ES2593836T3 - Oligonucleótido que comprende una inosina para tratar la DMD - Google Patents

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Abstract

Oligonucleótido antisentido que comprende al menos una inosina, donde el oligonucleótido comprende una secuencia dirigida al menos a parte de una parte de un exón de pre-ARNm de distrofina que es una extensión contigua que comprende al menos 13 nucleótidos y donde el oligonucleótido antisentido es capaz de realizar saltos de exón.

Description

DESCRIPCIÓN
Oligonucleótido que comprende una inosina para tratar la DMD.
Campo de la invención 5
[0001] La invención se refiere a los campos de la biología molecular y la medicina.
Antecedentes de la invención
10
[0002] Un trastorno muscular es una enfermedad que normalmente tiene un impacto significativo en la vida de un individuo.
Un trastorno muscular puede tener o bien una causa genética o bien una causa no genética. Un grupo importante de enfermedades musculares con causa genética son la distrofia muscular de Becker (BMD) y la distrofia muscular de Duchenne (DMD). Estos trastornos son provocados por defectos en un gen para una proteína muscular. 15
[0003] La distrofia muscular de Becker y la distrofia muscular de Duchenne son distrofias musculares genéticas con una incidencia relativamente alta.
En las distrofias musculares tanto de Duchenne como de Becker, la proteína muscular distrofina se ve afectada. En la distrofia de Duchenne, la distrofina está ausente, mientras que en la de Becker hay algo de distrofina pero su 20 producción muy a menudo no es suficiente y/o la distrofina presente se forma de manera anormal. Ambas enfermedades se asocian con una herencia recesiva ligada al cromosoma X. La DMD resulta de una mutación de desplazamiento del marco de lectura en el gen DMD. El desplazamiento del marco de lectura en la transcripción del gen DMD (ARNm) tiene como resultado la producción de una proteína distrofina no funcional truncada, dando como resultado una atrofia y debilidad muscular progresivas. La BMD ocurre cuando una mutación no causa un 25 desplazamiento de marco en la transcripción del DMD (ARNm).
Como en la BMD existe presencia de algo de distrofina parcialmente o en gran medida funcional, a diferencia de la DMD donde la distrofina está ausente, la BMD tiene síntomas generalmente menos graves que la DMD.
La aparición de la DMD es anterior que la de la BMD. la DMD normalmente se manifiesta en la infancia temprana, y la BMD en los adolescentes o en la edad adulta temprana. La progresión de la BMD es más lenta y menos previsible 30 que la de la DMD. Los pacientes con BMD pueden sobrevivir hasta entre la edad adulta intermedia y tardía. Los pacientes con DMD raramente sobreviven más allá de la treintena.
[0004] La distrofina desempeña una importante función estructural en la fibra muscular, conectando la matriz extracelular y el citoesqueleto. 35
La región N-terminal enlaza la actina, mientras que el extremo C-terminal forma parte del complejo distrofina-glicoproteína (DGC), que abarca el sarcolema.
En ausencia de distrofina, la tensión mecánica lleva a roturas del sarcolema, lo que causa un flujo descontrolado de calcio en la fibra muscular interior, activando así las proteasas activadas por calcio y necrosis de la fibra.
40
[0005] Para la mayoría de distrofias musculares genéticas, actualmente no hay disponible ningún tratamiento clínicamente aplicable y eficaz.
Actualmente se exploran las técnicas de salto de exón para combatir las distrofias musculares genéticas.
Recientemente se han reportado resultados prometedores, por nosostros y por otros, en una terapia genética dirigida a la restauración del marco de lectura del pre-ARNm de distrofina en células de ratón mdx, de perro golden 45 retriever con distrofia muscular (referencia 59) y patients de DMD 1-11.
WO 2006/000057 describe una lista de oligonucleótidos antisentido dirigidos a diferentes exones del gen DMD con un grado variable de eficiencia de salto de exón.
Mediante el salto previsto de un exón específico, un fenotipo de DMD (distrofina carente) se convierte en un fenotipo de BMD más suave (distrofina parcialmente o en gran medida funcional). 50
El salto de un exón es preferiblemente inducido por la unión de oligorribonucleótidos antisentido (AON) dirigidos a uno o ambos de los sitios de empalme, o secuencias internas de exón.
Ya que un exón sólo se incluye en el ARNm cuando los sitios de empalme son reconocidos por el complejo espliceosoma, los sitios de empalme se han considerado objetivos obvios para los AON.
Más preferiblemente, se usan uno o más AON que son específicos para al menos parte de una o varias secuencias 55 exónicas implicadas en el empalme correcto del exón.
Al utilizar AON internos de exón específicos para una secuencia de exón 46, previamente fuimos capaces de modular el modelo de empalme en miotubos cultivados de dos pacientes de DMD diferentes con una deleción del exón 45 11.
Después del tratamiento con AON, el exón 46 fue saltado, lo que resultó en un marco de lectura restaurado y en la 60 inducción de síntesis de distrofina en al menos 75% de las células.
Recientemente hemos demostrado que el salto de exón también puede ser eficazmente inducido en células musculares de control humanas y de paciente para 39 exones de DMD diferentes usando AON internos al exón 1, 2, 11-15.
65
[0006] Por lo tanto, las técnicas de salto de exón aplicadas en el gen de distrofina suponen la generación de proteína
distrofina al menos parcialmente funcional - aunque más corta - en pacientes de DMD.
Ya que la DMD está provocada por una proteína distrofina disfuncional, sería de esperar que los síntomas de la DMD se vean lo suficientemente aliviados una vez que se ha proporcionado a un paciente de DMD proteína distrofina funcional.
Sin embargo, la presente invención proporciona el conocimiento de que, aunque las técnicas de salto de exón son 5 capaces de inducir la síntesis de distrofina, el oligonucleótido usado para la técnica de salto de exón se puede mejorar más mediante la incorporación de una inosina y/o un nucleótido con una base capaz de formar un par de base de balanceo en dicho oligonucleótido.
WO 2001/083503 describe oligonucleótidos que tienen inosina para sustituciones de guanina y se refiere a un método para el marcaje de oligonucleótidos que podrían ser usados en series de diagnóstico. 10
WO 2005/115479 divulga inosina para sustituciones de guanina para reducir la agregación de conjugados PMO-péptido ricos en G.
Descripción de la invención
15
Oligonucleótido
[0007] En un primer aspecto de la invención, se proporciona un oligonucleótido antisentido que comprende al menos una inosina, donde el oligonucleótido comprende una secuencia que se dirige a al menos parte de una parte de exón de pre-ARNm de distrofina que es una extensión contigua que comprende al menos 13 nucleótidos y donde el 20 oligonucleótido antisentido es capaz de realizar un salto de exón.
En otro aspecto, se proporciona un oligonucleótido según la divulgación que incluye una inosina y/o un nucleótido con una base capaz de formar un par de bases de balanceo o un equivalente funcional del mismo, donde el oligonucleótido, o un equivalente funcional del mismo, comprende una secuencia que es complementaria por lo menos de parte de un exón de pre-ARNm de distrofina o al menos de parte de una región sin exón de un pre-ARNm 25 de distrofina, dicha parte siendo una extensión contigua que comprende al menos 8 nucleótidos.
El uso de una inosina y/o un nucleótido que contiene una base capaz de formar un par de bases de balanceo en un oligonucleótido de la invención es muy atractivo, como se explica a continuación.
La inosina, por ejemplo, es una base modificada conocida que se puede aparear con tres bases: uracilo, adenina, y citosina. 30
La inosina es un nucleósido que se forma cuando la hipoxantina se fija a un anillo de ribosa (también conocido como una ribofuranosa) a través de un enlace ß-N9-glucosídico.
La inosina se encuentra comúnmente en el ARNt y es esencial para la traducción apropiada del código genético en los pares de bases de balanceo.
Un par de bases de balanceo es un par G-U e I-U / I-A / I-C fundamental en la estructura secundaria del ARN. 35
Su estabilidad termodinámica es comparable a la del par de bases Watson-Crick.
Los pares de bases de balanceo son fundamentales para la traducción apropiada del código genético.
El código genético compensa las disparidades en el número de aminoácidos (20) para codones tripletes (64) usando pares de bases modificados en la primera base del anticodón.
De forma similar, al diseñar cebadores para la reacción en cadena de la polimerasa, la inosina es útil porque se 40 aparea indiscriminadamente con adenina, timina, o citosina.
Una primera ventaja del uso de tal base permite diseñar un cebador que abarca un polimorfismo de nucleótido único (SNP), sin preocuparse de que el polimorfismo interrumpa la eficiencia de reconocimiento del cebador.
Por lo tanto, en la invención, el uso de tal base permite diseñar un oligonucleótido que se puede utilizar para un individuo con un SNP en la extensión de pre-ARNm de distrofina al que se dirige un oligonucleótido de la invención. 45
Una segunda ventaja del uso de una inosina y/o una base capaz de formar un par de bases de balanceo en un oligonucleótido de la invención es cuando dicho oligonucleótido normalmente contendría una CpG si un hubiera sido diseñado como complementario de por lo menos parte de un exón de pre-ARNm de distrofina o al menos parte de una región sin exón de un pre-ARNm de distrofina, dicha parte siendo una extensión contigua que comprende al menos 13 nucleótidos. 50
La presencia de una CpG en un oligonucleótido está normalmente asociada a una inmunogenicidad aumentada de dicho oligonucleótido (referencia 60).
Esta inmunogenicidad aumentada no es deseable, ya que puede inducir la descomposición de fibras musculares.
Se espera que el reemplazo de una, dos o más CpG por la inosina correspondiente y/o una base capaz de formar un par de bases de balanceo en dicho oligonucleótido proporcione un oligonucleótido con un nivel disminuido y/o 55 aceptable de inmunogenicidad.
La inmunogenicidad se puede evaluar en un modelo animal mediante la evaluación de la presencia de células CD4+ y/o CD8+ y/o infiltrantes de mononucleocitos inflamatorios en la biopsia muscular de dicho animal.
La inmunogenicidad también se puede evaluar en la sangre de un animal o de un ser humano tratado con un oligonucleótido de la invención mediante la detección de la presencia de un anticuerpo de neutralización y/o un 60 anticuerpo que reconoce dicho oligonucleótido utilizando un inmunoensayo estándar conocido por la persona experta.
Un aumento en la inmunogenicidad corresponde preferiblemente a un aumento detectable de al menos uno de estos tipos celulares por comparación con la cantidad de cada tipo celular en una biopsia de músculo correspondiente de un animal antes del tratamiento o tratado con un oligonucleótido correspondiente con al menos una inosina y/o una 65 base capaz de formar un par de bases de balanceo.
Alternativamente, un aumento en la inmunogenicidad se puede evaluar mediante la detección de la presencia o de una cantidad en aumento de un anticuerpo de neutralización o de un anticuerpo que reconoce dicho oligonucleótido utilizando un inmunoensayo estándar.
Una reducción en la inmunogenicidad corresponde preferiblemente a una reducción detectable de al menos uno de estos tipos celulares por comparación a la cantidad de tipo de célula correspondiente en una biopsia de músculo 5 correspondiente de un animal antes del tratamiento o tratado con un oligonucleótido correspondiente sin ninguna inosina y/o base capaz de formar un par de bases de balanceo.
Alternativamente, una reducción en la inmunogenicidad se puede evaluar por la ausencia o una cantidad decreciente de dicho compuesto y/o anticuerpos de neutralización utilizando un inmunoensayo estándar.
10
[0008] Una tercera ventaja del uso de una inosina y/o de una base capaz de formar un par de bases de balanceo en un oligonucleótido de la invención es la de evitar o reducir una multimerización o agregación potencial de oligonucleótidos.
Por ejemplo, se sabe que un oligonucleótido que comprende un motivo G-cuádruple tiende a formar un cuádruplex, un multímero o agregado formado por el apareamiento de bases Hoogsteen de cuatro oligonucleótidos 15 monocatenarios (referencia 61), que por supuesto no es deseado: como resultado, se espera que la eficiencia del oligonucleótido disminuya.
La multimerización o agregación es preferiblemente evaluada por técnicas de electroforesis estándar con gel no desnaturalizante de poliacrilamida conocidas por la persona experta.
En una forma de realización preferida, menos del 20% o 15%, 10%, 7%, 5% o menos de una cantidad total de un 20 oligonucleótido de la invención tiene la capacidad para multimerizar o agregar, evaluado utilizando el ensayo mencionado anteriormente.
[0009] Una cuarta ventaja del uso de una inosina y/o una base capaz de formar un par de bases de balanceo en un oligonucleótido de la invención es también, por lo tanto, la de evitar estructuras cuádruplex que han sido asociadas a 25 actividad antitrombótica (referencia 62) así como a la unión a, y la inhibición de, los receptores depuradores de los macrófagos (referencia 63 .).
[0010] Una quinta ventaja del uso de una inosina y/o una base capaz de formar un par de bases de balanceo en un oligonucleótido de la invención es la de permitir el diseño de un oligonucleótido con una cinética de unión de ARN 30 y/o propiedades termodinámicas mejoradas.
La cinética de unión de ARN y/o las propiedades termodinámicas son, al menos en parte, determinadas por la temperatura de fusión de un oligonucleótido (Tm; calculada con el calculador de propiedades oligonucleótidas (http://www.unc.edu/?cail/biotool/oligo/index.html) para ARN monocatenario que utiliza la Tm básica y el modelo del vecino más cercano), y/o la energía libre del complejo de exón dirigido a AON (usando RNA structure versión 4.5). 35
Si una Tm es demasiado alta, se espera que el oligonucleótido sea menos específico.
Una Tm y una energía libre aceptables dependen de la secuencia del oligonucleótido.
Por lo tanto, es difícil de dar rangos preferidos para cada uno de estos parámetros.
Una Tm aceptable puede oscilar entre 35 y 65°C y una energía libre aceptable puede oscilar entre 15 y 45 kcal/mol.
40
[0011] La persona experta puede, por lo tanto, elegir primero un oligonucleótido como compuesto terapéutico potencial.
En un segundo paso, puede usar la invención para optimizar más dicho oligonucleótido haciendo decrecer su inmunogenicidad y/o evitando la agregación y/o la formación de cuádruplex y/o optimizando su Tm y/o la energía libre del complejo dirigido a AON. 45
Puede tratar de introducir al menos una inosina y/o una base capaz de formar un par de bases de balanceo en dicho oligonucleótido en una posición adecuada y valorar cómo la inmunogenicidad y/o la agregación y/o la formación de cuádruplex y/o la Tm y/o la energía libre del complejo dirigido a AON han sido alteradas por la presencia de dicha inosina y/o una base capaz de formar un par de bases de balanceo.
Si la alteración no proporciona la alteración o reducción de la inmunogenicidad y/o agregación y/o formación de 50 cuádruplex y/o su Tm y/o energía libre del complejo dirigido a AON deseadas, la persona experta puede elegir introducir una otra inosina y/o una base capaz de formar un par de bases de balanceo en dicho oligonucleótido y/o introducir una inosina dada y/o una base capaz de formar un par de bases de balanceo en una posición adecuada diferente dentro de dicho oligonucleótido.
55
[0012] Un oligonucleótido que comprende una inosina y/o una base capaz de formar un par de bases de balanceo se puede definir como un oligonucleótido donde al menos un nucleótido ha sido sustituido por una inosina y/o una base capaz de formar un par de bases de balanceo.
La persona experta sabe cómo comprobar si un nucleótido contiene una base capaz de formar un par de bases de balanceo. 60
Ya que, por ejemplo, la inosina puede formar un par de bases con uracilo, adenina, y/o citosina, significa que al menos un nucleótido capaz de formar un par de bases con uracilo, adenina y/o citosina ha sido sustituido por inosina.
Sin embargo, para salvaguardar la especificidad, la inosina que contiene oligonucleótidos preferiblemente comprende la sustitución de al menos uno, dos, tres, cuatro nucleótido(s) capaces de formar un par de bases con 65 uracilo o adenina o citosina cuando se retiene un nivel aceptable de una actividad funcional de dicho oligonucleótido
tal y como se define más adelante en este documento.
Un oligonucleótido que comprende una inosina y/o una base capaz de formar un par de bases de balanceo es preferiblemente un oligonucleótido, que sigue siendo capaz de mostrar un nivel aceptable de una actividad funcional de un oligonucleótido correspondiente que no comprende una inosina y/o una base capaz de formar un par de bases de balanceo. 5
Una actividad funcional de dicho oligonucleótido consiste preferiblemente en proporcionar a un individuo una proteína distrofina y/o ARNm funcional y/o disminuir al menos en parte la producción de una proteína distrofina y/o ARNm aberrante.
Cada una de estas características se definen más adelante en este documento.
Un nivel aceptable de tal actividad funcional es preferiblemente al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 100% 10 de la actividad funcional del oligonucleótido correspondiente que no comprende una inosina y/o una base capaz de formar un par de bases de balanceo.
