-11 proporcionada en la SEC ID nº: 11.

La expresión "propéptido de BMP-11 modificado" se refiere a un inhibidor de GDF-8 que comprende un propéptido de BMP-11 modificado, o fragmento o variante de éste, el cual retiene una o más actividades biológicas de un propéptido de BMP-11, y que comprende además una modificación estabilizadora como se expone en la presente memoria. Las formas variantes del propéptido de BMP-11 incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, propéptidos de BMP-11 que han sido modificados para que incluyan mutaciones (incluyendo la inserción, supresión y sustitución de aminoácidos) en el péptido serial o sitios de escisión proteolítica del propéptido, para hacer que estos sitios sean más o menos susceptibles a la escisión proteolítica.

Los propéptidos de GDF-8 de la invención se denominan de manera colectiva como "propéptidos de GDF".

Las proteínas de GDF-8 de la invención se denominan de manera colectiva como "polipéptidos de GDF" o "proteínas de GDF".

Los métodos y composiciones de la invención proporcionan inhibidores de GDF que reducen la actividad de proteína de GDF con relación a la actividad de una proteína de GDF, según se compara con la misma proteína de GDF no unida por un inhibidor. En ciertas formas de realización, la actividad de una proteína de GDF, cuando está unida por uno o más de los propéptidos de GDF modificados, se reduce por lo menos aproximadamente 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% o 55%, preferentemente por lo menos aproximadamente 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86% u 88%, más preferentemente por lo menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93% o 94%, e incluso más preferentemente por lo menos aproximadamente 95% a 100%, con relación a la misma proteína de GDF que no está unida por dichos propéptidos modificados. En una forma de realización preferida, el inhibidor de GDF es un propéptido de GDF-8 modificado enlazado covalentemente a una región Fc de una molécula de IgG.

La expresión "modificación estabilizadora" es cualquier modificación conocida en la técnica o expuesta en la presente memoria capaz de estabilizar una proteína, mejorar la semivida in vitro de una proteína, mejorar la semivida circulatoria de una proteína y/o reducir la degradación proteolitica de una proteína. Tales modificaciones estabilizadoras incluyen pero no se limitan a proteínas de fusión (incluyendo, por ejemplo, proteínas de fusión que comprenden un propéptido de GDF y una segunda proteína), la modificación de un sitio de glucosilación (incluyendo, por ejemplo, la adición de un sitio de glucosilación a un propéptido de GDF), y la modificación del resto de hidrato de carbono (incluyendo, por ejemplo, la eliminación de restos de hidrato de carbono de un propéptido de GDF). En el caso de una modificación estabilizadora que comprende una proteína de fusión (por ejemplo, de forma que una segunda proteína se fusione a un propéptido de GDF), la segunda proteína se puede denominar como una "porción estabilizadora" o una "proteína estabilizadora". Por ejemplo, en una forma de realización, un propéptido de GDF-8 modificado de la invención comprende una fusión entre un propéptido de GDF-8 humano (con un sitio de escisión inactivado) y una molécula de IgG (IgG la cual actúa como la proteína estabilizadora o la porción estabilizadora). Como se utiliza en la presente memoria, además de hacer referencia a una segunda proteína de una proteína de fusión, una "porción estabilizadora" también incluye modificaciones no proteinosas tales como un resto de hidrato de carbono, o polímero no proteinoso.

Los términos "aislado" o "purificado" se refieren a una molécula que está sustancialmente libre de su entorno natural. Por ejemplo, una proteína aislada está sustancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes procedentes de la célula o de la fuente de tejido de la cual deriva. La frase "sustancialmente libre de material celular" se refiere a preparaciones en las que la proteína aislada es por lo menos 70% a 80% pura (peso/peso), más preferentemente por lo menos 80-89% (peso/peso) pura, incluso más preferentemente 90-95% pura, y lo más preferible por lo menos 96%, 97%, 98%, 99% o 100% pura (peso/peso).

La expresión "sitio de escisión" se refiere a un sitio proteolítico en una proteína o polipéptido sobre el que actúa una enzima proteolítica, dando como resultado la escisión del enlace peptídico. En una forma de realización, un sitio de escisión de la invención es "RSRR" como se representa por el código de aminoácidos de una sola letra.

La expresión "región Fc de una molécula de IgG" se refiere al dominio Fc de una inmunoglobulina del isotipo IgG, como es bien conocido por aquellos expertos en la materia. La región Fc de una molécula de IgG es aquella porción de la molécula de IgG (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) que es responsable del aumento de la semivida en suero in vivo de la molécula de IgG. Preferentemente, la molécula de IgG es IgG1.

"Semivida in vitro" se refiere a la estabilidad de una proteína medida fuera del contexto de un organismo vivo. Los ensayos para medir la semivida in vitro son bien conocidos en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a, SDS-PAGE, ELISA, ensayos basados en células, radiomarcado y seguimiento, transferencia western, transferencia northern, etc. Estos y otros ensayos útiles son bien conocidos en la técnica.

"Semivida in vivo" se refiere a la estabilidad de una proteína en un organismo. La semivida in vivo se puede medir por un número de métodos conocidos en la técnica, y que incluyen pero no se limitan a semivida en suero in vivo, semivida circulatoria, y los ensayos expuestos en la presente memoria en los ejemplos.

"Semivida en suero in vivo" se refiere a la semivida de una proteína que circula en la sangre de un organismo. En una forma de realización, la semivida in vivo se mide como se expone en el Ejemplo 8. Se pueden usar otros métodos conocidos en la técnica para medir la semivida in vivo.

El término "mamífero" incluye definiciones conocidas en la técnica, y también se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo los seres humanos, animales domésticos y de granja, así como animales de zoológico, de deportes o mascotas tales como perros, gatos, ovejas, cerdos, vacas, etc. En una forma de realización preferida, el mamífero es un ser humano.

La expresión "superfamilia de TGF-\beta" se refiere a una familia de factores de crecimiento estructuralmente relacionados, la totalidad de los cuales poseen propiedades reguladoras del crecimiento y morfogenéticas fisiológicamente importantes. Esta familia de factores de crecimiento relacionados es bien conocida en la técnica (Kingsley et al. (1994) Genes Dev. 8:133-46; y Hoodless et al. (1998) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 228:235-72). La superfamilia de TGF-\beta incluye Proteínas Morfogenéticas Óseas (BMP), Activinas, Inhibinas, Sustancia Inhibidora de Mullerian, Factor Neurotrófico Derivado de Neurogliales, y un número todavía creciente de Factores de Crecimiento y Diferenciación (GDF), tales como GDF-8 (miostatina). Muchas de estas proteínas están relacionadas en estructura con GDF-8, tal como la BMP-11 (también conocida como GDF-11), y/o en actividad, tal como la activina.

El término "tratamiento" se refiere tanto a tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas. Aquellos que necesitan tratamiento pueden incluir individuos que ya tienen un trastorno médico particular, así como también aquellos que finalmente adquieren el trastorno (esto es, aquellos que requieren medidas preventivas).

Las expresiones "transformación" y "transfección" se refieren a una variedad de técnicas reconocidas en la técnica para introducir ácido nucleico extraño (esto es, ADN y ARN) en una célula hospedante, incluyendo pero sin limitarse a coprecipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección y electroporación.

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Descripción detallada de las formas de realización preferidas

La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que los propéptidos de GDF tienen una semivida in vivo corta, reduciendo de ese modo su eficacia como inhibidores farmacológicos de la actividad del GDF-8 o de la BMP-11. En consecuencia, en un aspecto, la invención se refiere a un propéptido de GDF-8 modificado y estabilizado que tiene propiedades farmacocinéticas mejoradas, específicamente una semivida circulatoria incrementada.

La presente invención proporciona nuevos propéptidos de GDF modificados que forman complejos inactivos con proteínas de GDF (por ejemplo, proteínas de GDF-8 y BMP-11) in vitro e in vivo. Los propéptidos de GDF modificados de la invención se unen preferentemente a un dominio de unión a propéptido, en la proteína de GDF madura. En consecuencia, en ciertas formas de realización de la invención, el propéptido de GDF modificado comprende una proteína de fusión entre un propéptido de GDF y una proteína estabilizadora. Una proteína estabilizadora puede ser cualquier proteína que potencie la estabilidad global del propéptido de GDF modificado. Como se reconocerá por el experto en la materia, dicha proteína de fusión puede comprender opcionalmente un péptido ligador entre la porción de propéptido y la porción estabilizadora. Como es bien conocido en la técnica, las proteínas de fusión se preparan de tal forma que la segunda proteína se fusiona en marco con la primera proteína, de manera que la proteína traducida resultante comprenda tanto la primera como la segunda proteína. Por ejemplo, en la presente invención, se puede preparar una proteína de fusión de forma que la porción del propéptido de GDF esté fusionado a una segunda proteína (por ejemplo, una porción de proteína estabilizadora). Dicha proteína de fusión se prepara de manera que la proteína traducida resultante contenga tanto la porción del propéptido como la porción estabilizadora.

En otras formas de realización, el propéptido de GDF comprende un propéptido de GDF que está modificado para que tenga una mayor semivida circulatoria in vivo, en comparación con el propéptido de GDF sin modificar. Si bien no se conoce el mecanismo preciso ni los tiempos de la unión del propéptido de GDF modificado, se cree que los propéptidos de GDF-8 modificados de la invención se unen al GDF-8 maduro y a la BMP-11 madura. En una forma de realización preferida, la presente invención proporciona propéptidos de GDF modificados que forman complejos inactivos con proteínas de GDF-8 y BMP-11 in vivo o in vitro. En una forma de realización, los propéptidos de GDF se unen preferentemente a un dominio de unión a propéptido, en la proteína del GDF-8 maduro o de la BMP-11 madura. Dicha unión puede ocurrir, por ejemplo, tras la liberación de propéptido natural en el sitio de actividad del GDF-8 y la BMP-11, tras la sustitución del propéptido natural por el propéptido de GDF-8 modificado, y/o tras la escisión del propéptido de la proteína precursora del GDF-8 y de la BMP-11. Independientemente del mecanismo, la unión del propéptido de GDF-8 modificado da como resultado una reducción en una o más de las actividades biológicas asociadas con el GDF-8, con relación a una proteína de GDF-8 madura que no está unida por el mismo propéptido modificado. En una forma de realización preferida, los propéptidos de GDF-8 modificados reducen la actividad de GDF-8 y BMP-11 asociada con la regulación negativa de la masa muscular esquelética.

En otra forma de realización preferida, la presente invención proporciona propéptidos de GDF modificados que forman complejos inactivos con proteínas de BMP-11 in vivo o in vitro. En una forma de realización, los propéptidos de GDF se unen preferentemente a un dominio de unión a propéptido, en la proteína de BMP-11 madura. En todavía otra forma de realización, el propéptido de GDF modificado es una proteína de fusión que comprende un propéptido de GDF y una región Fc de una molécula de IgG (como proteína estabilizadora). Dichos inhibidores de GDF pueden comprender un propéptido de GDF (por ejemplo como se establece en la SEC ID nº: 5), o un fragmento o variante de dicho propéptido, el cual retiene una o más actividades biológicas de un propéptido de GDF. Tales propéptidos de GDF modificados son capaces de inhibir la actividad de proteínas de GDF. Los propéptidos de GDF-8 utilizados en la invención se pueden producir de manera sintética, pueden derivar de propéptidos de GDF-8 (naturales) de origen natural, o se pueden producir de manera recombinante, utilizando cualquiera de una variedad de reactivos, células hospedantes y métodos que son bien conocidos en la técnica de la ingeniería genética. En una forma de realización, el propéptido de GDF-8 modificado comprende un propéptido de GDF-8 humano enlazado covalentemente a una molécula de IgG o a un fragmento de ésta. El propéptido de GDF-8 se puede fusionar adyacente a la región Fc de la molécula de IgG, o se puede unir a la región Fc de la molécula de IgG vía un péptido ligador. El uso de tales péptidos ligadores es bien conocido en la técnica de la bioquímica de las proteínas.

En ciertas formas de realización en las que los propéptidos de GDF modificados de la invención comprenden proteínas de fusión, la porción del propéptido de GDF de dicha proteína de fusión es preferentemente por lo menos aproximadamente 75-80% idéntica a la SEC ID nº: 5, más preferentemente por lo menos aproximadamente 81% hasta aproximadamente 85% idéntica a la SEC ID nº: 5, incluso más preferentemente por lo menos aproximadamente 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93% o 94% idéntica a la SEC ID nº: 5, y incluso todavía más preferentemente por lo menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la SEC ID nº: 5. En una forma de realización preferida, los propéptidos de GDF-8 comprenden una secuencia idéntica a las secuencias expuestas en SEC ID nº: 5. En todavía otra forma de realización preferida, la porción del propéptido de GDF de una proteína de fusión de la invención puede comprender un fragmento o variante del propéptido de GDF expuesto en SEC ID nº: 5, en tanto que el fragmento o variante retenga una o más actividades biológicas de un propéptido de GDF. En otra forma de realización preferida, los propéptidos de GDF-8 modificados comprenden una versión mutante de SEC ID nº: 5 en la que el mutante se ha modificado para incluir una o más mutaciones (incluyendo inserción, supresión, o sustitución) en tanto que el fragmento o variante retenga una o más actividades biológicas de un propéptido de GDF.

De manera crítica, en formas de realización de la invención que involucran propéptidos de GDF modificados que comprenden proteínas de fusión, es esencial que la proteína de fusión se produzca o diseñe de forma que el sitio de escisión proteolítica natural (por ejemplo, RSRR) en el propéptido de GDF esté roto, destruido, inactivado o eliminado en la proteína de fusión resultante. Como reconocerá el experto en la materia, el no hacerlo así daría como resultado que la segunda proteína (por ejemplo, la porción estabilizadora) de la proteína de fusión se escinda de la primera proteína (la poción del propéptido) de la proteína de fusión. En consecuencia, un aspecto crítico de la invención prevé la inactivación o eliminación del sitio de escisión natural en propéptidos de GDF cuando se utiliza dicho propéptido para preparar una proteína de fusión que sea un propéptido de GDF modificado de la invención. Los métodos para la inactivación de dicho sitio de escisión proteolítica son bien conocidos en la técnica, e incluyen pero no se limitan a la mutación, supresión o inserción de la secuencia de aminoácidos o de nucleótidos del sitio de escisión
proteolítica.

En todavía otras formas de realización de la invención, las mutaciones se pueden realizar en la secuencia de GDF para hacer que los sitios sean menos susceptibles a la escisión proteolítica. Por ejemplo, en una forma de realización, dicho mutante puede contener una mutación puntual en los aminoácidos 45, 46, 49, 50, 52, 53, 63, 64, 65, 66, 98 o 99 de SEC ID nº: 1. En una forma de realización preferida, la mutación puntual es una mutación puntual en el aminoácido 99 de SEC ID nº: 1. En una forma de realización particularmente preferida, la mutación puntual es una mutación puntual del aminoácido 99 de SEC ID nº: 1, de Asp a Ala. También se puede utilizar el análisis por computadora (usando un programa que está comercialmente disponible, por ejemplo, MacVector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.) para identificar sitios de escisión proteolítica. Como se reconocerá por alguien experto en la materia, cualquiera de las mutaciones, variantes o modificaciones descritas puede realizarse alternativamente a nivel del ácido nucleico. Dichas formas de realización son bien conocidas en la técnica.

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TABLA 2 Aminoácidos Ejemplares Mutables para Prevenir la Escisión de Propéptido

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\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  GDF-8  (Los números de aminoácidos se
refieren a SEC ID nº: 1)\cr  Arg-45\cr 
Gln-46\cr  Lys-49\cr 
Ser-50\cr  Arg-52\cr 
Ile-53\cr  Lys-63\cr 
Leu-64\cr  Arg-65\cr 
Leu-66\cr  Arg-98\cr 
Asp-99\cr \cr   BMP-11  (Los
números de los aminoácidos se refieren a SEC ID nº: 7)\cr 
Asp-122\cr  Ala-123\cr 
Glu-286\cr 
Leu-287\cr}

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Como se señaló anteriormente, se ha descubierto que los propéptidos de GDF tienen una semivida in vivo corta. De esta manera, para que sea farmacéuticamente útil como una agente terapéutico o profiláctico, el propéptido de GDF se debe de estabilizar química o físicamente en busca de una mayor longevidad en condiciones fisiológicas.

Los propéptidos de GDF se pueden estabilizar o modificar por cualquier medio conocido en la técnica, en tanto que el propéptido de GDF modificado mantenga una capacidad de inhibir una proteína de GDF o proteína de GDF madura. En una forma de realización preferida, el propéptido de GDF modificado mantiene su capacidad para unirse a su proteína de GDF diana o a un sitio de unión al propéptido de GDF. En una forma de realización preferida, el propéptido de GDF modificado comprende un propéptido de GDF-8 fusionado de forma adyacente a o vía un ligador, a una región Fc de una molécula de IgG. La región Fc de la IgG proporciona un efecto protector o estabilizador en el propéptido (y de esta manera actúa como una modificación estabilizadora), como se refleja en las propiedades farmacocinéticas mejoradas (esto es, semivida en suero incrementada) de la proteína de fusión cuando se comprara con el propéptido de GDF-8 no modificado correspondiente.

En una forma de realización particular, el propéptido de GDF-8 modificado comprende un propéptido de GDF-8 humano o un mutante de propéptido de GDF-8 humano; y la molécula de IgG es la región Fc de una IgGl, o una IgG4, o una región Fc de IgG1 modificada para obtener una función efectora reducida. En una forma de realización, el fragmento de IgG es IgG1 (SEC ID nº: 15). En otra forma de realización, el fragmento de IgG es IgG1 modificada para obtener una función efectora reducida (SEC ID nº: 16). Ejemplos de moléculas modificadas para obtener una función efectora reducida incluyen la modificación de la fusión de IgG1 con Fc humana, para incluir alanina (A) en las posiciones 14 y 17 del aminoácido, como se expone en SEC ID nº: 16.

Los propéptidos de GDF-8 modificados se pueden aislar o purificar de acuerdo con procedimientos estándar de aislamiento y purificación de proteínas bien conocidos en la técnica.

La presente invención también proporciona métodos para obtener propéptidos de GDF modificados que tienen una semivida in vivo o in vitro aumentada. En una forma de realización preferida, el método comprende preparar un propéptido de GDF modificado que comprende una proteína de fusión de GDF-8/Fc de IgG1 preparando una molécula de ADNc que codifica:

(1)

un propéptido de GDF (por ejemplo, propéptido de GDF-8 humano, SEC ID nº: 5), el cual está modificado para inactivar el sitio de escisión proteolítica, y la región Fc de una molécula de IgG (por ejemplo, región Fc de IgG1 humana, SEC ID nº: 15);

(2)

expresando el ADNc en un sistema de expresión procariota o eucariota apropiado, usando plásmidos y células de expresión apropiados; y

(3)

aislando y purificando la proteína de fusión expresada que contiene el propéptido de GDF modificado, en la que el propéptido de GDF modificado tiene una semivida in vivo o in vitro aumentada, según se compara con un propéptido de GDF no modificado.

Un ejemplo de tal propéptido de GDF modificado preferido de la invención se expone en la Figura 11A.

Los sistemas de expresión de ADNc son bien conocidos en la técnica de la biología molecular, así como lo son los métodos para el aislamiento y purificación de las proteínas expresadas (los ejemplos 2 y 7, en la presente memoria, proporcionan ejemplos de tales formas de realización).

En una forma de realización alternativa, las construcciones de ADNc utilizadas para la expresión de dichas proteínas de fusión pueden contener nucleótidos que codifican un péptido ligador entre los nucleótidos que codifican el propéptido de GDF y la región Fc de IgG (o porción estabilizadora). La orientación del péptido ligador con relación al GDF o a la región Fc de IgG no es importante. El péptido ligador puede comprender nucleótidos que codifican 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 o más aminoácidos de longitud. En una forma de realización particular, el péptido ligador comprende nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos que consiste en glicina-serina-glicina-serina (GSGS).

En otra forma de realización, los plásmidos de expresión pueden contener opcionalmente etiquetas que permiten el asilamiento y purificación convenientes de las proteínas expresadas. Se conocen bien en la técnica el uso de tales plásmidos de expresión etiquetados y los métodos para el aislamiento y la purificación de los productos proteínicos etiquetados.

Los propéptidos del GDF de la invención incluyen específicamente proteínas de fusión en las que la porción de la molécula del propéptido de GDF es idéntica o tiene una homología mayor que 60% con respecto a las secuencias correspondientes de GDF procedentes de una especie particular, en tanto que la porción estabilizadora, tal como la región Fc de la molécula de IgG, puede ser idéntica o tener una homología mayor que 60% con respecto a las secuencias correspondientes de IgG procedentes de una especie diferente. Por ejemplo, el propéptido de GDF-8 humano, o fragmento de éste, se puede fusionar a una región Fc de una molécula de IgG de ratón, o viceversa, en tanto que la proteína de fusión resultante presente la actividad biológica deseada, a saber, la inhibición de la actividad biológica del GDF, como se materializa en los Ejemplos 3 - 6. En formas de realización preferidas de la invención, las proteínas de fusión de la invención son quimeras de proteínas humanas. Como se comprenderá en la técnica, en el tratamiento de seres humanos se preferirán proteínas de fusión o quiméricas de proteínas
humanas.

Como una alternativa a o además de las proteínas de fusión de Fc anteriormente descritas, los propéptidos de GDF ser pueden estabilizar mediante una variedad de otros métodos y fuentes que son bien conocidos y que están fácilmente disponibles en la técnica de las proteínas. Tales métodos y materiales incluyen, por ejemplo, glucosilación, o el enlace a albúmina o un polímero no proteinoso, como se describe con detalle más adelante. Los propéptidos de GDF modificados se pueden aislar y purificar usando técnicas estándar de aislamiento y purificación de proteínas, bien conocidas en la técnica de las proteínas.

Los propéptidos de GDF o propéptidos de GDF modificados se pueden producir mediante una variedad de técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, tales propéptidos se pueden sintetizar (por ejemplo, química o recombinantemente), aislar y purificar, y se pueden ensayar para determinar su capacidad para formar complejos con proteína de GDF-8 madura o proteína de BMP-11 madura, utilizando los métodos descritos en la presente memoria o mediante métodos que se conocen en la técnica. Los propéptidos se pueden sintetizar usando técnicas estándar de química de proteínas, tales como las descritas en Boudansky, M. Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlín (1993) y Grant G.A. (ed.), Synthetic Peptides; A User 's Guide, W. Freeman and Company, New York (1992), cuyo contenido se incorpora en la presente memoria como referencia. Además, existen sintetizadores de péptidos automatizados comercialmente disponibles (por ejemplo, Advanced ChemTech Model 396; Milligen/Biosearch 9600).

Como alternativa, los propéptidos de GDF modificados o no modificados, o fragmentos de estos, se pueden producir de manera recombinante usando diversos sistemas de expresión (por ejemplo, E. coli, células de Ovario de Hámster Chino, células COS, baculovirus), como se conoce bien en la técnica. Por ejemplo, el propéptido expresado de GDF-8 se puede purificar, por ejemplo, mediante el uso del método descrito en Bottinger et al. (1996) PNAS 93:5877-5882 y Gentry y Nash (1990) Biochemistry 29:6851-6857, cuyo contenido se incorpora a la presente como referencia, o cualquier otro método reconocido en la técnica para la purificación de péptidos. Como alternativa, el propéptido de GDF modificado o no modificado, o fragmento de éste, se puede etiquetar, por ejemplo, con FLAG o 6-His para la purificación subsiguiente usando técnicas establecidas en la técnica de proteínas.