Dicha actividad funcional puede ser tal y como se mide en un tejido muscular o en una célula muscular de un individuo o in vitro en una célula por comparación con la actividad funcional de unos oligonucleótidos correspondientes que no comprenden una inosina y/o una base capaz de formar un par de bases de balanceo. 15
La evaluación de la funcionalidad se puede realizar en el nivel del ARNm, preferiblemente utilizando RT-PCR.
La evaluación de la funcionalidad se puede realizar en el nivel de las proteínas, preferiblemente utilizando el análisis de electrotransferencia o el análisis de inmunofluorescencia de secciones transversales.
[0013] En el contexto de la divulgación, una inosina y/o una base capaz de formar un par de bases de balanceo tal y 20 como están presentes en un oligonucleótido está/están presente(s) en una parte de dicho oligonucleótido que es complementaria a por lo menos parte de un exón de pre-ARNm de distrofina o al menos parte de una región sin exón de un pre-ARNm de distrofina, dicha parte siendo una extensión contigua que comprende al menos 8 nucleótidos.
Por lo tanto, en una forma de realización preferida, un oligonucleótido que comprende una inosina y/o un nucleótido 25 con una base capaz de formar un par de bases de balanceo o un equivalente funcional del mismo, donde el oligonucleótido, o un equivalente funcional del mismo, comprende una secuencia que es complementaria a por lo menos parte de un exón de pre-ARNm de distrofina o al menos a parte de una región sin exón de un pre-ARNm de distrofina, dicha parte siendo una extensión contigua que comprende al menos 8 nucleótidos y donde dicha inosina y/o un nucleótido con una base está/están presente(s) en la secuencia oligonucleótida que es complementaria por lo 30 menos a parte de un pre-ARNm de distrofina tal y como se define en la frase precedente.
[0014] Sin embargo, como se define más adelante, tal inosina y/o una base capaz de formar un par de bases de balanceo también puede estar presente en una fracción de enlace presente en un oligonucleótido de la divulgación.
Las fracciones de enlace preferidas se definen más adelante en el presente documento. 35
En una forma de realización preferida, un oligonucleótido según la invención es preferiblemente un medicamento.
Más preferiblemente, dicho medicamento es para prevenir o tratar la distrofia muscular de Duchenne o la distrofia muscular de Becker en un individuo o un paciente.
Tal y como se define en este documento, un pre-ARNm de DMD significa preferiblemente el pre-ARNm de un gen DMD de un paciente de DMD o de BMD. 40
Con paciente se pretende designar un paciente con DMD o BMD o un paciente susceptible de desarrollar DMD o BMD debido a su contexto genético.
En el caso de un paciente de DMD, un oligonucleótido usado corregirá preferiblemente al menos una de las mutaciones de DMD según están presentes en el gen DMD de dicho paciente y, por lo tanto, preferiblemente creará una distrofina que se parecerá a una distrofina de BMD: dicha distrofina preferiblemente será una distrofina funcional 45 según se define más adelante en este documento.
En el caso de un paciente de BMD, un oligonucleótido usado corregirá preferiblemente al menos una de las mutaciones BMD según están presentes en el gen DMD de dicho paciente y, por lo tanto, preferiblemente crearán una, o más de una, distrofina, que será más funcional que la distrofina que estaba originalmente presente en dicho paciente de BMD. 50
Aún más preferiblemente, dicho medicamento proporciona a un individuo una o más (de una) proteína(s) de distrofina y/o ARNm funcionales y/o reduce al menos en parte la producción de una proteína distrofina y/o ARNm aberrante.
Preferiblemente, un método de la invención mediante la inducción y/o la estimulación del salto de al menos un exón del pre-ARNm de DMD como se identifica aquí en una o más células, preferiblemente células musculares de un 55 paciente, proporciona a dicho paciente una producción aumentada de una proteína distrofina y/o ARNm más funcional y/o reduce la producción de una proteína distrofina y/o ARNm aberrante o menos funcional en dicho paciente.
El proporcionar a un paciente una proteína distrofina y/o ARNm más funcional y/o la disminución de la producción de una proteína distrofina y/o ARNm aberrante en dicho paciente se aplica típicamente a un paciente de DMD. 60
El aumento de la producción de una distrofina y/o ARNm más funcional o funcional se aplica típicamente en un paciente de BMD.
Por lo tanto, un método preferido es un método en el que se porporciona a un paciente o a una o varias células de dicho paciente una producción aumentada de una proteína distrofina y/o ARNm más funcional o funcional y/o en el que se disminuye la producción de una proteína distrofina y/o ARNm aberrante en dicho paciente, donde el nivel de 65 dicha proteína distrofina y/o ARNm aberrante o más funcional se evalúa por comparación con el nivel de dicha
distrofina y/o ARNm en dicho paciente al comienzo del método.
[0015] Tal y como se define en este documento, una distrofina funcional es preferiblemente una distrofina de tipo salvaje que corresponde con una proteína que contiene la secuencia de aminoácidos según se identifica en la SEC ID n.º: 1. 5
Una distrofina funcional es preferiblemente una distrofina, que tiene un dominio de unión de actina en su parte N-terminal (primeros 240 aminoácidos del extremo N-terminal), un dominio rico en cisteína (aminoácido 3361 a 3685) y un dominio C-terminal (últimos 325 aminoácidos del extremo C-terminal) cada uno de estos dominios que está presente en una distrofina de tipo salvaje, tal y como sabe la persona experta.
Los aminoácidos indicados aquí corresponden con aminoácidos de la distrofina de tipo salvaje que es representada 10 por la SEC ID n.º: 1.
En otra forma de realización, una distrofina funcional es una distrofina que muestra al menos hasta cierto punto una actividad de una distrofina de tipo salvaje. "Al menos hasta cierto punto" preferiblemente significa al menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 100% de una actividad correspondiente a una distrofina funcional de tipo salvaje. 15
En este contexto, una actividad de una distrofina de tipo salvaje es preferiblemente la unión a actina y al complejo de glicoproteínas asociado a la distrofina (DGC)56.
La unión de la distrofina a actina y al complejo DGC se puede visualizar mediante o bien co-inmunoprecipitación que usa extractos de proteínas totales o bien análisis de inmunofluorescencia de secciones transversales, de una biopsia de un músculo que se sospecha que es distrófico, como sabe la persona experta. 20
[0016] Los individuos que padecen distrofia muscular de Duchenne típicamente tienen una mutación en el gen que codifica la distrofina de que evita la síntesis de la proteína completa, es decir, una parada prematura evita la síntesis del extremo C-terminal de la proteína.
En la distrofia muscular de Becker, el gen de la distrofina también comprende una mutación en comparación con el 25 tipo salvaje, pero la mutación típicamente no incluye una parada prematura y el extremo C-terminal de la proteína típicamente es sintetizado.
Como resultado, se sintetiza una proteína distrofina funcional que tiene al menos el mismo tipo de actividad que una proteína de tipo salvaje, aunque no necesariamente la misma cantidad de actividad.
En una forma de realización preferida, una proteína distrofina funcional significa un gen de distrofina dentro del 30 marco.
El genoma de un individuo con BMD codifica típicamente una proteína distrofina que comprende la parte N-terminal (primeros 240 aminoácidos del extremol N-terminal), un dominio rico en cisteína (aminoácidos 3361 a 3685) y un dominio C-terminal (últimos 325 aminoácidos del extremo C-terminal) pero su dominio central con forma de barra puede ser más corto que el de una distrofina de tipo salvaje 56. 35
El salto de exón para el tratamiento de DMD está preferiblemente pero no exclusivamente dirigido a superar una parada prematura en el pre-ARNm mediante el salto de un exón en el dominio con forma de barra para corregir el marco de lectura y permitir la síntesis del resto de la proteína distrofina incluyendo el extremo C-terminal, aunque que la proteína es algo más pequeña como resultado de un dominio de barra menor.
En una forma de realización preferida, a un individuo con DMD y que está siendo tratado utilizando un 40 oligonucleótido tal y como se define en el presente documento se le proporciona una distrofina, que muestra al menos hasta cierto punto una actividad de una distrofina de tipo salvaje.
Más preferiblemente, si dicho individuo es un paciente de Duchenne o se sospecha que puede ser un paciente de Duchenne, una distrofina funcional es una distrofina de un individuo con BMD: preferiblemente dicha distrofina es capaz de interactuar tanto con la actina y el DGC, pero su dominio central con forma de barra puede ser más corto 45 que el de una distrofina de tipo salvaje (Aartsma-Rus et al (2006, ref 56).
El dominio central de barra de la distrofina de tipo salvaje comprende 24 repeticiones de tipo espectrina 56.
Por ejemplo, un dominio central con forma de barra de una distrofina como se proporciona aquí puede comprender de 5 a 23, de 10 a 22 o de 12 a 18 repeticiones de tipo espectrina mientras se pueda enlazar con actina y con DGC.
La disminución de la producción de una distrofina aberrante en dicho paciente o en una célula de dicho paciente se 50 puede evaluar en el nivel del ARNm y preferiblemente significa que 99%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% o menos de la cantidad inicial de ARNm de distrofina aberrante sigue siendo detectable por RT PCR.
Un ARNm o una proteína distrofina aberrante también se denomina en este caso como un ARNm o proteína distrofina no funcional o de menos a no funcional o semifuncional.
Una distrofina de pre-ARNm no funcional preferiblemente lleva a una proteína distrofina fuera del marco, lo que 55 significa que no se producirá ni/o se detectará ninguna proteína distrofina.
Una proteína distrofina no funcional es preferiblemente una proteína distrofina que no es capaz de enlazar actina y/o miembros del complejo de proteína DGC.
Una proteína distrofina o ARNm de distrofina no funcional típicamente no tiene o no codifica una proteína distrofina con un extremo C-terminal intacto de la proteína. 60
[0017] El aumento de la producción de una distrofina funcional en dicho paciente o en una célula de dicho paciente se puede evaluar en el nivel del ARNm (por análisis RT-PCR) y preferiblemente significa que una cantidad detectable de un ARNm de distrofina funcional o dentro del marco es detectable por RT PCR.
En otra forma de realización, un 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más del ARNm de la 65 distrofina detectable es un ARNm de distrofina funcional o dentro del marco.
El aumento de la producción de una distrofina funcional en dicho paciente o en una célula de dicho paciente se puede evaluar en el nivel de la proteína (por inmunofluorescencia y análsis de electrotransferencia) y preferiblemente significa que una cantidad detectable de una proteína distrofina funcional es detectable mediante inmunofluorescencia o análisis de electrotransferencia.
En otra forma de realización, un 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más de la proteína 5 distrofina detectable es una proteína distrofina funcional.
[0018] Un aumento o una reducción es preferiblemente evaluada en un tejido muscular o en una célula muscular de un individuo o un paciente por comparación a la cantidad presente en dicho individuo o paciente antes del tratamiento con dicha molécula o composición de la invención. 10
Alternativamente, la comparación puede ser hecha con un tejido muscular o célula de dicho individuo o paciente que todavía no ha sido tratado con dicho oligonucleótido o composición en el caso de que el tratamiento sea local.
[0019] En un método preferido, uno o varios síntoma(s) de un paciente de DMD o BMD es/son aliviado(s) y/o una o varias característica(s) de una célula o tejido muscular de un paciente de DMD o de BMD es/son aliviada(s) 15 utilizando una molécula o una composición de la invención.
Tales síntomas se pueden evaluar en el propio paciente.
Tales características se pueden evaluar en el nivel celular y del tejido de un paciente determinado.
El alivio de una o varias características se puede evaluar por medio de cualquiera de los ensayos siguientes en una célula miogénica o célula muscular de un paciente: reducción de la absorción de calcio por las células musculares, 20 disminución de la síntesis de colágeno, alteración de la morfología, alteración de la biosíntesis de lípidos, disminución del estrés oxidativo, y/o mejora de la función, integridad, y/o supervivencia de la fibra muscular.
Estos parámetros normalmente son evaluados usando inmunofluorescencia y/o análisis histoquímicos de secciones transversales de biopsias de músculo.
25
[0020] El alivio de uno o varios síntoma(s) de la distrofia muscular de Duchenne o de la distrofia muscular de Becker en un individuo utilizando una molécula o una composición de la invención se puede evaluar mediante cualquiera de las pruebas siguientes: prolongación del tiempo para la pérdida de la capacidad de andar, mejora de la fuerza muscular, mejora de la capacidad para levantar peso, mejora del tiempo que se tarda en levantarse del suelo, mejora en el tiempo que se tarda en caminar nueve metros, mejora en el tiempo que se tarda en subir cuatro 30 escaleras, mejora del grado de función de la pierna, mejora de la función pulmonar, mejora de la función cardíaca, mejora de la calidad de vida.
Cada uno de estas pruebas es conocida por la persona experta.
Como ejemplo, la publicación de Manzur et al (2008, ref 58) da una explicación extensa de cada una de estas pruebas. 35
Para cada una de estas pruebas, tan pronto como se encuentra una mejora o prolongación detectable de un parámetro medido en una prueba, preferiblemente significará que uno o varios síntomas de distrofia muscular de Duchenne ode distrofia muscular de Becker ha sido aliviados en un individuo que utiliza una molécula o composición de la invención.
La mejora o prolongación detectable es preferiblemente una mejora o prolongación estadísticamente significativa 40 como se describe en Hodgetts et al (2006, ref 57).
Alternativamente, el alivio de uno o varios síntoma(s) de la distrofia muscular de Duchenne o de la distrofia muscular de Becker se puede evaluar mediante la medición de una mejora de la función, integridad y/o supervivencia de una fibra muscular como se defina más adelante en este documento.
45
[0021] Un oligonucleótido como se utiliza en este caso comprende preferiblemente un oligonucleótido antisentido o un oligorribonucleótido antisentido.
En una forma de realización preferida se aplica una técnica de salto de exón.
El salto de exón interfiere con los procesos de empalme naturales que ocurren dentro de una célula eucariota.
En eucariotas más altas, la información genética para proteínas del ADN de la célula se codifica en exones que 50 están separados entre sí por secuencias intrónicas.
Estos intrones son en algunos casos muy largos.
La maquinaria de transcripción de eucariotas genera un pre-ARNm que contiene tanto exones como intrones, mientras que la maquinaria de empalme, frecuentemente ya durante la producción del pre-ARNm, genera la región de codificación real para la proteína mediante el empalme de los exones presentes en el pre-ARNm. 55
[0022] El salto de exón produce ARNm maduro que carece de al menos un exón saltado.
Así, cuando dicho exón codifica aminoácidos, el salto de exón lleva a la expresión de un producto alterado.
la tecnología para el salto de exón de está actualmente dirigida hacia el uso de oligonucleótidos antisentido (AON).
Gran parte de este trabajo se hace en el modelo de ratón mdx para la distrofia muscular de Duchenne. 60
El ratón mdx lleva una mutación sin sentido en el exón 23.
A pesar de la mutación del mdx, que debería impedir la síntesis de una proteína distrofina funcional, se han observado fibras positivas de distrofina raras y de origen natural en el tejido muscular del mdx.
Se piensa que estas fibras positivas en distrofina han surgido de un mecanismo de salto de exón aparentemente de origen natural, o bien debido a mutaciones somáticas o a través de empalme alternativo. 65
Se ha observado que los AON dirigidos a, respectivamente, los sitios de empalme 3' y/o 5' de los intrones 22 y 23 en
el pre-ARNm de distrofina, interfieren con factores normalmente implicados en la eliminación del intrón 23 de modo que también el exón 23 fue eliminado del ARNm 3, 5, 6, 39, 40.
[0023] Mediante el salto previsto de un exón específico, un fenotipo de DMD se convierte en un fenotipo de BMD más suave. 5
En la divulgación, el salto de un exón es preferiblemente inducido por la unión de AON dirigidos a uno o ambos de los sitios de empalme, o secuencias internas de exón.
Un oligonucleótido de la invención dirigido hacia una secuencia interna de exón típicamente no muestra ningún solapamiento con secuencias sin exón.
Preferiblemente no se solapa con los sitios de empalme, al menos cuando éstos están presentes en el intrón. 10
Un oligonucleótido dirigido hacia una secuencia interna de exón preferiblemente no contiene una secuencia complementaria a un intrón adyacente.
Así, también se proporciona un oligonucleótido según la invención, donde dicho oligonucleótido, o un equivalente funcional del mismo, es para inhibir la inclusión de un exón de un pre-ARNm de distrofina en el ARNm producido del empalme de dicho pre-ARNm. 15
Una técnica de salto de exón es preferiblemente aplicada de manera que la ausencia de un exón de ARNm producido a partir del pre-ARNm de distrofina genera una región de codificación para una proteína distrofina más funcional, aunque más corta.
En este contexto, la inhibición de la inclusión de un exón preferiblemente significa que la detección del ARNm y/o proteína distrofina original aberrante es disminuida como se ha definido anteriormente en el presente documento. 20
[0024] Ya que un exón de un pre-ARNm de distrofina sólo será incluido en el ARNm resultante cuando los sitios de empalme son reconocidos por el complejo espliceosoma, los sitios de empalme han sido objetivos obvios para los AON.