Los propéptidos de GDF-8 modificados o sin modificar se pueden producir además mediante digestión de GDF-8 o BMP-11 de origen natural o producidos de manera recombinante usando, por ejemplo, una proteasa, por ejemplo, tripsina, termolisina, quimotripsina, pepsina o enzima de conversión de aminoácidos básicos emparejados (PACE). El análisis por computadora (usando un programa comercialmente disponible, por ejemplo, MacVector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.) se puede usar para identificar los sitios de escisión proteolítica. Alternativamente, tales propéptidos de GDF se pueden producir a partir de GDF-8 de origen natural o producidos de manera recombinante, tal como técnicas estándar conocidas en la técnica, tales como mediante escisión química (por ejemplo, bromuro de cianógeno, hidroxilamina).

Las porciones del propéptido de GDF-8 proteolíticas o sintéticas del propéptido de GDF modificado pueden comprender tantos restos de aminoácido como sean necesarios para unirse a la proteína de GDF diana, inhibiendo de ese modo, parcial o completamente, la actividad del GDF-8 o de la BMP-11. Los Ejemplos 4 - 6 que en la presente memoria se presentan ilustran formas de realización de ensayos de unión y de inhibición. En particular, están incluidos dentro del alcance de la invención fragmentos funcionales de secuencias de propéptido de GDF-8 que mantienen la capacidad para modular o inhibir GDF-8. Las porciones del propéptido de GDF-8 comprenden preferentemente por lo menos 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ó 90 aminoácidos, más preferentemente por lo menos 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180 ó 190 aminoácidos; y lo más preferible, por lo menos 200, 210, 220, 230 ó 240 o más aminoácidos de longitud. En una forma de realización preferida, la porción del propéptido de GDF-8 del propéptido de GDF-8 modificado tiene una longitud de 243 aminoácidos, esto es, correspondiente a las SEC ID nº: 5. La secuencia señal para GDF-8 humano se expone en SEC ID nº: 13, e incluye los primeros 23 aminoácidos de SEC ID nº:1.

La secuencia señal para BMP-11 humana se expone en SEC ID nº: 14, e incluye los primeros 24 aminoácidos de SEC ID nº: 7. La identificación de una secuencia de propéptido de GDF-8 o BMP-11 parcial como un fragmento funcional de propéptido de GDF-8 o BMP-11 se puede determinar fácilmente, por ejemplo, utilizando los ensayos descritos en los Ejemplos 4-6 que se presentan en la presente memoria.

Además de las secuencias del propéptido truncadas, las variantes del propéptido en la presente memoria incluyen de manera específica propéptidos de GDF que tienen mutaciones puntuales u otras modificaciones (incluyendo inserción, supresión, y sustitución), en tanto que tales variantes contengan una o más actividades biológicas o inhibidoras deseadas de un propéptido de GDF. Tal actividad se puede medir, por ejemplo, como se describe en los Ejemplos 4-6. Tales modificaciones se pueden introducir dentro de la molécula para potenciar la actividad, la semivida circulatoria o de almacenamiento, o la producción del propéptido de GDF-8. Por ejemplo, las mutaciones puntuales se pueden introducir dentro de uno o más sitios de escisión proteolítica para prevenir o inhibir la degradación proteolítica in vivo del propéptido de GDF-8 modificado. El análisis por computadora (usando un programa que está comercialmente disponible, por ejemplo, MacVector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.) se puede utilizar para identificar sitios de escisión proteolitica.

En consecuencia, los métodos para obtener los propéptidos de GDF de la invención incluyen de manera específica, además de las secuencias codificantes de ADNc de tipo natural, secuencias codificantes de ADNc que codifican los propéptidos de GDF de tipo natural pero que difieren de la secuencia de ADNc procedente de la secuencia de ADNc del GDF de tipo natural debido a las degeneraciones del código genético o variaciones alélicas (cambios de bases que ocurren de manera natural en las poblaciones de especies que pueden o no dar como resultado un cambio de aminoácidos). La invención también contempla secuencias de ADN que se hibridan en condiciones de hibridación restrictivas (en una forma de realización como se describe en T. Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, p. 387-389) a un ácido nucleico que codifica un propéptido de GDF o a un ácido nucleico que codifica una proteína o un polipéptido que tiene la capacidad para unirse a una proteína de GDF particular, como se materializa en los Ejemplos 4-6. También son útiles para la presente invención variaciones en las secuencias de ADNc causadas por mutaciones puntuales o mediante modificaciones inducidas (por ejemplo, inserción, supresión, y sustitución) para potenciar la actividad, la semivida o la producción de los propéptidos de GDF-8 codificados mediante éstas. Los programas de computación útiles en la determinación de la homología de la secuencia de ADN son conocidos en la técnica y se describen en la presente memoria.

La capacidad de un propéptido de GDF modificado para formar un complejo no covalente con una proteína de GDF se puede evaluar mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica, incluyendo la cromatografia de exclusión por tamaños y/o análisis de reticulación, como se describe en el Ejemplo 2 en la presente memoria. Como se muestra en el Ejemplo 2, el propéptido de GDF-8 forma una asociación no covalente con proteína de GDF-8 madura. El complejo de GDF-8 maduro/propéptido de GDF-8 tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 75 kDa.

Como se ha establecido anteriormente, además del método de fusión con Fc, los propéptidos de GDF se pueden estabilizar mediante un número de otras técnicas. En una forma de realización, una porción estabilizadora se enlaza covalentemente a una porción del propéptido de GDF para crear una proteína de fusión. Por ejemplo, el propéptido de GDF-8 se puede enlazar a uno o más de una variedad de polímeros no proteinosos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol, o polioxialquilenos, en la forma como se expone en las patentes de U.S. nº 4.640.835, nº 4.496.689, nº 4.301.144, nº 4.670.417, nº 4.791.192 o nº 4.179.337. En ciertas formas de realización, los propéptidos de GDF se modifican químicamente mediante conjugación covalente a un polímero para incrementar su semivida circulatoria. Los polímeros preferidos, y los métodos para unirlos a péptidos, también se describen en las patentes U.S. nº 4.766.106, nº 4.179.337, nº 4.495.285 y nº 4.609.546.

En otra forma de realización, el propéptido de GDF-8 se puede modificar para que tenga un patrón de glucosilación alterado (es decir, alterado con respecto al patrón de glucosilación de tipo natural). Como se utiliza en la presente memoria, "alterado" significa que tiene uno o más restos de hidrato de carbono añadidos a o suprimidos del propéptido de GDF de tipo natural. La glucosilación de proteínas y polipéptidos es típicamente mediante enlace a N o mediante enlace a O. Enlace a N se refiere a la unión del resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de un resto de asparagina. Las secuencias tripeptídicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en las que X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de asparagina. De este modo, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un sitio de glucosilación potencial. Glucosilación mediante enlace a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, más habitualmente serina o treonina, aunque también se puede usar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

La adición o supresión de sitios de glucosilación al propéptido de GDF se logra de manera conveniente alterando la secuencia de aminoácidos de forma que contenga u omita una o más de las secuencias tripeptídicas anteriormente descritas (para sitios de glucosilación mediante enlace a N). La alteración también se puede realizar mediante adición de, o sustitución por, uno o más restos de serina o treonina a la secuencia del propéptido de GDF de tipo natural (para sitios de glucosilación mediante enlace a O). Por facilidad, la secuencia de aminoácidos del propéptido de GDF se altera preferentemente a través de cambios a nivel de ADN, cuyas técnicas son bien conocidas en la
técnica.

Otros medios para aumentar el número de restos de hidrato de carbono en el propéptido de GDF es mediante acoplamiento químico o enzimático de glucósidos al propéptido de GDF. Estos procedimientos son ventajosos por cuanto no requieren la producción del propéptido de GDF en una célula hospedante que tenga capacidades de glucosilación para glucosilación mediante enlace a N o a O. Dependiendo del modo de acoplamiento utilizado, el(los) azúcar(es)
se puede(n) unir a (a) arginina e histidina; (b) grupos carboxilo libres; (c) grupos sulfhidrilo libres tales como los de cisteína; (d) grupos hidroxilo libres tales como los de serina, treonina o hidroxiprolina; (e) restos aromáticos tales como los de fenilalanina, tirosina o triptófano; o (f) el grupo amida de glutamina. Estos métodos se describen en el documento WO 87/05330, publicado el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., p. 259-306.

La eliminación de cualesquiera restos de hidrato de carbono presentes en el propéptido de GDF se puede lograr de manera química o enzimática. La desglucosilación química requiere la exposición del propéptido de GDF al compuesto ácido trifluorometanosulfónico, o a un compuesto equivalente. Este tratamiento da como resultado la escisión de la mayoría o de la totalidad de los azúcares, excepto el azúcar enlazante (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), a la vez que se deja intacta la secuencia de aminoácidos.

La desglucosilación química se describe por Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259:52 y por Edge et al. (1981) Anal. Biochem. 118:131. La escisión enzimática de restos de hidrato de carbono en propéptidos de GDF se puede lograr mediante el uso de una variedad de endo- y exo-glucosidasas, como se describe por Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol. 138:350.

Cuando el propéptido de GDF modificado es una proteína de fusión de propéptido de GDF con Fc, como se describió anteriormente, la región Fc de la molécula de IgG también se puede modificar para que tenga un patrón de glucosilación alterado.

En otra forma de realización, un propéptido de GDF se enlaza a la proteína albúmina o a un derivado de albúmina. Los métodos para enlazar proteínas y polipéptidos a la proteína albúmina o a derivados de albúmina son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la patente US nº 5.116.944 (Sivam et al.), incorporada en la presente memoria como referencia.

Se comprenderá por el experto en la materia que determinados aminoácidos se pueden sustituir por otros aminoácidos en una estructura proteínica sin afectar de manera adversa la actividad de la proteína. De este modo, se contempla que se pueden hacer diversos cambios en las secuencias de aminoácidos de los propéptido de GDF modificados o sin modificar, o en las secuencias de ADN que codifican tales propéptidos, sin pérdida apreciable de su utilidad o actividad biológica. En una forma de realización, dicha actividad se mide en los Ejemplos 4-6. Tales cambios pueden incluir, pero no se limitan a, supresiones, inserciones, truncamientos, sustituciones, fusiones y similares. Por ejemplo, están explícitamente abarcadas por la presente invención alteraciones de las secuencias de aminoácidos en sitios de escisión proteolítica dentro del propéptido de GDF modificado.

Al realizar tales cambios, se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos. Generalmente se comprende en la técnica la importancia del índice hidropático de aminoácidos al conferir función biológica interactiva en una proteína (Kyte y Doolittle (1982) J. Mol. Biol. 157:105-132). Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, la cual a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos y similares.

A cada aminoácido se le ha sido asignado un índice hidropático en base a su hidrofobia y características de carga (Kyte y Doolittle, 1982, más arriba); estos son isoleucina (+4,5), valina (+4,2), leucina (+3,8), fenilalanina (+2,8), cisteína/cistina (+2,5), metionina (+1,9), alanina (+1,8), glicina (-0,4), treonina (-0,7), serina (-0,8), triptófano (-0,9), tirosina (-1,3), prolina (-1,6), histidina (-3,2), glutamato (-3,5), glutamina (-3,5), aspartato (-3,5), asparagina (-3,5), lisina (-3,9), y arginina (-4,5).

Al hacer dichos cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de \pm 2; se prefieren de manera particular aquellos que se encuentran dentro de \pm 1; y todavía son incluso más particularmente preferibles aquellos que se encuentran dentro de \pm 0,5.

También se comprende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares se puede realizar de manera efectiva en base a la hidrofilia. Por ejemplo, la patente US nº 4.554.101 establece que la hidrofilia media local más grande de una proteína, según se gobierna por la hidrofilia de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con una propiedad biológica de la proteína.

Como se detalla en la patente US número 4.554.110, se han asignado los siguientes valores de hidrofilia a los restos de aminoácidos: arginina (+3,0), lisina (+3,0), aspartato (+3,0 \pm 1), glutamato (+3,0 \pm 1), serina (+0,3), asparagina (+0,2), glutamina (+0,2), glicina (0), treonina (-0,4), prolina (-0,5 \pm 1), alanina (-0,5), histidina (-0,5), cisteína (-1,0), metionina (-1,3), valina (-1,5), leucina (-1,8), isoleucina (-1,8), tirosina (-2,3), fenilalanina (-2,5) y triptófano (-3,4).

Al realizar dichos cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilia estén dentro de \pm2; se prefieren de manera particular aquellos que se encuentran dentro de \pm1; y todavía son de manera particular más preferibles aquellos que se encuentran dentro de \pm0,5.

Las modificaciones pueden ser conservativas de manera que la estructura o función biológica de la proteína no se vea afectada por el cambio. Dichas modificaciones de aminoácido conservativas se basan en la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral de aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobia, hidrofilia, carga, tamaño, y similares. Son bien conocidas por los expertos en la materia las sustituciones conservativas ejemplares que toman en consideración diversas de las características precedentes, e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina. La secuencia de aminoácidos de los propéptidos de GDF modificados se puede modificar para que tenga cualquier número de cambios conservativos, en tanto que la unión del propéptido de GDF modificado a su proteína de GDF diana no se vea afectada de manera adversa.

Preferentemente, la similitud o identidad de secuencia relativa (también conocida en las técnicas de la biología molecular y de proteínas como homología de secuencias) se determina utilizando los programas "BestFit" o "Gap" del Sequence Analysis Software Package^{TM} (Versión 10, Genetics Computer Group, Inc., University of Wisconsin Biotecnology Center, Madison, WI). "Gap" utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970) para encontrar el alineamiento de dos secuencias que maximiza el número de concordancias y minimiza el número de saltos. "BestFit" realiza un alineamiento óptimo del mejor segmento de similitud entre dos secuencias. Los alineamientos óptimos se encuentran insertando saltos para maximizar el número de concidencias usando el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (Smith y Waterman, 1981; Smith et al., 1983).

El Sequence Analysis Software Package^{TM} descrito anteriormente contiene un número de otras herramientas de análisis de secuencia útiles para la identificación de homólogos de las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos que se describen en la presente. Por ejemplo, el programa "BLAST" (Altschul, et al. 1990) investiga secuencias similares a una secuencia pregunta (ya sea péptido o ácido nucleico) en una base de datos específica (por ejemplo, bases de datos de secuencias mantenidas en el National Center for Biotechnology Information (NCBI) en Bethesda, Maryland, USA), "FastA" (Lipman y Pearson, 1985; véase también Pearson y Lipman, 1988; Pearson, et al., 1990) realiza una búsqueda de similitudes de Pearson y Lipman entre una secuencia pregunta y un grupo de secuencias del mismo tipo (ácido nucleico o proteína); "TfastA" realiza una búsqueda de similitudes de Pearson y Lipman entre una secuencia pregunta de proteína y cualquier grupo de secuencias de nucleótidos (traduce las secuencias de nucleótidos en los seis marcos de lectura antes de efectuar la comparación); "FastX" realiza una búsqueda de similitudes de Pearson y Lipman entre una secuencia pregunta de nucleótidos y un grupo de secuencias de proteína, tomando en cuenta desplazamientos del marco. "TfastX" realiza una búsqueda de similitudes de Pearson y Lipman entre una secuencia pregunta de proteína y cualquier grupo de secuencias de nucleótidos, tomando en cuenta desplazamientos del marco (traduce ambas cadenas de la secuencia de ácidos nucleicos antes de realizar la comparación).

El experto en la materia reconocerá que los propéptidos de GDF modificados o sin modificar pueden contener cualquier número de sustituciones en sus secuencias de aminoácidos sin alterar sus propiedades biológicas. En una forma de realización preferida, tales cambios son sustituciones conservativas de aminoácidos, las cuales son bien conocidas en la técnica. Son bien conocidas por los expertos en la materia de la bioquímica de proteínas las sustituciones conservativas ejemplares que toman en consideración diversas de las características anteriores, e incluyen, pero no se limitan a: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.

En ciertas formas de realización de la invención, la estabilidad in vivo de una proteína se puede medir en un gran número de formas. En una forma de realización, se cosechan muestras de suero o de tejido en una variedad de puntos de tiempo tras la administración de la proteína ya sea en forma intravenosa o intraperitoneal, o la proteína se marca radioactivamente, es decir, con yodo-125, utilizando métodos bien conocidos en la técnica. La cantidad de radiactividad presente en cada muestra de suero o tejido se puede determinar utilizando un contador gamma. En otra forma de realización, la integridad/estabilidad de la proteína en el suero se puede evaluar mediante SDS-PAGE seguido de autoradiografia o de análisis de trasnferencia Western. En otra forma de realización, la actividad biológica de la proteína se puede medir utilizando uno cualquiera de un número de ensayos funcionales bien conocidos en la técnica, incluyendo un ELISA o ensayos basados en células.

Métodos de Tratamiento de Enfermedades

Los propéptidos de GDF de la presente invención son útiles para prevenir o tratar diversos trastornos médicos en seres humanos o animales. Los propéptidos de GDF se utilizan preferentemente para inhibir o reducir una o más actividades asociadas con una proteína de GDF. En una forma de realización muy preferida, el propéptido de GDF modificado inhibe o reduce una o más de las actividades del GDF-8 maduro con relación a una proteína de GDF-8 maduro que no está unida por el mismo propéptido. En una forma de realización preferida, la actividad de la proteína de GDF-8 maduro, cuando está unida por uno o más de los propéptidos de GDF modificados, está inhibida por lo menos 50%, preferentemente por lo menos 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86% u 88%, más preferentemente por lo menos 90%, 91%, 92%, 93% o 94%, y aún más preferentemente por lo menos 95% a 100%, con relación a una proteína de GDF-8 maduro que no está unida por uno o más de los propéptidos de GDF modificados.

El trastorno médico que está siendo tratado o prevenido por los propéptidos de GDF modificados es preferentemente un trastorno muscular o neuromuscular (tal como esclerosis lateral amiotrófica, distrofia muscular, atrofia muscular, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, síndrome de emaciación muscular, sarcopenia o caquexia), una enfermedad metabólica (tal como diabetes de tipo 2, diabetes mellitus no dependiente de insulina, hiperglucemia, u obesidad), un trastorno del tejido adiposo (tal como obesidad) o enfermedad degenerativa ósea (tal como osteoporosis). Lo más preferible, la afección médica es un trastorno muscular o neuromuscular, tal como esclerosis lateral amiotrófica, distrofia muscular, atrofia muscular, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, síndrome de emaciación muscular, sarcopenia o caquexia. En otra forma de realización preferida, la afección médica es una enfermedad o trastorno metabólico, tal como aquel que resulta de un metabolismo disfuncional de la glucosa y/o resistencia a la insulina, tal como diabetes de tipo 2, diabetes mellitus no dependiente de insulina, o trastornos metabólicos tales como hiperglucemia u obesidad. Los propéptidos de GDF se utilizan preferentemente para prevenir o tratar tales trastornos médicos en mamíferos, más preferentemente en seres humanos.

Los propéptidos de GDF o composiciones de propéptidos de GDF de la presente invención se administran en cantidades terapéuticamente eficaces. Como se utiliza en la presente memoria, una "cantidad eficaz" del propéptido de GDF modificado es una dosis que es suficiente para reducir la actividad de proteínas de GDF para lograr una respuesta biológica deseada (por ejemplo, aumentar la masa muscular esquelética). En una forma de realización, la respuesta biológica deseada puede ser cualquier beneficio terapéutico, incluyendo un aumento de la masa muscular, un aumento de la fuerza muscular, un metabolismo mejorado, una adiposidad reducida, o una homeostasis de glucosa mejorada. Tales mejoras se pueden medir mediante una variedad de métodos que incluyen aquellos que miden la masa de carne magra y grasa corporal (tal como análisis de barrido doble por rayos X), fuerza muscular, lípidos en suero, leptina en suero, glucosa en suero, hemoglobina glucada, tolerancia a la glucosa, y mejoras en la complicación secundaria de diabetes. Generalmente, una cantidad terapéuticamente eficaz puede variar con la edad, peso, estado físico y sexo del sujeto, así como también con la gravedad de la afección médica en dicho sujeto. La dosis se puede determinar por un médico, y se puede ajustar, según se requiera, para adaptarse a los efectos observados del tratamiento. Generalmente, las composiciones se administran de manera que los propéptidos de GDF se administren en una dosis de entre 50 \mug/Kg y 20 mg/Kg. Preferentemente, los propéptidos de GDF se administran como una dosis de bolo, para maximizar los niveles circulantes de los propéptidos de GDF durante la duración más prolongada de tiempo después de la dosis. También se puede utilizar la infusión continua después de la dosis de bolo.

La presente invención proporciona asimismo métodos para prevenir o tratar enfermedades o trastornos metabólicos que resultan de la homeostasis anormal de la glucosa. La homeostasis normal de la glucosa requiere, entre otras cosas, la orquestación finamente ajustada de la secreción de insulina por las células pancreáticas beta en respuesta a cambios sutiles en la glucemia. Una de las acciones fundamentales de la insulina es la de estimular la absorción de glucosa proveniente de la sangre en los tejidos, especialmente músculo y grasa.

En consecuencia, la presente invención proporciona un método para tratar diabetes mellitus y trastornos relacionados, tales como obesidad o hiperglucemia, mediante la administración a un sujeto de un propéptido de GDF modificado o una composición del propéptido de GDF modificado, en una cantidad suficiente para mejorar los síntomas de la enfermedad. La diabetes de tipo 2 o diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM), en particular, se caracteriza por una tríada de (1) resistencia a la acción de la insulina en la absorción de glucosa en tejidos periféricos, especialmente músculo esquelético y adipocitos, (2) acción dañada de la insulina para inhibir la producción de glucosa hepática, y (3) secreción mal regulada de insulina (DeFronzo, (1997) Diabetes Rev. 5:177-269). Por lo tanto, los sujetos que padecen diabetes de tipo 2 pueden ser tratados de acuerdo con la presente invención mediante la administración de un propéptido de GDF modificado, que aumenta la sensibilidad a la insulina y la absorción de glucosa por parte de las células.

De manera similar, otras enfermedades y trastornos metabólicos caracterizados por la disfunción de la insulina (por ejemplo, resistencia, inactividad, o deficiencia) y/o transporte insuficiente de la glucosa hacia las células se pueden tratar de acuerdo con la presente invención mediante la administración de un propéptido de GDF modificado, que incrementa la sensibilidad a la glucosa y la absorción de glucosa por parte de las células.

El propéptido de GDF modificado o las composiciones de propéptido de GDF modificado de la presente invención se administran en cantidades terapéuticamente eficaces. Cuando se utiliza para el tratamiento de la diabetes y trastornos relacionados, una "cantidad eficaz" del propéptido de GDF modificado es una dosis que es suficiente para reducir la actividad de proteínas de GDF para lograr uno o más resultados terapéuticos deseados, tales como, por ejemplo, un aumento en la sensibilidad a la insulina o en la absorción de glucosa por parte de las células, una disminución de la masa de grasa corporal o un cambio deseado en lípidos en suero, leptina en suero, glucosa en suero, hemoglobina glucada, tolerancia a la glucosa, o mejora en la complicación secundaria de la diabetes. Generalmente, una cantidad terapéuticamente eficaz puede variar con la edad, estado físico y sexo del sujeto, así como también con la gravedad de la disfunción de la insulina en dicho sujeto. La dosis se puede determinar por un médico, y se puede ajustar, según se requiera, para adaptarse a los efectos observados del tratamiento. Generalmente, las composiciones se administran de manera que los propéptidos de GDF se administren a una dosis de entre 50 \mug/Kg y 20 mg/Kg. Preferentemente, los propéptidos de GDF se administran como una dosis de bolo, para maximizar los niveles circulantes de los propéptidos de GDF durante la duración más prolongada de tiempo después de la dosis. También se puede utilizar la infusión continua después de la dosis de bolo.

La presente invención también proporciona terapia génica para la producción in vivo de los propéptidos de GDF. Dicha terapia lograría su efecto terapéutico mediante la introducción de las secuencias polinucleotídicas del propéptido de GDF dentro de las células o tejidos que tienen los trastornos de la lista anterior. El suministro de las secuencias polinucleotídicas del propéptido de GDF se puede lograr utilizando un vector de expresión recombinante, tal como un virus quimérico o un sistema de dispersión coloidal. Se prefiere de manera especial para el suministro terapéutico de las secuencias polinucleotídicas del propéptido de GDF el uso de liposomas diana.