Una forma de realización de la divulgación, por lo tanto, proporciona un oligonucleótido, o un equivalente funcional 25 del mismo, que comprende una secuencia que es complementaria a una región sin exón de una distrofina pre-ARNm.
En una forma de realización de la divulgación se usa un AON que solamente es complementario a una región sin exón de una distrofina pre-ARNm.
Esto, sin embargo, no necesario: también es posible usar un AON que comprende una secuencia específica de 30 intrón así como una secuencia específica de exón.
Tal AON de la divulgación comprende una secuencia que es complementaria a una región sin exón de una distrofina pre-ARNm, así como una secuencia que es complementaria una región de exón de una distrofina pre-ARNm.
Por supuesto, un AON no es necesariamente complementario a la secuencia entera de un exón o intrón de distrofina. 35
Los AON de la divulgación, que son complementarios a una parte de tal exón o intrón, son preferidos.
Un AON de la divulgación es preferiblemente complementario por lo menos a parte de un exón y/o intrón de distrofina, dicha parte teniendo al menos 8, 10, 13, 15, 20 nucleótidos.
[0025] El empalme de un pre-ARNm de distrofina ocurre a través de dos reacciones de transesterificación 40 secuenciales.
Primero, el 2'OH de un nucleótido de punto de ramificación específico en el intrón que se define durante el ensamblaje de espliceosoma lleva a cabo un ataque nucleofílico en el primer nucleótido del intrón en el sitio de empalme 5' que forma el lazo intermedio.
En segundo lugar, el 3'OH del exón liberado lleva a cabo un ataque nucleofílico en el último nucleótido del intrón en 45 el sitio de empalme 3', juntando así los exones y liberando el lazo del intrón.
Así, el punto de ramificación y los sitios de empalme de un intrón están implicados en un evento de empalme.
Por lo tanto, un oligonucleótido de la divulgación que comprende una secuencia, que es complementaria a tal punto de ramificación y/o sitio de empalme, es preferiblemente usada para el salto de exón.
Además, se proporciona, por lo tanto, un oligonucleótido de la divulgación, o un equivalente funcional del mismo, 50 que comprende una secuencia que es complementaria a un sitio de empalme y/o punto de ramificación de una pre-ARNm de distrofina.
[0026] Ya que los sitios de empalme contienen secuencias de consenso, el uso de un oligonucleótido o un equivalente funcional del mismo de la divulgación (aquí también llamado un AON) que comprende una secuencia 55 que es complementaria de un sitio de empalme implica el riesgo de hibridación promiscua.
La hibridación de AON a otros sitios de empalme que los sitios del exón por ser saltado podría fácilmente interferir con la exactitud del proceso de empalme.
Para superar estos y otros problemas potenciales relacionados con el uso de AON que son complementarios una secuencia de intrón, una forma de realización preferida de la divulgación proporciona un oligonucleótido, o un 60 equivalente funcional del mismo, que comprende una secuencia que es complementaria a un exón de pre-ARNm de distrofina.
Preferiblemente, dicho AON es capaz de inhibir específicamente una señal de inclusión de exón de al menos un exón en dicho pre-ARNm de distrofina.
Interferir con una señal de inclusión de exón (EIS) tiene la ventaja de que tales elementos se sitúan en el exón. 65
Al proporcionar un AON para el interior del exón por ser saltado, es posible interferir con la señal de inclusión del
exón, así enmascarando eficazmente el exón frente al aparato de empalme.
La incapacidad del empalme para reconocer el exón por ser saltado así lleva a la exclusión del exón del ARNm final.
Esta forma de realización no interfiere directamente con el proceso enzimático de la maquinaria de empalme (la unión de los exones).
Se piensa que esto permite que el método sea más específico y/o fiable. 5
Se piensa que una EIS es una estructura particular de un exón que permite que el aceptor y el donador de empalme adopten una conformación espacial particular.
En este concepto, es la conformación espacial particular la que permite a la maquinaria de empalme reconocer el exón.
Sin embargo, la invención ciertamente no se limita a este modelo. 10
En una forma de realización preferida, se hace uso de un oligonucleótido, que es capaz de unirse a un exón y es capaz de inhibir un EIS.
Un AON específicamente puede entrar en contacto con dicho exón en cualquier punto y todavía ser capaz de inhibir específicamente dicho EIS.
15
[0027] En el contexto de la invención, un equivalente funcional de un oligonucleótido significa preferiblemente un oligonucleótido tal y como se define en este documento, donde uno o varios nucleótidos han sido sustituidos y donde una actividad de dicho equivalente funcional se retiene por lo menos hasta cierto punto.
Preferiblemente, una actividad de dicho equivalente funcional proporciona una proteína distrofina funcional.
Dicha actividad de dicho equivalente funcional es, por lo tanto, evaluada preferiblemente mediante la cuantificación 20 de la cantidad de una proteína distrofina funcional o mediante la cuantificación de la cantidad de un ARNm de distrofina funcional.
Una proteína distrofina funcional (o un ARNm de distrofina funcional) es preferiblemente definido en este documento como una proteína distrofina (o una proteína distrofina codificada por dicho ARNm) capaz de enlazar actina y miembros de la proteína DGC. 25
La evaluación de dicha actividad de un oligonucleótido es preferiblemente hecha por RT-PCR (ARN-m) o por inmunofluorescencia o inmunoelectrotransferencia (proteína).
Dicha actividad es preferiblemente retenida al menos hasta cierto punto cuando representa al menos 50%, o al menos 60%, o al menos 70% o al menos 80% o al menos 90% o al menos 95% o más de actividad correspondiente de dicho oligonucleótido del que deriva el equivalente. 30
Tal actividad se puede medir en un tejido muscular o en una célula muscular de un individuo o in vitro en una célula mediante comparación con una actividad de un oligonucleótido correspondiente de dicho oligonucleótido del que deriva el equivalente funcional.
En toda esta solicitud, cuando la palabra oligonucleótido se usa, se puede sustituir por un equivalente funcional del mismo tal y como se define en el presente documento. 35
[0028] Por lo tanto, un oligonucleótido, o un equivalente funcional del mismo, que comprende o consiste en una secuencia que es complementaria a un exón de pre-ARNm de distrofina proporciona buenos resultados terapéuticos para DMD.
En una forma de realización preferida, se usa un oligonucleótido, o un equivalente funcional del mismo, que 40 comprende o consiste en una secuencia que es complementaria por lo menos de parte de cualquiera de los exones de pre-ARNm de distrofina 2 a 75, dicha parte que tiene o que comprende al menos 13 nucleótidos.
Sin embargo, dicha parte también puede tener al menos 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 nucleótidos.
En la divulgación, dicha parte también puede tener al menos 8, 9, 10, 11,12 nucleótidos. 45
Una parte de pre-ARNm de distrofina de la que un oligonucleótido es complementaria también se puede llamar una extensión contigua de pre-ARNm de distrofina.
[0029] De la forma más preferible se usa un AON que comprende o consiste en una secuencia que es complementaria de por lo menos parte del exón de pre-ARNm de distrofina 51, 45, 53, 44, 46, 52, 50, 43, 6, 7, 8, 55, 50 2, 11, 17, 19, 21, 57, 59, 62, 63, 65, 66, 69, y/o 75, dicha parte que tiene o que comprende al menos 13 nucleótidos.
Sin embargo, dicha parte también puede tener al menos 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 nucleótidos.
En la divulgación, dicha parte también puede tener al menos 8, 9, 10, 11, 12 nucleótidos.
Los oligonucleótidos más preferidos están representados por una secuencia que comprende o consiste en cada una 55 de las secuencias siguientes SEC ID Nº: 2 a SEC ID Nº: 539, donde al menos una inosina y/o una base capaz de formar un par de bases de balanceo está presente en dicha secuencia.
Preferiblemente, una inosina ha sido introducida en una de estas secuencias para reemplazar una guanosina, una adenina, o un uracilo.
Por consiguiente, un oligonucleótido aún más preferido como se utiliza en este caso está representado por una 60 secuencia que comprende o consiste en SEC ID Nº:2 a SEC ID Nº:486 o SEC ID Nº:539, aún más preferiblemente SEC ID Nº:2 a Nº 237 o SEC ID Nº:539, de la forma más preferible SEC ID Nº:76 donde al menos una inosina y/o una base capaz de formar un par de bases de balanceo está presente en dicha secuencia.
Preferiblemente, una inosina ha sido introducida en una de estas secuencias para reemplazar una guanosina, una adenina, o un uracilo. 65
[0030] Por consiguiente, en otra forma de realización preferida, un oligonucleótido como se utiliza en este caso está representado por una secuencia que comprende o consiste en SEC ID Nº:540 a SEC ID Nº:576.
Más preferiblemente, un oligonucleótido como se utiliza en este caso está representado por una secuencia que comprende o consiste en SEC ID Nº:557.
5
[0031] Dichos exones se enumeran en orden decreciente de aplicabilidad a población de pacientes.
Por lo tanto, el uso de un AON que comprende una secuencia que es complementaria por lo menos de parte de exón de pre-ARNm de distrofina 51 es adecuado para el uso en una parte más grande de la población de pacientes de DMD en comparación con un AON que comprende una secuencia que es complementaria del exón de pre-ARNm de distrofina 44, et cetera. 10
[0032] En una forma de realización preferida, un oligonucleótido de la invención, que comprende una secuencia que es complementaria a parte del pre-ARNm de distrofina es tal que la parte complementaria es al menos 50% de la longitud del oligonucleótido de la invención, más preferiblemente al menos 60%, aún más preferiblemente al menos 70%, aún más preferiblemente al menos 80%, aún más preferiblemente al menos 90% o aún más preferiblemente al 15 menos 95%, o aún más preferiblemente 98% o aún más preferiblemente al menos 99%, o aún más preferiblemente 100%.
En una forma de realización más preferida, el oligonucleótido de la invención consiste en una secuencia que es complementaria a parte del pre-ARNm de distrofina tal y como se define aquí.
Como ejemplo, un oligonucleótido puede comprender una secuencia que es complementaria a parte del pre-ARNm 20 de distrofina tal y como se define aquí y secuencias flanqueadoras adicionales.
En una forma de realización más preferida, la longitud de dicha parte complementaria de dicho oligonucleótido es de al menos 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 nucleótidos.
En la divulgación, dicha parte también puede tener al menos 8, 9, 10, 11, 12 nucleótidos. 25
Preferiblemente, se utilizan secuencias flanqueantes adicionales para modificar la unión de una proteína al oligonucleótido, o para modificar una propiedad termodinámica del oligonucleótido, más preferiblemente para modificar la afinidad de unión de ARN objetivo.
[0033] Una forma de realización preferida proporciona un oligonucleótido, o un equivalente funcional del mismo que 30 comprende:
 una secuencia que es complementaria a una región de un exón de pre-ARNm de distrofina que está hibridizada a otra parte de un exón de pre-ARNm de distrofina (estructura cerrada), y
 una secuencia que es complementaria a una región de un exón de pre-ARNm de distrofina que no está hibridizada en dicho pre-ARNm de distrofina (estructura abierta). 35
[0034] Para esta forma de realización, se hace referencia a WO 2004/083432.
Las moléculas de ARN poseen estructuras secundarias fuertes, principalmente debido al apareamiento de bases de extensiones complementarias o parcialmente complementarias dentro del mismo ARN.
Desde hace mucho tiempo se ha pensado que las estructuras del ARN desempeñan un papel en la función del ARN. 40
Sin pretender imponer ninguna teoría, se cree que la estructura secundaria del ARN de un exón desempeña un papel en la estructuración del proceso de empalme.
La estructura de un exón es un parámetro que se cree que dirige su inclusión en el ARNm.
Sin embargo, otros parámetros también puede desempeñar un papel en esto.
Aquí, a esta función de señalización se hace referencia como una señal de inclusión de exón. 45
Un oligonucleótido complementario de esta forma de realización es capaz de interferir con la estructura del exón y así ser capaz de interferir con la señal de inclusión de exón del exón.
Se ha descubierto que muchos oligonucleótidos complementarios de hecho comprenden esta capacidad, algunos más eficaces que otros.
Los oligonucleótidos de esta forma de realización preferida, es decir aquéllos con dicho solapamiento dirigido hacia 50 estructuras abiertas y cerradas en el ARN del exón nativo, son una selección de todos los oligonucleótidos posibles.
La selección abarca oligonucleótidos que pueden interferir de forma eficiente con una señal de inclusión de exón.
Sin pretender imponer ninguna teoría, se piensa que el solapamiento con una estructura abierta mejora la eficiencia de invasión del oligonucleótido y evita la unión de factores de empalme (es decir, aumenta la eficiencia con la cual el oligonucleótido puede introducirse en la estructura), mientras que el solapamiento con la estructura cerrada aumenta 55 posteriormente la eficiencia de la interferencia de con la estructura secundaria del ARN del exón, y así interfieren con la señal de inclusión de exón.
Se ha descubierto que la longitud de la complementariedad parcial para la estructura cerrada y abierta no está extremadamente restringida.
Hemos observado altas eficiencias con oligonucleótidos con longitudes variables de complementariedad en ambas 60 estructuras.
El término complementariedad se utiliza en este caso para referirse a una extensión de ácidos nucleicos que se pueden hibridar a otra extensión de ácidos nucleicos bajo condiciones fisiológicas.
Por lo tanto, no es absolutamente requerido que todas las bases en la región de complementariedad sean capaces de aparearse con bases de la cadena opuesta. 65
Por ejemplo, al diseñar el oligonucleótido, se puede querer incorporar, por ejemplo, un residuo que no forma un par
de bases con la base de la cadena complementaria.
Los desapareamientos, hasta cierto punto, se pueden permitir, si dadas las circunstancias en la célula, la extensión de nucleótidos es suficientemente capaz de hibridarse a la parte complementaria.
En este contexto, "suficientemente" preferiblemente significa que, utilizando un ensayo de cambio de movilidad en gel como se describe en el ejemplo 1 de la EP 1619 249, una unión de un oligonucleótido es detectable. 5
Opcionalmente, dicho oligonucleótido puede ser además evaluado por transfección en células musculares de pacientes.
El salto del exón objetivo se puede evaluar mediante RT-PCR (como se describe en EP 1 619 249).
Las regiones complementarias están preferiblemente diseñadas de manera que, cuando se combinan, son específicas para el exón en el pre-ARNm. 10
Tal especificidad se puede crear con varias longitudes de regiones complementarias, ya que depende de las secuencias reales en otro (pre-)mRNA dl sistema.
El riesgo de que también uno o varios de otro pre-ARNm sea(n) capaz/capaces de hibridar al oligonucleótido se reduce con el aumento de tamaño del oligonucleótido.
Está claro que los oligonucleótidos que comprenden desapareamientos en la región de complementariedad pero que 15 retienen la capacidad para hibridarse a la(s) región(es) prevista(s) en el pre-ARNm se pueden usar en la presente invención.
Sin embargo, preferiblemente al menos las partes complementarias no comprenden tales desapareamientos, ya que típicamente tienen una eficiencia más alta y una especificidad más alta que los oligonucleótidos que tienen tales desapareamientos en una o más regiones complementarias. 20
Se piensa que las fuerzas de hibridación más altas (es decir, un número en aumento de interacciones con la cadena opuesta) son favorables para aumentar la eficiencia del proceso de la interferencia con la maquinaria de empalme del sistema.
Preferiblemente, la complementariedad es de entre 90 y 100%.
En general, esto permite aproximadamente 1 o 2 desapareamiento(s) en un oligonucleótido de alrededor de 20 25 nucleótidos
[0035] La estructura secundaria se analiza mejor en el contexto del pre-ARNm en el que el exón reside.
Tal estructura se puede analizar en el ARN real.
Sin embargo, actualmente es posible predecir la estructura secundaria de una molécula de ARN (con costes de 30 energía mínimos) bastante bien usando programas de modelado de estructura.
Un ejemplo no limitativo de un programa adecuado es ARN mfold versión 3.1 server 41.
Un experto en la técnica será capaz de predecir, con reproducibilidad adecuada, una estructura posible del exón, dada la secuencia de nucleótidos.
Las mejores predicciones se obtienen cuando se proporciona a dichos programas de modelación tanto el exón como 35 las secuencias de intrones flanqueantes.
Típicamente no es necesario modelar la estructura de todo el pre-ARNm.
[0036] La estructura abierta y cerrada a la que el oligonucleótido es dirigido son preferiblemente adyacentes la una a la otra. 40
Se piensa que, de esta manera, la hibridación del oligonucleótido a la estructura abierta induce la apertura de la estructura cerrada a partir de lo cual la hibrizaciónal interior de esta estructura cerrada.
A través de esta acción, la estructura previamente cerrada asume una conformación diferente.
La conformación diferente produce la interrupción de la señal de inclusión de exón.
Sin embargo, cuando hay secuencias aceptoras y/o donadoras potenciales de empalme (crípticas) presentes en el 45 exón objetivo, ocasionalmente se genera una nueva señal de inclusión de exón que define un (neo) exón diferente, es decir, con un extremo 5' diferente, un extremo 3'diferente, o ambos.
Este tipo de actividad está dentro del alcance de la presente invención, ya que el exón objetivo es excluido del ARNm.
La presencia de un exón nuevo, que contiene parte del exón objetivo, en el ARNm no altera el hecho de que el exón 50 objetivo, como tal, es excluido.
La inclusión de un neoexón puede verse como un efecto secundario, que ocurre sólo ocasionalmente.
Hay dos posibilidades cuando el salto de exón se utiliza para restaurar (parte de) un marco de lectura abierto de distrofina que es interrumpido como resultado de una mutación.
Una es que el neoexón sea funcional en la restauración del marco de lectura, mientras que en el otro caso el marco 55 de lectura no se restaura.
Cuando se seleccionan oligonucleótidos para restaurar los marcos de lectura de la distrofina mediante salto de exón, por supuesto está claro que bajo estas condiciones sólo se seleccionan aquellos oligonucleótidos que de hecho suponen salto de exón que restaura el marco de lectura abierto de distrofina, con o sin un neoexón.
60
[0037] También se proporciona un oligonucleótido, o un equivalente funcional del mismo, que comprende una secuencia que es complementaria a un sitio de unión para una proteína arginina-serina (SR) en el ARN de un exón de un pre-ARNm de distrofina.
En WO 2006/112705 hemos descrito la presencia de una correlación entre la efectividad de un (AON) de oligonucleótido antisentido interno del exón para la inducción del salto de exón y la presencia de un sitio de unión de 65 SR predicho (por ejemplo mediante ESE finder) en el sitio de pre-ARNm objetivo de dicho AON.
Por lo tanto, en una forma de realización, se genera un oligonucleótido que comprende la determinación de un sitio de unión (putativo) para una proteína SR (Ser-Arg) en el ARN de un exón de distrofina y la producción de un oligonucleótido que es complementario a dicho ARN y que se solapa al menos parcialmente a dicho sitio de unión (putativo).
El término "se solapa al menos parcialmente" se define en este caso para comprender un solapamiento de un único 5 nucleótido de un sitio de unión de SR, así como múltiples nucleótidos de dicho sitio de unión, así como un solapamiento completo de dicho sitio de unión.
Esta forma de realización preferiblemente comprende además la determinación, a partir de una estructura secundaria de dicho ARN, de una región que está hibridada a otra parte de dicho ARN (estructura cerrada) y una región que no está hibridada en dicha estructura (estructura abierta), y posteriormente la generación de un 10 oligonucleótido que se solapa al menos parcialmente a dicho sitio de unión (putativo) y que se solapa al menos a parte de dicha estructura cerrada y se solapa al menos a parte de dicha estructura abierta.
De esta manera, aumentamos la oportunidad de obtener un oligonucleótido que es capaz de interferir con la inclusión de exón del pre-ARNm en el ARNm.
Es posible que una primera región de unión de SR seleccionada no tenga la estructura abierta-cerrada requerida, 15 en cuyo caso se selecciona otro (segundo) sitio de unión de proteínas SR que es luego posteriormente evaluado para detectar la presencia de una estructura abierta-cerrada.
Este proceso es continuado hasta que se identifica una secuencia que contiene un sitio de unión de proteínas SR así como una estructura abierta-cerrada (parcialmente solapada).
Esta secuencia es luego usada para diseñar un oligonucleótido que es complementario a dicha secuencia. 20
[0038] Tal método para generar un oligonucleótido, es también realizado por inversión del orden descrito, es decir, primero la generación de un oligonucleótido que comprende la determinación, a partir de una estructura secundaria de ARN de un exón de distrofina, de una región que asume una estructura que está hibridada a otra parte de dicho ARN (estructura cerrada) y una región que no está hibridado en dicha estructura (estructura abierta), y 25 posteriormente la generación de un oligonucleótido, del cual al menos una parte de dicho oligonucleótido es complementaria a dicha estructura cerrada y del cual al menos otra parte de dicho oligonucleótido es complementaria a dicha estructura abierta.
Esto es luego seguido de la determinación de si un sitio de unión de proteínas SR al menos se solapa con dicha estructura abierta/cerrada. 30
De esta manera, el método de WO 2004/083432 es mejorado.
En otra forma de realización, las selecciones se realizan simultáneamente.
[0039] Sin desear quedar limitado por ninguna teoría, actualmente se piensa que el uso de un oligonucleótido dirigido a un sitio de unión de proteínas SR perjudica (al menos parcialmente) la unión de una proteína SR al sitio 35 de unión de una proteína SR, que resulta en un empalme interrumpido o perjudicado.
[0040] Preferiblemente, una estructura abierta/cerrada y un sitio de unión de proteínas SR se solapan parcialmente, e incluso más preferiblemente una estructura abierta/cerrada se solapa completamente a un sitio de unión de proteínas SR o un sitio de unión a proteínas SR se solapa completamente a una estructura abierta/cerrada. 40
Esto permite una interrupción mejorada de la inclusión del exón.
[0041] Además de las secuencias de sitios de empalme de consenso, muchos (si no todos) exones contienen secuencias reguladoras del empalme tales como secuencias intensificadoras del empalme exónico (ESE) para facilitar el reconocimiento de sitios de empalme genuinos por el espliceosoma 42, 43. 45
Un subgrupo de factores de empalme, llamados proteínas SR, puede unirse a estas ESE y reclutar otros factores de empalme, tales como U1 y U2AF para sitios de empalme(débilmente definidos).
Los sitios de unión de las cuatro proteínas SR más abundantes (SF2/ASF, SC35, SRp40 y SRp55) han sido analizados en detalle y estos resultados se implementan en ESE finder, una fuente en la web que predice sitios de unión potenciales para estas proteínas SR 42, 43. 50
Hay una correlación entre la eficacia de un AON y la presencia/ausencia de un sitio de unión SF2/ASF, SC35 y SRp40.
En una forma de realización preferida, la invención proporciona así una combinación como se ha descrito anteriormente, donde dicha proteína SR es SF2/ASF o SC35 o SRp40.
55
[0042] En una forma de realización, un oligonucleótido, o un equivalente funcional del mismo, es capaz de unir específicamente una secuencia de ARN regulador que se requiere para el empalme correcto de un exón de distrofina en una transcripción.
Diferentes secuencias de ARN que actúan en cis se requieren para el empalme correcto de exones en una transcripción. 60
En particular en la divulgación, se identifican elementos suplementarios tales como potenciadores de empalme intrónico o exónico (ISE y ESE) o silenciadores (ISS y ESE) para regular el empalme específico y eficaz de exones constitutivos y alternativos.
Al utilizar oligonucleótidos antisentido (AON) específicos de secuencia que se unen con los elementos, su función reguladora se perturba de modo que el exón es saltado, como se muestra para la DMD. 65
Por lo tanto, en una forma de realización preferida de la divulgación, se usa un equivalente oligonucleótido o
funcional de los mismos que es complementario a un potenciador de empalme intrónico (ISE), un potenciador de empalme exónico (ESE), un silenciador de empalme intrónico (ISS) y/o un silenciador de empalme exónico (ESS).
Como ya se ha descrito aquí antes, un exón de distrofina es, en una forma de realización preferida, saltado por un agente capaz de inhibir específicamente una señal de inclusión de exón de dicho exón, de modo que dicho exón no es reconocido por la maquinaria de empalme como una parte que tiene que ser incluida en el ARNm. 5
Como resultado, se forma un ARNm sin dicho exón.
[0043] Un AON usado en la divulgación es preferiblemente complementario a una parte consecutiva o una extensión contigua de entre 8 y 50 nucleótidos de ARN de exón de distrofina o de ARN de intrón de distrofina.
En una forma de realización, un AON usado aquí es complementario a una parte consecutiva o una extensión 10 contigua de entre 14 y 50 nucleótidos de un ARN de exón de distrofina o un ARN de intrón de distrofina.
Preferiblemente, dicho AON es complementario a una parte consecutiva o extensión contigua de entre 14 y 25 nucleótidos de dicho ARN de exón.
Más preferiblemente, se usa un AON que comprende una secuencia que es complementaria a una parte consecutiva o una extensión contigua de entre 20 y 25 nucleótidos de un ARN de exón de distrofina o de un ARN de 15 intrón de distrofina.
[0044] Se pueden utilizar diferentes tipos de ácido nucleico para generar un oligonucleótido según la invención.
Preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende ARN, ya que los híbridos ARN/ARN son muy estables.
Ya que uno de los objetivos de la técnica de salto de exón es dirigir el empalme en sujetos, se prefiere que el ARN 20 del oligonucleótido comprenda una modificación que proporcione al ARN una propiedad adicional, por ejemplo resistencia para endonucleasas, exonucleasas, y RNasa H, fuerza de hibridación adicional, estabilidad aumentada (por ejemplo en un fluido corporal), flexibilidad aumentada o reducida, toxicidad reducida, transporte intracelular aumentado, especificidad para tejido, etc. Preferiblemente, dicha modificación comprende una modificación de oligorribonucleótido en 2'-O-metil-fosforotioato. 25
Preferiblemente, dicha modificación comprende una modificación de oligorribonucleótido en 2'-O-metil-fosforotioato.
Una forma de realización proporciona así un oligonucleótido para usar que comprende ARN que contiene una modificación, preferiblemente una modificación de ribosa (ARN) o desoxirribosa (ADN) modificada en 2'-O-metilo.
[0045] En una forma de realización, la invención proporciona un oligonucleótido híbrido que comprende un 30 oligonucleótido que comprende una modificación de oligo(deoxi)ribonucleótido en 2'-O-metil-fosforotioato y ácido nucleico bloqueado.
Este oligonucleótido particular comprende una mejor especificidad de secuencia en comparación con un equivalente consistente en ácido nucleico bloqueado, y comprende una efectividad mejorada en comparación con un oligonucleótido consistente en modificación de oligo(deoxi)ribonucleótido en 2'-O-metil-fosforotioato. 35
[0046] Con el descubrimiento de la tecnología de imitación de ácidos nucleicos se ha hecho posible generar moléculas que tienen unas características de hibridación similares, preferiblemente las mismas, en cuanto al tipo, no necesariamente en cuanto a la cantidad, que el propio ácido nucleico.
Tales equivalentes funcionales, por supuesto, también son adecuados para usar en la invención. 40
Ejemplos preferidos de equivalentes funcionales de un oligonucleótido son el ácido peptidonucleico de péptido y/o el ácido nucleico bloqueado.
De la forma más preferible, se usa un morfolino fosforodiamidato.
Ejemplos adecuados pero no limitativos de equivalentes de oligonucleótidos de la invención se pueden encontrar en 44-50. 45
Los híbridos entre uno o varios de los equivalentes entre sí y/o junto con ácido nucleico también son adecuados, por supuesto.
En una forma de realización preferida, el ácido nucleico bloqueado se usa como un equivalente funcional de un oligonucleótido, ya que el ácido nucleico bloqueado muestra una afinidad de objetivo más alta y una toxicidad reducida y, por lo tanto, muestra una eficiencia más alta de salto de exón. 50
[0047] En una forma de realización, un oligonucleótido, o un equivalente funcional del mismo, que es capaz de inhibir la inclusión de un exón de distrofina en el ARNm de distrofina, se combina con al menos otro oligonucleótido, o equivalente funcional del mismo, que es capaz de inhibir la inclusión de otro exón de distrofina en el ARNm de distrofina. 55
De esta manera, se evita la inclusión de dos o más exones de un pre-ARNm de distrofina en el ARNm producido a partir de este pre-ARNm.
A esta forma de realización se hace referencia posteriormente como salto doble o multi-exón 2, 15.
En la mayoría de los casos, el salto de exón doble produce la exclusión de sólo los dos exones objetivo del pre-ARNm de distrofina. 60
Sin embargo, en otros casos se ha observado que los exones objetivo y la región entera entre dichos exones en dicho pre-ARNm no estaban presentes en el ARNm producidon incluso cuando otros exones (exones de intervención) estaban presentes en tal región.
Este salto multi-exón fue sobre todo así para la combinación de oligonucleótidos derivados del gen DMD, donde un oligonucleótido para el exón 45 y un oligonucleótido para el exón 51 se añadieron a una célula que transcribe el gen 65 DMD.
Tal configuración resultó en un ARNm producido que no contenía los exones 45 a 51.
Aparentemente, la estructura del pre-ARNm en presencia de los oligonucleótidos mencionados fue tal que la maquinaria de empalme fue estimulada para conectar los exones 44 y 52 entre sí.
Otros ejemplos preferidos de salto multi-exón son:
 el uso de un oligonucleótido dirigido al exón 17, y un segundo exón 48 que puede resultar en el salto de 5 dichos ambos exones o de la región entera entre el exón 17 y el exón 48.
 el uso de un oligonucleótido dirigido al exón 17, y un segundo exón 51 que puede resultar en el salto de dichos ambos exones o de la región entera entre el exón 17 y el exón 51.
 el uso de un oligonucleótido dirigido al exón 42, y un segundo exón 55 que puede resultar en el salto de dichos ambos exones o de la región entera entre el exón 42 y el exón 55. 10
 el uso de un oligonucleótido dirigido al exón 43, y un segundo exón 51 que puede resultar en el salto de dichos ambos exones o de la región entera entre el exón 43 y el exón 51.
 el uso de un oligonucleótido dirigido al exón 43, y un segundo exón 55 que puede resultar en el salto de dichos ambos exones o de la región entera entre el exón 43 y el exón 55.
 el uso de un oligonucleótido dirigido al exón 45, y un segundo exón 55 que puede resultar en el salto de 15 dicho ambos exones o de la región entera entre el exón 45 y el exón 55.
 el uso de un oligonucleótido dirigido al exón 45, y un segundo exón 59 que puede resultar en el salto de dichos ambos exones o de la región entera entre el exón 45 y el exón 59.
 el uso de un oligonucleótido dirigido al exón 48, y un segundo exón 59 que puede resultar en el salto de dichos ambos exones o de la región entera entre el exón 48 y el exón 59. 20
 el uso de un oligonucleótido dirigido al exón 50, y un segundo exón 51 que puede resultar en el salto de dichos ambos exones.
 el uso de un oligonucleótido dirigido al exón 51, y un segundo exón 52 que puede resultar en el salto de dichos ambos exones.
25
[0048] Por lo tanto, en la divulgación también se proporciona un oligonucleótido que comprende al menos 8, preferiblemente entre 16 a 80, nucleótidos consecutivos que son complementarios a un primer exón de un pre-ARNm de distrofina y donde se usa una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 8, preferiblemente entre 16 a 80, nucleótidos consecutivos que son complementarios a un segundo exón de dicho pre-ARNm de distrofina.
Dicho primer y dicho segundo exón pueden ser iguales. 30
[0049] En una forma de realización preferida, dicho primer y dicho segundo exón son separados en dicho pre-ARNm de distrofina por al menos un exón al que dicho oligonucleótido no es complementario.
Alternativamente, dicho primer y dicho segundo exón son adyacentes.
35
[0050] Es posible promover específicamente el salto de también los exones de intervención mediante una conexión entre los dos oligonucleótidos complementarios.
Por lo tanto, en una forma de realización, una extensión de nucleótidos complementaria a por lo menos dos exones de distrofina está separada por una fracción de conexión.
Al menos dos extensiones de nucleótidos son así enlazadas en esta forma de realización para formar una única 40 molécula.
Además, se proporciona, por lo tanto, un oligonucleótido, o un equivalente funcional del mismo, de la divulgación que es complementario por lo menos a dos exones en un pre-ARNm de distrofina, dicho equivalente oligonucleótido o funcional que comprende al menos dos partes, donde una primera parte comprende un oligonucleótido que tiene al menos 8, preferiblemente entre 16 a 80, nucleótidos consecutivos que son complementarios a un primero de dichos 45 al menos dos exones y donde una segunda parte comprende un oligonucleótido que tiene al menos 8, preferiblemente entre 16 a 80, nucleótidos consecutivos que son complementarios a un segundo exón en dicho pre-ARNm de distrofina.
La conexión puede ser a través de cualquier medio, pero es preferiblemente realizada a través de un enlace de nucleótidos. 50
En este último caso, el número de nucleótidos que no contienen un solapamiento entre uno u otro exón complementario pueden ser cero, pero es preferiblemente entre 4 a 40 nucleótidos.
La fracción de conexión puede ser cualquier tipo de fracción capaz de enlazar oligonucleótidos.
Preferiblemente, dicha fracción de conexión comprende al menos 4 nucleótidos de uracilo.
Actualmente, hay disponibles muchos compuestos diferentes que imitan las características de hibridación de los 55 oligonucleótidos.
Tal compuesto, llamado aquí un equivalente funcional de un oligonucleótido, es también adecuado para la presente invención si tal equivalente comprende características de hibridación similares en cuanto al tipo, no necesariamente en cuanto a la cantidad.
Los equivalentes funcionales adecuados son mencionados anteriormente en esta descripción. 60
Tal y como se menciona, los oligonucleótidos de la invención no tienen que consistir en solo oligonucleótidos que contribuyan a la hibridación del exón objetivo.
Puede haber material adicional y/o nucleótidos añadidos.