Los diversos vectores víricos que se pueden utilizar para la terapia génica, como se enseña en la presente memoria, incluyen adenovirus, virus del herpes, virus de la vacuna, o, preferentemente, un virus de ARN tal como un retrovirus. Preferentemente, el vector retrovírico es un derivado de un retrovirus murino o aviario. Los ejemplos de vectores retrovíricos en los que se puede insertar un único gen extraño incluyen, pero no se limitan a: virus de leucemia de murina de Moloney (MoMuLV), virus del sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), virus de tumor mamario murino (MuMTV), y el virus del sarcoma de Rous (RSV). Un número de vectores retrovíricos adicionales pueden incorporar múltiples genes. La totalidad de estos vectores pueden transferir o incorporar un gen para un marcador susceptible de ser seleccionado de manera que células transducidas se pueden identificar y generar mediante la inserción de una secuencia polinucleotídica del propéptido de GDF de interés dentro del vector vírico, junto con otro gen que codifica el ligando para un receptor en una célula diana específica, por ejemplo, el vector es ahora específico para la diana. Los vectores retrovíricos se pueden hacer específicos para la diana uniendo, por ejemplo, un azúcar, glucolípido, o proteína. La selección preferida como diana se logra utilizando un anticuerpo. Los expertos en la materia reconocerán que se pueden insertar secuencias polinucleotídicas específicas dentro del genoma retrovírico, o se pueden unir a una cubierta vírica para permitir el suministro específico a la diana del vector retrovírico que contiene el polinucleótido del propéptido
de GDF. En una forma de realización preferida, el vector está dirigido contra células de músculo o tejido muscular.

Puesto que los retrovirus recombinantes son defectuosos, requieren de estirpes celulares auxiliares que contienen plásmidos que codifican la totalidad de los genes estructurales del retrovirus bajo el control de secuencias reguladoras dentro del LTR. Estos plásmidos carecen de un secuencia nucleotídica que permite que el mecanismo de empaquetamiento reconozca un transcrito de ARN para encapsulamiento. Las estirpes celulares auxiliares que tienen supresiones de la señal de empaquetamiento incluyen, pero no se limitan a, PSI.2, PA317 y PAl2, por ejemplo. Estas estirpes celulares producen viriones vacíos, puesto que no se empaqueta ningún genoma. Si un vector retrovírico se introduce dentro de dichas células en la que la señal de empaquetamiento está intacta, pero los genes estructurales están sustituidos por otros genes de interés, el vector se puede empaquetar, y se puede producir el virión del vector.

Como alternativa, otras células de cultivo de tejido pueden ser transfectadas directamente con plásmidos que codifican genes estructurales retrovíricos gag, pol y env, mediante transfección convencional con fosfato de calcio. Estas células se transfectan entonces con el plásmido vector que contiene los genes de interés. Las células resultantes liberan el vector retrovírico en el medio de cultivo.

Otro sistema de suministro seleccionado como diana para el polinucleótido del propéptido de GDF es un sistema de dispersión coloidal. Los sistemas de dispersión coloidal incluyen complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas, y sistemas a base de lípidos, incluyendo emulsiones aceite en agua, micelas, micelas mixtas, y liposomas. El sistema coloidal preferido de esta invención es un liposoma. Los liposomas son vesículas de membranas artificiales que son útiles como vehículos de suministro in vitro e in vivo. Los ARN, ADN y viriones intactos se pueden encapsular dentro del interior acuoso, y pueden ser liberados a las células en una forma biológicamente activa (véase, por ejemplo, Fraley et al., Trends Biochem. Sci. 6:77, 1981). Son bien conocidos en la técnica métodos para la transferencia eficiente de genes utilizando un vehículo liposómico; véase, por ejemplo, Mannino, et al., Biotechniques, 6:682, 1988. La composición del liposoma habitualmente es una combinación de fosfolípidos, normalmente en combinación con esteroides, especialmente colesterol. También se pueden usar otros fosfolípidos u otros lípidos. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, de la fuerza fónica y de la presencia de cationes divalentes.

Los ejemplos de lípidos útiles en la producción de liposomas incluyen compuestos de fosfatidilo, tales como fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, esfingolípidos, cerebrósidos y gangliósidos. Los fosfolípidos ilustrativos incluyen la fosfatidilcolina de huevo, la dipalmitoilfosfatidilcolina y la diesteroilfosfatidilcolina.

La selección de liposomas como dianas también es posible en base a, por ejemplo, la especificidad del órgano, especificidad de la célula, y especificidad del organelo, y se conoce bien en la técnica.

Los métodos para tratar o prevenir las afecciones médicas anteriores con los propéptidos de GDF modificados también se pueden usar para inhibir otras proteínas en la superfamilia de TGF-\beta1. Muchas de estas proteínas están relacionadas en estructura con el GDF-8, tal como la BMP-11. En consecuencia, en otra forma de realización, la invención proporciona métodos para tratar los trastornos antes mencionados mediante la administración a un sujeto de un propéptido de GDF modificado que es capaz de inhibir una proteína que no es de GDF-8, ya sea solo o en combinación con un propéptido de GDF modificado contra GDF-8.

Composiciones de propéptido de GDF modificado

La presente invención proporciona composiciones que comprenden los propéptidos de GDF modificados. Tales composiciones pueden ser adecuadas para uso y administración farmacéuticos a pacientes. Las composiciones comprenden típicamente uno o más propéptidos de GDF modificados de la presente invención, y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Como se utiliza en la presente memoria, la frase "excipiente farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y que retrasan la absorción, y similares, que son compatibles con la administración farmacéutica. Se conoce bien en la técnica el uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas. En "The Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3ª ed. 2000, Am. Pharmaceutical Press, A.E. Kibbe ed., se pueden encontrar excipientes farmacéuticamente aceptables ejemplares. Las composiciones también pueden contener otros compuestos activos que proporcionan funciones terapéuticas complementarias, adicionales o mejoradas. Las composiciones farmacéuticas también pueden estar incluidas en un envase, paquete o dispensador, junto con instrucciones para su administración.

Una composición farmacéutica de la invención se formula para que sea compatible con su vía de administración pretendida. Los métodos para llevar a cabo la administración son conocidos por aquellos con conocimientos normales en la técnica. También puede ser posible obtener composiciones que se puedan administrar tópica u oralmente, o que se puedan transmitir a través de membranas mucosas. La administración puede, por ejemplo, ser intravenosa (I.V.), intraperitoneal (I.P.), intramuscular (I.M.), intracavidades, subcutánea (S.C.) o transdérmica. Las formas de realización preferidas incluyen inyecciones I.V., I.P., I.M. y S.C. En una forma de realización preferida, las composiciones farmacéuticas de la invención se administran de forma intravenosa.

Las disoluciones o suspensiones utilizadas para aplicación intradérmica o subcutánea incluyen típicamente uno o más de los siguientes componentes: un diluyente estéril, tal como agua para inyección, disolución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos, tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes, tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes, tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones, tales como acetatos, citratos o fosfatos; y agentes para el ajuste de tonicidad, tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. Tales preparaciones se pueden encerrar en ampollas, jeringuillas desechables o viales de múltiples dosis hechos de vidrio o plástico.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para inyección incluyen disoluciones o dispersiones acuosas estériles, y polvos estériles para la preparación extemporánea de disoluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen disolución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL^{TM} (BASF, Parsippany, NJ) o disolución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida hasta el punto de que tenga un fácil manejo con la jeringuilla. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y se debe conservar contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo debe ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), y sus mezclas adecuadas. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento tal como lecitina, mediante la conservación del tamaño de partículas requerido en el caso de una dispersión, y mediante el uso de tensoactivos. La prevención de la acción de microorganismos se puede lograr mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir en la composición agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede fomentar incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las composiciones orales incluyen generalmente un diluyente inerte o un vehículo comestible. Por ejemplo, pueden estar encerradas en cápsulas de gelatina, o se pueden comprimir en comprimidos. Para los fines de la administración terapéutica oral, los propéptidos de GDF se pueden incorporar con excipientes, y se pueden utilizar en forma de comprimidos, trociscos, o cápsulas. Se pueden incluir agentes de aglutinantes farmacéuticamente compatibles, y/o materiales adyuvantes, como parte de la composición. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de una naturaleza similar; un aglutinante, tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente, tal como almidón o lactosa, un agente de desintegración, tal como ácido algínico, Primogel, o almidón de maíz; un lubricante, tal como estearato de magnesio o Sterotes; un agente que proporciona deslizamiento, tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante, tal como
sacarosa o sacarina; o un agente saborizante, tal como menta piperita, salicilato de metilo o saborizante de naranja.

Para la administración por inhalación, los propéptidos de GDF se pueden suministrar en forma de una pulverización en aerosol desde un recipiente o dispensador a presión que contenga un propelente adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono, o un nebulizador.

La administración sistémica también puede ser por medios transmucosales o transdérmicos. Para la administración transmucosal o transdérmica, se utilizan en la formulación agentes de penetración apropiados para que la barrera sea penetrada. Dichos agentes de penetración generalmente se conocen en la técnica, e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosal, detergentes, sales biliares y derivados del ácido fusídico. La administración transmucosal se puede lograr a través del uso de pulverizaciones nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en ungüentos, bálsamos, geles o cremas, como se conoce generalmente en la técnica.

Los propéptidos de GDF también se pueden preparar en forma de supositorios (por ejemplo, con bases convencionales para supositorios, tales como manteca de cacao y otros glicéridos), o enemas de retención para suministro rectal.

En una forma de realización, los propéptidos de GDF modificados se preparan con vehículos que protegerán al compuesto contra la eliminación rápida del organismo, tales como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de suministro microencapsulados. Se pueden utilizar polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como el etileno acetato de vinilo, polianhídridos, poli(ácido glicólico), colágeno, poliortoésteres y poli(ácido láctico). Los métodos para la preparación de tales formulaciones serán manifiestos para los expertos en la materia. Los materiales también se pueden obtener comercialmente en Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. También se pueden utilizar como vehículos farmacéuticamente aceptables suspensiones liposómicas que contengan los propéptidos de GDF modificados. Éstas se pueden preparar de acuerdo con los métodos conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo como se describe en la patente US nº 4.522.811.

Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma de dosis unitaria para una fácil administración y uniformidad de la dosis. La forma de dosis unitaria, como se usa en la presente memoria, se refiere a unidades físicamente discretas que son adecuadas como dosis unitarias para el sujeto que va a ser tratado, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéuticamente requerido. La especificación para las formas de dosis unitaria de la invención están dictadas por y dependen directamente de las características únicas del compuesto activo y del efecto terapéutico particular que se va a lograr, así como de las limitaciones inherentes en la técnica de la formulación de dicho compuesto activo para el tratamiento de individuos.

La toxicidad y la eficacia terapéutica de tales compuestos se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándares, en cultivos de células o en animales experimentales, por ejemplo, para determinar la LD_{50} (la dosis letal hasta el 50% de la población) y la ED_{50} (la dosis terapéuticamente eficaz en 50% de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico, y se puede expresar como la relación LD_{50}/ED_{50}. Se prefieren propéptidos de GDF que presentan grandes índices terapéuticos.

Se pueden utilizar los datos obtenidos a partir de ensayos de cultivos de células y de estudios con animales para proponer un intervalo de dosis para uso en seres humanos. La dosificación de tales compuestos cae preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la ED_{50} con poca o nula toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación utilizada y de la vía de administración utilizada. Para cualquier propéptido de GDF modificado que se utiliza en la presente invención, la dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente a partir de ensayos con cultivos de células. Una dosis se puede formular en modelos de animales, para lograr un intervalo de concentración plasmática circulante que incluya el IC_{50} (esto es, la concentración del propéptido de GDF modificado de ensayo, que logra una inhibición semimáxima de los síntomas), según se determina en un cultivo de células. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, mediante cromatografía de liquidos de alta resolución. Los efectos de cualquier dosificación particular se pueden monitorizar mediante un bioensayo adecuado. Ejemplos de bioensayos adecuados incluyen ensayos de replicación de ADN, ensayos basados en la trascripción, ensayos de unión receptor/proteína de GDF, ensayos de creatina quinasa, ensayos basados en la diferenciación de pre-adipocitos, ensayos basados en la absorción de glucosa en adipocitos, y ensayos inmunológicos.

Los siguientes ejemplos proporcionan formas de realización preferidas de la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Purificación del GDF-8

Se acidificó hasta un pH de 6,5 medio acondicionado procedente de una estirpe celular seleccionada que expresa proteína de GDF-8 humano recombinante (GDF-8 maduro + propéptido de GDF-8), y se aplicó a una columna de intercambio aniónico POROS HQ de 80 x 50 mm en tándem con una columna de intercambio catiónico POROS SP de 80 x 50 mm (Perseptive Biosystems). El caudal se ajustó a pH 5,0, y se aplicó a una columna de intercambio catiónico POROS SP de 75 x 20 mm (Perseptive Biosystems) y se eluyó con un gradiente de NaCl. Las fracciones que contenían GDF-8, como se indica por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), se reunieron, se acidificaron con ácido trifluoroacético (TFA) hasta un pH 2-3, posteriormente se llevaron hasta 200 ml con TFA al 0,1% para reducir la viscosidad. El conjunto se aplicó posteriormente a una columna de C_{5} de 250 x 21,2 mm (Phenomenex), precedida por una columna guard de 60 x 21,2 mm (Phenomenex), y se eluyó con un gradiente de TFA/CH_{3}CN, para separar el GDF-8 maduro del propéptido de GDF-8. Las fracciones reunidas que contenían GDF-8 maduro se concentraron mediante liofilización, para eliminar el acetonitrilo, y se añadieron 20 ml de TFA al 0,1%. La muestra se aplicó entonces a una columna C_{5} de 250 x 10 mm (Phenomenex) calentada hasta 60ºC, para ayudar a la separación. Esto se repitió hasta que ya no se pudo lograr una separación adicional. Las fracciones que contenían GDF-8 maduro se reunieron entonces y se llevaron a acetonitrilo al 40%, y se aplicaron a una columna de exclusión por tamaños BioSep S-3000 de 600 x 21,2 (Phenomenex), precedida por una columna guard de 60 x 21,2. Las fracciones que contenían GDF-8 maduro purificado se reunieron y se concentraron para uso en experimentos subsiguientes. Los rendimientos típicos del dímero de GDF-8 maduro fueron de 0,33 mg de proteína por litro de medio
acondicionado.

Las fracciones de la columna C_{5} que contenían propéptido de GDF-8 se reunieron, se eliminó el acetonitrilo mediante evaporación, se añadieron 20 ml de TFA al 0,1%, y las muestras se inyectaron posteriormente en la columna C_{5} de 250 x 10 mm a 60ºC. Esto se repitió hasta que ya no se logró ninguna separación adicional. Las fracciones que contenían propéptido de GDF-8 se reunieron entonces y se llevaron a acetonitrilo al 40%, y se aplicaron a una columna de exclusión por tamaños BioSep S-3000 de 600 x 21,2 (Phenomenex), precedida por una columna guard de 60 x 21,2. Las fracciones que contenían el propéptido de GDF-8 purificado se reunieron y se concentraron para uso en experimentos subsiguientes. Un rendimiento típico del propéptido de GDF-8 fue de 0,24 mg de proteína por litro de medio acondicionado.

En el análisis SDS-PAGE, el GDF-8 maduro purificado migró como una banda ancha a 25 kDa en condiciones no reductoras, y 13 kDa en condiciones reductoras. Se ha dado a conocer un perfil de SDS-PAGE similar para GDF-8 de murino (McPherron et al. (1997) Nature 387:83-90), y refleja la naturaleza dimérica de la proteína madura.

El peso molecular aparente del propéptido de GDF-8 purificado fue de 38 kDa tanto en condiciones reductoras como no reductoras. Esto indica que el propéptido de GDF-8 es monomérico. La diferencia entre el peso molecular aparente y el peso molecular pronosticado del propéptido de GDF-8, ~26 kDa, puede reflejar la adición de hidrato de carbono, puesto que su secuencia de aminoácidos contiene un sitio potencial de glucosilación enlazado mediante N (McPherron et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:12457-12461). De esta forma, el proceso anterior condujo a la producción de propéptido de GDF-8 y dímero de GDF-8 maduro, activo y purificado.

Ejemplo 2 Características de GDF-8 humano recombinante purificado

Se mezclaron 50 ug de cada uno de GDF-8 maduro purificado y de propéptido de GDF-8 purificado, y se dializaron en fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0, y se sometieron a cromatografía en una columna de exclusión por tamaños BioSep S-3000 de 300 x 7,8 mm (Phenomenex). El peso molecular del complejo de GDF-8 maduro/propéptido se determinó a partir del tiempo de elución, utilizando patrones de peso molecular (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), sometidos a cromatografía en la misma columna.

Cuando el propéptido de GDF-8 purificado se incubó a pH neutro con GDF-8 maduro purificado, las dos proteínas parecieron formar un complejo, como se indica por el perfil de exclusión por tamaños. El pico de proteína principal que eluyó a los 12,7 minutos tuvo un peso molecular estimado de 78 kDa a partir de patrones de peso molecular (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), sometidos a cromatografía en la misma columna. El tamaño del complejo es más consistente con un dímero del GDF-8 maduro que se asocia con dos monómeros de propéptido, formando de esta manera un complejo tetramérico.

Para confirmar esta observación, se incubó una preparación, que contenía tanto GDF-8 maduro como propéptido de GDF-8, con o sin 100 mM de hidrocloruro de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiamida (EDC, Pierce) durante 1 hora a temperatura ambiente, se acidificó con HCl hasta un pH de 2-3, y se concentró con un concentrador Micron-10 (Amicon) para SDS-PAGE, usando un gel de acrilamida al 10% tamponado con tricina. Las proteínas se visualizaron mediante tinción con azul de Coomassie. Se observó una banda correspondiente a un peso molecular de aproximadamente 75 kDa sólo en la muestra en la que se añadió EDC, y no en la línea del control, confirmando la presencia del complejo de GDF-8 maduro/propéptido de GDF-8. Esto valida el ensayo como útil para medir la actividad y la concentración de dímero de GDF-8 maduro purificado.

Ejemplo 3 Actividad biológica in vitro de GDF-8 purificado

Para demostrar la actividad del GDF-8, se desarrolló un ensayo de gen informador (RGA) utilizando una secuencia de vector informador pGL3(CAGA)_{12} acoplada a luciferasa. La secuencia de CAGA se dio a conocer previamente como una secuencia susceptible a TGF-\beta dentro del promotor del gen inducido por TGF-\beta, PAI-1 (Dennler et al., (1998) EMBO J. 17:3091-3100).

El vector informador que contiene 12 cajas de CAGA se preparó utilizando el plásmido informador básico, pGL3 (Promega Corporation, Madison, WI, USA, nº de catálogo E1751). La caja de TATA y el sitio de iniciación de la transcripción procedente del promotor tardío principal de adenovirus (-35/+10) se insertaron entre los sitios BglII e HindIII. Se hibridaron oligonucleótidos que contenían doce repeticiones AGCCAGACA de las cajas CAGA, y se clonaron en el sitio XhoI. La estirpe celular de rabdomiosarcoma humano, A204 (ATCC HTB-82), se transfectó de manera transitoria con pGL3(CAGA)_{12}, usando reactivo de transfección FuGENE 6 (Roche Diagnostics, Indianápolis, USA, nº de catálogo 1814443). Tras la transfección, las células se cultivaron en placas de 48 pocillos en medio de McCoy 5A (Life Technologies, Rockville, Maryland, USA, nº de catálogo 21500-079) complementado con 2 nM de glutamina, 100 U/ml de estreptomicina, 100 \mug/ml de penicilina y suero de ternera fetal al 10%, durante 16 horas. Las células se trataron entonces con GDF-8, BMP-11 o activina en medio 5A de McCoy con glutamina, estreptomicina, penicilina y 1 mg/ml de seroalbúmina bovina, durante 6 horas a 37ºC. Se cuantificó la luciferasa en las células tratadas, utilizando el sistema de ensayo de luciferasa (Promega Corporation, Madison WI, USA, nº de catálogo E1483). Los resultados del ensayo se ilustran en la Figura 1. Para GDF-8, los resultados se expresan como media \pm S.E. (desviación estándar) para tres experimentos separados. Para BMP-11 y activina, los resultados son representativos de dos experimentos separados.

Los resultados muestran que GDF-8 activó máximamente el constructo informador 10 veces, con una ED_{50} de 10 ng/ml de GDF-8, indicando que el GDF-8 recombinante purificado fue biológicamente activo. La BMP-11, que es 90% idéntica al GDF-8 a nivel de aminoácidos (Gamer et al. (1999) Dev. Biol. 208:222-232 y Nakashima et al. (1999) Mech. Dev. 80:185-189), y la activina produjeron una respuesta biológica similar, indicando que el ensayo del gen informador es un ensayo adecuado para detectar la actividad biológica in vitro de GDF-8, BMP-11 o activina.

Ejemplo 4 Propiedades de unión del GDF-8 purificado

Se biotiniló el complejo latente de GDF-8 a una relación de 20 moles de sulfo-NHS-Biotina con enlace EZ (Pierce, Rockville, Illinois, USA, nº de catálogo 21217) por mol del complejo de GDF-8, durante 2 horas en hielo, se inactivó con TFA al 0,5% y se sometió a cromatografía en una columna C4 Jupiter de 250 x 4,6 mm (Phenomenex), para separar GDF-8 maduro de propéptido de GDF-8. Se reunieron las fracciones de GDF-8 maduro biotinilado que eluyeron con un gradiente de TFA/CH_{3}CN, se concentraron y se cuantificaron mediante el kit de reactivo de ensayo de proteína MicroBCA (Pierce, Rockville, Illinois, USA, nº de catálogo 23235).

Se recubrieron quimeras de ActRIIB-Fc recombinantes (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA, nº de catálogo 339-RB/CF) en placas de ensayo de fondo plano de 96 pocillos (Costar, NY, nº de catálogo 3590) a 1 \mug/ml en 0,2M de tampón de carbonato de sodio durante toda la noche, a 4ºC. Las placas se bloquearon entonces con 1 mg/ml de seroalbúmina bovina, y se lavaron siguiendo el protocolo de ELISA estándar. Se añadieron 100 \mul de alícuotas de GDF-8 biotinilado, a diversas concentraciones, a la placa de ELISA bloqueada, se incubaron durante 1 hora, se lavaron, y se detectó la cantidad de GDF-8 unido, usando estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (SA-HRP, BD PharMingen, San Diego, CA, USA, nº de cat. 13047E), seguido de la adición de TMB (KPL, Gaithersburg, Maryland, USA, nº de cat. 50-76-04). Las mediciones colorimétricas se realizaron a 450 nm en un lector de microplacas de Molecular Devices.

Como se muestra en la Figura 2, el GDF-8 biotinilado se unió a ActRIIB, el receptor de tipo II de GDF-8 putativo, con una ED_{50} de 12 ng/ml, indicando que el ensayo de unión a ActRII es un ensayo de unión in vitro sensible para GDF-8.

Ejemplo 5 Inhibición de GDF-8 y BMP-11 mediante propéptido de GDF-8

Cuando se preincubó GDF-8 con propéptido de GDF-8 durante 1 hora a temperatura ambiente, se redujo la actividad biológica del GDF-8. La Figura 3 muestra la inducción de la actividad del informador de pGL3(CAGA)_{12} a la ED_{50} para GDF-8, 10 ng/ml, en presencia de propéptido de GDF-8. El propéptido de GDF-8 redujo la inducción de GDF-8 de manera sensible a la dosis, con una IC_{50} de 25 ng/ml (0,6 nM). El propéptido de GDF-8 también inhibió la actividad biológica de BMP-11 en el mismo grado. Por el contrario, la actividad de activina en este ensayo no se vio afectada por el propéptido de GDF-8, presumiblemente debido a la homología relativamente baja entre GDF-8 y la activina, en comparación con GDF-8 y la BMP-11.