[0051] El gen DMD es un gen grande, con muchos exones diferentes. 65
Considerando que el gen está localizado en el cromosoma X, en su mayoría son los niños los que son afectados, aunque las niñas también pueden ser afectadas por la enfermedad, ya que pueden recibir una copia mala del gen de ambos padres, o sufren una inactivación particularmente desviada del alelo funcional debido a una inactivación particularmente desviada del cromosoma X en sus células musculares.
La proteína es codificada por una pluralidad de exones (79) en un rango de al menos 2,4 Mb. 5
Los defectos pueden ocurrir en cualquier parte del gen DMD.
El salto de un exón particular o exones particulares puede, muy a menudo, supone un ARNm reestructurado que codifica una proteína distrofina más corta de lo normal pero al menos parcialmente funcional.
Un problema práctico en el desarrollo de un medicamento basado en la tecnología del salto de exón es la pluralidad de mutaciones, que pueden suponer una deficiencia en la proteína distrofina funcional en la célula. 10
A pesar del hecho de que ya varias mutaciones se pueden corregir por el salto de un único exón, esta pluralidad de mutaciones requiere la generación de una serie de fármacos diferentes, ya que para diferentes mutaciones, diferentes exones necesitan ser saltados.
Una ventaja de un oligonucleótido o de una composición que comprende al menos dos oligonucleótidos diferentes, como se define más adelante en este documento, capaces de inducir el salto de dos o más exones, es que se puede 15 saltar más de un exón con un único fármaco.
Esta propiedad no es solo muy útil en la practica por el hecho de que sólo un número limitado de fármacos necesita ser generado para tratar muchas mutaciones de DMD diferentes o de BMD particulares y graves.
Otra opción ahora abierta al experto en la técnica es seleccionar proteínas de distrofina reestructuradas particularmente funcionales y producir compuestos capaces de generar estas proteínas de distrofina preferidas. 20
A tales resultados finales preferidos se hace referencia además como distrofinas de fenotipo moderado.
[0052] Los rangos de dosis de oligonucleótidos según la invención son preferiblemente diseñados basándose en estudios de aumento de dosis en ensayos clínicos (uso in vivo) para los que existen rigurosos requisitos de protocolo. 25
Una molécula o un oligonucleótido tal y como se define aquí se puede usar en una dosis que oscila entre 0,1 y 20 mg/kg, preferiblemente 0,5 y 10 mg/kg.
En una forma de realización preferida, se usa una concentración de un oligonucleótido tal y como se define aquí, que oscila entre 0,1 nM y 1 µM.
Preferiblemente, este rango es para el uso in vitro en un modelo celular tal como células musculares o tejido 30 muscular.
Más preferiblemente, la concentración usada oscila entre 0,3 a 400 nM, aún más preferiblemente entre 1 a 200 nM.
Si se usan varios oligonucleótidos, esta concentración o dosis puede referirse a la concentración total o dosis de oligonucleótidos o la concentración o dosis de cada oligonucleótido añadido.
35
[0053] Los rangos de concentración o dosis de oligonucleótido(s) como se dan arriba son concentraciones o dosis preferidas para usos in vitro o ex vivo.
La persona experta entenderá que dependiendo del/de los oligonucleótido(s) usado(s), la célula objetivo por ser tratada, el objetivo de gen y sus niveles de expresión, el usado medio y las condiciones de transfección e incubación, la concentración o dosis de oligonucleótido(s) usada pueden variar más y pueden necesitar ser más 40 optimizados.
[0054] Un oligonucleótido tal y como se define aquí para un uso según la invención puede ser adecuado para administrarlo una célula, tejido y/u órgano in vivo de individuos afectados por o con riesgo de desarrollar DMD o BMD, y se puede administrar in vivo, ex vivo o in vitro. 45
Dicho oligonucleótido puede ser administrado directa o indirectamente a una célula, tejido y/o un órgano in vivo de de un individuo afectado por o con riesgo de desarrollar DMD o BMD, y se puede administrar directa o indirectamente in vivo, ex vivo o in vitro.
Como la distrofia muscular de Duchenne y de Becker tienen un fenotipo pronunciado en las células musculares, se prefiere que dichas células sean células musculares, y además se prefiere que dicho tejido sea un tejido muscular 50 y/o además se prefiere que dicho órgano comprenda o consista en un tejido muscular.
Un órgano preferido es el corazón.
Preferiblemente, dichas células comprenden un gen que codifica una proteína distrofina mutante.
Preferiblemente, dichas células son las células de un individuo que padece DMD o BMD.
55
[0055] Un oligonucleótido de la invención puede ser administrado indirectamente usando medios adecuados conocidos en la técnica. Un oligonucleótido puede, por ejemplo, ser proporcionado para un individuo o una célula, tejido o órgano de dicho individuo en forma de un vector de expresión donde el vector de expresión codifica una transcripción que comprende dicho oligonucleótido.
El vector de expresión es preferiblemente introducido en una célula, tejido, órgano o individuo mediante un vehículo 60 de entrega de gen.
En una forma de realización preferida, se proporciona un vector de expresión de base viral que incluye un casete de expresión o un casete de transcripción que acciona la expresión o transcripción de una molécula como se identifica aquí.
Un vehículo de entrega preferido es un vector viral tal como un vector de virus adeno-asociado (AAV), o un vector 65 retroviral tal como un vector lentivirus 4, 51, 52 y similares.
Además, los plásmidos, cromosomas artificiales, plásmidos adecuados para la recombinación homóloga objetivo y la integración en el genoma humano de células pueden ser adecuadamente aplicados para la entrega de un oligonucleótido tal y como se define aquí.
Para la presente invención se prefieren los vectores en los que transcripción es iniciada a partir de promotores PolIII, y/o en los que las transcripciones están en las fusiones de forma con transcripciones U1 o U7, que producen buenos 5 resultados entregando transcripciones pequeñas.
Está dentro de la habilidad del técnico diseñar transcripciones adecuadas.
Las preferidas son transcripciones activasas por PolIII.
Preferiblemente, en forma de una transcripción de fusión con una transcripción Ulor U7 4, 51, 52.
Tales fusiones se pueden generar como se describe 53, 54. 10
El oligonucleótido se puede entregar tal y como es.
Sin embargo, el oligonucleótido también puede ser codificado por el vector viral.
Típicamente, este está en forma de una transcripción de ARN que comprende la secuencia del oligonucleótido en una parte de la transcripción.
15
[0056] Las mejoras en medios para suministrar a un individuo o a una célula, tejido, órgano de dicho individuo un oligonucleótido y/o un equivalente del mismo, son esperadas considerando el progreso que ya se ha conseguido hasta el momento.
Dichas mejoras futuras pueden, por supuesto, ser incorporadas para conseguir el efecto mencionado en la reestructuración de ARNm utilizando un método de la invención. 20
Un oligonucleótido y/o un equivalente del mismo se puede entregar tal cual a un individuo, una célula, tejido u órgano de dicho individuo.
Cuando se administra un oligonucleótido y/o un equivalente del mismo, se prefiere que un oligonucleótido y/o un equivalente del mismo esté disuelto en una solución que es compatible con el método de entrega.
Para la administración intravenosa, subcutánea, intramuscular, intratecal y/o intraventricular se prefiere que la 25 solución sea una solución fisiológica.
Particularmente en la invención se prefiere el uso de un excipiente que ayudará en la entrega de cada uno de los constituyentes tal y como se define aquí a una célula y/o al interior de una célula, preferiblemente una célula muscular.
Se pregieren los excipientes capaces de formar complejos, nanopartículas, micelas, vesículas y/o liposomas que 30 entregan cada constituyente tal y como se define aquí, complejos o retenidos en una vesícula o liposoma a través de una membrana celular.
Muchos de estos excipientes se conocen en la técnica. Los excipientes adecuados comprenden polietilenimina (PEI), o polímeros catiónicos similares, incluyendo polipropilenimina o copolímeros de polietilenimina (PECs y derivados, 35
anfifilos sintéticos (SAINT-18), lipofectinTM, DOTAP y/o proteinas cápsidas virales que son capaces de autoensamblarse en partículas que pueden entregar cada constituyente tal y como se define aquí a una célula, preferiblemente una célula muscular.
Se ha observado que tales excipientes entregan eficazmente un oligonucleótido, tales como ácidos nucleicos antisentido, a una amplia variedad de células cultivadas, incluyendo células musculares. 40
Su elevado potencial de transfección se combina con una toxicidad baja a moderada en cuanto a la supervivencia total de la célula.
La facilidad de modificación estructural puede utilizarse para permitir otras modificaciones y el análisis de sus otras (en vivo) características de transferencia de ácido nucleico y toxicidad.
45
[0057] La lipofectina representa un ejemplo de un agente de transfección liposomal.
Consiste en dos componentes lípidicos, un lípido catiónico cloruro de N-[1-(2,3 dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA) (comparar DOTAP, que es la sal de metilsulfato) y un lípido neutro de dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) . El componente neutro media la liberación intracelular.
Otro grupo de sistemas de entrega son las nanopartículas poliméricas. 50
[0058] Los policationes tales como dietilaminoetilaminoetilo (DEAE)-dextrano, que son bien conocidos como reactivos de transfección de ADN, se pueden combinar con butilcianoacrilato (PBCA) y hexilcianoacrilato (PHCA) para formular nanopartículas catiónicas que pueden entregar cada constituyente tal y como se define aquí, preferiblemente un oligonucleótido a través de membranas celulares al interior de células. 55
[0059] Además de estos materiales de nanopartículas comunes, la protamina de péptido catiónico ofrece un método alternativo para formular un oligonucleótido con coloides.
Este sistema de nanopartícula coloidal puede formar las llamadas partículas con base de protamina, que se pueden preparar mediante un proceso de autoensamblaje simple para empaquetar y mediar la liberación intracelular de un 60 oligonucleótido.
La persona experta puede seleccionar y adaptar cualquiera de los anteriores u otros excipientes alternativos disponibles comercialmente y sistemas de entrega para empaquetar y entregar un oligonucleótido para usar en la presente invención para entregarlo para el tratamiento de la distrofia muscular de Duchenne o de la distrofia muscular de Becker en seres humanos. 65
[0060] Además, un oligonucleótido podría estar enlazado de manera covalente o de manera no covalente a un ligando de objetivo específicamente diseñado para facilitar la absorción en la célula, citoplasma y/o su núcleo.
Tal ligando podría comprender (i) una célula de reconocimiento de compuestos (incluyendo pero no limitado a estructuras peptídicas), tejido o elementos específicos para el órgano que faciliten la absorción celular y/o (ii) un compuesto químico capaz de facilitar la absorción en células y/o la liberación intracelular de un oligonucleótido a 5 partir de vesículas, por ejemplo endosomas o lisosomas.
[0061] Por lo tanto, en una forma de realización preferida, un oligonucleótido se formula en una composición o un medicamento o una composición, que dispone de al menos un excipiente y/o un ligando de objetivo para la entrega y/o un dispositivo de entrega del mismo a una célula y/o que aumenta su entrega intracelular. 10
Por consiguiente, la invención también abarca una composición farmacéuticamente aceptable que incluye un oligonucleótido y que comprende además al menos un excipiente y/o un ligando de objetivo para la entrega y/o un dispositivo de entrega de dicho oligonucleótido a una célula y/o que aumenta su entrega intracelular.
Debe entenderse que si una composición comprende un constituyente adicional, tal como un compuesto complementario como se define aquí más adelante, cada constituyente de la composición puede no estar formulado 15 en una combinación o composición o preparación única.
Dependiendo de su identidad, la persona experta conocerá qué tipo de formulación es el más apropiado para cada constituyente tal y como se define aquí.
En una forma de realización preferida, la invención proporciona una composición o una preparación que está en la forma de un conjunto de partes que incluyen un oligonucleótido y otro compuesto complementario como se define 20 aquí más adelante.
[0062] Un oligonucleótido preferido es para evitar o tratar la distrofia muscular de Becker (BMD) o la distrofia muscular de Duchenne (DMD) en un individuo.
Un individuo, que puede ser tratado utilizando un oligonucleótido de la invención, puede haber sido diagnosticado ya 25 con DMD o BMD.
Alternativamente, un individuo que puede ser tratado utilizando un oligonucleótido de la invención puede no haber sido diagnosticado todavía con DMD o BMD, pero puede ser un individuo con un riesgo aumentado de desarrollar DMD o BMD en el futuro dado su contexto genético.
Un individuo preferido es un ser humano. 30
Composición
[0063] En otro aspecto, se proporciona una composición que incluye un oligonucleótido tal y como se define aquí.
Preferiblemente, dicha composición comprende al menos dos oligonucleótido diferentes tal y como se define aquí. 35
Más preferiblemente, estos dos oligonucleótidos diferentes están diseñados para saltar dos o más exones distintos como se ha definido anteriormente en el presente documento para el salto multi-exón.
[0064] En una forma de realización preferida, dicha composición es preferiblemente una composición farmacéutica, dicha composición farmacéutica que comprende un portador adyuvante, diluyente y/o excipiente farmacéuticamente 40 aceptables.
Tal composición farmacéutica puede comprender cualquier portador, carga, conservante, adyuvante, solubilizador, diluyente y/o excipiente farmacéuticamente aceptable que es también proporcionado.
Tal portador, carga, conservante, adyuvante, solubilizador, diluyente y/o excipiente farmacéuticamente aceptable puede por ejemplo encontrarse en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition. Baltimore, MD: 45 Lippincott Williams & Wilkins, 2000.
Cada característica de dicha composición ha sido definida anteriormente en este documento.
[0065] Si se usan diferentes oligonucleótidos, la concentración o la dosis ya definida aquí puede referirse a la concentración o dosis total de todos los oligonucleótidos usados o la concentración o dosis de cada oligonucleótido 50 usado o añadido.
Por lo tanto, en una forma de realización, se proporciona una composición donde cada cantidad o la cantidad total de oligonucleótido usado se dosifica en una cantidad que oscila entre 0,5 mg/kg y 10 mg/kg.
[0066] Una composición preferida comprende adicionalmente: 55
a) un compuesto complementario para reducir la inflamación, preferiblemente para reducir la inflamación del tejido muscular, y/o
b) un compuesto complementario para mejorar la función, integridad y/o supervivenciade la fibra muscular, y/o
c) un compuesto que muestra actividad de translectura. 60
[0067] Se ha descubierto sorprendentemente que la frecuencia de salto de un exón de distrofina de un pre-ARNm que comprende dicho exón, cuando se usa un oligonucleótido dirigido acia el exón o a uno o ambos sitios de empalme de dicho exón, es mejorada si las células que expresan dicho pre-ARNm también están provistas de un compuesto complementario para reducir la inflamación, preferiblemente para la reducción de la inflamación del tejido 65 muscular, y/o un compuesto complementario para mejorar la función, integridad y/o supervivencia de la fibra
muscular.
La frecuencia de salto mejorada también aumenta el nivel de proteína distrofina funcional producida en una célula muscular de un individuo con DMD o BMD.
[0068] Según la presente divulgación, incluso cuando una deficiencia de proteína distrofina ha sido restaurada en un 5 paciente de DMD mediante la administración de un oligonucleótido de la invención, la presencia de inflamación de tejido y células musculares dañadas todavía sigue contribuyendo a los síntomas de la DMD.
Por lo tanto, aunque la causa de la DMD - es decir una proteína distrofina disfuncional - se mitiga, el tratamiento de la DMD se mejora aún más mediante el uso adicional de un tratamiento complementario según la presente divulgación. 10
Además, la presente divulgación proporciona el conocimiento de que una reducción de la inflamación no supone una reducción significativa de la absorción de AON por las células musculares.
Esto es sorprendente porque, en general, la inflamación mejora el tráfico de las células, la sangre y otros compuestos.
Como resultado, la absorción/entrega de AON también se ve mejorada durante inflamación. 15
Por lo tanto, antes de la presente divulgación, se preveía que un tratamiento complementario que contrarrestara la inflamación implicaría el riesgo de influir negativamente en el tratamiento con AON.
Esto, sin embargo, parece no ser el caso.
[0069] Un compuesto complementario para reducir la inflamación comprende cualquier tratamiento que sea capaz 20 de reducir inflamación al menos en parte, preferiblemente inflamación provocada por células musculares dañadas.
Dicho compuesto complementario es más preferiblemente capaz de reducir la inflamación de tejido muscular.
La inflamación es preferiblemente evaluada mediante la detección de un aumento en el número de las células inmunitarias infiltrantes tales como neutrófilos y/o mastocitos y/o células dendríticas y/o linfocitos en el tejido muscular que se sospecha que es distrófico. 25
Esta evaluación es preferiblemente realizada en secciones transversales de una biopsia 57 de tejido muscular que se sospecha que es distrófico después de haber teñido específicamente células inmunitarias según se han identificado anteriormente.
La cuantificación se realiza preferiblemente bajo microscopio.
La reducción de la inflamación es, por lo tanto, preferiblemente evaluada mediante la detección de una reducción en 30 el número de células inmunitarias en una sección transversal de tejido muscular que se sospechada que es distrófico.
La detección de una reducción preferiblemente significa que el número de al menos un tipo de células inmunitarias según se identifican arriba ha disminuido en al menos 1%, 2%, 3%, 5%, 7%, 10%, 12%, 15%, 17%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más en comparación con el número de una célula inmunológica correspondiente en un 35 mismo individuo antes del tratamiento.
De la forma más preferible, no se detectan ningunas células inmunitarias infiltrantes en secciones transversales de dicha biopsia.
[0070] Un compuesto complementario de la divulgación para mejorar la función, la integridad y/o la supervivencia de 40 la fibra muscular comprende cualquier tratamiento que sea capaz de, hasta cierto punto, aumentar la función, la integridad y/o la supervivencia de la fibra muscular en comparación con otro situación similar en la que dicho compuesto complementario no está presente.
La mejora de la función, la integridad y/o la supervivencia de la fibra muscular se puede evaluar utilizando al menos una de las siguientes pruebas: una reducción detectable de la creatina-cinasa en sangre, una reducción detectable 45 de la necrosis de las fibras musculares en una sección transversal de biopsia de un músculo que se sospecha que es distrófico, y/o un aumento detectable de la homogeneidad del diámetro de las fibras musculares en una sección transversal de biopsia de un músculo que se sospecha que es distrófico.
Cada una de estas pruebas es conocida por la persona experta.
50
[0071] La creatina-cinasa se puede detectar en sangre como se describe en 57.
Una reducción detectable en la creatina-cinasa puede significar una reducción del 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más en comparación con la concentración de creatina-cinasa en un mismo individuo antes del tratamiento.
55
[0072] Una reducción detectable de la necrosis de las fibras musculares es preferiblemente evaluada en una biopsia muscular, más preferiblemente como se describe en 57 usando secciones transversales de biopsia.
Una reducción detectable de la necrosis puede ser una reducción del 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más del área en la que la necrosis ha sido identificada utilizando secciones transversales de biopsia.
La reducción se mide por comparación a la necrosis evaluada en un mismo individuo antes del tratamiento. 60
[0073] Un aumento detectable de la homogeneidad del diámetro de una fibra muscular es preferiblemente evaluado en una sección transversal de biopsia muscular, más preferiblemente como se describe en 57.
[0074] En una forma de realización de la divulgación, se usa un compuesto complementario para aumentar la 65 renovación de las células musculares dañadas.
Un compuesto complementario para aumentar la renovación de células musculares dañadas comprende cualquier tratamiento que sea capaz al menos de inducir y/o aumentar la renovación de células musculares dañadas.
Las células musculares dañadas son células musculares que tienen una funcionalidad significativamente menos medible clínicamente que una célula muscular sana e intacta.
En ausencia de distrofina, la tensión mecánica lleva a roturas del sarcolema, lo que causa un flujo descontrolado de 5 calcio en el interior de la fibra muscular, lo que activa así las proteasas activadas por calcio y la necrosis de las fibras, dando como resultado células musculares dañadas.
El aumento de la renovación de células musculares dañadas significa que las células musculares dañadas se descomponen y se eliminan más rápidamente en comparación con una situación en la que la renovación de células musculares dañadas no es aumentada. 10
La renovación de células musculares dañadas es preferiblemente evaluada en una biopsia muscular, más preferiblemente como se describe en 57 utilizando una sección transversal de una biopsia.
Un aumento detectable de la producción puede ser un aumento del 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más del área en la que la renovación ha sido identificada utilizando una sección transversal de biopsia.
El aumento se mide por comparación a la renovación evaluada en un mismo individuo antes del tratamiento. 15
[0075] Sin desear limitarse a la teoría, se cree que el aumento de la renovación de células musculares es preferido porque reduce las respuestas inflamatorias.
[0076] Según la presente divulgación, una composición de la invención que comprende además un tratamiento 20 complementario para reducir la inflamación, preferiblemente para reducir la inflamación de tejido muscular de un individuo, es especialmente adecuada para usar como medicamento.
Tal composición es incluso más capaz de paliar uno o varios síntoma(s) de la distrofia muscular de Duchenne o de la distrofia muscular de Becker en comparación con una combinación que no no comprende dicho componente complementario. 25
Esta forma de realización también mejora la frecuencia del salto de un exón de distrofina de un pre-ARNm que comprende dicho exón, cuando se usa un oligonucleótido dirigido hacia el exón o hacia uno o ambos sitios de empalme de dicho exón.
La frecuencia del salto mejorada también aumenta el nivel de proteína distrofina funcional producido en una célula muscular de un individuo con DMD o BMD. 30
[0077] También se proporciona, por lo tanto, una composición que comprende además un compuesto complementario para reducir la inflamación, preferiblemente para reducir la inflamación de tejido muscular en dicho individuo, para usar como medicamento, preferiblemente para tratar, prevenir o contrarrestar la DMD.
En una forma de realización, dicha composición se usa para paliar uno o varios síntoma(s) de una forma grave de 35 BMD donde se forma una proteína distrofina muy corta o un ARNm o proteína distrofina alterado/a o truncado/a que no es lo suficientemente funcional.
[0078] El complemento compuesto preferido de la divulgación para reducir la inflamación incluye un esteroide, un inhibidor TNFα, una fuente de mIGF-1 y/o un antioxidante. 40
Sin embargo, cualquier otro compuesto capaz de reducir la inflamación tal y como se define aquí también está incluido en la presente divulgación.
Cada uno de estos compuestos se presenta ampliamente más adelante.
Cada uno de los compuestos ampliamente presentados se puede utilizar separadamente o en combinación entre sí y/o en combinación con uno o varios de los compuestos complementarios usados para mejorar la función, la 45 integridad y/o supervivencia de la fibra muscular.
[0079] Además, en la divulgación, una composición que incluye un tratamiento complementario para mejorar la función, la integridad y/o la supervivencia de la fibra muscular en un individuo es especialmente adecuada para usar como medicamento, preferiblemente para tratar o prevenir la DMD. 50
Tal composición es aún más capaz de paliar uno o varios síntoma(s) de distrofia muscular de Duchenne en comparación con una composición que no comprende dicho compuesto complementario.
[0080] Los compuestos complementarios preferidos para mejorar la función, la integridad y/o la supervivencia de la fibra muscular incluyen un inhibidor de canal iónico, un inhibidor de proteasa y un bloqueador de receptor tipo I de la 55 L-arginina y/o de la angiontensina II.
Sin embargo, cualquier otro compuesto capaz de mejorar la función, la integridad y/o la supervivencia de fibra muscular tal y como se define aquí también está incluido en la presente divulgación.
Cada uno de estos compuestos se presenta ampliamente más adelante.
Cada uno de los compuestos presentados ampliamente se puede utilizar separadamente o en combinación entre sí 60 y/o en combinación con uno o varios de los compuestos complementarios usados para reducir la inflamación.
[0081] En una forma de realización particularmente preferida de la divulgación, una composición comprende además un esteroide.
Tal composición produce un alivio significativo de los síntomas de la DMD. 65
Esta forma de realización también mejora la frecuencia del salto de un exón de distrofina de un pre-ARNm que
comprende dicho exón, cuando se usa un oligonucleótido dirigido hacia el exón o hacia uno o ambos sitios de empalme de dicho exón.
La frecuencia del salto mejorada también aumenta el nivel de proteína distrofina funcional producida en una célula muscular de un individuo com DMD o BMD.
5
[0082] En una forma de realización de la divulgación, dicha composición se usa para paliar uno o varios síntoma(s) de una forma grave de BMD en la que se forma una proteína distrofina muy corta que no es lo suficientemente funcional.
[0083] Un esteroide es un lípido terpenoide caracterizado por un esqueleto de carbono con cuatro anillos fusionados, 10 generalmente dispuesto en una forma 6-6-6-5.
Los esteroides varían por los grupos funcionales fijados a estos anillos y el estado de oxidación de los anillos.
Los esteroides incluyen hormonas y fármacos, que se usan normalmente para aliviar la hinchazón y la inflamación, como por ejemplo la prednisona, la dexametasona y la vitamina D.
15
[0084] Según la presente divulgación, los efectos adicionales del tratamiento complementario con esteroides para pacientes de DMD incluyen la reducción de la inflamación del tejido, la supresión de células citotóxicas y una homeostasis del calcio mejorada.
La mayoría de los resultados positivos se obtienen en niños más jóvenes.
Preferiblemente, el esteroide es un corticoesteroide, más preferiblemente, un glucocorticoesteroide. 20
Preferiblemente, los esteroides de prednisona tales como la prednisona, la prednisolona o el deflazacort se usan en una combinación según la invención 21.
Los rangos de dosis de un esteroide o de un glucocorticoesteroide para usarse en las aplicaciones terapéuticas como se describe en este documento se diseñan basándose en estudios de aumento de dosis en ensayos clínicos para que los que existen requisitos de protocolo rigurosos. 25
Las dosis usuales son de 0,5 - 1,0 mg/kg/día, preferiblemente de 0,75 mg/kg/día para la prednisona y la prednisolona, y de 0,4 - 1,4 mg/kg/día, preferiblemente de 0,9 mg/kg/día para el deflazacort.
[0085] En una forma de realización de la divulgación, un esteroide se administra a dicho individuo antes de la administración de una composición como se ha definido anteriormente en el presente documento. 30
En esta forma de realización, se prefiere que dicho esteroide se administre al menos un día, más preferiblemente al menos una semana, más preferiblemente al menos dos semanas, más preferiblemente al menos tres semanas antes de la administración de dicha composición.
[0086] En otra forma de realización preferida de la divulgación, una combinación comprende además un inhibidor del 35 factor de necrosis tumoral alfa (TNFα).
El factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) es una citocina proinflamatoria que estimula la respuesta inflamatoria.
El bloqueo farmacológico de la actividad del TNFα con el anticuerpo de neutralización infliximab (Remicade) es de gran eficacia clínica para la reducción de los síntomas de las enfermedades inflamatorias.
En ratones mdx, tanto el infliximab como el etanercept retrasan y reducen la necrosis del músculo distrófico 24, 25, con 40 beneficios fisiológicos adicionales en la fuerza muscular, la función de los canales de cloruro y los niveles reducidos de la creatina-cinasa demostrados en ratones mdx adultos ejercitados tratados de manera crónica 26.
Tales fármacos antiinflamatorios altamente específicos diseñados para usar en otras condiciones clínicas son alternativas atractivas al uso de esteroides para la DMD.
En una forma de realización, el uso de un inhibidor del TNFα se limita a periodos de crecimiento muscular intensivo 45 en niños cuando el daño muscular y el deterioro son especialmente pronunciados.
[0087] También se proporciona una composición que comprende además un inhibidor del TNFα para usar como medicamento.
En una forma de realización, dicha composición se usa para paliar uno o varios síntoma(s) de una forma grave de 50 BMD en la que se forma una proteína distrofina muy corta que no es lo suficientemente funcional.
Un inhibidor del TNFα preferido es una proteína de fusión dimérica que consiste en el dominio extracelular de unión al ligando del receptor p75 humano del TNFα enlazado a la porción Fc del IgG1 humano.
Un inhibidor del TNFαmás preferido es el ethanercept (Amgen, America)26.
Las dosis habitual de ethanercept es aproximadamente de 0,2 mg/kg, preferiblemente aproximadamente 0,5 mg/kg 55 dos veces a la semana.
La administración es preferiblemente subcutánea.
[0088] En otra forma de realización preferida de la divulgación, una composición de la invención comprende además una fuente de mIGF-1. 60
Tal y como se define aquí, una fuente de IGF-1 preferiblemente abarca el propio mIGF-1, un compuesto capaz de mejorar la expresión y/o la actividad del mIGF-1.
Mejorar en este caso es sinónimo de aumentar.
La expresión de mIGF-1 es sinónima de cantidad de mIGF-1. El mIGF-1 favorece la regeneración de los músculos a través del aumento de la actividad de las células satélite, y la reduce inflamación y la fibrosis 27. 65
La lesión local del músculo resulta en una expresión de mIGF-1 aumentada.
En ratones transgénicos con genes bIGF-1 extra, se observaron hipertrofia muscular y fibras musculares agrandadas 27.
De forma similar, los ratones mdx transgénicos muestran una degeneración de la fibra muscular 28.
La regulación del gen mIGF-1 y/o la administración de cantidades extra de proteína mIGF-1 o un equivalente funcional de la misma (especialmente la isoforma Ea de mIGF-1 [como se describe en 27, isoforma 4 de IGF-1 5 homólogo humano: SEC ID n.º: 577]) promueve así el efecto de otros tratamientos para DMD, preferiblemente genéticos, incluyendo el salto de exón inducido antisentido.
Los niveles de mIGF-1 adicionales en los ratones transgénicos anteriormente mencionados no inducen problemas cardíacos ni favorecen el cáncer, y no tienen efectos secundarios patológicos.
Como se ha mencionado antes, la cantidad de mIGF-1 es por ejemplo aumentada mediante la mejora de la 10 expresión del gen mIGF-1 y/o mediante la administración de proteína mIGF-1 y/o un equivalente funcional de la misma (especialmente la isoforma Ea de mIGF-1[como se describe en 27, isoforma 4 de IGF-1 homólogo humano: SEC ID n.º: 577]).
También se proporciona una composición de la invención que preferiblemente también comprende mIGF-1, un compuesto capaz de aumentar la expresión de mIGF-1 y/o la actividad de un mIGF-1, para usar como medicamento 15
Dicho medicamento es preferiblemente para el alivio de uno o varios síntoma(s) de DMD.
En una forma de realización, tal composición se usa para paliar uno o varios síntoma(s) de una forma grave de BMD en la que se forma una proteína distrofina muy corta que no es lo suficientemente funcional.
[0089] En el contexto de la divulgación, una cantidad o actividad aumentada de mIGF-1 se puede alcanzar mediante 20 el aumento del nivel de expresión génica de un gen IGF-1, mediante el aumento de la cantidad de una proteína IGF-1 correspondiente y/o mediante el aumento de una actividad de una IGF1 proteína.
Una mIGF-1 proteína preferida ha sido definida anteriormente en este documento.
Se entiende que un aumento de una actividad de dicha proteína significa cualquier cambio detectable en una actividad biológica ejercida por dicha proteína o en el nivel estable de dicha proteína en comparación con dicha 25 actividad o estado estable en un individuo que no ha sido tratado.
Cantidad o actividad de mIGF-1 aumentada es preferiblemente evaluada mediante la detección de una expresión aumentada del biomarcador de hipertrofia muscular GATA-2 (como se describe en 27).
[0090] El nivel de expresión génica preferiblemente es evaluado usando técnicas de biología molecular tradicionales 30 tal como la PCR (tiempo real), matrices o análisis Northern.
Un nivel estable de una proteína se determina directamente por la cuantificación de la cantidad de una proteína.
La cuantificación de una cantidad de proteína se puede realizar mediante cualquier técnica conocida tal como la inmunoelectotransferencia o el inmunoensayo utilizando un anticuerpo dirigido contra una proteína.
La persona experta entenderá que, alternativamente o en combinación con la cuantificación de un nivel de expresión 35 génica y/o una proteína correspondiente, la cuantificación de un sustrato de una proteína correspondiente o de cualquier compuesto que se sabe que está asociado a una función o actividad de una proteína correspondiente o la cuantificación de dicha función o actividad de una proteína correspondiente utilizando una prueba específica se puede utilizar para valorar la alteración de un nivel de actividad o estado estable de una proteína.
40
[0091] En la invención, una actividad o nivel de estado estable de una dicha proteína se puede alterar en el nivel de la propia proteína, por ejemplo proporcionando una proteína a una célula de una fuente exógena.
[0092] Preferiblemente, un aumento o una sobrerregulación del nivel de expresión de dicho gen significa un aumento de al menos 5% del nivel de expresión de dicho gen utilizando matrices. 45
Más preferiblemente, un aumento del nivel de expresión de dicho gen significa un aumento de al menos 10%, aún más preferiblemente al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 70%, al menos 90%, al menos 150% o más.
En otra forma de realización preferida, un aumento del nivel de expresión de dicha proteína significa un aumento de al menos 5% del nivel de expresión de dicha proteína usando inmunoelectrotransferencia y/o usando ELISA o un 50 ensayo adecuado.
Más preferiblemente, un aumento del nivel de expresión de una proteína significa un aumento de al menos 10%, aún más preferiblemente al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 70%, al menos 90%, al menos 150% o más.
55
[0093] En otra forma de realización preferida, un aumento de una actividad de polipéptido significa un aumento de al menos el 5% de una actividad de polipéptido utilizando un ensayo adecuado.
Más preferiblemente, un aumento de una actividad de polipéptido significa un aumento de al menos 10%, aún más preferiblemente al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 70%, al menos 90%, al menos 150% o más. 60
El aumento es preferiblemente evaluado mediante comparación con la actividad correspondiente en el individuo antes del tratamiento.