De manera similar, la Figura 4 muestra que la preincubación del propéptido de GDF-8 con el GDF-8 biotinilado, a 5 ng/ml, inhibió la unión de GDF-8 a ActRIIB en el ensayo de unión a ActRIIB, como se describe en el Ejemplo 4, con una IC_{50} de 0,3 nM. En conclusión, el propéptido de GDF-8 de la invención es un potente inhibidor subnanomolar de la actividad de GDF-8 y BMP-11 in vitro, según se mide en el ensayo del gen informador y en el ensayo de unión a ActRIIB. En consecuencia, este ensayo muestra que el propéptido de GDF-8 es activo, y es un potente inhibidor de la actividad de GDF-8 en este ensayo.

Ejemplo 6 Inhibición de la unión al receptor de GDF-8 mediante propéptido de GDF-8

Se yodó GDF-8 con cloramina T como se describe por Frolik et al., (1984) J. Biol. Chem. 259:10995-10999, hasta una actividad específica de 100-200 \muCi/\mug. El GDF-8 yodado mostró actividad biológica comparable al GDF-8 no marcado, en el ensayo del informador de (CAGA)_{12} descrito en el Ejemplo 3. El GDF-8 marcado con ^{125}I se evaluó en busca de la unión específica a una estirpe celular de mioblastos, L6.

Los mioblastocitos L6 (ATCC CRL-1458) se hicieron crecer hasta confluencia en medio de Eagle modificado de Dulbecco, complementado con suero fetal de ternera al 10% inactivado con calor, en placas de 24 pocillos gelatinizados. Se llevó a cabo la unión de equilibrio como se describe en Song et al., (1995) Endocrinology 136:4293-4297, el cual se incorpora a la presente en su totalidad como referencia. Se incubó 1 ng/ml de GDF-8 marcado con ^{125}I (con o sin GDF-8 no marcado) con células L6 confluentes, durante 4 horas a 4ºC. Después de lavar las células, el [^{125}I]GDF-8 unido se extrajo y se cuantificó con un contador gamma. Los resultados se expresan como media \pm S.D. de determinaciones por triplicado, y son representativos de tres experimentos separados.

Como se muestra en la Figura 5, el ^{125}I-GDF-8 se unió a células L6 con una afinidad elevada. De manera notable, la BMP-11, pero no el TGF-\beta1, desplazó la unión de [^{125}I]GDF-8, indicando que GDF-8 y BMP-11 (pero no TGF-\beta1) comparten un receptor común en estas células (datos no mostrados). A partir de un análisis de Scatchard de la unión de GDF-8, se estimó que el valor K_{d} era de 140 pM. Además, cuando se preincubó 1 ng/ml de ^{125}I-GDF-8 con propéptido de GDF-8 durante 1 hora a temperatura ambiente, la unión específica de GDF-8 a células L6 se pudo inhibir con concentraciones crecientes de propéptido de GDF-8 no marcado (Figura 6). Los resultados se expresan como
media \pm S.D. de determinaciones por triplicado, y son representativos de dos experimentos separados. La IC_{50} para 1 ng/ml de GDF-8 fue 140 ng/ml de propéptido de GDF-8. Como queda en evidencia por estos datos, el propéptido de GDF-8 inhibe la actividad biológica del GDF-8 mediante el bloqueo de la unión al receptor de GDF-8.

Ejemplo 7 Inhibición de la actividad de GDF-8 mediante proteínas de fusión de propéptido de GDF-8 con Fc

Como se muestra en el Ejemplo 8 más abajo, el propéptido de GDF-8 murino tiene una semivida in vivo relativamente corta. Para incrementar la biodisponibilidad del propéptido de GDF-8, se construyeron fusiones entre el propéptido de GDF-8 y una región Fc de IgG2a murina, usando técnicas estándar de ingeniería genética.

Se introdujeron cuatro mutaciones en la región Fc para reducir la función efectora, como se describe en Steurer et al. (1995) J. Immunol. 155:1165-1174. Utilizando metodología de PCR estándar, se prepararon dos constructos de fusión mediante la fusión de un ADNc que codifica el propéptido de GDF-8 murino (aminoácidos 1-267) a la región Fc de IgG2a murina (Figura 7). La Fusión 1 (Figura 7A) codifica los primeros 265 aminoácidos del propéptido de GDF-8 murino (incluyendo un líder secretor de 24 aminoácidos) fusionados en marco a 233 aminoácidos de la región Fc de IgG2a murina, comenzando en el primer aminoácido en la sección de bisagra. La Fusión 2 (Figura 7B) se construye de forma similar a la Fusión 1, excepto que un corto ligador de glicina-serina-glicina-serina (GSGS) separa el propéptido de GDF-8 de la región Fc murina.

Las dos quimeras se introdujeron en un vector de expresión eucariota, pED (Kaufinan et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4485-4490), y se expresaron de manera transitoria en células M6 de COS-1 (Horowitz et al. (1983) Journal of Molecular and Applied Genetics 2:147-159), utilizando reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (Gibco BRL, Life Technologies, Rockville, Maryland, USA, nº de cat. 11668-019) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de 24 horas de incubación, se añadió R1CD1 (un medio de cultivo libre de suero de DMEM/F12 modificado). Se reunió el medio acondicionado (CM), se sustituyó por R1CD1 fresco, y se cosechó el CM nuevamente, 60 horas más tarde. El medio acondicionado se reunió entonces y se purificó sobre Proteína A Sepharose CL-4B (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, HP7 9NA, Inglaterra, nº de cat. 17-07080-01) después de la adición de 1/10 de volumen de Tris 1M, pH 8,0. La proteína purificada se eluyó en 0,1M de ácido acético, 150 mM de NaCl, e inmediatamente se neutralizó con 1/20 de volumen de Tris 3M, pH 9,0. Las proteínas se cuantificaron utilizando un protocolo estándar de ELISA con IgG murina, y se ensayaron en el ELISA competitivo de ActRIIB conjuntamente con un propéptido de GDF-8 humano purificado, como se describe en el Ejemplo 5. En la Figura 8 se muestran los resultados. Las IC_{50} de las fusiones de propéptido de GDF-8 con Fc se encuentran en el intervalo nanomolar bajo, y no existe diferencia entre la fusión 1 y la 2. La fusión 1 (sin ligador entre el propéptido de GDF-8 y la IgG2a murina) se seleccionó para uso en la preparación de una estirpe celular de CHO estable, y se ensayó para determinar la inhibición de GDF-8 en el ensayo de RGA.

Se subclonó ADNc de propéptido de GDF-8-Fc en el plásmido pHTop de expresión de CHO, y se transfectó en células CHO/A2, como se describe en Thies et al. (2001), Growth Factors 18:251-259, el cual se incorpora en su totalidad a la presente como referencia. Se estableció una estirpe celular estable (PF-4/0.02) seleccionando células en metotrexato 0,02 M. Se cosechó medio acondicionado que contenía la proteína de fusión de propéptido de GDF-8 con Fc, procedente de una estirpe seleccionada, y se ajustó su pH mediante adición de 10% v/v de Tris 1M, pH 8,0, y se purificó sobre Pharmacia rProteinA Sepharose Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, HP7 9NA, Inglaterra, nº de cat. 17-1279-02) previamente equilibrada con Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5. Las fracciones se eluyeron con ácido acético 100 mM, NaCl 150 mM, pH 2,5, e inmediatamente se neutralizaron añadiendo 5% v/v de Tris 3M, pH 9,0. Las fracciones de los picos se reunieron y se cargaron sobre una columna de exclusión por tamaños Pharmacia Superdex 200 Size Exclusion Column (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, HP7 9NA, Inglaterra, nº de cat. 17-1069-91). Se añadió 0,05% de Tween 80 a las fracciones, para evitar la agregación. Las fracciones se evaluaron mediante SDS-PAGE en geles de tricina al 10% de Novex (Novex, San Diego, CA, USA, nº de cat. EC66755).

Las fracciones reunidas se cuantificaron mediante espectrofotometría, y se ensayaron en busca de la actividad en el ensayo de unión a ActRIIB, como se describe en el Ejemplo 4, así como en el ensayo del gen informador (Figura 9). La IC_{50} de la fusión de propéptido de GDF-8 con Fc purificada fue de 1,3 nM. Los datos muestran que el propéptido de GDF modificado de la invención que comprende una proteína de fusión de propéptido de GDF-8 con Fc tiene retenida una potente actividad inhibidora (neutralizante) en comparación con el propéptido de GDF-8.

Ejemplo 8 Farmacocinética

Se evaluó la farmacocinética (PK) del propéptido de GDF-8 (denominado en la presente memoria como "GDF8-Pro") y de la proteína de fusión de propéptido de GDF-8 con Fc (denominada en la presente memoria como "GDF8-ProFc") en ratones C57B1/67, a una dosis de 0,2 ug/ratón (GDF8-Pro) o 2 ug/ratón (GDF8-ProFc) tras una sola administración intravenosa. Los animales recibieron una mezcla de GDF8-Pro marcado con ^{125}I y sin marcar o GDF8-ProFc, a las dosis enumeradas anteriormente, y se determinaron las concentraciones séricas basándose en la radiactividad de ^{125}I en el suero y la actividad específica de la dosis inyectada. La Figura 10 muestra la concentración sérica frente a curvas de tiempo, tanto para GDF8-Pro como para GDF8-ProFc. La Tabla 1 muestra los parámetros de PK para GDF8-Pro y GDF8-ProFc después de una sola administración intravenosa de 2 \mug/ratón. Las concentraciones séricas y los parámetros de PK para el GDF8-Pro están normalizados a una dosis de 2 \mug/ratón, con fines comparativos.

TABLA 1

2

Como se puede apreciar en la Figura 10, el aclaración es 400 veces más lento, y la semivida es 100 veces más prolongada para el GDF8-ProFc en comparación con el GDF8- Pro. Tanto el volumen inicial de distribución como el volumen de distribución en estado estacionario son aproximadamente 3 veces mayores para el GDF8-Pro en comparación con el GDF8-ProFc, indicando que el GDF8-Pro se distribuye en un mayor grado fuera del espacio vascular en comparación con el GDF8-ProFc.

Si bien el efecto estabilizante de la región Fc de una molécula de IgG en un propéptido de GDF se ejemplifica usando la proteína de fusión de propéptido de GDF con Fc de ratón (esto es, ambos componentes derivaron de ratón), los métodos de la presente invención se pueden aplicar a cualquier combinación de componentes de propéptido de GDF e IgG, sin importar la proteína precursora particular o la especie animal de la cual derivan los componentes, siempre que la proteína de fusión sea construya de manera apropiada para retener actividad (esto es, como se describe en la presente memoria).

Ejemplo 9 Derivación y actividad de dos fusiones de propéptido de GDF-8 con Fc humanas

Se prepararon dos constructos de fusión de propéptido de GDF-8 con Fc, usando metodología de PCR estándar, para la evaluación del potencial terapéutico. Se fusionó un ADNc que codifica el propéptido de GDF-8 humano (SEC ID nº: 5) a la región Fc de IgG1 humana (SEC ID nº: 15, Figura 11A) o Fc de IgG1 humana modificada para que tenga una función efectora reducida (SEC ID nº: 16, Figura 11B).

1. Proteína de fusión humana de propéptido de GDF-8 con Fc de tipo natural de IgG1 (Figura 11A)

Los primeros 264 aminoácidos del propéptido de GDF-8 humano (incluyendo los aminoácidos 1-241 de la SEC ID nº: 5 y el péptido señal de 23 aminoácidos como se expone en SEC ID nº: 13) se fusionaron en marco con los 232 aminoácidos de la región constante de IgG1 humana, comenzando en el primer aminoácido en la región de bisagra (SEC ID nº: 15).

2. Propéptido de GDF-8 humano-IgG1 mutante (Figura 11B)

Los primeros 264 aminoácidos del propéptido de GDF-8 humano, como se describe anteriormente, se fusionaron en marco con los 227 aminoácidos de una región Fc de IgG1 humana mutada (SEC ID nº: 16). Se introdujeron dos mutaciones, restos de alanina (Ala-14 y Ala-17) como se expone en SEC ID nº: 16, con el fin de reducir la función efectora como se describe en Lund et al. (1991) J. Immun. 147:2657-2662 y Morgan et al. (1995) Immunology 86:319-324.