[0094] Una forma preferida de proporcionar una fuente de mIGF1 es introducir un transgen que codifica mIGF1, preferiblemente una isoforma Ea de mIGF-1 (como se describe en 27, isoforma 4 de IGF-1 homólogo humano: SEC 65 ID n.º: 577), más preferiblemente en un vector AAV como se define más adelante en este documento.
Tal fuente de mIGF1 es expresada específicamente en el tejido muscular como se describe en ratones en 27.
[0095] En otra forma de realización preferida de la divulgación, una composición comprende además un antioxidante.
El estrés oxidativo es un factor importante en la progresión de la DMD y favorece la inflamación y la fibrosis crónica 5 29.
Los productos más predominantes del estrés oxidativo, los lípidos peroxidados, aumentan una media de 35% en niños pacientes de Duchenne.
Los niveles aumentados de las enzimas superóxido dismutasa y catalasa reducen la cantidad excesiva de radicales libres que causan estos efectos. 10
De hecho, un suplemento dietético Protandim® (LifeVantage) fue clínicamente evaluado y se descubrió que aumenta los niveles de superóxido-dismutasa (hasta 30%) y catalasa (hasta 54%), lo que, de hecho, inhibió significativamente la peroxidación de lípidos en 29 personas sanas 30.
Tal gestión eficaz del estrés oxidativo, por lo tanto, preserva la calidad muscular y promueve así el efecto positivo del tratamiento de la DMD. 15
La idebenona es otro antioxidante potente con una estructura química derivada de la coenzima natural Q10.
Protege las mitocondrias donde se genera el trifosfato de adenosina, ATP, por fosforilación oxidante.
La ausencia de distrofina en la DMD afecta negativamente a este proceso en el corazón, y probablemente también en el músculo esquelético.
La idebenona fue aplicada recientemente en ensayos clínicos en EEUU y Europa que demuestran la eficacia en 20 aspectos neurológicos de la ataxia de Friedreich 31.
Un ensayo clínico aleatorizado doble ciego controlado por placebo en fase IIa con Idebenona ha comenzado recientemente en Bélgica, incluyendo 21 niños pacientes de Duchenne de 8 a 16 años de edad.
El objetivo primario de este estudio es decidir el efecto de la Idebenona en la función del músculo cardiaco.
Además, diferentes pruebas será realizadas para detectar el beneficio funcional posible en la fuerza muscular de los 25 pacientes.
Cuando es eficaz, la Idebenona es un compuesto ccomplementario preferido para usar en una combinación según la presente divulgación para mejorar el efecto terapéutico del tratamiento de la DMD, especialmente en el corazón.
También se proporciona una composición que comprende además un antioxidante para usar como medicamento.
Dicho medicamento es preferiblemente para el alivio de uno o varios síntoma(s) de DMD. 30
En una forma de realización, dicha composición se usa para paliar uno o varios síntoma(s) de una forma grave de BMD en la que se forma una proteína distrofina muy corta que no es lo suficientemente funcional.
Dependiendo de la identidad del antioxidante, la persona experta sabrá qué cantidades son usadas preferiblemente.
Un antioxidante puede incluir bacósido, silimarina, curcumina y/o un polifenol.
Preferiblemente, un polifenol es o comprende 3-galato de epigalocatequina (EGCG). 35
Preferiblemente, un antioxidante es una mezcla de antioxidantes como el suplemento dietético Protandim® (LifeVantage).
Una cápsula diaria de 675mg de Protandim® comprende 150 mg de B. monniera (45% de bacósidos), 225mg de S. marianum (70-80% de silimarina), 150 mg de polvo de W. somnífera, 75mg de té verde (98% de polifenoles, donde 45% son de EGCG) y 75mg de cúrcuma (95% de curcumina). 40
[0096] En otra forma de realización preferida de la divulgación, una composición comprende además un inhibidor de canal iónico.
La presencia de membranas musculares dañadas en la DMD altera el paso de iones de calcio al interior de las miofibras, y la homeostasis del calcio consecuentemente interrumpida activa muchas enzimas, por ejemplo 45 proteasas, que causan daño adicional y necrosis muscular.
Los canales iónicos que contribuyen directamente a la acumulación patológica de calcio en el músculo distrófico son objetivos potenciales para los compuestos complementarios para tratar la DMD.
Existen pruebas de que algunos fármacos, tales como la pentoxifilina, bloquean los canales sensibles al ejercicio 32 y de que los antibióticos que bloquean canales activados por extensión reducen la necrosis de la miofibra en ratones 50 mdx y los niveles de creatina-cinasa en niños con DMD 33.
También se proporciona una composición que comprende además un inhibidor de canal iónico para usar como medicamento.
Dicho medicamento es preferiblemente para el alivio de uno o varios síntoma(s) de DMD.
En una forma de realización, dicha composición se usa para paliar uno o varios síntoma(s) de una forma grave de 55 BMD en la que se forma una proteína distrofina muy corta que no es lo suficientemente funcional.
[0097] Preferiblemente se usa un inhibidor de canal iónico de la clase de las xantinas.
Más preferiblemente, dichas xantinas son derivados de metilxantinas, y de la forma más preferible, dichos derivados de metilxantina son elegidos del grupo consistente en pentoxifilina, furafilina, isofilina, propentofilina, pentifilina, 60 teofilina, torbafilina, albifilina, enprofilina y derivados de las mismas.
Lo más preferido es el uso de pentoxifilina.
Los inhibidores de canal iónico de la clase de las xantinas mejoran la frecuencia del salto de un exón de distrofina de un pre-ARNm que comprende dicho exón, cuando se usa un oligonucleótido dirigido hacia el exón o a uno o ambos sitios de empalme de dicho exón. 65
La frecuencia del salto mejorada también aumenta el nivel de proteína distrofina funcional producido en una célula
muscular de un individuo con DMD o BMD.
[0098] Dependiendo de la identidad del inhibidor de canal iónico, la persona experta sabrá qué cantidades son preferiblemente usadas.
Las dosis adecuadas de pentoxifilina están entre 1 mg/kg/día y 100 mg/kg/día, las dosis preferidas están entre 10 5 mg/kg/día y 50 mg/kg/día.
las dosis típicas usadas en seres humanos son de 20 mg/kg/día.
[0099] En una forma de realización de la divulgación, un inhibidor de canal iónico se administra a dicho individuo antes de la administración de una composición que incluye un oligonucleótido. 10
En esta forma de realización, se prefiere que dicho inhibidor de canal iónico se administre al menos un día, más preferiblemente al menos una semana, más preferiblemente al menos dos semanas, más preferiblemente al menos tres semanas antes de la administración de una composición que incluye un oligonucleótido.
[0100] En otra forma de realización preferida de la divulgación, una composición comprende además un inhibidor de 15 proteasa.
Las calpaínas son proteasas activadas por calcio que están aumentadas en el músculo distrófico y explican la degeneración de la miofibra.
Los inhibidores de calpaína, tales como la calpastatina, leupeptina 34, calpeptina, inhibidor de calpaina III, o PD150606 son, por lo tanto, aplicados para reducir el proceso de degeneración. 20
Un compuesto nuevo, BN 82270 (Ipsen) que posee una acción doble como inhibidor de calpaína y como antioxidante, aumentó la fuerza muscular, disminuyó la creatina-cinasa en suero y redujo la fibrosis reducida del diafragma del mdx, lo que indica un efecto terapéutico con este nuevo compuesto 35.
Otro compuesto de Leupeptina/Carnitina (Myodur) ha sido propuesto recientemente para ensayos clínicos en pacientes de DMD. 25
[0101] El MG132 es otro inhibidor proteasómico que se ha demostrado que reduce el daño de la membrana muscular y que mejora los signos histopatológicos de la distrofia muscular 36.
MG-132 (CBZ-leucil-leucil-leucinal) es un inhibidor proteasómico permeable a células (Ki=4nM), que inhibe la activación de NFkappaB al evitar la degradación de IkappaB (IC50 = 3 µM). 30
Además, es un aldehído péptido que inhibe la proteólisis mediada por ubiquitina al unirse e inactivar los proteasomas 20S y 26S.
Se ha observado que MG-132 inhibe la degradación proteasómica de proteínas asociadas a la distrofina en el modelo de ratón mdx distrófico 36.
Por lo tanto, este compuesto también es adecuado para usar como un compuesto farmacológico complementario 35 para la DMD.
También se proporciona una composición que comprende además un inhibidor de proteasa para usar como un medicamento.
Dicho medicamento es preferiblemente para el alivio de uno o varios síntoma(s) de DMD.
En una forma de realización, dicha combinación se usa para paliar uno o varios síntoma(s) de una forma grave de 40 BMD en la que se forma una proteína distrofina muy corta que no es lo suficientemente funcional.
Dependiendo de la identidad del inhibidor de proteasa, la persona experta sabrá qué cantidades son preferiblemente usadas.
[0102] En otra forma de realización preferida de la divulgación, una composición comprende además L-arginina. 45
La falta de distrofina está asociada con la pérdida del complejo DGC en las membranas de fibra, incluyendo la óxido nítrico sintasa neuronal (nNOS).
La expresión de un transgen nNOS en ratones mdx reducen en gran medida el daño de la membrana muscular.
De forma similar, la administración de L-arginina (el sustrato para la óxido nítrico sintasa) aumentó la producción de NO y sobrerreguló la expresión de utrofina en ratones mdx. 50
Seis semanas de tratamiento con L-arginina mejoraron la patología muscular y disminuyeron la creatina-cinasa en ratones mdx 37.
El uso de L-arginina como otro constituyente en una composición de la invención no ha sido descrito.
[0103] También se proporciona una composición que comprende L-arginina para usar como medicamento. 55
Dicho medicamento es preferiblemente para el alivio de uno o varios síntoma(s) de DMD.
En una forma de realización, dicha composición se usa para paliar uno o varios síntoma(s) de una forma grave de BMD en la que se forma una proteína distrofina muy corta que no es lo suficientemente funcional.
[0104] En otra forma de realización preferida de la divulgación, una composición comprende además losartán 60 bloqueante de los receptores de tipo 1 de la angiotensina II, que normaliza la arquitectura, la reparación y la función muscular, como se muestra en el modelo de ratón mdx deficiente en distrofina 23.
También se proporciona una composición que comprende además losartán bloqueante de los receptores de tipo 1 de la angiotensina II para usar como medicamento.
Dicho medicamento es preferiblemente para el alivio de uno o varios síntoma(s) de DMD. 65
En una forma de realización, dicha composición se usa para paliar uno o varios síntoma(s) de una forma grave de
BMD en la que se forma una proteína distrofina muy corta que no es lo suficientemente funcional.
Dependiendo de la identidad del bloqueante de los receptores de tipo 1 de la angiotensina II, la persona experta sabrá que cantidades son preferiblemente usadas.
[0105] En otra forma de realización preferida de la divulgación, una composición comprende además un inhibidor de 5 la enzima convertidora de angiotensina(ECA) , preferiblemente perindoprilo.
Los inhibidores de la ECA son capaces de reducir la presión sanguínea.
La iniciación temprana del tratamiento con perindoprilo se asocia a una mortalidad inferior en pacientes de DMD 22.
También se proporciona una composición que comprende además un inhibidor de la ECA, preferiblemente perindoprilo, para usar como medicamento. 10
Dicho medicamento es preferiblemente para el alivio de uno o varios síntoma(s) de DMD.
En una forma de realización, dicha composición se usa para paliar uno o varios síntoma(s) de una forma grave de BMD en la que se forma una proteína distrofina muy corta que no es lo suficientemente funcional.
Las dosis usuales de un inhibidor de la ECA, preferiblemente perindoprilo, son aproximadamente de 2 a 4 mg/día 22.
En una forma de realización más preferida de la divulgación, un inhibidor de la ECA se combina con al menos uno 15 de los compuestos complementarios previamente identificados.
[0106] En otra forma de realización preferida de la divulgación, una composición comprende además un compuesto que muestra una actividad de translectura.
Un compuesto que muestra una actividad de translectura puede ser cualquier compuesto que sea capaz de suprimir 20 un codón de terminación.
Para el 20% de pacientes de DMD, la mutación en el gen de distrofina comprende una mutación puntual, de la cual 13% es una mutación sin sentido.
Un compuesto que muestra una actividad de translectura o que es capaz de suprimir un codón de terminación es un compuesto que es capaz de proporcionar una cantidad aumentada de un ARNm o proteína distrofina funcional y/o 25 una cantidad disminuida de un ARNm o proteína distrofina aberrante o truncada.
Aumentado/a significa preferiblemente aumentado al menos un 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% o más.
Disminuido/a significa preferiblemente al menos un 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% o más. 30
Un aumento o una reducción de dicha proteína se evalúa preferiblemente en un tejido muscular o en una célula muscular de un individuo mediante comparación con la cantidad presente en dicho individuo antes del tratamiento con dicho compuesto que muestra una actividad de translectura.
Alternativamente, la comparación se puede hacer con un tejido o célula muscular de dicho individuo que no todavía no ha sido tratada con dicho compuesto en caso de que el tratamiento sea local. 35
La evaluación de una cantidad al nivel de las proteínas se realiza preferiblemente llevando a cabo el análisis de electrotransferencia.
[0107] Los compuestos preferidos que muestran una actividad de translectura comprenden o consisten en aminoglicósidos, incluyendo, pero no limitados a, geneticina (G418), paromomicina, gentamicina y/o ácido 3-(5-(2-40 fluorofenil)-1,2,4-oxadiazol-3-il)benzoico), y derivados de los mismos (referencias 64, 65).
[0108] Un compuesto más preferido que muestra una actividad de translectura comprende o consiste en PTC124™, y/o un equivalente funcional del mismo.
PTC124™ es una marca registrada registrada de PTC Therapeutics, Inc. 45
Sur Plainfield, Nueva Jersey. El ácido 3-(5-(2-fluorofenil)-1,2,4-oxadiazol-3-il)benzoico) también conocido como PTC124™ (referencias 16, 17) pertenece a una nueva clase de moléculas pequeñas que imita a concentraciones inferiores la actividad de translectura de la gentamicina (referencia 55).
Un equivalente funcional del ácido 3-(5-(2-fluorofenil)-1,2,4-oxadiazol-3-il)benzoico) o de la gentamicina es un compuesto que es capaz de mostrar una actividad de translectura como se ha definido antes en el presente 50 documento.
De la forma más preferible, un compuesto que muestra una actividad de translectura comprende o consiste en gentamicina y/o ácido 3-(5-(2-fluorofenil)-1,2,4-oxadiazol-3-il)benzoico) también conocido como PTC124™.
También se proporciona una composición que comprende además un compuesto que muestra una actividad de translectura, preferiblemente que comprende o consiste en gentamicina y/o ácido 3-(5-(2-fluorofenil)-1,2,4-oxadiazol-55 3-il)benzoico) para usar como medicamento.
Dicho medicamento es preferiblemente para el alivio de uno o varios síntoma(s) de DMD.
En una forma de realización, dicha composición se usa para paliar uno o varios síntoma(s) de una forma grave de BMD en la que se forma una proteína distrofina muy corta que no es lo suficientemente funcional.
Las dosis usuales de un compuesto que muestra una actividad de translectura, preferiblemente ácido 3-(5-(2-60 fluorofenil)-1,2,4-oxadiazol-3-il)benzoico) o de gentamicina oscilan entre 3 mg/kg/día a 200 mg/kg/día, las dosis preferidas están entre 10 mg/kg a 50 mg/kg al día o dos veces al día.
En una forma de realización más preferida, un compuesto que muestra una actividad de translectura se combina con al menos uno de los compuestos complementarios previamente identificados.
65
[0109] En otra forma de realización preferida de la divulgación, una composición comprende además un compuesto,
que es capaz de mejorar el salto de exón y/o inhibir el ensamblaje y/o empalme de espliceosoma.
Se ha observado que los compuestos químicos pequeños, tales como, por ejemplo, los derivados específicos del indol, inhiben selectivamente el ensamblaje y el empalme del espliceosoma 38, por ejemplo al interferir con la unión de proteínas ricas en serina y en arginina (SR) a sus potenciadores de empalme afines (ISE o ESE) y/o al interferir con la unión de represores de empalme a secuencias silenciadoras (ESS o ISS). 5
Estos compuestos son, por lo tanto, adecuados para ser aplicados como compuestos complementarios que mejoran el salto de exón.
También se proporciona una composición que comprende además un compuesto para mejorar el salto de exón y/o para inhibir el ensamblaje y/o el empalme del espliceosoma para usar como medicamento.
Dicho medicamento es preferiblemente para el alivio de uno o varios síntoma(s) de DMD. 10
En una forma de realización, dicha composición se usa para paliar uno o varios síntoma(s) de una forma grave de BMD en la que se forma una proteína distrofina muy corta que no es lo suficientemente funcional.
Dependiendo de la identidad del compuesto, que es capaz de mejorar el salto de exón y/o de inhibir el ensamblaje y/o empalme del espliceosoma, la persona experta sabrá qué cantidades son preferiblemente usadas.
En una forma de realización más preferida, un compuesto para mejorar el salto de exón y/o inhibir el ensamblaje y/o 15 empalme del espliceosoma se combina con un inhibidor de la ECA y/o con cualquier compuesto complementario como se ha identificado en este documento anteriormente.