Las dos proteínas de fusión se introdujeron en un vector de expresión eucariota, pED (Kaufinan et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4485-4490), y se expresaron de manera transitoria en células M6 de COS-1 (Horowitz et al. (1983) Journal of Molecular and Applied Genetics 2:147-159), utilizando reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (Gibco BRL, Life Technologies, Rockville, Maryland, USA, nº de cat. 11668-019) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de 24 horas de incubación, se añadió R1CD1 (un medio de cultivo libre de suero de DMEM/F12 modificado). El medio acondicionado (CM) se reunió, se sustituyó por R1CD1 fresco, y el CM se cosechó otra vez, 60 horas más tarde. El medio acondicionado se reunió entonces y se purificó sobre Protein A Sepharose CL-4B (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, HP7 9NA, Inglaterra, nº de cat. 17-07080-01) tras la adición de 1/10 de volumen de Tris 1M, pH 8,0. La proteína purificada eluyó en ácido acético 0,1M, NaCl 150 mM, e inmediatamente se neutralizó con 1/20 de volumen de Tris 3M, pH 9,0. Las proteínas se cuantificaron utilizando un protocolo estándar de ELISA de IgG humana, y se ensayó en el ensayo de unión a ActRIIB junto con un propéptido de GDF-8 humano purificado, como se describe en el Ejemplo 5. En la Figura 12 se muestran los resultados. En conclusión, ambas proteínas de fusión humanas de propéptido con Fc son potentes inhibidores de la unión de GDF-8 a ActRIIB.

Ejemplo 10 Ensayo in vivo de proteína de fusión de propéptido de GDF-8 con Fc

La proteína de fusión murina de propéptido de GDF-8 con Fc (procedente del Ejemplo 9) se ensayó en ratones adultos. Se seleccionaron al azar ratones BALB/c hembra adultos, de siete a nueve semanas, con respecto al peso corporal, y se colocaron en grupos de siete (excepto para el grupo sin tratamiento, el cual tenía seis ratones). A los ratones se les aplicó la dosis dos veces por semana mediante inyección I.P. con una dosis semanal total de 10 ug, 100 ug ó 1.000 ug por animal, durante cinco semanas. Las inyecciones de control fueron Fc de IgG2a murina, a un equivalente molar a la dosis elevada de propéptido-Fc. Al final del estudio, se retiraron y se pesaron el gastrocnemio, cuadriceps, almohadilla de grasa epididímica, el riñón y el hígado. La Figura 13 muestra la masa media del tejido, indicando las barras de error el error estándar de la media. El asterisco (*) indica una diferencia estadísticamente significativa (p<0,01 usando una prueba de la T de Student) cuando se compara con los ratones tratados con la proteína de control, IgG2aFc. El bloqueo de la actividad de GDF-8 in vivo mediante inyección I.P. de proteína de fusión de propéptido de GDF-8 con Fc, a razón de 1 mg/semana (ratones tratados), dio como resultado un aumento del 6,2% del gastrocnemio, y un aumento del 11,3% masa del músculo del cuadriceps, en comparación con los ratones de control que no recibieron proteína de fusión de propéptido de GDF-8 con Fc. Además, el bloqueo de la actividad de GDF-8 in vivo mediante inyección I.P. de proteína de fusión de propéptido de GDF-8 con Fc, a razón de 100 ug/semana (ratones tratados), dio como resultado un aumento del 23,0% en la masa de la almohadilla de grasa. El tratamiento con la dosis elevada (1 mg/semana) también condujo a una disminución de la masa de la almohadilla de grasa, pero debido a la variabilidad en la masa de la almohadilla de grasa, la diferencia no fue muy significativa estadísticamente (p=0,047). No hubo efecto del tratamiento sobre la masa de otros tejidos ensayados, incluyendo hígado y riñón. En resumen, el propéptido de GDF-8 modificado bloqueó la actividad del GDF-8 in vivo, y condujo a un aumento de la masa muscular y a una disminución de la masa de grasa. En resumen, el bloqueo de la actividad del GDF-8 in vivo mediante inyección I.P. de proteína de fusión de propéptido de GDF-8 con Fc (ratones tratados) dio como resultado una masa incrementada del músculo del gastrocnemio y del cuadriceps, en comparación con ratones de control que no recibieron proteína de fusión de propéptido de GDF-8 con Fc.

Equivalentes

Los expertos en la materia reconocerán, o serán capaces de averiguar, utilizando no más de una experimentación normal, muchos equivalentes a las formas de realización específicas de la invención descrita en la presente memoria.

<110> American Home Products Corporation

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<120> Propéptidos de GDF modificados y estabilizados y usos de los mismos

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<130> 01997.002000

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<140> Todavía no asignado

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<141> 2001-02-07

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<150> US 60/267.509

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<151> 2001-02-08

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<160> 16

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<170> PatentIn version 3.1

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<210> 1

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<211> 375

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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3

4

5

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<210> 2

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<211> 1125

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

6

7

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<210> 3

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<211> 109

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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8

9

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<210> 4

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<211> 327

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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10

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<210> 5

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<211> 243

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

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11

12

13

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<210> 6

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<211> 729

< 212 > ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

14

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<210> 7

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<211> 407

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 7

15

16

17

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<210> 8

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<211> 1221

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 8

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18

19

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<210> 9

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<211> 109

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 9

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20

21

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<210> 10

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<211> 327

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 10

22

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<210> 11

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<211> 274

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 11

23

24

25

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<210> 12

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<211> 822

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 12

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26

27

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<210> 13

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<211> 23

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 13

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\sa{Met Gln Lys Leu Gln Leu Cys Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Ile}

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\sa{Val Ala Gly Pro Val Asp Leu}

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<210> 14

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<211> 24

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 14

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\sa{Met Val Leu Ala Ala Pro Leu Leu Leu Gly Phe Leu Leu Leu Ala Leu}

\sac{Glu Leu Arg Pro Arg Gly Glu Ala}

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<210> 15

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<211> 232

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 15

28

29

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<210> 16

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<211> 227

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 16

30

31

Claims (39)

1. Propéptido de GDF-8 modificado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una mutación que modifica la secuencia de aminoácidos en el resto que corresponde a la posición 76 de SEC ID nº: 5, en el que el propéptido de GDF-8 modificado tiene una semivida incrementada in vivo o in vitro, con relación a un propéptido de GDF-8 no modificado correspondiente.

2. Propéptido de GDF-8 modificado según la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos es por lo menos idéntica en un 75% a la SEC ID nº 5 o un fragmento de la misma que es capaz de inhibir la actividad de GDF-8, en el que dicho fragmento comprende una mutación que modifica la secuencia de aminoácidos en el resto que corresponde a la posición 76 de SEC ID nº: 5.

3. Propéptido de GDF-8 modificado según la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos es por lo menos 75% idéntica a SEC ID nº: 5.

4. Propéptido de GDF-8 modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el propéptido de GDF-8 modificado comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 5 o un fragmento de la misma que es capaz de inhibir la actividad de GDF-8, excepto que la secuencia de aminoácidos o fragmento tiene una mutación en el resto que corresponde a la posición 76 de SEC ID nº: 5.

5. Propéptido de GDF-8 modificado según la reivindicación 4, en el que el propéptido de GDF-8 modificado comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 5, excepto que tiene una mutación en el resto que corresponde a la posición 76 de SEC ID nº: 5.

6. Propéptido de GDF-8 modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la mutación que modifica la secuencia de aminoácidos en el resto que corresponde a la posición 76 de SEC ID nº: 5 se selecciona de entre una mutación por sustitución, supresión, e inserción.

7. Propéptido de GDF-8 modificado según la reivindicación 6, en el que el resto que corresponde a la posición 76 de SEC ID nº: 5 es alanina.

8. Propéptido modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que un sitio de escisión proteolítica está inactivado por la mutación para dicho sitio.

9. Propéptido modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el propéptido modificado comprende además una porción estabilizadora fusionada al propéptido.

10. Propéptido modificado según la reivindicación 9, en el que la porción estabilizadora comprende una región Fc de una molécula de IgG.

11. Propéptido modificado según la reivindicación 10, en el que la molécula de IgG comprende una región Fc de IgG1 o IgG4.

12. Propéptido modificado según la reivindicación 10, en el que la molécula de IgG es IgG1 o IgG4.

13. Propéptido modificado según la reivindicación 10, en el que la secuencia de aminoácidos de la molécula de IgG es por lo menos 75% idéntica a SEC ID nº: 15.

14. Propéptido modificado según la reivindicación 10, en el que la secuencia de aminoácidos de la molécula de IgG es idéntica a SEC ID nº: 15.

15. Propéptido modificado según la reivindicación 10, en el que la secuencia de aminoácidos de la molécula de IgG es por lo menos 75% idéntica a SEC ID nº: 16.

16. Propéptido modificado según la reivindicación 10, en el que la secuencia de aminoácidos de la molécula de IgG es SEC ID nº: 16.

17. Propéptido modificado según la reivindicación 10, en el que el propéptido está fusionado a la región Fc de la molécula de IgG a través de un péptido ligador.

18. Propéptido modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el propéptido modificado tiene un sitio de glucosilación alterado.

19. Propéptido modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el propéptido modificado comprende por lo menos un resto de hidrato de carbono.

\newpage

20. Propéptido modificado según la reivindicación 9, en el que la porción estabilizadora comprende albúmina o un derivado de albúmina.

21. Propéptido modificado según la reivindicación 9, en el que la porción estabilizadora comprende un polímero no proteinoso.

22. Propéptido modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el propéptido modificado comprende además una etiqueta de purificación.

23. Molécula de ácido nucleico que codifica el propéptido de GDF-8 modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22.

24. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 23, que comprende por lo menos 20 nucleótidos contiguos como se expone en SEC ID nº: 2.

25. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 23, que comprende por lo menos 20 nucleótidos contiguos como se expone en SEC ID nº: 6.

26. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 24, que comprende por lo menos 50 nucleótidos contiguos como se expone en SEC ID nº: 2.

27. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 24, que comprende por lo menos 50 nucleótidos contiguos como se expone en SEC ID nº: 6.

28. Composición farmacéutica que comprende el propéptido modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

29. Composición farmacéutica que comprende la molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27, y un vehículo o vector farmacéuticamente aceptable.

30. Método para obtener un propéptido de GDF-8 modificado, que comprende:

(a)

preparar una molécula de ADNc que codifica el propéptido de GDF-8 modificado según la reivindicación 1, en el que el sitio de escisión proteolítica está modificado;

(b)

preparar una molécula de ADNc que codifica la región Fc de la molécula de IgG; y

(c)

fusionar las moléculas de ADNc de las etapas (a) y (b) para producir un propéptido de GDF-8 modificado.

31. Método según la reivindicación 30, que comprende además preparar un oligonucleótido bicatenario que codifica un péptido ligador, y fusionar las moléculas de ADNc de las etapas (a) y (b) a cualquier extremo del oligonucleótido bicaternario que codifica el péptido ligador.

32. Método según la reivindicación 31, en el que el péptido ligador comprende la secuencia de aminoácidos que consiste en GSGS.

33. Célula aislada recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica un propéptido de GDF-8 modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22.

34. Célula aislada recombinante según la reivindicación 33, en la que dicho ácido nucleico comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una porción estabilizadora.

35. Propéptido modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, para su utilización como medicamento.

36. Uso de un propéptido modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una o más afecciones seleccionadas de trastorno muscular, trastorno neuromuscular, trastorno metabólico y trastorno degenerativo óseo.

37. Uso de un propéptido modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una o más afecciones seleccionadas de esclerosis lateral amiotrófica, distrofia muscular, atrofia muscular, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, síndrome de emaciación muscular, sarcopenia y caquexia.

38. Uso de un propéptido modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de osteoporosis.

39. Uso de un propéptido modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en la preparación de un medicamento para incrementar la masa muscular.