[0110] De este modo, la divulgación proporciona una composición que comprende además un compuesto complementario, donde dicho compuesto complementario comprende un esteroide, un inhibidor de la ECA 20 (preferiblemente perindoprilo), losartán bloqueante de los receptores de tipo 1 de la angiotensina II_, un inhibidor del factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) , una fuente de mIGF-1, preferiblemente mIGF-1, un compuesto para mejorar la expresión de mIGF-1, un compuesto para mejorar la actividad de mIGF-1, un antioxidante, un inhibidor de canal iónico, un inhibidor de proteasa, L-arginina, un compuesto que muestra una actividad de translectura y/o que inhibe el ensamblaje y/o empalme del espliceosoma. 25
[0111] En una forma de realización de la divulgación, también se proporciona a un individuo una proteína distrofina funcional que utiliza un vector, preferiblemente un vector viral, que comprende un gen de micro-mini-distrofina.
De la forma más preferible, se usa un vector viral adenoasociado recombinante (rAAV).
AAV es un parvovirus de ADN monocatenario que no es patógeno y que muestra un ciclo de vida dependiente del 30 ayudante.
A diferencia de otros virus (adenovirus, retrovirus, y el virus del herpes simple), los vectores rAAV han demostradoser muy eficaces para la transducción de músculo esquelético maduro.
La aplicación de rAAV en estudios tradicionales de "adición génica" de la DMD ha sido obstaculizada por sus límites restringidos de empaquetado (< 5 kb). 35
Por lo tanto, el rAAV se aplica preferiblemente a la entrega eficaz de un gen de micro o mini distrofina mucho más pequeño.
La administración de tal gen de micro o mini distrofina tiene como resultado la presencia de una proteína distrofina al menos parcialmente funcional.
Se hace referencia a 18-20. 40
[0112] Cada constituyente de una composición se puede administrar a un individuo en cualquier orden.
En una forma de realización, cada constituyente se administra simultáneamente (lo que significa que cada constituyente se administra dentro de un periodo de 10 horas, preferiblemente dentro de una hora).
Sin embargo, esto no es necesario. 45
En una forma de realización, al menos un compuesto complementario se administra a un individuo que lo necesite antes de la administración de un oligonucleótido.
Alternativamente, un oligonucleótido se administra a un individuo que lo necesite antes de la administración de al menos un compuesto complementario.
50
Uso
[0113] En otro aspecto, se proporciona el uso de un oligoucleótido o de una composición tal y como se define en este documento para la producción de un medicamento para prevenir o tratar la distrofia muscular de Duchenne o la distrofia muscular de Becker en un individuo. 55
Cada característica de dicho uso ha sido definida anteriormente en este documento.
Un tratamiento en un uso o en un método según la invención dura al menos una semana, al menos un mes, al menos varios meses, al menos un año, al menos 2, 3, 4, 5, 6 años o más.
Cada molécula u oligonucleótido o equivalente de los mismos, tal y como se define en el presente documento, para uso según la invención puede ser adecuado para la administración directa a una célula, tejido y/u órgano in vivo de 60 de individuos afectados por o con riesgo de desarrollar DMD o BMD, y se puede administrar directamente in vivo, ex vivo o in vitro.
La frecuencia de la administración de un, oligonucleótido composición, compuesto o compuesto complementario de la invención puede depender de diferentes parámetros, tales como la edad del paciente, la mutación del paciente, el número de moléculas (es decir, ladosis), la formulación de dicha molécula. 65
La frecuencia puede oscilar entre al menos una vez cada dos semanas, o tres semanas o cuatro semanas o cinco
semanas o un período de tiempo más largo.
Método
[0114] En otro aspecto de la invención, se proporciona un método in vitro para el alivio de uno o varios síntoma(s) de 5 la distrofia muscular de Duchenne o de la distrofia muscular de Becker en un individuo o para mitigar una o varias característica(s) de una célula miogénica o muscular de dicho individuo, método que comprende la administración a dicho individuo de un oligonucleótido o de una composición tal y como se define en este documento.
Además, se proporciona un método para el mejorar, inducir o promover el salto de un exón de un pre-ARNm de distrofina en una célula que expresa dicho pre-ARNm en un individuo que padece distrofia muscular de Duchenne o 10 distrofia muscular de Becker, método que comprende administrar a dicho individuo un oligonucleótido o una composición tal y como se define en este documento.
Además, se proporciona un método para aumentar la producción de una proteína distrofina funcional y/o disminuir la producción de una proteína distrofina aberrante en una célula, dicha célula que comprende un pre-ARNm de un gen de distrofina que codifica una proteína distrofina aberrante, método que comprende proporcionar a dicha célula un 15 oligonucleótido o composición de la invención y permitir la traducción de ARNm producido del empalme de dicho pre-ARNm.
En una forma de realización, dicho método se realiza en vitro, por ejemplo utilizando un cultivo celular.
Preferiblemente en la divulgación, dicho método es in vivo.
20
[0115] En este contexto, el aumento de la producción de una proteína distrofina funcional se ha definido anteriormente en este documento.
[0116] A menos que se indique lo contrario, cada forma de realización según se describe en este documento se puede combinar con otra forma de realización como se describe en este documento. 25
[0117] En este documento y en sus reivindicaciones, la palabra "comprender" y sus conjugaciones se usan en su sentido no limitativo para significar que los elementos que van después de la palabra quedan incluidos, pero los artículos no específicamente mencionados no se excluyen.
Además la palabra "consistir" se puede sustituir por "consistir esencialmente en", con el significado de que un 30 compuesto o compuesto complementario tal y como se define en este documento puede comprender componente(s) adicional(es) además de los específicamente identificados, dicho(s) componente(s) adicional(es) que no altera(n) la característica única de la invención.
[0118] Además, la referencia a un elemento con el artículo indefinido "un" o "una" no excluye la posibilidad de que 35 esté presente más de uno de ese elemento, a menos que el contexto requiera claramente que sólo haya uno de los elementos.
De este modo, el artículo indefinido "un" o "una" normalmente significa "al menos uno/a".
[0119] La palabra "aproximadamente" o "alrededor de" cuando se usa en asociación con un valor numérico 40 (aproximadamente 10, alrededor de 10) preferiblemente significa que el valor puede ser el valor dado de 10 más o menos 1% del valor.
[0120] Cada forma de realización según se identifica en este documento se puede combinar a menos que se indique lo contrario. 45
[0121] La invención se explica más en los siguientes ejemplos.
Estos ejemplos no limitan el ámbito de la invención, sino que sólo sirven para clarificar la invención.
Breve descripción de los dibujos 50
[0122]
Figura 1. En los miotubos humanos de control, PS220 y PS305, ambos dirigidos a una secuencia idéntica dentro del exón 45, fueron directamente comparados para obervar sus eficiencias de salto relativas. PS220 indujo de forma reproducible los niveles máximos de salto del exón 45 (hasta un 73%), mientras que con PS305 se 55 obtuvieron niveles máximos de salto del exón 45 de hasta 46%. No se observó ningún salto del exón 45 en células no tratadas. (M: marcador de tamaño de ADN; NT: células no tratadas)
Figura 2. Gráfico que muestra los niveles relativos de salto del exón 45 de AON que contienen inosina evaluados por análisis RT-PCR. En los miotubos humanos de control, una serie de nuevos AON, todos dirigidos al exón 45 y que contienen una inosina para la slustitución de guanosina fueron evaluados para observar las eficiencias 60 relativas del salto de exón 45 en comparación con PS220 y PS305 (ver figura 1). Todos los nuevos AON que contienen inosina fueron eficaces, aunque a niveles variables (entre 4% y 25%). PS220 indujo niveles máximos de salto del exón 45 (hasta 72%), mientras que con PS305 se obtuvieron niveles máximos de salto del exón 45 de hasta 63%. No se observó ningún salto del exón 45 en células no tratadas. (M: marcador de tamaño de ADN; NT: células no tratadas). 65
Ejemplos
Ejemplo 1
Materiales y métodos 5
[0123] El diseño de los AON se basó (parcialmente) en estructuras secundarias abiertas solapadas del ARN del exón objetivo como predijo el programa m-fold, en sitios de unión de la proteína SR putativa (parcialmente) solapados como predijo el software ESEfinder.
Los AON fueron sintetizados por Prosensa Therapeutics B.V. (Leiden, Países Bajos), y contienen ARN de 2'-O-10 metilo y estructuras de fosforotioato (PS) en toda su longitud.
Cultivo de tejidos, transfección y análisis RT-PCR
[0124] Los cultivos de miotubos derivados de un individuo sano ("control humano") (ejemplos 1, 3, y 4; salto del exón 15 43, 50, 52) o de un paciente DMD que lleva una deleción del exón 45 (ejemplo 2, salto de exón 46) fueron procesados como se ha descrito previamente (Aartsma-Rus et al., Neuromuscul. Disord. 2002; 12: S71-77 and Hum Mol Genet 2003; 12(8): 907-14).
Para la selección de los AON, se transfectaron cultivos de miotubos con 200nM para cada AON (PS220 y PS305).
Se usó el reactivo de transfección UNIFectylin (Prosensa Therapeutics BV, Países Bajos), con 2 µl de UNIFectylin 20 por µg de AON.
Las eficiencias de los saltos de exón fueron determinados por análisis de RT-PCR anidada usando cebadores en los exones que flanquean el exón 45 objetivo.
Los fragmentos de la PCR fueron aislados de geles de agarosa para la verificación de la secuencia.
Para la cuantificación, los productos de la PCR fueron analizados utilizando el DNA 1000 LabChip Kit en el 25 bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies, EEUU).
Resultados
Salto de exón 45 de DMD. 30
[0125] Dos AON, PS220 (SEC ID n.º: 76,5'-UUUGCCGCUGCCCAAUGCCAUCCUG-3') y PS305 (SEC ID n.º: 557,5'-UUUGCCICUGCCCAAUGCCAUCCUG-3'), ambos dirigidos a una secuencia idéntica dentro del exón 45, fueron directamente comparados para obervar sus eficiencias de salto relativas en los cultivos de miotubos sanos de control. 35
El análisis posterior RT-PCR y de secuencias de ARN aislado demostró que ambos AON eran, de hecho, capaces de inducir el salto del exón 45.
PS220, que consiste una extensión GCCGC, indujo de forma reproducible niveles máximos de salto del exón 45 (hasta73%), como se muestra en la Figura 1.
Sin embargo, PS305, que es idéntico a PS220 pero que contiene una inosina para una sustitución de G en la 40 posición 4 dentro de que extensión, también es eficaz y conduce a niveles de salto del exón 45 de hasta 46%.
No se observó ningún salto del exón 45 en células no tratadas (NT).
Ejemplo 2
45
Materiales y métodos
[0126] El diseño de los AON se basó en estructuras secundarias abiertas (parcialmente) solapadas del ARN del exón 45 objetivo como predijo el programa m-fold, en sitios de unión de proteína SR putativa (parcialmente) solapados como predijo el software ESEfinder. 50
Los AON fueron sintetizados por Prosensa Therapeutics B.V. (Leiden, Países Bajos), y contienen ARN de 2'-O-metilo, estructuras de fosforotioato (PS) en toda su longitud y una inosina para la sustitución de guanosina.
Cultivo de tejidos, transfección y análisis RT-PCR
55
[0127] Se procesaron cultivos de miotubos derivados de un individuo sano ("control humanno") como se ha descrito previamente (Aartsma-Rus et al., Neuromuscul. Disord. 2002; 12: S71-77 and Hum Mol Genet 2003; 12(8): 907-14).
Para la selección de AON, los cultivos de miotubos fueron transfectados con 200nM para cada AON.
Se usó el reactivo de transfección UNIFectylin (Prosensa Therapeutics BV, Países Bajos), con 2 µl de UNIFectylin por µg de AON. 60
Las eficiencias de los saltos de exón fueron determinados por análisis de RT-PCR anidada usando cebadores en los exones que flanquean el exón 45 objetivo.
Los fragmentos de la PCR fueron aislados de geles de agarosa para la verificación de la secuencia.
Para la cuantificación, los productos de la PCR fueron analizados utilizando el DNA 1000 LabChip Kit en el bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies, EEUU). 65
Resultados
Salto de exón 45 de DMD.
[0128] Una serie adicional de AON dirigidos al exón 45 y que contienen una sustitución de inosina fueron evaluados 5 en cultivos de miotubos de control sanos para obtener las eficiencias de salto del exón 45, y fueron comparados directamente con PS220 (sin inosina; SEC ID n.º: 76)) y PS305 (secuencia idéntica a PS220 pero con sustitución de inosina; SEC ID n.º: 557).
El análisis posterior de secuencias y de RT-PCR de ARN aislado demostró que todos los AON nuevos (PS309 a PS316) fueron capazes de inducir el salto del exón 45 entre 4% (PS311) y 25% (PS310), como se muestra en la 10 Figura 2.
En comparación con PS220 y PS305, PS220 indujo niveles máximo de salto del exón 45 (hasta 72%).
De los nuevos AON que contienen inosina, PS305 fue el más eficaz, mostrando niveles de salto de exón 45 de hasta 63%.
No se observó ningún salto del exón 45 en células no tratadas (NT). 15
Referencias
[0129]
20
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Claims (16)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Oligonucleótido antisentido que comprende al menos una inosina, donde el oligonucleótido comprende una secuencia dirigida al menos a parte de una parte de un exón de pre-ARNm de distrofina que es una extensión 5 contigua que comprende al menos 13 nucleótidos y donde el oligonucleótido antisentido es capaz de realizar saltos de exón.
  2. 2. Oligonucleótido según la reivindicación 1, donde la extensión contigua comprende entre 13 y 50 nucleótidos, preferiblemente entre 14 y 25 nucleótidos, de ARN de un exón de un pre-ARNm de distrofina. 10
  3. 3. Oligonucleótido según la reivindicación 1 o 2, donde dicho exón comprende el exón 51, 45, 53, 44, 46, 52, 50 y/o 55.
  4. 4. Oligonucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el oligonucleótido comprende ARN y donde 15 preferiblemente dicho ARN contiene una modificación.
  5. 5. Oligonucleótido según la reivindicación 4, donde la modificación se selecciona de una ribosa modificada en 2'-O-metilo y una ribosa modificada en 2'-deoxi, preferiblemente la modificación es una ribosa modificada en 2'-O-metilo.
    20
  6. 6. Oligonucleótido según la reivindicación 4, donde dicha modificación comprende una modificación de 2'-O-metil-fosforotioato.
  7. 7. Oligonucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde dicho oligonucleótido comprende un ácido peptidonucleico, un ácido nucleico bloqueado, un morfolino fosforodiamidato o cualquier combinación de los mismos, 25 de la forma más preferible morfolino fosforodiamidato.
  8. 8. Oligonucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para ser usado como un medicamento, preferiblemente para prevenir o tratar la distrofia muscular de Duchenne o la distrofia muscular de Becker en un individuo. 30
  9. 9. Oligonucleótido según la reivindicación 8, donde el medicamento proporciona al individuo una proteína distrofina funcional y/o reduce al menos en parte la producción de una proteína distrofina aberrante y/o aumenta la producción de una proteína distrofina funcional o más funcional.
    35
  10. 10. Oligonucleótido según la reivindicación 8 o 9, donde el medicamento alivia uno o varios síntoma(s) de la distrofia muscular de Duchenne o de la distrofia muscular de Becker en dicho individuo.
  11. 11. Oligonucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde el oligonucleótido está representado por una secuencia que comprende o consiste en cualquiera de las secuencias de base SEC ID Nº:2 a 486 o 539, donde 40 al menos una inosina está presente en dicha secuencia.
  12. 12. Oligonucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde dicho oligonucleótido comprende o consiste en la base o secuencia de nucleótidos 5'-UUUGCCICUGCCCAAUGCCAUCCUG-3' (SEC ID Nº:557).
    45
  13. 13. Oligonucleótido antisentido consistente en la secuencia de base 5'-UUUGCCICUGCCCAAUGCCAUCCUG-3' (SEC ID Nº:557), donde el oligonucleótido contiene fracciones de ribosa de 2'-O-metilo y tiene una estructura completa de fosforotioato.
  14. 14. Composición que comprende al menos dos oligonucleótidos diferentes tal y como se define en cualquiera de las 50 reivindicaciones 1 a 7, u 11 a 13, donde la composición es preferiblemente una composición farmacéutica, dicha composición farmacéutica que comprende un portador, adyuvante, diluyente y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.
  15. 15. Uso del oligonucleótido tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o 11 o de la composición 55 tal y como se define en la reivindicación 14 para la fabricación de un medicamento para prevenir o tratar la distrofia muscular de Duchenne o la distrofia muscular de Becker en un individuo.
  16. 16. Método in vitro para el alivio de uno o varios síntoma(s) de la distrofia muscular de Duchenne o de la distrofia muscular de Becker en una célula, método que comprende administrar a dicha célula un oligonucleótido tal y como 60 se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 o una composición tal y como se define en la reivindicación 14.
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